ガレクチン−９利用遺伝子治療剤
【課題】ガレクチン９は生体内で様々な生物活性を発揮している。生体内又は細胞内で有効にガレクチン-9活性を有する新規な遺伝子治療剤の提供。
【解決手段】分泌型ガレクチン-9ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を有するベクター、該遺伝子又は該ベクターからなるガレクチン-9感受性の病気又は疾患の遺伝子治療及び／又は予防用剤。抗腫瘍剤（抗がん剤）、抗アレルギー剤、免疫調節剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤として期待できる。
【解決手段】分泌型ガレクチン-9ポリペプチドをコードする遺伝子、該遺伝子を有するベクター、該遺伝子又は該ベクターからなるガレクチン-9感受性の病気又は疾患の遺伝子治療及び／又は予防用剤。抗腫瘍剤（抗がん剤）、抗アレルギー剤、免疫調節剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤として期待できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有効成分として含有するガレクチン-9感受性の病気又は疾患の遺伝子治療及び／又は予防用剤並びにその遺伝子治療及び／又は予防法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガレクチンはβ-ガラクトシドに親和性を持ち、一次配列上に保存された領域を持つレクチンファミリーである。現在までに、10種類以上の哺乳類ガレクチンが発見され、細胞-細胞接着又は細胞-細胞外基質接着、細胞活性化、細胞増殖、アポトーシスなど多彩な生物活性が報告されている。
【０００３】
本発明者等のグループはヒトＴ細胞由来好酸球遊走因子のクローニングに成功し、それによりそれが Tureci 等が報告したヒトガレクチン-9 (human galectin-9: hGal-9、非特許文献１）のバリアント、エカレクチンであることを見出した（非特許文献２）。さらに、本発明者等のグループはエカレクチンとGal-9は同一の物質であることを明らかにし、ヒトのGal-9はそのリンクペプチドの長さの違いにより、ショートタイプ、メディアムタイプ、ロングタイプの3 種類があることをも明らかにした（非特許文献３）。Gal-9含有医薬が、抗腫瘍剤（抗がん剤）、抗アレルギー剤、免疫抑制剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤として有望であることは、WO 2004/064857 (2004.08.05) 〔特許文献１〕に開示してある。Gal-9は、活性化T細胞にアポトーシスを誘導することも報告されている。さらに、安定化Gal-9（Gal-9改変体）及びその用途についてWO 2005/093064 (2005.10.06)〔PCT/JP2005/006580 (2005.03.29):特許文献２〕に開示を行っている。
【０００４】
【特許文献１】WO 2004/064857 (2004.08.05)
【特許文献２】WO 2005/093064 (2005.10.06)
【非特許文献１】Tureci O. et al., J Biol Chem., Mar. 7, 1997, 272(10):6416-22
【非特許文献２】Matsumoto R. et al., J Biol Chem., 1998, 273:16976-84
【非特許文献３】Matsushita N. et al., J Biol Chem., 2000, 275:8355-60
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ガレクチン９は生体内で様々な生物活性を発揮していることが明らかにされつつあるが、天然型ガレクチン９は生体内ではそのリンクペプチドが消化されて速やかにその活性を消失すると考えられる。これを解決する安定化Gal-9（Gal-9改変体）を使用して、ガレクチン９が抗腫瘍剤（抗がん剤）、抗アレルギー剤、免疫抑制剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤として有望であり、さらには活性化T細胞にアポトーシスを誘導するなど、生体にとって重要な機能及び生物活性を示すというデータも得られてきていることから、生体内でより有効に且つ効率的にガレクチン９（又はGal-9改変体）の機能並びに生物活性を利用する手段の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は鋭意研究の結果、シグナルペプチドを付けたガレクチン９（分泌型ガレクチン９）遺伝子を構築し、これを癌細胞に導入したところ優れた結果を得ることに成功した。ガレクチン９はある種の癌細胞にはアポトーシスを誘導するが、分泌型ガレクチン９遺伝子を導入された癌細胞は試験管内で増殖した。これを経静脈的にマウスに移植するとコントロールと比較してこの癌細胞の転移や増殖は抑制され、その結果マウスの延命効果が認められた。この癌細胞は自ら分泌したガレクチン９の多彩な免疫調節作用により、主に局所で活性化された免疫細胞が癌細胞を攻撃したと考えられる。これより、ガレクチン９の患部局所での有効性が再確認された。さらには、分泌型ガレクチン９遺伝子を患者の体内に導入し、患部において薬としてガレクチン９を発現させる遺伝子治療の可能性が示唆された。
【０００７】
本発明では、次なる態様が提供される。
〔１〕(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有効成分として含有することを特徴とするガレクチン-9感受性の病気又は疾患の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
〔２〕(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有している分泌型ガレクチン-9及び／又はその改変体発現ベクターを有効成分として含有することを特徴とする上記〔１〕記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
〔３〕免疫調節剤であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
〔４〕抗腫瘍薬であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
〔５〕脳腫瘍（多型性膠芽腫など）、脊髄腫瘍、上顎洞がん、膵液腺がん、歯肉がん、舌がん、口唇がん、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、肺がん、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道がん、胃がん、大腸がん、胆管がん、胆嚢がん、膵臓がん、肝がん、腎臓のがん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、精巣腫瘍、副腎のがん、子宮頸がん、子宮体がん、膣がん、外陰がん、卵巣がん、繊毛上皮腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、乳がん、皮膚がん、悪性黒色腫、基底細胞腫、白血病、骨髄化性を伴う骨髄線維症、悪性リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、グリオーマなどを包含するがんおよび肉腫からなる群から選択された腫瘍に対する抗腫瘍薬であることを特徴とする上記〔４〕記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【０００８】
〔６〕下記の疾患あるいは病気、又は病的な症状に対するものであることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤：
(A) 炎症性疾患であり、各臓器でおこる種々の急性および慢性炎症、アレルギー性および自己免疫性の炎症、感染症等からなる群から選択されたもの；
(B) 急性および慢性疾患であり、気管支炎、気管支肺炎、間質性肺炎、肺臓炎、細気管支炎、急性縦隔炎を含む肺の疾患、心外膜炎、心内膜炎、心筋炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽頭炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、虫垂炎、虚血性大腸炎、薬物性大腸炎、直腸炎を含む肺以外の他の臓器の疾患、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、劇症肝炎、急性および慢性肝炎や肝硬変、胆嚢炎、急性膵炎、慢性膵炎、急性および慢性腎炎、膜性腎炎、糸球体腎炎、IgA腎症、種々の膀胱炎、脳髄炎、乳腺炎、皮膚炎、表層角膜炎、乾性角結膜炎、中耳炎や鼻炎、副鼻腔炎や鼻茸、歯肉炎、歯周炎、歯周囲炎を含む炎症等からなる群から選択されたもの；
(C) 神経性炎症（例えば、神経性胃炎、神経性膀胱炎など）、がんや炎症に伴う痛みからなる群から選択されたもの；
(D) アレルギー性炎症疾患であり、全身性アナフィラキシー、気管支喘息、過敏性肺炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、免疫複合体がおこすアレルギー性疾患、血管神経性浮腫等からなる群から選択されたもの；
(E) 自己免疫性の炎症（自己免疫疾患）であり、全身性（慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、結節性多発性動脈炎、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病など）、神経系（多発性硬化症、重症筋無力症、HAM（HTLV-1脊髄症）、筋萎縮性側索硬化症など）、内分泌性（バセドウ病、橋本病、1型糖尿病など）、血液（特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血など）、呼吸器（サルコイドーシス、肺繊維症など）、消化管（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、肝臓（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性胆管炎など）、腎・尿路系（抗好中球細胞質抗体関連腎炎、血管炎、Goodpasture症候群、抗糸球体基底膜抗体病など）等からなる群から選択されたもの；
(F) 感染症であり、病原体が生体の細胞・組織・臓器を傷害することによって生じる疾患、あるいはヒトに感染症をもたらす病原体に起因する疾患で病原体が、1）細菌（スピロヘータ、クラミジア、リケッチアを含む）、2）ウイルス、3）真菌、4）植物（藻類）、5）原虫、6）寄生虫（吸虫、条虫、線虫）、7）節足動物からなる群から選択されたもので、細菌性感染症（コレラ、ペスト、大腸菌感染症など）、スピロヘータ感染症（レプトスピラ症など）、クラミジア感染症（オウム病など）、リケッチア感染症（発疹チフス、破傷風など）、ウイルス性感染症（帯状疱疹、ウイルス性出血熱、狂犬病など）、真菌症（ガンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギウス症など）、原虫性疾患（アメーバー赤痢、マラリア、トキソプラズマ症など）、寄生虫（吸虫症、線虫症など）、その他、マイコプラズマ感染症（マイコプラズマ肺炎など）、ミコバクテリア感染症（結核、非定型抗酸菌症など）を含むものから選択されたもの；
(G) 皮膚科領域の疾患であり、i)皮膚感染症、アレルギー性炎症や自己免疫性炎症を含む皮膚炎症や、乾癬、水疱症、膿疱症、角化、角化異常症など特有の炎症を有する皮膚疾患、ii)美容皮膚科関連の障害あるいは老化で、a)メラニン代謝調節（美白）、b)毛髪成長（発毛）の調節、ｃ)コラーゲン産生調節に関わる皮膚科領域の疾患（老化を含む）から選択されたもの；
(H) 生活習慣病であり、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、糖尿病などを含むものから選択されたもの；
(I) 正常細菌叢の維持に関わる異常；
(J) アミロイドーシス、アルツハイマー病、骨粗鬆症、骨折などを含むものから選択されたもの；
(K) 脳、神経領域における炎症反応、例えば、脳梗塞、心筋梗塞等の虚血性病変の進展に伴い生じる炎症、統合失調症；
(L) 痛風；
(M) 骨粗鬆症；又は
(N) 間質性肺炎。
〔７〕(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤。
〔８〕(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有し且つ上記(b)のN末端側に(a)を有していることを特徴とする分泌型ガレクチン-9をコードする遺伝子。
〔９〕上記〔８〕記載の分泌型ガレクチン-9をコードする遺伝子を含有することを特徴とする分泌型ガレクチン-9発現ベクター。
〔10〕(a)分泌シグナルペプチドと(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものとが連結されていることを特徴とするポリペプチド。
〔11〕(a)分泌シグナルペプチドと(b)ガレクチン-9改変体（安定化ガレクチン-9）とが連結されていることを特徴とする上記〔10〕記載のポリペプチド。
〔12〕配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする上記〔10〕又は〔11〕記載のポリペプチド。
〔13〕上記〔10〕〜〔12〕のいずれか一記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴とする遺伝子又はポリヌクレオチド。
〔14〕配列表の配列番号２で示される塩基配列を有することを特徴とする上記〔13〕記載の遺伝子又はポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００９】
分泌型ガレクチン-9及びその改変体（分泌型安定化ガレクチン-9）を細胞内に導入することにより、生体内でより有効に且つ効率的にガレクチン９（又はGal-9改変体）の機能並びに生物活性を利用することが可能である。分泌型ガレクチン９遺伝子をガレクチン-9感受性の病気又は疾患をかかえる患者の体内に導入し、患部において薬としてガレクチン９を発現させることに基づく遺伝子治療が可能となる。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態につき説明する。
WO 2005/093064 (2005.10.06)〔PCT/JP 2005/006580 (出願日2005.03.29)〕に開示のガレクチン-9改変体（安定化ガレクチン９）〔例えば、WO 2005/093064 (2005.10.06)の実施例１で製造取得されているG9NC(null)〔WO 2005/093064 (2005.10.06)の配列番号1で示される塩基配列によりコードされ、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〕〕は、その投与により、癌や難治性の自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症疾患、骨代謝に関わる疾患の治療に有用であることが示されている。該ガレクチン-9改変体（安定化ガレクチン９）〔例えば、G9NC(null)〕の機能及び用途(医薬用途を含む)は、WO 2005/093064 (2005.10.06)に開示されており、その記載は、それを参照することにより本明細書の内容に含まれる。
かくして、解明されたガレクチン９（及びガレクチン-9改変体〔安定化ガレクチン９〕））の機能並びに生物活性を生体内でより効率よく利用することを目指し、シグナルペプチドを付けたガレクチン９（分泌型ガレクチン９）遺伝子を構築した。そして構築された分泌型ガレクチン９発現遺伝子を癌細胞に導入した。ガレクチン９はある種の癌細胞にはアポトーシスを誘導するが、分泌型ガレクチン９遺伝子を導入された癌細胞は試験管内で増殖した。これを経静脈的にマウスに移植するとコントロールと比較してこの癌細胞の転移や増殖は抑制され、その結果マウスの延命効果が認められた。この癌細胞は自ら分泌したガレクチン９の多彩な免疫調節作用により、主に局所で活性化された免疫細胞が癌細胞を攻撃したと考えられる。これより、ガレクチン９の患部局所での有効性が再確認された。さらには、分泌型ガレクチン９遺伝子を患者の体内に導入し、患部において薬としてガレクチン９を発現させる遺伝子治療の可能性が示唆された。
本発明の「ガレクチン-9」 (galectin-9: Gal-9)とは、例えば、Gal-9産生能を有するヒトの白血球や培養株化細胞から産生される天然型ガレクチン-9 (native Gal-9 or naturally-occurring Gal-9) を意味し、さらに、前記白血球や特定の培養株化細胞由来のGal-9をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術により動物細胞や大腸菌などの微生物に組み込んで得られる組換え型ガレクチン-9 (recombinant galectin-9: rGal-9)などを包含する意味であってよく、その何れを意味するものであってもよい。また、当該Gal-9として、２種以上のガレクチン9を発現するように組み合わせたものを用いることも可能である。当該Gal-9は、抗原性の面から見て、ヒトGal-9 (hGal-9)が有利に使用できる。
【００１１】
本明細書中、「ガレクチン-9」(galectin-9: Gal-9)としては典型的には天然型Gal-9が挙げられるが、それと同等の活性を有するものも含まれてよく、例えば、その糖鎖認識部位が保有する特定の糖鎖に対して特異的に結合するといった活性で特徴付けられるものを包含していてよい。天然型Gal-9としては、現在、ロングタイプ（L 型）ガレクチン-9(galectin-9 long isoform or long type galectin-9: Gal-9L)、ミディアムタイプ（M 型）ガレクチン-9(galectin-9 medium isoform or medium type galectin-9: Gal-9M)及びショートタイプ（S 型）ガレクチン-9(galectin-9 short isoform or short type galectin-9: Gal-9S)が報告されているが、Gal-9LはWO 02/37114 A1に開示の配列番号4 の推定リンクペプチド領域によりN端ドメイン(N末端側糖鎖認識部位、N-terminal carbohydrate recognition domain: NCRD)とC端ドメイン(C末端側糖鎖認識部位、C-terminal carbohydrate recognition domain: CCRD)とが連結されたもの、Gal-9Mは該WO 02/37114 A1の配列番号5の推定リンクペプチド領域によりNCRDとCCRDとが連結されたもの、そしてGal-9Sは該WO 02/37114 A1の配列番号6 の推定リンクペプチド領域によりNCRDとCCRDとが連結されたものであると考えられており、Gal-9MではGal-9Lの当該リンクペプチド領域より該WO 02/37114 A1の配列番号7の配列のアミノ酸残基が欠失している点でGal-9Lと異なること、そしてGal-9SではGal-9Mの当該リンクペプチド領域より該WO 02/37114 A1の配列番号8の配列のアミノ酸残基が欠失している点でGal-9Mと異なること、すなわちGal-9SではGal-9L推定リンクペプチド領域より該WO 02/37114 A1の配列番号9 のアミノ酸残基が欠失している点でL 型ガレクチン-9と異なる。ところで、Gal-9Lのアミノ酸配列は、WO 02/37114 A1に開示の配列番号１に、Gal-9Mのアミノ酸配列は、WO 02/37114 A1に開示の配列番号２に、そしてGal-9Sのアミノ酸配列は、WO 02/37114 A1に開示の配列番号３に、それぞれその典型的な配列のものが示されている。
【００１２】
本明細書において、ガレクチン-9としては、上記Gal-9L、Gal-9M及びGal-9S、その他、それらガレクチン-9ファミリーの天然に生ずる変異体、さらにそれらに人工的な変異（すなわち、一個以上のアミノ酸残基において、置換、欠失、付加、修飾、挿入など）を施したものあるいはそれらの一部のドメインや一部のペプチドフラグメントを含むものを意味してよい。WO 2004/064857 (2004.08.05)、J. Biol. Chem., 275 (12): pp. 8355-8360 (2000)に開示のものはすべて含まれてよい。
当該ガレクチン-9には、天然のガレクチン-9バリアント、さらにWO 2005/093064 (2005.10.06)〔PCT/JP 2005/006580 (出願日2005.03.29)〕に開示の「ガレクチン-9改変体」、「ガレクチン-9改変体ポリペプチド」、さらには「ガレクチン-9改変体治療剤」はすべて含まれてよい。特に好ましいものとしては、WO 2005/093064 (2005.10.06)の実施例１で製造取得されているG9NC(null)〔WO 2005/093064 (2005.10.06)の配列番号1で示される塩基配列によりコードされ、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〕が挙げられる。「ガレクチン-9改変体」又は「ガレクチン-9改変体ポリペプチド」のうちには、天然型ガレクチン-9に比して、より安定化された性状を示すものが得られることが認識されており、そうしたものは本明細書において、「安定化ガレクチン-9」と称されてもいる。該安定化ガレクチン-9の代表的なものとしては、上記したG9NC(null)が挙げられるが、これに限定されるものではなく、同様な性状を示すものはそれに含まれてよい。
本明細書に記載の発明は、これまでに公表された研究および特許出願、例えば、WO 2004/064857 (2004.08.05)、WO 2005/093064 (2005.10.06)を参考にしており、その内容は本明細書の開示の中に含められる。
「ガレクチン９改変体」とは、ガレクチン９の糖鎖認識部位が保有する特定の糖鎖に対して特異的に結合するといった活性又はそれと類似した活性（本活性のうちには定性的な活性及び／又は定量的な活性が含まれてよい）を提供する物質をいう。ガレクチン９は、特定の細胞に対してアポトーシス誘導活性を有するが、本ガレクチン９改変体は野生型ガレクチン９が有するアポトーシス誘導活性あるいはそれと類縁の活性を有するものであってよく、ガレクチン９が有する生物活性が改変又は修飾されているものであってよいし、ある場合には好ましい。本発明で特に好ましいガレクチン９改変体とは、生物活性を有する試薬として、臨床検査の分野、分析の分野、あるいは医学又は医薬などの分野で、野生型ガレクチン９よりは好ましい性質を示すものを指す。
【００１３】
本発明では、「遺伝子組換え技術」を利用して所定の核酸（ポリヌクレオチド）や所定のペプチド（ポリペプチド）を構築したり取得すること、また単離・配列決定したり、組換え体を作製したりできる。本明細書中使用できる遺伝子組換え技術（組換えDNA技術を含む)としては、当該分野で知られたものが挙げられ、例えば J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition (1989) & 3rd edition (2001)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995);日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、東京化学同人 (1992); M. J. Gait (Ed), Oligonucleotide Synthesis, IRL Press （1984); B. D. Hames and S. J. Higgins (Ed), Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press Ltd., Oxford, UK (1985); B. D.Hames and S. J. Higgins (Ed), Transcription and Translation: A Practical Approach (Practical Approach Series), IRL Press Ltd., Oxford, UK (1984); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (2nd Edition), John Wiley & Sons, New York (1988); J. H. Miller and M. P. Calos (Ed), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1987); R. J. Mayer and J. H. Walker (Ed), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, (1987); R. K. Scopes et al. (Ed), Protein Purification: Principles and Practice (2nd Edition, 1987 & 3rd Edition, 1993), Springer-Verlag、N.Y.; D. M. Weir and C. C. Blackwell (Ed), Handbook of Experimental Immunology, Vol.1, 2, 3 and 4, Blackwell Scientific Publications, Oxford, (1986); L. A. Herzenberg et al. (Ed), Weir's Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1, 2, 3 and 4, Blackwell Science Ltd. (1997); R. W. Ellis (Ed), Vaccines new approaches to immunological problems, Butterworth-Heinemann, London (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101(Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987); J. H. Miller ed., "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (1991); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 218, Academic Press, New York (1993); S. Weissman (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 303, Academic Press, New York (1999); J. C. Glorioso et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 306, Academic Press, New York (1999); Jeremy Thorner et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 326 to 328, Academic Press, New York (2000); David R. Engelke et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 392, Academic Press, New York (2005)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる (それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる) 〔以下、これら全てを「遺伝子組換え技術」という）。
【００１４】
本発明で使用されるGal-9活性を有するポリペプチド（すなわち、ガレクチン-9又はその改変体（安定化ガレクチン-9））をコードする遺伝子（又はヌクレオチド配列）には、特に限定はなく、上記した本発明で使用されるGal-9活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子又はポリヌクレオチド配列を使用することが出来る。例えば、J. Biol. Chem., 272 (10): pp. 6416-6422 (1997)の第6418頁のFIG. 1の配列、NCBIデータベースのAccession Number NP 033665に示された配列、WO 02/37114 A1に開示の配列表の配列番号1〜3(SEQ ID NO: 1〜3)のいずれかで表されるペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列（又はヌクレオチド配列）、J. Biol. Chem., 273 (27): pp. 16976-16984 (1998)の第16983頁のFig. 8の配列、J. Biol. Chem., 275 (12): pp. 8355-8360 (2000)の第8359頁のTable IIに示されたガレクチン９の変異（同文献の図８参照）を有するペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列（又はヌクレオチド配列）、WO 2005/093064 (2005.10.06)に開示の配列表の配列番号1 (SEQ ID NO: 1)及び配列番号5 (SEQ ID NO: 5)が使用され、その一例として、WO 2005/093064 (2005.10.06)に開示の配列表の配列番号1 (SEQ ID NO: 1)に示す塩基配列を有するもの、さらにWO 2005/093064 (2005.10.06)に開示の配列表の配列番号5 (SEQ ID NO: 5)に示す塩基配列を有するものが挙げられる。
【００１５】
また、天然型のGal-9のアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異が導入されたポリペプチドをコードする遺伝子も使用することができる。例えば、WO 2005/093064 (2005.10.06)に記載のポリペプチドをコードする遺伝子、即ち、G9NC(null)ポリペプチドをコードする遺伝子、Gal-9Mポリペプチドをコードする遺伝子、あるいはGal-9Sポリペプチドをコードする遺伝子が使用される。ガレクチン-9、及びその改変体からなる群から選択されたものをコードする核酸（又はヌクレオチド配列）の配列内には、例えば、選択した宿主細胞で好適に発現するに適した修飾されたコドン（例えば、コドンの置換）を含むようにしてあってよいし、制限酵素部位が設けられていても良い。縮重遺伝子を介して、前記遺伝子とは異なる塩基配列を有する遺伝子も本発明に使用できる。また、本発明に使用されるGal-9活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子には、上記した塩基配列の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつGal-9活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子も含まれる。ハイブリダイゼーションは、例えば、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition (1989) & 3rd edition (2001)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法により実施することが出来る。本明細書で「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例えばナトリウム濃度に関し、約15〜約50mM、好ましくは約19〜約40mM、より好ましくは約19〜約20mMで、温度については約35〜約85℃、好ましくは約50〜約70℃、より好ましくは約60〜約65℃の条件を示し、典型的な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下とは、例えば、6×SSC(1×SSCの組成:150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5% SDS、5×デンハルト、100mg/ml ニシン精子DNAを含む溶液中、プローブとともに65℃で一晩保温するという条件が挙げられる。
【００１６】
本明細書において、「実質的に同等」とはタンパク質の活性、例えば、所定の細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性、抗炎症活性、抗アレルギー活性、免疫調節活性、糖鎖結合活性、生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。さらにまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性を有する場合を包含していてよく、該実質的に同質の活性としては、結合活性、細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性などを挙げることができる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、薬理学的に、あるいは生物学的に同質であることを示す。例えば、結合活性、細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性などの活性が、同等 (例えば、約 0.001〜約1000倍、好ましくは約0.01〜約100 倍、より好ましくは約 0.1〜約20倍、さらに好ましくは約 0.5〜約2 倍) であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的な要素は異なっていてもよい。
【００１７】
本明細書で使用の用語「治療剤」とは、本発明における治療において使用する１つまたはそれ以上のその治療行為を達成するかまたは達成するのに寄与する任意の薬剤であってよい。例えば、治療剤がガレクチン９ポリペプチド(あるいはガレクチン９改変体ポリペプチド)を発現するように設計されたポリヌクレオチドである場合、その薬剤は、哺乳動物に投与されそして細胞で発現することができるポリヌクレオチドである。この場合、薬剤の活性形熊は、発現された分泌型ポリペプチドである。
本発明のガレクチン９利用遺伝子治療剤は、ガレクチン９（又はガレクチン９改変体）の生物活性を遺伝子治療的に利用する治療剤、または天然のガレクチン９(あるいは天然のガレクチン９よりも長く特定の糖鎖に対して結合している活性を有するポリペプチド、マトリックスメタロプロテアーゼなどのタンパク分解酵素に対してネイティブなガレクチン９より安定化されているガレクチン９改変体ポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドを生体内で発現する治療剤である。該治療剤は、単独で、あるいは他の薬剤（例えば、分泌型ガレクチン９（又は分泌型ガレクチン９改変体）発現ベクターの投与と共に使用され且つ特定の腫瘍あるいは自己免疫などに対するその他の公知の処置法に使用されるような薬物、あるいは哺乳動物での分泌型ガレクチン９（又は分泌型ガレクチン９改変体）発現ベクターの発現を容易に行いうるような遺伝子導入用キャリアーなど)と組み合わせて、その治療目的を達成する。例えば、該治療剤は、他の目的のために開発されたガレクチン９（又は分泌型ガレクチン９改変体）自体を含むものであってよく、さらには、ガレクチン９のアゴニスト、ガレクチン９活性を修飾又は調節する薬物を含むものであってよく、例えば、有機低分子化合物又は物質、ペプチド、ペプチド様化合物又は物質、ガレクチン９（又はガレクチン９改変体）ポリペプチドあるいはプロテアーゼに対してネイティブなガレクチン９より安定化されているガレクチン９改変体のキメラ体あるいは変異体などを発現し且つ形質転換された細胞であってよい。
【００１８】
