血液学的基準対照および製法
【課題】血液学的基準対照細胞およびその製法を提供。
【解決手段】白血球（ＷＢＣ）からなるＷＢＣ分画を含む血液学的対照懸濁液であって、前記哺乳類ＷＢＣが当該細胞の細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した細胞性多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記哺乳類ＷＢＣを溶解し、細胞を固定する固定プロセスにかけてある。さらに有核赤血球（ＮＲＢＣ）を含み、ＮＲＢＣ分画の細胞が鳥類の赤血球、魚類の赤血球および哺乳類のリンパ球からなる群から選択され、選択された細胞が当該ＮＲＢＣの細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記選択された細胞を、細胞質を溶解し、核を固定する溶解および固定プロセスにかけてある。
【解決手段】白血球（ＷＢＣ）からなるＷＢＣ分画を含む血液学的対照懸濁液であって、前記哺乳類ＷＢＣが当該細胞の細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した細胞性多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記哺乳類ＷＢＣを溶解し、細胞を固定する固定プロセスにかけてある。さらに有核赤血球（ＮＲＢＣ）を含み、ＮＲＢＣ分画の細胞が鳥類の赤血球、魚類の赤血球および哺乳類のリンパ球からなる群から選択され、選択された細胞が当該ＮＲＢＣの細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記選択された細胞を、細胞質を溶解し、核を固定する溶解および固定プロセスにかけてある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液学的対照組成物、その製法および基準品への使用に関する。より詳細には、本発明は、安定化した白血球（ＷＢＣ）および哺乳類のＷＢＣまたは鳥類もしくは魚類の赤血球の核を含有する血液学的基準対照縣濁液に関する。さらに詳細には、本発明は、安定化した状態で多角度光散乱特性を保持するように、製造中に全血溶解プロセスにかけてある安定化したＷＢＣを含有する血液学的基準対照縣濁液に関する。この結果、この安定化した細胞は、多角度光散乱信号にのみ基づいてＷＢＣを識別する血液学的分析器で使用したときに、全血のＷＢＣ信号を模倣した多角度光散乱信号を生成することができる。
【背景技術】
【０００２】
現在、いくつかの異なる銘柄の自動血液学的測定機器が市販されている。これらの種々の分析装置では、好中球、リンパ球、単球、好酸球および好塩基球を定量するために種々の検出手法を使用している。使用されている検出手法には、電子的インピーダンス、前方光散乱、偏光９０゜光散乱、吸光、高周波およびそれらの組み合わせがある。光学ベンチ設計が異なると、安定化した対照細胞から得られる光学信号の特性に大きく影響する。これらの測定機器は白血球分類分析（ＷＢＣ／Ｄｉｆｆ）に種々の検出法を使用しているため、特定な種類の機器で実施する場合に、全血球細胞と類似した対照細胞特性を得るためには、種々の型のＷＢＣ／Ｄｉｆｆ対照溶液の使用が必要となる。
【０００３】
現在ある種類の機器では、細胞を他の細胞から識別し、決定するために、インピーダンス、インピーダンスと光散乱（必ずしも、多角度光散乱でなくてもよい）、または、光散乱とインピーダンスと高周波数信号を使用する必要がある。さらに、これらの現在利用できる血液学的測定機器では有核赤血球（ＮＲＢＣ）の定量はできない。ＮＲＢＣは正確なＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を妨害する。現在利用できる血液学的測定機器は試料中にＮＲＢＣの存在することを「知らせる」だけである。しかし、まもなく発売されるＡｂｂｏｔｔ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的分析器システムでは、ＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣの同時全血分析が実施できるであろう。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）の測定機器は、ＷＢＣとＮＲＢＣとを識別するために蛍光を適宜使用することを含めて、多角度光散乱のみを使用して同時に全血を分析する。そのため、ＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣを分析するための新しい血液学的対照の開発が必要となった。この新しい基準対照の対照細胞は、それらが模倣すると思われる全血試料の細胞の多角度光散乱能を全て有している必要がある。
【０００４】
現在、当業界では、現在の種類の分析器、すなわち、多角度光散乱によるＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析のみを実施するのではない分析器用の血液学的基準対照を製造するための方法および試薬系を記載している特許がいくつかある。本出願人らは、ＷＢＣおよびＮＲＢＣの多角度光散乱分析用の血液学的基準対照の製造および使用のための方法および試薬系について記載したものはまったく知らない。
【０００５】
Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社に譲渡されたＣａｒｖｅｒ他の米国特許第４７０４３６４号はヒト白血球の主要三成分を模倣する３成分系の製造法を開示している。しかし、これらの模倣細胞はインピーダンスによる検出系で検出されるが、多角度光散乱検出系では検出されない。Ｃａｒｖｅｒ他は、ヒト顆粒球を模倣するためにテンジクザメ由来の固定した赤血球（ＲＢＣ）を、ヒト単核細胞を模倣するためにシチメンチョウ由来の固定したＲＢＣを、ヒトリンパ球を模倣するために固定したヒトＲＢＣを使用している。白血球の三つの成分は大きさ（インピーダンス）によってのみ識別され、光学特性では識別されないため、Ｃａｒｖｅｒ他の教示により製造した血液学的対照は、三成分についてのＷＢＣ／Ｄｉｆｆの電子的インピーダンスによる測定にのみ有用である。
【０００６】
Ｃａｒｖｅｒ他の方法で製造したこれらの三つの成分は、ヒトＷＢＣと類似の細胞表面構造や、実質的にヒトＷＢＣと等しい細胞質粒度を有していない。従って、この三成分は多角度光散乱に基づく系の基準対照としては使用できない。本出願人らは、まもなく市販されるＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００分析器でこれらの模倣細胞を調べ、Ｃａｒｖｅｒ他の対照中の模倣されたＷＢＣの光散乱特性から、正常な血液試料と非常に異なる多角度光散乱信号が生じることを見出した。第１ａ図〜第１ｃ図は正常血についてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的分析器で得られた点のプロットを再現したものである。
【０００７】
以下の図面で軸を表示するために使用する略号を示す。
【０００８】
【表１】
【０００９】
第４ａ図〜第４ｃ図は、Ｃｏｕｌｔｅｒ社の製品４Ｃ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ対照で具体化されたＣａｒｖｅｒ他の模倣ＷＢＣ対照について、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００分析器で得られた結果を示している。第４ａ図〜第４ｃ図から判るように、これらのクラスタは同定できない。
【００１０】
Ｒｙａｎの米国特許第５２７０２０８号は、ＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析のための血液学的基準対照を製造する別の方法を開示している。Ｒｙａｎの方法では、アルデヒドで固定したヒトＷＢＣを、全血から得られるものと実質的に同様のＷＢＣ特徴プロフィールが得られる混合物を提供するのに十分な量のリポタンパク質を含む等張水性媒質に縣濁する。Ｒｙａｎはクレームを支持するために、横軸をＤＦ１とし、縦軸を容積として、Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＳＴＫ−Ｓ（登録商標）分析器の点のプロットでＷＢＣの分布を示した。ＲｙａｎのＷＢＣ調製物は、Ｓｔｒｅｃｋ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＰＡＲＡ １２（登録商標）（低、中、高）三レベル血液学対照という名前で市販されていると考えられる。本出願人はこの市販の物質について、多角度光散乱（軸方向の光の消失、多次元光散乱および蛍光）によりＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣを同時に分析するＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００分析器で調べた。この結果（第５ａ図〜第５ｃ図参照）から、Ｒｙａｎの調製物のＷＢＣ成分は全血から得られたものと有意に異なる光散乱特性を示すことが明らかとなった。第５ａ図〜第５ｃ図から明らかなように、この製品の好中球成分は全血のものに比べ軸方向の光の消失および偏光側の散乱信号が非常に少なく、好中球からの偏光解消光側の散乱信号が好酸球の信号から分離するには非常に大きく、単球クラスタは好中球クラスタからまったく分離されず、リンパ球成分は全血に比べ非常に大きな中間角度の散乱（７゜）信号を生じ、その結果、好塩基球の領域と重なり、この領域がなくなってしまう。
【００１１】
Ｙｏｕｎｇ他の米国特許第５３２０９６４号は白血球類似体を製造するための方法および試薬組成物を開示している。Ｙｏｕｎｇ他のリンパ球類似体は低張リン酸塩緩衝溶液（１５〜２５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したアヒルＲＢＣから調製し、単球類似体は低張緩衝溶液（１５〜２５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したワニＲＢＣから調製し、好酸球類似体も低張緩衝溶液（７５〜８５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したワニＲＢＣから調製し、好中球類似体は低張緩衝溶液（４５〜６５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したワニＲＢＣから調製している。アヒルのＲＢＣとワニのＲＢＣのいずれも楕円形で、有核であり、滑らかな細胞表面を有している。Ｙｏｕｎｇ他は、かれらの手法で調製した固定細胞は、各々がヒト白血球の物理特性を少なくとも二つ有している少なくとも二つの異なるヒト白血球を模倣すると主張している。これらの特性は、（ａ）直流電流で測定される容積、（ｂ）高周波数（ＲＦ）サイズ、（ｃ）不透明性、（ｄ）光散乱から選択される。光散乱の種類を特定していないが、Ｙｏｕｎｇ他のアヒルおよびワニのＲＢＣから調製した模倣ＷＢＣ成分は細胞表面構造および細胞質の粒度については、哺乳類のＷＢＣと同じ特性は有していない。従って、これらの細胞は、ヒト全血ＷＢＣと実質的に等しいかまたは類似の偏光および偏光解消光９０゜光散乱の多角度光散乱信号と軸方向の光の消失の信号は発生しない。従って、Ｙｏｕｎｇ他の製品は多角度光散乱、軸方向の光の消失および蛍光信号を使用する、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００分析器などの高度な血液学的機器で、例えば、ＷＢＣ／ＤｉｆｆおよびＮＲＢＣの定量に血液学的標準対照として使用することはできない。実際、Ｙｏｕｎｇ他の細胞を低張緩衝溶液で固定すると、次の二つ、すなわち、溶液の浸透圧が非常に低い（５〜２５ｍＯｓｍ／ｋｇ）場合、細胞の細胞質が溶解する。あるいは、浸透圧が約８５ｍＯｓｍ／ｋｇの場合、細胞容積が大きくなる、のいずれかになる。
【００１２】
第１８ａ図〜第１８ｄ図は、対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含む対照細胞溶液を多パラメータの光散乱に基づいて分析した結果を示している。図から明らかなように、固定したワニのＲＢＣは検出可能なＰＳＳ信号を発生せず、ＩＡＳ信号はリンパ球と好塩基球の間にあり、ＡＬＬ信号は好中球および好酸球のいずれとして計測するにも低すぎる。
【００１３】
