ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）拮抗性ポリペプチド
以下のアミノ酸配列：Ｚ1‐ＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬ‐Ｚ2（ＡＬＢ‐４０８）を有するペプチド、ならびに、その生物学的活性断片、および／または変異体、および／または誘導体、特にアミド化、アセチル化、硫酸化、リン酸化、および／もしくはグリコシル化誘導体、ならびに、多重合成によって得ることができるＡＬＢ４０８‐４２３の生物学的活性を有するペプチドであって、Ｚは０〜１０の数のアミノ酸残基を表す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ‐１等のＣＸＣＲ４依存性ウイルスの感染を阻害し、ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合によって媒介される腫瘍細胞遊走を阻害するＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）拮抗性ポリペプチド（タンパク質）及びヒト循環抗ウイルスアルブミン断片（Ｈｕｍａｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｌｂｕｍｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ）（ＡＬＢ４０８‐４２３）、ならびに治療および診断におけるその使用に関する。本発明は、ＡＬＢ４０８‐４２３の天然の形態、ならびにそれから得られた断片および／または類似体もしくは誘導体、ならびに、最後に、薬効の指標として用いられるおよび診断薬として用いられる、該天然の、組換えの、および合成のペプチドを含有する薬剤を含む。さらに、本発明は、特に好ましい治療効果を有するＡＬＢ４０８‐４２３の修飾された形態および誘導体を含む。さらに、本発明は、ＡＬＢ４０８‐４２３またはその断片および／もしくは誘導体の一つへハイブリダイズする核酸プローブ、ならびにＡＬＢ４０８‐４２３またはその断片および／もしくは誘導体の一つに対して指向された抗体、またはアンタゴニストを含み、診断または治療目的、特にウイルス性疾患における、ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２感染の治療、さらには癌細胞の転移を防ぐための新生物疾患の治療、または喘息、肺線維症、もしくは関節リウマチ等の慢性炎症性疾患の治療のためのものである。
【背景技術】
【０００２】
ケモカイン受容体は、特定の細胞の表面上で発現され、ケモカインと称されるサイトカインと相互作用を起こす。ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）は、その内在性リガンドであるケモカインＣＸＣＬ１２（ストロマ細胞由来因子‐１、ＳＤＦ‐１）のシグナルを伝達するＧタンパク質共役受容体である。ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２の相互作用に続いて、細胞内カルシウム（Ｃａ2+）イオンの流入が誘発される。これが、細胞の生物内での移動を可能とする化学遊走を含む細胞反応を引き起こす。ＣＸＣＲ４は、ミエロイド細胞、Ｔ‐リンパ球、Ｂ‐リンパ球、上皮細胞、内皮細胞および樹状細胞上で発現される。ケモカインＣＸＣＬ１２は、ＣＸＣＲ４の唯一の既知のアゴニスト性リガンドである。ＣＸＣＬ１２とＣＸＣＲ４との相互作用は、心血管系、造血系、または中枢神経系の胚発生中の前駆細胞遊走において極めて重要な役割を担っている。この相互作用は、ＨＩＶ感染／ＡＩＤＳ、癌細胞転移、白血病細胞の進行、肺線維症、および関節リウマチ等のいくつかの疾患に関与していることも知られている。この相互作用は、これらの疾患すべてに対する決定的な治療標的であり得ると推察される。ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２シグナル伝達を阻害する物質は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療を例とする薬剤としての可能性を有するか、または、癌転移、白血病、および肺線維症、関節リウマチ、もしくは喘息等の炎症性疾患に関与する細胞遊走プロセスを阻止すると推察される（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）。細胞反応を誘発するＣＸＣＬ１２等の受容体アゴニストとは対照的に、受容体アンタゴニストは、その受容体と結合した際に、生物反応、すなわち、細胞遊走またはＣａ2+シグナル伝達、を誘発しないリガンドまたは薬剤である。受容体アンタゴニストは、ＨＩＶ‐１感染の阻害（ＣＣＲ５アンタゴニスト）またはアゴニストが媒介する細胞反応の低減が可能である有用な薬剤として既に臨床的に使用されている（例：アンジオテンシンアンタゴニスト、β‐アドレナリンアンタゴニスト、セロトニンアンタゴニスト、またはＣＣＲ５アンタゴニスト）。受容体アンタゴニストと受容体との相互作用により、アゴニストの機能が阻害される。ほとんどの薬剤アンタゴニストは、受容体上の構造的に決定される結合部位において内在性のリガンドまたは基質と競合することにより、その効力を発揮する。
【０００３】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストが癌細胞遊走を阻害し、従って転移を阻害することは、インビトロおよびインビボにてすでに示されている。ＣＸＣＲ４は、種々の細胞（ミエロイド細胞、Ｔ‐リンパ球、Ｂ‐リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、および樹状細胞）の表面上、ならびに異なる２３種類の癌細胞にて発現される。ＣＸＣＬ１２‐ＣＸＣＲ４相互作用は、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、肺癌、および膵臓癌、ならびにメラノーマ、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、および悪性脳腫瘍を含むいくつかの種類の癌の転移に関与している（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）。Ｔ１４０類似体等のＣＸＣＲ４アンタゴニストが、ＣＸＣＬ１２によって誘発される膵臓細胞遊走および浸潤、または乳癌細胞遊走をインビトロおよびインビボにて抑制することが示されている（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）。ＣＸＣＲ４アンタゴニストが、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の浸潤および接着をインビトロにて効果的に抑制することも実証されており（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）、ＣＸＣＬ１２‐ＣＸＣＲ４相互作用がＳＣＬＣ転移に関与していることが確認される。ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２相互作用は、前駆Ｂ（プレ‐Ｂ）急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ。ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレ‐Ｂ ＡＬＬ細胞の遊走も低下させる）の発症にも関与している（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）。さらに、関節リウマチが、ＣＸＣＲ４を発現するＣＤ４＋メモリーＴ細胞の炎症滑膜への蓄積によって引き起こされることが示されている。関節リウマチ患者では滑膜中のＣＸＣＬ１２濃度が非常に上昇しており、これがメモリーＴ細胞を誘引する。ＣＸＣＲ４拮抗性分子は、メモリーＴ細胞の滑膜への遊走を阻害する（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）。
【０００４】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、アゴニストＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を阻害するだけでなく、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０とＣＸＣＲ４との相互作用も阻止し、それによってウイルスの感染を阻害する。ヒト免疫不全ウイルス１および２（ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２）は、細胞表面に発現されたＣＤ４を一次受容体として用い、ケモカイン受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４を細胞移入のための共受容体として用いる。ＣＤ４およびＣＸＣＲ４を介して細胞に感染するウイルスは、ＣＸＣＲ４（Ｘ４）向性、ＣＤ４およびＣＣＲ５を用いるＨＩＶ‐１変異体は、Ｒ５向性、ならびに両方の共受容体を用いることができるウイルスは、二重向性（ｄｕａｌｔｒｏｐｉｃ）、と称される。Ｘ４向性ＨＩＶ‐１変異体は、全ＡＩＤＳ患者の約５０％で見ることができるに過ぎないが、Ｒ５向性ＨＩＶ変異体は、ＨＩＶ‐１感染の初期ステージおよび無症状ステージにおいて支配的である。Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染は、インビトロおよびＨＩＶ‐１に感染したヒトにおいて、細胞または患者をＡＭＤ３１００等のＣＸＣＲ４アンタゴニストで処理、治療することによって阻害可能であることが示されている。興味深いことに、ＣＣＲ５アンタゴニストであるマラビロクは、Ｒ５向性ＨＩＶ‐１変異体の感染を阻害する、ＡＩＤＳ治療において最初に臨床認可された薬剤である（Ｔｓｉｂｒｉｓ ａｎｄ Ｋｕｒｉｔｚｋｅｓ， ２００７， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５８：４４５‐４５９、にてレビューされている）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、癌と関連する病状、および喘息または肺線維症等の慢性炎症性疾患の治療に対する魅力的な治療標的である。ＣＸＣＬ１２が媒介する細胞反応を阻害するＣＸＣＲ４アンタゴニストは、疾患の発症および進行におけるこれらの重要な経路を阻害し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下のアミノ酸配列：
Ｚ1‐ＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬ‐Ｚ2（ＡＬＢ‐４０８）
を有するペプチド、ならびに、その生物学的活性誘導体、特にアミド化、アセチル化、硫酸化、リン酸化、および／もしくはグリコシル化誘導体、ならびに、多重合成によって得ることができるＡＬＢ４０８‐４２３の生物活性を有するペプチド、に関し；
ここで、Ｚは、０〜１０の数のアミノ酸残基を表す。
【０００７】
本発明のペプチドは、本発明のペプチド、特に本発明のＡＬＢ４０８‐４２３ペプチドにおいて、その配列中の単一もしくは複数のアミノ酸残基が、置換、欠失、もしくは付加されているか、または、本発明のペプチド、特にＡＬＢ４０８‐４２３、の単一のアミノ酸上に化学修飾が導入されており、本発明のペプチド、特にＡＬＢ４０８‐４２３、と類似もしくは同一の生物活性または薬理活性を有しているものとも関連している。特に、疎水性アミノ酸に対して疎水性アミノ酸、または芳香族アミノ酸に対して他の芳香族アミノ酸、または塩基性アミノ酸に対して他の塩基性アミノ酸を置換すること、等を意味する保存的なやり方で配列のアミノ酸を置換することによって容易に得ることができるペプチドが関係する。これは当業者に周知である。
【０００８】
本発明のペプチドのレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ‐ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチド、ならびにペプチダーゼに対してペプチド結合を安定化させるその他の誘導体も、本発明の範囲内である。
【０００９】
誘導体という用語は、Ｎ末端およびＣ末端切断などのあらゆる長さの断片、ＡＬＢ４０８‐４２３においてＤ‐アミノ酸残基や修飾アミノ酸残基も含めたアミノ酸残基の置換を有するもの、およびジスルフィド結合や、Ｎ末端やＣ末端での伸長を有するペプチド、を意味する。
【００１０】
本発明の別の主題は、本発明のペプチド、特にＡＬＢ４０８‐４２３および／またはその誘導体をコードするポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＰＮＡから構成されることを特徴とする。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞内での組換えペプチド発現、変異誘発試験、対象とするベクター内、特に遺伝子導入の手法に用いることができるベクター内でのクローン化、に用いられる。
【００１１】
本発明のさらなる主題は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をコードするベクターは、原核細胞または真核細胞内での組換えペプチド発現、変異誘発試験、および、特に、真核細胞へのＡＬＢ４０８‐４２３遺伝子導入に用いられる。
【００１２】
本発明の別の主題は、本発明のベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞である。遺伝子操作された、ＡＬＢ４０８‐４２３または関連する誘導体を発現するトランスジェニック細胞を遺伝子治療の手法に用いることができ、それによって、ＡＬＢ４０８‐４２３および関連する誘導体を、ＣＸＣＲ４アンタゴニストを必要とする個体内、特に癌およびＡＩＤＳ患者内で発現および分泌させることが可能となる。
【００１３】
本発明のさらに別の主題は、本発明のポリペプチドに対する抗体である。このような抗体は、血液、血清、血漿等の身体サンプル中のＡＬＢ４０８‐４２３および関連するペプチドを、診断目的で、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または免疫蛍光にて検出するのに有用である。
【００１４】
本発明のペプチドは、本発明のペプチド、特にＡＬＢ４０８‐４２３を必要とする患者を治療するための方法において、投与することができる。
【００１５】
本発明のさらなる主題は、本発明のペプチドのアンタゴニスト／阻害剤の治療量を投与することによって、ＡＬＢ４０８‐４２３の阻害を必要とする患者を治療するための方法である。ＡＬＢ４０８‐４２３およびその誘導体は、ＣＸＣＲ４アンタゴニストであり、ＨＩＶ感染／ＡＩＤＳ、癌細胞転移、白血病細胞の進行、肺線維症、および関節リウマチ等のいくつかの疾患、ならびにその他の癌および炎症性疾患の治療を可能とする。
【００１６】
本発明のポリペプチドから成るガレノス製剤（ｇａｌｅｎｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）も、本発明の主題である。
【００１７】
本発明によると、本発明のペプチドをコードするＤＮＡの投与および患者内でのインビボでのその発現によってポリペプチドの治療効果が達成される、患者を治療するための方法も提供される。
【００１８】
本発明のペプチドは、カチオン交換抽出による血液ろ過液からの抽出、ならびにそれに続く吸着物質の溶離、ペプチドを含有する抽出物の再度のカチオン交換クロマトグラフィ、および分画逆相クロマトグラフィを含むプロセスによって提供することができる。
【００１９】
あるいは、本発明のペプチドを製造するためのプロセスは、メリフィールド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）による固相合成、または、保護アミノ酸を用い、それ自体が当業者に公知の方法による液相合成、およびその精製によって実施することができる。
【００２０】
本発明のペプチドを製造するためのさらなるプロセスは、一般的な生物工学的ベクターを用いる、当業者に公知の異種発現の方法を用いる。
【００２１】
本発明のさらなる主題は、本発明のポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を含有する、または本発明のペプチド、特にＡＬＢ４０８‐４２３、をコードする核酸もしくはｍＲＮＡを含有する診断薬である。
【００２２】
本発明の診断薬は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを含有し、組織、血漿、尿、および脳脊髄液等のサンプル中のこの物質のレベルを分析するための試験システムに用いるためのものである。
【００２３】
特に、診断薬および本発明のペプチドを検出する試験システムは、組織、血漿、尿、および脳脊髄液のこの物質のレベルを、ＲＰ‐ＨＰＬＣ、タンパク質沈殿、および／または固相抽出によるサンプル調製と組み合わせた、ＭＡＬＤＩ‐ＭＳまたはＥＳＩ‐ＭＳ等の質量分析法によって分析するために用いられる。
【００２４】
本発明の主題は、さらに、ウイルス性疾患、細菌および真菌感染、炎症および新生物形成プロセスに対するマーカーとして、ならびに炎症プロセス、撹乱された炎症反応（ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、腫瘍性疾患、成長障害、免疫系の疾患におけるマーカーとして、ならびに骨疾患におけるマーカーとして、本発明のペプチドを含有する診断薬である。
【００２５】
本発明は、さらに、経口、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、くも膜下腔内投与のためのガレノス剤形（ｇａｌｅｎｉｃ ｆｏｒｍ）の活性成分として、および経肺投与のためのエアロゾルとして、本発明のペプチドを含有する薬剤も提供する。
【００２６】
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、抗体／アンタゴニスト、およびガレノス製剤は、ウイルス性疾患、特にＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス（１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、エプスタイン‐バーウイルス、の治療、ならびに細菌および真菌感染、炎症プロセス、撹乱された炎症反応、腫瘍性疾患、成長障害、神経疾患、凝血および造血の疾患、血管疾患、免疫系の疾患の治療、ならびに創傷および骨の治癒、のために用いることができる。
【００２７】
ＡＬＢ４０８‐４２３を具体例として用いて、本発明をさらに詳細に説明する。以下の説明において、同様にＡＬＢ４０８‐４２３を本発明のペプチドに置き換えることが可能であることは容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａ〜図１Ｆは、ヒト血液ろ過液からのＡＬＢ４０８‐４２３の単離の詳細を示す図である。
【図２】画分３１を含有するＡＬＢ４０８‐４２３が、ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３感染を阻害することを示す図である。
【図３】化学的に合成されたＡＬＢ４０８‐４２３が、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染を特異的に阻害することを示す図である。
【図４】ＡＬＢ４０８‐４２３が、Ｘ４向性レンチウイルス感染を阻害することを示す図である。
【図５】ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性を示す図である。
【図６】ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性を示す図である。
【図７】ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性を示す図である。
【図８】ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性を示す図である。
【図９】ＡＬＢ誘導体の細胞毒性アッセイを示す図である。
【図１０】ＡＬＢ４０８‐４２３および切断型ＡＬＢ誘導体が、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染を特異的に阻害することを示す図である。
【図１１】ＡＬＢ４０８‐４２３および誘導体が、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のＸ４向性ＨＩＶ‐１感染を阻害することを示す図である。
【図１２】ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を阻害することを示す図である。
【図１３】ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ１のいずれのアゴニストでもないことを示す図である。
【図１４】ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＲ４を発現する細胞内において、ＣＸＣＬ１２が誘発するＣａ2+動員を特異的に阻害することを示す図である。
【図１５】ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ１２が介するＣＸＣＲ４の内在化を阻害することを示す図である。
【図１６】ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ‐１２が介するジャーカットＴ細胞の遊走を用量依存的に阻害することを示す図である。
【図１７】ＡＬＢ誘導体のＣＸＣＲ４アンタゴニスト活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
ＡＬＢ４０８‐４２３は、驚くべきことに、クロマトグラフィ法および生物学的アッセイにより、ヒト血液ろ過液から単離することができた。本発明のペプチドの生化学的特徴付けは、アミノ酸の完全な配列分析を含む質量分析によって行った。
【００３０】
このペプチドは、以下の配列番号８のアミノ酸配列：ＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬを有する。
【００３１】
本発明のペプチドＡＬＢ４０８‐４２３の分子量は１８３０．２Ｄａである。
【００３２】
本発明のペプチドＡＬＢ４０８‐４２３の等電点（ｐＩ）は、１０．３である。
【００３３】
驚くべきことに、本発明のペプチドは、そのプロセッシングされた形態で５８５個のアミノ酸から成る既知のヒト血漿タンパク質血清アルブミン（アクセス番号ＮＰ０００４６８）の１６個のアミノ酸を含む断片である。ヒトアルブミンは、分子量約６５，０００の可溶性単量体血清タンパク質であり、全血漿タンパク質の半分超を占める（濃度：３．５〜５ｇ／ｄｌ）。ヒトアルブミンの機能は、主として、例えばステロイドおよびペプチドホルモン、脂肪酸、ビタミン、薬剤、ならびにカチオンといったあらゆる種類の疎水性ならびに親水性物質のための担体分子としてのものであると説明される。その非常に高い血清中濃度のために、血液ｐＨの安定化、細胞外液体積、およびコロイド浸透圧の維持に実質的に寄与している。アルブミンは、多数のジスルフィド架橋によって安定化された球状構造を有しており、通常はグリコシル化されていないが、分子の老化に従い、または病態生理学的変化の際に、アセチル化、酵素的グリコシル化、および非酵素的グリコシル化による変化が発生する場合が多い。これは、６０９個のアミノ酸を有するプレプロアルブミン（ｐｒｅ‐ｐｒｏ‐ａｌｂｕｍｉｎ）として肝臓で合成され；１８個のアミノ酸を含むＮ‐末端シグナルペプチドが、小胞体への進入の際に細胞内で切断され；別の６個のアミノ酸がゴルジ体内で除去された後、５８５個のアミノ酸を含む成熟アルブミンが肝細胞によって分泌される。アルブミンのクリアランスは腎臓、消化管を通して、および肝臓の組織細胞内で行われる。
【００３４】
本発明のＡＬＢ４０８‐４２３のペプチド配列は、アミノ酸４０８から開始し、従って、循環形態のアルブミンのアミノ酸４０８〜４２３を含む。これは明らかに、対応するプロテアーゼによるアルブミン前駆体の天然のプロセッシングによって産生される。
【００３５】