本願発明の遺伝子治療剤には、配合治療剤も包含されてよい。本明細書で「配合治療剤」とは、一緒に投与した場合にそれらの別々の効果を生じるといった、いくつかの成分またはいくつかの薬剤を含有する治療組成物を指しており、それらは疾患などを処置するために一緒に投与された場合に相乗効果を生じるようなものを指してよい。好ましくは、配合治療剤中のいくつかの成分またはいくつかの薬剤のそれぞれにより得られる別々の作用効果は、より大きな治療効果、例えば、腫瘍の消失あるいは正常化、アレルギー症状、炎症症状、免疫不均衡、自己免疫疾患からの回復および長期生存が得られるようにそれを組み合わせることができるのである。配合治療剤を投与して得られる効果の例としては、短期での症状の回復と長期投与の後に得られる症状の回復との組み合わせとか、患者における特定の型の細胞のそれぞれに対する免疫反応あるいは自己免疫応答を減少せしめるといったような効果の組み合わせが挙げられる。本発明の配合治療剤の例としては、分泌型ガレクチン９をコードするポリヌクレオチドとIFN類, IL-2などのサイトカイン類の少なくとも一つをコードするポリヌクレオチドを含んでいる遺伝子導入用ベクターを投与するためのものなどが挙げられる。別の例としては、２つの遺伝子導入ベクターを使用することもでき、例えば、１つは分泌型ガレクチン９を発現するもので、他方はサイトカイン類の少なくとも一つを発現するためのものであってよい。さらに、標的細胞においてアポトーシスを誘導するための分泌型ガレクチン９発現ベクターの投与を見越してアップレギュレートするために、IFN類, IL-2など、あるいはIFN-γなどを発現する遺伝子導入ベクターを投与することもできる。種々の治療剤は、それを同時に供与することもできるし、例えば、治療を効率化するよう、必要に応じて個々の薬剤の１つまたはすべてを繰り返し投与するものであってよく、同一の薬学的に許容される担体中に入れて投与することもできる。
【００１９】
本発明に使用される分泌シグナルペプチド(シグナル配列)をコードする遺伝子（又はヌクレオチド配列: 分泌シグナル）には、特に限定はなく、タンパク質の分泌を指令するものであればよく、例えば、タンパク質を細胞外に分泌させることが出来る任意のシグナルペプチドを使用することが出来る。そして、普通、分泌タンパク質と呼ばれるものは、該シグナルペプチドをそのアミノ末端に有している。これらのシグナルペプチドは、分泌タンパク質をコードする遺伝子（（又はヌクレオチド配列）のコード配列の5'-末端に位置するシグナル配列によってコードされる。これらのシグナルペプチドは、それらが機能的に結合しているGal-9活性を有するポリペプチド（すなわち、ガレクチン-9タンパク質又はその改変体（安定化ガレクチン-9）タンパク質）の細胞外分泌を指令することができる。シグナルペプチドとして、膜転移配列と呼ばれるものあるいはその一部を利用すれば、当該ペプチドあるいはタンパク質の細胞内への輸送を指令することも可能である。かくして、当該遺伝子産物〔Gal-9活性を有するポリペプチド（すなわち、ガレクチン-9タンパク質又はその改変体（安定化ガレクチン-9）タンパク質）〕を、それを産生する細胞以外の細胞に送達することが可能にもなる。かくして、ガレクチン-9又はその改変体（安定化ガレクチン-9）による遺伝子治療技術で優れた作用効果が奏されることになる。
【００２０】
シグナル配列は、通常、疎水性に富んだ配列を有しており、細胞質中でSRP（シグナル認識粒子）により認識され、小胞体へ運ばれるように機能する。運ばれたタンパク質は、Ｎ末端から小胞体中へ陥入し、最終的に小胞体の膜上に存在するようになる。該膜タンパク質は、小胞体からゴルジ体を経て、細胞膜へ移動する経路が知られている。シグナル配列は、最終的にシグナルペプチダーゼの作用により切除される。
シグナルペプチドは、しばしば、20〜40個のアミノ酸残基からなる配列からなり、分泌後は切り取られるが、Ｎ末端側にArg, Lysなどの塩基性アミノ酸残基が位置し、中央部には高い疎水性を与えるアミノ酸残基、例えば、Leu, Ile, Val, Alaなどが占め、そして切断部位にはAlaなどの側鎖の小さなアミノ酸残基を有するという特徴のものが好適に使用されれる。
本発明の分泌シグナルをコードする遺伝子は、公知の方法で化学合成することが出来、また、培養細胞、組織より単離したDNA又はRNAを鋳型としたPCR法、逆転写PCR (polymerase chain reaction coupled reverse transcription; RT-PCR)法、RACE (rapid amplification of cDNA ends)により増幅することで得ることが出来る。また、例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法) (Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487, 1987; Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331, 1986), カセット変異導入法 (cassette mutagenesis: Wells et al., Gene, 34: 315, 1985), 制限部位選択変異導入法 (restriction selection mutagenesis: Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser A, 317: 415, 1986), PCR 変異導入法などを使用することも出来る。
【００２１】
PCR 反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えば R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki,et al., Science, 239: 487, 1988 ; H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、PCR 法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
本発明の分泌シグナルは、本発明のGal-9活性を有するポリペプチドに直接結合していても良く、またスペーサーを介して結合していても良い。
分泌シグナルをGal-9活性を有するポリペプチド（すなわち、ガレクチン-9タンパク質又はその改変体（安定化ガレクチン-9）タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に機能するように連結せしめるには、分泌シグナル源として、公知の分泌発現システム(例えば、分泌タンパク質発現用ベクターなど)や市販の分泌発現システム(例えば、分泌タンパク質発現用ベクターなど)から選択してそれを使用できる。市販分泌タンパク質発現用ベクターは、例えば、Invitrogen社, タカラバイオ社(TaKaRa社), BioLeaders社, GenHunter社, アマシャム バイオサイエンス社, メルク社, Novagen社, クロンテック社(Clontech社), QIAGEN社などより入手できるものが挙げられる。
【００２２】
本発明の遺伝子は、適当なプロモーターと連結し、その制御下で使用することが出来る。該プロモーターとしては、特に限定はなく、例えば、CMVプロモーター、RSVプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、EF1プロモーター、PGKプロモーター、α1ATプロモーター、tieプロモーター、AFPプロモーター、CEAプロモーター、PSAプロモーター、レトロウイルスのLTRプロモーター等が挙げられ、目的に応じて好適なものを選択すれば良い。該プロモーターとしては、組織特異的プロモーターや事象特異的プロモーターを使用してもよく、それを使用することで、組織特異的な発現を行なうことや転写活性が細胞性刺激に対する応答の際に変化するように出来る。組織特異的なプロモーターとしては、特に限定はなく、例えば、インスリンプロモーター、成長ホルモン因子プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、α-アクチンプロモーター、γ-クチンプロモーター、α-ミオシンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、プレプロエンドセリン-1プロモーター、E-セレクチンプロモーター等が挙げられる。事象特異的プロモーターの代表的な例としては、チミジンキナーゼもしくはチミジレートシンターゼプロモーター、αもしくはβインターフェロンプロモーター、さらにホルモン（天然ホルモン、合成ホルモン、または他の非宿主生物からのホルモンのいずれか、例えば、昆虫ホルモンなど) の存在に応答するプロモーターなどが挙げられる。
【００２３】
本発明の遺伝子には、ポリアデニル化シグナル、選択を可能にする選択マーカー、発現制御配列、調節配列、SD配列、制限酵素部位、翻訳終結配列などが連結されていてよい。
本明細書中用語「発現制御配列」や「調節配列」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現に影響を与え、転写や翻訳のためのシグナルを含むといった発現に影響を及ぼすような１つまたはそれ以上の成分を含んでおり且つ当該分野で使用されている配列をいう。本発明のポリペプチドの発現に適している発現制御配列は、ポリペプチドが発現されるべき宿主系によってそれは異なる。
本明細書で使用の用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、RNAまたはDNA、さらにはDNA:RNA ハイブリッドなどの分子をさしており、特定のアミノ酸配列またはその相補鎖をコードするものを含めてよい。本明細書で使用の「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列またはその相補鎖をコードするRNAまたはDNA、さらにはDNA:RNA ハイブリッドなどのいずれかをいう。ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子の3'または5'非翻訳領域のような配列、遺伝子のイントロン、遺伝子のコード領域を構成していないといった遺伝子の他の領域を含んでいてよい。DNAやRNAは、一本鎖または二本鎖であってよい。合成核酸や合成ポリヌクレオチドには、化学的に合成された核酸配列を有するものも含まれてよく、さらに変性に対する抵抗性を分子に与えるために化学的に部分改変しておくこともできる。ポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)増幅、相補的DNAもしくはRNAを使用しての組換え発現などによって製造できるし、あるいは化学合成によって生成させることもできる。
【００２４】
遺伝子治療用ベクター（ビヒクル）(又は遺伝子導入ベクター)は、細胞におけるポリペプチドの発現のためのコード配列を細胞へ導入することを容易になし得るようにする成分を指しており、遺伝子組換え技術を利用して、簡便に得ることができ、哺乳動物における発現のために哺乳動物に導入されるべき本発明のガレクチン-9コード配列、あるいはガレクチン-9改変体コード配列と、そのＮ末端側にシグナル配列を含んでいる構築物（コンストラクト、construct)を運搬するためのもの、あるいは、ガレクチン-9(又はガレクチン-9改変体)の全てもしくは部分であって且つ遺伝子導入されるべき核酸配列（ヌクレオチド配列）並びにシグナル配列を含んでいる該構築物を運搬するためのものである。該細胞は、インビボ(in vivo)遺伝子治療におけるように哺乳動物の体内に存在していてもよいし、エキソビボ(ex vivo)遺伝子治療におけるようにトランスフェクション処理のために一旦哺乳動物から取り出され、ポリペプチドが発現するように処置されてから哺乳動物に戻されたものであってよい。遺伝子治療用ベクターは、例えば、組換えウイルスベクター、プラスミドベクター、ネイキッド核酸分子（例えば、遺伝子)、ポリカチオン分子と複合体化されている核酸分子、リポソームと結合した核酸などであってよいし、宿主細胞に１つ以上の所望の特性を生物学的に有している核酸分子を導入できるといったプロデューサー細胞のような特定の真核生物細胞を包含していてよく、これらは局所的または全身的のいずれかの方法で投与されることのできるものである。所望の特性とは、例えば、タンパク質、酵素、あるいは抗体などのような所望物質を発現する能力及び／又は生物学的活性を提供する能力を含んでいてよい。これらの構築物の細胞内への導入方法としては、公知の方法が使用され、ウイルスベクターによる導入方法、ウイルスベクターを使用しない導入方法の何れも本発明に使用でき、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。該構築物は、インビボ(in vivo)またはエキソビボ(ex vivo)の形で投与されてよく、それらの何れで投与しても良く、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。それらの投与は、ウイルスベクターによるアプローチまたは非ウイルスベクター形式でのアプローチを利用することのできるものである。このようなコード配列を発現するには、内因性の哺乳動物プローモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導することにより行うことができる。インビボでのコード配列の発現は、構成的になされるか、または調節されて行われるかのいずれかである。これらの両方においてまたはそのいずれかにおいて、それらは、例えば、全てのガレクチン-9(又は膜結合型ガレクチン-9改変体)、あるいはガレクチン-9(又はガレクチン-9改変体)の生物学的に活性な部分、バリアント、改変体、誘導体、もしくは融合体などであってよい。所要の遺伝子の共発現を目的としたものも含まれてよい。
【００２５】
本発明は、所要のガレクチン-9の核酸配列、又はガレクチン-9改変体の核酸配列を発現することのできる遺伝子導入ベクター（共遺伝子導入も包含される）を提供する。遺伝子導入ベクターとしては、好ましくは、ウイルスベクターが挙げられ、より好ましくは、レトロウイルス、HIV、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルスまたはアルファウイルスなどのウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターとしては、さらに、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、トガウイルスなどのウイルスベクターも挙げられ、例えば、HVJ Envelope Vector(石原産業)なども挙げられ、目的に応じて好適なものを選択することができる。特にポリヌクレオチドとして導入する場合には、知見が多く、技術も確立し、導入効率も高いウイルス等を担体とする導入方法を採択することが好ましい。たとえば、このポリヌクレオチドを真核細胞用の発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを、たとえばウイルスベクターや生体認識分子を具備した中空ナノ粒子等に組み込むようにして、いわゆる遺伝子治療用ベクターとして、遺伝子治療の手法により生体内の標的細胞等に導入することができる。特にレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが好適に使用され、更に好適にはレトロウイルスベクターが使用される。本発明で使用されるレトロウイルスベクターとしては、特に限定はないが、例えば、MFGベクター(ATCC No.68754)、α-SGCベクター(ATCC No.68755)、LXSNベクター（バイオテクニクス(Biotechniques)、第７巻、第980〜990頁 (1989))、pDON-AI（宝酒造社製）等が挙げれる。当該遺伝子導入ベクターに関しては、一般には、D. Jolly, Cancer Gene Therapy, 1(1): 51-64 (1994); O. Kimura et al., Human Gene Therapy, 5: 845-852 (1994); S. Connelly et al., Human Gene Therapy, 6: 185-193 (1995); M.G. Kaplitt et al., Nature Genetics, 8: 148-153 (1994)などを参照することができる。
【００２６】
レトロウイルスベクターは、当該分野でよく知られており、例えば、B型、C型、およびD型レトロウイルス、xenotropicレトロウイルス（例えば、NZB-X1, NZB-X2, NZB9.1 (R. R. O'Neill, J. Virol., 53: 100-106 (1985)参照)など）、polytropicレトロウイルス（例えば、MCF, MCF-MLV (M. Kelly, J. Virol., 45: 291-298 (1983) 参照)など）、スプマウイルス、レンチウイルスなど（R.L.Weiss et al. (Eds.), RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1985参照）を含む任意のレトロウイルス遺伝子治療ベクターが本発明において使用可能であろう。
遺伝子治療レトロウイルスベクターの一部は、異なっているレトロウイルス由来のものであってよい。例えば、レトロベクターのLTRはネズミザルコーマウイルス由来のものであってよいし、tRNA結合部位はラウスザルコーマウイルス由来のものであってよいし、パッケージングシグナルはネズミ白血病ウイルス由来のものであってよいし、第二鎖合成オリジンはトリ白血症ウイルス由来のものであってよい。これらの組換えレトロウイルスベクターは、それらを適切なパッケージング細胞株に導入することによって形質導入可能なレトロウイルスベクター粒子を形成せしめるのに使用することができる（米国特許第5,591,624号明細書参照）。レトロウイルスベクターは、インテグラーゼという目的DNAを宿主細胞のDNA中に部位特異的に組み込む能力を有する組換え酵素をレトロウイルス粒子内に持つようにすることで構築することができる。組換えウイルスベクターとしては、複製能欠損組換えウイルスであることが好ましい。
上記のレトロウイルスベクターとの使用に適しているパッケージング細胞株としては、当該分野でよく知られたものが挙げられ、また、容易に調製されることができる（米国特許第6,013,517号明細書, WO 92/05266参照）。当該パッケージング細胞株は、組換えベクター粒子を産生するためのプロデューサー細胞株（ベクター細胞株, vector cell line: VCL)を作製するのに使用することができる。好ましくは、パッケージング細胞株は、ヒト血清中で不活化することがないようにして、ヒトの親細胞（例えば、HT1080細胞）またはミンクの親細胞株から作製される。
【００２７】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築に好ましいレトロウイルスとしては、トリ白血症ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネズミ白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、ネズミザルコーマウイルス、網細内皮症ウイルス、ラウスザルコーマウイルスなどが挙げられる。ネズミ白血病ウイルスとして特に好ましいものとしては、例えば、4070Aおよび1504A (Hartley & Rowe, J. Virol., 19: 19-25 (1976))、Abelson (ATCC No. VR-999)、Friend (ATCC No. VR-245)、Graffi, Gross (ATCC No. VR-590)、Kirsten、ハーベイザルコーマウイルス並びにRauscher (ATCC No. VR-998)、及びモロニーマウス白血病ウイルス(ATCC No. VR-190)などが挙げられる。
このようなレトロウイルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC, Rockville, Maryland, USA)のような寄託機関または保存機関から入手可能であるか、あるいは、一般に利用可能な技術を使用して既知の供給源から単離することができる。
本発明で使用可能な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターの例としては、GB 2200651, EP 0415731, EP 0345242, WO 89/02468, WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03662, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 93/10218, WO 91/02805、米国特許第5,219,740号明細書、同第4,405,712号明細書、同第4,861,719号明細書、同第4,980,289号明細書、同第4,777,127号明細書、同第5,591,624号明細書、Vile, Cancer Res, 53: 3860-3864 (1993), Vile, Cancer Res, 53: 962-967 (1993), Ra, Cancer Res, 53: 83-88 (1993), Takamiya, J Neurosci Res, 33: 493-503 (1992), Baba, J Neurosurg, 79: 729-735 (1993), Mann, Cell 33: 153 (1983), Cane, Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6349 (1984), Miller, Human Gene Therapy, 1: 5-14 (1990)などに記載されたものが挙げられる。
【００２８】
ヒトのアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、本発明で使用可能であり、例えば、Berkne, Biotechniques, 6: 616 (1988); Rosenfeld, Science, 252: 431 (1991); WO 93/07283; WO 93/06223; WO 93/07282などを参照することができる。本発明で使用可能な既知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターの例としては、上記の参考文献に記載されているものや、例えば、WO 94/12649; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984; WO 95/00655; WO 95/27071; WO 95/29993; WO 95/34671; WO 96/05320; WO 94/08026; WO 94/11506; WO 93/06223; WO 94/24299; WO 95/14102; WO 95/24297; WO 95/02697; WO 94/28152; WO 94/24299; WO 95/09241; WO 95/25807; WO 95/05835; WO 94/18922; WO 95/09654などに記載されているものが挙げられる。また、Curiel, Human Gene Therapy, 3: 147-154 (1992)に記載されているように死んでいるアデノウイルスに連結されたDNAを投与することによってもよい。
【００２９】
また、本発明の遺伝子導入ベクターとしては、アデノウイルス随伴ウイルス(AAV)ベクターが挙げられる。このようなベクターのうち本発明での使用のための好ましい例としては、WO 93/09239に開示されているような、AAV-2に基づいたベクターが挙げられる。最も好ましいAAVベクターとしては、２つのAAVの逆末端反復配列を含むものである。このものは、天然のD配列がヌクレオチド置換によって改変されており、その結果、少なくとも５つの天然型のヌクレオチドおよび18個までの天然型ヌクレオチド（好ましくは、少なくとも10個の天然型ヌクレオチドおよび18個までの天然型ヌクレオチド、最も好ましくは、10個の天然型ヌクレオチド) が維持されているものであり、D配列の残りのヌクレオチドは欠失しているかまたは非天然型のヌクレオチドで置換されているものである。AAV逆末端反復領域の天然型のD配列は、各AAV逆末端反復配列中に20個の連続するヌクレオチドを有する配列（すなわち、各末端に１つの配列が存在するもの) であり、このものはHP形成には関与してはいないものである。非天然型の置換されたヌクレオチドは、同じ部位で天然型のD配列中に見出されるヌクレオチドとは異なっている任意のヌクレオチドであってよい。他の使用可能なAAVベクターの例としては、pWP-19、pWN-1などが挙げられる（Nahreini, Gene, 124: 257-262 (1993))。このようなAAVベクターの別の例としては、psub201などが挙げられる(Samulski, J. Virol., 61: 3096 (1987))。別のAAVベクターの例としては、Double-D ITRベクターなどが挙げられる。Double-D ITRを作製する方法は、米国特許第5,478,745号明細書に開示されている。またそれに加えて、AAVベクターは、例えば、米国特許第4,797,368号明細書、同第5,139,941号明細書、同第5,474,935号明細書、WO 94/288157号などに開示のものが挙げられる。本発明で利用可能なAAVベクターの別の例としては、SSV9AFABTKneoが挙げられ、このものは、AFPエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含んでおり、さらに肝臓で優先的に発現せしめることに向けられたものである。その構造並びに作製方法は、Su, Human Gene Therapy, 7: 463-470 (1996)に開示されている。別のAAV遺伝子治療ベクターとしては、米国特許第5,354,678号明細書、同第 5,173,414号明細書、同第 5,139,941号明細書、同第 5,252,479号明細書などに記載されているものが挙げられる。
【００３０】
本発明の遺伝子治療ベクターは、ヘルペスベクターであってもよい。主なヘルペスベクターの好ましい例としては、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含んでいる単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第5,288,641号明細書およびEP 0176170に開示されるベクター) が挙げられる。さらなる単純ヘルペスウイルスベクターの例としては、WO 95/04139などに開示されるHFEM/ICP6-LacZ, Geller, Sclence, 241: 1667-1669 (1988)、WO 90/09441、WO 92/07945などに記載されるpHSVlac, Fink, Human Gene Therapy, 3: 11-19 (1992)に記載されるHSV Us3::pgC-lacZ、EP 0453242 Aに記載されるHSV7134, 2RH 105およびGAL4、寄託番号ATCC VR-977およびATCC VR-260としてATCCに寄託されているベクターなどが挙げられる。
本発明においては、アルファウイルス遺伝子治療ベクターを使用することもできる。好ましいアルファウイルスベクターとしては、シンドビスウイルスベクター、トガウイルス、Semliki Forestウイルス(ATCC VR-67; ATCC VR-1247)、Middlebergウイルス(ATCC VR-370)、Ross Riverウイルス(ATCC VR-373; ATCC VR-1246)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532)、米国特許第5,091,309号、同第5,217,879号、およびWO 92/10578に記載されるベクターなどが挙げられる。また、使用可能なアルファウイルスベクターとしては、米国特許第5,091,309号明細書、同第5,217,879号明細書、同第5,843,723号明細書、同第6,376,236 号明細書、WO 94/21792、WO 92/10578、WO 95/07994などに記載されるものも挙げられる。このようなアルファウイルスは、ATCC (Rockville, Maryland, USA)のような寄託機関または保存機関から入手可能であるか、あるいは、一般に利用可能な技術を使用して既知の供給源から単離することができる。好ましくは、細胞傷害性が低減せしめられているアルファウイルスベクターを使用することができる（米国特許第6,391,632号明細書参照) 。
DNAベクター系（例えば、真核生物階層型発現系(eukarytic layered expression system)など)は、本発明の分泌型ガレクチン９あるいは分泌型ガレクチン９改変体の核酸を発現するために有用である。真核生物階層型発現系の詳細については、WO 95/07994を参照することができる。好ましくは、本発明の真核生物階層型発現系としては、アルファウイルスベクターに由来するものが挙げられ、好ましくは、シンドビスウイルスベクターに由来するものが挙げられる。
【００３１】
本発明での使用に適した他のウイルスベクターとしては、ポリオウイルス（例えば、ATCC VR-58, Evans, Nature, 339: 385 (1989), Sabin, J. Biol. Standardization, 1: 115 (1973)などに記載されているウイルスなど);ライノウイルス（例えば、ATCC VR-1110およびArnold, J. Cell Biochem, L401-405 (1990)に記載されるウイルスなど);ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスウイルスなど) またはワクシニアウイルス（例えば、ATCC VR-111, ATCC VR-2010など、Fisher-Hoch, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 317(1989), Flexner, Ann NY Acad Sci, 569: 86 (1989), Flexner, Vaccine, 8: 17 (1990)、米国特許第4,603,112号明細書及び同第4,769,330号明細書、並びにWO 89/01973に記載されるウイルスなど); SV40ウイルス（例えば、ATCC VR-305およびMulligan, Nature, 277: 108 (1979)およびMadzak, J. Gen. Vir, 73: 1533(1992)に記載されるウイルスなど);インフルエンザウイルス（例えば、ATCC VR-797など)、米国特許第5,166,057号明細書、Enami, Proc Natl Acad Sci USA, 87: 3802-3805(1990), Enami & Palese, J Virol, 65: 2711-2713 (1991), Luytjes, Cell, 59: 110 (1989), McMicheal., N E J Med, 309: 13 (1983), Yap, Nature, 273: 238 (1978)、及びNature, 277: 108(1979)などに記載されているような逆遺伝学技術を用いて作製された組換えインフルエンザウイルス；EP 0386882、Ruchschacher, J. Vir., 66: 2731 (1992)などに記載されているヒト免疫不全症ウイルス(HIV)；麻疹ウイルス（例えば、ATCC VR-67, VR-1247 並びにEP 0440219に記載されているウイルスなど) ；アウラウイルス（例えば、ATCC VR-368など) ；ベバルウイルス（例えば、ATCC VR-600およびATCC VR-1240など) ；Cabassouウイルス（例えば、ATCC VR-922 など) ；チクングニヤウイルス（例えば、ATCC VR-64, ATCC VR-1241など); Fort Morganウイルス（例えば、ATCC VR-924など) ；ゲタウイルス（例えば、ATCC VR-369, ATCC VR-1243など); Kyzylagachウイルス（例えば、ATCC VR-927など);マヤロウイルス（例えば、ATCCVR-66など);ムカンボウイルス（例えば、ATCC VR-580, ATCC VR-1244など) ; ヌヅムウイルス（例えば、ATCC VR-371など);ピクスナウイルス（例えば、ATCC VR-372, ATCC VR-1245など); Tonateウイルス（例えば、ATCCVR-925など);トリニティウイルス（例えば、ATCC VR-469など);ユナウイルス（例えば、ATCC VR-374など);ワトロアウイルス（例えば、ATCC VR-926など); Y-62-33ウイルス（例えば、ATCC VR-375など) ；O'Nyongウイルス、東部脳炎ウイルス（例えば、ATCC VR-65, ATCC VR-1242など);西部脳炎ウイルス（例えば、ATCC VR-70, ATCC VR-125L, ATCC VR-622, ATCC VR-1252など);コロナウイルス（例えば、ATCC VR-740, Hamre, Proc Soc Exp Biol Med, 121: 190 (1966)に記載されるウイルス) に由来するベクターなどが挙げられる。
【００３２】
ウイルスベクターを使用しない導入方法としては、特に限定はないが、例えば、ネイキッドDNA法、マイクロインジェクション法、リガンド-DNA複合体法、リポフェクション法、リポソーム法、赤血球ゴースト法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、遺伝子銃法等が挙げられ、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。
Ex vivo法で投与する場合は、常法に従って本発明の遺伝子の導入が望まれる細胞、例えば、造血幹細胞、リンパ球、血管内皮前駆細胞等を採取し、採取された細胞に本発明の遺伝子を上記した方法によって導入し、得られた細胞を生体内に戻すことにより本発明の遺伝子を投与することが出来る。
In vivo法で投与する場合、例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内に投与、あるいは腎臓、肝臓、肺、脳、神経、心臓等の疾患の対象部位に直接投与することが出来る。製剤形態には、特に限定はないが、例えば注射剤とすることが出来る。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（HVJ)-リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
これら各種の遺伝子導入の方法は、細胞や器官等の大きさ、種類等によって適宜に採択することができる。
本明細書で用語「ネイキッドDNA」とは、哺乳動物での発現のために哺乳動物へ投与されるポリヌクレオチドDNAを指していてよい。ポリヌクレオチドとしては、例えば、コード配列であってよく、ポリヌクレオチドDNAは、一旦DNAが細胞内に入るとコード配列が容易に発現するように発現制御配列に直接的または間接的に結合しているものであってよい。間接的な結合としては、哺乳動物細胞でのDNAの発現を容易にする目的で調節領域とコード配列を結合するためとか、他の配列を組み込むのを容易にするなどのため、リンカーまたはスペーサーを介して２つのポリヌクレオチド領域を一緒に結合することを含んでいてよい。
【００３３】
本明細書で「ベクター」とは、１つ又は複数の目的の配列または遺伝子の発現を指示することのできる集合体（アセンブリ）を指している。ベクターは、転写プロモーター／エンハンサー、１または複数の遺伝子座を規定しているエレメント、さらにはオールターナティブ・スプライシング、核RNA輸送、メッセンジャーの翻訳後に起こる修飾、あるいはタンパク質の転写後に起こる修飾などといった過程を指示又は制御している他の遺伝子が発現するのを制御しているその他のエレメントを任意に含んでいなければならない。
さらに、ベクターは、転写される場合に、１つ又はそれ以上の目的の配列または遺伝子に作動可能に連結され、且つ翻訳開始配列として作用するような配列を含まなければならない。必要に応じて、ベクターは、ポリアデニル化を指示するシグナル、Neo、TK、ハイグロマイシン、ブレオマイシン（フレオマイシン）、ヒスチジノール、DHFRなどのような選択マーカー、１つ又はそれ以上の制限酵素部位および翻訳終結配列を含んでいてよい。さらに、ベクターがレトロウイルス中に配置される場合、ベクターは、パッケージングシグナル、長末端反復配列（LTR) 、そして、もしそれが無いなら、使用されるレトロウイルスに適したプラス鎖やマイナス鎖のプライマー結合部位を含まなければならない。
