Ａｐｏ（ａ）遺伝子における多型はアセチルサリチル酸治療に対する応答性を予測する
リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））は、単一のアポリポタンパク質Ｂ−１００分子に対するジスルフィド結合を通じてコレステロールリッチの脂質と一緒に共有結合された単一のアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））分子からなる血漿複合体である。高レベルのＬｐ（ａ）は増大した心血管系のリスクおよび心血管系イベント、例えば、心筋梗塞および発作を、特にＬＤＬ−Ｃも上昇している場合にともなっている。本発明は、ヒトＡｐｏ（ａ）遺伝子中のヌクレオチド多型、およびヒト被験体がアセチルサリチル酸での処置に応答するか否かを決定する工程における、Ａｐｏ（ａ）ヌクレオチド多型の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセチルサリチル酸治療に対するヒト被験体の応答性を評価するための、アポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子におけるヌクレオチド変化を分析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））は、単一のアポリポタンパク質Ｂ−１００分子に対するジスルフィド結合を通じてコレステロールリッチの脂質と一緒に共有結合された単一のアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））分子からなる血漿複合体である（非特許文献１）。正常な生理学におけるＬｐ（ａ）の生物学的機能は、不明確なままであるが、高レベルのＬｐ（ａ）は増大した心血管系のリスクおよび心血管系イベント、例えば、心筋梗塞および発作を、特にＬＤＬ−Ｃも上昇している場合にともなっている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００３】
なかでもアポリポタンパク質（ａ）遺伝子座は、ヒトゲノムでは最も多型である。Ａｐｏ（ａ）の遺伝子のバリエーションは、広範なＬｐ（ａ）値を伴っており、Ｌｐ（ａ）の遺伝力のかなりの部分を占めている（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。近年では、Ａｐｏ（ａ）遺伝子におけるいくつかの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）が特定されており、心血管系の障害、例えば、心筋梗塞および発作および／または薬物応答、例えば、スタチン類に対する応答に関連している（特許文献１を参照のこと）。
【０００４】
将来の心血管系イベントのリスクの増大している被験体はしばしば、心血管系イベントのリスクを低減するためにアセチルサリチル酸（アスピリン）を処方される。しかし、アセチルサリチル酸は、全ての被験体で有効なのではなく、心血管系イベントに対する一次予防としてのアセチルサリチル酸（アスピリン）の使用は、データが少ない女性では特に、議論の余地があった（非特許文献１１）。
【０００５】
従って、薬剤選択設計および治療を改善することが継続して必要である。それに関しては、ＳＮＰ類は、アセチルサリチル酸および／または他の抗血小板および／または抗血栓剤などの特定の薬剤での処置にもっとも適した患者を特定するために用いられ得る（しばしば、「薬理遺伝学」と呼ばれる）。同様に、ＳＮＰ類は、毒性の副作用を発症する可能性が増大している患者、またはその処置に対して応答がない可能性に起因して、特定の処置から患者を除外するために用いられ得る。そうすることによって、このようなＳＮＰ類は、個々の被験体の所定の介入のリスク比に対して利点を規定するのに有用であり得る。薬理遺伝学はまた、薬物開発および選択プロセスを補助するための薬理学的研究に用いられ得る。（非特許文献１２；非特許文献１３；特許文献２；および非特許文献１４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２７２０５４号明細書
【特許文献２】国際公開第９７／４０４６２号パンフレット，Ｓｐｅｃｔｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｒｃｏｖｉｎａら．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｅｓｔｉｎｇ Ｒｉｆａｉら、編集：ＡＡＣＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０００；ｐ．８１９
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２４，２２１９（２００４）
【非特許文献３】Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ １０，２２５（１９９９）
【非特許文献４】Ｄａｎｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２，１０８２（２０００）
【非特許文献５】Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２９７，６１１（２００７）
【非特許文献６】Ｄａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２９６，１３６３（２００６）
【非特許文献７】Ｂｒｏｅｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３０，２１０（２００２）
【非特許文献８】Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９０，５２（１９９２）
【非特許文献９】Ｍｏｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６１，４０２（１９９７）
【非特許文献１０】Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １４ １９０（２００６）
【非特許文献１１】Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５２，１２９３；２００５
【非特許文献１２】Ｌｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３，２５４（１９９７）
【非特許文献１３】Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，１２４９（１９９７）
【非特許文献１４】Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，３（１９９８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、将来の心血管系イベントのリスクを低減するためのアセチルサリチル酸処置に対するヒト被験体の応答を評価する方法に部分的には関する。本発明は、Ａｐｏ（ａ）遺伝子における新規なヌクレオチド多型によって、ヒト被験体がアセチルサリチル酸での処置、特定の用量のアセチルサリチル酸、または別の抗血小板もしくは抗血栓剤に応答するかしないかに関して推論が可能になるという知見に一部は基づく。本発明によって、治療の開始の前に、アセチルサリチル酸での処置に対して応答する被験体および応答しない被験体を特定することが可能になる。本発明によってまた、特定の被験体について心血管系イベントのリスクを下げるという最高の利点をもたらす可能性が最も高い剤を抗血小板および抗血栓剤の中から選択することが可能になる。開示された多型はまた、心血管系イベントおよび関連の病理の診断および処置における使用のための、診断試薬の設計および治療剤の開発のための標的として有用である。
【０００９】
本発明の局面によれば、将来の心血管系イベントのリスクを低減するためのアセチルサリチル酸処置に対するヒト被験体の応答性の評価のための方法が提供される。この方法は、ヒト被験体のアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置で単一ヌクレオチド多型の同一性を確認する工程を包含する。いくつかの重要な実施形態では、染色体６：１６０８８０８７７の位置のシトシンまたはグアニンによって特徴付けられる多型の存在は、アセチルサリチル酸処置に対する応答性を示す。他の重要な実施形態では、染色体６：１６０８８０８７７の位置のチミンまたはアデニンによって特徴付けられる多型性の存在は、アセチルコリン酸処置に対する非応答性を示す。
【００１０】
当業者に周知である、任意の種々の検出方法を使用してもよい。一般的方法としては、被験体から得た核酸と核酸プローブとを接触させる工程、または被験体から得た核酸を配列決定する工程を包含する。このような方法の例としては限定はしないが、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、サイズ分析および一本鎖高次構造多型が挙げられる。いくつかの重要な実施形態では、多型の同一性は、被験体から得た核酸を配列決定することによって決定される。
【００１１】
本発明の別の局面によれば、あるアッセイが提供される。このアッセイは、ある剤と、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でヌクレオチドのシトシンまたはグアニンを有する（Ａｐｏ（ａ））遺伝子によってコードされる単離されたアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））タンパク質とを接触する工程と、この単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に、またはリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））に対するこの剤の結合を評価する工程と、コントロールに対する結合を比較する工程と、を包含する。ある実施形態では、このコントロールは、この単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質にもしくはＬｐ（ａ）に、またはＬｐ（ａ）に対するアセチルサリチル酸の結合の測定、あるいは血小板とのアセチルサリチル酸相互作用の測定を包含する。
【００１２】
本発明の別の局面によれば、あるアッセイが提供される。このアッセイは、ある剤と、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でヌクレオチドのチミンまたはアデニンを有するＡｐｏ（ａ）遺伝子によってコードされる単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質とを接触する工程と、この単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に対するこの剤の結合を評価する工程と、コントロールに対する結合を比較する工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、このコントロールは、この単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に、もしくはＬｐ（ａ））に、または血小板に対するアセチルサリチル酸の結合の測定、あるいは血小板とのアセチルサリチル酸の相互作用の測定を包含する。
【００１３】
本発明の別の局面によれば、処置の方法が提供される。この方法は、ヒト被験体が染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でシトシンまたはグアニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型を有することに基づいてこのヒト被験体を選択する工程と、この被験体が多型を有する理由で将来の心血管系イベントのリスクを低減するためにこの被験体に対してアセチルサリチル酸を投与することとを包含する。いくつかの実施形態では、この被験体はまた、血中のＬｐ（ａ）のレベルが上昇している。
【００１４】
本発明の別の局面によれば、処置の方法が提供される。この方法は、ヒト被験体が染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でチミンまたはアデニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型を有することに基づいてこのヒト被験体を選択する工程と、この被験体が多型を有する理由で将来の心血管系イベントのリスクを低減するためにこの被験体に対してアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤を投与することと、を包含する。いくつかの実施形態では、この被験体はまた、血中のＬｐ（ａ）のレベルが上昇している。
【００１５】
抗血栓剤は、チエノピリジンであっても、またはチエノピリジン誘導体であってもよい。チエノピリジンまたはチエノピリジン誘導体の例としては限定はしないが、クロピドグレル、クロピドグレル重硫酸塩、チクロピジン、プラスグレル（ＣＳ−７４７またはＬＹ６４０３１５）、ＳＲ２５９８９、およびＰＣＲ４０９９が挙げられる。抗血栓剤としてはまた、限定はしないが、セノキサパリンナトリウム、キメラガトラン、アブシキシマブ、オチロフィバンが挙げられる。他の抗血栓剤の例としてはまた、プラスミノーゲンアクチベータ（例えば、アクチベース、アルテプラーゼ）（不活性なプラスミノーゲンのプラスミンへの変換を触媒する）が挙げられる。これは、プレカリクレイン、キニノーゲン、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、プラスミノーゲンプロアクチベータ、および組織プラスミノーゲン活性化因子ＴＰＡ）、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼアクチベータ複合体、プロ−ウロキナーゼ（Ｐｒｏ−ＵＫ）、ｒＴＰＡ（アルテプラーゼまたはアクチバーゼ；ｒは組み換えを意味する）、ｒＰｒｏ−ＵＫ、アボキナーゼ、エミナーゼ、セレプターゼ、アナグレリド、塩酸アナグレリド、ビバリルジン、ダルテパリンナトリウム、ダナパロイドナトリウム、塩酸ダゾキシベン、硫酸エフェガトラン、エノキサパリンナトリウム、イフェトロバン、イフェトロバンナトリウム、チンザパリンナトリウム、レタプラーゼ、トリフェナグレル、ワルファリン、デキストラン、アミノカプロン酸（Ａｍｉｃａｒ）、およびトラネキサム酸（Ａｍｓｔａｔ）、スルフィンピラゾン、ジピリダモール、クロフィブラート、カルバミン酸ピリジノール、ＰＧＥ、グルカゴン、抗セロトニン薬、カフェイン、テオフィリンペントキシフィリン、およびチクロピジンの相互作用により生じる可能性がある。抗血栓剤としてはまた、限定はしないが、ＰＡＲ−１およびＰＡＲ−２レセプターを含む血小板レセプター、ならびにトロンビンの血小板レセプター、およびＰ２Ｙ１２などの血小板ＡＤＰレセプターに特異的に結合する抗血栓剤が挙げられる。
【００１６】
本発明の別の局面によれば、将来の心血管系イベントのリスクを減らすためのアセチルサリチル酸処理に対するヒト被験体の応答性を評価するための方法が提供される。本発明は、ヒト被験体のアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置で単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と連鎖または連鎖不均衡である遺伝子マーカーの有無を検出する工程を包含する。この遺伝子マーカーは対立遺伝子、ＳＮＰ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、または単純配列リピート（ＳＳＲ）であってもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、上記遺伝子マーカーは、染色体６：１６０８４９８９４（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９３１ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである。いくつかの実施形態では、上記遺伝子マーカーは、染色体６：１６０８３０２７２（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９２７ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである。いくつかの実施形態では、上記連鎖は、Ｋｒｉｎｇｌｅ（Ｋｒ）ＩＶ２型ドメインの１６、１７または１８リピートの間である。
【００１８】
いくつかの重要な実施形態では、染色体６：１６０８８０８７７の位置のシトシンまたはグアニンによって特徴付けられる多型の存在は、アセチルサリチル酸に対する応答性を示す。他の重要な実施形態では、染色体６：１６０８８０８７７の位置のチミンまたはアデニンによって特徴付けられる多型の存在は、アセチルサリチル酸に対する非応答性を示す。ある実施形態では、この方法は、被験体由来の血液サンプル中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルを決定する工程をさらに包含する。
【００１９】
本発明のさらに別の局面によれば、処置の方法が提供される。この方法は、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でのシトシンまたはグアニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型と連鎖するか、または連鎖不均衡である遺伝子マーカーをヒト被験体が有することに基づいてこのヒト被験体を選択する工程と、この被験体が多型を有する理由で将来の心血管系イベントのリスクを低減するためにこの被験体に対してアセチルサリチル酸を投与することと、を包含する。
【００２０】
上記遺伝子マーカーは、対立遺伝子、ＳＮＰ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、または単純配列リピート（ＳＳＲ）であってもよい。いくつかの実施形態では、上記ヒト被験体はまた、血液中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の上昇した値を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、上記遺伝子マーカーは、染色体６：１６０８４９８９４（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９３１ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである。いくつかの実施形態では、上記遺伝子マーカーは、染色体６：１６０８３０２７２（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９２７ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである。いくつかの実施形態では、上記連鎖は、Ｋｒｉｎｇｌｅ（Ｋｒ）ＩＶ２型ドメインの１６、１７または１８リピートの間である。
【００２２】
本発明のさらに別の局面によれば、処置の方法が提供される。この方法は、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）のチミンまたはアデニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型と連鎖するか、または連鎖不均衡である遺伝子マーカーをヒト被験体が有することに基づいてこのヒト被験体を選択する工程と、この被験体が多型を有する理由で将来の心血管系イベントのリスクを低減するためにこの被験体に対してアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤を投与することと、を包含する。いくつかの実施形態では、このヒト被験体はまた、血液中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の上昇した値を有する。
【００２３】
上記遺伝子マーカーは、対立遺伝子、ＳＮＰ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、または単純配列リピート（ＳＳＲ）であってもよい。いくつかの実施形態では、上記ヒト被験体はまた、血液中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の上昇した値を有する。
【００２４】
本発明のなお別の局面によれば、将来の心血管系イベントのヒト被験体のリスクを評価するための方法が提供される。この方法は、ヒト被験体のＡｐｏ（ａ）遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置での単一ヌクレオチド多型の同一性を確認する工程と、このヒト被験体由来の血液サンプル中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルを測定する工程とを包含する。いくつかの実施形態では、ヒト被験体のＡｐｏ（ａ）遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でのシトシンまたはグアニンによって特徴づけられる多型の存在、およびこの被験体由来の血液サンプル中のＬｐ（ａ）のレベルの上昇の存在は、この被験体が将来の心血管系イベントのリスク増大にあることを示す。
【００２５】
以下の実施形態は、別段示さない限り、本明細書に示される本発明の種々の局面に等しくあてはまる。
【００２６】
上記の心血管系イベントは、心筋梗塞、発作、急性冠症候群、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、血管形成術、一過性虚血性発作、肺塞栓症、血管閉塞または静脈血栓症であってもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態では、上記の方法は、被験体由来の血液サンプル中のＬｐ（ａ）のレベルを測定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この被験体は、血中のＬｐ（ａ）のレベルが上昇している。Ｌｐ（ａ）のレベルは、被験体由来の血液サンプル中で約１０ｍｇ／ｄｌ、約１５ｍｇ／ｄｌ以上、約２０ｍｇ／ｄｌ、約２５ｍｇ／ｄｌ以上、約３０ｍｇ／ｄｌ、約３５ｍｇ／ｄｌ以上、約４０ｍｇ／ｄｌ、約４５ｍｇ／ｄｌ以上、約５０ｍｇ／ｄｌであってもよい。Ｌｐ（ａ）のレベルを測定するためには任意の種々の方法が使用され得る。このような方法は、当業者に公知である。Ｌｐ（ａ）のレベルを測定するための方法の例は、Ｄａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２９６，１３６３（２００６）に記載される。
【００２８】
本発明のこれらおよび他の局面は、下にさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】Ｌｐ（ａ）とｒｓ３７９８２２０の遺伝子型との関係を示す１セットのグラフである。Ａ）ＷＨＳからのコーカサス人女性の研究参加者の間のＬｐ（ａ）のレベル（中央値＝１０．３ｍｇ／ｄＬ）、Ｂ）Ａ）と同様にｒｓ３７９８２２０の３つの遺伝子型の間のＬｐ（ａ）のレベル。３つの遺伝子型についての四分位範囲（ＩＱＲ）および中央値は、ボックスおよびその中央のラインによって示す。ウィスカーは、中央値からＩＱＲの１．５倍である範囲ではＬｐ（ａ）の範囲にわたり、ウィスカーを超える過剰なＬｐ（ａ）値は丸で示す。Ｃ）ヘテロ接合性の遺伝子型を有するコーカサス人女性のＬｐ（ａ）値（中央値＝７９．３ｍｇ／ｄＬ）。低Ｌｐ（ａ）および高Ｌｐ（ａ）を有する小集団中のＬｐ（ａ）の分布についてのモデルは、それぞれあてはめ対数正規分布および正規分布によって示される。Ｄ）ｒｓ３７９８２２０についてのヘテロ接合性遺伝子型を有するＰＨＳからのコーカサス人男性の間のＬｐ（ａ）分布（中央値＝６６．９ｍｇ／ｄＬ、ＷＨＳからのサンプルについてとは異なるアッセイで測定、方法を参照のこと）。
【図１Ｂ】Ｌｐ（ａ）とｒｓ３７９８２２０の遺伝子型との関係を示す１セットのグラフである。Ａ）ＷＨＳからのコーカサス人女性の研究参加者の間のＬｐ（ａ）のレベル（中央値＝１０．３ｍｇ／ｄＬ）、Ｂ）Ａ）と同様にｒｓ３７９８２２０の３つの遺伝子型の間のＬｐ（ａ）のレベル。３つの遺伝子型についての四分位範囲（ＩＱＲ）および中央値は、ボックスおよびその中央のラインによって示す。ウィスカーは、中央値からＩＱＲの１．５倍である範囲ではＬｐ（ａ）の範囲にわたり、ウィスカーを超える過剰なＬｐ（ａ）値は丸で示す。Ｃ）ヘテロ接合性の遺伝子型を有するコーカサス人女性のＬｐ（ａ）値（中央値＝７９．３ｍｇ／ｄＬ）。低Ｌｐ（ａ）および高Ｌｐ（ａ）を有する小集団中のＬｐ（ａ）の分布についてのモデルは、それぞれあてはめ対数正規分布および正規分布によって示される。Ｄ）ｒｓ３７９８２２０についてのヘテロ接合性遺伝子型を有するＰＨＳからのコーカサス人男性の間のＬｐ（ａ）分布（中央値＝６６．９ｍｇ／ｄＬ、ＷＨＳからのサンプルについてとは異なるアッセイで測定、方法を参照のこと）。
【図１Ｃ】Ｌｐ（ａ）とｒｓ３７９８２２０の遺伝子型との関係を示す１セットのグラフである。Ａ）ＷＨＳからのコーカサス人女性の研究参加者の間のＬｐ（ａ）のレベル（中央値＝１０．３ｍｇ／ｄＬ）、Ｂ）Ａ）と同様にｒｓ３７９８２２０の３つの遺伝子型の間のＬｐ（ａ）のレベル。３つの遺伝子型についての四分位範囲（ＩＱＲ）および中央値は、ボックスおよびその中央のラインによって示す。ウィスカーは、中央値からＩＱＲの１．５倍である範囲ではＬｐ（ａ）の範囲にわたり、ウィスカーを超える過剰なＬｐ（ａ）値は丸で示す。Ｃ）ヘテロ接合性の遺伝子型を有するコーカサス人女性のＬｐ（ａ）値（中央値＝７９．３ｍｇ／ｄＬ）。低Ｌｐ（ａ）および高Ｌｐ（ａ）を有する小集団中のＬｐ（ａ）の分布についてのモデルは、それぞれあてはめ対数正規分布および正規分布によって示される。Ｄ）ｒｓ３７９８２２０についてのヘテロ接合性遺伝子型を有するＰＨＳからのコーカサス人男性の間のＬｐ（ａ）分布（中央値＝６６．９ｍｇ／ｄＬ、ＷＨＳからのサンプルについてとは異なるアッセイで測定、方法を参照のこと）。
【図１Ｄ】Ｌｐ（ａ）とｒｓ３７９８２２０の遺伝子型との関係を示す１セットのグラフである。Ａ）ＷＨＳからのコーカサス人女性の研究参加者の間のＬｐ（ａ）のレベル（中央値＝１０．３ｍｇ／ｄＬ）、Ｂ）Ａ）と同様にｒｓ３７９８２２０の３つの遺伝子型の間のＬｐ（ａ）のレベル。３つの遺伝子型についての四分位範囲（ＩＱＲ）および中央値は、ボックスおよびその中央のラインによって示す。ウィスカーは、中央値からＩＱＲの１．５倍である範囲ではＬｐ（ａ）の範囲にわたり、ウィスカーを超える過剰なＬｐ（ａ）値は丸で示す。Ｃ）ヘテロ接合性の遺伝子型を有するコーカサス人女性のＬｐ（ａ）値（中央値＝７９．３ｍｇ／ｄＬ）。低Ｌｐ（ａ）および高Ｌｐ（ａ）を有する小集団中のＬｐ（ａ）の分布についてのモデルは、それぞれあてはめ対数正規分布および正規分布によって示される。Ｄ）ｒｓ３７９８２２０についてのヘテロ接合性遺伝子型を有するＰＨＳからのコーカサス人男性の間のＬｐ（ａ）分布（中央値＝６６．９ｍｇ／ｄＬ、ＷＨＳからのサンプルについてとは異なるアッセイで測定、方法を参照のこと）。
【図２Ａ】アスピリン治療による、ｒｓ３７９８２２０またはＬｐ（ａ）の上昇からのリスクの減弱を示す１セットのグラフである。偶発的な血管疾患を有するコーカサス人ＷＨＳ参加者の累積画分のカプラン−マイヤー推定値。Ａ）主要な血管イベントの複合的エンドポイントについてＷＨＳのトライアルの間、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型およびアスピリンまたはプラシーボの割り当てによって層別化した、Ｂ）Ａと同じだが、ただし心筋梗塞の指標について、Ｃ）Ａと同じだが、ただし虚血性発作のエンドポイントについて、およびＤ）ｒｓ３７９８２２０（ＴＴ遺伝子型）のマイナーな対立遺伝子の非キャリアのうち、主な血管イベントの複合的エンドポイントについて９０パーセンタイル（６５．１ｍｇ／ｄＬ）より上または下のＬｐ（ａ）値、およびアスピリンまたはプラシーボ割り当てによって層別化した。
【図２Ｂ】アスピリン治療による、ｒｓ３７９８２２０またはＬｐ（ａ）の上昇からのリスクの減弱を示す１セットのグラフである。偶発的な血管疾患を有するコーカサス人ＷＨＳ参加者の累積画分のカプラン−マイヤー推定値。Ａ）主要な血管イベントの複合的エンドポイントについてＷＨＳのトライアルの間、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型およびアスピリンまたはプラシーボの割り当てによって層別化した、Ｂ）Ａと同じだが、ただし心筋梗塞の指標について、Ｃ）Ａと同じだが、ただし虚血性発作のエンドポイントについて、およびＤ）ｒｓ３７９８２２０（ＴＴ遺伝子型）のマイナーな対立遺伝子の非キャリアのうち、主な血管イベントの複合的エンドポイントについて９０パーセンタイル（６５．１ｍｇ／ｄＬ）より上または下のＬｐ（ａ）値、およびアスピリンまたはプラシーボ割り当てによって層別化した。
【図２Ｃ】アスピリン治療による、ｒｓ３７９８２２０またはＬｐ（ａ）の上昇からのリスクの減弱を示す１セットのグラフである。偶発的な血管疾患を有するコーカサス人ＷＨＳ参加者の累積画分のカプラン−マイヤー推定値。Ａ）主要な血管イベントの複合的エンドポイントについてＷＨＳのトライアルの間、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型およびアスピリンまたはプラシーボの割り当てによって層別化した、Ｂ）Ａと同じだが、ただし心筋梗塞の指標について、Ｃ）Ａと同じだが、ただし虚血性発作のエンドポイントについて、およびＤ）ｒｓ３７９８２２０（ＴＴ遺伝子型）のマイナーな対立遺伝子の非キャリアのうち、主な血管イベントの複合的エンドポイントについて９０パーセンタイル（６５．１ｍｇ／ｄＬ）より上または下のＬｐ（ａ）値、およびアスピリンまたはプラシーボ割り当てによって層別化した。
【図２Ｄ】アスピリン治療による、ｒｓ３７９８２２０またはＬｐ（ａ）の上昇からのリスクの減弱を示す１セットのグラフである。偶発的な血管疾患を有するコーカサス人ＷＨＳ参加者の累積画分のカプラン−マイヤー推定値。Ａ）主要な血管イベントの複合的エンドポイントについてＷＨＳのトライアルの間、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型およびアスピリンまたはプラシーボの割り当てによって層別化した、Ｂ）Ａと同じだが、ただし心筋梗塞の指標について、Ｃ）Ａと同じだが、ただし虚血性発作のエンドポイントについて、およびＤ）ｒｓ３７９８２２０（ＴＴ遺伝子型）のマイナーな対立遺伝子の非キャリアのうち、主な血管イベントの複合的エンドポイントについて９０パーセンタイル（６５．１ｍｇ／ｄＬ）より上または下のＬｐ（ａ）値、およびアスピリンまたはプラシーボ割り当てによって層別化した。
【図３−１】ヒスパニックでない白人のうちＫｒＩＶ２ｒ数の分布を示している１セットの棒グラフである。
【図３−２】ヒスパニックでない白人のうちＫｒＩＶ２ｒ数の分布を示している１セットの棒グラフである。
【図４】ヒスパニックでない白人のうちＫｒＩＶ２ｒの数によるＬｐ（ａ）値の分布を示している１セットのプロットである。
【図５】ヒスパニックでない白人のうちｒｓ３７９８２２０遺伝子型によって有意に異なるＬｐ（ａ）のレベルを有するｋｒＩＶ２ｒ（すなわち対立遺伝子）の数を示しているプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は一部は、将来の心血管イベントのリスクを低減するためのアセチルサリチル酸処理に対する被験体の応答性に関連するＡｐｏ（ａ）遺伝子におけるＳＮＰに関する。本発明はまた、Ａｐｏ（ａ）遺伝子単独での多型の使用、またはアセチルサリチル酸処理に対するヒト被験体の応答を評価するためのリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルと組み合わせた使用に、およびそれに基づく処置の方法に関する。本発明はまた、新規な抗血栓剤を特定および設計することに関する。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「推定する、評価する（ｅｖａｌｕａｔｅ）」または「推定、評価（すること、する工程）（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」という用語は、アセチルサリチル酸処置に対する被験体の応答に関して用いる場合、被験体の核酸サンプル中のヒト被験体のＡｐｏ（ａ）遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でヌクレオチドの同一性を分析するプロセスを用いてアセチルサリチル酸処置に対する応答についての結果を描写すること、および染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でヌクレオチド出現（単数または複数）の既知の関係に対して単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の出現を比較することを意味する。ヌクレオチド出現は、核酸分子を直接調査することによって、またはＡｐｏ（ａ）遺伝子によってコードされるポリペプチドを間接的に調査することによって、特定できる。
【００３２】
アセチルサリチル酸処理に対する応答とは、被験体のそれ以外は統計学的に類似のプール中で、ヒト被験体のアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でシトシンまたはグアニンによって特徴づけられる多型を有する、アセチルサリチル酸処置に対する被験体が、アセチルサリチル酸処置のない被験体よりも将来の心血管系イベントを有する可能性が少ないということを意味する。
【００３３】
隣接する配列の状況では、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でアセチルサリチル酸応答性に関連する対立遺伝子は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒによれば以下である：
【００３４】
【化１】
【００３５】
（プラス（「＋」）鎖は、上部の鎖であって、マイナス（「−」）鎖は、下部の鎖である）
染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でアセチルサリチル酸非応答性に関連する対立遺伝子は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒによれば以下である：
【００３６】
【化２】
【００３７】
（プラス（「＋」）鎖は、上部の鎖であって、マイナス（「−」）鎖は、下部の鎖である）
Ａｐｏ（ａ）遺伝子ＳＮＰは、米国特許出願公開第２００５２７２０５４号でｒｓ３７９８２２０ ｈＣＶ２５９３０２７１の名称で記載されている。Ａｐｏ（ａ）遺伝子ＳＮＰはまた、その内容全体が本明細書において参照によって援用されている、米国特許出願公開第２００５／０２７２０５４号Ａ１に記載のプライマー配列ＣＧＡＡＴＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＡ（配列番号５）のマッチによって見出され得る。
【００３８】
ヒト被験体という用語は、心血管系イベントを有していたヒト、心血管イベントを発症すると疑われるヒト、または将来の心血管系イベントの素因があるかまたはそのリスクがあり得る無症状のヒトを包含する。従って、いくつかの実施形態では、このヒト被験体はすでに、例えば、心筋梗塞などの一次的（第一の）心血管イベントを有していたか、または血管形成術を行っていた。一次的な心血管系イベントを有していたヒト被験体は、二次（第二）心血管系イベントのリスクが上昇している。いくつかの実施形態では、ヒト被験体は、一次的心血管系イベントを有していなかったが、心血管系イベントを有するリスクが増大している。なぜなら、そのヒト被験体は、心血管系イベントを有する１つ以上の危険因子があるからである。いくつかの実施形態では、この被験体はすでに将来の心血管系イベントのリスクを低減するための治療を用いて処置されている。この治療は、下に言及される任意の治療剤であってもよい。さらに他の実施形態では、この被験体は、一次的心血管系事象を有していて、１つ以上の他の危険因子を有する。いくつかの実施形態では、このヒト被験体は、将来の心血管系イベントのリスクを低減するために治療中である（例えば、スタチン治療などの抗脂質治療）。いくつかの実施形態では、ヒト被験体は、急性冠症候群の真ん中にあり、処置の決定は、即自的な心血管系イベントを管理するため、およびイベントの再発を防ぐために行われている。
