イチョウ抽出物から農薬を除去する方法および前記方法によって得られる抽出物
イチョウ抽出物から農薬を除去する方法であって、従来の方法によって得られる抽出物を、以下のステップ：ａ．ヘキサンで除去できない農薬およびイチョウテルペンを含む中間極性画分、ならびにイチョウフラボングリコシドを含む高極性画分を得るための、前記抽出物の液液抽出ステップ；ｂ．５０％以上のギンコライド含量を有する中間物を得るための、ステップａ）で得られた中間極性画分からの結晶化ステップ；ｃ．５０％以上のビロバライド含量を有する中間物を得るための、ステップｂ）で得られた残留溶液からの結晶化ステップ；ｄ．ステップａ）で得られた高極性画分と、ステップｂ）およびｃ）で得られたイチョウテルペン中間物およびビロバライド中間物との混合ステップにかけることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イチョウ（Ginkgo biloba）抽出物から農薬（pesticides）を除去する方法、および前記方法によって得ることのできる抽出物に関する。
【０００２】
先行技術
イチョウ葉抽出物は、前記抽出物の成分に起因する複数の薬理特性（血管拡張、免疫賦活、抗酸化および抗凝集（antiaggregant）特性）のために、中国の伝統医学で、および多数の欧米諸国で長く用いられてきた。
【０００３】
イチョウ葉抽出物の調製のための方法は、US 5700468、EP 360 556、EP 431 535およびJP 09110713に開示されている。
【０００４】
特に過去において、前記抽出物を生成するために用いられる植物の栽培で、その毒性が十分に報告されている有機リン化合物などの農薬が使用されてきた。多くの保健および農業当局がそのような農薬の使用を禁止または規制してきているが、植物原料の原産地を確証することは必ずしも容易ではなく、さらに農薬の使用が規制されている国でさえ、医薬または栄養用のグレードの抽出物中でのその存在が全く望ましくない殺虫作用物質の違法または不適切な使用を排除することは不可能である。特に把握が難しい問題は、近くの作物に由来する農薬によって起こり得る交叉汚染である。
【０００５】
汚染一般の問題は、Journal of AOAC International、第88巻（3号）、2005年、729〜735ページで述べられており、その論文は、ガスクロマトグラフィーによるイチョウ葉の有機リン農薬含量の決定方法も記載している。
【０００６】
US 5,660,832は、特定のｐＨ範囲の極性溶媒による抽出、それに続く樹脂上での吸収および脱吸収を含む、農薬からの植物抽出物の一般精製方法を開示している。イチョウ葉の場合、抽出はエタノールと水との混合物で実施される。
【０００７】
農薬は、イチョウ抽出物中の唯一の望ましくない汚染物ではない。例えば、EP 1 968 625は、低含量のギンコトキシンとしても知られる４’−Ｏ−メチルピリドキシンおよび／またはビフラボンを含むイチョウ抽出物の多段階式調製方法を記載している。しかしこの場合、望ましくない成分は植物に天然に存在する。
【０００８】
最後に、EP 1 868 626は、イチョウ作物の近くでの化石燃料の使用に由来する多環芳香族炭化水素を低含量で有するイチョウ抽出物を調製する方法を開示している。記載されている方法は非常に複雑であり、１１のステップ、長い調製時間、およびポリアミドなどの高価な試薬、または鉛塩などの有毒試薬の使用を含む。
【０００９】
事実上すべての公知の方法は、イチョウ抽出物の親油性成分（特にビフラボンおよびギンコール（ginkgols））の除去の１つまたは複数のステップを含む。前記抽出は、存在するいかなる親油性農薬含量も減少させるが、より高い極性を有する農薬は、その挙動が親水性成分（例えばフラボングリコシドおよびテルペン）の挙動により類似しているので、抽出物中に残存する。
【００１０】
その結果、医薬用、栄養用または化粧用の植物起源の製品中のいかなる種類の農薬の残留含量も管理しうる、特に米国での法律によって課される限度に適合するためにイチョウ葉抽出物から農薬または他の汚染物質を低減させるまたは取り除く便利な精製方法の必要性がある。
【００１１】
発明の説明
以下のステップを含む方法によって、イチョウ抽出物の農薬含量を低減させることができることが今や見出された：
ａ）ヘキサンで除去できない農薬およびイチョウテルペン（ginkgo terpenes）を含む中間極性画分、ならびにイチョウフラボングリコシド（ginkgo flavone glycosides）を含む高極性画分を得るための、前記抽出物の液液抽出；
ｂ）５０％以上のギンコライド含量を有する中間物（intermediate）を得るための、ステップａ）で得られた中間極性画分からの結晶化；
ｃ）５０％以上のビロバライド含量を有する中間物を得るための、ステップｂ）で得られた残留溶液からの結晶化；
ｄ）ステップａ）で得られた高極性画分と、ステップｂ）およびｃ）で得られたイチョウテルペン中間物およびビロバライド中間物との混合。
【００１２】
残留農薬含量を取り除くまたは実質的に低減することに加えて、本発明の方法は、イチョウテルペン含量およびその相対比率の制御も可能にする。
【００１３】
したがって本発明は、上記の方法から入手できる、所定比率のイチョウテルペンを有する抽出物にも関する。
【００１４】
本発明によれば、ステップａ）は、エステル、塩素化炭化水素、炭化水素とアルコールとの混合物、ケトンおよびケトンとアルコールとの混合物、好ましくはＣ２〜Ｃ８エステル、例えば酢酸エチルおよび酢酸ｔ−ブチル、またはトルエン−ブタノール混合物から選択される水非混和性溶媒による抽出によって、イチョウテルペンが富化された画分およびイチョウフラボングリコシドが富化された画分を生成する。
【００１５】
イチョウテルペンは水とＣ１〜Ｃ５アルコールとの混合物中で結晶化されるが、一方、ステップｃ）で得られたテルペンに富む画分から結晶化するのは、水中または水とＣ１〜Ｃ３アルコールとの混合物中で実施される。本発明による方法は、ギンコールと共に除去されない中間極性農薬を取り除く。
【００１６】
本発明は、下記の例でより詳細に例示される。
