非常に大きい規模の固定化されたポリマーの合成
【課題】支持体上で多くのポリマー配列を合成するための反応器システムの提供。
【解決手段】支持体上で多くのポリマー配列を合成するための反応器システムであって：
ａ）前記支持体に反応流体を接触するための反応器；ｂ）前記反応器に選択された反応流体を送るためのシステム；ｃ）少なくとも第１相対位置から第２相対位置に対してマスク又は支持体を移動するための並進段階；ｄ）マスクを通して前記支持体を選択された時間で照射するための光；ｅ）前記反応器システムからの流体の流れを選択的に方向付けし、前記並進段階を選択的に活性化し、そして前記支持体上で多くの多様なポリマー配列を予定された位置で形成するために前記支持体を選択的に照射するための適切にプログラムされたディジタル型コンピューターを含んで成る反応器システム。
【解決手段】支持体上で多くのポリマー配列を合成するための反応器システムであって：
ａ）前記支持体に反応流体を接触するための反応器；ｂ）前記反応器に選択された反応流体を送るためのシステム；ｃ）少なくとも第１相対位置から第２相対位置に対してマスク又は支持体を移動するための並進段階；ｄ）マスクを通して前記支持体を選択された時間で照射するための光；ｅ）前記反応器システムからの流体の流れを選択的に方向付けし、前記並進段階を選択的に活性化し、そして前記支持体上で多くの多様なポリマー配列を予定された位置で形成するために前記支持体を選択的に照射するための適切にプログラムされたディジタル型コンピューターを含んで成る反応器システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は次の米国特許出願に関係する：米国特許出願第４９２，４６２号、出願日１９９０年３月７日；米国特許出願第３６２，９０１号、出願日１９８９年６月７日；米国特許出願第６２４，１２０号、出願日１９９０年１２月６日；米国特許出願第６２６，７３０号、出願日１９９０年１２月６日；および米国特許出願第６２４，１１４号、出願日１９９０年１２月６日。これらの出願の各々をすべての目的のためにここに引用によって加える。この出願は、また、１９９０年１２月１３日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９０／１５０７０号に関係し、そしてこれをまたすべての目的のためにここに引用によって加える。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明はポリマーの合成の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は反応器システム、マスキング法、光除去可能な保護基、データの収集およびプロセシング技術、および支持体上の多様なポリマー一配列の光統制（１ｉｇｈｔ ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成のための応用を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（項目１） 支持体上で多くのポリマー配列を合成するための反応器システムであって：
ａ）前記支持体に反応流体を接触するための反応器；
ｂ）前記反応器に選択された反応流体を送るためのシステム；
ｃ）少なくとも第１相対位置から第２相対位置に対してマスク又は支持体を移動するための並進段階；
ｄ）マスクを通して前記支持体を選択された時間で照射するための光；
ｅ）前記反応器システムからの流体の流れを選択的に方向付けし、前記並進段階を選択的に活性化し、そして前記支持体上で多くの多様なポリマー配列を予定された位置で形成するために前記支持体を選択的に照射するための適切にプログラムされたディジタル型コン
ピューターを含んで成る反応器システム。
（項目２） ポリマー配列の初期スクリーニングのために使用される前記支持体に反応流体における多くのモノマーを供給するように適合される第１項記載の反応器システム。
（項目３） 試薬の連続的な添加により多くのポリマー配列を形成するための規則方法であって、二段階合成手段を用いて前記多くのポリマー配列の一部を前記ポリマー配列の他の一部の添加のために連続的に保護し、そして保護解除する段階を含んで成る方法。
（項目４） 前記二段階合成手段が二段階マスキング手段である第３項記載の方法。
（項目５） 前記マスキング手段が、マスクが、前もって照射された部分の一部を光から保護し、そして前もって保護された部分の一部を光に照射することによって、前のマスクの代理をする、少なくとも２つの連続的段階を提供する第４項記載の方法。
（項目６） 前記マスキング手段における少なくとも２つの連続的段階が前記支持体上の対象の領域の約半分を照射することを含んで成る第４項記載の方法。
（項目７） 前記マスキング手段が単一の支持体上に多くのポリマー配列を形成することを含んで成る第４項記載の方法。
（項目８） 前記マスクが、多くの合成部位の個々上に１つの端面照射を有するグレイコードマスキング手段により配置される第４項記載の方法。
（項目９） 前記マスキング手段が、多くの合成されるポリマーのために最少数のマスキング段階に起因する第４項記載の方法。
（項目１０） 長さ１のすべての可能なポリマーが与えられた基本組のモノマーにより形成される第４項記載の方法。
（項目１１） 前記マスキング手段が、ポリマーの少なくとも所望する基本組及び長さを入力する適切にプログラムされたディジタル型コンピューターで開発される第４項記載の方法。
（項目１２） １よりも短い又は１に等しい長さのすべての可能なポリマーが与えられた基本組のモノマーにより形成される第４項記載の方法。
（項目１３） 非二段階マスキング手段により前記ポリマーの一部を形成する段階をさらに含んで成る第４項記載の方法。
（項目１４） マスキング手段を出力する段階をさらに含んで成る第１０項記載の方法。
（項目１５） 前記支持体上に合成されたポリマーの地図を出力する段階をさらに含んで成る第１０項記載の方法。
（項目１６） 前記地図が図９の形で存在する第１５項記載の方法。
（項目１７） 結合親和性研究への使用のために多くのリンカーポリマーをスクリーニングするための方法であって：
ａ）選択された領域における支持体上に多くのリンカーポリマーを形成し、ここで前記ポリマーが：
ｉ）支持体の表面上で、保護基を除去するために前記選択された領域の一部を照射し；そして
ｉｉ）前記表面とモノマーとを接触せしめる回帰的段階により形成され；
ｂ）前記多くのリンカーポリマーとリガンドとを接触せしめ；そして
ｃ）前記リガンドとラベルされたレセプターとを接触せしめる段階を含んで成る方法。
（項目１８） 前記リガンドがポリペプチドである第１７項記載の方法。
（項目１９） 前記レセプターが抗体である第１７項記載の方法。
（項目２０） 前記段階ｉｉ）で添加されるモノマーが前記回帰的段階の個々において同じであり、前記選択された領域が異なった長さのリンカー分子を含んで成る第１７項記載の方法。
（項目２１） 前記ラベルされたレセプターがフルオレセイン化されたレセプターである第１７項記載の方法。
（項目２２） リガンドに対するレセプターの親和性を決定するためのシステムであって：
ａ）予定された位置で多くのリガンドを含んで成る支持体の表面に光を適用するための手段、ここで前記直接光を適用するための手段が前記多くの予定された位置で同時照射を提供し；及び
ｂ）前記多くの予定された位置で螢光を検出するためのずらりと並んだ検出器を含んで成るシステム。
（項目２３） 前記光を適用するための手段が点光源及び実質的に直線路にそって前記点光源の焦点を合わすための円柱状レンズを含んで成る第２２項記載のシステム。
（項目２４） 前記ずらりと並んだ検出器が直線状アレイを含んで成る第２２項記載のシステム。
（項目２５） 前記ずらりと並んだ検出器が直線状ＣＣＤアレイを含んで成る第２２項記載のシステム。
（項目２６） ディジタルコンピューターにおいて、リガンドに対して結合レセプターの傾向を検出するための方法であって：
ａ）既知位置での領域において多くのリガンドを含んで成る支持体に螢光ラベルされたレセプターを暴露し；
ｂ）前記個々の領域内の多くのデータ収集点で、前記データ収集点から螢光の量を決定し；
ｃ）予定された統計学的分布から設定量からずれる前記データ収集点を除去し；そして
ｄ）残存するデータ収集点に対する前記レセプターの相対的結合親和性を決定することを含んで成る方法。
（項目２７） 前記予定された統計学的分布が正規分布である第２６項記載の方法。
（項目２８） 下記式：
【０００４】
【化１】
【０００５】
［式中、ｎ＝０又は１であり；Ｙは天然又は非天然のアミノ酸のカルボキシル基の酸素原子、天然又は非天然のアミノ酸のアミノ基、又は天然又は非天然のデオキシリボ核酸又はリボ核酸のＣ−５’酸素基から成る群から選択され；Ｒ’及びＲ２は独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィド、又はホスフィド基であり；そしてＲ３はアルコキシ、アルキル、アリール、水素又はアルケニル基である］で表わされる化合物。
（項目２９） 前記Ｙが天然又は非天然のデオキシリボ核酸又はリボ核酸のＣ−５’酸素基である第２８項記載の化合物。
（項目３０） 前記ｎがゼロである第２９項記載の化合物。
（項目３１） 前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ水素原子である第２９項記載の化合物。
（項目３２） 前記Ｒ３が水素原子である第３１項記載の化合物。
（項目３３） 前記Ｒ３がメチル基である第３１項記載の化合物。
（項目３４） 前記Ｙがアミノ酸のカルボキシル基の酸素原子であり、そしてｎ−０である第２８項記載の化合物。
（項目３５） 前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ水素原子である第３４項記載の化合物。
（項目３６） 前記Ｒ３が水素原子である第３５項記載の化合物。
（項目３７） 前記Ｒ３がメチル基である第３５項記載の化合物。
（項目３８）下記式：
【０００６】
【化２】
【０００７】
［式中、ｎ−０又は１であり；Ｙは天然又は非天然のアミノ酸のアミノ基又は天然又は非天然のデオキシリボ核酸又はリボ核酸のＣ−５’酸素基から成る群から選択され；Ｒ１，Ｒ２及びＲ３が独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル・ハロゲン・ヒ
ドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィド又はホスフィド基であり；Ｒ４及びＲ５は独立して、アルコキシ、アルキル、水素原子、ハロ、アリール又はアルケニル基である］で表わされる化合物。
（項目３９） 前記Ｒ１〜Ｒ３がそれぞれ水素原子である第３８項記載の化合物。
（項目４０） 前記Ｒ４及びＲ５がそれぞれ水素原子である第３９項記載の化合物。
（項目４１） 前記Ｒ４及びＲ５がそれぞれメチル基である第３９項記載の化合物。
（項目４２） 下記式：
【０００８】
【化３】
【０００９】
［式中、ｎ−０又は１であり；Ｙは天然又は非天然のデオキシリボ核酸又はリボ核酸のＣ−５’酸素基であり；Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィド又はホスフィド基であり；そしてＲ５がアルコキシ、アルキル、アリール又はアルケニル基である）で表わされる化合物。
（項目４３） 前記Ｒ２及びＲ３がそれぞれメトキシ基である第４２項記載の化合物。
（項目４４） 前記Ｒ１及びＲ４がそれぞれ水素原子である第４３項記載の化合物。
（項目４５） 前記Ｒ５がメチル基である第４４項記載の化合物。
（項目４６） 下記式：
【００１０】
【化４】
【００１１】
［式中、ｎ−０又は１であり；Ｙは保護されるべき原子であり；Ｒ１及びＲ２は独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィド又はホスフィド基であり；そしてＲ３はアルコキシ、アルキル、アリール又はアルケニル基である］で表わされる化合物。
（項目４７） 前記Ｙが天然又は非天然のアミノ酸のカルボキシル基の酸素原子又は天然又は非天然のデオキシリボ核酸又はリボ核酸のＣ−５’酸素基、又は天然又は非天然のアミノ酸のアミノ基から成る群から選択される第４６項記載の化合物。
（項目４８） 前記Ｒ１及びＲ２が水素原子である第４７項記載の化合物。
（項目４９） 前記Ｒ３がメチル基である第４８項記載の化合物。
（項目５０） 下記式：
【００１２】
【化５】
【００１３】
［式中、Ｒは天然又は非天然のアミノ酸の側鎖であり、そしてＸは光除去できる保護基である］で表わされる化合物。
（項目５１） 前記Ｘが下記式：
【００１４】
【化６】
【００１５】
［式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４は独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド又はホスフィド基であり、又は隣接する置換基は環状アセタール又はケタールを一緒に形成する置換された酸素基であり；そしてＲ５は水素原子、アルコキシル、アルキル、ハロ、アリール、又はアルケニル基である］で表わされる第５０項記載の化合物。
（項目５２） 前記Ｒ１及びＲ４がそれぞれ水素原子であり、そしてＲ２及びＲ３がそれぞれメトキシ基である第５１項記載の化合物。
（項目５３） 前記Ｒ５がメチル基である第５２項記載の化合物。
（項目５４） 前記Ｒ２及びＲ３が環状アセタールを一緒に形成する置換された酸素基である第５１項記載の化合物。
（項目５５） 前記Ｒ１及びＲ４がそれぞれ水素原子である第５４項記載の化合物。
（項目５６） 前記Ｒ５がメチル基である第５５項記載の化合物。
発明の要約
支持体上の多様なポリマーの配列の合成の方法、装置および組成物、および技術の使用、ならびにそれらの応用を開示する。
【００１６】
本発明の１つの面によると、支持体上の多様なポリマーの配列のための改良された反応器システムが提供される。この態様に従い、本発明は支持体へ反応流体を接触させる反応器；選択した反応流体を反応器に供給するシステム；マスクまたは支持体を少なくとも第１の相対位置から第２の相対位置に動かす並進段階；選択した時間にマスクを通して支持体を照明する光；および流体の流れを反応器システムから選択的に向け、並進段階を選択的に活性化し、そして支持体を選択的に照明して、支持体上に前以て決定した位置において複数の多様なポリマーの配列を形成するための適当にプログラミングされたディジタルニンピューターを提供する。
【００１７】
本発明は、また、ＶＬＳＩＰＳの中のリンカー分子を選択する技術を提供する。本発明のこの面によれば、本発明は結合親和性の研究において使用するための複数のリンカーポリマーをスクリーニングする方法を提供する。本発明は、複数のリンカーポリマーを支持体上に選択した領域において形成し、リンカーポリマーはこの工程により支持体の表面上に反復的に形成され、選択した領域の一部分を照射して保護基を除去し、そして前記表面をモノマーと接触させ；複数のリンカーポリマーをリガンドと接触させ；そして前記リガンドを標識したレセプターと接触させる；工程を包含する。本発明の他の面によれば、改良された光除去可能な保護基が提供される。
【００１８】
本発明のこの面によれば、式：
【００１９】
【化７】
【００２０】
式中、ｎ−０または１；Ｙは天然または天然以外のアミノ酸のカルボキシル基の酸素、天然または天然以外のアミノ酸のアミノ基、または天然または天然以外のデオキシリボ核酸またはリボ核酸のＣ−５’酸素基から選択され；Ｒ１およびＲ２は独立に水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィドまたはボスフィド基であり；そしてＲ３はアルコキシ、アルキル、アリール、水素またはアルケニル基である、
を有する化合物が提供される。
【００２１】
本発明は、また、ＶＬＳＩＰＳのための改良されたマスキング技術を提供する。マスキング技術の１つの面によれば、本発明は、バイナリー合成法を使用して、未リマーの配列の他の部分の添加のために、複数のポリマーの配列の一部分を系統的に保護および脱保護する工程からなる、試薬の順次の添加により複数のポリマーの配列を形成する順序づけられた方法を提供する。
【００２２】
改良されたデータ収集の装置および技術が、また、提供される。
【００２３】
１つの態様によれば、計装は、光を支持体の表面に適用する手段、支持体は前以て決定した位置における複数のリガンドからなる、光を向けて複数の前以て決定した位置を同時に照射する手段；および前記複数の前以て決定した位置において蛍光を検出する配列からなるリガンドに対するレセプターの親和性を決定するシステムを提供する。さらに、本発明は、蛍光標識したレセプターを支持体に暴露し、前記支持体は領域の中の既知の位置における複数のリガンドからなる；前記領域の各々内の複数のデータ収集点において、前記データ収集点からの蛍光の量を決定し；前以て決定した統計学的分布から逸脱するデータ収集点を除去し；そして残りのデータ収集点からのレセプターの相対結合親和性を決定する；工程を含む、改良されたデータ分析技術を提供する。
【００２４】
ポリマーの合成において使用するための保護されたアミノ酸Ｎ一カルボキシ無水物が、また、提供される。本発明のこの面によれば、次の式を有する化合物が提供される：
【００２５】
【化８】
【００２６】
式中、Ｒは天然または天然以外のアミノ酸の側鎖であり、そしてＸは光除去可能な保護基である。
【００２７】
ここにおける本発明の性質および利点のそれ以上の理解は、明細書の残りの部分および添付図面を参照することによって実現するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
好ましい態様の説明
内容
Ｉ．定義
ＩＩ．一般
Ａ．脱保護および添加
１．実施例
２．実施例
ＩＩＩ．合成
Ａ．反応器システム
Ｂ．バイナリー合成法
１．実施例
２．実施例
３．実施例
４．実施例
５．実施例
６．実施例
Ｃ．リンカーの選択
Ｄ．保護基
１．ペプチドの固相合成の問の光除去可能な保護基の使用
２．オリゴヌクレオチドの固相合成の間の光除去可能な保護基の使用
Ｅ．光除去可能な基で保護されたアミノ酸Ｎ一カルボキシ無水物
ＩＶ．データ収集
Ａ．データ収集システム
Ｂ．データの分析
Ｖ．他の代表的な応用
Ａ．オリゴヌクレオチドの合成
１．実施例
ＶＩ．結論
１．定義
ここにおいて使用するある種の用語は次の一般的定義を有することを意図する：
１．相補性：リガンド分子およびそのレセプターの相互作用する表面のトポロジー的相補性または一緒に合致することを意味する。こうして、レセプターおよびそのリガンドは相補性として記載することができ、そしてさらに、接触表面の特性は互いに相補的である。
【００２９】
２．エピトープ３抗体として知られているレセプターのサブクラスとの相互作用の区域により描写される、抗原分子の部分。
【００３０】
３．リガンド：リガンドは特定のレセプターにより認識される分子である。本発明により研究することができるリガンドの例は、次のものを包含するが、これらに限定されない：細胞膜のレセプターのための作動物質および拮抗物質、毒素および毒液、ウイルスのエピトープ、ホルモン（例えば、オピェート、ステロイドなど）、ホルモンのレセプター、ペプチド、酵素、酵素の基質、コファクター、薬物、レクチン、糖類、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、およびモノクローナル抗体。
【００３１】
４．モノマー：一緒に接合してポリマーを形成することができる小さい分子の組の構成員。モノマーの組は次のものを包含するが、これらに限定されない：例えば、普通のＬ一アミノ酸の組、Ｄ一アミノ酸の組、合成アミノ酸の組、ヌクレオチドの組およびペントースおよびヘキソースの組。ここで使用するとき、モノマーはポリマーの合成のための基本的組の任意の構成員を呼ぶ。例えば、２０の天然に見いだされるＬ一アミノ酸の２量体は、ポリペプチドの合成のための４００のモノマーの基本的組を形成する。モノマーの異なる基本的組をポリマーの合成において連続する工程において使用することができる。さらに、組の各々は合成後に修飾される保護された構成員を包含することができる。
【００３２】
５．ペプチド：モノマーがアルファアミノ酸でありかつアミド結合を通して一緒に接合されておりそして二者択一的にポリペプチドと呼ばれるポリマー。この明細書に関係して、アミノ酸はＬ一光学的異性体またはＤ一光学的異性体であることができることを理解すべきである。ペプチドはしばしば２またはそれ以上のモノマーの長さであり、そしてしばしば２０より大きいアミノ酸モノマーの長さである。アミノ酸の標準の略号を使用する（例えば、プロリンについてＰ）。これらの略号はＳｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ，第３版、１９８８、の中に含まれており、これをすべての目的のためにここに引用によって加える。
【００３３】
６．放射線：１０−１４〜１０４メートルの波長を有するエネルギーを含む、選択的に適用することができるエネルギー、例えば、電子ビ一ム放射線、ガンマ放射線、Ｘ線放射線、紫外線放射線、可視光、赤外放射線、マイクロ波放射線、およびラジオ波。「照射」は表面に放射線を適用することを意味する。
【００３４】
７．レセプタ：所定のリガンドに対して親和性を有する分子。レセプターは天然に見いだされる分子または合成分子であることができる。また、それらは変更しない状態であるいは他の種との集合体として使用することができる。レセプターは結合する構成員に、直接にあるいは特定の結合物質を介して、取り付け、共有結合または非共有結合することができる。本発明において使用できるレセプターの例は、次のものを包含するが、これらに限定されない；抗体、細胞膜のレセプター、特定の抗原性決定基（例えば、ウイルス、細胞、または他の物質）と反応性のモノクローナル抗体および抗血清、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、コファクター、レクチン、糖類、多糖、細胞、細胞膜、および細胞小器官。レセプターは時にはこの分野において抗リガンドと呼ばれる。用語レセプターをここにおいて使用するとき、意味の差を意図しない。２つの高分子が分子の認識を通して組み合って複合体を形成するとき、「リガンドレセプターの対」が形成される。
【００３５】
本発明により研究することができるレセプターの他の例は、次のものを包含するが、これらに限定されない：
ａ）微生物のレセプター：レセプターに結合するリガンド、例えば、微生物の生き残りに対して必須の特定の輸送タンパク質または酵素の決定は抗体の新しいクラスのために有用である。日和見性の菌類、原生動物、および現在の使用における抗体に対して耐性のバクテリアに対する抗体はとくに価値があるであろう。
ｂ）酸素：例えば、酵素、例えば、神経伝達物質を切断することに関係する酵素の結合部位の決定は有用情報を提供する。ある種のレセプターに結合して、異なる神経伝達物質を切断する酵素の作用を変調するリガンドの決定は、神経伝達物質の障害の処置において使用できる薬物の開発において有用である。
ｃ）抗体：例えば、本発明は問題の抗原のエピトープと結合する抗体分子上のリガンド結合部位の研究において有用である；抗原のエピトープをまねる配列を決定することは、免疫原が１種または２種以上のこのような物質に基づくワクチンの開発に導くことができるか、あるいは治療的処置、例えば、自己免疫病において有用である（例えば、「自己」抗体の結合をブロックすることによって）関係する診断剤または化合物の開発に導くことができる。
ｄ）．核酸：核酸の配列を合成して、ＤＮＡまたはＲＮＡの結合性配列を確立することができる。
ｅ）触媒のポリペプチド：１種または２種以上の反応成分を１種または２種以上の生成物に変換することを包含する化学的反応を促進することができるポリマー、好ましくはポリペプチド。このようなポリペプチドは、一般に、少なくとも１つの反応成分または反応の中間体に対して特異的な結合部位および、官能性が結合した反応成分を化学的修飾することができる、結合部位に近接した活性な官能性を含む。触媒のポリペプチドは、例えば、米国特許第４０４，９２０号（これをすべての目的のためにここに引用によって加える）に記載されている。
ｆ）ホルモンのレセプター：例えば、インスリンおよび成長ホルモンのためのレセプター。高い親和性をもってレセプターに結合するリガンドの決定は、例えば、糖尿病患者が糖尿病の症状を解放しなくてはならない毎日の注射の経口的代替物、および他の場合において、死体からか、あるいは組み換えＤＮＡ技術によってのみ得ることができる、稀なホモ成長ホルモンの代替物の開発において有用である。他の例は脈管収縮性ホルモンのレセプターである；レセプターに結合するそれらのリガンドの決定は、血圧をコントロールする薬物の開発に導くことができる。
ｇ）オピエートレセプター：脳の中のオピエートのレセプターに結合するリガンドの決定は、モルフィンおよび関係する薬物のための嗜癖性が低い代替物の開発において有用である。
【００３６】
８．支持体：剛性または半剛性の表面を有する材料。多数の態様において、支持体の少なくとも１つの表面は実質的に平らであるが、ある態様において、異なるポリマーのために、例えば、ウェル、上昇した領域、エッチングした溝などで合成領域を物理的に分離することが望ましいことがある。他の態様によれば、合成が完結したとき解放することができる、小さいビーズを表面上に準備することができる。
【００３７】
９．保護基：モノマー単位に化学的に結合しそしてアクチベーター、例えば、電磁輻射線に選択的に暴露したとき除去することができる物質。ここにおいて実用性をもつ保護基の例は、次のものを包含する：ニトロピペロニル、ピレニルメトキシ−カルボニル、ニトロベラトリル、ニトロベンジル、ジメチルジメトキシベンジル、５−ブロモ−７−エトロインドリニル、ｏ−ヒドロキシ−α−メチルシンナモイルおよび２−オキシメチレンアントラキノン。
【００３８】
１０．前以って規定した領域：前以て規定した領域は表面上の、ポリマーの形成のために活性化する、活性化した、あるいは活性化を意図する、局在化した区域である。前以て規定した領域は任意の便利な形状、例えば、円形、長方形、楕円形、クサビ形などを有することができる。ここにおいて簡潔さを目的として、「前以て規定した領域」は時には単に「領域」と呼ぶ。
【００３９】
１１．実質的に純粋：ある支持体の前以て規定した領域がそれを他の前以て規定した領域と区別する特性を示すとき、ポリマーはその前以て規定した領域内で「実質的に純粋」であると考えられる。典型的には、純度は均一な配列の結果として生物学的活性または機能により測定されるであろう。このような特性は、典型的には、選択したリガンドまたはレセプターとの結合により測定されるであろう。
【００４０】
１２．アクチベーター：基を活性とすることができそしてある源から支持体上の前以て規定した位置に向けられるエネルギー源を呼ぶ。アクチベーターの主な例示は光である。アクチベーターの他の例は、イオンビーム、電場、磁場、電子ビーム、Ｘ線などを包含する。
【００４１】
１３．バイナリー合成法：反応成分のマトリックス、およびスイッチのマトリックス（その生成物は生成物のマトリックスである）により代表することができる試薬の順次の添加により、多様なポリマーの配列を平行に合成する順序づけられた方法を呼ぶ。反応成分のマトリックスは添加すべき構成ブロックの１×ｍマトリックスである。スイッチのマトリックスは、列で配置された１とｍとの間の、野ましくは順序づけられた、バイナリー数のすべてまたはサブセットである。好ましい態様において、バイナリー法は少なくとも２つの連続する工程が支持体上の問題の領域の半分を照明する方法である。最も好ましい態様において、バイナリー合成は、また、前の添加工程を実行する合成法を呼ぶ。例えば、マスキング法のためのスイッチのマトリックスが前に照明した領域を半分にし、前に照明した領域の約半分を照明し、そして残りの半分を保護する（同時にまた前に保護された領域の約半分を保護し、そして前に保護された領域の約半分を照明する）方法。バイナリーのラウンドを非バイナリーのラウンドと相互に分散させることができ、そして支持体の一部分のみをバイナリー法にかけることができるのが認識されるであろうが、なおここにおける定義内のバイナリーマスキング法であると考慮される。バイナリー「マスキング」法は、他の物質、例えば、アミノ酸の添加のために、物質から保護基を除去するために長さを使用するバイナリー合成である。好ましい態様において、スイッチのマトリックスの選択した列をスイッチのマトリックスの列においてバイナリー数が増加する碩序で配置する。
【００４２】
１４．リンカー・：支持体に取り付けられそして合成されたポリマーを暴露／レセプターへの結合のために支持体から間隔を置いて配置する分子または分子の群を呼ぶ。
ＩＩ．一般
本発明は、大規模の化学的多様性をつくる合成法および装置を提供する。固相の化学、光不安定性保護基、および写真平版を一緒にして、光統制された空間的にアドレス可能な平行の化学的合成を好ましい態様において達成する。
【００４３】
本発明は、ここにおいて、ペプチドおよびヌクレオチドの調製に主として関して例示の目的で記載するが、他のポリマーに容易に応用することができるであろう。このようなポリマーは、例えば、次のものを包含する３核酸の線状および環状のポリマー、多糖類、り１ン脂質、およびα−，β−またはω−アミノ酸を有するペプチド、既知の薬物が上の任意のものに共有結合したヘテロポリマー、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンサルファイド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、あるいはこの開示を見て明らかになるであろう他のポリマー。さらに、認識されるように、ここにおける例示は主としてＣ末端→Ｎ末端の合成について参照するが、本発明はその範囲から逸脱しないでＮ末端→Ｃ末端の合成に容易に応用することができる。
【００４４】
Ａ．脱保護および添加
本発明は、マスクした抗原または他のアクチベーターを使用して、多数の異なる化学的化合物の同時の合成を統制する。第１図は、本発明の１つの態様に従う化学的化合物を形成する方法を示すフローチャートである。合成は固体の支持体２上で起こる。光源６を使用してマスク４ａを通る照明のパターンは、支持体のどの領域が化学的カップリングのために活性化されるかを決定する。１つの好ましい態様において、活性化は光を使用して、支持体の選択した区域から光不安定性保護基を除去することによって達成される。
【００４５】
脱保護後、構成ブロックの組の第１のもの（第１図において「Ａ」で示す）、各々は光不安定性保護基（「Ｘ」で示す）を有する、を支持体の表面に対して暴露し、そしてそれは前の工程において光でアドレスされた領域と反応する。次いで支持体を第２のマスク４ｂを通して照明し、これは第２の保護された構成ブロックｒＢ」との反応のための他の領域を活性化する。これらの照明において使用したマスクのパターンおよび反応成分の順序は究極の生成物およびそれらの位置を定め、第１図の下部において配列ＡＣＥＧおよびＢＤＦＨで示すように、前以て規定した位置に多様な配列を生ずる。本発明の好ましい態様は、小さい数の化学的工程において多数の化合物を形成するという、組み合わせのマスキング法の利点を得る。化合物の密度は主としてアクチベーターの空間的アドレス可能性、１つの場合において光の回折に関して決定されるので、高度の小型化は可能である。各化合物は物理的にアクセス可能であり、そしてその位置は正確に知られている。それゆえ、配列は空間的にアドレス可能であり、そして他の分子とのその相互作用を評価することができる。