驚くべきことに、本発明のペプチドは、ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）に対するアンタゴニストであり、ヒト細胞内でのＨＩＶ‐１の感染および複製の抑制、ならびに細胞遊走、Ｃａ2+動員、またはＣＸＣＲ４内在化等のＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４が誘発する細胞反応の抑制を引き起こす。
【００３６】
本発明のペプチドは、ヒト血液ろ過液（ＨＦ）からのクロマトグラフィによる精製によって得ることができる。ＨＦは、腎臓患者の血液の限外ろ過から大量に得られる（実施例１）。ＨＦは、ヒト血液中を循環する分子量３０ｋＤａ未満のすべてのペプチドおよびタンパク質を含有している。ＨＦ中のペプチドおよびタンパク質は、カチオン交換クロマトグラフィを用いて抽出した。カラムに結合したペプチドおよびタンパク質は種々のｐＨ値のバッファー系で溶離し、溶離液を逆相クロマトグラフィに掛けた（実施例１）。ＨＩＶ‐１感染を阻害する画分を同定するために、ペプチド画分をＰＢＳ中へ溶解し、ＨＩＶ許容性指標細胞（ＨＩＶ ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）へ添加した。次に、細胞をＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ‐１に感染させ、感染後３日目（ｄｐｉ）の感染率を測定した（実施例１）。１つの画分が強力な抗ＨＩＶ活性を示し、これを、クロマトグラフィ精製およびＨＩＶ阻害アッセイのさらなるラウンドに掛け、生物活性ペプチドの同定を目指した（実施例１）。４ラウンドの精製の後、活性画分３１の質量分析から、分子量１８３０Ｄａの単一のペプチドの存在が明らかとなった（実施例２）。配列分析からＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬが同定され、配列比較から、アミノ酸残基４０８‐４２３（ＡＬＢ４０８‐４２３）を包含する、非常に豊富である血清タンパク質「ヒト血清アルブミン；（ＡＬＢ）」との１００％の相同性が示された（実施例２）。化学的に合成されたペプチド（実施例３）がＸ４向性ＨＩＶ‐１感染を用量依存的に阻害することから、活性の証拠が実証された（実施例４）。指標細胞内にて、ＡＬＢ４０８‐４２３は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１変異体を特異的に阻害するが、Ｒ５向性ＨＩＶ‐１感染には影響を与えない（実施例４および５）。ＡＬＢ４０８‐４２３は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐２の感染も抑制した（実施例５）。抗ウイルス活性に対して極めて重要である残基の同定を目的とした構造活性相関研究（ＳＡＲ）から得られたデータを実施例６にまとめるが、これより、ＡＬＢ４０８‐４２３のＮ末端の完全性がその抗ウイルス活性に対して重要であることが示される。対照的に、最大６アミノ酸残基までのＣ末端の切断では抗ウイルス活性が抑止されることはなかった。ＳＡＲ研究により、野生型ＡＬＢ４０８‐４２３と比較して抗ウイルス活性の上昇を示すＡＬＢ４０８‐４１９またはＡＬＢ Ｌ４０８Ｉ‐４１９等のＡＬＢ４０８‐４２３誘導体を同定することもできた（実施例６）。ＡＬＢ誘導体のいずれも細胞毒性を示さない（実施例７）。指標細胞内（実施例８）または一次血液単核細胞内（実施例９）にて、ＡＬＢ４０８‐４２３、ＡＬＢ４０８‐４１９、およびＡＬＢ Ｌ４０８Ｉ‐４１９は、種々のＸ４向性ＨＩＶ‐１変異体の感染は用量依存的に阻害したが、Ｒ５向性ＨＩＶ‐１変異体の感染は阻害しなかった。これらのデータはすべて、ＡＬＢ４０８‐４２３またはその誘導体とＨＩＶ共受容体ＣＸＣＲ４との特異的な相互作用を示している。
【００３７】
蛍光に基づく技術を用いて、ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＲ４と直接結合してこれと相互作用を起こし、それによって天然のＣＸＣＲ４アゴニストであるＣＸＣＬ１２の結合を阻止することを実証することができた（実施例１０〜１２）。ＡＬＢ４０８‐４２３またはその誘導体単独では、ＣＸＣＲ４、またはＣＣＲ５およびＣＸＣＲ１等のその他のケモカイン受容体を介したＣａ2+動員を誘発せず、このことは、ＡＬＢ４０８‐４２３が定義に従うＣＸＣＲ４アンタゴニストであることを示している（実施例１０〜１２および１４）。ＡＬＢ４０８‐４２３の存在下にて、ＣＸＣＬ１２が介する細胞遊走（実施例１３）、およびＣＸＣＲ４受容体の内在化も阻害することができ、このことから、ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＲ４アンタゴニストであることのさらなる証拠が提供される（実施例１２）。まとめると、ヒト血清アルブミン断片であるＡＬＢ４０８‐４２３は、ＨＩＶ‐１感染阻害アッセイを用い、ＨＦ由来のペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定された。化学合成されたペプチドおよびその誘導体は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２感染を、ＣＸＣＲ４受容体との直接の相互作用によって用量依存的に阻害する。ＡＬＢ４０８‐４２３およびその誘導体は、細胞応答を媒介せず、天然のＣＸＣＲ４アゴニストであるＣＸＣＬ１２の活性を抑制することから、アンタゴニストとして作用する。これらのデータは、ＡＬＢ４０８‐４２３が最初のヒトＣＸＣＲ４アンタゴニストであることの証拠である。ＡＬＢ４０８‐４２３およびその誘導体は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１に感染した個体の治療において、癌転移の予防、ならびにＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２シグナル伝達が関与する慢性炎症性疾患への干渉、およびＣＸＣＬ１２が介するＣＸＣＲ４を通してのシグナル伝達の抑制に有用であり得る。
【００３８】
本発明のペプチド、ならびにそのペプチドの類似体、断片、および誘導体、そのｃＤＮＡ、その遺伝子、ならびにＡＬＢ４０８‐４２３の活性を中和する抗体を、薬剤として用いることができる。その生物学的活性は、ウイルス阻害物質、癌細胞遊走阻害物質、およびＣＸＣＲ４拮抗性物質の生物学的活性に対応している。ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＲ４と特異的に結合し、それによって、ＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ‐１変異体の感染および天然のＣＸＣＲ４アゴニストであるＣＸＣＬ１２の結合を阻止する。本発明のペプチドは、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、局所‐外用（ｌｏｃａｌ‐ｔｏｐｉｃ）、皮下、または頬側経路でのペプチドに対して通例である方法によって投与することができる。投与されるペプチドの量は、１日の単位用量あたり１μｇ〜１ｇである。本発明のペプチドの活性は、適切な阻害剤／アンタゴニストを投与することによって阻害することができる。
【００３９】
本発明の診断薬は、本発明のペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含み、それ自体が公知であるＥＬＩＳＡまたはＲＩＡで用いるために、蛍光標識または放射性標識された形態であってもよい。本発明の診断薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはＰＮＡを含み、ＰＣＲまたはフィンガープリンティング等の当業者に公知の試験システムで用いるために、修飾および／または標識された形態であってもよい。別の選択肢として、本発明の診断薬は、対応するサンプル調製および濃縮（沈殿による大型タンパク質の分離、クロマトグラフィまたはＲＰ媒体（ＲＰ ｍｅｄｉａ）、固相抽出によるＡＬＢ４０８‐４２３の濃縮）の後、その物質をその一価または多価イオン（親イオンまたはＭＳ‐ＭＳフラグメンテーション後の生成イオン）から定性的および定量的に明白に検出する質量分析法（ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ‐ＭＳ）から成る。
【００４０】
本発明を、以下の実施例により、さらに説明する。
【実施例】
【００４１】
[実施例１]
ヒト血液ろ過液からの抗ウイルス効果を有するＡＬＢ４０８‐４２３の単離
ヒト血液ろ過液は、所望により水による希釈および酸性化を行ってもよい。ｐＨ値は、１．５〜３．５が好ましく、２．５〜３．０が特に好ましい。その後、この血液ろ過液を、例えばスルホン酸基で修飾された支持体材料（Ｆｒａｋｔｏｇｅｌ ＳＰ‐６５０（Ｍ）， Ｍｅｒｃｋ，ダルムシュタット，ドイツ）などのカチオン交換樹脂に通す。カチオン交換樹脂に結合したペプチドは、比較的高濃度の塩溶液で溶離させる。溶出液のイオン強度は、０．５Ｍ〜１Ｍの酢酸アンモニウム溶液のそれとおよそ同じである。
【００４２】
回収した溶出液を別のカチオン交換クロマトグラフィに掛ける。このクロマトグラフィは、バッファーのｐＨ値を上昇させていくことによる分画溶離が好ましい。
【００４３】
本発明のペプチドを含有する画分は、分取用逆相クロマトグラフィ、続いて、例えばＣ１８‐修飾支持体上での、セミ分取用逆相クロマトグラフィによってさらに精製する。精製の度合いは、例えばＣ１８‐修飾支持体材料上での、分析用逆相クロマトグラフィを用いてモニタリングすることが好ましい。
【００４４】
第一工程：血液ろ過液のバッチ抽出
８００〜１０００リットルの血液ろ過液を、ＨＣｌにより２．７のｐＨ値に調節し、水で希釈して導電率を５．５ｍＳ／ｃｍとし、３Ｌ／分の流速で強カチオン交換体にチャージする。
【００４５】
クロマトグラフィ条件：
カラム： Ｖａｎｔａｇｅ ＶＡ２５０（Ａｍｉｃｏｎ，ビッテン，ドイツ）
カラム材料： Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＳＫ ＳＰ６５０（Ｍ）、２５ｃｍ×２０ｃｍ
流速： ３Ｌ／分
検出： ２８０ｎｍ、ｐＨ、導電率
バッファーＡ： 血液ろ過液 ｐＨ２．７、導電率５．５ｍＳ／ｃｍ
バッファーＢ： ０．５Ｍ酢酸アンモニウム
装置： Ａｕｔｏｐｉｌｏｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ビースバーデン，ドイツ）
【００４６】
全量１０００リットルの液体を一晩かけてチャージした後、数カラム容量分の５ｍＭのＨＣｌによる洗浄を行う。結合したペプチドの溶離は、０．５Ｍの酢酸アンモニウムによるバッチ溶離として行う。ペプチドの完全な溶離は、ｐＨ値の勾配（６．８〜７．２）および導電率の勾配（５６ｍＳ／ｃｍ）により、約５リットルの溶離液で達成される。
【００４７】
第二工程：一回目の分取分離（バッチ０１／２００３）
バッチ抽出の酢酸アンモニウム溶出液を、１０，０００リットルの血液ろ過液ペプチド分まとめる。ｐＨを２．７に調節した後、このペプチド抽出液を、導電率が５．５ｍＳ／ｃｍである完全脱塩水を添加した状態の分取用カチオン交換体にチャージする。
【００４８】
クロマトグラフィ条件：
カラム： Ｖａｎｔａｇｅ ２５０ＶＡ
カラム材料： Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＳＫ ＳＰ６５０（Ｍ）、２５ｃｍ×２０ｃｍ
流速： チャージ時 最大３Ｌ／分
溶離時 ０．５〜１Ｌ／分
検出： ２８０ｎｍ、ｐＨ、導電率
サンプル： 血液ろ過液 ｐＨ２．７、導電率５．５ｍＳ／ｃｍ
装置： Ａｕｔｏｐｉｌｏｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ビースバーデン，ドイツ）
【００４９】
未処理の抽出液を２４０分かけてチャージした後、導電率が１ｍＳ／ｃｍ未満となるまで０．０１ＭのＨＣｌでカラムを洗浄する。溶離は、以下に示すバッファーを用いて数工程で実施する。
【００５０】
【数１】
【００５１】
溶出液１〜７を、ｐＨプールＩ〜ＶＩＩと称する。これらは、別々に回収し、最後に、完全脱塩水で洗浄する。溶離は、新たなベースラインが達成されるまで行い、個々のｐＨプールＩ〜ＶＩＩに対して溶離容量は１０〜２５リットルに達する。
【００５２】
第三工程：二回目の分取分離：
分画および同時に行う脱塩のために、個々のｐＨプールを逆相クロマトグラフィによって分離する。
【００５３】
クロマトグラフィ条件：
カラム： ＦｉｎｅＬｉｎｅ １００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，フライブルク，ドイツ）
カラム材料： Ｓｏｕｒｃｅ ＲＰＣ、１５μｍ
１０×１２．５ｃｍ（ＦｉｎｅＬｉｎｅ １００）
流速： １５０ｍｌ／分（ＦｉｎｅＬｉｎｅ １００）
検出： ２８０ｎｍ、導電率、ｐＨ
バッファーＡ： １０ｍＭ ＨＣｌ
バッファーＢ： １０ｍＭ ＨＣｌ中の８０％ アセトニトリル
勾配： ０〜６０％のバッファーＢで５カラム分の容量
【００５４】
個々のｐＨプールをチャージ後、カラムをバッファーＡで洗浄する。溶離中に、２００ｍｌの画分を回収する。これらの画分を凍結乾燥し、−２０℃にて保存する。形成された画分のアリコートをＨＩＶ阻害アッセイにて試験する。ｐＨプールＩＩからの画分６〜８が本発明のペプチドを含有していた。
【００５５】
図１Ａ〜Ｆ：ヒト血液ろ過液からのＡＬＢ４０８‐４２３の単離。ｐＨ段階溶離により分画した血液ろ過液をＲＰ‐ＨＰＬＣによってさらに分画し、得られた画分をＨＩＶ阻害試験にて測定した。コントロール：Ｔ２０コントロール。
【００５６】
Ａ． 単離の第三工程。ｐＨプール２のＲＰ画分が、画分６〜８において阻害活性を示した。
Ｂ〜Ｅ． 単離の第四〜第七工程。阻害活性を、純粋物質が得られるまで精製した。
Ｆ． 精製されたＡＬＢ４０８‐４２３の質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ‐ＭＳ）および配列分析。
【００５７】
ＨＩＶ阻害試験は、４０００個のＰ４‐Ｒ５ ＭＡＧＩ細胞（Ｐ． Ｃｈａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４１： ６５１， １９９４）を、１００μｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）中へ播種することによって実施した。Ｐ４‐Ｒ５細胞は、ＬＴＲ‐ｌａｃＺカセットによって安定的にトランスフェクトされ、ＨＩＶ‐１による感染に成功すると、Ｔａｔに依存的にβ‐ガラクトシダーゼを発現し、これは、化学発光試験にて検出することができる。翌日、画分のアリコートを添加した。そのために、凍結乾燥された画分を８０μｌのＤＭＥＭへ再懸濁させ、その各々の２５μｌをＰ４‐Ｒ５細胞へピペットで分注し、３７℃にて１時間インキュベートし、続いてＨＩＶ‐１ ＮＬ４＿３（１ｎｇのｐ２４抗原）で感染させた。ウイルスストックは、リン酸カルシウム法（ＣａｌＰｈｏｓ（商標） Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によるプロウイルスＤＮＡを用いた２９３Ｔ細胞の一過性の感染によって得た。ウイルスストックはトランスフェクションの４８時間後に回収してろ過し、感染に用いた。感染後３日目に、感染したＰ４‐Ｒ５細胞のβ‐ガラクトシダーゼ活性を、製造元の推奨に従ってＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ｔｒｏｐｉｘ）を用ることで検出した。簡単に述べると、上清を除去し、ＰＢＳ／ＧａｌＳｃｒｅｅｎ＋基質の１：１希釈物４０μｌを添加し、続いて室温にて３０分間インキュベートした。次に、ライセート３０μｌを９６ウェルのルミプレート（ｌｕｍｉｐｌａｔｅ）へ移した。続いて、発光を、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｏｒｉｏｎ）により、秒あたりの相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ）として検出した。全測定値から、非感染コントロール細胞の平均β‐ガラクトシダーゼバックグラウンド活性を減じた。各感染についての感染％の値を、ペプチド非含有のコントロール（１００％）に対して算出した。ＡＬＢ４０８‐４２３の非存在下での測定における酵素活性を１００％に設定し、その他のすべての値はこれに基づいたものとした。最終精製（第七工程）は、ＴＺＭ‐ｂｌ細胞（Ｘ． Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４６： １８９６， ２００２）とまったく同一の条件下にて試験した。
【００５８】
第四工程：セミ分取用逆相Ｃ１８クロマトグラフィ
本アッセイにて生物活性であった（図１Ａ）ｐＨプールＩＩからの画分６〜８の全量２００ｍｇ（１０８７リットルの血液ろ過液等量に相当）を、セミ分取用逆相カラムを通して分離した。画分３３＋３４が、本発明の物質を含有していた（図１Ｂ）。
【００５９】
クロマトグラフィ条件：
カラム： ４．７ｃｍ×３０ｃｍ スチールカラム
充填材料： Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＲＰ‐Ｃ１８、１５〜３０μｍ、３００Å）
バッファーＡ： １００％ 水、１０ｍＭ ＨＣｌ
バッファーＢ： ８０％ アセトニトリル、２０％ 水、１０ｍＭ ＨＣｌ
勾配： ０〜３０％のＢで２０００ｍｌ
流速： ４０ｍｌ／分（圧力：４０ｂａｒ）
検出： ２１４ｎｍおよび２８０ｎｍ
クロマトグラフィ装置： ＢｉｏＣａｄ ２５０、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
画分： 勾配の開始（１０．７５分）から５０ｍｌずつ
【００６０】
第五工程：セミ分取用逆相Ｃ１８クロマトグラフィ
アッセイで生物活性を示した、先のクロマトグラフィ工程からの画分３３＋３４を、異なる移動相を用いて類似のセミ分取用逆相カラムを通して分離した。続くＨＩＶ感染アッセイにより、画分５＋６が本発明の物質を含有することが明らかとなった（図１Ｃ）。
【００６１】
クロマトグラフィ条件：
カラム： ４．７ｃｍ×３０ｃｍ スチールカラム
充填材料： Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＲＰ‐Ｃ１８、１５〜３０μｍ、３００Å）
バッファーＡ： ３０％ メタノール、７０％ 水、１０ｍＭ ＨＣｌ
バッファーＢ： １００％ メタノール、１０ｍＭ ＨＣｌ
勾配： ０〜１５％のＢで４０ｍｌ
１５〜６０％のＢで１９００ｍｌ
流速： ４０ｍｌ／分（圧力：３０ｂａｒ）
検出： ２１４ｎｍおよび２８０ｎｍ
クロマトグラフィ装置： ＢｉｏＣａｄ ２５０、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
画分： 勾配の開始（９．７５分）から５０ｍｌずつ
【００６２】
第六工程：分析用逆相Ｃ４クロマトグラフィ
先のクロマトグラフィからの生物活性画分５＋６を、分析用逆相カラムを通して分離した。アリコートをバイオアッセイ（ＨＩＶ阻害アッセイ）で試験した。画分５１〜５７が本発明の物質を含有していた（図１Ｄ）。
【００６３】
クロマトグラフィ条件：
カラム： ２ｃｍ×２５ｃｍ スチールカラム
充填材料： ＲＰ‐Ｃ４、５μｍ、１００Å、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｉｌｉｃａ，エストリンゲン，ドイツ）
バッファーＡ： 水、０．１％ ＴＦＡ
バッファーＢ： ８０％ アセトニトリル、２０％ 水、０．１％ ＴＦＡ
勾配： ０〜５％のＢで２分間、５〜３５％のＢで６０分間、３５〜１００％のＢで３分間
流速： ７ｍｌ／分
検出： ２１４ｎｍおよび２８０ｎｍ
クロマトグラフィ装置： Ｋｏｎｔｒｏｎ
画分： １分から１分ごと
【００６４】
第七工程：分析用逆相Ｃ１８クロマトグラフィ
先のクロマトグラフィからの生物活性画分５１〜５７を、分析用逆相カラムを通して分離した。アリコートをバイオアッセイで試験した。画分３１が本発明の物質を純粋な形態で含有していた（図１Ｅ）。
【００６５】
クロマトグラフィ条件：
カラム： １ｃｍ×２５ｃｍ スチールカラム
充填材料： ＲＰ‐Ｃ１８、５μｍ、３００Å、Ｖｙｄａｃ（ヘスピーリア，米国）
バッファーＡ： 水、０．１％ ＴＦＡ
バッファーＢ： ８０％ アセトニトリル、２０％ 水、０．１％ ＴＦＡ
勾配： ０〜１５％のＢで５分間、１５〜４５％のＢで６０分間、４５〜１００％のＢで１分間
流速： ２ｍｌ／分
検出： ２１４ｎｍおよび２８０ｎｍ
クロマトグラフィ装置： Ｋｏｎｔｒｏｎ
画分： １分から１分ごと
【００６６】
本発明の純粋な物質は画分３１に含有されており、次にこれを、用量依存的にバイオアッセイにて試験し、ペプチド化学によって特性を明らかにした（実施例２）。
【００６７】
[実施例２]
質量測定
血液ろ過液から単離されたペプチド（実施例１の第七工程の画分３１より）、および化学合成されたペプチド（実施例３）の質量測定を、ＭＡＬＤＩ質量分析器（Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ‐Ｐｒｏ）で実施した。ペプチドの分子質量は、以下の質量数値（ＭＷ）に相当すると測定された。
ＡＬＢ４０８‐４２３、ヒト血液ろ過液から単離（図１Ｆ）： １８３０．９Ｄａ
ＡＬＢ４０８‐４２３、化学合成ペプチド： １８３０．６Ｄａ
【００６８】
配列決定
精製された天然のペプチドを、ＰＲＯＴＥＯＭＥＦＡＣＴＯＲＹ ＡＧ社，Ｄｏｒｏｔｈｅｅｎｓｔｒ．９４，１０１１７ ベルリン（ドイツ）、から提供されたＭＳ‐ＭＳカップリング分析（ＥＳＩ‐ＴＲＡＰ）により、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンによる確立されたＥＳＩ ＭＳ‐ＭＳ質量のデータベース比較によって分析した結果、次の配列が最も確率の高かった。
ＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬ（図１Ｆ）
【００６９】
データベース比較
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースによるさらなるデータベース比較により、このペプチド配列が、ヒトタンパク質血清アルブミン（アクセス番号ＮＰ０００４６８）のアミノ酸４０８‐４２３と１００％の同一性を有することが示され、この配列は、アミノ酸：ＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬ、を含有している。
【００７０】
精製画分３１はＨＩＶ‐１阻害バイオアッセイにおいて活性である
実施例１の第七工程からの画分３１の１．６ｍｇを１６０μｌのＤＭＥＭへ溶解した。続いて、ＡＬＢ４０８‐４２３を含有する画分３１の段階希釈物１０μｌを６０μｌのＴＺＭ‐ｂｌ細胞（６０μｌ）へ添加し、１ｎｇのｐ２４抗原ＨＩＶ‐１ ＮＬ４＿３によって感染させ、全量を１００μｌとした。３日後、ＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにて感染率を測定した（実施例１参照）。画分３１は、このＸ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４＿３による感染を用量依存的に阻害した。最大値の半分まで感染を阻害する用量（ＩＣ50）は、２１．４５μｇ／ｍｌであった（図２）。
【００７１】
図２：ＡＬＢ４０８‐４２３を含有する画分３１は、ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３の感染を阻害する。ＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、画分３１の段階希釈物と共にインキュベートし、次にＸ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３で感染させた。３日後、ＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにて感染率を測定した。ＰＢＳ処理コントロール（１００％）に対する、３回の反復感染の平均値±標準偏差を示す。
【００７２】
[実施例３]
ＡＬＢ４０８‐４２３の化学合成
ＡＬＢ４０８‐４２３の化学合成は、公知のＦｍｏｃ化学を用い、ペプチド合成機９０５０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上での従来の固相合成によって実施した。得られたペプチドは、逆相クロマトグラフィで精製し、実施例２で述べた分析用ＲＰ‐ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ‐ＭＳ質量測定により、その同一性および純度を確定した。
