アムラの抽出成分を配合したマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤
【課題】 マトリックスメタロプロテアーゼ(ＭＭＰ)活性に対する阻害効果に優れた新規のＭＭＰ阻害剤を提供する。
【解決手段】 アムラ(Emblic officinalis Gaertn.)の果実を溶媒で抽出して得られた分離成分を含むＭＭＰ阻害剤、および、当該ＭＭＰ阻害剤を含む口腔用組成物、食品および化粧品。
【解決手段】 アムラ(Emblic officinalis Gaertn.)の果実を溶媒で抽出して得られた分離成分を含むＭＭＰ阻害剤、および、当該ＭＭＰ阻害剤を含む口腔用組成物、食品および化粧品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、新規なマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスは、コラーゲン、プロテオグリカン、エラスチンなどを主要な構成成分とする生体高分子であって、哺乳動物の生体組織を構成する細胞間に存在する間隙を埋める役割を果たしている。 これら細胞外マトリックスに作用してその分解を促す金属酵素群が、一般に、マトリックスメタロプロテアーゼ（以下、単に「ＭＭＰ」と称する）と呼ばれている。 そして、この細胞外マトリックスの代謝活動は、ＭＭＰに特異的な組織由来メタロプロテアーゼインヒビター（以下、単に「ＴＩＭＰ」と称する）とＭＭＰとの相互作用によって司られている。
【０００３】
ＭＭＰは、ガン(癌)疾患、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、歯肉炎等の種々の病態での細胞外マトリックスの分解において中心的な役割を果たす物質である（非特許文献１参照）。 また、紫外線などの外部刺激によって活性の亢進したＭＭＰが、皮膚の構造維持に重要な成分を分解してしまうことから、紫外線によって活性化する皮膚の老化促進因子としての側面も併せ持っている。
【０００４】
ＭＭＰは、多種多様の細胞によって産生されており、コラゲナーゼ（ＭＭＰ-１およびＭＭＰ-８）、ストロメライシン（ＭＭＰ-３）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ-２およびＭＭＰ-９）などの、10種類以上の酵素分子種がこれまでに報告されている（非特許文献２参照）。
【０００５】
この内、コラゲナーゼは、通常は、上皮系細胞からは産生されないが、歯周組織の付着上皮および歯周ポケット上皮周辺に発現していることが報告されている（非特許文献３参照）。 また、ゼラチナーゼは、歯周病原因菌由来のリポ多糖などによる刺激に起因して上皮細胞から産生され、かつ基底膜の構成成分であるタイプIVコラーゲンを分解することが報告されている。 つまり、このことは、ＭＭＰ活性の上昇が、歯周病の病態の進行とも密接に相関していることを示唆しているものと考えられる。
【０００６】
実際のところ、歯周病患者の口腔洗浄液、歯肉溝滲出液および唾液内に含まれるＭＭＰ量は、歯周病患者の病態を反映しており、歯周病の治療処置を施すことによって、ＭＭＰ量が減少したことも報告されている（非特許文献４参照）。 また、歯肉炎患者と健常者が保有しているＭＭＰの量とＴＩＭＰの量を測定したところ、歯肉炎患者でのＭＭＰ量が非常に多く、しかも、歯周炎患者に至ってはＭＭＰ量が著量であったことも報告されている（非特許文献５参照)。 従って、ＭＭＰの酵素活性やＭＭＰ産生を阻害する物質は、局所的炎症の悪化に伴う歯周疾患の病態進行の抑制を促す上で有用であると考えられる。
【０００７】
ＭＭＰ阻害剤としては、これまでに、ヒドロキサム酸誘導体（特許文献１〜２参照）やエスクレチン誘導体（特許文献３参照）などの物質が合成されており、また、天然物由来のフラボン類やアントシアニジン類を有効成分とする阻害剤も提案されている（特許文献４参照）。 また、細胞でのＭＭＰ産生を阻害する物質として、グルココルチコイド類の１種であるデキサメタゾンが合成されている（非特許文献６参照）。
【０００８】
そして、前出のコラゲナーゼに対する天然物由来の阻害剤／物質として、荊芥エキスまたは薄荷エキスを有効成分とする阻害剤（特許文献５参照）、ノルジヒドログアヤレテックアシッドを有効成分とする阻害剤（特許文献６参照）、ポリポレニックアシッドＣを有効成分とする阻害剤（特許文献７参照）、それに、ホウフクロウタケから分離精製された四環式トリテルペンの 20-carboxy-16-hydroxy-21-nor-5 α-7,9(11)-lanostadien-3,24-dione（特許文献８参照）などが、これまでに報告されている。
【０００９】
さらに、ＭＭＰの活性のみならず、細胞でのＭＭＰの産生能力に対する阻害剤として、ブドウ種子エキスを有効成分とする阻害剤（特許文献９参照）も報告されている。 また、最近になって、マンネンタケの溶媒抽出物が、癌細胞が産生するＭＭＰに対して阻害活性を示す上に、ＭＭＰが関与する癌転移をも抑制することが明らかにされている（特許文献１０参照）。
【特許文献１】特表平７−５０５３８７号公報
【特許文献２】特開平８− ８１４４３号公報
【特許文献３】特開平８−１８３７８５号公報
【特許文献４】特開平８−１０４６２８号公報
【特許文献５】特開平６−１８３９９０号公報
【特許文献６】特開平４−２１７６２６号公報
【特許文献７】特開平９− ４０５５２号公報
【特許文献８】特開平９−２３５２９３号公報
【特許文献９】特開２０００−１９１４８７号公報
【特許文献１０】特開２００３−１７１３０７号公報
【非特許文献１】中田、岡田、「呼吸」、18、４、pp.365-371 (1999)
【非特許文献２】吉原、新名、「炎症と免疫」、２、pp.177-185 (1994)
【非特許文献３】M．Kylmaniemi, et al: J．Dent Res., 75, pp.919-926 (1996）
【非特許文献４】M. Makela, et al: J．Dent Res., 73, pp.1397-1406 (1994)
【非特許文献５】A．Haerian, et al: J．Clin Periodontol., 22, pp.505-509 (1995)
【非特許文献６】M．Kylmaniemi: J．Dent．Res., 75, pp.919-926 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本願発明は、ＭＭＰ活性に対する阻害効果に優れ、なおかつ歯肉炎や歯周炎などの口腔内疾患の予防効果および治療効果を改善する新規のＭＭＰ阻害剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本願発明の要旨とするところは、古来より周知の薬用植物であり、しかもヒトに対する安全性が確認されている、アムラ（ラテン語学名：Emblica officinalis Gaertn.、英語学名：Emblic Myrobalan）を溶媒で抽出して得られた分離成分を含むＭＭＰ阻害剤にある。 また、本願発明の他の態様によれば、本願発明のＭＭＰ阻害剤を有効成分とする口腔用組成物、食品、化粧品なども提供される。
【００１２】
本願発明者が鋭意研究を行ってきた結果、アムラを溶媒で抽出して得られた分離成分が、ＭＭＰ阻害作用を奏するとの知見を得るに至り、歯肉炎や歯周炎（歯周病）などの口腔内疾患の予防や治療などの用途への応用性を見出したのである。