【００１７】
例１：US 5700468およびEP 0 360 556（Ｉｎｄｅｎａ）の例Ｉによって生成される抽出物の精製
１）１００ｋｇの細断葉を、約５０℃の温度で、４００ｌの６０％（ｗ／ｗ）アセトンで４回抽出する。
【００１８】
２）合わせたパーコレート（the combined percolates）を、５００ｌのヘキサンにより向流で抽出する。
【００１９】
３）その脱脂された溶液を真空下で２００ｌの体積まで濃縮し、２℃で一晩放置し、その後遠心分離にかけてビフラボン画分を分離する。
【００２０】
４）その水溶液を、４００ｌのｎ−ブタノール／トルエンの８／２ ｖ／ｖ混合物により向流で抽出する。
【００２１】
５）その有機溶液を真空下で小体積まで濃縮し、水で置き換える（substituting with water）。濃縮物を水に溶解させて（taken up with water）、約３０％の乾燥残留物を含む溶液を得る。
【００２２】
６）その溶液を、約６５ｌの酢酸エチルにより向流で抽出する。水相をシロップ様稠度（consistency）まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る（１．９５ｋｇ）。
【００２３】
７）その酢酸エチル相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を３ｌの７５％エタノール水溶液に溶解させる。
【００２４】
８）溶液を２０ｌのヘキサンにより向流で抽出し、合わせた有機相（the combined organic phases）を取り除く。
【００２５】
９）その水−アルコール溶液を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、０．９ｌの５０％エタノール水溶液を加える。
【００２６】
得られた溶液を撹拌下で還流加熱し、次に室温まで冷却させ、４日間放置して結晶化させる。
【００２７】
１０）次にその溶液をろ過し、固体を５０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、９５ｇの精製されたギンコライドを得る。
【００２８】
１１）その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を１．９ｌの水に溶解させ、撹拌下で３０分間９０℃に加熱する。水溶液を分離し、さらに３回残留物を９０℃で１．９ｌの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
【００２９】
１２）その水溶液（複数）を合わせ、１４ｌのヘキサンにより向流で抽出する。
【００３０】
１３）その水溶液を０．３ｌの体積まで濃縮し、次に０．１ｌの９５°のＥｔＯＨを加え、溶液を撹拌下、５０℃で加熱し、次に室温まで冷却させ、３日間放置して結晶化させる。
【００３１】
１４）その溶液をろ過し、固体を２０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、１０３ｇの精製されたビロバライドを得る。
【００３２】
１５）第６、１０および１４項で得られた生成物を混合して、以下の特性を有するイチョウ抽出物２．１５ｋｇを得る：イチョウフラボングリコシド２６．０％；ビロバライド３．２％；ギンコライド３．５％；ギンコール酸＜５．０ｐｐｍ；各農薬＜１０ｐｐｂ。
【００３３】
例２：US 5700468、EP 0 360 556（Ｉｎｄｅｎａ）の例ＩＩに記載の通りに生成される抽出物の精製
１）１００ｋｇの細断葉を、約３５℃の温度で、４００ｌの５０％（ｗ／ｗ）メタノールで４回抽出する。
【００３４】
２）合わせたパーコレートを４０℃、真空下で１００ｌまで濃縮し、濃縮物を１００ｌのメタノールに溶解させ、得られた懸濁液をろ過する。
【００３５】
３）ろ過した溶液を、１００ｌのトルエン／ｎ−ブタノールの９：２混合物で３回抽出する。
【００３６】
４）合わせた有機相を、５０ｌの５０％メタノールにより向流洗浄する（counterwashed）。
【００３７】
５）その水−メタノール溶液を真空下で水溶液へ濃縮し、ろ過の後、ｎ−ブタノール／トルエンの８：２混合物で抽出する。
【００３８】
６）その有機溶液を水で向流洗浄し、真空下で少量の体積まで濃縮し、水で置き換える。その溶液を水に溶解させて、２０％の乾燥残留物を含む溶液を得る。
【００３９】
７）生じた溶液を、９０ｌのｎ−ブタノール／トルエンの１：１混合物により向流で抽出する。水相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る（２．０５ｋｇ）。
【００４０】
８）そのｎ−ブタノール／トルエン混合物を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を３．５ｌの６０％エタノール水溶液に溶解させる。
【００４１】
９）生じた溶液を２０ｌのヘキサンにより向流で抽出し、合わせた有機相を取り除く。
【００４２】
１０）その水−アルコール溶液を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、１．２ｌの４０％エタノール水溶液を加える。
【００４３】
生じた溶液を撹拌下で４５分間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、３〜４日間放置して結晶化させる。
【００４４】
１１）次にその溶液をろ過し、固体を４０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、９７ｇの精製されたギンコライドを得る。
【００４５】
１２）その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を２ｌの水に溶解させ、撹拌下、９０℃で３０分間加熱する。その水溶液を分離し、さらに３回残留物を９０℃の２ｌの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
【００４６】
１３）その水溶液を合わせ、１７ｌのヘキサンにより向流で抽出する。
【００４７】