【００７３】
[実施例４]
Ｘ４‐向性ＨＩＶ‐１変異体の感染を特異的に阻害する合成ＡＬＢ４０８‐４２３
５０００個のＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、１００μｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）中へ播種した。ＡＬＢ４０８‐４２３をＰＢＳへ溶解した（１０ｍｇ／ｍｌ）。１日後、ＰＢＳによるＡＬＢ４０８‐４２３の段階希釈物２０μｌを細胞へ添加し、続いて、０．５ｎｇのｐ２４抗原ＨＩＶ‐１で細胞を感染させ、全量を２００μｌとした。共受容体向性の異なる複数のＨＩＶ‐１分子クローンを用い、これらは記載に従って作出した（Ｐａｐｋａｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６： ８４５５‐９， ２００２）。
【００７４】
図３：化学合成ＡＬＢ４０８‐４２３は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１の感染を特異的に阻害する。示した希釈率のペプチドを含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、その共受容体向性が異なる複数のＨＩＶ‐１変異体で感染させた。３日後、ＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイを用いて感染率を測定した。Ａ）Ｘ４向性ＨＩＶ‐１変異体ＮＬ４‐３、Ｐ５１‐Ｓｃ、Ｐ５９‐Ｓ／２７、およびＰ３４‐Ｓ、または二重向性９２ｈｔ５９３．１の用量依存的阻害。Ｂ）５００μｇ／ｍｌのＡＬＢ４０８‐４２３の存在下での感染率。このペプチドが、Ｒ５向性ＨＩＶ‐１感染は阻害しないがＸ４向性ＨＩＶ‐１感染は特異的に阻害することを示している。示したデータは、ＰＢＳ含有細胞（１００％感染）に対する、３回の反復感染の平均値±標準偏差である。
【００７５】
３日後、ＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ｔｒｏｐｉｘ）を用いて感染を検出した（実施例１）。ＡＬＢ４０８‐４２３は、分析したすべてのＸ４‐向性ＨＩＶ‐１変異体による感染を用量依存的に阻害した（図３Ａ）（平均ＩＣ50は２４．２μｇ／ｍｌ）。二重向性（ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を利用する）変異体９２ｈｔ５９３．１の阻害は、これよりも効率が低かった。対照的に、ＣＣＲ５向性ＨＩＶ‐１変異体は、非常に高い用量のＡＬＢ４０８‐４２３の存在下（５００μｇ／ｍｌ）であっても阻害されなかった（図３Ｂ）。Ｘ４‐向性ＨＩＶ‐１変異体に起因する感染を特異的に阻害することから、ＡＬＢ４０８‐４２３は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４と相互作用を起こすと推定される。
【００７６】
血液ろ過液から精製されたＡＬＢ４０８‐４２３（実施例２）および化学合成されたＡＬＢ４０８‐４２３（実施例４）のいずれも、標的細胞内でのＨＩＶ‐１の複製を用量依存的に阻害することを示し、このことは、ＡＬＢ４０８‐４２３が天然のヒトＨＩＶ‐１阻害分子であることの証拠を提供する。
【００７７】
[実施例５]
合成ＡＬＢ４０８‐４２３はＣＸＣＲ４向性レンチウイルスの感染を用量依存的に阻害する
Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３およびＨＩＶ‐２ＲＯＤ１０、またはＣＣＲ５向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３ ９２ｔｈ０１４、ＨＩＶ‐１‐７３１２、およびＳＩＶｍａｃ２３９は、２９３Ｔ細胞の一過性のトランスフェクションによって作出し、これらを用いて、示した濃度のＡＬＢ４０８‐４２３を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を感染させた。２日後、感染率を既述のようにして測定し算出した（実施例４）。結果から、ＡＬＢ４０８‐４２３は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２の感染を用量依存的に阻害したが（ＩＣ50は約１０〜２０μＭ）、一方このペプチドは、Ｒ５向性レンチウイルスの感染には影響を及ぼさなかったことが示され、これは、ＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２の特異的な阻害を実証するものである（図４）。
【００７８】
図４：ＡＬＢ４０８‐４２３は、Ｘ４向性レンチウイルスの感染を阻害する。感染性を正規化したＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２、およびＳＩＶのストックを用いてＡＬＢ４０８‐４２３を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を感染させた。３日後、Ｇａｌ Ｓｃｒｅｅｎアッセイを用いて感染率を測定した。３回の反復測定から得られた平均値±標準偏差を示す。ペプチドを含有しない細胞の感染率を１００％とする。
【００７９】
表１：Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３の感染に対する種々のＡＬＢ断片の抗ウイルス活性。合成ペプチドの段階希釈物を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３によって感染させ、感染の２日後に、実施例１および２で述べたようにして感染率を測定、算出した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージを用いてＩＣ50値を求めた。略語：Ｄａ、分子量；ＩＣ50 μＭ、３回の反復実験より得た半数（５０％）阻害濃度；ＳＥＭ、平均値の標準誤差；ｅｘｐ、実施した実験回数。
【００８０】
【表１】
【００８１】
[実施例６]
ＡＬＢ４０８‐４２３誘導体を用いた構造活性相関（ＳＡＲ）研究
ＮもしくはＣ末端欠失、またはアミノ酸置換を含有する種々のＡＬＢ４０８‐４２３誘導体（表１）を化学的に合成し、凍結乾燥したペプチドをＰＢＳ中へ溶解した。この抗ウイルス活性を、既述のようにしてＸ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３を用い、ＴＺＭ‐ｂｌ細胞内で分析した（実施例４）。ＡＬＢ４０８‐４２３のＮ末端欠失（４０９‐４２３、４１０‐４２３、４１１‐４２３、４１２‐４２３、４１３‐４２３、４１４‐４２３、４１５‐４２３）によって抗ウイルス活性が大きく減退または無効化され、このことは、ＡＬＢ４０８‐４２３が介するＸ４向性ＨＩＶ‐１の阻害に対して、Ｎ末端ロイシン（Ｌ４０８）が極めて重要であることを示している（図５および図６）。
【００８２】
図５．ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性。ＡＬＢ誘導体の段階希釈物を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３により感染させた。２日後、感染率をＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにより測定した。ペプチドを含有しないサンプル（感染率＝１００％）に対して、３回の反復感染から得られた平均値を示す。
【００８３】
図６．ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性。ＡＬＢ誘導体の段階希釈物を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３により感染させた。２日後、感染率をＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにより測定した。ペプチドを含有しないサンプル（感染率＝１００％）に対して、３回の反復感染から得られた平均値を示す。
【００８４】
Ｃ末端にて最大８個のアミノ酸残基が切断されたＡＬＢ４０８‐４２３誘導体（４０８‐４２２、４０８‐４２１、４０８‐４２０、４０８‐４１９、４０８‐４１８、４０８‐４１７、４０８‐４１６、４０８‐４１５、４０８‐４１４、４０８‐４１３）は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染の阻害についての活性を維持した（図５および６、表１）。しかしながら、Ｃ末端におけるさらなる欠失（４０８‐４１４および４０８‐４１３）により、不活性ペプチドとなった（ＩＣ50値＞５０μＭ）（図６）。興味深いことに、Ｃ末端欠失変異体ＡＬＢ４０８‐４１９は、野生型ＡＬＢ４０８‐４２３よりも効率的にＸ４向性ＨＩＶ‐１感染を阻害した（４．４±１．０ 対 ７．６±１．２；平均ＩＣ50値（μＭ）±ｓｅｍ）（表１；図５、６、７、および８）。
【００８５】
図７．ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性。ＡＬＢ誘導体の段階希釈物を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３により感染させた。２日後、感染率をＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにより測定した。ペプチドを含有しないサンプル（感染率＝１００％）に対して、３回の反復感染から得られた平均値を示す。
【００８６】
図８．ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性。ＡＬＢ誘導体の段階希釈物を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３により感染させた。２日後、感染率をＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにより測定した。ペプチドを含有しないサンプル（感染率＝１００％）に対して、３回の反復感染から得られた平均値を示す。
【００８７】
ＡＬＢ４０８‐４１５誘導体を包含する８個のアミノ酸残基のみが強力な抗ウイルス活性を示したことから（１７．４±６．５）、特定のアミノ酸置換を含有するＡＬＢ４０８‐４１５誘導体を合成してこれを試験することにより、アラニンスキャンを行った（表１）。図７および表１に示したデータは、ほとんどの置換がＡＬＢ４０８‐４１５の抗ウイルス活性を減退させたことを実証している。特に、アルギニン４１０（ＡＬＢ‐Ｒ４１０Ａ、ＩＣ50＞１０００μＭ 対 ＡＬＢ４０８‐４１５；１７．４±６．５）が、ＨＩＶ‐１阻害において重要な役割を担っている（図７、表１）。スレオニン４１２のアラニンへの置換（ＡＬＢ‐Ｔ４１２Ａ）により、中程度に抗ウイルス活性が高められたペプチドが得られた（１１．２±０．１）（図７および表１）。
【００８８】
ＡＬＢ４０８‐４１９の抗ウイルス活性に対するＮ末端ロイシン（Ｌ４０８）の役割をさらに解明するために、この残基をフェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換した。ＨＩＶ‐１阻害アッセイにより、Ｎ末端における置換のほとんどが不活性なペプチドをもたらすことが明らかとなった（ＡＬＢ４０８Ｆ‐４１９、ＡＬＢ４０８Ａ‐４１９、およびＡＬＢ４０８Ｇ‐４１９）（図８）。しかしながら、イソロイシンへの相同的な置換（ＡＬＢＬ４０８Ｉ‐４１９）は、中程度に抗ウイルス活性が高められたペプチドをもたらした（１．５５±１．２）（図８）。ＡＬＢ４０８‐４１９のＮ末端におけるロイシンの付加（４０７‐４１９）は、抗ウイルス活性を低下させた（図８）。
【００８９】
まとめると、ＳＡＲ分析は、抗ウイルス活性が高められた切断型のＡＬＢ誘導体の同定を可能とし、Ｃ末端とは対照的に、Ｎ末端部分が、ＡＬＢ４０８‐４２３が介するＸ４向性ＨＩＶ‐１感染の阻害に対して極めて重要であることを示した。
【００９０】
[実施例７]
ＡＬＢ誘導体はいずれも細胞毒性を示さない
ＡＬＢ変異体の細胞毒性効果の可能性を評価するために、５×１０3個のＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、最も強力な抗ウイルス活性を及ぼすペプチド（表１および図９）の増加する種々の濃度と共に、３日間インキュベートした。細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ７５７１）を製造元の推奨に従って用いて測定した。この発光に基づくアッセイは、細胞内ＡＴＰの量に基づいて生存細胞数を測定する。データは、ルミノメーターを用い、試薬の添加後１０分で記録した。ＰＢＳのみでインキュベートした細胞から得られた発光活性を１００％に設定した。図９に示した結果より、試験したいずれのＡＬＢ誘導体でも、３００μＭ以下の濃度では細胞毒性効果が見られなかったことが明らかに示される。
【００９１】
図９．ＡＬＢ誘導体の細胞毒性アッセイ。ＡＬＢ誘導体の段階希釈物をＴＺＭ‐ｂｌ細胞へ添加した。２日後、細胞のＡＴＰレベルをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイを用いて測定した。数値は、３回の反復測定から得た。ＰＢＳを含有する（ペプチドを含有しない）細胞内のＡＴＰレベル（１００％）に対して、生存率の％を算出した。
【００９２】
[実施例８]
ＡＬＢ４０８‐４２３の抗ウイルス活性および最も強力な誘導体
種々のＨＩＶ‐１クローンに対する最も活性であるＡＬＢペプチドの効果を調べるために、２９３Ｔ細胞をプロウイルスプラスミドでトランスフェクトすることによって異なる共受容体を利用するウイルスを作出した（Ｐａｐｋａｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６： ８４５５‐９， ２００２）。ウイルスストックをまずＴＺＭ‐ｂｌ細胞に滴定した。次に、１００μＭのペプチドを含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、感染性を正規化した量のＸ４向性、二重向性（Ｘ４／Ｒ５）、またはＲ５向性ＨＩＶ‐１で感染させた。既述のように（実施例４）感染率を測定し、野生型ＡＬＢ４０８‐４２３、Ｃ末端切断型ＡＬＢ４０８‐４１９およびＡＬＢ Ｌ４０８Ｉ‐４１９変異体、ならびにＡＬＢ‐Ｔ４１２Ａが、分析したすべてのＸ４向性ＨＩＶ‐１クローン（ＮＬ４‐３、Ｐ５１‐Ｓｃ、Ｐ３４‐ｓ）の感染をほぼ完全に阻害したことが示された（図１０）。これらのペプチドは、Ｒ５向性ＨＩＶ‐１感染に対しては影響を及ぼさず、二重向性ＨＩＶ‐１クローン９２ｈｔ５９３．１によるＴＺＭ‐ｂｌ細胞の感染は中程度に阻害しただけであった。これらのデータは、抗ウイルス活性が高められたＡＬＢ変異体（ＡＬＢ４０８‐４２３と比較して）（表１）も、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１変異体の広範囲にわたる阻害剤であることを実証している。
【００９３】
図１０．ＡＬＢ４０８‐４２３および切断型ＡＬＢ誘導体は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染を特異的に阻害する。ＰＢＳ及び１００μＭの示されたペプチドを含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、正規化された感染性のＸ４向性、二重向性、またはＲ５向性ＨＩＶ‐１クローンで感染させた。感染の２日後に感染率をＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイを用いて測定した。３回の反復測定から得られた平均値（ＰＢＳ処理コントロールに対する％）±標準偏差を示す。
【００９４】
[実施例９]
ＡＬＢ４０８‐４２３、ＡＬＢ４０８‐４１９、およびＡＬＢ Ｌ４０８Ｉ‐４１９はＸ４向性ＨＩＶ‐１の感染およびＰＢＭＣ内での複製を阻害する
該当する一次細胞におけるＡＬＢ４０８‐４２３およびその誘導体の効果を分析するために、末梢血液単核細胞を、フィコール密度遠心分離を用いて、ドイツ赤十字献血サービス バーデンビュルテンベルクヘッセン（ＤＲＫ‐Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ Ｂａｄｅｎ‐Ｗｕｒｔｔｅｍｂｅｒｇ‐Ｈｅｓｓｅｎ）より得たバフィーコートから単離した。１ｍｌあたり１×１０6個のＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、Ｏｘｏｉｄ、＃３０８５２８０）および１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン２（ＩＬ‐２、Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ、＃９５１１１９２）にて３日間刺激した。その後、細胞をペレット化し、ＩＬ‐２を含有する培地へ再懸濁させた。１．５×１０5個のＰＢＭＣ（２５０μｌ）を９６ウェルディッシュへ播種し、ペプチドを添加し、細胞をＸ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３のｐ２４抗原５０ｐｇ／ｍｌで感染させた。子孫ウイルスを含有する上清を感染後の第１、３、および６日に採取した。ウイルス産生をｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（ＳＡＩＣ‐Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｉｎｃ［ＡＩＤＳ ＆ Ｃａｎｃｅｒ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｇｒａｍ］）で測定した。１００μＭのＡＬＢ４０８‐４２３およびＡＬＢ Ｌ４０８Ｉ‐４１９を含む細胞から第６日に得られた上清では、ｐ２４抗原は検出することができず、１００μＭのＡＬＢ４０８‐４１９を含有する上清では、ほんの僅かのｐ２４レベルしか検出することができなかった（図１１）。２０μＭのペプチドの存在下では、ウイルスの複製が大きく減退した。これらのデータは、試験したＡＬＢ４０８‐４２３およびその２種類の誘導体が、天然のＨＩＶ標的細胞内にて、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１の感染および複製を阻害することを示している。
【００９５】
図１１．ＡＬＢ４０８‐４２３および誘導体は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のＸ４向性ＨＩＶ‐１感染を阻害する。細胞を、示した濃度のＡＬＢ４０８‐４２３または切断型変異体と共にインキュベートし、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１で感染させた。６日後に得られた上清をｐ２４ＥＬＩＳＡにより分析した。３回の反復感染から得られた平均ｐ２４抗原値（ｎｇ／ｍｌ）±標準偏差を示す。
【００９６】
[実施例１０]
ＡＬＢ４０８‐４２３ペプチドはＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を阻害する
ケモカインＣＸＣＬ１２のその受容体ＣＸＣＲ４への結合を阻害するＡＬＢ４０８‐４２３の能力を試験するために、過去の記載（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ‐Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， ｅｔ ａｌ．； ２００１， ＪＢＣ ２７６：２６５５０‐２６５５８）に従って蛍光結合アッセイを生存細胞全体に対して実施した。ＣＸＣＲ４受容体は、ＥＧＦＰ蛍光タンパク質が受容体の細胞外アミノ末端部へ融合した融合タンパク質（ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４）として、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞へ安定にトランスフェクトされる。ヒトケモカインＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＬ１２‐テキサスレッドを記載に従って合成した（Ａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＪＢＣ ２７４：２３９１６‐２３９２５； Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ‐Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， ｅｔ ａｌ．， ２００１， ＪＢＣ ２７６：２６５５０‐２６５５８）。リガンド‐受容体相互作用のリアルタイム蛍光モニタリングを以下のようにして実施した。融合受容体ＥＧＦＰ‐ｈＣＸＣＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞を、５ｍＭのＥＤＴＡを補ったｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水中で採取し、遠心分離に掛け、プロテアーゼ阻害剤（４０μｇ／ｍＬ ベスタチンおよびバシトラシン、２０μｇ／ｍＬ ホスホラミドン、５０μｇ／ｍＬ キモスタチン、および１μｇ／ｍＬ ロイペプチン）を補ったＨＥＰＥＳ‐ウシ血清アルブミンバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３７．５ｍＭ ＮａＣｌ、１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ2、６ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ グルコース、０．４ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１％ ウシ血清アルブミン（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．４）中へ再懸濁させた。実験は、ＨＥＰＥＳ−ＢＳＡバッファー中に懸濁させた細胞（通常、１０6細胞／ｍＬ）に対して実施した。５１０ｎｍで発光（４７０ｎｍで励起）される蛍光の時系列での記録を、分光蛍光光度計（ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ ２，Ｓｐｅｘ）を用いて２１℃にて行い、０．３秒ごとにサンプリングした。３０秒の時点て１００ｎＭのＣＸＣＬ１２‐ＴＲを１ｍＬの細胞懸濁液へ添加することによって蛍光結合測定を開始した。競合実験では、ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４を発現する細胞を、種々の濃度の競合物質の非存在下または存在下にて、予め１０分間インキュベートした。次に、ＣＸＣＬ１２‐ＴＲ（１００ｎＭ）を添加し、平衡に達するまで（３００秒）蛍光を記録した。データの解析は、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ ３．０８ ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，レディング，ペンシルベニア州，米国）を用いて行った。ＣＸＣＬ１２のテキサスレッド（ＴＲ）基へのエネルギー移動に起因するＥＧＦＰ蛍光発光の低下として、蛍光ＣＸＣＬ１２との関連性が検出される。
【００９７】
ＣＸＣＬ１２の結合の飽和には、３００ｎＭ超の濃度で達し、ＣＸＣＲ４受容体に対する蛍光ＣＸＣＬ１２の解離定数は、５５±１５ｎＭに等しい（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ‐Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， （２００１）， ＪＢＣ ２７６， ２６５５０‐２６５５８）， Ｈａｃｈｅｔ‐Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．； （２００８）， ＪＢＣ）。蛍光ＣＸＣＬ１２と競合する非標識分子は、受容体部位の占有に対応して、ＥＧＦＰの発光の低下を阻止する。検出された蛍光強度の変動を定量化して（Ｐａｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， （２００１）， ＪＢＣ ２７６：３４８５３‐３４８６１； Ｖｏｌｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＪＢＣ ２７４：３７９１５‐３７９２２； Ｉｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ８５：７６８‐７７８）、競合物質の結合定数を導くことができる。