遺伝子治療技術は、例えば、日経サイエンス,1994年4月号,20-45頁、月刊薬事,36(1),23-48（1994）、実験医学増刊,12(15)(1994)、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」,羊土社（1996）などを参照できる。
【００３４】
本明細書で「患者」とは、生きている生物で任意の治療又は予防処置可能なものをさしてよく、真核生物または原核生物を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、患者である真核生物としては、脊椎動物であってよい。したがって、例えば、患者は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、ヒトが挙げられる。
本発明のガレクチン９利用遺伝子治療剤の１つの態様では、ガレクチン９が保有する生理活性又は生物活性の不足又は欠如に起因する疾患・病気・異常状態を処置する技術を提供する。該処置技術としては、例えば、分泌型ガレクチン９発現ベクターを提供する工程及び／又は当該疾患などを有する哺乳動物に有効量の分泌型ガレクチン９を発現せしめる工程などが挙げられる。ガレクチン９（又はガレクチン９改変体）利用遺伝子治療剤及び／又は遺伝子治療法は、悪性腫瘍細胞に対する細胞傷害活性、悪性腫瘍細胞に対してのアポトーシス誘導活性、悪性腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性（抗がん活性）、活性化T細胞のアポトーシス誘導活性、特にCD4陽性T細胞のアポトーシス誘導活性、免疫調節活性、抗炎症作用、抗アレルギー作用を発揮することから、抗腫瘍剤（抗がん剤）、抗アレルギー剤、免疫調節剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤として期待できるものである。該処置技術は、活性化Ｔ細胞が顕著な自己免疫疾患を処置する方法を包含する。「自己免疫疾患」、および「自己免疫」とはすべて、哺乳動物での自己免疫によって特徴づけられる障害（これは、自己成分に対する免疫系の応答である)をいう。自己免疫応答は、臨床的兆候を現す症状に進展し得るものである。厳密にいえば、移植拒絶は自己免疫反応ではないが、患者が症状的に細胞、組織、または器官を置換したりあるいは移植するといった外科手術を受ける場合、同種移植を受ける体というものは、外来移植に対して免疫学的に反応するものである。種の１つのメンバーから他の種への、細胞、組織、または器官の同種移植中に、受容体（レシピエント）では移植された細胞、組織、または器官を拒絶するのに十分な免疫応答が生じる場合では、「移植拒絶」が起こるのである。
【００３５】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤によって処置することができる「腫瘍」の例としては、悪性腫瘍が含まれていてよく、例えば、転移をする腫瘍は悪性腫瘍で、一般的にその悪性腫瘍は上皮性と非上皮性のものがあるとされ、ある場合には、がん、肉腫、白血病などに区分して考えられることもあるが、単に「がん」と呼んだ場合、一般人では悪性腫瘍を指すことが多い。本明細書で「がん」とは、広い意味で解釈してよく、単に上皮性の悪性腫瘍と解釈すべきではない。本明細書において「がん」とは、上皮性悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍（腫瘍形成性のものも非形成性のものも含む）を包含していてよく、皮膚がん〔メラノーマ（悪性黒色腫）を含めてよい〕、乳がん、卵巣がん、子宮がん（子宮頸がん、子宮体がんを含めてよい）、膣がん、外陰がん、陰茎がん、睾丸悪性腫瘍（精巣腫瘍を含めてよい）、前立腺がん、膀胱がん、腎がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、咽頭・喉頭がん（上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん）、舌がん、口唇がん、歯肉がん、上顎がん、食道がん、胃がん、結腸・直腸がん（大腸がん）、肺・気管支がん、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、肝がん（肝細胞癌、肝内胆管がんを含む）、肝外胆管・胆嚢がん、膵臓がん、膵液腺がん、白血病、悪性リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、基底細胞腫、繊毛上皮腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、悪性血管腫、悪性血管内皮腫、脊髄腫瘍、脳腫瘍（メニンギオーマ、グリオーマ、アストロサイトーマなどを含む）等が挙げられるが、これらに限定されることなく、本発明のガレクチン９（又はガレクチン９改変体）利用遺伝子治療用剤を使用することで好ましい結果が得られるもの、さらには当該分泌型ガレクチン９（又はガレクチン９改変体）が関与して何らかの生理的又は生物学的な応答が得られるものは含まれてよいと理解されるべきである。
【００３６】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤によって処置することができる「自己免疫疾患」の例としては、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、グッドパスチャー(Goodpasture)症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、変形性関節症、慢性関節炎リウマチ、抗コラーゲン抗体による強皮症（schleroderma)、複合化結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自発性不妊症、糸球体腎炎、水疱性類天庖瘡、アドレナリン作用性薬物耐性、慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫ベースの内分泌腺不全、白斑、脈管炎、心筋梗塞後遺症（post-myocardial infarction)、心臓穿孔症候群、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫ベースの喘息、自己免疫ベースの炎症性反応、肉芽腫症障害、強直性（alkylizing)脊椎炎、連鎖球菌感染後(poststreptococcal)糸球体腎炎、自己免疫溶血性貧血、脳炎、リンパ腫に対する二次的自己免疫反応、変性障害、萎縮性障害などが挙げられる。レセプター自己免疫を表す自己免疫疾患としては、例えば、グレーブス病、重症筋無力症、インスリン耐性症などが挙げられる。アドレナリン性薬物耐性の自己免疫疾患としては、例えば、喘息および嚢胞性線維症などが挙げられる。
本発明における他の自己免疫疾患としては、例えば、動物モデルが存在するものが挙げられ、例えば、シェーグレン症候群（自己免疫涙腺炎(dacryodentis)または免疫媒介唾液腺炎)、自己免疫心筋炎、原発性胆汁性肝硬変（PBC)、炎症性心臓病、水銀誘導性腎自己免疫、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病またはIDD)、胸腺切除術後自己免疫、中枢神経系（CNS)脱髄障害、CNS狼瘡、睡眠発作、免疫媒介PNS障害、変形性関節症、慢性関節炎リウマチ、ブドウ膜炎、髄質嚢胞性線維症、自己免疫溶血性疾患、自己免疫脈管炎、卵巣自己免疫疾患、ト強皮症（scheroderma)などが挙げられる。中枢神経系（CNS)脱髄障害によって特徴づけられる自己免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症（MS)などが挙げられる。末梢神経系（PNS)自己免疫疾患は、例えば、ギヤン−バレー症候群（GBS)であってよい。
【００３７】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤によって処置することができる「炎症性疾患」としては、各臓器でおこる種々の急性および慢性炎症、アレルギー性および自己免疫性の炎症、感染症等が挙げられる。急性および慢性疾患としては、肺炎では、例えば、気管支炎、気管支肺炎、間質性肺炎、肺臓炎、細気管支炎や急性縦隔炎などが挙げられ、さらにその他の臓器の炎症、例えば、心外膜炎、心内膜炎、心筋炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽頭炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、虫垂炎、虚血性大腸炎、薬物性大腸炎、直腸炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎などの種々の急性および慢性肝炎や肝硬変、胆嚢炎、急性膵炎、慢性膵炎、また急性および慢性腎炎、膜性腎炎、糸球体腎炎、IgA腎症などや、種々の膀胱炎、脳髄炎、乳腺炎、皮膚炎、表層角膜炎、乾性角結膜炎、種々の中耳炎や鼻炎、副鼻腔炎や鼻茸など、歯肉炎、歯周炎、歯周囲炎など、種々様々な炎症が含まれる。
また神経性炎症（例えば、神経性胃炎、神経性膀胱炎など）にも有効と考えられる。例えば、分泌型ガレクチン9発現ベクターで遺伝子治療すると、カプサイシン誘導神経性皮膚炎症において、その炎症反応に対する強い抑制効果を得ることが可能と考えられる。カプサイシンは末梢神経を刺激することにより、神経性炎症や痛みを引き起こす物質である。カプサイシンは、知覚神経C線維末端に貯蔵されている神経ペプチドであるサブスタンスPの遊離刺激作用を有する。サブスタンスPは肥満細胞からヒスタミンを遊離させる作用を有し、その結果血管が拡張され、浮腫が生じる。また、遊離されたヒスタミンにより知覚神経が刺激を受け、C線維末端からサブスタンスPが放出され、その周囲の肥満細胞に作用し、更にヒスタミンを遊離させるという増強サイクルが成立する。分泌型ガレクチン9の発現はこの病態形成の抑制作用を有すると期待される。
さらに、カプサイシンは、感覚神経終末の痛み受容センサーであるカプサイシン受容体（バニロイドレセプター）に結合し、痛みを引き起こす。痛みは化学的刺激（酸など）、熱刺激（熱湯など）や過剰な機械的刺激（打撲など）によって感覚神経終末が活性化されることによって引き起こされ、カプサイシン受容体はこのような刺激による痛みにも関与している。そこで、分泌型ガレクチン9による遺伝子治療処理で、カプサイシン受容体による神経終末の活性化を抑制でき、がんや炎症に伴う痛みの軽減等、鎮痛作用への可能性も期待できる。
【００３８】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤によって処置することができる「アレルギー性疾患」あるいは「アレルギー性炎症疾患」としては、全身性アナフィラキシー、気管支喘息、過敏性肺炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、免疫複合体がおこすアレルギー性疾患、血管神経性浮腫等が挙げられる。
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤は免疫性疾患にも有効と考えられる。リウマチなどを含む免疫性疾患、および炎症性腸疾患、間質性膀胱炎及びその他のマスト細胞の無秩序な活性化が発症に関与する病気又は疾患なども含まれてよい。
また、自己免疫性の炎症（自己免疫疾患）には、全身性（慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、結節性多発性動脈炎、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病など）、神経系（多発性硬化症、重症筋無力症、HAM（HTLV-1脊髄症）、筋萎縮性側索硬化症など）、内分泌性（バセドウ病、橋本病、1型糖尿病など）、血液（特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血など）、呼吸器（サルコイドーシス、肺繊維症など）、消化管（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、肝臓（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性胆管炎など）、腎・尿路系（抗好中球細胞質抗体関連腎炎、血管炎、グッドパスチャー症候群、抗糸球体基底膜抗体病など）等がある。
【００３９】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤によって処置することができる「感染症」としては、病原体が生体の細胞・組織・臓器を傷害することによって生じる疾患が包含され、監修：町並陸生、編集：秦順一、坂本穆彦、「標準病理学（第2版）」、医学書院、2002年3月15日発行を参考にすることができる。ヒトに感染症をもたらす病原体には、1）細菌（スピロヘータ、クラミジア、リケッチアを含む）、2）ウイルス、3）真菌、4）植物（藻類）、5）原虫、6）寄生虫（吸虫、条虫、線虫）、7）節足動物がある。各病原体がもたらす主な疾患には、細菌性感染症（コレラ、ペスト、大腸菌感染症など）、スピロヘータ感染症（レプトスピラ症など）、クラミジア感染症（オウム病など）、リケッチア感染症（発疹チフス、破傷風など）、ウイルス性感染症（帯状疱疹、ウイルス性出血熱、狂犬病など）、真菌症（ガンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギウス症など）、原虫性疾患（アメーバー赤痢、マラリア、トキソプラズマ症など）、寄生虫（吸虫症、線虫症など）、その他、マイコプラズマ感染症（マイコプラズマ肺炎など）、ミコバクテリア感染症（結核、非定型抗酸菌症など）が挙げられる。例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、成人T細胞白血病ウイルス(ATL)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)などのレトロウイルス及びそれに関連する病気又は疾患に対しても有効と考えられる。
【００４０】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤は皮膚科領域にも適用でき、例えば、1)皮膚疾患には、感染症、アレルギー性炎症や自己免疫性炎症を含む炎症や、乾癬、水疱症、膿疱症、角化、角化異常症など特有の炎症がある。また、2)美容皮膚科関連としては、a)メラニン代謝調節（美白）〔分泌型ガレクチン９遺伝子導入メラノーマ細胞での黒色調から白色に変化。皮膚基底細胞層での分泌型ガレクチン９感受性細胞〕、b)毛髪成長（発毛）の調節、ｃ)コラーゲン産生調節などが挙げられる。
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤は生活習慣病に適用でき、該生活習慣病としては、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、糖尿病などが挙げられる。生活習慣病動脈硬化症の病態形成に関与する細胞の一つである泡沫細胞にgal9陽性細胞と陰性細胞が存在することが明らかになっている。このことより動脈硬化症の病態にはgal9の関与が示唆され、それを制御することで治療や予防することが可能となることが否定できない。高血圧では動物実験モデルにて高血圧発症の際にガレクチン９が尿細管や糸球体の発現が増強することからガレクチン９発現を制御したり、分泌型ガレクチン９発現ベクターを投与することによって治療できる可能性が高い。
また、正常細菌叢の維持にも適用でき、例えば、gal9は腸管の上皮に正常においても強く発現されており、また悪玉細菌叢を投与した際には、腸管上皮及びマクロファージなどの炎症細胞におけるガレクチン９の発現が増強する。このことから消化管における正常細菌叢の維持にガレクチン９が関与していることが強く示唆される。
【００４１】
さらに、アミロイドーシスに適用でき、例えば、アミロイドーシスを認める部分でのマクロファージでは、ガレクチン９発現を示すマクロファージの存在がある。分泌型ガレクチン９発現によってアミロイド沈着を制御できる可能性がある。
アルツハイマー病、骨粗鬆症、骨折などにも有用と考えられ、例えば、アルツハイマー病患者の脳において変性した神経細胞はガレクチン９陽性所見を示す。よって、治療に用いることが出来る可能性がある。また、骨粗鬆症では、ガレクチン９には、骨吸収は抑制し骨形成は促進する可能性が考えられる。このような作用は、骨代謝の面から考えると理想的な薬剤と考えられる。
また、脳、神経領域においても有用で、例えば、脳梗塞、心筋梗塞等の虚血性病変の進展は、炎症細胞の湿潤を伴い、スーパーオキサイド産生等が起こり、悪化する。その炎症をガレクチン９並びにガレクチン９改変体が制御することが期待できる。炎症、免疫系の変化が原因となる脱骨髄性疾患として、例えば多発性硬化症などがある。変性疾患として、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病なども挙げられる。また、統合失調症は何らかの炎症性の変化が原因と言われている。すなわち、EPA（エイコサペンタエン酸）は脳で炎症反応の制御や神経細胞膜の形成に用いられる。統合失調症患者では細胞膜中のEPAやその他の必須脂肪酸が枯渇していることを示す研究例がある。
【００４２】
痛風に対してもガレクチン９並びにガレクチン９改変体が有用と期待でき、本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤が有用と考えられる。尿酸結晶の組織沈着に対する痛みの強い急性炎症に対してもガレクチン９並びにガレクチン９改変体がそれを制御することが期待でき、本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤が有用と考えられる。
喘息は可逆性の気道閉塞（喘息発作）を来たす呼吸器疾患で、抗原特異的（アレルゲン）あるいは非特異的（感染、冷気など）な刺激に対する気道の反応性が亢進している状態を指している。近年、喘息の気道には発作のない安定期にも好酸球、Ｔリンパ球、及び肥満細胞を主体とした炎症が存在することが証明され、現在、喘息の本体は慢性の気管支炎であると考えられている。また、小児喘息の多くはアトピー素因(IgE産生)との関連が強いが（アトピー型喘息）、成人喘息ではIgEの関与が証明できないものが約半数に認められる（非アトピー型喘息）。喘息予防・管理ガイドライン（1998年厚生省研究班）が作成され、喘息治療は急性発作と慢性気道炎症の二つに分けて行われている。発作治療薬としては、気管支拡張薬（β2刺激薬、アミノフィリン）が第一選択薬として用いられているが、中等症以上の発作ではこれらの薬剤では不十分で、ステロイド薬の大量全身投与が行われる。ステロイド薬は副作用が大きく、特に、消化性潰瘍、高血圧、高血糖、精神症状等が重大で、長期に使用すれば、感染症、副腎抑制、骨粗鬆症などが問題となってくる。また、合併症を伴う場合は、ステロイドの使用は危険を伴う。副作用が少なく、ステロイドと同等の効果を持つ薬剤の開発が求められている。長期的な管理薬として慢性気道炎症の治療には抗炎症薬が主体となっているが、なかでも吸入ステロイド薬の使用が推奨されている。該ステロイド薬を長期に大量に使用した場合、副腎抑制、骨粗鬆症、気道感染などの副作用が出現する可能性は否定できない。また、吸入薬は正確な吸入手技が要求され、内服薬に比較してコンプライアンスという点で劣っている。中等症以上の喘息では、吸入ステロイド薬に加えて、吸入β2刺激薬、ロイコトリエン拮抗薬あるいは徐放性テオフィリン薬の併用が推奨されている。重症例ではステロイドの全身投与が余儀なくされている。こうした薬剤に代わる薬剤の開発が求められている。
【００４３】
喘息の病態形成において、Ｔリンパ球、好酸球の肺組織及び気道への浸潤が重要な役割を果たすことが知られている。一方、ガレクチン９は、細胞のアポトーシスを誘導する機能を有し、活性化Ｔ細胞及び好酸球のアポトーシスを誘導する。こうしたことを踏まえたガレクチン９改変体などを使用した研究から、ガレクチン９並びにガレクチン９改変体が喘息における気道炎症を改善（抑制）する活性を有することが明らかにされており、本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤が有用と考えられる。
さらに、ガレクチン９並びにガレクチン９改変体は、骨芽細胞増殖と分化の増強及び破骨細胞分化抑制活性を有しており、骨粗鬆症の予防及び／又は治療、ステロイド長期投与で問題となる副作用の一つ、骨生育抑制に対しても有効であると考えられ、本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤が有用と考えられる。
ガレクチン９並びにガレクチン９改変体は、リンパ球に対する作用においてステロイドとは異なり、活性化リンパ球特異的な抑制作用を示し、ステロイドに比して副作用、例えば、免疫抑制が少ないことが期待できるので、本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤も有用と考えられる。また、ステロイドに存在しない接着分子の機能抑制及び神経性炎症の抑制作用を示して、喘息治療、例えば、発作治療薬として有望である。またステロイドの副作用を軽減することも可能と思われる。
【００４４】
本発明の活性成分は、本明細書で説明している、(a) 分泌型ガレクチン９あるいは分泌型ガレクチン９改変体及びそれと実質的に均等な生物活性を有するポリペプチドなど、(b) 分泌型ガレクチン９あるいは分泌型ガレクチン９改変体及びそれと実質的に均等な生物活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、(c) 分泌型ガレクチン９あるいは分泌型ガレクチン９改変体発現技術を利用して見出された因子など、(d) 分泌型ガレクチン９あるいは分泌型ガレクチン９改変体及びそれと実質的に均等な生物活性を有するポリペプチド遺伝子導入ベクターなどが挙げられ、それらはヒトガレクチン９が正常細胞には傷害活性を示さず、腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示すという性状、腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導するが、正常細胞にはアポトーシスを誘導しないという性状、悪性細胞の転移性を抑制するという性状、活性化された免疫細胞、特には活性化したCD4陽性T細胞のアポトーシスを誘導する活性（これに対しレスティングT細胞、特にCD4陽性T細胞（ヘルパーT細胞）のアポトーシス誘導はそれを誘導しないという性状）などを利用する上で有用であり、抗腫瘍剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤、副腎皮質ステロイドホルモンと同様な活性を利用する薬剤として有望である。
複数の遺伝子導入ベクターを、動物または植物に投与することができる。好ましい実施態様において、動物は温血動物であり、さらに好ましくは、マウス、ニワトリ、ウシ、ブタ、例えば、ネコおよびイヌなどのペット 、ウマ、およびヒトからなる群より選択される。
【００４５】
ポリペプチド発現に有用な遺伝子治療剤（例えば、天然または改変体の分泌型ガレクチン９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなど) 関しては、組織を標的とした投与では、患者（例えば、哺乳動物) におけるポリヌクレオチド発現に応じて、コード配列または非コード配列を発現することが可能な構築物を含むベクターを次のように投与できる: 局所的投与の遺伝子治療プロトコルでは、約100ng〜約200mg DNA、あるいは約500ng〜約50mg DNA、または約１μg〜約2mg DNA、あるいは約5μg DNA 〜約500μg DNA 、そして遺伝子治療プロトコルにおける局所投与の間では、約20μg 〜約100μg の範囲、そして例えば、注射あたりまたは投与あたり約500μg の用量で投与することができる。より多くの発現が所望される場合では、組織のより広い領域にわたって、より多くの量のDNAまたは同じ量のDNAが連続投与プロトコルに従い再投与されようし、例えば、腫瘍部位の異なる近接または密接した組織部分へいくつか投与され、そうしたことは陽性の治療結果をもたらすために必要とされよう。
本発明の活性成分は、その投与量を広範囲にわたって選択して投与できるが、その投与量及び投与回数などは、処置患者の性別、年齢、体重、一般的健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療を行なっている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。
明細書及び図面において、用語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【００４６】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
なお、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、DNA クローニングではJ. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition (1989) & 3rd edition (2001) ", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York及び D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); PCR 法を使用する場合には、H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) 及び M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols", Academic Press, New York (1990)に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書(protocols) や添付の薬品等を使用している。
G9NC(null)は、PCT/JP 2005/006580 (出願日2005.03.29)に開示され、PCT/JP 2005/006580の実施例１で製造取得されている。
【実施例１】
【００４７】
〔B16/F10細胞への遺伝子導入〕
マウス悪性黒色腫由来のB16/F10細胞を用いたマウス肺転移モデルにおいて、ガレクチン９改変体による癌細胞の転移抑制効果を認めている（図１および図２）。
そこで、マウス悪性黒色腫由来のB16/F10細胞に(a)シグナルペプチドを有しない野生型マウスガレクチン9M(mGal-9M)の発現ベクターおよび(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(mGal-9M)(分泌型マウスガレクチン9)の発現ベクター、さらに(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトした細胞株を樹立した。
ガレクチン-9の発現を構成的に促進させた癌細胞株を樹立する目的で、マウスガレクチン-9発現プラスミドを作成し、メラノーマ細胞B16/F10に導入した。以下に実験の概略を述べる。
樹立した遺伝子導入細胞は、(a)B16/F10細胞にマウスガレクチン9(M)(mGal-9M)をトランスフェクトした細胞(mGal-9)と(b)シグナルペプチドを付加したマウスGal-9Mをトランスフェクトすることにより、マウスGal-9Mを恒常的に分泌する(sec mGal-9)細胞と(c)各細胞のコントロールとなるmockベクターを導入した細胞(mock)の３種類である。
マウスガレクチン-9の塩基配列は、J. Biol Chem., 1997: 272(9), pp.6078-6086に記載されている。
【００４８】
〔ガレクチン９発現ベクターの作製〕
マウスガレクチン-9発現のために用いた２種類の発現プラスミドのひとつは発現ベクターpCXN2のプロモーター下流にマウスガレクチン-9遺伝子を挿入したpCXN2/mG9であり、もうひとつはpSecTag2/HygroB(Invitrogen)由来のシグナルペプチドをコードする塩基配列をマウスガレクチン-9遺伝子の上流にフレームが合うように連結し、これをpCXN2のプロモーター下流に導入したpCXN2/Igk-mG9である。pCXN2/mG9では天然型のガレクチン-9が細胞質中に蓄積し、一方pCXN2/Igk-mG9ではシグナルペプチドの働きでガレクチン-9がERを経由する古典的な経路で細胞外に分泌される。
作製したヒトおよびマウスガレクチン発現プラスミドは定法に基づき癌細胞に導入した。ここではリポフェクション法（キットはQiagen社やGibco社などから発売）を用いたがその他の方法、たとえばリン酸カルシウム共沈法やエレクトロポレーション法なども同様の目的に使用可能である。安定発現株のクローニングには遺伝子導入操作を施した細胞を抗生物質存在下で培養し、耐性となった株を選択した。マウスガレクチン-9発現プラスミドを用いた場合にはG-418を、ヒトガレクチン-9発現プラスミドを用いた場合にはハイグロマイシンBを選択のための抗生物質として用いた。以下にマウス悪性黒色腫細胞B16/F10へのマウスガレクチン-9遺伝子導入の具体例を挙げる。すなわち、作成したプラスミドをB16/F10細胞に導入した。また、コントロールとしてpCXN2をB16/F10細胞に導入した
【００４９】
〔B16/F10細胞の培養〕
B16/F10細胞は10% FBS(JRH)加RPMI(SIGMA)培地で培養した。2×105個の細胞を75cm2フラスコ(SUMILON)に播き、2日後に回収し継代する。2日間で約10倍に増殖する。継代数が多くなった細胞は使用しない。回収時に細胞の一部を遺伝子導入に使用した。
【００５０】
〔遺伝子導入法〕
B16/F10細胞への遺伝子導入には、カチオン性脂質LipofectamineTM2000試薬（invitrogen, No.11668-027）によるDNA導入法を用いた。方法は「真核細胞への遺伝子導入ガイド」（Invitrogen）内のLipofectamineTM2000試薬96-ウェルトランストランスフェクションの迅速代替プロトコールに従って行った。
(1) Opti-MEMTMI培養液（Invitrogen）で各DNAを320ng/25μLに調製し、各ウェルに25μLずつ添加した。
(2) LipofectamineTM 2000試薬(invitrogen)1.0μLをOpti-MEMTMI培養液25μLに加えた脂質試薬希釈液を調製した。
(3)希釈したDNA((1))を含む各ウェルに脂質試薬希釈液((2)) 25μLを添加し、室温で20分間反応させた。
(4)各ウェルにB16/F10細胞を1×105/100μL（10% FCS加RPMI）ずつ添加して軽く混合後、24時間培養した。
(5) 選択培地 G418（250μg/mL）加RPMIを用いて、遺伝子導入した細胞をセレクトした。
遺伝子導入細胞によるガレクチンの発現はガレクチン-9に特異的なELISAおよびウエスタン解析によって確認した。以下にB16/F10細胞にガレクチン-9発現プラスミドを導入した細胞を用いた場合のウエスタン解析の具体的な方法を挙げる。
【００５１】
〔ウエスタン・ブロッティング〕
ウエスタン・ブロッティング法でmouse-Gal-9を検出測定した。
〔1)細胞の培養方法〕
使用した細胞は(a)B16/F10細胞にマウスガレクチン9(M)(mGal-9M)をトランスフェクトした細胞(mGal-9)と(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9(M)をトランスフェクトすることにより、マウスガレクチン9(M)(mGal-9M)を恒常的に分泌する(sec mGal-9)細胞と(c)各細胞のコントロールとなるmockベクターを導入した細胞の（mock）の３種類である。全ての細胞は10%FBS（JRH）加RPMI(SIGMA)培地で培養した。 2×105個の細胞を75cm2フラスコ(SUMILON)に播き、2日後に回収し継代を行う。2日間で約10倍に増殖する。継代数が多くなった細胞は使用しない。
〔2)サンプルの作製〕
細胞を３日間培養し、その培養上清を採取し、サンプルとした。
【００５２】
〔3)ウエスタン・ブロッティング法〕
2×サンプルバッファー（0.125M Tris-HCl(pH6.8),10% 2-Mercaptoethanol, 4% SDS, 10% Sucrose, 0.004% Bromophenol blue）で細胞数1×106/50μLに調整し、ゲルに10μLずつ(2×105個)アプライし、泳動装置で泳動した(20mA、1時間)。分子量マーカーとしてPrecision Protein Marker, Broad Range (BioLabs)を使用した。次に転写装置で100V、1時間転写し、終了後、洗浄バッファー(0.05% Tween 20加TBS(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl）、Tween-TBS)で2回洗浄した。その後5%スキムミルク加Tween-TBSに浸け、4℃でオーバーナイトでブロッキングを行った。翌日、5μg/mLの一次抗体 (Polyclonal Anti-mouse G9)を室温にて1時間反応させた。反応後、洗浄バッファーで5回洗浄した。次に二次抗体 (AP-Goat Anti-rabbit IgG(H+L): ZYMED, 65-6122)を室温にて1h反応させた。洗浄バッファーで5回洗浄後、Alkaline Phosphatase Substrate Kit II <VECTOR Black> (フナコシ)を用いて、発色させた。
各遺伝子導入した細胞の培養上清を抗マウスガレクチン９ポリクローナル抗体によるウエスタン・ブロッティング法によりガレクチン９分泌を確認したところ、分泌型マウスガレクチン９を導入したB16/F10細胞の培養上清中にのみガレクチン９が検出された（図３）。
【実施例２】
【００５３】
〔B16/F10細胞により遺伝子治療の可能性〕
遺伝子導入したB16/F10細胞とそのコントロールB16/F10細胞のそれぞれを、マウスの尾静脈に投与し、肺への転移を肺の結節数をカウントして調べることにより、ガレクチン−９を利用した遺伝子治療の可能性を検討した。
1)細胞の培養方法
本発明者等が樹立した上記のB16/F10細胞にマウスガレクチン9(M)(mGal-9M)をトランスフェクトした細胞(mGal-9)と、シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9(M)をトランスフェクトすることによりマウスガレクチン9(M)(mGal-9M)を恒常的に分泌する(sec mGal-9)細胞と、各細胞のコントロールとなるmockベクターを導入した細胞(mock)の３種類を使用した。全ての細胞は10% FBS(JRH)加RPMI(SIGMA)培地で培養した。 2×105個の細胞を75cm2フラスコ(SUMILON)に捲き、2日後に回収し継代を行う。2日間で約10倍に増殖する。継代数が多くなった細胞は使用しない。
【００５４】
2)転移モデルにおけるガレクチン９の効果判定実験
1)の方法にて培養した各遺伝子導入B16/F10細胞を回収し、PBS(-)で2回洗浄後（遠心:1500rpm, 5min）、各細胞を2×105個/200μLになるようにPBS(-)で調製した。調製した各細胞をC57/BL6マウス (SLC、6週令、雌) 1匹あたり2×105個/200μL、27ゲージの注射針で尾静脈内に投与した。接種後10日目にネンブタール（大日本製薬）による麻酔を行い、脱血死後、肺の結節数をカウントした。肺の結節数をノンパラメトリックなマン・ホイットニーのU検定(Mann-Whitney's U test)で解析した。
得られた結果を図４（肺の結節数）に示す。分泌型マウスガレクチン９遺伝子細胞投与群（sec mGal-9群）で明らかな転移の抑制が認められた。肺の結節数の比較では、mock導入細胞投与群（mock群）では127.2±17.99であるのに対してマウスガレクチン９遺伝子導入細胞投与群（mGal-9群）では112.6±12.47で有意差は認められないが、sec mGal-9群では9.6±5.6となり、mock群と比較してp<0.0001で有意性が認められた（マン・ホイットニーのU検定）。さらに、肺の外観を図５に示した。個々の転移巣のサイズはmock群やmGal-9群と比較するとsec mGal-9群が有意に小さかった。
【００５５】
3)転移モデルにおけるガレクチン９の効果判定実験