【発明の効果】
【００１３】
本願発明によると、ＭＭＰ活性に対する阻害効果に優れ、なおかつ歯肉炎や歯周炎などの口腔内疾患の予防および治療などへの利用に好適な新規のＭＭＰ阻害剤が実現されるのである。 また、これらＭＭＰ阻害剤を有効成分として取り込んだ口腔用組成物、食品、化粧品などを調製し、これを摂食または使用することで、ＭＭＰ阻害剤の作用を容易かつ持続的に享受することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本願発明のＭＭＰ阻害剤の構成を、以下に、詳細に説明する。
【００１５】
本願発明の一態様によれば、アムラを溶媒で抽出して得られた分離成分を含むＭＭＰ阻害剤が提供される。 なお、本明細書で使用する「ＭＭＰ阻害」の表現は、ＭＭＰの酵素活性の阻害および／または細胞内でのＭＭＰの産生阻害を指すものである。 すなわち、細胞内でのＭＭＰの産生阻害とは、歯肉炎や歯周炎などの疾病に罹患した哺乳動物の歯周組織を構成する細胞が産生したＭＭＰが、歯周組織間に存在する細胞外マトリックスを分解して、同組織の破壊に至らしめる一連の作用を阻害することである。 また、ＭＭＰの産生阻害とは、歯肉炎や歯周炎などの疾病に罹患した哺乳動物の歯周組織を構成する細胞が、ＭＭＰの産生を阻害し、かつ同組織内でのＭＭＰの蓄積を抑制することによって、歯周組織の破壊を免れることを意味している。
【００１６】
アムラは、古来よりインドにて主に強壮用剤として利用されている薬用植物である。 その果実には、身体への吸収性が非常に優れた約3,000mgもの熱安定性のビタミンＣを含有しており、この含有量は、オレンジ12個に含まれるビタミンＣの総量に匹敵する。 そして、アムラの果実が、生体組織の活性化、赤血球数の増大化、口腔内の清浄作用、歯茎出血の止血、視力改善、骨の再生、毛髪および爪の成長促進、白髪形成防止、血糖値調節、胃腸の炎症軽減などに対して作用すると言われている。
【００１７】
まず、アムラの果実を、溶媒を用いた抽出工程に適用する。 抽出工程に適用される果実は、そのままの状態で、または、物理的に破砕してから、あるいは、必要に応じて、乾燥および粉砕して粉体に加工してから抽出工程に適用することもできる。
【００１８】
この抽出工程で利用する溶媒としては、当該技術分野で周知の溶媒が利用可能であり、例えば、低級アルコール、多価アルコール、非極性溶媒、極性溶媒などが使用できる。
【００１９】
低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどの炭素数が１〜４のアルコール；多価アルコールとしては、グリセリン、ポリエチレングリコールなど；非極性溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカンなどの飽和炭化水素；極性溶媒としては、水、温水（熱水）、アセトン、酢酸エチル、酢酸メチルなどがある。 溶媒としては、前記したものの内の単品だけを選択して利用できることは勿論、二種類以上の溶媒を組み合わせて使用することもできる。 例えば、脂肪分の多い原料を用いる場合には、非極性溶媒で脱脂抽出処理した後に、任意の溶媒で抽出処理を行ってもよく、あるいは含水有機溶媒を用いて抽出処理を行うこともできる。
【００２０】
アムラの果実の抽出方法としては、当該技術分野で周知の方法を用いることができる。
【００２１】
例えば、アムラの果実そのもの、もしくはその粗粉砕物または裁断物、あるいはその乾燥破砕物（粉末）を、溶媒に、冷浸、温浸などして浸漬する方法や、加温して攪拌しながら抽出を行って、濾過を経て所望の分離成分を含む抽出物を得る方法、それにパーコレーション法なども利用することができる。
【００２２】
このようにして得られた抽出物を、必要に応じて、濾過または遠心分離によって不要な固形物（固形分）を除去した後に、使用態様に応じて、そのまま用いるか、または溶媒を留去して一部濃縮または乾燥したものを用いることができる。 なお、濃縮または乾燥して得られた分離物を、非溶解性溶媒で洗浄して精製して用いてもよく、あるいは、このものをさらに適当な溶剤に溶解または懸濁して用いることもできる。
【００２３】
別法として、得られた抽出物を、慣用されている精製法、例えば、向流分配法や液体クロマトグラフィーなどを用いて、所望の阻害活性を有する画分を取得および精製して使用することも可能である。
【００２４】
さらに、前述したようにして得られた溶媒抽出物を、減圧乾燥、凍結乾燥などの通常の乾燥手段によって、乾燥濃縮エキスの形態に加工して使用することも可能である。
【００２５】
また、本願発明の好ましい実施態様によれば、本願発明のＭＭＰ阻害剤を有効成分とする口腔用組成物も提供される。 本願発明の口腔用組成物でのアムラを溶媒で抽出して得られた分離成分の配合量は、通常は、乾燥重量でとして、約0.000１〜約20重量％、好ましくは、約0.0001〜約10重量％の範囲で調製される。 これはすなわち、分離成分の配合量が、約0.0001重量％に満たないと、相応のＭＭＰ阻害効果が発現されず、一方で、約20重量％を超えてしまうと、服用時における口腔用組成物の味が不快なものになってしまう上に、所望の阻害効果を獲得できないことによる。
【００２６】
そして、本願発明のＭＭＰ阻害効果に悪影響を及ぼすものでない限りは、口腔用組成物、食品や化粧品に一般的に用いられているその他の成分、例えば、粘着剤、清涼剤、結合剤、甘味料、着香料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤などを任意に加えることもできる。
【００２７】
粘着剤としては、多糖類、セルロース系高分子物質、合成高分子物質、天然系高分子物質、アミノ酸系高分子物質、ゴム系高分子物質などを由来とする水溶性高分子物質が利用できる。 例えば、プルラン、プルラン誘導体およびデンプンなどの多糖類；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース塩類（カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびカルボキシメチルセルロースカリウムなど）、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩（ポリアクリル酸ナトリウムおよびアクリル酸・アクリル酸オクチルエステル共重合体など）、メタアクリル酸類の共重合体（メタアクリル酸とアクリル酸 ｎ-ブチルの重合体、メタアクリル酸とメタアクリル酸メチルの重合体およびメタアクリル酸とアクリル酸エチルの重合体など）などのセルロース系高分子物質；カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどの合成高分子物質；レクチン、アルギン酸、アルギン酸塩（アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、アルギン酸トリエタノールアミン、アルギン酸トリイソプロパノールアミン、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸ブチルアミンおよびアルギン酸ジアミルアミンなど）、コンドロイチン硫酸ナトリウム、寒天、キトサン、カラギーナンなどの天然系高分子物質；コラーゲンおよびゼラチンなどのアミノ酸系高分子物質；および、アラビアガム、カラヤガム、トラガカントガム、キサンタンガム、ローカストビンガム、グアガム、タマリンドガムおよびジェランガムなどのゴム系高分子物質などが、本願発明において好適に利用することができる。
