ＰＴＰ１Ｂ阻害剤及び該阻害剤を含む糖尿病治療薬、皮膚外用剤並びに食品
【課題】本発明は、ＰＴＰ１Ｂ阻害活性を示す有効成分を含むＰＴＰ１Ｂ阻害剤と、該阻害剤を含む糖尿病治療薬、皮膚外用剤及び食品を提供する。
【解決手段】ピロロキノリンキノン又はその誘導体からなるＰＴＰ１Ｂ阻害剤を提供する。また、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、糖尿病治療薬全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする糖尿病治療薬、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、皮膚外用剤全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする皮膚外用剤、及び、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、食品全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする食品を提供する。
【解決手段】ピロロキノリンキノン又はその誘導体からなるＰＴＰ１Ｂ阻害剤を提供する。また、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、糖尿病治療薬全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする糖尿病治療薬、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、皮膚外用剤全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする皮膚外用剤、及び、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、食品全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする食品を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、特に、ピロロキノリンキノン又はその誘導体からなるＰＴＰ１Ｂ阻害剤に関する。また、本発明は、該阻害剤を含む糖尿病治療薬、皮膚外用剤及び食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生活習慣の欧米化に伴い、肥満を始めとする生活習慣病と呼ばれる疾患が、社会的に大きな問題となっている。生活習慣病は、食習慣、運動習慣、喫煙、飲酒等の生活習慣がその発症及び進行に関与する疾患群とされており、例えば、肥満症、糖尿病、高脂血症、高尿酸血症、循環器疾患、大腸癌、歯周病、高血圧、肺扁平上皮がん、慢性気管支炎、閉塞性肺疾患、肺気腫、アルコール性肝疾患又はアルコール性膵炎等が挙げられる。
【０００３】
その中でも特に注目されている疾患の１つが糖尿病である。糖尿病は、慢性的に血糖値が高い状態となることを特徴とする疾患である。慢性的な高血糖状態は、様々な疾患へとつながり、網膜症、腎症、神経障害等の合併症を引き起こす。糖尿病は、膵臓β細胞の大部分に破壊が起こり、インスリン分泌が欠乏してインスリンの絶対的な不足が生じるＩ型糖尿病と、インスリンの分泌低下や骨格筋、肝臓、脂肪組織でのインスリン抵抗性によってインスリンの相対的な不足が生じるＩＩ型糖尿病とに大きく分類される。現在、ＩＩ型糖尿病患者が急増しており、糖尿病患者の９０％以上を占めている。しかし、従来用いられている糖尿病治療薬であるスルホニルウレア系糖尿病治療薬、ビグアナイド系糖尿病治療薬、α−グルコシダーゼ阻害薬は、その効果が充分でなく、低血糖、乳酸アシドーシス、下痢、便秘、嘔吐等の問題がある。また最近、インスリン抵抗性改善薬としてチアゾリジン系薬剤の開発がなされている。しかし、これも作用発現までに数日を要すること、ノンレスポンダーの存在、体重増加等の課題が残されている上に、毒性も問題視されており、未だ充分な糖尿病治療薬はない。
【０００４】
前述したように、糖尿病の発症にはインスリンが深く関わっている。インスリンは、膵臓β細胞でつくられる血糖調節に関わるホルモンである。分泌されたインスリンは、細胞膜上に存在するインスリン受容体に結合すると、チロシンキナーゼの作用を受けて、インスリン受容体の細胞内ドメインに存在するチロシン残基がリン酸化される。このチロシンリン酸化はチロシンキナーゼと、逆にこれを脱リン酸化するチロシンホスファターゼにより調節を受けており、この両者のバランスにより多様な細胞機能が発現されると考えられている。よって、このバランスが破綻してチロシンホスファターゼ活性が異常亢進すると、リン酸化されたチロシンの脱リン酸化が亢進し、インスリン作用が低下、つまりインスリン抵抗性へと至る。
【０００５】
現在、種々のチロシンホスファターゼが知られているが、インスリンシグナル伝達に関与するチロシンホスファターゼとして、肝臓、脂肪細胞、骨格筋などに存在するプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）１Ｂがある。これはインスリンシグナル伝達の減弱因子の１つとして考えられている。また、このＰＴＰ１Ｂは脂肪細胞から分泌されるペプチドホルモンであるレプチンのシグナル伝達にも関与している。レプチンは、強い摂食抑制とエネルギー産生の亢進を引き起こす作用を持ち、過食や肥満抑制に関与するホルモンである。レプチンシグナルはインスリンシグナルと同様、レプチン受容体の細胞内ドメインにおけるリン酸化がチロシンキナーゼとチロシンホスファターゼにより調節を受けている。よって、チロシンホスファターゼ活性が異常亢進することによって、リン酸化されたチロシンの脱リン酸化が亢進し、レプチン抵抗性へと至る。最近、ＰＴＰ１Ｂノックアウトマウスは、正常に発育するが、インスリン感受性の増大、エネルギー代謝の亢進、白色脂肪組織重量の減少を呈することが報告された（非特許文献１）。
【０００６】
すなわち、ＰＴＰ１Ｂを阻害すると、ＰＴＰ１Ｂの活性化による脱リン酸化作用が阻害され、インスリン及びレプチンのシグナル伝達が増強される。したがって、インスリン抵抗性及びレプチン抵抗性による糖尿病、肥満症及び高脂血症等が改善されると考えられる。以上のことから、ＰＴＰ１Ｂ阻害作用を有する薬剤はホスファターゼ阻害によって細胞内シグナル伝達を正常化するという、これまでの糖尿病治療薬にはない新規な作用を有するため、既存の糖尿病治療薬が抱える問題点を回避した生活習慣病、特に糖尿病、肥満症及び高脂血症の治療薬となり得る可能性がある。
【０００７】