2)と同様に各遺伝子導入B16/F10細胞を回収し、C57/BL6マウス(SLC、6週令、雌) 1匹あたりに各遺伝子導入B16/F10細胞5×105個/200μL、27ゲージの注射針で尾静脈内に投与した。マウスの生存率を測定し、Kaplan-Meier検定にて解析した。得られた結果を図６（生存率）に示す。すなわち、同様の系において生存率を比較したところ、やはりsec mGal-9群では、mock群と比較してp<0.0001で有意に延命効果が認められた(Kaplan-Meier検定)。
【実施例３】
【００５６】
〔皮下移植モデルでの遺伝子治療の可能性〕
マウス肝癌由来のMH-134細胞を用いた皮下移植モデルにおいても遺伝子治療の可能性を検討した。
(a)野生型マウスガレクチン9Mの発現ベクター、(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(分泌型マウスガレクチン９)の発現ベクターと(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトしたMH-134細胞を樹立した。これらの細胞をマウスに皮下移植し、腫瘍重量と動物の生存率を調べた。
1)細胞の培養方法
遺伝子導入細胞の作製は、B16/F10細胞と同様に行った。実験には、MH134細胞にマウスガレクチン9(M)をトランスフェクトした細胞(mGal-9)と、MH134細胞にシグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9(M)をトランスフェクトすることにより、マウスガレクチン9(M)を恒常的に分泌する(sec mGal-9)細胞と、各細胞のコントロールとなるMH134細胞にmockベクターを導入した細胞(mock)の３種類を使用した。
全ての細胞は10%FBS(JRH)加RPMI(SIGMA)培地で培養した。2×105 個の細胞を75cm2フラスコ (SUMILON)に捲き、2日後に回収し継代を行う。2日間で約10倍に増殖する。継代数が多くなった細胞は使用しない。
【００５７】
2)癌性腹膜炎モデルにおけるガレクチン９の効果判定実験
1)の方法にて培養した各細胞を回収し、PBS(-)で2回洗浄後（遠心:1500rpm, 5min）、各細胞を2.5×106個/200μLになるようにPBS(-)で調製した。調製した各細胞をC3H/HeNマウス (日本クレア：6週令、♀) 1匹あたり2.5×106個/200μL、26ゲージの注射針で皮下に投与した。週に3回腫瘍の大きさとマウスの生存率を測定した。腫瘍の容積（V）は次式：
V=1/2×長軸×短軸の二乗
により計算して求めた。得られた結果を図７（腫瘍重量）に示す。
3)統計処理
2)で得た動物の生存率を Kaplan-Meier検定で解析した。得られた結果を図８（生存曲線）に示す。
(a)野生型マウスガレクチン9Mの発現ベクター、(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(分泌型マウスガレクチン９)の発現ベクターと(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトしたMH-134細胞を樹立し、これらの細胞をマウスに皮下移植し、腫瘍重量（図７）と生存率（図８）を調べた。かくして、このモデルにおいても分泌型マウスガレクチン９遺伝子導入細胞投与群において、明らかな腫瘍増殖抑制効果と延命効果が認められた。癌細胞移植後24日目のマウスを図９に示す。
以上のことより、分泌されたガレクチン９が抗腫瘍活性（転移抑制、腫瘍増殖抑制、宿主延命）を有することが明らかとなり、分泌型ガレクチン９発現ベクター導入による遺伝子治療の可能性と有用性が示唆された。
【実施例４】
【００５８】
(i) 分泌型ガレクチン-9作成のためには真核生物由来の各種分泌シグナルを用いることができる。同目的に汎用される市販の発現ベクターにはプレプロトリプシンのシグナルを用いたもの（pFLAG-CMV シリーズ、Sigma）、アルカリホスファターゼのシグナルを用いたもの（pAPtag シリーズ、GenHunter）や Ig kappa のシグナルを用いたもの（pSecTag シリーズ、Invitrogen）などがあり、いずれも有効に用いることが出来る。
分泌型ヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミドの作製には、ヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミドpET11a-hG9NC(null)を出発材料として用いた。このプラスミド作成法は既にWO2005/093064(公開日:2005年10月06日、当該出願の優先権主張の基礎出願である特願2004-287005（出願日: 2004年09月30日）の明細書の段落番号〔0092〕から〔0096〕）に示されているので概略を説明する。Jurkat細胞より定法に基づきcDNAを調製し、それからガレクチン-9のN-末端側糖鎖結合ドメインとC-末端側糖鎖結合ドメインをコードする遺伝子をPCR法にて増幅した。それらをpET11aベクター(Novagen)のNdeI-BamHI siteに挿入してリンカーペプチドを欠く、ヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミドpET11a-hG9NC(null)を作成した。このプラスミド上のヒト安定化ガレクチン-9の遺伝子には5'-側と内部に各１箇所NdeI siteが存在しているので後のクローニング操作を容易にするために、先ずPCR法によって内部のNdeI site(catatg)をcacatgに変異させ、NdeI siteを欠失させた。次にNdeI-XbaIで消化し、ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子の5'-側にSfiI-XbaIアダプター(5'-ctagagttggcctg-3'(配列表の配列番号５)と5'-tacaggccaact-3'(配列表の配列番号６)をアニールさせたもの)を挿入した。このプラスミドをSfiI消化して末端をT4 DNAポリメラーゼを用いて平滑化し、続いてHindIII消化してヒト安定化ガレクチン遺伝子を含むDNA断片を取り出し、発現ベクターpSecTaq2/HygroA(Invitrogen)のSfiI-HindIII site(SfiI siteは切断後T4 DNA ポリメラーゼで平滑化)に挿入して分泌型ヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミドpSecTag2/HygroA siganl-hG9NC(null)を作製した。
【００５９】
構築された分泌型ヒト安定化ガレクチン-9の遺伝子配列(配列表の配列番号２)と予想されるアミノ酸配列(配列表の配列番号１)を図10に示す。下線部はシグナル配列、ボックスで囲まれた配列はクローニングにより新規に生じた配列、その後にヒト安定化ガレクチン-9の配列（2-296 aa）が続く。矢印は予想されるシグナル切断部位。影をつけた配列cacatgはcatatg(NdeI site)に変異を導入してNdeI siteを欠失させた部分。この変異導入によるアミノ酸配列置換は無い。またpSecTag2/HygroA signal-hG9NC(null)の全塩基配列(配列表の配列番号４)を図11〜13に示す。
図14に、分泌型ヒト安定化ガレクチン発現プラスミドを導入したCOS7細胞からのガレクチン分泌を調べた結果（ＡはELISAでの解析、Ｂはウエスタン解析）を示す。図14Bのアローヘッドは非特異的シグナル、矢印は分泌されたガレクチン-9のシグナルを示す。遺伝子配列から想定される分子量は33 kDaであるが、33-40 kDa付近に４本のバンドが見られる。これは分泌されたヒトガレクチン-9が様々な程度の糖鎖修飾を受けていることも考えられる。図３には、マウスガレクチン-9発現プラスミドを導入したB16/F10細胞でのウエスタンブロッティングの結果が示してある。これらの結果より、遺伝子導入によってガレクチン-9 が培養液中に分泌されることが確認された。
【００６０】
(ii) 構築したヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミド(hG9NC(null)を発現するプラスミド)をメラノーマ細胞B16/F10細胞に導入した。
樹立した遺伝子導入細胞は、B16/F10細胞にシグナルペプチドを付加したヒト安定化ガレクチン-9をトランスフェクトすることにより、ヒト安定化ガレクチン-9を恒常的に分泌する細胞(sec hGal-9細胞)と各細胞のコントロールとなるmockベクターを導入した細胞の（mock）の2種類である。作製したヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミドは定法に基づき癌細胞に導入した。ハイグロマイシンBを用いて、安定化発現株のクローニングを行った。また、コントロールとしてpSecTag2/HygroAをB16/Ｆ10細胞に導入した。
各細胞への遺伝子の導入確認はPCRで行った（図15参照）。
【００６１】
遺伝子導入確認の具体的な方法は以下のようにして実施した。
(1) 細胞の培養方法
使用した細胞は、sec hGal-9細胞とコントロールとなるmockを導入した2種類である。全ての細胞は10%FBS（JRH）加えRPMI(SIGMA)培地で培養した。 2X105 個の細胞を75cm2フラスコ (SUMILON)に蒔き、2日後に回収し継代を行った。継代数が多くなった細胞は使用しない。
(2) Total RNAの単離
1×106cellsのB16/F10細胞をPBS(-)で洗浄し、ISOGEN（(株)ニッポンジーン(Nippon Gene Co., Ltd.)）、TRIzolTM(invitrogen Life technologies, Catalog No. 15596-026)を500μL加え、22G針付きシリンジで30回ホモジナイズした。100μLのクロロホルムを加え、15秒間ボルテックスで撹拌し、室温に3分間置いた。13000 rpm、15分、4℃で遠心し、透明層を別のエッペンに移し、250μLのイソプロパノールを加え、室温に10分放置。13000 rpm、10分、4℃で遠心後、500μLの80%エタノールを加え、9500 rpm、5分、4℃で遠心。上清を捨てた後、DEPC処理水に懸濁した。試薬はRNase freeを使用した。
(3) RT-PCR
RT-PCR反応は、 GenAmpTM RNA PCR キット(PERKIN ELMER, N808-0017)を用いて、方法は添付のプロトコールに従って行った。
PCR tube(TakaRa)に上記サンプル0.5μg/2-3μL, Master Mix 20μL [25mM MgCl2 solution 4μL, 10×PCR Buffer II 2μL, (dGTP, dATP, dTTP, dCTP mix) 2μL, RNase inhibitor 1μL, Oligo d(T)16 1μL, RNase free water を加えtotal 20μLにする]、MuLV Reverse Transcriptase 1μLを入れて、ピペッティングした。RT-PCR装置（BIO RAD iCyclerTM）にセットし、次の条件で (42℃: 15min, 99℃: 5min, 4℃) RT反応を行った。
RT後のサンプル5μL、目的配列のprimer (あるいはPositive control primer) 0.5μL, PCR Master Mix [25mM MgCl2 solution 2μL,10×PCR Buffer II 4μL, 蒸留水 37.75μL]を混合し、AmpliTaqTM DNA polymerase 0.25μLを入れてピペッティングした。PCRの装置にセットして、次の条件[94℃:1min, (94℃:30sec, 60℃:15sec, 72℃:1min) 30cycle, 72℃:7min, 4℃] で反応を行った。
【００６２】
Primer sequence
hGal9S(10μM) 5'-GAGAGGAAGACACACATGCCTTTC-3' (配列表の配列番号７)
hGal9AS(10μM) 5'-GACCACAGCATTCTCATCAAAACG-3' (配列表の配列番号８)
【００６３】
positive control
GAPDH GSPDH-S1(20μM) 5'-GCCATCAATGACCCCTTCATTGAC-3' (配列表の配列番号９)
GAPDH GSPDH-AS1(20μM) 5'-ACGGAAGGCCATGCCAGTGAGCTT-3' (配列表の配列番号10)
【００６４】
(4) 電気泳動
上記サンプル5μLに蒸留水（4μL）と1μLの10×Loading Buffer（TakaRa:1% SDS, 50% Glycerol, 0.05% Bromophenol Blue）の計10μLを、2％アガロースゲルのウェルにアプライし、100Vで25分間、電気泳動した。
【実施例５】
【００６５】
〔分泌型ヒト安定化ガレクチン発現プラスミドを導入したB16/F10細胞の解析〕
(1) ウエスタン・ブロッティング法およびELISA法により分泌型ヒト安定化ガレクチン発現プラスミドを導入したB16/F10細胞からのガレクチンの分泌を調べた。
1)細胞の培養方法
培養方法は、マウスガレクチン-9をトランスフェクトしたB16/F10細胞の方法に準じた。
sec hGal-9細胞とコントロールとなるmockを導入した2種類の細胞は、10%FBS（JRH）加RPMI(SIGMA)培地で培養した。 2X105 個の細胞を75cm2フラスコ (SUMILON)に捲き、2日後に回収し継代を行う。2日間で約10倍に増殖する。継代数が多くなった細胞は使用しない。
2)サンプルの作製
細胞を3日間培養し、その培養上清を採取し、サンプルとした。
3)ウエスタン・ブロッティング法
電気泳動法およびウエスタン・ブロッティング法は、マウスガレクチン-9をトランスフェクトしたB16/F10細胞のウエスタン・ブロッティング法に準じた。
本法における使用抗体は、一次抗体には抗ヒトガレクチン-9CTポリクローナル抗体を、二次抗体としてAP-Goat Anti-rabbit IgG(H+L)（ZYMED, 65-6122）を使用した。
4）ELISA法
抗ヒトガレクチン-9モノクローナル抗体とポロクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA法にて解析した。Standardとして、ヒト安定化ガレクチン-9を用いた（3ng/mL〜1pg/mL）。二次抗体には、Anti-rabbit IgG-HRP (1:1000) (Amersham Biosciences: NA934V)使用した。TMB (KPL 50-76-00)を発色基質とし、1Mリン酸 (Wako 167-02166) で、反応を停止させ、450の吸光度をプレートリーダーで培養上清中の安定化ガレクチン9量を測定した。
【００６６】
分泌型遺伝子を導入したB16/F10細胞からのガレクチン分泌を調べた結果（図16はELISAでの解析、図17はウエスタン・ブロッティングによる解析）を示す。図17の矢印は分泌されたガレクチン-9のシグナルを示すが、分泌されたガレクチン-9は33〜45kDa付近に数本（3〜4本）のバンドが認められる。これは培養上清中に分泌されたヒトガレクチン-9が様々な程度の糖鎖修飾を受けていることも考えられる。分泌型遺伝子を導入したB16/F10細胞の培養上清中のELISA法によるヒトガレクチン-9の検出結果も示した。これらの結果より、遺伝子導入によってガレクチン-9が培養液中に分泌されることが確認された。
【００６７】
(2) 細胞増殖能の解析
テトラゾリウム塩WST-1〔2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt〕を使用したWST-1法にて細胞増殖を解析した。WST-1は生細胞においてのみフォルマザンに分解される。フォルマザン色素量を吸光度計によって測定することにより、生細胞数を定量的に解析することができる。
具体的には96wellプレート(FALCON)にsec hGal-9およびmockをトランスフェクトしたB16/F10細胞を播種し（1×104/100μL）、24時間培養した。24時間培養後、WST-1 (Roche) を10μL入れ、2時間培養し、450nm〜600nmの吸光度をプレートリーダーで計測した。
図18に分泌型ガレクチン-9遺伝子およびコントロールベクター mockを導入した細胞の増殖能の解析結果を示したが、特に違いは認められなかった。
【００６８】
(3) 遺伝子治療の可能性 (in vivo 実験)
前出のように、マウス悪性黒色腫由来のB16/F10細胞を用いたマウス肺転移モデルにおいて、ガレクチン-9改変体による癌細胞の転移抑制効果が認められている。シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン-9(M)（sec mGal-9）遺伝子導入細胞を用いた担癌モデル（実施例２および３）においても、分泌されたガレクチン９が抗腫瘍活性を有することを明らかにした。
そこで、シグナルペプチドを付加したヒト安定化ガレクチン-9 (sec hGal-9)の遺伝子を導入したB16/F10細胞を用いた転移モデルにおいて、分泌型ヒトガレクチン９の効果を評価した。
(i) 方法
マウスガレクチン遺伝子導入細胞におけるモデル実験に準じた。
sec hGal-9とmock細胞は10%FBS(JRH)加RPMI (SIGMA)培地で培養した。
2×105 個の細胞を75cm2フラスコ(SUMILON)に捲き、2日後に回収し継代を行う。継代した各遺伝子導入B16/F10細胞を回収し、PBS(-)で2回洗浄後（1500rpm, 5min）、細胞濃度が2×105個/200μLになるようにPBS(-)で調製した。調製した各細胞をC57BL/6マウス（SLC, 6週齢の♀）1匹あたり2×105個/200μL、27ゲージの針で尾静脈に投与した。sec hGal-9/K4群(n=10)、mock群(n=10)。投与後19日目に解剖し、肺の結節数をカウントした。肺の結節数はノンパラメトリックなマンホイットニーのU検定で解析した。残りのマウス(n=7)は引き続き生存率を測定し、Kaplan-Meier検定にて解析した。
【００６９】
(ii) 結果
肺の結節数を図19に示した。分泌型ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子導入細胞投与群(sec hGal-9)では明らかな転移の抑制が認められた。肺の結節数は、mock群では131.7±15.78であるのに対して、sec hGal-9群では7±0.78と有意な差（p<0.01）が認められた（マンホイットニーのU検定）。肺の外観を図20に示した。個々の転移巣のサイズはmock群と比較するとsechGal-9群では、明らかに小さい。
生存率を図21に示す。同モデルにおいて生存率を比較したところ、mock群と比較してsec hGal-9群では有意（p<0.01）に延命効果が認められた（Kaplan-Meier検定）。
尚、この転移抑制ならびに延命効果は、ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子を導入B16/F10細胞のサブクローンにおいても同様な結果が得られている。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、有効成分として分泌型ガレクチン-9又はその改変体を発現するベクターを使用することで、細胞内を含めた生体内において、ガレクチン-9が発揮する生物活性を利用可能にして、ガレクチン-9感受性の病気又は疾患に対する遺伝子治療技術（遺伝子治療剤及び遺伝子治療法を包含する）を提供する。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
SEQ ID NO: 1, Description of Artificial Sequence: Designed polypeptide for secretory human galectin-9 mutein (hG9NC(null))
SEQ ID NO: 2, Description of Artificial Sequence: Polynucleotide for secretory hG9NC(null)
SEQ ID NO: 3, Description of Artificial Sequence: Polynucleotide for secretory hG9NC(null)
SEQ ID NO: 4, Description of Artificial Sequence: Full-length nucleotide sequence for pSecTag2/HygroA signal-hG9NC(nulll)
SEQ ID NO: 5, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for an adaptor
SEQ ID NO: 6, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for an adaptor
SEQ ID NO: 7, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for PCR
SEQ ID NO: 8, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for PCR
SEQ ID NO: 9, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for PCR
SEQ ID NO: 10, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for PCR
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】マウス悪性黒色腫由来のB16/F10 細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を構築し、該がん転移モデルへガレクチン9改変体(G9NC(null))を投与してその作用を調べた結果（肺の結節数をカウントした結果）を示す。
【図２】B16/F10 細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を構築し、該がん転移モデルへガレクチン9改変体を投与してその作用を調べた結果（モデル動物の肺の外観）を示す。
【図３】B16/F10細胞に(a)シグナルペプチドを有しない野生型マウスガレクチン9M(mGal-9M)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(mGal-9)および(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(mGal-9M)(分泌型マウスガレクチン9)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(sec mGal-9)、さらに(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトした細胞株(mock)を樹立し、各遺伝子導入した細胞の培養上清につきウエスタン・ブロッティング法でマウスGal-9を検出測定した結果を示す。
【図４】B16/F10細胞に(a)シグナルペプチドを有しない野生型マウスガレクチン9M(mGal-9M)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(mGal-9)および(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(mGal-9M)(分泌型マウスガレクチン9)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(sec mGal-9)、さらに(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトした細胞株(mock)を樹立し、各遺伝子導入した細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を利用して、該がん転移モデルへの作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（肺の結節数をカウントした結果）を示す。
【図５】図４における、各遺伝子導入したB16/F10細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を利用して、該がん転移モデルへの作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（モデル動物の肺の外観）を示す。
【図６】図４と同様にして各遺伝子導入したB16/F10細胞をC57/BL6マウスに投与し、マウスの生存率を測定した結果を示す。
【図７】マウス肝癌由来のMH-134細胞を用いた皮下移植モデルにおいて、MH-134細胞に(a)シグナルペプチドを有しない野生型マウスガレクチン9M(mGal-9M)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(mGal-9)および(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(mGal-9M)(分泌型マウスガレクチン9)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(sec mGal-9)、さらに(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトした細胞株(mock)を樹立し、各遺伝子導入した細胞を使用して癌性腹膜炎モデル（マウス）での作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（腫瘍重量）を示す。
【図８】図７と同様にして各遺伝子導入したMH-134細胞をC3H/HeNマウスに投与し、マウスの生存率を測定した結果（生存曲線）を示す。
【図９】図７における、各遺伝子導入したMH-134細胞を使用して皮下移植モデル（癌性腹膜炎マウス）を利用して、該がんモデルへの作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（モデル動物の外観）を示す。
【図１０】構築された分泌型ヒト安定化ガレクチン-9の遺伝子配列と予想されるアミノ酸配列を示す。下線部はシグナル配列、ボックスで囲まれた配列はクローニングにより新規に生じた配列、その後にヒト安定化ガレクチン-9の配列（2-296 aa）が続く。矢印は予想されるシグナル切断部位。影をつけた配列cacatgはcatatg(NdeI site)に変異を導入してNdeI siteを欠失させた部分。この変異導入によるアミノ酸配列置換は無い。
【図１１】pSecTag2/HygroA signal-hG9NC(null)の全塩基配列を示す。図１２及び図１３に続く。
【図１２】pSecTag2/HygroA signal-hG9NC(null)の全塩基配列を示す。図１１の続きで、図１３に続く。
【図１３】pSecTag2/HygroA signal-hG9NC(null)の全塩基配列を示す。図１２の続き。
【図１４】分泌型ヒト安定化ガレクチン発現プラスミドを導入したCos7細胞からのガレクチン分泌を調べた結果（ＡはELISAでの解析、Ｂはウエスタン解析）を示す。
【図１５】ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子導入を行った各細胞への遺伝子の導入確認のためのPCRの結果（電気泳動）を示す。
【図１６】ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子を導入したB16/F10細胞からのガレクチン分泌を調べた結果（ELISAでの解析）を示す。
【図１７】ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子を導入したB16/F10細胞からのガレクチン分泌を調べた結果（ウエスタン・ブロッティングによる解析）を示す。
【図１８】分泌型ガレクチン-9遺伝子およびコントロールベクター mockを導入した細胞の増殖能の解析結果を示す。
【図１９】分泌型ガレクチン-9遺伝子およびコントロールベクター mockを導入したB16/F10細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を利用して、該がん転移モデルへの作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（肺の結節数をカウントした結果）を示す。
【図２０】図１９における、各遺伝子導入したB16/F10細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を利用して、該がん転移モデルへの作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（モデル動物の肺の外観）を示す。
【図２１】図１９と同様、各遺伝子導入したB16/F10細胞をC57/BL6マウスに投与し、マウスの生存率を測定した結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有効成分として含有するガレクチン-9感受性の病気又は疾患の遺伝子治療及び／又は予防用剤並びにその遺伝子治療及び／又は予防法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガレクチンはβ-ガラクトシドに親和性を持ち、一次配列上に保存された領域を持つレクチンファミリーである。現在までに、10種類以上の哺乳類ガレクチンが発見され、細胞-細胞接着又は細胞-細胞外基質接着、細胞活性化、細胞増殖、アポトーシスなど多彩な生物活性が報告されている。
【０００３】
本発明者等のグループはヒトＴ細胞由来好酸球遊走因子のクローニングに成功し、それによりそれが Tureci 等が報告したヒトガレクチン-9 (human galectin-9: hGal-9、非特許文献１）のバリアント、エカレクチンであることを見出した（非特許文献２）。さらに、本発明者等のグループはエカレクチンとGal-9は同一の物質であることを明らかにし、ヒトのGal-9はそのリンクペプチドの長さの違いにより、ショートタイプ、メディアムタイプ、ロングタイプの3 種類があることをも明らかにした（非特許文献３）。Gal-9含有医薬が、抗腫瘍剤（抗がん剤）、抗アレルギー剤、免疫抑制剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤として有望であることは、WO 2004/064857 (2004.08.05) 〔特許文献１〕に開示してある。Gal-9は、活性化T細胞にアポトーシスを誘導することも報告されている。さらに、安定化Gal-9（Gal-9改変体）及びその用途についてWO 2005/093064 (2005.10.06)〔PCT/JP2005/006580 (2005.03.29):特許文献２〕に開示を行っている。
【０００４】
【特許文献１】WO 2004/064857 (2004.08.05)
【特許文献２】WO 2005/093064 (2005.10.06)
【非特許文献１】Tureci O. et al., J Biol Chem., Mar. 7, 1997, 272(10):6416-22
【非特許文献２】Matsumoto R. et al., J Biol Chem., 1998, 273:16976-84
【非特許文献３】Matsushita N. et al., J Biol Chem., 2000, 275:8355-60
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ガレクチン９は生体内で様々な生物活性を発揮していることが明らかにされつつあるが、天然型ガレクチン９は生体内ではそのリンクペプチドが消化されて速やかにその活性を消失すると考えられる。これを解決する安定化Gal-9（Gal-9改変体）を使用して、ガレクチン９が抗腫瘍剤（抗がん剤）、抗アレルギー剤、免疫抑制剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤として有望であり、さらには活性化T細胞にアポトーシスを誘導するなど、生体にとって重要な機能及び生物活性を示すというデータも得られてきていることから、生体内でより有効に且つ効率的にガレクチン９（又はGal-9改変体）の機能並びに生物活性を利用する手段の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は鋭意研究の結果、シグナルペプチドを付けたガレクチン９（分泌型ガレクチン９）遺伝子を構築し、これを癌細胞に導入したところ優れた結果を得ることに成功した。ガレクチン９はある種の癌細胞にはアポトーシスを誘導するが、分泌型ガレクチン９遺伝子を導入された癌細胞は試験管内で増殖した。これを経静脈的にマウスに移植するとコントロールと比較してこの癌細胞の転移や増殖は抑制され、その結果マウスの延命効果が認められた。この癌細胞は自ら分泌したガレクチン９の多彩な免疫調節作用により、主に局所で活性化された免疫細胞が癌細胞を攻撃したと考えられる。これより、ガレクチン９の患部局所での有効性が再確認された。さらには、分泌型ガレクチン９遺伝子を患者の体内に導入し、患部において薬としてガレクチン９を発現させる遺伝子治療の可能性が示唆された。
【０００７】
本発明では、次なる態様が提供される。
〔１〕(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有効成分として含有することを特徴とするガレクチン-9感受性の病気又は疾患の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
〔２〕(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有している分泌型ガレクチン-9及び／又はその改変体発現ベクターを有効成分として含有することを特徴とする上記〔１〕記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
〔３〕免疫調節剤であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
〔４〕抗腫瘍薬であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
〔５〕脳腫瘍（多型性膠芽腫など）、脊髄腫瘍、上顎洞がん、膵液腺がん、歯肉がん、舌がん、口唇がん、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、肺がん、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道がん、胃がん、大腸がん、胆管がん、胆嚢がん、膵臓がん、肝がん、腎臓のがん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、精巣腫瘍、副腎のがん、子宮頸がん、子宮体がん、膣がん、外陰がん、卵巣がん、繊毛上皮腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、乳がん、皮膚がん、悪性黒色腫、基底細胞腫、白血病、骨髄化性を伴う骨髄線維症、悪性リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、グリオーマなどを包含するがんおよび肉腫からなる群から選択された腫瘍に対する抗腫瘍薬であることを特徴とする上記〔４〕記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【０００８】
〔６〕下記の疾患あるいは病気、又は病的な症状に対するものであることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤：
(A) 炎症性疾患であり、各臓器でおこる種々の急性および慢性炎症、アレルギー性および自己免疫性の炎症、感染症等からなる群から選択されたもの；
(B) 急性および慢性疾患であり、気管支炎、気管支肺炎、間質性肺炎、肺臓炎、細気管支炎、急性縦隔炎を含む肺の疾患、心外膜炎、心内膜炎、心筋炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽頭炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、虫垂炎、虚血性大腸炎、薬物性大腸炎、直腸炎を含む肺以外の他の臓器の疾患、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、劇症肝炎、急性および慢性肝炎や肝硬変、胆嚢炎、急性膵炎、慢性膵炎、急性および慢性腎炎、膜性腎炎、糸球体腎炎、IgA腎症、種々の膀胱炎、脳髄炎、乳腺炎、皮膚炎、表層角膜炎、乾性角結膜炎、中耳炎や鼻炎、副鼻腔炎や鼻茸、歯肉炎、歯周炎、歯周囲炎を含む炎症等からなる群から選択されたもの；