【００９８】
本発明者らの分析から、ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＬ１２‐Ｔｒとその受容体ＣＸＣＲ４との相互作用を、用量依存的に阻止することが実証される（図１２）。ＡＬＢ４０８‐４２３の解離定数（ＥＣ５０）は８±３μＭに等しく、これは、３±１μＭに等しいＫＩ値に相当する。解離定数であるＥＣ５０値は、ＨＩＶ‐１阻害アッセイで得られたＩＣ50値と類似している。
【００９９】
図１２．ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を阻害する。リガンド‐受容体相互作用のリアルタイム蛍光モニタリングを、ＥＧＦＰ‐ｈＣＸＣＲ４を発現する２９３細胞を用いて実施した。細胞を、種々の濃度のＡＬＢ４０８‐４２３の非存在下または存在下にて、予め１０分間インキュベートした。次に、ＣＸＣＬ１２‐ＴＲ（１００ｎＭ）を添加し、平衡に達するまで（３００秒）蛍光を記録した。データの解析は、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ ３．０８ ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，レディング，ペンシルベニア州，米国）を用いて行った。ＣＸＣＬ１２‐Ｔｒ処理細胞のみの蛍光強度（１００％）に対して、３回の反復測定から得られた平均値±標準偏差を示す。
【０１００】
[実施例１１]
ペプチドＡＬＢ４０８‐４２３はＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４を介するＣａ2+動員を誘発せず、ＣＸＣＬ１２が誘発するカルシウム細胞応答を阻害する
ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、またはＣＸＣＲ１が介する細胞応答を制御するＡＬＢ４０８‐４２３の能力を、カルシウム指示薬をロードしたＨＥＫ２９３細胞上で調べた。ｉｎｄｏ‐１アセトキシメチルエステルをカルシウムプローブとして用い、記載に従って（Ｐａｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１， ＪＢＣ ２７６：３４８５３‐３４８６１； Ｖｏｌｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＪＢＣ ２７４：３７９１５‐３７９２２）細胞内Ｃａ2+放出測定を実施した。細胞応答は、分光蛍光光度計を用いて励起を３５５ｎｍに、発光を４０５ｎｍおよび４７５ｎｍに設定し、１ｍＬキュベット内で攪拌しながら３７℃にて記録した。ヒトケモカインＣＣＬ５およびＣＸＣＬ８は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（サンホゼ，カリフォルニア州）より購入した。ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、またはＣＸＣＲ１を発現する細胞を用いたＣａ2+動員アッセイにより、ケモカインアゴニスト、ＣＸＣＬ１２（ＣＸＣＲ４）、ＣＣＬ５（ＣＣＲ５）、およびＣＸＣＬ８（ＣＸＣＲ１）それぞれがＣａ2+動員を誘発し（図１３）、一方、ＡＬＢ４０８‐４２３単独ではいずれのカルシウム応答も誘発せず、従って、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ１アゴニスト特性を示さないことが実証される（図１３）。
【０１０１】
図１３．ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ１のいずれのアゴニストでもない。示したケモカイン受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞を、それぞれのケモカイン［１０ｎＭ ＣＸＣＬ１２（ＣＸＣＲ４）；２０ｎＭ ＣＣＬ５（ＣＣＲ５）、もしくは５０ｎＭ ＣＸＣＬ８（ＣＸＣＲ１）］または５０μＭのＡＬＢ４０８‐４２３で処理した。細胞内Ｃａ2+応答を分光蛍光光度計を用いて測定した。ＡＬＢ４０８‐４２３による処理後に得られた蛍光強度を、それぞれのケモカインの測定値（１００％）に対して示す。
【０１０２】
図１４．ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＲ４を発現する細胞内にて、ＣＸＣＬ１２が誘発するＣａ2+動員を特異的に阻害する。Ａ）ＣＸＣＬ１２が介する細胞内Ｃａ2+放出のＡＬＢ４０８‐４２３による用量依存的阻害。Ｂ）ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＨＥＫ ＣＣＲ５細胞内でのＣＣＬ５が誘発するカルシウム応答にも、ＨＥＫ ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ１細胞内でのＣＸＣＬ８が誘発する反応にも影響を及ぼさない。黒色棒グラフ：それぞれのケモカインのみ；灰色棒グラフ：それぞれのケモカインおよび５０μＭのＡＬＢ４０８‐４２３。ケモカインのみで処理した細胞（１００％）に対する、２回の反復実験からのカルシウムピーク応答の平均値を示す。
【０１０３】
ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＲ４アンタゴニスト特性を有するかどうかを理解するために、本発明者らは、アゴニストＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４受容体への結合に対するＡＬＢ４０８‐４２３の影響を分析した。従って、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を種々の濃度のＡＬＢ４０８‐４２３と共にインキュベートし、次にＣＸＣＬ１２で処理した。Ｃａ2+応答を記録した。図１４Ａに示すデータより、ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ１２が誘発するカルシウム応答を、見掛けの阻害定数８５μｇ／ｍｌにより、用量依存的な形で阻害することが実証される。化合物選択性に関する知見を得るために、本発明者らは次に、種々のケモカイン／受容体対のカルシウム応答に対するこのペプチドの影響を特徴付けた。図１４Ａのデータと一致して、５０μＭのペプチドが、ＨＥＫ ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４細胞内におけるＣＸＣＬ１２が誘発するカルシウム応答の７０％を阻害する（図１４Ｂ）。対照的に、このペプチドは、ＨＥＫ ＣＣＲ５細胞内でのＣＣＬ５が誘発するカルシウム応答にも、ＨＥＫ ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ１細胞内でのＣＸＣＬ８が誘発する反応にも影響を及ぼさない（図１４Ｂ）。これらの結果から、このペプチドがＣＸＣＲ４受容体に対する選択性を示し、ＣＸＣＲ４アンタゴニストであるという考えが支持される。
【０１０４】
[実施例１２]
ＡＬＢ４０８‐４２３はＣＸＣＬ１２が誘発するＣＸＣＲ４の内在化を阻害する
適切なケモカインで刺激すると、数多くのＧタンパク質共役受容体が、クラスリン被覆ピットにより内在化する。ＣＸＣＲ４反応のアンタゴニストとして、ＡＬＢ４０８‐４２３は、ケモカインが誘発するＣＸＣＲ４受容体の内在化を変化させることもできる。ＣＸＣＬ１２が媒介するＣＸＣＲ４の内在化に対するＡＬＢ４０８‐４２３のアンタゴニスト特性を分析するために、ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４受容体を発現する細胞を分割し、ラットＩ型コラーゲンをコーティングした１２ｍｍカバーガラス上で２４ウェルプレートにて２日間増殖させた。次に、細胞を０〜３０分の範囲の時間、１００ｎＭ ＣＸＣＬ１２、または５０μＭ ＡＬＢ４０８‐４２３、または１００ｎＭ ＣＸＣＬ１２プラス５０μＭ ＡＬＢ４０８‐４２３、を含有する、プロテアーゼ阻害剤を補ったＨＥＰＥＳ‐ＢＳＡバッファー中にて３７℃でインキュベートした。細胞を氷上へ配置することで内在化を停止させ、氷冷ＨＥＰＥＳ‐ＢＳＡバッファーで直ちに洗浄した。次に、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中にて４℃で１５分間固定し、続いて５０ｍＭのＮＨ4Ｃｌ中にて１５分間インキュベートした。カバーガラスを抗退色剤（ａｎｔｉ‐ｆａｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）である
【数２】
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて顕微鏡のスライドグラス上へ載せ、２４時間室温で維持した後、−２０℃で保存した。次に、細胞を倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）およびＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ Ｉｂｄ．ＢＬ ６３× １．４０ ＯＩＬ ＵＶ 対物レンズ（ｎ°５０６１９２）を用いたレーザー走査型共焦点イメージングシステム（Ｌｅｉｃａ ＡＯＢＳ ＳＰ２ ＭＰ）で分析した。電子ズームは３に設定し、ピンホールは１エアリー（Ａｉｒｙ）であり、得られたピクセルサイズは０．１５４μｍであった。ＥＧＦＰはアルゴンレーザーの４８８ｎｍレーザー線で励起し、４９５〜５５０ｎｍのいわゆるｍＣＦＰチャネル内の１つの光電子増倍管（ＰＭＴ）によって検出および増幅した（ＰＭＴ１ ６１０高電圧‐ＨＶ‐、オフセット０）。良好なシグナル対ノイズ比を得るために、連続して取得した４つのイメージから平均化した。
【０１０５】
図１５．ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＬ１２が媒介するＣＸＣＲ４の内在化を阻害する。受容体エンドサイトーシスを、ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４を発現するＨＥＫ細胞上でモニタリングし、ＣＸＣＬ１２、ＡＬＢ４０８‐４２３、もしくはその両方の化合物の添加後、直ちに（０分、上部パネル）、または３０分後に（下部パネル）、共焦点顕微鏡により分析した。３０分後、ＣＸＣＬ１２で処理した細胞はＣＸＣＲ４を内在化した。ＡＬＢ４０８‐４２３の存在下では、ＣＸＣＬ１２が媒介する受容体内在化は抑止される。
【０１０６】
共焦点イメージにより、１００ｎＭのＣＸＣＬ１２による３７℃、３０分間の処理が、細胞の周辺部へのおよび小胞構造内へのＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４の内在化をもたらしたことが示される（図１５）。予想された通り、蛍光の大部分が細胞表面に残留していたため、ＡＬＢ４０８‐４２３単独では受容体の内在化が誘発されず、ＣＸＣＬ１２が媒介するＣＸＣＲ４の内在化が阻害された（図１５）。この結果は、ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＲ４受容体に対するアンタゴニストとして作用することのさらなる証拠を提供する。
【０１０７】
[実施例１３]
ＣＸＣＬ‐１２が媒介するジャーカットＴ細胞の遊走を阻害するＡＬＢ４０８‐４２３
ＣＸＣＬ１２‐ＣＸＣＲ４シグナル伝達は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、癌、白血病、および関節炎等のいくつかの疾患において極めて重要な役割を担っている。ＣＸＣＬ１２を発現する器官、組織、または細胞は、ＣＸＣＲ４を発現する腫瘍細胞を引き寄せることができ、転移を起こさせる。ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＬ１２の媒介による腫瘍細胞遊走を阻害することが可能かどうかを調べるために、モデルシステムとしてＣＸＣＲ４を発現するジャーカットＴ細胞を用いて遊走アッセイを実施した（Ｐｒｉｎｃｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７８： １２９９６−１３００６）。ジャーカットＴ細胞を０．４×１０6（２００μｌ）にて１０％ＦＢＳを含有する媒体へ懸濁させ、次に、この細胞懸濁液（２００μｌ）を５μｍポアフィルターデバイス（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，２４‐ウェル細胞培養，Ｃｏｓｔａｒ）の上部コンパートメントに添加した。次に、ＣＸＣＬ１２含有（１００ｎｇ／ｍｌ）または非含有の培養液６００μｌを下部コンパートメントに添加し、上部コンパートメントから細胞を誘引させた。ＣＸＣＬ１２の誘発によるジャーカットＴ細胞遊走に対する阻害効果を研究するために、下部コンパートメントのＣＸＣＬ１２を種々の濃度のＡＬＢ４０８‐４２３と混合した。この細胞培養プレートを、細胞培養インキュベータ内にて３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを取り出し、下部コンパートメントに遊走した細胞１００μｌを、計数チャンバーを用いて直接計数するか、または増殖アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ（登録商標）試薬，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造元の推奨に従って分析した。増殖アッセイは、細胞数と直接比例する細胞内ＡＴＰレベルを測定する（データ示さず）。図１６に示すデータは、ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ１２が媒介するジャーカットＴ細胞遊走を用量依存的に阻害することを実証している。高濃度（３６０μｇ／ｍｌ）では、ＡＬＢ４０８‐４２３はＣＸＣＬ１２が誘発する細胞遊走ほぼ完全に阻害し、いずれのペプチドも存在しない状態（ＣＸＣＬ１２もＡＬＢ４０８‐４２３もなし）で観察された比率と同等であった。これらのデータは、ＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ１２によって媒介される腫瘍細胞の誘引を阻害することができることを示している。
【０１０８】
図１６．ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＬ‐１２が媒介するジャーカットＴ細胞の遊走を用量依存的に阻害する。５μｍポアフィルターを有するトランスウェルデバイスの上部コンパートメントへジャーカットＴ細胞を添加した。次に、ＰＢＳ、ＣＸＣＲ４アゴニストＣＸＣＬ１２（１００ｎＭ）、またはＡＬＢ４０８‐４２３の段階希釈物を細胞培養プレートの下部コンパートメントへ添加した。３７℃での２時間のインキュベーションの後、下部コンパートメント内の遊走細胞数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞内ＡＴＰレベルを測定することによって検出した。示した数値はすべて、ＣＸＣＬ１２のみで処理した細胞（１００％遊走）に対する、３回の反復実験からの遊走細胞の平均数±標準偏差を意味する。
【０１０９】
[実施例１４]
ＣＸＣＲ４へのＡＬＢ４０８‐４２３の結合はＮ末端アミノ酸の完全性に依存する
ＣＸＣＲ４への結合を媒介し、従ってＸ４向性ＨＩＶ‐１の感染およびＣＸＣＬ１２の結合を阻害するＡＬＢ４０８‐４２３の領域を同定するために、本発明者らは、いくつかのＡＬＢ４０８‐４２３誘導体（表１参照）の、ＣＸＣＬ１２が誘発するＣａ2+動員およびＣＸＣＬ１２‐Ｔｒの結合に対する影響を分析した。実験の詳細については実施例ｘおよびｙを参照されたい。図１７のＡおよびＢに示すように、Ｎ末端ロイシンが欠失したＡＬＢ４０９‐４２３は、ＣＸＣＬ１２が媒介するＣａ2+応答もＣＸＣＬ１２‐ＴｒのＣＸＣＲ４受容体への結合も阻害しなかった。興味深いことに、ＡＬＢ４０９‐４２３は、ＨＩＶ‐１阻害アッセイにおいても不活性であり、ＡＬＢ４０９‐４２３がＣＸＣＲ４へ結合できないことが、抗ウイルス活性の喪失の原因でもあることが示唆される。対照的に、Ｃ末端切断型のＡＬＢ誘導体はいずれも、依然としてＣＸＣＲ４受容体との相互作用が可能であり（図１７Ａ）、ＣＸＣＬ１２が媒介するＣａ2+応答を阻害し（図１７Ｂ）、野生型ペプチドに近い解離定数（３０μＭ）を示すが、ただし、最も短い４０８‐４１３は、受容体に対する親和性が下がり（＞２００μＭ）、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染の阻害にもほとんど効果がない（図６および表１）。まとめると、これらのデータは、いくつかのＣ末端切断型ＡＬＢ誘導体が、ＣＸＣＲ４と結合することができ、それによってＣＸＣＬ１２の結合およびシグナル伝達、またはＸ４向性ＨＩＶ‐１感染を阻止するＣＸＣＲ４アンタゴニストであることを示している。
【０１１０】
図１７．ＡＬＢ誘導体のＣＸＣＲ４アンタゴニスト活性。Ａ）ＡＬＢ断片は、ＣＸＣＬ１２が誘発するＣａ2+動員は阻害するがＣＣＬ５が誘発するものは阻害しない。ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５を発現するＨＥＫ２９３細胞を、示したＡＬＢ誘導体の非存在下（ＡＬＢなし）または存在下（５０μＭ）にて、それぞれＣＸＣＲ４アゴニストＣＸＣＬ１２（１０ｎＭ）またはＣＣＲ５アゴニストＣＣＬ５（２０ｎＭ）で処理した。カルシウム応答を記載のようにして記録した。示したデータは、アゴニストのみによる処理後のピークカルシウム応答（１００％）に対する、２回の反復サンプルから得られた平均値±標準偏差である。Ｂ）ＡＬＢ誘導体は、ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を抑止する。ＣＸＣＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＡＬＢペプチドの存在下または非存在下にて、テキサスレッド標識ＣＸＣＬ１２（ＣＸＣＬ１２‐Ｔｒ）で処理した。リガンド‐受容体相互作用のリアルタイム蛍光モニタリングを記載のようにして実施した。ＣＸＣＬ１２‐Ｔｒのみで処理した細胞（１００％結合）に対して、ＡＬＢペプチドの存在下における結合したＣＸＣＬ１２‐Ｔｒのレベルを示す。数値は、２回の反復実験から得た。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＩＶ‐１等のＣＸＣＲ４依存性ウイルスの感染を阻害し、ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合によって媒介される腫瘍細胞遊走を阻害するＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）拮抗性ポリペプチド（タンパク質）及びヒト循環抗ウイルスアルブミン断片（Ｈｕｍａｎ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｌｂｕｍｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ）（ＡＬＢ４０８‐４２３）、ならびに治療および診断におけるその使用に関する。本発明は、ＡＬＢ４０８‐４２３の天然の形態、ならびにそれから得られた断片および／または類似体もしくは誘導体、ならびに、最後に、薬効の指標として用いられるおよび診断薬として用いられる、該天然の、組換えの、および合成のペプチドを含有する薬剤を含む。さらに、本発明は、特に好ましい治療効果を有するＡＬＢ４０８‐４２３の修飾された形態および誘導体を含む。さらに、本発明は、ＡＬＢ４０８‐４２３またはその断片および／もしくは誘導体の一つへハイブリダイズする核酸プローブ、ならびにＡＬＢ４０８‐４２３またはその断片および／もしくは誘導体の一つに対して指向された抗体、またはアンタゴニストを含み、診断または治療目的、特にウイルス性疾患における、ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２感染の治療、さらには癌細胞の転移を防ぐための新生物疾患の治療、または喘息、肺線維症、もしくは関節リウマチ等の慢性炎症性疾患の治療のためのものである。
【背景技術】
【０００２】
ケモカイン受容体は、特定の細胞の表面上で発現され、ケモカインと称されるサイトカインと相互作用を起こす。ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）は、その内在性リガンドであるケモカインＣＸＣＬ１２（ストロマ細胞由来因子‐１、ＳＤＦ‐１）のシグナルを伝達するＧタンパク質共役受容体である。ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２の相互作用に続いて、細胞内カルシウム（Ｃａ2+）イオンの流入が誘発される。これが、細胞の生物内での移動を可能とする化学遊走を含む細胞反応を引き起こす。ＣＸＣＲ４は、ミエロイド細胞、Ｔ‐リンパ球、Ｂ‐リンパ球、上皮細胞、内皮細胞および樹状細胞上で発現される。ケモカインＣＸＣＬ１２は、ＣＸＣＲ４の唯一の既知のアゴニスト性リガンドである。ＣＸＣＬ１２とＣＸＣＲ４との相互作用は、心血管系、造血系、または中枢神経系の胚発生中の前駆細胞遊走において極めて重要な役割を担っている。この相互作用は、ＨＩＶ感染／ＡＩＤＳ、癌細胞転移、白血病細胞の進行、肺線維症、および関節リウマチ等のいくつかの疾患に関与していることも知られている。この相互作用は、これらの疾患すべてに対する決定的な治療標的であり得ると推察される。ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２シグナル伝達を阻害する物質は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ治療を例とする薬剤としての可能性を有するか、または、癌転移、白血病、および肺線維症、関節リウマチ、もしくは喘息等の炎症性疾患に関与する細胞遊走プロセスを阻止すると推察される（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）。細胞反応を誘発するＣＸＣＬ１２等の受容体アゴニストとは対照的に、受容体アンタゴニストは、その受容体と結合した際に、生物反応、すなわち、細胞遊走またはＣａ2+シグナル伝達、を誘発しないリガンドまたは薬剤である。受容体アンタゴニストは、ＨＩＶ‐１感染の阻害（ＣＣＲ５アンタゴニスト）またはアゴニストが媒介する細胞反応の低減が可能である有用な薬剤として既に臨床的に使用されている（例：アンジオテンシンアンタゴニスト、β‐アドレナリンアンタゴニスト、セロトニンアンタゴニスト、またはＣＣＲ５アンタゴニスト）。受容体アンタゴニストと受容体との相互作用により、アゴニストの機能が阻害される。ほとんどの薬剤アンタゴニストは、受容体上の構造的に決定される結合部位において内在性のリガンドまたは基質と競合することにより、その効力を発揮する。
【０００３】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストが癌細胞遊走を阻害し、従って転移を阻害することは、インビトロおよびインビボにてすでに示されている。ＣＸＣＲ４は、種々の細胞（ミエロイド細胞、Ｔ‐リンパ球、Ｂ‐リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、および樹状細胞）の表面上、ならびに異なる２３種類の癌細胞にて発現される。ＣＸＣＬ１２‐ＣＸＣＲ４相互作用は、乳癌、腎臓癌、前立腺癌、肺癌、および膵臓癌、ならびにメラノーマ、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、および悪性脳腫瘍を含むいくつかの種類の癌の転移に関与している（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）。Ｔ１４０類似体等のＣＸＣＲ４アンタゴニストが、ＣＸＣＬ１２によって誘発される膵臓細胞遊走および浸潤、または乳癌細胞遊走をインビトロおよびインビボにて抑制することが示されている（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）。ＣＸＣＲ４アンタゴニストが、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）の浸潤および接着をインビトロにて効果的に抑制することも実証されており（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）、ＣＸＣＬ１２‐ＣＸＣＲ４相互作用がＳＣＬＣ転移に関与していることが確認される。ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２相互作用は、前駆Ｂ（プレ‐Ｂ）急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ。ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、プレ‐Ｂ ＡＬＬ細胞の遊走も低下させる）の発症にも関与している（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）。さらに、関節リウマチが、ＣＸＣＲ４を発現するＣＤ４＋メモリーＴ細胞の炎症滑膜への蓄積によって引き起こされることが示されている。関節リウマチ患者では滑膜中のＣＸＣＬ１２濃度が非常に上昇しており、これがメモリーＴ細胞を誘引する。ＣＸＣＲ４拮抗性分子は、メモリーＴ細胞の滑膜への遊走を阻害する（Ｔｓｕｔｓｕｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８８： ２７９‐２８９、にてレビューされている）。
