クロストリジウム・ディフィシルによる感染症の処置
本発明は、配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは９９．５％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、クロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素を開示している。クロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素は、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる。同じく、それをコードする核酸配列、ベクターおよび宿主細胞、それに対する抗体、クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置用の医薬および医薬の製造方法、ならびに診断試験キットおよびそれの診断試験方法を開示している。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）は、グラム陽性の嫌気性細菌であり、中程度の下痢から劇症の偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）の範囲の−総称して、Ｃ．ディフィシル抗生物質関連下痢（ＣＤＡＤ）と称される一連の疾患を引き起こす重要なヒト病原菌と考えられている。ＣＤＡＤは、特に高齢者において、かなりの罹患率および死亡率を伴う、一般的で、医原性の院内疾患である。二つの要因、抗生物質の投与による常在腸内細菌叢の抑制およびその細菌による２種の高分子量毒素、毒素Ａおよび毒素Ｂの製造が、ＣＤＡＤの病原性において主要な役割を果たしているとされている。
【０００２】
その細菌は、病院内に特有のものであり、研究では、急性期治療用病棟において抗生物質処置を受けた患者の約３分の１が、病院にいる間に、Ｃ．ディフィシルに感染することが示されている（Kyne, L.ら、2002, Clin. Infect. Dis. 34(3), pp346-53, PMID: 11774082）。これらの患者のうち、半数以上がＣＤＡＤを発症し、残りは、症状のない保菌者であった。ＣＤＡＤは、患者の病院滞在時間を延長させる主要な要因であり、米国におけるこの疾患のコストは、１１億ドル／年を超えると推定されている（Kyne, L.ら、上記文献）。ＣＤＡＤを患う患者は、誘因抗生物質の中断と抗生物質メトロニダゾールおよびバンコマイシンの何れかでの処置を含む処置によく反応する。しかしながら、バンコマイシン等の使用は、いくつかの問題を伴うため、最後の手段の一つである。腎毒性、耳毒性、骨髄毒性、およびレッドマン（red man）症候群を引き起こすのみならず、この処置法での問題は、初期の発症を成功裡に処置したのちに、ＣＤＡＤがしばしば再発することであり、この再発は、重大な臨床上の問題を提起する。加えて、Ｃ．ディフィシルはメトロニダゾールに耐性になりつつあり、またバンコマイシンに対して一部耐性になりつつあるという兆候があり、ＣＤＡＤの処置において新規な代替法が必要であることを示している。
【０００３】
その細菌の病原性株により製造される外毒素ＡおよびＢは、細胞毒性、腸管毒性、および炎症性であり、この非侵襲性微生物の主要な病原性の要因であると考えられる。しかしながら、毒素産生株での感染が全て疾患を発症するものではなく、さらなる病原性要因の探索が推進されている。細菌表面に発現した抗原は、病原性要因の候補を提示し、また、そのようなタンパク質は、コロニー形成の第一ステップにおける腸の上皮層への接着または局所免疫のメディエーターとの相互作用等の必須の機能をおそらくは仲介するため、重要であると考えられている。他の多くの細菌に共通して、Ｃ．ディフィシルは、外側の細胞表面上で結晶性またはパラ結晶性表面層（Ｓ層）を発現する。そのようなＳ層は、細菌の外表面上に規則的に配列した格子を形成するタンパク質または糖タンパク質を含み、また、アエロマナス・サルモニシダ（Aeromanas salmonicida）およびカンピロバクター・フェタス（Campylobacter fetus）等の病原菌の病原性に必須であることが既に示されている。一つのＳ層を含む大部分の細菌とは対照的に、Ｃ．ディフィシルは、Ｃ．ディフィシル株の間で見かけ上の分子量が各々若干異なる糖タンパク質からなる、２種の重ね合わせられたパラ結晶性Ｓ層を含むことが知られている。Ｃ．ディフィシルの大部分の株は、３２〜３８ｋＤａのもの（低分子量ＳＬＰ）と４２〜４８ｋＤａの二番目のもの（高分子量ＳＬＰ）２個の主たるＳ層タンパク質（ＳＬＰｓ）を発現する。低分子量ＳＬＰは、免疫優位であるようであり、ＣＤＡＤを患う患者に最も一般的に認められる抗原であり、全Ｃ．ディフィシル細胞に対してウサギ中で育てられた抗血清による細菌のＥＤＴＡ抽出物中で認められる唯一の抗原である（Calabi, E.ら、2001, Mol. Microbiol., 40(5) p1187-99, PMID: 11401722）。
【０００４】
