アルカリキシラナーゼ
【課題】アルカリ領域で作用し、キシログリカン分解活性を有し、且つ結晶性セルロース分解活性を有する洗剤用酵素として有用な酵素及びその遺伝子の提供。
【解決手段】次の酵素学的性質を有するアルカリキシラナーゼ；１）作用：キシランのβ１，４−グリコシド結合を加水分解する、２）基質特異性：キシラン及び結晶性セルロースを分解し、特にキシランをよく分解する、３）最適反応ｐＨ：キシランを基質として４０℃で反応させた場合、最適反応ｐＨは約８．５、４）ｐＨ安定性：キシランを基質として５℃で２０時間処理した場合、ｐＨ４．０〜１０．５で未処理の８０％以上の残存活性を示し安定である、５）最適反応温度：キシランを基質としてｐＨ９．０で２０分間反応させた場合、最適反応温度は約５０℃、６）熱安定性：キシランを基質としてｐＨ７．０で２０分間処理した場合、５０℃までは未処理の９０％以上の残存活性を示し安定ある、７）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約４０ｋＤａである。
【解決手段】次の酵素学的性質を有するアルカリキシラナーゼ；１）作用：キシランのβ１，４−グリコシド結合を加水分解する、２）基質特異性：キシラン及び結晶性セルロースを分解し、特にキシランをよく分解する、３）最適反応ｐＨ：キシランを基質として４０℃で反応させた場合、最適反応ｐＨは約８．５、４）ｐＨ安定性：キシランを基質として５℃で２０時間処理した場合、ｐＨ４．０〜１０．５で未処理の８０％以上の残存活性を示し安定である、５）最適反応温度：キシランを基質としてｐＨ９．０で２０分間反応させた場合、最適反応温度は約５０℃、６）熱安定性：キシランを基質としてｐＨ７．０で２０分間処理した場合、５０℃までは未処理の９０％以上の残存活性を示し安定ある、７）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約４０ｋＤａである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗浄剤用酵素として有用なキシラナーゼ及び該キシラナーゼをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤には、その洗浄力を向上させるためにプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼといった各種加水分解酵素が配合されている。セルラーゼはセルロースのβ−１，４グリコシド結合を加水分解する酵素の総称であるが、繊維の基本となる結晶領域のセルロース分子には殆ど作用せず、非結晶領域の水和セルロースがつくるゲル構造を軟化しそこに閉じこめられている汚れを流出させることから、衣料用洗剤酵素として有用である。近年、掘越（特許文献１、非特許文献１）によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出され、衣料用重質洗剤へ配合可能なアルカリセルラーゼが種々開発されている（特許文献２〜５）。
【０００３】
ところで、衣料に付着した汚れや染みの中で、洗濯により除去することが困難なものの一つに野菜や果物に由来する染みがある。衣料に付着した野菜や果物に由来する染みは、色素が野菜や果物の細胞壁中の構成成分に共有結合や物理的結合により結合している。色素の結合した野菜や果物の細胞壁の構成成分が衣類の木綿繊維に付着することが、洗濯により除去しづらい原因なっている。細胞壁の構成成分は結晶性のセルロースとキシログリカン（キシラン）等のヘミセルロース等であることから、これらの染み汚れを除去することを目的としてセルラーゼとキシラナーゼ等のヘミセルラーゼを複数配合した洗浄剤が報告されている（特許文献６）。
木綿繊維にダメージを与えない程度でセルロースの結晶領域に作用し、キシランも分解する酵素があれば野菜や果物由来の染みを効果的に除去でき、コストや生産性の面からも衣料用洗浄等に配合しやすいと考えられるが、現在洗剤に配合されているセルラーゼには、キシログリカン分解活性（キシラナーゼ活性）を有し、またセルロースの結晶部分に作用するものは知られていない。
【０００４】
また、セルロース系の合成繊維（綿レーヨン）、亞麻、大麻、ジュート、ラミー等を使用した布帛から製造された衣類は、繰り返し洗浄を行うことにより、繊維が機械的に破壊され砕かれる結果、毛羽立ちが発生し、それに伴い着色布帛においては色あせを起こすことになる。従って、毛羽立ちや色あせを起こしにくい洗浄剤が求められている。
【０００５】
一方、近年、遺伝子工学の発展に伴い洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになっている。アルカリセルラーゼについても例外ではなく既に数多くの遺伝子についてクローニング、塩基配列の決定がなされ、実生産に用いられている例もある。
【特許文献１】特公昭５０−２８５１５号公報
【特許文献２】特公昭６０−２３１５８号公報
【特許文献３】特公平６−０３０５７８号公報
【特許文献４】米国特許第４９４５０５３号明細書
【特許文献５】特開平１０−３１３８５９号公報
【特許文献６】特表平１１−５００４６４号公報
【非特許文献１】Horikoshi & Akiba,Alkalophilic Microorganisms,Springer,Berlin,(1982)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アルカリ領域で作用し、キシログリカン分解活性を有し、且つ結晶性セルロース分解活性を有する洗剤用酵素として有用な酵素及びその遺伝子を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、自然界からアルカリキシラナーゼ生産菌のスクリーニングを行ったところ、上記目的に適う酵素を生産する微生物を見出し、さらに当該微生物からアルカリキシラナーゼの遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の酵素学的性質を有するアルカリキシラナーゼに係るものである。
１．作用：
キシランのβ１，４−グリコシド結合を加水分解する。
２．基質特異性：
キシラン及び結晶性セルロースを分解し、特にキシランをよく分解する。
３．最適反応ｐＨ：
キシランを基質として４０℃で反応させた場合、最適反応ｐＨは約８．５である。
４．ｐＨ安定性：
キシランを基質として５℃で２０時間処理した場合、ｐＨ４．０〜１０．５で未処理の８０％以上の残存活性を示す。
５．最適反応温度：
キシランを基質としてｐＨ９．０で２０分間反応させた場合、最適反応温度は約５０℃である。
６．熱安定性：
キシランを基質としてｐＨ７．０で２０分間処理した場合、５０℃までは未処理の９０％以上の残存活性を示す。
７．分子量：
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約４０ｋＤａである。
【０００９】
また、本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）いずれかに記載のタンパク質及びこれをコードする遺伝子に係るものである。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
また、本発明は、以下の（ａ）から（ｄ）いずれかに記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子に係るものである。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００１１】
また、本発明は、上記遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含む形質転換体に係るものである。
【００１２】
また、本発明は、上記の形質転換体を培養し、キシラナーゼを採取するキシラナーゼの生産方法に係るものである。
【００１３】
また、本発明は、上記アルカリキシラナーゼ又はキシラナーゼ活性を有するタンパク質を配合してなる洗浄剤組成物に係るものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の新規なキシラナーゼは、キシラナーゼ活性と結晶性セルロース加水分解活性を有している新規な酵素であり、衣料用洗剤等の洗浄剤用酵素として有用である。また、本発明のアルカリキシラナーゼ遺伝子を用いれば、当該酵素を単一且つ大量に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のアルカリキシラナーゼは新規な酵素であり、以下の酵素学的性質を有するものである。
（１）作用
キシランに作用しこれを加水分解する。
【００１６】
（２）基質特異性
キシラン及び結晶性セルロース（ＣＰ）を加水分解する。
すなわち、ｐＨ９．０のグリシン水酸化ナトリウム緩衝液中で、４０℃で各基質を作用させた場合、キシラン及びＣＰを加水分解し、特にキシランを良く分解する。
また、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ＡＺＣＬ−アビセル、ＡＺＣＬ−カードラン、ＡＺＣＬ−マンナン及びコロイダルキチンは加水分解しない。
【００１７】
（３）最適反応ｐＨとｐＨ依存性
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、キシランを基質とした場合の最適反応ｐＨは、ｐＨ約８．５付近で、ｐＨ８．０〜９．０で最大活性の９０％以上を示し、ｐＨ７〜１０で最大活性の６０％以上を示す（図１Ａ）。すなわち、キシランを基質として４０℃で反応させた場合、最適反応ｐＨは約８．５である。
また、ＣＰを基質とした場合は、最適反応ｐＨは約ｐＨ５．５で、ｐＨ４．５〜９．０で最大活性の９０％以上を示し、ｐＨ４〜９．５で最大活性の６０％以上を示す（図１Ｂ）。このように、本発明のアルカリキシラナーゼは基質が異なることで、その最適反応ｐＨも異なるという極めて珍しい性質を示す。
【００１８】
〔測定条件〕
基質として、１％（ｗ／ｖ）キシラン及び１％（ｗ／ｖ）ＣＰを用いて、各０．１Ｍの緩衝液（グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８及びリン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２）中、４０℃、２０分間、反応させ、キシラナーゼ活性及びＣＰ分解活性を測定する（最大活性時を示したｐＨの値を１００％とした相対活性で示す）。尚、キシラナーゼ活性測定にはキシラン分解活性で０．１ユニット／ｍＬ、ＣＰ分解活性測定にはＣＰ分解活性で０．２５ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。
【００１９】
（４）ｐＨ安定性
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、キシラナーゼ活性及びＣＰ分解活性共に、ｐＨ４〜ｐＨ１０．５の範囲では残存活性は８０％以上であり、広いｐＨ範囲で安定である（図２）。すわなち、キシランを基質として５℃で２０時間処理した場合、ｐＨ４．０〜１０．５で未処理の８０％以上の残存活性を示す。
【００２０】
〔測定条件〕
各０．１Ｍの緩衝液（グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５酢酸緩衝液ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８及びリン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２）中、５℃で２０時間処理後、参考例に記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法にて活性を測定する（ｐＨ緩衝液未処理での活性を１００％とした残存活性で示す）。尚、キシラナーゼ活性測定ではキシラナーゼ活性で０．１ユニット／ｍＬ及びＣＰ分解活性測定にはＣＰ分解活性で０．２５ユニット／ｍＬの酵素液を用いた。
【００２１】
（５）最適反応温度
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、キシラナーゼ活性の最適反応温度は約５０℃であり、４０℃〜５５℃で最大活性の６０％以上を示す。（図３Ａ）。すなわち、キシランを基質としてｐＨ９．０で２０分間反応させた場合、最適反応温度は約５０℃である。
また、ＣＰ分解活性の最適反応温度は約５５℃であり、４０℃〜６０℃で最大活性の６０％以上を示す（図３Ｂ）。
【００２２】
〔測定条件〕
参考例記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法に準じ、反応温度を２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃、７０℃及び８０℃で反応させる（最高活性を示した温度での値を１００％とした相対活性で示す）。尚、キシラナーゼ活性測定にはキシラン分解活性で０．０５ユニット／ｍＬ、ＣＰ分解活性測定にはＣＰ分解活性で０．１２５ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。
【００２３】
（６）温度安定性
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、キシラナーゼ活性及びＣＰ分解活性共に、５０℃、２０分間の熱処理では、９０％以上の残存活性を有しており、５０℃までは安定である。また、２ｍＭ塩化カルシウムにより、酵素の熱に対する安定生が若干向上する（図４）。すなわち、キシランを基質としてｐＨ７．０で２０分間処理した場合、５０℃までは未処理の９０％以上の残存活性を示す。
【００２４】
〔測定条件〕
キシラナーゼ活性測定にはキシラン分解活性で０．１ユニット／ｍＬ、及びＣＰ分解活性測定にはＣＰ分解活性で０．２５ユニット／ｍＬの酵素液を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃及び９０℃の各温度下で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、２０分間熱処理した後、参考例に記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法にて残存活性を測定する（熱に対して未処理の活性を１００％とした残存活性で示す）。２ｍＭ塩化カルシウム添加及び無添加系で行った。
【００２５】
（７）分子量
分子量マーカーとして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダードＬＯＷ（バイオラッド）を用い、ゲル濃度１２．５％のゲルを用いて、３０ｍＡで約４０分間電気泳動を行い、分子量を求めると約４０ｋＤａである。尚、ＳＤＳ−電気泳動法では±５０００Ｄａ程度の振れを生じることから、当該分子量には約５０００Ｄａの変動が許容される。
【００２６】
本発明の（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、キシログリカンに作用し、そのβ１，４−グリコシド結合を分解する活性と結晶性セルロースに作用し、そのβ１，４−グリコシド結合を分解する活性を有する新規なキシラナーゼである。
本発明のタンパク質には、斯かる（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の他当該タンパク質と等価なタンパク質が包含される。
【００２７】
ここで、等価なタンパク質としては、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００２８】
ここで、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、１乃至１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましい。また、上記の付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００２９】
本発明の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質（アルカリキシラナーゼ；以下、Ｎ５４６ｂキシラナーゼとも表記する）と公知の酵素とのアミノ酸配列における同一性を比較すると、Bacillus sp.strain ＹＡ３５５株の生産するキシラナーゼ（Ju-Hyun,YらJ.Microbiol.Biotechnol.,3,139-145,1993）との同一性が最も高く、７６％であり、Bacillus sp.41M-1株由来のキシラナーゼ（NakaiらNucleic Acids Symp.Ser.,31,235-236,1994））と76%、Dictyoglomus thermophilum株由来のキシラナーゼとは、５１％であった。基質特異性及び相同検索の結果から本発明酵素はキシラナーゼに分類されると考えられた。
しかし、本発明のアルカリキシラナーゼは他酵素のアミノ酸配列との同一性でもっとも高いものが７６％であること、また、後記実施例に示すようにキシラン分解活性の最適ｐＨがアルカリ性領域にあり、ＣＰを基質にした結晶性セルロース分解活性の最適ｐＨが酸性領域にあるという、基質の種類により最適ｐＨが異なる従来知られていない性質を有することから、本発明のアルカリキシラナーゼは新規な酵素であると判断できる。
【００３０】
すなわち、本発明で提供するアルカリキシラナーゼと等価なタンパク質には、配列番号２に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質からなり、且つ、キシラナーゼ活性を有するタンパク質が包含される。
【００３１】