【００２８】
清涼剤としては、ｌ-メントール、dl-メントール、ハッカ油、カンフル、ハッカ水、ボルネオール、ペパーミント精油、スペアミント精油などが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００２９】
結合剤としては、糖類（ブドウ糖など）、糖アルコール類（ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マンニトールなど）、ポリビニルピロリドン、デンプン類、マクロゴール、デキストリン、トラガント、ゼラチン、ポリビニルアルコール、セラック、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロースなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３０】
甘味料としては、サッカリンナトリウム、ステビオサイド、ステビアエキス、アスパルテーム、キシリトール、水飴、蜂蜜、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、糖類（乳糖、白糖、果糖、ブドウ糖など）などが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３１】
着香料としては、天然香料（スペアミント油、アニス油、ユーカリ油、ウインターグリーン油、カシア油、クローブ油、タイム油、セージ油、レモン油、オレンジ油、ハッカ油、カルダモン油、コリアンダー油、マンダリン油、ライム油、ラベンダー油、ローズマリー油、ローレル油、カモミル油、キャラウェイ油、マジョラム油、ベイ油、レモングラス油、オリナガム油、パインニードル油など）、合成香料（カルボン、アネトール、シネオール、サリチル酸メチル、シンナミックアルデヒド、オイゲノール、チモール、リナロール、リナリールアセテート、リモネン、メントン、メンチルアセテート、ピネン、オクチルアルデヒド、シトラール、プレゴン、カルビールアセテート、アニスアルデヒドなど）、前掲の天然香料および／または合成香料から任意に選択した香料を混合して得た調合香料などが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３２】
崩壊剤としては、デンプン類、メチルセルロース、結晶セルロース、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、アルギン酸、アルギン酸塩、炭酸塩、有機酸、ポリビニルピロリドン、架橋ポリビニルピロリドンなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３３】
滑沢剤としては、滑石、金属石鹸、脂肪酸（ステアリン酸など）、ステアリン酸塩（ステアリン酸マグネシウムなど）、タルク、蔗糖脂肪酸エステル、含水ニ酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、マクロゴールなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３４】
着色料としては、青色１号、黄色４号、二酸化チタン、銅クロロフィリンナトリウムなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３５】
防腐剤としては、安息香酸類、サリチル酸類、ソルビン酸類、パラベン類、塩化セチルピリジニウム、塩化デカリニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、イソプロピルメチルフェノール、トリクロサン、ヒノキチオール、フェノールなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３６】
徐放調整剤としては、ポリ酢酸ビニル、エチルセルロース、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは双方を併用することもできる。
【００３７】
界面活性剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル流酸ナトリウム、ラウロマクロゴールなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３８】
溶解剤としては、グリセリン、濃グリセリン、プロピレングリコール、エタノール、流動パラフィン、精製水、マクロゴール、ポリソルベートなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３９】
湿潤剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール液、水、エタノール、希エタノールなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００４０】
ｐＨ調整剤としては、乳酸、パントテン酸、リン酸塩、リンゴ酸、クエン酸などが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００４１】
本願発明の口腔用組成物の剤型としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、液剤、シート剤、ゲル剤、ペースト剤などのいずれでも利用可能である。 とりわけ、本願発明の口腔用組成物を歯科製剤とする場合には、練歯磨、洗口液、口腔用パスタ、トローチなどの形態とすることで、歯周炎、歯肉炎、歯根膜炎、智歯周囲炎、インプラント周囲炎などの歯周組織の破壊に起因する口腔内疾患の予防および治療に有効に対処できる。
【００４２】
以下に、本願発明をその実施例に沿って説明するが、この実施例の開示に基づいて本願発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【実施例】
【００４３】
Ａ：ＭＭＰ阻害剤の調製
アムラ(Emblica officinalis Gaertn.)果実の乾燥物100ｇに、900mlの50％エタノールを加えて、常温で７日間かけて抽出を行った。 その後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固して、1.9ｇのアムラ乾燥エキスを得た。
【００４４】
なお、対照試料として、ウイキョウ(Foeniculum vulgare Mill.)果実の乾燥物20ｇを選択し、このものに、400mlの精製水を加え、90〜100℃で２時間かけて抽出を行った。 その後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固して、1.4ｇのウイキョウ乾燥エキスを得た。
【００４５】
このようにして得た各乾燥エキスの0.02ｇ/ml(２％W/V)を、抽出工程で用いた溶媒に溶解して調製した溶液を、後続の実施例で用いた。
【００４６】
Ｂ：ＭＭＰ阻害効果の検定
実施例Ａで調製したＭＭＰ阻害剤に関して、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ-２およびＭＭＰ-９）の酵素活性に対する効果を、ゼラチンザイモグラフィーを用いて検定した。