Ｃ．ディフィシル感染症の処置／予防に対する抗生物質に基づかない他の治療法は、受動免疫化およびワクチン接種に基づく。受動的免疫化は、（ＷＯ９９／２０３０４に開示のような）毒素中和抗体または（ＷＯ９６／０７４３０に開示のような）細菌全体と毒素に対して育てられた抗体の患者への投与による。ワクチン接種処置は、Ｃ．ディフィシル表面層タンパク質もしくは変異株もしくは同族体の免疫原性フラグメントをコードする核酸配列または（ＷＯ０２／０６２３７９に開示のような）均等なポリペプチドフラグメントのいずれかを患者に投与することを含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者等は、低分子量ＳＬＰが、（患者の抗血清をプローブとする細菌抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより決定された）これまでに同定されていなかった３６ｋＤａの細菌性タンパク質を覆い隠していることを発見した。このタンパク質は、クロストリジウム・ディフィシルに感染した患者から単離された血清中に存在する抗体により認識されるという事実は、ＣＤＡＤの病原性にそのタンパク質が関与している可能性がある。このように、このタンパク質およびそのエピトープは、潜在的に広範囲の用途を提供するものであり、それらは治療上、免疫原、例えば、ワクチンとして使用され、あるいは診断上、それらに特異的に結合する薬剤（例えば、抗体）を検出するために使用しうる。それらはまた、治療上または診断上、それ自体であるいは、例えば受動免疫化に使用される他の抗体と組み合わせて使用しうる、中和剤、例えば抗体を製造するために使用しうる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、Ｃ．ディフィシル乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が提供される。Ｃ．ディフィシルにより示される株間変異に従って、アミノ酸配列内でいくつかの変異が存在しうる。例えば、本発明に係るタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは９９．５％の同一性を示しうる。
【０００７】
配列の相同性／同一性は、National Center for Biotechnology Information, USA (www.ncbi.nlm.nih.gov)でのＢＬＡＳＴ２プログラム（Tatusova TAら、FEMS Microbiol Lett. 1999 May 15; 174(2); 247-50; PMID: 10339815）を用いて決定される。本明細書中、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と均等である。
【０００８】
同様に本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルをコードする単離核酸分子である。
【０００９】
例えば、単離核酸分子は、配列番号１の核酸配列を含んでなる。Ｃ．ディフィシルにより示される株間変異に従って、配列内でいくつかの変異が存在しうる。例えば、配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは９９．５％の同一性を示しうる。
【００１０】
同じく本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨをコードする核酸分子を含んでなる核酸ベクターである。用語「ベクター」は、核酸分子を運ぶことができる、ビヒクル、好ましくは核酸分子を意味する。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子は、ベクター核酸に共有結合的に結合している。本発明のこの観点で、ベクターは、例えば、プラスミド、一本鎖もしくは二本鎖のファージ、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡウイルスベクター、または人工染色体、例えばＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、もしくはＭＡＣであることができる。ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、原核細胞もしくは真核細胞または両者（例えば、シャトルベクター）中で機能しうる。原核生物宿主および真核生物宿主に対する好適なクローニング、発現およびシャトルベクターは、Sambrook, J.およびRussell, D., "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual", 第三版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 2001に記載されている。
【００１１】
同じく本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨをコードするベクターを含む宿主細胞である。ベクターは、核酸分子のさらなるコピーを複製し製造する染色体外因子として宿主細胞内に保持されることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノムに統合され、宿主細胞が複製される際に、核酸分子のさらなるコピーを製造する。
【００１２】
同じく本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨを含んでなるポリペプチドの製造方法であり、そのポリペプチドの製造に十分な条件下に宿主細胞を培養することおよびそのポリペプチドを回収することを含んでなる方法である。
【００１３】
それに由来するLDHタンパク質またはペプチド配列は、それを発現するように改変された細胞（組換え体）で発現され精製されるか、あるいは公知のタンパク質合成方法を用いて合成される。例えば、タンパク質またはペプチド配列をコードする核酸分子が発現ベクターにクローン化され、その発現ベクターは宿主細胞に導入され、次いでタンパク質が宿主細胞中で発現される。タンパク質は、次いで、標準的なタンパク質精製法を用いて、適当な精製スキームにより細胞から単離することができる。