また、近年、美容についての関心は、老若男女を問わず極めて高いものがあり、殊に顔、美肌に対しては化粧料の作用をいかに高めるか、顔、肌に対する安全をいかに図るかという追及がなされてきた。また、頭髪に関しても、幅広い層に関心が高く、特に一定の年齢を経た男性については、悩みの種であり、効果的な成分の出現が待たれていた。このような観点から、これまでの美肌化粧料及び頭髪化粧料を根本から見直す画期的な成分の開発が試みられている（特許文献１〜４）。
【０００８】
本来、人の肌はデリケートなものであり、人によっては化粧料の種類により、かぶれや痒み等を生じ、場合によっては顔や肌に対して大きなダメージを与えることとなる。また、有効的な成分であっても、その成分の安定化に欠ける場合、その成分が皮膚へ有効的に浸透することに欠ける場合には、その成分の作用効果を活かすことはできなかった。
【０００９】
現在、ＰＴＰの阻害剤としてはバナジウム誘導体、ホスホチロシン誘導体等が知られている。しかし、これらは阻害活性の特異性、細胞内への透過性等に問題があり、実用化には至っていない。インスリンシグナル伝達に関与することが明らかになりつつあるＰＴＰ１Ｂ等のＰＴＰを阻害する薬剤を見出すことができれば、糖尿病等の治療薬、予防薬として利用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平６−２１１６６０号公報
【特許文献２】特開平８−２０５１２号公報
【特許文献３】特開２００４−３４５９５４号公報
【特許文献４】特開２００７−２３０９１２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Molecular and Cellular Biology, 20(15), 5479-5489 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は上記事情に鑑み、ＰＴＰ１Ｂ阻害活性を示す有効成分を含むＰＴＰ１Ｂ阻害剤と、該阻害剤を含む糖尿病治療薬、皮膚外用剤及び食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害活性を示す有効成分であることを見出した。また、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、生活習慣病、特に糖尿病の治療薬、皮膚外用剤、特に育毛剤、及び食品として有効であることを見出した。
すなわち、本発明に係るＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体からなる。
【００１４】
前記ピロロキノリンキノン誘導体は、以下の構造式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２はＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは自然数である。）
で表されることが好適である。
前記構造式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれメチル基であることが好適である。
【００１５】
本発明に係る糖尿病治療薬は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、糖尿病治療薬全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする。
また、本発明に係る皮膚外用剤は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、皮膚外用剤全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする。
さらに、本発明に係る食品は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、食品全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害活性を示す有効成分として作用する。本発明の糖尿病治療薬は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、糖尿病の治療薬として有効である。また、本発明の皮膚外用剤は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、皮膚外用剤、特に発毛、育毛作用を損なわずに、安定性、安全性を向上させた育毛剤として有効である。さらに、本発明の食品は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、糖尿病やメタボリックシンドロームの予防および改善食として有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１において得られたＰＴＰ１Ｂ活性測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ＰＴＰ１Ｂ阻害剤
本発明に係るＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）又はその誘導体からなる。
ピロロキノリンキノン誘導体は、以下の構造式（ＩＩ）
【化２】
（式中、Ｒ１及びＲ２はＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは自然数である。）
で表されるアシル化ピロロキノリンキノン誘導体であることが好適である。このような誘導体とすることにより、活性部位である２つのキノンが保護され、服用した際に体内酵素等の作用によってアシル基が外れることにより、ピロロキノリンキノンの活性が得られる。したがって、このような誘導体を用いることにより、ピロロキノリンキノンの不活性化を抑制することができるため、ピロロキノリンキノンの活性を安定化することができる。また、アシル化ピロロキノリンキノン誘導体は、単純な反応で合成できる点においても好ましい。
【００１９】
上述した構造式（ＩＩ）中、Ｒ１及びＲ２がそれぞれメチル基であるアセチル化ピロロキノリンキノン誘導体とすることが好適である。
【００２０】
その他のピロロキノリンキノン誘導体としては、マレイン酸等のその他の酸無水物を２つのキノンの各々に付加した構造、無水化している部位を２箇所有する酸無水物により２つのキノン間を架橋した構造等を有するものとすることも可能である。
【００２１】
アシル化ピロロキノリンキノン誘導体は、例えば、ピロロキノリンキノン又はその塩中の２つのキノンを、有機溶剤又は水混和性有機溶剤を含んだ水溶液中でカテコール体へと還元する還元剤の存在下、もしくは、その還元反応の後に、アシル化触媒存在下又は非存在下において、カルボン酸の酸無水物又は酸ハロゲン化物を反応させることによって合成することができる。