第６ａ図〜第６ｃ図は、別の市販の対照である、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のＣＢＣ−３ｋ（商標）血液学的対照についての結果を示している。ＣＢＣ−３ｋ（商標）の製品が特許査定されているかどうかは判らない。図に示すように、クラスタは同定できない。
【発明の開示】
【００１４】
本発明のこれらの特徴およびその他の特徴ならびに利点は以下の本発明の好適実施形態の説明から明らかとなろう。
【００１５】
本発明の一つの目的は、多次元光散乱ＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を使用するＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ３０００機器などの自動血液学的測定機器の血液学的基準対照を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、ＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣを同時に分析するために、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光を利用するＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００機器などの自動血液学的システムの血液学的基準対照を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、ＷＢＣ／ＤｉｆｆおよびＮＲＢＣを同時に分析するために、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光を使用するＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００機器などの自動血液学的測定システムで使用できる、安定化したＲＢＣ、血小板、好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球およびＮＲＢＣ成分を含有する安定な血液学的基準対照を提供することである。
【００１８】
広範には、本発明は、安定なＷＢＣおよびＮＲＢＣ成分ならびにこれらの成分を一つまたは複数含有する血液学的基準対照溶液の製造方法に関する。この方法では、ヒト全血細胞の電子光学信号と類似の信号を発生する、しっかりと固定し、安定化したＷＢＣおよび模倣ＮＲＢＣが製造され、その結果、新鮮なヒト血液試料用の分析器で使用するものと同じアルゴリズムを使用する完全なＷＢＣ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣ分析が可能となる。本発明方法で製造される固定したＷＢＣおよび模倣ＮＲＢＣはクランプを含まず、適当な血漿様媒質中で冷蔵下、長期にわたり安定であり、多パラメータ光散乱を使用する機器などの日常的な臨床血液学測定機器のＷＢＣ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣ用の血液学的対照として使用できる。これらの利点は従来技術に対する実質的な改良に相当する。
【００１９】
図面の簡単な説明
本発明およびその利点ををより完全に理解するために、添付図面と共に以下の説明を参照する。
【００２０】
第１ａ図〜第１ｃ図は、多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【００２１】
第２ａ図〜第２ｃ図は、１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【００２２】
第３ａ図〜第３ｃ図は、４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【００２３】
第４ａ図〜第４ｃ図は、Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標） ４Ｃ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２４】
第５ａ図〜第５ｃ図は、正常レベルのＳｔｒｅｃｋ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ １２（登録商標） Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２５】
第６ａ図〜第６ｄ図は、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標） Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２６】
第７ａ図〜第７ｃ図は、本発明の血液学的基準対照について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２７】
第８ａ図〜第８ｃ図は、本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２８】
第９ａ図〜第９ｃ図は、第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２９】
第１０ａ図〜第１０ｃ図は、本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３０】
第１１ａ図〜第１１ｃ図は、第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３１】
第１２ａ図〜第１２ｃ図は、本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３２】
第１３ａ図〜第１３ｃ図は、第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３３】
第１４ａ図〜第１４ｃ図は、本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３４】
第１５ａ図〜第１５ｃ図は、本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３５】
第１６ａ図〜第１６ｃ図は、すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３６】
第１７ａ図〜第１７ｄ図は、本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３７】
第１８ａ図〜第１８ｄ図は、対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
細胞を検出し、分類するための自動システムではいずれも、そのシステムが適切に作動していることを確認するために基準対照の使用が必要である。これはどんな検出システムを使用した場合にもいえる。
【００３９】
新しい検出方式、主として試料中のＷＢＣのサブポピュレーションおよびＮＲＢＣを分類し、識別するために多角度／パラメータ光散乱信号のみを使用する（他のすべての非光信号を除く）検出方式が出現したため、新しい対照が必要となった。当業界の現在の基準対照はこのような多パラメータシステムで適切に機能しない。
【００４０】
本発明者らは、現在の対照が、多角度光散乱に基づく血液学的分析器で機能しない理由を発見し、機能する対照を製造する方法を考案した。本発明の対照は多パラメータ光散乱に基づくシステムで機能するだけではなく、他の検出法に基づくシステムでも機能するはずである。これは、新しい対照の細胞が、処理しただけの血液試料中で認められる細胞と同じであるためである。従って、新しい対照の細胞はそれらの細胞の光散乱特性を保持している。
【００４１】
本発明の基準対照縣濁液の細胞性成分は、多パラメータ光散乱に基づく検出システムにかけると、全血試料中のＷＢＣまたはＮＲＢＣの多パラメータ光散乱特性を実質的に模倣する。
【００４２】
本発明では、多パラメータ、多角度または多次元光散乱とは、当該細胞を測定または分類するために、偏光および偏光解消光９０゜光散乱および軸方向の光の消失の信号およびこれらを組み合わせたもののみ（すなわち、非の付くものを除く）を使用することを含む。この測定には、その他の光ベースではない信号は使用できない。蛍光などのその他の種類の光信号も使用できるが、インピーダンスおよびその他の光ベースではない信号は使用できない。しかし、例えば、光ベースではない信号、または光散乱とインピーダンスとの組み合わせを使用する機器にも本発明の対照は役立つが、現在のところ、多角度光散乱に基づく測定機器には、利用できるこのような対照がないため、このような機器に最も役立つであろう。
【００４３】
本発明の対照縣濁液のＷＢＣ成分は、（血液試料を分析していた分析器内における環境と同様な）非常に緩和な溶解環境におき、次いで固定してある血液から得たＷＢＣである。ＮＲＢＣ成分についても同様であり、核を溶解環境に露出し、固定してその細胞特性を保存する。しかし、ＮＲＢＣ成分については、哺乳類の有核赤血球は遊離した核の源として使用できる唯一の細胞ではない。鳥類または魚類の赤血球もこの分画に使用できる。
【００４４】
対照細胞が当該細胞の光散乱特性を模倣できるのは、先ず、細胞組成（すなわち光散乱特性）により細胞を選択したためである。製造プロセスの間に、最初に緩和な溶解環境においてＲＢＣを溶解し、次いで、所望の細胞特性が溶解環境で破壊される前に、残存するＷＢＣおよびＮＲＢＣの核を固定することにより、対照細胞のこれらの細胞成分が保存される。この製造プロセスは、「本当の」血球が分析器の内部を通過する際におかれる環境を模倣している。対照細胞は「固定」されているため、分析器を通過するときに溶解環境の影響はそれほど受けず、その結果、所望の特性を保持する。さらに、固定した細胞は対照溶液中で安定であるが、全血細胞は安定ではない。しかし、細胞の光散乱特性を主として決定する屈折率が実質的に同じとなるようにするには、試料中の血球が分析器中でおかれる溶解環境と同じまたは同様の環境に対照細胞をおく必要があると考えられている。このように、対照細胞はその機器により、「機器で溶解した」当該細胞とみなされ、そのように記録される。
【００４５】
また、同じ本発明の細胞成分は、溶解環境におかれる前に「固定する」と、多角度光散乱に基づくシステムで満足に機能しないことも判明した。これらの細胞は「固定する」前に、溶解環境におく必要がある。その後、これらの細胞が分析中で対照細胞として処理されると、これらの処理された細胞は分析器によって当該の血球と「みなされる」。これは、多パラメータ光散乱に基づく分析器は、分析器の内部処理環境で全血細胞を認識するようにしかプログラムされていないためである。従って、基準の対照細胞または細胞成分が適当な細胞特性を保持しており、その結果、全血と実質的に同様に反応または行動（光および／または蛍光を散乱）しない限り、分析器によって異なる細胞であるまたは完全に認識できないと「みなされる」。
【００４６】
従って、本発明の主な方法では、細胞または細胞成分を、「固定」の前に、基準対照を製造するプロセスの間、基準対照として使用されるときに、分析器内で遭遇するであろう溶解環境におく。
【００４７】
以下の実施例では、次の試薬処方を使用した。
（実施例）
【００４８】
溶解試薬：
約０．７５Ｍ〜約１．１０Ｍの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）
約０．１Ｍ〜約０．４Ｍのホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）
約１０ｍＭ〜約２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）
約１０ｍＭ〜約２５ｍＭの重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）
約５０ｍｇ／Ｌ〜約２５０ｍｇ／Ｌのサポニン
約０．２ｇ／Ｌ〜約０．４ｇ／ＬのＰｒｏｃｌｉｎ ３００
ＷＢＣ−Ｃｙｔｏ−Ｌｙｓｅ：
約２．５ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌのマレイン酸、コハク酸またはフタル酸
約１０．０ｇ／Ｌから約３０．０ｇ／ＬのＢｒｉｊ ３５、Ｔｗｅｅｎ ２０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
固定剤：
約３．０ｇ／Ｌから約５．０ｇ／Ｌのリン酸一ナトリウム
約６．０ｇ／Ｌから約７．０ｇ／Ｌのリン酸二ナトリウム
約１００ｍｌ／Ｌから約２００ｍｌ／Ｌのホルマリン（３７〜４０％のホルムアルデヒド溶液）
第２ａ図〜第２ｃ図および第３ａ図〜第３ｃ図は各々、ＮＲＢＣ