１４）その水溶液を０．４ｌの体積に濃縮し、０．１５ｌの９５°のＥｔＯＨを加える；生じた溶液を撹拌下、５０〜５５℃で３０分間加熱し、次に室温まで冷却させ、３〜４日間放置して結晶化させる。
【００４８】
１５）溶液をろ過し、固体を２０％ＥｔＯＨで洗浄し、６０℃の真空下で乾燥させて、１１０ｇの精製されたビロバライドを得る。
【００４９】
１６）第７、１１および１５項で得られた生成物を混合して、例１で得られたものに類似したイチョウ抽出物２．２６ｋｇを得る。
【００５０】
例３：EP 431 535（Ｓｃｈｗａｂｅ）の例Ｉによって生成される抽出物の精製
１）１００ｋｇの細断葉を、５７〜５９℃の温度で３０分間、７５０ｋｇの６０％（ｗ／ｗ）アセトンで２回抽出する。
【００５１】
２）合わせた抽出物を３０〜４０％の乾燥残留物を含む水溶液まで濃縮し、等量の水を加え、混合物を撹拌下、１２℃で１時間放置する。
【００５２】
３）アルキルフェノールに富む沈殿物を遠心分離によって分離し、取り除く。
【００５３】
４）３０％の硫安を清澄化された溶液に撹拌下で加え、その溶液を、１／２の体積のメチルエチルケトン／アセトンの６：４混合物で２回抽出する。
【００５４】
５）合わせたメチルエチルケトン／アセトン溶液を、真空下で乾燥残留物５０〜７０％まで濃縮し、次に水および９５％エタノールで希釈して、１０％の乾燥残留物を含む５０％エタノール溶液を得る。
【００５５】
６）色が褐色から淡褐色に変化するまで、撹拌下で酢酸水酸化鉛の水溶液を加える。得られた沈殿物を、遠心分離によって取り除く。
【００５６】
７）遠心分離された溶液を、１／３の体積のヘキサンで３回抽出する。
【００５７】
８）脱脂された溶液を真空下で水溶液へ濃縮し、２０％の硫安を加え、１／２の体積のメチルエチルケトン／エタノールの６：４混合物で２回抽出する。合わせた有機相を２０％の硫安で洗浄し、水および形成された固体をすべて除去する。
【００５８】
９）次に、その透明な溶液を真空下で少量の体積に濃縮し、水で置き換える。
【００５９】
濃縮物を水に溶解させて、約１０％の乾燥残留物を含む溶液を得る。
【００６０】
１０）その溶液を、約１００ｌの酢酸ｔ−ブチルにより向流で抽出する。その水相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る（１．８８ｋｇ）。
【００６１】
１１）その酢酸ブチル相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、０．８ｌの６０％エタノール水溶液を加える。
【００６２】
生じた溶液を撹拌下で２５分間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、２日間放置して結晶化させる。
【００６３】
１２）次にその溶液をろ過し、固体を６０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、９８ｇの精製されたギンコライドを得る。
【００６４】
１３）その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を１．９ｌの水に溶解させ、撹拌下、９０℃で３０分間加熱する。水溶液を分離し、さらに３回残留物を９０℃で１．９ｌの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
【００６５】
１４）合わせた水溶液を０．６ｌの体積まで濃縮し、撹拌下、７０℃まで６０分間加熱し、次に室温まで冷却させ、１日放置して結晶化させる。
【００６６】
１５）生じた溶液をろ過し、固体を水で洗浄し、真空下で乾燥させて、９９ｇの精製されたビロバライドを得る。
【００６７】
１６）第１０、１２および１５項で得られた生成物を混合して、例１で得られたものに類似したイチョウ抽出物２．０８ｋｇを得る。
【００６８】
例４：JP 09110713（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｒｅｅｎ ｗａｖｅ）によって生成される抽出物の精製
１）１００ｋｇの細断イチョウ葉を、５０℃で３０時間、５００ｌの７０％エタノールで３回抽出する。
【００６９】
２）合わせたパーコレートを真空下で１００ｌまで濃縮し、濃縮物を１００ｌの水に溶解させる。
【００７０】
得られた懸濁液をろ過する。
【００７１】
３）ろ過した溶液を１００ｌのＨＰ２０樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）を含むクロマトグラフィーカラムに導入して、抽出物を吸着させる。次に、カラムを２００ｌの水で洗浄し、２００ｌの７０％エタノールで溶出することによって抽出物を回収する。
【００７２】
４）その水−エタノール溶液を真空下で少量の体積に濃縮し、水で置き換える。濃縮物を２０％エタノールに溶解させて、２０％の乾燥残留物を含む溶液を得る。
【００７３】
５）生じた溶液を、７０ｌの塩化メチレンにより向流で抽出する。水−エタノール相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る（２．４ｋｇ）。
【００７４】
６）そのクロロメチレン相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を４ｌの７５％メタノール水溶液に溶解させる。
【００７５】
７）生じた溶液を２ｌのヘキサンにより１０回抽出し、合わせたヘキサン相を取り除く。
【００７６】
８）その水−アルコール溶液を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、１ｌの５０％メタノール水溶液を加える。
【００７７】
生じた溶液を撹拌下で３０分間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、５日間放置して結晶化させる。
【００７８】
９）次にその溶液をろ過し、固体を５０％ＭｅＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、１０５ｇの精製されたギンコライドを得る。
【００７９】