【０００４】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストは、アゴニストＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を阻害するだけでなく、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ１２０とＣＸＣＲ４との相互作用も阻止し、それによってウイルスの感染を阻害する。ヒト免疫不全ウイルス１および２（ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２）は、細胞表面に発現されたＣＤ４を一次受容体として用い、ケモカイン受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４を細胞移入のための共受容体として用いる。ＣＤ４およびＣＸＣＲ４を介して細胞に感染するウイルスは、ＣＸＣＲ４（Ｘ４）向性、ＣＤ４およびＣＣＲ５を用いるＨＩＶ‐１変異体は、Ｒ５向性、ならびに両方の共受容体を用いることができるウイルスは、二重向性（ｄｕａｌｔｒｏｐｉｃ）、と称される。Ｘ４向性ＨＩＶ‐１変異体は、全ＡＩＤＳ患者の約５０％で見ることができるに過ぎないが、Ｒ５向性ＨＩＶ変異体は、ＨＩＶ‐１感染の初期ステージおよび無症状ステージにおいて支配的である。Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染は、インビトロおよびＨＩＶ‐１に感染したヒトにおいて、細胞または患者をＡＭＤ３１００等のＣＸＣＲ４アンタゴニストで処理、治療することによって阻害可能であることが示されている。興味深いことに、ＣＣＲ５アンタゴニストであるマラビロクは、Ｒ５向性ＨＩＶ‐１変異体の感染を阻害する、ＡＩＤＳ治療において最初に臨床認可された薬剤である（Ｔｓｉｂｒｉｓ ａｎｄ Ｋｕｒｉｔｚｋｅｓ， ２００７， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５８：４４５‐４５９、にてレビューされている）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、癌と関連する病状、および喘息または肺線維症等の慢性炎症性疾患の治療に対する魅力的な治療標的である。ＣＸＣＬ１２が媒介する細胞反応を阻害するＣＸＣＲ４アンタゴニストは、疾患の発症および進行におけるこれらの重要な経路を阻害し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、以下のアミノ酸配列：
Ｚ1‐ＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬ‐Ｚ2（ＡＬＢ‐４０８）
を有するペプチド、ならびに、その生物学的活性誘導体、特にアミド化、アセチル化、硫酸化、リン酸化、および／もしくはグリコシル化誘導体、ならびに、多重合成によって得ることができるＡＬＢ４０８‐４２３の生物活性を有するペプチド、に関し；
ここで、Ｚは、０〜１０の数のアミノ酸残基を表す。
【０００７】
本発明のペプチドは、本発明のペプチド、特に本発明のＡＬＢ４０８‐４２３ペプチドにおいて、その配列中の単一もしくは複数のアミノ酸残基が、置換、欠失、もしくは付加されているか、または、本発明のペプチド、特にＡＬＢ４０８‐４２３、の単一のアミノ酸上に化学修飾が導入されており、本発明のペプチド、特にＡＬＢ４０８‐４２３、と類似もしくは同一の生物活性または薬理活性を有しているものとも関連している。特に、疎水性アミノ酸に対して疎水性アミノ酸、または芳香族アミノ酸に対して他の芳香族アミノ酸、または塩基性アミノ酸に対して他の塩基性アミノ酸を置換すること、等を意味する保存的なやり方で配列のアミノ酸を置換することによって容易に得ることができるペプチドが関係する。これは当業者に周知である。
【０００８】
本発明のペプチドのレトロインベルソ（ｒｅｔｒｏ‐ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチド、ならびにペプチダーゼに対してペプチド結合を安定化させるその他の誘導体も、本発明の範囲内である。
【０００９】
誘導体という用語は、Ｎ末端およびＣ末端切断などのあらゆる長さの断片、ＡＬＢ４０８‐４２３においてＤ‐アミノ酸残基や修飾アミノ酸残基も含めたアミノ酸残基の置換を有するもの、およびジスルフィド結合や、Ｎ末端やＣ末端での伸長を有するペプチド、を意味する。
【００１０】
本発明の別の主題は、本発明のペプチド、特にＡＬＢ４０８‐４２３および／またはその誘導体をコードするポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＰＮＡから構成されることを特徴とする。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞内での組換えペプチド発現、変異誘発試験、対象とするベクター内、特に遺伝子導入の手法に用いることができるベクター内でのクローン化、に用いられる。
【００１１】
本発明のさらなる主題は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をコードするベクターは、原核細胞または真核細胞内での組換えペプチド発現、変異誘発試験、および、特に、真核細胞へのＡＬＢ４０８‐４２３遺伝子導入に用いられる。
【００１２】
本発明の別の主題は、本発明のベクターを含む遺伝子操作された宿主細胞である。遺伝子操作された、ＡＬＢ４０８‐４２３または関連する誘導体を発現するトランスジェニック細胞を遺伝子治療の手法に用いることができ、それによって、ＡＬＢ４０８‐４２３および関連する誘導体を、ＣＸＣＲ４アンタゴニストを必要とする個体内、特に癌およびＡＩＤＳ患者内で発現および分泌させることが可能となる。
【００１３】
本発明のさらに別の主題は、本発明のポリペプチドに対する抗体である。このような抗体は、血液、血清、血漿等の身体サンプル中のＡＬＢ４０８‐４２３および関連するペプチドを、診断目的で、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または免疫蛍光にて検出するのに有用である。
【００１４】
本発明のペプチドは、本発明のペプチド、特にＡＬＢ４０８‐４２３を必要とする患者を治療するための方法において、投与することができる。
【００１５】
本発明のさらなる主題は、本発明のペプチドのアンタゴニスト／阻害剤の治療量を投与することによって、ＡＬＢ４０８‐４２３の阻害を必要とする患者を治療するための方法である。ＡＬＢ４０８‐４２３およびその誘導体は、ＣＸＣＲ４アンタゴニストであり、ＨＩＶ感染／ＡＩＤＳ、癌細胞転移、白血病細胞の進行、肺線維症、および関節リウマチ等のいくつかの疾患、ならびにその他の癌および炎症性疾患の治療を可能とする。
【００１６】
本発明のポリペプチドから成るガレノス製剤（ｇａｌｅｎｉｃ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）も、本発明の主題である。
【００１７】
本発明によると、本発明のペプチドをコードするＤＮＡの投与および患者内でのインビボでのその発現によってポリペプチドの治療効果が達成される、患者を治療するための方法も提供される。
【００１８】
本発明のペプチドは、カチオン交換抽出による血液ろ過液からの抽出、ならびにそれに続く吸着物質の溶離、ペプチドを含有する抽出物の再度のカチオン交換クロマトグラフィ、および分画逆相クロマトグラフィを含むプロセスによって提供することができる。
【００１９】
あるいは、本発明のペプチドを製造するためのプロセスは、メリフィールド合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）による固相合成、または、保護アミノ酸を用い、それ自体が当業者に公知の方法による液相合成、およびその精製によって実施することができる。
【００２０】
本発明のペプチドを製造するためのさらなるプロセスは、一般的な生物工学的ベクターを用いる、当業者に公知の異種発現の方法を用いる。
【００２１】
本発明のさらなる主題は、本発明のポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を含有する、または本発明のペプチド、特にＡＬＢ４０８‐４２３、をコードする核酸もしくはｍＲＮＡを含有する診断薬である。
【００２２】
本発明の診断薬は、本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドを含有し、組織、血漿、尿、および脳脊髄液等のサンプル中のこの物質のレベルを分析するための試験システムに用いるためのものである。
【００２３】
特に、診断薬および本発明のペプチドを検出する試験システムは、組織、血漿、尿、および脳脊髄液のこの物質のレベルを、ＲＰ‐ＨＰＬＣ、タンパク質沈殿、および／または固相抽出によるサンプル調製と組み合わせた、ＭＡＬＤＩ‐ＭＳまたはＥＳＩ‐ＭＳ等の質量分析法によって分析するために用いられる。
【００２４】
本発明の主題は、さらに、ウイルス性疾患、細菌および真菌感染、炎症および新生物形成プロセスに対するマーカーとして、ならびに炎症プロセス、撹乱された炎症反応（ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、腫瘍性疾患、成長障害、免疫系の疾患におけるマーカーとして、ならびに骨疾患におけるマーカーとして、本発明のペプチドを含有する診断薬である。
【００２５】
本発明は、さらに、経口、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、くも膜下腔内投与のためのガレノス剤形（ｇａｌｅｎｉｃ ｆｏｒｍ）の活性成分として、および経肺投与のためのエアロゾルとして、本発明のペプチドを含有する薬剤も提供する。
【００２６】
本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、抗体／アンタゴニスト、およびガレノス製剤は、ウイルス性疾患、特にＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス（１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、エプスタイン‐バーウイルス、の治療、ならびに細菌および真菌感染、炎症プロセス、撹乱された炎症反応、腫瘍性疾患、成長障害、神経疾患、凝血および造血の疾患、血管疾患、免疫系の疾患の治療、ならびに創傷および骨の治癒、のために用いることができる。
【００２７】
ＡＬＢ４０８‐４２３を具体例として用いて、本発明をさらに詳細に説明する。以下の説明において、同様にＡＬＢ４０８‐４２３を本発明のペプチドに置き換えることが可能であることは容易に理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａ〜図１Ｆは、ヒト血液ろ過液からのＡＬＢ４０８‐４２３の単離の詳細を示す図である。
【図２】画分３１を含有するＡＬＢ４０８‐４２３が、ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３感染を阻害することを示す図である。
【図３】化学的に合成されたＡＬＢ４０８‐４２３が、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染を特異的に阻害することを示す図である。
【図４】ＡＬＢ４０８‐４２３が、Ｘ４向性レンチウイルス感染を阻害することを示す図である。
【図５】ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性を示す図である。
【図６】ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性を示す図である。
【図７】ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性を示す図である。
【図８】ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性を示す図である。
【図９】ＡＬＢ誘導体の細胞毒性アッセイを示す図である。
【図１０】ＡＬＢ４０８‐４２３および切断型ＡＬＢ誘導体が、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染を特異的に阻害することを示す図である。
【図１１】ＡＬＢ４０８‐４２３および誘導体が、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のＸ４向性ＨＩＶ‐１感染を阻害することを示す図である。
【図１２】ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を阻害することを示す図である。
【図１３】ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ１のいずれのアゴニストでもないことを示す図である。
【図１４】ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＲ４を発現する細胞内において、ＣＸＣＬ１２が誘発するＣａ2+動員を特異的に阻害することを示す図である。
【図１５】ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ１２が介するＣＸＣＲ４の内在化を阻害することを示す図である。
【図１６】ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ‐１２が介するジャーカットＴ細胞の遊走を用量依存的に阻害することを示す図である。
【図１７】ＡＬＢ誘導体のＣＸＣＲ４アンタゴニスト活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
ＡＬＢ４０８‐４２３は、驚くべきことに、クロマトグラフィ法および生物学的アッセイにより、ヒト血液ろ過液から単離することができた。本発明のペプチドの生化学的特徴付けは、アミノ酸の完全な配列分析を含む質量分析によって行った。
【００３０】
このペプチドは、以下の配列番号８のアミノ酸配列：ＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬを有する。
【００３１】
本発明のペプチドＡＬＢ４０８‐４２３の分子量は１８３０．２Ｄａである。
【００３２】
本発明のペプチドＡＬＢ４０８‐４２３の等電点（ｐＩ）は、１０．３である。
【００３３】
驚くべきことに、本発明のペプチドは、そのプロセッシングされた形態で５８５個のアミノ酸から成る既知のヒト血漿タンパク質血清アルブミン（アクセス番号ＮＰ０００４６８）の１６個のアミノ酸を含む断片である。ヒトアルブミンは、分子量約６５，０００の可溶性単量体血清タンパク質であり、全血漿タンパク質の半分超を占める（濃度：３．５〜５ｇ／ｄｌ）。ヒトアルブミンの機能は、主として、例えばステロイドおよびペプチドホルモン、脂肪酸、ビタミン、薬剤、ならびにカチオンといったあらゆる種類の疎水性ならびに親水性物質のための担体分子としてのものであると説明される。その非常に高い血清中濃度のために、血液ｐＨの安定化、細胞外液体積、およびコロイド浸透圧の維持に実質的に寄与している。アルブミンは、多数のジスルフィド架橋によって安定化された球状構造を有しており、通常はグリコシル化されていないが、分子の老化に従い、または病態生理学的変化の際に、アセチル化、酵素的グリコシル化、および非酵素的グリコシル化による変化が発生する場合が多い。これは、６０９個のアミノ酸を有するプレプロアルブミン（ｐｒｅ‐ｐｒｏ‐ａｌｂｕｍｉｎ）として肝臓で合成され；１８個のアミノ酸を含むＮ‐末端シグナルペプチドが、小胞体への進入の際に細胞内で切断され；別の６個のアミノ酸がゴルジ体内で除去された後、５８５個のアミノ酸を含む成熟アルブミンが肝細胞によって分泌される。アルブミンのクリアランスは腎臓、消化管を通して、および肝臓の組織細胞内で行われる。
【００３４】
本発明のＡＬＢ４０８‐４２３のペプチド配列は、アミノ酸４０８から開始し、従って、循環形態のアルブミンのアミノ酸４０８〜４２３を含む。これは明らかに、対応するプロテアーゼによるアルブミン前駆体の天然のプロセッシングによって産生される。
【００３５】
驚くべきことに、本発明のペプチドは、ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）に対するアンタゴニストであり、ヒト細胞内でのＨＩＶ‐１の感染および複製の抑制、ならびに細胞遊走、Ｃａ2+動員、またはＣＸＣＲ４内在化等のＣＸＣＬ１２／ＣＸＣＲ４が誘発する細胞反応の抑制を引き起こす。
【００３６】
本発明のペプチドは、ヒト血液ろ過液（ＨＦ）からのクロマトグラフィによる精製によって得ることができる。ＨＦは、腎臓患者の血液の限外ろ過から大量に得られる（実施例１）。ＨＦは、ヒト血液中を循環する分子量３０ｋＤａ未満のすべてのペプチドおよびタンパク質を含有している。ＨＦ中のペプチドおよびタンパク質は、カチオン交換クロマトグラフィを用いて抽出した。カラムに結合したペプチドおよびタンパク質は種々のｐＨ値のバッファー系で溶離し、溶離液を逆相クロマトグラフィに掛けた（実施例１）。ＨＩＶ‐１感染を阻害する画分を同定するために、ペプチド画分をＰＢＳ中へ溶解し、ＨＩＶ許容性指標細胞（ＨＩＶ ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｃｅｌｌｓ）へ添加した。次に、細胞をＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ‐１に感染させ、感染後３日目（ｄｐｉ）の感染率を測定した（実施例１）。１つの画分が強力な抗ＨＩＶ活性を示し、これを、クロマトグラフィ精製およびＨＩＶ阻害アッセイのさらなるラウンドに掛け、生物活性ペプチドの同定を目指した（実施例１）。４ラウンドの精製の後、活性画分３１の質量分析から、分子量１８３０Ｄａの単一のペプチドの存在が明らかとなった（実施例２）。配列分析からＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬが同定され、配列比較から、アミノ酸残基４０８‐４２３（ＡＬＢ４０８‐４２３）を包含する、非常に豊富である血清タンパク質「ヒト血清アルブミン；（ＡＬＢ）」との１００％の相同性が示された（実施例２）。化学的に合成されたペプチド（実施例３）がＸ４向性ＨＩＶ‐１感染を用量依存的に阻害することから、活性の証拠が実証された（実施例４）。指標細胞内にて、ＡＬＢ４０８‐４２３は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１変異体を特異的に阻害するが、Ｒ５向性ＨＩＶ‐１感染には影響を与えない（実施例４および５）。ＡＬＢ４０８‐４２３は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐２の感染も抑制した（実施例５）。抗ウイルス活性に対して極めて重要である残基の同定を目的とした構造活性相関研究（ＳＡＲ）から得られたデータを実施例６にまとめるが、これより、ＡＬＢ４０８‐４２３のＮ末端の完全性がその抗ウイルス活性に対して重要であることが示される。対照的に、最大６アミノ酸残基までのＣ末端の切断では抗ウイルス活性が抑止されることはなかった。ＳＡＲ研究により、野生型ＡＬＢ４０８‐４２３と比較して抗ウイルス活性の上昇を示すＡＬＢ４０８‐４１９またはＡＬＢ Ｌ４０８Ｉ‐４１９等のＡＬＢ４０８‐４２３誘導体を同定することもできた（実施例６）。ＡＬＢ誘導体のいずれも細胞毒性を示さない（実施例７）。指標細胞内（実施例８）または一次血液単核細胞内（実施例９）にて、ＡＬＢ４０８‐４２３、ＡＬＢ４０８‐４１９、およびＡＬＢ Ｌ４０８Ｉ‐４１９は、種々のＸ４向性ＨＩＶ‐１変異体の感染は用量依存的に阻害したが、Ｒ５向性ＨＩＶ‐１変異体の感染は阻害しなかった。これらのデータはすべて、ＡＬＢ４０８‐４２３またはその誘導体とＨＩＶ共受容体ＣＸＣＲ４との特異的な相互作用を示している。
【００３７】
蛍光に基づく技術を用いて、ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＲ４と直接結合してこれと相互作用を起こし、それによって天然のＣＸＣＲ４アゴニストであるＣＸＣＬ１２の結合を阻止することを実証することができた（実施例１０〜１２）。ＡＬＢ４０８‐４２３またはその誘導体単独では、ＣＸＣＲ４、またはＣＣＲ５およびＣＸＣＲ１等のその他のケモカイン受容体を介したＣａ2+動員を誘発せず、このことは、ＡＬＢ４０８‐４２３が定義に従うＣＸＣＲ４アンタゴニストであることを示している（実施例１０〜１２および１４）。ＡＬＢ４０８‐４２３の存在下にて、ＣＸＣＬ１２が介する細胞遊走（実施例１３）、およびＣＸＣＲ４受容体の内在化も阻害することができ、このことから、ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＲ４アンタゴニストであることのさらなる証拠が提供される（実施例１２）。まとめると、ヒト血清アルブミン断片であるＡＬＢ４０８‐４２３は、ＨＩＶ‐１感染阻害アッセイを用い、ＨＦ由来のペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって同定された。化学合成されたペプチドおよびその誘導体は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２感染を、ＣＸＣＲ４受容体との直接の相互作用によって用量依存的に阻害する。ＡＬＢ４０８‐４２３およびその誘導体は、細胞応答を媒介せず、天然のＣＸＣＲ４アゴニストであるＣＸＣＬ１２の活性を抑制することから、アンタゴニストとして作用する。これらのデータは、ＡＬＢ４０８‐４２３が最初のヒトＣＸＣＲ４アンタゴニストであることの証拠である。ＡＬＢ４０８‐４２３およびその誘導体は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１に感染した個体の治療において、癌転移の予防、ならびにＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２シグナル伝達が関与する慢性炎症性疾患への干渉、およびＣＸＣＬ１２が介するＣＸＣＲ４を通してのシグナル伝達の抑制に有用であり得る。
【００３８】
本発明のペプチド、ならびにそのペプチドの類似体、断片、および誘導体、そのｃＤＮＡ、その遺伝子、ならびにＡＬＢ４０８‐４２３の活性を中和する抗体を、薬剤として用いることができる。その生物学的活性は、ウイルス阻害物質、癌細胞遊走阻害物質、およびＣＸＣＲ４拮抗性物質の生物学的活性に対応している。ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＲ４と特異的に結合し、それによって、ＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ‐１変異体の感染および天然のＣＸＣＲ４アゴニストであるＣＸＣＬ１２の結合を阻止する。本発明のペプチドは、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、局所‐外用（ｌｏｃａｌ‐ｔｏｐｉｃ）、皮下、または頬側経路でのペプチドに対して通例である方法によって投与することができる。投与されるペプチドの量は、１日の単位用量あたり１μｇ〜１ｇである。本発明のペプチドの活性は、適切な阻害剤／アンタゴニストを投与することによって阻害することができる。