上記のアミノ酸配列の同一性は京都大学化学研究所バイオインフォマティクスセンターのゲノムネット中の相同検索ツールに存在するＢＬＡＳＴ２を用いたアミノ酸配列ホモロジー検索法で、プラグラムはＢＬＡＳＴＰを使用し、オプションパラメータは初期設定値（Scoring matrixはBLOSUM62、Filter なし、Alignment viewはpairwise）によって行った。
【００３２】
ここで、キシラナーゼ活性を有するとは、キシログリカン中のβ１，４−グリコシド結合を加水分解する活性を意味するが、その活性の程度は、その機能を発揮する限り配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同程度のもののみならず、これより高いもの、或いは低いものであってもよい。
【００３３】
また、上記アルカリキシラナーゼと等価なタンパク質は、結晶性セルロースの加水分解活性も有している。結晶性セルロースの分解活性とは結晶性セルロースのβ１，４−グリコシド結合を加水分解する活性を意味するが、その活性の程度は、その機能を発揮する限り配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同程度のもののみならず、これより高いもの、或いは低いものであってもよい。
【００３４】
また、上記アルカリキシラナーゼと等価なタンパク質は、さらに付加的な性質を有していてもよい。斯かる性質としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に比べて安定性に優れているという性質、低温及び／又は高温においてのみ異なる機能を有する性質、最適ｐＨが異なるという性質等が挙げられる。
【００３５】
また、本発明のアルカリキシラナーゼは、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。ここで、融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
【００３６】
本発明のアルカリキシラナーゼは、キシランを基質としたときは、最適ｐＨが約８．５であり、セルロースパウダー（ＣＰ）を基質にしたときは約５．５と基質により異なっていた。よって、洗浄剤として使用する際の環境のｐＨを調整することで、キシラナーゼ活性と結晶性セルロースの分解活性のバランスを調整することが可能になる。
【００３７】
本発明の遺伝子は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであり、好適には、（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子、及びこれと等価な遺伝子が挙げられる。ここで、等価な遺伝子には、（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルカリキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つアルカリキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【００３８】
ここで、ストリンジエントな条件とは、例えばMolecular cloning -a laboratory manual,2nd edition(Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００３９】
また、上記（ａ）で示される遺伝子と等価な遺伝子には、（ａ）で示される遺伝子に比べて、ｍＲＮＡの発現量が多い及び／又は安定性が高い、翻訳されるタンパク質の安定性が優れている等の性質を有していても良い。
【００４０】
尚、上記の塩基配列の同一性の検索も京都大学化学研究所バイオインフォマティクスセンターのゲノムネット中の相同検索ツールに存在するＢＬＡＳＴ２を用いたホモロジー検索法によって行った。プラグラムはＢＬＡＳＴＮを使用し、オプションパラメータは初期設定値（Scoring matrixはBLOSUM62、Filter なし、Alignment viewはpairwise）にて行った。
【００４１】
本発明のアルカリキシラナーゼ遺伝子は、バチルス エスピー（Bacillus Sp.)ＫＳＭ−Ｎ５４６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９７２９）等からクローン化することができ、クローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行う方法が挙げられる。
【００４２】
また、本発明で提供する遺伝子は、例えば、計画的なもしくはランダムな変異導入法等の方法により、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子を改変することにより作製することもできる。
【００４３】
ここで、計画的に変異を導入する際の変異の計画は、例えば、遺伝子配列上の特徴的な配列を参酌することにより行うことができる。ここで特徴的な配列の参酌は、例えば、そのタンパク質の立体構造予測、既知のタンパク質との相同性を考慮することにより行うことができる。ランダムに変異を導入する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、変異原処理による方法が挙げられる。計画的に変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異誘発法が挙げられ、より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ）等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ(polymerase chain reaction)法(PCR protocols,Academic press,New York,1990)を用いることもできる。
【００４４】
また、本発明の遺伝子は、本発明の遺伝子の一部又は全部を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列を適当な原理を用いて取得することにより得ることもできる。この適当な原理には、例えば、上記の本発明の遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドをプライマーとして用いて行うＰＣＲ法、上記の本発明の遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いる方法が含まれる。
【００４５】
本発明のアルカリキシラナーゼは、例えば、その生産微生物を天然又は合成培地に接種して、通常の培養条件で培養し、その培養物から採取することにより取得できる。また、上記の酵素遺伝子を人為的に発現させて、採取することも可能である。当該遺伝子を用いれば、本発明で提供するタンパク質を大量に生産することができ有用である。
ここで、アルカリキシラナーゼ生産微生物としては、例えばバチルス エスピー(Bacillus sp.)ＫＳＭ−Ｎ５４６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９７２９）が挙げられる。
【００４６】
本発明の遺伝子を用いてアルカリキシラナーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリキシラナーゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリキシラナーゼを採取すればよい。培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００４７】
また、本発明のアルカリキシラナーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターにアルカリキシラナーゼ遺伝子を組込めばよい。また、枯草菌を宿主にする場合、アルカリキシラナーゼ遺伝子の上流に当該アルカリキシラナーゼを高発現させることができるように特開２０００−２８７６８７号公報に記載のバチルス エスピー ＫＳＭ−６４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のＤＮＡ断片が結合されていてもよい。斯かるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci.Biotechnol,Biocem.,59,2172-2175,1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００４８】
斯くして得られた組換えベクターを用いて宿主を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主としては特に制限されず、あらゆるものを用いることができ、例えば、動物、動物由来の細胞、植物、植物由来の細胞、微生物等を用いることができるが、微生物が好ましく、微生物としては、Bacillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Escherichia coli（大腸菌）等のグラム陰性菌、Streptomyces属（放線菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌等が好ましく、枯草菌がより好ましく、枯草菌１６８株や枯草菌ＩＳＷ１２１４株が特に好ましい。動物由来の細胞、植物由来の細胞としては、培養細胞として確立しているものが好ましい。また、宿主としてはアルカリプロテアーゼが欠損している株が好ましい。
【００４９】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。斯くして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。
【００５０】
斯くして得られた培養物中からのアルカリキシラナーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。すなわち、培養物から遠心分離または濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液または乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００５１】
本発明のアルカリキシラナーゼは、後記実施例に示すように、キシラナーゼ活性と結晶性セルロース加水分解活性を有する。従って、各種洗剤組成物の配合用酵素として有用である。
【００５２】
本発明の洗浄剤組成物は、本発明のアルカリキシラナーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。斯かる酵素としては、例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等が挙げられ、このうち、プロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼがより好ましく、特に、結晶性セルロース分解能を有するセルラーゼを併用するのが特に好ましい。
【００５３】
後記実施例に示すように、本発明のアルカリキシラナーゼと結晶性セルロース分解能を有するセルラーゼを組み合わせることで、木綿繊維からなる衣料の毛羽を効率よく除去することができる。従って、これによれば、着色布帛において毛羽の発生によって生じる色あせを防止することも可能である。斯かる結晶性セルロース分解能を有するセルラーゼとしては、例えば、ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ（特開平１０−３１３８５９公報）、ＫＳＭ−Ｎ２５２セルラーゼ（特開２００１−３４００７４公報）、ＫＳＭ−Ｎ１４５セルラーゼ（特開２００５−２８７４４１公報）、ケアザイム（登録商標、ノボザイムズ社）などが挙げられる。
【００５４】
本発明の洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができる。斯かる成分としては、例えば界面活性剤、二価金属イオン捕捉剤、アルカリ剤、再汚染防止剤、漂白剤、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩等）、抑泡剤（シリコーン等）、香料、その他の添加剤が挙げられる。
【００５５】
界面活性剤は、洗浄剤組成物中０．５〜６０質量％配合するのが好ましく、特に粉末状洗浄剤組成物とする場合には１０〜４５質量％、液体洗浄剤組成物とする場合には２０〜５０質量％配合するのが好ましい。
界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種または組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
【００５６】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４の、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００５７】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００５８】
二価金属イオン捕捉剤は、０．０１〜５０質量％、好ましくは５〜４０質量％配合するのが好ましい。当該二価金属イオン捕捉剤としては、例えば、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩等の縮合リン酸塩、ゼオライト等のアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩等が挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのものが好適に使用される。
【００５９】
アルカリ剤は、０．０１〜８０質量％、好ましくは１〜４０質量％配合するのが好ましい。粉末状洗浄剤組成物とする場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号等の非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリ剤としてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられ、またトリポリリン酸塩等のリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗浄剤組成物とする場合に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる
【００６０】
再汚染防止剤は、０．００１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合するのが好ましい。再汚染防止剤としては、例えばポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸等のホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩等のポリマー、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸等のアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【００６１】
漂白剤、例えば過酸化水素、過炭酸塩等は、１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載等の漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。
【００６２】
蛍光剤としては、ビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘ等）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料等）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。
【００６３】
本発明の洗浄剤組成物は、本発明のアルカリキシラナーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形等にすることができる。
【００６４】
斯くして得られる洗浄剤組成物は、衣料用粉末洗浄剤、衣料用液体洗浄剤、自動食器洗浄機用洗剤、木綿繊維改質用洗浄剤等として使用することができる。
【実施例】
【００６５】
実施例１ アルカリキシラナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、３０分間熱処理し、以下の表１に示す組成を有する寒天平板培地に塗布した。３０℃の培養器で３日間静置培養し、菌の生育後、キシランの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返した。これによりBacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ５４６株を取得した。
【００６６】
【表１】
【００６７】
実施例２ Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ５４６株由来アルカリキシラナーゼ（Ｎ５４６ｂキシラナーゼ）の生産並びに精製
Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ５４６株を表２に示す組成から成る液体培地を用いて３０℃、３日間振盪培養を行った。
【００６８】
【表２】
【００６９】