【００３９】
心血管系イベントの危険因子の例としては以下が挙げられる：高脂血症、肥満、真性糖尿病、高血圧、高血圧前症、全身性炎症のマーカーの値（単数または複数）の上昇、年齢、心血管系イベントの家族歴、および喫煙。心血管系イベントのリスクの程度は、ヒト被験体が有する危険因子の多さおよび重症度または大きさに依存する。リスクチャートおよび予測アルゴリズムは、危険因子の存在および重症度に基づきヒト被験体の心血管系イベントのリスクを評価するために利用可能である。このような例の１つは、フラミンガム心臓研究（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙ）リスク予測スコアである。ヒト被験体は、その被験体が１０年計算のフラミンガム心臓研究リスクスコアが５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％より大きい場合に心血管系イベントを有するリスクが増大している。
【００４０】
ヒト被験体における心血管系イベントのリスクを評価するための別の方法は、ＣＲＰのような全身性炎症のマーカーの値の測定をフラミンガム心臓研究リスク予測スコアへ組み込んでいる、全体的なリスクスコアである。ヒト被験体において心血管系イベントのリスクを評価する他の方法としては、冠動脈カルシウム・スキャン、心臓核磁気共鳴画像化、および／または磁気共鳴血管造影法が挙げられる（Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２９７，６１１，２００７）。
【００４１】
高脂血症は、高コレステロール血症および／または高トリグリセリド血症である。高コレステロール血症のヒト被験体および高トリグリセリド血症のヒト被験体は、心血管系イベントの頻度が増大している。高コレステロール血症のヒト被験体とは、高コレステロール血症のヒト被験体について確立された現行の基準があてはまる被験体である。高トリグリセリド血症のヒト被験体とは、高トリグリセリド血症のヒト被験体について確立された現行の基準があてはまる被験体である。高コレステロール血症の被験体は、１６０ｍｇ／ｄＬを超えるＬＤＬ値、または１３０ｍｇ／ｄＬを超えるＬＤＬ値、および以下からなる群より選択される少なくとも２つの危険因子を有する：雄性、早熟性心疾患の家族歴、喫煙、高血圧、低ＬＤＬ（３５ｍｇ／ｄＬ未満）、真性糖尿病、高インスリン血症、腹部肥満、高リポタンパク質、および心血管系イベントの個人歴。高トリグリセリド血症のヒト被験体は、２５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド（ＴＧ）値を有する。
【００４２】
高血圧は、１４０ｍｍＨｇを超える収縮期血圧、および／もしくは９０ｍｍＨｇを超える拡張期血圧、またはその両方として定義される。高血圧前症は、１１５〜１４０ｍｍＨｇの収縮期血圧、および／または８０〜９０ｍｍＨｇの拡張期血圧として定義される。
【００４３】
肥満は過剰な脂肪組織量の状態である。肥満症の直接の測定ではないが、肥満を計測するための最も広範に用いられる方法は、ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）であって、これは質量／高さ２（ｋｇ／ｍ２）に等しい（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１５版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．−本明細書において以降は「Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ」を参照のこと）。実質的な罹患率のデータに基づいて、３０というＢＭＩが男性および女性の両方の肥満の閾値として最も一般に用いられる。２５〜３０のＢＭＩは、高血圧および耐糖能異常などの肥満によって影響される危険因子の存在において特に、医学的に重要かつ、治療の介入の価値があるとみなされるべきである。多くの場合体重の増加と等しいとみられるが、そうである必要はない。無駄肉がないが極めて筋肉質の個体は、脂肪症の増大がなくとも恣意的な標準によって過剰体重である場合がある。肥満を定量するための他のアプローチとしては、形態測定（皮下脂肪）、比重測定（水面下秤量）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、または磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、および／または電気インピーダンスが挙げられる。
【００４４】
真性糖尿病は、１２５ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血漿グルコース値を有するヒト被験体で確立される。
【００４５】
全身性炎症のマーカーの上昇した値（単数または複数）とは、健康なヒト被験体集団（すなわち、疾患の兆候も症状もないヒト被験体）の平均を上回る値である。全身性炎症のマーカーがＣＲＰである場合、１以上のＣＲＰ値は上昇した値とみなされる。
【００４６】
将来の心血管系イベントのリスクを低減するための治療としては、限定はしないが、食餌および／または運動および／または以下を用いる治療が挙げられる：抗脂質剤類、抗炎症剤類、抗血栓剤類、線維素溶解剤類、抗血小板剤類、直接トロンビンインヒビター類、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターインヒビター類、細胞接着分子に結合して、白血球がこのような分子に取り付く能力を阻害する薬剤類（例：抗細胞接着分子抗体類）、α−アドレナリン遮断薬類、β−アドレナリン遮断薬類、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター類、アンジオテンシン系インヒビター、抗不整脈薬類、カルシウムチャネル遮断薬類、利尿薬類、変力薬類、血管拡張剤類、昇圧剤類、チアゾリジンジオン類、カナビノイド−１受容体遮断薬類、および／またはこれらの任意の組み合わせ。
【００４７】
抗脂血症剤とは、総コレステロールを低下させ、ＬＤＬＣを低下させ、トリグリセリド類を低下させ、および／またはＨＤＬＣを増大させる剤である。抗脂血症剤としては、スタチン類および非スタチン抗脂血症剤類、および／またはこれらの組み合わせが挙げられる。スタチン類は、ヒトの総コレステロール、ＬＤＬＣおよびトリグリセリドのレベルを低下させる効果があることが証明されている医薬品の一クラスである。スタチン類は、コレステロールの合成の段階で作用する。ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ遺伝子の阻害を通じ、細胞により合成されるコレステロールの量を低下させることによって、スタチン類は、肝細胞によるＬＤＬＣの取り込みの増大に至る事象のサイクルを開始する。ＬＤＬＣの取り込みが増大するにつれて、血中の総コレステロールおよびＬＤＬＣの値が低下する。両因子の血中レベルが低いほど、それに伴ってアテローム性動脈硬化および心疾患のリスクが低く、スタチン類はアテローム性動脈硬化による罹患率および死亡率の低減に広く用いられている。
【００４８】
スタチン類の例としては、限定はしないが、シンバスタチン（Ｚｏｃｏｒ）、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ）、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ）、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ）、アトロバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ）、セリバスタチン（Ｂａｙｃｏｌ）、ロスバスタチン（Ｃｒｅｓｔｏｒ）、ピチバスタチン、およびその他多数が挙げられる。
【００４９】
非スタチン抗脂血症剤としては、限定はしないが、フィブリン酸誘導体類（フィブラート）、胆汁酸捕捉剤または樹脂、ニコチン酸薬剤類、コレステロール吸収インヒビター類、アシル−補酵素Ａ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）インヒビター類、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）インヒビター類、ＬＤＬレセプターアンタゴニスト類、ファルネソイドＸレセプター（ＦＸＲ）アンタゴニスト類、ステロール調節結合タンパク質切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）活性化因子類、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）インヒビター類、スクアレン合成酵素インヒビター類、およびペルオキシソーム増殖活性化レセプター（ＰＰＡＲ）アゴニスト類が挙げられる。
【００５０】
フィブリン酸誘導体の例としては限定はしないが、ゲムフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ）、フェノフィブラート（Ｔｒｉｃｏｒ）、クロフィブラート（Ａｔｒｏｍｉｄ）およびベサフィブラートが挙げられる。
【００５１】
胆汁酸捕捉剤または樹脂類の例としては限定はしないが、コレセベラム（ＷｅｌＣｈｏｌ）、コレスチラミン（ＱｕｅｓｔｒａｎまたはＰｒｅｖａｌｉｔｅ）およびコレスチポール（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ）、ＤＭＤ−５０４、ＧＴ−１０２２７９、ＨＢＳ−１０７、およびＳ−８９２１が挙げられる。
【００５２】
ニコチン酸剤の例としては限定はしないが、ナイアシンおよびプロブコールが挙げられる。
【００５３】
コレステロール吸収インヒビターの例としては限定はしないが、エゼチミブ（Ｚｅｔｉａ）が挙げられる。
【００５４】
ＡＣＡＴインヒビターの例としては限定はしないが、アバシミブ（Ａｖａｓｉｍｉｂｅ）、ＣＩ−９７６（Ｐａｒｋｅ Ｄａｖｉｓ）、ＣＰ−１１３８１８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＤ−１３８１４２−１５（Ｐａｒｋｅ Ｄａｖｉｓ）、Ｆ１３９４、ならびに米国特許第６，２０４，２７８号、同第６，１６５，９８４号、同第６，１２７，４０３号、同第６，０６３，８０６号、同第６，０４０，３３９号、同第５，８８０，１４７号、同第５，６２１，０１０号、同第５，５９７，８３５号、同第５，５７６，３３５号、同第５，３２１，０３１号、同第５，２３８，９３５号、同第５，１８０，７１７号、同第５，１４９，７０９号，および同第５，１２４，３３７号に記載されるその他多数のインヒビターが挙げられる。
【００５５】
ＣＥＴＰインヒビターの例としては、限定はしないが、トルセロラピブ、ＣＰ−５２９４１４、ＣＥＴｉ−ｌ、ＪＴＴ−７０５、ならびに
【００５６】
【化３】
【００５７】
に記載される他の多数のインヒビターが挙げられる。
【００５８】
ＦＸＲアンタゴニストの一例は、ググルステロン（Ｇｕｇｇｕｌｓｔｅｒｏｎｅ）である。ＳＣＡＰ活性化因子の一例は、ＧＷ５３２（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）である。
【００５９】
ＭＴＰインヒビターの例としては限定はしないが、インプリタピド（ｉｍｐｌｉｔａｐｉｄｅ）およびＲ−１０３７５７が挙げられる。
【００６０】
スクアレン合成酵素インヒビターの例としては限定はしないが、ザラゴジン酸が挙げられる。
【００６１】
ＰＰＡＲアゴニストの例としては限定はしないが、ＧＷ−４０９５４４、ＧＷ−５０１５１６、およびＬＹ−５１０９２９が挙げられる。
【００６２】
本発明は、Ａｐｏ（ａ）遺伝子の多型を特定する工程を包含する。多型とは、集団中に存在する対立遺伝子改変体である。多型は、ある遺伝子座に存在する単一ヌクレオチドの相違であってもよいし、またはある遺伝子のある位置での１つまたは２〜３個のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。従って、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、ヒトゲノムなどのゲノム中の特定の遺伝子座での、代表的には４つ全てのヌクレオチドに満たない、１つまたは２つ、３つまたは４つのヌクレオチド（すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、またはチミン）の集団中での存在によって特徴づけられる。
【００６３】
当業者は核酸分子が二本鎖分子であってもよいこと、および一本の鎖の特定の部位に対して、ならびに相補的な鎖の上の対応する部位に対して言及することを容易に認識するであろう。ＳＮＰ位置を定義するのにおいて、ＳＮＰ対立遺伝子、またはヌクレオチド配列とは、ある核酸分子の１本の鎖上の特定の部位でのアデニン、チミン（ウリジン）、シトシン、またはグアニンを指し、またその核酸分子の相補鎖上の対応する部位のチミン（ウリジン）、アデニン、グアニン、またはシトシンを（それぞれ）定義する。従って、特定のＳＮＰ位置、ＳＮＰ対立遺伝子、またはヌクレオチド配列について言及するためには、いずれかの鎖を参照する必要がある場合がある。プローブおよびプライマーは、いずれかの鎖にハイブリダイズするように設計してもよいし、本明細書に開示されるＳＮＰ遺伝子型決定方法は一般にいずれかの鎖を標的してもよい。
【００６４】
Ａｐｏ（ａ）遺伝子中のヌクレオチドの同一性を決定することは、例えば、ヌクレオチドを含む核酸分子に、それぞれ、選択的にハイブリダイズするかまたは近いオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとともにこの核酸サンプルをインキュベートすること、およびプライマーまたはプローブの選択的ハイブリダイゼーションを検出することによって行うことができる。プローブの選択的ハイブリダイゼーションは、例えば、プローブを検出可能に標識すること、およびサザンブロット分析などのブロット型の分析を用いて標識の存在を検出することによって、検出され得る。プライマーの選択的なハイブリダイゼーションは、例えば、プライマー伸長反応を行うこと、およびプライマーを含むプライマー伸長反応産物を検出することによって検出され得る。所望の場合、プライマー伸長反応は、ポリメラーゼ連鎖反応として行ってもよい。この方法は、１つ以上のヌクレオチドを特定する工程を包含し得る。
【００６５】
多くの分析手順を用いて、本発明の多型位置で改変体ヌクレオチドの有無を検出し得る。一般には、対立遺伝子改変の検出には、変異識別技術、必要に応じて増幅反応および必要に応じてシグナル発生システムを要する。多数の変異検出技術が、そのいくつかはＰＣＲに基づくのだが、多数のシグナル発生システムと組み合わせて用いられ得る。対立遺伝子バリエーションの検出のための多くの現行の方法は、Ｎｏｌｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３，１１１４−１１２０，１９９７によって；ならびに標準的な教科書中に、例えば、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、編集Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６、および「ＰＣＲ」、第２版、Ｎｅｗｔｏｎ ＆ Ｇｒａｈａｍ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９７に概説される。Ａｐｏ（ａ）遺伝子のＳＮＰ検出および遺伝子型決定方法および試薬は、その内容全体が本明細書において参照によって援用される米国特許出願公開第２００５／０２７２０５４号Ａ１に記載される。
【００６６】
配列相同性を共有する２つの分子の２つのヌクレオチド配列または２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、その配列を最適比較目的で整列させる（例えば、最適アラインメントのためにはギャップを第一および第二の核酸またはアミノ酸配列の一方または両方に導入してもよく、比較目的のためには非相同性配列を無視してもよい）。いくつかの実施形態では、参照配列の長さのうち少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％またはそれ以上を比較目的のために整列させる。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。最初の配列中のある位置が、第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されるならば、その分子は、その位置で同一である（本明細書において用いる場合、アミノ酸または核酸の「同一性」とは、アミノ酸または核酸の「相同性」に等しい）。２つの配列の間の同一性パーセントとは、その２つの配列の最適アラインメントのために導入されることを要する、ギャップの数および各々のギャップの長さを考慮して、その配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００６７】
２つの配列間の配列の比較および同一性のパーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。いくつかの実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３ １９７０））を用いて決定される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０というギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６という長さウェイトを用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））を用いて決定される。他の実施形態では、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の間の同一性のパーセントは、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へ組み込まれているＥ．ＭｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））を用いて決定される。
【００６９】
ＳＮＰを分析するために、選択的ＳＮＰ対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用いることが、適切であり得る。標的配列における単一ヌクレオチド変化を検出するそのようなオリゴヌクレオチドは、「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」、「対立遺伝子特異的プローブ」または「対立遺伝子特異的プライマー」のような用語によって呼ばれてもよい。多型を分析するための対立遺伝子特異的プローブの設計および使用は、例えば、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｏｔｔｏｎら編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３２４，１６３〜１６６（１９８６）；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ，欧州特許２３５，７２６号；およびＳａｉｋｉ，国際公開第８９／１１５４８号に記載される。
【００７０】
各々の対立遺伝子特異的なプライマーまたはプローブの設計は、変数、例えば、標的核酸分子中のＳＮＰ位置に隣接するヌクレオチド配列の正確な組成、ならびにそのプライマーまたはプローブの長さに依存するが、プライマーおよびプローブの使用における別の要因は、そのプローブまたはプライマーと、標的配列との間のハイブリダイゼーションが実施される条件のストリンジェンシーである。高いストリンジェンシー条件ほど、より低いイオン強度の緩衝液および／またはより高い反応温度を利用し、そして安定な二重鎖を形成するためには、プローブ／プライマーと標的配列との間のより完全な一致を必要とする傾向がある。しかし、そのストリンジェンシーが高すぎる場合、ハイブリダイゼーションは、全く生じないかもしれない。対照的に、低いストリンジェンシー条件ほど、より高いイオン強度の緩衝液および／またはより低い反応温度を利用し、そしてプローブ／プライマーと標的配列との間でよりミスマッチの多い塩基による安定な二重鎖の形成が可能になる。例としてであって限定としてではないが、対立遺伝子特異的プローブを用いる高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件についての例示的な条件は、以下のとおりである：５×標準的生理食塩水リン酸ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）、０．５％ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）を含む溶液を用いる５５℃でのプレハイブリダイゼーション、同じ溶液中にある標的核酸分子とともに同じ温度でプローブをインキュベートすること、その後、２×ＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液を用いて５５℃または室温で洗浄すること。
【００７１】
中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を、例えば、約４６℃にて５０ｍＭのＫＣｌを含む溶液を用いて、対立遺伝子特異的プライマー伸長反応のために用いてもよい。あるいは、この反応は、高温、例えば、６０℃にて行ってもよい。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）反応（この反応では、２つのプローブが、それらが標的配列と完全に相補的な場合に連結される）のために適切な中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約１００ｍＭのＫＣｌの溶液を、４６℃という温度にて利用し得る。
【００７２】
ハイブリダイゼーションベ−スのアッセイでは、ある個体由来の標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、別の個体由来の対応するセグメントには、その２つの個体由来の個々のＤＮＡセグメントにおける異なる多型形態（例えば、選択的ＳＮＰ対立遺伝子／ヌクレオチド）の存在に起因してハイブリダイズしない、対立遺伝子特異的プローブを設計してもよい。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度における検出可能な有意な差異が存在し、かつ好ましくは、本質的には二成分の応答が存在し、それによって、プローブが対立遺伝子のうちの一方のみにハイブリダイズするかまたは一方の対立遺伝子に対して有意により強くハイブリダイズするのに充分なほど、ストリンジェントであるべきである。プローブは、ＳＮＰ部位を含む標的配列にハイブリダイズしてその結果そのＳＮＰ部位がそのプローブの配列に沿ったどこかに整列するように設計されてもよいが、そのプローブは、好ましくは、標的配列のセグメントにハイブリダイズして、その結果、そのＳＮＰ部位が、そのプローブの中心位置（例えば、そのプローブのいずれかの末端から少なくとも３ヌクレオチド離れているそのプローブ内の位置）と整列するように設計される。このプローブ設計によって、一般的には、異なる対立遺伝子形態の間でのハイブリダイゼーションにおける良好な識別が達成される。
【００７３】
ヌクレオチド配列（ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド）はＲＮＡであってもよいし、またはＤＮＡであってもよく、これは１つの遺伝子もしくはその一部、ｃＤＮＡ、合成ポリデオキシリボ核酸配列などであってもよく、一本鎖または二本鎖であっても、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。種々の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、プローブまたはプライマー）を含むポリヌクレオチドは、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドアナログ、またはリン酸ジエステル結合以外の骨格結合を含んでもよい。一般に、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、天然に存在する、２’−デオキシリボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニンもしくはチミンのようなデオキシリボヌクレオチド、またはリボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニンもしくはウラシルのようなリボヌクレオチドである。しかし、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとしてはまた、天然には存在しない合成ヌクレオチドまたは天然に存在するヌクレオチドの修飾型を含む、ヌクレオチドアナログを含んでもよい。そのようなヌクレオチドアナログは、当技術分野において周知でありかつ市販されており、そのようなヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドについても同様である（各々が参照として本明細書に組み入れられる、Ｌｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５２２０〜５２３４（１９９４）；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１３６３〜１１３７２（１９９５）；Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８〜７３（１９９７））。
【００７４】
ポリヌクレオチドのヌクレオチドの共有結合は一般にリン酸ジエステル結合である。しかし、この共有結合はまた、チオジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合、またはヌクレオチドと結合して合成ポリヌクレオチドを生成する際に有用な、当業者に公知の任意の他の結合を含む、任意の多数の他の結合である場合もある（例えば各々が参照として本明細書に組み入れられる、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：９７７−９８６，１９９４；ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３５１３６０，１９９５を参照のこと）。天然に存在しないヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチドもしくはアナログを連結する結合を組み入れることは、このポリヌクレオチドが、例えば組織培地を含む、ヌクレアーゼ活性を含み得る環境に曝露される場合に、または生きている被験体への投与の際に特に有用な場合がある。なぜなら修飾型ポリヌクレオチドは、分解に対する感受性が低い場合があるためである。
【００７５】
天然に存在するヌクレオチドおよびリン酸ジエステル結合を含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは化学的に合成することができるほか、適切なポリヌクレオチドをテンプレートとして用いる組換えＤＮＡ法を用いて作製することができる。これとは対照的に、ヌクレオチドアナログ、またはリン酸ジエステル結合以外の共有結合を含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは一般に化学的に合成されるが、Ｔ７ポリメラーゼなどの酵素は、ある種のヌクレオチドアナログをポリヌクレオチド中に取り込むことが可能なので、このようなポリヌクレオチドを適切なテンプレートから組換え的に生成させるために用いてもよい（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．、前出、１９９５）。従って、ポリヌクレオチドという用語は本明細書において用いる場合、天然に存在する核酸分子であって、細胞から単離され得る核酸分子、および合成の分子であって、例えば、化学合成の方法によって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによる酵素的な方法によって調製され得る合成分子を包含する。
【００７６】
核酸の試験サンプルは、簡便には血液のサンプル、気管支肺胞洗浄液、喀痰、または被験体（例えば、ヒト）から得られる他の体液もしくは組織である。試験サンプルはその試験サンプル中の配列に相当する核酸配列に等しくてもよい、すなわち対立遺伝子バリエーションの分析前に、任意の従来の技術、例えば、ＰＣＲを用いてサンプル核酸の中の領域の全てまたは一部を最初に増幅してもよいことが理解されるであろう。
【００７７】
種々の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはオリゴペプチドを検出可能に標識することが有用である場合がある。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出可能な標識は、当該分野で周知である。検出可能な標識の特に非限定的な例としては、化学発光標識、放射性標識、酵素、ハプテンまたは固有のオリゴヌクレオチド配列さえ挙げられる。
【００７８】
多型を特定する方法はまた、特異的な結合対メンバーを用いて行ってもよい。本明細書において用いる場合、「特異的な結合対メンバー」という用語は、特異的な結合対の別のメンバーに対して特異的に結合するかまたは選択的にハイブリダイズする分子をいう。特異的な結合対メンバーとしては、例えば、プローブ、プライマー、ポリヌクレオチド、抗体などが挙げられる。例えば、特異的結合対メンバーとしては、多型遺伝子座を含む標的ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズするか、またはテンプレートとして標的ポリヌクレオチドを用いて生成される増幅産物にハイブリダイズする、プライマーもしくはプローブが挙げられる。
【００７９】
本明細書において用いる場合、「特異的な相互作用」または「特異的に結合する」などの用語は、２つの分子が、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成することを意味する。この用語は本明細書において、例えば、多型部位を含むポリヌクレオチドに結合する抗体の相互作用；または多型部位を含むコドンによってコードされるアミノ酸を含むポリペプチドに結合する抗体の相互作用を含む、種々の相互作用を指して用いられる。
【００８０】
本発明の方法によれば、抗体は、多型部位を含むコドンによってコードされる特定のアミノ酸を含むポリペプチドに選択的に結合し得る。あるいは、抗体は、例えば、プライマー伸長アッセイを用いて多型部位で特定のヌクレオチド出現についてのみ多型部位に組み込まれている特定の修飾されたヌクレオチドに優先的に結合し得る。
【００８１】
特異的な相互作用は一般に、例えば、ヒトまたは他の脊椎動物もしくは無脊椎動物などの生きた個体に生じる条件を含む、生理学的条件下で、ならびに哺乳動物細胞または別の脊椎動物生物体もしくは無脊椎動物生物体由来の細胞を維持するために用いられるような細胞培養で生じる条件下で安定である。２つの分子が特異的に相互作用するか否かを決定するための方法は、周知であって、これには、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。
【００８２】
サンプル中の特定の多型についてヌクレオチドの存在を検出するためには当該分野では多数の方法が公知である。このような方法は、Ａｐｏ（ａ）遺伝子中の１つ以上の多型を含む、標的ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズする、例えば、増幅プライマー対を含む、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを利用し得る。
【００８３】
対立遺伝子特異的プライマーが、一般には定常プライマーと一緒に、ＰＣＲ反応などの増幅反応中で用いられ、これによって例えば、ＡＲＭＳ（商標）アッセイに用いられるのと同様に、特定の配列位置での１つの対立遺伝子の選択的な増幅を通じた対立遺伝子の間の識別が得られる。対立遺伝子特異的プライマーは好ましくは、１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、さらに好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００８４】
対立遺伝子特異的プライマーは好ましくは、検出されるべき対立遺伝子と正確に対応するが、その誘導体であって、ここで、３’末端のヌクレオチドのほぼ６〜８が、検出されるべき対立遺伝子と対応しており、かつ残りのヌクレオチドのうち最大１０まで、例えば、８、６、４、２または１がそのプライマーの特性に有意に影響することなく変化してもよい誘導体も考慮される。
【００８５】
プライマーは、合成の任意の従来の方法を用いて製造され得る。このような方法の例は、標準的な教科書、例えば、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ；第２０巻；編集Ｓｕｄｈｉｒ Ａｇｒａｗａｌ，Ｈｕｍａｎａ ＩＳＢＮ：０−８９６０３−２４７−７；１９９３；第１版に見出すことができる。必要に応じて、このプライマー（単数または複数）は、検出を容易にするために標識されてもよい。
【００８６】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書に規定される位置でＡｐｏ（ａ）遺伝子多型を検出するために用いられ得る。このようなプローブの設計は、当該分野の通常技術の分子生物学者には明白であろう。このようなプローブは、任意の都合のよい長さ、例えば、最大５０塩基、最大４０塩基、さらに好都合なことには最大３０塩基長、例えば、８〜２５塩基または８〜１５塩基長のいずれかである。一般には、このようなプローブは、遺伝子中の対応する野性型または改変遺伝子座に全体として相補的な塩基配列を含む。しかし、必要な場合、１つ以上のミスマッチを導入してもよく、ただし、オリゴヌクレオチドプローブの判別力は過度に影響されない。本発明のプローブは検出を容易にするための１つ以上の標識を担持し得る。
【００８７】
本発明の方法を行うのに有用なオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、多型の位置（その位置での特定のヌクレオチドの存在が、このプローブの選択的ハイブリダイゼーションの有無によって検出される）を含む、標的ポリヌクレオチドの一部に相補的であり、かつそれにまたがるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。このような方法はさらに、標的ポリヌクレオチドおよびハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドとエンドヌクレアーゼとを接触させる工程と、多型部位に存在するヌクレオチドがプローブの対応するヌクレオチドに相補的であるか否かに依存して、プローブの切断産物の有無を検出する工程とを包含し得る。
【００８８】