【００４６】
第１図に示す特定の態様において、支持体は光不安定性保護基でブロックされたアミノ基を含有する。アミノ酸の配列は光保護基の除去によリレセプターとのカップリングのためにアクセス可能とされる。
【００４７】
合成すべきポリマーの配列が、例えば、ポリペプチドであるとき、ガラスの支持体に取り付けられたリンカーの末端のアミノ基はニトロベアトリルオキシカルボニル（醒ＯＣ）、光除去可能な保護基で誘導化される。リンカーの分子は、例えば、アリールアセチレン、２〜１０のモノマーからのエチレングリコールのオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであることができる。光脱保護は、例えば、マスクを通して支持体を照明することによって実施され、ここでパターンは、例えば、１ｃｍ２より小、１０−１ｃｍ２、１０−２ｃｍ２、１０−３ｃｍ２、１０−４ｃｍ２、１０−５ｃｍ２、１０−６ｃｍ２、１０−７ｃｍ２、１０−８ｃｍ２、１０−９ｍ２、または１０−１０ｍ２の寸法をもつ透明な領域を有する。好ましい態様において、領域は約１０×１０μｍ〜５００×５００μｍである。ある態様に従うと、マスクはポリマーのチェッカー盤状の配列を生成するように配置されるが、種々の幾何学的形状の任意の１つを利用することができる。
【００４８】
１．本発明の１つの実施例において、全体の支持体表面を光脱保護後蛍光性イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で処理することによって、遊離アミノ基を蛍光標識した。ガラスの顕微鏡スライドを清浄にし、９５％のエタノール中の０．１％のアミノプロピルトリエトキシシランで処理してアミン化し、そして１１０℃において２０分間インキュベーションした。次いで、スライドのアミン化された表面をＤＭＦ中のＮＶＯＣ−ＧＡＢＡ（ニトロベアトリルオキシカルボユルーγ一アミノ酪酸）のＮ一ヒドロキシスクシンイミドエステルの３０ｍＭの溶液に暴露する。Ｈｇアークランプからの３６５ｎｍのアウトプットを、ガラスの１００μｍのチェッカー盤状のマスク上のクロムを通して支持体上に、１２ｍＷ／ｃｍ２の電力密度で画像形成することによって、ＷＯＣ保護基を光分解的に除去した。次いで、露出された表面をＤＭＦ中の１ｍＭのＦＩＴＣで処理した。支持体表面をｅｐｉ一蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２０）でアルゴンイオンのレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ ２０２５型）からの４８８ｎｍの励起を使用して走査した。光子計数モードで作動する冷却した光電子増倍管（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ９４３−０２）により、５２０ｎｍ以上の蛍光の放射を光検出した。蛍光の強度の区域において赤色でおよび最低の強度の区域において黒色で色表示に、光の強度を変換した。１００×１００μｍの要素の高いコントラストの蛍光性チェッカー盤状のパターンの存在は、空間的に局在化した光脱保護により特定の領域において遊離アミノ基が発生したことを明らかにした。
【００４９】
２．実施例
第２図は、本発明の他の実施例を例示するフローチャートである，カルボキシ活性化されたＮＶＯＣ一ロイシンをアミン化された支持体と反応させた。この合成において使用したロイシンおよび他のアミノ酸のカルボキシ活性化されたＨＯＢＴエステルは、２．５ｍｌの脳Ｆ中で０．２５ミリモルのＮＶＯＣアミノ保護されたアミノ酸を３７ｍｇのＨＯＢＴ（１一ヒドロキシベンゾトリアゾール）、１１１ｍｇのＢｏｐ（ベンゾトリアゾリル−ｎ−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサ−フルオロホスフェート）および８６μ１のＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）と混合することによって形成した。ＮＶＯＣ保護基は均一な照明により除去した。カルボキシ活性化されたＮＶＯＣ−フェニルアラニンを暴露されたアミノ基に室温において２時間の間カップリングさせ、次いでＤＭＦおよび塩化メチレンで洗浄した。光脱保護のマスク除去のサイクルおよびカルボキシ活性化されたＮＶＯＣ一グリシンとのカップリングを実施した。次いで表面をガラスの５０μｍのチェッカー盤状のパターンのマスク上のクロムを通して照明した。次いでカルボキシ活性化されたＮα−ｔＢＯＣ−ｏ−ｔ一ブチル−Ｌ−チロシンを添加した。全体の表面を均一に照明して、残りのＮＶＯＣ基を光分解した。最後に、カルボキシ活性化されたＮＶＯＣ−Ｌ一プロリンを添加し、ＮＶＯＣ基を照明により除去し、そしてｔ−ＢＯＣおよびｔ一ブチル保護基をＴＦＡで除去した。保護基の除去後、表面はＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（ＹＧＧＦＬ）およびＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（ＰＧＧＦＬ）の５０μｍのチェッカー盤状の配列から成っていた。参照、また、配列識別番号：１および配列識別番号：２。
【００５０】
Ｂ．抗体の標識
１つの好ましい態様において、支持体を使用して、複数のアミノ酸配列のどれが問題の抗体により認識されるかを決定する。
【００５１】
１．実施例
１つの実施例において、第２図に示す実雄例におけるペンタペプチドの配列をβ一エンドルフィンに対して向けられたマウスモノクローナル抗体でプロービングした。この抗体（３Ｅ７と呼ぶ）はナノモルの親和性でＹＧＧＦＬおよびＹＧＧＦＭ（参照、また、配列識別番号：１および配列識別番号３２１）に結合することが知られており、そしてＭｅｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：４０８４、これをすべての目的のためにここに引用によって加える、の中で論じられでいる。この抗体は高い親和性の結合のためにアミノ末端のチロシンを必要とする。第２図に記載するように形成したペプチドの配列を、ＹＧＧＦＬを認識することが知られている２μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗体（３Ｅ７）とインキュベーションした。参照、また、配列識別番号：１。３Ｅ７はＰＧＧＦＬと結合しなかった。参照、また、配列識別番号２。蛍光化ヤギ抗マウス抗体との第２インキュベーションは３Ｅ７と結合した領域を標識した。表面をｅｐｉ−蛍光顕微鏡で走査した。結果は交互する輝いたおよび暗い５０μｍの正方形を示し、ＹＧＧＦＬ（配列識別番号：１）およびＰＧＧＦＬ（配列識別番号：２）がマスクにより決定された幾何学的配列で合成されたことが示された。高いコントラスト（＞１２：１の強度の比）の蛍光性チェッカー盤状の画像が示すように、（ａ）ＹＧＧＦＬ（配列識別番号：１）およびＰＧＧＦＬ（配列識別番号：２）は交互する５０μｍの正方形で合成され、（ｂ）表面に取り付けられたＹＧＧＦＬ（配列識別番号：１）は抗体３Ｅ７への結合のためにアクセス可能であり、そして（ｃ）抗体３Ｅ７はＰＧＧＦＬ（配列識別番号：２）に結合しない。
【００５２】
チェッカー盤の２正方形×４正方形の部分における蛍光強度のデータの３次元の表示が生成された。それは合成部位の境界が鋭いことを示す。この表示における各スパイク波形の高さは、２．５μｍの絵素で統合された蛍光強度に直線的に比例する。ＰＧＧＦＬとＹＧＧＦＬとの間のトランジションは２スパイク波形（５μｍ）内で起こる。異なるＹＧＧＦＬの正方形の蛍光強度の変動はほとんど存在しない。１６のＹＧＧＦＬ合成部位の平均の強度は２．０３×１０５の計数であり、そして標準偏差は９．６×１０３の計数であった。
【００５３】
ＩＩＩ．合成
Ａ．反応器システム
第３図は、支持体上で多様なポリマーの配列を合成するために使用する装置を概略的に示す。この装置は自動化されたペプチド合成装置４０１を含む。自動化されたペプチド合成装置は、コンピューター４０１の指令下にフローセル４０２を通して選択した反応流体を流す。好ましい態様において、合成装置はＡＢＩペプチド合成装置、型Ｎｏ．４３１Ａである。コンピューターは広範な種類のコンピューターまたは離散的ロジック、例えば、ペプチド合成装置における適当な内部のコントロールシステムと連係した１聞ＰＣ−ＡＴまたは同様なコンピューターから選択することができる。ＰＣは、例えばカップリングサイクルの終わりを示すボードコンピューターからのシグナルを供給される。
【００５４】
支持体４０６をフローセルの上に取り付け、支持体とフローセルとの間に空洞を形成する。選択した試薬はこの空洞を通してペプチド合成装置から選択した時間に流れ、支持体の面上に空洞の中にペプチドの配列を形成する。マスク４０８は支持体の上に、好ましくは支持体と接触して取り付けられる。マスク４０８は選択した領域において光の選択した波長に対して透明であり、そして他の領域において光の選択した波長に対して不透明である。マスクを光源４１０、例えば、紫外線の光源で照明する。特定の態様において、光源４１０はオリエル（Ｏｒｉｅｌ）製の型Ｎｏ．８２４２０である。マスクはｘ−ｙ−ｚの並進ステージ４１２、例えば、ニューポート・コーポレーション（Ｎｅｗ−ｐｏｒｔ Ｃｏｒ．）製のｘ−ｙ並進ステージにより保持および並進される。コンピューターはペプチド合成装置、ｘ−ｙ並進ステージおよび光源の作用と共同する。もちろん、本発明はある態様においてマスクの代わりに支持体の並進で使用することができる。
【００５５】
操作において、支持体をフローセル上に取り付ける。マスクを位置決定しそして光を光源から、マスクを通して、支持体上に所望の期間（例えば、ペプチド合成の場合において１秒〜６０分）の間向けることによって、適当な光除去可能な保護基によりその表面が保護された支持体を光に選択した位置において露出する。支持体上の選択した位置において結合するために、ペプチド合成装置により、選択したペプチドまたは他のモノマー／ポリマーを反応器の空洞を通して送る。選択した反応時間（例えば、ペプチド反応の場合において約１秒〜３００分）後、モノマーをシステムから洗浄除去し、マスクを適当に再位置決定または置換し、そしてサイクルを反復する。本発明のほとんどの態様において、反応は周囲温度またはその付近において実施することができる。
【００５６】
第４ａ図および第４ｂ図は、反応器システムの操作において使用するソフトウェアのフローチャートである。ステップ５０２において、ペプチド合成のソフトウェアを初期化する。ステップ５０４において、システムはｘ−ｙ並進ステージ上の位置を目盛り定めし、そして主要なループを開始する。ステップ５０６において、システムは、存在する場合、コンピューター上のファンクションキーのどれがプレスされているかを決定する。Ｆ１がプレスされている場合、システムは所望の合成方法をインプットするようにユーザーを促す。ユーザーがＦ２をエンターすると、システムはステップ５１０において合成法のためにファイルの編集を可能とする。ユーザーがＦ３をエンターする場合、システムはステップ５１２におけるディスクからのプロセスを負荷する。ユーザーがＦ４をエンターする場合、システムはエンターまたは編集されたプロセスをステップ５１４におけるディスクにセーブする。ユーザーがＦ５を選択する場合、現在のプロセスはステップ５１６において表示されるが、Ｆ６の選択はプログラムの主要な部分、すなわち、選択したプロセスに従う実際の合成を開始する。ユーザーがＦ７を選択すると、システムは合成されたペプチドの位置を表示するが、Ｆ１０をプレスすると、ディスクの操作システムに戻る。
【００５７】
第４ｂ図は合成ステップ５１８をより詳細に示す。このプログラムの主要なループは開始され、ここでシステムはまずマスクをステップ５２６の次の位置に動かす。プログラムの主要なループの間に、ペプチド合成装置の中のオン−ボードコンピューターの指示下に必要な化学物質は反応セルを通して流れる。ズテップ５２８において、次いでシステムは露出の指令のために待機しそして、露出の指令を受け取ると、ステップ５３０において所望の時間の間支持体耀出する。完全な露出の肯定応答がステップ５３２において受け取られると、システムはこのプロセスがステップ５３４において完結されたかどうかを決定しそして、そこにある場合、ステップ５３６における追加のキーボードのインプットのために待機しそして、その後、実行合成プロセスを出る。
【００５８】
前述のシステムの操作のために使用するコンピュータープログラムはターボ（Ｔｕｒｂｏ）Ｃ（Ｂｏｒｌａｎｄ Ｉｎｔ’１）に記載されており、そしてＩＢＭコンパティブルシステムにおいて実行された。モーターコントロールのソフトウェアは、ニューポート・コーポレーション（Ｎｅｗ−ｐｏｒｔ Ｃｏｒ．）により製造されたソフトウェアから採用される。認識さるように、広範な種類のプログラム言語をここにおいて本発明の範囲を逸脱しないで利用することができる。ある種の呼び出しは「ＰＣおよびＰＳ２ビデオシステムに対するプログラマーのガイド（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ＰＣ ａｎｄ ＰＳ２ Ｖｉｄｅｏ Ｓｙｓｔｅｍ）」（Ｗｉｌｔｏｎ，Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）（これをすべての目的のためにここに引用によって加える）においてグラフィックスプログラムに対してなされている。
【００５９】
マスクの整列は好ましい態様において２つの方法の１つにより達成される。第１の態様において、システムは変法成分の相対的整列に頼り、これはｘ−ｙ−ｚ並進ステージがここにおける目的のために十分な制度をもつことができるので通常許容される。別の態様において、支持体上の整列のマークを適当な整列のためにＣＣＤ装置に連結する。
【００６０】
ある態様によれば、純粋な試薬を各工程において添加しないか、あるいは保護基の完全な光分解を各工程において設けない。これらの態様によれば、多数の生成物が各合成部位において形成される。例えば、モノマーＡおよびＢを合成工程の間に混合し、ＡおよびＢは、おおよそ溶液の中のそれらの濃度に比例して、脱保護された領域に結合するであろう。それゆえ、化合物の混合物は合成領域において形成されるであろう。変法合成領域における化合物の混合物とともに形成された支持体は、例えば、多数の化合物の初期のスクリーニングを実施するために使用することができ、その後、高い親和性を示す領域における小さい数の化合物をさらにスクリーニングする。ある領域を部分的にのみ光分解し、第１モノマーを添加し、同一領域を再光分解し、そしてその領域を第２モノマーに暴露することによって、同様な結果を得ることができる。
【００６１】
Ｂ．二段階合成法
光統制された化学的合成において、形成する生成物はマスクのパターンおよび順序、および反応成分の順序に依存する。１組の生成物をつくるために、一般に有限の数可能な方法が存在するであろう。本発明の好ましい態様において、二段階合成法を利用する。二段階合成法はここにおいて主としてマスキング法に関して例示するが、それは他のポリマーの合成、例えば、ピン法などに適用することができるであろう。
【００６２】
二段階合成法において、支持体を第１マスクで照射し、第１構成ブロックに対して暴露し、第２マスクで照射し、第２構成ブロックに暴露する。マスクした照射および構成ブロックへの露出の各組み合わせをここにおいて「サイクル」と呼ぶ。
【００６３】
好ましい二段階マスキング法において・各サイクルのためのマスクは支持体上の問題の領域の半分の照明を可能とし、そして問題の領域の残りの半分を照明しない。「半分」はここにおいて問題の領域の正確な半分を意味せず、その代わり問題の領域の大きい部分、例えば、問題の領域の約３０〜７０％を意味する。理解されるように、全体のマスキング法は必ずしも二段階の形態を取ることは必要ではない；その代わり、非二段階サイクルを必要に応じて二段階サイクルの間に導入することができる。
【００６４】
二段階マスキング法の好ましい態様において、所定のサイクルは前のサイクルにおいて照明された領域の約半分のみを照明するが、前のサイクルからの照明された残りの半分を照明しない。逆に、このような好ましい態様において、所定のサイクルは前のサイクルにおいて照明されなかった領域の半分を照明し、そして前のサイクルにおいて照明されなかった領域の半分を照明しない。
【００６５】
ここに開示する合成法において、合成されるポリマーの最長の長さ（ｌ）はｌ＝ｎ／ａである；ここでｎはサイクルの数でありそしてａは化学的構成ブロックの数である（所定の構成ブロックを反復一することができることに注意すべきである）。
【００６６】
合成法はマトリックスの表示法で最も容易に例示および取り扱われる。各合成部位において、所定のモノマーを添加するかどうかの決定は二段階プロセスである。したがって、各生成物の要素Ｐｊは２つのベクトル、すなわち、化学的反応成分のベクトル、例えば、Ｃ＝［Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ］およびバイナリーベクトルσｊの点の生成物により与えられる。４工程の合成についての下の実施例における生成物を見ると、示されるように、１つの４工程の合成において、σ１＝［１，０，１，０］、σ２＝［１，０，０，０］、σ３＝［０，１，１，０］およびσ４＝［０，１，０，１］、ここで１は照明を示し、そして０は照明なしを示す。したがって、列のベクトルσｊから「スイッチのマトリックス」Ｓを構成することが可能となる（ｊ＝１，ｋここでｋは生成物の数である）。
【００６７】
【数１】
【００６８】
合成の結果Ｐは単にＰ＝ＣＳ、化学的反応成分のマトリックスおよびスイッチのマトリックスの生成物である。
【００６９】
ｋの生成物を生ずるｎサイクルの合成のためにスイッチのマトリックスはｎ行およびｋ列を有する。Ｓの属性は各行がマスクを特定することである。合成の第ｊの化学的工程のための２次元のマスクｍｊはＳの第ｊ行から、要素Ｓｊｉ，…Ｓｊｋを、例えば、平方のフォーマットの中に配置することによって直接得られる。下の特定の配置は正方形のフォーマットを提供するが、線状または他の配置を利用することができる。
【００７０】
【数２】
【００７１】
もちろん、光活性化された合成において形成した化合物は任意の規定された幾何学的配列で配置することができる。正方形または長方形のマトリックスは便利であるが、不必要である。スイッチのマトリックスの行は、同等の転位を各行のために使用するかぎり、任意の便利な配列に転位することができる。
【００７２】
例えば、４工程の合成におけるマスクは次いで次により表される：
【００７３】
【数３】
【００７４】
ここで１は照明（活性化）を意味しそして０は照明なしを意味する。
【００７５】
好ましい態様において、マトリックスの表示を使用して生成物の所望の組および生成物の地図を発生させる。各化合物は化学的ベクトルおよび特定のスイッチのベクトルの生成物により定義される。したがって、各合成のアドレスについて、単にスイッチのベクトルをセーブし、これらのすべてをスイッチのマトリックスにアセンブリングし、そして行の各々を抽出してマスクを形成する。ある場合において、特定の生成物の分布または生成物の最大数が要求される。例えば、Ｃ＝［Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ］について、スイッチのベクトル（σｉ）は４ビットから成る。１６の４ビットのベクトルが存在する。１６の異なる生成物の最大は反応成分［Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ］の順次の添加によりつくることができる。これらの１６列のベクトルは１６の異なる方法でアセンブリングしてスイッチのマトリックスを形成することができる。列のベクトルの順序はマスキングのパターンを規定し、したがって、生成物の空間的順序を規定するが、それらの構成を規定しない。これらの列の１つの順序は次のスイッチのマトリックスを与える（ここで「零」（
【００７６】
【数４】
【００７７】
）の付加を完全性を目的一として括弧内に含めるが、このような零の付加はここにおいてどこかで無視されている）：
【００７８】
【数５】
【００７９】
本発明のこの面に従うＳの列は数１５〜０のバイナリー表示である。この二段階合成の１６の生成物は、ＡＢＣＤ，ＡＢＣ，ＡＢＤ，ＡＢ，ＡＣＤ，ＡＣ，ＡＤ，Ａ，ＢＣＤ，ＢＣ，ＢＤ，Ｂ，ＣＤ，Ｃ，Ｄ、および
【００８０】
【数６】
【００８１】
（零）である。また、上の４工程の合成マスクからのスイッチのベクトルの各々（およびそれゆえ合成生成物）は４ビットのバイナリースイッチのマトリックスの中に存在することに注意すべきである。（参照、列６，７，１０、および１１）
この合成手順は完成した生成物をマッピングする容易な方法を提供する。支持体上の種々の位置における生成物は、スイッチのマトリックスの列により簡単に規定される（第１列は、例えば、生成物ＡＢＣＤが支持体の上左の位置に存在するであろうことを示す）。さらに、選択した所望の生成物のみをつくる場合、マスクの配列は列を所望の配列で抽出することによって誘導することができる。例えば、生成物の組ＡＢＣＤ，ＡＢＤ，ＡＣＤ，ＡＤ，ＢＣＤ，ＢＤ，ＣＤ、およびＤを形成するために、第１、第３、第５、第７、第９、第１１、第１３、および第１５の列がスイッチのマトリックスに配置されたスイッチのマトリックスを使用することによって、マスクを形成する：
【００８２】
【数７】
【００８３】
長さ４のポリマーの全てを形成するために、反応成分のマトリックス［ＡＢＣＤＡＢＣＤＡＢＣＤＡＢＣＤ）を使用する。スイッチのマトリックスは列に配置された０〜２１６のバイナリー数のマトリックスから形成されるであろう。次いで４モノマーを有する列を選択し、そしてスイッチのマトリックスに配置する。したがって、理解されるように、バイナリースイッチのマトリックスは一般にｎ工程の合成からつくることができるすべての生成物を表示し、次いでこれから所望の生成物を抽出する。
【００８４】
バイナリースイッチのマトリックスの行は、好ましい態様において、各マスキング工程が合成区域の半分を照明するという性質を有する。各マスキング工程は、また、先行するマスキング工程を実行する；すなわち、先行する工程において照明された領域の半分を再び照明するが、他方の半分を照明しない。先行する工程において照明されなかった領域の半分はまた照明されるが、他方の半分は照明されない。こうして、マスキングは反復される。マスクは、前述したように、各行の要素を抽出し、そしてそれらを正方形の配列に配置することによらて構成される。例えば、４工程の合成についてのＳにおける４つのマスクは、次の通りである：
【００８５】
【数８】
【００８６】
マスクの反復する実行は、光統制された合成の生成物の多項式による表現を可能とする。（ある光活性化された合成は、約されない、すなわち、素数の多項式によってのみ表示することができる。）例えば、第８ａ図の上の合成（下に記載する）に相当する多項式は、次の通りである：
Ｐ＝（Ａ＋Ｂ）（Ｃ＋Ｄ）
反応の多項式は、それが代数学の表現であるように、展開することができるが、ただし反応成分Ｘ１、およびＸ２を接合する順序は保存される（Ｘ１、Ｘ２、≠Ｘ２、Ｘ１）、すなわち、生成物は交換可能ではないことを条件とする。次いで生成物はＡＣ＋ＡＤ＋ＢＣ＋ＢＤである。多項式は反応成分を明瞭に特定し、そして各工程のためのマスクを暗示的に特定する。括弧の各対は合成のラウンドを証明する。あるラウンドの化学的反応成分（例えば、ＡおよびＢ）はオーバーラッピングしない部位において反応し、それゆえ互いに組み合わせることができない。合成区域はラウンドの要素の間で等しく分画される（例えば、Ａはその区域の１つの半分に向けられ、そしてＢは他方の半分に向けられる）。それゆえ、あるラウンドにためのマスク（例えば、マスクｍＡおよびｍＢ）は直交し、そして正規直交の組を形成する。多項式の表示は、また、あるラウンドにおける各要素が次のラウンドの各要素に対して接合すべきであることを意味する（例えば、ＡとＣ、ＡとＤ、ＢとＣ、およびＢとＤ）。これはｍＣをｍＡおよびｍＢと等しくオーバーラッピングし、そしてｍＤについて同様にオーバーラッピングすることによって達成される。ＣおよびＤはあるラウンドの要素であるので、ｍＣおよびｍＤは互いに対して直交し、そして正規直交の組を形成する。
【００８７】
１６の生成物が４つの反応成分から作られる、前述のバイナリー合成の多項式の表示は、次の通りである：
【００８８】
【数９】
【００８９】
これは展開するとＡＢＣＤ，ＡＢＣ，ＡＢＤ，ＡＢ，ＡＣＤ，ＡＣ，ＡＤ，Ａ，ＢＣＤ，ＢＣ，ＢＤ，Ｂ，ＣＤ，Ｃ，Ｄ、および
【００９０】
【数９Ａ】
【００９１】
を与える（
【００９２】
【数１０】
【００９３】
であるという規則であり、そして接合は順序づけられていることを思い起こす）。二段階合成において、各ラウンドは１つの反応成分および１つの零（
【００９４】
【数１１】
【００９５】
により表示される）を含有する。合成区域の半分は反応成分を受け取り、そして他方の半分はゼロを受け取る。各マスクはすべての他のマスクと等しくオーバーラップする。二段階のラウンドおよび非二段階のラウンドは、次のように、必要に応じて相互に分散させることができる：
【００９６】
【数１２】
【００９７】
形成される１８の化合物は、ＡＢＣＥ，ＡＢＣＦ，ＡＢＣＧ，ＡＢＤＥ，ＡＢＤＦ，ＡＢＤＧ，ＡＢＥ，ＡＢＦ，ＡＢＧ，ＢＣＥ，ＢＣＦ，ＢＣＧ，ＢＤＲ，ＢＤＦ，ＢＤＧ，ＢＥ，ＢＦおよびＢＧである。この７工程のためのスイッチのマトリックスＳは、次の通りである：
【００９８】
【数１３】
【００９９】
（Ｂ）により表示されるラウンドはすべての生成物の中にＢを配置する。なぜなら、反応区域は均一に活性化されるからである（Ｂのためのマスクは完全に１から成る）。
【０１００】
第ｉラウンドがｂｉの化学的反応成分およびＺｉの零を有する、ｒラウンドから成る合成において形成される化合物Ｋの数は、
Ｋ：＝Σ（ｂｉ＋Ｚｉ）
であり、そして化学的工程ｎの数は
ｎ＝Ｅｂｉ
である。すべてのラウンドにおいてｂ＝ａ（化学的構成ブロックの数）およびｚ＝０であるとき合成される化合物の数はａｎ／ａであり、これに対して二段階合成については２ｎである。ｎ−２０かつａ＝５について、６２５の化合物（すべてテトラマー）が形成し、これに対して同一の数の化学的工程をもつ二段階合成において１，０４９×１０６の化合物が形成するであろう。また、多項式におけるラウンドは、
【０１０１】
【数１４】
【０１０２】
におけるように、集合させることができることに注意すべきである。生成物はＡＤ，ＢＣＤ，ＢＤ，ＣＤ，Ｄ，Ａ，ＢＣ，Ｂ，Ｃおよび
【０１０３】
【数１５】
【０１０４】
である。
【０１０５】
二段階合成は２つの理由で魅力的である。第１に、それらは所定の数の化学的工程（ｎ）について最大の数の生成物（２ｎ）を発生する。４つの反応成分について、１６の化合物が二段階合成において形成するが、各ラウンドが２つの反応成分を有するとき、わずかに４つがつくられる。１０工程の二段階合成は１，０２４の化合物を生じ、そして２０工程の合成は１，０４８，５７６を生ずる。第２に、二段階合成において形成する生成物は０からｎの長さの範囲をもつ完全な集合した組である。最長の生成物（ｎマー）から１または２以上の単位を欠失させることによって形成できるすべての化合物が存在する。二段階の組内のより小さい組が含有され、これらの組は任意の他のマスクの組を使用して同一の反応成分から形成されるであろう（例えば、第５図に示す合成において形成するＡＣ，ＡＤ，ＢＣおよびＢＤは、二段階合成により形成する１６の組の中に存在する）。しかしながら、ある場合において、実験的に達成することができる空間的分割は形成するすべての化合物を収容するために十分でないことがある。したがって、実際の制限は、所定の合成のために可能なスイッチのベクトルの特定のサブセットの選択を必要とすることがある。
【実施例】
【０１０６】
１．実施例
第５図は、二段階マスキング法を使用する合成を示す。二段階マスキング法は、所定数のサイクルについて最大数の配列を提供する。この態様によれば、マズクｍ１は支持体の半分の照明を可能とする。次いで支持体を構成ブロックに対して露出し、これは照明された領域において結合する。
【０１０７】
次いでｍ２は前に照明された領：域の半分の照明を可能とするが、それは前に照明された領域の半分を照明しない。次いで構成ブロックＢを添加し、これはｍ２からの照明された領域において結合する。このプロセスをマスクｍ３，ｍ４およびｍ５を使用して続け、この図面の下部に示す生成物の配列を生ずる。このプロセスは５（モノマーの数）サイクルで３２（モノマーの数の基数で２を累乗した）サイクルを発生する。
【０１０８】
２．実施例
第６図は、ここにおいてグレイコードのマスキング法と呼ぶ他の好ましい二段階マスキング法を例示する。この態様によれば、任意の所定の合成領域の側面が１つだけのマスクのへりにより規定されたように、マスクｍ１〜ｍ５を選択する。例えば、配列ＢＣＤＥが形成される部位は、ｍ５により規定されたその右へりおよびマスクｍ４により形成されたその左側を有する（そして他のマスクはこの部位の側面で整列されていない）。したがって、非整列、マスクの下の光の拡散などにより発生する問題は最小とされるであろう。
【０１０９】
３．実施例
第７図は、他の二段階マスキング法を例示する。ここにおいて変更されたグレイコードの二段階マスキング法と呼ぶ、このスキームによれば、必要なマスクの数は最小とされる。例えば、マスクｍ２はｍ１と同一のマスクであり、そして単に横方向に並進させることができる。同様に、マスクｍ４はｍ３と同一のマスクであり、そして単に横方向に並進させることができる。
【０１１０】
４．実施例
４工程の合成は第８ａ図に示されている。反応成分は順序づけられた組である｛Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ｝。第１サイクルにおいて、ｍ１を通した照明は合成区域の上半分を活性化する。次いで構成ブロックＡを添加して分布６０２を与える。マスクｍ２を通して照明し（これは下半分を活性化する）、次いでＢを添加すると、次の照明分布６０４が生ずる。ｍ３を通して照明し（これは左半分を活性化する）次いでＣを添加すると、分布６０４が得られ、そしてｍ４を通して照明し（これは右半分を活性化する）次いでＤを添加すると、最終の生成物のパターン６０８が得られる｛ＡＣ，ＡＤ，ＢＣ，ＢＤ｝。
【０１１１】
５．実施例
合成の上のマスキング法を、第８ｂ図に示すように、２０の天然に見いだされるアミノ酸からのすべての４００ジペプチドのために拡張することができる。この合成は２ラウンドから成り、２０の光分解および化学的カップリング／ラウンドを使用する。ラウンド１の第１サイクルにおいて、マスク１は２０のアミノ酸の第１とのカップリングのために支持体の１／２０を活性化する。ラウンド１において１９の引き続く照明／カップリングのサイクルは、各々が２０アミノ酸の離散した構成員を有する、２０の長方形のストライプから成る支持体を生ずる。ラウンド２のマスクはラウンド１のマスクに対して垂直であり、したがって、ラウンド２における単一の照明／カップリングのサイクルは２０のジペプチドを生ずる。ラウンド２の２０の照明／カップリングのサイクルは４００のジペプチドの合成を完結する。