【００３９】
本発明の診断薬は、本発明のペプチドに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含み、それ自体が公知であるＥＬＩＳＡまたはＲＩＡで用いるために、蛍光標識または放射性標識された形態であってもよい。本発明の診断薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはＰＮＡを含み、ＰＣＲまたはフィンガープリンティング等の当業者に公知の試験システムで用いるために、修飾および／または標識された形態であってもよい。別の選択肢として、本発明の診断薬は、対応するサンプル調製および濃縮（沈殿による大型タンパク質の分離、クロマトグラフィまたはＲＰ媒体（ＲＰ ｍｅｄｉａ）、固相抽出によるＡＬＢ４０８‐４２３の濃縮）の後、その物質をその一価または多価イオン（親イオンまたはＭＳ‐ＭＳフラグメンテーション後の生成イオン）から定性的および定量的に明白に検出する質量分析法（ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ‐ＭＳ）から成る。
【００４０】
本発明を、以下の実施例により、さらに説明する。
【実施例】
【００４１】
[実施例１]
ヒト血液ろ過液からの抗ウイルス効果を有するＡＬＢ４０８‐４２３の単離
ヒト血液ろ過液は、所望により水による希釈および酸性化を行ってもよい。ｐＨ値は、１．５〜３．５が好ましく、２．５〜３．０が特に好ましい。その後、この血液ろ過液を、例えばスルホン酸基で修飾された支持体材料（Ｆｒａｋｔｏｇｅｌ ＳＰ‐６５０（Ｍ）， Ｍｅｒｃｋ，ダルムシュタット，ドイツ）などのカチオン交換樹脂に通す。カチオン交換樹脂に結合したペプチドは、比較的高濃度の塩溶液で溶離させる。溶出液のイオン強度は、０．５Ｍ〜１Ｍの酢酸アンモニウム溶液のそれとおよそ同じである。
【００４２】
回収した溶出液を別のカチオン交換クロマトグラフィに掛ける。このクロマトグラフィは、バッファーのｐＨ値を上昇させていくことによる分画溶離が好ましい。
【００４３】
本発明のペプチドを含有する画分は、分取用逆相クロマトグラフィ、続いて、例えばＣ１８‐修飾支持体上での、セミ分取用逆相クロマトグラフィによってさらに精製する。精製の度合いは、例えばＣ１８‐修飾支持体材料上での、分析用逆相クロマトグラフィを用いてモニタリングすることが好ましい。
【００４４】
第一工程：血液ろ過液のバッチ抽出
８００〜１０００リットルの血液ろ過液を、ＨＣｌにより２．７のｐＨ値に調節し、水で希釈して導電率を５．５ｍＳ／ｃｍとし、３Ｌ／分の流速で強カチオン交換体にチャージする。
【００４５】
クロマトグラフィ条件：
カラム： Ｖａｎｔａｇｅ ＶＡ２５０（Ａｍｉｃｏｎ，ビッテン，ドイツ）
カラム材料： Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＳＫ ＳＰ６５０（Ｍ）、２５ｃｍ×２０ｃｍ
流速： ３Ｌ／分
検出： ２８０ｎｍ、ｐＨ、導電率
バッファーＡ： 血液ろ過液 ｐＨ２．７、導電率５．５ｍＳ／ｃｍ
バッファーＢ： ０．５Ｍ酢酸アンモニウム
装置： Ａｕｔｏｐｉｌｏｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ビースバーデン，ドイツ）
【００４６】
全量１０００リットルの液体を一晩かけてチャージした後、数カラム容量分の５ｍＭのＨＣｌによる洗浄を行う。結合したペプチドの溶離は、０．５Ｍの酢酸アンモニウムによるバッチ溶離として行う。ペプチドの完全な溶離は、ｐＨ値の勾配（６．８〜７．２）および導電率の勾配（５６ｍＳ／ｃｍ）により、約５リットルの溶離液で達成される。
【００４７】
第二工程：一回目の分取分離（バッチ０１／２００３）
バッチ抽出の酢酸アンモニウム溶出液を、１０，０００リットルの血液ろ過液ペプチド分まとめる。ｐＨを２．７に調節した後、このペプチド抽出液を、導電率が５．５ｍＳ／ｃｍである完全脱塩水を添加した状態の分取用カチオン交換体にチャージする。
【００４８】
クロマトグラフィ条件：
カラム： Ｖａｎｔａｇｅ ２５０ＶＡ
カラム材料： Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＳＫ ＳＰ６５０（Ｍ）、２５ｃｍ×２０ｃｍ
流速： チャージ時 最大３Ｌ／分
溶離時 ０．５〜１Ｌ／分
検出： ２８０ｎｍ、ｐＨ、導電率
サンプル： 血液ろ過液 ｐＨ２．７、導電率５．５ｍＳ／ｃｍ
装置： Ａｕｔｏｐｉｌｏｔ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ビースバーデン，ドイツ）
【００４９】
未処理の抽出液を２４０分かけてチャージした後、導電率が１ｍＳ／ｃｍ未満となるまで０．０１ＭのＨＣｌでカラムを洗浄する。溶離は、以下に示すバッファーを用いて数工程で実施する。
【００５０】
【数１】
【００５１】
溶出液１〜７を、ｐＨプールＩ〜ＶＩＩと称する。これらは、別々に回収し、最後に、完全脱塩水で洗浄する。溶離は、新たなベースラインが達成されるまで行い、個々のｐＨプールＩ〜ＶＩＩに対して溶離容量は１０〜２５リットルに達する。
【００５２】
第三工程：二回目の分取分離：
分画および同時に行う脱塩のために、個々のｐＨプールを逆相クロマトグラフィによって分離する。
【００５３】
クロマトグラフィ条件：
カラム： ＦｉｎｅＬｉｎｅ １００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，フライブルク，ドイツ）
カラム材料： Ｓｏｕｒｃｅ ＲＰＣ、１５μｍ
１０×１２．５ｃｍ（ＦｉｎｅＬｉｎｅ １００）
流速： １５０ｍｌ／分（ＦｉｎｅＬｉｎｅ １００）
検出： ２８０ｎｍ、導電率、ｐＨ
バッファーＡ： １０ｍＭ ＨＣｌ
バッファーＢ： １０ｍＭ ＨＣｌ中の８０％ アセトニトリル
勾配： ０〜６０％のバッファーＢで５カラム分の容量
【００５４】
個々のｐＨプールをチャージ後、カラムをバッファーＡで洗浄する。溶離中に、２００ｍｌの画分を回収する。これらの画分を凍結乾燥し、−２０℃にて保存する。形成された画分のアリコートをＨＩＶ阻害アッセイにて試験する。ｐＨプールＩＩからの画分６〜８が本発明のペプチドを含有していた。
【００５５】
図１Ａ〜Ｆ：ヒト血液ろ過液からのＡＬＢ４０８‐４２３の単離。ｐＨ段階溶離により分画した血液ろ過液をＲＰ‐ＨＰＬＣによってさらに分画し、得られた画分をＨＩＶ阻害試験にて測定した。コントロール：Ｔ２０コントロール。
【００５６】
Ａ． 単離の第三工程。ｐＨプール２のＲＰ画分が、画分６〜８において阻害活性を示した。
Ｂ〜Ｅ． 単離の第四〜第七工程。阻害活性を、純粋物質が得られるまで精製した。
Ｆ． 精製されたＡＬＢ４０８‐４２３の質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ‐ＭＳ）および配列分析。
【００５７】
ＨＩＶ阻害試験は、４０００個のＰ４‐Ｒ５ ＭＡＧＩ細胞（Ｐ． Ｃｈａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４１： ６５１， １９９４）を、１００μｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）中へ播種することによって実施した。Ｐ４‐Ｒ５細胞は、ＬＴＲ‐ｌａｃＺカセットによって安定的にトランスフェクトされ、ＨＩＶ‐１による感染に成功すると、Ｔａｔに依存的にβ‐ガラクトシダーゼを発現し、これは、化学発光試験にて検出することができる。翌日、画分のアリコートを添加した。そのために、凍結乾燥された画分を８０μｌのＤＭＥＭへ再懸濁させ、その各々の２５μｌをＰ４‐Ｒ５細胞へピペットで分注し、３７℃にて１時間インキュベートし、続いてＨＩＶ‐１ ＮＬ４＿３（１ｎｇのｐ２４抗原）で感染させた。ウイルスストックは、リン酸カルシウム法（ＣａｌＰｈｏｓ（商標） Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によるプロウイルスＤＮＡを用いた２９３Ｔ細胞の一過性の感染によって得た。ウイルスストックはトランスフェクションの４８時間後に回収してろ過し、感染に用いた。感染後３日目に、感染したＰ４‐Ｒ５細胞のβ‐ガラクトシダーゼ活性を、製造元の推奨に従ってＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ｔｒｏｐｉｘ）を用ることで検出した。簡単に述べると、上清を除去し、ＰＢＳ／ＧａｌＳｃｒｅｅｎ＋基質の１：１希釈物４０μｌを添加し、続いて室温にて３０分間インキュベートした。次に、ライセート３０μｌを９６ウェルのルミプレート（ｌｕｍｉｐｌａｔｅ）へ移した。続いて、発光を、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｏｒｉｏｎ）により、秒あたりの相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ）として検出した。全測定値から、非感染コントロール細胞の平均β‐ガラクトシダーゼバックグラウンド活性を減じた。各感染についての感染％の値を、ペプチド非含有のコントロール（１００％）に対して算出した。ＡＬＢ４０８‐４２３の非存在下での測定における酵素活性を１００％に設定し、その他のすべての値はこれに基づいたものとした。最終精製（第七工程）は、ＴＺＭ‐ｂｌ細胞（Ｘ． Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４６： １８９６， ２００２）とまったく同一の条件下にて試験した。
【００５８】
第四工程：セミ分取用逆相Ｃ１８クロマトグラフィ
本アッセイにて生物活性であった（図１Ａ）ｐＨプールＩＩからの画分６〜８の全量２００ｍｇ（１０８７リットルの血液ろ過液等量に相当）を、セミ分取用逆相カラムを通して分離した。画分３３＋３４が、本発明の物質を含有していた（図１Ｂ）。
【００５９】
クロマトグラフィ条件：
カラム： ４．７ｃｍ×３０ｃｍ スチールカラム
充填材料： Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＲＰ‐Ｃ１８、１５〜３０μｍ、３００Å）
バッファーＡ： １００％ 水、１０ｍＭ ＨＣｌ
バッファーＢ： ８０％ アセトニトリル、２０％ 水、１０ｍＭ ＨＣｌ
勾配： ０〜３０％のＢで２０００ｍｌ
流速： ４０ｍｌ／分（圧力：４０ｂａｒ）
検出： ２１４ｎｍおよび２８０ｎｍ
クロマトグラフィ装置： ＢｉｏＣａｄ ２５０、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
画分： 勾配の開始（１０．７５分）から５０ｍｌずつ
【００６０】
第五工程：セミ分取用逆相Ｃ１８クロマトグラフィ
アッセイで生物活性を示した、先のクロマトグラフィ工程からの画分３３＋３４を、異なる移動相を用いて類似のセミ分取用逆相カラムを通して分離した。続くＨＩＶ感染アッセイにより、画分５＋６が本発明の物質を含有することが明らかとなった（図１Ｃ）。
【００６１】
クロマトグラフィ条件：
カラム： ４．７ｃｍ×３０ｃｍ スチールカラム
充填材料： Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＲＰ‐Ｃ１８、１５〜３０μｍ、３００Å）
バッファーＡ： ３０％ メタノール、７０％ 水、１０ｍＭ ＨＣｌ
バッファーＢ： １００％ メタノール、１０ｍＭ ＨＣｌ
勾配： ０〜１５％のＢで４０ｍｌ
１５〜６０％のＢで１９００ｍｌ
流速： ４０ｍｌ／分（圧力：３０ｂａｒ）
検出： ２１４ｎｍおよび２８０ｎｍ
クロマトグラフィ装置： ＢｉｏＣａｄ ２５０、Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
画分： 勾配の開始（９．７５分）から５０ｍｌずつ
【００６２】
第六工程：分析用逆相Ｃ４クロマトグラフィ
先のクロマトグラフィからの生物活性画分５＋６を、分析用逆相カラムを通して分離した。アリコートをバイオアッセイ（ＨＩＶ阻害アッセイ）で試験した。画分５１〜５７が本発明の物質を含有していた（図１Ｄ）。
【００６３】
クロマトグラフィ条件：
カラム： ２ｃｍ×２５ｃｍ スチールカラム
充填材料： ＲＰ‐Ｃ４、５μｍ、１００Å、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｉｌｉｃａ，エストリンゲン，ドイツ）
バッファーＡ： 水、０．１％ ＴＦＡ
バッファーＢ： ８０％ アセトニトリル、２０％ 水、０．１％ ＴＦＡ
勾配： ０〜５％のＢで２分間、５〜３５％のＢで６０分間、３５〜１００％のＢで３分間
流速： ７ｍｌ／分
検出： ２１４ｎｍおよび２８０ｎｍ
クロマトグラフィ装置： Ｋｏｎｔｒｏｎ
画分： １分から１分ごと
【００６４】
第七工程：分析用逆相Ｃ１８クロマトグラフィ
先のクロマトグラフィからの生物活性画分５１〜５７を、分析用逆相カラムを通して分離した。アリコートをバイオアッセイで試験した。画分３１が本発明の物質を純粋な形態で含有していた（図１Ｅ）。
【００６５】
クロマトグラフィ条件：
カラム： １ｃｍ×２５ｃｍ スチールカラム
充填材料： ＲＰ‐Ｃ１８、５μｍ、３００Å、Ｖｙｄａｃ（ヘスピーリア，米国）
バッファーＡ： 水、０．１％ ＴＦＡ
バッファーＢ： ８０％ アセトニトリル、２０％ 水、０．１％ ＴＦＡ
勾配： ０〜１５％のＢで５分間、１５〜４５％のＢで６０分間、４５〜１００％のＢで１分間
流速： ２ｍｌ／分
検出： ２１４ｎｍおよび２８０ｎｍ
クロマトグラフィ装置： Ｋｏｎｔｒｏｎ
画分： １分から１分ごと
【００６６】
本発明の純粋な物質は画分３１に含有されており、次にこれを、用量依存的にバイオアッセイにて試験し、ペプチド化学によって特性を明らかにした（実施例２）。
【００６７】
[実施例２]
質量測定
血液ろ過液から単離されたペプチド（実施例１の第七工程の画分３１より）、および化学合成されたペプチド（実施例３）の質量測定を、ＭＡＬＤＩ質量分析器（Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ‐Ｐｒｏ）で実施した。ペプチドの分子質量は、以下の質量数値（ＭＷ）に相当すると測定された。
ＡＬＢ４０８‐４２３、ヒト血液ろ過液から単離（図１Ｆ）： １８３０．９Ｄａ
ＡＬＢ４０８‐４２３、化学合成ペプチド： １８３０．６Ｄａ
【００６８】
配列決定
精製された天然のペプチドを、ＰＲＯＴＥＯＭＥＦＡＣＴＯＲＹ ＡＧ社，Ｄｏｒｏｔｈｅｅｎｓｔｒ．９４，１０１１７ ベルリン（ドイツ）、から提供されたＭＳ‐ＭＳカップリング分析（ＥＳＩ‐ＴＲＡＰ）により、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンによる確立されたＥＳＩ ＭＳ‐ＭＳ質量のデータベース比較によって分析した結果、次の配列が最も確率の高かった。
ＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬ（図１Ｆ）
【００６９】
データベース比較
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースによるさらなるデータベース比較により、このペプチド配列が、ヒトタンパク質血清アルブミン（アクセス番号ＮＰ０００４６８）のアミノ酸４０８‐４２３と１００％の同一性を有することが示され、この配列は、アミノ酸：ＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬ、を含有している。
【００７０】
精製画分３１はＨＩＶ‐１阻害バイオアッセイにおいて活性である
実施例１の第七工程からの画分３１の１．６ｍｇを１６０μｌのＤＭＥＭへ溶解した。続いて、ＡＬＢ４０８‐４２３を含有する画分３１の段階希釈物１０μｌを６０μｌのＴＺＭ‐ｂｌ細胞（６０μｌ）へ添加し、１ｎｇのｐ２４抗原ＨＩＶ‐１ ＮＬ４＿３によって感染させ、全量を１００μｌとした。３日後、ＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにて感染率を測定した（実施例１参照）。画分３１は、このＸ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４＿３による感染を用量依存的に阻害した。最大値の半分まで感染を阻害する用量（ＩＣ50）は、２１．４５μｇ／ｍｌであった（図２）。
【００７１】
図２：ＡＬＢ４０８‐４２３を含有する画分３１は、ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３の感染を阻害する。ＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、画分３１の段階希釈物と共にインキュベートし、次にＸ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３で感染させた。３日後、ＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにて感染率を測定した。ＰＢＳ処理コントロール（１００％）に対する、３回の反復感染の平均値±標準偏差を示す。
【００７２】
[実施例３]
ＡＬＢ４０８‐４２３の化学合成
ＡＬＢ４０８‐４２３の化学合成は、公知のＦｍｏｃ化学を用い、ペプチド合成機９０５０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上での従来の固相合成によって実施した。得られたペプチドは、逆相クロマトグラフィで精製し、実施例２で述べた分析用ＲＰ‐ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ‐ＭＳ質量測定により、その同一性および純度を確定した。
【００７３】
[実施例４]
Ｘ４‐向性ＨＩＶ‐１変異体の感染を特異的に阻害する合成ＡＬＢ４０８‐４２３
５０００個のＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、１００μｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、および１００μｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン）中へ播種した。ＡＬＢ４０８‐４２３をＰＢＳへ溶解した（１０ｍｇ／ｍｌ）。１日後、ＰＢＳによるＡＬＢ４０８‐４２３の段階希釈物２０μｌを細胞へ添加し、続いて、０．５ｎｇのｐ２４抗原ＨＩＶ‐１で細胞を感染させ、全量を２００μｌとした。共受容体向性の異なる複数のＨＩＶ‐１分子クローンを用い、これらは記載に従って作出した（Ｐａｐｋａｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６： ８４５５‐９， ２００２）。
【００７４】
図３：化学合成ＡＬＢ４０８‐４２３は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１の感染を特異的に阻害する。示した希釈率のペプチドを含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、その共受容体向性が異なる複数のＨＩＶ‐１変異体で感染させた。３日後、ＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイを用いて感染率を測定した。Ａ）Ｘ４向性ＨＩＶ‐１変異体ＮＬ４‐３、Ｐ５１‐Ｓｃ、Ｐ５９‐Ｓ／２７、およびＰ３４‐Ｓ、または二重向性９２ｈｔ５９３．１の用量依存的阻害。Ｂ）５００μｇ／ｍｌのＡＬＢ４０８‐４２３の存在下での感染率。このペプチドが、Ｒ５向性ＨＩＶ‐１感染は阻害しないがＸ４向性ＨＩＶ‐１感染は特異的に阻害することを示している。示したデータは、ＰＢＳ含有細胞（１００％感染）に対する、３回の反復感染の平均値±標準偏差である。
【００７５】
３日後、ＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイ（Ｔｒｏｐｉｘ）を用いて感染を検出した（実施例１）。ＡＬＢ４０８‐４２３は、分析したすべてのＸ４‐向性ＨＩＶ‐１変異体による感染を用量依存的に阻害した（図３Ａ）（平均ＩＣ50は２４．２μｇ／ｍｌ）。二重向性（ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５を利用する）変異体９２ｈｔ５９３．１の阻害は、これよりも効率が低かった。対照的に、ＣＣＲ５向性ＨＩＶ‐１変異体は、非常に高い用量のＡＬＢ４０８‐４２３の存在下（５００μｇ／ｍｌ）であっても阻害されなかった（図３Ｂ）。Ｘ４‐向性ＨＩＶ‐１変異体に起因する感染を特異的に阻害することから、ＡＬＢ４０８‐４２３は、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４と相互作用を起こすと推定される。
【００７６】
血液ろ過液から精製されたＡＬＢ４０８‐４２３（実施例２）および化学合成されたＡＬＢ４０８‐４２３（実施例４）のいずれも、標的細胞内でのＨＩＶ‐１の複製を用量依存的に阻害することを示し、このことは、ＡＬＢ４０８‐４２３が天然のヒトＨＩＶ‐１阻害分子であることの証拠を提供する。
【００７７】
[実施例５]
合成ＡＬＢ４０８‐４２３はＣＸＣＲ４向性レンチウイルスの感染を用量依存的に阻害する
Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３およびＨＩＶ‐２ＲＯＤ１０、またはＣＣＲ５向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３ ９２ｔｈ０１４、ＨＩＶ‐１‐７３１２、およびＳＩＶｍａｃ２３９は、２９３Ｔ細胞の一過性のトランスフェクションによって作出し、これらを用いて、示した濃度のＡＬＢ４０８‐４２３を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を感染させた。２日後、感染率を既述のようにして測定し算出した（実施例４）。結果から、ＡＬＢ４０８‐４２３は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２の感染を用量依存的に阻害したが（ＩＣ50は約１０〜２０μＭ）、一方このペプチドは、Ｒ５向性レンチウイルスの感染には影響を及ぼさなかったことが示され、これは、ＣＸＣＲ４向性ＨＩＶ‐１およびＨＩＶ‐２の特異的な阻害を実証するものである（図４）。
【００７８】
図４：ＡＬＢ４０８‐４２３は、Ｘ４向性レンチウイルスの感染を阻害する。感染性を正規化したＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２、およびＳＩＶのストックを用いてＡＬＢ４０８‐４２３を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を感染させた。３日後、Ｇａｌ Ｓｃｒｅｅｎアッセイを用いて感染率を測定した。３回の反復測定から得られた平均値±標準偏差を示す。ペプチドを含有しない細胞の感染率を１００％とする。
【００７９】
表１：Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３の感染に対する種々のＡＬＢ断片の抗ウイルス活性。合成ペプチドの段階希釈物を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３によって感染させ、感染の２日後に、実施例１および２で述べたようにして感染率を測定、算出した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージを用いてＩＣ50値を求めた。略語：Ｄａ、分子量；ＩＣ50 μＭ、３回の反復実験より得た半数（５０％）阻害濃度；ＳＥＭ、平均値の標準誤差；ｅｘｐ、実施した実験回数。
【００８０】
【表１】
【００８１】
[実施例６]
ＡＬＢ４０８‐４２３誘導体を用いた構造活性相関（ＳＡＲ）研究
ＮもしくはＣ末端欠失、またはアミノ酸置換を含有する種々のＡＬＢ４０８‐４２３誘導体（表１）を化学的に合成し、凍結乾燥したペプチドをＰＢＳ中へ溶解した。この抗ウイルス活性を、既述のようにしてＸ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３を用い、ＴＺＭ‐ｂｌ細胞内で分析した（実施例４）。ＡＬＢ４０８‐４２３のＮ末端欠失（４０９‐４２３、４１０‐４２３、４１１‐４２３、４１２‐４２３、４１３‐４２３、４１４‐４２３、４１５‐４２３）によって抗ウイルス活性が大きく減退または無効化され、このことは、ＡＬＢ４０８‐４２３が介するＸ４向性ＨＩＶ‐１の阻害に対して、Ｎ末端ロイシン（Ｌ４０８）が極めて重要であることを示している（図５および図６）。
【００８２】