【００１４】
同じく本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨまたはその抗原フラグメントをコードするベクターであり、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨを含んでなるポリペプチドまたはその抗原フラグメントがそのベクターで形質転換された細胞により発現されるように、単離核酸分子が適正な配向と正しいリーディング・フレームでベクターに挿入されている。
【００１５】
本明細書に記載された単離核酸分子は、プロモーター配列に動作可能なように結合されている。
【００１６】
発現ベクターは、核酸分子の転写が宿主細胞内でなされるように、核酸分子にベクター中で動作可能なように結合されるシス作動性調節領域を含んでいる。核酸分子は、転写に影響を与えることができる別の核酸分子で宿主細胞に導入することができる。そこで、第二の核酸分子は、ベクターから核酸分子を転写させるシス制御性調節領域と相互作用するトランス作動性因子を提供しうる。あるいは、トランス作動性因子は、宿主細胞により供給されうる。最後に、トランス作動性因子は、ベクターそれ自体から製造することができる。しかしながら、いくつかの実施態様において、核酸分子の転写および／または翻訳は無細胞系で起こりうる。
【００１７】
本明細書に記載の核酸分子が動作可能なように結合できる調節配列は、ｍＲＮＡ転写を方向付けるプロモーターを含む。これらには、限定されるものではないが、バクテリオファージλからの左プロモーター、大腸菌からのｌａｃ、ＴＲＰ、およびＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター、ＣＭＶ即時型初期プロモーター、アデノウイルス初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルス長期リピートが包含される。
【００１８】
転写をプロモートする調節領域に加えて、発現ベクターは、また、転写をモジュレートする領域、例えばリプレッサー結合部位およびエンハンサーを含みうる。例として、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、およびレトロウイルスＬＴＲエンハンサーが挙げられる。
【００１９】
転写開始および調節用部位を含むことに加えて、発現ベクターは、また、転写終止に必要な配列および、転写された領域中にリボソーム翻訳用結合部位を含むことができる。発現用の他の調節制御因子は、開始コドンおよび終止コドンならびにポリアデニル化シグナルを含む。当業者は、発現ベクター中で有用な多数の調節配列を知っているであろう。そのような調節配列は、例えば、Sambrook, J.およびRussell, D., "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual", 第三版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 2001に記載されている。
【００２０】
調節配列は、１以上の宿主細胞中での構成性発現をもたらし（すなわち、組織特異的）、あるいは、例えば温度、栄養添加物、またはホルモンもしくは他のリガンド等の外因性因子により、１以上の細胞型中で誘発発現をもたらしうる。原核生物宿主および真核生物宿主中での構成性および誘発性発現をもたらす多種のベクターが、当業者に周知である。
【００２１】
核酸分子は、周知の方法により、ベクター核酸に挿入することができる。一般的に、究極的に発現されるであろうＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列と発現ベクターを１以上の制限酵素で切断し、次いでフラグメントを一緒に連結することにより、発現ベクターに結合される。制限酵素での消化および連結の手順は、当業者に周知である。適当な核酸分子を含むベクターは、周知の手法を用いて、増殖用または発現用の適切な宿主細胞に導入することができる。細菌細胞としては、限定されるものではないが、大腸菌、ストレプトミセス（Streptomyces）、およびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurim）が挙げられる。真核細胞としては、限定されるものではないが、酵母、ショウジョウバエ等の昆虫細胞、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞等の動物細胞、ならびにＨｅＬａまたはＨｕＨ−７等のヒト細胞が挙げられる。
【００２２】
同じく本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な、抗体またはその抗原結合性フラグメントである。例えば、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２からなるＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的でありうる。
【００２３】
抗体は、周知である（Harlow, E.およびLane, D., "Using Antibodies - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 1998）。その種々の文法上の形態での用語「抗体」は、本明細書中、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫的に活性な部分、すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子を指すものとして使用される。そのような分子は、また、免疫グロブリン分子の「抗原結合性フラグメント」と称される。