オリゴヌクレオチド連結アッセイはまた、多型位置でのヌクレオチド存在を特定するために用いられ得、ここでは１対のプローブが選択的に、多型の部位に上流にかつ隣接して、および下流にかつ隣接してハイブリダイズし、そのプローブの１つが多型のヌクレオチド出現に相補的な末端ヌクレオチドを含む。プローブの末端ヌクレオチドがヌクレオチド出現に相補的である場合、選択的ハイブリダイゼーションは、末端ヌクレオチドを含み、その結果、リガーゼの存在下で、上流および下流のオリゴヌクレオチドが連結される。従って、連結産物の有無は、多型の部位のヌクレオチド出現の指標である。
【００８９】
オリゴヌクレオチドはまた、プライマーとして、例えば、プライマー伸長反応に有用である場合があり、ここでは伸長反応の産物（または産物がないこと）は、ヌクレオチド出現の指標である。さらに、ＳＮＰを含む標的ポリヌクレオチドの一部を増幅するために有用なプライマー対が有用である場合があり、ここでは増幅産物を試験して、多型部位でのヌクレオチド出現を決定する。特に有用な方法としては、ハイ・スループット方式へ、多重方式へ、またはその両方へ容易に適合可能な方法が挙げられる。このプライマー伸長または増幅産物は、当該分野で公知の種々の方法を用いて直接もしくは間接的に検出されても、および／または配列決定されてもよい。多型遺伝子座にまたがる増幅産物は、伝統的な配列の方法論（例えば、「ジデオキシ−媒介性連鎖終止法」（「Ｓａｎｇｅｒ法」としても公知）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．９４：４４１（１９７５）；Ｐｒｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：３３６−３４０（１９８７））および「化学分解法」（「マキサム−ギルバート法」としても公知）（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７４：５６０（１９７７））（両方とも参照によって本明細書に援用される）を用いて配列決定されて、ＳＮＰ遺伝座でのヌクレオチド出現が決定され得る。
【００９０】
Ａｐｏ（ａ）遺伝子中のヌクレオチドの同一性を決定し得る方法としては、「マイクロシーケンシング（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」方法が挙げられる。マイクロシーケンシング法は、「所定の」部位で単一のヌクレオチドのみの同一性を決定する。このような方法は、標的ポリヌクレオチドにおける多型の存在および同一性を決定するのに特に有用性を有する。
【００９１】
このようなマイクロシーケンシング法、および多型遺伝子座でのヌクレオチド出現を決定するための他の方法は、参照によって本明細書に援用されるＢｏｙｃｅ−Ｊａｃｉｎｏらの、米国特許第６，２９４，３３６号に考察される。
【００９２】
マイクロシーケンシング法は、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（参照によって本明細書に援用される、国際公開第９２／１５７１２号）に開示されるＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ分析法を包含する。ＤＮＡ中の多型部位をアッセイするための、さらなるプライマーガイドのヌクレオチド組み込み手順も記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８：６８４−６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３−１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９−１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＧＡＴＡ ９：１０７−１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５（１９９３）；およびＷａｌｌａｃｅ，国際公開第８９／１０４１４）。これらの方法はＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ分析とは、それらが全て、多型部位の塩基の間で識別するために標識デオキシヌクレオチドの組み込みに依拠しているという点で異なる。このような方式では、このシグナルは、組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するので、同じヌクレオチドの実行で生じる多型は、その実行の長さに比例するシグナルを生じ得る（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６−５９（１９９３））。
【００９３】
別のマイクロシーケンシング方法は、Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７）およびＣｏｈｅｎ，Ｄ．ら（仏国特許第２，６５０，８４０号；国際公開第９１／０２０８７号）に記載されており、これは、多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するための溶液ベースの方法を考察している。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙの方法にあるとおり、多型部位のすぐ３’側の対立遺伝子配列に相補的であるプライマーを使用する。
【００９４】
配列を分析するためにゲル電気泳動を使用するのに生じる問題に対しては、マイクロシーケンシングの別方法が開発されている。Ｍａｃｅｖｉｃｚ（米国特許第５，００２，８６７）は、例えば、オリゴヌクレオチドプローブの複数の混合物とのハイブリダイゼーションを介して核酸配列を決定するための方法を記載している。このような方法によれば、標的ポリヌクレオチドの配列は、１つの位置で非改変体ヌクレオチドを、および他の位置で改変体ヌクレオチドを有するプローブのセットと標的が引き続きハイブリダイズすることを可能にすることによって決定される。Ｍａｃｅｖｉｃｚの方法は、標的とプローブのセットとをハイブリダイズすること、次いでそのセットの少なくとも１つのメンバーが標的にハイブリダイズし得る部位の数（すなわち、「マッチ」の数）を決定することによって標的のヌクレオチド配列を決定する。この手順は、プローブのあるセットの各々のメンバーが試験されるまで繰り返される。
【００９５】
Ｂｏｙｃｅ−Ｊａｃｉｎｏら、米国特許第６，２９４，３３６号では、ＳＮＰが標的に選択的に結合する最も３’側のヌクレオチドである部位でポリヌクレオチド標的に選択的に結合するプライマーを利用することによって、核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の配列を決定するための固相配列決定方法が得られる。
【００９６】
従って、上記の方法を用いて、アセチルサリチル酸応答関連のハプロタイプ対立遺伝子、またはアセチルサリチル酸応答関連ＳＮＰのヌクレオチド出現は、増幅反応、プライマー伸長反応、またはイムノアッセイを用いて特定できる。アセチルサリチル酸応答関連のハプロタイプ対立遺伝子、またはアセチルサリチル酸応答関連ＳＮＰのヌクレオチド出現はまた、結合対のメンバーがアセチルサリチル酸応答関連ＳＮＰにまたはその近くに特異的に結合する条件下で、サンプル中のポリヌクレオチドまたはサンプル由来のポリヌクレオチドと、アセチルサリチル酸応答関連ＳＮＰを含んでいるポリヌクレオチド領域に対して選択的にハイブリダイズする特異的な結合対のメンバーとを接触させることによって特定され得る。特異的な結合対のメンバーは、抗体であっても、またはポリヌクレオチドであってもよい。
【００９７】
本発明の方法で用いられる抗体としては、Ａｐｏ（ａ）遺伝子中の多型を包含するポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。さらに、抗体は、多型を含むコドンによってコードされるアミノ酸を含むポリペプチドに結合する。これらの抗体は、多型によって部分的にコードされるアミノ酸を含むポリペプチドに結合する。用いられ得る他の方法としては、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＩｎｆｉｎｉｕｍＩＩアッセイなどの抗体によって引き続き認識される改変ヌクレオチドを組み込む遺伝子型特定方法が挙げられる。
【００９８】
この抗体は、多型遺伝子座を含むコドンによってコードされる第一のアミノ酸を含むポリペプチドには特異的に結合するが、Ａｐｏ（ａ）遺伝子中の種々のヌクレオチドの出現を含むコドンによってコードされる第二のアミノ酸を含むポリペプチドには結合しないか、または結合が弱い。
【００９９】
抗体としては、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多価特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のうち任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。
【０１００】
抗体は、抗体フラグメントを包含し、これには、限定はしないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられる。側鎖抗体を含む、抗原結合抗体フラグメントは、単独で、または以下の全体または一部と組み合わせて可変領域（単数または複数）を含んでもよい：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。また、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとの可変領域（単数または複数）の任意の組み合わせも含む抗原結合フラグメントも含まれる。この抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物由来であってもよい。好ましくは、この抗体は、ヒト、マウス（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、シップ ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリである。この抗体は、単価、二価、三価またはより大きい多価特異性の抗体であってもよい。
【０１０１】
この抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって生成してもよい。目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によって生成され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために、限定はしないがウサギ、マウス、ラットなどを含む種々の宿主動物に投与され得る。種々のアジュバントを用いて、その宿主の種に応じて、免疫学的応答を増大してもよく、アジュバントとしては、限定はしないが、フロイント（完全または不完全）、鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性剤、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが挙げられる。このようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１０２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換えおよびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知であり、例えば以下で教示される技術を含むハイブリドーマ技術を用いて産生され得る；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（この引用文献はその全体が参照によって本明細書に援用される）。本明細書において用いる場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体には限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを包含する単一クローン由来の抗体を指し、それを産生する方法ではない。
【０１０３】
全ての関連の表現型および遺伝子型の情報が得られた後、統計学的分析を行って、個体の表現型特徴を有する対立遺伝子または遺伝子型の存在の間になんらかの有意な相関があるか否かを確認する。対立遺伝子の頻度、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇの平衡統計学、およびＳＮＰの間の連鎖不均衡（ＬＤ）を計算することができる。次いで、ハプロタイプを、例えば、ＥＭアルゴリズムを用いて計算できる（Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ ａｎｄ Ｓｌａｔｋｉｎ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ．１９９５ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１２（Ｓ）：９２１−７）。頻度を推定するためにＥＭアプローチを用いないハプロタイプを推論するためには他の方法もある。これらの方法は、組み換えおよび合体（ｃｏａｌｅｓｃｅｎｔ）を含む、進化史の再構築に基づいており、例えば、プログラムＰＨＡＳＥ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．，ａｎｄ Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｐ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６８，９７８−９８９，２００１）に示される。連鎖不均衡係数などの種々のパラメーターに加えて、対立遺伝子頻度、カイ二乗統計学および他の集団遺伝学のパラメーター、例えば、完全交配係数は、症例とコントロール群との間の民族的、祖先の、または他の系統的なバリエーションについて制御するために計算できる。
【０１０４】
好ましくは、データの調査およびクリーニングは最初に、遺伝子関連について統計学的試験を行う前に行う。サンプルの疫学的および臨床的なデータは、表およびグラフを用いて記述統計学によってまとめることができる。好ましくはデータの確認を行って、データ完成、不整合エントリー、およびアウトライナーについてチェックする。次いで、カイ二乗検定およびｔ検定（分布が正常でない場合はＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）を用いて、それぞれ、分散および連続型変数について症例とコントロールとの間で有意な相違についてチェックしてもよい。遺伝子型決定の質を確認するために、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ不均衡試験を、症例とコントロールとで別々に行ってもよい。症例とコントロールとの両方におけるＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ不均衡（ＨＷＥ）由来の有意な偏差は個々のマーカーについて、遺伝子型決定の誤差の指標であり得る。ＨＷＥがほとんどのマーカーで破られている場合、これは、さらに検討されるべき集団構造の指標である。さらに、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ不均衡の場合のみ、マーカーと疾患との遺伝的関連が示され得る（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｅｉｒ Ｂ．，Ｓｉｎａｕｅｒ（１９９０））。
【０１０５】
単一のＳＮＰの対立遺伝子が、表現型形質の症例またはコントロールの状態に関連しているか否かを試験するために、当業者は、症例とコントロールにおいて対立遺伝子頻度を比較し得る。標準的なカイ二乗検定およびフィッシャー正確検定を、２×２の表で行ってもよい（２つのＳＮＰ対立遺伝子×目的の分類形質中の２つの結果）。ＳＮＰの遺伝子型が関連するか否かを試験するために、カイ二乗検定を３×２の表で行ってもよい（３遺伝子型×２結果）。スコア検定も、遺伝子型関連性について行って、症例およびコントロールにおける３つの遺伝子型頻度（主要なホモ接合性、ヘテロ接合性、およびマイナーなホモ接合性）を対比し、かつ３つの異なる遺伝方式、すなわち、ドミナント（対比係数２、−１、−１）、アディティブ（対比係数１、０、−１）およびリセッシブ（対比係数１、１、−２）を用いて傾向について探す。マイナー対メジャーな対立遺伝子のオッズ比、ならびに野性型遺伝子型に対する異種接合性および同種接合性の改変体についてのオッズ比は、所望の信頼限界、通常は９５％で計算する。
【０１０６】
コントロールから症例のマトリックスを識別するための値を有する多型は、もしあれば、任意の関係を記載する数学形式で示され、関連性（試験および効果）統計学を伴う場合がある。少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％、最も好ましくは９５％の信頼区間、あるいは０．０５未満の非有意性の確率で、多型マーカーとアセチルサリチル酸応答との関係を示す統計分析結果を用いてもよい。
【０１０７】
さらなる局面では、本発明の診断方法を用いて、アセチルサリチル酸処理の薬理遺伝学を評価して、さらなる心血管系イベントのリスクを低下する。従って、Ａｐｏ（ａ）遺伝子の特定の対立遺伝子改変体を担持する個体は、アセチルサリチル酸処理などの異なる剤または治療に対して反応する能力が異なっている場合がある。これは、薬物治療に対する個体の応答に直接の影響を有し得る。本発明の診断方法は、アセチルサリチル酸処置に対する臨床的応答を予測するために、および治療用量を決定するために両方に有用であり得る。
【０１０８】
従って、本発明は、処置レジメンを選択または処方するための方法（例えば、アセチルサリチル酸の投与量および投与の頻度などの特定の処置レジメンを選択するための個々の方法に対してアセチルサリチル酸を投与するか否かを決定するか、またはアセチルサリチル酸治療に応答する可能性が少ないと予想される個体に対して別の抗血栓治療（すなわち、アセチルサリチル酸以外）を選択するための方法、ならびにアセチルサリチル酸治療から経験する毒性または他の所望されない副作用の確率を決定するための方法など）を提供する。本発明はまた、個体であって、アセチルサリチル酸治療または他の治療がその個体の遺伝子型に基づいて投与される個体を選択するための方法、ならびに個体の遺伝子型に基づいてアセチルサリチル酸治療または他の治療剤の臨床トライアルについて個体を選択する（例えば、アセチルサリチル酸治療に対して正に応答する可能性が最も高いトライアルに参加する個体を選択する）ための方法も提供する。
【０１０９】
本発明のＳＮＰはまた、新規な治療標的を特定するために用いられ得る。例えば、多型またはその産物を含む遺伝子、ならびにこれらの多型またはその産物で直接または間接的に調節されるか、またはそれと相互作用する遺伝子またはそれらの産物を、治療剤の開発のために標的してもよい。本発明の方法は、Ａｐｏ（ａ）遺伝子の１つ以上の改変体を選択的に標的する新規な薬物治療の開発で用いられる。特定の改変体と、疾患の発症に対する素因または薬物治療に対する応答との間の関係の特定は、新規薬物の設計に重要な影響を有し得る。薬物は、疾患プロセスに関与する改変体の生物学的活性を調節するために設計され得る。治療剤は、例えば、標的の遺伝子または遺伝子産物の機能またはレベルを調節する、低分子、タンパク質、タンパク質フラグメントまたはペプチド、抗体、核酸、またはそれらの誘導体もしくは模倣物から構成されてもよい。
【０１１０】
本発明の別の局面によれば、本発明の対立遺伝子特異的ヌクレオチドプローブ、および／または本発明の対立遺伝子特異的プライマーを含む診断キットが提供される。この診断キットは、本発明の方法における使用のための適切なパッケージおよび説明書を含み得る。このようなキットはさらに、適切な緩衝液（単数または複数）および熱安定性ポリメラーゼなどのポリメラーゼ（単数または複数）、例えばｔａｑポリメラーゼを含んでもよい。
【０１１１】
本発明の別の局面では、本発明の単一ヌクレオチド多型は、連鎖研究の遺伝子マーカーとして用いてもよい。これは特に、比較的高頻度の多型にあてはまる。低頻度の多型は特に、下記のようなハプロタイピイングに有用であり得る。ハプロタイプは、単一（父親または母親）の染色体上の多型部位（例えば、遺伝子内）に連鎖して見出される対立遺伝子のセットである。遺伝子内の組み換えがランダムである場合、２ｎ程度の多くのハプロタイプがある場合があり、ここで２は各々のＳＮＰの対立遺伝子の数であって、ｎはＳＮＰの数である。臨床応答に関係する変異または多型を特定するための１アプローチは、目的の集団中で特定され得る全てのハプロタイプを用いて関係性研究を行うことである。各々のハプロタイプの頻度は、その最もまれな対立遺伝子の頻度によって制限され、その結果対立遺伝子の頻度が低いＳＮＰは、低頻度ハプロタイプのマーカーとして特に有用である。特定の臨床特徴に関連する特定の変異または多型は、集団内で低頻度である可能性が高いので、低頻度ＳＮＰはこれらの変異を特定するのに特に有用であり得る。
【０１１２】
本発明の別の局面によれば、処置の方法が提供される。処置の方法は、ヒト被験体が、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でのシトシンまたはグアニンによって特徴づけられるＡｐｏ（ａ）多型を有することに基づいてこのヒト被験体を選択する工程と、この被験体がこの多型を有するせいで有害な心血管系イベントのリスクを低減するために、この被験体に対してアセチルサリチル酸またはアセチルサリチル酸以外の剤（例えば、抗血栓剤、例えば、チエノピリジンまたはチエノピリジン誘導体）の特定の用量を投与することを包含する。
【０１１３】
ヒト被験体の状態の好ましい決定は臨床的に有用である。臨床的な有用性の例としては、どの抗血栓薬物（単数または複数）を投与するかを決定すること、および／または薬物（単数または複数）の有効量を決定することを包含する。抗血栓剤の例は、上記される。
【０１１４】
本発明は、将来の心血管系イベントのリスクを低減するためのアセチルサリチル酸処置に対するヒト被験体の応答性を評価するための方法に関する。本発明の方法は、被験体のアセチルサリチル酸応答についての推論を単独でまたは組み合わせて可能にする、被験体のＡｐｏ（ａ）遺伝子の６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）位置でヌクレオチドの同一性を決定することに一部は基づく。アセチルサリチル酸応答は、心血管系の障害のリスクの低下である場合がある。そのようなものとして、本発明の組成物および方法はまた、例えば、アセチルサリチル酸処置に対して、またはアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤での処置に対して応答しやすいか、または応答する可能性が低い個体または患者を特定するために、有用である。本発明の組成物および方法は、個体または患者が、心血管系の障害のリスクを低減するためにアセチルサリチル酸またはアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤の用量の変化を要し得ることを予測または決定するのに有用である。
【０１１５】
本発明の別の局面によれば、あるアッセイが提供される。このアッセイは、Ａｐｏ（ａ）タンパク質（例えば、単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質）に対して、または染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でシトシンまたはグアニンを有する（Ａｐｏ（ａ））遺伝子によってコードされるＬｐ（ａ）に対して優先的に結合する剤についてスクリーニングする工程を包含する。
【０１１６】
本発明はまた、別のアッセイを提供する。このアッセイは、Ａｐｏ（ａ）タンパク質（例えば、単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質）に対して、または染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でチミンまたはアデニンを有する（Ａｐｏ（ａ））遺伝子によってコードされるＬｐ（ａ）に対して優先的に結合する剤についてスクリーニングする工程を包含する。
【０１１７】
このスクリーニングアッセイは、優先的に多型に結合する抗血栓剤のなかで選択するために用いられ得る。既存の抗血栓剤のバージョンを変更することまたは作製すること、続いて、このようなバージョンが本発明のスクリーニングアッセイ中の１つまたは別の多型を優先的に結合する相対能力を試験することを通じて、合理的な薬物設計を行ってもよい。同様に既存のまたは新規な薬剤の化学的ライブラリーをこのような結合についてスクリーニングしてもよい。
【０１１８】
当業者は、スクリーニングの方法にはなじみがある。スクリーニングアッセイは、ある剤がＬｐ（ａ）タンパク質に結合する能力を測定するアッセイを包含する。例えば、Ｌｐ（ａ）の多型に優先的に結合する剤をスクリーニングすることは、この剤とＬｐ（ａ）の多型とを接触させる工程と、Ｌｐ（ａ）の多型に対するこの剤の結合を決定する工程と、この剤の結合をこの多型を含まないＬｐ（ａ）の多型に対して比較する工程を包含し、ここでこの多型を含まないＬｐ（ａ）の多型に対するこの剤の結合に対して比較した、Ｌｐ（ａ）の多型に対するこの剤の結合の増大は、この剤がＬｐ（ａ）の多型における有効性が改善した抗血栓剤であることを示しており、ここでこの多型を含まないＬｐ（ａ）の多型に対するこの剤の結合に対して比較した、Ｌｐ（ａ）の多型に対するこの剤の結合の減少は、この剤がＬｐ（ａ）の多型における有効性が低下した抗血栓剤であることを示している。当業者は、この方法、ならびに限定はしないが、直接結合アッセイ、競合結合アッセイ、非競合結合アッセイ、機能的阻害アッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイなどを含む他のスクリーニング方法にはなじみがある。
【０１１９】
本発明は、以下の実施例を参照して例示されるが限定はされない。
【実施例】
【０１２０】
（実施例１）
リポタンパク質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］は、コレステロールリッチの脂質と一緒に単一のアポリポタンパク質Ｂ−１００分子に対するジスルフィド結合を通じて共有結合された単一の（Ａｐｏ（ａ））分子からなる血漿画分である（１）。Ｌｐ（ａ）の生物学的画分は、未確認のままであるが（２、３）、高レベルのＬｐ（ａ）は、特にＬＤＬ−Ｃも上昇しているときは、心血管系（ＣＶ）のリスクの増大に関連している（４〜６）。Ｌｐ（ａ）のコレステロール保有の局面は、脂質ベースの生物学に対する関連の心血管系リスクに見当がかなり集中していた（７〜１１）。しかし、アポリポタンパク質（ａ）はまた、プラスミノーゲンに対して極めて相同性であって、アポリポタンパク質（ａ）中にタンパク質分解性活性が認識されないにもかかわらず、この相同性は、恒常性、血小板機能および血栓におけるＬｐ（ａ）の役割に対する心血管系のリスクの別の検討に集中していた（１２〜１８）。
【０１２１】
アポリポタンパク質（ａ）遺伝子座はなかでも、ヒトゲノム中で最も多型である。アポリポタンパク質（ａ）の遺伝子型改変体は、広範なＬｐ（ａ）値に関連しており、かつＬｐ（ａ）の遺伝力の多くを占める（１９〜２２）。Ｌｐ（ａ）値に影響する公知のバリエーションのほとんどが、タンパク質のアミノ末端に向かって位置するＫｒｉｎｇｌｅ（Ｋｒ）ＩＶ２型ドメインの３〜４０リピートの間の形態をとる（１、２３）。この高い程度のＫｒＩＶ２型の多型は、アポリポタンパク質（ａ）の単一のＫｒＶドメインを認識するアッセイ試薬の近年の開発まで、血漿Ｌｐ（値）を測定するための課題であって、Ｋｒ ＩＶ２型リピートとは交差反応しない（２４、２５）。Ｌｐ（ａ）値と関連している他のアポリポタンパク質（ａ）遺伝子改変体としては、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ならびに、挿入−欠失多型、とりわけ、プロモーター中の、ペンタヌクレオチド配列、ＴＴＴＴＡが挙げられる（２６〜２８）。さらに、アポリポタンパク質（ａ）遺伝子座の多型は、コピー数バリエーションを包含すると思われる（２９）。
【０１２２】
近年、ＳＮＰ ｒｓ３７９８２２０（アポリポタンパク質（ａ）のプラスミノーゲンプロテアーゼ様ドメイン中のイソロイシン〜メチオニン置換をコードする）は、Ｌｐ（ａ）値および一般的な心血管疾患の両方との関連の新規な候補として示唆されている（Ｌｕｋｅ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ（３０））。従って、この多型の遺伝子型は、低用量のアスピリンまたはプラシーボに無作為に割り当てられ、次に１０年以上にわたって心血管系イベントの発生について追跡されたウーマン・ヘルス・スタディ（Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｕｄｙ）（ＷＨＳ）の当初健康な女性で２６，２７４例のうちから確認された（３１）。この設定によって、プロスペクティブ評価の機会はＬｐ（ａ）値および血管のリスクに関連するｒｓ３７９８２２０だけでなく、アスピリンとリスクに対する遺伝子的影響との間の相互作用も利用可能である。研究参加者のほとんどはコーカサス人であったが、異なる生物地理的祖先を有する集団のなかでも他のアポリポタンパク質（ａ）改変体の以前の比較で見出されるとおり、ｒｓ３７９８２２０とＬｐ（ａ）値との間の関連に対する集団特異的な影響に取り組むには、非コーカサス人の参加者の数も十分であった（３２〜３６）。
【０１２３】
ＷＨＳにおける２５，０３８例のコーカサス人参加者のうち、アポリポタンパク質（ａ）遺伝子におけるｒｓ３７９８２２０のマイナーな対立遺伝子は、１．９％というマイナー対立遺伝子頻度について、９０４（３．６％）ヘテロ接合性および１５（０．０６％）ホモ接合性で担われた。これらの遺伝子型は、ヘテロ接合性のわずかな欠損およびマイナー対立遺伝子の過剰なホモ接合性に起因して、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡から境界線の偏差を示す（ｐ＝０．０４８）。年齢、ＢＭＩ、喫煙率、ホルモン補充療法の使用、および閉経状態、ならびに高血圧および糖尿病の頻度は、３つの遺伝子型クラスの間で異なることはなかった（表１）。しかし、マイナーな対立遺伝子のヘテロ接合性（７９．３ｍｇ／ｄＬ）およびホモ接合性のキャリアにおける中央Ｌｐ（ａ）値（１５３．９ｍｇ／ｄＬ）は、非キャリアのＬｐ（ａ）値よりもそれぞれ８倍および１５倍高かった（１０．０ｍｇ／ｄＬ，ｐ＜＜０．００１）（表１、図１Ａ、Ｂ）。この効果は、Ｌｐ（ａ）値について調整した後の有意性の排除によって判定した場合、関連の血漿画分の総コレステロール、ＬＣＬ−Ｃ、およびアポリポタンパク質Ｂのそれほどではないが有意な上昇の背景にあると考えられた。他の血漿バイオマーカー（炎症のマーカーおよび他の脂質画分を含む）はｒｓ３７９８２２０遺伝子型には関連しなかった。マイナーな対立遺伝子のヘテロ接合性とホモ接合性のキャリアとを合わせた分析で、非キャリアでの臨床特徴と比較して、本質的に同一の結果が見出された（データ示さず）。
【０１２４】
コーカサス人のヘテロ接合性の間のＬｐ（ａ）値の分布は非キャリアの間でそれとは全く異なっており、完全に二峰性のパターンを有し、これによってこの小集団を、２７．９ｍｇ／ｄＬより大きい（中央値９２．４ｍｇ／ｄＬ、Ｎ＝６２７）Ｌｐ（ａ）を有する第１群および２７．９ｍｇ／ｄＬ未満（中央値５．０ｍｇ／ｄＬ、Ｎ＝２６０）を有する第２群に層別化することが可能になった（図１Ａ〜Ｃ）。マイナーな対立遺伝子の全てのホモ接合性キャリアは、２７．９ｍｇ／ｄＬより大きいＬｐ（ａ）を有するが、Ｌｐ（ａ）分布の経常を評価するためにはこの群の個体は少なすぎた（図１Ｂ）。ｒｓ３７９８２２０ヘテロ接合性の間のＬｐ（ａ）の二峰性の分布は、コーカサス人ＷＨＳ女性での頻度と同様で、ｒｓ３７９８２２０のマイナーな対立遺伝子の頻度が１．８％であったフィジシィアンズ・ヘルス・スタディ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｕｄｙ）（ＰＨＳ）のコーカサス人男性１０５８例の第二の無関係の集団で確認された（図１Ｄ）。
【０１２５】
コーカサス人ヘテロ接合性の間のＬｐ（ａ）値の二峰性の性質は、標準的な臨床特徴では説明できない。例えば、年齢、ＢＭＩ、喫煙、糖尿病、閉経状態、高血圧、心疾患の家族歴、またはホルモン補充療法の使用に関して低または高いＬｐ（ａ）を有するコーカサス人ヘテロ接合性女性の比較においては有意な相違は無かった。同様に、ＨＤＬ−Ｃ、アポリポタンパク質Ａ１、トリグリセリド、Ｃ反応性タンパク質、可溶性ＩＣＡＭ−Ｉ、フィブリノーゲン、クレアチニン、ホモシステイン、およびＨｂＡ１ｃは全て、ヘテロ接合性の２つの小集団中で比較可能であって、メジャーな対立遺伝子についてのホモ接合性の間のレベルと同様であった。さらに、米国にまたがる全体の地理的な割り当てでは、二峰性のＬｐ（ａ）値の地域的な基礎は示唆されなかった。ＬＤＬ−Ｃ、総コレステロール、およびアポリポタンパク質Ｂの値は、低Ｌｐ（ａ）を有するヘテロ接合性に比べて高Ｌｐ（ａ）を有するヘテロ接合性では有意に上昇していた（中央値：ＬＤＬ−Ｃ，１３０．５ｍｇ／ｄＬ，対１２２．５ｍｇ／ｄＬ；総コレステロール，２１９．０ｍｇ／ｄＬ対２１０．４ｍｇ／ｄＬ；アポリポタンパク質Ｂ，１０９．９ｍｇ／ｄＬ対１０３．１ｍｇ／ｄＬ；全てｐ＜０．０１）、しかし相違は、ここでも、Ｌｐ（ａ）で調整後は有意ではなかった。従って、ヘテロ接合性全体のなかで観察されるこれらの脂質のより高い値は、Ｌｐ（ａ）中の増大によって説明され得る。二峰性の分布は、コーカサス人のヘテロ接合性ＷＨＳ参加者の間で、これらの脂質のいずれでも観察されなかった。
【０１２６】
１０年の追跡期間の間、総ＣＶＤ複合エンドポイント初のイベントのうち８２５例を集団として経験した２４，３２０例のコーカサス人の研究参加者のうち将来の血管イベントのリスクにおいて、ヘテロ接合性におけるｒｓ３７９８２２０のマイナー対立遺伝子の単一のコピーによって、約５０％の増大がもたらされた（表２；年齢調整したＨＲ １．５０、９５％ＣＩ：１．０９〜２．０５、ｐ＝０．０１２）。全体的な低発現率と一致してマイナー対立遺伝子の１５のホモ接合性キャリアのうちイベントの発生したものはなく、従って、これらの２〜３個の個体は将来の疾患事象のリスクの分析から排除した。ｒｓ３７９８２２０の効果の大きさは、ＭＩ、虚血性発作および血管再生の特定のエンドポイントと同様であった。従って、主な血管イベント（非致死性ＭＩ、非致死性虚血性発作、および心血管系の死）のさらに臨床的に関連するエンドポイントについては、年齢調整した危険率は１．５８であった（９５％ＣＩ：１．０７−２．３３，ｐ＝０．０２１）。これらの効果は、伝統的な心血管系の危険因子について調整後も統計学的に有意なままであって、その結果、総血管イベントについての完全調節した危険率は、１．５０（１．０７−２．１０，ｐ＝０．００９）で、メジャーな血管イベントについて完全調整した危険率は１．５４（ＣＩ：１．０１−２．３５，ｐ＝０．０４３）であった。ヘテロ接合性の間のリスクの増大のほぼすべてが、Ｌｐ（ａ）値が上昇したものに限定された（表２）。例えば、メジャーな心血管系イベントについては、高Ｌｐ（ａ）［１．７８（ＣＩ：１．２６−２．５１，ｐ＝０．００１）］を有するヘテロ接合性について年齢調整した危険率が大きく、かつ全てのヘテロ接合性についてよりも有意であったが、低Ｌｐ（ａ）［０．８４（ＣＩ：０．８４−１．７７，ｐ＝０．６５）］を有するヘテロ接合性についての危険率は少なく、非キャリアの間でリスクが統計学的に異なる（表２）。
【０１２７】