を１．７８ｋ／ｍＬおよび４０．４ｋ／ｍＬ含む臨床血液試料についてＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００多パラメータ光散乱ベースのシステムで得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣ分布のサイトグラムである。これらの図面は、本明細書の図面中に記載され、示された種々の方法で製造される対照または細胞との比較の目的で示している。
【００４９】
本発明の鳥類、魚類および哺乳類の固定したＷＢＣおよび細胞の核は挿入物のため、任意の緩衝食塩水に再縣濁でき、緩衝食塩水はクランピングを防止するなんらかのタンパク質を含んでいてもよい。しかし、これらの固定した細胞は、全域対応型血液学的対照を製造するためには、固定していないが、安定化したＲＢＣと合わせる必要があり、細胞再縣濁媒質は安定化したＲＢＣを溶解から保護できなければならない。下記の処方は、本発明の対照細胞と共に良好に使用できることが判っている再縣濁用媒質の例である。この処方は、固定したＷＢＣおよび核のクランピングを防ぎ、対照溶液中のＲＢＣ成分を溶解から保護する血漿様細胞再縣濁液である。
【００５０】
【表２】
【００５１】
本発明方法で製造した血液学的対照を、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光によりＷＢＣ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣを分析するＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器で使用すると、試薬と共にシステムの性能を毎日モニターできる。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００システムでこの製品を使用して結果の質をモニターできるパラメータは以下の通りである。
【００５２】
【表３】
【実施例１】
【００５３】
この実施例では、上記の溶解試薬および固定剤を使用する。以下の手順で、安定で、クランプを含まない、固定したヒトＷＢＣを調製する。この実施例の固定したヒトＷＢＣについてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器で得られたＷＢＣのサイトグラムの例を第７ａ図〜第７ｃ図に示す。
１．ヒトのバフィコート層１部を（予め４２℃に温めた）溶解試薬５部と混合した。直ちに、緩和に渦状に回転させて、成分を混合し、室温に５０秒間放置して、ＲＢＣを完全に溶解させた。
２．ステップ１の溶解したＷＢＣ縣濁液１部を固定剤１０部と混合し、直ちに６０℃〜７０℃の水浴に入れ、ゆっくりと混合することにより１０分間固定させた。
３．固定させた細胞の縣濁液を室温に冷却し、１０℃で、２，５００ｒｐｍで５分間遠心して、固定剤を除去し、中性ｐＨの等張リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用して、同じ遠心速度で３回洗浄した後、ＣＲＳＭに再縣濁させた。
４．最終生成物のアリコートをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器にかけて、ＷＢＣ数および分布を調べた。
５．固定した細胞の濃度を、正常レベルの対照については、最終濃度が再縣濁用媒質中約７，５００／μＬとなるよう調整した。
【実施例２】
【００５４】
実施例１に使用したものと同じ溶解試薬および固定試薬を使用したが、ＲＢＣの溶解およびＷＢＣの固定を下記プロトコールに従って実施した。
１．ヒトのバフィコート層１部を溶解試薬溶液５部と共に緩和に渦状に回転させて、直ちに混合させ、室温に１０分間放置して、ＲＢＣを完全に溶解させた。
２．ステップ１の溶解したＷＢＣ縣濁液１部を固定剤１０部と合わせ、混合し、室温で２〜３時間固定した。
３．固定した細胞の縣濁液を１０℃、２，５００ｒｐｍで５分間遠心して、固定剤を除去し、中性ｐＨのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用して、同じ遠心速度で３回洗浄し、ＣＲＳＭに再縣濁した。
４．最終生成物のアリコートをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器にかけて、ＷＢＣ数および分布を調べた。
５．固定した細胞の濃度を、低濃度の対照については、最終濃度が約２，０００／μＬとなるように調整した。
【実施例３】
【００５５】
次のプロトコールおよびＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器の例示に従ってシチメンチョウの赤血球からＮＲＢＣ分画を調製した。固定したシチメンチョウの赤血球の核および固定したシチメンチョウの赤血球の核でスパイクした正常ヒトのＮＲＢＣサイトグラムを各々第１２ａ図〜第１２ｅ図および第１３ａ図〜第１３ｃ図に示す。
Ａ．材料：
１．シチメンチョウ全血
２．溶解試薬：実施例１に記載の通り
３．固定剤：ｗ／デキストロース：リン酸一ナトリウム ４グラム／Ｌ、リン酸二ナトリウム ６．５グラム／Ｌ、ホルマリン １５０ｍｌ／Ｌ、デキストロース １００ｇ／Ｌ、ｐＨ約６．８
４．細胞洗浄液：リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）
５．ＣＲＳＭ：上記と同じＣＲＳＭ
Ｂ．シチメンチョウ赤血球核固定用プロトコール：
１．リジン試薬のアリコート１０ｍｌを３７℃まで加温する。
２．シチメンチョウ全血を３０００ｒｐｍで１０分間遠心して、血漿層を分離し、バフィコート層を除去する。濃縮赤血球層に血漿を戻し、混合する。
３．予熱した溶解試薬溶液にＲＢＣ層１．０ｍｌを加え、蓋をして、直ちに３回上下混合する。全速で約１０秒間渦状に回転させ、ＲＢＣの細胞質の溶解を促進する。約１０分間または細胞質の溶解が完了するまで室温に放置する。細胞質が完全に溶解していることを顕微鏡下で確認する。
４．２０００ｒｐｍで１５分間遠心し、細胞ペレットを再縣濁するのに調度十分な量を残して、上清をすべてサイホンで除去する。細胞のクランプが見えなくなるまで緩和に攪拌して細胞を再懸濁する。
５．ステップ４と同じ遠心条件でＰＢＳを使用して、細胞を３回洗う。
６．固定剤１０ｍｌを加え、混合し、直ちに６０℃の水浴に入れ、細胞のクランピングを防ぐために撹拌を続けながら、少なくとも５分間固定させる。
７．細胞縣濁液を室温に３０分または一晩放置する。
８．混合し、ステップ４および５を２回繰り返す。
９．固定した核をＣＲＳＭに再縣濁する。
１０．Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器にかけて、ＦＬ３＋の核の濃度とクラスタの位置を測定する。
【実施例４】
【００５６】
実施例３に記載したものと同じ試薬およびプロトコールを使用して、マスの赤血球からＮＲＢＣ分画を調製した。固定したマスの赤血球の核および固定したマスの赤血球の核でスパイクした正常な全血をＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器にかけて得られたＮＲＢＣサイトグラムの例を第８ａ図〜第８ｃ図および第９ａ図〜第９ｃ図に示す。
【実施例５】
【００５７】
下記の材料および方法によりブタのリンパ球からＮＲＢＣ分画を調製し、固定したブタのリンパ球の核をＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器にかけて得られたＮＲＢＣサイトグラムの例を第１４ａ図〜第１４ｃ図に示す。
Ａ．材料：
ブタのバフィコート層（血小板を既に除去したもの）
Ｃｙｔｏ−Ｌｙｓｅ：
Ｂｒｉｊ ３５：１５．０ｇ／Ｌ
フタル酸：５．５ｇ／Ｌ
溶解試薬：実施例１と同様
固定剤：実施例１と同様
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
Ｂ．手順：
１．ブタのリンパ球高含有層１部を溶解試薬５部で希釈し、室温に５分間放置して、細胞縣濁液に残っているＲＢＣの溶解を完了させる。
２．細胞縣濁液を３０００ｒｐｍで３回遠心し、上清を注ぎ出し、細胞ペレットを取り出す。
３．この細胞をＣｙｔｏ−Ｌｙｓｅと１対１０の比で混合し、室温に２時間放置する。
４．核をＣｙｔｏ−Ｌｙｓｅに再縣濁し、３０００ｒｐｍで３分間回転させ、上清を注ぎ出す。
５．核を少なくとも２倍容の固定剤に再縣濁し、混合する。
６．６０℃で１０分間（または室温で４時間）固定し、室温に冷却する。
７．核を３０００ｒｐｍで３分間回転させ、上清を注ぎ出す。
８．細胞ペレットをＰＢＳに再縣濁し、核を３回洗浄する。
９．核をＣＲＳＭに再縣濁する。
【実施例６】
【００５８】
ウシのＷＢＣを実施例１に記載のプロトコールで固定し、実施例４に記載の手順に従って調製した固定したブタの核と混合する。固定したウシのＷＢＣのみおよびブタのリンパ球核と混合した固定したウシのＷＢＣについてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器で得られたＷＢＣチャネルサイトグラムの例を第１５ａ図〜第１５ｃ図および第１６ａ図〜第１６ｆ図に示す。
【実施例７】
【００５９】
実施例３に記載のプロトコールに従ってニワトリの赤血球からＮＲＢＣ分画を調製し、固定したニワトリの赤血球核および固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常なヒトの全血についてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器で得られたＮＲＢＣサイトグラムの例を第１０ａ図〜第１０ｃ図および第１１ａ図〜第１１ｃ図に示す。
【００６０】
本発明の方法で製造した血液学的対照は、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ３０００または３５００血液学的測定機器にかけて次のパラメータをモニターするのに使用できる。上記機器は光散乱およびインピーダンス信号の両者を使用して、次のＷＢＣ／Ｄｉｆｆパラメータを追跡できる。
【００６１】
【表４】
【００６２】
第１７ａ図〜第１７ｄ図は、本発明方法で製造した、固定したウシＷＢＣについて、光散乱パラメータ（軸方向の光の消失または蛍光ではない）を使用してＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を実施し、インピ−ダンスを使用してＲＢＣおよび血小板を測定するＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ３５００分析機器で得たＷＢＣサイトグラムである。この図では、ＷＢＣ分画と、固定した血小板および安定化したが固定していないＲＢＣとを合わせて、全域対応型対照縣濁液を製造した。