得られた培養上清液を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で約１０倍に希釈し、同緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ（東ソー）に添着後、同緩衝液約４８０ｍＬでカラム内を洗浄し、アルカリキシラナーゼを含む非吸着画分を得た。次いで非吸着画分をＰＭ１０濃縮膜（アミコン製）を用いて、１０ｍＭホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加えながら２０倍濃縮した。次に予め１０ｍＭホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍカラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）に添着しアルカリキシラナーゼを吸着させた。同緩衝液２００ｍＬでカラム内を洗浄した後、０〜０．１ＭのＫＣｌ２００ｍＬで吸着タンパク質を溶出した。アルカリキシラナーゼ活性画分を集め、ＰＭ１０濃縮膜により脱塩濃縮した。さらに、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍカラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）に添着した。アルカリキシラナーゼは非吸着画分に溶出され、ＰＭ１０濃縮膜により脱塩濃縮した。最後に、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｙｄｒｏｘｙ ａｐａｔｉｔｅカラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）に添着した。アルカリキシラナーゼは非吸着画分に溶出され、これをＰＭ１０濃縮膜により脱塩濃縮し、電気泳動的に均一にまで精製された酵素精製標品を得た。得られた精製標品を用いてＮ末端アミノ酸配列分析に供した。
【００７０】
実施例３ Ｎ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子断片の取得
（１）ゲノムＤＮＡの制限酵素処理
Ｎ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子の取得は、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラ製）を用いて行った。
実施例２で得られたBacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ５４６株の菌体から斉藤・三浦の方法（Biochim.Biophys.Acta,72,619-629,1963）によりゲノムＤＮＡを調製した。まず、ＫＳＭ−Ｎ５４６株のゲノムＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ処理を行った。Ｎ５４６株ゲノムＤＮＡ２μＬ（１μｇ）、１０×緩衝液１０μＬ、脱イオン水２４μＬ、及びＨｉｎｄＩＩＩを２μＬ（２０ｕｎｉｔｓ）混合し、３７℃で３時間処理し、反応終了後、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア製）で精製（２５μＬ）した。
【００７１】
（２）ライゲーション反応
精製ＤＮＡ溶液２０μＬに、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｇ ＫｉｔのＨｉｎｄＩＩＩカセット５μＬ（１００ｎｇＤＮＡ）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ２５μＬを加え、１６℃で一晩放置した後、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔによりＤＮＡを精製回収した。
【００７２】
（３）ＰＣＲによるＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子断片の増幅
ライゲーション精製溶液２６．５μＬにＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｇ Ｋｉｔ中の１０×緩衝液５μＬ、ＬＡ Ｔａｑ０．５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ８μＬ、ＭｇＣｌ2 ５μＬ、キット中のプライマーＣ１を１μＬ（１０ｐｍｏｌ）及びＮ５４６ｂキシラナーゼ精製酵素のＮ末配列より推定した複合プライマーＩ（配列番号３）を４μＬ混合した。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃３０秒間、５５℃２分間、７２℃２分間（３０サイクル）で行った。得られたＰＣＲ溶液の１μＬを鋳型として用いて２回目のＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡ溶液１μＬにＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｇ Ｋｉｔ中の１０×緩衝液５μＬ、ＬＡ Ｔａｑ０．５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ８μＬ、ＭｇＣｌ2 ５μＬ、カセットプライマーＣ２を１μＬ（１０ｐｍｏｌ）、脱イオン水２６．５μＬ及びＮ５４６ｂキシラナーゼ精製酵素のＮ末配列より推定した複合プライマーＩＩ（配列番号４）を４μＬ（１０ｐｍｏｌ）混合した。ＰＣＲ反応条件は、９４℃１分間の熱変性後、９４℃３０秒間、５５℃２分間、７２℃１分間（３０サイクル）で行った。斯くして得られたＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子の部分増幅断片（約１．２ｋｂ）を用いてカセットプライマーＣ２をプライマーとして部分塩基配列を解析した。
【００７３】
実施例４ インバースＰＣＲによるＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子の全塩基配列決定
５４６ｂキシラナーゼ遺伝子の部分増幅断片（約１．２ｋｂ）から得られた塩基配列を基にインバースＰＣＲ用プライマーＩＩＩ〜ＶＩ（配列番号５〜８）を構築し、インバースＰＣＲを行った。ＫＳＭ−Ｎ５４６ｂ株ゲノムＤＮＡ溶液５μＬ（１μｇ）、１０×緩衝液１０μＬ、脱イオン水８２μＬ及びＳａｃＩ３μＬ（３０ｕｎｉｔｓ）を混合後、３７℃で３時間制限酵素処理した。得られたゲノム分解産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後（２０μＬ）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを使用して自己閉環した（１６℃、１８時間）。得られたライゲーション混液１μＬを鋳型ＤＮＡとして１回目のＰＣＲを行った。インバースＰＣＲ用プライマーＩＩＩ（配列番号５）及びプライマーＩＶ（配列番号６）を用いた。鋳型ＤＮＡ溶液１μＬ、各プライマー５μＬ（１μＭ）、１０×緩衝液５μＬ、ＬＡ Ｔａｑ０．５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ８μＬ、ＭｇＣｌ2 ５μＬ、及び脱イオン水２１．５μＬを混合した後、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（アマシャム ファルマシア製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃１分間（２８サイクル）及び７２℃１分間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにより精製した。これにより約５．５ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得た。
ついで、精製した増幅ＤＮＡ断片を鋳型にインバースＰＣＲ用プライマーＶ及びＶＩを用いて２回目のインバースＰＣＲを行った。即ち、鋳型ＤＮＡ溶液０．５μＬ、各プライマー５μＬ（１μＭ）、１０×緩衝液５μＬ、ＬＡ Ｔａｑ０．５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ８μＬ、ＭｇＣｌ2 ５μＬ、及び脱イオン水１９μＬを混合した後、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃３０秒間、５７℃１分間、７２℃２分３０秒間（２８サイクル）及び７２℃２分３０秒間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにより精製した後、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し増幅されたＤＮＡ断片約５．５ｋｂをゲルから回収、精製し、プライマーＶ（配列番号７）及びプライマーＶＩ（配列番号８）を用いてＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子の全塩基配列（約１．８ｋｂｐ）を決定した。
【００７４】
実施例５ Ｎ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子のサブクローニング
解読したＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子のプロモーター上流及びターミネーター下流の塩基配列を元にプライマーを構築し（それぞれプライマーＶＩＩ、プライマーＶＩＩＩ、配列番号９、配列番号１０）、Ｎ５４６株ゲノムを鋳型としてゲノムＰＣＲを行った。Ｎ５４６株ゲノム０．５μＬ（１μｇ）、プライマーＶＩＩ（ＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位付加、配列番号９）５μＬ、プライマーＶＩＩＩ（ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位付加、配列番号１０）５μＬ、１０×緩衝液５μＬ、ＬＡ Ｔａｑ０．５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ８μＬ、ＭｇＣｌ２５μＬ、及び脱イオン水２１μＬを混合した後、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃１分間の熱変性後、９８℃１０秒間、６８℃４分３０秒間（２８サイクル）で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後（８７μＬ）、１０μＬの１０×緩衝液及びＨｉｎｄＩＩＩ３μＬ（３０ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で２０時間酵素処理した。ＨｉｎｄＩＩＩ処理液をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、同様にＢｇｌＩＩ処理を行った。制限酵素処理液を精製後、予めＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩで処理したシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いて連結した（１６℃、２０時間）。
得られたライゲーション混液３μＬを用いて、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（タカラ製）１００μＬを形質転換した。テトラサイクリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーＰＣＲにより目的のＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子が挿入されたｐＨＹ３００ＰＬＫ（ｐＨＹ５４６ｂ）を保持する菌株を選別した。選別した形質転換体からプラスミドをＭｉｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャム ファルマシア製）を用いて回収、精製した。次ぎに、ｐＨＹ５４６ｂを用いて宿主菌Bacillus subtilis ＩＳＷ１２１４株（ヤクルト製）をプロトプラスト法により形質転換体を取得した。形質転換体の再生培地には、テトラサイクリン塩酸塩（シグマ製）３０μｇ／ｍＬを含むＤＭ３再生寒天培地（表３）を用いた。
【００７５】
【表３】
【００７６】
実施例６ 組み換えＮ５４６ｂキシラナーゼの生産
ＤＭ３再生寒天培地上に生育した形質転換体をＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）を用いて培養後（３０℃、７２時間、１２５ｒｐｍ）、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）により培養上清（組換えＮ５４６ｂキシラナーゼ粗酵素液）を得た。キシラナーゼ活性は４１ユニット及びＣＰ分解活性は０．４３ユニットあった。
【００７７】
実施例７ Ｎ５４６ｂキシラナーゼの諸性質
（１）基質特異性
参考例に示した方法に従って、本酵素のＣＭＣ、ＣＰ、キシラン、ＡＺＣＬ−アビセル、ＡＺＣＬ−カードラン、ＡＺＣＬ−マンナン及びコロイダルキチンに対する加水分解能を調べた結果、キシランに対する分解活性を１００とした時、ＣＰに対する分解活性は０．３６であった。また、ＣＭＣ、ＡＺＣＬ−アビセル、ＡＺＣＬ−カードラン、ＡＺＣＬ−マンナン及びコロイダルキチンに対する加水分解能は有していなかった。
【００７８】
（２）最適反応ｐＨ
基質には１％（ｗ／ｖ）キシラン及び１％（ｗ／ｖ）ＣＰを用いて、各０．１Ｍの緩衝液（グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８及びリン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２）中、４０℃、２０分間の反応条件下で測定した。キシラナーゼ活性測定にはキシラン分解活性で０．１ユニット／ｍＬ、ＣＰ分解活性測定にはＣＰ分解活性で０．２５ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。最大活性時を示したｐＨの値を１００％とした相対活性で示した。キシランを基質とした場合の最適反応ｐＨはｐＨ約８．５付近でｐＨ８．０〜９．０で最大活性の９０％以上を示し、ｐＨ７〜１０で最大活性の６０％以上を示した。また、ＣＰを基質とした場合は最適反応ｐＨは約ｐＨ５．５でｐＨ４．５〜９．０で最大活性の９０％以上を示し、ｐＨ４〜９．５で最大活性の６０％以上を示した。基質が異なることで、その最適反応ｐＨも異るという極めて珍しい性質を示した（図１）。
【００７９】
（３）ｐＨ安定性
各０．１Ｍの緩衝液（グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５酢酸緩衝液ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８及びリン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２）中、５℃で２０時間処理後、参考例記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法にて活性を測定した。ｐＨ緩衝液未処理での活性を１００％とした残存活性で示した。本実験には０．１ユニット／ｍＬ（キシラナーゼ）及び０．２５ユニット／ｍＬ（ＣＰアーゼ）の酵素液を用いた。その結果、キシラナーゼ活性及びＣＰ分解活性共に、ｐＨ４〜ｐＨ１０．５の範囲では残存活性は８０％以上であり、広いｐＨ範囲で安定であることが判った（図２）。
【００８０】
（４）最適反応温度
参考例記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法に準じ、反応温度を２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃、７０℃及び８０℃で反応させた。最高活性を示した温度での値を１００％とした相対活性で示した。キシラナーゼ活性測定にはキシラン分解活性で０．０５ユニット／ｍＬ、ＣＰアーゼ活性測定にはＣＰアーゼ分解活性で０．１２５ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。その結果、キシラン及びＣＰに対する本酵素の最適反応温度を調べた。キシラナーゼ活性の最適反応温度は約５０℃、ＣＰ分解活性の最適反応温度は約５５℃であり、共に５０℃付近に最適反応温度を有していた（図３）。
【００８１】
（５）温度安定性
０．１ユニット／ｍＬ（キシラナーゼ）及び０．２５ユニット／ｍＬ（ＣＰアーゼ）の酵素液を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃及び９０℃の各温度下で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、２０分間熱処理した後、残存活性を参考例に記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法にて測定した。熱に対して未処理の活性を１００％とした残存活性で示した。２ｍＭ塩化カルシウム添加及び無添加系で行った。その結果、キシラナーゼ及びＣＰアーゼ共に、５０℃、２０分間の熱処理では、９０％以上の残存活性を有しており、５０℃まででは安定であった。２ｍＭ塩化カルシウムにより、酵素の熱に対する安定生が若干向上した（図４）。
【００８２】