(C) 神経性炎症（例えば、神経性胃炎、神経性膀胱炎など）、がんや炎症に伴う痛みからなる群から選択されたもの；
(D) アレルギー性炎症疾患であり、全身性アナフィラキシー、気管支喘息、過敏性肺炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、免疫複合体がおこすアレルギー性疾患、血管神経性浮腫等からなる群から選択されたもの；
(E) 自己免疫性の炎症（自己免疫疾患）であり、全身性（慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、結節性多発性動脈炎、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病など）、神経系（多発性硬化症、重症筋無力症、HAM（HTLV-1脊髄症）、筋萎縮性側索硬化症など）、内分泌性（バセドウ病、橋本病、1型糖尿病など）、血液（特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血など）、呼吸器（サルコイドーシス、肺繊維症など）、消化管（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、肝臓（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性胆管炎など）、腎・尿路系（抗好中球細胞質抗体関連腎炎、血管炎、Goodpasture症候群、抗糸球体基底膜抗体病など）等からなる群から選択されたもの；
(F) 感染症であり、病原体が生体の細胞・組織・臓器を傷害することによって生じる疾患、あるいはヒトに感染症をもたらす病原体に起因する疾患で病原体が、1）細菌（スピロヘータ、クラミジア、リケッチアを含む）、2）ウイルス、3）真菌、4）植物（藻類）、5）原虫、6）寄生虫（吸虫、条虫、線虫）、7）節足動物からなる群から選択されたもので、細菌性感染症（コレラ、ペスト、大腸菌感染症など）、スピロヘータ感染症（レプトスピラ症など）、クラミジア感染症（オウム病など）、リケッチア感染症（発疹チフス、破傷風など）、ウイルス性感染症（帯状疱疹、ウイルス性出血熱、狂犬病など）、真菌症（ガンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギウス症など）、原虫性疾患（アメーバー赤痢、マラリア、トキソプラズマ症など）、寄生虫（吸虫症、線虫症など）、その他、マイコプラズマ感染症（マイコプラズマ肺炎など）、ミコバクテリア感染症（結核、非定型抗酸菌症など）を含むものから選択されたもの；
(G) 皮膚科領域の疾患であり、i)皮膚感染症、アレルギー性炎症や自己免疫性炎症を含む皮膚炎症や、乾癬、水疱症、膿疱症、角化、角化異常症など特有の炎症を有する皮膚疾患、ii)美容皮膚科関連の障害あるいは老化で、a)メラニン代謝調節（美白）、b)毛髪成長（発毛）の調節、ｃ)コラーゲン産生調節に関わる皮膚科領域の疾患（老化を含む）から選択されたもの；
(H) 生活習慣病であり、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、糖尿病などを含むものから選択されたもの；
(I) 正常細菌叢の維持に関わる異常；
(J) アミロイドーシス、アルツハイマー病、骨粗鬆症、骨折などを含むものから選択されたもの；
(K) 脳、神経領域における炎症反応、例えば、脳梗塞、心筋梗塞等の虚血性病変の進展に伴い生じる炎症、統合失調症；
(L) 痛風；
(M) 骨粗鬆症；又は
(N) 間質性肺炎。
〔７〕(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤。
〔８〕(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有し且つ上記(b)のN末端側に(a)を有していることを特徴とする分泌型ガレクチン-9をコードする遺伝子。
〔９〕上記〔８〕記載の分泌型ガレクチン-9をコードする遺伝子を含有することを特徴とする分泌型ガレクチン-9発現ベクター。
〔10〕(a)分泌シグナルペプチドと(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものとが連結されていることを特徴とするポリペプチド。
〔11〕(a)分泌シグナルペプチドと(b)ガレクチン-9改変体（安定化ガレクチン-9）とが連結されていることを特徴とする上記〔10〕記載のポリペプチド。
〔12〕配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする上記〔10〕又は〔11〕記載のポリペプチド。
〔13〕上記〔10〕〜〔12〕のいずれか一記載のポリペプチドをコードする塩基配列を有することを特徴とする遺伝子又はポリヌクレオチド。
〔14〕配列表の配列番号２で示される塩基配列を有することを特徴とする上記〔13〕記載の遺伝子又はポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【０００９】
分泌型ガレクチン-9及びその改変体（分泌型安定化ガレクチン-9）を細胞内に導入することにより、生体内でより有効に且つ効率的にガレクチン９（又はGal-9改変体）の機能並びに生物活性を利用することが可能である。分泌型ガレクチン９遺伝子をガレクチン-9感受性の病気又は疾患をかかえる患者の体内に導入し、患部において薬としてガレクチン９を発現させることに基づく遺伝子治療が可能となる。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態につき説明する。
WO 2005/093064 (2005.10.06)〔PCT/JP 2005/006580 (出願日2005.03.29)〕に開示のガレクチン-9改変体（安定化ガレクチン９）〔例えば、WO 2005/093064 (2005.10.06)の実施例１で製造取得されているG9NC(null)〔WO 2005/093064 (2005.10.06)の配列番号1で示される塩基配列によりコードされ、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〕〕は、その投与により、癌や難治性の自己免疫疾患、アレルギー疾患、炎症疾患、骨代謝に関わる疾患の治療に有用であることが示されている。該ガレクチン-9改変体（安定化ガレクチン９）〔例えば、G9NC(null)〕の機能及び用途(医薬用途を含む)は、WO 2005/093064 (2005.10.06)に開示されており、その記載は、それを参照することにより本明細書の内容に含まれる。
かくして、解明されたガレクチン９（及びガレクチン-9改変体〔安定化ガレクチン９〕））の機能並びに生物活性を生体内でより効率よく利用することを目指し、シグナルペプチドを付けたガレクチン９（分泌型ガレクチン９）遺伝子を構築した。そして構築された分泌型ガレクチン９発現遺伝子を癌細胞に導入した。ガレクチン９はある種の癌細胞にはアポトーシスを誘導するが、分泌型ガレクチン９遺伝子を導入された癌細胞は試験管内で増殖した。これを経静脈的にマウスに移植するとコントロールと比較してこの癌細胞の転移や増殖は抑制され、その結果マウスの延命効果が認められた。この癌細胞は自ら分泌したガレクチン９の多彩な免疫調節作用により、主に局所で活性化された免疫細胞が癌細胞を攻撃したと考えられる。これより、ガレクチン９の患部局所での有効性が再確認された。さらには、分泌型ガレクチン９遺伝子を患者の体内に導入し、患部において薬としてガレクチン９を発現させる遺伝子治療の可能性が示唆された。
本発明の「ガレクチン-9」 (galectin-9: Gal-9)とは、例えば、Gal-9産生能を有するヒトの白血球や培養株化細胞から産生される天然型ガレクチン-9 (native Gal-9 or naturally-occurring Gal-9) を意味し、さらに、前記白血球や特定の培養株化細胞由来のGal-9をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術により動物細胞や大腸菌などの微生物に組み込んで得られる組換え型ガレクチン-9 (recombinant galectin-9: rGal-9)などを包含する意味であってよく、その何れを意味するものであってもよい。また、当該Gal-9として、２種以上のガレクチン9を発現するように組み合わせたものを用いることも可能である。当該Gal-9は、抗原性の面から見て、ヒトGal-9 (hGal-9)が有利に使用できる。
【００１１】
本明細書中、「ガレクチン-9」(galectin-9: Gal-9)としては典型的には天然型Gal-9が挙げられるが、それと同等の活性を有するものも含まれてよく、例えば、その糖鎖認識部位が保有する特定の糖鎖に対して特異的に結合するといった活性で特徴付けられるものを包含していてよい。天然型Gal-9としては、現在、ロングタイプ（L 型）ガレクチン-9(galectin-9 long isoform or long type galectin-9: Gal-9L)、ミディアムタイプ（M 型）ガレクチン-9(galectin-9 medium isoform or medium type galectin-9: Gal-9M)及びショートタイプ（S 型）ガレクチン-9(galectin-9 short isoform or short type galectin-9: Gal-9S)が報告されているが、Gal-9LはWO 02/37114 A1に開示の配列番号4 の推定リンクペプチド領域によりN端ドメイン(N末端側糖鎖認識部位、N-terminal carbohydrate recognition domain: NCRD)とC端ドメイン(C末端側糖鎖認識部位、C-terminal carbohydrate recognition domain: CCRD)とが連結されたもの、Gal-9Mは該WO 02/37114 A1の配列番号5の推定リンクペプチド領域によりNCRDとCCRDとが連結されたもの、そしてGal-9Sは該WO 02/37114 A1の配列番号6 の推定リンクペプチド領域によりNCRDとCCRDとが連結されたものであると考えられており、Gal-9MではGal-9Lの当該リンクペプチド領域より該WO 02/37114 A1の配列番号7の配列のアミノ酸残基が欠失している点でGal-9Lと異なること、そしてGal-9SではGal-9Mの当該リンクペプチド領域より該WO 02/37114 A1の配列番号8の配列のアミノ酸残基が欠失している点でGal-9Mと異なること、すなわちGal-9SではGal-9L推定リンクペプチド領域より該WO 02/37114 A1の配列番号9 のアミノ酸残基が欠失している点でL 型ガレクチン-9と異なる。ところで、Gal-9Lのアミノ酸配列は、WO 02/37114 A1に開示の配列番号１に、Gal-9Mのアミノ酸配列は、WO 02/37114 A1に開示の配列番号２に、そしてGal-9Sのアミノ酸配列は、WO 02/37114 A1に開示の配列番号３に、それぞれその典型的な配列のものが示されている。
【００１２】
本明細書において、ガレクチン-9としては、上記Gal-9L、Gal-9M及びGal-9S、その他、それらガレクチン-9ファミリーの天然に生ずる変異体、さらにそれらに人工的な変異（すなわち、一個以上のアミノ酸残基において、置換、欠失、付加、修飾、挿入など）を施したものあるいはそれらの一部のドメインや一部のペプチドフラグメントを含むものを意味してよい。WO 2004/064857 (2004.08.05)、J. Biol. Chem., 275 (12): pp. 8355-8360 (2000)に開示のものはすべて含まれてよい。
当該ガレクチン-9には、天然のガレクチン-9バリアント、さらにWO 2005/093064 (2005.10.06)〔PCT/JP 2005/006580 (出願日2005.03.29)〕に開示の「ガレクチン-9改変体」、「ガレクチン-9改変体ポリペプチド」、さらには「ガレクチン-9改変体治療剤」はすべて含まれてよい。特に好ましいものとしては、WO 2005/093064 (2005.10.06)の実施例１で製造取得されているG9NC(null)〔WO 2005/093064 (2005.10.06)の配列番号1で示される塩基配列によりコードされ、配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド〕が挙げられる。「ガレクチン-9改変体」又は「ガレクチン-9改変体ポリペプチド」のうちには、天然型ガレクチン-9に比して、より安定化された性状を示すものが得られることが認識されており、そうしたものは本明細書において、「安定化ガレクチン-9」と称されてもいる。該安定化ガレクチン-9の代表的なものとしては、上記したG9NC(null)が挙げられるが、これに限定されるものではなく、同様な性状を示すものはそれに含まれてよい。
本明細書に記載の発明は、これまでに公表された研究および特許出願、例えば、WO 2004/064857 (2004.08.05)、WO 2005/093064 (2005.10.06)を参考にしており、その内容は本明細書の開示の中に含められる。
「ガレクチン９改変体」とは、ガレクチン９の糖鎖認識部位が保有する特定の糖鎖に対して特異的に結合するといった活性又はそれと類似した活性（本活性のうちには定性的な活性及び／又は定量的な活性が含まれてよい）を提供する物質をいう。ガレクチン９は、特定の細胞に対してアポトーシス誘導活性を有するが、本ガレクチン９改変体は野生型ガレクチン９が有するアポトーシス誘導活性あるいはそれと類縁の活性を有するものであってよく、ガレクチン９が有する生物活性が改変又は修飾されているものであってよいし、ある場合には好ましい。本発明で特に好ましいガレクチン９改変体とは、生物活性を有する試薬として、臨床検査の分野、分析の分野、あるいは医学又は医薬などの分野で、野生型ガレクチン９よりは好ましい性質を示すものを指す。
【００１３】
本発明では、「遺伝子組換え技術」を利用して所定の核酸（ポリヌクレオチド）や所定のペプチド（ポリペプチド）を構築したり取得すること、また単離・配列決定したり、組換え体を作製したりできる。本明細書中使用できる遺伝子組換え技術（組換えDNA技術を含む)としては、当該分野で知られたものが挙げられ、例えば J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition (1989) & 3rd edition (2001)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995);日本生化学会編、「続生化学実験講座１、遺伝子研究法II」、東京化学同人 (1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技術）」、東京化学同人 (1992); M. J. Gait (Ed), Oligonucleotide Synthesis, IRL Press （1984); B. D. Hames and S. J. Higgins (Ed), Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press Ltd., Oxford, UK (1985); B. D.Hames and S. J. Higgins (Ed), Transcription and Translation: A Practical Approach (Practical Approach Series), IRL Press Ltd., Oxford, UK (1984); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (2nd Edition), John Wiley & Sons, New York (1988); J. H. Miller and M. P. Calos (Ed), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1987); R. J. Mayer and J. H. Walker (Ed), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, (1987); R. K. Scopes et al. (Ed), Protein Purification: Principles and Practice (2nd Edition, 1987 & 3rd Edition, 1993), Springer-Verlag、N.Y.; D. M. Weir and C. C. Blackwell (Ed), Handbook of Experimental Immunology, Vol.1, 2, 3 and 4, Blackwell Scientific Publications, Oxford, (1986); L. A. Herzenberg et al. (Ed), Weir's Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1, 2, 3 and 4, Blackwell Science Ltd. (1997); R. W. Ellis (Ed), Vaccines new approaches to immunological problems, Butterworth-Heinemann, London (1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68 (Recombinant DNA), Academic Press, New York (1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101(Recombinant DNA, Part C), Academic Press, New York (1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Recombinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), Academic Press, New York (1987); J. H. Miller ed., "Methods in Enzymology", Vol. 204, Academic Press, New York (1991); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 218, Academic Press, New York (1993); S. Weissman (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 303, Academic Press, New York (1999); J. C. Glorioso et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 306, Academic Press, New York (1999); Jeremy Thorner et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 326 to 328, Academic Press, New York (2000); David R. Engelke et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 392, Academic Press, New York (2005)などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる (それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる) 〔以下、これら全てを「遺伝子組換え技術」という）。
【００１４】
本発明で使用されるGal-9活性を有するポリペプチド（すなわち、ガレクチン-9又はその改変体（安定化ガレクチン-9））をコードする遺伝子（又はヌクレオチド配列）には、特に限定はなく、上記した本発明で使用されるGal-9活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子又はポリヌクレオチド配列を使用することが出来る。例えば、J. Biol. Chem., 272 (10): pp. 6416-6422 (1997)の第6418頁のFIG. 1の配列、NCBIデータベースのAccession Number NP 033665に示された配列、WO 02/37114 A1に開示の配列表の配列番号1〜3(SEQ ID NO: 1〜3)のいずれかで表されるペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列（又はヌクレオチド配列）、J. Biol. Chem., 273 (27): pp. 16976-16984 (1998)の第16983頁のFig. 8の配列、J. Biol. Chem., 275 (12): pp. 8355-8360 (2000)の第8359頁のTable IIに示されたガレクチン９の変異（同文献の図８参照）を有するペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列（又はヌクレオチド配列）、WO 2005/093064 (2005.10.06)に開示の配列表の配列番号1 (SEQ ID NO: 1)及び配列番号5 (SEQ ID NO: 5)が使用され、その一例として、WO 2005/093064 (2005.10.06)に開示の配列表の配列番号1 (SEQ ID NO: 1)に示す塩基配列を有するもの、さらにWO 2005/093064 (2005.10.06)に開示の配列表の配列番号5 (SEQ ID NO: 5)に示す塩基配列を有するものが挙げられる。
【００１５】
また、天然型のGal-9のアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異が導入されたポリペプチドをコードする遺伝子も使用することができる。例えば、WO 2005/093064 (2005.10.06)に記載のポリペプチドをコードする遺伝子、即ち、G9NC(null)ポリペプチドをコードする遺伝子、Gal-9Mポリペプチドをコードする遺伝子、あるいはGal-9Sポリペプチドをコードする遺伝子が使用される。ガレクチン-9、及びその改変体からなる群から選択されたものをコードする核酸（又はヌクレオチド配列）の配列内には、例えば、選択した宿主細胞で好適に発現するに適した修飾されたコドン（例えば、コドンの置換）を含むようにしてあってよいし、制限酵素部位が設けられていても良い。縮重遺伝子を介して、前記遺伝子とは異なる塩基配列を有する遺伝子も本発明に使用できる。また、本発明に使用されるGal-9活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子には、上記した塩基配列の相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、かつGal-9活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列を有する遺伝子も含まれる。ハイブリダイゼーションは、例えば、J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition (1989) & 3rd edition (2001)", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の方法により実施することが出来る。本明細書で「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、例えばナトリウム濃度に関し、約15〜約50mM、好ましくは約19〜約40mM、より好ましくは約19〜約20mMで、温度については約35〜約85℃、好ましくは約50〜約70℃、より好ましくは約60〜約65℃の条件を示し、典型的な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」下とは、例えば、6×SSC(1×SSCの組成:150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5% SDS、5×デンハルト、100mg/ml ニシン精子DNAを含む溶液中、プローブとともに65℃で一晩保温するという条件が挙げられる。
【００１６】
本明細書において、「実質的に同等」とはタンパク質の活性、例えば、所定の細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性、抗炎症活性、抗アレルギー活性、免疫調節活性、糖鎖結合活性、生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。さらにまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性を有する場合を包含していてよく、該実質的に同質の活性としては、結合活性、細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性などを挙げることができる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、薬理学的に、あるいは生物学的に同質であることを示す。例えば、結合活性、細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性などの活性が、同等 (例えば、約 0.001〜約1000倍、好ましくは約0.01〜約100 倍、より好ましくは約 0.1〜約20倍、さらに好ましくは約 0.5〜約2 倍) であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的な要素は異なっていてもよい。
【００１７】
本明細書で使用の用語「治療剤」とは、本発明における治療において使用する１つまたはそれ以上のその治療行為を達成するかまたは達成するのに寄与する任意の薬剤であってよい。例えば、治療剤がガレクチン９ポリペプチド(あるいはガレクチン９改変体ポリペプチド)を発現するように設計されたポリヌクレオチドである場合、その薬剤は、哺乳動物に投与されそして細胞で発現することができるポリヌクレオチドである。この場合、薬剤の活性形熊は、発現された分泌型ポリペプチドである。
本発明のガレクチン９利用遺伝子治療剤は、ガレクチン９（又はガレクチン９改変体）の生物活性を遺伝子治療的に利用する治療剤、または天然のガレクチン９(あるいは天然のガレクチン９よりも長く特定の糖鎖に対して結合している活性を有するポリペプチド、マトリックスメタロプロテアーゼなどのタンパク分解酵素に対してネイティブなガレクチン９より安定化されているガレクチン９改変体ポリペプチド)をコードするポリヌクレオチドを生体内で発現する治療剤である。該治療剤は、単独で、あるいは他の薬剤（例えば、分泌型ガレクチン９（又は分泌型ガレクチン９改変体）発現ベクターの投与と共に使用され且つ特定の腫瘍あるいは自己免疫などに対するその他の公知の処置法に使用されるような薬物、あるいは哺乳動物での分泌型ガレクチン９（又は分泌型ガレクチン９改変体）発現ベクターの発現を容易に行いうるような遺伝子導入用キャリアーなど)と組み合わせて、その治療目的を達成する。例えば、該治療剤は、他の目的のために開発されたガレクチン９（又は分泌型ガレクチン９改変体）自体を含むものであってよく、さらには、ガレクチン９のアゴニスト、ガレクチン９活性を修飾又は調節する薬物を含むものであってよく、例えば、有機低分子化合物又は物質、ペプチド、ペプチド様化合物又は物質、ガレクチン９（又はガレクチン９改変体）ポリペプチドあるいはプロテアーゼに対してネイティブなガレクチン９より安定化されているガレクチン９改変体のキメラ体あるいは変異体などを発現し且つ形質転換された細胞であってよい。
【００１８】
本願発明の遺伝子治療剤には、配合治療剤も包含されてよい。本明細書で「配合治療剤」とは、一緒に投与した場合にそれらの別々の効果を生じるといった、いくつかの成分またはいくつかの薬剤を含有する治療組成物を指しており、それらは疾患などを処置するために一緒に投与された場合に相乗効果を生じるようなものを指してよい。好ましくは、配合治療剤中のいくつかの成分またはいくつかの薬剤のそれぞれにより得られる別々の作用効果は、より大きな治療効果、例えば、腫瘍の消失あるいは正常化、アレルギー症状、炎症症状、免疫不均衡、自己免疫疾患からの回復および長期生存が得られるようにそれを組み合わせることができるのである。配合治療剤を投与して得られる効果の例としては、短期での症状の回復と長期投与の後に得られる症状の回復との組み合わせとか、患者における特定の型の細胞のそれぞれに対する免疫反応あるいは自己免疫応答を減少せしめるといったような効果の組み合わせが挙げられる。本発明の配合治療剤の例としては、分泌型ガレクチン９をコードするポリヌクレオチドとIFN類, IL-2などのサイトカイン類の少なくとも一つをコードするポリヌクレオチドを含んでいる遺伝子導入用ベクターを投与するためのものなどが挙げられる。別の例としては、２つの遺伝子導入ベクターを使用することもでき、例えば、１つは分泌型ガレクチン９を発現するもので、他方はサイトカイン類の少なくとも一つを発現するためのものであってよい。さらに、標的細胞においてアポトーシスを誘導するための分泌型ガレクチン９発現ベクターの投与を見越してアップレギュレートするために、IFN類, IL-2など、あるいはIFN-γなどを発現する遺伝子導入ベクターを投与することもできる。種々の治療剤は、それを同時に供与することもできるし、例えば、治療を効率化するよう、必要に応じて個々の薬剤の１つまたはすべてを繰り返し投与するものであってよく、同一の薬学的に許容される担体中に入れて投与することもできる。
【００１９】
本発明に使用される分泌シグナルペプチド(シグナル配列)をコードする遺伝子（又はヌクレオチド配列: 分泌シグナル）には、特に限定はなく、タンパク質の分泌を指令するものであればよく、例えば、タンパク質を細胞外に分泌させることが出来る任意のシグナルペプチドを使用することが出来る。そして、普通、分泌タンパク質と呼ばれるものは、該シグナルペプチドをそのアミノ末端に有している。これらのシグナルペプチドは、分泌タンパク質をコードする遺伝子（（又はヌクレオチド配列）のコード配列の5'-末端に位置するシグナル配列によってコードされる。これらのシグナルペプチドは、それらが機能的に結合しているGal-9活性を有するポリペプチド（すなわち、ガレクチン-9タンパク質又はその改変体（安定化ガレクチン-9）タンパク質）の細胞外分泌を指令することができる。シグナルペプチドとして、膜転移配列と呼ばれるものあるいはその一部を利用すれば、当該ペプチドあるいはタンパク質の細胞内への輸送を指令することも可能である。かくして、当該遺伝子産物〔Gal-9活性を有するポリペプチド（すなわち、ガレクチン-9タンパク質又はその改変体（安定化ガレクチン-9）タンパク質）〕を、それを産生する細胞以外の細胞に送達することが可能にもなる。かくして、ガレクチン-9又はその改変体（安定化ガレクチン-9）による遺伝子治療技術で優れた作用効果が奏されることになる。
【００２０】
シグナル配列は、通常、疎水性に富んだ配列を有しており、細胞質中でSRP（シグナル認識粒子）により認識され、小胞体へ運ばれるように機能する。運ばれたタンパク質は、Ｎ末端から小胞体中へ陥入し、最終的に小胞体の膜上に存在するようになる。該膜タンパク質は、小胞体からゴルジ体を経て、細胞膜へ移動する経路が知られている。シグナル配列は、最終的にシグナルペプチダーゼの作用により切除される。
シグナルペプチドは、しばしば、20〜40個のアミノ酸残基からなる配列からなり、分泌後は切り取られるが、Ｎ末端側にArg, Lysなどの塩基性アミノ酸残基が位置し、中央部には高い疎水性を与えるアミノ酸残基、例えば、Leu, Ile, Val, Alaなどが占め、そして切断部位にはAlaなどの側鎖の小さなアミノ酸残基を有するという特徴のものが好適に使用されれる。
本発明の分泌シグナルをコードする遺伝子は、公知の方法で化学合成することが出来、また、培養細胞、組織より単離したDNA又はRNAを鋳型としたPCR法、逆転写PCR (polymerase chain reaction coupled reverse transcription; RT-PCR)法、RACE (rapid amplification of cDNA ends)により増幅することで得ることが出来る。また、例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法（部位特異的変異導入法) (Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487, 1987; Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331, 1986), カセット変異導入法 (cassette mutagenesis: Wells et al., Gene, 34: 315, 1985), 制限部位選択変異導入法 (restriction selection mutagenesis: Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London Ser A, 317: 415, 1986), PCR 変異導入法などを使用することも出来る。
【００２１】
PCR 反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、例えば R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki,et al., Science, 239: 487, 1988 ; H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) ; M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、PCR 法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
本発明の分泌シグナルは、本発明のGal-9活性を有するポリペプチドに直接結合していても良く、またスペーサーを介して結合していても良い。
分泌シグナルをGal-9活性を有するポリペプチド（すなわち、ガレクチン-9タンパク質又はその改変体（安定化ガレクチン-9）タンパク質）をコードするヌクレオチド配列に機能するように連結せしめるには、分泌シグナル源として、公知の分泌発現システム(例えば、分泌タンパク質発現用ベクターなど)や市販の分泌発現システム(例えば、分泌タンパク質発現用ベクターなど)から選択してそれを使用できる。市販分泌タンパク質発現用ベクターは、例えば、Invitrogen社, タカラバイオ社(TaKaRa社), BioLeaders社, GenHunter社, アマシャム バイオサイエンス社, メルク社, Novagen社, クロンテック社(Clontech社), QIAGEN社などより入手できるものが挙げられる。
【００２２】
本発明の遺伝子は、適当なプロモーターと連結し、その制御下で使用することが出来る。該プロモーターとしては、特に限定はなく、例えば、CMVプロモーター、RSVプロモーター、CAGプロモーター、SRαプロモーター、EF1プロモーター、PGKプロモーター、α1ATプロモーター、tieプロモーター、AFPプロモーター、CEAプロモーター、PSAプロモーター、レトロウイルスのLTRプロモーター等が挙げられ、目的に応じて好適なものを選択すれば良い。該プロモーターとしては、組織特異的プロモーターや事象特異的プロモーターを使用してもよく、それを使用することで、組織特異的な発現を行なうことや転写活性が細胞性刺激に対する応答の際に変化するように出来る。組織特異的なプロモーターとしては、特に限定はなく、例えば、インスリンプロモーター、成長ホルモン因子プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、α-アクチンプロモーター、γ-クチンプロモーター、α-ミオシンプロモーター、クレアチンキナーゼプロモーター、プレプロエンドセリン-1プロモーター、E-セレクチンプロモーター等が挙げられる。事象特異的プロモーターの代表的な例としては、チミジンキナーゼもしくはチミジレートシンターゼプロモーター、αもしくはβインターフェロンプロモーター、さらにホルモン（天然ホルモン、合成ホルモン、または他の非宿主生物からのホルモンのいずれか、例えば、昆虫ホルモンなど) の存在に応答するプロモーターなどが挙げられる。