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１ａ】多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【図１ｂ】多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【図１ｃ】多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【図２ａ】１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図２ｂ】１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図２ｃ】１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図３ａ】４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図３ｂ】４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図３ｃ】４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図４ａ】Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標） ４Ｃ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図４ｂ】Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標） ４Ｃ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図４ｃ】Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標） ４Ｃ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図５ａ】正常レベルのＳｔｒｅｃｋ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ １２（登録商標） Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図５ｂ】正常レベルのＳｔｒｅｃｋ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ １２（登録商標） Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図５ｃ】正常レベルのＳｔｒｅｃｋ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ １２（登録商標） Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ａ】Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標） Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ｂ】Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標） Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ｃ】Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標） Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ｄ】Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標） Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図７ａ】本発明の血液学的基準対照について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図７ｂ】本発明の血液学的基準対照について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図７ｃ】本発明の血液学的基準対照について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図８ａ】本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図８ｂ】本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図８ｃ】本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図９ａ】第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図９ｂ】第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図９ｃ】第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１０ａ】本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１０ｂ】本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１０ｃ】本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１１ａ】第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１１ｂ】第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１１ｃ】第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１２ａ】本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１２ｂ】本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１２ｃ】本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１３ａ】第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１３ｂ】第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１３ｃ】第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１４ａ】本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１４ｂ】本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１４ｃ】本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１５ａ】本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１５ｂ】本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１５ｃ】本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ａ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｂ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｃ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｄ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｅ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｆ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ａ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ｂ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ｃ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ｄ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ａ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ｂ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ｃ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ｄ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液学的対照組成物、その製法および基準品への使用に関する。より詳細には、本発明は、安定化した白血球（ＷＢＣ）および哺乳類のＷＢＣまたは鳥類もしくは魚類の赤血球の核を含有する血液学的基準対照縣濁液に関する。さらに詳細には、本発明は、安定化した状態で多角度光散乱特性を保持するように、製造中に全血溶解プロセスにかけてある安定化したＷＢＣを含有する血液学的基準対照縣濁液に関する。この結果、この安定化した細胞は、多角度光散乱信号にのみ基づいてＷＢＣを識別する血液学的分析器で使用したときに、全血のＷＢＣ信号を模倣した多角度光散乱信号を生成することができる。
【背景技術】
【０００２】
現在、いくつかの異なる銘柄の自動血液学的測定機器が市販されている。これらの種々の分析装置では、好中球、リンパ球、単球、好酸球および好塩基球を定量するために種々の検出手法を使用している。使用されている検出手法には、電子的インピーダンス、前方光散乱、偏光９０゜光散乱、吸光、高周波およびそれらの組み合わせがある。光学ベンチ設計が異なると、安定化した対照細胞から得られる光学信号の特性に大きく影響する。これらの測定機器は白血球分類分析（ＷＢＣ／Ｄｉｆｆ）に種々の検出法を使用しているため、特定な種類の機器で実施する場合に、全血球細胞と類似した対照細胞特性を得るためには、種々の型のＷＢＣ／Ｄｉｆｆ対照溶液の使用が必要となる。
【０００３】
現在ある種類の機器では、細胞を他の細胞から識別し、決定するために、インピーダンス、インピーダンスと光散乱（必ずしも、多角度光散乱でなくてもよい）、または、光散乱とインピーダンスと高周波数信号を使用する必要がある。さらに、これらの現在利用できる血液学的測定機器では有核赤血球（ＮＲＢＣ）の定量はできない。ＮＲＢＣは正確なＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を妨害する。現在利用できる血液学的測定機器は試料中にＮＲＢＣの存在することを「知らせる」だけである。しかし、まもなく発売されるＡｂｂｏｔｔ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的分析器システムでは、ＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣの同時全血分析が実施できるであろう。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標）の測定機器は、ＷＢＣとＮＲＢＣとを識別するために蛍光を適宜使用することを含めて、多角度光散乱のみを使用して同時に全血を分析する。そのため、ＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣを分析するための新しい血液学的対照の開発が必要となった。この新しい基準対照の対照細胞は、それらが模倣すると思われる全血試料の細胞の多角度光散乱能を全て有している必要がある。
【０００４】
現在、当業界では、現在の種類の分析器、すなわち、多角度光散乱によるＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析のみを実施するのではない分析器用の血液学的基準対照を製造するための方法および試薬系を記載している特許がいくつかある。本出願人らは、ＷＢＣおよびＮＲＢＣの多角度光散乱分析用の血液学的基準対照の製造および使用のための方法および試薬系について記載したものはまったく知らない。
【０００５】
Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社に譲渡されたＣａｒｖｅｒ他の米国特許第４７０４３６４号はヒト白血球の主要三成分を模倣する３成分系の製造法を開示している。しかし、これらの模倣細胞はインピーダンスによる検出系で検出されるが、多角度光散乱検出系では検出されない。Ｃａｒｖｅｒ他は、ヒト顆粒球を模倣するためにテンジクザメ由来の固定した赤血球（ＲＢＣ）を、ヒト単核細胞を模倣するためにシチメンチョウ由来の固定したＲＢＣを、ヒトリンパ球を模倣するために固定したヒトＲＢＣを使用している。白血球の三つの成分は大きさ（インピーダンス）によってのみ識別され、光学特性では識別されないため、Ｃａｒｖｅｒ他の教示により製造した血液学的対照は、三成分についてのＷＢＣ／Ｄｉｆｆの電子的インピーダンスによる測定にのみ有用である。
【０００６】
Ｃａｒｖｅｒ他の方法で製造したこれらの三つの成分は、ヒトＷＢＣと類似の細胞表面構造や、実質的にヒトＷＢＣと等しい細胞質粒度を有していない。従って、この三成分は多角度光散乱に基づく系の基準対照としては使用できない。本出願人らは、まもなく市販されるＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００分析器でこれらの模倣細胞を調べ、Ｃａｒｖｅｒ他の対照中の模倣されたＷＢＣの光散乱特性から、正常な血液試料と非常に異なる多角度光散乱信号が生じることを見出した。第１ａ図〜第１ｃ図は正常血についてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的分析器で得られた点のプロットを再現したものである。