【００４７】
ＭＭＰ-２試料として、「MMP-２, Active, Human」（５μｇ、CALBIOCHEM、カタログ#PF023）を、30mM HEPES (pH 7.4) [５mM塩化カルシウム、0.2Ｍ塩化ナトリウム、0.02％アジ化ナトリウムを含有]２mlで調整し、−20℃で保管した。
【００４８】
同様に、ＭＭＰ-９試料として、「MMP-９, Recombinant, Active (67kD)」（５μｇ、CALBIOCHEM、カタログ#PF140）を、30mM HEPES (pH 7.4) [５mM塩化カルシウム、0.2Ｍ塩化ナトリウム、0.02％アジ化ナトリウムを含有]２mlで調整し、−20℃で保管した。
【００４９】
次に、10％SDS-PAGEゲル[１mm厚の分離用ゲル；0.3mg/mlゼラチン、10％のアクリルアミド／0.8％ビスアクリルアミド、0.100％SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、0.085％APS(アデニリル硫酸)、0.130％TEMED(N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン)を含有]を準備した。 次いで、250mM Tris-HCl (pH 6.8) [10％SDS、50％グリセロールを含有]でSDS化したＭＭＰ-２試料およびＭＭＰ-９試料をそれぞれ2.0μl、1.5μlサンプルアプライ用の溝に置き、常法に従って、250Ｖ、20mAの電気負荷条件下で、ゼラチンザイモグラフィーを実施した。
【００５０】
SDS-PAGEの泳動相用の緩衝液は、25mM Tris、192mMグリシン、および0.1％SDSを含む緩衝液を用いた。 電気泳動を終えた後、2.5％Triton X-100（SIGMA）の溶液に、分離用ゲルを、室温下で、30分間、２回浸漬して、SDSを除去した。 その後、200mM塩化ナトリウム、５mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウムを含む50mM Tris-HCl (pH 7.4)を、濃縮用ゲル[３％のアクリルアミド／0.8％ビスアクリルアミド、0.125M Tris-HCl (pH 6.8)、0.100％SDS、0.095％APS、0.250％TEMEDを含有]に浸漬し、37℃で、19時間インキュベートした。 この際に、実施例Ａで調製した各乾燥エキス（１％および0.1％の濃度）の試料溶液を、Tris-HCl緩衝液に加えた。
【００５１】
反応終了後に、濃縮用ゲルを、0.2％ ゲルコード ブルー染色剤（GelCode Blue Stain Reagent）の溶液に浸漬し、１時間、振とうした。 その後、蒸留水で洗浄して脱色を行い、ゼラチナーゼ活性は、青色のゲル上で染色されないバンドとして出現した（図１）。
【００５２】
図１に関して、図１(ａ)は、アムラ(Emblica officinalis Gaertn.)を溶媒で抽出して得られた分離成分を用いた試験区であり、また、図１(ｂ)は、ウイキョウ(Foeniculum vulgare Mill.)を溶媒で抽出して得られた分離成分を用いた試験区である。 そして、各ゲル上に追記された破線中心線の向かって左側のレーンにはＭＭＰ-２試料が、また、右側のレーンにはＭＭＰ-９試料が置かれて、泳動に付されている。 また、ＭＭＰ阻害成分を全く含まないゲルを、ネガティブコントロールとし、そして、ｏ-フェナントロリン（１mM）のゲルを、ポジティブコントロールとした。
【００５３】
ゲル上に現れた非染色バンド（白抜き部分）を目視して、実施例Ａで調製したＭＭＰ阻害剤のＭＭＰ阻害効果を、顕著な阻害効果（+++）、強度の阻害効果（++）、通常の阻害効果（+）および阻害効果無し（-）、との４段階評価に従って等級付けを行った。 その評価結果を、以下の表１にまとめた。
【００５４】
【表１】
図１および表１に記載の結果から明らかなように、アムラ(Emblica officinalis Gaertn.)を溶媒で抽出して得られた分離成分を含む本願発明のＭＭＰ阻害剤は、ＭＭＰ阻害効果を奏することが確認された。 また、本願発明のＭＭＰ阻害剤は、低濃度であるにもかかわらず、実用に供するに十分なＭＭＰ阻害活性を有していた。
【００５５】
Ｃ：口腔用組成物の調製
アムラ抽出物（１.０％）を配合した各種口腔用組成物を調製した。
【００５６】
なお、本実施例での成分配合量の単位は、特に断りのない限り、重量％で表示してある。
【００５７】
１：練歯磨剤
以下の表２に記載の材料を、常温下で、混合および練合して練歯磨剤を調製した。
【００５８】
【表２】
２：練歯磨剤
以下の表３に記載の材料を、常温下で、混合および練合して練歯磨剤を調製した。
【００５９】
【表３】
３：洗口液
以下の表４に記載の材料を、常温下で、混液して洗口液を調製した。
【００６０】
【表４】
Ｄ．食品の調製
アムラ抽出物（１.０％）を配合した各種食品を調製した。
【００６１】
なお、本実施例での成分配合量の単位は、特に断りのない限り、重量％で表示してある。
【００６２】
１：チューインガム
以下の表５に記載の材料を、常温下で、混合してチューインガムを調製した。
【００６３】
【表５】
２：固形製剤（錠剤）
以下の表６に記載の材料を、常温下で、混合、打錠して錠剤を調製した。
【００６４】
【表６】
３：糖菓
以下の表７に記載の材料を、常温下で、混合して飴菓子（キャンディー）を調製した。
【００６５】
【表７】
Ｅ：化粧品の調製
アムラ抽出物（１.０％）を配合した各種化粧品を調製した。
【００６６】
なお、本実施例での成分配合量の単位は、特に断りのない限り、重量％で表示してある。
【００６７】
１：化粧水
以下の表８に記載の材料を、常温下で、混合して化粧水を調製した。
【００６８】
【表８】
２：化粧クリーム
以下の表９に記載の材料を、常温下で、混合して化粧クリームを調製した。
【００６９】
【表９】
３：乳液
以下の表１０に記載の材料を、常温下で、混合して乳液を調製した。
【００７０】
【表１０】
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本願発明のＭＭＰ阻害剤は、歯肉炎や歯周炎などの口腔内疾患を予防および治療するための手段として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】(ａ)アムラ(Emblica officinalis Gaertn.)および(ｂ)ウイキョウ(Foeniculum vulgare Mill.)を溶媒抽出して得た分離成分を含む試料に関して実施した電気泳動の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、新規なマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックスは、コラーゲン、プロテオグリカン、エラスチンなどを主要な構成成分とする生体高分子であって、哺乳動物の生体組織を構成する細胞間に存在する間隙を埋める役割を果たしている。 これら細胞外マトリックスに作用してその分解を促す金属酵素群が、一般に、マトリックスメタロプロテアーゼ（以下、単に「ＭＭＰ」と称する）と呼ばれている。 そして、この細胞外マトリックスの代謝活動は、ＭＭＰに特異的な組織由来メタロプロテアーゼインヒビター（以下、単に「ＴＩＭＰ」と称する）とＭＭＰとの相互作用によって司られている。