【００２３】
本発明の遺伝子には、ポリアデニル化シグナル、選択を可能にする選択マーカー、発現制御配列、調節配列、SD配列、制限酵素部位、翻訳終結配列などが連結されていてよい。
本明細書中用語「発現制御配列」や「調節配列」とは、ポリペプチドをコードする遺伝子の発現に影響を与え、転写や翻訳のためのシグナルを含むといった発現に影響を及ぼすような１つまたはそれ以上の成分を含んでおり且つ当該分野で使用されている配列をいう。本発明のポリペプチドの発現に適している発現制御配列は、ポリペプチドが発現されるべき宿主系によってそれは異なる。
本明細書で使用の用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、RNAまたはDNA、さらにはDNA:RNA ハイブリッドなどの分子をさしており、特定のアミノ酸配列またはその相補鎖をコードするものを含めてよい。本明細書で使用の「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列またはその相補鎖をコードするRNAまたはDNA、さらにはDNA:RNA ハイブリッドなどのいずれかをいう。ポリヌクレオチドは、例えば、遺伝子の3'または5'非翻訳領域のような配列、遺伝子のイントロン、遺伝子のコード領域を構成していないといった遺伝子の他の領域を含んでいてよい。DNAやRNAは、一本鎖または二本鎖であってよい。合成核酸や合成ポリヌクレオチドには、化学的に合成された核酸配列を有するものも含まれてよく、さらに変性に対する抵抗性を分子に与えるために化学的に部分改変しておくこともできる。ポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR)増幅、相補的DNAもしくはRNAを使用しての組換え発現などによって製造できるし、あるいは化学合成によって生成させることもできる。
【００２４】
遺伝子治療用ベクター（ビヒクル）(又は遺伝子導入ベクター)は、細胞におけるポリペプチドの発現のためのコード配列を細胞へ導入することを容易になし得るようにする成分を指しており、遺伝子組換え技術を利用して、簡便に得ることができ、哺乳動物における発現のために哺乳動物に導入されるべき本発明のガレクチン-9コード配列、あるいはガレクチン-9改変体コード配列と、そのＮ末端側にシグナル配列を含んでいる構築物（コンストラクト、construct)を運搬するためのもの、あるいは、ガレクチン-9(又はガレクチン-9改変体)の全てもしくは部分であって且つ遺伝子導入されるべき核酸配列（ヌクレオチド配列）並びにシグナル配列を含んでいる該構築物を運搬するためのものである。該細胞は、インビボ(in vivo)遺伝子治療におけるように哺乳動物の体内に存在していてもよいし、エキソビボ(ex vivo)遺伝子治療におけるようにトランスフェクション処理のために一旦哺乳動物から取り出され、ポリペプチドが発現するように処置されてから哺乳動物に戻されたものであってよい。遺伝子治療用ベクターは、例えば、組換えウイルスベクター、プラスミドベクター、ネイキッド核酸分子（例えば、遺伝子)、ポリカチオン分子と複合体化されている核酸分子、リポソームと結合した核酸などであってよいし、宿主細胞に１つ以上の所望の特性を生物学的に有している核酸分子を導入できるといったプロデューサー細胞のような特定の真核生物細胞を包含していてよく、これらは局所的または全身的のいずれかの方法で投与されることのできるものである。所望の特性とは、例えば、タンパク質、酵素、あるいは抗体などのような所望物質を発現する能力及び／又は生物学的活性を提供する能力を含んでいてよい。これらの構築物の細胞内への導入方法としては、公知の方法が使用され、ウイルスベクターによる導入方法、ウイルスベクターを使用しない導入方法の何れも本発明に使用でき、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。該構築物は、インビボ(in vivo)またはエキソビボ(ex vivo)の形で投与されてよく、それらの何れで投与しても良く、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。それらの投与は、ウイルスベクターによるアプローチまたは非ウイルスベクター形式でのアプローチを利用することのできるものである。このようなコード配列を発現するには、内因性の哺乳動物プローモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導することにより行うことができる。インビボでのコード配列の発現は、構成的になされるか、または調節されて行われるかのいずれかである。これらの両方においてまたはそのいずれかにおいて、それらは、例えば、全てのガレクチン-9(又は膜結合型ガレクチン-9改変体)、あるいはガレクチン-9(又はガレクチン-9改変体)の生物学的に活性な部分、バリアント、改変体、誘導体、もしくは融合体などであってよい。所要の遺伝子の共発現を目的としたものも含まれてよい。
【００２５】
本発明は、所要のガレクチン-9の核酸配列、又はガレクチン-9改変体の核酸配列を発現することのできる遺伝子導入ベクター（共遺伝子導入も包含される）を提供する。遺伝子導入ベクターとしては、好ましくは、ウイルスベクターが挙げられ、より好ましくは、レトロウイルス、HIV、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルスまたはアルファウイルスなどのウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターとしては、さらに、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、トガウイルスなどのウイルスベクターも挙げられ、例えば、HVJ Envelope Vector(石原産業)なども挙げられ、目的に応じて好適なものを選択することができる。特にポリヌクレオチドとして導入する場合には、知見が多く、技術も確立し、導入効率も高いウイルス等を担体とする導入方法を採択することが好ましい。たとえば、このポリヌクレオチドを真核細胞用の発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを、たとえばウイルスベクターや生体認識分子を具備した中空ナノ粒子等に組み込むようにして、いわゆる遺伝子治療用ベクターとして、遺伝子治療の手法により生体内の標的細胞等に導入することができる。特にレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターが好適に使用され、更に好適にはレトロウイルスベクターが使用される。本発明で使用されるレトロウイルスベクターとしては、特に限定はないが、例えば、MFGベクター(ATCC No.68754)、α-SGCベクター(ATCC No.68755)、LXSNベクター（バイオテクニクス(Biotechniques)、第７巻、第980〜990頁 (1989))、pDON-AI（宝酒造社製）等が挙げれる。当該遺伝子導入ベクターに関しては、一般には、D. Jolly, Cancer Gene Therapy, 1(1): 51-64 (1994); O. Kimura et al., Human Gene Therapy, 5: 845-852 (1994); S. Connelly et al., Human Gene Therapy, 6: 185-193 (1995); M.G. Kaplitt et al., Nature Genetics, 8: 148-153 (1994)などを参照することができる。
【００２６】
レトロウイルスベクターは、当該分野でよく知られており、例えば、B型、C型、およびD型レトロウイルス、xenotropicレトロウイルス（例えば、NZB-X1, NZB-X2, NZB9.1 (R. R. O'Neill, J. Virol., 53: 100-106 (1985)参照)など）、polytropicレトロウイルス（例えば、MCF, MCF-MLV (M. Kelly, J. Virol., 45: 291-298 (1983) 参照)など）、スプマウイルス、レンチウイルスなど（R.L.Weiss et al. (Eds.), RNA Tumor Viruses, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1985参照）を含む任意のレトロウイルス遺伝子治療ベクターが本発明において使用可能であろう。
遺伝子治療レトロウイルスベクターの一部は、異なっているレトロウイルス由来のものであってよい。例えば、レトロベクターのLTRはネズミザルコーマウイルス由来のものであってよいし、tRNA結合部位はラウスザルコーマウイルス由来のものであってよいし、パッケージングシグナルはネズミ白血病ウイルス由来のものであってよいし、第二鎖合成オリジンはトリ白血症ウイルス由来のものであってよい。これらの組換えレトロウイルスベクターは、それらを適切なパッケージング細胞株に導入することによって形質導入可能なレトロウイルスベクター粒子を形成せしめるのに使用することができる（米国特許第5,591,624号明細書参照）。レトロウイルスベクターは、インテグラーゼという目的DNAを宿主細胞のDNA中に部位特異的に組み込む能力を有する組換え酵素をレトロウイルス粒子内に持つようにすることで構築することができる。組換えウイルスベクターとしては、複製能欠損組換えウイルスであることが好ましい。
上記のレトロウイルスベクターとの使用に適しているパッケージング細胞株としては、当該分野でよく知られたものが挙げられ、また、容易に調製されることができる（米国特許第6,013,517号明細書, WO 92/05266参照）。当該パッケージング細胞株は、組換えベクター粒子を産生するためのプロデューサー細胞株（ベクター細胞株, vector cell line: VCL)を作製するのに使用することができる。好ましくは、パッケージング細胞株は、ヒト血清中で不活化することがないようにして、ヒトの親細胞（例えば、HT1080細胞）またはミンクの親細胞株から作製される。
【００２７】
レトロウイルス遺伝子治療ベクターの構築に好ましいレトロウイルスとしては、トリ白血症ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネズミ白血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、ネズミザルコーマウイルス、網細内皮症ウイルス、ラウスザルコーマウイルスなどが挙げられる。ネズミ白血病ウイルスとして特に好ましいものとしては、例えば、4070Aおよび1504A (Hartley & Rowe, J. Virol., 19: 19-25 (1976))、Abelson (ATCC No. VR-999)、Friend (ATCC No. VR-245)、Graffi, Gross (ATCC No. VR-590)、Kirsten、ハーベイザルコーマウイルス並びにRauscher (ATCC No. VR-998)、及びモロニーマウス白血病ウイルス(ATCC No. VR-190)などが挙げられる。
このようなレトロウイルスは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC, Rockville, Maryland, USA)のような寄託機関または保存機関から入手可能であるか、あるいは、一般に利用可能な技術を使用して既知の供給源から単離することができる。
本発明で使用可能な公知のレトロウイルス遺伝子治療ベクターの例としては、GB 2200651, EP 0415731, EP 0345242, WO 89/02468, WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03662, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 93/10218, WO 91/02805、米国特許第5,219,740号明細書、同第4,405,712号明細書、同第4,861,719号明細書、同第4,980,289号明細書、同第4,777,127号明細書、同第5,591,624号明細書、Vile, Cancer Res, 53: 3860-3864 (1993), Vile, Cancer Res, 53: 962-967 (1993), Ra, Cancer Res, 53: 83-88 (1993), Takamiya, J Neurosci Res, 33: 493-503 (1992), Baba, J Neurosurg, 79: 729-735 (1993), Mann, Cell 33: 153 (1983), Cane, Proc Natl Acad Sci USA, 81: 6349 (1984), Miller, Human Gene Therapy, 1: 5-14 (1990)などに記載されたものが挙げられる。
【００２８】
ヒトのアデノウイルス遺伝子治療ベクターもまた当該分野で公知であり、本発明で使用可能であり、例えば、Berkne, Biotechniques, 6: 616 (1988); Rosenfeld, Science, 252: 431 (1991); WO 93/07283; WO 93/06223; WO 93/07282などを参照することができる。本発明で使用可能な既知のアデノウイルス遺伝子治療ベクターの例としては、上記の参考文献に記載されているものや、例えば、WO 94/12649; WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984; WO 95/00655; WO 95/27071; WO 95/29993; WO 95/34671; WO 96/05320; WO 94/08026; WO 94/11506; WO 93/06223; WO 94/24299; WO 95/14102; WO 95/24297; WO 95/02697; WO 94/28152; WO 94/24299; WO 95/09241; WO 95/25807; WO 95/05835; WO 94/18922; WO 95/09654などに記載されているものが挙げられる。また、Curiel, Human Gene Therapy, 3: 147-154 (1992)に記載されているように死んでいるアデノウイルスに連結されたDNAを投与することによってもよい。
【００２９】
また、本発明の遺伝子導入ベクターとしては、アデノウイルス随伴ウイルス(AAV)ベクターが挙げられる。このようなベクターのうち本発明での使用のための好ましい例としては、WO 93/09239に開示されているような、AAV-2に基づいたベクターが挙げられる。最も好ましいAAVベクターとしては、２つのAAVの逆末端反復配列を含むものである。このものは、天然のD配列がヌクレオチド置換によって改変されており、その結果、少なくとも５つの天然型のヌクレオチドおよび18個までの天然型ヌクレオチド（好ましくは、少なくとも10個の天然型ヌクレオチドおよび18個までの天然型ヌクレオチド、最も好ましくは、10個の天然型ヌクレオチド) が維持されているものであり、D配列の残りのヌクレオチドは欠失しているかまたは非天然型のヌクレオチドで置換されているものである。AAV逆末端反復領域の天然型のD配列は、各AAV逆末端反復配列中に20個の連続するヌクレオチドを有する配列（すなわち、各末端に１つの配列が存在するもの) であり、このものはHP形成には関与してはいないものである。非天然型の置換されたヌクレオチドは、同じ部位で天然型のD配列中に見出されるヌクレオチドとは異なっている任意のヌクレオチドであってよい。他の使用可能なAAVベクターの例としては、pWP-19、pWN-1などが挙げられる（Nahreini, Gene, 124: 257-262 (1993))。このようなAAVベクターの別の例としては、psub201などが挙げられる(Samulski, J. Virol., 61: 3096 (1987))。別のAAVベクターの例としては、Double-D ITRベクターなどが挙げられる。Double-D ITRを作製する方法は、米国特許第5,478,745号明細書に開示されている。またそれに加えて、AAVベクターは、例えば、米国特許第4,797,368号明細書、同第5,139,941号明細書、同第5,474,935号明細書、WO 94/288157号などに開示のものが挙げられる。本発明で利用可能なAAVベクターの別の例としては、SSV9AFABTKneoが挙げられ、このものは、AFPエンハンサーおよびアルブミンプロモーターを含んでおり、さらに肝臓で優先的に発現せしめることに向けられたものである。その構造並びに作製方法は、Su, Human Gene Therapy, 7: 463-470 (1996)に開示されている。別のAAV遺伝子治療ベクターとしては、米国特許第5,354,678号明細書、同第 5,173,414号明細書、同第 5,139,941号明細書、同第 5,252,479号明細書などに記載されているものが挙げられる。
【００３０】
本発明の遺伝子治療ベクターは、ヘルペスベクターであってもよい。主なヘルペスベクターの好ましい例としては、チミジンキナーゼポリペプチドをコードする配列を含んでいる単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第5,288,641号明細書およびEP 0176170に開示されるベクター) が挙げられる。さらなる単純ヘルペスウイルスベクターの例としては、WO 95/04139などに開示されるHFEM/ICP6-LacZ, Geller, Sclence, 241: 1667-1669 (1988)、WO 90/09441、WO 92/07945などに記載されるpHSVlac, Fink, Human Gene Therapy, 3: 11-19 (1992)に記載されるHSV Us3::pgC-lacZ、EP 0453242 Aに記載されるHSV7134, 2RH 105およびGAL4、寄託番号ATCC VR-977およびATCC VR-260としてATCCに寄託されているベクターなどが挙げられる。
本発明においては、アルファウイルス遺伝子治療ベクターを使用することもできる。好ましいアルファウイルスベクターとしては、シンドビスウイルスベクター、トガウイルス、Semliki Forestウイルス(ATCC VR-67; ATCC VR-1247)、Middlebergウイルス(ATCC VR-370)、Ross Riverウイルス(ATCC VR-373; ATCC VR-1246)、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(ATCC VR923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532)、米国特許第5,091,309号、同第5,217,879号、およびWO 92/10578に記載されるベクターなどが挙げられる。また、使用可能なアルファウイルスベクターとしては、米国特許第5,091,309号明細書、同第5,217,879号明細書、同第5,843,723号明細書、同第6,376,236 号明細書、WO 94/21792、WO 92/10578、WO 95/07994などに記載されるものも挙げられる。このようなアルファウイルスは、ATCC (Rockville, Maryland, USA)のような寄託機関または保存機関から入手可能であるか、あるいは、一般に利用可能な技術を使用して既知の供給源から単離することができる。好ましくは、細胞傷害性が低減せしめられているアルファウイルスベクターを使用することができる（米国特許第6,391,632号明細書参照) 。
DNAベクター系（例えば、真核生物階層型発現系(eukarytic layered expression system)など)は、本発明の分泌型ガレクチン９あるいは分泌型ガレクチン９改変体の核酸を発現するために有用である。真核生物階層型発現系の詳細については、WO 95/07994を参照することができる。好ましくは、本発明の真核生物階層型発現系としては、アルファウイルスベクターに由来するものが挙げられ、好ましくは、シンドビスウイルスベクターに由来するものが挙げられる。
【００３１】
本発明での使用に適した他のウイルスベクターとしては、ポリオウイルス（例えば、ATCC VR-58, Evans, Nature, 339: 385 (1989), Sabin, J. Biol. Standardization, 1: 115 (1973)などに記載されているウイルスなど);ライノウイルス（例えば、ATCC VR-1110およびArnold, J. Cell Biochem, L401-405 (1990)に記載されるウイルスなど);ポックスウイルス（例えば、カナリアポックスウイルスなど) またはワクシニアウイルス（例えば、ATCC VR-111, ATCC VR-2010など、Fisher-Hoch, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 317(1989), Flexner, Ann NY Acad Sci, 569: 86 (1989), Flexner, Vaccine, 8: 17 (1990)、米国特許第4,603,112号明細書及び同第4,769,330号明細書、並びにWO 89/01973に記載されるウイルスなど); SV40ウイルス（例えば、ATCC VR-305およびMulligan, Nature, 277: 108 (1979)およびMadzak, J. Gen. Vir, 73: 1533(1992)に記載されるウイルスなど);インフルエンザウイルス（例えば、ATCC VR-797など)、米国特許第5,166,057号明細書、Enami, Proc Natl Acad Sci USA, 87: 3802-3805(1990), Enami & Palese, J Virol, 65: 2711-2713 (1991), Luytjes, Cell, 59: 110 (1989), McMicheal., N E J Med, 309: 13 (1983), Yap, Nature, 273: 238 (1978)、及びNature, 277: 108(1979)などに記載されているような逆遺伝学技術を用いて作製された組換えインフルエンザウイルス；EP 0386882、Ruchschacher, J. Vir., 66: 2731 (1992)などに記載されているヒト免疫不全症ウイルス(HIV)；麻疹ウイルス（例えば、ATCC VR-67, VR-1247 並びにEP 0440219に記載されているウイルスなど) ；アウラウイルス（例えば、ATCC VR-368など) ；ベバルウイルス（例えば、ATCC VR-600およびATCC VR-1240など) ；Cabassouウイルス（例えば、ATCC VR-922 など) ；チクングニヤウイルス（例えば、ATCC VR-64, ATCC VR-1241など); Fort Morganウイルス（例えば、ATCC VR-924など) ；ゲタウイルス（例えば、ATCC VR-369, ATCC VR-1243など); Kyzylagachウイルス（例えば、ATCC VR-927など);マヤロウイルス（例えば、ATCCVR-66など);ムカンボウイルス（例えば、ATCC VR-580, ATCC VR-1244など) ; ヌヅムウイルス（例えば、ATCC VR-371など);ピクスナウイルス（例えば、ATCC VR-372, ATCC VR-1245など); Tonateウイルス（例えば、ATCCVR-925など);トリニティウイルス（例えば、ATCC VR-469など);ユナウイルス（例えば、ATCC VR-374など);ワトロアウイルス（例えば、ATCC VR-926など); Y-62-33ウイルス（例えば、ATCC VR-375など) ；O'Nyongウイルス、東部脳炎ウイルス（例えば、ATCC VR-65, ATCC VR-1242など);西部脳炎ウイルス（例えば、ATCC VR-70, ATCC VR-125L, ATCC VR-622, ATCC VR-1252など);コロナウイルス（例えば、ATCC VR-740, Hamre, Proc Soc Exp Biol Med, 121: 190 (1966)に記載されるウイルス) に由来するベクターなどが挙げられる。
【００３２】
ウイルスベクターを使用しない導入方法としては、特に限定はないが、例えば、ネイキッドDNA法、マイクロインジェクション法、リガンド-DNA複合体法、リポフェクション法、リポソーム法、赤血球ゴースト法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、遺伝子銃法等が挙げられ、目的に応じて好適な方法を選択すれば良い。
Ex vivo法で投与する場合は、常法に従って本発明の遺伝子の導入が望まれる細胞、例えば、造血幹細胞、リンパ球、血管内皮前駆細胞等を採取し、採取された細胞に本発明の遺伝子を上記した方法によって導入し、得られた細胞を生体内に戻すことにより本発明の遺伝子を投与することが出来る。
In vivo法で投与する場合、例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内に投与、あるいは腎臓、肝臓、肺、脳、神経、心臓等の疾患の対象部位に直接投与することが出来る。製剤形態には、特に限定はないが、例えば注射剤とすることが出来る。また、リポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（HVJ)-リポソーム等）の形態にした場合は、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることができる。
これら各種の遺伝子導入の方法は、細胞や器官等の大きさ、種類等によって適宜に採択することができる。
本明細書で用語「ネイキッドDNA」とは、哺乳動物での発現のために哺乳動物へ投与されるポリヌクレオチドDNAを指していてよい。ポリヌクレオチドとしては、例えば、コード配列であってよく、ポリヌクレオチドDNAは、一旦DNAが細胞内に入るとコード配列が容易に発現するように発現制御配列に直接的または間接的に結合しているものであってよい。間接的な結合としては、哺乳動物細胞でのDNAの発現を容易にする目的で調節領域とコード配列を結合するためとか、他の配列を組み込むのを容易にするなどのため、リンカーまたはスペーサーを介して２つのポリヌクレオチド領域を一緒に結合することを含んでいてよい。
【００３３】
本明細書で「ベクター」とは、１つ又は複数の目的の配列または遺伝子の発現を指示することのできる集合体（アセンブリ）を指している。ベクターは、転写プロモーター／エンハンサー、１または複数の遺伝子座を規定しているエレメント、さらにはオールターナティブ・スプライシング、核RNA輸送、メッセンジャーの翻訳後に起こる修飾、あるいはタンパク質の転写後に起こる修飾などといった過程を指示又は制御している他の遺伝子が発現するのを制御しているその他のエレメントを任意に含んでいなければならない。
さらに、ベクターは、転写される場合に、１つ又はそれ以上の目的の配列または遺伝子に作動可能に連結され、且つ翻訳開始配列として作用するような配列を含まなければならない。必要に応じて、ベクターは、ポリアデニル化を指示するシグナル、Neo、TK、ハイグロマイシン、ブレオマイシン（フレオマイシン）、ヒスチジノール、DHFRなどのような選択マーカー、１つ又はそれ以上の制限酵素部位および翻訳終結配列を含んでいてよい。さらに、ベクターがレトロウイルス中に配置される場合、ベクターは、パッケージングシグナル、長末端反復配列（LTR) 、そして、もしそれが無いなら、使用されるレトロウイルスに適したプラス鎖やマイナス鎖のプライマー結合部位を含まなければならない。
遺伝子治療技術は、例えば、日経サイエンス,1994年4月号,20-45頁、月刊薬事,36(1),23-48（1994）、実験医学増刊,12(15)(1994)、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」,羊土社（1996）などを参照できる。
【００３４】
本明細書で「患者」とは、生きている生物で任意の治療又は予防処置可能なものをさしてよく、真核生物または原核生物を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、患者である真核生物としては、脊椎動物であってよい。したがって、例えば、患者は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、ヒトが挙げられる。
本発明のガレクチン９利用遺伝子治療剤の１つの態様では、ガレクチン９が保有する生理活性又は生物活性の不足又は欠如に起因する疾患・病気・異常状態を処置する技術を提供する。該処置技術としては、例えば、分泌型ガレクチン９発現ベクターを提供する工程及び／又は当該疾患などを有する哺乳動物に有効量の分泌型ガレクチン９を発現せしめる工程などが挙げられる。ガレクチン９（又はガレクチン９改変体）利用遺伝子治療剤及び／又は遺伝子治療法は、悪性腫瘍細胞に対する細胞傷害活性、悪性腫瘍細胞に対してのアポトーシス誘導活性、悪性腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性（抗がん活性）、活性化T細胞のアポトーシス誘導活性、特にCD4陽性T細胞のアポトーシス誘導活性、免疫調節活性、抗炎症作用、抗アレルギー作用を発揮することから、抗腫瘍剤（抗がん剤）、抗アレルギー剤、免疫調節剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤として期待できるものである。該処置技術は、活性化Ｔ細胞が顕著な自己免疫疾患を処置する方法を包含する。「自己免疫疾患」、および「自己免疫」とはすべて、哺乳動物での自己免疫によって特徴づけられる障害（これは、自己成分に対する免疫系の応答である)をいう。自己免疫応答は、臨床的兆候を現す症状に進展し得るものである。厳密にいえば、移植拒絶は自己免疫反応ではないが、患者が症状的に細胞、組織、または器官を置換したりあるいは移植するといった外科手術を受ける場合、同種移植を受ける体というものは、外来移植に対して免疫学的に反応するものである。種の１つのメンバーから他の種への、細胞、組織、または器官の同種移植中に、受容体（レシピエント）では移植された細胞、組織、または器官を拒絶するのに十分な免疫応答が生じる場合では、「移植拒絶」が起こるのである。
【００３５】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤によって処置することができる「腫瘍」の例としては、悪性腫瘍が含まれていてよく、例えば、転移をする腫瘍は悪性腫瘍で、一般的にその悪性腫瘍は上皮性と非上皮性のものがあるとされ、ある場合には、がん、肉腫、白血病などに区分して考えられることもあるが、単に「がん」と呼んだ場合、一般人では悪性腫瘍を指すことが多い。本明細書で「がん」とは、広い意味で解釈してよく、単に上皮性の悪性腫瘍と解釈すべきではない。本明細書において「がん」とは、上皮性悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍（腫瘍形成性のものも非形成性のものも含む）を包含していてよく、皮膚がん〔メラノーマ（悪性黒色腫）を含めてよい〕、乳がん、卵巣がん、子宮がん（子宮頸がん、子宮体がんを含めてよい）、膣がん、外陰がん、陰茎がん、睾丸悪性腫瘍（精巣腫瘍を含めてよい）、前立腺がん、膀胱がん、腎がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、咽頭・喉頭がん（上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん）、舌がん、口唇がん、歯肉がん、上顎がん、食道がん、胃がん、結腸・直腸がん（大腸がん）、肺・気管支がん、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、肝がん（肝細胞癌、肝内胆管がんを含む）、肝外胆管・胆嚢がん、膵臓がん、膵液腺がん、白血病、悪性リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、基底細胞腫、繊毛上皮腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、悪性血管腫、悪性血管内皮腫、脊髄腫瘍、脳腫瘍（メニンギオーマ、グリオーマ、アストロサイトーマなどを含む）等が挙げられるが、これらに限定されることなく、本発明のガレクチン９（又はガレクチン９改変体）利用遺伝子治療用剤を使用することで好ましい結果が得られるもの、さらには当該分泌型ガレクチン９（又はガレクチン９改変体）が関与して何らかの生理的又は生物学的な応答が得られるものは含まれてよいと理解されるべきである。
【００３６】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤によって処置することができる「自己免疫疾患」の例としては、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、グッドパスチャー(Goodpasture)症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、変形性関節症、慢性関節炎リウマチ、抗コラーゲン抗体による強皮症（schleroderma)、複合化結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自発性不妊症、糸球体腎炎、水疱性類天庖瘡、アドレナリン作用性薬物耐性、慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫ベースの内分泌腺不全、白斑、脈管炎、心筋梗塞後遺症（post-myocardial infarction)、心臓穿孔症候群、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫ベースの喘息、自己免疫ベースの炎症性反応、肉芽腫症障害、強直性（alkylizing)脊椎炎、連鎖球菌感染後(poststreptococcal)糸球体腎炎、自己免疫溶血性貧血、脳炎、リンパ腫に対する二次的自己免疫反応、変性障害、萎縮性障害などが挙げられる。レセプター自己免疫を表す自己免疫疾患としては、例えば、グレーブス病、重症筋無力症、インスリン耐性症などが挙げられる。アドレナリン性薬物耐性の自己免疫疾患としては、例えば、喘息および嚢胞性線維症などが挙げられる。
本発明における他の自己免疫疾患としては、例えば、動物モデルが存在するものが挙げられ、例えば、シェーグレン症候群（自己免疫涙腺炎(dacryodentis)または免疫媒介唾液腺炎)、自己免疫心筋炎、原発性胆汁性肝硬変（PBC)、炎症性心臓病、水銀誘導性腎自己免疫、インスリン依存性糖尿病（Ｉ型糖尿病またはIDD)、胸腺切除術後自己免疫、中枢神経系（CNS)脱髄障害、CNS狼瘡、睡眠発作、免疫媒介PNS障害、変形性関節症、慢性関節炎リウマチ、ブドウ膜炎、髄質嚢胞性線維症、自己免疫溶血性疾患、自己免疫脈管炎、卵巣自己免疫疾患、ト強皮症（scheroderma)などが挙げられる。中枢神経系（CNS)脱髄障害によって特徴づけられる自己免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症（MS)などが挙げられる。末梢神経系（PNS)自己免疫疾患は、例えば、ギヤン−バレー症候群（GBS)であってよい。
【００３７】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤によって処置することができる「炎症性疾患」としては、各臓器でおこる種々の急性および慢性炎症、アレルギー性および自己免疫性の炎症、感染症等が挙げられる。急性および慢性疾患としては、肺炎では、例えば、気管支炎、気管支肺炎、間質性肺炎、肺臓炎、細気管支炎や急性縦隔炎などが挙げられ、さらにその他の臓器の炎症、例えば、心外膜炎、心内膜炎、心筋炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽頭炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、虫垂炎、虚血性大腸炎、薬物性大腸炎、直腸炎、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎などの種々の急性および慢性肝炎や肝硬変、胆嚢炎、急性膵炎、慢性膵炎、また急性および慢性腎炎、膜性腎炎、糸球体腎炎、IgA腎症などや、種々の膀胱炎、脳髄炎、乳腺炎、皮膚炎、表層角膜炎、乾性角結膜炎、種々の中耳炎や鼻炎、副鼻腔炎や鼻茸など、歯肉炎、歯周炎、歯周囲炎など、種々様々な炎症が含まれる。