図５．ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性。ＡＬＢ誘導体の段階希釈物を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３により感染させた。２日後、感染率をＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにより測定した。ペプチドを含有しないサンプル（感染率＝１００％）に対して、３回の反復感染から得られた平均値を示す。
【００８３】
図６．ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性。ＡＬＢ誘導体の段階希釈物を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３により感染させた。２日後、感染率をＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにより測定した。ペプチドを含有しないサンプル（感染率＝１００％）に対して、３回の反復感染から得られた平均値を示す。
【００８４】
Ｃ末端にて最大８個のアミノ酸残基が切断されたＡＬＢ４０８‐４２３誘導体（４０８‐４２２、４０８‐４２１、４０８‐４２０、４０８‐４１９、４０８‐４１８、４０８‐４１７、４０８‐４１６、４０８‐４１５、４０８‐４１４、４０８‐４１３）は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染の阻害についての活性を維持した（図５および６、表１）。しかしながら、Ｃ末端におけるさらなる欠失（４０８‐４１４および４０８‐４１３）により、不活性ペプチドとなった（ＩＣ50値＞５０μＭ）（図６）。興味深いことに、Ｃ末端欠失変異体ＡＬＢ４０８‐４１９は、野生型ＡＬＢ４０８‐４２３よりも効率的にＸ４向性ＨＩＶ‐１感染を阻害した（４．４±１．０ 対 ７．６±１．２；平均ＩＣ50値（μＭ）±ｓｅｍ）（表１；図５、６、７、および８）。
【００８５】
図７．ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性。ＡＬＢ誘導体の段階希釈物を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３により感染させた。２日後、感染率をＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにより測定した。ペプチドを含有しないサンプル（感染率＝１００％）に対して、３回の反復感染から得られた平均値を示す。
【００８６】
図８．ＡＬＢ誘導体の抗ウイルス活性。ＡＬＢ誘導体の段階希釈物を含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３により感染させた。２日後、感染率をＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイにより測定した。ペプチドを含有しないサンプル（感染率＝１００％）に対して、３回の反復感染から得られた平均値を示す。
【００８７】
ＡＬＢ４０８‐４１５誘導体を包含する８個のアミノ酸残基のみが強力な抗ウイルス活性を示したことから（１７．４±６．５）、特定のアミノ酸置換を含有するＡＬＢ４０８‐４１５誘導体を合成してこれを試験することにより、アラニンスキャンを行った（表１）。図７および表１に示したデータは、ほとんどの置換がＡＬＢ４０８‐４１５の抗ウイルス活性を減退させたことを実証している。特に、アルギニン４１０（ＡＬＢ‐Ｒ４１０Ａ、ＩＣ50＞１０００μＭ 対 ＡＬＢ４０８‐４１５；１７．４±６．５）が、ＨＩＶ‐１阻害において重要な役割を担っている（図７、表１）。スレオニン４１２のアラニンへの置換（ＡＬＢ‐Ｔ４１２Ａ）により、中程度に抗ウイルス活性が高められたペプチドが得られた（１１．２±０．１）（図７および表１）。
【００８８】
ＡＬＢ４０８‐４１９の抗ウイルス活性に対するＮ末端ロイシン（Ｌ４０８）の役割をさらに解明するために、この残基をフェニルアラニン（Ｆ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、またはイソロイシン（Ｉ）で置換した。ＨＩＶ‐１阻害アッセイにより、Ｎ末端における置換のほとんどが不活性なペプチドをもたらすことが明らかとなった（ＡＬＢ４０８Ｆ‐４１９、ＡＬＢ４０８Ａ‐４１９、およびＡＬＢ４０８Ｇ‐４１９）（図８）。しかしながら、イソロイシンへの相同的な置換（ＡＬＢＬ４０８Ｉ‐４１９）は、中程度に抗ウイルス活性が高められたペプチドをもたらした（１．５５±１．２）（図８）。ＡＬＢ４０８‐４１９のＮ末端におけるロイシンの付加（４０７‐４１９）は、抗ウイルス活性を低下させた（図８）。
【００８９】
まとめると、ＳＡＲ分析は、抗ウイルス活性が高められた切断型のＡＬＢ誘導体の同定を可能とし、Ｃ末端とは対照的に、Ｎ末端部分が、ＡＬＢ４０８‐４２３が介するＸ４向性ＨＩＶ‐１感染の阻害に対して極めて重要であることを示した。
【００９０】
[実施例７]
ＡＬＢ誘導体はいずれも細胞毒性を示さない
ＡＬＢ変異体の細胞毒性効果の可能性を評価するために、５×１０3個のＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、最も強力な抗ウイルス活性を及ぼすペプチド（表１および図９）の増加する種々の濃度と共に、３日間インキュベートした。細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ７５７１）を製造元の推奨に従って用いて測定した。この発光に基づくアッセイは、細胞内ＡＴＰの量に基づいて生存細胞数を測定する。データは、ルミノメーターを用い、試薬の添加後１０分で記録した。ＰＢＳのみでインキュベートした細胞から得られた発光活性を１００％に設定した。図９に示した結果より、試験したいずれのＡＬＢ誘導体でも、３００μＭ以下の濃度では細胞毒性効果が見られなかったことが明らかに示される。
【００９１】
図９．ＡＬＢ誘導体の細胞毒性アッセイ。ＡＬＢ誘導体の段階希釈物をＴＺＭ‐ｂｌ細胞へ添加した。２日後、細胞のＡＴＰレベルをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイを用いて測定した。数値は、３回の反復測定から得た。ＰＢＳを含有する（ペプチドを含有しない）細胞内のＡＴＰレベル（１００％）に対して、生存率の％を算出した。
【００９２】
[実施例８]
ＡＬＢ４０８‐４２３の抗ウイルス活性および最も強力な誘導体
種々のＨＩＶ‐１クローンに対する最も活性であるＡＬＢペプチドの効果を調べるために、２９３Ｔ細胞をプロウイルスプラスミドでトランスフェクトすることによって異なる共受容体を利用するウイルスを作出した（Ｐａｐｋａｌｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６： ８４５５‐９， ２００２）。ウイルスストックをまずＴＺＭ‐ｂｌ細胞に滴定した。次に、１００μＭのペプチドを含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、感染性を正規化した量のＸ４向性、二重向性（Ｘ４／Ｒ５）、またはＲ５向性ＨＩＶ‐１で感染させた。既述のように（実施例４）感染率を測定し、野生型ＡＬＢ４０８‐４２３、Ｃ末端切断型ＡＬＢ４０８‐４１９およびＡＬＢ Ｌ４０８Ｉ‐４１９変異体、ならびにＡＬＢ‐Ｔ４１２Ａが、分析したすべてのＸ４向性ＨＩＶ‐１クローン（ＮＬ４‐３、Ｐ５１‐Ｓｃ、Ｐ３４‐ｓ）の感染をほぼ完全に阻害したことが示された（図１０）。これらのペプチドは、Ｒ５向性ＨＩＶ‐１感染に対しては影響を及ぼさず、二重向性ＨＩＶ‐１クローン９２ｈｔ５９３．１によるＴＺＭ‐ｂｌ細胞の感染は中程度に阻害しただけであった。これらのデータは、抗ウイルス活性が高められたＡＬＢ変異体（ＡＬＢ４０８‐４２３と比較して）（表１）も、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１変異体の広範囲にわたる阻害剤であることを実証している。
【００９３】
図１０．ＡＬＢ４０８‐４２３および切断型ＡＬＢ誘導体は、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染を特異的に阻害する。ＰＢＳ及び１００μＭの示されたペプチドを含有するＴＺＭ‐ｂｌ細胞を、正規化された感染性のＸ４向性、二重向性、またはＲ５向性ＨＩＶ‐１クローンで感染させた。感染の２日後に感染率をＧａｌＳｃｒｅｅｎアッセイを用いて測定した。３回の反復測定から得られた平均値（ＰＢＳ処理コントロールに対する％）±標準偏差を示す。
【００９４】
[実施例９]
ＡＬＢ４０８‐４２３、ＡＬＢ４０８‐４１９、およびＡＬＢ Ｌ４０８Ｉ‐４１９はＸ４向性ＨＩＶ‐１の感染およびＰＢＭＣ内での複製を阻害する
該当する一次細胞におけるＡＬＢ４０８‐４２３およびその誘導体の効果を分析するために、末梢血液単核細胞を、フィコール密度遠心分離を用いて、ドイツ赤十字献血サービス バーデンビュルテンベルクヘッセン（ＤＲＫ‐Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ Ｂａｄｅｎ‐Ｗｕｒｔｔｅｍｂｅｒｇ‐Ｈｅｓｓｅｎ）より得たバフィーコートから単離した。１ｍｌあたり１×１０6個のＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、Ｏｘｏｉｄ、＃３０８５２８０）および１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン２（ＩＬ‐２、Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ、＃９５１１１９２）にて３日間刺激した。その後、細胞をペレット化し、ＩＬ‐２を含有する培地へ再懸濁させた。１．５×１０5個のＰＢＭＣ（２５０μｌ）を９６ウェルディッシュへ播種し、ペプチドを添加し、細胞をＸ４向性ＨＩＶ‐１ ＮＬ４‐３のｐ２４抗原５０ｐｇ／ｍｌで感染させた。子孫ウイルスを含有する上清を感染後の第１、３、および６日に採取した。ウイルス産生をｐ２４抗原ＥＬＩＳＡ（ＳＡＩＣ‐Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｉｎｃ［ＡＩＤＳ ＆ Ｃａｎｃｅｒ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｇｒａｍ］）で測定した。１００μＭのＡＬＢ４０８‐４２３およびＡＬＢ Ｌ４０８Ｉ‐４１９を含む細胞から第６日に得られた上清では、ｐ２４抗原は検出することができず、１００μＭのＡＬＢ４０８‐４１９を含有する上清では、ほんの僅かのｐ２４レベルしか検出することができなかった（図１１）。２０μＭのペプチドの存在下では、ウイルスの複製が大きく減退した。これらのデータは、試験したＡＬＢ４０８‐４２３およびその２種類の誘導体が、天然のＨＩＶ標的細胞内にて、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１の感染および複製を阻害することを示している。
【００９５】
図１１．ＡＬＢ４０８‐４２３および誘導体は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のＸ４向性ＨＩＶ‐１感染を阻害する。細胞を、示した濃度のＡＬＢ４０８‐４２３または切断型変異体と共にインキュベートし、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１で感染させた。６日後に得られた上清をｐ２４ＥＬＩＳＡにより分析した。３回の反復感染から得られた平均ｐ２４抗原値（ｎｇ／ｍｌ）±標準偏差を示す。
【００９６】
[実施例１０]
ＡＬＢ４０８‐４２３ペプチドはＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を阻害する
ケモカインＣＸＣＬ１２のその受容体ＣＸＣＲ４への結合を阻害するＡＬＢ４０８‐４２３の能力を試験するために、過去の記載（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ‐Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， ｅｔ ａｌ．； ２００１， ＪＢＣ ２７６：２６５５０‐２６５５８）に従って蛍光結合アッセイを生存細胞全体に対して実施した。ＣＸＣＲ４受容体は、ＥＧＦＰ蛍光タンパク質が受容体の細胞外アミノ末端部へ融合した融合タンパク質（ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４）として、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞へ安定にトランスフェクトされる。ヒトケモカインＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＬ１２‐テキサスレッドを記載に従って合成した（Ａｍａｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＪＢＣ ２７４：２３９１６‐２３９２５； Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ‐Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ， ｅｔ ａｌ．， ２００１， ＪＢＣ ２７６：２６５５０‐２６５５８）。リガンド‐受容体相互作用のリアルタイム蛍光モニタリングを以下のようにして実施した。融合受容体ＥＧＦＰ‐ｈＣＸＣＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞を、５ｍＭのＥＤＴＡを補ったｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水中で採取し、遠心分離に掛け、プロテアーゼ阻害剤（４０μｇ／ｍＬ ベスタチンおよびバシトラシン、２０μｇ／ｍＬ ホスホラミドン、５０μｇ／ｍＬ キモスタチン、および１μｇ／ｍＬ ロイペプチン）を補ったＨＥＰＥＳ‐ウシ血清アルブミンバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３７．５ｍＭ ＮａＣｌ、１．２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ2、６ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ グルコース、０．４ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１％ ウシ血清アルブミン（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．４）中へ再懸濁させた。実験は、ＨＥＰＥＳ−ＢＳＡバッファー中に懸濁させた細胞（通常、１０6細胞／ｍＬ）に対して実施した。５１０ｎｍで発光（４７０ｎｍで励起）される蛍光の時系列での記録を、分光蛍光光度計（ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ ２，Ｓｐｅｘ）を用いて２１℃にて行い、０．３秒ごとにサンプリングした。３０秒の時点て１００ｎＭのＣＸＣＬ１２‐ＴＲを１ｍＬの細胞懸濁液へ添加することによって蛍光結合測定を開始した。競合実験では、ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４を発現する細胞を、種々の濃度の競合物質の非存在下または存在下にて、予め１０分間インキュベートした。次に、ＣＸＣＬ１２‐ＴＲ（１００ｎＭ）を添加し、平衡に達するまで（３００秒）蛍光を記録した。データの解析は、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ ３．０８ ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，レディング，ペンシルベニア州，米国）を用いて行った。ＣＸＣＬ１２のテキサスレッド（ＴＲ）基へのエネルギー移動に起因するＥＧＦＰ蛍光発光の低下として、蛍光ＣＸＣＬ１２との関連性が検出される。
【００９７】
ＣＸＣＬ１２の結合の飽和には、３００ｎＭ超の濃度で達し、ＣＸＣＲ４受容体に対する蛍光ＣＸＣＬ１２の解離定数は、５５±１５ｎＭに等しい（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ‐Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， （２００１）， ＪＢＣ ２７６， ２６５５０‐２６５５８）， Ｈａｃｈｅｔ‐Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．； （２００８）， ＪＢＣ）。蛍光ＣＸＣＬ１２と競合する非標識分子は、受容体部位の占有に対応して、ＥＧＦＰの発光の低下を阻止する。検出された蛍光強度の変動を定量化して（Ｐａｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， （２００１）， ＪＢＣ ２７６：３４８５３‐３４８６１； Ｖｏｌｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＪＢＣ ２７４：３７９１５‐３７９２２； Ｉｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ８５：７６８‐７７８）、競合物質の結合定数を導くことができる。
【００９８】
本発明者らの分析から、ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＬ１２‐Ｔｒとその受容体ＣＸＣＲ４との相互作用を、用量依存的に阻止することが実証される（図１２）。ＡＬＢ４０８‐４２３の解離定数（ＥＣ５０）は８±３μＭに等しく、これは、３±１μＭに等しいＫＩ値に相当する。解離定数であるＥＣ５０値は、ＨＩＶ‐１阻害アッセイで得られたＩＣ50値と類似している。
【００９９】
図１２．ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を阻害する。リガンド‐受容体相互作用のリアルタイム蛍光モニタリングを、ＥＧＦＰ‐ｈＣＸＣＲ４を発現する２９３細胞を用いて実施した。細胞を、種々の濃度のＡＬＢ４０８‐４２３の非存在下または存在下にて、予め１０分間インキュベートした。次に、ＣＸＣＬ１２‐ＴＲ（１００ｎＭ）を添加し、平衡に達するまで（３００秒）蛍光を記録した。データの解析は、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ ３．０８ ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，レディング，ペンシルベニア州，米国）を用いて行った。ＣＸＣＬ１２‐Ｔｒ処理細胞のみの蛍光強度（１００％）に対して、３回の反復測定から得られた平均値±標準偏差を示す。
【０１００】
[実施例１１]
ペプチドＡＬＢ４０８‐４２３はＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４を介するＣａ2+動員を誘発せず、ＣＸＣＬ１２が誘発するカルシウム細胞応答を阻害する
ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、またはＣＸＣＲ１が介する細胞応答を制御するＡＬＢ４０８‐４２３の能力を、カルシウム指示薬をロードしたＨＥＫ２９３細胞上で調べた。ｉｎｄｏ‐１アセトキシメチルエステルをカルシウムプローブとして用い、記載に従って（Ｐａｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１， ＪＢＣ ２７６：３４８５３‐３４８６１； Ｖｏｌｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ＪＢＣ ２７４：３７９１５‐３７９２２）細胞内Ｃａ2+放出測定を実施した。細胞応答は、分光蛍光光度計を用いて励起を３５５ｎｍに、発光を４０５ｎｍおよび４７５ｎｍに設定し、１ｍＬキュベット内で攪拌しながら３７℃にて記録した。ヒトケモカインＣＣＬ５およびＣＸＣＬ８は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（サンホゼ，カリフォルニア州）より購入した。ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、またはＣＸＣＲ１を発現する細胞を用いたＣａ2+動員アッセイにより、ケモカインアゴニスト、ＣＸＣＬ１２（ＣＸＣＲ４）、ＣＣＬ５（ＣＣＲ５）、およびＣＸＣＬ８（ＣＸＣＲ１）それぞれがＣａ2+動員を誘発し（図１３）、一方、ＡＬＢ４０８‐４２３単独ではいずれのカルシウム応答も誘発せず、従って、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ１アゴニスト特性を示さないことが実証される（図１３）。
【０１０１】
図１３．ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ１のいずれのアゴニストでもない。示したケモカイン受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞を、それぞれのケモカイン［１０ｎＭ ＣＸＣＬ１２（ＣＸＣＲ４）；２０ｎＭ ＣＣＬ５（ＣＣＲ５）、もしくは５０ｎＭ ＣＸＣＬ８（ＣＸＣＲ１）］または５０μＭのＡＬＢ４０８‐４２３で処理した。細胞内Ｃａ2+応答を分光蛍光光度計を用いて測定した。ＡＬＢ４０８‐４２３による処理後に得られた蛍光強度を、それぞれのケモカインの測定値（１００％）に対して示す。
【０１０２】
図１４．ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＲ４を発現する細胞内にて、ＣＸＣＬ１２が誘発するＣａ2+動員を特異的に阻害する。Ａ）ＣＸＣＬ１２が介する細胞内Ｃａ2+放出のＡＬＢ４０８‐４２３による用量依存的阻害。Ｂ）ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＨＥＫ ＣＣＲ５細胞内でのＣＣＬ５が誘発するカルシウム応答にも、ＨＥＫ ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ１細胞内でのＣＸＣＬ８が誘発する反応にも影響を及ぼさない。黒色棒グラフ：それぞれのケモカインのみ；灰色棒グラフ：それぞれのケモカインおよび５０μＭのＡＬＢ４０８‐４２３。ケモカインのみで処理した細胞（１００％）に対する、２回の反復実験からのカルシウムピーク応答の平均値を示す。
【０１０３】
ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＲ４アンタゴニスト特性を有するかどうかを理解するために、本発明者らは、アゴニストＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４受容体への結合に対するＡＬＢ４０８‐４２３の影響を分析した。従って、ＣＸＣＲ４を発現する細胞を種々の濃度のＡＬＢ４０８‐４２３と共にインキュベートし、次にＣＸＣＬ１２で処理した。Ｃａ2+応答を記録した。図１４Ａに示すデータより、ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ１２が誘発するカルシウム応答を、見掛けの阻害定数８５μｇ／ｍｌにより、用量依存的な形で阻害することが実証される。化合物選択性に関する知見を得るために、本発明者らは次に、種々のケモカイン／受容体対のカルシウム応答に対するこのペプチドの影響を特徴付けた。図１４Ａのデータと一致して、５０μＭのペプチドが、ＨＥＫ ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４細胞内におけるＣＸＣＬ１２が誘発するカルシウム応答の７０％を阻害する（図１４Ｂ）。対照的に、このペプチドは、ＨＥＫ ＣＣＲ５細胞内でのＣＣＬ５が誘発するカルシウム応答にも、ＨＥＫ ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ１細胞内でのＣＸＣＬ８が誘発する反応にも影響を及ぼさない（図１４Ｂ）。これらの結果から、このペプチドがＣＸＣＲ４受容体に対する選択性を示し、ＣＸＣＲ４アンタゴニストであるという考えが支持される。
【０１０４】
[実施例１２]
ＡＬＢ４０８‐４２３はＣＸＣＬ１２が誘発するＣＸＣＲ４の内在化を阻害する