（６）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法に従い行った。尚、用いた分子量マーカーは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダードＬｏｗ（バイオ ラッド）であり、標準タンパク質として、ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂ（分子量；９７，４００）、ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（分子量；６６，２００）、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量；４５，０００）、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ（分子量；３１，０００）、ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（分子量；２１，５００）及びｌｙｓｏｚｙｍｅ（分子量；１４，４００）を含んでいた。ゲル濃度１２．５％のゲルを用いて、３０ｍＡ／ゲルで約４０分間電気泳動を行い、分子量を求めた場合、分子量は約４０ｋであった。
【００８３】
参考例 酵素活性測定方法
（１）ＣＭＣアーゼ活性測定法［３．５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法］
終濃度１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、日本製紙製）、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９ｍＬに適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、４０℃で２０分間反応した後、ＤＮＳ溶液１ｍＬを加えて沸騰湯浴中で５分間熱処理した。熱処理後氷水中で冷却し、脱イオン水４ｍＬを加え攪拌後、Ｕ２０００スペクトロフォトメーター（日立製作所）を用いて、５３５ｎｍでの吸光度を測定した。酵素１ユニット、１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する量とした。
【００８４】
（２）ＣＰアーゼ（結晶性セルロース分解活性）活性測定法
終濃度１％（ｗ／ｖ）セルロースパウダー（ＣＰ、ＳＩＧＭＡＣＥＬＬ、ｔｙｐｅ１０１、シグマ製）、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９ｍＬに適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、４０℃で１〜５時間反応した後、ＤＮＳ溶液１ｍＬを加えて遠心分離（３０００ｒｐｍ、２５℃、１５分間）後、１ｍＬを分取し、脱イオン水２ｍＬを加え攪拌した。沸騰湯浴中で５分間熱処理した後、熱処理後氷水中で冷却し、Ｕ２０００スペクトロフォトメーター（日立製作所）を用いて、５３５ｎｍでの吸光度を測定した。酵素１ｕｎｉｔは、１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する量とした。この方法をＣＰアーゼ（結晶性セルロース分解活性）標準活性測定法とした。
【００８５】
（３）キシラナーゼ活性測定法
終濃度１％（ｗ／ｖ）キシラン（Ｏａｔ−ｓｐｅｌｔ、フルカ製）、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９ｍＬに適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、４０℃で２０分間反応した後、ＤＮＳ溶液１ｍＬを加えて沸騰湯浴中で５分間熱処理した。熱処理後氷水中で冷却し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、２５℃、１５分間）した後、１ｍＬ分取し脱イオン水４ｍＬを加え攪拌した。Ｕ２０００スペクトロフォトメーター（日立製作所）を用いて、５３５ｎｍでの吸光度を測定した。酵素１ｕｎｉｔは、１分間に１μｍｏｌのキシロースを遊離する量とした。この方法をキシラナーゼ標準活性測定法とした。
【００８６】
（４）アビセラーゼ活性測定法
終濃度１％（ｗ／ｖ）ＡＺＣＬ−アビセル（メガザイム製）、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９ｍＬに適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、４０℃で４時間反応した後、３ｍＬのエタノールを加え撹拌した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、２５℃、１５分間）した後、上清液の６５０ｎｍでの吸光度をＵ２０００スペクトロフォトメーター（日立製作所）を用いて測定した。
【００８７】
（５）キチナーゼ活性測定法
１％（ｗ／ｖ）コロイダルキチン基質及び０．２Ｍグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）を用い、再終濃度が各々０．４％及び０．１Ｍになるように調製した基質溶液０．９ｍＬに、酵素液０．１ｍＬを添加して４０℃で２時間反応した。ＤＮＳ溶液１ｍＬを添加して反応を停止させた後、沸騰湯浴中で５分間煮沸した。氷水中で冷却後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間、２５℃）により得られた上清液の５３５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＶＥＲＳＡｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）で測定した。尚、基質溶液０．９ｍＬにＤＮＳ溶液１ｍＬを添加後、粗酵素液０．１ｍＬを加え、同様の操作を行ったものをブランクとした。酵素１ユニットは、１分間当たり、１μｍｏｌのＮ―アセチルグルコサミンを遊離する酵素量とした。
【００８８】
（６）マンナナ−ゼ活性測定法
１％（ｗ／ｖ）ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（メガザイム製）溶液０．２ｍＬ、０．５Ｍグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）０．２ｍＬ、脱イオン水０．５ｍＬ及び酵素液０．１ｍＬを混合し、４０℃で２０分間反応した後、エタノール３ｍＬを加え、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間、２５℃）し、残渣を沈殿させた。その上清液の６００ｎｍにおける吸光度を測定した。１ＭａｎＵ（マンナナーゼユニット）は、上記反応条件下において６００ｎｍにおける吸光度が０．４４を示す酵素量とした（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＡＭ００１株由来のマンナナーゼ１ユニットは上記反応条件下で吸光度０．４４を与える。これを基準とした）。
【００８９】
（７）β（１，３）−グルカナーゼ活性測定法
１％（ｗ／ｖ）ＡＺＣＬ−カードラン（β（１，３）−グルカン、メガザイム製）溶液０．２ｍＬ、０．５Ｍグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）０．２ｍＬ、脱イオン水０．５ｍＬ及び酵素液０．１ｍＬを混合し、４０℃で２０分間反応した後、エタノール３ｍＬを加え、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間、２５℃）し、残渣を沈殿させた。その上清液の６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９０】
実施例８ 各種セルラーゼとの組み合わせによる綿布の表面の毛羽除去効果
本発明のＮ５４６ｂキシラナーゼを以下に示すセルラーゼと組み合わせた場合における綿布の表面の毛羽除去効果を検討した。
（１）毛羽除去処理の方法
毛羽除去処理は、市販洗剤を用い繰り返し洗濯により毛羽立たせた濃青色の中古メリヤスシャツ生地を毛羽立ち表面が表に来るように縫い合わせた試験布片（６ｃｍ×６ｃｍ）を３枚用いてＴｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒで行った。４０℃に恒温した下記のセルラーゼ又はセルラーゼと本発明のキシラナーゼを含む処理液１Ｌを用い、少なくとも１２０ｒｐｍで２時間処理を行った。処理後、水道水でよくすすいで、数枚のタオルと一緒に乾燥機仕上げを行った。
＜セルラーゼ＞
１）レノザイム（Renozyme：ノボザイム社）
２）ケアザイム（Carezyme：ノボザイム社）
３）ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ（特開平10-313859）
４）ＫＳＭ−Ｎ２５２セルラーゼ（特願2001-043663）
５）ＫＳＭ−Ｎ１４５セルラーゼ（特開2005-287441）
【００９１】
（２）毛羽除去度の測定
毛羽除去度は分光測色計（ミノルタ社製 ＣＭ−３５００ｄ）を用い、ＳＣＥ（正反射光除去）方式で測定したＬａｂ表示系のＬ値（明度）で評価した。処理前サンプルのＬ値に対する処理後のＬ値の減少（明度の低下）＝ΔＬ値を求め、このΔＬ値により毛羽除去
の度合いを評価した。各試験において６点のΔＬ値を測定し（Ｎ＝６）、その平均値を算
出した。
【００９２】
（３）結果
ＫＳＭ−Ｎ１４５セルラーゼを１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で測定したＣＰ分解活性として０．０２Ｕ用いた時、同緩衝液で測定したＮ５４６ｂキシラナーゼを０．３Ｕ反応系に添加した場合には、ＫＳＭ−Ｎ１４５セルラーゼ単独使用に比べてより高い毛羽除去度を示した（図５）。
また、上記条件で測定したケアザイムセルラーゼを０．０１Ｕ反応系に用い、同条件で測定したＮ５４６ｂキシラナーゼをキシラナーゼ活性として０．１Ｕ、０．５Ｕ、１．０Ｕ添加した。その結果、添加量が高くなるにつれ、より高い毛羽除去度を示した（図６）。
実施例９
【００９３】
さらに、表４に示す組成の洗浄剤１００重量部にＮ５４６キシラナーゼを０．１重量部配合して本発明洗浄剤組成物（処方例１〜５）を調製した。なお、粒状洗浄剤の場合には、酵素、ＰＣ、ＡＣ−１、ＡＣ−２を除いた成分で粒子化した洗剤生地に、酵素、ＰＣ、ＡＣ−１、ＡＣ−２をそれぞれ粒子化したものをブレンドすることにより製造する。得られた洗浄剤は、優れた洗浄力を有し、衣料用洗浄剤として有用である。
【００９４】
【表４】
【００９５】
ＬＡＳ−２：日石洗剤（株）製アルキルベンゼンスルホン酸「アルケンＬ（アルキル鎖の炭素数１０〜１４）」を４８％ＮａＯＨで中和したもの
ＬＡＳ−３：日石洗剤（株）製アルキルベンゼンスルホン酸「アルケンＬ（アルキル鎖の炭素数１０〜１４）」を５０％ＫＯＨで中和したもの
ＡＳ−２：三菱化学（株）製ドバノール２５サルフェート（Ｃ12〜Ｃ15硫酸）のソーダ塩
ＳＡＳ：ヘキストジャパン（株）製Hostapur ＳＡＳ ９３、Ｃ13〜Ｃ18アルカンスルホン酸ソーダ
ＡＯＳ：アルファオレフィンスルホン酸ソーダ
ＳＦＥ：パーム油由来、アルファスルホ脂肪酸メチルエステルソーダ
脂肪酸塩：パルミチン酸ソーダ
ＡＥＳ−２：ポリオキシエチレンアルキル（Ｃ12〜Ｃ15）エーテル硫酸ソーダ（ＥＯ平均付加モル数２）
ＡＥ−３：ノニデッド Ｓ−３（Ｃ12、Ｃ13アルコールにＥＯを平均３モル付加したもの、三菱化学（株）製）
ＡＥ−４：ノニデッド Ｒ−７（Ｃ12〜Ｃ15アルコールにＥＯを平均７．２モル付加したもの、三菱化学（株）製）
ＡＥ−５：ソフタノール ７０（Ｃ12〜Ｃ15 ２級アルコールにＥＯを平均７モル付加したもの、日本触媒製）
ＡＧ：アルキル（ヤシ油由来）グルコシド（平均重合度１．５）
吸油性担体：ＴＩＸＯＬＥＸ ２５（非晶質アルミノ珪酸ソーダ、コフランケミカル社製、吸油能２３５ml／１００ｇ）
結晶性珪酸塩：ＳＫＳ−６、δ−Ｎａ2Ｓｉ2Ｏ5、結晶性層状シリケート，平均粒子径２０μｍ、ヘキストトクヤマ社製
非晶質珪酸塩：ＪＩＳ１号珪酸ソーダ
ＳＴＰＰ：トリポリリン酸ソーダ
ＮＴＡ：ニトリロトリ酢酸ソーダ
ＰＡＡ：ポリアクリル酸ソーダ、平均分子量１２０００
ＡＡ−ＭＡ：ソカランＣＰ５、アクリル酸−マレイン酸共重合体
ＣＭＣ：サンローズＢ１Ｂ、カルボキシメチルセルロースソーダ、山陽国策パルプ（株）製（現在、日本製紙（株））
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール、平均分子量６０００
ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン、平均分子量４００００、Ｋ値＝２６〜３５
蛍光染料：チノパールＣＢＳ（チバガイギー社製）と、ホワイテックスＳＡ（住友化学社製）を重量比１：１で配合したもの
（注意：液体洗剤の場合はチノパールＣＢＳのみ配合）
香料：特開平８−２３９７００号公報の実施例記載の香料組成を使用
酵素：サビナーゼ12.0TW（プロテアーゼ）、リポラーゼ100T（リパーゼ）、ターマミル60T（アミラーゼ）、ケアザイム（セルラーゼ）（以上の酵素はノボノルディスク社製）、及びＫＡＣ５００（セルラーゼ、花王製）を重量比率で２：１：１：１の割合で配合したもの（注意：液体洗剤はサビナーゼ16.0Ｌ（プロテアーゼ、ノボノルディスク社製）のみを配合）
ＰＣ：過炭酸ソーダ、平均粒子径４００μｍ、メタホウ酸ソーダにて被覆したもの
ＡＣ−１：ＴＡＥＤ、テトラアセチルエレンジアミン、ヘキスト社製
ＡＣ−２：ラウロイルオキシベンゼンスルホン酸ソーダ
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明のアルカリキシラナーゼの最適ｐＨを示すグラフである。Ａ：キシラナーゼ活性、Ｂ：ＣＰ（セルロースパウダー）分解活性。×：グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、＊：クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、＋：酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、●：リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、○：トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、▲：グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、△：ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８、□：リン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２。
【図２】本発明のアルカリキシラナーゼのｐＨ安定性を示すグラフである。Ａ：キシラナーゼ活性、Ｂ：ＣＰ分解活性。×：グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、＊：クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、＋：酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、●：リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、○：トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、▲：グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、△：ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８、□：リン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２。
【図３】本発明のアルカリキシラナーゼの最適反応温度を示すグラフである。Ａ：キシラナーゼ活性、Ｂ：ＣＰ分解活性。
【図４】本発明のアルカリキシラナーゼの温度安定性を示すグラフである。Ａ：キシラナーゼ活性、Ｂ：ＣＰ分解活性。●：２ｍＭ塩化カルシウム無添加、○２ｍＭ塩化カルシウム添加
【図５】本発明のアルカリキシラナーゼとセルラーゼ（ＫＳＭ−Ｎ１４５）との組み合わせによる綿布の表面の毛羽除去効果を示すグラフである。５４６ｂ：Ｎ５４６ｂキシラナーゼ、Ｎ１４５：ＫＳＭ−Ｎ１４５セルラーゼ
【図６】本発明のアルカリキシラナーゼとセルラーゼ（ケアザイム）との組み合わせによる綿布の表面の毛羽除去効果を示すグラフである。ｃａｒｅ：ケアザイム（ノボザイム社）、５４６ｂ：Ｎ５４６ｂキシラナーゼ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗浄剤用酵素として有用なキシラナーゼ及び該キシラナーゼをコードする遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤には、その洗浄力を向上させるためにプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼといった各種加水分解酵素が配合されている。セルラーゼはセルロースのβ−１，４グリコシド結合を加水分解する酵素の総称であるが、繊維の基本となる結晶領域のセルロース分子には殆ど作用せず、非結晶領域の水和セルロースがつくるゲル構造を軟化しそこに閉じこめられている汚れを流出させることから、衣料用洗剤酵素として有用である。近年、掘越（特許文献１、非特許文献１）によって好アルカリ性バチルス属細菌由来のアルカリセルラーゼが見出され、衣料用重質洗剤へ配合可能なアルカリセルラーゼが種々開発されている（特許文献２〜５）。
【０００３】