ｒｓ３７９８２２０のコーカサス人のヘテロ接合性の間の心血管系イベント発生のリスクの増大は、低用量アスピリン処置への割り当てではほとんど打ち消された（図２）。特に、ヘテロ接合性の間では、アスピリンに対するランダムな割り当ては、メジャーな血管系イベントの相対リスクの５９％低下を伴っていた（９５％ＣＩ：０．８１−０．１０，ｐ＝０．０２５）が、アスピリンに対する非キャリアのランダムな割り当てのなかでは、有意な影響を有さなかった（相対リスク低下９％、９５％ＣＩ：０．０２３〜−０．０９，ｐ＝０．３１）（図２Ａ）。正式には、アスピリンおよび遺伝子型の相互作用は、有意であった（ｐ＝０．０５、年齢調整したモデル）。遺伝子型の亜群のなかでアスピリンの種々の効果も、ＭＩおよび虚血性発作（急性プラーク破壊および閉塞性血栓に関連する臨床イベント）のエンドポイントについて観察された。従って、アスピリンなしのヘテロ接合性の正味の遺伝子効果は、主要な血管イベント発生の組み合わせ（年齢調整したＨＲ ２．１９，９５％ ＣＩ：１．３９−３．４６，ｐ＝０．０００７）、ならびに別々に心筋梗塞（年齢調整したＨＲ ２．４３，９５％ ＣＩ：１．２３−４．８０，ｐ＝０．０１）および虚血性発作（年齢調整したＨＲ ２．４１，９５％ ＣＩ：１．２６−４．５９，ｐ＝０．００８）については全体的リスクのほぼ２倍であった（図２Ａ〜Ｃ）。しかし、アスピリンの効果は、冠血管再生のエンドポイントについては減弱された（急性閉塞なしの背景にある疾患進行を伴う臨床イベント；相対リスク低下３６％、９５％ＣＩ：０．８９〜−０．４４，ｐ＝０．２８）。
【０１２８】
ｒｓ３７９８２２０遺伝子型を有するアスピリンの相互作用は、一般にはアスピリンとＬｐ（ａ）値の上昇との同様の相互作用に一部は関連すると考えられる。ｒｓ３７９８２２０のマイナーな対立遺伝子のコーカサス人の非キャリアのなかで、アスピリンは９０パーセンタイルを超えるＬｐ（ａ）値（６５．１ｍｇ／ｄＬ）を有するもののうち血管イベントの相対リスクを低下したが、９０パーセンタイル未満のＬｐ（ａ）値を有するもののなかでは最小効果が観察された（図２Ｄ）。血管再生エンドポイントについては、Ｌｐ（ａ）値が９０パーセンタイルを超えるコーカサス人のなかのアスピリン効果（相対リスク低下３９％、９５％ＣＩ：０．６４−０．０５、ｐ＝０．０３）は、コーカサス人のヘテロ接合性のうちアスピリン効果に対する大きさに匹敵した。
【０１２９】
ｒｓ３７９８２２０のマイナー対立遺伝子の有病率はＷＨＳの中でコーカサス人（ＭＡＦ＝１．９％）と非コーカサス人との間で顕著に異なった。詳細には、ｒｓ３７９８２２０でのバリエーションは、自己特定したアフリカ系アメリカ人の中ではほとんど存在しなかった（ＭＡＦ＝０．５％）。対照的に、マイナーな対立遺伝子は、アジア系アメリカ人（ＭＡＦ＝７．６％）、ヒスパニック（ＭＡＦ＝１５．１％）、およびネイティブアメリカン（ＭＡＦ＝９．１％）についてコーカサス人の間よりも優勢であった（表３）。アフリカ系アメリカ人と、ヒスパニック、アジア系アメリカ人またはネイティブアメリカンの間、およびヒスパニックとアジア人との間で相違していたので、コーカサス人に比較して対立遺伝子頻度の相違は、全て有意であった。ＨａｐＭａｐの遺伝子型決定プロジェクトで、マイナーな対立遺伝子がアジア人（ＣＨＢ＋ＪＰＴ，ＭＡＦ＝５．６％）では検出されたが、コーカサス人（ＣＥＵ）またはアフリカ人（ＹＲＩ）（３７）では検出されなかった。ＨａｐＭａｐアジア人の間の頻度は、ＷＨＳのアジア系アメリカ人小集団での頻度と有意に異なることはなかった（ｐ＝０．５９）。コーカサス人の間では、種々の程度の混合物に潜在的に関連する対立遺伝子頻度の局所的な相違は、米国にまたがる全体的な地理学的分類では検出できなかった。コーカサス人での知見とは対照的に、Ｌｐ（ａ）のレベルは、ＷＨＳのアジア系アメリカ人またはヒスパニックの小集団（その両方ともＬｐ（ａ）分布を評価するために十分な数の参加者を有した）のヘテロ接合性において上昇もしておらず、二峰性でもなかった。同様に、これらの集団中でｒｓ３７９８２２０とＣＶＤの発生との間に関連があるとは考えられなかったが、力は限られていた。
【０１３０】
米国の初期の健康な女性でのこの大規模研究においては、アポリポタンパク質（ａ）遺伝子（３０）中のｒｓ３７９８２２０多型のマイナーな対立遺伝子のコーカサス人キャリアは、Ｌｐ（ａ）のレベルが大きく増大しており、同様に、主要な血管系イベントのリスクが倍であった。しかし、低用量アスピリンに無作為に割り当てられたヘテロ接合性の間では、将来の血管系イベントのリスクの増大は、効率的に無効にされた（相対的リスク低下、アスピリン５９％、ｐ＝０．０２５）。非キャリアのなかでも、対照的に、アスピリン治療から利益があるという証拠は最小であった（相対リスク低下は、アスピリン９％、ｐ＝０．３１）。アスピリンの抗血栓活性の状況では、この薬理学的結果は、以前に示唆されているように、プラスミノーゲンプロテアーゼ様ドメインまたはＫｒドメインのリジン結合機能をおそらく通じた、血栓におけるＬｐ（ａ）の直接の役割と一致している（１３、３８）。ｒｓ３７９８２２０と心筋梗塞および発作との関連に対するアスピリンの効果が冠血管再生に対するその影響よりも大きいという知見によって、アスピリンと特定のアポリポタンパク質（ａ）対立遺伝子由来のＬｐ（ａ）との間の相互作用が急性のプラーク破壊および疾患進行よりも血管閉塞により関係し得るという興味深い可能性が高まる。ｒｓ３７９８２２０の遺伝薬理学的効果がまた、アスピリンによるアポリポタンパク質（ａ）発現の潜在的な対立遺伝子依存性の減少に関与するか否かは未知のままである（３９、４０）。さらに、それらのデータによって、血管系疾患の予防および処置におけるアスピリンまたはチエノピリジンなどのアスピリン代替物の議論の余地のある選択に関する論点である、アスピリン治療からの利益が大きいかまたは少ない小集団を規定するための直接の遺伝子方法が得られる（３１、４１、４２）。
【０１３１】
ｒｓ３７９８２２０によってコードされる非同義置換とＬｐ（ａ）のレベルおよび心血管系のリスクとの間の複雑な関係の分子的基礎は、さらなる解明を要する。詳細には、Ｌｐ（ａ）のレベルおよび分布に対する遺伝子効果によって、アミノ酸置換によって授けられる内因性の生物学的活性に関連する効果（これもＬｐ（ａ）の上昇に直接寄与する場合がある）から、Ｌｐ（ａ）値の増大に単に関するリスクおよびアスピリン応答に対する効果を識別することが困難になる。同様に、ｒｓ３７９８２２０とハプロタイプとの間の関係は、アポリポタンパク質（ａ）遺伝子座では明らかではなく、ただし、例えば、普通でない数の２型ＫｒｉｎｇｌｅＩＶドメインを有するコーカサス人でのアポリポタンパク質（ａ）遺伝子座の高発現対立遺伝子に対する連鎖に関与し得る（４３，４４）。この仮説によってさらに、特にｒｓ３７９８２２０が異なる値のＬｐ（ａ）を指向する２つ以上のハプロタイプに関連する場合、Ｌｐ（ａ）分布の二峰性パターンが説明され得る。
【０１３２】
対立遺伝子頻度分析は、アジア人でのｒｓ３７９８２２０の少なくとも１つの起源と一致しているが、コーカサス人でのこの改変体の存在には取り組まない。コーカサス人でのｒｓ３７８９２２０の頻度がそれほどでもないこと、および米国にまたがるその分布に明確な地域的バイアスがないことを考慮すれば、アジア系アメリカ人集団との混合は、説明しにくいと考えられる。しかし、非アフリカ人集団に対してプライベートなほとんどのバリエーションは、正の選択でなく確率過程を通じて生じている場合があり（４５）、ｒｓ３７９８２２０とＬｐ（ａ）値との関連は、コーカサス人および他の非アフリカ人集団におけるその有意に異なる頻度と組み合わせて、選択およびドリフトの両方が、その生物地理学的分布を担う場合がある可能性を上昇させる。これらのプロセスの両方が、アポリポタンパク質（ａ）遺伝子座での高レベルの集団特異的遺伝子バリエーションおよび発現、ならびにＬｐ（ａ）機能についての推測と一致している（３）。
【０１３３】
Ｌｐ（ａ）の生物学的特性についての手掛かりを得ることは別にして、ｒｓ３７９８２２０とＬｐ（ａ）値、心血管系のリスク、およびアスピリン処置の効果の関係は、一般的な複雑な疾患を理解するのにおける遺伝子的アプローチの可能性を示す。これに関しては、この結果によって、遺伝子バリエーションに起因するＣＶＤリスクの特定のタイプを管理するための薬理学的ストラテジーだけでなく、遺伝子ベースのオーダーメード医療を通じた可能な最高の予測を伴って保健医療管理のより広範な望みが得られる。
【０１３４】
引用文献
【０１３５】
【化４】
【０１３６】
【化５】
【０１３７】
【化６】
【０１３８】
材料および方法
研究集団：１０年間にわたって追跡した、登録時に少なくとも４５歳の最初は健康な女性の間で行った、心血管系疾患の一次予防におけるアスピリン（隔日で経口１００ｍｇ）およびプラシーボの無作為トライアルである、ウーマンズ・ヘルス・スタディ（Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｕｄｙ）（ＷＨＳ）由来の一次研究集団（１，２）。登録時、参加者は、ベースラインの臨床および人口学的情報を得た。２８，３４５例のＷＨＳ参加者が血漿および遺伝子分析のために血液を供給した。これらのサンプルのなかで、Ｈｉｔａｃｈｉ ９１７アナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＤ．）上で、Ｋｒ ＩＶ２型リピートの数に影響されない濁度検定で、ベースラインのＬｐ（ａ）値を測定した（３）。他の脂質画分、炎症バイオマーカーおよび他の血漿成分のベースラインの測定は、以前に記載されている（４）。追跡期間の間に調整した心血管系イベントの総発生には、プラーク破裂および血管閉塞、例えば、心筋梗塞（ＭＩ）、虚血性発作および心血管系死に代表的に関連するもの、ならびに経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）または冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）による血管再生として規定される、背景にあるアテローム性動脈硬化症の進行に代表的には関係するものを包含した。主な心血管系イベントの発生は、心筋梗塞、虚血性発作または心血管系死として規定された。さらに、ｒｓ３７９８２２０と血漿Ｌｐ（ａ）値との間の関係は、フィジシャンズ・ヘルス・スタディ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｕｄｙ）（ＰＨＳ）に関与していた１０５８例のコーカサス人男性の独立した群で評価した（５）。これらのＰＨＳ参加者のうち、Ｌｐ（ａ）値は、標準的な臨床ＥＬＩＳＡベースの方法を用いて決定した（６）。
【０１３９】
遺伝子型決定：ＷＨＳ参加者におけるｒｓ３７９８２２０の遺伝子型は、３ｎｇのゲノムＤＮＡ由来の標的配列のＰＣＲ増幅と、引き続く対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド連結とを組み合わせたオリゴヌクレオチド連結手順によって決定した（７）。次いで、２つの対立遺伝子の連結産物をハイブリダイゼーションによって分離して、別々に異なるＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００ＴＭ×ＭＡＰマイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に各々がカップリングされた特定のオリゴヌクレオチドを生成した。捕獲された産物をストレプトアビジンＲ−フィコエリトリン（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）で蛍光標識して、マイクロスフェアスペクトルに基づいてソートして、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００ＴＭ装置によって検出した（８）。ＰＨＳ中のｒｓ３７９８２２０の遺伝子型は、記載どおり（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ），蛍光ベースの、対立遺伝子特異的、リアルタイムＤＮＡ増幅方法で決定した（９）。それぞれＷＨＳおよびＰＨＳ集団については、首尾よい遺伝子型決定のサンプルの画分は、９６．３％および９７．８％であった。遺伝子型決定のためのＤＮＡサンプルの女性２７，２８９例のうち、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型、Ｌｐ（ａ）値、年齢および心血管系イベント発生頻度の完全確認は２５，４３６で利用可能であった。これらのうち、２４，３２０がコーカサス人、４６８例がアフリカ系アメリカ人、２８２例がアジア系アメリカ人、２６２例がヒスパニック、６２例がネイティブアメリカン、および４２例が祖先不明であった。
【０１４０】
統計学的方法：Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡からの偏差は、対数尤度比検定を用いて評価した。３つの遺伝子型クラスの間の臨床的共分散の相違は、正規分布した特徴についてのＡＮＯＶＡ手順によって、非正規分布した特徴についてクラスカル−ワリス検定によって、および分類別特性についての割合のカイ二乗検定によって評価した。同様に、異なる生物地理的祖先の集団の対の間の対立遺伝子頻度に相違の有意差は、カイ二乗検定で決定した。Ｌｐ（ａ）値におけるおよびｒｓ３７９８２２０対立遺伝子のマイナー対立遺伝子頻度における地理学的バイアスの分析のためには、登録時の住居の位置を米国の北部、南部、中西部、南西部、山地および西端の地域に相当する６つの群のうちの１つに分類した。Ｌｐ（ａ）のレベルまたは対立遺伝子頻度を説明するのにおけるこれらの割り当ての有意差は、ロジスティック回帰またはカイ二乗分析で決定した。ｒｓ３７９８２２０とＣＶＤの発生のリスクとの間の関連の予測的評価は、年齢または伝統的なリスク共分散について調整したＣｏｘ比例ハザードモデルで行った（年齢、血圧、糖尿病歴、喫煙状態、心筋梗塞の家族歴、ＬＤＬ−ＣおよびＨＤＬ−Ｃ）。報告された全ての分析では、Ｃｏｘモデルの比例の仮説は、拒絶できなかった（ｐ＞０．０５）。アスピリン処置に関連するリスクの相違は、Ｃｏｘモデルでの相互作用項を含むことによって、またはアスピリンもしくはプラシーボに対するその割り当てに従って、参加者を層別化する分析によって決定した。
【０１４１】
コーカサス人のｒｓ３７９８２２０ヘテロ接合性の間のＬｐ（ａ）のレベルの検討によって、明確な二峰性分布が明らかになった。１つのサブグループは、マイナーな対立遺伝子の非キャリアでも観察される近似的対数正規分布の低いＬｐ（ａ）値を有したが、他のサブグループは、近似的な正規分布の高いＬｐ（ａ）値を有した。従って、それらの参加者は、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムを有するＬｐ（ａ）にフィットした、独立した対数正規分布［低Ｌｐ（ａ）について］および正規分布［高Ｌｐ（ａ）について］の混合物として観察された二峰性の分布をモデリングすることによって低または高Ｌｐ（ａ）サブグループに分類された（１０）。ＥＭアルゴリズムにおける０．５という責任値に相当する２７．９ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）値を用いて、低Ｌｐ（ａ）群から高Ｌｐ（ａ）群を識別した。この２分布モデルでの分類は、８８７例のうち８０６例の割り当て（９１％）が少なくとも９５％の確実性である責任値を有するという点で本質的に明白であった。
【０１４２】
材料および方法の引用文献：
【０１４３】
【化７】
【０１４４】
【表１】
【０１４５】
【表２】
【０１４６】
【表３】
【０１４７】
（実施例２）
欧州人−アメリカ人、アジア人−アメリカ人およびヒスパニック系アメリカ人におけるｒｓ３７９８２２０を有するＬＤ中のＳＮＰバリエーションを決定するためのＷＨＳサンプル中のＬＰＡ遺伝子座およびその近位の４０個の追加のＳＮＰの遺伝子型決定
本発明者らは、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型および自己報告された祖先（欧州人−アメリカ人（すなわち、白人またはコーカサス人）、アジア人−アメリカ人、またはヒスパニック系アメリカ人）の両方に基づいて選択したＷＨＳ由来のサンプルのサブセット中のＬＰＡ（アポリポタンパク質（ａ）の遺伝子）および近隣の遺伝子座で４０個の追加のＳＮＰを遺伝子型決定した。次いで、本発明者らは、これらの新規なＳＮＰとｒｓ３７８２２０との間の連鎖不均衡（ＬＤ）を推定した。サンプルはランダムに選択したのではなく、ｒｓ３７８９２２０に基づいて選択したので、本発明者らは、サンプルから直接対立遺伝子頻度およびＬＤを簡単に見積もることはできず、ｒｓ３７９２２０に基づくサンプリングストラテジーを考慮して観察された遺伝子型と予想される遺伝子型との間の相違を最小にすることによって対立遺伝子頻度およびＬＤを推測しなければならなかった。その結果は下に示した：
１）２つのＳＮＰ（ｒｓ９４５７９３１ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ（染色体６：１６０８４９８９４ ＮＣＢＩビルド１２８での単一ヌクレオチド多型）およびｒｓ９４５７９２７ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ（染色体６：１６０８３０２７２ ＮＣＢＩビルド１２８での単一ヌクレオチド多型））はＷＨＳコーカサス人（欧州人−アメリカ人）のうちｒｓ３７９８２２０を有するほぼ完全なＬＤにあった。両方のＳＮＰが隣接するＬＰＡＬ２遺伝子にある（リポタンパク質，Ｌｐ（ａ）−様２前駆体遺伝子、アポリポタンパク質（ａ）の遺伝子に隣接）；
２）他のＳＮＰは、ＬＤ〜ｒｓ３７９８２２０の範囲を有する；ならびに
３）非欧州人の小集団に極めて異なるＬＤのパターンがある。本発明者らは、これらの結果を解釈して、実施例１で本発明者が記載した効果が３つ全てのＳＮＰ（ｒｓ３７９８２２０、ｒｓ９４５７９３１、ｒｓ９４５７９２７）を担持する対立遺伝子に関係するということを示唆する。
（実施例３）
別個の祖先を有するダラス・ハート・スタディ（Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙ）由来の３つのサブグループ中のｒｓ３７９８２２０遺伝子型、Ｋｒｉｎｇｌｅ ＩＶ２型リピートの数およびＬｐ（ａ）発現の間の関係。
【０１４８】
本発明者らは、血漿Ｌｐ（ａ）のアポリポタンパク質（ａ）成分（すなわち、発現されたアポ（ａ）タンパク質）中のＫｒ ＩＶ、２型リピート（ＫｒＩＶ２ｒ’ｓ）の数が以前に決定されている（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００５；１１１：１４７１−１４７９）ダラス・ハート・スタディ（ＤＨＳ）（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ９３，Ｉｓｓｕｅ １２，１５ Ｊｕｎ．２００４，１４７３〜１４８０頁）中で遺伝子型決定されたｒｓ３７９８２２０を有した（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００５；１１１：１４７１〜１４７９）。この集団は、男性および女性の両方を、非ヒスパニック白人（欧州人祖先）、黒人（アフリカ人祖先）およびヒスパニック交えて、全部で３５２９例のサンプルを包含した。この分析は、ｒｓ３７９８２２０のマイナー対立遺伝子と、発現されたＫｒＩＶ２ｒの数との間の対応を、できるだけ祖先に依存して特定しようとしていた。この分析は、２つの方法で分析を行った。まず初めに、全ての個体を考慮して、各々の個体のＫｒＩＶ２ｒ対立遺伝子を（ＤＮＡレベルで）、発現された対立遺伝子に対して（タンパク質レベルで）等価であると仮定した。すなわち、１つのＫｒＩＶ２ｒのみを発現した個体は、ＬＰＡ遺伝子座でその対立遺伝子の２つのコピーを有すると仮定した（３５２９個体）。２番目に、本発明者らは、分析から、発現された唯一のＫｒＩＶ２ｒ対立遺伝子を有する６６８例を除いて、２つの明らかに別個のＫｒＩＶ２ｒ対立遺伝子（全部で２８５９）を有する個体のみを考慮した。その結果は両方に極めて類似であった。すなわち、１）非ヒスパニック白人のうち、ｒｓ３７９８２２０のマイナー対立遺伝子は、１７ＫｒＩＶ２ｒリピートと強力に相関しており、１６または１８リピートに対してはそれより程度が劣った（ただし１６、１７および１８リピートの間の相違は、ＫｒＩＶ２ｒ数についてのアッセイの解に関連し得る）（図３）；２）非ヒスパニック白人のうち、少数のＫｒＩＶ２ｒを有する対立遺伝子は一般に、高レベルのＬｐ（ａ）を発現する（図４）；３）１７のＫｒＩＶ２ｒを発現する非ヒスパニックの白人は、高レベルのＬｐ（ａ）を有し、さらに、また、ｒｓ３７９８２２０のマイナーな対立遺伝子の１コピーを担持する個体は、有意に十分高いレベルのＬｐ（ａ）を有する（１１頁、下の右側）（図５）；および４）ＫｒＩＶ２ｒ’の分布、発現レベルとのそれらの関係、およびｒｓ３７９８２２０とのそれらの関係は、異なる祖先群で異なっており、その結果ｒｓ３７９８２２０および非ヒスパニック白人で観察されるＬｐ（ａ）の過度の値の相関は、他の祖先の群では観察されない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アセチルサリチル酸治療に対するヒト被験体の応答性を評価するための、アポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子におけるヌクレオチド変化を分析するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））は、単一のアポリポタンパク質Ｂ−１００分子に対するジスルフィド結合を通じてコレステロールリッチの脂質と一緒に共有結合された単一のアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））分子からなる血漿複合体である（非特許文献１）。正常な生理学におけるＬｐ（ａ）の生物学的機能は、不明確なままであるが、高レベルのＬｐ（ａ）は増大した心血管系のリスクおよび心血管系イベント、例えば、心筋梗塞および発作を、特にＬＤＬ−Ｃも上昇している場合にともなっている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００３】
なかでもアポリポタンパク質（ａ）遺伝子座は、ヒトゲノムでは最も多型である。Ａｐｏ（ａ）の遺伝子のバリエーションは、広範なＬｐ（ａ）値を伴っており、Ｌｐ（ａ）の遺伝力のかなりの部分を占めている（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。近年では、Ａｐｏ（ａ）遺伝子におけるいくつかの単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）が特定されており、心血管系の障害、例えば、心筋梗塞および発作および／または薬物応答、例えば、スタチン類に対する応答に関連している（特許文献１を参照のこと）。
【０００４】
将来の心血管系イベントのリスクの増大している被験体はしばしば、心血管系イベントのリスクを低減するためにアセチルサリチル酸（アスピリン）を処方される。しかし、アセチルサリチル酸は、全ての被験体で有効なのではなく、心血管系イベントに対する一次予防としてのアセチルサリチル酸（アスピリン）の使用は、データが少ない女性では特に、議論の余地があった（非特許文献１１）。
【０００５】
従って、薬剤選択設計および治療を改善することが継続して必要である。それに関しては、ＳＮＰ類は、アセチルサリチル酸および／または他の抗血小板および／または抗血栓剤などの特定の薬剤での処置にもっとも適した患者を特定するために用いられ得る（しばしば、「薬理遺伝学」と呼ばれる）。同様に、ＳＮＰ類は、毒性の副作用を発症する可能性が増大している患者、またはその処置に対して応答がない可能性に起因して、特定の処置から患者を除外するために用いられ得る。そうすることによって、このようなＳＮＰ類は、個々の被験体の所定の介入のリスク比に対して利点を規定するのに有用であり得る。薬理遺伝学はまた、薬物開発および選択プロセスを補助するための薬理学的研究に用いられ得る。（非特許文献１２；非特許文献１３；特許文献２；および非特許文献１４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／０２７２０５４号明細書
【特許文献２】国際公開第９７／４０４６２号パンフレット，Ｓｐｅｃｔｒａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｒｃｏｖｉｎａら．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｅｓｔｉｎｇ Ｒｉｆａｉら、編集：ＡＡＣＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２０００；ｐ．８１９
【非特許文献２】Ｂｅｒｇｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ ２４，２２１９（２００４）
【非特許文献３】Ｈｏｂｂｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ １０，２２５（１９９９）
【非特許文献４】Ｄａｎｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２，１０８２（２０００）
【非特許文献５】Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２９７，６１１（２００７）
【非特許文献６】Ｄａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２９６，１３６３（２００６）
【非特許文献７】Ｂｒｏｅｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ３０，２１０（２００２）
【非特許文献８】Ｂｏｅｒｗｉｎｋｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９０，５２（１９９２）
【非特許文献９】Ｍｏｏｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６１，４０２（１９９７）
【非特許文献１０】Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １４ １９０（２００６）
【非特許文献１１】Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５２，１２９３；２００５
【非特許文献１２】Ｌｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３，２５４（１９９７）
【非特許文献１３】Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，１２４９（１９９７）
【非特許文献１４】Ｓｃｈａｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，３（１９９８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、将来の心血管系イベントのリスクを低減するためのアセチルサリチル酸処置に対するヒト被験体の応答を評価する方法に部分的には関する。本発明は、Ａｐｏ（ａ）遺伝子における新規なヌクレオチド多型によって、ヒト被験体がアセチルサリチル酸での処置、特定の用量のアセチルサリチル酸、または別の抗血小板もしくは抗血栓剤に応答するかしないかに関して推論が可能になるという知見に一部は基づく。本発明によって、治療の開始の前に、アセチルサリチル酸での処置に対して応答する被験体および応答しない被験体を特定することが可能になる。本発明によってまた、特定の被験体について心血管系イベントのリスクを下げるという最高の利点をもたらす可能性が最も高い剤を抗血小板および抗血栓剤の中から選択することが可能になる。開示された多型はまた、心血管系イベントおよび関連の病理の診断および処置における使用のための、診断試薬の設計および治療剤の開発のための標的として有用である。
【０００９】
本発明の局面によれば、将来の心血管系イベントのリスクを低減するためのアセチルサリチル酸処置に対するヒト被験体の応答性の評価のための方法が提供される。この方法は、ヒト被験体のアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置で単一ヌクレオチド多型の同一性を確認する工程を包含する。いくつかの重要な実施形態では、染色体６：１６０８８０８７７の位置のシトシンまたはグアニンによって特徴付けられる多型の存在は、アセチルサリチル酸処置に対する応答性を示す。他の重要な実施形態では、染色体６：１６０８８０８７７の位置のチミンまたはアデニンによって特徴付けられる多型性の存在は、アセチルコリン酸処置に対する非応答性を示す。
【００１０】
当業者に周知である、任意の種々の検出方法を使用してもよい。一般的方法としては、被験体から得た核酸と核酸プローブとを接触させる工程、または被験体から得た核酸を配列決定する工程を包含する。このような方法の例としては限定はしないが、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、サイズ分析および一本鎖高次構造多型が挙げられる。いくつかの重要な実施形態では、多型の同一性は、被験体から得た核酸を配列決定することによって決定される。
【００１１】
本発明の別の局面によれば、あるアッセイが提供される。このアッセイは、ある剤と、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でヌクレオチドのシトシンまたはグアニンを有する（Ａｐｏ（ａ））遺伝子によってコードされる単離されたアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））タンパク質とを接触する工程と、この単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に、またはリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））に対するこの剤の結合を評価する工程と、コントロールに対する結合を比較する工程と、を包含する。ある実施形態では、このコントロールは、この単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質にもしくはＬｐ（ａ）に、またはＬｐ（ａ）に対するアセチルサリチル酸の結合の測定、あるいは血小板とのアセチルサリチル酸相互作用の測定を包含する。
【００１２】
本発明の別の局面によれば、あるアッセイが提供される。このアッセイは、ある剤と、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でヌクレオチドのチミンまたはアデニンを有するＡｐｏ（ａ）遺伝子によってコードされる単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質とを接触する工程と、この単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に対するこの剤の結合を評価する工程と、コントロールに対する結合を比較する工程と、を包含する。いくつかの実施形態では、このコントロールは、この単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に、もしくはＬｐ（ａ））に、または血小板に対するアセチルサリチル酸の結合の測定、あるいは血小板とのアセチルサリチル酸の相互作用の測定を包含する。
【００１３】
本発明の別の局面によれば、処置の方法が提供される。この方法は、ヒト被験体が染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でシトシンまたはグアニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型を有することに基づいてこのヒト被験体を選択する工程と、この被験体が多型を有する理由で将来の心血管系イベントのリスクを低減するためにこの被験体に対してアセチルサリチル酸を投与することとを包含する。いくつかの実施形態では、この被験体はまた、血中のＬｐ（ａ）のレベルが上昇している。
【００１４】
本発明の別の局面によれば、処置の方法が提供される。この方法は、ヒト被験体が染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でチミンまたはアデニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型を有することに基づいてこのヒト被験体を選択する工程と、この被験体が多型を有する理由で将来の心血管系イベントのリスクを低減するためにこの被験体に対してアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤を投与することと、を包含する。いくつかの実施形態では、この被験体はまた、血中のＬｐ（ａ）のレベルが上昇している。
【００１５】
抗血栓剤は、チエノピリジンであっても、またはチエノピリジン誘導体であってもよい。チエノピリジンまたはチエノピリジン誘導体の例としては限定はしないが、クロピドグレル、クロピドグレル重硫酸塩、チクロピジン、プラスグレル（ＣＳ−７４７またはＬＹ６４０３１５）、ＳＲ２５９８９、およびＰＣＲ４０９９が挙げられる。抗血栓剤としてはまた、限定はしないが、セノキサパリンナトリウム、キメラガトラン、アブシキシマブ、オチロフィバンが挙げられる。他の抗血栓剤の例としてはまた、プラスミノーゲンアクチベータ（例えば、アクチベース、アルテプラーゼ）（不活性なプラスミノーゲンのプラスミンへの変換を触媒する）が挙げられる。これは、プレカリクレイン、キニノーゲン、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩａ因子、プラスミノーゲンプロアクチベータ、および組織プラスミノーゲン活性化因子ＴＰＡ）、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキナーゼアクチベータ複合体、プロ−ウロキナーゼ（Ｐｒｏ−ＵＫ）、ｒＴＰＡ（アルテプラーゼまたはアクチバーゼ；ｒは組み換えを意味する）、ｒＰｒｏ−ＵＫ、アボキナーゼ、エミナーゼ、セレプターゼ、アナグレリド、塩酸アナグレリド、ビバリルジン、ダルテパリンナトリウム、ダナパロイドナトリウム、塩酸ダゾキシベン、硫酸エフェガトラン、エノキサパリンナトリウム、イフェトロバン、イフェトロバンナトリウム、チンザパリンナトリウム、レタプラーゼ、トリフェナグレル、ワルファリン、デキストラン、アミノカプロン酸（Ａｍｉｃａｒ）、およびトラネキサム酸（Ａｍｓｔａｔ）、スルフィンピラゾン、ジピリダモール、クロフィブラート、カルバミン酸ピリジノール、ＰＧＥ、グルカゴン、抗セロトニン薬、カフェイン、テオフィリンペントキシフィリン、およびチクロピジンの相互作用により生じる可能性がある。抗血栓剤としてはまた、限定はしないが、ＰＡＲ−１およびＰＡＲ−２レセプターを含む血小板レセプター、ならびにトロンビンの血小板レセプター、およびＰ２Ｙ１２などの血小板ＡＤＰレセプターに特異的に結合する抗血栓剤が挙げられる。
【００１６】
本発明の別の局面によれば、将来の心血管系イベントのリスクを減らすためのアセチルサリチル酸処理に対するヒト被験体の応答性を評価するための方法が提供される。本発明は、ヒト被験体のアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置で単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と連鎖または連鎖不均衡である遺伝子マーカーの有無を検出する工程を包含する。この遺伝子マーカーは対立遺伝子、ＳＮＰ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、または単純配列リピート（ＳＳＲ）であってもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、上記遺伝子マーカーは、染色体６：１６０８４９８９４（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９３１ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである。いくつかの実施形態では、上記遺伝子マーカーは、染色体６：１６０８３０２７２（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９２７ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである。いくつかの実施形態では、上記連鎖は、Ｋｒｉｎｇｌｅ（Ｋｒ）ＩＶ２型ドメインの１６、１７または１８リピートの間である。