【０００７】
以下の図面で軸を表示するために使用する略号を示す。
【０００８】
【表１】
【０００９】
第４ａ図〜第４ｃ図は、Ｃｏｕｌｔｅｒ社の製品４Ｃ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ対照で具体化されたＣａｒｖｅｒ他の模倣ＷＢＣ対照について、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００分析器で得られた結果を示している。第４ａ図〜第４ｃ図から判るように、これらのクラスタは同定できない。
【００１０】
Ｒｙａｎの米国特許第５２７０２０８号は、ＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析のための血液学的基準対照を製造する別の方法を開示している。Ｒｙａｎの方法では、アルデヒドで固定したヒトＷＢＣを、全血から得られるものと実質的に同様のＷＢＣ特徴プロフィールが得られる混合物を提供するのに十分な量のリポタンパク質を含む等張水性媒質に縣濁する。Ｒｙａｎはクレームを支持するために、横軸をＤＦ１とし、縦軸を容積として、Ｃｏｕｌｔｅｒ社のＳＴＫ−Ｓ（登録商標）分析器の点のプロットでＷＢＣの分布を示した。ＲｙａｎのＷＢＣ調製物は、Ｓｔｒｅｃｋ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＰＡＲＡ １２（登録商標）（低、中、高）三レベル血液学対照という名前で市販されていると考えられる。本出願人はこの市販の物質について、多角度光散乱（軸方向の光の消失、多次元光散乱および蛍光）によりＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣを同時に分析するＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００分析器で調べた。この結果（第５ａ図〜第５ｃ図参照）から、Ｒｙａｎの調製物のＷＢＣ成分は全血から得られたものと有意に異なる光散乱特性を示すことが明らかとなった。第５ａ図〜第５ｃ図から明らかなように、この製品の好中球成分は全血のものに比べ軸方向の光の消失および偏光側の散乱信号が非常に少なく、好中球からの偏光解消光側の散乱信号が好酸球の信号から分離するには非常に大きく、単球クラスタは好中球クラスタからまったく分離されず、リンパ球成分は全血に比べ非常に大きな中間角度の散乱（７゜）信号を生じ、その結果、好塩基球の領域と重なり、この領域がなくなってしまう。
【００１１】
Ｙｏｕｎｇ他の米国特許第５３２０９６４号は白血球類似体を製造するための方法および試薬組成物を開示している。Ｙｏｕｎｇ他のリンパ球類似体は低張リン酸塩緩衝溶液（１５〜２５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したアヒルＲＢＣから調製し、単球類似体は低張緩衝溶液（１５〜２５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したワニＲＢＣから調製し、好酸球類似体も低張緩衝溶液（７５〜８５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したワニＲＢＣから調製し、好中球類似体は低張緩衝溶液（４５〜６５ｍＯｓｍ／ｋｇ）中で固定したワニＲＢＣから調製している。アヒルのＲＢＣとワニのＲＢＣのいずれも楕円形で、有核であり、滑らかな細胞表面を有している。Ｙｏｕｎｇ他は、かれらの手法で調製した固定細胞は、各々がヒト白血球の物理特性を少なくとも二つ有している少なくとも二つの異なるヒト白血球を模倣すると主張している。これらの特性は、（ａ）直流電流で測定される容積、（ｂ）高周波数（ＲＦ）サイズ、（ｃ）不透明性、（ｄ）光散乱から選択される。光散乱の種類を特定していないが、Ｙｏｕｎｇ他のアヒルおよびワニのＲＢＣから調製した模倣ＷＢＣ成分は細胞表面構造および細胞質の粒度については、哺乳類のＷＢＣと同じ特性は有していない。従って、これらの細胞は、ヒト全血ＷＢＣと実質的に等しいかまたは類似の偏光および偏光解消光９０゜光散乱の多角度光散乱信号と軸方向の光の消失の信号は発生しない。従って、Ｙｏｕｎｇ他の製品は多角度光散乱、軸方向の光の消失および蛍光信号を使用する、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００分析器などの高度な血液学的機器で、例えば、ＷＢＣ／ＤｉｆｆおよびＮＲＢＣの定量に血液学的標準対照として使用することはできない。実際、Ｙｏｕｎｇ他の細胞を低張緩衝溶液で固定すると、次の二つ、すなわち、溶液の浸透圧が非常に低い（５〜２５ｍＯｓｍ／ｋｇ）場合、細胞の細胞質が溶解する。あるいは、浸透圧が約８５ｍＯｓｍ／ｋｇの場合、細胞容積が大きくなる、のいずれかになる。
【００１２】
第１８ａ図〜第１８ｄ図は、対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含む対照細胞溶液を多パラメータの光散乱に基づいて分析した結果を示している。図から明らかなように、固定したワニのＲＢＣは検出可能なＰＳＳ信号を発生せず、ＩＡＳ信号はリンパ球と好塩基球の間にあり、ＡＬＬ信号は好中球および好酸球のいずれとして計測するにも低すぎる。
【００１３】
第６ａ図〜第６ｃ図は、別の市販の対照である、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社のＣＢＣ−３ｋ（商標）血液学的対照についての結果を示している。ＣＢＣ−３ｋ（商標）の製品が特許査定されているかどうかは判らない。図に示すように、クラスタは同定できない。
【発明の開示】
【００１４】
本発明のこれらの特徴およびその他の特徴ならびに利点は以下の本発明の好適実施形態の説明から明らかとなろう。
【００１５】
本発明の一つの目的は、多次元光散乱ＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を使用するＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ３０００機器などの自動血液学的測定機器の血液学的基準対照を提供することである。
【００１６】
本発明の別の目的は、ＷＢＣ／ＤｉｆｆとＮＲＢＣを同時に分析するために、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光を利用するＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００機器などの自動血液学的システムの血液学的基準対照を提供することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、ＷＢＣ／ＤｉｆｆおよびＮＲＢＣを同時に分析するために、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光を使用するＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００機器などの自動血液学的測定システムで使用できる、安定化したＲＢＣ、血小板、好中球、リンパ球、好酸球、好塩基球およびＮＲＢＣ成分を含有する安定な血液学的基準対照を提供することである。
【００１８】
広範には、本発明は、安定なＷＢＣおよびＮＲＢＣ成分ならびにこれらの成分を一つまたは複数含有する血液学的基準対照溶液の製造方法に関する。この方法では、ヒト全血細胞の電子光学信号と類似の信号を発生する、しっかりと固定し、安定化したＷＢＣおよび模倣ＮＲＢＣが製造され、その結果、新鮮なヒト血液試料用の分析器で使用するものと同じアルゴリズムを使用する完全なＷＢＣ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣ分析が可能となる。本発明方法で製造される固定したＷＢＣおよび模倣ＮＲＢＣはクランプを含まず、適当な血漿様媒質中で冷蔵下、長期にわたり安定であり、多パラメータ光散乱を使用する機器などの日常的な臨床血液学測定機器のＷＢＣ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣ用の血液学的対照として使用できる。これらの利点は従来技術に対する実質的な改良に相当する。
【００１９】
図面の簡単な説明
本発明およびその利点ををより完全に理解するために、添付図面と共に以下の説明を参照する。
【００２０】
第１ａ図〜第１ｃ図は、多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【００２１】
第２ａ図〜第２ｃ図は、１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【００２２】
第３ａ図〜第３ｃ図は、４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【００２３】
第４ａ図〜第４ｃ図は、Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標） ４Ｃ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２４】
第５ａ図〜第５ｃ図は、正常レベルのＳｔｒｅｃｋ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ １２（登録商標） Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２５】
第６ａ図〜第６ｄ図は、Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標） Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２６】
第７ａ図〜第７ｃ図は、本発明の血液学的基準対照について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２７】
第８ａ図〜第８ｃ図は、本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２８】
第９ａ図〜第９ｃ図は、第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００２９】
第１０ａ図〜第１０ｃ図は、本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３０】
第１１ａ図〜第１１ｃ図は、第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３１】
第１２ａ図〜第１２ｃ図は、本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３２】
第１３ａ図〜第１３ｃ図は、第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３３】
第１４ａ図〜第１４ｃ図は、本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３４】
第１５ａ図〜第１５ｃ図は、本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３５】
第１６ａ図〜第１６ｃ図は、すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３６】
第１７ａ図〜第１７ｄ図は、本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【００３７】
第１８ａ図〜第１８ｄ図は、対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
細胞を検出し、分類するための自動システムではいずれも、そのシステムが適切に作動していることを確認するために基準対照の使用が必要である。これはどんな検出システムを使用した場合にもいえる。
【００３９】
新しい検出方式、主として試料中のＷＢＣのサブポピュレーションおよびＮＲＢＣを分類し、識別するために多角度／パラメータ光散乱信号のみを使用する（他のすべての非光信号を除く）検出方式が出現したため、新しい対照が必要となった。当業界の現在の基準対照はこのような多パラメータシステムで適切に機能しない。
【００４０】