【００２２】
アシル化ピロロキノリンキノン誘導体としては、例えば、アセチル化ピロロキノリンキノン誘導体を、上述した方法により合成することができる。
アセチル化剤としては、塩化アセチル、アセチルケテン、ケテンＮ−アセチルイミダゾール、無水酢酸等を任意に使用することが可能である。このようなアセチル化剤において、無水酢酸を使用することが好ましい。有機溶剤を必要とせず、副生する酢酸の除去を容易に行うことができるからである。
還元剤としては、亜鉛、マグネシウム、アルミニウム等の金属、ハイドロサルファイトナトリウム、硫化水素、二酸化硫黄、塩化スズ（ＩＩ）、水素、ギ酸、アスコルビン酸等を使用することが可能である。このような還元剤において、亜鉛、マグネシウムを使用することが好ましい。後処理が簡易であり、還元力が高いからである。
【００２３】
糖尿病治療薬
本発明に係る糖尿病治療薬は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、糖尿病治療薬全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有する。好ましくは０．０００００２〜０．５質量％である。少なくとも０．０００００１質量％以上含有していれば、ＰＴＰ１Ｂ阻害効果が最小限得られる濃度に相当するからであり、多くとも１０質量％以下であれば、十分にＰＴＰ１Ｂ阻害効果が得られ且つ安全性も得られるからである。
【００２４】
ハイドロキノン類、キノン類、キノン系化合物は、細胞毒性が強く、発癌性があるため、治療薬として利用することは難しいのに対し、ＰＱＱは食品にも含まれていて安全性が高いため、治療薬としての優位性を備えている。
【００２５】
本発明の糖尿病治療薬の投与形態としては、例えば、散剤、顆粒剤、細粒剤、ドライシロップ剤、錠剤及びカプセル剤等の経口投与剤；注射剤、軟膏剤、トローチ剤などが挙げられる。
【００２６】
本発明の糖尿病治療薬には、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤として作用するピロロキノリンキノン又はその誘導体の他に、治療薬の投与形態に応じて、適宜組み合わせて用いることができる。例えば、乳糖等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の結合剤；マクロゴール等の界面活性剤；炭酸水素ナトリウム等の発泡剤；シクロデキストリン等の溶解補助剤；クエン酸等の酸味剤；エデト酸ナトリウム等の安定化剤；リン酸塩等のｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００２７】
以上のように、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤として作用し、本発明は糖尿病の治療薬として有効である。
【００２８】
皮膚外用剤
本発明に係る皮膚外用剤は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、皮膚外用剤全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有する。好ましくは０．０００００２〜０．５質量％である。少なくとも０．０００００１質量％以上含有していれば、ＰＴＰ１Ｂ阻害効果が最小限得られる濃度に相当するからであり、多くとも１０質量％以下であれば、ＰＴＰ１Ｂ阻害効果が得られ且つ安全性も得られるからである。
【００２９】
本発明に係る皮膚外用剤は、ＰＱＱと反応するアミノ酸及びチオール化合物を含有していない。そのため、皮膚の老化防止、肌荒れの改善、抗炎症、創傷治癒等の効果も期待される。このような効果を奏する皮膚外用剤を製造するためには、ＰＱＱ又はその誘導体（有効成分）を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等に加え、必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体等の粘着剤と練合した後、ポリアルキル等の不織布に展延してテープ剤とすることが好適である。
【００３０】
本発明の成分は、化粧料、医薬品、医薬部外品など外皮に適用される皮膚外用剤として用いることができる。したがって、その剤型として水溶性系（ローション系）、可溶化系、乳化系（Ｗ／Ｏ型、Ｏ／Ｗ型）、粉末系、軟膏系、油液系、ジェル系、水−油二層系、水−油−粉末三層系など幅広い形態に使用することができる。また、本発明の皮膚外用剤は、上記必須成分の他に、本発明の効果を損なわない範囲で、皮膚外用剤に通常用いられる他の成分、例えば、粉末、油分、湿潤剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、酵素、保湿剤、香料、水、多価アルコール、低級アルコール、高分子（増粘剤）、シリコーン類、色素などを必要に応じて適宜、配合することができる。
【００３１】
本発明の皮膚外用剤の剤型としては、例えば、ローション、油剤、乳剤、クリーム、軟膏等が挙げられる。また、化粧水、クリーム、乳液、パック、美容液、洗浄料等の様々な形態の化粧料として提供することも可能である。
【００３２】
以上のように、本発明の皮膚外用剤は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、皮膚外用剤、特に発毛、育毛作用を損なわずに、安定性、安全性を向上させた育毛剤として有効である。
【００３３】
食品
本発明に係る食品は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、食品全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有する。好ましくは０．０００００２〜０．５質量％である。少なくとも０．０００００１質量％以上含有していれば、ＰＴＰ１Ｂ阻害効果が最小限得られる濃度に相当するからであり、多くとも１０質量％以下であれば、ＰＴＰ１Ｂ阻害効果が得られ且つ安全性も得られるからである。
【００３４】