【００１８】
いくつかの重要な実施形態では、染色体６：１６０８８０８７７の位置のシトシンまたはグアニンによって特徴付けられる多型の存在は、アセチルサリチル酸に対する応答性を示す。他の重要な実施形態では、染色体６：１６０８８０８７７の位置のチミンまたはアデニンによって特徴付けられる多型の存在は、アセチルサリチル酸に対する非応答性を示す。ある実施形態では、この方法は、被験体由来の血液サンプル中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルを決定する工程をさらに包含する。
【００１９】
本発明のさらに別の局面によれば、処置の方法が提供される。この方法は、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でのシトシンまたはグアニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型と連鎖するか、または連鎖不均衡である遺伝子マーカーをヒト被験体が有することに基づいてこのヒト被験体を選択する工程と、この被験体が多型を有する理由で将来の心血管系イベントのリスクを低減するためにこの被験体に対してアセチルサリチル酸を投与することと、を包含する。
【００２０】
上記遺伝子マーカーは、対立遺伝子、ＳＮＰ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、または単純配列リピート（ＳＳＲ）であってもよい。いくつかの実施形態では、上記ヒト被験体はまた、血液中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の上昇した値を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、上記遺伝子マーカーは、染色体６：１６０８４９８９４（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９３１ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである。いくつかの実施形態では、上記遺伝子マーカーは、染色体６：１６０８３０２７２（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９２７ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである。いくつかの実施形態では、上記連鎖は、Ｋｒｉｎｇｌｅ（Ｋｒ）ＩＶ２型ドメインの１６、１７または１８リピートの間である。
【００２２】
本発明のさらに別の局面によれば、処置の方法が提供される。この方法は、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）のチミンまたはアデニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型と連鎖するか、または連鎖不均衡である遺伝子マーカーをヒト被験体が有することに基づいてこのヒト被験体を選択する工程と、この被験体が多型を有する理由で将来の心血管系イベントのリスクを低減するためにこの被験体に対してアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤を投与することと、を包含する。いくつかの実施形態では、このヒト被験体はまた、血液中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の上昇した値を有する。
【００２３】
上記遺伝子マーカーは、対立遺伝子、ＳＮＰ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、または単純配列リピート（ＳＳＲ）であってもよい。いくつかの実施形態では、上記ヒト被験体はまた、血液中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の上昇した値を有する。
【００２４】
本発明のなお別の局面によれば、将来の心血管系イベントのヒト被験体のリスクを評価するための方法が提供される。この方法は、ヒト被験体のＡｐｏ（ａ）遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置での単一ヌクレオチド多型の同一性を確認する工程と、このヒト被験体由来の血液サンプル中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルを測定する工程とを包含する。いくつかの実施形態では、ヒト被験体のＡｐｏ（ａ）遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でのシトシンまたはグアニンによって特徴づけられる多型の存在、およびこの被験体由来の血液サンプル中のＬｐ（ａ）のレベルの上昇の存在は、この被験体が将来の心血管系イベントのリスク増大にあることを示す。
【００２５】
以下の実施形態は、別段示さない限り、本明細書に示される本発明の種々の局面に等しくあてはまる。
【００２６】
上記の心血管系イベントは、心筋梗塞、発作、急性冠症候群、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、血管形成術、一過性虚血性発作、肺塞栓症、血管閉塞または静脈血栓症であってもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態では、上記の方法は、被験体由来の血液サンプル中のＬｐ（ａ）のレベルを測定する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、この被験体は、血中のＬｐ（ａ）のレベルが上昇している。Ｌｐ（ａ）のレベルは、被験体由来の血液サンプル中で約１０ｍｇ／ｄｌ、約１５ｍｇ／ｄｌ以上、約２０ｍｇ／ｄｌ、約２５ｍｇ／ｄｌ以上、約３０ｍｇ／ｄｌ、約３５ｍｇ／ｄｌ以上、約４０ｍｇ／ｄｌ、約４５ｍｇ／ｄｌ以上、約５０ｍｇ／ｄｌであってもよい。Ｌｐ（ａ）のレベルを測定するためには任意の種々の方法が使用され得る。このような方法は、当業者に公知である。Ｌｐ（ａ）のレベルを測定するための方法の例は、Ｄａｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２９６，１３６３（２００６）に記載される。
【００２８】
本発明のこれらおよび他の局面は、下にさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】Ｌｐ（ａ）とｒｓ３７９８２２０の遺伝子型との関係を示す１セットのグラフである。Ａ）ＷＨＳからのコーカサス人女性の研究参加者の間のＬｐ（ａ）のレベル（中央値＝１０．３ｍｇ／ｄＬ）、Ｂ）Ａ）と同様にｒｓ３７９８２２０の３つの遺伝子型の間のＬｐ（ａ）のレベル。３つの遺伝子型についての四分位範囲（ＩＱＲ）および中央値は、ボックスおよびその中央のラインによって示す。ウィスカーは、中央値からＩＱＲの１．５倍である範囲ではＬｐ（ａ）の範囲にわたり、ウィスカーを超える過剰なＬｐ（ａ）値は丸で示す。Ｃ）ヘテロ接合性の遺伝子型を有するコーカサス人女性のＬｐ（ａ）値（中央値＝７９．３ｍｇ／ｄＬ）。低Ｌｐ（ａ）および高Ｌｐ（ａ）を有する小集団中のＬｐ（ａ）の分布についてのモデルは、それぞれあてはめ対数正規分布および正規分布によって示される。Ｄ）ｒｓ３７９８２２０についてのヘテロ接合性遺伝子型を有するＰＨＳからのコーカサス人男性の間のＬｐ（ａ）分布（中央値＝６６．９ｍｇ／ｄＬ、ＷＨＳからのサンプルについてとは異なるアッセイで測定、方法を参照のこと）。
【図１Ｂ】Ｌｐ（ａ）とｒｓ３７９８２２０の遺伝子型との関係を示す１セットのグラフである。Ａ）ＷＨＳからのコーカサス人女性の研究参加者の間のＬｐ（ａ）のレベル（中央値＝１０．３ｍｇ／ｄＬ）、Ｂ）Ａ）と同様にｒｓ３７９８２２０の３つの遺伝子型の間のＬｐ（ａ）のレベル。３つの遺伝子型についての四分位範囲（ＩＱＲ）および中央値は、ボックスおよびその中央のラインによって示す。ウィスカーは、中央値からＩＱＲの１．５倍である範囲ではＬｐ（ａ）の範囲にわたり、ウィスカーを超える過剰なＬｐ（ａ）値は丸で示す。Ｃ）ヘテロ接合性の遺伝子型を有するコーカサス人女性のＬｐ（ａ）値（中央値＝７９．３ｍｇ／ｄＬ）。低Ｌｐ（ａ）および高Ｌｐ（ａ）を有する小集団中のＬｐ（ａ）の分布についてのモデルは、それぞれあてはめ対数正規分布および正規分布によって示される。Ｄ）ｒｓ３７９８２２０についてのヘテロ接合性遺伝子型を有するＰＨＳからのコーカサス人男性の間のＬｐ（ａ）分布（中央値＝６６．９ｍｇ／ｄＬ、ＷＨＳからのサンプルについてとは異なるアッセイで測定、方法を参照のこと）。
【図１Ｃ】Ｌｐ（ａ）とｒｓ３７９８２２０の遺伝子型との関係を示す１セットのグラフである。Ａ）ＷＨＳからのコーカサス人女性の研究参加者の間のＬｐ（ａ）のレベル（中央値＝１０．３ｍｇ／ｄＬ）、Ｂ）Ａ）と同様にｒｓ３７９８２２０の３つの遺伝子型の間のＬｐ（ａ）のレベル。３つの遺伝子型についての四分位範囲（ＩＱＲ）および中央値は、ボックスおよびその中央のラインによって示す。ウィスカーは、中央値からＩＱＲの１．５倍である範囲ではＬｐ（ａ）の範囲にわたり、ウィスカーを超える過剰なＬｐ（ａ）値は丸で示す。Ｃ）ヘテロ接合性の遺伝子型を有するコーカサス人女性のＬｐ（ａ）値（中央値＝７９．３ｍｇ／ｄＬ）。低Ｌｐ（ａ）および高Ｌｐ（ａ）を有する小集団中のＬｐ（ａ）の分布についてのモデルは、それぞれあてはめ対数正規分布および正規分布によって示される。Ｄ）ｒｓ３７９８２２０についてのヘテロ接合性遺伝子型を有するＰＨＳからのコーカサス人男性の間のＬｐ（ａ）分布（中央値＝６６．９ｍｇ／ｄＬ、ＷＨＳからのサンプルについてとは異なるアッセイで測定、方法を参照のこと）。
【図１Ｄ】Ｌｐ（ａ）とｒｓ３７９８２２０の遺伝子型との関係を示す１セットのグラフである。Ａ）ＷＨＳからのコーカサス人女性の研究参加者の間のＬｐ（ａ）のレベル（中央値＝１０．３ｍｇ／ｄＬ）、Ｂ）Ａ）と同様にｒｓ３７９８２２０の３つの遺伝子型の間のＬｐ（ａ）のレベル。３つの遺伝子型についての四分位範囲（ＩＱＲ）および中央値は、ボックスおよびその中央のラインによって示す。ウィスカーは、中央値からＩＱＲの１．５倍である範囲ではＬｐ（ａ）の範囲にわたり、ウィスカーを超える過剰なＬｐ（ａ）値は丸で示す。Ｃ）ヘテロ接合性の遺伝子型を有するコーカサス人女性のＬｐ（ａ）値（中央値＝７９．３ｍｇ／ｄＬ）。低Ｌｐ（ａ）および高Ｌｐ（ａ）を有する小集団中のＬｐ（ａ）の分布についてのモデルは、それぞれあてはめ対数正規分布および正規分布によって示される。Ｄ）ｒｓ３７９８２２０についてのヘテロ接合性遺伝子型を有するＰＨＳからのコーカサス人男性の間のＬｐ（ａ）分布（中央値＝６６．９ｍｇ／ｄＬ、ＷＨＳからのサンプルについてとは異なるアッセイで測定、方法を参照のこと）。
【図２Ａ】アスピリン治療による、ｒｓ３７９８２２０またはＬｐ（ａ）の上昇からのリスクの減弱を示す１セットのグラフである。偶発的な血管疾患を有するコーカサス人ＷＨＳ参加者の累積画分のカプラン−マイヤー推定値。Ａ）主要な血管イベントの複合的エンドポイントについてＷＨＳのトライアルの間、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型およびアスピリンまたはプラシーボの割り当てによって層別化した、Ｂ）Ａと同じだが、ただし心筋梗塞の指標について、Ｃ）Ａと同じだが、ただし虚血性発作のエンドポイントについて、およびＤ）ｒｓ３７９８２２０（ＴＴ遺伝子型）のマイナーな対立遺伝子の非キャリアのうち、主な血管イベントの複合的エンドポイントについて９０パーセンタイル（６５．１ｍｇ／ｄＬ）より上または下のＬｐ（ａ）値、およびアスピリンまたはプラシーボ割り当てによって層別化した。
【図２Ｂ】アスピリン治療による、ｒｓ３７９８２２０またはＬｐ（ａ）の上昇からのリスクの減弱を示す１セットのグラフである。偶発的な血管疾患を有するコーカサス人ＷＨＳ参加者の累積画分のカプラン−マイヤー推定値。Ａ）主要な血管イベントの複合的エンドポイントについてＷＨＳのトライアルの間、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型およびアスピリンまたはプラシーボの割り当てによって層別化した、Ｂ）Ａと同じだが、ただし心筋梗塞の指標について、Ｃ）Ａと同じだが、ただし虚血性発作のエンドポイントについて、およびＤ）ｒｓ３７９８２２０（ＴＴ遺伝子型）のマイナーな対立遺伝子の非キャリアのうち、主な血管イベントの複合的エンドポイントについて９０パーセンタイル（６５．１ｍｇ／ｄＬ）より上または下のＬｐ（ａ）値、およびアスピリンまたはプラシーボ割り当てによって層別化した。
【図２Ｃ】アスピリン治療による、ｒｓ３７９８２２０またはＬｐ（ａ）の上昇からのリスクの減弱を示す１セットのグラフである。偶発的な血管疾患を有するコーカサス人ＷＨＳ参加者の累積画分のカプラン−マイヤー推定値。Ａ）主要な血管イベントの複合的エンドポイントについてＷＨＳのトライアルの間、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型およびアスピリンまたはプラシーボの割り当てによって層別化した、Ｂ）Ａと同じだが、ただし心筋梗塞の指標について、Ｃ）Ａと同じだが、ただし虚血性発作のエンドポイントについて、およびＤ）ｒｓ３７９８２２０（ＴＴ遺伝子型）のマイナーな対立遺伝子の非キャリアのうち、主な血管イベントの複合的エンドポイントについて９０パーセンタイル（６５．１ｍｇ／ｄＬ）より上または下のＬｐ（ａ）値、およびアスピリンまたはプラシーボ割り当てによって層別化した。
【図２Ｄ】アスピリン治療による、ｒｓ３７９８２２０またはＬｐ（ａ）の上昇からのリスクの減弱を示す１セットのグラフである。偶発的な血管疾患を有するコーカサス人ＷＨＳ参加者の累積画分のカプラン−マイヤー推定値。Ａ）主要な血管イベントの複合的エンドポイントについてＷＨＳのトライアルの間、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型およびアスピリンまたはプラシーボの割り当てによって層別化した、Ｂ）Ａと同じだが、ただし心筋梗塞の指標について、Ｃ）Ａと同じだが、ただし虚血性発作のエンドポイントについて、およびＤ）ｒｓ３７９８２２０（ＴＴ遺伝子型）のマイナーな対立遺伝子の非キャリアのうち、主な血管イベントの複合的エンドポイントについて９０パーセンタイル（６５．１ｍｇ／ｄＬ）より上または下のＬｐ（ａ）値、およびアスピリンまたはプラシーボ割り当てによって層別化した。
【図３−１】ヒスパニックでない白人のうちＫｒＩＶ２ｒ数の分布を示している１セットの棒グラフである。
【図３−２】ヒスパニックでない白人のうちＫｒＩＶ２ｒ数の分布を示している１セットの棒グラフである。
【図４】ヒスパニックでない白人のうちＫｒＩＶ２ｒの数によるＬｐ（ａ）値の分布を示している１セットのプロットである。
【図５】ヒスパニックでない白人のうちｒｓ３７９８２２０遺伝子型によって有意に異なるＬｐ（ａ）のレベルを有するｋｒＩＶ２ｒ（すなわち対立遺伝子）の数を示しているプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は一部は、将来の心血管イベントのリスクを低減するためのアセチルサリチル酸処理に対する被験体の応答性に関連するＡｐｏ（ａ）遺伝子におけるＳＮＰに関する。本発明はまた、Ａｐｏ（ａ）遺伝子単独での多型の使用、またはアセチルサリチル酸処理に対するヒト被験体の応答を評価するためのリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルと組み合わせた使用に、およびそれに基づく処置の方法に関する。本発明はまた、新規な抗血栓剤を特定および設計することに関する。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「推定する、評価する（ｅｖａｌｕａｔｅ）」または「推定、評価（すること、する工程）（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」という用語は、アセチルサリチル酸処置に対する被験体の応答に関して用いる場合、被験体の核酸サンプル中のヒト被験体のＡｐｏ（ａ）遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でヌクレオチドの同一性を分析するプロセスを用いてアセチルサリチル酸処置に対する応答についての結果を描写すること、および染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でヌクレオチド出現（単数または複数）の既知の関係に対して単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の出現を比較することを意味する。ヌクレオチド出現は、核酸分子を直接調査することによって、またはＡｐｏ（ａ）遺伝子によってコードされるポリペプチドを間接的に調査することによって、特定できる。
【００３２】
アセチルサリチル酸処理に対する応答とは、被験体のそれ以外は統計学的に類似のプール中で、ヒト被験体のアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でシトシンまたはグアニンによって特徴づけられる多型を有する、アセチルサリチル酸処置に対する被験体が、アセチルサリチル酸処置のない被験体よりも将来の心血管系イベントを有する可能性が少ないということを意味する。
【００３３】
隣接する配列の状況では、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でアセチルサリチル酸応答性に関連する対立遺伝子は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒによれば以下である：
【００３４】
【化１】
【００３５】
（プラス（「＋」）鎖は、上部の鎖であって、マイナス（「−」）鎖は、下部の鎖である）
染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でアセチルサリチル酸非応答性に関連する対立遺伝子は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒによれば以下である：
【００３６】
【化２】
【００３７】
（プラス（「＋」）鎖は、上部の鎖であって、マイナス（「−」）鎖は、下部の鎖である）
Ａｐｏ（ａ）遺伝子ＳＮＰは、米国特許出願公開第２００５２７２０５４号でｒｓ３７９８２２０ ｈＣＶ２５９３０２７１の名称で記載されている。Ａｐｏ（ａ）遺伝子ＳＮＰはまた、その内容全体が本明細書において参照によって援用されている、米国特許出願公開第２００５／０２７２０５４号Ａ１に記載のプライマー配列ＣＧＡＡＴＣＴＣＡＴＧＴＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＡ（配列番号５）のマッチによって見出され得る。
【００３８】
ヒト被験体という用語は、心血管系イベントを有していたヒト、心血管イベントを発症すると疑われるヒト、または将来の心血管系イベントの素因があるかまたはそのリスクがあり得る無症状のヒトを包含する。従って、いくつかの実施形態では、このヒト被験体はすでに、例えば、心筋梗塞などの一次的（第一の）心血管イベントを有していたか、または血管形成術を行っていた。一次的な心血管系イベントを有していたヒト被験体は、二次（第二）心血管系イベントのリスクが上昇している。いくつかの実施形態では、ヒト被験体は、一次的心血管系イベントを有していなかったが、心血管系イベントを有するリスクが増大している。なぜなら、そのヒト被験体は、心血管系イベントを有する１つ以上の危険因子があるからである。いくつかの実施形態では、この被験体はすでに将来の心血管系イベントのリスクを低減するための治療を用いて処置されている。この治療は、下に言及される任意の治療剤であってもよい。さらに他の実施形態では、この被験体は、一次的心血管系事象を有していて、１つ以上の他の危険因子を有する。いくつかの実施形態では、このヒト被験体は、将来の心血管系イベントのリスクを低減するために治療中である（例えば、スタチン治療などの抗脂質治療）。いくつかの実施形態では、ヒト被験体は、急性冠症候群の真ん中にあり、処置の決定は、即自的な心血管系イベントを管理するため、およびイベントの再発を防ぐために行われている。
【００３９】
心血管系イベントの危険因子の例としては以下が挙げられる：高脂血症、肥満、真性糖尿病、高血圧、高血圧前症、全身性炎症のマーカーの値（単数または複数）の上昇、年齢、心血管系イベントの家族歴、および喫煙。心血管系イベントのリスクの程度は、ヒト被験体が有する危険因子の多さおよび重症度または大きさに依存する。リスクチャートおよび予測アルゴリズムは、危険因子の存在および重症度に基づきヒト被験体の心血管系イベントのリスクを評価するために利用可能である。このような例の１つは、フラミンガム心臓研究（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙ）リスク予測スコアである。ヒト被験体は、その被験体が１０年計算のフラミンガム心臓研究リスクスコアが５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％より大きい場合に心血管系イベントを有するリスクが増大している。
【００４０】
ヒト被験体における心血管系イベントのリスクを評価するための別の方法は、ＣＲＰのような全身性炎症のマーカーの値の測定をフラミンガム心臓研究リスク予測スコアへ組み込んでいる、全体的なリスクスコアである。ヒト被験体において心血管系イベントのリスクを評価する他の方法としては、冠動脈カルシウム・スキャン、心臓核磁気共鳴画像化、および／または磁気共鳴血管造影法が挙げられる（Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ ２９７，６１１，２００７）。
【００４１】
高脂血症は、高コレステロール血症および／または高トリグリセリド血症である。高コレステロール血症のヒト被験体および高トリグリセリド血症のヒト被験体は、心血管系イベントの頻度が増大している。高コレステロール血症のヒト被験体とは、高コレステロール血症のヒト被験体について確立された現行の基準があてはまる被験体である。高トリグリセリド血症のヒト被験体とは、高トリグリセリド血症のヒト被験体について確立された現行の基準があてはまる被験体である。高コレステロール血症の被験体は、１６０ｍｇ／ｄＬを超えるＬＤＬ値、または１３０ｍｇ／ｄＬを超えるＬＤＬ値、および以下からなる群より選択される少なくとも２つの危険因子を有する：雄性、早熟性心疾患の家族歴、喫煙、高血圧、低ＬＤＬ（３５ｍｇ／ｄＬ未満）、真性糖尿病、高インスリン血症、腹部肥満、高リポタンパク質、および心血管系イベントの個人歴。高トリグリセリド血症のヒト被験体は、２５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリド（ＴＧ）値を有する。
【００４２】
高血圧は、１４０ｍｍＨｇを超える収縮期血圧、および／もしくは９０ｍｍＨｇを超える拡張期血圧、またはその両方として定義される。高血圧前症は、１１５〜１４０ｍｍＨｇの収縮期血圧、および／または８０〜９０ｍｍＨｇの拡張期血圧として定義される。
【００４３】
肥満は過剰な脂肪組織量の状態である。肥満症の直接の測定ではないが、肥満を計測するための最も広範に用いられる方法は、ボディ・マス・インデックス（ＢＭＩ）であって、これは質量／高さ２（ｋｇ／ｍ２）に等しい（例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第１５版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．−本明細書において以降は「Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ」を参照のこと）。実質的な罹患率のデータに基づいて、３０というＢＭＩが男性および女性の両方の肥満の閾値として最も一般に用いられる。２５〜３０のＢＭＩは、高血圧および耐糖能異常などの肥満によって影響される危険因子の存在において特に、医学的に重要かつ、治療の介入の価値があるとみなされるべきである。多くの場合体重の増加と等しいとみられるが、そうである必要はない。無駄肉がないが極めて筋肉質の個体は、脂肪症の増大がなくとも恣意的な標準によって過剰体重である場合がある。肥満を定量するための他のアプローチとしては、形態測定（皮下脂肪）、比重測定（水面下秤量）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、または磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、および／または電気インピーダンスが挙げられる。
【００４４】
真性糖尿病は、１２５ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血漿グルコース値を有するヒト被験体で確立される。
【００４５】
全身性炎症のマーカーの上昇した値（単数または複数）とは、健康なヒト被験体集団（すなわち、疾患の兆候も症状もないヒト被験体）の平均を上回る値である。全身性炎症のマーカーがＣＲＰである場合、１以上のＣＲＰ値は上昇した値とみなされる。
【００４６】
将来の心血管系イベントのリスクを低減するための治療としては、限定はしないが、食餌および／または運動および／または以下を用いる治療が挙げられる：抗脂質剤類、抗炎症剤類、抗血栓剤類、線維素溶解剤類、抗血小板剤類、直接トロンビンインヒビター類、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターインヒビター類、細胞接着分子に結合して、白血球がこのような分子に取り付く能力を阻害する薬剤類（例：抗細胞接着分子抗体類）、α−アドレナリン遮断薬類、β−アドレナリン遮断薬類、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター類、アンジオテンシン系インヒビター、抗不整脈薬類、カルシウムチャネル遮断薬類、利尿薬類、変力薬類、血管拡張剤類、昇圧剤類、チアゾリジンジオン類、カナビノイド−１受容体遮断薬類、および／またはこれらの任意の組み合わせ。
【００４７】
抗脂血症剤とは、総コレステロールを低下させ、ＬＤＬＣを低下させ、トリグリセリド類を低下させ、および／またはＨＤＬＣを増大させる剤である。抗脂血症剤としては、スタチン類および非スタチン抗脂血症剤類、および／またはこれらの組み合わせが挙げられる。スタチン類は、ヒトの総コレステロール、ＬＤＬＣおよびトリグリセリドのレベルを低下させる効果があることが証明されている医薬品の一クラスである。スタチン類は、コレステロールの合成の段階で作用する。ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ遺伝子の阻害を通じ、細胞により合成されるコレステロールの量を低下させることによって、スタチン類は、肝細胞によるＬＤＬＣの取り込みの増大に至る事象のサイクルを開始する。ＬＤＬＣの取り込みが増大するにつれて、血中の総コレステロールおよびＬＤＬＣの値が低下する。両因子の血中レベルが低いほど、それに伴ってアテローム性動脈硬化および心疾患のリスクが低く、スタチン類はアテローム性動脈硬化による罹患率および死亡率の低減に広く用いられている。
【００４８】
スタチン類の例としては、限定はしないが、シンバスタチン（Ｚｏｃｏｒ）、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ）、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ）、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ）、アトロバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ）、セリバスタチン（Ｂａｙｃｏｌ）、ロスバスタチン（Ｃｒｅｓｔｏｒ）、ピチバスタチン、およびその他多数が挙げられる。
【００４９】
非スタチン抗脂血症剤としては、限定はしないが、フィブリン酸誘導体類（フィブラート）、胆汁酸捕捉剤または樹脂、ニコチン酸薬剤類、コレステロール吸収インヒビター類、アシル−補酵素Ａ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）インヒビター類、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）インヒビター類、ＬＤＬレセプターアンタゴニスト類、ファルネソイドＸレセプター（ＦＸＲ）アンタゴニスト類、ステロール調節結合タンパク質切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）活性化因子類、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質（ＭＴＰ）インヒビター類、スクアレン合成酵素インヒビター類、およびペルオキシソーム増殖活性化レセプター（ＰＰＡＲ）アゴニスト類が挙げられる。
【００５０】
フィブリン酸誘導体の例としては限定はしないが、ゲムフィブロジル（Ｌｏｐｉｄ）、フェノフィブラート（Ｔｒｉｃｏｒ）、クロフィブラート（Ａｔｒｏｍｉｄ）およびベサフィブラートが挙げられる。
【００５１】
胆汁酸捕捉剤または樹脂類の例としては限定はしないが、コレセベラム（ＷｅｌＣｈｏｌ）、コレスチラミン（ＱｕｅｓｔｒａｎまたはＰｒｅｖａｌｉｔｅ）およびコレスチポール（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ）、ＤＭＤ−５０４、ＧＴ−１０２２７９、ＨＢＳ−１０７、およびＳ−８９２１が挙げられる。
【００５２】
ニコチン酸剤の例としては限定はしないが、ナイアシンおよびプロブコールが挙げられる。
【００５３】
コレステロール吸収インヒビターの例としては限定はしないが、エゼチミブ（Ｚｅｔｉａ）が挙げられる。
【００５４】
ＡＣＡＴインヒビターの例としては限定はしないが、アバシミブ（Ａｖａｓｉｍｉｂｅ）、ＣＩ−９７６（Ｐａｒｋｅ Ｄａｖｉｓ）、ＣＰ−１１３８１８（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＰＤ−１３８１４２−１５（Ｐａｒｋｅ Ｄａｖｉｓ）、Ｆ１３９４、ならびに米国特許第６，２０４，２７８号、同第６，１６５，９８４号、同第６，１２７，４０３号、同第６，０６３，８０６号、同第６，０４０，３３９号、同第５，８８０，１４７号、同第５，６２１，０１０号、同第５，５９７，８３５号、同第５，５７６，３３５号、同第５，３２１，０３１号、同第５，２３８，９３５号、同第５，１８０，７１７号、同第５，１４９，７０９号，および同第５，１２４，３３７号に記載されるその他多数のインヒビターが挙げられる。
【００５５】
ＣＥＴＰインヒビターの例としては、限定はしないが、トルセロラピブ、ＣＰ−５２９４１４、ＣＥＴｉ−ｌ、ＪＴＴ−７０５、ならびに
【００５６】
【化３】
【００５７】
に記載される他の多数のインヒビターが挙げられる。
【００５８】
ＦＸＲアンタゴニストの一例は、ググルステロン（Ｇｕｇｇｕｌｓｔｅｒｏｎｅ）である。ＳＣＡＰ活性化因子の一例は、ＧＷ５３２（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）である。
【００５９】
ＭＴＰインヒビターの例としては限定はしないが、インプリタピド（ｉｍｐｌｉｔａｐｉｄｅ）およびＲ−１０３７５７が挙げられる。
【００６０】
スクアレン合成酵素インヒビターの例としては限定はしないが、ザラゴジン酸が挙げられる。
【００６１】
ＰＰＡＲアゴニストの例としては限定はしないが、ＧＷ−４０９５４４、ＧＷ−５０１５１６、およびＬＹ−５１０９２９が挙げられる。
【００６２】
本発明は、Ａｐｏ（ａ）遺伝子の多型を特定する工程を包含する。多型とは、集団中に存在する対立遺伝子改変体である。多型は、ある遺伝子座に存在する単一ヌクレオチドの相違であってもよいし、またはある遺伝子のある位置での１つまたは２〜３個のヌクレオチドの挿入または欠失であってもよい。従って、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、ヒトゲノムなどのゲノム中の特定の遺伝子座での、代表的には４つ全てのヌクレオチドに満たない、１つまたは２つ、３つまたは４つのヌクレオチド（すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、またはチミン）の集団中での存在によって特徴づけられる。
【００６３】
当業者は核酸分子が二本鎖分子であってもよいこと、および一本の鎖の特定の部位に対して、ならびに相補的な鎖の上の対応する部位に対して言及することを容易に認識するであろう。ＳＮＰ位置を定義するのにおいて、ＳＮＰ対立遺伝子、またはヌクレオチド配列とは、ある核酸分子の１本の鎖上の特定の部位でのアデニン、チミン（ウリジン）、シトシン、またはグアニンを指し、またその核酸分子の相補鎖上の対応する部位のチミン（ウリジン）、アデニン、グアニン、またはシトシンを（それぞれ）定義する。従って、特定のＳＮＰ位置、ＳＮＰ対立遺伝子、またはヌクレオチド配列について言及するためには、いずれかの鎖を参照する必要がある場合がある。プローブおよびプライマーは、いずれかの鎖にハイブリダイズするように設計してもよいし、本明細書に開示されるＳＮＰ遺伝子型決定方法は一般にいずれかの鎖を標的してもよい。
【００６４】
Ａｐｏ（ａ）遺伝子中のヌクレオチドの同一性を決定することは、例えば、ヌクレオチドを含む核酸分子に、それぞれ、選択的にハイブリダイズするかまたは近いオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーとともにこの核酸サンプルをインキュベートすること、およびプライマーまたはプローブの選択的ハイブリダイゼーションを検出することによって行うことができる。プローブの選択的ハイブリダイゼーションは、例えば、プローブを検出可能に標識すること、およびサザンブロット分析などのブロット型の分析を用いて標識の存在を検出することによって、検出され得る。プライマーの選択的なハイブリダイゼーションは、例えば、プライマー伸長反応を行うこと、およびプライマーを含むプライマー伸長反応産物を検出することによって検出され得る。所望の場合、プライマー伸長反応は、ポリメラーゼ連鎖反応として行ってもよい。この方法は、１つ以上のヌクレオチドを特定する工程を包含し得る。
【００６５】
多くの分析手順を用いて、本発明の多型位置で改変体ヌクレオチドの有無を検出し得る。一般には、対立遺伝子改変の検出には、変異識別技術、必要に応じて増幅反応および必要に応じてシグナル発生システムを要する。多数の変異検出技術が、そのいくつかはＰＣＲに基づくのだが、多数のシグナル発生システムと組み合わせて用いられ得る。対立遺伝子バリエーションの検出のための多くの現行の方法は、Ｎｏｌｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３，１１１４−１１２０，１９９７によって；ならびに標準的な教科書中に、例えば、「Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、編集Ｕ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６、および「ＰＣＲ」、第２版、Ｎｅｗｔｏｎ ＆ Ｇｒａｈａｍ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９７に概説される。Ａｐｏ（ａ）遺伝子のＳＮＰ検出および遺伝子型決定方法および試薬は、その内容全体が本明細書において参照によって援用される米国特許出願公開第２００５／０２７２０５４号Ａ１に記載される。
【００６６】