本発明者らは、現在の対照が、多角度光散乱に基づく血液学的分析器で機能しない理由を発見し、機能する対照を製造する方法を考案した。本発明の対照は多パラメータ光散乱に基づくシステムで機能するだけではなく、他の検出法に基づくシステムでも機能するはずである。これは、新しい対照の細胞が、処理しただけの血液試料中で認められる細胞と同じであるためである。従って、新しい対照の細胞はそれらの細胞の光散乱特性を保持している。
【００４１】
本発明の基準対照縣濁液の細胞性成分は、多パラメータ光散乱に基づく検出システムにかけると、全血試料中のＷＢＣまたはＮＲＢＣの多パラメータ光散乱特性を実質的に模倣する。
【００４２】
本発明では、多パラメータ、多角度または多次元光散乱とは、当該細胞を測定または分類するために、偏光および偏光解消光９０゜光散乱および軸方向の光の消失の信号およびこれらを組み合わせたもののみ（すなわち、非の付くものを除く）を使用することを含む。この測定には、その他の光ベースではない信号は使用できない。蛍光などのその他の種類の光信号も使用できるが、インピーダンスおよびその他の光ベースではない信号は使用できない。しかし、例えば、光ベースではない信号、または光散乱とインピーダンスとの組み合わせを使用する機器にも本発明の対照は役立つが、現在のところ、多角度光散乱に基づく測定機器には、利用できるこのような対照がないため、このような機器に最も役立つであろう。
【００４３】
本発明の対照縣濁液のＷＢＣ成分は、（血液試料を分析していた分析器内における環境と同様な）非常に緩和な溶解環境におき、次いで固定してある血液から得たＷＢＣである。ＮＲＢＣ成分についても同様であり、核を溶解環境に露出し、固定してその細胞特性を保存する。しかし、ＮＲＢＣ成分については、哺乳類の有核赤血球は遊離した核の源として使用できる唯一の細胞ではない。鳥類または魚類の赤血球もこの分画に使用できる。
【００４４】
対照細胞が当該細胞の光散乱特性を模倣できるのは、先ず、細胞組成（すなわち光散乱特性）により細胞を選択したためである。製造プロセスの間に、最初に緩和な溶解環境においてＲＢＣを溶解し、次いで、所望の細胞特性が溶解環境で破壊される前に、残存するＷＢＣおよびＮＲＢＣの核を固定することにより、対照細胞のこれらの細胞成分が保存される。この製造プロセスは、「本当の」血球が分析器の内部を通過する際におかれる環境を模倣している。対照細胞は「固定」されているため、分析器を通過するときに溶解環境の影響はそれほど受けず、その結果、所望の特性を保持する。さらに、固定した細胞は対照溶液中で安定であるが、全血細胞は安定ではない。しかし、細胞の光散乱特性を主として決定する屈折率が実質的に同じとなるようにするには、試料中の血球が分析器中でおかれる溶解環境と同じまたは同様の環境に対照細胞をおく必要があると考えられている。このように、対照細胞はその機器により、「機器で溶解した」当該細胞とみなされ、そのように記録される。
【００４５】
また、同じ本発明の細胞成分は、溶解環境におかれる前に「固定する」と、多角度光散乱に基づくシステムで満足に機能しないことも判明した。これらの細胞は「固定する」前に、溶解環境におく必要がある。その後、これらの細胞が分析中で対照細胞として処理されると、これらの処理された細胞は分析器によって当該の血球と「みなされる」。これは、多パラメータ光散乱に基づく分析器は、分析器の内部処理環境で全血細胞を認識するようにしかプログラムされていないためである。従って、基準の対照細胞または細胞成分が適当な細胞特性を保持しており、その結果、全血と実質的に同様に反応または行動（光および／または蛍光を散乱）しない限り、分析器によって異なる細胞であるまたは完全に認識できないと「みなされる」。
【００４６】
従って、本発明の主な方法では、細胞または細胞成分を、「固定」の前に、基準対照を製造するプロセスの間、基準対照として使用されるときに、分析器内で遭遇するであろう溶解環境におく。
【００４７】
以下の実施例では、次の試薬処方を使用した。
（実施例）
【００４８】
溶解試薬：
約０．７５Ｍ〜約１．１０Ｍの塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）
約０．１Ｍ〜約０．４Ｍのホルムアルデヒド（ＨＣＨＯ）
約１０ｍＭ〜約２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）
約１０ｍＭ〜約２５ｍＭの重炭酸カリウム（ＫＨＣＯ３）
約５０ｍｇ／Ｌ〜約２５０ｍｇ／Ｌのサポニン
約０．２ｇ／Ｌ〜約０．４ｇ／ＬのＰｒｏｃｌｉｎ ３００
ＷＢＣ−Ｃｙｔｏ−Ｌｙｓｅ：
約２．５ｇ／Ｌ〜約５．０ｇ／Ｌのマレイン酸、コハク酸またはフタル酸
約１０．０ｇ／Ｌから約３０．０ｇ／ＬのＢｒｉｊ ３５、Ｔｗｅｅｎ ２０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
固定剤：
約３．０ｇ／Ｌから約５．０ｇ／Ｌのリン酸一ナトリウム
約６．０ｇ／Ｌから約７．０ｇ／Ｌのリン酸二ナトリウム
約１００ｍｌ／Ｌから約２００ｍｌ／Ｌのホルマリン（３７〜４０％のホルムアルデヒド溶液）
第２ａ図〜第２ｃ図および第３ａ図〜第３ｃ図は各々、ＮＲＢＣ
を１．７８ｋ／ｍＬおよび４０．４ｋ／ｍＬ含む臨床血液試料についてＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００多パラメータ光散乱ベースのシステムで得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣ分布のサイトグラムである。これらの図面は、本明細書の図面中に記載され、示された種々の方法で製造される対照または細胞との比較の目的で示している。
【００４９】
本発明の鳥類、魚類および哺乳類の固定したＷＢＣおよび細胞の核は挿入物のため、任意の緩衝食塩水に再縣濁でき、緩衝食塩水はクランピングを防止するなんらかのタンパク質を含んでいてもよい。しかし、これらの固定した細胞は、全域対応型血液学的対照を製造するためには、固定していないが、安定化したＲＢＣと合わせる必要があり、細胞再縣濁媒質は安定化したＲＢＣを溶解から保護できなければならない。下記の処方は、本発明の対照細胞と共に良好に使用できることが判っている再縣濁用媒質の例である。この処方は、固定したＷＢＣおよび核のクランピングを防ぎ、対照溶液中のＲＢＣ成分を溶解から保護する血漿様細胞再縣濁液である。
【００５０】
【表２】
【００５１】
本発明方法で製造した血液学的対照を、多次元光散乱、軸方向の光の消失および蛍光によりＷＢＣ／Ｄｉｆｆ／ＮＲＢＣを分析するＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器で使用すると、試薬と共にシステムの性能を毎日モニターできる。Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００システムでこの製品を使用して結果の質をモニターできるパラメータは以下の通りである。
【００５２】
【表３】
【実施例１】
【００５３】
この実施例では、上記の溶解試薬および固定剤を使用する。以下の手順で、安定で、クランプを含まない、固定したヒトＷＢＣを調製する。この実施例の固定したヒトＷＢＣについてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器で得られたＷＢＣのサイトグラムの例を第７ａ図〜第７ｃ図に示す。
１．ヒトのバフィコート層１部を（予め４２℃に温めた）溶解試薬５部と混合した。直ちに、緩和に渦状に回転させて、成分を混合し、室温に５０秒間放置して、ＲＢＣを完全に溶解させた。
２．ステップ１の溶解したＷＢＣ縣濁液１部を固定剤１０部と混合し、直ちに６０℃〜７０℃の水浴に入れ、ゆっくりと混合することにより１０分間固定させた。
３．固定させた細胞の縣濁液を室温に冷却し、１０℃で、２，５００ｒｐｍで５分間遠心して、固定剤を除去し、中性ｐＨの等張リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用して、同じ遠心速度で３回洗浄した後、ＣＲＳＭに再縣濁させた。
４．最終生成物のアリコートをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器にかけて、ＷＢＣ数および分布を調べた。
５．固定した細胞の濃度を、正常レベルの対照については、最終濃度が再縣濁用媒質中約７，５００／μＬとなるよう調整した。
【実施例２】
【００５４】
実施例１に使用したものと同じ溶解試薬および固定試薬を使用したが、ＲＢＣの溶解およびＷＢＣの固定を下記プロトコールに従って実施した。
１．ヒトのバフィコート層１部を溶解試薬溶液５部と共に緩和に渦状に回転させて、直ちに混合させ、室温に１０分間放置して、ＲＢＣを完全に溶解させた。
２．ステップ１の溶解したＷＢＣ縣濁液１部を固定剤１０部と合わせ、混合し、室温で２〜３時間固定した。
３．固定した細胞の縣濁液を１０℃、２，５００ｒｐｍで５分間遠心して、固定剤を除去し、中性ｐＨのリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用して、同じ遠心速度で３回洗浄し、ＣＲＳＭに再縣濁した。
４．最終生成物のアリコートをＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器にかけて、ＷＢＣ数および分布を調べた。
５．固定した細胞の濃度を、低濃度の対照については、最終濃度が約２，０００／μＬとなるように調整した。
【実施例３】
【００５５】
次のプロトコールおよびＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器の例示に従ってシチメンチョウの赤血球からＮＲＢＣ分画を調製した。固定したシチメンチョウの赤血球の核および固定したシチメンチョウの赤血球の核でスパイクした正常ヒトのＮＲＢＣサイトグラムを各々第１２ａ図〜第１２ｅ図および第１３ａ図〜第１３ｃ図に示す。
Ａ．材料：
１．シチメンチョウ全血
２．溶解試薬：実施例１に記載の通り
３．固定剤：ｗ／デキストロース：リン酸一ナトリウム ４グラム／Ｌ、リン酸二ナトリウム ６．５グラム／Ｌ、ホルマリン １５０ｍｌ／Ｌ、デキストロース １００ｇ／Ｌ、ｐＨ約６．８
４．細胞洗浄液：リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）
５．ＣＲＳＭ：上記と同じＣＲＳＭ
Ｂ．シチメンチョウ赤血球核固定用プロトコール：
１．リジン試薬のアリコート１０ｍｌを３７℃まで加温する。
２．シチメンチョウ全血を３０００ｒｐｍで１０分間遠心して、血漿層を分離し、バフィコート層を除去する。濃縮赤血球層に血漿を戻し、混合する。
３．予熱した溶解試薬溶液にＲＢＣ層１．０ｍｌを加え、蓋をして、直ちに３回上下混合する。全速で約１０秒間渦状に回転させ、ＲＢＣの細胞質の溶解を促進する。約１０分間または細胞質の溶解が完了するまで室温に放置する。細胞質が完全に溶解していることを顕微鏡下で確認する。
４．２０００ｒｐｍで１５分間遠心し、細胞ペレットを再縣濁するのに調度十分な量を残して、上清をすべてサイホンで除去する。細胞のクランプが見えなくなるまで緩和に攪拌して細胞を再懸濁する。
５．ステップ４と同じ遠心条件でＰＢＳを使用して、細胞を３回洗う。
６．固定剤１０ｍｌを加え、混合し、直ちに６０℃の水浴に入れ、細胞のクランピングを防ぐために撹拌を続けながら、少なくとも５分間固定させる。
７．細胞縣濁液を室温に３０分または一晩放置する。
８．混合し、ステップ４および５を２回繰り返す。
９．固定した核をＣＲＳＭに再縣濁する。
１０．Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器にかけて、ＦＬ３＋の核の濃度とクラスタの位置を測定する。
【実施例４】
【００５６】
実施例３に記載したものと同じ試薬およびプロトコールを使用して、マスの赤血球からＮＲＢＣ分画を調製した。固定したマスの赤血球の核および固定したマスの赤血球の核でスパイクした正常な全血をＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器にかけて得られたＮＲＢＣサイトグラムの例を第８ａ図〜第８ｃ図および第９ａ図〜第９ｃ図に示す。
【実施例５】
【００５７】
下記の材料および方法によりブタのリンパ球からＮＲＢＣ分画を調製し、固定したブタのリンパ球の核をＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器にかけて得られたＮＲＢＣサイトグラムの例を第１４ａ図〜第１４ｃ図に示す。
Ａ．材料：
ブタのバフィコート層（血小板を既に除去したもの）
Ｃｙｔｏ−Ｌｙｓｅ：
Ｂｒｉｊ ３５：１５．０ｇ／Ｌ
フタル酸：５．５ｇ／Ｌ
溶解試薬：実施例１と同様
固定剤：実施例１と同様