本発明の成分は、食品添加物として、例えば、健康食品等に配合することができる。本発明の成分を含むことができる食品の具体例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等の形態、あるいは、日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等の形態で提供可能である。なお、調製の際に使用される添加剤としては、液剤としては水、果糖、ブドウ糖等の糖類、落下生油、大豆油、オリーブ油等の油類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類を用いることができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形剤の賦型剤としては乳糖、ショ糖、マンニット等の糖類、滑沢剤としてはカオリン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等、崩壊剤としてデンプン、アルギン酸ナトリウム、結合剤としてポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン等、界面活性剤としては脂肪酸エステル等、可塑剤としてグリセリン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明において提供される食品は、そのまま食しても良く、例えば、カプセル型、錠剤型等の食品としても良い。その他、顆粒、粉末、栄養ドリンク食品等として提供しても良い。食品的に許容される他の食材、防腐剤、増粘剤、着色料、酸化防止剤その他の添加剤を加えることもできる。また、他の食品と合わせて摂取しても良い。
【００３６】
本発明の食品は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、糖尿病やメタボリックシンドロームの予防および改善食として有効である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例、製剤例等を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
製剤例１
散剤ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体５ｇ、乳糖８９５ｇ及びトウモロコシデンプン１００ｇをブレンダーで混合することにより、経口投与用の散剤を得た。
【００３８】
製剤例２
顆粒剤ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体５ｇ、乳糖８６５ｇ及び低置換度ヒドロキシプロピルセルロース１００ｇを混合した後、１０％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液３００ｇを加えて練合した。これを押出し造粒機を用いて造粒し、乾燥後、経口投与用の顆粒剤を得た。
【００３９】
製剤例３
カプセル剤ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体５ｇ、乳糖１１５ｇ、トウモロコシデンプン５８ｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｇをＶ型混合機を用いて混合した後、３号カプセルに１８０ｍｇずつ充填することによって、経口投与用のカプセル剤を得た。
【００４０】
製剤例４
ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体０．５重量％、プロピレングリコール１０重量％、α−モノイソステアリルグリセリルエーテル１０重量％、エタノール６５重量％、精製水１４．５重量％を配合することによって、ローションタイプの育毛剤を得た。
【００４１】
製剤例５
ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体０．５重量％、ステアリン酸２重量％、セタノール１．５重量％、白色ワセリン３重量％、ラノリンアルコール２重量％、ポリオキシエチレン（１０）モノオレエート２重量％、α−モノイソステアリルグリセリルエーテル５重量％、ビタミンＥアセテート０．２重量％、グリチルレチン酸０．２重量％、パラオキシ安息香酸メチル０．０５重量％、エチレンジアミンテトラアセテート−２ナトリウム塩０．０５重量％、プロピレングリコール１０重量％、精製水７３．５重量％を配合することによって、乳液タイプの育毛剤を得た。
【００４２】
実施例１（ＰＴＰ１Ｂ活性測定）
ＰＴＰ１Ｂ活性は、９６穴マイクロタイタープレートを用いて、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮＰＰ）を脱リン酸化する活性（４０５ｎｍの吸光度の変化）を測定した。Protein tyrosine phosphatase 1B（human recombinant）は、Cayman Chemical Company社から購入して使用した。酵素希釈液（37.5 mM HEPES、20%グリセロール、0.005% Triton X-100）に溶解したＰＴＰ１Ｂを２０μｌと50 mM HEPES（pH 7.5）に溶解したＰＱＱを５０μｌずつ各穴に加えて３７℃で３０分間インキュベートした。基質溶液（37.5 mM 酢酸ナトリウム、150 mM 塩化ナトリウム、2.5 mM EDTA、0.1% BSA、50 mM pNPP、0.5 mM DTT（pH 5.0））をマルチピペットを用いて、各wellに１５０μｌずつ加えた。室温において、マイクロプレートリーダーによって４０５ｎｍの吸光度を経時的に測定した。
実施例１の結果を図１に示す。
【００４３】
図１より、ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤として作用し、糖尿病の治療薬、皮膚外用剤、又は食品として有効であることが確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、特に、ピロロキノリンキノン又はその誘導体からなるＰＴＰ１Ｂ阻害剤に関する。また、本発明は、該阻害剤を含む糖尿病治療薬、皮膚外用剤及び食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生活習慣の欧米化に伴い、肥満を始めとする生活習慣病と呼ばれる疾患が、社会的に大きな問題となっている。生活習慣病は、食習慣、運動習慣、喫煙、飲酒等の生活習慣がその発症及び進行に関与する疾患群とされており、例えば、肥満症、糖尿病、高脂血症、高尿酸血症、循環器疾患、大腸癌、歯周病、高血圧、肺扁平上皮がん、慢性気管支炎、閉塞性肺疾患、肺気腫、アルコール性肝疾患又はアルコール性膵炎等が挙げられる。
【０００３】