ところで、衣料に付着した汚れや染みの中で、洗濯により除去することが困難なものの一つに野菜や果物に由来する染みがある。衣料に付着した野菜や果物に由来する染みは、色素が野菜や果物の細胞壁中の構成成分に共有結合や物理的結合により結合している。色素の結合した野菜や果物の細胞壁の構成成分が衣類の木綿繊維に付着することが、洗濯により除去しづらい原因なっている。細胞壁の構成成分は結晶性のセルロースとキシログリカン（キシラン）等のヘミセルロース等であることから、これらの染み汚れを除去することを目的としてセルラーゼとキシラナーゼ等のヘミセルラーゼを複数配合した洗浄剤が報告されている（特許文献６）。
木綿繊維にダメージを与えない程度でセルロースの結晶領域に作用し、キシランも分解する酵素があれば野菜や果物由来の染みを効果的に除去でき、コストや生産性の面からも衣料用洗浄等に配合しやすいと考えられるが、現在洗剤に配合されているセルラーゼには、キシログリカン分解活性（キシラナーゼ活性）を有し、またセルロースの結晶部分に作用するものは知られていない。
【０００４】
また、セルロース系の合成繊維（綿レーヨン）、亞麻、大麻、ジュート、ラミー等を使用した布帛から製造された衣類は、繰り返し洗浄を行うことにより、繊維が機械的に破壊され砕かれる結果、毛羽立ちが発生し、それに伴い着色布帛においては色あせを起こすことになる。従って、毛羽立ちや色あせを起こしにくい洗浄剤が求められている。
【０００５】
一方、近年、遺伝子工学の発展に伴い洗剤用酵素の生産も遺伝子組換えにより大量生産されるようになっている。アルカリセルラーゼについても例外ではなく既に数多くの遺伝子についてクローニング、塩基配列の決定がなされ、実生産に用いられている例もある。
【特許文献１】特公昭５０−２８５１５号公報
【特許文献２】特公昭６０−２３１５８号公報
【特許文献３】特公平６−０３０５７８号公報
【特許文献４】米国特許第４９４５０５３号明細書
【特許文献５】特開平１０−３１３８５９号公報
【特許文献６】特表平１１−５００４６４号公報
【非特許文献１】Horikoshi & Akiba,Alkalophilic Microorganisms,Springer,Berlin,(1982)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、アルカリ領域で作用し、キシログリカン分解活性を有し、且つ結晶性セルロース分解活性を有する洗剤用酵素として有用な酵素及びその遺伝子を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、自然界からアルカリキシラナーゼ生産菌のスクリーニングを行ったところ、上記目的に適う酵素を生産する微生物を見出し、さらに当該微生物からアルカリキシラナーゼの遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の酵素学的性質を有するアルカリキシラナーゼに係るものである。
１．作用：
キシランのβ１，４−グリコシド結合を加水分解する。
２．基質特異性：
キシラン及び結晶性セルロースを分解し、特にキシランをよく分解する。
３．最適反応ｐＨ：
キシランを基質として４０℃で反応させた場合、最適反応ｐＨは約８．５である。
４．ｐＨ安定性：
キシランを基質として５℃で２０時間処理した場合、ｐＨ４．０〜１０．５で未処理の８０％以上の残存活性を示す。
５．最適反応温度：
キシランを基質としてｐＨ９．０で２０分間反応させた場合、最適反応温度は約５０℃である。
６．熱安定性：
キシランを基質としてｐＨ７．０で２０分間処理した場合、５０℃までは未処理の９０％以上の残存活性を示す。
７．分子量：
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約４０ｋＤａである。
【０００９】
また、本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）いずれかに記載のタンパク質及びこれをコードする遺伝子に係るものである。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質
【００１０】
また、本発明は、以下の（ａ）から（ｄ）いずれかに記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子に係るものである。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００１１】
また、本発明は、上記遺伝子を含有する組み換えベクター、該組み換えベクターを含む形質転換体に係るものである。
【００１２】
また、本発明は、上記の形質転換体を培養し、キシラナーゼを採取するキシラナーゼの生産方法に係るものである。
【００１３】
また、本発明は、上記アルカリキシラナーゼ又はキシラナーゼ活性を有するタンパク質を配合してなる洗浄剤組成物に係るものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の新規なキシラナーゼは、キシラナーゼ活性と結晶性セルロース加水分解活性を有している新規な酵素であり、衣料用洗剤等の洗浄剤用酵素として有用である。また、本発明のアルカリキシラナーゼ遺伝子を用いれば、当該酵素を単一且つ大量に生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のアルカリキシラナーゼは新規な酵素であり、以下の酵素学的性質を有するものである。
（１）作用
キシランに作用しこれを加水分解する。
【００１６】
（２）基質特異性
キシラン及び結晶性セルロース（ＣＰ）を加水分解する。
すなわち、ｐＨ９．０のグリシン水酸化ナトリウム緩衝液中で、４０℃で各基質を作用させた場合、キシラン及びＣＰを加水分解し、特にキシランを良く分解する。
また、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ＡＺＣＬ−アビセル、ＡＺＣＬ−カードラン、ＡＺＣＬ−マンナン及びコロイダルキチンは加水分解しない。
【００１７】
（３）最適反応ｐＨとｐＨ依存性
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、キシランを基質とした場合の最適反応ｐＨは、ｐＨ約８．５付近で、ｐＨ８．０〜９．０で最大活性の９０％以上を示し、ｐＨ７〜１０で最大活性の６０％以上を示す（図１Ａ）。すなわち、キシランを基質として４０℃で反応させた場合、最適反応ｐＨは約８．５である。
また、ＣＰを基質とした場合は、最適反応ｐＨは約ｐＨ５．５で、ｐＨ４．５〜９．０で最大活性の９０％以上を示し、ｐＨ４〜９．５で最大活性の６０％以上を示す（図１Ｂ）。このように、本発明のアルカリキシラナーゼは基質が異なることで、その最適反応ｐＨも異なるという極めて珍しい性質を示す。
【００１８】
〔測定条件〕
基質として、１％（ｗ／ｖ）キシラン及び１％（ｗ／ｖ）ＣＰを用いて、各０．１Ｍの緩衝液（グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８及びリン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２）中、４０℃、２０分間、反応させ、キシラナーゼ活性及びＣＰ分解活性を測定する（最大活性時を示したｐＨの値を１００％とした相対活性で示す）。尚、キシラナーゼ活性測定にはキシラン分解活性で０．１ユニット／ｍＬ、ＣＰ分解活性測定にはＣＰ分解活性で０．２５ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。
【００１９】
（４）ｐＨ安定性
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、キシラナーゼ活性及びＣＰ分解活性共に、ｐＨ４〜ｐＨ１０．５の範囲では残存活性は８０％以上であり、広いｐＨ範囲で安定である（図２）。すわなち、キシランを基質として５℃で２０時間処理した場合、ｐＨ４．０〜１０．５で未処理の８０％以上の残存活性を示す。
【００２０】
〔測定条件〕
各０．１Ｍの緩衝液（グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５酢酸緩衝液ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８及びリン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２）中、５℃で２０時間処理後、参考例に記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法にて活性を測定する（ｐＨ緩衝液未処理での活性を１００％とした残存活性で示す）。尚、キシラナーゼ活性測定ではキシラナーゼ活性で０．１ユニット／ｍＬ及びＣＰ分解活性測定にはＣＰ分解活性で０．２５ユニット／ｍＬの酵素液を用いた。
【００２１】
（５）最適反応温度
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、キシラナーゼ活性の最適反応温度は約５０℃であり、４０℃〜５５℃で最大活性の６０％以上を示す。（図３Ａ）。すなわち、キシランを基質としてｐＨ９．０で２０分間反応させた場合、最適反応温度は約５０℃である。
また、ＣＰ分解活性の最適反応温度は約５５℃であり、４０℃〜６０℃で最大活性の６０％以上を示す（図３Ｂ）。
【００２２】
〔測定条件〕
参考例記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法に準じ、反応温度を２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃、７０℃及び８０℃で反応させる（最高活性を示した温度での値を１００％とした相対活性で示す）。尚、キシラナーゼ活性測定にはキシラン分解活性で０．０５ユニット／ｍＬ、ＣＰ分解活性測定にはＣＰ分解活性で０．１２５ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。
【００２３】
（６）温度安定性
以下に示す条件で酵素活性を測定した場合、キシラナーゼ活性及びＣＰ分解活性共に、５０℃、２０分間の熱処理では、９０％以上の残存活性を有しており、５０℃までは安定である。また、２ｍＭ塩化カルシウムにより、酵素の熱に対する安定生が若干向上する（図４）。すなわち、キシランを基質としてｐＨ７．０で２０分間処理した場合、５０℃までは未処理の９０％以上の残存活性を示す。
【００２４】
〔測定条件〕
キシラナーゼ活性測定にはキシラン分解活性で０．１ユニット／ｍＬ、及びＣＰ分解活性測定にはＣＰ分解活性で０．２５ユニット／ｍＬの酵素液を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃及び９０℃の各温度下で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、２０分間熱処理した後、参考例に記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法にて残存活性を測定する（熱に対して未処理の活性を１００％とした残存活性で示す）。２ｍＭ塩化カルシウム添加及び無添加系で行った。
【００２５】
（７）分子量
分子量マーカーとして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダードＬＯＷ（バイオラッド）を用い、ゲル濃度１２．５％のゲルを用いて、３０ｍＡで約４０分間電気泳動を行い、分子量を求めると約４０ｋＤａである。尚、ＳＤＳ−電気泳動法では±５０００Ｄａ程度の振れを生じることから、当該分子量には約５０００Ｄａの変動が許容される。
【００２６】
本発明の（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、キシログリカンに作用し、そのβ１，４−グリコシド結合を分解する活性と結晶性セルロースに作用し、そのβ１，４−グリコシド結合を分解する活性を有する新規なキシラナーゼである。
本発明のタンパク質には、斯かる（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質の他当該タンパク質と等価なタンパク質が包含される。
【００２７】
ここで、等価なタンパク質としては、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００２８】
ここで、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、１乃至１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましい。また、上記の付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００２９】
本発明の配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質（アルカリキシラナーゼ；以下、Ｎ５４６ｂキシラナーゼとも表記する）と公知の酵素とのアミノ酸配列における同一性を比較すると、Bacillus sp.strain ＹＡ３５５株の生産するキシラナーゼ（Ju-Hyun,YらJ.Microbiol.Biotechnol.,3,139-145,1993）との同一性が最も高く、７６％であり、Bacillus sp.41M-1株由来のキシラナーゼ（NakaiらNucleic Acids Symp.Ser.,31,235-236,1994））と76%、Dictyoglomus thermophilum株由来のキシラナーゼとは、５１％であった。基質特異性及び相同検索の結果から本発明酵素はキシラナーゼに分類されると考えられた。
しかし、本発明のアルカリキシラナーゼは他酵素のアミノ酸配列との同一性でもっとも高いものが７６％であること、また、後記実施例に示すようにキシラン分解活性の最適ｐＨがアルカリ性領域にあり、ＣＰを基質にした結晶性セルロース分解活性の最適ｐＨが酸性領域にあるという、基質の種類により最適ｐＨが異なる従来知られていない性質を有することから、本発明のアルカリキシラナーゼは新規な酵素であると判断できる。
【００３０】
すなわち、本発明で提供するアルカリキシラナーゼと等価なタンパク質には、配列番号２に示すアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質からなり、且つ、キシラナーゼ活性を有するタンパク質が包含される。
【００３１】
上記のアミノ酸配列の同一性は京都大学化学研究所バイオインフォマティクスセンターのゲノムネット中の相同検索ツールに存在するＢＬＡＳＴ２を用いたアミノ酸配列ホモロジー検索法で、プラグラムはＢＬＡＳＴＰを使用し、オプションパラメータは初期設定値（Scoring matrixはBLOSUM62、Filter なし、Alignment viewはpairwise）によって行った。
【００３２】
ここで、キシラナーゼ活性を有するとは、キシログリカン中のβ１，４−グリコシド結合を加水分解する活性を意味するが、その活性の程度は、その機能を発揮する限り配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同程度のもののみならず、これより高いもの、或いは低いものであってもよい。
【００３３】
また、上記アルカリキシラナーゼと等価なタンパク質は、結晶性セルロースの加水分解活性も有している。結晶性セルロースの分解活性とは結晶性セルロースのβ１，４−グリコシド結合を加水分解する活性を意味するが、その活性の程度は、その機能を発揮する限り配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同程度のもののみならず、これより高いもの、或いは低いものであってもよい。
【００３４】
また、上記アルカリキシラナーゼと等価なタンパク質は、さらに付加的な性質を有していてもよい。斯かる性質としては、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に比べて安定性に優れているという性質、低温及び／又は高温においてのみ異なる機能を有する性質、最適ｐＨが異なるという性質等が挙げられる。
【００３５】
また、本発明のアルカリキシラナーゼは、融合タンパク質のような、より大きいタンパク質の一部であってもよい。ここで、融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
【００３６】
本発明のアルカリキシラナーゼは、キシランを基質としたときは、最適ｐＨが約８．５であり、セルロースパウダー（ＣＰ）を基質にしたときは約５．５と基質により異なっていた。よって、洗浄剤として使用する際の環境のｐＨを調整することで、キシラナーゼ活性と結晶性セルロースの分解活性のバランスを調整することが可能になる。
【００３７】
本発明の遺伝子は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするものであり、好適には、（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子、及びこれと等価な遺伝子が挙げられる。ここで、等価な遺伝子には、（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つアルカリキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つアルカリキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【００３８】
ここで、ストリンジエントな条件とは、例えばMolecular cloning -a laboratory manual,2nd edition(Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。すなわち、６ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件等が挙げられる。
【００３９】