配列相同性を共有する２つの分子の２つのヌクレオチド配列または２つのアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、その配列を最適比較目的で整列させる（例えば、最適アラインメントのためにはギャップを第一および第二の核酸またはアミノ酸配列の一方または両方に導入してもよく、比較目的のためには非相同性配列を無視してもよい）。いくつかの実施形態では、参照配列の長さのうち少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％またはそれ以上を比較目的のために整列させる。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。最初の配列中のある位置が、第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されるならば、その分子は、その位置で同一である（本明細書において用いる場合、アミノ酸または核酸の「同一性」とは、アミノ酸または核酸の「相同性」に等しい）。２つの配列の間の同一性パーセントとは、その２つの配列の最適アラインメントのために導入されることを要する、ギャップの数および各々のギャップの長さを考慮して、その配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
【００６７】
２つの配列間の配列の比較および同一性のパーセントの決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）。いくつかの実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３ １９７０））を用いて決定される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性のパーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０、または８０というギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６という長さウェイトを用いてＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））を用いて決定される。他の実施形態では、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列の間の同一性のパーセントは、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へ組み込まれているＥ．ＭｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））を用いて決定される。
【００６９】
ＳＮＰを分析するために、選択的ＳＮＰ対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを用いることが、適切であり得る。標的配列における単一ヌクレオチド変化を検出するそのようなオリゴヌクレオチドは、「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」、「対立遺伝子特異的プローブ」または「対立遺伝子特異的プライマー」のような用語によって呼ばれてもよい。多型を分析するための対立遺伝子特異的プローブの設計および使用は、例えば、Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｏｔｔｏｎら編，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９８；Ｓａｉｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ ３２４，１６３〜１６６（１９８６）；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ，欧州特許２３５，７２６号；およびＳａｉｋｉ，国際公開第８９／１１５４８号に記載される。
【００７０】
各々の対立遺伝子特異的なプライマーまたはプローブの設計は、変数、例えば、標的核酸分子中のＳＮＰ位置に隣接するヌクレオチド配列の正確な組成、ならびにそのプライマーまたはプローブの長さに依存するが、プライマーおよびプローブの使用における別の要因は、そのプローブまたはプライマーと、標的配列との間のハイブリダイゼーションが実施される条件のストリンジェンシーである。高いストリンジェンシー条件ほど、より低いイオン強度の緩衝液および／またはより高い反応温度を利用し、そして安定な二重鎖を形成するためには、プローブ／プライマーと標的配列との間のより完全な一致を必要とする傾向がある。しかし、そのストリンジェンシーが高すぎる場合、ハイブリダイゼーションは、全く生じないかもしれない。対照的に、低いストリンジェンシー条件ほど、より高いイオン強度の緩衝液および／またはより低い反応温度を利用し、そしてプローブ／プライマーと標的配列との間でよりミスマッチの多い塩基による安定な二重鎖の形成が可能になる。例としてであって限定としてではないが、対立遺伝子特異的プローブを用いる高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件についての例示的な条件は、以下のとおりである：５×標準的生理食塩水リン酸ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）、０．５％ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）を含む溶液を用いる５５℃でのプレハイブリダイゼーション、同じ溶液中にある標的核酸分子とともに同じ温度でプローブをインキュベートすること、その後、２×ＳＳＰＥおよび０．１％ ＳＤＳを含む溶液を用いて５５℃または室温で洗浄すること。
【００７１】
中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を、例えば、約４６℃にて５０ｍＭのＫＣｌを含む溶液を用いて、対立遺伝子特異的プライマー伸長反応のために用いてもよい。あるいは、この反応は、高温、例えば、６０℃にて行ってもよい。別の実施形態では、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）反応（この反応では、２つのプローブが、それらが標的配列と完全に相補的な場合に連結される）のために適切な中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約１００ｍＭのＫＣｌの溶液を、４６℃という温度にて利用し得る。
【００７２】
ハイブリダイゼーションベ−スのアッセイでは、ある個体由来の標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、別の個体由来の対応するセグメントには、その２つの個体由来の個々のＤＮＡセグメントにおける異なる多型形態（例えば、選択的ＳＮＰ対立遺伝子／ヌクレオチド）の存在に起因してハイブリダイズしない、対立遺伝子特異的プローブを設計してもよい。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度における検出可能な有意な差異が存在し、かつ好ましくは、本質的には二成分の応答が存在し、それによって、プローブが対立遺伝子のうちの一方のみにハイブリダイズするかまたは一方の対立遺伝子に対して有意により強くハイブリダイズするのに充分なほど、ストリンジェントであるべきである。プローブは、ＳＮＰ部位を含む標的配列にハイブリダイズしてその結果そのＳＮＰ部位がそのプローブの配列に沿ったどこかに整列するように設計されてもよいが、そのプローブは、好ましくは、標的配列のセグメントにハイブリダイズして、その結果、そのＳＮＰ部位が、そのプローブの中心位置（例えば、そのプローブのいずれかの末端から少なくとも３ヌクレオチド離れているそのプローブ内の位置）と整列するように設計される。このプローブ設計によって、一般的には、異なる対立遺伝子形態の間でのハイブリダイゼーションにおける良好な識別が達成される。
【００７３】
ヌクレオチド配列（ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド）はＲＮＡであってもよいし、またはＤＮＡであってもよく、これは１つの遺伝子もしくはその一部、ｃＤＮＡ、合成ポリデオキシリボ核酸配列などであってもよく、一本鎖または二本鎖であっても、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであってもよい。種々の実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、プローブまたはプライマー）を含むポリヌクレオチドは、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドアナログ、またはリン酸ジエステル結合以外の骨格結合を含んでもよい。一般に、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、天然に存在する、２’−デオキシリボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニンもしくはチミンのようなデオキシリボヌクレオチド、またはリボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニンもしくはウラシルのようなリボヌクレオチドである。しかし、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとしてはまた、天然には存在しない合成ヌクレオチドまたは天然に存在するヌクレオチドの修飾型を含む、ヌクレオチドアナログを含んでもよい。そのようなヌクレオチドアナログは、当技術分野において周知でありかつ市販されており、そのようなヌクレオチドアナログを含むポリヌクレオチドについても同様である（各々が参照として本明細書に組み入れられる、Ｌｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５２２０〜５２３４（１９９４）；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１３６３〜１１３７２（１９９５）；Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８〜７３（１９９７））。
【００７４】
ポリヌクレオチドのヌクレオチドの共有結合は一般にリン酸ジエステル結合である。しかし、この共有結合はまた、チオジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合、またはヌクレオチドと結合して合成ポリヌクレオチドを生成する際に有用な、当業者に公知の任意の他の結合を含む、任意の多数の他の結合である場合もある（例えば各々が参照として本明細書に組み入れられる、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：９７７−９８６，１９９４；ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３５１３６０，１９９５を参照のこと）。天然に存在しないヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチドもしくはアナログを連結する結合を組み入れることは、このポリヌクレオチドが、例えば組織培地を含む、ヌクレアーゼ活性を含み得る環境に曝露される場合に、または生きている被験体への投与の際に特に有用な場合がある。なぜなら修飾型ポリヌクレオチドは、分解に対する感受性が低い場合があるためである。
【００７５】
天然に存在するヌクレオチドおよびリン酸ジエステル結合を含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは化学的に合成することができるほか、適切なポリヌクレオチドをテンプレートとして用いる組換えＤＮＡ法を用いて作製することができる。これとは対照的に、ヌクレオチドアナログ、またはリン酸ジエステル結合以外の共有結合を含むポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは一般に化学的に合成されるが、Ｔ７ポリメラーゼなどの酵素は、ある種のヌクレオチドアナログをポリヌクレオチド中に取り込むことが可能なので、このようなポリヌクレオチドを適切なテンプレートから組換え的に生成させるために用いてもよい（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．、前出、１９９５）。従って、ポリヌクレオチドという用語は本明細書において用いる場合、天然に存在する核酸分子であって、細胞から単離され得る核酸分子、および合成の分子であって、例えば、化学合成の方法によって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などによる酵素的な方法によって調製され得る合成分子を包含する。
【００７６】
核酸の試験サンプルは、簡便には血液のサンプル、気管支肺胞洗浄液、喀痰、または被験体（例えば、ヒト）から得られる他の体液もしくは組織である。試験サンプルはその試験サンプル中の配列に相当する核酸配列に等しくてもよい、すなわち対立遺伝子バリエーションの分析前に、任意の従来の技術、例えば、ＰＣＲを用いてサンプル核酸の中の領域の全てまたは一部を最初に増幅してもよいことが理解されるであろう。
【００７７】
種々の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはオリゴペプチドを検出可能に標識することが有用である場合がある。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの検出可能な標識は、当該分野で周知である。検出可能な標識の特に非限定的な例としては、化学発光標識、放射性標識、酵素、ハプテンまたは固有のオリゴヌクレオチド配列さえ挙げられる。
【００７８】
多型を特定する方法はまた、特異的な結合対メンバーを用いて行ってもよい。本明細書において用いる場合、「特異的な結合対メンバー」という用語は、特異的な結合対の別のメンバーに対して特異的に結合するかまたは選択的にハイブリダイズする分子をいう。特異的な結合対メンバーとしては、例えば、プローブ、プライマー、ポリヌクレオチド、抗体などが挙げられる。例えば、特異的結合対メンバーとしては、多型遺伝子座を含む標的ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズするか、またはテンプレートとして標的ポリヌクレオチドを用いて生成される増幅産物にハイブリダイズする、プライマーもしくはプローブが挙げられる。
【００７９】
本明細書において用いる場合、「特異的な相互作用」または「特異的に結合する」などの用語は、２つの分子が、生理学的条件下で比較的安定な複合体を形成することを意味する。この用語は本明細書において、例えば、多型部位を含むポリヌクレオチドに結合する抗体の相互作用；または多型部位を含むコドンによってコードされるアミノ酸を含むポリペプチドに結合する抗体の相互作用を含む、種々の相互作用を指して用いられる。
【００８０】
本発明の方法によれば、抗体は、多型部位を含むコドンによってコードされる特定のアミノ酸を含むポリペプチドに選択的に結合し得る。あるいは、抗体は、例えば、プライマー伸長アッセイを用いて多型部位で特定のヌクレオチド出現についてのみ多型部位に組み込まれている特定の修飾されたヌクレオチドに優先的に結合し得る。
【００８１】
特異的な相互作用は一般に、例えば、ヒトまたは他の脊椎動物もしくは無脊椎動物などの生きた個体に生じる条件を含む、生理学的条件下で、ならびに哺乳動物細胞または別の脊椎動物生物体もしくは無脊椎動物生物体由来の細胞を維持するために用いられるような細胞培養で生じる条件下で安定である。２つの分子が特異的に相互作用するか否かを決定するための方法は、周知であって、これには、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴などが挙げられる。
【００８２】
サンプル中の特定の多型についてヌクレオチドの存在を検出するためには当該分野では多数の方法が公知である。このような方法は、Ａｐｏ（ａ）遺伝子中の１つ以上の多型を含む、標的ポリヌクレオチドに対して選択的にハイブリダイズする、例えば、増幅プライマー対を含む、１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを利用し得る。
【００８３】
対立遺伝子特異的プライマーが、一般には定常プライマーと一緒に、ＰＣＲ反応などの増幅反応中で用いられ、これによって例えば、ＡＲＭＳ（商標）アッセイに用いられるのと同様に、特定の配列位置での１つの対立遺伝子の選択的な増幅を通じた対立遺伝子の間の識別が得られる。対立遺伝子特異的プライマーは好ましくは、１７〜５０ヌクレオチド、より好ましくは約１７〜３５ヌクレオチド、さらに好ましくは約１７〜３０ヌクレオチドである。
【００８４】
対立遺伝子特異的プライマーは好ましくは、検出されるべき対立遺伝子と正確に対応するが、その誘導体であって、ここで、３’末端のヌクレオチドのほぼ６〜８が、検出されるべき対立遺伝子と対応しており、かつ残りのヌクレオチドのうち最大１０まで、例えば、８、６、４、２または１がそのプライマーの特性に有意に影響することなく変化してもよい誘導体も考慮される。
【００８５】
プライマーは、合成の任意の従来の方法を用いて製造され得る。このような方法の例は、標準的な教科書、例えば、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ；第２０巻；編集Ｓｕｄｈｉｒ Ａｇｒａｗａｌ，Ｈｕｍａｎａ ＩＳＢＮ：０−８９６０３−２４７−７；１９９３；第１版に見出すことができる。必要に応じて、このプライマー（単数または複数）は、検出を容易にするために標識されてもよい。
【００８６】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書に規定される位置でＡｐｏ（ａ）遺伝子多型を検出するために用いられ得る。このようなプローブの設計は、当該分野の通常技術の分子生物学者には明白であろう。このようなプローブは、任意の都合のよい長さ、例えば、最大５０塩基、最大４０塩基、さらに好都合なことには最大３０塩基長、例えば、８〜２５塩基または８〜１５塩基長のいずれかである。一般には、このようなプローブは、遺伝子中の対応する野性型または改変遺伝子座に全体として相補的な塩基配列を含む。しかし、必要な場合、１つ以上のミスマッチを導入してもよく、ただし、オリゴヌクレオチドプローブの判別力は過度に影響されない。本発明のプローブは検出を容易にするための１つ以上の標識を担持し得る。
【００８７】
本発明の方法を行うのに有用なオリゴヌクレオチドプローブは、例えば、多型の位置（その位置での特定のヌクレオチドの存在が、このプローブの選択的ハイブリダイゼーションの有無によって検出される）を含む、標的ポリヌクレオチドの一部に相補的であり、かつそれにまたがるオリゴヌクレオチドを含んでもよい。このような方法はさらに、標的ポリヌクレオチドおよびハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドとエンドヌクレアーゼとを接触させる工程と、多型部位に存在するヌクレオチドがプローブの対応するヌクレオチドに相補的であるか否かに依存して、プローブの切断産物の有無を検出する工程とを包含し得る。
【００８８】
オリゴヌクレオチド連結アッセイはまた、多型位置でのヌクレオチド存在を特定するために用いられ得、ここでは１対のプローブが選択的に、多型の部位に上流にかつ隣接して、および下流にかつ隣接してハイブリダイズし、そのプローブの１つが多型のヌクレオチド出現に相補的な末端ヌクレオチドを含む。プローブの末端ヌクレオチドがヌクレオチド出現に相補的である場合、選択的ハイブリダイゼーションは、末端ヌクレオチドを含み、その結果、リガーゼの存在下で、上流および下流のオリゴヌクレオチドが連結される。従って、連結産物の有無は、多型の部位のヌクレオチド出現の指標である。
【００８９】
オリゴヌクレオチドはまた、プライマーとして、例えば、プライマー伸長反応に有用である場合があり、ここでは伸長反応の産物（または産物がないこと）は、ヌクレオチド出現の指標である。さらに、ＳＮＰを含む標的ポリヌクレオチドの一部を増幅するために有用なプライマー対が有用である場合があり、ここでは増幅産物を試験して、多型部位でのヌクレオチド出現を決定する。特に有用な方法としては、ハイ・スループット方式へ、多重方式へ、またはその両方へ容易に適合可能な方法が挙げられる。このプライマー伸長または増幅産物は、当該分野で公知の種々の方法を用いて直接もしくは間接的に検出されても、および／または配列決定されてもよい。多型遺伝子座にまたがる増幅産物は、伝統的な配列の方法論（例えば、「ジデオキシ−媒介性連鎖終止法」（「Ｓａｎｇｅｒ法」としても公知）（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．９４：４４１（１９７５）；Ｐｒｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：３３６−３４０（１９８７））および「化学分解法」（「マキサム−ギルバート法」としても公知）（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７４：５６０（１９７７））（両方とも参照によって本明細書に援用される）を用いて配列決定されて、ＳＮＰ遺伝座でのヌクレオチド出現が決定され得る。
【００９０】
Ａｐｏ（ａ）遺伝子中のヌクレオチドの同一性を決定し得る方法としては、「マイクロシーケンシング（ｍｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」方法が挙げられる。マイクロシーケンシング法は、「所定の」部位で単一のヌクレオチドのみの同一性を決定する。このような方法は、標的ポリヌクレオチドにおける多型の存在および同一性を決定するのに特に有用性を有する。
【００９１】
このようなマイクロシーケンシング法、および多型遺伝子座でのヌクレオチド出現を決定するための他の方法は、参照によって本明細書に援用されるＢｏｙｃｅ−Ｊａｃｉｎｏらの、米国特許第６，２９４，３３６号に考察される。
【００９２】
マイクロシーケンシング法は、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．（参照によって本明細書に援用される、国際公開第９２／１５７１２号）に開示されるＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ分析法を包含する。ＤＮＡ中の多型部位をアッセイするための、さらなるプライマーガイドのヌクレオチド組み込み手順も記載されている（Ｋｏｍｈｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４（１９８９）；Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｂ．Ｐ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：３６７１（１９９０）；Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８：６８４−６９２（１９９０）；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，Ｍ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８８：１１４３−１１４７（１９９１）；Ｐｒｅｚａｎｔ，Ｔ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１：１５９−１６４（１９９２）；Ｕｇｏｚｚｏｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，ＧＡＴＡ ９：１０７−１１２（１９９２）；Ｎｙｒｅｎ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５（１９９３）；およびＷａｌｌａｃｅ，国際公開第８９／１０４１４）。これらの方法はＧｅｎｅｔｉｃ Ｂｉｔ分析とは、それらが全て、多型部位の塩基の間で識別するために標識デオキシヌクレオチドの組み込みに依拠しているという点で異なる。このような方式では、このシグナルは、組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するので、同じヌクレオチドの実行で生じる多型は、その実行の長さに比例するシグナルを生じ得る（Ｓｙｖａｎｅｎ，Ａ．−Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５２：４６−５９（１９９３））。
【００９３】
別のマイクロシーケンシング方法は、Ｍｕｎｄｙ，Ｃ．Ｒ．（米国特許第４，６５６，１２７）およびＣｏｈｅｎ，Ｄ．ら（仏国特許第２，６５０，８４０号；国際公開第９１／０２０８７号）に記載されており、これは、多型部位のヌクレオチドの同一性を決定するための溶液ベースの方法を考察している。米国特許第４，６５６，１２７号のＭｕｎｄｙの方法にあるとおり、多型部位のすぐ３’側の対立遺伝子配列に相補的であるプライマーを使用する。
【００９４】
配列を分析するためにゲル電気泳動を使用するのに生じる問題に対しては、マイクロシーケンシングの別方法が開発されている。Ｍａｃｅｖｉｃｚ（米国特許第５，００２，８６７）は、例えば、オリゴヌクレオチドプローブの複数の混合物とのハイブリダイゼーションを介して核酸配列を決定するための方法を記載している。このような方法によれば、標的ポリヌクレオチドの配列は、１つの位置で非改変体ヌクレオチドを、および他の位置で改変体ヌクレオチドを有するプローブのセットと標的が引き続きハイブリダイズすることを可能にすることによって決定される。Ｍａｃｅｖｉｃｚの方法は、標的とプローブのセットとをハイブリダイズすること、次いでそのセットの少なくとも１つのメンバーが標的にハイブリダイズし得る部位の数（すなわち、「マッチ」の数）を決定することによって標的のヌクレオチド配列を決定する。この手順は、プローブのあるセットの各々のメンバーが試験されるまで繰り返される。
【００９５】
Ｂｏｙｃｅ−Ｊａｃｉｎｏら、米国特許第６，２９４，３３６号では、ＳＮＰが標的に選択的に結合する最も３’側のヌクレオチドである部位でポリヌクレオチド標的に選択的に結合するプライマーを利用することによって、核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の配列を決定するための固相配列決定方法が得られる。
【００９６】
従って、上記の方法を用いて、アセチルサリチル酸応答関連のハプロタイプ対立遺伝子、またはアセチルサリチル酸応答関連ＳＮＰのヌクレオチド出現は、増幅反応、プライマー伸長反応、またはイムノアッセイを用いて特定できる。アセチルサリチル酸応答関連のハプロタイプ対立遺伝子、またはアセチルサリチル酸応答関連ＳＮＰのヌクレオチド出現はまた、結合対のメンバーがアセチルサリチル酸応答関連ＳＮＰにまたはその近くに特異的に結合する条件下で、サンプル中のポリヌクレオチドまたはサンプル由来のポリヌクレオチドと、アセチルサリチル酸応答関連ＳＮＰを含んでいるポリヌクレオチド領域に対して選択的にハイブリダイズする特異的な結合対のメンバーとを接触させることによって特定され得る。特異的な結合対のメンバーは、抗体であっても、またはポリヌクレオチドであってもよい。
【００９７】
本発明の方法で用いられる抗体としては、Ａｐｏ（ａ）遺伝子中の多型を包含するポリヌクレオチドに特異的に結合する抗体が挙げられる。さらに、抗体は、多型を含むコドンによってコードされるアミノ酸を含むポリペプチドに結合する。これらの抗体は、多型によって部分的にコードされるアミノ酸を含むポリペプチドに結合する。用いられ得る他の方法としては、例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのＩｎｆｉｎｉｕｍＩＩアッセイなどの抗体によって引き続き認識される改変ヌクレオチドを組み込む遺伝子型特定方法が挙げられる。
【００９８】
この抗体は、多型遺伝子座を含むコドンによってコードされる第一のアミノ酸を含むポリペプチドには特異的に結合するが、Ａｐｏ（ａ）遺伝子中の種々のヌクレオチドの出現を含むコドンによってコードされる第二のアミノ酸を含むポリペプチドには結合しないか、または結合が弱い。
【００９９】
抗体としては、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多価特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のうち任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。
【０１００】
抗体は、抗体フラグメントを包含し、これには、限定はしないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられる。側鎖抗体を含む、抗原結合抗体フラグメントは、単独で、または以下の全体または一部と組み合わせて可変領域（単数または複数）を含んでもよい：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。また、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとの可変領域（単数または複数）の任意の組み合わせも含む抗原結合フラグメントも含まれる。この抗体は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物由来であってもよい。好ましくは、この抗体は、ヒト、マウス（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、シップ ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリである。この抗体は、単価、二価、三価またはより大きい多価特異性の抗体であってもよい。
【０１０１】
この抗体は、当該分野で公知の任意の適切な方法によって生成してもよい。目的の抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野で周知の種々の手順によって生成され得る。例えば、本発明のポリペプチドは、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために、限定はしないがウサギ、マウス、ラットなどを含む種々の宿主動物に投与され得る。種々のアジュバントを用いて、その宿主の種に応じて、免疫学的応答を増大してもよく、アジュバントとしては、限定はしないが、フロイント（完全または不完全）、鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性剤、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが挙げられる。このようなアジュバントはまた、当該分野で周知である。
【０１０２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換えおよびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該分野で公知の広範な種々の技術を用いて調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、当該分野で公知であり、例えば以下で教示される技術を含むハイブリドーマ技術を用いて産生され得る；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，第２版．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）（この引用文献はその全体が参照によって本明細書に援用される）。本明細書において用いる場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通じて産生される抗体には限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを包含する単一クローン由来の抗体を指し、それを産生する方法ではない。
【０１０３】
全ての関連の表現型および遺伝子型の情報が得られた後、統計学的分析を行って、個体の表現型特徴を有する対立遺伝子または遺伝子型の存在の間になんらかの有意な相関があるか否かを確認する。対立遺伝子の頻度、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇの平衡統計学、およびＳＮＰの間の連鎖不均衡（ＬＤ）を計算することができる。次いで、ハプロタイプを、例えば、ＥＭアルゴリズムを用いて計算できる（Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ ａｎｄ Ｓｌａｔｋｉｎ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ．１９９５ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１２（Ｓ）：９２１−７）。頻度を推定するためにＥＭアプローチを用いないハプロタイプを推論するためには他の方法もある。これらの方法は、組み換えおよび合体（ｃｏａｌｅｓｃｅｎｔ）を含む、進化史の再構築に基づいており、例えば、プログラムＰＨＡＳＥ（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｎ．，ａｎｄ Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｐ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６８，９７８−９８９，２００１）に示される。連鎖不均衡係数などの種々のパラメーターに加えて、対立遺伝子頻度、カイ二乗統計学および他の集団遺伝学のパラメーター、例えば、完全交配係数は、症例とコントロール群との間の民族的、祖先の、または他の系統的なバリエーションについて制御するために計算できる。
【０１０４】
好ましくは、データの調査およびクリーニングは最初に、遺伝子関連について統計学的試験を行う前に行う。サンプルの疫学的および臨床的なデータは、表およびグラフを用いて記述統計学によってまとめることができる。好ましくはデータの確認を行って、データ完成、不整合エントリー、およびアウトライナーについてチェックする。次いで、カイ二乗検定およびｔ検定（分布が正常でない場合はＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）を用いて、それぞれ、分散および連続型変数について症例とコントロールとの間で有意な相違についてチェックしてもよい。遺伝子型決定の質を確認するために、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ不均衡試験を、症例とコントロールとで別々に行ってもよい。症例とコントロールとの両方におけるＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ不均衡（ＨＷＥ）由来の有意な偏差は個々のマーカーについて、遺伝子型決定の誤差の指標であり得る。ＨＷＥがほとんどのマーカーで破られている場合、これは、さらに検討されるべき集団構造の指標である。さらに、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ不均衡の場合のみ、マーカーと疾患との遺伝的関連が示され得る（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗｅｉｒ Ｂ．，Ｓｉｎａｕｅｒ（１９９０））。
【０１０５】
単一のＳＮＰの対立遺伝子が、表現型形質の症例またはコントロールの状態に関連しているか否かを試験するために、当業者は、症例とコントロールにおいて対立遺伝子頻度を比較し得る。標準的なカイ二乗検定およびフィッシャー正確検定を、２×２の表で行ってもよい（２つのＳＮＰ対立遺伝子×目的の分類形質中の２つの結果）。ＳＮＰの遺伝子型が関連するか否かを試験するために、カイ二乗検定を３×２の表で行ってもよい（３遺伝子型×２結果）。スコア検定も、遺伝子型関連性について行って、症例およびコントロールにおける３つの遺伝子型頻度（主要なホモ接合性、ヘテロ接合性、およびマイナーなホモ接合性）を対比し、かつ３つの異なる遺伝方式、すなわち、ドミナント（対比係数２、−１、−１）、アディティブ（対比係数１、０、−１）およびリセッシブ（対比係数１、１、−２）を用いて傾向について探す。マイナー対メジャーな対立遺伝子のオッズ比、ならびに野性型遺伝子型に対する異種接合性および同種接合性の改変体についてのオッズ比は、所望の信頼限界、通常は９５％で計算する。