その中でも特に注目されている疾患の１つが糖尿病である。糖尿病は、慢性的に血糖値が高い状態となることを特徴とする疾患である。慢性的な高血糖状態は、様々な疾患へとつながり、網膜症、腎症、神経障害等の合併症を引き起こす。糖尿病は、膵臓β細胞の大部分に破壊が起こり、インスリン分泌が欠乏してインスリンの絶対的な不足が生じるＩ型糖尿病と、インスリンの分泌低下や骨格筋、肝臓、脂肪組織でのインスリン抵抗性によってインスリンの相対的な不足が生じるＩＩ型糖尿病とに大きく分類される。現在、ＩＩ型糖尿病患者が急増しており、糖尿病患者の９０％以上を占めている。しかし、従来用いられている糖尿病治療薬であるスルホニルウレア系糖尿病治療薬、ビグアナイド系糖尿病治療薬、α−グルコシダーゼ阻害薬は、その効果が充分でなく、低血糖、乳酸アシドーシス、下痢、便秘、嘔吐等の問題がある。また最近、インスリン抵抗性改善薬としてチアゾリジン系薬剤の開発がなされている。しかし、これも作用発現までに数日を要すること、ノンレスポンダーの存在、体重増加等の課題が残されている上に、毒性も問題視されており、未だ充分な糖尿病治療薬はない。
【０００４】
前述したように、糖尿病の発症にはインスリンが深く関わっている。インスリンは、膵臓β細胞でつくられる血糖調節に関わるホルモンである。分泌されたインスリンは、細胞膜上に存在するインスリン受容体に結合すると、チロシンキナーゼの作用を受けて、インスリン受容体の細胞内ドメインに存在するチロシン残基がリン酸化される。このチロシンリン酸化はチロシンキナーゼと、逆にこれを脱リン酸化するチロシンホスファターゼにより調節を受けており、この両者のバランスにより多様な細胞機能が発現されると考えられている。よって、このバランスが破綻してチロシンホスファターゼ活性が異常亢進すると、リン酸化されたチロシンの脱リン酸化が亢進し、インスリン作用が低下、つまりインスリン抵抗性へと至る。
【０００５】
現在、種々のチロシンホスファターゼが知られているが、インスリンシグナル伝達に関与するチロシンホスファターゼとして、肝臓、脂肪細胞、骨格筋などに存在するプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）１Ｂがある。これはインスリンシグナル伝達の減弱因子の１つとして考えられている。また、このＰＴＰ１Ｂは脂肪細胞から分泌されるペプチドホルモンであるレプチンのシグナル伝達にも関与している。レプチンは、強い摂食抑制とエネルギー産生の亢進を引き起こす作用を持ち、過食や肥満抑制に関与するホルモンである。レプチンシグナルはインスリンシグナルと同様、レプチン受容体の細胞内ドメインにおけるリン酸化がチロシンキナーゼとチロシンホスファターゼにより調節を受けている。よって、チロシンホスファターゼ活性が異常亢進することによって、リン酸化されたチロシンの脱リン酸化が亢進し、レプチン抵抗性へと至る。最近、ＰＴＰ１Ｂノックアウトマウスは、正常に発育するが、インスリン感受性の増大、エネルギー代謝の亢進、白色脂肪組織重量の減少を呈することが報告された（非特許文献１）。
【０００６】
すなわち、ＰＴＰ１Ｂを阻害すると、ＰＴＰ１Ｂの活性化による脱リン酸化作用が阻害され、インスリン及びレプチンのシグナル伝達が増強される。したがって、インスリン抵抗性及びレプチン抵抗性による糖尿病、肥満症及び高脂血症等が改善されると考えられる。以上のことから、ＰＴＰ１Ｂ阻害作用を有する薬剤はホスファターゼ阻害によって細胞内シグナル伝達を正常化するという、これまでの糖尿病治療薬にはない新規な作用を有するため、既存の糖尿病治療薬が抱える問題点を回避した生活習慣病、特に糖尿病、肥満症及び高脂血症の治療薬となり得る可能性がある。
【０００７】
また、近年、美容についての関心は、老若男女を問わず極めて高いものがあり、殊に顔、美肌に対しては化粧料の作用をいかに高めるか、顔、肌に対する安全をいかに図るかという追及がなされてきた。また、頭髪に関しても、幅広い層に関心が高く、特に一定の年齢を経た男性については、悩みの種であり、効果的な成分の出現が待たれていた。このような観点から、これまでの美肌化粧料及び頭髪化粧料を根本から見直す画期的な成分の開発が試みられている（特許文献１〜４）。
【０００８】
本来、人の肌はデリケートなものであり、人によっては化粧料の種類により、かぶれや痒み等を生じ、場合によっては顔や肌に対して大きなダメージを与えることとなる。また、有効的な成分であっても、その成分の安定化に欠ける場合、その成分が皮膚へ有効的に浸透することに欠ける場合には、その成分の作用効果を活かすことはできなかった。
【０００９】
現在、ＰＴＰの阻害剤としてはバナジウム誘導体、ホスホチロシン誘導体等が知られている。しかし、これらは阻害活性の特異性、細胞内への透過性等に問題があり、実用化には至っていない。インスリンシグナル伝達に関与することが明らかになりつつあるＰＴＰ１Ｂ等のＰＴＰを阻害する薬剤を見出すことができれば、糖尿病等の治療薬、予防薬として利用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平６−２１１６６０号公報
【特許文献２】特開平８−２０５１２号公報
【特許文献３】特開２００４−３４５９５４号公報
【特許文献４】特開２００７−２３０９１２号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Molecular and Cellular Biology, 20(15), 5479-5489 (2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は上記事情に鑑み、ＰＴＰ１Ｂ阻害活性を示す有効成分を含むＰＴＰ１Ｂ阻害剤と、該阻害剤を含む糖尿病治療薬、皮膚外用剤及び食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行い、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害活性を示す有効成分であることを見出した。また、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、生活習慣病、特に糖尿病の治療薬、皮膚外用剤、特に育毛剤、及び食品として有効であることを見出した。
すなわち、本発明に係るＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体からなる。
【００１４】
前記ピロロキノリンキノン誘導体は、以下の構造式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２はＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは自然数である。）
で表されることが好適である。
前記構造式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれメチル基であることが好適である。
【００１５】