また、上記（ａ）で示される遺伝子と等価な遺伝子には、（ａ）で示される遺伝子に比べて、ｍＲＮＡの発現量が多い及び／又は安定性が高い、翻訳されるタンパク質の安定性が優れている等の性質を有していても良い。
【００４０】
尚、上記の塩基配列の同一性の検索も京都大学化学研究所バイオインフォマティクスセンターのゲノムネット中の相同検索ツールに存在するＢＬＡＳＴ２を用いたホモロジー検索法によって行った。プラグラムはＢＬＡＳＴＮを使用し、オプションパラメータは初期設定値（Scoring matrixはBLOSUM62、Filter なし、Alignment viewはpairwise）にて行った。
【００４１】
本発明のアルカリキシラナーゼ遺伝子は、バチルス エスピー（Bacillus Sp.)ＫＳＭ−Ｎ５４６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９７２９）等からクローン化することができ、クローニング方法としては、既知の手段、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いて行う方法が挙げられる。
【００４２】
また、本発明で提供する遺伝子は、例えば、計画的なもしくはランダムな変異導入法等の方法により、配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる遺伝子を改変することにより作製することもできる。
【００４３】
ここで、計画的に変異を導入する際の変異の計画は、例えば、遺伝子配列上の特徴的な配列を参酌することにより行うことができる。ここで特徴的な配列の参酌は、例えば、そのタンパク質の立体構造予測、既知のタンパク質との相同性を考慮することにより行うことができる。ランダムに変異を導入する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、変異原処理による方法が挙げられる。計画的に変異を導入する方法としては、部位特異的突然変異誘発法が挙げられ、より具体的には、例えばSite-Directed Mutagenesis System Mutan-SuperExpress Kmキット（タカラバイオ）等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ(polymerase chain reaction)法(PCR protocols,Academic press,New York,1990)を用いることもできる。
【００４４】
また、本発明の遺伝子は、本発明の遺伝子の一部又は全部を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする配列を適当な原理を用いて取得することにより得ることもできる。この適当な原理には、例えば、上記の本発明の遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドをプライマーとして用いて行うＰＣＲ法、上記の本発明の遺伝子の一部を含むポリヌクレオチドをプローブとして用いる方法が含まれる。
【００４５】
本発明のアルカリキシラナーゼは、例えば、その生産微生物を天然又は合成培地に接種して、通常の培養条件で培養し、その培養物から採取することにより取得できる。また、上記の酵素遺伝子を人為的に発現させて、採取することも可能である。当該遺伝子を用いれば、本発明で提供するタンパク質を大量に生産することができ有用である。
ここで、アルカリキシラナーゼ生産微生物としては、例えばバチルス エスピー(Bacillus sp.)ＫＳＭ−Ｎ５４６（ＦＥＲＭ Ｐ−１９７２９）が挙げられる。
【００４６】
本発明の遺伝子を用いてアルカリキシラナーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリキシラナーゼ遺伝子を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリキシラナーゼを採取すればよい。培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００４７】
また、本発明のアルカリキシラナーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターにアルカリキシラナーゼ遺伝子を組込めばよい。また、枯草菌を宿主にする場合、アルカリキシラナーゼ遺伝子の上流に当該アルカリキシラナーゼを高発現させることができるように特開２０００−２８７６８７号公報に記載のバチルス エスピー ＫＳＭ−６４（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のＤＮＡ断片が結合されていてもよい。斯かるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci.Biotechnol,Biocem.,59,2172-2175,1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００４８】
斯くして得られた組換えベクターを用いて宿主を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主としては特に制限されず、あらゆるものを用いることができ、例えば、動物、動物由来の細胞、植物、植物由来の細胞、微生物等を用いることができるが、微生物が好ましく、微生物としては、Bacillus属（枯草菌）等のグラム陽性菌、Escherichia coli（大腸菌）等のグラム陰性菌、Streptomyces属（放線菌）、Saccharomyces属（酵母）、Aspergillus属（カビ）等の真菌等が好ましく、枯草菌がより好ましく、枯草菌１６８株や枯草菌ＩＳＷ１２１４株が特に好ましい。動物由来の細胞、植物由来の細胞としては、培養細胞として確立しているものが好ましい。また、宿主としてはアルカリプロテアーゼが欠損している株が好ましい。
【００４９】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。斯くして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の採取、精製を行い、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化により必要な酵素形態を得ることができる。
【００５０】
斯くして得られた培養物中からのアルカリキシラナーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。すなわち、培養物から遠心分離または濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液または乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００５１】
本発明のアルカリキシラナーゼは、後記実施例に示すように、キシラナーゼ活性と結晶性セルロース加水分解活性を有する。従って、各種洗剤組成物の配合用酵素として有用である。
【００５２】
本発明の洗浄剤組成物は、本発明のアルカリキシラナーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。斯かる酵素としては、例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等が挙げられ、このうち、プロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼがより好ましく、特に、結晶性セルロース分解能を有するセルラーゼを併用するのが特に好ましい。
【００５３】
後記実施例に示すように、本発明のアルカリキシラナーゼと結晶性セルロース分解能を有するセルラーゼを組み合わせることで、木綿繊維からなる衣料の毛羽を効率よく除去することができる。従って、これによれば、着色布帛において毛羽の発生によって生じる色あせを防止することも可能である。斯かる結晶性セルロース分解能を有するセルラーゼとしては、例えば、ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ（特開平１０−３１３８５９公報）、ＫＳＭ−Ｎ２５２セルラーゼ（特開２００１−３４００７４公報）、ＫＳＭ−Ｎ１４５セルラーゼ（特開２００５−２８７４４１公報）、ケアザイム（登録商標、ノボザイムズ社）などが挙げられる。
【００５４】
本発明の洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができる。斯かる成分としては、例えば界面活性剤、二価金属イオン捕捉剤、アルカリ剤、再汚染防止剤、漂白剤、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩等）、抑泡剤（シリコーン等）、香料、その他の添加剤が挙げられる。
【００５５】
界面活性剤は、洗浄剤組成物中０．５〜６０質量％配合するのが好ましく、特に粉末状洗浄剤組成物とする場合には１０〜４５質量％、液体洗浄剤組成物とする場合には２０〜５０質量％配合するのが好ましい。
界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種または組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
【００５６】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４の、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００５７】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００５８】
二価金属イオン捕捉剤は、０．０１〜５０質量％、好ましくは５〜４０質量％配合するのが好ましい。当該二価金属イオン捕捉剤としては、例えば、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩等の縮合リン酸塩、ゼオライト等のアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩等が挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのものが好適に使用される。
【００５９】
アルカリ剤は、０．０１〜８０質量％、好ましくは１〜４０質量％配合するのが好ましい。粉末状洗浄剤組成物とする場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウム等のアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号等の非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリ剤としてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられ、またトリポリリン酸塩等のリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗浄剤組成物とする場合に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる
【００６０】
再汚染防止剤は、０．００１〜１０質量％、好ましくは１〜５質量％配合するのが好ましい。再汚染防止剤としては、例えばポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸等のホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩等のポリマー、カルボキシメチルセルロース等のセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸等のアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
【００６１】
漂白剤、例えば過酸化水素、過炭酸塩等は、１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載等の漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。
【００６２】
蛍光剤としては、ビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘ等）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料等）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。
【００６３】
本発明の洗浄剤組成物は、本発明のアルカリキシラナーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形等にすることができる。
【００６４】
斯くして得られる洗浄剤組成物は、衣料用粉末洗浄剤、衣料用液体洗浄剤、自動食器洗浄機用洗剤、木綿繊維改質用洗浄剤等として使用することができる。
【実施例】
【００６５】
実施例１ アルカリキシラナーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したものを８０℃、３０分間熱処理し、以下の表１に示す組成を有する寒天平板培地に塗布した。３０℃の培養器で３日間静置培養し、菌の生育後、キシランの分解に伴う溶解斑が検出されたものについて選抜し、シングルコロニー化を繰り返した。これによりBacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ５４６株を取得した。
【００６６】
【表１】
【００６７】
実施例２ Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ５４６株由来アルカリキシラナーゼ（Ｎ５４６ｂキシラナーゼ）の生産並びに精製
Bacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ５４６株を表２に示す組成から成る液体培地を用いて３０℃、３日間振盪培養を行った。
【００６８】
【表２】
【００６９】
得られた培養上清液を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で約１０倍に希釈し、同緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒＱ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ（東ソー）に添着後、同緩衝液約４８０ｍＬでカラム内を洗浄し、アルカリキシラナーゼを含む非吸着画分を得た。次いで非吸着画分をＰＭ１０濃縮膜（アミコン製）を用いて、１０ｍＭホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）を加えながら２０倍濃縮した。次に予め１０ｍＭホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍカラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）に添着しアルカリキシラナーゼを吸着させた。同緩衝液２００ｍＬでカラム内を洗浄した後、０〜０．１ＭのＫＣｌ２００ｍＬで吸着タンパク質を溶出した。アルカリキシラナーゼ活性画分を集め、ＰＭ１０濃縮膜により脱塩濃縮した。さらに、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍカラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）に添着した。アルカリキシラナーゼは非吸着画分に溶出され、ＰＭ１０濃縮膜により脱塩濃縮した。最後に、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｙｄｒｏｘｙ ａｐａｔｉｔｅカラム（１ｃｍ×１０ｃｍ）に添着した。アルカリキシラナーゼは非吸着画分に溶出され、これをＰＭ１０濃縮膜により脱塩濃縮し、電気泳動的に均一にまで精製された酵素精製標品を得た。得られた精製標品を用いてＮ末端アミノ酸配列分析に供した。
【００７０】
実施例３ Ｎ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子断片の取得
（１）ゲノムＤＮＡの制限酵素処理
Ｎ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子の取得は、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラ製）を用いて行った。
実施例２で得られたBacillus sp.ＫＳＭ−Ｎ５４６株の菌体から斉藤・三浦の方法（Biochim.Biophys.Acta,72,619-629,1963）によりゲノムＤＮＡを調製した。まず、ＫＳＭ−Ｎ５４６株のゲノムＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ処理を行った。Ｎ５４６株ゲノムＤＮＡ２μＬ（１μｇ）、１０×緩衝液１０μＬ、脱イオン水２４μＬ、及びＨｉｎｄＩＩＩを２μＬ（２０ｕｎｉｔｓ）混合し、３７℃で３時間処理し、反応終了後、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア製）で精製（２５μＬ）した。
【００７１】
（２）ライゲーション反応