適切なケモカインで刺激すると、数多くのＧタンパク質共役受容体が、クラスリン被覆ピットにより内在化する。ＣＸＣＲ４反応のアンタゴニストとして、ＡＬＢ４０８‐４２３は、ケモカインが誘発するＣＸＣＲ４受容体の内在化を変化させることもできる。ＣＸＣＬ１２が媒介するＣＸＣＲ４の内在化に対するＡＬＢ４０８‐４２３のアンタゴニスト特性を分析するために、ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４受容体を発現する細胞を分割し、ラットＩ型コラーゲンをコーティングした１２ｍｍカバーガラス上で２４ウェルプレートにて２日間増殖させた。次に、細胞を０〜３０分の範囲の時間、１００ｎＭ ＣＸＣＬ１２、または５０μＭ ＡＬＢ４０８‐４２３、または１００ｎＭ ＣＸＣＬ１２プラス５０μＭ ＡＬＢ４０８‐４２３、を含有する、プロテアーゼ阻害剤を補ったＨＥＰＥＳ‐ＢＳＡバッファー中にて３７℃でインキュベートした。細胞を氷上へ配置することで内在化を停止させ、氷冷ＨＥＰＥＳ‐ＢＳＡバッファーで直ちに洗浄した。次に、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中にて４℃で１５分間固定し、続いて５０ｍＭのＮＨ4Ｃｌ中にて１５分間インキュベートした。カバーガラスを抗退色剤（ａｎｔｉ‐ｆａｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）である
【数２】
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて顕微鏡のスライドグラス上へ載せ、２４時間室温で維持した後、−２０℃で保存した。次に、細胞を倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）およびＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ Ｉｂｄ．ＢＬ ６３× １．４０ ＯＩＬ ＵＶ 対物レンズ（ｎ°５０６１９２）を用いたレーザー走査型共焦点イメージングシステム（Ｌｅｉｃａ ＡＯＢＳ ＳＰ２ ＭＰ）で分析した。電子ズームは３に設定し、ピンホールは１エアリー（Ａｉｒｙ）であり、得られたピクセルサイズは０．１５４μｍであった。ＥＧＦＰはアルゴンレーザーの４８８ｎｍレーザー線で励起し、４９５〜５５０ｎｍのいわゆるｍＣＦＰチャネル内の１つの光電子増倍管（ＰＭＴ）によって検出および増幅した（ＰＭＴ１ ６１０高電圧‐ＨＶ‐、オフセット０）。良好なシグナル対ノイズ比を得るために、連続して取得した４つのイメージから平均化した。
【０１０５】
図１５．ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＬ１２が媒介するＣＸＣＲ４の内在化を阻害する。受容体エンドサイトーシスを、ＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４を発現するＨＥＫ細胞上でモニタリングし、ＣＸＣＬ１２、ＡＬＢ４０８‐４２３、もしくはその両方の化合物の添加後、直ちに（０分、上部パネル）、または３０分後に（下部パネル）、共焦点顕微鏡により分析した。３０分後、ＣＸＣＬ１２で処理した細胞はＣＸＣＲ４を内在化した。ＡＬＢ４０８‐４２３の存在下では、ＣＸＣＬ１２が媒介する受容体内在化は抑止される。
【０１０６】
共焦点イメージにより、１００ｎＭのＣＸＣＬ１２による３７℃、３０分間の処理が、細胞の周辺部へのおよび小胞構造内へのＥＧＦＰ‐ＣＸＣＲ４の内在化をもたらしたことが示される（図１５）。予想された通り、蛍光の大部分が細胞表面に残留していたため、ＡＬＢ４０８‐４２３単独では受容体の内在化が誘発されず、ＣＸＣＬ１２が媒介するＣＸＣＲ４の内在化が阻害された（図１５）。この結果は、ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＲ４受容体に対するアンタゴニストとして作用することのさらなる証拠を提供する。
【０１０７】
[実施例１３]
ＣＸＣＬ‐１２が媒介するジャーカットＴ細胞の遊走を阻害するＡＬＢ４０８‐４２３
ＣＸＣＬ１２‐ＣＸＣＲ４シグナル伝達は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、癌、白血病、および関節炎等のいくつかの疾患において極めて重要な役割を担っている。ＣＸＣＬ１２を発現する器官、組織、または細胞は、ＣＸＣＲ４を発現する腫瘍細胞を引き寄せることができ、転移を起こさせる。ＡＬＢ４０８‐４２３がＣＸＣＬ１２の媒介による腫瘍細胞遊走を阻害することが可能かどうかを調べるために、モデルシステムとしてＣＸＣＲ４を発現するジャーカットＴ細胞を用いて遊走アッセイを実施した（Ｐｒｉｎｃｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７８： １２９９６−１３００６）。ジャーカットＴ細胞を０．４×１０6（２００μｌ）にて１０％ＦＢＳを含有する媒体へ懸濁させ、次に、この細胞懸濁液（２００μｌ）を５μｍポアフィルターデバイス（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，２４‐ウェル細胞培養，Ｃｏｓｔａｒ）の上部コンパートメントに添加した。次に、ＣＸＣＬ１２含有（１００ｎｇ／ｍｌ）または非含有の培養液６００μｌを下部コンパートメントに添加し、上部コンパートメントから細胞を誘引させた。ＣＸＣＬ１２の誘発によるジャーカットＴ細胞遊走に対する阻害効果を研究するために、下部コンパートメントのＣＸＣＬ１２を種々の濃度のＡＬＢ４０８‐４２３と混合した。この細胞培養プレートを、細胞培養インキュベータ内にて３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを取り出し、下部コンパートメントに遊走した細胞１００μｌを、計数チャンバーを用いて直接計数するか、または増殖アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ（登録商標）試薬，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造元の推奨に従って分析した。増殖アッセイは、細胞数と直接比例する細胞内ＡＴＰレベルを測定する（データ示さず）。図１６に示すデータは、ＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ１２が媒介するジャーカットＴ細胞遊走を用量依存的に阻害することを実証している。高濃度（３６０μｇ／ｍｌ）では、ＡＬＢ４０８‐４２３はＣＸＣＬ１２が誘発する細胞遊走ほぼ完全に阻害し、いずれのペプチドも存在しない状態（ＣＸＣＬ１２もＡＬＢ４０８‐４２３もなし）で観察された比率と同等であった。これらのデータは、ＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＬＢ４０８‐４２３が、ＣＸＣＬ１２によって媒介される腫瘍細胞の誘引を阻害することができることを示している。
【０１０８】
図１６．ＡＬＢ４０８‐４２３は、ＣＸＣＬ‐１２が媒介するジャーカットＴ細胞の遊走を用量依存的に阻害する。５μｍポアフィルターを有するトランスウェルデバイスの上部コンパートメントへジャーカットＴ細胞を添加した。次に、ＰＢＳ、ＣＸＣＲ４アゴニストＣＸＣＬ１２（１００ｎＭ）、またはＡＬＢ４０８‐４２３の段階希釈物を細胞培養プレートの下部コンパートメントへ添加した。３７℃での２時間のインキュベーションの後、下部コンパートメント内の遊走細胞数を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ‐Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞内ＡＴＰレベルを測定することによって検出した。示した数値はすべて、ＣＸＣＬ１２のみで処理した細胞（１００％遊走）に対する、３回の反復実験からの遊走細胞の平均数±標準偏差を意味する。
【０１０９】
[実施例１４]
ＣＸＣＲ４へのＡＬＢ４０８‐４２３の結合はＮ末端アミノ酸の完全性に依存する
ＣＸＣＲ４への結合を媒介し、従ってＸ４向性ＨＩＶ‐１の感染およびＣＸＣＬ１２の結合を阻害するＡＬＢ４０８‐４２３の領域を同定するために、本発明者らは、いくつかのＡＬＢ４０８‐４２３誘導体（表１参照）の、ＣＸＣＬ１２が誘発するＣａ2+動員およびＣＸＣＬ１２‐Ｔｒの結合に対する影響を分析した。実験の詳細については実施例ｘおよびｙを参照されたい。図１７のＡおよびＢに示すように、Ｎ末端ロイシンが欠失したＡＬＢ４０９‐４２３は、ＣＸＣＬ１２が媒介するＣａ2+応答もＣＸＣＬ１２‐ＴｒのＣＸＣＲ４受容体への結合も阻害しなかった。興味深いことに、ＡＬＢ４０９‐４２３は、ＨＩＶ‐１阻害アッセイにおいても不活性であり、ＡＬＢ４０９‐４２３がＣＸＣＲ４へ結合できないことが、抗ウイルス活性の喪失の原因でもあることが示唆される。対照的に、Ｃ末端切断型のＡＬＢ誘導体はいずれも、依然としてＣＸＣＲ４受容体との相互作用が可能であり（図１７Ａ）、ＣＸＣＬ１２が媒介するＣａ2+応答を阻害し（図１７Ｂ）、野生型ペプチドに近い解離定数（３０μＭ）を示すが、ただし、最も短い４０８‐４１３は、受容体に対する親和性が下がり（＞２００μＭ）、Ｘ４向性ＨＩＶ‐１感染の阻害にもほとんど効果がない（図６および表１）。まとめると、これらのデータは、いくつかのＣ末端切断型ＡＬＢ誘導体が、ＣＸＣＲ４と結合することができ、それによってＣＸＣＬ１２の結合およびシグナル伝達、またはＸ４向性ＨＩＶ‐１感染を阻止するＣＸＣＲ４アンタゴニストであることを示している。
【０１１０】
図１７．ＡＬＢ誘導体のＣＸＣＲ４アンタゴニスト活性。Ａ）ＡＬＢ断片は、ＣＸＣＬ１２が誘発するＣａ2+動員は阻害するがＣＣＬ５が誘発するものは阻害しない。ＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５を発現するＨＥＫ２９３細胞を、示したＡＬＢ誘導体の非存在下（ＡＬＢなし）または存在下（５０μＭ）にて、それぞれＣＸＣＲ４アゴニストＣＸＣＬ１２（１０ｎＭ）またはＣＣＲ５アゴニストＣＣＬ５（２０ｎＭ）で処理した。カルシウム応答を記載のようにして記録した。示したデータは、アゴニストのみによる処理後のピークカルシウム応答（１００％）に対する、２回の反復サンプルから得られた平均値±標準偏差である。Ｂ）ＡＬＢ誘導体は、ＣＸＣＬ１２のＣＸＣＲ４への結合を抑止する。ＣＸＣＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＡＬＢペプチドの存在下または非存在下にて、テキサスレッド標識ＣＸＣＬ１２（ＣＸＣＬ１２‐Ｔｒ）で処理した。リガンド‐受容体相互作用のリアルタイム蛍光モニタリングを記載のようにして実施した。ＣＸＣＬ１２‐Ｔｒのみで処理した細胞（１００％結合）に対して、ＡＬＢペプチドの存在下における結合したＣＸＣＬ１２‐Ｔｒのレベルを示す。数値は、２回の反復実験から得た。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
Ｚ1‐ＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬ‐Ｚ2（ＡＬＢ‐４０８）
を有し、Ｚは０〜１０の数のアミノ酸残基を表す、ペプチド、ならびに、その生物活性断片、および／または変異体、および／または誘導体、特にアミド化、アセチル化、硫酸化、リン酸化、および／もしくはグリコシル化誘導体、ならびに、多重合成によって得ることができるＡＬＢ４０８‐４２３の生物学的活性を有するペプチド。
【請求項２】
前記配列中の単一もしくは複数のアミノ酸残基が、置換、欠失、もしくは付加されたか、または、ＡＬＢ４０８‐４２３の生物学的活性または薬理学的活性を改良する結果となるＡＬＢ４０８‐４２３の単一のアミノ酸上への化学修飾が導入された、請求項１に記載のＡＬＢ４０８‐４２３ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号１〜３２のアミノ酸配列を有する、請求項１および／または２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＬＢ４０８‐４２３、ならびに／またはその断片、変異体、誘導体、および類似体、をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＰＮＡから構成されることを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含有する遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項８】
ＡＬＢ４０８‐４２３活性を有するポリペプチドをコードし、請求項４に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト／阻害剤。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドの治療量を投与することによって、ＡＬＢ４０８‐４２３を必要とする患者を治療するための方法。
【請求項１２】
アンタゴニスト／阻害剤の治療量を投与することによって、ＡＬＢ４０８‐４２３の阻害を必要とする患者を治療するための方法。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、および適合する担体からなる、ガレノス製剤。
【請求項１４】
ＡＬＢ４０８‐４２３をコードするＤＮＡの投与および患者内でのインビボでのその発現によって前記ポリペプチドの治療効果が達成される、患者を治療するための方法。
【請求項１５】
カチオン交換抽出による血液ろ過液からの抽出、ならびにそれに続く吸着物質の溶離、ペプチドを含有する前記抽出物の再度のカチオン交換クロマトグラフィ、および分画逆相クロマトグラフィ、による請求項１に記載のＡＬＢ４０８‐４２３を調製するためのプロセス。
【請求項１６】
メリフィールド合成である固相合成、または、保護アミノ酸を用いる、当業者に公知の方法による液相合成、およびその精製による、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＬＢ４０８‐４２３を調製するためのプロセス。
【請求項１７】
一般的な生物工学的ベクターを用いる、当業者に公知の異種発現の方法による、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＬＢ４０８‐４２３を調製するためのプロセス。
【請求項１８】
請求項８に記載のポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を含有する、または請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＬＢ４０８‐４２３をコードする核酸もしくはｍＲＮＡを含有する、診断薬。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する、組織、血漿、尿、および脳脊髄液中のこの物質のレベルを分析するための試験システムのための、診断薬。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを検出する診断薬および試験システムであって、組織、血漿、尿、および脳脊髄液中のこの物質のレベルを、ＲＰ‐ＨＰＬＣ、タンパク質沈殿、および／または固相抽出によるサンプル調製とＭＡＬＤＩ‐ＭＳまたはＥＳＩ‐ＭＳ等の質量分析法を組み合わせることによって分析するための、診断薬および試験システム。
【請求項２１】
ウイルス性疾患、細菌および真菌感染、炎症および新生物形成プロセスに対するマーカーとして、ならびに炎症プロセス、撹乱された炎症反応、腫瘍性疾患、成長障害、免疫系の疾患におけるマーカーとして、ならびに骨疾患におけるマーカーとして、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを含有する診断薬。
【請求項２２】
経口、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、くも膜下腔内投与のためのガレノス剤形の活性成分として、および経肺投与のためのエアロゾルとして、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを含有する薬剤。
【請求項２３】
ウイルス性疾患、特にＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス（１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、エプスタイン‐バーウイルスの治療、ならびに細菌および真菌感染、炎症プロセス、撹乱された炎症反応、腫瘍性疾患、成長障害、神経疾患、凝血および造血の疾患、血管疾患、免疫系の疾患の治療、ならびに創傷および骨の治癒、のための薬剤の調製のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド、ならびに請求項４の記載のポリヌクレオチド、ならびに請求項９および１０に記載の抗体／アンタゴニスト、ならびに請求項１３に記載のガレノス製剤の、使用。
【請求項１】
以下のアミノ酸配列：
Ｚ1‐ＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬ‐Ｚ2（ＡＬＢ‐４０８）
を有し、Ｚは０〜１０の数のアミノ酸残基を表す、ペプチド、ならびに、その生物活性断片、および／または変異体、および／または誘導体、特にアミド化、アセチル化、硫酸化、リン酸化、および／もしくはグリコシル化誘導体、ならびに、多重合成によって得ることができるＡＬＢ４０８‐４２３の生物学的活性を有するペプチド。
【請求項２】
前記配列中の単一もしくは複数のアミノ酸残基が、置換、欠失、もしくは付加されたか、または、ＡＬＢ４０８‐４２３の生物学的活性または薬理学的活性を改良する結果となるＡＬＢ４０８‐４２３の単一のアミノ酸上への化学修飾が導入された、請求項１に記載のＡＬＢ４０８‐４２３ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号１〜３２のアミノ酸配列を有する、請求項１および／または２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＬＢ４０８‐４２３、ならびに／またはその断片、変異体、誘導体、および類似体、をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＰＮＡから構成されることを特徴とする、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含有する遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項８】
ＡＬＢ４０８‐４２３活性を有するポリペプチドをコードし、請求項４に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドに対するアンタゴニスト／阻害剤。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドの治療量を投与することによって、ＡＬＢ４０８‐４２３を必要とする患者を治療するための方法。
【請求項１２】
アンタゴニスト／阻害剤の治療量を投与することによって、ＡＬＢ４０８‐４２３の阻害を必要とする患者を治療するための方法。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、および適合する担体からなる、ガレノス製剤。
【請求項１４】
ＡＬＢ４０８‐４２３をコードするＤＮＡの投与および患者内でのインビボでのその発現によって前記ポリペプチドの治療効果が達成される、患者を治療するための方法。
【請求項１５】
カチオン交換抽出による血液ろ過液からの抽出、ならびにそれに続く吸着物質の溶離、ペプチドを含有する前記抽出物の再度のカチオン交換クロマトグラフィ、および分画逆相クロマトグラフィ、による請求項１に記載のＡＬＢ４０８‐４２３を調製するためのプロセス。
【請求項１６】
メリフィールド合成である固相合成、または、保護アミノ酸を用いる、当業者に公知の方法による液相合成、およびその精製による、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＬＢ４０８‐４２３を調製するためのプロセス。
【請求項１７】
一般的な生物工学的ベクターを用いる、当業者に公知の異種発現の方法による、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＬＢ４０８‐４２３を調製するためのプロセス。
【請求項１８】
請求項８に記載のポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を含有する、または請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＬＢ４０８‐４２３をコードする核酸もしくはｍＲＮＡを含有する、診断薬。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド、または請求項４に記載のポリヌクレオチドを含有する、組織、血漿、尿、および脳脊髄液中のこの物質のレベルを分析するための試験システムのための、診断薬。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを検出する診断薬および試験システムであって、組織、血漿、尿、および脳脊髄液中のこの物質のレベルを、ＲＰ‐ＨＰＬＣ、タンパク質沈殿、および／または固相抽出によるサンプル調製とＭＡＬＤＩ‐ＭＳまたはＥＳＩ‐ＭＳ等の質量分析法を組み合わせることによって分析するための、診断薬および試験システム。
【請求項２１】
ウイルス性疾患、細菌および真菌感染、炎症および新生物形成プロセスに対するマーカーとして、ならびに炎症プロセス、撹乱された炎症反応、腫瘍性疾患、成長障害、免疫系の疾患におけるマーカーとして、ならびに骨疾患におけるマーカーとして、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを含有する診断薬。
【請求項２２】
経口、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、くも膜下腔内投与のためのガレノス剤形の活性成分として、および経肺投与のためのエアロゾルとして、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを含有する薬剤。
【請求項２３】
ウイルス性疾患、特にＨＩＶ‐１、ＨＩＶ‐２、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス（１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、エプスタイン‐バーウイルスの治療、ならびに細菌および真菌感染、炎症プロセス、撹乱された炎症反応、腫瘍性疾患、成長障害、神経疾患、凝血および造血の疾患、血管疾患、免疫系の疾患の治療、ならびに創傷および骨の治癒、のための薬剤の調製のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド、ならびに請求項４の記載のポリヌクレオチド、ならびに請求項９および１０に記載の抗体／アンタゴニスト、ならびに請求項１３に記載のガレノス製剤の、使用。
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【公表番号】特表２０１０−５３１６５５（Ｐ２０１０−５３１６５５Ａ）
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１３９８６（Ｐ２０１０−５１３９８６）
【出願日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５８５６６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００４０５４
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５１０００４４９１）ファリス バイオテック ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５８５６６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００４０５４
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５１０００４４９１）ファリス バイオテック ゲーエムベーハー (1)
【Ｆターム（参考）】
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