本発明に係る糖尿病治療薬は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、糖尿病治療薬全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする。
また、本発明に係る皮膚外用剤は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、皮膚外用剤全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする。
さらに、本発明に係る食品は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、食品全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害活性を示す有効成分として作用する。本発明の糖尿病治療薬は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、糖尿病の治療薬として有効である。また、本発明の皮膚外用剤は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、皮膚外用剤、特に発毛、育毛作用を損なわずに、安定性、安全性を向上させた育毛剤として有効である。さらに、本発明の食品は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、糖尿病やメタボリックシンドロームの予防および改善食として有効である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１において得られたＰＴＰ１Ｂ活性測定結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ＰＴＰ１Ｂ阻害剤
本発明に係るＰＴＰ１Ｂ阻害剤は、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）又はその誘導体からなる。
ピロロキノリンキノン誘導体は、以下の構造式（ＩＩ）
【化２】
（式中、Ｒ１及びＲ２はＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは自然数である。）
で表されるアシル化ピロロキノリンキノン誘導体であることが好適である。このような誘導体とすることにより、活性部位である２つのキノンが保護され、服用した際に体内酵素等の作用によってアシル基が外れることにより、ピロロキノリンキノンの活性が得られる。したがって、このような誘導体を用いることにより、ピロロキノリンキノンの不活性化を抑制することができるため、ピロロキノリンキノンの活性を安定化することができる。また、アシル化ピロロキノリンキノン誘導体は、単純な反応で合成できる点においても好ましい。
【００１９】
上述した構造式（ＩＩ）中、Ｒ１及びＲ２がそれぞれメチル基であるアセチル化ピロロキノリンキノン誘導体とすることが好適である。
【００２０】
その他のピロロキノリンキノン誘導体としては、マレイン酸等のその他の酸無水物を２つのキノンの各々に付加した構造、無水化している部位を２箇所有する酸無水物により２つのキノン間を架橋した構造等を有するものとすることも可能である。
【００２１】
アシル化ピロロキノリンキノン誘導体は、例えば、ピロロキノリンキノン又はその塩中の２つのキノンを、有機溶剤又は水混和性有機溶剤を含んだ水溶液中でカテコール体へと還元する還元剤の存在下、もしくは、その還元反応の後に、アシル化触媒存在下又は非存在下において、カルボン酸の酸無水物又は酸ハロゲン化物を反応させることによって合成することができる。
【００２２】
アシル化ピロロキノリンキノン誘導体としては、例えば、アセチル化ピロロキノリンキノン誘導体を、上述した方法により合成することができる。
アセチル化剤としては、塩化アセチル、アセチルケテン、ケテンＮ−アセチルイミダゾール、無水酢酸等を任意に使用することが可能である。このようなアセチル化剤において、無水酢酸を使用することが好ましい。有機溶剤を必要とせず、副生する酢酸の除去を容易に行うことができるからである。
還元剤としては、亜鉛、マグネシウム、アルミニウム等の金属、ハイドロサルファイトナトリウム、硫化水素、二酸化硫黄、塩化スズ（ＩＩ）、水素、ギ酸、アスコルビン酸等を使用することが可能である。このような還元剤において、亜鉛、マグネシウムを使用することが好ましい。後処理が簡易であり、還元力が高いからである。
【００２３】
糖尿病治療薬
本発明に係る糖尿病治療薬は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、糖尿病治療薬全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有する。好ましくは０．０００００２〜０．５質量％である。少なくとも０．０００００１質量％以上含有していれば、ＰＴＰ１Ｂ阻害効果が最小限得られる濃度に相当するからであり、多くとも１０質量％以下であれば、十分にＰＴＰ１Ｂ阻害効果が得られ且つ安全性も得られるからである。
【００２４】
ハイドロキノン類、キノン類、キノン系化合物は、細胞毒性が強く、発癌性があるため、治療薬として利用することは難しいのに対し、ＰＱＱは食品にも含まれていて安全性が高いため、治療薬としての優位性を備えている。
【００２５】
本発明の糖尿病治療薬の投与形態としては、例えば、散剤、顆粒剤、細粒剤、ドライシロップ剤、錠剤及びカプセル剤等の経口投与剤；注射剤、軟膏剤、トローチ剤などが挙げられる。
【００２６】
本発明の糖尿病治療薬には、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤として作用するピロロキノリンキノン又はその誘導体の他に、治療薬の投与形態に応じて、適宜組み合わせて用いることができる。例えば、乳糖等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の結合剤；マクロゴール等の界面活性剤；炭酸水素ナトリウム等の発泡剤；シクロデキストリン等の溶解補助剤；クエン酸等の酸味剤；エデト酸ナトリウム等の安定化剤；リン酸塩等のｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００２７】
以上のように、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤として作用し、本発明は糖尿病の治療薬として有効である。
【００２８】
皮膚外用剤