【０１１２】
６．実施例
２段階マスキング法の力は、１，０２４ペプチドを生成した１０工程の合成の結果から理解することができる。この１０工程の二段階合成のための多項式の表現は、次の通りであった：
【０１１３】
【数１６】
【０１１４】
各ペプチドは４００×４００μｍの正方形を占有した。３２×３２のペプチドの配列（１，０２４のペプチド、ｌ＝１の零のペプチドおよび１０ペプチド、および制限された数の複製を含む）は、側面の基の脱保護および抗体３Ｅ７および蛍光化抗体による処理後に、蛍光走査により明瞭に明らかであった。各合成部位は４００×４００μｍの正方形であた。
【０１１５】
走査は、３，３００の計数のバックグラウンド値から最も明るい正方形（ｘ−２０，ｙ−９）における２２，４００の計数の、蛍光強度の範囲を示した。わずかに１５の化合物は１２，３００の計数より大きい強度を示した。この配列の平均値は４，８００の計数であった。
【０１１６】
この配列における各ペプチドの同一性は第９図のそのｘおよびｙ座標（各々０〜３１の範囲）および地図から決定することができた。位置２，５，６，９および１０における化学的単位はｙ座標により特定され、そして位置１，３，４，７，８におけるそれらはｘ座標により特定されている。ペプチドの１つの除外するすべては１０残基より短かった。例えば、ｘ＝１２および＝３におけるペプチドはＹＧＡＧＦである（配列識別番号：３；位置１，６，８，９および１０は零である）。ＹＧＡＦＬＳ（配列識別番号：４）、この配列の最も明るい要素はｘ＝２０およびｙ＝９に存在する。
【０１１７】
測定した蛍光強度から所定のペプチドの結合親和性を推定することがしばしば望ましい。考えられることには、最も簡単な場合は単一のペプチドが１価の抗体分子に結合する場合である。蛍光走査は、スライドを緩衝液で規定された時間の問洗浄した後、実施する。次いで、蛍光強度の順序は抗体−ペプチド複合体の相対的解離速度の測度である。速度定数が同一である場合（すなわち、それらが拡散コントロールされている場合）、蛍光強度の順序は典型的には結合親和性の順序に相当するであろう。しかしながら、立場は時にはいっそう複雑である。なぜなら、２価の一次抗体および２価の二次抗体を使用するからである。合成区域におけるペプチドの密度は約７ｎｍの平均の分離に相当し、これは多価の抗体−ペプチドの相互作用を可能とするであろう。それゆえ、ここにおける方法に従い得られた蛍光強度はしばしば結合親和性の定量的インジケーターであろう。
【０１１８】
他の重要な考察は合成の信頼性である。不完全光脱保護または不完全なカップリングにより、欠失が生成される。これらの実験におけるカップリングの収率／サイクルは典型的には８５％〜９５％である。マスキングによリスイッチのマトリックスを実施することは、光の拡散、内部反射および散乱のために、不完全である。結局、積み込み（内蔵ではない化学的ユニット）が、暗くあるべき領域の意図しない照明により生ずる。二段階合成配列は、合成の信頼性を評価するために必要な多数のコントロールを含有する。例えば、公称テトラペプチドＡＢＣＤを含有する合成区域からの蛍光シグナルはトリペプチド欠失不純物、例えば、ＡＣＤから来ることがある。このような人工物は、ＡＣＤ部位の蛍光強度がＡＢＣＤ部位のそれより低いという発見により除外されるであろう。
【０１１９】
前述の１，０２４ペプチドの合成で得られた配列の中の１５の最も高度に蛍光性のペプチドは、次の通りであった：ＹＧＦＬＳ（配列番号：４）、ＹＧＡＦＳ（配列番号：５）、ＹＧＡＦＬ（配列番号：６）、ＹＧＧＦＬＳ（一配列番号７３）、ＹＧＡＦ（配列番号：８）、ＹＧＡＬＳ（配列番号：９）、ＹＧＧＦＳ（配列番号：１０）、ＹＧＡＬ（配列番号：１１）、ＹＧＡＦＬＦ（配列番号：１２）、ＹＧＡＦ（配列番号：８）、ＵＧＡＦＦ（配列番号：１３）、ＹＧＧＬＳ（配列番号：１４）、ＹＧＧＦＬ（配列番号：１および配列番号：１５）、ＹＧＡＦＳＦ（配列番号：１６）、およびＹＧＡＦＬＳＦ（配列番号：１７）。顕著な特徴は、すべての１５がＹＧで開始するということであり、これはアミノ末端のチロシンが３Ｅ７への結合の主要な決定基であることを示す前の研究と一致する。この組の残基３はＡまたはＧであり、そして残基４はＦまたはＬである。これらの位置からのＳおよびＴの排除は明瞭な切断である。好ましい配列はＹＧ（Ａ／Ｇ）（Ｆ／Ｌ）であるという発見は、組み換えＤＮＡ方法により発生したファージ上のペプチドの非常に大きいライブラリーを抗体３Ｅ７への結合についてスクリーニングした研究の結果とよく合致する（参照、Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９００）８７：６３７８、ここに引用によって加える）。ファージの実験でペプチドからの手がかりに基づく追加のバイナリー合成は、ＹＧＡＭＱ（配列番号：１８）、ＹＧＡＦＭ（配列識別番号：１９）およびＹＧＡＦＱ（配列識別番号：２０）がＹＧＧＦＭ（配列番号：２１）（抗体３Ｅ７を得るために使用した免疫原）より強い蛍光シグナルを与えることを示す。
【０１２０】
上のマスキング法についての変法はある種の場合において価値があるであろう。例えば、問題の「中心部（ｋｅｒｎｅ１）」配列がＸＹＺから分離したＰＱＲから成る場合、目的はこれらの単位が可変数の異なる残基により分離されているペプチドを合成することである。中心部はどこかに１を有するマスクを使用することによって各ペプチドの中に配置することができる。適当な合成の多項式の表示は、次の通りである：
【０１２１】
【数１７】
【０１２２】
６マーのＰＱＲＸＹＺから１０マーのＰＱＲＡＢＣＤＸＹＺまでの長さの範囲の、１６のペプチドが形成されるであろう。
【０１２３】
いくつかの他のマスキング法は、また、選択した場合において価値を見いだすであろう。１より多い特定のマスクを使用することによって、２またはそれ以上の反応成分が同一の組の生成物の中に現れるであろう。例えば、８工程の合成のためのマスクが、
Ａ１１１１００００
Ｂ００００１１１１
Ｃ１１００１１００
Ｄ００１１００１１
Ｅ１０１０１０１０
Ｆ０１０１０１０１
Ｇ１１１１００００
Ｈ００００１１１１
であると仮定する。
【０１２４】
生成物はＡＣＥＧ，ＡＣＦＧ，ＡＤＥＧ，ＡＤＦＧ，ＢＣＥＨ，ＢＣＦＨ，ＢＤＥＨおよびＢＤＦＨである。ＡおよびＧは常に同一の生成物の中に現れるが、必ずしも互いに隣接しない。なぜなら、それらの添加は同一マスクにより方向づけられていたからであり、そしてＢおよびＨについても同様であった。
【０１２５】
Ｃ．リンカーの選択
好ましい態様によれば、合成されたポリマーと支持体との間の中間体として使用するリンカー分子は、レセプターとの改良された結合相互作用のために最適な長さまたは型について選択される。本発明のこの面に従い、変化する長さおよび／または型の種々のリンカーの長さおよび型の変動により、固定化されたリガンドおよびそのレセプターとの間の結合相互作用を最適化することが可能となる。
【０１２６】
リガンド（ペプチド、インヒビター、ハプテン、薬物など）およびその（酵素、抗体など）との間の結合の程度は、相手の一方を支持体上に固定化すると、ある態様において、溶液の中のレセプターの固定化されたリガンドへのアクセス可能性に依存する。引き続いてアクセス可能性は、相手の一方を固定化するために使用したリンカー分子の長さおよび／または型に依存するであろう。したがって、本発明の好ましい態様は、ここに記載するＶＬＳＩＰＳ技術を使用して、変化する長さおよび／または型のリンカーの配列を発生させ、好ましくはリンカーを不活性化または不活性とし、光化学的保護を使用して支持体の異なる領域を選択的に暴露し、そして化学的活性な基を構成する。
【０１２７】
この概念の最も簡単な態様において、同一の単位をＶＬＳＩＰＳ技術により支持体上の既知の位置において変化する多重度または長さで支持体に取り付けて、変化する長さのポリマーの配列を発生する。単一のリガンド（ペプチド、薬物、ハプテンなど）をそれらの各々に取り付け、そして結合部位を使用してアッセイを実施して、リガンドに結合することが知られているレセプターとの結合の程度を評価する。リンカーの長さがリガンドに結合するレセプターの能力を衝撃する場合において、変化するレベルの結合が観察されるであろう。一般に、最高の結合を提供するリンカーは引き続いて使用して、ここにおける技術に従い合成された他のリガンドをアッセイする。
【０１２８】
他の態様に従い、単一のリガンド／レセプターの対の間の結合を種々のモノマー配列のリンカーについて評価する。これらの態様によると、リンカーをここにおける技術に従い配列で合成し、そしてリンカーは異なるモノマーの配列（および、必要に応じて、異なる長さ）を有する。したがって、リンカー分子のすべては所定のレセプターに対する結合親和性を少なくともある程度もつことが知られているリガンドを有する。次いで、所定のレセプターをリガンドに暴露し、そして結合親和性を推定する。次いで、リガンドとレセプターとの間の適切な結合を提供するリンカー分子をスクリーニングの研究において利用する。
【０１２９】
Ｄ．保護基
前述したように、選択的に除去可能な保護基は異なる反応性を有する支持体表面のよく規定された区域の発生を可能とする。好ましくは、保護基は特定のアクチベーター、例えば、特定の波長および強度の電磁輻射線を適用することによって表面から選択的に除去する。さらに詳しくは、特定のアクチベーターは表面の選択した区域を暴露して、暴露された区域における保護基を除去する。
【０１３０】
本発明の保護基は固相オリゴマー合成、例えば、天然または天然以外のアミノ酸を使用するペプチド合成、デオキシリボ核酸およびリボ核酸を使用するヌクレオチド合成、オリゴ糖合成などに関連して使用される。支持体表面を不必要な反応から保護することに加えて、保護基はモノマーの反応性末端をブロックして自己重合を防止する。例えば、活性化されたアミノ酸、例えばＮ一ヒドロキシスクシンイミド活性化されたアミノ酸のエステルのアミノ末端に保護基を取り付けると、１つのモノマーのアミノ末端はペプチド合成の間に他の活性化されたエステル部分との反応から防止される。あるいは、保護基をアミノ酸のカルボキシル基に取り付けて、この部位における反応を防止することができる。大部分の保護基はアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基に取り付けることができ、そして化学的合成の性質はどの反応性基が保護基を必要とするかを支配するであろう。同様に、合成の間、例えば、ホスフェート−トリエステルカップリング化学を使用してヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基に保護基を取り付けると、１つのヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基は他の３’−活性化ボスフェート−トリエステルとの反応から防止される。
【０１３１】
特定の使用に無関係に、保護基を使用してある分子のある部分を他の試薬との反応から保護する。本発明の保護基は次の特性を有する：保護基は選択した試薬がそれらが取り付けられている基を修飾するのを防止する：保護基は合成反応条件に対して安定である（すなわち、それらは分子の結合したままである）：それらは残りの構造に悪影響を及ぼさない条件下に除去可能である：そしていったん除去されると、それらは表面または表面に結合したオリゴマーと感知し得る程度に反応しない。適当な保護基の選択は、もちろん、モノマー単位およびオリゴマーの化学的性質、ならびにそれらが保護を目的とする特定の試薬に依存するであろう。
【０１３２】
好ましい態様において、保護基は光活性化可能である。光活性保護の化合物の性質および使用は概観されてきている。参照、ＭｃＣｒａｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）１８：２３９−２７０、その開示をここに引用によって加える。好ましくは、光感受性保護基は電磁スペクトルの紫外線（ｕＶ）または可視部分における放射線により除去可能である。より好ましくは、保護基はスペクトルの近ＵＶまたは可視部分における放射線により除去可能であろう。しかしながら、ある態様において、活性化は他の方法、例えば、局在化加熱、電子ビームの平板印刷法、レーザーポンピング、微小電極を使用する酸化または還元などにより実施することができる。スルホニル化合物は電子ビームの平板印刷法のために適当な群である。酸化的または還元的除去は、好ましくは活性化しようとする表面の前以て規定した領域に向けられた微小電極を使用して、電源に保護基を暴露することによって達成される。他の方法はこの開示に照らして使用することができる。
【０１３３】
光除去可能な保護基の、すべてではないが、多数は近ＵＶまたは可視放射線を吸収する芳香族化合物であろう。適当な光除去可能な保護基は、例えば、ＭｃＣｒａｙら、Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９７０）９２：６３３３、およびＡｍｉｔら、Ｊ．Ｏｒｇ，Ｃｈｅｍ．（１９７４）３９：１９２、その開示をここに引用によって加える、に記載されている。
【０１３４】
光除去可能な保護基の好ましいクラスは次の一般式を有する：
【０１３５】
【化９】
【０１３６】
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は独立に水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、またはホスフィド基であるか、あるいは隣接する置換基（すなわち、Ｒ１−Ｒ２，Ｒ２−Ｒ３，Ｒ３−Ｒ４）は一緒になって環状アセタールまたはケタールを形成する置換された酸素基であり；Ｒ５は水素原子、アルコキシル、アルキル、ハロ、アリール、またはアルケニル基であり、そしてｎ＝０または１。
【０１３７】
アミノ酸のカルボキシル末端またはヌクレオチドのヒドロキシル基を保護するために使用する、好ましい保護基である６−ニトロベラトリル（ＮＶ）は、Ｒ２およびＲ３の各々がメトキシ基であり、Ｒ１，Ｒ４およびＲ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝０であるとき、形成する：
【０１３８】
【化１０】
【０１３９】
アミノ酸のアミノ末端を保護するために使用する、好ましい保護基である６−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）は、例えば、Ｒ２およびＲ３の各々がメトキシ基であり、Ｒ１，Ｒ４およびＲ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝１であるとき、形成する：
【０１４０】
【化１１】
【０１４１】
アミノ酸のカルボキシル末端またはヌクレオチドのヒドロキシル基を保護するために使用する、他の好ましい保護基である６−ニトロピペロニル（ＮＰ）は、Ｒ２およびＲ３が一緒になってメチレンアセタールを形成し、Ｒ１，Ｒ４およびＲ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝０であるとき、形成する：
【０１４２】
【化１２】
【０１４３】
アミノ酸のアミノ末端を保護するために使用する、他の好ましい保護基である６−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＮＰＯＣ）は、例えば、Ｒ２およびＲ３が一緒になってメチレンアセタールを形成し、Ｒ１，Ｒ４およびＲ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝１であるとき、形成する：
【０１４４】
【化１３】
【０１４５】
アミノ酸のカルボキシル末端またはヌクレオチドのヒドロキシル基を保護するために使用する、最も好ましい保護基であるメチル−６−ニトロベラトリル（ＭｅＮＶ）は、Ｒ２およびＲ３の各々がメトキシ基であり、Ｒ１およびＲ５の各々が水素原子であり、Ｒ５はメチル基であり、そしてｎ＝０であるとき、形成する：
【０１４６】
【化１４】
【０１４７】
アミノ酸のアミノ末端を保護するために使用する、最も好ましい保護基であるメチル−６−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＭｅＮＶＯＣ）は、例えば、Ｒ２およびＲ３０）各々がメトキシ基であり、Ｒ１およびＲ４の各々が水素原子であり、Ｒ５がメチル基であり、そしてｎ＝１であるとき、形成する：
【０１４８】
【化１５】
【０１４９】
アミノ酸のカルボキシル末端またはヌクレオチドのヒドロキシル基を保護するために使用する、他の最も好ましい保護基であるメチル−６−ニトロピペロニル（ＭｅＮＰ）は、Ｒ２およびＲ３が一緒になってメチレンアセタールを形成し、ＲｌおよびＲ４の各々が水素原子であり、Ｒ５がメチル基であり、そしてｎ＝０であるとき、形成する：
【０１５０】
【化１６】
【０１５１】
アミノ酸のアミノ末端を保護するか、あるいはヌクレオシドの５’ヒドロキシルを保護するために使用する、他の最も好ましい保護基であるメチル−６−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）は、例えば、Ｒ２およびＲ３が一緒になってメチレンアセタールを形成し、Ｒ１およびＲ４の各々が水素原子であり、Ｒ５がメチル基であり、そしてｎ＝１であるとき、形成する：
【０１５２】
【化１７】
【０１５３】
アミノ末端上に光活性化可能な保護基、例えば、ＮＶＯＣまたはＮＰＯＶＣまたはそれらの対応するメチル誘導体、それぞれ、ＭｅＮＶＯＣまたはＭｅＮＰＯＣＶを有する保護されたアミノ酸は、アミノ酸のアミンを保護基の活性化されたオキシカルボニルエステルでアシル化することによって形成される。ＮＶＯＣおよびＭｅＮＶＯＣの活性化されたオキシカルボニルエステルの例は、次の一般式を有する：
【０１５４】
【化１８】
【０１５５】
式中Ｘはハロゲン、混合された無水物、フェノキシ、ｐ−ニトロフェノキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどである。
【０１５６】
アミノ酸のカルボキシ末端またはヌクレオチドの５’−ヒドロキシル末端上に光活性化可能な保護基、例えば、ＮＶまたはＮＰまたはそれらの対応するメチル誘導体、結果ＭｅＮＶまたはＭｅＮＰを有する保護されたアミノ酸またはヌクレオチドは、カルボキシ末端または５’−〇Ｈを保護基の活性化されたベンジル誘導体でアシル化することによって形成される。ＭｅＮＶまたはＭｅＮＰの活性化された誘導体の例は、次の一般式を有する：
【０１５７】
【化１９】
【０１５８】
式中Ｘはハロゲン、ヒドロキシル、トシル、メシル・トリフルオロメチル、ジアゾ、アジドなどである。
【０１５９】
保護されたモノマーを発生させる他の方法は、保護基のベンジルアルコール誘導体をモノマーの活性化エステルと反応させることである。例えば、アミノ酸のアミノ末端を保護するために、アミノ酸の活性化エステルを保護基のアルコール誘導体、例えば、６−ニトロベラトロ一ル（ＮＶＯＨ）と反応させる．このような使用に適当な活性化エステルの例は、ハロ−ホルメート、混合無水物、イミダゾイルホルメート、アシルハライドを包含し、そしてまた活性化エステルのその場の形成および普通の試薬、例えば、ＤＣＣなどの使用を包含する。活性化エステルの他の例については、Ａｔｈｅｒｔｏｎらを参照のこと。
【０１６０】
保護されたモノマーを発生する他の方法は、保護基のベンジルアルコール誘導体をモノマーの活性化された炭素と反応させることである。例えば、核酸の５’−ヒドロキシルを保護するために、５’−活性化炭素を有する誘導体を保護基のアルコール誘導体、例えばメチル−６−ニトロピペロノール（ＭｅＰｙＲＯＨ）と反応させる。５’−ヒドロキシル基に結合した活性化基を有するヌクレオチドの例は、次の一般式を有する：
【０１６１】
【化２０】
【０１６２】
式中Ｙはハロゲン原子、トシル、メシル、トリフルオロメチル、アジド、またはジアゾ基などである。
【０１６３】
好ましい光化学的保護基の他のクラスは、次の式を有する：
【０１６４】
【化２１】
【０１６５】
式中、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は独立に水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルファネート、スルフィドまたはホスフィド基であり、Ｒ４およびＲ５は独立に水素原子、アルコキシ、アルキル、ハロ、アリール、またはアルケニル基であり、そしてｎ＝０または１。
【０１６６】
アミノ酸のアミノ末端を保護するために使用する、好ましい保護基である１一ピレニルメチルオキシカルボニル（ＰｙＲＰＣ）は、例えば、Ｒ１〜Ｒ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝１であるとき形成する：
【０１６７】
【化２２】
【０１６８】
アミノ酸のカルボキシ末端またはヌクレオチドのヒドロキシル基を保護するために使用する、他の好ましい保護基である１−ピレニルメチル（ＰｙＲ）は、例えば、Ｒ１〜Ｒ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝０であるとき形成する：
【０１６９】
【化２３】
【０１７０】
そのアミノ末端上にピレニルメチルオキシカルボニル保護基を有するアミノ酸は、アミノ酸の遊離アミンをピレニル保護基の活性化オキシカルボニルエステルでアシル化することによって形成される。ＰｙＲＯＣの活性化オキシカルボニルエステルの例は、次の一般式を有する：
【０１７１】
【化２４】
【０１７２】
式中Ｘはハロゲンまたは混合無水物、ｐ−ニトロフェノキシまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基などである。
【０１７３】
それぞれ、アミノ酸のカルボキシ末端または核酸の５’−ヒドロキシ末端上に光活性化可能な保護基、例えば、ＰｙＲを有する保護されたアミノ酸またはヌクレオチドは、カルボキシ末端または５’−〇Ｈを保護基の活性化ピレニルメチル誘導体でアシル化することによって形成される。ＰｙＲＯＣの活性化ピレニルメチル誘導体の例は、次の一般式を有する：
【０１７４】
【化２５】
【０１７５】
式中Ｘはハロゲン原子、ヒドロキシル、ジアゾ、またはアジド基などである。
【０１７６】
保護されたモノマーを発生する他の方法は、保護基のピレニルメチルアルコール部分をモノマーの活性化エステルと反応させることである。例えば、アミノ酸の活性化エステルは、保護基のアルコール誘導体、例えば、ピレニルメチルアルコール（ＰｙＲＯＨ）と反応させて、アミノ酸のカルボキシ末端の保護された誘導体を形成することができる。活性化エステルの例は、ハロ−ホルメート、混合無水物、イミダゾイルホルメート、アシルハライドを包含し、そしてまた活性化エステルのその場の形成および普通の試薬、例えば、ＤＣＣなどの使用を包含する。
【０１７７】
明らかなように、多数の光感受性保護基は本発明において適当である。
【０１７８】
好ましい態様において、支持体を照射して光不安定性保護基を除去し、そして遊離の反応性部分および保護基から生ずる副生物を有する領域をつくる。保護基の除去速度は、入射放射線の波長および強度、ならびに保護基それ自体の物理的および化学的性質に依存する。好ましい保護基は、より速い速度でかつより低い強度の放射線で除去される。例えば、所定の組の条件において、ＭｅＮＶＯＣおよびＭｅＮＰＯＣは、それらの非置換の親化合物、結果ＮＶＯＣおよびＮＰＯＣより速く、ペプチド鎖のＮ末端から光分解的に除去される。
【０１７９】
保護基の除去は、照射により反応性基および保護基から誘導された分解生成物を分離することによって達成される。理論により拘束されたくないが、ＮＶＯＣおよびＭｅＮＶＯＣで保護されたオリゴマーの照射は次の反応スキームにより起こると信じられる：
ＮＶＯＣ−ＡＡ→３，４−ジメトキシ−６−ニトロソベンズアルデヒド＋ＣＯ２＋ＡＡ
ＭｅＮＶＯＣ−ＡＡ→３，４−ジメトキシ−６−ニトロソアセトフェノン＋ＣＯ２＋ＡＡここでＡＡはアミノ酸オリゴマーのＮ末端を表す。
【０１８０】
保護されないアミノ酸と一緒に、他の生成物は溶液の中に遊離する：二酸化炭素および２，３−ジメトキシ−６−ニトロソフェニルカルボニル化合物、これはオリゴマーの親核部分と反応して不必要な二次反応を形成する。ＮＶＯＣ保護されたアミノ酸の場合において、分解生成物はニトロソベンズアルデヒドであるが、他方の分解生成物はニトロソフェニルケトンである。例えば、ＮＶＯＣからの生成物のアルデヒドは遊離アミンと反応してシッフ塩基（イミン）を形成し、これは残りのポリマーの合成に影響を与える。好ましい光除去可能な保護基の支持体上のオリゴマーをゆっくりまたは逆に反応する。
【０１８１】
再び理論により拘束されたくないが、ＭｅＮＶＯＣ保護されたオリゴマーの照射からの生成物であるケトンは、同一のＮＶＯＣ保護されたオリゴマーの生成物であるアルデヒドよりゆっくりした速度で、オリゴマー上の親核成分と反応すると信じられる。明瞭には決定されないが、この反応速度の差は、立体的および電子的効果のための親核物質に向かうアルデヒドとケトンとの間の全体の反応性の差のためである。本発明の光除去可能な保護基は容易に除去される。例えば、異なる光除去可能な保護基を有する溶液中のＮ−保護されたＬ−フェエルアラニンの光分解を分析し、そして結果を下表に表す：
【０１８２】
〔表〕
【０１８３】
半減期ｔ１／２は、出発量の保護基の５０％を除去するために要求される時間（秒）である。ＮＢＯＣは６一ニトロベンジルオキシカルボニル基であり、ＮＶＯＣは６−ニトロベラトリルオキシカルボニル基であり、ＭｅＮＶＯＣはメチル−６−ニトロベラトリルオキシカルボニル基であり、そしてＭｅＮＰＯＣはメチル−６−ニトロピペロニルオキシカルボニル基である。光分解は示した溶媒の中で１０ｍＷ／ｃｍ２の強度を有する３６２／３６４ｎｍの波長の照射を使用して実施し、そして各保護されたフェニルアラニンの濃度は０．１０ｍＭであった。
【０１８４】
この表が示すように、ＮＶＯＣ，ＭｅＮＶＯＣおよびＭｅＮＰＯＣで保護されたフェニルアラニンの脱保護はＮＢＯＣの脱保護より速く進行した。さらに、ベンジル炭素上で置換された２つの誘導体であるＭｅＮＶＯＣおよびＭｅＮＰＯＣは、ジオキサンおよび酸性化されたジオキサンの両者の中で最高速度で光分解された。
【０１８５】
１．ペプチドの固相合成の間の光除去可能な基の使用
固相支持体上のペプチドの形成は、支持体に結合した成長する鎖にアミノ酸を段階的に取り付けることを必要とする。反応条件下のモノマーのアミノ酸の不都合な重合を防止するために、アミノ酸のアミノ末端の保護を必要とする。モノマーをペプチドの末端にカップリングさせた後、Ｎ末端の保護基を除去し、そして他のアミノ酸をこの鎖にカップリングさせた。カップリングおよび脱保護のこのサイクルはペプチド配列の中の各アミノ酸について続けられる。参照、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６３）８５：２１４９、およびＡｔｈｅｒｔｏｎら、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、１９８９，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ロンドン、それらの両者をすべての目的のためにここに引用によって加える。前述したように、光除去可能な保護基の使用は、固相合成の脱保護サイクルの聞に、パターン化された照射により、支持体表面の選択した部分の除去を可能とする。これは合成の窒間的コントロールを選択的に可能とする−一次のアミノ酸を照射された区域にのみカップリングされる。
【０１８６】
１つの態様において、本発明の光除去可能な保護基はアミノ末端におけるアミノ酸の活性化エステルに取り付けられる：
【０１８７】
【化２６】
【０１８８】
式中Ｒは天然または天然以外のアミノ酸の側鎖であり、Ｘは光除去可能な保護基であり、そしてＹは活性カルボン酸誘導体である。光除去可能な保護基であるＸは、好ましくは前述したようにＮＶＯＣ，ＮＰＯＣ，ＰｙＲＯＣ，ＭｅＮＶＯＣ，ＭｅＮＰＯＣなどである。活性化エステルであるＹは、好ましくは高いカップリング効率を有する反応性誘導体、例えば、アシルハライド、混合無水物、Ｎ一ヒドロキシスクシンイミドエステル、パーフルオロフェニルエステル、またはウレタン保護された酸などである。他の活性化エステルおよび反応条件はよく知られている（参照、Ａｔｈｅｒｔｏｎら）。
【０１８９】
２．オリゴヌクレオチドの．固相合成の間の光除去可能な基の使用
固相支持体上のヌクレオチドの形成は、支持体に結合した成長するオリゴマーへのヌクレオチドの段階的取り付けを必要とする。反応条件下のモノマーのヌクレオチドの不都合な重合を防止するために、ヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基の保護を必要とする。モノマーをオリゴマーの末端にカップリングした後、５’−ヒドロキシル保護基を除去し、そして他のヌクレオチドをこの鎖にカップリングする。カップリングおよび脱保護のこのサイクルはオリゴマー配列の中の各ヌクレオチドについて統ける。参照、Ｇａｉｔ，「オリゴヌクレオチドの合成：実際のアプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、１９８４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ロンドン、これをすべての目的のためにここに引用によって加える。前述したように、光除去可能な保護基の使用は、固相合成の脱保護サイクルの間に、支持体表面の選択した部分の、パターン化された照射により、除去を可能とする。これは選択的に合成の空間的コントロールを可能とする−一次のヌクレオチドは照射された区域にのみカップリングされる。
【０１９０】
ヌクレオチドの合成は、一般に、ヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基上の活性化されたリン誘導体を固体の支持体に結合したオリゴマーの５’−ヒドロキシル基にカップリングすることを包含する。このカップリングを実施する２つの主要な化学的方法が存在する：ホスフェート−トリエステル法およびホスホルアミダイト法（参照、Ｇａｉｔ）。本発明の保護基はいずれの方法における使用にも適する。
【０１９１】
好ましい態様において、光除去可能な保護基を５’−ヒドロキシル基上の活性化されたヌクレオチドに取り付ける；
【０１９２】
【化２７】
【０１９３】
式中Ｂは糖環に結合した塩基であり；Ｒは糖がデオキシリボースであるとき水素原子であるか、あるいはＲは糖がリボースであるときヒドロキシルであり；Ｐは活性化されたリンの基であり；そしてＸは光除去可能な保護基である。光除去可能な保護基であるＸは前述したように好ましくはＮＶ，ＮＰ，ＰｙＲ，ＭｅＮＶ，ＭｅＮＰ，ＮＶＯＣ，ＮＰＯＣ，ＰｙＲＯＣ，ＭｅＮＶＯＣ，ＭｅＮＰＯＣなどである。活性化されたリンの基であるＰは、好ましくは高いカップリング効率を有する反応性誘導体、例えば、ホスフェート−トリエステル、ホスホルアミダイトなどである。他の活性化リン誘導体、ならびに反応条件はよく知られている（参照、Ｇａｉｔ）。
【０１９４】