【０００３】
ＭＭＰは、ガン(癌)疾患、潰瘍形成、慢性関節リュウマチ、骨粗鬆症、歯周炎、歯肉炎等の種々の病態での細胞外マトリックスの分解において中心的な役割を果たす物質である（非特許文献１参照）。 また、紫外線などの外部刺激によって活性の亢進したＭＭＰが、皮膚の構造維持に重要な成分を分解してしまうことから、紫外線によって活性化する皮膚の老化促進因子としての側面も併せ持っている。
【０００４】
ＭＭＰは、多種多様の細胞によって産生されており、コラゲナーゼ（ＭＭＰ-１およびＭＭＰ-８）、ストロメライシン（ＭＭＰ-３）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ-２およびＭＭＰ-９）などの、10種類以上の酵素分子種がこれまでに報告されている（非特許文献２参照）。
【０００５】
この内、コラゲナーゼは、通常は、上皮系細胞からは産生されないが、歯周組織の付着上皮および歯周ポケット上皮周辺に発現していることが報告されている（非特許文献３参照）。 また、ゼラチナーゼは、歯周病原因菌由来のリポ多糖などによる刺激に起因して上皮細胞から産生され、かつ基底膜の構成成分であるタイプIVコラーゲンを分解することが報告されている。 つまり、このことは、ＭＭＰ活性の上昇が、歯周病の病態の進行とも密接に相関していることを示唆しているものと考えられる。
【０００６】
実際のところ、歯周病患者の口腔洗浄液、歯肉溝滲出液および唾液内に含まれるＭＭＰ量は、歯周病患者の病態を反映しており、歯周病の治療処置を施すことによって、ＭＭＰ量が減少したことも報告されている（非特許文献４参照）。 また、歯肉炎患者と健常者が保有しているＭＭＰの量とＴＩＭＰの量を測定したところ、歯肉炎患者でのＭＭＰ量が非常に多く、しかも、歯周炎患者に至ってはＭＭＰ量が著量であったことも報告されている（非特許文献５参照)。 従って、ＭＭＰの酵素活性やＭＭＰ産生を阻害する物質は、局所的炎症の悪化に伴う歯周疾患の病態進行の抑制を促す上で有用であると考えられる。
【０００７】
ＭＭＰ阻害剤としては、これまでに、ヒドロキサム酸誘導体（特許文献１〜２参照）やエスクレチン誘導体（特許文献３参照）などの物質が合成されており、また、天然物由来のフラボン類やアントシアニジン類を有効成分とする阻害剤も提案されている（特許文献４参照）。 また、細胞でのＭＭＰ産生を阻害する物質として、グルココルチコイド類の１種であるデキサメタゾンが合成されている（非特許文献６参照）。
【０００８】
そして、前出のコラゲナーゼに対する天然物由来の阻害剤／物質として、荊芥エキスまたは薄荷エキスを有効成分とする阻害剤（特許文献５参照）、ノルジヒドログアヤレテックアシッドを有効成分とする阻害剤（特許文献６参照）、ポリポレニックアシッドＣを有効成分とする阻害剤（特許文献７参照）、それに、ホウフクロウタケから分離精製された四環式トリテルペンの 20-carboxy-16-hydroxy-21-nor-5 α-7,9(11)-lanostadien-3,24-dione（特許文献８参照）などが、これまでに報告されている。
【０００９】
さらに、ＭＭＰの活性のみならず、細胞でのＭＭＰの産生能力に対する阻害剤として、ブドウ種子エキスを有効成分とする阻害剤（特許文献９参照）も報告されている。 また、最近になって、マンネンタケの溶媒抽出物が、癌細胞が産生するＭＭＰに対して阻害活性を示す上に、ＭＭＰが関与する癌転移をも抑制することが明らかにされている（特許文献１０参照）。
【特許文献１】特表平７−５０５３８７号公報
【特許文献２】特開平８− ８１４４３号公報
【特許文献３】特開平８−１８３７８５号公報
【特許文献４】特開平８−１０４６２８号公報
【特許文献５】特開平６−１８３９９０号公報
【特許文献６】特開平４−２１７６２６号公報
【特許文献７】特開平９− ４０５５２号公報
【特許文献８】特開平９−２３５２９３号公報
【特許文献９】特開２０００−１９１４８７号公報
【特許文献１０】特開２００３−１７１３０７号公報
【非特許文献１】中田、岡田、「呼吸」、18、４、pp.365-371 (1999)
【非特許文献２】吉原、新名、「炎症と免疫」、２、pp.177-185 (1994)
【非特許文献３】M．Kylmaniemi, et al: J．Dent Res., 75, pp.919-926 (1996）
【非特許文献４】M. Makela, et al: J．Dent Res., 73, pp.1397-1406 (1994)
【非特許文献５】A．Haerian, et al: J．Clin Periodontol., 22, pp.505-509 (1995)
【非特許文献６】M．Kylmaniemi: J．Dent．Res., 75, pp.919-926 (1996)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本願発明は、ＭＭＰ活性に対する阻害効果に優れ、なおかつ歯肉炎や歯周炎などの口腔内疾患の予防効果および治療効果を改善する新規のＭＭＰ阻害剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
すなわち、本願発明の要旨とするところは、古来より周知の薬用植物であり、しかもヒトに対する安全性が確認されている、アムラ（ラテン語学名：Emblica officinalis Gaertn.、英語学名：Emblic Myrobalan）を溶媒で抽出して得られた分離成分を含むＭＭＰ阻害剤にある。 また、本願発明の他の態様によれば、本願発明のＭＭＰ阻害剤を有効成分とする口腔用組成物、食品、化粧品なども提供される。
【００１２】
本願発明者が鋭意研究を行ってきた結果、アムラを溶媒で抽出して得られた分離成分が、ＭＭＰ阻害作用を奏するとの知見を得るに至り、歯肉炎や歯周炎（歯周病）などの口腔内疾患の予防や治療などの用途への応用性を見出したのである。
【発明の効果】
【００１３】
本願発明によると、ＭＭＰ活性に対する阻害効果に優れ、なおかつ歯肉炎や歯周炎などの口腔内疾患の予防および治療などへの利用に好適な新規のＭＭＰ阻害剤が実現されるのである。 また、これらＭＭＰ阻害剤を有効成分として取り込んだ口腔用組成物、食品、化粧品などを調製し、これを摂食または使用することで、ＭＭＰ阻害剤の作用を容易かつ持続的に享受することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本願発明のＭＭＰ阻害剤の構成を、以下に、詳細に説明する。
【００１５】
本願発明の一態様によれば、アムラを溶媒で抽出して得られた分離成分を含むＭＭＰ阻害剤が提供される。 なお、本明細書で使用する「ＭＭＰ阻害」の表現は、ＭＭＰの酵素活性の阻害および／または細胞内でのＭＭＰの産生阻害を指すものである。 すなわち、細胞内でのＭＭＰの産生阻害とは、歯肉炎や歯周炎などの疾病に罹患した哺乳動物の歯周組織を構成する細胞が産生したＭＭＰが、歯周組織間に存在する細胞外マトリックスを分解して、同組織の破壊に至らしめる一連の作用を阻害することである。 また、ＭＭＰの産生阻害とは、歯肉炎や歯周炎などの疾病に罹患した哺乳動物の歯周組織を構成する細胞が、ＭＭＰの産生を阻害し、かつ同組織内でのＭＭＰの蓄積を抑制することによって、歯周組織の破壊を免れることを意味している。