本発明に係る皮膚外用剤は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、皮膚外用剤全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有する。好ましくは０．０００００２〜０．５質量％である。少なくとも０．０００００１質量％以上含有していれば、ＰＴＰ１Ｂ阻害効果が最小限得られる濃度に相当するからであり、多くとも１０質量％以下であれば、ＰＴＰ１Ｂ阻害効果が得られ且つ安全性も得られるからである。
【００２９】
本発明に係る皮膚外用剤は、ＰＱＱと反応するアミノ酸及びチオール化合物を含有していない。そのため、皮膚の老化防止、肌荒れの改善、抗炎症、創傷治癒等の効果も期待される。このような効果を奏する皮膚外用剤を製造するためには、ＰＱＱ又はその誘導体（有効成分）を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等に加え、必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体等の粘着剤と練合した後、ポリアルキル等の不織布に展延してテープ剤とすることが好適である。
【００３０】
本発明の成分は、化粧料、医薬品、医薬部外品など外皮に適用される皮膚外用剤として用いることができる。したがって、その剤型として水溶性系（ローション系）、可溶化系、乳化系（Ｗ／Ｏ型、Ｏ／Ｗ型）、粉末系、軟膏系、油液系、ジェル系、水−油二層系、水−油−粉末三層系など幅広い形態に使用することができる。また、本発明の皮膚外用剤は、上記必須成分の他に、本発明の効果を損なわない範囲で、皮膚外用剤に通常用いられる他の成分、例えば、粉末、油分、湿潤剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、界面活性剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、酵素、保湿剤、香料、水、多価アルコール、低級アルコール、高分子（増粘剤）、シリコーン類、色素などを必要に応じて適宜、配合することができる。
【００３１】
本発明の皮膚外用剤の剤型としては、例えば、ローション、油剤、乳剤、クリーム、軟膏等が挙げられる。また、化粧水、クリーム、乳液、パック、美容液、洗浄料等の様々な形態の化粧料として提供することも可能である。
【００３２】
以上のように、本発明の皮膚外用剤は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、皮膚外用剤、特に発毛、育毛作用を損なわずに、安定性、安全性を向上させた育毛剤として有効である。
【００３３】
食品
本発明に係る食品は、上記したＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、食品全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有する。好ましくは０．０００００２〜０．５質量％である。少なくとも０．０００００１質量％以上含有していれば、ＰＴＰ１Ｂ阻害効果が最小限得られる濃度に相当するからであり、多くとも１０質量％以下であれば、ＰＴＰ１Ｂ阻害効果が得られ且つ安全性も得られるからである。
【００３４】
本発明の成分は、食品添加物として、例えば、健康食品等に配合することができる。本発明の成分を含むことができる食品の具体例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤等の形態、あるいは、日常食する飲食物、栄養補強食、各種病院食等の形態で提供可能である。なお、調製の際に使用される添加剤としては、液剤としては水、果糖、ブドウ糖等の糖類、落下生油、大豆油、オリーブ油等の油類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のグリコール類を用いることができる。錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの固形剤の賦型剤としては乳糖、ショ糖、マンニット等の糖類、滑沢剤としてはカオリン、タルク、ステアリン酸マグネシウム等、崩壊剤としてデンプン、アルギン酸ナトリウム、結合剤としてポリビニルアルコール、セルロース、ゼラチン等、界面活性剤としては脂肪酸エステル等、可塑剤としてグリセリン等を例示することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
本発明において提供される食品は、そのまま食しても良く、例えば、カプセル型、錠剤型等の食品としても良い。その他、顆粒、粉末、栄養ドリンク食品等として提供しても良い。食品的に許容される他の食材、防腐剤、増粘剤、着色料、酸化防止剤その他の添加剤を加えることもできる。また、他の食品と合わせて摂取しても良い。
【００３６】
本発明の食品は、ピロロキノリンキノン又はその誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤の有効成分として作用し、糖尿病やメタボリックシンドロームの予防および改善食として有効である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例、製剤例等を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
製剤例１
散剤ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体５ｇ、乳糖８９５ｇ及びトウモロコシデンプン１００ｇをブレンダーで混合することにより、経口投与用の散剤を得た。
【００３８】
製剤例２
顆粒剤ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体５ｇ、乳糖８６５ｇ及び低置換度ヒドロキシプロピルセルロース１００ｇを混合した後、１０％ヒドロキシプロピルセルロース水溶液３００ｇを加えて練合した。これを押出し造粒機を用いて造粒し、乾燥後、経口投与用の顆粒剤を得た。
【００３９】
製剤例３
カプセル剤ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体５ｇ、乳糖１１５ｇ、トウモロコシデンプン５８ｇ及びステアリン酸マグネシウム２ｇをＶ型混合機を用いて混合した後、３号カプセルに１８０ｍｇずつ充填することによって、経口投与用のカプセル剤を得た。
【００４０】
製剤例４
ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体０．５重量％、プロピレングリコール１０重量％、α−モノイソステアリルグリセリルエーテル１０重量％、エタノール６５重量％、精製水１４．５重量％を配合することによって、ローションタイプの育毛剤を得た。