１０）その母液を真空下で濃縮してメタノールを取り除き、次に残留物を２ｌの水に溶解させ、撹拌下、９０℃で３０分間加熱する。水溶液を分離し、さらに３回残留物を９０℃で２ｌの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
【００８０】
１１）合わせた水溶液を０．４ｌの体積まで濃縮し、０．１ｌのＭｅＯＨを加える；生じた溶液を撹拌下、５０℃で３０分間加熱し、次に室温まで冷却させ、３日間放置して結晶化させる。
【００８１】
１２）生じた溶液をろ過し、固体を２０％ＭｅＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、１０２ｇの精製されたビロバライドを得る。
【００８２】
１３）第５、９および１２項で得られた生成物を混合して、例１で得られたものに類似したイチョウ抽出物２．６ｋｇを得る。
【００８３】
例５：テルペン含量の高い農薬を含む精製された抽出物の精製
１）２４％のイチョウフラボングリコシド、１２％のイチョウテルペン、２ｐｐｍのギンコール酸ならびに３１５ｐｐｂのクロルピリホスおよびトリシクラゾールを含む１ｋｇのイチョウ葉抽出物を、撹拌下で５ｌの水に懸濁する。
【００８４】
２）懸濁液を、室温で、５ｌの酢酸エチルで１２回抽出する。次に、水相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る（８１０ｇ）。
【００８５】
３）合わせた酢酸エチル相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を２ｌの５０％エタノール水溶液に溶解させる。
【００８６】
生じた溶液を撹拌下で１時間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、２日間放置して結晶化させる。
【００８７】
４）次にその溶液をろ過し、固体を５０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、８２ｇの精製されたギンコライドを得る。
【００８８】
５）その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を２ｌの水に溶解させ、撹拌下、９０℃で１５分間加熱する。水溶液を分離し、残留物を９０℃で２ｌの水で２回目の溶解をさせ、水溶液を回収する。
【００８９】
６）その水溶液を合わせ、真空下でシロップ様稠度まで濃縮する；次に残留物を４００ｍｌの１０％ＥｔＯＨに溶解させる。生じた溶液を撹拌下、５０℃で６０分間加熱し、次に室温まで冷却させ、２日間放置して結晶化させる。
【００９０】
７）その溶液をろ過し、固体を１０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、７０ｇの精製されたビロバライドを得る。
【００９１】
８）４１ｇの精製されたギンコライドおよび３５ｇの精製されたビロバライドを第２項で得られた生成物と混合して、以下の特性を有するイチョウ抽出物８８５ｇを得る：ａ．イチョウフラボングリコシド２７％；ｂ．イチョウテルペン６．８％；ｃ．ギンコール酸１．０ｐｐｍ；ｄ．各農薬＜１０ｐｐｂ。
【００９２】
記載された方法は農薬を除去し、イチョウ抽出物のテルペン含量の制御を可能にし、精製された中間物が混合されるステップにおいて要求に応じてテルペン含量を調整する。実際上、抽出物で理想的とみなされる２４／６の比率（ＧＦＧ／ＧＴ）は、植物において見られる天然の比率としばしば異なる。例えば、中国産の葉は、しばしばより高いテルペン含量を有し、適合する（conforming）抽出物を得るためにイチョウテルペン力価（titre）の低減ステップが必要とされる。
【００９３】
下の表は、上記の手順によって得られる抽出物の農薬含量を示す。各例について２つの試験を実施した：第１試験では特許で開示される手順に正確に従い、第２試験ではテルペン画分の処理が加えられた。
【００９４】
すべての抽出物は、同じ植物から得られた。
【００９５】
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イチョウ（Ginkgo biloba）抽出物から農薬（pesticides）を除去する方法、および前記方法によって得ることのできる抽出物に関する。
【０００２】
先行技術
イチョウ葉抽出物は、前記抽出物の成分に起因する複数の薬理特性（血管拡張、免疫賦活、抗酸化および抗凝集（antiaggregant）特性）のために、中国の伝統医学で、および多数の欧米諸国で長く用いられてきた。
【０００３】
イチョウ葉抽出物の調製のための方法は、US 5700468、EP 360 556、EP 431 535およびJP 09110713に開示されている。
【０００４】
特に過去において、前記抽出物を生成するために用いられる植物の栽培で、その毒性が十分に報告されている有機リン化合物などの農薬が使用されてきた。多くの保健および農業当局がそのような農薬の使用を禁止または規制してきているが、植物原料の原産地を確証することは必ずしも容易ではなく、さらに農薬の使用が規制されている国でさえ、医薬または栄養用のグレードの抽出物中でのその存在が全く望ましくない殺虫作用物質の違法または不適切な使用を排除することは不可能である。特に把握が難しい問題は、近くの作物に由来する農薬によって起こり得る交叉汚染である。
【０００５】
汚染一般の問題は、Journal of AOAC International、第88巻（3号）、2005年、729〜735ページで述べられており、その論文は、ガスクロマトグラフィーによるイチョウ葉の有機リン農薬含量の決定方法も記載している。
【０００６】
US 5,660,832は、特定のｐＨ範囲の極性溶媒による抽出、それに続く樹脂上での吸収および脱吸収を含む、農薬からの植物抽出物の一般精製方法を開示している。イチョウ葉の場合、抽出はエタノールと水との混合物で実施される。
【０００７】