精製ＤＮＡ溶液２０μＬに、ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｇ ＫｉｔのＨｉｎｄＩＩＩカセット５μＬ（１００ｎｇＤＮＡ）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ２５μＬを加え、１６℃で一晩放置した後、ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔによりＤＮＡを精製回収した。
【００７２】
（３）ＰＣＲによるＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子断片の増幅
ライゲーション精製溶液２６．５μＬにＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｇ Ｋｉｔ中の１０×緩衝液５μＬ、ＬＡ Ｔａｑ０．５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ８μＬ、ＭｇＣｌ2 ５μＬ、キット中のプライマーＣ１を１μＬ（１０ｐｍｏｌ）及びＮ５４６ｂキシラナーゼ精製酵素のＮ末配列より推定した複合プライマーＩ（配列番号３）を４μＬ混合した。ＰＣＲ条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃３０秒間、５５℃２分間、７２℃２分間（３０サイクル）で行った。得られたＰＣＲ溶液の１μＬを鋳型として用いて２回目のＰＣＲを行った。鋳型ＤＮＡ溶液１μＬにＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｇ Ｋｉｔ中の１０×緩衝液５μＬ、ＬＡ Ｔａｑ０．５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ８μＬ、ＭｇＣｌ2 ５μＬ、カセットプライマーＣ２を１μＬ（１０ｐｍｏｌ）、脱イオン水２６．５μＬ及びＮ５４６ｂキシラナーゼ精製酵素のＮ末配列より推定した複合プライマーＩＩ（配列番号４）を４μＬ（１０ｐｍｏｌ）混合した。ＰＣＲ反応条件は、９４℃１分間の熱変性後、９４℃３０秒間、５５℃２分間、７２℃１分間（３０サイクル）で行った。斯くして得られたＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子の部分増幅断片（約１．２ｋｂ）を用いてカセットプライマーＣ２をプライマーとして部分塩基配列を解析した。
【００７３】
実施例４ インバースＰＣＲによるＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子の全塩基配列決定
５４６ｂキシラナーゼ遺伝子の部分増幅断片（約１．２ｋｂ）から得られた塩基配列を基にインバースＰＣＲ用プライマーＩＩＩ〜ＶＩ（配列番号５〜８）を構築し、インバースＰＣＲを行った。ＫＳＭ−Ｎ５４６ｂ株ゲノムＤＮＡ溶液５μＬ（１μｇ）、１０×緩衝液１０μＬ、脱イオン水８２μＬ及びＳａｃＩ３μＬ（３０ｕｎｉｔｓ）を混合後、３７℃で３時間制限酵素処理した。得られたゲノム分解産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後（２０μＬ）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを使用して自己閉環した（１６℃、１８時間）。得られたライゲーション混液１μＬを鋳型ＤＮＡとして１回目のＰＣＲを行った。インバースＰＣＲ用プライマーＩＩＩ（配列番号５）及びプライマーＩＶ（配列番号６）を用いた。鋳型ＤＮＡ溶液１μＬ、各プライマー５μＬ（１μＭ）、１０×緩衝液５μＬ、ＬＡ Ｔａｑ０．５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ８μＬ、ＭｇＣｌ2 ５μＬ、及び脱イオン水２１．５μＬを混合した後、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００（アマシャム ファルマシア製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃１分間（２８サイクル）及び７２℃１分間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにより精製した。これにより約５．５ｋｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得た。
ついで、精製した増幅ＤＮＡ断片を鋳型にインバースＰＣＲ用プライマーＶ及びＶＩを用いて２回目のインバースＰＣＲを行った。即ち、鋳型ＤＮＡ溶液０．５μＬ、各プライマー５μＬ（１μＭ）、１０×緩衝液５μＬ、ＬＡ Ｔａｑ０．５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ８μＬ、ＭｇＣｌ2 ５μＬ、及び脱イオン水１９μＬを混合した後、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９７００でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃３０秒間、５７℃１分間、７２℃２分３０秒間（２８サイクル）及び７２℃２分３０秒間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔにより精製した後、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル電気泳動に供し増幅されたＤＮＡ断片約５．５ｋｂをゲルから回収、精製し、プライマーＶ（配列番号７）及びプライマーＶＩ（配列番号８）を用いてＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子の全塩基配列（約１．８ｋｂｐ）を決定した。
【００７４】
実施例５ Ｎ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子のサブクローニング
解読したＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子のプロモーター上流及びターミネーター下流の塩基配列を元にプライマーを構築し（それぞれプライマーＶＩＩ、プライマーＶＩＩＩ、配列番号９、配列番号１０）、Ｎ５４６株ゲノムを鋳型としてゲノムＰＣＲを行った。Ｎ５４６株ゲノム０．５μＬ（１μｇ）、プライマーＶＩＩ（ＢｇｌＩＩ制限酵素認識部位付加、配列番号９）５μＬ、プライマーＶＩＩＩ（ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位付加、配列番号１０）５μＬ、１０×緩衝液５μＬ、ＬＡ Ｔａｑ０．５μＬ、ｄＮＴＰ ｍｉｘ８μＬ、ＭｇＣｌ２５μＬ、及び脱イオン水２１μＬを混合した後、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃１分間の熱変性後、９８℃１０秒間、６８℃４分３０秒間（２８サイクル）で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後（８７μＬ）、１０μＬの１０×緩衝液及びＨｉｎｄＩＩＩ３μＬ（３０ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で２０時間酵素処理した。ＨｉｎｄＩＩＩ処理液をＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、同様にＢｇｌＩＩ処理を行った。制限酵素処理液を精製後、予めＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩで処理したシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫにＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いて連結した（１６℃、２０時間）。
得られたライゲーション混液３μＬを用いて、コンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（タカラ製）１００μＬを形質転換した。テトラサイクリン耐性株として得られた形質転換体の中から、コロニーＰＣＲにより目的のＮ５４６ｂキシラナーゼ遺伝子が挿入されたｐＨＹ３００ＰＬＫ（ｐＨＹ５４６ｂ）を保持する菌株を選別した。選別した形質転換体からプラスミドをＭｉｃｒｏ Ｐｒｅｐ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャム ファルマシア製）を用いて回収、精製した。次ぎに、ｐＨＹ５４６ｂを用いて宿主菌Bacillus subtilis ＩＳＷ１２１４株（ヤクルト製）をプロトプラスト法により形質転換体を取得した。形質転換体の再生培地には、テトラサイクリン塩酸塩（シグマ製）３０μｇ／ｍＬを含むＤＭ３再生寒天培地（表３）を用いた。
【００７５】
【表３】
【００７６】
実施例６ 組み換えＮ５４６ｂキシラナーゼの生産
ＤＭ３再生寒天培地上に生育した形質転換体をＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム）を用いて培養後（３０℃、７２時間、１２５ｒｐｍ）、遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）により培養上清（組換えＮ５４６ｂキシラナーゼ粗酵素液）を得た。キシラナーゼ活性は４１ユニット及びＣＰ分解活性は０．４３ユニットあった。
【００７７】
実施例７ Ｎ５４６ｂキシラナーゼの諸性質
（１）基質特異性
参考例に示した方法に従って、本酵素のＣＭＣ、ＣＰ、キシラン、ＡＺＣＬ−アビセル、ＡＺＣＬ−カードラン、ＡＺＣＬ−マンナン及びコロイダルキチンに対する加水分解能を調べた結果、キシランに対する分解活性を１００とした時、ＣＰに対する分解活性は０．３６であった。また、ＣＭＣ、ＡＺＣＬ−アビセル、ＡＺＣＬ−カードラン、ＡＺＣＬ−マンナン及びコロイダルキチンに対する加水分解能は有していなかった。
【００７８】
（２）最適反応ｐＨ
基質には１％（ｗ／ｖ）キシラン及び１％（ｗ／ｖ）ＣＰを用いて、各０．１Ｍの緩衝液（グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８及びリン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２）中、４０℃、２０分間の反応条件下で測定した。キシラナーゼ活性測定にはキシラン分解活性で０．１ユニット／ｍＬ、ＣＰ分解活性測定にはＣＰ分解活性で０．２５ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。最大活性時を示したｐＨの値を１００％とした相対活性で示した。キシランを基質とした場合の最適反応ｐＨはｐＨ約８．５付近でｐＨ８．０〜９．０で最大活性の９０％以上を示し、ｐＨ７〜１０で最大活性の６０％以上を示した。また、ＣＰを基質とした場合は最適反応ｐＨは約ｐＨ５．５でｐＨ４．５〜９．０で最大活性の９０％以上を示し、ｐＨ４〜９．５で最大活性の６０％以上を示した。基質が異なることで、その最適反応ｐＨも異るという極めて珍しい性質を示した（図１）。
【００７９】
（３）ｐＨ安定性
各０．１Ｍの緩衝液（グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５酢酸緩衝液ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８及びリン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２）中、５℃で２０時間処理後、参考例記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法にて活性を測定した。ｐＨ緩衝液未処理での活性を１００％とした残存活性で示した。本実験には０．１ユニット／ｍＬ（キシラナーゼ）及び０．２５ユニット／ｍＬ（ＣＰアーゼ）の酵素液を用いた。その結果、キシラナーゼ活性及びＣＰ分解活性共に、ｐＨ４〜ｐＨ１０．５の範囲では残存活性は８０％以上であり、広いｐＨ範囲で安定であることが判った（図２）。
【００８０】
（４）最適反応温度
参考例記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法に準じ、反応温度を２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃、７０℃及び８０℃で反応させた。最高活性を示した温度での値を１００％とした相対活性で示した。キシラナーゼ活性測定にはキシラン分解活性で０．０５ユニット／ｍＬ、ＣＰアーゼ活性測定にはＣＰアーゼ分解活性で０．１２５ユニット／ｍＬの酵素溶液を０．１ｍＬ使用した。その結果、キシラン及びＣＰに対する本酵素の最適反応温度を調べた。キシラナーゼ活性の最適反応温度は約５０℃、ＣＰ分解活性の最適反応温度は約５５℃であり、共に５０℃付近に最適反応温度を有していた（図３）。
【００８１】
（５）温度安定性
０．１ユニット／ｍＬ（キシラナーゼ）及び０．２５ユニット／ｍＬ（ＣＰアーゼ）の酵素液を３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃及び９０℃の各温度下で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、２０分間熱処理した後、残存活性を参考例に記載のキシラナーゼ標準活性測定法及びＣＰアーゼ標準活性測定法にて測定した。熱に対して未処理の活性を１００％とした残存活性で示した。２ｍＭ塩化カルシウム添加及び無添加系で行った。その結果、キシラナーゼ及びＣＰアーゼ共に、５０℃、２０分間の熱処理では、９０％以上の残存活性を有しており、５０℃まででは安定であった。２ｍＭ塩化カルシウムにより、酵素の熱に対する安定生が若干向上した（図４）。
【００８２】
（６）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、Ｌａｅｍｍｌｉらの方法に従い行った。尚、用いた分子量マーカーは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダードＬｏｗ（バイオ ラッド）であり、標準タンパク質として、ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂ（分子量；９７，４００）、ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（分子量；６６，２００）、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（分子量；４５，０００）、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ（分子量；３１，０００）、ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（分子量；２１，５００）及びｌｙｓｏｚｙｍｅ（分子量；１４，４００）を含んでいた。ゲル濃度１２．５％のゲルを用いて、３０ｍＡ／ゲルで約４０分間電気泳動を行い、分子量を求めた場合、分子量は約４０ｋであった。
【００８３】
参考例 酵素活性測定方法
（１）ＣＭＣアーゼ活性測定法［３．５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）法］
終濃度１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、日本製紙製）、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９ｍＬに適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、４０℃で２０分間反応した後、ＤＮＳ溶液１ｍＬを加えて沸騰湯浴中で５分間熱処理した。熱処理後氷水中で冷却し、脱イオン水４ｍＬを加え攪拌後、Ｕ２０００スペクトロフォトメーター（日立製作所）を用いて、５３５ｎｍでの吸光度を測定した。酵素１ユニット、１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する量とした。
【００８４】
（２）ＣＰアーゼ（結晶性セルロース分解活性）活性測定法
終濃度１％（ｗ／ｖ）セルロースパウダー（ＣＰ、ＳＩＧＭＡＣＥＬＬ、ｔｙｐｅ１０１、シグマ製）、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９ｍＬに適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、４０℃で１〜５時間反応した後、ＤＮＳ溶液１ｍＬを加えて遠心分離（３０００ｒｐｍ、２５℃、１５分間）後、１ｍＬを分取し、脱イオン水２ｍＬを加え攪拌した。沸騰湯浴中で５分間熱処理した後、熱処理後氷水中で冷却し、Ｕ２０００スペクトロフォトメーター（日立製作所）を用いて、５３５ｎｍでの吸光度を測定した。酵素１ｕｎｉｔは、１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する量とした。この方法をＣＰアーゼ（結晶性セルロース分解活性）標準活性測定法とした。
【００８５】
（３）キシラナーゼ活性測定法
終濃度１％（ｗ／ｖ）キシラン（Ｏａｔ−ｓｐｅｌｔ、フルカ製）、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９ｍＬに適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、４０℃で２０分間反応した後、ＤＮＳ溶液１ｍＬを加えて沸騰湯浴中で５分間熱処理した。熱処理後氷水中で冷却し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、２５℃、１５分間）した後、１ｍＬ分取し脱イオン水４ｍＬを加え攪拌した。Ｕ２０００スペクトロフォトメーター（日立製作所）を用いて、５３５ｎｍでの吸光度を測定した。酵素１ｕｎｉｔは、１分間に１μｍｏｌのキシロースを遊離する量とした。この方法をキシラナーゼ標準活性測定法とした。