【０１０６】
コントロールから症例のマトリックスを識別するための値を有する多型は、もしあれば、任意の関係を記載する数学形式で示され、関連性（試験および効果）統計学を伴う場合がある。少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％、最も好ましくは９５％の信頼区間、あるいは０．０５未満の非有意性の確率で、多型マーカーとアセチルサリチル酸応答との関係を示す統計分析結果を用いてもよい。
【０１０７】
さらなる局面では、本発明の診断方法を用いて、アセチルサリチル酸処理の薬理遺伝学を評価して、さらなる心血管系イベントのリスクを低下する。従って、Ａｐｏ（ａ）遺伝子の特定の対立遺伝子改変体を担持する個体は、アセチルサリチル酸処理などの異なる剤または治療に対して反応する能力が異なっている場合がある。これは、薬物治療に対する個体の応答に直接の影響を有し得る。本発明の診断方法は、アセチルサリチル酸処置に対する臨床的応答を予測するために、および治療用量を決定するために両方に有用であり得る。
【０１０８】
従って、本発明は、処置レジメンを選択または処方するための方法（例えば、アセチルサリチル酸の投与量および投与の頻度などの特定の処置レジメンを選択するための個々の方法に対してアセチルサリチル酸を投与するか否かを決定するか、またはアセチルサリチル酸治療に応答する可能性が少ないと予想される個体に対して別の抗血栓治療（すなわち、アセチルサリチル酸以外）を選択するための方法、ならびにアセチルサリチル酸治療から経験する毒性または他の所望されない副作用の確率を決定するための方法など）を提供する。本発明はまた、個体であって、アセチルサリチル酸治療または他の治療がその個体の遺伝子型に基づいて投与される個体を選択するための方法、ならびに個体の遺伝子型に基づいてアセチルサリチル酸治療または他の治療剤の臨床トライアルについて個体を選択する（例えば、アセチルサリチル酸治療に対して正に応答する可能性が最も高いトライアルに参加する個体を選択する）ための方法も提供する。
【０１０９】
本発明のＳＮＰはまた、新規な治療標的を特定するために用いられ得る。例えば、多型またはその産物を含む遺伝子、ならびにこれらの多型またはその産物で直接または間接的に調節されるか、またはそれと相互作用する遺伝子またはそれらの産物を、治療剤の開発のために標的してもよい。本発明の方法は、Ａｐｏ（ａ）遺伝子の１つ以上の改変体を選択的に標的する新規な薬物治療の開発で用いられる。特定の改変体と、疾患の発症に対する素因または薬物治療に対する応答との間の関係の特定は、新規薬物の設計に重要な影響を有し得る。薬物は、疾患プロセスに関与する改変体の生物学的活性を調節するために設計され得る。治療剤は、例えば、標的の遺伝子または遺伝子産物の機能またはレベルを調節する、低分子、タンパク質、タンパク質フラグメントまたはペプチド、抗体、核酸、またはそれらの誘導体もしくは模倣物から構成されてもよい。
【０１１０】
本発明の別の局面によれば、本発明の対立遺伝子特異的ヌクレオチドプローブ、および／または本発明の対立遺伝子特異的プライマーを含む診断キットが提供される。この診断キットは、本発明の方法における使用のための適切なパッケージおよび説明書を含み得る。このようなキットはさらに、適切な緩衝液（単数または複数）および熱安定性ポリメラーゼなどのポリメラーゼ（単数または複数）、例えばｔａｑポリメラーゼを含んでもよい。
【０１１１】
本発明の別の局面では、本発明の単一ヌクレオチド多型は、連鎖研究の遺伝子マーカーとして用いてもよい。これは特に、比較的高頻度の多型にあてはまる。低頻度の多型は特に、下記のようなハプロタイピイングに有用であり得る。ハプロタイプは、単一（父親または母親）の染色体上の多型部位（例えば、遺伝子内）に連鎖して見出される対立遺伝子のセットである。遺伝子内の組み換えがランダムである場合、２ｎ程度の多くのハプロタイプがある場合があり、ここで２は各々のＳＮＰの対立遺伝子の数であって、ｎはＳＮＰの数である。臨床応答に関係する変異または多型を特定するための１アプローチは、目的の集団中で特定され得る全てのハプロタイプを用いて関係性研究を行うことである。各々のハプロタイプの頻度は、その最もまれな対立遺伝子の頻度によって制限され、その結果対立遺伝子の頻度が低いＳＮＰは、低頻度ハプロタイプのマーカーとして特に有用である。特定の臨床特徴に関連する特定の変異または多型は、集団内で低頻度である可能性が高いので、低頻度ＳＮＰはこれらの変異を特定するのに特に有用であり得る。
【０１１２】
本発明の別の局面によれば、処置の方法が提供される。処置の方法は、ヒト被験体が、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でのシトシンまたはグアニンによって特徴づけられるＡｐｏ（ａ）多型を有することに基づいてこのヒト被験体を選択する工程と、この被験体がこの多型を有するせいで有害な心血管系イベントのリスクを低減するために、この被験体に対してアセチルサリチル酸またはアセチルサリチル酸以外の剤（例えば、抗血栓剤、例えば、チエノピリジンまたはチエノピリジン誘導体）の特定の用量を投与することを包含する。
【０１１３】
ヒト被験体の状態の好ましい決定は臨床的に有用である。臨床的な有用性の例としては、どの抗血栓薬物（単数または複数）を投与するかを決定すること、および／または薬物（単数または複数）の有効量を決定することを包含する。抗血栓剤の例は、上記される。
【０１１４】
本発明は、将来の心血管系イベントのリスクを低減するためのアセチルサリチル酸処置に対するヒト被験体の応答性を評価するための方法に関する。本発明の方法は、被験体のアセチルサリチル酸応答についての推論を単独でまたは組み合わせて可能にする、被験体のＡｐｏ（ａ）遺伝子の６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）位置でヌクレオチドの同一性を決定することに一部は基づく。アセチルサリチル酸応答は、心血管系の障害のリスクの低下である場合がある。そのようなものとして、本発明の組成物および方法はまた、例えば、アセチルサリチル酸処置に対して、またはアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤での処置に対して応答しやすいか、または応答する可能性が低い個体または患者を特定するために、有用である。本発明の組成物および方法は、個体または患者が、心血管系の障害のリスクを低減するためにアセチルサリチル酸またはアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤の用量の変化を要し得ることを予測または決定するのに有用である。
【０１１５】
本発明の別の局面によれば、あるアッセイが提供される。このアッセイは、Ａｐｏ（ａ）タンパク質（例えば、単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質）に対して、または染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でシトシンまたはグアニンを有する（Ａｐｏ（ａ））遺伝子によってコードされるＬｐ（ａ）に対して優先的に結合する剤についてスクリーニングする工程を包含する。
【０１１６】
本発明はまた、別のアッセイを提供する。このアッセイは、Ａｐｏ（ａ）タンパク質（例えば、単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質）に対して、または染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でチミンまたはアデニンを有する（Ａｐｏ（ａ））遺伝子によってコードされるＬｐ（ａ）に対して優先的に結合する剤についてスクリーニングする工程を包含する。
【０１１７】
このスクリーニングアッセイは、優先的に多型に結合する抗血栓剤のなかで選択するために用いられ得る。既存の抗血栓剤のバージョンを変更することまたは作製すること、続いて、このようなバージョンが本発明のスクリーニングアッセイ中の１つまたは別の多型を優先的に結合する相対能力を試験することを通じて、合理的な薬物設計を行ってもよい。同様に既存のまたは新規な薬剤の化学的ライブラリーをこのような結合についてスクリーニングしてもよい。
【０１１８】
当業者は、スクリーニングの方法にはなじみがある。スクリーニングアッセイは、ある剤がＬｐ（ａ）タンパク質に結合する能力を測定するアッセイを包含する。例えば、Ｌｐ（ａ）の多型に優先的に結合する剤をスクリーニングすることは、この剤とＬｐ（ａ）の多型とを接触させる工程と、Ｌｐ（ａ）の多型に対するこの剤の結合を決定する工程と、この剤の結合をこの多型を含まないＬｐ（ａ）の多型に対して比較する工程を包含し、ここでこの多型を含まないＬｐ（ａ）の多型に対するこの剤の結合に対して比較した、Ｌｐ（ａ）の多型に対するこの剤の結合の増大は、この剤がＬｐ（ａ）の多型における有効性が改善した抗血栓剤であることを示しており、ここでこの多型を含まないＬｐ（ａ）の多型に対するこの剤の結合に対して比較した、Ｌｐ（ａ）の多型に対するこの剤の結合の減少は、この剤がＬｐ（ａ）の多型における有効性が低下した抗血栓剤であることを示している。当業者は、この方法、ならびに限定はしないが、直接結合アッセイ、競合結合アッセイ、非競合結合アッセイ、機能的阻害アッセイ、ハイスループットスクリーニングアッセイなどを含む他のスクリーニング方法にはなじみがある。
【０１１９】
本発明は、以下の実施例を参照して例示されるが限定はされない。
【実施例】
【０１２０】
（実施例１）
リポタンパク質（ａ）［Ｌｐ（ａ）］は、コレステロールリッチの脂質と一緒に単一のアポリポタンパク質Ｂ−１００分子に対するジスルフィド結合を通じて共有結合された単一の（Ａｐｏ（ａ））分子からなる血漿画分である（１）。Ｌｐ（ａ）の生物学的画分は、未確認のままであるが（２、３）、高レベルのＬｐ（ａ）は、特にＬＤＬ−Ｃも上昇しているときは、心血管系（ＣＶ）のリスクの増大に関連している（４〜６）。Ｌｐ（ａ）のコレステロール保有の局面は、脂質ベースの生物学に対する関連の心血管系リスクに見当がかなり集中していた（７〜１１）。しかし、アポリポタンパク質（ａ）はまた、プラスミノーゲンに対して極めて相同性であって、アポリポタンパク質（ａ）中にタンパク質分解性活性が認識されないにもかかわらず、この相同性は、恒常性、血小板機能および血栓におけるＬｐ（ａ）の役割に対する心血管系のリスクの別の検討に集中していた（１２〜１８）。
【０１２１】
アポリポタンパク質（ａ）遺伝子座はなかでも、ヒトゲノム中で最も多型である。アポリポタンパク質（ａ）の遺伝子型改変体は、広範なＬｐ（ａ）値に関連しており、かつＬｐ（ａ）の遺伝力の多くを占める（１９〜２２）。Ｌｐ（ａ）値に影響する公知のバリエーションのほとんどが、タンパク質のアミノ末端に向かって位置するＫｒｉｎｇｌｅ（Ｋｒ）ＩＶ２型ドメインの３〜４０リピートの間の形態をとる（１、２３）。この高い程度のＫｒＩＶ２型の多型は、アポリポタンパク質（ａ）の単一のＫｒＶドメインを認識するアッセイ試薬の近年の開発まで、血漿Ｌｐ（値）を測定するための課題であって、Ｋｒ ＩＶ２型リピートとは交差反応しない（２４、２５）。Ｌｐ（ａ）値と関連している他のアポリポタンパク質（ａ）遺伝子改変体としては、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ならびに、挿入−欠失多型、とりわけ、プロモーター中の、ペンタヌクレオチド配列、ＴＴＴＴＡが挙げられる（２６〜２８）。さらに、アポリポタンパク質（ａ）遺伝子座の多型は、コピー数バリエーションを包含すると思われる（２９）。
【０１２２】
近年、ＳＮＰ ｒｓ３７９８２２０（アポリポタンパク質（ａ）のプラスミノーゲンプロテアーゼ様ドメイン中のイソロイシン〜メチオニン置換をコードする）は、Ｌｐ（ａ）値および一般的な心血管疾患の両方との関連の新規な候補として示唆されている（Ｌｕｋｅ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ（３０））。従って、この多型の遺伝子型は、低用量のアスピリンまたはプラシーボに無作為に割り当てられ、次に１０年以上にわたって心血管系イベントの発生について追跡されたウーマン・ヘルス・スタディ（Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｕｄｙ）（ＷＨＳ）の当初健康な女性で２６，２７４例のうちから確認された（３１）。この設定によって、プロスペクティブ評価の機会はＬｐ（ａ）値および血管のリスクに関連するｒｓ３７９８２２０だけでなく、アスピリンとリスクに対する遺伝子的影響との間の相互作用も利用可能である。研究参加者のほとんどはコーカサス人であったが、異なる生物地理的祖先を有する集団のなかでも他のアポリポタンパク質（ａ）改変体の以前の比較で見出されるとおり、ｒｓ３７９８２２０とＬｐ（ａ）値との間の関連に対する集団特異的な影響に取り組むには、非コーカサス人の参加者の数も十分であった（３２〜３６）。
【０１２３】
ＷＨＳにおける２５，０３８例のコーカサス人参加者のうち、アポリポタンパク質（ａ）遺伝子におけるｒｓ３７９８２２０のマイナーな対立遺伝子は、１．９％というマイナー対立遺伝子頻度について、９０４（３．６％）ヘテロ接合性および１５（０．０６％）ホモ接合性で担われた。これらの遺伝子型は、ヘテロ接合性のわずかな欠損およびマイナー対立遺伝子の過剰なホモ接合性に起因して、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡から境界線の偏差を示す（ｐ＝０．０４８）。年齢、ＢＭＩ、喫煙率、ホルモン補充療法の使用、および閉経状態、ならびに高血圧および糖尿病の頻度は、３つの遺伝子型クラスの間で異なることはなかった（表１）。しかし、マイナーな対立遺伝子のヘテロ接合性（７９．３ｍｇ／ｄＬ）およびホモ接合性のキャリアにおける中央Ｌｐ（ａ）値（１５３．９ｍｇ／ｄＬ）は、非キャリアのＬｐ（ａ）値よりもそれぞれ８倍および１５倍高かった（１０．０ｍｇ／ｄＬ，ｐ＜＜０．００１）（表１、図１Ａ、Ｂ）。この効果は、Ｌｐ（ａ）値について調整した後の有意性の排除によって判定した場合、関連の血漿画分の総コレステロール、ＬＣＬ−Ｃ、およびアポリポタンパク質Ｂのそれほどではないが有意な上昇の背景にあると考えられた。他の血漿バイオマーカー（炎症のマーカーおよび他の脂質画分を含む）はｒｓ３７９８２２０遺伝子型には関連しなかった。マイナーな対立遺伝子のヘテロ接合性とホモ接合性のキャリアとを合わせた分析で、非キャリアでの臨床特徴と比較して、本質的に同一の結果が見出された（データ示さず）。
【０１２４】
コーカサス人のヘテロ接合性の間のＬｐ（ａ）値の分布は非キャリアの間でそれとは全く異なっており、完全に二峰性のパターンを有し、これによってこの小集団を、２７．９ｍｇ／ｄＬより大きい（中央値９２．４ｍｇ／ｄＬ、Ｎ＝６２７）Ｌｐ（ａ）を有する第１群および２７．９ｍｇ／ｄＬ未満（中央値５．０ｍｇ／ｄＬ、Ｎ＝２６０）を有する第２群に層別化することが可能になった（図１Ａ〜Ｃ）。マイナーな対立遺伝子の全てのホモ接合性キャリアは、２７．９ｍｇ／ｄＬより大きいＬｐ（ａ）を有するが、Ｌｐ（ａ）分布の経常を評価するためにはこの群の個体は少なすぎた（図１Ｂ）。ｒｓ３７９８２２０ヘテロ接合性の間のＬｐ（ａ）の二峰性の分布は、コーカサス人ＷＨＳ女性での頻度と同様で、ｒｓ３７９８２２０のマイナーな対立遺伝子の頻度が１．８％であったフィジシィアンズ・ヘルス・スタディ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｕｄｙ）（ＰＨＳ）のコーカサス人男性１０５８例の第二の無関係の集団で確認された（図１Ｄ）。
【０１２５】
コーカサス人ヘテロ接合性の間のＬｐ（ａ）値の二峰性の性質は、標準的な臨床特徴では説明できない。例えば、年齢、ＢＭＩ、喫煙、糖尿病、閉経状態、高血圧、心疾患の家族歴、またはホルモン補充療法の使用に関して低または高いＬｐ（ａ）を有するコーカサス人ヘテロ接合性女性の比較においては有意な相違は無かった。同様に、ＨＤＬ−Ｃ、アポリポタンパク質Ａ１、トリグリセリド、Ｃ反応性タンパク質、可溶性ＩＣＡＭ−Ｉ、フィブリノーゲン、クレアチニン、ホモシステイン、およびＨｂＡ１ｃは全て、ヘテロ接合性の２つの小集団中で比較可能であって、メジャーな対立遺伝子についてのホモ接合性の間のレベルと同様であった。さらに、米国にまたがる全体の地理的な割り当てでは、二峰性のＬｐ（ａ）値の地域的な基礎は示唆されなかった。ＬＤＬ−Ｃ、総コレステロール、およびアポリポタンパク質Ｂの値は、低Ｌｐ（ａ）を有するヘテロ接合性に比べて高Ｌｐ（ａ）を有するヘテロ接合性では有意に上昇していた（中央値：ＬＤＬ−Ｃ，１３０．５ｍｇ／ｄＬ，対１２２．５ｍｇ／ｄＬ；総コレステロール，２１９．０ｍｇ／ｄＬ対２１０．４ｍｇ／ｄＬ；アポリポタンパク質Ｂ，１０９．９ｍｇ／ｄＬ対１０３．１ｍｇ／ｄＬ；全てｐ＜０．０１）、しかし相違は、ここでも、Ｌｐ（ａ）で調整後は有意ではなかった。従って、ヘテロ接合性全体のなかで観察されるこれらの脂質のより高い値は、Ｌｐ（ａ）中の増大によって説明され得る。二峰性の分布は、コーカサス人のヘテロ接合性ＷＨＳ参加者の間で、これらの脂質のいずれでも観察されなかった。
【０１２６】
１０年の追跡期間の間、総ＣＶＤ複合エンドポイント初のイベントのうち８２５例を集団として経験した２４，３２０例のコーカサス人の研究参加者のうち将来の血管イベントのリスクにおいて、ヘテロ接合性におけるｒｓ３７９８２２０のマイナー対立遺伝子の単一のコピーによって、約５０％の増大がもたらされた（表２；年齢調整したＨＲ １．５０、９５％ＣＩ：１．０９〜２．０５、ｐ＝０．０１２）。全体的な低発現率と一致してマイナー対立遺伝子の１５のホモ接合性キャリアのうちイベントの発生したものはなく、従って、これらの２〜３個の個体は将来の疾患事象のリスクの分析から排除した。ｒｓ３７９８２２０の効果の大きさは、ＭＩ、虚血性発作および血管再生の特定のエンドポイントと同様であった。従って、主な血管イベント（非致死性ＭＩ、非致死性虚血性発作、および心血管系の死）のさらに臨床的に関連するエンドポイントについては、年齢調整した危険率は１．５８であった（９５％ＣＩ：１．０７−２．３３，ｐ＝０．０２１）。これらの効果は、伝統的な心血管系の危険因子について調整後も統計学的に有意なままであって、その結果、総血管イベントについての完全調節した危険率は、１．５０（１．０７−２．１０，ｐ＝０．００９）で、メジャーな血管イベントについて完全調整した危険率は１．５４（ＣＩ：１．０１−２．３５，ｐ＝０．０４３）であった。ヘテロ接合性の間のリスクの増大のほぼすべてが、Ｌｐ（ａ）値が上昇したものに限定された（表２）。例えば、メジャーな心血管系イベントについては、高Ｌｐ（ａ）［１．７８（ＣＩ：１．２６−２．５１，ｐ＝０．００１）］を有するヘテロ接合性について年齢調整した危険率が大きく、かつ全てのヘテロ接合性についてよりも有意であったが、低Ｌｐ（ａ）［０．８４（ＣＩ：０．８４−１．７７，ｐ＝０．６５）］を有するヘテロ接合性についての危険率は少なく、非キャリアの間でリスクが統計学的に異なる（表２）。
【０１２７】
ｒｓ３７９８２２０のコーカサス人のヘテロ接合性の間の心血管系イベント発生のリスクの増大は、低用量アスピリン処置への割り当てではほとんど打ち消された（図２）。特に、ヘテロ接合性の間では、アスピリンに対するランダムな割り当ては、メジャーな血管系イベントの相対リスクの５９％低下を伴っていた（９５％ＣＩ：０．８１−０．１０，ｐ＝０．０２５）が、アスピリンに対する非キャリアのランダムな割り当てのなかでは、有意な影響を有さなかった（相対リスク低下９％、９５％ＣＩ：０．０２３〜−０．０９，ｐ＝０．３１）（図２Ａ）。正式には、アスピリンおよび遺伝子型の相互作用は、有意であった（ｐ＝０．０５、年齢調整したモデル）。遺伝子型の亜群のなかでアスピリンの種々の効果も、ＭＩおよび虚血性発作（急性プラーク破壊および閉塞性血栓に関連する臨床イベント）のエンドポイントについて観察された。従って、アスピリンなしのヘテロ接合性の正味の遺伝子効果は、主要な血管イベント発生の組み合わせ（年齢調整したＨＲ ２．１９，９５％ ＣＩ：１．３９−３．４６，ｐ＝０．０００７）、ならびに別々に心筋梗塞（年齢調整したＨＲ ２．４３，９５％ ＣＩ：１．２３−４．８０，ｐ＝０．０１）および虚血性発作（年齢調整したＨＲ ２．４１，９５％ ＣＩ：１．２６−４．５９，ｐ＝０．００８）については全体的リスクのほぼ２倍であった（図２Ａ〜Ｃ）。しかし、アスピリンの効果は、冠血管再生のエンドポイントについては減弱された（急性閉塞なしの背景にある疾患進行を伴う臨床イベント；相対リスク低下３６％、９５％ＣＩ：０．８９〜−０．４４，ｐ＝０．２８）。
【０１２８】
ｒｓ３７９８２２０遺伝子型を有するアスピリンの相互作用は、一般にはアスピリンとＬｐ（ａ）値の上昇との同様の相互作用に一部は関連すると考えられる。ｒｓ３７９８２２０のマイナーな対立遺伝子のコーカサス人の非キャリアのなかで、アスピリンは９０パーセンタイルを超えるＬｐ（ａ）値（６５．１ｍｇ／ｄＬ）を有するもののうち血管イベントの相対リスクを低下したが、９０パーセンタイル未満のＬｐ（ａ）値を有するもののなかでは最小効果が観察された（図２Ｄ）。血管再生エンドポイントについては、Ｌｐ（ａ）値が９０パーセンタイルを超えるコーカサス人のなかのアスピリン効果（相対リスク低下３９％、９５％ＣＩ：０．６４−０．０５、ｐ＝０．０３）は、コーカサス人のヘテロ接合性のうちアスピリン効果に対する大きさに匹敵した。
【０１２９】
ｒｓ３７９８２２０のマイナー対立遺伝子の有病率はＷＨＳの中でコーカサス人（ＭＡＦ＝１．９％）と非コーカサス人との間で顕著に異なった。詳細には、ｒｓ３７９８２２０でのバリエーションは、自己特定したアフリカ系アメリカ人の中ではほとんど存在しなかった（ＭＡＦ＝０．５％）。対照的に、マイナーな対立遺伝子は、アジア系アメリカ人（ＭＡＦ＝７．６％）、ヒスパニック（ＭＡＦ＝１５．１％）、およびネイティブアメリカン（ＭＡＦ＝９．１％）についてコーカサス人の間よりも優勢であった（表３）。アフリカ系アメリカ人と、ヒスパニック、アジア系アメリカ人またはネイティブアメリカンの間、およびヒスパニックとアジア人との間で相違していたので、コーカサス人に比較して対立遺伝子頻度の相違は、全て有意であった。ＨａｐＭａｐの遺伝子型決定プロジェクトで、マイナーな対立遺伝子がアジア人（ＣＨＢ＋ＪＰＴ，ＭＡＦ＝５．６％）では検出されたが、コーカサス人（ＣＥＵ）またはアフリカ人（ＹＲＩ）（３７）では検出されなかった。ＨａｐＭａｐアジア人の間の頻度は、ＷＨＳのアジア系アメリカ人小集団での頻度と有意に異なることはなかった（ｐ＝０．５９）。コーカサス人の間では、種々の程度の混合物に潜在的に関連する対立遺伝子頻度の局所的な相違は、米国にまたがる全体的な地理学的分類では検出できなかった。コーカサス人での知見とは対照的に、Ｌｐ（ａ）のレベルは、ＷＨＳのアジア系アメリカ人またはヒスパニックの小集団（その両方ともＬｐ（ａ）分布を評価するために十分な数の参加者を有した）のヘテロ接合性において上昇もしておらず、二峰性でもなかった。同様に、これらの集団中でｒｓ３７９８２２０とＣＶＤの発生との間に関連があるとは考えられなかったが、力は限られていた。
【０１３０】
米国の初期の健康な女性でのこの大規模研究においては、アポリポタンパク質（ａ）遺伝子（３０）中のｒｓ３７９８２２０多型のマイナーな対立遺伝子のコーカサス人キャリアは、Ｌｐ（ａ）のレベルが大きく増大しており、同様に、主要な血管系イベントのリスクが倍であった。しかし、低用量アスピリンに無作為に割り当てられたヘテロ接合性の間では、将来の血管系イベントのリスクの増大は、効率的に無効にされた（相対的リスク低下、アスピリン５９％、ｐ＝０．０２５）。非キャリアのなかでも、対照的に、アスピリン治療から利益があるという証拠は最小であった（相対リスク低下は、アスピリン９％、ｐ＝０．３１）。アスピリンの抗血栓活性の状況では、この薬理学的結果は、以前に示唆されているように、プラスミノーゲンプロテアーゼ様ドメインまたはＫｒドメインのリジン結合機能をおそらく通じた、血栓におけるＬｐ（ａ）の直接の役割と一致している（１３、３８）。ｒｓ３７９８２２０と心筋梗塞および発作との関連に対するアスピリンの効果が冠血管再生に対するその影響よりも大きいという知見によって、アスピリンと特定のアポリポタンパク質（ａ）対立遺伝子由来のＬｐ（ａ）との間の相互作用が急性のプラーク破壊および疾患進行よりも血管閉塞により関係し得るという興味深い可能性が高まる。ｒｓ３７９８２２０の遺伝薬理学的効果がまた、アスピリンによるアポリポタンパク質（ａ）発現の潜在的な対立遺伝子依存性の減少に関与するか否かは未知のままである（３９、４０）。さらに、それらのデータによって、血管系疾患の予防および処置におけるアスピリンまたはチエノピリジンなどのアスピリン代替物の議論の余地のある選択に関する論点である、アスピリン治療からの利益が大きいかまたは少ない小集団を規定するための直接の遺伝子方法が得られる（３１、４１、４２）。
【０１３１】
ｒｓ３７９８２２０によってコードされる非同義置換とＬｐ（ａ）のレベルおよび心血管系のリスクとの間の複雑な関係の分子的基礎は、さらなる解明を要する。詳細には、Ｌｐ（ａ）のレベルおよび分布に対する遺伝子効果によって、アミノ酸置換によって授けられる内因性の生物学的活性に関連する効果（これもＬｐ（ａ）の上昇に直接寄与する場合がある）から、Ｌｐ（ａ）値の増大に単に関するリスクおよびアスピリン応答に対する効果を識別することが困難になる。同様に、ｒｓ３７９８２２０とハプロタイプとの間の関係は、アポリポタンパク質（ａ）遺伝子座では明らかではなく、ただし、例えば、普通でない数の２型ＫｒｉｎｇｌｅＩＶドメインを有するコーカサス人でのアポリポタンパク質（ａ）遺伝子座の高発現対立遺伝子に対する連鎖に関与し得る（４３，４４）。この仮説によってさらに、特にｒｓ３７９８２２０が異なる値のＬｐ（ａ）を指向する２つ以上のハプロタイプに関連する場合、Ｌｐ（ａ）分布の二峰性パターンが説明され得る。
【０１３２】
対立遺伝子頻度分析は、アジア人でのｒｓ３７９８２２０の少なくとも１つの起源と一致しているが、コーカサス人でのこの改変体の存在には取り組まない。コーカサス人でのｒｓ３７８９２２０の頻度がそれほどでもないこと、および米国にまたがるその分布に明確な地域的バイアスがないことを考慮すれば、アジア系アメリカ人集団との混合は、説明しにくいと考えられる。しかし、非アフリカ人集団に対してプライベートなほとんどのバリエーションは、正の選択でなく確率過程を通じて生じている場合があり（４５）、ｒｓ３７９８２２０とＬｐ（ａ）値との関連は、コーカサス人および他の非アフリカ人集団におけるその有意に異なる頻度と組み合わせて、選択およびドリフトの両方が、その生物地理学的分布を担う場合がある可能性を上昇させる。これらのプロセスの両方が、アポリポタンパク質（ａ）遺伝子座での高レベルの集団特異的遺伝子バリエーションおよび発現、ならびにＬｐ（ａ）機能についての推測と一致している（３）。
【０１３３】
Ｌｐ（ａ）の生物学的特性についての手掛かりを得ることは別にして、ｒｓ３７９８２２０とＬｐ（ａ）値、心血管系のリスク、およびアスピリン処置の効果の関係は、一般的な複雑な疾患を理解するのにおける遺伝子的アプローチの可能性を示す。これに関しては、この結果によって、遺伝子バリエーションに起因するＣＶＤリスクの特定のタイプを管理するための薬理学的ストラテジーだけでなく、遺伝子ベースのオーダーメード医療を通じた可能な最高の予測を伴って保健医療管理のより広範な望みが得られる。
【０１３４】
引用文献
【０１３５】
【化４】
【０１３６】
【化５】
【０１３７】
【化６】
【０１３８】
材料および方法
研究集団：１０年間にわたって追跡した、登録時に少なくとも４５歳の最初は健康な女性の間で行った、心血管系疾患の一次予防におけるアスピリン（隔日で経口１００ｍｇ）およびプラシーボの無作為トライアルである、ウーマンズ・ヘルス・スタディ（Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｕｄｙ）（ＷＨＳ）由来の一次研究集団（１，２）。登録時、参加者は、ベースラインの臨床および人口学的情報を得た。２８，３４５例のＷＨＳ参加者が血漿および遺伝子分析のために血液を供給した。これらのサンプルのなかで、Ｈｉｔａｃｈｉ ９１７アナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＤ．）上で、Ｋｒ ＩＶ２型リピートの数に影響されない濁度検定で、ベースラインのＬｐ（ａ）値を測定した（３）。他の脂質画分、炎症バイオマーカーおよび他の血漿成分のベースラインの測定は、以前に記載されている（４）。追跡期間の間に調整した心血管系イベントの総発生には、プラーク破裂および血管閉塞、例えば、心筋梗塞（ＭＩ）、虚血性発作および心血管系死に代表的に関連するもの、ならびに経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）または冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）による血管再生として規定される、背景にあるアテローム性動脈硬化症の進行に代表的には関係するものを包含した。主な心血管系イベントの発生は、心筋梗塞、虚血性発作または心血管系死として規定された。さらに、ｒｓ３７９８２２０と血漿Ｌｐ（ａ）値との間の関係は、フィジシャンズ・ヘルス・スタディ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｕｄｙ）（ＰＨＳ）に関与していた１０５８例のコーカサス人男性の独立した群で評価した（５）。これらのＰＨＳ参加者のうち、Ｌｐ（ａ）値は、標準的な臨床ＥＬＩＳＡベースの方法を用いて決定した（６）。
【０１３９】
遺伝子型決定：ＷＨＳ参加者におけるｒｓ３７９８２２０の遺伝子型は、３ｎｇのゲノムＤＮＡ由来の標的配列のＰＣＲ増幅と、引き続く対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド連結とを組み合わせたオリゴヌクレオチド連結手順によって決定した（７）。次いで、２つの対立遺伝子の連結産物をハイブリダイゼーションによって分離して、別々に異なるＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００ＴＭ×ＭＡＰマイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に各々がカップリングされた特定のオリゴヌクレオチドを生成した。捕獲された産物をストレプトアビジンＲ−フィコエリトリン（Ｐｒｏｚｙｍｅ，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）で蛍光標識して、マイクロスフェアスペクトルに基づいてソートして、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００ＴＭ装置によって検出した（８）。ＰＨＳ中のｒｓ３７９８２２０の遺伝子型は、記載どおり（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ），蛍光ベースの、対立遺伝子特異的、リアルタイムＤＮＡ増幅方法で決定した（９）。それぞれＷＨＳおよびＰＨＳ集団については、首尾よい遺伝子型決定のサンプルの画分は、９６．３％および９７．８％であった。遺伝子型決定のためのＤＮＡサンプルの女性２７，２８９例のうち、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型、Ｌｐ（ａ）値、年齢および心血管系イベント発生頻度の完全確認は２５，４３６で利用可能であった。これらのうち、２４，３２０がコーカサス人、４６８例がアフリカ系アメリカ人、２８２例がアジア系アメリカ人、２６２例がヒスパニック、６２例がネイティブアメリカン、および４２例が祖先不明であった。
【０１４０】
統計学的方法：Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡からの偏差は、対数尤度比検定を用いて評価した。３つの遺伝子型クラスの間の臨床的共分散の相違は、正規分布した特徴についてのＡＮＯＶＡ手順によって、非正規分布した特徴についてクラスカル−ワリス検定によって、および分類別特性についての割合のカイ二乗検定によって評価した。同様に、異なる生物地理的祖先の集団の対の間の対立遺伝子頻度に相違の有意差は、カイ二乗検定で決定した。Ｌｐ（ａ）値におけるおよびｒｓ３７９８２２０対立遺伝子のマイナー対立遺伝子頻度における地理学的バイアスの分析のためには、登録時の住居の位置を米国の北部、南部、中西部、南西部、山地および西端の地域に相当する６つの群のうちの１つに分類した。Ｌｐ（ａ）のレベルまたは対立遺伝子頻度を説明するのにおけるこれらの割り当ての有意差は、ロジスティック回帰またはカイ二乗分析で決定した。ｒｓ３７９８２２０とＣＶＤの発生のリスクとの間の関連の予測的評価は、年齢または伝統的なリスク共分散について調整したＣｏｘ比例ハザードモデルで行った（年齢、血圧、糖尿病歴、喫煙状態、心筋梗塞の家族歴、ＬＤＬ−ＣおよびＨＤＬ−Ｃ）。報告された全ての分析では、Ｃｏｘモデルの比例の仮説は、拒絶できなかった（ｐ＞０．０５）。アスピリン処置に関連するリスクの相違は、Ｃｏｘモデルでの相互作用項を含むことによって、またはアスピリンもしくはプラシーボに対するその割り当てに従って、参加者を層別化する分析によって決定した。
【０１４１】
コーカサス人のｒｓ３７９８２２０ヘテロ接合性の間のＬｐ（ａ）のレベルの検討によって、明確な二峰性分布が明らかになった。１つのサブグループは、マイナーな対立遺伝子の非キャリアでも観察される近似的対数正規分布の低いＬｐ（ａ）値を有したが、他のサブグループは、近似的な正規分布の高いＬｐ（ａ）値を有した。従って、それらの参加者は、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムを有するＬｐ（ａ）にフィットした、独立した対数正規分布［低Ｌｐ（ａ）について］および正規分布［高Ｌｐ（ａ）について］の混合物として観察された二峰性の分布をモデリングすることによって低または高Ｌｐ（ａ）サブグループに分類された（１０）。ＥＭアルゴリズムにおける０．５という責任値に相当する２７．９ｍｇ／ｄＬのＬｐ（ａ）値を用いて、低Ｌｐ（ａ）群から高Ｌｐ（ａ）群を識別した。この２分布モデルでの分類は、８８７例のうち８０６例の割り当て（９１％）が少なくとも９５％の確実性である責任値を有するという点で本質的に明白であった。
【０１４２】
材料および方法の引用文献：
【０１４３】
【化７】
【０１４４】
【表１】
【０１４５】
【表２】
【０１４６】
【表３】
【０１４７】
（実施例２）
欧州人−アメリカ人、アジア人−アメリカ人およびヒスパニック系アメリカ人におけるｒｓ３７９８２２０を有するＬＤ中のＳＮＰバリエーションを決定するためのＷＨＳサンプル中のＬＰＡ遺伝子座およびその近位の４０個の追加のＳＮＰの遺伝子型決定
本発明者らは、ｒｓ３７９８２２０遺伝子型および自己報告された祖先（欧州人−アメリカ人（すなわち、白人またはコーカサス人）、アジア人−アメリカ人、またはヒスパニック系アメリカ人）の両方に基づいて選択したＷＨＳ由来のサンプルのサブセット中のＬＰＡ（アポリポタンパク質（ａ）の遺伝子）および近隣の遺伝子座で４０個の追加のＳＮＰを遺伝子型決定した。次いで、本発明者らは、これらの新規なＳＮＰとｒｓ３７８２２０との間の連鎖不均衡（ＬＤ）を推定した。サンプルはランダムに選択したのではなく、ｒｓ３７８９２２０に基づいて選択したので、本発明者らは、サンプルから直接対立遺伝子頻度およびＬＤを簡単に見積もることはできず、ｒｓ３７９２２０に基づくサンプリングストラテジーを考慮して観察された遺伝子型と予想される遺伝子型との間の相違を最小にすることによって対立遺伝子頻度およびＬＤを推測しなければならなかった。その結果は下に示した：
１）２つのＳＮＰ（ｒｓ９４５７９３１ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ（染色体６：１６０８４９８９４ ＮＣＢＩビルド１２８での単一ヌクレオチド多型）およびｒｓ９４５７９２７ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ（染色体６：１６０８３０２７２ ＮＣＢＩビルド１２８での単一ヌクレオチド多型））はＷＨＳコーカサス人（欧州人−アメリカ人）のうちｒｓ３７９８２２０を有するほぼ完全なＬＤにあった。両方のＳＮＰが隣接するＬＰＡＬ２遺伝子にある（リポタンパク質，Ｌｐ（ａ）−様２前駆体遺伝子、アポリポタンパク質（ａ）の遺伝子に隣接）；