Ｅ．光除去可能な基で保護されたアミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄのペプチド合成の間に、アミノ酸の活性化エステルを支持体に結合したオリゴマーの遊離アミノ末端とカップリングさせる。固相合成に適当なアミノ酸の活性化エステルは、ハロ−ホルメート、混合無水物、イミダゾイルホルメート、アシル化ハライドを包含し、そしてまた活性化エステルの’その場の形成および普通の試薬、例えば、ＤＣＣなどの使用を包含する（参照、Ａｔｈｅｒｔｏｎら）。好ましい保護されかつ活性化されたアミノ酸は、次の一般式を有する：
【０１９５】
【化２８】
【０１９６】
式中Ｒはアミノ酸の側鎖であり、そしてＸは光除去可能な保護基である。この化合物はアミンに結合した光除去可能な保護基を有するウレタン保護アミノ酸である。より好ましい活性化アミノ酸は、光除去可能な保護基が次の一般式を有するとき形成する：
【０１９７】
【化２９】
【０１９８】
式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は独立に水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミドまたはホスフィド基であるか、あるいは隣接する置換基（すなわち、Ｒ１−Ｒ２，Ｒ２−Ｒ３，Ｒ３−Ｒ４）は一緒になって環状アセタールまたはケタールを形成し；そしてＲ５は水素原子、アルコキシル、アルキル、ハロ、アリール、またはアルケニル基である。
【０１９９】
好ましい活性化アミノ酸は、光除去可能な保護基が６−ニトロベラトリルオキシカルボニルであるとき、形成する。すなわち、Ｒ１およびＲ４の各々は水素原子であり、そしてＲ２およびＲ３の各々はメトキシ基であり、そしてＲ５は水素原子である。他の好ましい活性化アミノ酸は、光除去可能な基が６−ニトロピペロニルであるとき、形成する；すなわち、Ｒ１およびＲ４の各々は水素原子であり、Ｒ２およびＲ３は一緒になってメチレンアセタールを形成し、そしてＲ５は水素原子である。他の保護基は可能である。他の活性化アミノ酸は、光除去可能な基がメチル−６−ニトロベラトリルまたはメチル−６−ニトロピペロニルであるとき、形成する。
【０２００】
他の好ましい活性化アミノ酸は、光除去可能な保護基が次の一般式を有するとき、形成する：
【０２０１】
【化３０】
【０２０２】
式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は独立に水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルファネート、スルフィドまたはホスフィド基であり、そしてＲ４およびＲ５は独立に水素原子、アルコキシ、アルキル、ハロ、アリールまたはアルケニル基である。生ずる化合物はアミンに結合したプレニルメチルオキシカルボニル保護基を有するウレタン保護されたアミノ酸である。より好ましい態様は、Ｒ１〜Ｒ６の各々が水素原子であるとき、形成される。
【０２０３】
本発明の光除去可能な保護基を有するウレタン保護されたアミノ酸は、Ｎ−保護アミノ酸をアシル化剤、例えば、アシル化ハライド、無水物、クロロホルメートなどと縮合することによって調製される（参照、Ｆｕｌｌｅｒら、米国特許第４，９４６，９４２号およびＦｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９０）１１２：７４１４−７４１６、両者をすべての目的のためにここに引用によって加える）。
【０２０４】
光除去可能な保護基を有するウレタン保護されたアミノ酸は、一般に、固相ペプチド合成の間の試薬として有用でありそして、光除去可能な保護基を使用して空間的選択性が可能であるために、空間的にアドレスするペプチド合成のためにことに有用である。これらのアミノ酸は２官能性である：ウレタン基はまず表面に結合したアミンとの反応のためにカルボキシ末端を活性化し、そして、いったんペプチド結合が形成すると、光除去可能な保護基はここで形成したアミノ末端をそれ以上の反応から防止する。これらのアミノ酸は、また、親核物質、例えば、固体の支持体の表面上の脱保護されたアミンに対して高度に反応性であり、そしてこの高い反応性のために、固相のペプチドのカップリング時間は有意に減少し、そして収率は典型的にはより高い。
【０２０５】
ＩＶ．データ収集
Ａ．データ収集システム
前述したように調製された支持体を１つの態様において使用して、支持体上の複数の配列のどれが問題のレセプターに結合するかを決定する。第１０図は、蛍光性マスクを含有する支持体の領域を検出するために使用する装置の１つの態様を例示する。この装置は、例えば、蛍光標識したレセプター、例えば、支持体上の合成されたポリマーに結合している抗体の存在または不存在を検出するために使用されるであろう。
【０２０６】
光は光源１００２、例えば、当業者によく知られている型のレーザー光源、例えば、スペクトラ・フィジカ（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃａ）製の型 Ｎｏ．２０２５から支持体に向けられる。光源からの光はレンズ１００４で向けられ、このレンズは好ましくは当業者によく知られている型の円筒形レンズである。レンズ１００４から生ずる出力は光のスポットするよりむしろ直線のビームである。こうして、データは絵素×絵素の基準するよりむしろ絵素の線状の配列に沿って実質的に同時に検出することができる。理解されるように、ここにおいて表面上に直線のビームを発生する１つの技術の例示として円筒形レンズを使用するが、他の技術をまた利用することができる。
【０２０７】
円筒形レンズからのビームを二色性ミラーまたはプリズム通過させ、そして適当に調製された支持体１００８の表面に向ける。支持体１００８をｘ−ｙ並進ステージ１００９、例えば、ニューポート製の型 Ｎｏ．ＰＭ５００−８上に配置する。支持体上のある位置は蛍光を発し、そして蛍光はダッシュ線により示された通路に沿って二色性ミラーを通して伝送しもどされ、そして線状の検出器上の適当なレンズ１０１０、例えば、ｆ／１．４のカメラのレンズで可変ｆストップ収束レンズ１０１４を経て収束される。直線の光のビームの使用により、支持体上の個々の点からよりむしろ、支持体に沿って絵素の線（例えば、約１ｃｍ）にわたってデータを発生させることができるようになる。別の態様において、光は支持体の２次元の区域に向けられ、そして蛍光は２次元のＣＣＤの配列により検出される。線状の検出は、実質的により高い電力密度が得られるので、好ましい。
【０２０８】
検出器１０１２は支持体から放射される蛍光量を位置の関数として検出する。１つの態様によれば、検出器は当業者に普通に知られている型の線状のＣＣＤの配列である。ｘ−ｙ並進ステージ、光源および検出器１０１２のすべてはコンピューター１０１６、例えば、装置およびＣＣＤの配列からのデータ収集をコントロールするＩＢＭ ＰＣ−ＡＴまたは同等のコンピューターに操作的に接続されている。
【０２０９】
操作において、支持体を並進ステージにより適当に位置決定する。次いで光源を照明し、そして蛍光強度のデータを検出器を介してコンピューターで集める。
【０２１０】
別の態様において、支持体およびｘ−ｙ並進テーブルを１または２以上の対物レンズを含む顕微鏡の下に配置する。レーザー（これにある態様において型 Ｎｏ．２０２０−０５のアルゴンイオンのレーザー、Ｓｐｅｃｔｒａｐｈｙｓｉｃｓ製）からの光（約４８８ｎｍ）を二色性ミラーにより支持体に向け、この二色性ミラーは約５２０ｎｍより大きい光を通過させるが、４８８ｎｍの光を反射する。二色性ミラーは、例えば、カール・ツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）製の型 Ｎｏ．ＦＴ５１０であることができる。鎖から反射した光は顕微鏡に入り、この顕微鏡は、例えば、カール・ツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）製の型 Ｎｏ．Ａｘｉｏｓｃｏｐ２０であることができる。支持体上の蛍光でマークされた物質は＞４８８ｎｍの光の蛍光を発し、そしてこの蛍光した光は顕微鏡により集められ、そして鏡を通過する。次いで支持体からの蛍光は波長フィルターに向けられ、その後、開ロプレートを通過する。波長フィルターは、例えば、メレス・グリオット（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ）製の型 Ｎｏ．０Ｇ５３０であることができ、そして開ロプレートは、カール・ツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）製の型 Ｎｏ．４７７３５２／４７７３８０であることができる。
【０２１１】
次いで蛍光した光は光電子増倍管に入り、この光電子増倍管はある態様においてハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）製の型 Ｎｏ．Ｒ９４３−０２であり、信号は前置増幅器において増幅され、そしてフォトンはフォトンカウンターにより計数される。フォトンの数をコンピューターにおいて位置の関数として記録される。前置増幅器は、例えば、スタンフォード・リサーチ・システム（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）製の型 Ｎｏ．ＳＲ４４０であることができ、そしてフォトンカウンターはスタンフォード・リサーチ・システム（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）製の型Ｎｏ．ＳＲ４４０であることができる。次いで支持体を引き続く位置に動かし、そしてこのプロセスを反復する。好ましい態様において、データを１〜１００μｍ毎に獲得し、ここで約０．８〜１０μｍのデータ収集直径が好ましい。十分に高い蛍光を使用する態様において、広い場の照明をもつＣＣＤ検出器を利用する。
【０２１２】
第１１図は、データ収集システムの構成をより詳細に例示する。このシステムの操作はフォトン計数プログラム１１０２の指示のもとに実施される。ユーザーは走査の次元、ある領域の絵素または点の数、および計数プログラムに対する走査速度をインプットする。ＧＰ１Ｂバス１１０４を介して、プログラム（例えば、ＩＢＨＰＣコンパーチブルコンピユーター）はマルチチャンネルのスケーラー１１０６、例えば、スタンフォード・リサーチのＳＲ４３０およびｘ−ｙ並進ステージのコントローラー１１０８、例えば、ニューポートＰＭ５００とインターフェースする。蛍光を発生する支持体からの光からの信号は光電子増倍管１１１０に入り、スケーラー１１０６の出力を与える。所定の領域における計数の数を示すデータはスケーラーから出力される。選択した区域を走査した後、ステージコントローラーは加速および速度のために命令で活性化され、これは引き続いて走査ステージ１１１２、例えば、ニューポートＰＭ５００−Ａを他の領域に推進する。
【０２１３】
データは画像データのファイル１１１４において収集され、そしてスケーリングプログラム１１１６においてプロセシングされる。スケールされた画像は、例えば、ＶＧＡディスプレー１１１８上の表示のために出力される。画像は絵素／クリップの百分率および表すべき絵素レベルの最小および最大の入力に基づいてスケールされる。このシステムは使用のために生データにおける最小および最大の絵素レベルを出力する。
【０２１４】
Ｂ．データの分析
データ収集システムからの出力は、蛍光強度／支持体上の位置を示すデータの配列である。データは、典型的には、所定のポリマーの合成が起こった区域より実質的に小さい領域にわたって採取される。単に例として、ポリマーが５００ミクロン×５００ミクロンの寸法を有する支持体上の正方形で合成された場合、データは５ミクロン×５ミクロンの寸法を有する領域にわたって採取することができる。最も好ましい態様において、支持体を横切って蛍光のデータを取る領域は、個々のポリマーが合成される領域の区域の約１／２より小さく、妊ましくは単一のポリマーが合成される領域の区域の約１／１０より小さく、最も好ましくは単一のポリマーが合成される領域の区域の約１／１００より小さい。それゆえ、所定のポリマーが合成された任意の区域内で、多数の蛍光のデータ点が集められる。
【０２１５】
セルが、例えば、標識した抗体に暴露されたとき、セルの走査のための絵素の数／蛍光強度のプロットは、典型的には、ベル状の曲線の形態を取るが、もっともらしいデータは、とくにより高い強度において、観察される．相対的結合親和性を決定するとき所定の合成領域にわたって蛍光強度の平均を使用することが望ましいので、これらのもっともらしいデータは望ましくないようにデータをゆがめる傾向がある。
【０２１６】
したがって、本発明の１つ態様において、データをこれらのもっともらしいデータ点を除去するために補正し、その後データ点の平均は相対的結合の効率の決定において利用する。
【０２１７】
第１２図は、１組の蛍光のデータ、例えば、親和性のスクリーニングの研究において使用するデータからのもっともらしいデータの除去のためのシステムの１つの態様を例示する。ユーザーまたはシステムは、工程１３０２におけるチップの位置およびセルのコーナーに関するデータを入力する。この情報および画像のファイルから、このシステムは工程１３０４におけるヒストグラムのコンピューターの表示をつくり、このヒストグラム（少なくともコンピューターのファイルの形態）はデータの絵素の数／強度をプロットする。
【０２１８】
各セルについて、次いで主要なデータ分析ループを実施する。各セルについて、工程１３０６において、このシステムは変化するレベル付近に集中したバンド幅について、合計の蛍光強度または絵素の数を計算する。例えば、プロットにおいて工程１３０６の右に示すように、こシステムは幅ｗのバンド内の絵素の数を計算する。このシステムはこのバンド幅をより高い中心の強度に「動かし」、そして再びこのバンド幅において絵素の数を計算する。このプロセスを強度の全体の範囲が走査されてしまうまで反復し、そして工程１３０８において、このシステムはどのバンドが最高の合計の数の絵素を有するかを決定する。このバンド幅内のデータはそれ以上の分析のために使用される。このバンド幅を合理的に小さいように選択すると仮定すると、この手順はより高い強度のレベルに位置するもっともらしいデータを排除する効果を有する。次いでこのシステムは、すべてのセルが評価された場合、工程１３１０において反復されるか、あるいは次のセルについて反復される。
【０２１９】
工程１３１２において、次いでこのシステムは選択したセルの各々についてバンド幅内のデータを積分し、工程１３１４において合成手順のファイルを使用してデータを分類し、そしてユーザーに対して、例えば、ビデオのディスプレーまたはプリンター上にデータを表示する。
【０２２０】
Ｖ．代表的な応用
Ａ．オリゴヌクレオチドの合成
光統制された空間的にアドレス可能な平行の化学的合成の一般性を、核酸の合成への応用により証明する。
【０２２１】
１．実施例
チミジン−シチジンの２量体の光活性化された形成を実施した。ジヌクレオチドの光統制された合成により発生された７つの正方形×４つの正方形のチェッカー盤状のパターンを示す蛍光の走査の３次元の表示を生成した。５’−ニトロベラトリルチミジンを合成支持体に３’ヒドロキシ基を通して取り付けた。ニトロベラトリル保護基を５００μｍのチェッカー盤状のマスクを通す照明により除去した。次いで、支持体をホスホルアミダイト活性化２’−デオキシシチジンで処理した。反応を蛍光測定的に追跡するために、デオキシシチジンはエキソサイクリックアミンに取り付けられたＦＭＯＣ保護されたアミノヒドロキシルリンカーで修飾されていた（５’−〇−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−（６−Ｎ−フルオレニルメチルカルバモイル−ヒドロキシルカルボキシ）−２’−デオキシシチジン）。ＦＭＯＣ保護基を塩基で除去した後、支持体をＤＭＦ中の１ｍＭのＦＩＴＣで１時間の間処理することによって、ジヌクレオチドを含有する領域を蛍光標識した。
【０２２２】
輝いた上昇した絵素の交互する正方形を示す蛍光強度のデータの３次元の表示は、支持体の光分解の間に使用したチェッカー盤状の照明のパターンを再現する。この結果が示すように、オリゴヌクレオチドならびにペプチドは光統制された方法により合成することができる。
【０２２３】
他の実施例において、チミジン−シチジン−シチジンの光活性化された形成を第１３図に示すように実施した。ここで、前の実施例におけるように、５’−ニトロベラトリルチミジンを支持体にホスホルアミダイト化学を経て［ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルシロキサン］を含有する表面に取り付けた。次いでスライドをジオキサンの存在下に１０分間均一に照明した（３６２ｎｍ、約１４ｍＷ／ｍ２）。乾燥後、次いで表面をＮ，４一ジメトキシトリチル−５’−ニトロベラトリル−２’−デオキシシチジン−３’−〇−（２−シアノエチル）ーＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトでテトラゾールの存在下に処理した（標準のホスホルアミダイトのカップリング化学）。酸化および乾燥後、プレートを再び前述のように照明したが、ただし５００μｍのチェッカー盤状のマスクを光源とスライドとの間に配置した。次いで表面を５’−Ｏ−（４，４’一ジメトキシ）−Ｎ−４−（６−（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサノイル、アミノヘキシル）−５−メチル−２’−デオキシシチジン−３’−〇−（シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトおよびテトラゾールに暴露した。酸化および乾燥後、トリヌクレオチドを含有する区域はＦＩＴＣ標識したストレプトアビジンで処理することによって蛍光標識した。蛍光強度のデータの生ずる表示は、光分解の間に使用した５００μｍおよびチェッカー盤状の照明のパターンに相当する交互する輝いた正方形および暗い正方形を示した。
【０２２４】
ＶＩ．結論
ここにおける本発明は、多数の化合物を同時に合成する新規なアプローチを提供する。この方法は、固相のフォーマットでカップリングすることができる化学的構成ブロックを有するとき、および光を使用して反応性基を発生させることができるとき、いつでも応用することができる。
【０２２５】
上の記載は例示でありそして限定的ではない。本発明の多数の変化は当業者にとってこの開示を見ると明らかであろう。単に例として、本発明をペプチドおよびヌクレオチドの合成に主として関して例示したが、本発明はそのように限定されない。したがって、本発明の範囲は上の記載を参照せず、その代わりに添付する請求の範囲ならびにそれらの同等の態様の完全な範囲を参照して決定されるべきである。
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
１ ５
（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｌ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号２：
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
１ ５
（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号３：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
１ ５
（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号４：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号５：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号６：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
１ ５
（２）配列番号７についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号７：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号８についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号８：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ
１
（２）配列番号９についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号９：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号１０についての情報；
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１０：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号１１についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１１：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ
１
（２）配列番号１２についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１２：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
１ ５
（２）配列番号１３についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１３；
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｈｅ
１ ５
（２）配列番号１４についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｌ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１４：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号１５についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１５：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
１ ５
（２）配列番号１６についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１６：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
１ ５
（２）配列番号１７についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：７個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列＝配列番号１７：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
１ ５
（２）配列番号１８についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ；６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１８：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ
１ ５
（２）配列番号１９についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１９：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｍｅｔ
１ ５
（２）配列番号２０についての情報：
（ｉ）配列特致
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号２０：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
１ ５
（２）配列番号２１についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号２１：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｍｅｔ
１ ５
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】第１図は、光統制された空間的にアドレ：ス可能な平行の化学的合成を概略的に示す。
【図２】第２図は、光統制されたペプチドの合成の１つの実施例を概略的に示す。
【図３】第３図は、多様なポリマーの配列を合成する自動化されたシステムのためのソフトウェアを概略的に示す。
【図４】第４ａ図および第４ｂ図はポリマーの合成のためのプログラムの操作を示す。
【図５−１】第５図は、「純粋な」バイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図５−２】第５図は、「純粋な」バイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図６−１】第６図は、グレイコードのバイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図６−２】第６図は、グレイコードのバイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図７−１】第７図は、変更されたグレイコードのバイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図７−２】第７図は、変更されたグレイコードのバイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図８】第８ａ図は、４工程の合成のためのマスキング法を概略的に示す。第８ｂ図は、すべての４００のペプチドの２量体の合成を概略的に示す。
【図９】第９図は、１０工程のバイナリー合成のための座標地図である。
【図１０】第１０図は、データ収集システムを概略的に示す。
【図１１】第１１図は、データ収集システムの構成を示すブロック線図である。
【図１２】第１２図は、データ収集／分析システムのためのソフトウェアの操作を示すフローチャートである。
【図１３】第１３図は、光統制されたオリゴヌクレオチドの合成の１つの実施例を概略的に示す。
【技術分野】
【０００１】
この出願は次の米国特許出願に関係する：米国特許出願第４９２，４６２号、出願日１９９０年３月７日；米国特許出願第３６２，９０１号、出願日１９８９年６月７日；米国特許出願第６２４，１２０号、出願日１９９０年１２月６日；米国特許出願第６２６，７３０号、出願日１９９０年１２月６日；および米国特許出願第６２４，１１４号、出願日１９９０年１２月６日。これらの出願の各々をすべての目的のためにここに引用によって加える。この出願は、また、１９９０年１２月１３日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９０／１５０７０号に関係し、そしてこれをまたすべての目的のためにここに引用によって加える。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明はポリマーの合成の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は反応器システム、マスキング法、光除去可能な保護基、データの収集およびプロセシング技術、および支持体上の多様なポリマー一配列の光統制（１ｉｇｈｔ ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成のための応用を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（項目１） 支持体上で多くのポリマー配列を合成するための反応器システムであって：
ａ）前記支持体に反応流体を接触するための反応器；
ｂ）前記反応器に選択された反応流体を送るためのシステム；
ｃ）少なくとも第１相対位置から第２相対位置に対してマスク又は支持体を移動するための並進段階；
ｄ）マスクを通して前記支持体を選択された時間で照射するための光；
ｅ）前記反応器システムからの流体の流れを選択的に方向付けし、前記並進段階を選択的に活性化し、そして前記支持体上で多くの多様なポリマー配列を予定された位置で形成するために前記支持体を選択的に照射するための適切にプログラムされたディジタル型コン
ピューターを含んで成る反応器システム。
（項目２） ポリマー配列の初期スクリーニングのために使用される前記支持体に反応流体における多くのモノマーを供給するように適合される第１項記載の反応器システム。
（項目３） 試薬の連続的な添加により多くのポリマー配列を形成するための規則方法であって、二段階合成手段を用いて前記多くのポリマー配列の一部を前記ポリマー配列の他の一部の添加のために連続的に保護し、そして保護解除する段階を含んで成る方法。
（項目４） 前記二段階合成手段が二段階マスキング手段である第３項記載の方法。
（項目５） 前記マスキング手段が、マスクが、前もって照射された部分の一部を光から保護し、そして前もって保護された部分の一部を光に照射することによって、前のマスクの代理をする、少なくとも２つの連続的段階を提供する第４項記載の方法。
（項目６） 前記マスキング手段における少なくとも２つの連続的段階が前記支持体上の対象の領域の約半分を照射することを含んで成る第４項記載の方法。
（項目７） 前記マスキング手段が単一の支持体上に多くのポリマー配列を形成することを含んで成る第４項記載の方法。
（項目８） 前記マスクが、多くの合成部位の個々上に１つの端面照射を有するグレイコードマスキング手段により配置される第４項記載の方法。
（項目９） 前記マスキング手段が、多くの合成されるポリマーのために最少数のマスキング段階に起因する第４項記載の方法。
（項目１０） 長さ１のすべての可能なポリマーが与えられた基本組のモノマーにより形成される第４項記載の方法。
（項目１１） 前記マスキング手段が、ポリマーの少なくとも所望する基本組及び長さを入力する適切にプログラムされたディジタル型コンピューターで開発される第４項記載の方法。
（項目１２） １よりも短い又は１に等しい長さのすべての可能なポリマーが与えられた基本組のモノマーにより形成される第４項記載の方法。
（項目１３） 非二段階マスキング手段により前記ポリマーの一部を形成する段階をさらに含んで成る第４項記載の方法。
（項目１４） マスキング手段を出力する段階をさらに含んで成る第１０項記載の方法。
（項目１５） 前記支持体上に合成されたポリマーの地図を出力する段階をさらに含んで成る第１０項記載の方法。
（項目１６） 前記地図が図９の形で存在する第１５項記載の方法。
（項目１７） 結合親和性研究への使用のために多くのリンカーポリマーをスクリーニングするための方法であって：
ａ）選択された領域における支持体上に多くのリンカーポリマーを形成し、ここで前記ポリマーが：
ｉ）支持体の表面上で、保護基を除去するために前記選択された領域の一部を照射し；そして
ｉｉ）前記表面とモノマーとを接触せしめる回帰的段階により形成され；
ｂ）前記多くのリンカーポリマーとリガンドとを接触せしめ；そして