また神経性炎症（例えば、神経性胃炎、神経性膀胱炎など）にも有効と考えられる。例えば、分泌型ガレクチン9発現ベクターで遺伝子治療すると、カプサイシン誘導神経性皮膚炎症において、その炎症反応に対する強い抑制効果を得ることが可能と考えられる。カプサイシンは末梢神経を刺激することにより、神経性炎症や痛みを引き起こす物質である。カプサイシンは、知覚神経C線維末端に貯蔵されている神経ペプチドであるサブスタンスPの遊離刺激作用を有する。サブスタンスPは肥満細胞からヒスタミンを遊離させる作用を有し、その結果血管が拡張され、浮腫が生じる。また、遊離されたヒスタミンにより知覚神経が刺激を受け、C線維末端からサブスタンスPが放出され、その周囲の肥満細胞に作用し、更にヒスタミンを遊離させるという増強サイクルが成立する。分泌型ガレクチン9の発現はこの病態形成の抑制作用を有すると期待される。
さらに、カプサイシンは、感覚神経終末の痛み受容センサーであるカプサイシン受容体（バニロイドレセプター）に結合し、痛みを引き起こす。痛みは化学的刺激（酸など）、熱刺激（熱湯など）や過剰な機械的刺激（打撲など）によって感覚神経終末が活性化されることによって引き起こされ、カプサイシン受容体はこのような刺激による痛みにも関与している。そこで、分泌型ガレクチン9による遺伝子治療処理で、カプサイシン受容体による神経終末の活性化を抑制でき、がんや炎症に伴う痛みの軽減等、鎮痛作用への可能性も期待できる。
【００３８】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤によって処置することができる「アレルギー性疾患」あるいは「アレルギー性炎症疾患」としては、全身性アナフィラキシー、気管支喘息、過敏性肺炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、免疫複合体がおこすアレルギー性疾患、血管神経性浮腫等が挙げられる。
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤は免疫性疾患にも有効と考えられる。リウマチなどを含む免疫性疾患、および炎症性腸疾患、間質性膀胱炎及びその他のマスト細胞の無秩序な活性化が発症に関与する病気又は疾患なども含まれてよい。
また、自己免疫性の炎症（自己免疫疾患）には、全身性（慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、結節性多発性動脈炎、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病など）、神経系（多発性硬化症、重症筋無力症、HAM（HTLV-1脊髄症）、筋萎縮性側索硬化症など）、内分泌性（バセドウ病、橋本病、1型糖尿病など）、血液（特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血など）、呼吸器（サルコイドーシス、肺繊維症など）、消化管（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、肝臓（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性胆管炎など）、腎・尿路系（抗好中球細胞質抗体関連腎炎、血管炎、グッドパスチャー症候群、抗糸球体基底膜抗体病など）等がある。
【００３９】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤によって処置することができる「感染症」としては、病原体が生体の細胞・組織・臓器を傷害することによって生じる疾患が包含され、監修：町並陸生、編集：秦順一、坂本穆彦、「標準病理学（第2版）」、医学書院、2002年3月15日発行を参考にすることができる。ヒトに感染症をもたらす病原体には、1）細菌（スピロヘータ、クラミジア、リケッチアを含む）、2）ウイルス、3）真菌、4）植物（藻類）、5）原虫、6）寄生虫（吸虫、条虫、線虫）、7）節足動物がある。各病原体がもたらす主な疾患には、細菌性感染症（コレラ、ペスト、大腸菌感染症など）、スピロヘータ感染症（レプトスピラ症など）、クラミジア感染症（オウム病など）、リケッチア感染症（発疹チフス、破傷風など）、ウイルス性感染症（帯状疱疹、ウイルス性出血熱、狂犬病など）、真菌症（ガンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギウス症など）、原虫性疾患（アメーバー赤痢、マラリア、トキソプラズマ症など）、寄生虫（吸虫症、線虫症など）、その他、マイコプラズマ感染症（マイコプラズマ肺炎など）、ミコバクテリア感染症（結核、非定型抗酸菌症など）が挙げられる。例えば、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、成人T細胞白血病ウイルス(ATL)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)などのレトロウイルス及びそれに関連する病気又は疾患に対しても有効と考えられる。
【００４０】
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤は皮膚科領域にも適用でき、例えば、1)皮膚疾患には、感染症、アレルギー性炎症や自己免疫性炎症を含む炎症や、乾癬、水疱症、膿疱症、角化、角化異常症など特有の炎症がある。また、2)美容皮膚科関連としては、a)メラニン代謝調節（美白）〔分泌型ガレクチン９遺伝子導入メラノーマ細胞での黒色調から白色に変化。皮膚基底細胞層での分泌型ガレクチン９感受性細胞〕、b)毛髪成長（発毛）の調節、ｃ)コラーゲン産生調節などが挙げられる。
本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤は生活習慣病に適用でき、該生活習慣病としては、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、糖尿病などが挙げられる。生活習慣病動脈硬化症の病態形成に関与する細胞の一つである泡沫細胞にgal9陽性細胞と陰性細胞が存在することが明らかになっている。このことより動脈硬化症の病態にはgal9の関与が示唆され、それを制御することで治療や予防することが可能となることが否定できない。高血圧では動物実験モデルにて高血圧発症の際にガレクチン９が尿細管や糸球体の発現が増強することからガレクチン９発現を制御したり、分泌型ガレクチン９発現ベクターを投与することによって治療できる可能性が高い。
また、正常細菌叢の維持にも適用でき、例えば、gal9は腸管の上皮に正常においても強く発現されており、また悪玉細菌叢を投与した際には、腸管上皮及びマクロファージなどの炎症細胞におけるガレクチン９の発現が増強する。このことから消化管における正常細菌叢の維持にガレクチン９が関与していることが強く示唆される。
【００４１】
さらに、アミロイドーシスに適用でき、例えば、アミロイドーシスを認める部分でのマクロファージでは、ガレクチン９発現を示すマクロファージの存在がある。分泌型ガレクチン９発現によってアミロイド沈着を制御できる可能性がある。
アルツハイマー病、骨粗鬆症、骨折などにも有用と考えられ、例えば、アルツハイマー病患者の脳において変性した神経細胞はガレクチン９陽性所見を示す。よって、治療に用いることが出来る可能性がある。また、骨粗鬆症では、ガレクチン９には、骨吸収は抑制し骨形成は促進する可能性が考えられる。このような作用は、骨代謝の面から考えると理想的な薬剤と考えられる。
また、脳、神経領域においても有用で、例えば、脳梗塞、心筋梗塞等の虚血性病変の進展は、炎症細胞の湿潤を伴い、スーパーオキサイド産生等が起こり、悪化する。その炎症をガレクチン９並びにガレクチン９改変体が制御することが期待できる。炎症、免疫系の変化が原因となる脱骨髄性疾患として、例えば多発性硬化症などがある。変性疾患として、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病なども挙げられる。また、統合失調症は何らかの炎症性の変化が原因と言われている。すなわち、EPA（エイコサペンタエン酸）は脳で炎症反応の制御や神経細胞膜の形成に用いられる。統合失調症患者では細胞膜中のEPAやその他の必須脂肪酸が枯渇していることを示す研究例がある。
【００４２】
痛風に対してもガレクチン９並びにガレクチン９改変体が有用と期待でき、本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤が有用と考えられる。尿酸結晶の組織沈着に対する痛みの強い急性炎症に対してもガレクチン９並びにガレクチン９改変体がそれを制御することが期待でき、本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤が有用と考えられる。
喘息は可逆性の気道閉塞（喘息発作）を来たす呼吸器疾患で、抗原特異的（アレルゲン）あるいは非特異的（感染、冷気など）な刺激に対する気道の反応性が亢進している状態を指している。近年、喘息の気道には発作のない安定期にも好酸球、Ｔリンパ球、及び肥満細胞を主体とした炎症が存在することが証明され、現在、喘息の本体は慢性の気管支炎であると考えられている。また、小児喘息の多くはアトピー素因(IgE産生)との関連が強いが（アトピー型喘息）、成人喘息ではIgEの関与が証明できないものが約半数に認められる（非アトピー型喘息）。喘息予防・管理ガイドライン（1998年厚生省研究班）が作成され、喘息治療は急性発作と慢性気道炎症の二つに分けて行われている。発作治療薬としては、気管支拡張薬（β2刺激薬、アミノフィリン）が第一選択薬として用いられているが、中等症以上の発作ではこれらの薬剤では不十分で、ステロイド薬の大量全身投与が行われる。ステロイド薬は副作用が大きく、特に、消化性潰瘍、高血圧、高血糖、精神症状等が重大で、長期に使用すれば、感染症、副腎抑制、骨粗鬆症などが問題となってくる。また、合併症を伴う場合は、ステロイドの使用は危険を伴う。副作用が少なく、ステロイドと同等の効果を持つ薬剤の開発が求められている。長期的な管理薬として慢性気道炎症の治療には抗炎症薬が主体となっているが、なかでも吸入ステロイド薬の使用が推奨されている。該ステロイド薬を長期に大量に使用した場合、副腎抑制、骨粗鬆症、気道感染などの副作用が出現する可能性は否定できない。また、吸入薬は正確な吸入手技が要求され、内服薬に比較してコンプライアンスという点で劣っている。中等症以上の喘息では、吸入ステロイド薬に加えて、吸入β2刺激薬、ロイコトリエン拮抗薬あるいは徐放性テオフィリン薬の併用が推奨されている。重症例ではステロイドの全身投与が余儀なくされている。こうした薬剤に代わる薬剤の開発が求められている。
【００４３】
喘息の病態形成において、Ｔリンパ球、好酸球の肺組織及び気道への浸潤が重要な役割を果たすことが知られている。一方、ガレクチン９は、細胞のアポトーシスを誘導する機能を有し、活性化Ｔ細胞及び好酸球のアポトーシスを誘導する。こうしたことを踏まえたガレクチン９改変体などを使用した研究から、ガレクチン９並びにガレクチン９改変体が喘息における気道炎症を改善（抑制）する活性を有することが明らかにされており、本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤が有用と考えられる。
さらに、ガレクチン９並びにガレクチン９改変体は、骨芽細胞増殖と分化の増強及び破骨細胞分化抑制活性を有しており、骨粗鬆症の予防及び／又は治療、ステロイド長期投与で問題となる副作用の一つ、骨生育抑制に対しても有効であると考えられ、本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤が有用と考えられる。
ガレクチン９並びにガレクチン９改変体は、リンパ球に対する作用においてステロイドとは異なり、活性化リンパ球特異的な抑制作用を示し、ステロイドに比して副作用、例えば、免疫抑制が少ないことが期待できるので、本発明の遺伝子治療方法および遺伝子治療剤も有用と考えられる。また、ステロイドに存在しない接着分子の機能抑制及び神経性炎症の抑制作用を示して、喘息治療、例えば、発作治療薬として有望である。またステロイドの副作用を軽減することも可能と思われる。
【００４４】
本発明の活性成分は、本明細書で説明している、(a) 分泌型ガレクチン９あるいは分泌型ガレクチン９改変体及びそれと実質的に均等な生物活性を有するポリペプチドなど、(b) 分泌型ガレクチン９あるいは分泌型ガレクチン９改変体及びそれと実質的に均等な生物活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、(c) 分泌型ガレクチン９あるいは分泌型ガレクチン９改変体発現技術を利用して見出された因子など、(d) 分泌型ガレクチン９あるいは分泌型ガレクチン９改変体及びそれと実質的に均等な生物活性を有するポリペプチド遺伝子導入ベクターなどが挙げられ、それらはヒトガレクチン９が正常細胞には傷害活性を示さず、腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示すという性状、腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導するが、正常細胞にはアポトーシスを誘導しないという性状、悪性細胞の転移性を抑制するという性状、活性化された免疫細胞、特には活性化したCD4陽性T細胞のアポトーシスを誘導する活性（これに対しレスティングT細胞、特にCD4陽性T細胞（ヘルパーT細胞）のアポトーシス誘導はそれを誘導しないという性状）などを利用する上で有用であり、抗腫瘍剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤、副腎皮質ステロイドホルモンと同様な活性を利用する薬剤として有望である。
複数の遺伝子導入ベクターを、動物または植物に投与することができる。好ましい実施態様において、動物は温血動物であり、さらに好ましくは、マウス、ニワトリ、ウシ、ブタ、例えば、ネコおよびイヌなどのペット 、ウマ、およびヒトからなる群より選択される。
【００４５】
ポリペプチド発現に有用な遺伝子治療剤（例えば、天然または改変体の分泌型ガレクチン９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなど) 関しては、組織を標的とした投与では、患者（例えば、哺乳動物) におけるポリヌクレオチド発現に応じて、コード配列または非コード配列を発現することが可能な構築物を含むベクターを次のように投与できる: 局所的投与の遺伝子治療プロトコルでは、約100ng〜約200mg DNA、あるいは約500ng〜約50mg DNA、または約１μg〜約2mg DNA、あるいは約5μg DNA 〜約500μg DNA 、そして遺伝子治療プロトコルにおける局所投与の間では、約20μg 〜約100μg の範囲、そして例えば、注射あたりまたは投与あたり約500μg の用量で投与することができる。より多くの発現が所望される場合では、組織のより広い領域にわたって、より多くの量のDNAまたは同じ量のDNAが連続投与プロトコルに従い再投与されようし、例えば、腫瘍部位の異なる近接または密接した組織部分へいくつか投与され、そうしたことは陽性の治療結果をもたらすために必要とされよう。
本発明の活性成分は、その投与量を広範囲にわたって選択して投与できるが、その投与量及び投与回数などは、処置患者の性別、年齢、体重、一般的健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄速度、薬物の組み合わせ、患者のその時に治療を行なっている病状の程度に応じ、それらあるいはその他の要因を考慮して決められる。
明細書及び図面において、用語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【００４６】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
なお、以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに処理条件などは、DNA クローニングではJ. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd edition (1989) & 3rd edition (2001) ", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York及び D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); PCR 法を使用する場合には、H. A. Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995) 及び M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols", Academic Press, New York (1990)に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書(protocols) や添付の薬品等を使用している。
G9NC(null)は、PCT/JP 2005/006580 (出願日2005.03.29)に開示され、PCT/JP 2005/006580の実施例１で製造取得されている。
【実施例１】
【００４７】
〔B16/F10細胞への遺伝子導入〕
マウス悪性黒色腫由来のB16/F10細胞を用いたマウス肺転移モデルにおいて、ガレクチン９改変体による癌細胞の転移抑制効果を認めている（図１および図２）。
そこで、マウス悪性黒色腫由来のB16/F10細胞に(a)シグナルペプチドを有しない野生型マウスガレクチン9M(mGal-9M)の発現ベクターおよび(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(mGal-9M)(分泌型マウスガレクチン9)の発現ベクター、さらに(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトした細胞株を樹立した。
ガレクチン-9の発現を構成的に促進させた癌細胞株を樹立する目的で、マウスガレクチン-9発現プラスミドを作成し、メラノーマ細胞B16/F10に導入した。以下に実験の概略を述べる。
樹立した遺伝子導入細胞は、(a)B16/F10細胞にマウスガレクチン9(M)(mGal-9M)をトランスフェクトした細胞(mGal-9)と(b)シグナルペプチドを付加したマウスGal-9Mをトランスフェクトすることにより、マウスGal-9Mを恒常的に分泌する(sec mGal-9)細胞と(c)各細胞のコントロールとなるmockベクターを導入した細胞(mock)の３種類である。
マウスガレクチン-9の塩基配列は、J. Biol Chem., 1997: 272(9), pp.6078-6086に記載されている。
【００４８】
〔ガレクチン９発現ベクターの作製〕
マウスガレクチン-9発現のために用いた２種類の発現プラスミドのひとつは発現ベクターpCXN2のプロモーター下流にマウスガレクチン-9遺伝子を挿入したpCXN2/mG9であり、もうひとつはpSecTag2/HygroB(Invitrogen)由来のシグナルペプチドをコードする塩基配列をマウスガレクチン-9遺伝子の上流にフレームが合うように連結し、これをpCXN2のプロモーター下流に導入したpCXN2/Igk-mG9である。pCXN2/mG9では天然型のガレクチン-9が細胞質中に蓄積し、一方pCXN2/Igk-mG9ではシグナルペプチドの働きでガレクチン-9がERを経由する古典的な経路で細胞外に分泌される。
作製したヒトおよびマウスガレクチン発現プラスミドは定法に基づき癌細胞に導入した。ここではリポフェクション法（キットはQiagen社やGibco社などから発売）を用いたがその他の方法、たとえばリン酸カルシウム共沈法やエレクトロポレーション法なども同様の目的に使用可能である。安定発現株のクローニングには遺伝子導入操作を施した細胞を抗生物質存在下で培養し、耐性となった株を選択した。マウスガレクチン-9発現プラスミドを用いた場合にはG-418を、ヒトガレクチン-9発現プラスミドを用いた場合にはハイグロマイシンBを選択のための抗生物質として用いた。以下にマウス悪性黒色腫細胞B16/F10へのマウスガレクチン-9遺伝子導入の具体例を挙げる。すなわち、作成したプラスミドをB16/F10細胞に導入した。また、コントロールとしてpCXN2をB16/F10細胞に導入した
【００４９】
〔B16/F10細胞の培養〕
B16/F10細胞は10% FBS(JRH)加RPMI(SIGMA)培地で培養した。2×105個の細胞を75cm2フラスコ(SUMILON)に播き、2日後に回収し継代する。2日間で約10倍に増殖する。継代数が多くなった細胞は使用しない。回収時に細胞の一部を遺伝子導入に使用した。
【００５０】
〔遺伝子導入法〕
B16/F10細胞への遺伝子導入には、カチオン性脂質LipofectamineTM2000試薬（invitrogen, No.11668-027）によるDNA導入法を用いた。方法は「真核細胞への遺伝子導入ガイド」（Invitrogen）内のLipofectamineTM2000試薬96-ウェルトランストランスフェクションの迅速代替プロトコールに従って行った。
(1) Opti-MEMTMI培養液（Invitrogen）で各DNAを320ng/25μLに調製し、各ウェルに25μLずつ添加した。
(2) LipofectamineTM 2000試薬(invitrogen)1.0μLをOpti-MEMTMI培養液25μLに加えた脂質試薬希釈液を調製した。
(3)希釈したDNA((1))を含む各ウェルに脂質試薬希釈液((2)) 25μLを添加し、室温で20分間反応させた。
(4)各ウェルにB16/F10細胞を1×105/100μL（10% FCS加RPMI）ずつ添加して軽く混合後、24時間培養した。
(5) 選択培地 G418（250μg/mL）加RPMIを用いて、遺伝子導入した細胞をセレクトした。
遺伝子導入細胞によるガレクチンの発現はガレクチン-9に特異的なELISAおよびウエスタン解析によって確認した。以下にB16/F10細胞にガレクチン-9発現プラスミドを導入した細胞を用いた場合のウエスタン解析の具体的な方法を挙げる。
【００５１】
〔ウエスタン・ブロッティング〕
ウエスタン・ブロッティング法でmouse-Gal-9を検出測定した。
〔1)細胞の培養方法〕
使用した細胞は(a)B16/F10細胞にマウスガレクチン9(M)(mGal-9M)をトランスフェクトした細胞(mGal-9)と(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9(M)をトランスフェクトすることにより、マウスガレクチン9(M)(mGal-9M)を恒常的に分泌する(sec mGal-9)細胞と(c)各細胞のコントロールとなるmockベクターを導入した細胞の（mock）の３種類である。全ての細胞は10%FBS（JRH）加RPMI(SIGMA)培地で培養した。 2×105個の細胞を75cm2フラスコ(SUMILON)に播き、2日後に回収し継代を行う。2日間で約10倍に増殖する。継代数が多くなった細胞は使用しない。
〔2)サンプルの作製〕
細胞を３日間培養し、その培養上清を採取し、サンプルとした。
【００５２】
〔3)ウエスタン・ブロッティング法〕
2×サンプルバッファー（0.125M Tris-HCl(pH6.8),10% 2-Mercaptoethanol, 4% SDS, 10% Sucrose, 0.004% Bromophenol blue）で細胞数1×106/50μLに調整し、ゲルに10μLずつ(2×105個)アプライし、泳動装置で泳動した(20mA、1時間)。分子量マーカーとしてPrecision Protein Marker, Broad Range (BioLabs)を使用した。次に転写装置で100V、1時間転写し、終了後、洗浄バッファー(0.05% Tween 20加TBS(10mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl）、Tween-TBS)で2回洗浄した。その後5%スキムミルク加Tween-TBSに浸け、4℃でオーバーナイトでブロッキングを行った。翌日、5μg/mLの一次抗体 (Polyclonal Anti-mouse G9)を室温にて1時間反応させた。反応後、洗浄バッファーで5回洗浄した。次に二次抗体 (AP-Goat Anti-rabbit IgG(H+L): ZYMED, 65-6122)を室温にて1h反応させた。洗浄バッファーで5回洗浄後、Alkaline Phosphatase Substrate Kit II <VECTOR Black> (フナコシ)を用いて、発色させた。
各遺伝子導入した細胞の培養上清を抗マウスガレクチン９ポリクローナル抗体によるウエスタン・ブロッティング法によりガレクチン９分泌を確認したところ、分泌型マウスガレクチン９を導入したB16/F10細胞の培養上清中にのみガレクチン９が検出された（図３）。
【実施例２】
【００５３】
〔B16/F10細胞により遺伝子治療の可能性〕
遺伝子導入したB16/F10細胞とそのコントロールB16/F10細胞のそれぞれを、マウスの尾静脈に投与し、肺への転移を肺の結節数をカウントして調べることにより、ガレクチン−９を利用した遺伝子治療の可能性を検討した。
1)細胞の培養方法
本発明者等が樹立した上記のB16/F10細胞にマウスガレクチン9(M)(mGal-9M)をトランスフェクトした細胞(mGal-9)と、シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9(M)をトランスフェクトすることによりマウスガレクチン9(M)(mGal-9M)を恒常的に分泌する(sec mGal-9)細胞と、各細胞のコントロールとなるmockベクターを導入した細胞(mock)の３種類を使用した。全ての細胞は10% FBS(JRH)加RPMI(SIGMA)培地で培養した。 2×105個の細胞を75cm2フラスコ(SUMILON)に捲き、2日後に回収し継代を行う。2日間で約10倍に増殖する。継代数が多くなった細胞は使用しない。
【００５４】
2)転移モデルにおけるガレクチン９の効果判定実験
1)の方法にて培養した各遺伝子導入B16/F10細胞を回収し、PBS(-)で2回洗浄後（遠心:1500rpm, 5min）、各細胞を2×105個/200μLになるようにPBS(-)で調製した。調製した各細胞をC57/BL6マウス (SLC、6週令、雌) 1匹あたり2×105個/200μL、27ゲージの注射針で尾静脈内に投与した。接種後10日目にネンブタール（大日本製薬）による麻酔を行い、脱血死後、肺の結節数をカウントした。肺の結節数をノンパラメトリックなマン・ホイットニーのU検定(Mann-Whitney's U test)で解析した。
得られた結果を図４（肺の結節数）に示す。分泌型マウスガレクチン９遺伝子細胞投与群（sec mGal-9群）で明らかな転移の抑制が認められた。肺の結節数の比較では、mock導入細胞投与群（mock群）では127.2±17.99であるのに対してマウスガレクチン９遺伝子導入細胞投与群（mGal-9群）では112.6±12.47で有意差は認められないが、sec mGal-9群では9.6±5.6となり、mock群と比較してp<0.0001で有意性が認められた（マン・ホイットニーのU検定）。さらに、肺の外観を図５に示した。個々の転移巣のサイズはmock群やmGal-9群と比較するとsec mGal-9群が有意に小さかった。
【００５５】
3)転移モデルにおけるガレクチン９の効果判定実験
2)と同様に各遺伝子導入B16/F10細胞を回収し、C57/BL6マウス(SLC、6週令、雌) 1匹あたりに各遺伝子導入B16/F10細胞5×105個/200μL、27ゲージの注射針で尾静脈内に投与した。マウスの生存率を測定し、Kaplan-Meier検定にて解析した。得られた結果を図６（生存率）に示す。すなわち、同様の系において生存率を比較したところ、やはりsec mGal-9群では、mock群と比較してp<0.0001で有意に延命効果が認められた(Kaplan-Meier検定)。
【実施例３】
【００５６】
〔皮下移植モデルでの遺伝子治療の可能性〕
マウス肝癌由来のMH-134細胞を用いた皮下移植モデルにおいても遺伝子治療の可能性を検討した。
(a)野生型マウスガレクチン9Mの発現ベクター、(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(分泌型マウスガレクチン９)の発現ベクターと(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトしたMH-134細胞を樹立した。これらの細胞をマウスに皮下移植し、腫瘍重量と動物の生存率を調べた。
1)細胞の培養方法
遺伝子導入細胞の作製は、B16/F10細胞と同様に行った。実験には、MH134細胞にマウスガレクチン9(M)をトランスフェクトした細胞(mGal-9)と、MH134細胞にシグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9(M)をトランスフェクトすることにより、マウスガレクチン9(M)を恒常的に分泌する(sec mGal-9)細胞と、各細胞のコントロールとなるMH134細胞にmockベクターを導入した細胞(mock)の３種類を使用した。
全ての細胞は10%FBS(JRH)加RPMI(SIGMA)培地で培養した。2×105 個の細胞を75cm2フラスコ (SUMILON)に捲き、2日後に回収し継代を行う。2日間で約10倍に増殖する。継代数が多くなった細胞は使用しない。
【００５７】
2)癌性腹膜炎モデルにおけるガレクチン９の効果判定実験
1)の方法にて培養した各細胞を回収し、PBS(-)で2回洗浄後（遠心:1500rpm, 5min）、各細胞を2.5×106個/200μLになるようにPBS(-)で調製した。調製した各細胞をC3H/HeNマウス (日本クレア：6週令、♀) 1匹あたり2.5×106個/200μL、26ゲージの注射針で皮下に投与した。週に3回腫瘍の大きさとマウスの生存率を測定した。腫瘍の容積（V）は次式：
V=1/2×長軸×短軸の二乗
により計算して求めた。得られた結果を図７（腫瘍重量）に示す。
3)統計処理
2)で得た動物の生存率を Kaplan-Meier検定で解析した。得られた結果を図８（生存曲線）に示す。
(a)野生型マウスガレクチン9Mの発現ベクター、(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(分泌型マウスガレクチン９)の発現ベクターと(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトしたMH-134細胞を樹立し、これらの細胞をマウスに皮下移植し、腫瘍重量（図７）と生存率（図８）を調べた。かくして、このモデルにおいても分泌型マウスガレクチン９遺伝子導入細胞投与群において、明らかな腫瘍増殖抑制効果と延命効果が認められた。癌細胞移植後24日目のマウスを図９に示す。
以上のことより、分泌されたガレクチン９が抗腫瘍活性（転移抑制、腫瘍増殖抑制、宿主延命）を有することが明らかとなり、分泌型ガレクチン９発現ベクター導入による遺伝子治療の可能性と有用性が示唆された。
【実施例４】
【００５８】
(i) 分泌型ガレクチン-9作成のためには真核生物由来の各種分泌シグナルを用いることができる。同目的に汎用される市販の発現ベクターにはプレプロトリプシンのシグナルを用いたもの（pFLAG-CMV シリーズ、Sigma）、アルカリホスファターゼのシグナルを用いたもの（pAPtag シリーズ、GenHunter）や Ig kappa のシグナルを用いたもの（pSecTag シリーズ、Invitrogen）などがあり、いずれも有効に用いることが出来る。
分泌型ヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミドの作製には、ヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミドpET11a-hG9NC(null)を出発材料として用いた。このプラスミド作成法は既にWO2005/093064(公開日:2005年10月06日、当該出願の優先権主張の基礎出願である特願2004-287005（出願日: 2004年09月30日）の明細書の段落番号〔0092〕から〔0096〕）に示されているので概略を説明する。Jurkat細胞より定法に基づきcDNAを調製し、それからガレクチン-9のN-末端側糖鎖結合ドメインとC-末端側糖鎖結合ドメインをコードする遺伝子をPCR法にて増幅した。それらをpET11aベクター(Novagen)のNdeI-BamHI siteに挿入してリンカーペプチドを欠く、ヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミドpET11a-hG9NC(null)を作成した。このプラスミド上のヒト安定化ガレクチン-9の遺伝子には5'-側と内部に各１箇所NdeI siteが存在しているので後のクローニング操作を容易にするために、先ずPCR法によって内部のNdeI site(catatg)をcacatgに変異させ、NdeI siteを欠失させた。次にNdeI-XbaIで消化し、ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子の5'-側にSfiI-XbaIアダプター(5'-ctagagttggcctg-3'(配列表の配列番号５)と5'-tacaggccaact-3'(配列表の配列番号６)をアニールさせたもの)を挿入した。このプラスミドをSfiI消化して末端をT4 DNAポリメラーゼを用いて平滑化し、続いてHindIII消化してヒト安定化ガレクチン遺伝子を含むDNA断片を取り出し、発現ベクターpSecTaq2/HygroA(Invitrogen)のSfiI-HindIII site(SfiI siteは切断後T4 DNA ポリメラーゼで平滑化)に挿入して分泌型ヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミドpSecTag2/HygroA siganl-hG9NC(null)を作製した。
【００５９】
構築された分泌型ヒト安定化ガレクチン-9の遺伝子配列(配列表の配列番号２)と予想されるアミノ酸配列(配列表の配列番号１)を図10に示す。下線部はシグナル配列、ボックスで囲まれた配列はクローニングにより新規に生じた配列、その後にヒト安定化ガレクチン-9の配列（2-296 aa）が続く。矢印は予想されるシグナル切断部位。影をつけた配列cacatgはcatatg(NdeI site)に変異を導入してNdeI siteを欠失させた部分。この変異導入によるアミノ酸配列置換は無い。またpSecTag2/HygroA signal-hG9NC(null)の全塩基配列(配列表の配列番号４)を図11〜13に示す。
図14に、分泌型ヒト安定化ガレクチン発現プラスミドを導入したCOS7細胞からのガレクチン分泌を調べた結果（ＡはELISAでの解析、Ｂはウエスタン解析）を示す。図14Bのアローヘッドは非特異的シグナル、矢印は分泌されたガレクチン-9のシグナルを示す。遺伝子配列から想定される分子量は33 kDaであるが、33-40 kDa付近に４本のバンドが見られる。これは分泌されたヒトガレクチン-9が様々な程度の糖鎖修飾を受けていることも考えられる。図３には、マウスガレクチン-9発現プラスミドを導入したB16/F10細胞でのウエスタンブロッティングの結果が示してある。これらの結果より、遺伝子導入によってガレクチン-9 が培養液中に分泌されることが確認された。
【００６０】
(ii) 構築したヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミド(hG9NC(null)を発現するプラスミド)をメラノーマ細胞B16/F10細胞に導入した。
樹立した遺伝子導入細胞は、B16/F10細胞にシグナルペプチドを付加したヒト安定化ガレクチン-9をトランスフェクトすることにより、ヒト安定化ガレクチン-9を恒常的に分泌する細胞(sec hGal-9細胞)と各細胞のコントロールとなるmockベクターを導入した細胞の（mock）の2種類である。作製したヒト安定化ガレクチン-9発現プラスミドは定法に基づき癌細胞に導入した。ハイグロマイシンBを用いて、安定化発現株のクローニングを行った。また、コントロールとしてpSecTag2/HygroAをB16/Ｆ10細胞に導入した。