【００２４】
例示される抗体分子は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子ならびに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦ（ｖ）としてこの分野で公知であるそれらの部分を包含する、パラトープを含む免疫グロブリン分子のそれらの部分である。
【００２５】
本発明に係る結合剤は、ＬＤＨに結合するだけではなく、細菌感染症を中和あるいは緩和しうる。
【００２６】
本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、人体または動物体の処置方法または診断方法において使用しうる。
【００２７】
同じく本発明により提供されるものは、本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用を含んでなる、感染症の処置用の医薬の製造方法である。
【００２８】
ＬＤＨタンパク質またはＬＤＨタンパク質に由来するエピトープは、抗体を発生させるために使用しうる。細菌性ＬＤＨタンパク質のエピトープは、標準的な手順を用いて決定しうる（例えば、Geysen, H.M.,ら、J. Immunol. Methods, 1987, 102(2):259-74, PMID: 2443575; Geysen, H.M.,ら、J Mol. Recognit., 1988, 1(1):32-41, PMID: 2483922; Jung, G.,およびBeck-Sickinger, A.G., 1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31:367-486; Beck-Sickinger, A.G.,およびJung, G., Pharm. Acta. Helv. 1993; 68(1):3-20; PMID: 7692453）。抗体またはその抗原結合性フラグメントは、当業者に周知の確立された免疫学的手法を用いて調製されうる（例えば、Harlow, E.およびLane, D., "Using Antibodies - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 1998参照）。そこで、例えば、任意の好適な宿主にタンパク質を注入し、血液を採取して、適当な精製および／または濃縮後に、所望のポリクローナル抗体が得られる（例えば、親和性媒体として固定化タンパク質を用いるアフィニティー・クロマトグラフィーにより）。あるいは、脾細胞またはリンパ細胞をタンパク質注入宿主から回収し、例えばKohlerらの方法（1976, Eur. J. Immunol., 6: 511）を用いて固定化し、得られた細胞を分離してモノクローナル抗体を産生する単一遺伝子系を得る。抗体フラグメントは、慣用の手法、例えば、ペプシンまたはパパインでの酵素的消化により製造しうる。本発明に係る組換え抗体を製造することが所望される場合は、これらは、例えば、ＥＰ１７１４６９、ＥＰ１７３４９４、ＥＰ１９４２７６およびＥＰ２３９４００に記載の方法を用いて、製造しうる。
【００２９】
医薬は、ワクチンでありうる。ワクチンは、免疫系を病原体由来の抗原でふさぐことにより、感染から保護する。ワクチン接種は、病原体由来の抗原に一回または繰り返し暴露することにより達成され、本格的な感染プロセスの有害な作用を伴わずに、抗体の成熟およびＢ細胞クローン性発現をもたらす。ＬＤＨタンパク質またはそのタンパク質に由来するエピトープを、ワクチン中で使用しうる。１以上のそのようなエピトープを含むワクチンを、ヒトを免疫化するために使用することができ、これにより、Ｃ．ディフィシル感染への感受性が減少する。タンパク質および／またはエピトープは免疫原性であるか、あるいはそれらは、例えばアジュバントを含む免疫原性組成物として投与しうる。ワクチンは、ＤＮＡワクチンであってもよい。ＤＮＡワクチンは、十分に認知されており、当業者に公知であろう。
【００３０】
エンテロコッカス・ファエシウム（Enterococcus faecium）（Bugg, T.D.,ら、1999, Biochemistry, 30(43), pp10408-15, PMID: 1931965）およびスタフィロコッカス・オウレウス（Staphylococcus aureus）（Milewski, W.M.ら、1996, Antimicrob Agents Chemother 40(1), pp166-72, PMID: 8787900）等の細菌において、乳酸脱水素酵素はバンコマイシン等の抗生物質への耐性メカニズムにおいて重要な役割を果たしているという証拠があるため、本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントと、抗生物質、例えば、バンコマイシン等の糖タンパク質抗生物質とを共に組み合わせることは、Ｃ．ディフィシルによる感染症をさらに成功裡に処置しうる手段を提示しうる。あるいは、糖タンパク質抗生物質は、例えば、ラモプラニンまたはテイコプラニンであってもよい。抗生物質は、時折、ＣＤＡＤの処置に使用されるメトロニダゾールであってもよい。
【００３１】