ｃ）前記リガンドとラベルされたレセプターとを接触せしめる段階を含んで成る方法。
（項目１８） 前記リガンドがポリペプチドである第１７項記載の方法。
（項目１９） 前記レセプターが抗体である第１７項記載の方法。
（項目２０） 前記段階ｉｉ）で添加されるモノマーが前記回帰的段階の個々において同じであり、前記選択された領域が異なった長さのリンカー分子を含んで成る第１７項記載の方法。
（項目２１） 前記ラベルされたレセプターがフルオレセイン化されたレセプターである第１７項記載の方法。
（項目２２） リガンドに対するレセプターの親和性を決定するためのシステムであって：
ａ）予定された位置で多くのリガンドを含んで成る支持体の表面に光を適用するための手段、ここで前記直接光を適用するための手段が前記多くの予定された位置で同時照射を提供し；及び
ｂ）前記多くの予定された位置で螢光を検出するためのずらりと並んだ検出器を含んで成るシステム。
（項目２３） 前記光を適用するための手段が点光源及び実質的に直線路にそって前記点光源の焦点を合わすための円柱状レンズを含んで成る第２２項記載のシステム。
（項目２４） 前記ずらりと並んだ検出器が直線状アレイを含んで成る第２２項記載のシステム。
（項目２５） 前記ずらりと並んだ検出器が直線状ＣＣＤアレイを含んで成る第２２項記載のシステム。
（項目２６） ディジタルコンピューターにおいて、リガンドに対して結合レセプターの傾向を検出するための方法であって：
ａ）既知位置での領域において多くのリガンドを含んで成る支持体に螢光ラベルされたレセプターを暴露し；
ｂ）前記個々の領域内の多くのデータ収集点で、前記データ収集点から螢光の量を決定し；
ｃ）予定された統計学的分布から設定量からずれる前記データ収集点を除去し；そして
ｄ）残存するデータ収集点に対する前記レセプターの相対的結合親和性を決定することを含んで成る方法。
（項目２７） 前記予定された統計学的分布が正規分布である第２６項記載の方法。
（項目２８） 下記式：
【０００４】
【化１】
【０００５】
［式中、ｎ＝０又は１であり；Ｙは天然又は非天然のアミノ酸のカルボキシル基の酸素原子、天然又は非天然のアミノ酸のアミノ基、又は天然又は非天然のデオキシリボ核酸又はリボ核酸のＣ−５’酸素基から成る群から選択され；Ｒ’及びＲ２は独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィド、又はホスフィド基であり；そしてＲ３はアルコキシ、アルキル、アリール、水素又はアルケニル基である］で表わされる化合物。
（項目２９） 前記Ｙが天然又は非天然のデオキシリボ核酸又はリボ核酸のＣ−５’酸素基である第２８項記載の化合物。
（項目３０） 前記ｎがゼロである第２９項記載の化合物。
（項目３１） 前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ水素原子である第２９項記載の化合物。
（項目３２） 前記Ｒ３が水素原子である第３１項記載の化合物。
（項目３３） 前記Ｒ３がメチル基である第３１項記載の化合物。
（項目３４） 前記Ｙがアミノ酸のカルボキシル基の酸素原子であり、そしてｎ−０である第２８項記載の化合物。
（項目３５） 前記Ｒ１及びＲ２がそれぞれ水素原子である第３４項記載の化合物。
（項目３６） 前記Ｒ３が水素原子である第３５項記載の化合物。
（項目３７） 前記Ｒ３がメチル基である第３５項記載の化合物。
（項目３８）下記式：
【０００６】
【化２】
【０００７】
［式中、ｎ−０又は１であり；Ｙは天然又は非天然のアミノ酸のアミノ基又は天然又は非天然のデオキシリボ核酸又はリボ核酸のＣ−５’酸素基から成る群から選択され；Ｒ１，Ｒ２及びＲ３が独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル・ハロゲン・ヒ
ドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィド又はホスフィド基であり；Ｒ４及びＲ５は独立して、アルコキシ、アルキル、水素原子、ハロ、アリール又はアルケニル基である］で表わされる化合物。
（項目３９） 前記Ｒ１〜Ｒ３がそれぞれ水素原子である第３８項記載の化合物。
（項目４０） 前記Ｒ４及びＲ５がそれぞれ水素原子である第３９項記載の化合物。
（項目４１） 前記Ｒ４及びＲ５がそれぞれメチル基である第３９項記載の化合物。
（項目４２） 下記式：
【０００８】
【化３】
【０００９】
［式中、ｎ−０又は１であり；Ｙは天然又は非天然のデオキシリボ核酸又はリボ核酸のＣ−５’酸素基であり；Ｒ１〜Ｒ４が独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィド又はホスフィド基であり；そしてＲ５がアルコキシ、アルキル、アリール又はアルケニル基である）で表わされる化合物。
（項目４３） 前記Ｒ２及びＲ３がそれぞれメトキシ基である第４２項記載の化合物。
（項目４４） 前記Ｒ１及びＲ４がそれぞれ水素原子である第４３項記載の化合物。
（項目４５） 前記Ｒ５がメチル基である第４４項記載の化合物。
（項目４６） 下記式：
【００１０】
【化４】
【００１１】
［式中、ｎ−０又は１であり；Ｙは保護されるべき原子であり；Ｒ１及びＲ２は独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィド又はホスフィド基であり；そしてＲ３はアルコキシ、アルキル、アリール又はアルケニル基である］で表わされる化合物。
（項目４７） 前記Ｙが天然又は非天然のアミノ酸のカルボキシル基の酸素原子又は天然又は非天然のデオキシリボ核酸又はリボ核酸のＣ−５’酸素基、又は天然又は非天然のアミノ酸のアミノ基から成る群から選択される第４６項記載の化合物。
（項目４８） 前記Ｒ１及びＲ２が水素原子である第４７項記載の化合物。
（項目４９） 前記Ｒ３がメチル基である第４８項記載の化合物。
（項目５０） 下記式：
【００１２】
【化５】
【００１３】
［式中、Ｒは天然又は非天然のアミノ酸の側鎖であり、そしてＸは光除去できる保護基である］で表わされる化合物。
（項目５１） 前記Ｘが下記式：
【００１４】
【化６】
【００１５】
［式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４は独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド又はホスフィド基であり、又は隣接する置換基は環状アセタール又はケタールを一緒に形成する置換された酸素基であり；そしてＲ５は水素原子、アルコキシル、アルキル、ハロ、アリール、又はアルケニル基である］で表わされる第５０項記載の化合物。
（項目５２） 前記Ｒ１及びＲ４がそれぞれ水素原子であり、そしてＲ２及びＲ３がそれぞれメトキシ基である第５１項記載の化合物。
（項目５３） 前記Ｒ５がメチル基である第５２項記載の化合物。
（項目５４） 前記Ｒ２及びＲ３が環状アセタールを一緒に形成する置換された酸素基である第５１項記載の化合物。
（項目５５） 前記Ｒ１及びＲ４がそれぞれ水素原子である第５４項記載の化合物。
（項目５６） 前記Ｒ５がメチル基である第５５項記載の化合物。
発明の要約
支持体上の多様なポリマーの配列の合成の方法、装置および組成物、および技術の使用、ならびにそれらの応用を開示する。
【００１６】
本発明の１つの面によると、支持体上の多様なポリマーの配列のための改良された反応器システムが提供される。この態様に従い、本発明は支持体へ反応流体を接触させる反応器；選択した反応流体を反応器に供給するシステム；マスクまたは支持体を少なくとも第１の相対位置から第２の相対位置に動かす並進段階；選択した時間にマスクを通して支持体を照明する光；および流体の流れを反応器システムから選択的に向け、並進段階を選択的に活性化し、そして支持体を選択的に照明して、支持体上に前以て決定した位置において複数の多様なポリマーの配列を形成するための適当にプログラミングされたディジタルニンピューターを提供する。
【００１７】
本発明は、また、ＶＬＳＩＰＳの中のリンカー分子を選択する技術を提供する。本発明のこの面によれば、本発明は結合親和性の研究において使用するための複数のリンカーポリマーをスクリーニングする方法を提供する。本発明は、複数のリンカーポリマーを支持体上に選択した領域において形成し、リンカーポリマーはこの工程により支持体の表面上に反復的に形成され、選択した領域の一部分を照射して保護基を除去し、そして前記表面をモノマーと接触させ；複数のリンカーポリマーをリガンドと接触させ；そして前記リガンドを標識したレセプターと接触させる；工程を包含する。本発明の他の面によれば、改良された光除去可能な保護基が提供される。
【００１８】
本発明のこの面によれば、式：
【００１９】
【化７】
【００２０】
式中、ｎ−０または１；Ｙは天然または天然以外のアミノ酸のカルボキシル基の酸素、天然または天然以外のアミノ酸のアミノ基、または天然または天然以外のデオキシリボ核酸またはリボ核酸のＣ−５’酸素基から選択され；Ｒ１およびＲ２は独立に水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィドまたはボスフィド基であり；そしてＲ３はアルコキシ、アルキル、アリール、水素またはアルケニル基である、
を有する化合物が提供される。
【００２１】
本発明は、また、ＶＬＳＩＰＳのための改良されたマスキング技術を提供する。マスキング技術の１つの面によれば、本発明は、バイナリー合成法を使用して、未リマーの配列の他の部分の添加のために、複数のポリマーの配列の一部分を系統的に保護および脱保護する工程からなる、試薬の順次の添加により複数のポリマーの配列を形成する順序づけられた方法を提供する。
【００２２】
改良されたデータ収集の装置および技術が、また、提供される。
【００２３】
１つの態様によれば、計装は、光を支持体の表面に適用する手段、支持体は前以て決定した位置における複数のリガンドからなる、光を向けて複数の前以て決定した位置を同時に照射する手段；および前記複数の前以て決定した位置において蛍光を検出する配列からなるリガンドに対するレセプターの親和性を決定するシステムを提供する。さらに、本発明は、蛍光標識したレセプターを支持体に暴露し、前記支持体は領域の中の既知の位置における複数のリガンドからなる；前記領域の各々内の複数のデータ収集点において、前記データ収集点からの蛍光の量を決定し；前以て決定した統計学的分布から逸脱するデータ収集点を除去し；そして残りのデータ収集点からのレセプターの相対結合親和性を決定する；工程を含む、改良されたデータ分析技術を提供する。
【００２４】
ポリマーの合成において使用するための保護されたアミノ酸Ｎ一カルボキシ無水物が、また、提供される。本発明のこの面によれば、次の式を有する化合物が提供される：
【００２５】
【化８】
【００２６】
式中、Ｒは天然または天然以外のアミノ酸の側鎖であり、そしてＸは光除去可能な保護基である。
【００２７】
ここにおける本発明の性質および利点のそれ以上の理解は、明細書の残りの部分および添付図面を参照することによって実現するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
好ましい態様の説明
内容
Ｉ．定義
ＩＩ．一般
Ａ．脱保護および添加
１．実施例
２．実施例
ＩＩＩ．合成
Ａ．反応器システム
Ｂ．バイナリー合成法
１．実施例
２．実施例
３．実施例
４．実施例
５．実施例
６．実施例
Ｃ．リンカーの選択
Ｄ．保護基
１．ペプチドの固相合成の問の光除去可能な保護基の使用
２．オリゴヌクレオチドの固相合成の間の光除去可能な保護基の使用
Ｅ．光除去可能な基で保護されたアミノ酸Ｎ一カルボキシ無水物
ＩＶ．データ収集
Ａ．データ収集システム
Ｂ．データの分析
Ｖ．他の代表的な応用
Ａ．オリゴヌクレオチドの合成
１．実施例
ＶＩ．結論
１．定義
ここにおいて使用するある種の用語は次の一般的定義を有することを意図する：
１．相補性：リガンド分子およびそのレセプターの相互作用する表面のトポロジー的相補性または一緒に合致することを意味する。こうして、レセプターおよびそのリガンドは相補性として記載することができ、そしてさらに、接触表面の特性は互いに相補的である。
【００２９】
２．エピトープ３抗体として知られているレセプターのサブクラスとの相互作用の区域により描写される、抗原分子の部分。
【００３０】
３．リガンド：リガンドは特定のレセプターにより認識される分子である。本発明により研究することができるリガンドの例は、次のものを包含するが、これらに限定されない：細胞膜のレセプターのための作動物質および拮抗物質、毒素および毒液、ウイルスのエピトープ、ホルモン（例えば、オピェート、ステロイドなど）、ホルモンのレセプター、ペプチド、酵素、酵素の基質、コファクター、薬物、レクチン、糖類、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴ糖、タンパク質、およびモノクローナル抗体。
【００３１】
４．モノマー：一緒に接合してポリマーを形成することができる小さい分子の組の構成員。モノマーの組は次のものを包含するが、これらに限定されない：例えば、普通のＬ一アミノ酸の組、Ｄ一アミノ酸の組、合成アミノ酸の組、ヌクレオチドの組およびペントースおよびヘキソースの組。ここで使用するとき、モノマーはポリマーの合成のための基本的組の任意の構成員を呼ぶ。例えば、２０の天然に見いだされるＬ一アミノ酸の２量体は、ポリペプチドの合成のための４００のモノマーの基本的組を形成する。モノマーの異なる基本的組をポリマーの合成において連続する工程において使用することができる。さらに、組の各々は合成後に修飾される保護された構成員を包含することができる。
【００３２】
５．ペプチド：モノマーがアルファアミノ酸でありかつアミド結合を通して一緒に接合されておりそして二者択一的にポリペプチドと呼ばれるポリマー。この明細書に関係して、アミノ酸はＬ一光学的異性体またはＤ一光学的異性体であることができることを理解すべきである。ペプチドはしばしば２またはそれ以上のモノマーの長さであり、そしてしばしば２０より大きいアミノ酸モノマーの長さである。アミノ酸の標準の略号を使用する（例えば、プロリンについてＰ）。これらの略号はＳｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ，第３版、１９８８、の中に含まれており、これをすべての目的のためにここに引用によって加える。
【００３３】
６．放射線：１０−１４〜１０４メートルの波長を有するエネルギーを含む、選択的に適用することができるエネルギー、例えば、電子ビ一ム放射線、ガンマ放射線、Ｘ線放射線、紫外線放射線、可視光、赤外放射線、マイクロ波放射線、およびラジオ波。「照射」は表面に放射線を適用することを意味する。
【００３４】
７．レセプタ：所定のリガンドに対して親和性を有する分子。レセプターは天然に見いだされる分子または合成分子であることができる。また、それらは変更しない状態であるいは他の種との集合体として使用することができる。レセプターは結合する構成員に、直接にあるいは特定の結合物質を介して、取り付け、共有結合または非共有結合することができる。本発明において使用できるレセプターの例は、次のものを包含するが、これらに限定されない；抗体、細胞膜のレセプター、特定の抗原性決定基（例えば、ウイルス、細胞、または他の物質）と反応性のモノクローナル抗体および抗血清、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、コファクター、レクチン、糖類、多糖、細胞、細胞膜、および細胞小器官。レセプターは時にはこの分野において抗リガンドと呼ばれる。用語レセプターをここにおいて使用するとき、意味の差を意図しない。２つの高分子が分子の認識を通して組み合って複合体を形成するとき、「リガンドレセプターの対」が形成される。
【００３５】
本発明により研究することができるレセプターの他の例は、次のものを包含するが、これらに限定されない：
ａ）微生物のレセプター：レセプターに結合するリガンド、例えば、微生物の生き残りに対して必須の特定の輸送タンパク質または酵素の決定は抗体の新しいクラスのために有用である。日和見性の菌類、原生動物、および現在の使用における抗体に対して耐性のバクテリアに対する抗体はとくに価値があるであろう。
ｂ）酸素：例えば、酵素、例えば、神経伝達物質を切断することに関係する酵素の結合部位の決定は有用情報を提供する。ある種のレセプターに結合して、異なる神経伝達物質を切断する酵素の作用を変調するリガンドの決定は、神経伝達物質の障害の処置において使用できる薬物の開発において有用である。
ｃ）抗体：例えば、本発明は問題の抗原のエピトープと結合する抗体分子上のリガンド結合部位の研究において有用である；抗原のエピトープをまねる配列を決定することは、免疫原が１種または２種以上のこのような物質に基づくワクチンの開発に導くことができるか、あるいは治療的処置、例えば、自己免疫病において有用である（例えば、「自己」抗体の結合をブロックすることによって）関係する診断剤または化合物の開発に導くことができる。
ｄ）．核酸：核酸の配列を合成して、ＤＮＡまたはＲＮＡの結合性配列を確立することができる。
ｅ）触媒のポリペプチド：１種または２種以上の反応成分を１種または２種以上の生成物に変換することを包含する化学的反応を促進することができるポリマー、好ましくはポリペプチド。このようなポリペプチドは、一般に、少なくとも１つの反応成分または反応の中間体に対して特異的な結合部位および、官能性が結合した反応成分を化学的修飾することができる、結合部位に近接した活性な官能性を含む。触媒のポリペプチドは、例えば、米国特許第４０４，９２０号（これをすべての目的のためにここに引用によって加える）に記載されている。
ｆ）ホルモンのレセプター：例えば、インスリンおよび成長ホルモンのためのレセプター。高い親和性をもってレセプターに結合するリガンドの決定は、例えば、糖尿病患者が糖尿病の症状を解放しなくてはならない毎日の注射の経口的代替物、および他の場合において、死体からか、あるいは組み換えＤＮＡ技術によってのみ得ることができる、稀なホモ成長ホルモンの代替物の開発において有用である。他の例は脈管収縮性ホルモンのレセプターである；レセプターに結合するそれらのリガンドの決定は、血圧をコントロールする薬物の開発に導くことができる。
ｇ）オピエートレセプター：脳の中のオピエートのレセプターに結合するリガンドの決定は、モルフィンおよび関係する薬物のための嗜癖性が低い代替物の開発において有用である。
【００３６】
８．支持体：剛性または半剛性の表面を有する材料。多数の態様において、支持体の少なくとも１つの表面は実質的に平らであるが、ある態様において、異なるポリマーのために、例えば、ウェル、上昇した領域、エッチングした溝などで合成領域を物理的に分離することが望ましいことがある。他の態様によれば、合成が完結したとき解放することができる、小さいビーズを表面上に準備することができる。
【００３７】
９．保護基：モノマー単位に化学的に結合しそしてアクチベーター、例えば、電磁輻射線に選択的に暴露したとき除去することができる物質。ここにおいて実用性をもつ保護基の例は、次のものを包含する：ニトロピペロニル、ピレニルメトキシ−カルボニル、ニトロベラトリル、ニトロベンジル、ジメチルジメトキシベンジル、５−ブロモ−７−エトロインドリニル、ｏ−ヒドロキシ−α−メチルシンナモイルおよび２−オキシメチレンアントラキノン。
【００３８】
１０．前以って規定した領域：前以て規定した領域は表面上の、ポリマーの形成のために活性化する、活性化した、あるいは活性化を意図する、局在化した区域である。前以て規定した領域は任意の便利な形状、例えば、円形、長方形、楕円形、クサビ形などを有することができる。ここにおいて簡潔さを目的として、「前以て規定した領域」は時には単に「領域」と呼ぶ。
【００３９】
１１．実質的に純粋：ある支持体の前以て規定した領域がそれを他の前以て規定した領域と区別する特性を示すとき、ポリマーはその前以て規定した領域内で「実質的に純粋」であると考えられる。典型的には、純度は均一な配列の結果として生物学的活性または機能により測定されるであろう。このような特性は、典型的には、選択したリガンドまたはレセプターとの結合により測定されるであろう。
【００４０】
１２．アクチベーター：基を活性とすることができそしてある源から支持体上の前以て規定した位置に向けられるエネルギー源を呼ぶ。アクチベーターの主な例示は光である。アクチベーターの他の例は、イオンビーム、電場、磁場、電子ビーム、Ｘ線などを包含する。
【００４１】
１３．バイナリー合成法：反応成分のマトリックス、およびスイッチのマトリックス（その生成物は生成物のマトリックスである）により代表することができる試薬の順次の添加により、多様なポリマーの配列を平行に合成する順序づけられた方法を呼ぶ。反応成分のマトリックスは添加すべき構成ブロックの１×ｍマトリックスである。スイッチのマトリックスは、列で配置された１とｍとの間の、野ましくは順序づけられた、バイナリー数のすべてまたはサブセットである。好ましい態様において、バイナリー法は少なくとも２つの連続する工程が支持体上の問題の領域の半分を照明する方法である。最も好ましい態様において、バイナリー合成は、また、前の添加工程を実行する合成法を呼ぶ。例えば、マスキング法のためのスイッチのマトリックスが前に照明した領域を半分にし、前に照明した領域の約半分を照明し、そして残りの半分を保護する（同時にまた前に保護された領域の約半分を保護し、そして前に保護された領域の約半分を照明する）方法。バイナリーのラウンドを非バイナリーのラウンドと相互に分散させることができ、そして支持体の一部分のみをバイナリー法にかけることができるのが認識されるであろうが、なおここにおける定義内のバイナリーマスキング法であると考慮される。バイナリー「マスキング」法は、他の物質、例えば、アミノ酸の添加のために、物質から保護基を除去するために長さを使用するバイナリー合成である。好ましい態様において、スイッチのマトリックスの選択した列をスイッチのマトリックスの列においてバイナリー数が増加する碩序で配置する。
【００４２】
１４．リンカー・：支持体に取り付けられそして合成されたポリマーを暴露／レセプターへの結合のために支持体から間隔を置いて配置する分子または分子の群を呼ぶ。
ＩＩ．一般
本発明は、大規模の化学的多様性をつくる合成法および装置を提供する。固相の化学、光不安定性保護基、および写真平版を一緒にして、光統制された空間的にアドレス可能な平行の化学的合成を好ましい態様において達成する。
【００４３】
本発明は、ここにおいて、ペプチドおよびヌクレオチドの調製に主として関して例示の目的で記載するが、他のポリマーに容易に応用することができるであろう。このようなポリマーは、例えば、次のものを包含する３核酸の線状および環状のポリマー、多糖類、り１ン脂質、およびα−，β−またはω−アミノ酸を有するペプチド、既知の薬物が上の任意のものに共有結合したヘテロポリマー、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ尿素、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンサルファイド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、あるいはこの開示を見て明らかになるであろう他のポリマー。さらに、認識されるように、ここにおける例示は主としてＣ末端→Ｎ末端の合成について参照するが、本発明はその範囲から逸脱しないでＮ末端→Ｃ末端の合成に容易に応用することができる。
【００４４】
Ａ．脱保護および添加
本発明は、マスクした抗原または他のアクチベーターを使用して、多数の異なる化学的化合物の同時の合成を統制する。第１図は、本発明の１つの態様に従う化学的化合物を形成する方法を示すフローチャートである。合成は固体の支持体２上で起こる。光源６を使用してマスク４ａを通る照明のパターンは、支持体のどの領域が化学的カップリングのために活性化されるかを決定する。１つの好ましい態様において、活性化は光を使用して、支持体の選択した区域から光不安定性保護基を除去することによって達成される。
【００４５】
脱保護後、構成ブロックの組の第１のもの（第１図において「Ａ」で示す）、各々は光不安定性保護基（「Ｘ」で示す）を有する、を支持体の表面に対して暴露し、そしてそれは前の工程において光でアドレスされた領域と反応する。次いで支持体を第２のマスク４ｂを通して照明し、これは第２の保護された構成ブロックｒＢ」との反応のための他の領域を活性化する。これらの照明において使用したマスクのパターンおよび反応成分の順序は究極の生成物およびそれらの位置を定め、第１図の下部において配列ＡＣＥＧおよびＢＤＦＨで示すように、前以て規定した位置に多様な配列を生ずる。本発明の好ましい態様は、小さい数の化学的工程において多数の化合物を形成するという、組み合わせのマスキング法の利点を得る。化合物の密度は主としてアクチベーターの空間的アドレス可能性、１つの場合において光の回折に関して決定されるので、高度の小型化は可能である。各化合物は物理的にアクセス可能であり、そしてその位置は正確に知られている。それゆえ、配列は空間的にアドレス可能であり、そして他の分子とのその相互作用を評価することができる。
【００４６】
第１図に示す特定の態様において、支持体は光不安定性保護基でブロックされたアミノ基を含有する。アミノ酸の配列は光保護基の除去によリレセプターとのカップリングのためにアクセス可能とされる。
【００４７】
合成すべきポリマーの配列が、例えば、ポリペプチドであるとき、ガラスの支持体に取り付けられたリンカーの末端のアミノ基はニトロベアトリルオキシカルボニル（醒ＯＣ）、光除去可能な保護基で誘導化される。リンカーの分子は、例えば、アリールアセチレン、２〜１０のモノマーからのエチレングリコールのオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであることができる。光脱保護は、例えば、マスクを通して支持体を照明することによって実施され、ここでパターンは、例えば、１ｃｍ２より小、１０−１ｃｍ２、１０−２ｃｍ２、１０−３ｃｍ２、１０−４ｃｍ２、１０−５ｃｍ２、１０−６ｃｍ２、１０−７ｃｍ２、１０−８ｃｍ２、１０−９ｍ２、または１０−１０ｍ２の寸法をもつ透明な領域を有する。好ましい態様において、領域は約１０×１０μｍ〜５００×５００μｍである。ある態様に従うと、マスクはポリマーのチェッカー盤状の配列を生成するように配置されるが、種々の幾何学的形状の任意の１つを利用することができる。
【００４８】
１．本発明の１つの実施例において、全体の支持体表面を光脱保護後蛍光性イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で処理することによって、遊離アミノ基を蛍光標識した。ガラスの顕微鏡スライドを清浄にし、９５％のエタノール中の０．１％のアミノプロピルトリエトキシシランで処理してアミン化し、そして１１０℃において２０分間インキュベーションした。次いで、スライドのアミン化された表面をＤＭＦ中のＮＶＯＣ−ＧＡＢＡ（ニトロベアトリルオキシカルボユルーγ一アミノ酪酸）のＮ一ヒドロキシスクシンイミドエステルの３０ｍＭの溶液に暴露する。Ｈｇアークランプからの３６５ｎｍのアウトプットを、ガラスの１００μｍのチェッカー盤状のマスク上のクロムを通して支持体上に、１２ｍＷ／ｃｍ２の電力密度で画像形成することによって、ＷＯＣ保護基を光分解的に除去した。次いで、露出された表面をＤＭＦ中の１ｍＭのＦＩＴＣで処理した。支持体表面をｅｐｉ一蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２０）でアルゴンイオンのレーザー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ ２０２５型）からの４８８ｎｍの励起を使用して走査した。光子計数モードで作動する冷却した光電子増倍管（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ９４３−０２）により、５２０ｎｍ以上の蛍光の放射を光検出した。蛍光の強度の区域において赤色でおよび最低の強度の区域において黒色で色表示に、光の強度を変換した。１００×１００μｍの要素の高いコントラストの蛍光性チェッカー盤状のパターンの存在は、空間的に局在化した光脱保護により特定の領域において遊離アミノ基が発生したことを明らかにした。
【００４９】
２．実施例
第２図は、本発明の他の実施例を例示するフローチャートである，カルボキシ活性化されたＮＶＯＣ一ロイシンをアミン化された支持体と反応させた。この合成において使用したロイシンおよび他のアミノ酸のカルボキシ活性化されたＨＯＢＴエステルは、２．５ｍｌの脳Ｆ中で０．２５ミリモルのＮＶＯＣアミノ保護されたアミノ酸を３７ｍｇのＨＯＢＴ（１一ヒドロキシベンゾトリアゾール）、１１１ｍｇのＢｏｐ（ベンゾトリアゾリル−ｎ−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサ−フルオロホスフェート）および８６μ１のＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）と混合することによって形成した。ＮＶＯＣ保護基は均一な照明により除去した。カルボキシ活性化されたＮＶＯＣ−フェニルアラニンを暴露されたアミノ基に室温において２時間の間カップリングさせ、次いでＤＭＦおよび塩化メチレンで洗浄した。光脱保護のマスク除去のサイクルおよびカルボキシ活性化されたＮＶＯＣ一グリシンとのカップリングを実施した。次いで表面をガラスの５０μｍのチェッカー盤状のパターンのマスク上のクロムを通して照明した。次いでカルボキシ活性化されたＮα−ｔＢＯＣ−ｏ−ｔ一ブチル−Ｌ−チロシンを添加した。全体の表面を均一に照明して、残りのＮＶＯＣ基を光分解した。最後に、カルボキシ活性化されたＮＶＯＣ−Ｌ一プロリンを添加し、ＮＶＯＣ基を照明により除去し、そしてｔ−ＢＯＣおよびｔ一ブチル保護基をＴＦＡで除去した。保護基の除去後、表面はＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（ＹＧＧＦＬ）およびＰｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（ＰＧＧＦＬ）の５０μｍのチェッカー盤状の配列から成っていた。参照、また、配列識別番号：１および配列識別番号：２。
【００５０】
Ｂ．抗体の標識
１つの好ましい態様において、支持体を使用して、複数のアミノ酸配列のどれが問題の抗体により認識されるかを決定する。
【００５１】
１．実施例