農薬は、イチョウ抽出物中の唯一の望ましくない汚染物ではない。例えば、EP 1 968 625は、低含量のギンコトキシンとしても知られる４’−Ｏ−メチルピリドキシンおよび／またはビフラボンを含むイチョウ抽出物の多段階式調製方法を記載している。しかしこの場合、望ましくない成分は植物に天然に存在する。
【０００８】
最後に、EP 1 868 626は、イチョウ作物の近くでの化石燃料の使用に由来する多環芳香族炭化水素を低含量で有するイチョウ抽出物を調製する方法を開示している。記載されている方法は非常に複雑であり、１１のステップ、長い調製時間、およびポリアミドなどの高価な試薬、または鉛塩などの有毒試薬の使用を含む。
【０００９】
事実上すべての公知の方法は、イチョウ抽出物の親油性成分（特にビフラボンおよびギンコール（ginkgols））の除去の１つまたは複数のステップを含む。前記抽出は、存在するいかなる親油性農薬含量も減少させるが、より高い極性を有する農薬は、その挙動が親水性成分（例えばフラボングリコシドおよびテルペン）の挙動により類似しているので、抽出物中に残存する。
【００１０】
その結果、医薬用、栄養用または化粧用の植物起源の製品中のいかなる種類の農薬の残留含量も管理しうる、特に米国での法律によって課される限度に適合するためにイチョウ葉抽出物から農薬または他の汚染物質を低減させるまたは取り除く便利な精製方法の必要性がある。
【００１１】
発明の説明
以下のステップを含む方法によって、イチョウ抽出物の農薬含量を低減させることができることが今や見出された：
ａ）ヘキサンで除去できない農薬およびイチョウテルペン（ginkgo terpenes）を含む中間極性画分、ならびにイチョウフラボングリコシド（ginkgo flavone glycosides）を含む高極性画分を得るための、前記抽出物の液液抽出；
ｂ）５０％以上のギンコライド含量を有する中間物（intermediate）を得るための、ステップａ）で得られた中間極性画分からの結晶化；
ｃ）５０％以上のビロバライド含量を有する中間物を得るための、ステップｂ）で得られた残留溶液からの結晶化；
ｄ）ステップａ）で得られた高極性画分と、ステップｂ）およびｃ）で得られたイチョウテルペン中間物およびビロバライド中間物との混合。
【００１２】
残留農薬含量を取り除くまたは実質的に低減することに加えて、本発明の方法は、イチョウテルペン含量およびその相対比率の制御も可能にする。
【００１３】
したがって本発明は、上記の方法から入手できる、所定比率のイチョウテルペンを有する抽出物にも関する。
【００１４】
本発明によれば、ステップａ）は、エステル、塩素化炭化水素、炭化水素とアルコールとの混合物、ケトンおよびケトンとアルコールとの混合物、好ましくはＣ２〜Ｃ８エステル、例えば酢酸エチルおよび酢酸ｔ−ブチル、またはトルエン−ブタノール混合物から選択される水非混和性溶媒による抽出によって、イチョウテルペンが富化された画分およびイチョウフラボングリコシドが富化された画分を生成する。
【００１５】
イチョウテルペンは水とＣ１〜Ｃ５アルコールとの混合物中で結晶化されるが、一方、ステップｃ）で得られたテルペンに富む画分から結晶化するのは、水中または水とＣ１〜Ｃ３アルコールとの混合物中で実施される。本発明による方法は、ギンコールと共に除去されない中間極性農薬を取り除く。
【００１６】
本発明は、下記の例でより詳細に例示される。
【００１７】
例１：US 5700468およびEP 0 360 556（Ｉｎｄｅｎａ）の例Ｉによって生成される抽出物の精製
１）１００ｋｇの細断葉を、約５０℃の温度で、４００ｌの６０％（ｗ／ｗ）アセトンで４回抽出する。
【００１８】
２）合わせたパーコレート（the combined percolates）を、５００ｌのヘキサンにより向流で抽出する。
【００１９】
３）その脱脂された溶液を真空下で２００ｌの体積まで濃縮し、２℃で一晩放置し、その後遠心分離にかけてビフラボン画分を分離する。
【００２０】
４）その水溶液を、４００ｌのｎ−ブタノール／トルエンの８／２ ｖ／ｖ混合物により向流で抽出する。
【００２１】
５）その有機溶液を真空下で小体積まで濃縮し、水で置き換える（substituting with water）。濃縮物を水に溶解させて（taken up with water）、約３０％の乾燥残留物を含む溶液を得る。
【００２２】
６）その溶液を、約６５ｌの酢酸エチルにより向流で抽出する。水相をシロップ様稠度（consistency）まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る（１．９５ｋｇ）。
【００２３】
７）その酢酸エチル相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を３ｌの７５％エタノール水溶液に溶解させる。
【００２４】
８）溶液を２０ｌのヘキサンにより向流で抽出し、合わせた有機相（the combined organic phases）を取り除く。
【００２５】
９）その水−アルコール溶液を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、０．９ｌの５０％エタノール水溶液を加える。
【００２６】
得られた溶液を撹拌下で還流加熱し、次に室温まで冷却させ、４日間放置して結晶化させる。
【００２７】
１０）次にその溶液をろ過し、固体を５０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、９５ｇの精製されたギンコライドを得る。
【００２８】
１１）その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を１．９ｌの水に溶解させ、撹拌下で３０分間９０℃に加熱する。水溶液を分離し、さらに３回残留物を９０℃で１．９ｌの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
【００２９】
１２）その水溶液（複数）を合わせ、１４ｌのヘキサンにより向流で抽出する。
【００３０】
１３）その水溶液を０．３ｌの体積まで濃縮し、次に０．１ｌの９５°のＥｔＯＨを加え、溶液を撹拌下、５０℃で加熱し、次に室温まで冷却させ、３日間放置して結晶化させる。
【００３１】