【００１６】
アムラは、古来よりインドにて主に強壮用剤として利用されている薬用植物である。 その果実には、身体への吸収性が非常に優れた約3,000mgもの熱安定性のビタミンＣを含有しており、この含有量は、オレンジ12個に含まれるビタミンＣの総量に匹敵する。 そして、アムラの果実が、生体組織の活性化、赤血球数の増大化、口腔内の清浄作用、歯茎出血の止血、視力改善、骨の再生、毛髪および爪の成長促進、白髪形成防止、血糖値調節、胃腸の炎症軽減などに対して作用すると言われている。
【００１７】
まず、アムラの果実を、溶媒を用いた抽出工程に適用する。 抽出工程に適用される果実は、そのままの状態で、または、物理的に破砕してから、あるいは、必要に応じて、乾燥および粉砕して粉体に加工してから抽出工程に適用することもできる。
【００１８】
この抽出工程で利用する溶媒としては、当該技術分野で周知の溶媒が利用可能であり、例えば、低級アルコール、多価アルコール、非極性溶媒、極性溶媒などが使用できる。
【００１９】
低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどの炭素数が１〜４のアルコール；多価アルコールとしては、グリセリン、ポリエチレングリコールなど；非極性溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカンなどの飽和炭化水素；極性溶媒としては、水、温水（熱水）、アセトン、酢酸エチル、酢酸メチルなどがある。 溶媒としては、前記したものの内の単品だけを選択して利用できることは勿論、二種類以上の溶媒を組み合わせて使用することもできる。 例えば、脂肪分の多い原料を用いる場合には、非極性溶媒で脱脂抽出処理した後に、任意の溶媒で抽出処理を行ってもよく、あるいは含水有機溶媒を用いて抽出処理を行うこともできる。
【００２０】
アムラの果実の抽出方法としては、当該技術分野で周知の方法を用いることができる。
【００２１】
例えば、アムラの果実そのもの、もしくはその粗粉砕物または裁断物、あるいはその乾燥破砕物（粉末）を、溶媒に、冷浸、温浸などして浸漬する方法や、加温して攪拌しながら抽出を行って、濾過を経て所望の分離成分を含む抽出物を得る方法、それにパーコレーション法なども利用することができる。
【００２２】
このようにして得られた抽出物を、必要に応じて、濾過または遠心分離によって不要な固形物（固形分）を除去した後に、使用態様に応じて、そのまま用いるか、または溶媒を留去して一部濃縮または乾燥したものを用いることができる。 なお、濃縮または乾燥して得られた分離物を、非溶解性溶媒で洗浄して精製して用いてもよく、あるいは、このものをさらに適当な溶剤に溶解または懸濁して用いることもできる。
【００２３】
別法として、得られた抽出物を、慣用されている精製法、例えば、向流分配法や液体クロマトグラフィーなどを用いて、所望の阻害活性を有する画分を取得および精製して使用することも可能である。
【００２４】
さらに、前述したようにして得られた溶媒抽出物を、減圧乾燥、凍結乾燥などの通常の乾燥手段によって、乾燥濃縮エキスの形態に加工して使用することも可能である。
【００２５】
また、本願発明の好ましい実施態様によれば、本願発明のＭＭＰ阻害剤を有効成分とする口腔用組成物も提供される。 本願発明の口腔用組成物でのアムラを溶媒で抽出して得られた分離成分の配合量は、通常は、乾燥重量でとして、約0.000１〜約20重量％、好ましくは、約0.0001〜約10重量％の範囲で調製される。 これはすなわち、分離成分の配合量が、約0.0001重量％に満たないと、相応のＭＭＰ阻害効果が発現されず、一方で、約20重量％を超えてしまうと、服用時における口腔用組成物の味が不快なものになってしまう上に、所望の阻害効果を獲得できないことによる。
【００２６】
そして、本願発明のＭＭＰ阻害効果に悪影響を及ぼすものでない限りは、口腔用組成物、食品や化粧品に一般的に用いられているその他の成分、例えば、粘着剤、清涼剤、結合剤、甘味料、着香料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤、ｐＨ調整剤などを任意に加えることもできる。
【００２７】
粘着剤としては、多糖類、セルロース系高分子物質、合成高分子物質、天然系高分子物質、アミノ酸系高分子物質、ゴム系高分子物質などを由来とする水溶性高分子物質が利用できる。 例えば、プルラン、プルラン誘導体およびデンプンなどの多糖類；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース塩類（カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびカルボキシメチルセルロースカリウムなど）、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩（ポリアクリル酸ナトリウムおよびアクリル酸・アクリル酸オクチルエステル共重合体など）、メタアクリル酸類の共重合体（メタアクリル酸とアクリル酸 ｎ-ブチルの重合体、メタアクリル酸とメタアクリル酸メチルの重合体およびメタアクリル酸とアクリル酸エチルの重合体など）などのセルロース系高分子物質；カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどの合成高分子物質；レクチン、アルギン酸、アルギン酸塩（アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、アルギン酸トリエタノールアミン、アルギン酸トリイソプロパノールアミン、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸ブチルアミンおよびアルギン酸ジアミルアミンなど）、コンドロイチン硫酸ナトリウム、寒天、キトサン、カラギーナンなどの天然系高分子物質；コラーゲンおよびゼラチンなどのアミノ酸系高分子物質；および、アラビアガム、カラヤガム、トラガカントガム、キサンタンガム、ローカストビンガム、グアガム、タマリンドガムおよびジェランガムなどのゴム系高分子物質などが、本願発明において好適に利用することができる。
【００２８】
清涼剤としては、ｌ-メントール、dl-メントール、ハッカ油、カンフル、ハッカ水、ボルネオール、ペパーミント精油、スペアミント精油などが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００２９】
結合剤としては、糖類（ブドウ糖など）、糖アルコール類（ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マンニトールなど）、ポリビニルピロリドン、デンプン類、マクロゴール、デキストリン、トラガント、ゼラチン、ポリビニルアルコール、セラック、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロースなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３０】
甘味料としては、サッカリンナトリウム、ステビオサイド、ステビアエキス、アスパルテーム、キシリトール、水飴、蜂蜜、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、糖類（乳糖、白糖、果糖、ブドウ糖など）などが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３１】