１つの実施例において、第２図に示す実雄例におけるペンタペプチドの配列をβ一エンドルフィンに対して向けられたマウスモノクローナル抗体でプロービングした。この抗体（３Ｅ７と呼ぶ）はナノモルの親和性でＹＧＧＦＬおよびＹＧＧＦＭ（参照、また、配列識別番号：１および配列識別番号３２１）に結合することが知られており、そしてＭｅｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：４０８４、これをすべての目的のためにここに引用によって加える、の中で論じられでいる。この抗体は高い親和性の結合のためにアミノ末端のチロシンを必要とする。第２図に記載するように形成したペプチドの配列を、ＹＧＧＦＬを認識することが知られている２μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗体（３Ｅ７）とインキュベーションした。参照、また、配列識別番号：１。３Ｅ７はＰＧＧＦＬと結合しなかった。参照、また、配列識別番号２。蛍光化ヤギ抗マウス抗体との第２インキュベーションは３Ｅ７と結合した領域を標識した。表面をｅｐｉ−蛍光顕微鏡で走査した。結果は交互する輝いたおよび暗い５０μｍの正方形を示し、ＹＧＧＦＬ（配列識別番号：１）およびＰＧＧＦＬ（配列識別番号：２）がマスクにより決定された幾何学的配列で合成されたことが示された。高いコントラスト（＞１２：１の強度の比）の蛍光性チェッカー盤状の画像が示すように、（ａ）ＹＧＧＦＬ（配列識別番号：１）およびＰＧＧＦＬ（配列識別番号：２）は交互する５０μｍの正方形で合成され、（ｂ）表面に取り付けられたＹＧＧＦＬ（配列識別番号：１）は抗体３Ｅ７への結合のためにアクセス可能であり、そして（ｃ）抗体３Ｅ７はＰＧＧＦＬ（配列識別番号：２）に結合しない。
【００５２】
チェッカー盤の２正方形×４正方形の部分における蛍光強度のデータの３次元の表示が生成された。それは合成部位の境界が鋭いことを示す。この表示における各スパイク波形の高さは、２．５μｍの絵素で統合された蛍光強度に直線的に比例する。ＰＧＧＦＬとＹＧＧＦＬとの間のトランジションは２スパイク波形（５μｍ）内で起こる。異なるＹＧＧＦＬの正方形の蛍光強度の変動はほとんど存在しない。１６のＹＧＧＦＬ合成部位の平均の強度は２．０３×１０５の計数であり、そして標準偏差は９．６×１０３の計数であった。
【００５３】
ＩＩＩ．合成
Ａ．反応器システム
第３図は、支持体上で多様なポリマーの配列を合成するために使用する装置を概略的に示す。この装置は自動化されたペプチド合成装置４０１を含む。自動化されたペプチド合成装置は、コンピューター４０１の指令下にフローセル４０２を通して選択した反応流体を流す。好ましい態様において、合成装置はＡＢＩペプチド合成装置、型Ｎｏ．４３１Ａである。コンピューターは広範な種類のコンピューターまたは離散的ロジック、例えば、ペプチド合成装置における適当な内部のコントロールシステムと連係した１聞ＰＣ−ＡＴまたは同様なコンピューターから選択することができる。ＰＣは、例えばカップリングサイクルの終わりを示すボードコンピューターからのシグナルを供給される。
【００５４】
支持体４０６をフローセルの上に取り付け、支持体とフローセルとの間に空洞を形成する。選択した試薬はこの空洞を通してペプチド合成装置から選択した時間に流れ、支持体の面上に空洞の中にペプチドの配列を形成する。マスク４０８は支持体の上に、好ましくは支持体と接触して取り付けられる。マスク４０８は選択した領域において光の選択した波長に対して透明であり、そして他の領域において光の選択した波長に対して不透明である。マスクを光源４１０、例えば、紫外線の光源で照明する。特定の態様において、光源４１０はオリエル（Ｏｒｉｅｌ）製の型Ｎｏ．８２４２０である。マスクはｘ−ｙ−ｚの並進ステージ４１２、例えば、ニューポート・コーポレーション（Ｎｅｗ−ｐｏｒｔ Ｃｏｒ．）製のｘ−ｙ並進ステージにより保持および並進される。コンピューターはペプチド合成装置、ｘ−ｙ並進ステージおよび光源の作用と共同する。もちろん、本発明はある態様においてマスクの代わりに支持体の並進で使用することができる。
【００５５】
操作において、支持体をフローセル上に取り付ける。マスクを位置決定しそして光を光源から、マスクを通して、支持体上に所望の期間（例えば、ペプチド合成の場合において１秒〜６０分）の間向けることによって、適当な光除去可能な保護基によりその表面が保護された支持体を光に選択した位置において露出する。支持体上の選択した位置において結合するために、ペプチド合成装置により、選択したペプチドまたは他のモノマー／ポリマーを反応器の空洞を通して送る。選択した反応時間（例えば、ペプチド反応の場合において約１秒〜３００分）後、モノマーをシステムから洗浄除去し、マスクを適当に再位置決定または置換し、そしてサイクルを反復する。本発明のほとんどの態様において、反応は周囲温度またはその付近において実施することができる。
【００５６】
第４ａ図および第４ｂ図は、反応器システムの操作において使用するソフトウェアのフローチャートである。ステップ５０２において、ペプチド合成のソフトウェアを初期化する。ステップ５０４において、システムはｘ−ｙ並進ステージ上の位置を目盛り定めし、そして主要なループを開始する。ステップ５０６において、システムは、存在する場合、コンピューター上のファンクションキーのどれがプレスされているかを決定する。Ｆ１がプレスされている場合、システムは所望の合成方法をインプットするようにユーザーを促す。ユーザーがＦ２をエンターすると、システムはステップ５１０において合成法のためにファイルの編集を可能とする。ユーザーがＦ３をエンターする場合、システムはステップ５１２におけるディスクからのプロセスを負荷する。ユーザーがＦ４をエンターする場合、システムはエンターまたは編集されたプロセスをステップ５１４におけるディスクにセーブする。ユーザーがＦ５を選択する場合、現在のプロセスはステップ５１６において表示されるが、Ｆ６の選択はプログラムの主要な部分、すなわち、選択したプロセスに従う実際の合成を開始する。ユーザーがＦ７を選択すると、システムは合成されたペプチドの位置を表示するが、Ｆ１０をプレスすると、ディスクの操作システムに戻る。
【００５７】
第４ｂ図は合成ステップ５１８をより詳細に示す。このプログラムの主要なループは開始され、ここでシステムはまずマスクをステップ５２６の次の位置に動かす。プログラムの主要なループの間に、ペプチド合成装置の中のオン−ボードコンピューターの指示下に必要な化学物質は反応セルを通して流れる。ズテップ５２８において、次いでシステムは露出の指令のために待機しそして、露出の指令を受け取ると、ステップ５３０において所望の時間の間支持体耀出する。完全な露出の肯定応答がステップ５３２において受け取られると、システムはこのプロセスがステップ５３４において完結されたかどうかを決定しそして、そこにある場合、ステップ５３６における追加のキーボードのインプットのために待機しそして、その後、実行合成プロセスを出る。
【００５８】
前述のシステムの操作のために使用するコンピュータープログラムはターボ（Ｔｕｒｂｏ）Ｃ（Ｂｏｒｌａｎｄ Ｉｎｔ’１）に記載されており、そしてＩＢＭコンパティブルシステムにおいて実行された。モーターコントロールのソフトウェアは、ニューポート・コーポレーション（Ｎｅｗ−ｐｏｒｔ Ｃｏｒ．）により製造されたソフトウェアから採用される。認識さるように、広範な種類のプログラム言語をここにおいて本発明の範囲を逸脱しないで利用することができる。ある種の呼び出しは「ＰＣおよびＰＳ２ビデオシステムに対するプログラマーのガイド（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ＰＣ ａｎｄ ＰＳ２ Ｖｉｄｅｏ Ｓｙｓｔｅｍ）」（Ｗｉｌｔｏｎ，Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）（これをすべての目的のためにここに引用によって加える）においてグラフィックスプログラムに対してなされている。
【００５９】
マスクの整列は好ましい態様において２つの方法の１つにより達成される。第１の態様において、システムは変法成分の相対的整列に頼り、これはｘ−ｙ−ｚ並進ステージがここにおける目的のために十分な制度をもつことができるので通常許容される。別の態様において、支持体上の整列のマークを適当な整列のためにＣＣＤ装置に連結する。
【００６０】
ある態様によれば、純粋な試薬を各工程において添加しないか、あるいは保護基の完全な光分解を各工程において設けない。これらの態様によれば、多数の生成物が各合成部位において形成される。例えば、モノマーＡおよびＢを合成工程の間に混合し、ＡおよびＢは、おおよそ溶液の中のそれらの濃度に比例して、脱保護された領域に結合するであろう。それゆえ、化合物の混合物は合成領域において形成されるであろう。変法合成領域における化合物の混合物とともに形成された支持体は、例えば、多数の化合物の初期のスクリーニングを実施するために使用することができ、その後、高い親和性を示す領域における小さい数の化合物をさらにスクリーニングする。ある領域を部分的にのみ光分解し、第１モノマーを添加し、同一領域を再光分解し、そしてその領域を第２モノマーに暴露することによって、同様な結果を得ることができる。
【００６１】
Ｂ．二段階合成法
光統制された化学的合成において、形成する生成物はマスクのパターンおよび順序、および反応成分の順序に依存する。１組の生成物をつくるために、一般に有限の数可能な方法が存在するであろう。本発明の好ましい態様において、二段階合成法を利用する。二段階合成法はここにおいて主としてマスキング法に関して例示するが、それは他のポリマーの合成、例えば、ピン法などに適用することができるであろう。
【００６２】
二段階合成法において、支持体を第１マスクで照射し、第１構成ブロックに対して暴露し、第２マスクで照射し、第２構成ブロックに暴露する。マスクした照射および構成ブロックへの露出の各組み合わせをここにおいて「サイクル」と呼ぶ。
【００６３】
好ましい二段階マスキング法において・各サイクルのためのマスクは支持体上の問題の領域の半分の照明を可能とし、そして問題の領域の残りの半分を照明しない。「半分」はここにおいて問題の領域の正確な半分を意味せず、その代わり問題の領域の大きい部分、例えば、問題の領域の約３０〜７０％を意味する。理解されるように、全体のマスキング法は必ずしも二段階の形態を取ることは必要ではない；その代わり、非二段階サイクルを必要に応じて二段階サイクルの間に導入することができる。
【００６４】
二段階マスキング法の好ましい態様において、所定のサイクルは前のサイクルにおいて照明された領域の約半分のみを照明するが、前のサイクルからの照明された残りの半分を照明しない。逆に、このような好ましい態様において、所定のサイクルは前のサイクルにおいて照明されなかった領域の半分を照明し、そして前のサイクルにおいて照明されなかった領域の半分を照明しない。
【００６５】
ここに開示する合成法において、合成されるポリマーの最長の長さ（ｌ）はｌ＝ｎ／ａである；ここでｎはサイクルの数でありそしてａは化学的構成ブロックの数である（所定の構成ブロックを反復一することができることに注意すべきである）。
【００６６】
合成法はマトリックスの表示法で最も容易に例示および取り扱われる。各合成部位において、所定のモノマーを添加するかどうかの決定は二段階プロセスである。したがって、各生成物の要素Ｐｊは２つのベクトル、すなわち、化学的反応成分のベクトル、例えば、Ｃ＝［Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ］およびバイナリーベクトルσｊの点の生成物により与えられる。４工程の合成についての下の実施例における生成物を見ると、示されるように、１つの４工程の合成において、σ１＝［１，０，１，０］、σ２＝［１，０，０，０］、σ３＝［０，１，１，０］およびσ４＝［０，１，０，１］、ここで１は照明を示し、そして０は照明なしを示す。したがって、列のベクトルσｊから「スイッチのマトリックス」Ｓを構成することが可能となる（ｊ＝１，ｋここでｋは生成物の数である）。
【００６７】
【数１】
【００６８】
合成の結果Ｐは単にＰ＝ＣＳ、化学的反応成分のマトリックスおよびスイッチのマトリックスの生成物である。
【００６９】
ｋの生成物を生ずるｎサイクルの合成のためにスイッチのマトリックスはｎ行およびｋ列を有する。Ｓの属性は各行がマスクを特定することである。合成の第ｊの化学的工程のための２次元のマスクｍｊはＳの第ｊ行から、要素Ｓｊｉ，…Ｓｊｋを、例えば、平方のフォーマットの中に配置することによって直接得られる。下の特定の配置は正方形のフォーマットを提供するが、線状または他の配置を利用することができる。
【００７０】
【数２】
【００７１】
もちろん、光活性化された合成において形成した化合物は任意の規定された幾何学的配列で配置することができる。正方形または長方形のマトリックスは便利であるが、不必要である。スイッチのマトリックスの行は、同等の転位を各行のために使用するかぎり、任意の便利な配列に転位することができる。
【００７２】
例えば、４工程の合成におけるマスクは次いで次により表される：
【００７３】
【数３】
【００７４】
ここで１は照明（活性化）を意味しそして０は照明なしを意味する。
【００７５】
好ましい態様において、マトリックスの表示を使用して生成物の所望の組および生成物の地図を発生させる。各化合物は化学的ベクトルおよび特定のスイッチのベクトルの生成物により定義される。したがって、各合成のアドレスについて、単にスイッチのベクトルをセーブし、これらのすべてをスイッチのマトリックスにアセンブリングし、そして行の各々を抽出してマスクを形成する。ある場合において、特定の生成物の分布または生成物の最大数が要求される。例えば、Ｃ＝［Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ］について、スイッチのベクトル（σｉ）は４ビットから成る。１６の４ビットのベクトルが存在する。１６の異なる生成物の最大は反応成分［Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ］の順次の添加によりつくることができる。これらの１６列のベクトルは１６の異なる方法でアセンブリングしてスイッチのマトリックスを形成することができる。列のベクトルの順序はマスキングのパターンを規定し、したがって、生成物の空間的順序を規定するが、それらの構成を規定しない。これらの列の１つの順序は次のスイッチのマトリックスを与える（ここで「零」（
【００７６】
【数４】
【００７７】
）の付加を完全性を目的一として括弧内に含めるが、このような零の付加はここにおいてどこかで無視されている）：
【００７８】
【数５】
【００７９】
本発明のこの面に従うＳの列は数１５〜０のバイナリー表示である。この二段階合成の１６の生成物は、ＡＢＣＤ，ＡＢＣ，ＡＢＤ，ＡＢ，ＡＣＤ，ＡＣ，ＡＤ，Ａ，ＢＣＤ，ＢＣ，ＢＤ，Ｂ，ＣＤ，Ｃ，Ｄ、および
【００８０】
【数６】
【００８１】
（零）である。また、上の４工程の合成マスクからのスイッチのベクトルの各々（およびそれゆえ合成生成物）は４ビットのバイナリースイッチのマトリックスの中に存在することに注意すべきである。（参照、列６，７，１０、および１１）
この合成手順は完成した生成物をマッピングする容易な方法を提供する。支持体上の種々の位置における生成物は、スイッチのマトリックスの列により簡単に規定される（第１列は、例えば、生成物ＡＢＣＤが支持体の上左の位置に存在するであろうことを示す）。さらに、選択した所望の生成物のみをつくる場合、マスクの配列は列を所望の配列で抽出することによって誘導することができる。例えば、生成物の組ＡＢＣＤ，ＡＢＤ，ＡＣＤ，ＡＤ，ＢＣＤ，ＢＤ，ＣＤ、およびＤを形成するために、第１、第３、第５、第７、第９、第１１、第１３、および第１５の列がスイッチのマトリックスに配置されたスイッチのマトリックスを使用することによって、マスクを形成する：
【００８２】
【数７】
【００８３】
長さ４のポリマーの全てを形成するために、反応成分のマトリックス［ＡＢＣＤＡＢＣＤＡＢＣＤＡＢＣＤ）を使用する。スイッチのマトリックスは列に配置された０〜２１６のバイナリー数のマトリックスから形成されるであろう。次いで４モノマーを有する列を選択し、そしてスイッチのマトリックスに配置する。したがって、理解されるように、バイナリースイッチのマトリックスは一般にｎ工程の合成からつくることができるすべての生成物を表示し、次いでこれから所望の生成物を抽出する。
【００８４】
バイナリースイッチのマトリックスの行は、好ましい態様において、各マスキング工程が合成区域の半分を照明するという性質を有する。各マスキング工程は、また、先行するマスキング工程を実行する；すなわち、先行する工程において照明された領域の半分を再び照明するが、他方の半分を照明しない。先行する工程において照明されなかった領域の半分はまた照明されるが、他方の半分は照明されない。こうして、マスキングは反復される。マスクは、前述したように、各行の要素を抽出し、そしてそれらを正方形の配列に配置することによらて構成される。例えば、４工程の合成についてのＳにおける４つのマスクは、次の通りである：
【００８５】
【数８】
【００８６】
マスクの反復する実行は、光統制された合成の生成物の多項式による表現を可能とする。（ある光活性化された合成は、約されない、すなわち、素数の多項式によってのみ表示することができる。）例えば、第８ａ図の上の合成（下に記載する）に相当する多項式は、次の通りである：
Ｐ＝（Ａ＋Ｂ）（Ｃ＋Ｄ）
反応の多項式は、それが代数学の表現であるように、展開することができるが、ただし反応成分Ｘ１、およびＸ２を接合する順序は保存される（Ｘ１、Ｘ２、≠Ｘ２、Ｘ１）、すなわち、生成物は交換可能ではないことを条件とする。次いで生成物はＡＣ＋ＡＤ＋ＢＣ＋ＢＤである。多項式は反応成分を明瞭に特定し、そして各工程のためのマスクを暗示的に特定する。括弧の各対は合成のラウンドを証明する。あるラウンドの化学的反応成分（例えば、ＡおよびＢ）はオーバーラッピングしない部位において反応し、それゆえ互いに組み合わせることができない。合成区域はラウンドの要素の間で等しく分画される（例えば、Ａはその区域の１つの半分に向けられ、そしてＢは他方の半分に向けられる）。それゆえ、あるラウンドにためのマスク（例えば、マスクｍＡおよびｍＢ）は直交し、そして正規直交の組を形成する。多項式の表示は、また、あるラウンドにおける各要素が次のラウンドの各要素に対して接合すべきであることを意味する（例えば、ＡとＣ、ＡとＤ、ＢとＣ、およびＢとＤ）。これはｍＣをｍＡおよびｍＢと等しくオーバーラッピングし、そしてｍＤについて同様にオーバーラッピングすることによって達成される。ＣおよびＤはあるラウンドの要素であるので、ｍＣおよびｍＤは互いに対して直交し、そして正規直交の組を形成する。
【００８７】
１６の生成物が４つの反応成分から作られる、前述のバイナリー合成の多項式の表示は、次の通りである：
【００８８】
【数９】
【００８９】
これは展開するとＡＢＣＤ，ＡＢＣ，ＡＢＤ，ＡＢ，ＡＣＤ，ＡＣ，ＡＤ，Ａ，ＢＣＤ，ＢＣ，ＢＤ，Ｂ，ＣＤ，Ｃ，Ｄ、および
【００９０】
【数９Ａ】
【００９１】
を与える（
【００９２】
【数１０】
【００９３】
であるという規則であり、そして接合は順序づけられていることを思い起こす）。二段階合成において、各ラウンドは１つの反応成分および１つの零（
【００９４】
【数１１】
【００９５】
により表示される）を含有する。合成区域の半分は反応成分を受け取り、そして他方の半分はゼロを受け取る。各マスクはすべての他のマスクと等しくオーバーラップする。二段階のラウンドおよび非二段階のラウンドは、次のように、必要に応じて相互に分散させることができる：
【００９６】
【数１２】
【００９７】
形成される１８の化合物は、ＡＢＣＥ，ＡＢＣＦ，ＡＢＣＧ，ＡＢＤＥ，ＡＢＤＦ，ＡＢＤＧ，ＡＢＥ，ＡＢＦ，ＡＢＧ，ＢＣＥ，ＢＣＦ，ＢＣＧ，ＢＤＲ，ＢＤＦ，ＢＤＧ，ＢＥ，ＢＦおよびＢＧである。この７工程のためのスイッチのマトリックスＳは、次の通りである：
【００９８】
【数１３】
【００９９】
（Ｂ）により表示されるラウンドはすべての生成物の中にＢを配置する。なぜなら、反応区域は均一に活性化されるからである（Ｂのためのマスクは完全に１から成る）。
【０１００】
第ｉラウンドがｂｉの化学的反応成分およびＺｉの零を有する、ｒラウンドから成る合成において形成される化合物Ｋの数は、
Ｋ：＝Σ（ｂｉ＋Ｚｉ）
であり、そして化学的工程ｎの数は
ｎ＝Ｅｂｉ
である。すべてのラウンドにおいてｂ＝ａ（化学的構成ブロックの数）およびｚ＝０であるとき合成される化合物の数はａｎ／ａであり、これに対して二段階合成については２ｎである。ｎ−２０かつａ＝５について、６２５の化合物（すべてテトラマー）が形成し、これに対して同一の数の化学的工程をもつ二段階合成において１，０４９×１０６の化合物が形成するであろう。また、多項式におけるラウンドは、
【０１０１】
【数１４】
【０１０２】
におけるように、集合させることができることに注意すべきである。生成物はＡＤ，ＢＣＤ，ＢＤ，ＣＤ，Ｄ，Ａ，ＢＣ，Ｂ，Ｃおよび
【０１０３】
【数１５】
【０１０４】
である。
【０１０５】
二段階合成は２つの理由で魅力的である。第１に、それらは所定の数の化学的工程（ｎ）について最大の数の生成物（２ｎ）を発生する。４つの反応成分について、１６の化合物が二段階合成において形成するが、各ラウンドが２つの反応成分を有するとき、わずかに４つがつくられる。１０工程の二段階合成は１，０２４の化合物を生じ、そして２０工程の合成は１，０４８，５７６を生ずる。第２に、二段階合成において形成する生成物は０からｎの長さの範囲をもつ完全な集合した組である。最長の生成物（ｎマー）から１または２以上の単位を欠失させることによって形成できるすべての化合物が存在する。二段階の組内のより小さい組が含有され、これらの組は任意の他のマスクの組を使用して同一の反応成分から形成されるであろう（例えば、第５図に示す合成において形成するＡＣ，ＡＤ，ＢＣおよびＢＤは、二段階合成により形成する１６の組の中に存在する）。しかしながら、ある場合において、実験的に達成することができる空間的分割は形成するすべての化合物を収容するために十分でないことがある。したがって、実際の制限は、所定の合成のために可能なスイッチのベクトルの特定のサブセットの選択を必要とすることがある。
【実施例】
【０１０６】
１．実施例
第５図は、二段階マスキング法を使用する合成を示す。二段階マスキング法は、所定数のサイクルについて最大数の配列を提供する。この態様によれば、マズクｍ１は支持体の半分の照明を可能とする。次いで支持体を構成ブロックに対して露出し、これは照明された領域において結合する。
【０１０７】
次いでｍ２は前に照明された領：域の半分の照明を可能とするが、それは前に照明された領域の半分を照明しない。次いで構成ブロックＢを添加し、これはｍ２からの照明された領域において結合する。このプロセスをマスクｍ３，ｍ４およびｍ５を使用して続け、この図面の下部に示す生成物の配列を生ずる。このプロセスは５（モノマーの数）サイクルで３２（モノマーの数の基数で２を累乗した）サイクルを発生する。
【０１０８】
２．実施例
第６図は、ここにおいてグレイコードのマスキング法と呼ぶ他の好ましい二段階マスキング法を例示する。この態様によれば、任意の所定の合成領域の側面が１つだけのマスクのへりにより規定されたように、マスクｍ１〜ｍ５を選択する。例えば、配列ＢＣＤＥが形成される部位は、ｍ５により規定されたその右へりおよびマスクｍ４により形成されたその左側を有する（そして他のマスクはこの部位の側面で整列されていない）。したがって、非整列、マスクの下の光の拡散などにより発生する問題は最小とされるであろう。
【０１０９】
３．実施例
第７図は、他の二段階マスキング法を例示する。ここにおいて変更されたグレイコードの二段階マスキング法と呼ぶ、このスキームによれば、必要なマスクの数は最小とされる。例えば、マスクｍ２はｍ１と同一のマスクであり、そして単に横方向に並進させることができる。同様に、マスクｍ４はｍ３と同一のマスクであり、そして単に横方向に並進させることができる。
【０１１０】
４．実施例
４工程の合成は第８ａ図に示されている。反応成分は順序づけられた組である｛Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ｝。第１サイクルにおいて、ｍ１を通した照明は合成区域の上半分を活性化する。次いで構成ブロックＡを添加して分布６０２を与える。マスクｍ２を通して照明し（これは下半分を活性化する）、次いでＢを添加すると、次の照明分布６０４が生ずる。ｍ３を通して照明し（これは左半分を活性化する）次いでＣを添加すると、分布６０４が得られ、そしてｍ４を通して照明し（これは右半分を活性化する）次いでＤを添加すると、最終の生成物のパターン６０８が得られる｛ＡＣ，ＡＤ，ＢＣ，ＢＤ｝。
【０１１１】
５．実施例
合成の上のマスキング法を、第８ｂ図に示すように、２０の天然に見いだされるアミノ酸からのすべての４００ジペプチドのために拡張することができる。この合成は２ラウンドから成り、２０の光分解および化学的カップリング／ラウンドを使用する。ラウンド１の第１サイクルにおいて、マスク１は２０のアミノ酸の第１とのカップリングのために支持体の１／２０を活性化する。ラウンド１において１９の引き続く照明／カップリングのサイクルは、各々が２０アミノ酸の離散した構成員を有する、２０の長方形のストライプから成る支持体を生ずる。ラウンド２のマスクはラウンド１のマスクに対して垂直であり、したがって、ラウンド２における単一の照明／カップリングのサイクルは２０のジペプチドを生ずる。ラウンド２の２０の照明／カップリングのサイクルは４００のジペプチドの合成を完結する。
【０１１２】
６．実施例
２段階マスキング法の力は、１，０２４ペプチドを生成した１０工程の合成の結果から理解することができる。この１０工程の二段階合成のための多項式の表現は、次の通りであった：
【０１１３】
【数１６】
【０１１４】
各ペプチドは４００×４００μｍの正方形を占有した。３２×３２のペプチドの配列（１，０２４のペプチド、ｌ＝１の零のペプチドおよび１０ペプチド、および制限された数の複製を含む）は、側面の基の脱保護および抗体３Ｅ７および蛍光化抗体による処理後に、蛍光走査により明瞭に明らかであった。各合成部位は４００×４００μｍの正方形であた。
【０１１５】
走査は、３，３００の計数のバックグラウンド値から最も明るい正方形（ｘ−２０，ｙ−９）における２２，４００の計数の、蛍光強度の範囲を示した。わずかに１５の化合物は１２，３００の計数より大きい強度を示した。この配列の平均値は４，８００の計数であった。
【０１１６】
この配列における各ペプチドの同一性は第９図のそのｘおよびｙ座標（各々０〜３１の範囲）および地図から決定することができた。位置２，５，６，９および１０における化学的単位はｙ座標により特定され、そして位置１，３，４，７，８におけるそれらはｘ座標により特定されている。ペプチドの１つの除外するすべては１０残基より短かった。例えば、ｘ＝１２および＝３におけるペプチドはＹＧＡＧＦである（配列識別番号：３；位置１，６，８，９および１０は零である）。ＹＧＡＦＬＳ（配列識別番号：４）、この配列の最も明るい要素はｘ＝２０およびｙ＝９に存在する。
【０１１７】
測定した蛍光強度から所定のペプチドの結合親和性を推定することがしばしば望ましい。考えられることには、最も簡単な場合は単一のペプチドが１価の抗体分子に結合する場合である。蛍光走査は、スライドを緩衝液で規定された時間の問洗浄した後、実施する。次いで、蛍光強度の順序は抗体−ペプチド複合体の相対的解離速度の測度である。速度定数が同一である場合（すなわち、それらが拡散コントロールされている場合）、蛍光強度の順序は典型的には結合親和性の順序に相当するであろう。しかしながら、立場は時にはいっそう複雑である。なぜなら、２価の一次抗体および２価の二次抗体を使用するからである。合成区域におけるペプチドの密度は約７ｎｍの平均の分離に相当し、これは多価の抗体−ペプチドの相互作用を可能とするであろう。それゆえ、ここにおける方法に従い得られた蛍光強度はしばしば結合親和性の定量的インジケーターであろう。
【０１１８】
他の重要な考察は合成の信頼性である。不完全光脱保護または不完全なカップリングにより、欠失が生成される。これらの実験におけるカップリングの収率／サイクルは典型的には８５％〜９５％である。マスキングによリスイッチのマトリックスを実施することは、光の拡散、内部反射および散乱のために、不完全である。結局、積み込み（内蔵ではない化学的ユニット）が、暗くあるべき領域の意図しない照明により生ずる。二段階合成配列は、合成の信頼性を評価するために必要な多数のコントロールを含有する。例えば、公称テトラペプチドＡＢＣＤを含有する合成区域からの蛍光シグナルはトリペプチド欠失不純物、例えば、ＡＣＤから来ることがある。このような人工物は、ＡＣＤ部位の蛍光強度がＡＢＣＤ部位のそれより低いという発見により除外されるであろう。
【０１１９】
前述の１，０２４ペプチドの合成で得られた配列の中の１５の最も高度に蛍光性のペプチドは、次の通りであった：ＹＧＦＬＳ（配列番号：４）、ＹＧＡＦＳ（配列番号：５）、ＹＧＡＦＬ（配列番号：６）、ＹＧＧＦＬＳ（一配列番号７３）、ＹＧＡＦ（配列番号：８）、ＹＧＡＬＳ（配列番号：９）、ＹＧＧＦＳ（配列番号：１０）、ＹＧＡＬ（配列番号：１１）、ＹＧＡＦＬＦ（配列番号：１２）、ＹＧＡＦ（配列番号：８）、ＵＧＡＦＦ（配列番号：１３）、ＹＧＧＬＳ（配列番号：１４）、ＹＧＧＦＬ（配列番号：１および配列番号：１５）、ＹＧＡＦＳＦ（配列番号：１６）、およびＹＧＡＦＬＳＦ（配列番号：１７）。顕著な特徴は、すべての１５がＹＧで開始するということであり、これはアミノ末端のチロシンが３Ｅ７への結合の主要な決定基であることを示す前の研究と一致する。この組の残基３はＡまたはＧであり、そして残基４はＦまたはＬである。これらの位置からのＳおよびＴの排除は明瞭な切断である。好ましい配列はＹＧ（Ａ／Ｇ）（Ｆ／Ｌ）であるという発見は、組み換えＤＮＡ方法により発生したファージ上のペプチドの非常に大きいライブラリーを抗体３Ｅ７への結合についてスクリーニングした研究の結果とよく合致する（参照、Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９００）８７：６３７８、ここに引用によって加える）。ファージの実験でペプチドからの手がかりに基づく追加のバイナリー合成は、ＹＧＡＭＱ（配列番号：１８）、ＹＧＡＦＭ（配列識別番号：１９）およびＹＧＡＦＱ（配列識別番号：２０）がＹＧＧＦＭ（配列番号：２１）（抗体３Ｅ７を得るために使用した免疫原）より強い蛍光シグナルを与えることを示す。
【０１２０】
上のマスキング法についての変法はある種の場合において価値があるであろう。例えば、問題の「中心部（ｋｅｒｎｅ１）」配列がＸＹＺから分離したＰＱＲから成る場合、目的はこれらの単位が可変数の異なる残基により分離されているペプチドを合成することである。中心部はどこかに１を有するマスクを使用することによって各ペプチドの中に配置することができる。適当な合成の多項式の表示は、次の通りである：
【０１２１】
【数１７】
【０１２２】
６マーのＰＱＲＸＹＺから１０マーのＰＱＲＡＢＣＤＸＹＺまでの長さの範囲の、１６のペプチドが形成されるであろう。
【０１２３】
いくつかの他のマスキング法は、また、選択した場合において価値を見いだすであろう。１より多い特定のマスクを使用することによって、２またはそれ以上の反応成分が同一の組の生成物の中に現れるであろう。例えば、８工程の合成のためのマスクが、
Ａ１１１１００００
Ｂ００００１１１１
Ｃ１１００１１００
Ｄ００１１００１１
Ｅ１０１０１０１０
Ｆ０１０１０１０１
Ｇ１１１１００００
Ｈ００００１１１１
であると仮定する。
【０１２４】
生成物はＡＣＥＧ，ＡＣＦＧ，ＡＤＥＧ，ＡＤＦＧ，ＢＣＥＨ，ＢＣＦＨ，ＢＤＥＨおよびＢＤＦＨである。ＡおよびＧは常に同一の生成物の中に現れるが、必ずしも互いに隣接しない。なぜなら、それらの添加は同一マスクにより方向づけられていたからであり、そしてＢおよびＨについても同様であった。