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）
Ｂ．手順：
１．ブタのリンパ球高含有層１部を溶解試薬５部で希釈し、室温に５分間放置して、細胞縣濁液に残っているＲＢＣの溶解を完了させる。
２．細胞縣濁液を３０００ｒｐｍで３回遠心し、上清を注ぎ出し、細胞ペレットを取り出す。
３．この細胞をＣｙｔｏ−Ｌｙｓｅと１対１０の比で混合し、室温に２時間放置する。
４．核をＣｙｔｏ−Ｌｙｓｅに再縣濁し、３０００ｒｐｍで３分間回転させ、上清を注ぎ出す。
５．核を少なくとも２倍容の固定剤に再縣濁し、混合する。
６．６０℃で１０分間（または室温で４時間）固定し、室温に冷却する。
７．核を３０００ｒｐｍで３分間回転させ、上清を注ぎ出す。
８．細胞ペレットをＰＢＳに再縣濁し、核を３回洗浄する。
９．核をＣＲＳＭに再縣濁する。
【実施例６】
【００５８】
ウシのＷＢＣを実施例１に記載のプロトコールで固定し、実施例４に記載の手順に従って調製した固定したブタの核と混合する。固定したウシのＷＢＣのみおよびブタのリンパ球核と混合した固定したウシのＷＢＣについてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器で得られたＷＢＣチャネルサイトグラムの例を第１５ａ図〜第１５ｃ図および第１６ａ図〜第１６ｆ図に示す。
【実施例７】
【００５９】
実施例３に記載のプロトコールに従ってニワトリの赤血球からＮＲＢＣ分画を調製し、固定したニワトリの赤血球核および固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常なヒトの全血についてＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ４０００血液学的測定機器で得られたＮＲＢＣサイトグラムの例を第１０ａ図〜第１０ｃ図および第１１ａ図〜第１１ｃ図に示す。
【００６０】
本発明の方法で製造した血液学的対照は、Ｃｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ３０００または３５００血液学的測定機器にかけて次のパラメータをモニターするのに使用できる。上記機器は光散乱およびインピーダンス信号の両者を使用して、次のＷＢＣ／Ｄｉｆｆパラメータを追跡できる。
【００６１】
【表４】
【００６２】
第１７ａ図〜第１７ｄ図は、本発明方法で製造した、固定したウシＷＢＣについて、光散乱パラメータ（軸方向の光の消失または蛍光ではない）を使用してＷＢＣ／Ｄｉｆｆ分析を実施し、インピ−ダンスを使用してＲＢＣおよび血小板を測定するＣｅｌｌ−Ｄｙｎ（登録商標） ３５００分析機器で得たＷＢＣサイトグラムである。この図では、ＷＢＣ分画と、固定した血小板および安定化したが固定していないＲＢＣとを合わせて、全域対応型対照縣濁液を製造した。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１ａ】多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【図１ｂ】多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【図１ｃ】多角度光散乱に基づく分析器で実施した正常血のＷＢＣサイトグラムである。
【図２ａ】１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図２ｂ】１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図２ｃ】１．７８ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図３ａ】４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図３ｂ】４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図３ｃ】４０．４Ｋ／μＬのＮＲＢＣを含有する臨床試料について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣ／ＮＲＢＣサイトグラムである。
【図４ａ】Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標） ４Ｃ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図４ｂ】Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標） ４Ｃ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図４ｃ】Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標） ４Ｃ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図５ａ】正常レベルのＳｔｒｅｃｋ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ １２（登録商標） Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図５ｂ】正常レベルのＳｔｒｅｃｋ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ １２（登録商標） Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図５ｃ】正常レベルのＳｔｒｅｃｋ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのＰＡＲＡ １２（登録商標） Ｍｕｌｔｉ−Ｐａｒａｍｅｔｅｒ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ａ】Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標） Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ｂ】Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標） Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ｃ】Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標） Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図６ｄ】Ｒ＆Ｄ ＳｙｓｔｅｍのＣＢＣ−３Ｋ（商標） Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｎｔｒｏｌについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図７ａ】本発明の血液学的基準対照について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図７ｂ】本発明の血液学的基準対照について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図７ｃ】本発明の血液学的基準対照について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図８ａ】本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図８ｂ】本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図８ｃ】本発明方法で製造した固定したマスの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図９ａ】第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図９ｂ】第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図９ｃ】第８ａ図〜第８ｃ図の固定したマスの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１０ａ】本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１０ｂ】本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１０ｃ】本発明方法で製造した固定したニワトリの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１１ａ】第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１１ｂ】第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１１ｃ】第１０ａ図〜第１０ｃ図の固定したニワトリの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１２ａ】本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１２ｂ】本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１２ｃ】本発明方法で製造した固定したシチメンチョウの赤血球核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１３ａ】第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１３ｂ】第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１３ｃ】第１２ａ図〜第１２ｃ図の固定したシチメンチョウの赤血球核でスパイクした正常な全血について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１４ａ】本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１４ｂ】本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１４ｃ】本発明方法で製造した固定したブタのリンパ球の核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１５ａ】本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１５ｂ】本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１５ｃ】本発明方法で製造したウシのＷＢＣの核について多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ａ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｂ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｃ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｄ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｅ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１６ｆ】すべての操作は本発明に従って実施した、固定したブタのリンパ球でスパイクした固定したウシＷＢＣについて多角度光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ａ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ｂ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ｃ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１７ｄ】本発明方法で製造した固定したウシのＷＢＣについてインピーダンスと光散乱の両者を使用する分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ａ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ｂ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ｃ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【図１８ｄ】対照細胞として固定したワニのＲＢＣを含有する対照細胞溶液について、多パラメータ光散乱に基づく分析器で得られたＷＢＣサイトグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に哺乳類の白血球（ＷＢＣ）からなるＷＢＣ分画を含む血液学的対照懸濁液であって、前記哺乳類ＷＢＣが当該細胞の細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した細胞性多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記哺乳類ＷＢＣを溶解し、細胞を固定する固定プロセスにかけてある血液学的対照懸濁液。