１４）その溶液をろ過し、固体を２０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、１０３ｇの精製されたビロバライドを得る。
【００３２】
１５）第６、１０および１４項で得られた生成物を混合して、以下の特性を有するイチョウ抽出物２．１５ｋｇを得る：イチョウフラボングリコシド２６．０％；ビロバライド３．２％；ギンコライド３．５％；ギンコール酸＜５．０ｐｐｍ；各農薬＜１０ｐｐｂ。
【００３３】
例２：US 5700468、EP 0 360 556（Ｉｎｄｅｎａ）の例ＩＩに記載の通りに生成される抽出物の精製
１）１００ｋｇの細断葉を、約３５℃の温度で、４００ｌの５０％（ｗ／ｗ）メタノールで４回抽出する。
【００３４】
２）合わせたパーコレートを４０℃、真空下で１００ｌまで濃縮し、濃縮物を１００ｌのメタノールに溶解させ、得られた懸濁液をろ過する。
【００３５】
３）ろ過した溶液を、１００ｌのトルエン／ｎ−ブタノールの９：２混合物で３回抽出する。
【００３６】
４）合わせた有機相を、５０ｌの５０％メタノールにより向流洗浄する（counterwashed）。
【００３７】
５）その水−メタノール溶液を真空下で水溶液へ濃縮し、ろ過の後、ｎ−ブタノール／トルエンの８：２混合物で抽出する。
【００３８】
６）その有機溶液を水で向流洗浄し、真空下で少量の体積まで濃縮し、水で置き換える。その溶液を水に溶解させて、２０％の乾燥残留物を含む溶液を得る。
【００３９】
７）生じた溶液を、９０ｌのｎ−ブタノール／トルエンの１：１混合物により向流で抽出する。水相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る（２．０５ｋｇ）。
【００４０】
８）そのｎ−ブタノール／トルエン混合物を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を３．５ｌの６０％エタノール水溶液に溶解させる。
【００４１】
９）生じた溶液を２０ｌのヘキサンにより向流で抽出し、合わせた有機相を取り除く。
【００４２】
１０）その水−アルコール溶液を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、１．２ｌの４０％エタノール水溶液を加える。
【００４３】
生じた溶液を撹拌下で４５分間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、３〜４日間放置して結晶化させる。
【００４４】
１１）次にその溶液をろ過し、固体を４０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、９７ｇの精製されたギンコライドを得る。
【００４５】
１２）その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を２ｌの水に溶解させ、撹拌下、９０℃で３０分間加熱する。その水溶液を分離し、さらに３回残留物を９０℃の２ｌの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
【００４６】
１３）その水溶液を合わせ、１７ｌのヘキサンにより向流で抽出する。
【００４７】
１４）その水溶液を０．４ｌの体積に濃縮し、０．１５ｌの９５°のＥｔＯＨを加える；生じた溶液を撹拌下、５０〜５５℃で３０分間加熱し、次に室温まで冷却させ、３〜４日間放置して結晶化させる。
【００４８】
１５）溶液をろ過し、固体を２０％ＥｔＯＨで洗浄し、６０℃の真空下で乾燥させて、１１０ｇの精製されたビロバライドを得る。
【００４９】
１６）第７、１１および１５項で得られた生成物を混合して、例１で得られたものに類似したイチョウ抽出物２．２６ｋｇを得る。
【００５０】
例３：EP 431 535（Ｓｃｈｗａｂｅ）の例Ｉによって生成される抽出物の精製
１）１００ｋｇの細断葉を、５７〜５９℃の温度で３０分間、７５０ｋｇの６０％（ｗ／ｗ）アセトンで２回抽出する。
【００５１】
２）合わせた抽出物を３０〜４０％の乾燥残留物を含む水溶液まで濃縮し、等量の水を加え、混合物を撹拌下、１２℃で１時間放置する。
【００５２】
３）アルキルフェノールに富む沈殿物を遠心分離によって分離し、取り除く。
【００５３】
４）３０％の硫安を清澄化された溶液に撹拌下で加え、その溶液を、１／２の体積のメチルエチルケトン／アセトンの６：４混合物で２回抽出する。
【００５４】
５）合わせたメチルエチルケトン／アセトン溶液を、真空下で乾燥残留物５０〜７０％まで濃縮し、次に水および９５％エタノールで希釈して、１０％の乾燥残留物を含む５０％エタノール溶液を得る。
【００５５】
６）色が褐色から淡褐色に変化するまで、撹拌下で酢酸水酸化鉛の水溶液を加える。得られた沈殿物を、遠心分離によって取り除く。
【００５６】
７）遠心分離された溶液を、１／３の体積のヘキサンで３回抽出する。
【００５７】
８）脱脂された溶液を真空下で水溶液へ濃縮し、２０％の硫安を加え、１／２の体積のメチルエチルケトン／エタノールの６：４混合物で２回抽出する。合わせた有機相を２０％の硫安で洗浄し、水および形成された固体をすべて除去する。
【００５８】
９）次に、その透明な溶液を真空下で少量の体積に濃縮し、水で置き換える。
【００５９】
濃縮物を水に溶解させて、約１０％の乾燥残留物を含む溶液を得る。
【００６０】
１０）その溶液を、約１００ｌの酢酸ｔ−ブチルにより向流で抽出する。その水相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る（１．８８ｋｇ）。
【００６１】
１１）その酢酸ブチル相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、０．８ｌの６０％エタノール水溶液を加える。
【００６２】
生じた溶液を撹拌下で２５分間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、２日間放置して結晶化させる。
【００６３】
１２）次にその溶液をろ過し、固体を６０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、９８ｇの精製されたギンコライドを得る。