【０１２５】
Ｃ．リンカーの選択
好ましい態様によれば、合成されたポリマーと支持体との間の中間体として使用するリンカー分子は、レセプターとの改良された結合相互作用のために最適な長さまたは型について選択される。本発明のこの面に従い、変化する長さおよび／または型の種々のリンカーの長さおよび型の変動により、固定化されたリガンドおよびそのレセプターとの間の結合相互作用を最適化することが可能となる。
【０１２６】
リガンド（ペプチド、インヒビター、ハプテン、薬物など）およびその（酵素、抗体など）との間の結合の程度は、相手の一方を支持体上に固定化すると、ある態様において、溶液の中のレセプターの固定化されたリガンドへのアクセス可能性に依存する。引き続いてアクセス可能性は、相手の一方を固定化するために使用したリンカー分子の長さおよび／または型に依存するであろう。したがって、本発明の好ましい態様は、ここに記載するＶＬＳＩＰＳ技術を使用して、変化する長さおよび／または型のリンカーの配列を発生させ、好ましくはリンカーを不活性化または不活性とし、光化学的保護を使用して支持体の異なる領域を選択的に暴露し、そして化学的活性な基を構成する。
【０１２７】
この概念の最も簡単な態様において、同一の単位をＶＬＳＩＰＳ技術により支持体上の既知の位置において変化する多重度または長さで支持体に取り付けて、変化する長さのポリマーの配列を発生する。単一のリガンド（ペプチド、薬物、ハプテンなど）をそれらの各々に取り付け、そして結合部位を使用してアッセイを実施して、リガンドに結合することが知られているレセプターとの結合の程度を評価する。リンカーの長さがリガンドに結合するレセプターの能力を衝撃する場合において、変化するレベルの結合が観察されるであろう。一般に、最高の結合を提供するリンカーは引き続いて使用して、ここにおける技術に従い合成された他のリガンドをアッセイする。
【０１２８】
他の態様に従い、単一のリガンド／レセプターの対の間の結合を種々のモノマー配列のリンカーについて評価する。これらの態様によると、リンカーをここにおける技術に従い配列で合成し、そしてリンカーは異なるモノマーの配列（および、必要に応じて、異なる長さ）を有する。したがって、リンカー分子のすべては所定のレセプターに対する結合親和性を少なくともある程度もつことが知られているリガンドを有する。次いで、所定のレセプターをリガンドに暴露し、そして結合親和性を推定する。次いで、リガンドとレセプターとの間の適切な結合を提供するリンカー分子をスクリーニングの研究において利用する。
【０１２９】
Ｄ．保護基
前述したように、選択的に除去可能な保護基は異なる反応性を有する支持体表面のよく規定された区域の発生を可能とする。好ましくは、保護基は特定のアクチベーター、例えば、特定の波長および強度の電磁輻射線を適用することによって表面から選択的に除去する。さらに詳しくは、特定のアクチベーターは表面の選択した区域を暴露して、暴露された区域における保護基を除去する。
【０１３０】
本発明の保護基は固相オリゴマー合成、例えば、天然または天然以外のアミノ酸を使用するペプチド合成、デオキシリボ核酸およびリボ核酸を使用するヌクレオチド合成、オリゴ糖合成などに関連して使用される。支持体表面を不必要な反応から保護することに加えて、保護基はモノマーの反応性末端をブロックして自己重合を防止する。例えば、活性化されたアミノ酸、例えばＮ一ヒドロキシスクシンイミド活性化されたアミノ酸のエステルのアミノ末端に保護基を取り付けると、１つのモノマーのアミノ末端はペプチド合成の間に他の活性化されたエステル部分との反応から防止される。あるいは、保護基をアミノ酸のカルボキシル基に取り付けて、この部位における反応を防止することができる。大部分の保護基はアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基に取り付けることができ、そして化学的合成の性質はどの反応性基が保護基を必要とするかを支配するであろう。同様に、合成の間、例えば、ホスフェート−トリエステルカップリング化学を使用してヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基に保護基を取り付けると、１つのヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基は他の３’−活性化ボスフェート−トリエステルとの反応から防止される。
【０１３１】
特定の使用に無関係に、保護基を使用してある分子のある部分を他の試薬との反応から保護する。本発明の保護基は次の特性を有する：保護基は選択した試薬がそれらが取り付けられている基を修飾するのを防止する：保護基は合成反応条件に対して安定である（すなわち、それらは分子の結合したままである）：それらは残りの構造に悪影響を及ぼさない条件下に除去可能である：そしていったん除去されると、それらは表面または表面に結合したオリゴマーと感知し得る程度に反応しない。適当な保護基の選択は、もちろん、モノマー単位およびオリゴマーの化学的性質、ならびにそれらが保護を目的とする特定の試薬に依存するであろう。
【０１３２】
好ましい態様において、保護基は光活性化可能である。光活性保護の化合物の性質および使用は概観されてきている。参照、ＭｃＣｒａｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）１８：２３９−２７０、その開示をここに引用によって加える。好ましくは、光感受性保護基は電磁スペクトルの紫外線（ｕＶ）または可視部分における放射線により除去可能である。より好ましくは、保護基はスペクトルの近ＵＶまたは可視部分における放射線により除去可能であろう。しかしながら、ある態様において、活性化は他の方法、例えば、局在化加熱、電子ビームの平板印刷法、レーザーポンピング、微小電極を使用する酸化または還元などにより実施することができる。スルホニル化合物は電子ビームの平板印刷法のために適当な群である。酸化的または還元的除去は、好ましくは活性化しようとする表面の前以て規定した領域に向けられた微小電極を使用して、電源に保護基を暴露することによって達成される。他の方法はこの開示に照らして使用することができる。
【０１３３】
光除去可能な保護基の、すべてではないが、多数は近ＵＶまたは可視放射線を吸収する芳香族化合物であろう。適当な光除去可能な保護基は、例えば、ＭｃＣｒａｙら、Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９７０）９２：６３３３、およびＡｍｉｔら、Ｊ．Ｏｒｇ，Ｃｈｅｍ．（１９７４）３９：１９２、その開示をここに引用によって加える、に記載されている。
【０１３４】
光除去可能な保護基の好ましいクラスは次の一般式を有する：
【０１３５】
【化９】
【０１３６】
Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は独立に水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、またはホスフィド基であるか、あるいは隣接する置換基（すなわち、Ｒ１−Ｒ２，Ｒ２−Ｒ３，Ｒ３−Ｒ４）は一緒になって環状アセタールまたはケタールを形成する置換された酸素基であり；Ｒ５は水素原子、アルコキシル、アルキル、ハロ、アリール、またはアルケニル基であり、そしてｎ＝０または１。
【０１３７】
アミノ酸のカルボキシル末端またはヌクレオチドのヒドロキシル基を保護するために使用する、好ましい保護基である６−ニトロベラトリル（ＮＶ）は、Ｒ２およびＲ３の各々がメトキシ基であり、Ｒ１，Ｒ４およびＲ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝０であるとき、形成する：
【０１３８】
【化１０】
【０１３９】
アミノ酸のアミノ末端を保護するために使用する、好ましい保護基である６−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）は、例えば、Ｒ２およびＲ３の各々がメトキシ基であり、Ｒ１，Ｒ４およびＲ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝１であるとき、形成する：
【０１４０】
【化１１】
【０１４１】
アミノ酸のカルボキシル末端またはヌクレオチドのヒドロキシル基を保護するために使用する、他の好ましい保護基である６−ニトロピペロニル（ＮＰ）は、Ｒ２およびＲ３が一緒になってメチレンアセタールを形成し、Ｒ１，Ｒ４およびＲ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝０であるとき、形成する：
【０１４２】
【化１２】
【０１４３】
アミノ酸のアミノ末端を保護するために使用する、他の好ましい保護基である６−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＮＰＯＣ）は、例えば、Ｒ２およびＲ３が一緒になってメチレンアセタールを形成し、Ｒ１，Ｒ４およびＲ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝１であるとき、形成する：
【０１４４】
【化１３】
【０１４５】
アミノ酸のカルボキシル末端またはヌクレオチドのヒドロキシル基を保護するために使用する、最も好ましい保護基であるメチル−６−ニトロベラトリル（ＭｅＮＶ）は、Ｒ２およびＲ３の各々がメトキシ基であり、Ｒ１およびＲ５の各々が水素原子であり、Ｒ５はメチル基であり、そしてｎ＝０であるとき、形成する：
【０１４６】
【化１４】
【０１４７】
アミノ酸のアミノ末端を保護するために使用する、最も好ましい保護基であるメチル−６−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＭｅＮＶＯＣ）は、例えば、Ｒ２およびＲ３０）各々がメトキシ基であり、Ｒ１およびＲ４の各々が水素原子であり、Ｒ５がメチル基であり、そしてｎ＝１であるとき、形成する：
【０１４８】
【化１５】
【０１４９】
アミノ酸のカルボキシル末端またはヌクレオチドのヒドロキシル基を保護するために使用する、他の最も好ましい保護基であるメチル−６−ニトロピペロニル（ＭｅＮＰ）は、Ｒ２およびＲ３が一緒になってメチレンアセタールを形成し、ＲｌおよびＲ４の各々が水素原子であり、Ｒ５がメチル基であり、そしてｎ＝０であるとき、形成する：
【０１５０】
【化１６】
【０１５１】
アミノ酸のアミノ末端を保護するか、あるいはヌクレオシドの５’ヒドロキシルを保護するために使用する、他の最も好ましい保護基であるメチル−６−ニトロピペロニルオキシカルボニル（ＭｅＮＰＯＣ）は、例えば、Ｒ２およびＲ３が一緒になってメチレンアセタールを形成し、Ｒ１およびＲ４の各々が水素原子であり、Ｒ５がメチル基であり、そしてｎ＝１であるとき、形成する：
【０１５２】
【化１７】
【０１５３】
アミノ末端上に光活性化可能な保護基、例えば、ＮＶＯＣまたはＮＰＯＶＣまたはそれらの対応するメチル誘導体、それぞれ、ＭｅＮＶＯＣまたはＭｅＮＰＯＣＶを有する保護されたアミノ酸は、アミノ酸のアミンを保護基の活性化されたオキシカルボニルエステルでアシル化することによって形成される。ＮＶＯＣおよびＭｅＮＶＯＣの活性化されたオキシカルボニルエステルの例は、次の一般式を有する：
【０１５４】
【化１８】
【０１５５】
式中Ｘはハロゲン、混合された無水物、フェノキシ、ｐ−ニトロフェノキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどである。
【０１５６】
アミノ酸のカルボキシ末端またはヌクレオチドの５’−ヒドロキシル末端上に光活性化可能な保護基、例えば、ＮＶまたはＮＰまたはそれらの対応するメチル誘導体、結果ＭｅＮＶまたはＭｅＮＰを有する保護されたアミノ酸またはヌクレオチドは、カルボキシ末端または５’−〇Ｈを保護基の活性化されたベンジル誘導体でアシル化することによって形成される。ＭｅＮＶまたはＭｅＮＰの活性化された誘導体の例は、次の一般式を有する：
【０１５７】
【化１９】
【０１５８】
式中Ｘはハロゲン、ヒドロキシル、トシル、メシル・トリフルオロメチル、ジアゾ、アジドなどである。
【０１５９】
保護されたモノマーを発生させる他の方法は、保護基のベンジルアルコール誘導体をモノマーの活性化エステルと反応させることである。例えば、アミノ酸のアミノ末端を保護するために、アミノ酸の活性化エステルを保護基のアルコール誘導体、例えば、６−ニトロベラトロ一ル（ＮＶＯＨ）と反応させる．このような使用に適当な活性化エステルの例は、ハロ−ホルメート、混合無水物、イミダゾイルホルメート、アシルハライドを包含し、そしてまた活性化エステルのその場の形成および普通の試薬、例えば、ＤＣＣなどの使用を包含する。活性化エステルの他の例については、Ａｔｈｅｒｔｏｎらを参照のこと。
【０１６０】
保護されたモノマーを発生する他の方法は、保護基のベンジルアルコール誘導体をモノマーの活性化された炭素と反応させることである。例えば、核酸の５’−ヒドロキシルを保護するために、５’−活性化炭素を有する誘導体を保護基のアルコール誘導体、例えばメチル−６−ニトロピペロノール（ＭｅＰｙＲＯＨ）と反応させる。５’−ヒドロキシル基に結合した活性化基を有するヌクレオチドの例は、次の一般式を有する：
【０１６１】
【化２０】
【０１６２】
式中Ｙはハロゲン原子、トシル、メシル、トリフルオロメチル、アジド、またはジアゾ基などである。
【０１６３】
好ましい光化学的保護基の他のクラスは、次の式を有する：
【０１６４】
【化２１】
【０１６５】
式中、Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は独立に水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルファネート、スルフィドまたはホスフィド基であり、Ｒ４およびＲ５は独立に水素原子、アルコキシ、アルキル、ハロ、アリール、またはアルケニル基であり、そしてｎ＝０または１。
【０１６６】
アミノ酸のアミノ末端を保護するために使用する、好ましい保護基である１一ピレニルメチルオキシカルボニル（ＰｙＲＰＣ）は、例えば、Ｒ１〜Ｒ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝１であるとき形成する：
【０１６７】
【化２２】
【０１６８】
アミノ酸のカルボキシ末端またはヌクレオチドのヒドロキシル基を保護するために使用する、他の好ましい保護基である１−ピレニルメチル（ＰｙＲ）は、例えば、Ｒ１〜Ｒ５の各々が水素原子であり、そしてｎ＝０であるとき形成する：
【０１６９】
【化２３】
【０１７０】
そのアミノ末端上にピレニルメチルオキシカルボニル保護基を有するアミノ酸は、アミノ酸の遊離アミンをピレニル保護基の活性化オキシカルボニルエステルでアシル化することによって形成される。ＰｙＲＯＣの活性化オキシカルボニルエステルの例は、次の一般式を有する：
【０１７１】
【化２４】
【０１７２】
式中Ｘはハロゲンまたは混合無水物、ｐ−ニトロフェノキシまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基などである。
【０１７３】
それぞれ、アミノ酸のカルボキシ末端または核酸の５’−ヒドロキシ末端上に光活性化可能な保護基、例えば、ＰｙＲを有する保護されたアミノ酸またはヌクレオチドは、カルボキシ末端または５’−〇Ｈを保護基の活性化ピレニルメチル誘導体でアシル化することによって形成される。ＰｙＲＯＣの活性化ピレニルメチル誘導体の例は、次の一般式を有する：
【０１７４】
【化２５】
【０１７５】
式中Ｘはハロゲン原子、ヒドロキシル、ジアゾ、またはアジド基などである。
【０１７６】
保護されたモノマーを発生する他の方法は、保護基のピレニルメチルアルコール部分をモノマーの活性化エステルと反応させることである。例えば、アミノ酸の活性化エステルは、保護基のアルコール誘導体、例えば、ピレニルメチルアルコール（ＰｙＲＯＨ）と反応させて、アミノ酸のカルボキシ末端の保護された誘導体を形成することができる。活性化エステルの例は、ハロ−ホルメート、混合無水物、イミダゾイルホルメート、アシルハライドを包含し、そしてまた活性化エステルのその場の形成および普通の試薬、例えば、ＤＣＣなどの使用を包含する。
【０１７７】
明らかなように、多数の光感受性保護基は本発明において適当である。
【０１７８】
好ましい態様において、支持体を照射して光不安定性保護基を除去し、そして遊離の反応性部分および保護基から生ずる副生物を有する領域をつくる。保護基の除去速度は、入射放射線の波長および強度、ならびに保護基それ自体の物理的および化学的性質に依存する。好ましい保護基は、より速い速度でかつより低い強度の放射線で除去される。例えば、所定の組の条件において、ＭｅＮＶＯＣおよびＭｅＮＰＯＣは、それらの非置換の親化合物、結果ＮＶＯＣおよびＮＰＯＣより速く、ペプチド鎖のＮ末端から光分解的に除去される。
【０１７９】
保護基の除去は、照射により反応性基および保護基から誘導された分解生成物を分離することによって達成される。理論により拘束されたくないが、ＮＶＯＣおよびＭｅＮＶＯＣで保護されたオリゴマーの照射は次の反応スキームにより起こると信じられる：
ＮＶＯＣ−ＡＡ→３，４−ジメトキシ−６−ニトロソベンズアルデヒド＋ＣＯ２＋ＡＡ
ＭｅＮＶＯＣ−ＡＡ→３，４−ジメトキシ−６−ニトロソアセトフェノン＋ＣＯ２＋ＡＡここでＡＡはアミノ酸オリゴマーのＮ末端を表す。
【０１８０】
保護されないアミノ酸と一緒に、他の生成物は溶液の中に遊離する：二酸化炭素および２，３−ジメトキシ−６−ニトロソフェニルカルボニル化合物、これはオリゴマーの親核部分と反応して不必要な二次反応を形成する。ＮＶＯＣ保護されたアミノ酸の場合において、分解生成物はニトロソベンズアルデヒドであるが、他方の分解生成物はニトロソフェニルケトンである。例えば、ＮＶＯＣからの生成物のアルデヒドは遊離アミンと反応してシッフ塩基（イミン）を形成し、これは残りのポリマーの合成に影響を与える。好ましい光除去可能な保護基の支持体上のオリゴマーをゆっくりまたは逆に反応する。
【０１８１】
再び理論により拘束されたくないが、ＭｅＮＶＯＣ保護されたオリゴマーの照射からの生成物であるケトンは、同一のＮＶＯＣ保護されたオリゴマーの生成物であるアルデヒドよりゆっくりした速度で、オリゴマー上の親核成分と反応すると信じられる。明瞭には決定されないが、この反応速度の差は、立体的および電子的効果のための親核物質に向かうアルデヒドとケトンとの間の全体の反応性の差のためである。本発明の光除去可能な保護基は容易に除去される。例えば、異なる光除去可能な保護基を有する溶液中のＮ−保護されたＬ−フェエルアラニンの光分解を分析し、そして結果を下表に表す：
【０１８２】
〔表〕
【０１８３】
半減期ｔ１／２は、出発量の保護基の５０％を除去するために要求される時間（秒）である。ＮＢＯＣは６一ニトロベンジルオキシカルボニル基であり、ＮＶＯＣは６−ニトロベラトリルオキシカルボニル基であり、ＭｅＮＶＯＣはメチル−６−ニトロベラトリルオキシカルボニル基であり、そしてＭｅＮＰＯＣはメチル−６−ニトロピペロニルオキシカルボニル基である。光分解は示した溶媒の中で１０ｍＷ／ｃｍ２の強度を有する３６２／３６４ｎｍの波長の照射を使用して実施し、そして各保護されたフェニルアラニンの濃度は０．１０ｍＭであった。
【０１８４】
この表が示すように、ＮＶＯＣ，ＭｅＮＶＯＣおよびＭｅＮＰＯＣで保護されたフェニルアラニンの脱保護はＮＢＯＣの脱保護より速く進行した。さらに、ベンジル炭素上で置換された２つの誘導体であるＭｅＮＶＯＣおよびＭｅＮＰＯＣは、ジオキサンおよび酸性化されたジオキサンの両者の中で最高速度で光分解された。
【０１８５】
１．ペプチドの固相合成の間の光除去可能な基の使用
固相支持体上のペプチドの形成は、支持体に結合した成長する鎖にアミノ酸を段階的に取り付けることを必要とする。反応条件下のモノマーのアミノ酸の不都合な重合を防止するために、アミノ酸のアミノ末端の保護を必要とする。モノマーをペプチドの末端にカップリングさせた後、Ｎ末端の保護基を除去し、そして他のアミノ酸をこの鎖にカップリングさせた。カップリングおよび脱保護のこのサイクルはペプチド配列の中の各アミノ酸について続けられる。参照、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６３）８５：２１４９、およびＡｔｈｅｒｔｏｎら、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、１９８９，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ロンドン、それらの両者をすべての目的のためにここに引用によって加える。前述したように、光除去可能な保護基の使用は、固相合成の脱保護サイクルの聞に、パターン化された照射により、支持体表面の選択した部分の除去を可能とする。これは合成の窒間的コントロールを選択的に可能とする−一次のアミノ酸を照射された区域にのみカップリングされる。
【０１８６】
１つの態様において、本発明の光除去可能な保護基はアミノ末端におけるアミノ酸の活性化エステルに取り付けられる：
【０１８７】
【化２６】
【０１８８】
式中Ｒは天然または天然以外のアミノ酸の側鎖であり、Ｘは光除去可能な保護基であり、そしてＹは活性カルボン酸誘導体である。光除去可能な保護基であるＸは、好ましくは前述したようにＮＶＯＣ，ＮＰＯＣ，ＰｙＲＯＣ，ＭｅＮＶＯＣ，ＭｅＮＰＯＣなどである。活性化エステルであるＹは、好ましくは高いカップリング効率を有する反応性誘導体、例えば、アシルハライド、混合無水物、Ｎ一ヒドロキシスクシンイミドエステル、パーフルオロフェニルエステル、またはウレタン保護された酸などである。他の活性化エステルおよび反応条件はよく知られている（参照、Ａｔｈｅｒｔｏｎら）。
【０１８９】
２．オリゴヌクレオチドの．固相合成の間の光除去可能な基の使用
固相支持体上のヌクレオチドの形成は、支持体に結合した成長するオリゴマーへのヌクレオチドの段階的取り付けを必要とする。反応条件下のモノマーのヌクレオチドの不都合な重合を防止するために、ヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基の保護を必要とする。モノマーをオリゴマーの末端にカップリングした後、５’−ヒドロキシル保護基を除去し、そして他のヌクレオチドをこの鎖にカップリングする。カップリングおよび脱保護のこのサイクルはオリゴマー配列の中の各ヌクレオチドについて統ける。参照、Ｇａｉｔ，「オリゴヌクレオチドの合成：実際のアプローチ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、１９８４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，ロンドン、これをすべての目的のためにここに引用によって加える。前述したように、光除去可能な保護基の使用は、固相合成の脱保護サイクルの間に、支持体表面の選択した部分の、パターン化された照射により、除去を可能とする。これは選択的に合成の空間的コントロールを可能とする−一次のヌクレオチドは照射された区域にのみカップリングされる。
【０１９０】
ヌクレオチドの合成は、一般に、ヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基上の活性化されたリン誘導体を固体の支持体に結合したオリゴマーの５’−ヒドロキシル基にカップリングすることを包含する。このカップリングを実施する２つの主要な化学的方法が存在する：ホスフェート−トリエステル法およびホスホルアミダイト法（参照、Ｇａｉｔ）。本発明の保護基はいずれの方法における使用にも適する。
【０１９１】
好ましい態様において、光除去可能な保護基を５’−ヒドロキシル基上の活性化されたヌクレオチドに取り付ける；
【０１９２】
【化２７】
【０１９３】
式中Ｂは糖環に結合した塩基であり；Ｒは糖がデオキシリボースであるとき水素原子であるか、あるいはＲは糖がリボースであるときヒドロキシルであり；Ｐは活性化されたリンの基であり；そしてＸは光除去可能な保護基である。光除去可能な保護基であるＸは前述したように好ましくはＮＶ，ＮＰ，ＰｙＲ，ＭｅＮＶ，ＭｅＮＰ，ＮＶＯＣ，ＮＰＯＣ，ＰｙＲＯＣ，ＭｅＮＶＯＣ，ＭｅＮＰＯＣなどである。活性化されたリンの基であるＰは、好ましくは高いカップリング効率を有する反応性誘導体、例えば、ホスフェート−トリエステル、ホスホルアミダイトなどである。他の活性化リン誘導体、ならびに反応条件はよく知られている（参照、Ｇａｉｔ）。
【０１９４】
Ｅ．光除去可能な基で保護されたアミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄのペプチド合成の間に、アミノ酸の活性化エステルを支持体に結合したオリゴマーの遊離アミノ末端とカップリングさせる。固相合成に適当なアミノ酸の活性化エステルは、ハロ−ホルメート、混合無水物、イミダゾイルホルメート、アシル化ハライドを包含し、そしてまた活性化エステルの’その場の形成および普通の試薬、例えば、ＤＣＣなどの使用を包含する（参照、Ａｔｈｅｒｔｏｎら）。好ましい保護されかつ活性化されたアミノ酸は、次の一般式を有する：
【０１９５】
【化２８】
【０１９６】
式中Ｒはアミノ酸の側鎖であり、そしてＸは光除去可能な保護基である。この化合物はアミンに結合した光除去可能な保護基を有するウレタン保護アミノ酸である。より好ましい活性化アミノ酸は、光除去可能な保護基が次の一般式を有するとき形成する：
【０１９７】
【化２９】
【０１９８】
式中Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３およびＲ４は独立に水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミドまたはホスフィド基であるか、あるいは隣接する置換基（すなわち、Ｒ１−Ｒ２，Ｒ２−Ｒ３，Ｒ３−Ｒ４）は一緒になって環状アセタールまたはケタールを形成し；そしてＲ５は水素原子、アルコキシル、アルキル、ハロ、アリール、またはアルケニル基である。
【０１９９】
好ましい活性化アミノ酸は、光除去可能な保護基が６−ニトロベラトリルオキシカルボニルであるとき、形成する。すなわち、Ｒ１およびＲ４の各々は水素原子であり、そしてＲ２およびＲ３の各々はメトキシ基であり、そしてＲ５は水素原子である。他の好ましい活性化アミノ酸は、光除去可能な基が６−ニトロピペロニルであるとき、形成する；すなわち、Ｒ１およびＲ４の各々は水素原子であり、Ｒ２およびＲ３は一緒になってメチレンアセタールを形成し、そしてＲ５は水素原子である。他の保護基は可能である。他の活性化アミノ酸は、光除去可能な基がメチル−６−ニトロベラトリルまたはメチル−６−ニトロピペロニルであるとき、形成する。
【０２００】
他の好ましい活性化アミノ酸は、光除去可能な保護基が次の一般式を有するとき、形成する：
【０２０１】
【化３０】
【０２０２】
式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は独立に水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルファネート、スルフィドまたはホスフィド基であり、そしてＲ４およびＲ５は独立に水素原子、アルコキシ、アルキル、ハロ、アリールまたはアルケニル基である。生ずる化合物はアミンに結合したプレニルメチルオキシカルボニル保護基を有するウレタン保護されたアミノ酸である。より好ましい態様は、Ｒ１〜Ｒ６の各々が水素原子であるとき、形成される。
【０２０３】
本発明の光除去可能な保護基を有するウレタン保護されたアミノ酸は、Ｎ−保護アミノ酸をアシル化剤、例えば、アシル化ハライド、無水物、クロロホルメートなどと縮合することによって調製される（参照、Ｆｕｌｌｅｒら、米国特許第４，９４６，９４２号およびＦｕｌｌｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９０）１１２：７４１４−７４１６、両者をすべての目的のためにここに引用によって加える）。
【０２０４】
光除去可能な保護基を有するウレタン保護されたアミノ酸は、一般に、固相ペプチド合成の間の試薬として有用でありそして、光除去可能な保護基を使用して空間的選択性が可能であるために、空間的にアドレスするペプチド合成のためにことに有用である。これらのアミノ酸は２官能性である：ウレタン基はまず表面に結合したアミンとの反応のためにカルボキシ末端を活性化し、そして、いったんペプチド結合が形成すると、光除去可能な保護基はここで形成したアミノ末端をそれ以上の反応から防止する。これらのアミノ酸は、また、親核物質、例えば、固体の支持体の表面上の脱保護されたアミンに対して高度に反応性であり、そしてこの高い反応性のために、固相のペプチドのカップリング時間は有意に減少し、そして収率は典型的にはより高い。
【０２０５】
ＩＶ．データ収集
Ａ．データ収集システム
前述したように調製された支持体を１つの態様において使用して、支持体上の複数の配列のどれが問題のレセプターに結合するかを決定する。第１０図は、蛍光性マスクを含有する支持体の領域を検出するために使用する装置の１つの態様を例示する。この装置は、例えば、蛍光標識したレセプター、例えば、支持体上の合成されたポリマーに結合している抗体の存在または不存在を検出するために使用されるであろう。
【０２０６】
光は光源１００２、例えば、当業者によく知られている型のレーザー光源、例えば、スペクトラ・フィジカ（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃａ）製の型 Ｎｏ．２０２５から支持体に向けられる。光源からの光はレンズ１００４で向けられ、このレンズは好ましくは当業者によく知られている型の円筒形レンズである。レンズ１００４から生ずる出力は光のスポットするよりむしろ直線のビームである。こうして、データは絵素×絵素の基準するよりむしろ絵素の線状の配列に沿って実質的に同時に検出することができる。理解されるように、ここにおいて表面上に直線のビームを発生する１つの技術の例示として円筒形レンズを使用するが、他の技術をまた利用することができる。
【０２０７】
円筒形レンズからのビームを二色性ミラーまたはプリズム通過させ、そして適当に調製された支持体１００８の表面に向ける。支持体１００８をｘ−ｙ並進ステージ１００９、例えば、ニューポート製の型 Ｎｏ．ＰＭ５００−８上に配置する。支持体上のある位置は蛍光を発し、そして蛍光はダッシュ線により示された通路に沿って二色性ミラーを通して伝送しもどされ、そして線状の検出器上の適当なレンズ１０１０、例えば、ｆ／１．４のカメラのレンズで可変ｆストップ収束レンズ１０１４を経て収束される。直線の光のビームの使用により、支持体上の個々の点からよりむしろ、支持体に沿って絵素の線（例えば、約１ｃｍ）にわたってデータを発生させることができるようになる。別の態様において、光は支持体の２次元の区域に向けられ、そして蛍光は２次元のＣＣＤの配列により検出される。線状の検出は、実質的により高い電力密度が得られるので、好ましい。
【０２０８】
検出器１０１２は支持体から放射される蛍光量を位置の関数として検出する。１つの態様によれば、検出器は当業者に普通に知られている型の線状のＣＣＤの配列である。ｘ−ｙ並進ステージ、光源および検出器１０１２のすべてはコンピューター１０１６、例えば、装置およびＣＣＤの配列からのデータ収集をコントロールするＩＢＭ ＰＣ−ＡＴまたは同等のコンピューターに操作的に接続されている。