各細胞への遺伝子の導入確認はPCRで行った（図15参照）。
【００６１】
遺伝子導入確認の具体的な方法は以下のようにして実施した。
(1) 細胞の培養方法
使用した細胞は、sec hGal-9細胞とコントロールとなるmockを導入した2種類である。全ての細胞は10%FBS（JRH）加えRPMI(SIGMA)培地で培養した。 2X105 個の細胞を75cm2フラスコ (SUMILON)に蒔き、2日後に回収し継代を行った。継代数が多くなった細胞は使用しない。
(2) Total RNAの単離
1×106cellsのB16/F10細胞をPBS(-)で洗浄し、ISOGEN（(株)ニッポンジーン(Nippon Gene Co., Ltd.)）、TRIzolTM(invitrogen Life technologies, Catalog No. 15596-026)を500μL加え、22G針付きシリンジで30回ホモジナイズした。100μLのクロロホルムを加え、15秒間ボルテックスで撹拌し、室温に3分間置いた。13000 rpm、15分、4℃で遠心し、透明層を別のエッペンに移し、250μLのイソプロパノールを加え、室温に10分放置。13000 rpm、10分、4℃で遠心後、500μLの80%エタノールを加え、9500 rpm、5分、4℃で遠心。上清を捨てた後、DEPC処理水に懸濁した。試薬はRNase freeを使用した。
(3) RT-PCR
RT-PCR反応は、 GenAmpTM RNA PCR キット(PERKIN ELMER, N808-0017)を用いて、方法は添付のプロトコールに従って行った。
PCR tube(TakaRa)に上記サンプル0.5μg/2-3μL, Master Mix 20μL [25mM MgCl2 solution 4μL, 10×PCR Buffer II 2μL, (dGTP, dATP, dTTP, dCTP mix) 2μL, RNase inhibitor 1μL, Oligo d(T)16 1μL, RNase free water を加えtotal 20μLにする]、MuLV Reverse Transcriptase 1μLを入れて、ピペッティングした。RT-PCR装置（BIO RAD iCyclerTM）にセットし、次の条件で (42℃: 15min, 99℃: 5min, 4℃) RT反応を行った。
RT後のサンプル5μL、目的配列のprimer (あるいはPositive control primer) 0.5μL, PCR Master Mix [25mM MgCl2 solution 2μL,10×PCR Buffer II 4μL, 蒸留水 37.75μL]を混合し、AmpliTaqTM DNA polymerase 0.25μLを入れてピペッティングした。PCRの装置にセットして、次の条件[94℃:1min, (94℃:30sec, 60℃:15sec, 72℃:1min) 30cycle, 72℃:7min, 4℃] で反応を行った。
【００６２】
Primer sequence
hGal9S(10μM) 5'-GAGAGGAAGACACACATGCCTTTC-3' (配列表の配列番号７)
hGal9AS(10μM) 5'-GACCACAGCATTCTCATCAAAACG-3' (配列表の配列番号８)
【００６３】
positive control
GAPDH GSPDH-S1(20μM) 5'-GCCATCAATGACCCCTTCATTGAC-3' (配列表の配列番号９)
GAPDH GSPDH-AS1(20μM) 5'-ACGGAAGGCCATGCCAGTGAGCTT-3' (配列表の配列番号10)
【００６４】
(4) 電気泳動
上記サンプル5μLに蒸留水（4μL）と1μLの10×Loading Buffer（TakaRa:1% SDS, 50% Glycerol, 0.05% Bromophenol Blue）の計10μLを、2％アガロースゲルのウェルにアプライし、100Vで25分間、電気泳動した。
【実施例５】
【００６５】
〔分泌型ヒト安定化ガレクチン発現プラスミドを導入したB16/F10細胞の解析〕
(1) ウエスタン・ブロッティング法およびELISA法により分泌型ヒト安定化ガレクチン発現プラスミドを導入したB16/F10細胞からのガレクチンの分泌を調べた。
1)細胞の培養方法
培養方法は、マウスガレクチン-9をトランスフェクトしたB16/F10細胞の方法に準じた。
sec hGal-9細胞とコントロールとなるmockを導入した2種類の細胞は、10%FBS（JRH）加RPMI(SIGMA)培地で培養した。 2X105 個の細胞を75cm2フラスコ (SUMILON)に捲き、2日後に回収し継代を行う。2日間で約10倍に増殖する。継代数が多くなった細胞は使用しない。
2)サンプルの作製
細胞を3日間培養し、その培養上清を採取し、サンプルとした。
3)ウエスタン・ブロッティング法
電気泳動法およびウエスタン・ブロッティング法は、マウスガレクチン-9をトランスフェクトしたB16/F10細胞のウエスタン・ブロッティング法に準じた。
本法における使用抗体は、一次抗体には抗ヒトガレクチン-9CTポリクローナル抗体を、二次抗体としてAP-Goat Anti-rabbit IgG(H+L)（ZYMED, 65-6122）を使用した。
4）ELISA法
抗ヒトガレクチン-9モノクローナル抗体とポロクローナル抗体を用いたサンドイッチELISA法にて解析した。Standardとして、ヒト安定化ガレクチン-9を用いた（3ng/mL〜1pg/mL）。二次抗体には、Anti-rabbit IgG-HRP (1:1000) (Amersham Biosciences: NA934V)使用した。TMB (KPL 50-76-00)を発色基質とし、1Mリン酸 (Wako 167-02166) で、反応を停止させ、450の吸光度をプレートリーダーで培養上清中の安定化ガレクチン9量を測定した。
【００６６】
分泌型遺伝子を導入したB16/F10細胞からのガレクチン分泌を調べた結果（図16はELISAでの解析、図17はウエスタン・ブロッティングによる解析）を示す。図17の矢印は分泌されたガレクチン-9のシグナルを示すが、分泌されたガレクチン-9は33〜45kDa付近に数本（3〜4本）のバンドが認められる。これは培養上清中に分泌されたヒトガレクチン-9が様々な程度の糖鎖修飾を受けていることも考えられる。分泌型遺伝子を導入したB16/F10細胞の培養上清中のELISA法によるヒトガレクチン-9の検出結果も示した。これらの結果より、遺伝子導入によってガレクチン-9が培養液中に分泌されることが確認された。
【００６７】
(2) 細胞増殖能の解析
テトラゾリウム塩WST-1〔2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt〕を使用したWST-1法にて細胞増殖を解析した。WST-1は生細胞においてのみフォルマザンに分解される。フォルマザン色素量を吸光度計によって測定することにより、生細胞数を定量的に解析することができる。
具体的には96wellプレート(FALCON)にsec hGal-9およびmockをトランスフェクトしたB16/F10細胞を播種し（1×104/100μL）、24時間培養した。24時間培養後、WST-1 (Roche) を10μL入れ、2時間培養し、450nm〜600nmの吸光度をプレートリーダーで計測した。
図18に分泌型ガレクチン-9遺伝子およびコントロールベクター mockを導入した細胞の増殖能の解析結果を示したが、特に違いは認められなかった。
【００６８】
(3) 遺伝子治療の可能性 (in vivo 実験)
前出のように、マウス悪性黒色腫由来のB16/F10細胞を用いたマウス肺転移モデルにおいて、ガレクチン-9改変体による癌細胞の転移抑制効果が認められている。シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン-9(M)（sec mGal-9）遺伝子導入細胞を用いた担癌モデル（実施例２および３）においても、分泌されたガレクチン９が抗腫瘍活性を有することを明らかにした。
そこで、シグナルペプチドを付加したヒト安定化ガレクチン-9 (sec hGal-9)の遺伝子を導入したB16/F10細胞を用いた転移モデルにおいて、分泌型ヒトガレクチン９の効果を評価した。
(i) 方法
マウスガレクチン遺伝子導入細胞におけるモデル実験に準じた。
sec hGal-9とmock細胞は10%FBS(JRH)加RPMI (SIGMA)培地で培養した。
2×105 個の細胞を75cm2フラスコ(SUMILON)に捲き、2日後に回収し継代を行う。継代した各遺伝子導入B16/F10細胞を回収し、PBS(-)で2回洗浄後（1500rpm, 5min）、細胞濃度が2×105個/200μLになるようにPBS(-)で調製した。調製した各細胞をC57BL/6マウス（SLC, 6週齢の♀）1匹あたり2×105個/200μL、27ゲージの針で尾静脈に投与した。sec hGal-9/K4群(n=10)、mock群(n=10)。投与後19日目に解剖し、肺の結節数をカウントした。肺の結節数はノンパラメトリックなマンホイットニーのU検定で解析した。残りのマウス(n=7)は引き続き生存率を測定し、Kaplan-Meier検定にて解析した。
【００６９】
(ii) 結果
肺の結節数を図19に示した。分泌型ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子導入細胞投与群(sec hGal-9)では明らかな転移の抑制が認められた。肺の結節数は、mock群では131.7±15.78であるのに対して、sec hGal-9群では7±0.78と有意な差（p<0.01）が認められた（マンホイットニーのU検定）。肺の外観を図20に示した。個々の転移巣のサイズはmock群と比較するとsechGal-9群では、明らかに小さい。
生存率を図21に示す。同モデルにおいて生存率を比較したところ、mock群と比較してsec hGal-9群では有意（p<0.01）に延命効果が認められた（Kaplan-Meier検定）。
尚、この転移抑制ならびに延命効果は、ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子を導入B16/F10細胞のサブクローンにおいても同様な結果が得られている。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、有効成分として分泌型ガレクチン-9又はその改変体を発現するベクターを使用することで、細胞内を含めた生体内において、ガレクチン-9が発揮する生物活性を利用可能にして、ガレクチン-9感受性の病気又は疾患に対する遺伝子治療技術（遺伝子治療剤及び遺伝子治療法を包含する）を提供する。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
SEQ ID NO: 1, Description of Artificial Sequence: Designed polypeptide for secretory human galectin-9 mutein (hG9NC(null))
SEQ ID NO: 2, Description of Artificial Sequence: Polynucleotide for secretory hG9NC(null)
SEQ ID NO: 3, Description of Artificial Sequence: Polynucleotide for secretory hG9NC(null)
SEQ ID NO: 4, Description of Artificial Sequence: Full-length nucleotide sequence for pSecTag2/HygroA signal-hG9NC(nulll)
SEQ ID NO: 5, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for an adaptor
SEQ ID NO: 6, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for an adaptor
SEQ ID NO: 7, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for PCR
SEQ ID NO: 8, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for PCR
SEQ ID NO: 9, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for PCR
SEQ ID NO: 10, Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide for PCR
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】マウス悪性黒色腫由来のB16/F10 細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を構築し、該がん転移モデルへガレクチン9改変体(G9NC(null))を投与してその作用を調べた結果（肺の結節数をカウントした結果）を示す。
【図２】B16/F10 細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を構築し、該がん転移モデルへガレクチン9改変体を投与してその作用を調べた結果（モデル動物の肺の外観）を示す。
【図３】B16/F10細胞に(a)シグナルペプチドを有しない野生型マウスガレクチン9M(mGal-9M)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(mGal-9)および(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(mGal-9M)(分泌型マウスガレクチン9)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(sec mGal-9)、さらに(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトした細胞株(mock)を樹立し、各遺伝子導入した細胞の培養上清につきウエスタン・ブロッティング法でマウスGal-9を検出測定した結果を示す。
【図４】B16/F10細胞に(a)シグナルペプチドを有しない野生型マウスガレクチン9M(mGal-9M)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(mGal-9)および(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(mGal-9M)(分泌型マウスガレクチン9)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(sec mGal-9)、さらに(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトした細胞株(mock)を樹立し、各遺伝子導入した細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を利用して、該がん転移モデルへの作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（肺の結節数をカウントした結果）を示す。
【図５】図４における、各遺伝子導入したB16/F10細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を利用して、該がん転移モデルへの作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（モデル動物の肺の外観）を示す。
【図６】図４と同様にして各遺伝子導入したB16/F10細胞をC57/BL6マウスに投与し、マウスの生存率を測定した結果を示す。
【図７】マウス肝癌由来のMH-134細胞を用いた皮下移植モデルにおいて、MH-134細胞に(a)シグナルペプチドを有しない野生型マウスガレクチン9M(mGal-9M)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(mGal-9)および(b)シグナルペプチドを付加したマウスガレクチン9M(mGal-9M)(分泌型マウスガレクチン9)発現ベクターをトランスフェクトした細胞株(sec mGal-9)、さらに(c)コントロールとしてmockベクターをトランスフェクトした細胞株(mock)を樹立し、各遺伝子導入した細胞を使用して癌性腹膜炎モデル（マウス）での作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（腫瘍重量）を示す。
【図８】図７と同様にして各遺伝子導入したMH-134細胞をC3H/HeNマウスに投与し、マウスの生存率を測定した結果（生存曲線）を示す。
【図９】図７における、各遺伝子導入したMH-134細胞を使用して皮下移植モデル（癌性腹膜炎マウス）を利用して、該がんモデルへの作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（モデル動物の外観）を示す。
【図１０】構築された分泌型ヒト安定化ガレクチン-9の遺伝子配列と予想されるアミノ酸配列を示す。下線部はシグナル配列、ボックスで囲まれた配列はクローニングにより新規に生じた配列、その後にヒト安定化ガレクチン-9の配列（2-296 aa）が続く。矢印は予想されるシグナル切断部位。影をつけた配列cacatgはcatatg(NdeI site)に変異を導入してNdeI siteを欠失させた部分。この変異導入によるアミノ酸配列置換は無い。
【図１１】pSecTag2/HygroA signal-hG9NC(null)の全塩基配列を示す。図１２及び図１３に続く。
【図１２】pSecTag2/HygroA signal-hG9NC(null)の全塩基配列を示す。図１１の続きで、図１３に続く。
【図１３】pSecTag2/HygroA signal-hG9NC(null)の全塩基配列を示す。図１２の続き。
【図１４】分泌型ヒト安定化ガレクチン発現プラスミドを導入したCos7細胞からのガレクチン分泌を調べた結果（ＡはELISAでの解析、Ｂはウエスタン解析）を示す。
【図１５】ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子導入を行った各細胞への遺伝子の導入確認のためのPCRの結果（電気泳動）を示す。
【図１６】ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子を導入したB16/F10細胞からのガレクチン分泌を調べた結果（ELISAでの解析）を示す。
【図１７】ヒト安定化ガレクチン-9遺伝子を導入したB16/F10細胞からのガレクチン分泌を調べた結果（ウエスタン・ブロッティングによる解析）を示す。
【図１８】分泌型ガレクチン-9遺伝子およびコントロールベクター mockを導入した細胞の増殖能の解析結果を示す。
【図１９】分泌型ガレクチン-9遺伝子およびコントロールベクター mockを導入したB16/F10細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を利用して、該がん転移モデルへの作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（肺の結節数をカウントした結果）を示す。
【図２０】図１９における、各遺伝子導入したB16/F10細胞を使用してがん転移モデル（肺転移マウス）を利用して、該がん転移モデルへの作用（遺伝子治療活性）を調べた結果（モデル動物の肺の外観）を示す。
【図２１】図１９と同様、各遺伝子導入したB16/F10細胞をC57/BL6マウスに投与し、マウスの生存率を測定した結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有効成分として含有することを特徴とするガレクチン-9感受性の病気又は疾患の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【請求項２】
(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有している分泌型ガレクチン-9及び／又はその改変体発現ベクターを有効成分として含有することを特徴とする請求項１記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【請求項３】
免疫調節剤であることを特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【請求項４】
抗腫瘍薬であることを特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【請求項５】
脳腫瘍（多型性膠芽腫など）、脊髄腫瘍、上顎洞がん、膵液腺がん、歯肉がん、舌がん、口唇がん、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、肺がん、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道がん、胃がん、大腸がん、胆管がん、胆嚢がん、膵臓がん、肝がん、腎臓のがん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、精巣腫瘍、副腎のがん、子宮頸がん、子宮体がん、膣がん、外陰がん、卵巣がん、繊毛上皮腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、乳がん、皮膚がん、悪性黒色腫、基底細胞腫、白血病、骨髄化性を伴う骨髄線維症、悪性リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、グリオーマなどを包含するがんおよび肉腫からなる群から選択された腫瘍に対する抗腫瘍薬であることを特徴とする請求項４記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【請求項６】
下記の疾患あるいは病気、又は病的な症状に対するものであることを特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤：
(A) 炎症性疾患であり、各臓器でおこる種々の急性および慢性炎症、アレルギー性および自己免疫性の炎症、感染症等からなる群から選択されたもの；
(B) 急性および慢性疾患であり、気管支炎、気管支肺炎、間質性肺炎、肺臓炎、細気管支炎、急性縦隔炎を含む肺の疾患、心外膜炎、心内膜炎、心筋炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽頭炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、虫垂炎、虚血性大腸炎、薬物性大腸炎、直腸炎を含む肺以外の他の臓器の疾患、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、劇症肝炎、急性および慢性肝炎や肝硬変、胆嚢炎、急性膵炎、慢性膵炎、急性および慢性腎炎、膜性腎炎、糸球体腎炎、IgA腎症、種々の膀胱炎、脳髄炎、乳腺炎、皮膚炎、表層角膜炎、乾性角結膜炎、中耳炎や鼻炎、副鼻腔炎や鼻茸、歯肉炎、歯周炎、歯周囲炎を含む炎症等からなる群から選択されたもの；
(C) 神経性炎症（例えば、神経性胃炎、神経性膀胱炎など）、がんや炎症に伴う痛みからなる群から選択されたもの；
(D) アレルギー性炎症疾患であり、全身性アナフィラキシー、気管支喘息、過敏性肺炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、免疫複合体がおこすアレルギー性疾患、血管神経性浮腫等からなる群から選択されたもの；
(E) 自己免疫性の炎症（自己免疫疾患）であり、全身性（慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、結節性多発性動脈炎、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病など）、神経系（多発性硬化症、重症筋無力症、HAM（HTLV-1脊髄症）、筋萎縮性側索硬化症など）、内分泌性（バセドウ病、橋本病、1型糖尿病など）、血液（特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血など）、呼吸器（サルコイドーシス、肺繊維症など）、消化管（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、肝臓（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性胆管炎など）、腎・尿路系（抗好中球細胞質抗体関連腎炎、血管炎、Goodpasture症候群、抗糸球体基底膜抗体病など）等からなる群から選択されたもの；
(F) 感染症であり、病原体が生体の細胞・組織・臓器を傷害することによって生じる疾患、あるいはヒトに感染症をもたらす病原体に起因する疾患で病原体が、1）細菌（スピロヘータ、クラミジア、リケッチアを含む）、2）ウイルス、3）真菌、4）植物（藻類）、5）原虫、6）寄生虫（吸虫、条虫、線虫）、7）節足動物からなる群から選択されたもので、細菌性感染症（コレラ、ペスト、大腸菌感染症など）、スピロヘータ感染症（レプトスピラ症など）、クラミジア感染症（オウム病など）、リケッチア感染症（発疹チフス、破傷風など）、ウイルス性感染症（帯状疱疹、ウイルス性出血熱、狂犬病など）、真菌症（ガンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギウス症など）、原虫性疾患（アメーバー赤痢、マラリア、トキソプラズマ症など）、寄生虫（吸虫症、線虫症など）、その他、マイコプラズマ感染症（マイコプラズマ肺炎など）、ミコバクテリア感染症（結核、非定型抗酸菌症など）を含むものから選択されたもの；
(G) 皮膚科領域の疾患であり、i)皮膚感染症、アレルギー性炎症や自己免疫性炎症を含む皮膚炎症や、乾癬、水疱症、膿疱症、角化、角化異常症など特有の炎症を有する皮膚疾患、ii)美容皮膚科関連の障害あるいは老化で、a)メラニン代謝調節（美白）、b)毛髪成長（発毛）の調節、ｃ)コラーゲン産生調節に関わる皮膚科領域の疾患（老化を含む）から選択されたもの；
(H) 生活習慣病であり、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、糖尿病などを含むものから選択されたもの；
(I) 正常細菌叢の維持に関わる異常；
(J) アミロイドーシス、アルツハイマー病、骨粗鬆症、骨折などを含むものから選択されたもの；
(K) 脳、神経領域における炎症反応、例えば、脳梗塞、心筋梗塞等の虚血性病変の進展に伴い生じる炎症、統合失調症；
(L) 痛風；
(M) 骨粗鬆症；又は
(N) 間質性肺炎。
【請求項７】
(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤。
【請求項８】
(a)分泌シグナルペプチドと(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものとが連結されていることを特徴とするポリペプチド。
【請求項９】
(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有し且つ上記(b)のN末端側に(a)を有していることを特徴とする分泌型ガレクチン-9をコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求項９記載の分泌型ガレクチン-9をコードする遺伝子を含有することを特徴とする分泌型ガレクチン-9発現ベクター。
【請求項１】
(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有効成分として含有することを特徴とするガレクチン-9感受性の病気又は疾患の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【請求項２】
(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有している分泌型ガレクチン-9及び／又はその改変体発現ベクターを有効成分として含有することを特徴とする請求項１記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【請求項３】
免疫調節剤であることを特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【請求項４】
抗腫瘍薬であることを特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【請求項５】
脳腫瘍（多型性膠芽腫など）、脊髄腫瘍、上顎洞がん、膵液腺がん、歯肉がん、舌がん、口唇がん、上咽頭がん、中咽頭がん、下咽頭がん、喉頭がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、肺がん、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道がん、胃がん、大腸がん、胆管がん、胆嚢がん、膵臓がん、肝がん、腎臓のがん、膀胱がん、前立腺がん、陰茎がん、精巣腫瘍、副腎のがん、子宮頸がん、子宮体がん、膣がん、外陰がん、卵巣がん、繊毛上皮腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、乳がん、皮膚がん、悪性黒色腫、基底細胞腫、白血病、骨髄化性を伴う骨髄線維症、悪性リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、グリオーマなどを包含するがんおよび肉腫からなる群から選択された腫瘍に対する抗腫瘍薬であることを特徴とする請求項４記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤。
【請求項６】
下記の疾患あるいは病気、又は病的な症状に対するものであることを特徴とする請求項１又は２記載の遺伝子治療及び／又は予防用剤：
(A) 炎症性疾患であり、各臓器でおこる種々の急性および慢性炎症、アレルギー性および自己免疫性の炎症、感染症等からなる群から選択されたもの；
(B) 急性および慢性疾患であり、気管支炎、気管支肺炎、間質性肺炎、肺臓炎、細気管支炎、急性縦隔炎を含む肺の疾患、心外膜炎、心内膜炎、心筋炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽頭炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、虫垂炎、虚血性大腸炎、薬物性大腸炎、直腸炎を含む肺以外の他の臓器の疾患、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、劇症肝炎、急性および慢性肝炎や肝硬変、胆嚢炎、急性膵炎、慢性膵炎、急性および慢性腎炎、膜性腎炎、糸球体腎炎、IgA腎症、種々の膀胱炎、脳髄炎、乳腺炎、皮膚炎、表層角膜炎、乾性角結膜炎、中耳炎や鼻炎、副鼻腔炎や鼻茸、歯肉炎、歯周炎、歯周囲炎を含む炎症等からなる群から選択されたもの；
(C) 神経性炎症（例えば、神経性胃炎、神経性膀胱炎など）、がんや炎症に伴う痛みからなる群から選択されたもの；
(D) アレルギー性炎症疾患であり、全身性アナフィラキシー、気管支喘息、過敏性肺炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、免疫複合体がおこすアレルギー性疾患、血管神経性浮腫等からなる群から選択されたもの；
(E) 自己免疫性の炎症（自己免疫疾患）であり、全身性（慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、結節性多発性動脈炎、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病など）、神経系（多発性硬化症、重症筋無力症、HAM（HTLV-1脊髄症）、筋萎縮性側索硬化症など）、内分泌性（バセドウ病、橋本病、1型糖尿病など）、血液（特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血など）、呼吸器（サルコイドーシス、肺繊維症など）、消化管（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、肝臓（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性胆管炎など）、腎・尿路系（抗好中球細胞質抗体関連腎炎、血管炎、Goodpasture症候群、抗糸球体基底膜抗体病など）等からなる群から選択されたもの；
(F) 感染症であり、病原体が生体の細胞・組織・臓器を傷害することによって生じる疾患、あるいはヒトに感染症をもたらす病原体に起因する疾患で病原体が、1）細菌（スピロヘータ、クラミジア、リケッチアを含む）、2）ウイルス、3）真菌、4）植物（藻類）、5）原虫、6）寄生虫（吸虫、条虫、線虫）、7）節足動物からなる群から選択されたもので、細菌性感染症（コレラ、ペスト、大腸菌感染症など）、スピロヘータ感染症（レプトスピラ症など）、クラミジア感染症（オウム病など）、リケッチア感染症（発疹チフス、破傷風など）、ウイルス性感染症（帯状疱疹、ウイルス性出血熱、狂犬病など）、真菌症（ガンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギウス症など）、原虫性疾患（アメーバー赤痢、マラリア、トキソプラズマ症など）、寄生虫（吸虫症、線虫症など）、その他、マイコプラズマ感染症（マイコプラズマ肺炎など）、ミコバクテリア感染症（結核、非定型抗酸菌症など）を含むものから選択されたもの；
(G) 皮膚科領域の疾患であり、i)皮膚感染症、アレルギー性炎症や自己免疫性炎症を含む皮膚炎症や、乾癬、水疱症、膿疱症、角化、角化異常症など特有の炎症を有する皮膚疾患、ii)美容皮膚科関連の障害あるいは老化で、a)メラニン代謝調節（美白）、b)毛髪成長（発毛）の調節、ｃ)コラーゲン産生調節に関わる皮膚科領域の疾患（老化を含む）から選択されたもの；
(H) 生活習慣病であり、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、糖尿病などを含むものから選択されたもの；
(I) 正常細菌叢の維持に関わる異常；
(J) アミロイドーシス、アルツハイマー病、骨粗鬆症、骨折などを含むものから選択されたもの；
(K) 脳、神経領域における炎症反応、例えば、脳梗塞、心筋梗塞等の虚血性病変の進展に伴い生じる炎症、統合失調症；
(L) 痛風；
(M) 骨粗鬆症；又は
(N) 間質性肺炎。
【請求項７】
(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有効成分として含有することを特徴とする制癌剤。
【請求項８】
(a)分泌シグナルペプチドと(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものとが連結されていることを特徴とするポリペプチド。
【請求項９】
(a)分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列と(b)ガレクチン-9及びその改変体（安定化ガレクチン-9）からなる群から選択されたものをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の双方を有し且つ上記(b)のN末端側に(a)を有していることを特徴とする分泌型ガレクチン-9をコードする遺伝子。
【請求項１０】
請求項９記載の分泌型ガレクチン-9をコードする遺伝子を含有することを特徴とする分泌型ガレクチン-9発現ベクター。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【公開番号】特開２００７−２０９３２８（Ｐ２００７−２０９３２８Ａ）
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３７９６４（Ｐ２００６−２３７９６４）
【出願日】平成１８年９月１日（２００６．９．１）
【出願人】（５００５０７６３０）株式会社ガルファーマ (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１日（２００６．９．１）
【出願人】（５００５０７６３０）株式会社ガルファーマ (7)
【Ｆターム（参考）】
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