【００６４】
１３）その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を１．９ｌの水に溶解させ、撹拌下、９０℃で３０分間加熱する。水溶液を分離し、さらに３回残留物を９０℃で１．９ｌの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
【００６５】
１４）合わせた水溶液を０．６ｌの体積まで濃縮し、撹拌下、７０℃まで６０分間加熱し、次に室温まで冷却させ、１日放置して結晶化させる。
【００６６】
１５）生じた溶液をろ過し、固体を水で洗浄し、真空下で乾燥させて、９９ｇの精製されたビロバライドを得る。
【００６７】
１６）第１０、１２および１５項で得られた生成物を混合して、例１で得られたものに類似したイチョウ抽出物２．０８ｋｇを得る。
【００６８】
例４：JP 09110713（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｒｅｅｎ ｗａｖｅ）によって生成される抽出物の精製
１）１００ｋｇの細断イチョウ葉を、５０℃で３０時間、５００ｌの７０％エタノールで３回抽出する。
【００６９】
２）合わせたパーコレートを真空下で１００ｌまで濃縮し、濃縮物を１００ｌの水に溶解させる。
【００７０】
得られた懸濁液をろ過する。
【００７１】
３）ろ過した溶液を１００ｌのＨＰ２０樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）を含むクロマトグラフィーカラムに導入して、抽出物を吸着させる。次に、カラムを２００ｌの水で洗浄し、２００ｌの７０％エタノールで溶出することによって抽出物を回収する。
【００７２】
４）その水−エタノール溶液を真空下で少量の体積に濃縮し、水で置き換える。濃縮物を２０％エタノールに溶解させて、２０％の乾燥残留物を含む溶液を得る。
【００７３】
５）生じた溶液を、７０ｌの塩化メチレンにより向流で抽出する。水−エタノール相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る（２．４ｋｇ）。
【００７４】
６）そのクロロメチレン相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を４ｌの７５％メタノール水溶液に溶解させる。
【００７５】
７）生じた溶液を２ｌのヘキサンにより１０回抽出し、合わせたヘキサン相を取り除く。
【００７６】
８）その水−アルコール溶液を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、１ｌの５０％メタノール水溶液を加える。
【００７７】
生じた溶液を撹拌下で３０分間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、５日間放置して結晶化させる。
【００７８】
９）次にその溶液をろ過し、固体を５０％ＭｅＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、１０５ｇの精製されたギンコライドを得る。
【００７９】
１０）その母液を真空下で濃縮してメタノールを取り除き、次に残留物を２ｌの水に溶解させ、撹拌下、９０℃で３０分間加熱する。水溶液を分離し、さらに３回残留物を９０℃で２ｌの水に溶解させ、水溶液を毎回回収する。
【００８０】
１１）合わせた水溶液を０．４ｌの体積まで濃縮し、０．１ｌのＭｅＯＨを加える；生じた溶液を撹拌下、５０℃で３０分間加熱し、次に室温まで冷却させ、３日間放置して結晶化させる。
【００８１】
１２）生じた溶液をろ過し、固体を２０％ＭｅＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、１０２ｇの精製されたビロバライドを得る。
【００８２】
１３）第５、９および１２項で得られた生成物を混合して、例１で得られたものに類似したイチョウ抽出物２．６ｋｇを得る。
【００８３】
例５：テルペン含量の高い農薬を含む精製された抽出物の精製
１）２４％のイチョウフラボングリコシド、１２％のイチョウテルペン、２ｐｐｍのギンコール酸ならびに３１５ｐｐｂのクロルピリホスおよびトリシクラゾールを含む１ｋｇのイチョウ葉抽出物を、撹拌下で５ｌの水に懸濁する。
【００８４】
２）懸濁液を、室温で、５ｌの酢酸エチルで１２回抽出する。次に、水相をシロップ様稠度まで濃縮し、真空下で乾燥させて、イチョウフラボングリコシドが富化されかつテルペンを含まない中間物を得る（８１０ｇ）。
【００８５】
３）合わせた酢酸エチル相を真空下でシロップ様稠度まで濃縮し、残留物を２ｌの５０％エタノール水溶液に溶解させる。
【００８６】
生じた溶液を撹拌下で１時間還流加熱し、次に室温まで冷却させ、２日間放置して結晶化させる。
【００８７】
４）次にその溶液をろ過し、固体を５０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、８２ｇの精製されたギンコライドを得る。
【００８８】
５）その母液を真空下で濃縮してエタノールを取り除き、次に残留物を２ｌの水に溶解させ、撹拌下、９０℃で１５分間加熱する。水溶液を分離し、残留物を９０℃で２ｌの水で２回目の溶解をさせ、水溶液を回収する。
【００８９】
６）その水溶液を合わせ、真空下でシロップ様稠度まで濃縮する；次に残留物を４００ｍｌの１０％ＥｔＯＨに溶解させる。生じた溶液を撹拌下、５０℃で６０分間加熱し、次に室温まで冷却させ、２日間放置して結晶化させる。
【００９０】
７）その溶液をろ過し、固体を１０％ＥｔＯＨで洗浄し、真空下で乾燥させて、７０ｇの精製されたビロバライドを得る。
【００９１】
８）４１ｇの精製されたギンコライドおよび３５ｇの精製されたビロバライドを第２項で得られた生成物と混合して、以下の特性を有するイチョウ抽出物８８５ｇを得る：ａ．イチョウフラボングリコシド２７％；ｂ．イチョウテルペン６．８％；ｃ．ギンコール酸１．０ｐｐｍ；ｄ．各農薬＜１０ｐｐｂ。
【００９２】