【００４１】
製剤例５
ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体０．５重量％、ステアリン酸２重量％、セタノール１．５重量％、白色ワセリン３重量％、ラノリンアルコール２重量％、ポリオキシエチレン（１０）モノオレエート２重量％、α−モノイソステアリルグリセリルエーテル５重量％、ビタミンＥアセテート０．２重量％、グリチルレチン酸０．２重量％、パラオキシ安息香酸メチル０．０５重量％、エチレンジアミンテトラアセテート−２ナトリウム塩０．０５重量％、プロピレングリコール１０重量％、精製水７３．５重量％を配合することによって、乳液タイプの育毛剤を得た。
【００４２】
実施例１（ＰＴＰ１Ｂ活性測定）
ＰＴＰ１Ｂ活性は、９６穴マイクロタイタープレートを用いて、ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｐＮＰＰ）を脱リン酸化する活性（４０５ｎｍの吸光度の変化）を測定した。Protein tyrosine phosphatase 1B（human recombinant）は、Cayman Chemical Company社から購入して使用した。酵素希釈液（37.5 mM HEPES、20%グリセロール、0.005% Triton X-100）に溶解したＰＴＰ１Ｂを２０μｌと50 mM HEPES（pH 7.5）に溶解したＰＱＱを５０μｌずつ各穴に加えて３７℃で３０分間インキュベートした。基質溶液（37.5 mM 酢酸ナトリウム、150 mM 塩化ナトリウム、2.5 mM EDTA、0.1% BSA、50 mM pNPP、0.5 mM DTT（pH 5.0））をマルチピペットを用いて、各wellに１５０μｌずつ加えた。室温において、マイクロプレートリーダーによって４０５ｎｍの吸光度を経時的に測定した。
実施例１の結果を図１に示す。
【００４３】
図１より、ピロロキノリンキノン又はピロロキノリンキノン誘導体がＰＴＰ１Ｂ阻害剤として作用し、糖尿病の治療薬、皮膚外用剤、又は食品として有効であることが確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロロキノリンキノン又はその誘導体からなるＰＴＰ１Ｂ阻害剤。
【請求項２】
前記ピロロキノリンキノン誘導体が、以下の構造式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２はＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは自然数である。）
で表されることを特徴とする請求項１に記載のＰＴＰ１Ｂ阻害剤。
【請求項３】
前記構造式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２がそれぞれメチル基であることを特徴とする請求項２に記載のＰＴＰ１Ｂ阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、糖尿病治療薬全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする糖尿病治療薬。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、皮膚外用剤全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、食品全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする食品。
【請求項１】
ピロロキノリンキノン又はその誘導体からなるＰＴＰ１Ｂ阻害剤。
【請求項２】
前記ピロロキノリンキノン誘導体が、以下の構造式（Ｉ）
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２はＣｎＨ２ｎ＋１であり、ｎは自然数である。）
で表されることを特徴とする請求項１に記載のＰＴＰ１Ｂ阻害剤。
【請求項３】
前記構造式（Ｉ）中、Ｒ１及びＲ２がそれぞれメチル基であることを特徴とする請求項２に記載のＰＴＰ１Ｂ阻害剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、糖尿病治療薬全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする糖尿病治療薬。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、皮膚外用剤全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のＰＴＰ１Ｂ阻害剤を、食品全量に対して、０．０００００１〜１０質量％含有することを特徴とする食品。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−１５０７（Ｐ２０１２−１５０７Ａ）
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１３９３６６（Ｐ２０１０−１３９３６６）
【出願日】平成２２年６月１８日（２０１０．６．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔発行者名〕 社団法人日本農芸化学会 〔刊行物名〕 日本農芸化学会２０１０年度（平成２２年度）大会講演要旨集 〔発行年月日〕 平成２２年３月５日
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【出願人】（５９９０９８５１８）株式会社ディーエイチシー (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１月５日（２０１２．１．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１８日（２０１０．６．１８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 〔発行者名〕 社団法人日本農芸化学会 〔刊行物名〕 日本農芸化学会２０１０年度（平成２２年度）大会講演要旨集 〔発行年月日〕 平成２２年３月５日
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【出願人】（５９９０９８５１８）株式会社ディーエイチシー (31)
【Ｆターム（参考）】
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