【０２０９】
操作において、支持体を並進ステージにより適当に位置決定する。次いで光源を照明し、そして蛍光強度のデータを検出器を介してコンピューターで集める。
【０２１０】
別の態様において、支持体およびｘ−ｙ並進テーブルを１または２以上の対物レンズを含む顕微鏡の下に配置する。レーザー（これにある態様において型 Ｎｏ．２０２０−０５のアルゴンイオンのレーザー、Ｓｐｅｃｔｒａｐｈｙｓｉｃｓ製）からの光（約４８８ｎｍ）を二色性ミラーにより支持体に向け、この二色性ミラーは約５２０ｎｍより大きい光を通過させるが、４８８ｎｍの光を反射する。二色性ミラーは、例えば、カール・ツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）製の型 Ｎｏ．ＦＴ５１０であることができる。鎖から反射した光は顕微鏡に入り、この顕微鏡は、例えば、カール・ツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）製の型 Ｎｏ．Ａｘｉｏｓｃｏｐ２０であることができる。支持体上の蛍光でマークされた物質は＞４８８ｎｍの光の蛍光を発し、そしてこの蛍光した光は顕微鏡により集められ、そして鏡を通過する。次いで支持体からの蛍光は波長フィルターに向けられ、その後、開ロプレートを通過する。波長フィルターは、例えば、メレス・グリオット（Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ）製の型 Ｎｏ．０Ｇ５３０であることができ、そして開ロプレートは、カール・ツァイス（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）製の型 Ｎｏ．４７７３５２／４７７３８０であることができる。
【０２１１】
次いで蛍光した光は光電子増倍管に入り、この光電子増倍管はある態様においてハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）製の型 Ｎｏ．Ｒ９４３−０２であり、信号は前置増幅器において増幅され、そしてフォトンはフォトンカウンターにより計数される。フォトンの数をコンピューターにおいて位置の関数として記録される。前置増幅器は、例えば、スタンフォード・リサーチ・システム（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）製の型 Ｎｏ．ＳＲ４４０であることができ、そしてフォトンカウンターはスタンフォード・リサーチ・システム（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ）製の型Ｎｏ．ＳＲ４４０であることができる。次いで支持体を引き続く位置に動かし、そしてこのプロセスを反復する。好ましい態様において、データを１〜１００μｍ毎に獲得し、ここで約０．８〜１０μｍのデータ収集直径が好ましい。十分に高い蛍光を使用する態様において、広い場の照明をもつＣＣＤ検出器を利用する。
【０２１２】
第１１図は、データ収集システムの構成をより詳細に例示する。このシステムの操作はフォトン計数プログラム１１０２の指示のもとに実施される。ユーザーは走査の次元、ある領域の絵素または点の数、および計数プログラムに対する走査速度をインプットする。ＧＰ１Ｂバス１１０４を介して、プログラム（例えば、ＩＢＨＰＣコンパーチブルコンピユーター）はマルチチャンネルのスケーラー１１０６、例えば、スタンフォード・リサーチのＳＲ４３０およびｘ−ｙ並進ステージのコントローラー１１０８、例えば、ニューポートＰＭ５００とインターフェースする。蛍光を発生する支持体からの光からの信号は光電子増倍管１１１０に入り、スケーラー１１０６の出力を与える。所定の領域における計数の数を示すデータはスケーラーから出力される。選択した区域を走査した後、ステージコントローラーは加速および速度のために命令で活性化され、これは引き続いて走査ステージ１１１２、例えば、ニューポートＰＭ５００−Ａを他の領域に推進する。
【０２１３】
データは画像データのファイル１１１４において収集され、そしてスケーリングプログラム１１１６においてプロセシングされる。スケールされた画像は、例えば、ＶＧＡディスプレー１１１８上の表示のために出力される。画像は絵素／クリップの百分率および表すべき絵素レベルの最小および最大の入力に基づいてスケールされる。このシステムは使用のために生データにおける最小および最大の絵素レベルを出力する。
【０２１４】
Ｂ．データの分析
データ収集システムからの出力は、蛍光強度／支持体上の位置を示すデータの配列である。データは、典型的には、所定のポリマーの合成が起こった区域より実質的に小さい領域にわたって採取される。単に例として、ポリマーが５００ミクロン×５００ミクロンの寸法を有する支持体上の正方形で合成された場合、データは５ミクロン×５ミクロンの寸法を有する領域にわたって採取することができる。最も好ましい態様において、支持体を横切って蛍光のデータを取る領域は、個々のポリマーが合成される領域の区域の約１／２より小さく、妊ましくは単一のポリマーが合成される領域の区域の約１／１０より小さく、最も好ましくは単一のポリマーが合成される領域の区域の約１／１００より小さい。それゆえ、所定のポリマーが合成された任意の区域内で、多数の蛍光のデータ点が集められる。
【０２１５】
セルが、例えば、標識した抗体に暴露されたとき、セルの走査のための絵素の数／蛍光強度のプロットは、典型的には、ベル状の曲線の形態を取るが、もっともらしいデータは、とくにより高い強度において、観察される．相対的結合親和性を決定するとき所定の合成領域にわたって蛍光強度の平均を使用することが望ましいので、これらのもっともらしいデータは望ましくないようにデータをゆがめる傾向がある。
【０２１６】
したがって、本発明の１つ態様において、データをこれらのもっともらしいデータ点を除去するために補正し、その後データ点の平均は相対的結合の効率の決定において利用する。
【０２１７】
第１２図は、１組の蛍光のデータ、例えば、親和性のスクリーニングの研究において使用するデータからのもっともらしいデータの除去のためのシステムの１つの態様を例示する。ユーザーまたはシステムは、工程１３０２におけるチップの位置およびセルのコーナーに関するデータを入力する。この情報および画像のファイルから、このシステムは工程１３０４におけるヒストグラムのコンピューターの表示をつくり、このヒストグラム（少なくともコンピューターのファイルの形態）はデータの絵素の数／強度をプロットする。
【０２１８】
各セルについて、次いで主要なデータ分析ループを実施する。各セルについて、工程１３０６において、このシステムは変化するレベル付近に集中したバンド幅について、合計の蛍光強度または絵素の数を計算する。例えば、プロットにおいて工程１３０６の右に示すように、こシステムは幅ｗのバンド内の絵素の数を計算する。このシステムはこのバンド幅をより高い中心の強度に「動かし」、そして再びこのバンド幅において絵素の数を計算する。このプロセスを強度の全体の範囲が走査されてしまうまで反復し、そして工程１３０８において、このシステムはどのバンドが最高の合計の数の絵素を有するかを決定する。このバンド幅内のデータはそれ以上の分析のために使用される。このバンド幅を合理的に小さいように選択すると仮定すると、この手順はより高い強度のレベルに位置するもっともらしいデータを排除する効果を有する。次いでこのシステムは、すべてのセルが評価された場合、工程１３１０において反復されるか、あるいは次のセルについて反復される。
【０２１９】
工程１３１２において、次いでこのシステムは選択したセルの各々についてバンド幅内のデータを積分し、工程１３１４において合成手順のファイルを使用してデータを分類し、そしてユーザーに対して、例えば、ビデオのディスプレーまたはプリンター上にデータを表示する。
【０２２０】
Ｖ．代表的な応用
Ａ．オリゴヌクレオチドの合成
光統制された空間的にアドレス可能な平行の化学的合成の一般性を、核酸の合成への応用により証明する。
【０２２１】
１．実施例
チミジン−シチジンの２量体の光活性化された形成を実施した。ジヌクレオチドの光統制された合成により発生された７つの正方形×４つの正方形のチェッカー盤状のパターンを示す蛍光の走査の３次元の表示を生成した。５’−ニトロベラトリルチミジンを合成支持体に３’ヒドロキシ基を通して取り付けた。ニトロベラトリル保護基を５００μｍのチェッカー盤状のマスクを通す照明により除去した。次いで、支持体をホスホルアミダイト活性化２’−デオキシシチジンで処理した。反応を蛍光測定的に追跡するために、デオキシシチジンはエキソサイクリックアミンに取り付けられたＦＭＯＣ保護されたアミノヒドロキシルリンカーで修飾されていた（５’−〇−ジメトキシトリチル−４−Ｎ−（６−Ｎ−フルオレニルメチルカルバモイル−ヒドロキシルカルボキシ）−２’−デオキシシチジン）。ＦＭＯＣ保護基を塩基で除去した後、支持体をＤＭＦ中の１ｍＭのＦＩＴＣで１時間の間処理することによって、ジヌクレオチドを含有する領域を蛍光標識した。
【０２２２】
輝いた上昇した絵素の交互する正方形を示す蛍光強度のデータの３次元の表示は、支持体の光分解の間に使用したチェッカー盤状の照明のパターンを再現する。この結果が示すように、オリゴヌクレオチドならびにペプチドは光統制された方法により合成することができる。
【０２２３】
他の実施例において、チミジン−シチジン−シチジンの光活性化された形成を第１３図に示すように実施した。ここで、前の実施例におけるように、５’−ニトロベラトリルチミジンを支持体にホスホルアミダイト化学を経て［ビス（２−ヒドロキシエチル）−３−アミノプロピルシロキサン］を含有する表面に取り付けた。次いでスライドをジオキサンの存在下に１０分間均一に照明した（３６２ｎｍ、約１４ｍＷ／ｍ２）。乾燥後、次いで表面をＮ，４一ジメトキシトリチル−５’−ニトロベラトリル−２’−デオキシシチジン−３’−〇−（２−シアノエチル）ーＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトでテトラゾールの存在下に処理した（標準のホスホルアミダイトのカップリング化学）。酸化および乾燥後、プレートを再び前述のように照明したが、ただし５００μｍのチェッカー盤状のマスクを光源とスライドとの間に配置した。次いで表面を５’−Ｏ−（４，４’一ジメトキシ）−Ｎ−４−（６−（ビオチノイル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ）ヘキサノイル、アミノヘキシル）−５−メチル−２’−デオキシシチジン−３’−〇−（シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトおよびテトラゾールに暴露した。酸化および乾燥後、トリヌクレオチドを含有する区域はＦＩＴＣ標識したストレプトアビジンで処理することによって蛍光標識した。蛍光強度のデータの生ずる表示は、光分解の間に使用した５００μｍおよびチェッカー盤状の照明のパターンに相当する交互する輝いた正方形および暗い正方形を示した。
【０２２４】
ＶＩ．結論
ここにおける本発明は、多数の化合物を同時に合成する新規なアプローチを提供する。この方法は、固相のフォーマットでカップリングすることができる化学的構成ブロックを有するとき、および光を使用して反応性基を発生させることができるとき、いつでも応用することができる。
【０２２５】
上の記載は例示でありそして限定的ではない。本発明の多数の変化は当業者にとってこの開示を見ると明らかであろう。単に例として、本発明をペプチドおよびヌクレオチドの合成に主として関して例示したが、本発明はそのように限定されない。したがって、本発明の範囲は上の記載を参照せず、その代わりに添付する請求の範囲ならびにそれらの同等の態様の完全な範囲を参照して決定されるべきである。
（２）配列番号１についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
１ ５
（２）配列番号２についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｌ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号２：
Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
１ ５
（２）配列番号３についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号３：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
１ ５
（２）配列番号４についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号４：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号５についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号５：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号６についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号６：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
１ ５
（２）配列番号７についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号７：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号８についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号８：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ
１
（２）配列番号９についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号９：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号１０についての情報；
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１０：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号１１についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：４個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１１：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ
１
（２）配列番号１２についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１２：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
１ ５
（２）配列番号１３についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１３；
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｈｅ
１ ５
（２）配列番号１４についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｌ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１４：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
１ ５
（２）配列番号１５についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１５：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
１ ５
（２）配列番号１６についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１６：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
１ ５
（２）配列番号１７についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：７個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列＝配列番号１７：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
１ ５
（２）配列番号１８についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ；６個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１８：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ｇｌｎ
１ ５
（２）配列番号１９についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号１９：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｍｅｔ
１ ５
（２）配列番号２０についての情報：
（ｉ）配列特致
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号２０：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ
１ ５
（２）配列番号２１についての情報：
（ｉ）配列特徴
（Ａ）長さ：５個のアミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：ペプチド
（ｘｉ）配列：配列番号２１：
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｍｅｔ
１ ５
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】第１図は、光統制された空間的にアドレ：ス可能な平行の化学的合成を概略的に示す。
【図２】第２図は、光統制されたペプチドの合成の１つの実施例を概略的に示す。
【図３】第３図は、多様なポリマーの配列を合成する自動化されたシステムのためのソフトウェアを概略的に示す。
【図４】第４ａ図および第４ｂ図はポリマーの合成のためのプログラムの操作を示す。
【図５−１】第５図は、「純粋な」バイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図５−２】第５図は、「純粋な」バイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図６−１】第６図は、グレイコードのバイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図６−２】第６図は、グレイコードのバイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図７−１】第７図は、変更されたグレイコードのバイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図７−２】第７図は、変更されたグレイコードのバイナリーマスキング法を概略的に示す。
【図８】第８ａ図は、４工程の合成のためのマスキング法を概略的に示す。第８ｂ図は、すべての４００のペプチドの２量体の合成を概略的に示す。
【図９】第９図は、１０工程のバイナリー合成のための座標地図である。
【図１０】第１０図は、データ収集システムを概略的に示す。
【図１１】第１１図は、データ収集システムの構成を示すブロック線図である。
【図１２】第１２図は、データ収集／分析システムのためのソフトウェアの操作を示すフローチャートである。
【図１３】第１３図は、光統制されたオリゴヌクレオチドの合成の１つの実施例を概略的に示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体上で、ポリマーの配列を複数合成するための反応器システムであって：
ａ）前記支持体に反応流体を接触するための反応器；
ｂ）前記反応器に選択された反応流体を送るためのシステム；
ｃ）少なくとも第１相対位置から第２相対位置に対してマスク又は支持体を移
動するための並進ステージ；
ｄ）マスクを通して前記支持体を選択された時間で照射するための光；
ｅ）前記反応器システムからの流体の流れを選択的に方向付けし、前記並進段
階を選択的に活性化し、そして前記支持体上で複数の多様なポリマー配列を予定された位置で形成するために前記支持体を選択的に照射するための適切にプログラムされたディジタル型コンピューターを含んで成る反応器システム。
【請求項２】
前記システムは、ポリマーの配列の初期スクリーニングのために使用される、前記支持体に、反応流体において複数のモノマーを供給するように適合される、請求項１に記載の反応器システム。
【請求項３】
結合親和性研究への使用のために複数のリンカーポリマーを基板上でスクリーニングするための方法であって：
ａ）選択された領域における支持体上に複数のリンカーポリマーを形成し、ここで前記リンカーポリマーが：
ｉ）支持体の表面上で、保護基を除去するために前記選択された領域の一部を照射し；そして
ｉｉ）前記表面とモノマーとを接触せしめる再帰的段階により形成され；
ｂ）前記複数のリンカーポリマーとリガンドとを接触せしめ；そして
ｃ）前記リガンドとラベルされたレセプターとを接触せしめる段階を含んで成る方法。
【請求項４】
前記リガンドがポリペプチドである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記レセプターが抗体である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記段階ｉｉ）で添加されるモノマーが前記再帰的段階の個々において同じであり、前記選択された領域が異なった長さのリンカー分子を含んで成る請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ラベルされたレセプターがフルオレセイン化されたレセプターである請求項３に記載の方法。
【請求項８】
下記式で表わされる化合物：
【化１Ａ】
［式中、ｎ＝０又は１であり；Ｙは、天然又は非天然のアミノ酸のカルボキシル基の酸素原子、天然又は非天然のアミノ酸のアミノ基、又は天然又は非天然のデオキシリボ核酸およびリボ核酸のＣ−５’酸素基から成る群から選択され；Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィド、又はホスフィド基であり；Ｒ４およびＲ５は、独立して、アルコキシ、アルキル、水素、ハロ、アリール又はアルケニル基である］。
【請求項９】
前記Ｒ１〜Ｒ３がそれぞれ水素原子である請求項第８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記Ｒ４及びＲ５がそれぞれ水素原子である請求項第８に記載の化合物。
【請求項１１】
前記Ｒ４及びＲ５がそれぞれメチル基である請求項第８に記載の化合物。
【請求項１２】
下記式を有する化合物：
【化２Ａ】
［式中、Ｒは、天然または非天然のアミノ酸の側鎖であり、そして、Ｘは、光除去可能な保護基である］。
【請求項１３】
前記Ｘが下記式：
【化３Ａ】
［式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４は独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド又はホスフィド基であり、又は隣接する置換基は環状アセタール又はケタールを一緒に形成する置換された酸素基であり；そしてＲ５は水素原子、アルコキシル、アルキル、ハロ、アリール、又はアルケニル基である］を有する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記Ｒ１及びＲ４がそれぞれ水素原子であり、そしてＲ２及びＲ３がそれぞれメトキシ基である請求項第１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記Ｒ５がメチル基である請求項第１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記Ｒ２及びＲ３が環状アセタールを一緒に形成する置換された酸素基である請求項第１３に記載の化合物。
【請求項１７】
前記Ｒ１及びＲ４がそれぞれ水素原子である請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記Ｒ５がメチル基である請求項１７に記載の化合物。
【請求項１】
支持体上で、ポリマーの配列を複数合成するための反応器システムであって：
ａ）前記支持体に反応流体を接触するための反応器；
ｂ）前記反応器に選択された反応流体を送るためのシステム；
ｃ）少なくとも第１相対位置から第２相対位置に対してマスク又は支持体を移
動するための並進ステージ；
ｄ）マスクを通して前記支持体を選択された時間で照射するための光；
ｅ）前記反応器システムからの流体の流れを選択的に方向付けし、前記並進段
階を選択的に活性化し、そして前記支持体上で複数の多様なポリマー配列を予定された位置で形成するために前記支持体を選択的に照射するための適切にプログラムされたディジタル型コンピューターを含んで成る反応器システム。
【請求項２】
前記システムは、ポリマーの配列の初期スクリーニングのために使用される、前記支持体に、反応流体において複数のモノマーを供給するように適合される、請求項１に記載の反応器システム。
【請求項３】
結合親和性研究への使用のために複数のリンカーポリマーを基板上でスクリーニングするための方法であって：
ａ）選択された領域における支持体上に複数のリンカーポリマーを形成し、ここで前記リンカーポリマーが：
ｉ）支持体の表面上で、保護基を除去するために前記選択された領域の一部を照射し；そして
ｉｉ）前記表面とモノマーとを接触せしめる再帰的段階により形成され；
ｂ）前記複数のリンカーポリマーとリガンドとを接触せしめ；そして
ｃ）前記リガンドとラベルされたレセプターとを接触せしめる段階を含んで成る方法。
【請求項４】
前記リガンドがポリペプチドである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記レセプターが抗体である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記段階ｉｉ）で添加されるモノマーが前記再帰的段階の個々において同じであり、前記選択された領域が異なった長さのリンカー分子を含んで成る請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ラベルされたレセプターがフルオレセイン化されたレセプターである請求項３に記載の方法。
【請求項８】
下記式で表わされる化合物：
【化１Ａ】
［式中、ｎ＝０又は１であり；Ｙは、天然又は非天然のアミノ酸のカルボキシル基の酸素原子、天然又は非天然のアミノ酸のアミノ基、又は天然又は非天然のデオキシリボ核酸およびリボ核酸のＣ−５’酸素基から成る群から選択され；Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド、スルフィド、又はホスフィド基であり；Ｒ４およびＲ５は、独立して、アルコキシ、アルキル、水素、ハロ、アリール又はアルケニル基である］。
【請求項９】
前記Ｒ１〜Ｒ３がそれぞれ水素原子である請求項第８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記Ｒ４及びＲ５がそれぞれ水素原子である請求項第８に記載の化合物。
【請求項１１】
前記Ｒ４及びＲ５がそれぞれメチル基である請求項第８に記載の化合物。
【請求項１２】
下記式を有する化合物：
【化２Ａ】
［式中、Ｒは、天然または非天然のアミノ酸の側鎖であり、そして、Ｘは、光除去可能な保護基である］。
【請求項１３】
前記Ｘが下記式：
【化３Ａ】
［式中、Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３及びＲ４は独立して、水素原子、低級アルキル、アリール、ベンジル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、チオール、チオエーテル、アミノ、ニトロ、カルボキシル、ホルメート、ホルムアミド又はホスフィド基であり、又は隣接する置換基は環状アセタール又はケタールを一緒に形成する置換された酸素基であり；そしてＲ５は水素原子、アルコキシル、アルキル、ハロ、アリール、又はアルケニル基である］を有する、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記Ｒ１及びＲ４がそれぞれ水素原子であり、そしてＲ２及びＲ３がそれぞれメトキシ基である請求項第１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記Ｒ５がメチル基である請求項第１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記Ｒ２及びＲ３が環状アセタールを一緒に形成する置換された酸素基である請求項第１３に記載の化合物。
【請求項１７】
前記Ｒ１及びＲ４がそれぞれ水素原子である請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記Ｒ５がメチル基である請求項１７に記載の化合物。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図１３】
【図３】
【図４】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１】
【図１３】
【公開番号】特開２００６−１８８４９５（Ｐ２００６−１８８４９５Ａ）
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３５１３７５（Ｐ２００５−３５１３７５）
【出願日】平成１７年１２月５日（２００５．１２．５）
【分割の表示】特願平４−５０３６６０の分割
【原出願日】平成３年１１月２０日（１９９１．１１．２０）
【出願人】（３９９１２５７５７）アフィメトリックス インコーポレイテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月５日（２００５．１２．５）
【分割の表示】特願平４−５０３６６０の分割
【原出願日】平成３年１１月２０日（１９９１．１１．２０）
【出願人】（３９９１２５７５７）アフィメトリックス インコーポレイテッド (17)
【Ｆターム（参考）】
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