【請求項２】
さらに有核赤血球（ＮＲＢＣ）を含み、ＮＲＢＣ分画の細胞が鳥類の赤血球、魚類の赤血球および哺乳類のリンパ球からなる群から選択され、選択された細胞が当該ＮＲＢＣの細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記選択された細胞を、細胞質を溶解し、核を固定する溶解および固定プロセスにかけてある請求の範囲第１項に記載の血液学的対照懸濁液。
【請求項３】
安定化した赤血球（ＲＢＣ）分画と、
安定化した血小板（ＰＬＴ）分画と、
安定化した白血球（ＷＢＣ）分画と、
再縣濁および保存用媒質と
を含む血液学的全血対照縣濁液であって、ＷＢＣ分画が当該細胞の細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した細胞性多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記哺乳類ＷＢＣを、細胞を固定する溶解および固定プロセスにかけてある血液学的全血対照縣濁液。
【請求項４】
さらに有核赤血球（ＮＲＢＣ）分画を含み、ＮＲＢＣ分画の細胞が鳥類の赤血球、魚類の赤血球および哺乳類のリンパ球からなる群から選択され、選択された細胞が当該ＮＲＢＣの細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記選択された細胞を、細胞質を溶解し、核を固定する溶解および固定プロセスにかけてある請求の範囲第３項に記載の血液学的縣濁液。
【請求項５】
血液学的対照溶液の白血球（ＷＢＣ）分画を製造する方法であって、
ａ．哺乳類の全血またはバフィコート層を提供するステップと、
ｂ．全血と溶解試薬とを、血液またはバフィコート層約１部に対して溶解試薬約１２部の割合で約１分間から５分間合わせて、存在する赤血球を除去し、ここで、溶解試薬は溶解物約１部に対して希釈剤約１２部の割合で存在するステップと、
ｃ．ステップｂの溶解し、希釈した細胞縣濁液を固定剤と合わせて、約６０℃〜約７０℃で約１０分間までインキュベートして、細胞を固定し、安定化させるステップと、
ｄ．ステップｃの混合物を室温まで冷却し、沈殿させるステップと、
ｅ．ステップｄで形成された上清を捨て、ステップｂおよびｃの活性試薬を除去するのに十分、得られた固定細胞を洗浄するステップと、
ｆ．固定し、洗浄した細胞を、固定細胞の長期保存に適した再縣濁用媒質に再縣濁するステップと
を含む方法。
【請求項６】
血液学的対照溶液の有核赤血球分画を製造する方法であって、
ａ．全血または鳥類および魚類の赤血球からなる群から選択される赤血球を提供するステップと、
ｂ．赤血球と溶解試薬を、赤血球１部に対して溶解試薬約１２部の割合で、約１分〜５分間合わせて核を露出させるステップと、
ｃ．ステップｂの溶解し、希釈した細胞縣濁液と固定剤とを合わせ、約６０℃〜約７０℃で約１０分間インキュベートして、核を固定し、安定化し、ここで固定剤と細胞縣濁液の比は約１：８から約１：１１であるステップと、
ｄ．ステップｃの混合物を室温まで冷却し、縣濁液を沈殿させるステップと、
ｅ．ステップｄで形成された上清を捨て、ステップｂおよびｃの活性試薬を除去するのに十分、得られた固定した核を洗うステップと、
ｆ．固定し、洗浄した核を固定した核の長期保存に適する再縣濁用媒質に再縣濁するステップと
を含む方法。
【請求項７】
血液学的対照溶液の有核赤血球分画を製造する方法であって、
ａ．哺乳動物のリンパ球を提供するステップと、
ｂ．リンパ球と溶解試薬を、リンパ球と溶解試薬との比約１：５から約１：３０で、約５分〜３時間合わせて核を露出させるステップと、
ｃ．ステップｂの核縣濁液と固定剤とを合わせ、約５５℃〜約６０℃で約１０分間インキュベートして、核を固定し、安定化し、ここで固定剤と細胞縣濁液の比は約１：１から約１：１０であるステップと、
ｄ．ステップｃの混合物を室温まで冷却し、縣濁液を沈殿させるステップと、
ｅ．ステップｄで形成された上清を捨て、ステップｂおよびｃの活性試薬を除去するのに十分、得られた固定した核を洗うステップと、
ｆ．固定し、洗浄した核を固定した核の長期保存に適する再縣濁用媒質に再縣濁するステップと
を含む方法。
【請求項１】
本質的に哺乳類の白血球（ＷＢＣ）からなるＷＢＣ分画を含む血液学的対照懸濁液であって、前記哺乳類ＷＢＣが当該細胞の細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した細胞性多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記哺乳類ＷＢＣを溶解し、細胞を固定する固定プロセスにかけてある血液学的対照懸濁液。
【請求項２】
さらに有核赤血球（ＮＲＢＣ）を含み、ＮＲＢＣ分画の細胞が鳥類の赤血球、魚類の赤血球および哺乳類のリンパ球からなる群から選択され、選択された細胞が当該ＮＲＢＣの細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記選択された細胞を、細胞質を溶解し、核を固定する溶解および固定プロセスにかけてある請求の範囲第１項に記載の血液学的対照懸濁液。
【請求項３】
安定化した赤血球（ＲＢＣ）分画と、
安定化した血小板（ＰＬＴ）分画と、
安定化した白血球（ＷＢＣ）分画と、
再縣濁および保存用媒質と
を含む血液学的全血対照縣濁液であって、ＷＢＣ分画が当該細胞の細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した細胞性多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記哺乳類ＷＢＣを、細胞を固定する溶解および固定プロセスにかけてある血液学的全血対照縣濁液。
【請求項４】
さらに有核赤血球（ＮＲＢＣ）分画を含み、ＮＲＢＣ分画の細胞が鳥類の赤血球、魚類の赤血球および哺乳類のリンパ球からなる群から選択され、選択された細胞が当該ＮＲＢＣの細胞性多角度光散乱特性と同様の予め設定した多角度光散乱特性を有しており、所望の細胞特性が破壊される前に、前記選択された細胞を、細胞質を溶解し、核を固定する溶解および固定プロセスにかけてある請求の範囲第３項に記載の血液学的縣濁液。
【請求項５】
血液学的対照溶液の白血球（ＷＢＣ）分画を製造する方法であって、
ａ．哺乳類の全血またはバフィコート層を提供するステップと、
ｂ．全血と溶解試薬とを、血液またはバフィコート層約１部に対して溶解試薬約１２部の割合で約１分間から５分間合わせて、存在する赤血球を除去し、ここで、溶解試薬は溶解物約１部に対して希釈剤約１２部の割合で存在するステップと、
ｃ．ステップｂの溶解し、希釈した細胞縣濁液を固定剤と合わせて、約６０℃〜約７０℃で約１０分間までインキュベートして、細胞を固定し、安定化させるステップと、
ｄ．ステップｃの混合物を室温まで冷却し、沈殿させるステップと、
ｅ．ステップｄで形成された上清を捨て、ステップｂおよびｃの活性試薬を除去するのに十分、得られた固定細胞を洗浄するステップと、
ｆ．固定し、洗浄した細胞を、固定細胞の長期保存に適した再縣濁用媒質に再縣濁するステップと
を含む方法。
【請求項６】
血液学的対照溶液の有核赤血球分画を製造する方法であって、
ａ．全血または鳥類および魚類の赤血球からなる群から選択される赤血球を提供するステップと、
ｂ．赤血球と溶解試薬を、赤血球１部に対して溶解試薬約１２部の割合で、約１分〜５分間合わせて核を露出させるステップと、
ｃ．ステップｂの溶解し、希釈した細胞縣濁液と固定剤とを合わせ、約６０℃〜約７０℃で約１０分間インキュベートして、核を固定し、安定化し、ここで固定剤と細胞縣濁液の比は約１：８から約１：１１であるステップと、
ｄ．ステップｃの混合物を室温まで冷却し、縣濁液を沈殿させるステップと、
ｅ．ステップｄで形成された上清を捨て、ステップｂおよびｃの活性試薬を除去するのに十分、得られた固定した核を洗うステップと、
ｆ．固定し、洗浄した核を固定した核の長期保存に適する再縣濁用媒質に再縣濁するステップと
を含む方法。
【請求項７】
血液学的対照溶液の有核赤血球分画を製造する方法であって、
ａ．哺乳動物のリンパ球を提供するステップと、
ｂ．リンパ球と溶解試薬を、リンパ球と溶解試薬との比約１：５から約１：３０で、約５分〜３時間合わせて核を露出させるステップと、
ｃ．ステップｂの核縣濁液と固定剤とを合わせ、約５５℃〜約６０℃で約１０分間インキュベートして、核を固定し、安定化し、ここで固定剤と細胞縣濁液の比は約１：１から約１：１０であるステップと、
ｄ．ステップｃの混合物を室温まで冷却し、縣濁液を沈殿させるステップと、
ｅ．ステップｄで形成された上清を捨て、ステップｂおよびｃの活性試薬を除去するのに十分、得られた固定した核を洗うステップと、
ｆ．固定し、洗浄した核を固定した核の長期保存に適する再縣濁用媒質に再縣濁するステップと
を含む方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図６ｄ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１５ｃ】
【図１６ａ】
【図１６ｂ】
【図１６ｃ】
【図１６ｄ】
【図１６ｅ】
【図１６ｆ】
【図１７ａ】
【図１７ｂ】
【図１７ｃ】
【図１７ｄ】
【図１８ａ】
【図１８ｂ】
【図１８ｃ】
【図１８ｄ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図２ｃ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図５ｃ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図６ｃ】
【図６ｄ】
【図７ａ】
【図７ｂ】
【図７ｃ】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図８ｃ】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図９ｃ】
【図１０ａ】
【図１０ｂ】
【図１０ｃ】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１２ｃ】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図１３ｃ】
【図１４ａ】
【図１４ｂ】
【図１４ｃ】
【図１５ａ】
【図１５ｂ】
【図１５ｃ】
【図１６ａ】
【図１６ｂ】
【図１６ｃ】
【図１６ｄ】
【図１６ｅ】
【図１６ｆ】
【図１７ａ】
【図１７ｂ】
【図１７ｃ】
【図１７ｄ】
【図１８ａ】
【図１８ｂ】
【図１８ｃ】
【図１８ｄ】
【公開番号】特開２００８−２６３１７（Ｐ２００８−２６３１７Ａ）
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００７−１８２８４９（Ｐ２００７−１８２８４９）
【出願日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【分割の表示】特願平１０−５０３０２９の分割
【原出願日】平成９年５月２９日（１９９７．５．２９）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８２８４９（Ｐ２００７−１８２８４９）
【出願日】平成１９年７月１２日（２００７．７．１２）
【分割の表示】特願平１０−５０３０２９の分割
【原出願日】平成９年５月２９日（１９９７．５．２９）
【出願人】（３９１００８７８８）アボット・ラボラトリーズ (650)
【氏名又は名称原語表記】ＡＢＢＯＴＴ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]