２）他のＳＮＰは、ＬＤ〜ｒｓ３７９８２２０の範囲を有する；ならびに
３）非欧州人の小集団に極めて異なるＬＤのパターンがある。本発明者らは、これらの結果を解釈して、実施例１で本発明者が記載した効果が３つ全てのＳＮＰ（ｒｓ３７９８２２０、ｒｓ９４５７９３１、ｒｓ９４５７９２７）を担持する対立遺伝子に関係するということを示唆する。
（実施例３）
別個の祖先を有するダラス・ハート・スタディ（Ｄａｌｌａｓ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙ）由来の３つのサブグループ中のｒｓ３７９８２２０遺伝子型、Ｋｒｉｎｇｌｅ ＩＶ２型リピートの数およびＬｐ（ａ）発現の間の関係。
【０１４８】
本発明者らは、血漿Ｌｐ（ａ）のアポリポタンパク質（ａ）成分（すなわち、発現されたアポ（ａ）タンパク質）中のＫｒ ＩＶ、２型リピート（ＫｒＩＶ２ｒ’ｓ）の数が以前に決定されている（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００５；１１１：１４７１−１４７９）ダラス・ハート・スタディ（ＤＨＳ）（Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ９３，Ｉｓｓｕｅ １２，１５ Ｊｕｎ．２００４，１４７３〜１４８０頁）中で遺伝子型決定されたｒｓ３７９８２２０を有した（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００５；１１１：１４７１〜１４７９）。この集団は、男性および女性の両方を、非ヒスパニック白人（欧州人祖先）、黒人（アフリカ人祖先）およびヒスパニック交えて、全部で３５２９例のサンプルを包含した。この分析は、ｒｓ３７９８２２０のマイナー対立遺伝子と、発現されたＫｒＩＶ２ｒの数との間の対応を、できるだけ祖先に依存して特定しようとしていた。この分析は、２つの方法で分析を行った。まず初めに、全ての個体を考慮して、各々の個体のＫｒＩＶ２ｒ対立遺伝子を（ＤＮＡレベルで）、発現された対立遺伝子に対して（タンパク質レベルで）等価であると仮定した。すなわち、１つのＫｒＩＶ２ｒのみを発現した個体は、ＬＰＡ遺伝子座でその対立遺伝子の２つのコピーを有すると仮定した（３５２９個体）。２番目に、本発明者らは、分析から、発現された唯一のＫｒＩＶ２ｒ対立遺伝子を有する６６８例を除いて、２つの明らかに別個のＫｒＩＶ２ｒ対立遺伝子（全部で２８５９）を有する個体のみを考慮した。その結果は両方に極めて類似であった。すなわち、１）非ヒスパニック白人のうち、ｒｓ３７９８２２０のマイナー対立遺伝子は、１７ＫｒＩＶ２ｒリピートと強力に相関しており、１６または１８リピートに対してはそれより程度が劣った（ただし１６、１７および１８リピートの間の相違は、ＫｒＩＶ２ｒ数についてのアッセイの解に関連し得る）（図３）；２）非ヒスパニック白人のうち、少数のＫｒＩＶ２ｒを有する対立遺伝子は一般に、高レベルのＬｐ（ａ）を発現する（図４）；３）１７のＫｒＩＶ２ｒを発現する非ヒスパニックの白人は、高レベルのＬｐ（ａ）を有し、さらに、また、ｒｓ３７９８２２０のマイナーな対立遺伝子の１コピーを担持する個体は、有意に十分高いレベルのＬｐ（ａ）を有する（１１頁、下の右側）（図５）；および４）ＫｒＩＶ２ｒ’の分布、発現レベルとのそれらの関係、およびｒｓ３７９８２２０とのそれらの関係は、異なる祖先群で異なっており、その結果ｒｓ３７９８２２０および非ヒスパニック白人で観察されるＬｐ（ａ）の過度の値の相関は、他の祖先の群では観察されない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
将来の心血管系イベントのリスクを減らすためのアセチルサリチル酸処理に対するヒト被験体の応答性を評価するための方法であって：
ヒト被験体のアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置で単一ヌクレオチド多型の同一性を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
染色体６：１６０８８０８７７の位置のシトシンまたはグアニンによって特徴付けられる多型の存在が、アセチルサリチル酸に対する応答性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体由来の血液サンプル中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルを決定する工程をさらに包含する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が、血中でＬｐ（ａ）のレベルが上昇している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約１０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約１５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約２０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約２５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
染色体６：１６０８８０８７７の位置のチミンまたはアデニンによって特徴付けられる多型の存在が、アセチルサリチル酸に対する非応答性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記心血管系イベントが、心筋梗塞、発作、急性冠症候群、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、血管形成術、一過性虚血性発作、肺塞栓症、血管閉塞または静脈血栓症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多型の同一性が、前記被験体から得た核酸と、核酸プローブとを接触することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記多型の同一性が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、サイズ分析、または一本鎖高次構造多型によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多型の同一性が、前記被験体から得られた核酸を配列決定することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
アッセイであって、
ある薬剤と、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でヌクレオチドのシトシンまたはグアニンを有する（Ａｐｏ（ａ））遺伝子によってコードされるアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））タンパク質とを接触させる工程と、
該単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に、またはリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））に対する該薬剤の結合を評価する工程と、
コントロールに対する結合を比較する工程と、
を包含する、アッセイ。
【請求項１５】
アッセイであって、
ある薬剤と、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でヌクレオチドのチミンまたはアデニンを有するアポリポタンパク質（ａ）遺伝子によってコードされるＡｐｏ（ａ）タンパク質とを接触させる工程と、
該単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に対する該薬剤の結合を評価する工程と、
コントロールに対する該結合を比較する工程と、
を包含する、アッセイ。
【請求項１６】
前記コントロールが、前記単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に対する、Ｌｐ（ａ）に対するもしくは血小板に対するアセチルサリチル酸の結合の測定、または血小板とのアセチルサリチル酸の相互作用の測定を含む、請求項１４または１５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１７】
ヒト被験体が染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でシトシンまたはグアニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型を有することに基づいて、該ヒト被験体を選択する工程と、
該被験体が多型を有する理由で、将来の心血管系イベントのリスクを低減するために該被験体に対してアセチルサリチル酸を投与する工程と、
を包含する、処置の方法。
【請求項１８】
前記ヒト被験体がまた、血中でリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルが上昇している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが、前記被験体由来の血液サンプル中で約１０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが、前記被験体由来の血液サンプル中で約１５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが、前記被験体由来の血液サンプル中で約２０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが、前記被験体由来の血液サンプル中で約２５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記心血管系イベントが、心筋梗塞、発作、急性冠症候群、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、血管形成術、一過性虚血性発作、肺塞栓症、血管閉塞または静脈血栓症である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト被験体が染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でチミンまたはアデニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型を有することに基づいて該ヒト被験体を選択する工程と、
該被験体が多型を有する理由で、将来の心血管系イベントのリスクを低減するために該被験体に対して抗血小板剤またはアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤を投与する工程と、
を包含する、処置の方法。
【請求項２５】
前記抗血栓剤がチエノピリジンまたはチエノピリジン誘導体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記チエノピリジンまたはチエノピリジン誘導体が、クロピドグレル、クロピドグレル重硫酸塩、チクロピジン、プラスグレル（ＣＳ−７４７またはＬＹ６４０３１５）、ＳＲ２５９８９、またはＰＣＲ４０９９である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗血栓剤が、セノキサパリンナトリウム、キメラガトラン、アブシキシマブまたはチロフィバンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
将来の心血管系イベントのリスクを低減するための、アセチルサリチル酸処理に対するヒト被験体の応答を評価するための方法であって、
該ヒト被験体のアポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置で単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と連鎖するかまたは連鎖不平衡にある遺伝子マーカーの有無を検出する工程、を包含する方法。
【請求項２９】
前記遺伝子マーカーが、対立遺伝子、ＳＮＰ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、または単純配列リピート（ＳＳＲ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子マーカーが、染色体６：１６０８４９８９４（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９３１ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子マーカーが、染色体６：１６０８３０２７２（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９２７ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記連鎖が、Ｋｒｉｎｇｌｅ（Ｋｒ）ＩＶ２型ドメインの１６、１７または１８リピートの間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記染色体６：１６０８８０８７７の位置のシトシンまたはグアニンによって特徴付けられる多型の存在が、アセチルサリチル酸に対する応答性を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記染色体６：１６０８８０８７７の位置のチミンまたはアデニンによって特徴付けられる多型の存在が、アセチルサリチル酸に対する非応答性を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体由来の血液サンプル中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルを決定する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記心血管系イベントが、心筋梗塞、発作、急性冠症候群、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、血管形成術、一過性虚血性発作、肺塞栓症、血管閉塞または静脈血栓症である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
処置の方法であって：
ヒト被験体が、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でシトシンまたはグアニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型と連鎖するか、または連鎖不均衡である遺伝子マーカーを有することに基づいて、該被験体を選択する工程と、
該被験体が該多型を有する理由で、将来の心血管系イベントのリスクを低減するために該被験体に対してアセチルサリチル酸を投与する工程と、
を包含する、方法。
【請求項３８】
処置の方法であって：
ヒト被験体が、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でチミンまたはアデニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型と連鎖するかまたは連鎖不平衡にある遺伝子マーカーを有することに基づいて、該被験体を選択する工程と、
該被験体が該多型を有する理由で、将来の心血管系イベントのリスクを低減するために該被験体に対してアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤を投与する工程と、
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記遺伝子マーカーが、対立遺伝子、ＳＮＰ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、または単純配列リピート（ＳＳＲ）である、請求項３７または３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヒト被験体がまた、血液中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の上昇したレベルを有する、請求項３７または３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記心血管系イベントが、心筋梗塞、発作、急性冠症候群、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、血管形成術、一過性虚血性発作、肺塞栓症、血管閉塞または静脈血栓症である、請求項３７または３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
将来の心血管系イベントのヒト被験体のリスクを評価するための方法であって：
該ヒト被験体のアポリポタンパク質（ａ）遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置の単一ヌクレオチド多型の同一性を決定する工程と、
該ヒト被験体由来の血液サンプル中でリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルを決定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項４３】
前記染色体６：１６０８８０８７７の位置のシトシンまたはグアニンによって特徴付けられる多型の存在、および前記被験体由来の血液サンプル中のＬｐ（ａ）のレベルの上昇の存在は、該被験体が将来の心血管系イベントのリスク増大にあることを示している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約１０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約１５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約２０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約２５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記心血管系イベントが、心筋梗塞、発作、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、肺塞栓症、または静脈血栓症である、請求項４２に記載の方法。
【請求項１】
将来の心血管系イベントのリスクを減らすためのアセチルサリチル酸処理に対するヒト被験体の応答性を評価するための方法であって：
ヒト被験体のアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置で単一ヌクレオチド多型の同一性を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
染色体６：１６０８８０８７７の位置のシトシンまたはグアニンによって特徴付けられる多型の存在が、アセチルサリチル酸に対する応答性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体由来の血液サンプル中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルを決定する工程をさらに包含する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が、血中でＬｐ（ａ）のレベルが上昇している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約１０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約１５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約２０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約２５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
染色体６：１６０８８０８７７の位置のチミンまたはアデニンによって特徴付けられる多型の存在が、アセチルサリチル酸に対する非応答性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記心血管系イベントが、心筋梗塞、発作、急性冠症候群、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、血管形成術、一過性虚血性発作、肺塞栓症、血管閉塞または静脈血栓症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多型の同一性が、前記被験体から得た核酸と、核酸プローブとを接触することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記多型の同一性が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーション、対立遺伝子特異的プライマー伸長、対立遺伝子特異的増幅、５’ヌクレアーゼ消化、分子ビーコンアッセイ、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、サイズ分析、または一本鎖高次構造多型によって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多型の同一性が、前記被験体から得られた核酸を配列決定することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
アッセイであって、
ある薬剤と、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でヌクレオチドのシトシンまたはグアニンを有する（Ａｐｏ（ａ））遺伝子によってコードされるアポリポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））タンパク質とを接触させる工程と、
該単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に、またはリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））に対する該薬剤の結合を評価する工程と、
コントロールに対する結合を比較する工程と、
を包含する、アッセイ。
【請求項１５】
アッセイであって、
ある薬剤と、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でヌクレオチドのチミンまたはアデニンを有するアポリポタンパク質（ａ）遺伝子によってコードされるＡｐｏ（ａ）タンパク質とを接触させる工程と、
該単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に対する該薬剤の結合を評価する工程と、
コントロールに対する該結合を比較する工程と、
を包含する、アッセイ。
【請求項１６】
前記コントロールが、前記単離されたＡｐｏ（ａ）タンパク質に対する、Ｌｐ（ａ）に対するもしくは血小板に対するアセチルサリチル酸の結合の測定、または血小板とのアセチルサリチル酸の相互作用の測定を含む、請求項１４または１５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１７】
ヒト被験体が染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でシトシンまたはグアニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型を有することに基づいて、該ヒト被験体を選択する工程と、
該被験体が多型を有する理由で、将来の心血管系イベントのリスクを低減するために該被験体に対してアセチルサリチル酸を投与する工程と、
を包含する、処置の方法。
【請求項１８】
前記ヒト被験体がまた、血中でリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルが上昇している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが、前記被験体由来の血液サンプル中で約１０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが、前記被験体由来の血液サンプル中で約１５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが、前記被験体由来の血液サンプル中で約２０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが、前記被験体由来の血液サンプル中で約２５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記心血管系イベントが、心筋梗塞、発作、急性冠症候群、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、血管形成術、一過性虚血性発作、肺塞栓症、血管閉塞または静脈血栓症である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト被験体が染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でチミンまたはアデニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型を有することに基づいて該ヒト被験体を選択する工程と、
該被験体が多型を有する理由で、将来の心血管系イベントのリスクを低減するために該被験体に対して抗血小板剤またはアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤を投与する工程と、
を包含する、処置の方法。
【請求項２５】
前記抗血栓剤がチエノピリジンまたはチエノピリジン誘導体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記チエノピリジンまたはチエノピリジン誘導体が、クロピドグレル、クロピドグレル重硫酸塩、チクロピジン、プラスグレル（ＣＳ−７４７またはＬＹ６４０３１５）、ＳＲ２５９８９、またはＰＣＲ４０９９である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗血栓剤が、セノキサパリンナトリウム、キメラガトラン、アブシキシマブまたはチロフィバンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
将来の心血管系イベントのリスクを低減するための、アセチルサリチル酸処理に対するヒト被験体の応答を評価するための方法であって、
該ヒト被験体のアポタンパク質（ａ）（Ａｐｏ（ａ））遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置で単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と連鎖するかまたは連鎖不平衡にある遺伝子マーカーの有無を検出する工程、を包含する方法。
【請求項２９】
前記遺伝子マーカーが、対立遺伝子、ＳＮＰ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、または単純配列リピート（ＳＳＲ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子マーカーが、染色体６：１６０８４９８９４（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９３１ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子マーカーが、染色体６：１６０８３０２７２（ＮＣＢＩビルド１２８；ｒｓ９４５７９２７ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置でＳＮＰである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記連鎖が、Ｋｒｉｎｇｌｅ（Ｋｒ）ＩＶ２型ドメインの１６、１７または１８リピートの間である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記染色体６：１６０８８０８７７の位置のシトシンまたはグアニンによって特徴付けられる多型の存在が、アセチルサリチル酸に対する応答性を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記染色体６：１６０８８０８７７の位置のチミンまたはアデニンによって特徴付けられる多型の存在が、アセチルサリチル酸に対する非応答性を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験体由来の血液サンプル中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルを決定する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記心血管系イベントが、心筋梗塞、発作、急性冠症候群、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、血管形成術、一過性虚血性発作、肺塞栓症、血管閉塞または静脈血栓症である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
処置の方法であって：
ヒト被験体が、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でシトシンまたはグアニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型と連鎖するか、または連鎖不均衡である遺伝子マーカーを有することに基づいて、該被験体を選択する工程と、
該被験体が該多型を有する理由で、将来の心血管系イベントのリスクを低減するために該被験体に対してアセチルサリチル酸を投与する工程と、
を包含する、方法。
【請求項３８】
処置の方法であって：
ヒト被験体が、染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）でチミンまたはアデニンによって特徴付けられるＡｐｏ（ａ）多型と連鎖するかまたは連鎖不平衡にある遺伝子マーカーを有することに基づいて、該被験体を選択する工程と、
該被験体が該多型を有する理由で、将来の心血管系イベントのリスクを低減するために該被験体に対してアセチルサリチル酸以外の抗血栓剤を投与する工程と、
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記遺伝子マーカーが、対立遺伝子、ＳＮＰ、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、または単純配列リピート（ＳＳＲ）である、請求項３７または３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ヒト被験体がまた、血液中のリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の上昇したレベルを有する、請求項３７または３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記心血管系イベントが、心筋梗塞、発作、急性冠症候群、心筋虚血、慢性安定狭心症、不安定狭心症、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、血管形成術、一過性虚血性発作、肺塞栓症、血管閉塞または静脈血栓症である、請求項３７または３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
将来の心血管系イベントのヒト被験体のリスクを評価するための方法であって：
該ヒト被験体のアポリポタンパク質（ａ）遺伝子の染色体６：１６０８８０８７７（２００６年３月アセンブリ−ＮＣＢＩビルド３６．１；ｒｓ３７９８２２０ ｄｂＳＮＰ＠ＮＣＢＩ）の位置の単一ヌクレオチド多型の同一性を決定する工程と、
該ヒト被験体由来の血液サンプル中でリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のレベルを決定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項４３】
前記染色体６：１６０８８０８７７の位置のシトシンまたはグアニンによって特徴付けられる多型の存在、および前記被験体由来の血液サンプル中のＬｐ（ａ）のレベルの上昇の存在は、該被験体が将来の心血管系イベントのリスク増大にあることを示している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約１０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約１５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約２０ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
Ｌｐ（ａ）の前記レベルが前記被験体由来の前記血液サンプル中で約２５ｍｇ／ｄｌ以上である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記心血管系イベントが、心筋梗塞、発作、心血管系死亡、冠動脈再狭窄、冠ステント再狭窄、冠ステント再血栓症、血管再生、肺塞栓症、または静脈血栓症である、請求項４２に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図２Ｃ】
【図２Ｄ】
【図３−１】
【図３−２】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１０−５２８２６２（Ｐ２０１０−５２８２６２Ａ）
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０７４７５（Ｐ２０１０−５０７４７５）
【出願日】平成２０年５月９日（２００８．５．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００５９８６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４０７７６
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０４４１２９４５）ザ ブライハム アンド ウイメンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (54)
【出願人】（５０９３０８０３４）アプレラ コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月９日（２００８．５．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００５９８６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４０７７６
【国際公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【出願人】（５０４４１２９４５）ザ ブライハム アンド ウイメンズ ホスピタル， インコーポレイテッド (54)
【出願人】（５０９３０８０３４）アプレラ コーポレイション (1)
【Ｆターム（参考）】
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