【００８６】
（４）アビセラーゼ活性測定法
終濃度１％（ｗ／ｖ）ＡＺＣＬ−アビセル（メガザイム製）、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム（ｐＨ９．０）の基質溶液０．９ｍＬに適当な濃度に希釈した酵素溶液０．１ｍＬを加え、４０℃で４時間反応した後、３ｍＬのエタノールを加え撹拌した。遠心分離（３０００ｒｐｍ、２５℃、１５分間）した後、上清液の６５０ｎｍでの吸光度をＵ２０００スペクトロフォトメーター（日立製作所）を用いて測定した。
【００８７】
（５）キチナーゼ活性測定法
１％（ｗ／ｖ）コロイダルキチン基質及び０．２Ｍグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）を用い、再終濃度が各々０．４％及び０．１Ｍになるように調製した基質溶液０．９ｍＬに、酵素液０．１ｍＬを添加して４０℃で２時間反応した。ＤＮＳ溶液１ｍＬを添加して反応を停止させた後、沸騰湯浴中で５分間煮沸した。氷水中で冷却後、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間、２５℃）により得られた上清液の５３５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＶＥＲＳＡｍａｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ製）で測定した。尚、基質溶液０．９ｍＬにＤＮＳ溶液１ｍＬを添加後、粗酵素液０．１ｍＬを加え、同様の操作を行ったものをブランクとした。酵素１ユニットは、１分間当たり、１μｍｏｌのＮ―アセチルグルコサミンを遊離する酵素量とした。
【００８８】
（６）マンナナ−ゼ活性測定法
１％（ｗ／ｖ）ＡＺＣＬ−ガラクトマンナン（メガザイム製）溶液０．２ｍＬ、０．５Ｍグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）０．２ｍＬ、脱イオン水０．５ｍＬ及び酵素液０．１ｍＬを混合し、４０℃で２０分間反応した後、エタノール３ｍＬを加え、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間、２５℃）し、残渣を沈殿させた。その上清液の６００ｎｍにおける吸光度を測定した。１ＭａｎＵ（マンナナーゼユニット）は、上記反応条件下において６００ｎｍにおける吸光度が０．４４を示す酵素量とした（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ＡＭ００１株由来のマンナナーゼ１ユニットは上記反応条件下で吸光度０．４４を与える。これを基準とした）。
【００８９】
（７）β（１，３）−グルカナーゼ活性測定法
１％（ｗ／ｖ）ＡＺＣＬ−カードラン（β（１，３）−グルカン、メガザイム製）溶液０．２ｍＬ、０．５Ｍグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）０．２ｍＬ、脱イオン水０．５ｍＬ及び酵素液０．１ｍＬを混合し、４０℃で２０分間反応した後、エタノール３ｍＬを加え、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１５分間、２５℃）し、残渣を沈殿させた。その上清液の６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００９０】
実施例８ 各種セルラーゼとの組み合わせによる綿布の表面の毛羽除去効果
本発明のＮ５４６ｂキシラナーゼを以下に示すセルラーゼと組み合わせた場合における綿布の表面の毛羽除去効果を検討した。
（１）毛羽除去処理の方法
毛羽除去処理は、市販洗剤を用い繰り返し洗濯により毛羽立たせた濃青色の中古メリヤスシャツ生地を毛羽立ち表面が表に来るように縫い合わせた試験布片（６ｃｍ×６ｃｍ）を３枚用いてＴｅｒｇ−ｏ−ｔｏｍｅｔｅｒで行った。４０℃に恒温した下記のセルラーゼ又はセルラーゼと本発明のキシラナーゼを含む処理液１Ｌを用い、少なくとも１２０ｒｐｍで２時間処理を行った。処理後、水道水でよくすすいで、数枚のタオルと一緒に乾燥機仕上げを行った。
＜セルラーゼ＞
１）レノザイム（Renozyme：ノボザイム社）
２）ケアザイム（Carezyme：ノボザイム社）
３）ＫＳＭ−Ｓ２３７セルラーゼ（特開平10-313859）
４）ＫＳＭ−Ｎ２５２セルラーゼ（特願2001-043663）
５）ＫＳＭ−Ｎ１４５セルラーゼ（特開2005-287441）
【００９１】
（２）毛羽除去度の測定
毛羽除去度は分光測色計（ミノルタ社製 ＣＭ−３５００ｄ）を用い、ＳＣＥ（正反射光除去）方式で測定したＬａｂ表示系のＬ値（明度）で評価した。処理前サンプルのＬ値に対する処理後のＬ値の減少（明度の低下）＝ΔＬ値を求め、このΔＬ値により毛羽除去
の度合いを評価した。各試験において６点のΔＬ値を測定し（Ｎ＝６）、その平均値を算
出した。
【００９２】
（３）結果
ＫＳＭ−Ｎ１４５セルラーゼを１００ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）で測定したＣＰ分解活性として０．０２Ｕ用いた時、同緩衝液で測定したＮ５４６ｂキシラナーゼを０．３Ｕ反応系に添加した場合には、ＫＳＭ−Ｎ１４５セルラーゼ単独使用に比べてより高い毛羽除去度を示した（図５）。
また、上記条件で測定したケアザイムセルラーゼを０．０１Ｕ反応系に用い、同条件で測定したＮ５４６ｂキシラナーゼをキシラナーゼ活性として０．１Ｕ、０．５Ｕ、１．０Ｕ添加した。その結果、添加量が高くなるにつれ、より高い毛羽除去度を示した（図６）。
実施例９
【００９３】
さらに、表４に示す組成の洗浄剤１００重量部にＮ５４６キシラナーゼを０．１重量部配合して本発明洗浄剤組成物（処方例１〜５）を調製した。なお、粒状洗浄剤の場合には、酵素、ＰＣ、ＡＣ−１、ＡＣ−２を除いた成分で粒子化した洗剤生地に、酵素、ＰＣ、ＡＣ−１、ＡＣ−２をそれぞれ粒子化したものをブレンドすることにより製造する。得られた洗浄剤は、優れた洗浄力を有し、衣料用洗浄剤として有用である。
【００９４】
【表４】
【００９５】
ＬＡＳ−２：日石洗剤（株）製アルキルベンゼンスルホン酸「アルケンＬ（アルキル鎖の炭素数１０〜１４）」を４８％ＮａＯＨで中和したもの
ＬＡＳ−３：日石洗剤（株）製アルキルベンゼンスルホン酸「アルケンＬ（アルキル鎖の炭素数１０〜１４）」を５０％ＫＯＨで中和したもの
ＡＳ−２：三菱化学（株）製ドバノール２５サルフェート（Ｃ12〜Ｃ15硫酸）のソーダ塩
ＳＡＳ：ヘキストジャパン（株）製Hostapur ＳＡＳ ９３、Ｃ13〜Ｃ18アルカンスルホン酸ソーダ
ＡＯＳ：アルファオレフィンスルホン酸ソーダ
ＳＦＥ：パーム油由来、アルファスルホ脂肪酸メチルエステルソーダ
脂肪酸塩：パルミチン酸ソーダ
ＡＥＳ−２：ポリオキシエチレンアルキル（Ｃ12〜Ｃ15）エーテル硫酸ソーダ（ＥＯ平均付加モル数２）
ＡＥ−３：ノニデッド Ｓ−３（Ｃ12、Ｃ13アルコールにＥＯを平均３モル付加したもの、三菱化学（株）製）
ＡＥ−４：ノニデッド Ｒ−７（Ｃ12〜Ｃ15アルコールにＥＯを平均７．２モル付加したもの、三菱化学（株）製）
ＡＥ−５：ソフタノール ７０（Ｃ12〜Ｃ15 ２級アルコールにＥＯを平均７モル付加したもの、日本触媒製）
ＡＧ：アルキル（ヤシ油由来）グルコシド（平均重合度１．５）
吸油性担体：ＴＩＸＯＬＥＸ ２５（非晶質アルミノ珪酸ソーダ、コフランケミカル社製、吸油能２３５ml／１００ｇ）
結晶性珪酸塩：ＳＫＳ−６、δ−Ｎａ2Ｓｉ2Ｏ5、結晶性層状シリケート，平均粒子径２０μｍ、ヘキストトクヤマ社製
非晶質珪酸塩：ＪＩＳ１号珪酸ソーダ
ＳＴＰＰ：トリポリリン酸ソーダ
ＮＴＡ：ニトリロトリ酢酸ソーダ
ＰＡＡ：ポリアクリル酸ソーダ、平均分子量１２０００
ＡＡ−ＭＡ：ソカランＣＰ５、アクリル酸−マレイン酸共重合体
ＣＭＣ：サンローズＢ１Ｂ、カルボキシメチルセルロースソーダ、山陽国策パルプ（株）製（現在、日本製紙（株））
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール、平均分子量６０００
ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン、平均分子量４００００、Ｋ値＝２６〜３５
蛍光染料：チノパールＣＢＳ（チバガイギー社製）と、ホワイテックスＳＡ（住友化学社製）を重量比１：１で配合したもの
（注意：液体洗剤の場合はチノパールＣＢＳのみ配合）
香料：特開平８−２３９７００号公報の実施例記載の香料組成を使用
酵素：サビナーゼ12.0TW（プロテアーゼ）、リポラーゼ100T（リパーゼ）、ターマミル60T（アミラーゼ）、ケアザイム（セルラーゼ）（以上の酵素はノボノルディスク社製）、及びＫＡＣ５００（セルラーゼ、花王製）を重量比率で２：１：１：１の割合で配合したもの（注意：液体洗剤はサビナーゼ16.0Ｌ（プロテアーゼ、ノボノルディスク社製）のみを配合）
ＰＣ：過炭酸ソーダ、平均粒子径４００μｍ、メタホウ酸ソーダにて被覆したもの
ＡＣ−１：ＴＡＥＤ、テトラアセチルエレンジアミン、ヘキスト社製
ＡＣ−２：ラウロイルオキシベンゼンスルホン酸ソーダ
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明のアルカリキシラナーゼの最適ｐＨを示すグラフである。Ａ：キシラナーゼ活性、Ｂ：ＣＰ（セルロースパウダー）分解活性。×：グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、＊：クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、＋：酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、●：リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、○：トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、▲：グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、△：ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８、□：リン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２。
【図２】本発明のアルカリキシラナーゼのｐＨ安定性を示すグラフである。Ａ：キシラナーゼ活性、Ｂ：ＣＰ分解活性。×：グリシン−塩酸緩衝液ｐＨ２．５、ｐＨ３、ｐＨ３．５、＊：クエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３、ｐＨ４、ｐＨ５、＋：酢酸緩衝液ｐＨ３．５、ｐＨ４．５、ｐＨ５．５、●：リン酸緩衝液ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、○：トリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、▲：グリシン水酸化ナトリウムｐＨ８．５、ｐＨ９．０、ｐＨ９．５、ｐＨ１０、ｐＨ１０．５、△：ホウ酸ナトリウム水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５、ｐＨ１０．５、ｐＨ１０．８、□：リン酸水酸化ナトリウム緩衝液ｐＨ１１、ｐＨ１２。
【図３】本発明のアルカリキシラナーゼの最適反応温度を示すグラフである。Ａ：キシラナーゼ活性、Ｂ：ＣＰ分解活性。
【図４】本発明のアルカリキシラナーゼの温度安定性を示すグラフである。Ａ：キシラナーゼ活性、Ｂ：ＣＰ分解活性。●：２ｍＭ塩化カルシウム無添加、○２ｍＭ塩化カルシウム添加
【図５】本発明のアルカリキシラナーゼとセルラーゼ（ＫＳＭ−Ｎ１４５）との組み合わせによる綿布の表面の毛羽除去効果を示すグラフである。５４６ｂ：Ｎ５４６ｂキシラナーゼ、Ｎ１４５：ＫＳＭ−Ｎ１４５セルラーゼ
【図６】本発明のアルカリキシラナーゼとセルラーゼ（ケアザイム）との組み合わせによる綿布の表面の毛羽除去効果を示すグラフである。ｃａｒｅ：ケアザイム（ノボザイム社）、５４６ｂ：Ｎ５４６ｂキシラナーゼ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の酵素学的性質を有するアルカリキシラナーゼ。
１．作用：
キシランのβ１，４−グリコシド結合を加水分解する。
２．基質特異性：
キシラン及び結晶性セルロースを分解し、特にキシランをよく分解する。
３．最適反応ｐＨ：
キシランを基質として４０℃で反応させた場合、最適反応ｐＨは約８．５である。
４．ｐＨ安定性：
キシランを基質として５℃で２０時間処理した場合、ｐＨ４．０〜１０．５で未処理の８０％以上の残存活性を示す。
５．最適反応温度：
キシランを基質としてｐＨ９．０で２０分間反応させた場合、最適反応温度は約５０℃である。
６．熱安定性：
キシランを基質としてｐＨ７．０で２０分間処理した場合、５０℃までは未処理の９０％以上の残存活性を示す。
７．分子量：
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約４０ｋＤａである。
【請求項２】
セルロースパウダーを基質として４０℃で反応させた場合に、最適反応ｐＨが約５．５である請求項１記載のアルカリキシラナーゼ。
【請求項３】
以下の（ａ）から（ｃ）いずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
請求項３記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
以下の（ａ）から（ｄ）いずれかに記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項６】
請求項４または５記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
宿主が微生物である請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項７または８記載の形質転換体を培養し、キシラナーゼを採取するキシラナーゼの生産方法。
【請求項１０】
請求項１又は２記載のアルカリキシラナーゼ、又は請求項３記載のタンパク質を配合してなる洗浄剤組成物。
【請求項１１】
さらに、結晶性セルロース分解能を有するセルラーゼを配合してなる請求項１０記載の洗浄剤組成物。
【請求項１】
以下の酵素学的性質を有するアルカリキシラナーゼ。
１．作用：
キシランのβ１，４−グリコシド結合を加水分解する。
２．基質特異性：
キシラン及び結晶性セルロースを分解し、特にキシランをよく分解する。
３．最適反応ｐＨ：
キシランを基質として４０℃で反応させた場合、最適反応ｐＨは約８．５である。
４．ｐＨ安定性：
キシランを基質として５℃で２０時間処理した場合、ｐＨ４．０〜１０．５で未処理の８０％以上の残存活性を示す。
５．最適反応温度：
キシランを基質としてｐＨ９．０で２０分間反応させた場合、最適反応温度は約５０℃である。
６．熱安定性：
キシランを基質としてｐＨ７．０で２０分間処理した場合、５０℃までは未処理の９０％以上の残存活性を示す。
７．分子量：
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約４０ｋＤａである。
【請求項２】
セルロースパウダーを基質として４０℃で反応させた場合に、最適反応ｐＨが約５．５である請求項１記載のアルカリキシラナーゼ。
【請求項３】
以下の（ａ）から（ｃ）いずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質
【請求項４】
請求項３記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項５】
以下の（ａ）から（ｄ）いずれかに記載のポリヌクレオチドからなる遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つキシラナーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
【請求項６】
請求項４または５記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項８】
宿主が微生物である請求項７記載の形質転換体。
【請求項９】
請求項７または８記載の形質転換体を培養し、キシラナーゼを採取するキシラナーゼの生産方法。
【請求項１０】
請求項１又は２記載のアルカリキシラナーゼ、又は請求項３記載のタンパク質を配合してなる洗浄剤組成物。
【請求項１１】
さらに、結晶性セルロース分解能を有するセルラーゼを配合してなる請求項１０記載の洗浄剤組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−５４０５０（Ｐ２００７−５４０５０Ａ）
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２０２１６７（Ｐ２００６−２０２１６７）
【出願日】平成１８年７月２５日（２００６．７．２５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月８日（２００７．３．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２５日（２００６．７．２５）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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