記載された方法は農薬を除去し、イチョウ抽出物のテルペン含量の制御を可能にし、精製された中間物が混合されるステップにおいて要求に応じてテルペン含量を調整する。実際上、抽出物で理想的とみなされる２４／６の比率（ＧＦＧ／ＧＴ）は、植物において見られる天然の比率としばしば異なる。例えば、中国産の葉は、しばしばより高いテルペン含量を有し、適合する（conforming）抽出物を得るためにイチョウテルペン力価（titre）の低減ステップが必要とされる。
【００９３】
下の表は、上記の手順によって得られる抽出物の農薬含量を示す。各例について２つの試験を実施した：第１試験では特許で開示される手順に正確に従い、第２試験ではテルペン画分の処理が加えられた。
【００９４】
すべての抽出物は、同じ植物から得られた。
【００９５】
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イチョウ抽出物から農薬を除去する方法であって、従来の方法によって得られる抽出物を、以下のステップ：
ａ）ヘキサンで除去できない農薬およびイチョウテルペンを含む中間極性画分、ならびにイチョウフラボングリコシドを含む高極性画分を得るための、前記抽出物の液液抽出ステップ；
ｂ）５０％以上のギンコライド含量を有する中間物を得るための、ステップａ）で得られた中間極性画分からの結晶化ステップ；
ｃ）５０％以上のビロバライド含量を有する中間物を得るための、ステップｂ）で得られた残留溶液からの結晶化ステップ；
ｄ）ステップａ）で得られた高極性画分と、ステップｂ）およびｃ）で得られたイチョウテルペン中間物およびビロバライド中間物との混合ステップ
にかけることを含む方法。
【請求項２】
ステップａ）の抽出が、エステル、塩素化炭化水素、炭化水素とアルコールとの混合物、ケトンおよびケトンとアルコールとの混合物から選択される水非混和性溶媒で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶媒が２〜８の炭素原子数を有するエステルである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
イチョウテルペンの結晶化が水とＣ１〜Ｃ３アルコールとの混合物中で実施される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップｃ）のテルペンに富む画分からの結晶化が、水中または水とＣ１〜Ｃ３アルコールとの混合物中で実施される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
予め定められたイチョウテルペン比率を有する、請求項１から５のいずれかに記載の方法によって得られる抽出物。
【請求項１】
イチョウ抽出物から農薬を除去する方法であって、従来の方法によって得られる抽出物を、以下のステップ：
ａ）ヘキサンで除去できない農薬およびイチョウテルペンを含む中間極性画分、ならびにイチョウフラボングリコシドを含む高極性画分を得るための、前記抽出物の液液抽出ステップ；
ｂ）５０％以上のギンコライド含量を有する中間物を得るための、ステップａ）で得られた中間極性画分からの結晶化ステップ；
ｃ）５０％以上のビロバライド含量を有する中間物を得るための、ステップｂ）で得られた残留溶液からの結晶化ステップ；
ｄ）ステップａ）で得られた高極性画分と、ステップｂ）およびｃ）で得られたイチョウテルペン中間物およびビロバライド中間物との混合ステップ
にかけることを含む方法。
【請求項２】
ステップａ）の抽出が、エステル、塩素化炭化水素、炭化水素とアルコールとの混合物、ケトンおよびケトンとアルコールとの混合物から選択される水非混和性溶媒で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶媒が２〜８の炭素原子数を有するエステルである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
イチョウテルペンの結晶化が水とＣ１〜Ｃ３アルコールとの混合物中で実施される、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップｃ）のテルペンに富む画分からの結晶化が、水中または水とＣ１〜Ｃ３アルコールとの混合物中で実施される、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
予め定められたイチョウテルペン比率を有する、請求項１から５のいずれかに記載の方法によって得られる抽出物。
【公表番号】特表２０１２−５２２８１５（Ｐ２０１２−５２２８１５Ａ）
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０３９０２（Ｐ２０１２−５０３９０２）
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００２０４６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１５５６６
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（５９１０９２１９８）インデナ エッセ ピ ア (52)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２７日（２０１２．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月３１日（２０１０．３．３１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００２０４６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１５５６６
【国際公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【出願人】（５９１０９２１９８）インデナ エッセ ピ ア (52)
【Ｆターム（参考）】
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