着香料としては、天然香料（スペアミント油、アニス油、ユーカリ油、ウインターグリーン油、カシア油、クローブ油、タイム油、セージ油、レモン油、オレンジ油、ハッカ油、カルダモン油、コリアンダー油、マンダリン油、ライム油、ラベンダー油、ローズマリー油、ローレル油、カモミル油、キャラウェイ油、マジョラム油、ベイ油、レモングラス油、オリナガム油、パインニードル油など）、合成香料（カルボン、アネトール、シネオール、サリチル酸メチル、シンナミックアルデヒド、オイゲノール、チモール、リナロール、リナリールアセテート、リモネン、メントン、メンチルアセテート、ピネン、オクチルアルデヒド、シトラール、プレゴン、カルビールアセテート、アニスアルデヒドなど）、前掲の天然香料および／または合成香料から任意に選択した香料を混合して得た調合香料などが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３２】
崩壊剤としては、デンプン類、メチルセルロース、結晶セルロース、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、アルギン酸、アルギン酸塩、炭酸塩、有機酸、ポリビニルピロリドン、架橋ポリビニルピロリドンなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３３】
滑沢剤としては、滑石、金属石鹸、脂肪酸（ステアリン酸など）、ステアリン酸塩（ステアリン酸マグネシウムなど）、タルク、蔗糖脂肪酸エステル、含水ニ酸化ケイ素、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、マクロゴールなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３４】
着色料としては、青色１号、黄色４号、二酸化チタン、銅クロロフィリンナトリウムなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３５】
防腐剤としては、安息香酸類、サリチル酸類、ソルビン酸類、パラベン類、塩化セチルピリジニウム、塩化デカリニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化クロルヘキシジン、グルコン酸クロルヘキシジン、イソプロピルメチルフェノール、トリクロサン、ヒノキチオール、フェノールなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３６】
徐放調整剤としては、ポリ酢酸ビニル、エチルセルロース、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは双方を併用することもできる。
【００３７】
界面活性剤としては、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル流酸ナトリウム、ラウロマクロゴールなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３８】
溶解剤としては、グリセリン、濃グリセリン、プロピレングリコール、エタノール、流動パラフィン、精製水、マクロゴール、ポリソルベートなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００３９】
湿潤剤としては、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール液、水、エタノール、希エタノールなどが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００４０】
ｐＨ調整剤としては、乳酸、パントテン酸、リン酸塩、リンゴ酸、クエン酸などが本願発明において利用可能であるが、これらに限定されるものではなく、これらのいずれか１種類のみを用いることも、あるいは２種類以上を併用することもできる。
【００４１】
本願発明の口腔用組成物の剤型としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、液剤、シート剤、ゲル剤、ペースト剤などのいずれでも利用可能である。 とりわけ、本願発明の口腔用組成物を歯科製剤とする場合には、練歯磨、洗口液、口腔用パスタ、トローチなどの形態とすることで、歯周炎、歯肉炎、歯根膜炎、智歯周囲炎、インプラント周囲炎などの歯周組織の破壊に起因する口腔内疾患の予防および治療に有効に対処できる。
【００４２】
以下に、本願発明をその実施例に沿って説明するが、この実施例の開示に基づいて本願発明が限定的に解釈されるべきでないことは勿論である。
【実施例】
【００４３】
Ａ：ＭＭＰ阻害剤の調製
アムラ(Emblica officinalis Gaertn.)果実の乾燥物100ｇに、900mlの50％エタノールを加えて、常温で７日間かけて抽出を行った。 その後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固して、1.9ｇのアムラ乾燥エキスを得た。
【００４４】
なお、対照試料として、ウイキョウ(Foeniculum vulgare Mill.)果実の乾燥物20ｇを選択し、このものに、400mlの精製水を加え、90〜100℃で２時間かけて抽出を行った。 その後、抽出液を濾過し、得られた濾液を濃縮乾固して、1.4ｇのウイキョウ乾燥エキスを得た。
【００４５】
このようにして得た各乾燥エキスの0.02ｇ/ml(２％W/V)を、抽出工程で用いた溶媒に溶解して調製した溶液を、後続の実施例で用いた。
【００４６】
Ｂ：ＭＭＰ阻害効果の検定
実施例Ａで調製したＭＭＰ阻害剤に関して、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ-２およびＭＭＰ-９）の酵素活性に対する効果を、ゼラチンザイモグラフィーを用いて検定した。
【００４７】
ＭＭＰ-２試料として、「MMP-２, Active, Human」（５μｇ、CALBIOCHEM、カタログ#PF023）を、30mM HEPES (pH 7.4) [５mM塩化カルシウム、0.2Ｍ塩化ナトリウム、0.02％アジ化ナトリウムを含有]２mlで調整し、−20℃で保管した。
【００４８】
同様に、ＭＭＰ-９試料として、「MMP-９, Recombinant, Active (67kD)」（５μｇ、CALBIOCHEM、カタログ#PF140）を、30mM HEPES (pH 7.4) [５mM塩化カルシウム、0.2Ｍ塩化ナトリウム、0.02％アジ化ナトリウムを含有]２mlで調整し、−20℃で保管した。
【００４９】
次に、10％SDS-PAGEゲル[１mm厚の分離用ゲル；0.3mg/mlゼラチン、10％のアクリルアミド／0.8％ビスアクリルアミド、0.100％SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)、0.085％APS(アデニリル硫酸)、0.130％TEMED(N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン)を含有]を準備した。 次いで、250mM Tris-HCl (pH 6.8) [10％SDS、50％グリセロールを含有]でSDS化したＭＭＰ-２試料およびＭＭＰ-９試料をそれぞれ2.0μl、1.5μlサンプルアプライ用の溝に置き、常法に従って、250Ｖ、20mAの電気負荷条件下で、ゼラチンザイモグラフィーを実施した。
【００５０】
SDS-PAGEの泳動相用の緩衝液は、25mM Tris、192mMグリシン、および0.1％SDSを含む緩衝液を用いた。 電気泳動を終えた後、2.5％Triton X-100（SIGMA）の溶液に、分離用ゲルを、室温下で、30分間、２回浸漬して、SDSを除去した。 その後、200mM塩化ナトリウム、５mM塩化カルシウム、0.02％アジ化ナトリウムを含む50mM Tris-HCl (pH 7.4)を、濃縮用ゲル[３％のアクリルアミド／0.8％ビスアクリルアミド、0.125M Tris-HCl (pH 6.8)、0.100％SDS、0.095％APS、0.250％TEMEDを含有]に浸漬し、37℃で、19時間インキュベートした。 この際に、実施例Ａで調製した各乾燥エキス（１％および0.1％の濃度）の試料溶液を、Tris-HCl緩衝液に加えた。
【００５１】
反応終了後に、濃縮用ゲルを、0.2％ ゲルコード ブルー染色剤（GelCode Blue Stain Reagent）の溶液に浸漬し、１時間、振とうした。 その後、蒸留水で洗浄して脱色を行い、ゼラチナーゼ活性は、青色のゲル上で染色されないバンドとして出現した（図１）。
【００５２】
図１に関して、図１(ａ)は、アムラ(Emblica officinalis Gaertn.)を溶媒で抽出して得られた分離成分を用いた試験区であり、また、図１(ｂ)は、ウイキョウ(Foeniculum vulgare Mill.)を溶媒で抽出して得られた分離成分を用いた試験区である。 そして、各ゲル上に追記された破線中心線の向かって左側のレーンにはＭＭＰ-２試料が、また、右側のレーンにはＭＭＰ-９試料が置かれて、泳動に付されている。 また、ＭＭＰ阻害成分を全く含まないゲルを、ネガティブコントロールとし、そして、ｏ-フェナントロリン（１mM）のゲルを、ポジティブコントロールとした。
【００５３】
ゲル上に現れた非染色バンド（白抜き部分）を目視して、実施例Ａで調製したＭＭＰ阻害剤のＭＭＰ阻害効果を、顕著な阻害効果（+++）、強度の阻害効果（++）、通常の阻害効果（+）および阻害効果無し（-）、との４段階評価に従って等級付けを行った。 その評価結果を、以下の表１にまとめた。
【００５４】
【表１】
図１および表１に記載の結果から明らかなように、アムラ(Emblica officinalis Gaertn.)を溶媒で抽出して得られた分離成分を含む本願発明のＭＭＰ阻害剤は、ＭＭＰ阻害効果を奏することが確認された。 また、本願発明のＭＭＰ阻害剤は、低濃度であるにもかかわらず、実用に供するに十分なＭＭＰ阻害活性を有していた。
【００５５】
Ｃ：口腔用組成物の調製
アムラ抽出物（１.０％）を配合した各種口腔用組成物を調製した。
【００５６】
なお、本実施例での成分配合量の単位は、特に断りのない限り、重量％で表示してある。
【００５７】
１：練歯磨剤
以下の表２に記載の材料を、常温下で、混合および練合して練歯磨剤を調製した。
【００５８】
【表２】
２：練歯磨剤
以下の表３に記載の材料を、常温下で、混合および練合して練歯磨剤を調製した。
【００５９】
【表３】
３：洗口液
以下の表４に記載の材料を、常温下で、混液して洗口液を調製した。
【００６０】
【表４】
Ｄ．食品の調製
アムラ抽出物（１.０％）を配合した各種食品を調製した。
【００６１】
なお、本実施例での成分配合量の単位は、特に断りのない限り、重量％で表示してある。
【００６２】
１：チューインガム
以下の表５に記載の材料を、常温下で、混合してチューインガムを調製した。
【００６３】
【表５】
２：固形製剤（錠剤）
以下の表６に記載の材料を、常温下で、混合、打錠して錠剤を調製した。
【００６４】
【表６】
３：糖菓
以下の表７に記載の材料を、常温下で、混合して飴菓子（キャンディー）を調製した。
【００６５】
【表７】
Ｅ：化粧品の調製
アムラ抽出物（１.０％）を配合した各種化粧品を調製した。
【００６６】
なお、本実施例での成分配合量の単位は、特に断りのない限り、重量％で表示してある。
【００６７】
１：化粧水
以下の表８に記載の材料を、常温下で、混合して化粧水を調製した。
【００６８】
【表８】
２：化粧クリーム
以下の表９に記載の材料を、常温下で、混合して化粧クリームを調製した。
【００６９】
【表９】
３：乳液
以下の表１０に記載の材料を、常温下で、混合して乳液を調製した。
【００７０】
【表１０】
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本願発明のＭＭＰ阻害剤は、歯肉炎や歯周炎などの口腔内疾患を予防および治療するための手段として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】(ａ)アムラ(Emblica officinalis Gaertn.)および(ｂ)ウイキョウ(Foeniculum vulgare Mill.)を溶媒抽出して得た分離成分を含む試料に関して実施した電気泳動の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アムラ（Emblica officinalis Gaertn.）を溶媒で抽出して得られた分離成分を含む、ことを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含む口腔用組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含む食品。
【請求項４】
請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含む化粧品。
【請求項１】
アムラ（Emblica officinalis Gaertn.）を溶媒で抽出して得られた分離成分を含む、ことを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含む口腔用組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含む食品。
【請求項４】
請求項１に記載のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含む化粧品。
【図１】
【公開番号】特開２００６−２８２５６１（Ｐ２００６−２８２５６１Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１０３７０２（Ｐ２００５−１０３７０２）
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（０００１８６５８８）小林製薬株式会社 (518)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１９日（２００６．１０．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月３１日（２００５．３．３１）
【出願人】（０００１８６５８８）小林製薬株式会社 (518)
【Ｆターム（参考）】
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