医薬は、Ｃ．ディフィシル感染症の処置に使用することができ、治療上有効量の、本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントあるいはそれを糖タンパク質抗生物質、例えばバンコマイシン、または抗生物質メトロニダゾールと組み合わせて含みうる。抗体またはその抗原結合性フラグメントは、抗生物質と相乗的に作用して、向上した治療効果、すなわち、組み合わせ治療を用いた処置で期待されるよりもさらに大きな効果をもたらす。
【００３２】
医薬は、人体または動物体の処置方法または診断方法において使用しうる。
【００３３】
医薬は、細菌が糖タンパク質抗生物質処置または抗生物質処置に耐性である、Ｃ．ディフィシル感染症の処置に使用しうる。
【００３４】
同じく本発明により提供されるものは、治療上有効量の抗生物質、例えば糖タンパク質抗生物質および本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用を特徴とする、Ｃ．ディフィシル感染症の処置用の医薬の製造方法である。抗生物質は、バンコマイシン、ラモプラニンまたはテイコプラニン等の糖タンパク質抗生物質でありうる。あるいは、抗生物質は、メトロニダゾールでありうる。
【００３５】
同じく本発明により提供されるものは、治療上有効量の抗生物質、例えば糖タンパク質抗生物質および本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントを、それを必要とする患者に投与する工程を含んでなる、Ｃ．ディフィシル感染症の処置方法である。抗生物質は、バンコマイシン、ラモプラニンまたはテイコプラニン等の糖タンパク質抗生物質でありうる。あるいは、抗生物質は、メトロニダゾールでありうる。
【００３６】
本発明に係る医薬および処置方法は、当業者には容易に明白であろう。医薬は、薬学的に許容しうる担体、希釈剤または助剤を用いて調製しうる（Remigton's: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Mack Publishing Company, Easton, PA, USA）。医薬および処置方法は、薬学上有効量のエピトープまたは抗体／抗体結合性フラグメントを用いて達成される。適切な用量は、当業者には容易に明白であり、例えば、用量反応実験により、容易に決定しうる。
【００３７】
同じく本発明により提供されるものは、上記Ｃ．ディフィシルＬＤＨの試料中での存在を検出する診断試験方法であって、
ｉ）試料と、本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントとを接触させ、
ｉｉ）抗体−抗原結合反応を検出し；
ｉｉｉ）検出工程（ｉｉ）の結果を、その試料中のそのＣ．ディフィシルＬＤＨの存在と関連付ける、
工程を含んでなる方法である。
【００３８】
同じく本発明により提供されるものは、本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体の試料中での存在を検出する診断試験方法であって、
ｉ）試料とそのＣ．ディフィシルＬＤＨとを接触させ、
ｉｉ）抗体−抗原結合反応を検出し；
ｉｉｉ）検出工程（ｉｉ）の結果を、その試料中のそのＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体の存在と関連付ける、
工程を含んでなる方法である。
【００３９】
試料は、患者からのもの、例えば、血清試料または腹膜透析物であり、ただし、抗Ｃ．ディフィシル抗体を有するあるいは有すると期待される全ての他の試料が、当然のことながら、使用しうる。
【００４０】
同じく本発明により提供されるものは、本発明に係る診断試験方法を行うための診断試験キットである。診断試験キットは、周知であり、例えば、ＷＯ８８／０８５３４に記載の浸漬スティック試験を包含する。試験キットは、本発明に係る診断試験方法でのその使用についての指示書を含みうる。
【００４１】
同じく本発明により提供されるものは、治療上有効量の抗生物質および本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる、Ｃ．ディフィシル感染症の処置用の医薬パックである。
【００４２】
抗生物質は、メトロニダゾールでありうるか、または抗生物質は、糖タンパク質抗生物質、例えば、バンコマイシン、ラモプラニンまたはテイコプラニンでありうる。
【００４３】
感染症は、抗生物質のみによる処置に耐性である、Ｃ．ディフィシルによるものでありうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明は、Ｃ．ディフィシルＬＤＨの単離および同定を記載する、以下の実験から、さらに明らかになるであろう。
実 験
【００４５】
以下に詳述する実験は、Ｃ．ディフィシルに感染した患者から得られた分画されたＣ．ディフィシルタンパク質抽出物および抗血清を用いた免疫ブロッティング実験において、見かけ上の分子量３６ｋＤａのタンパク質が大部分の患者により認められることを実証する。アミノ酸配列決定を使用して、このタンパク質が乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）であることが決定された。Ｃ．ディフィシルＬＤＨタンパク質をコードする遺伝子をクローン化し、次いで、組換えＬＤＨタンパク質発現用の細菌性発現ベクターにサブクローン化した。精製した組換えＬＤＨタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２Ｄ電気泳動により分画し、Ｃ．ディフィシルに感染した患者から得られた抗血清で探査する（probing）前に、免疫ブロッティングした。
【００４６】
他に特記しない限り、本明細書中に詳述した全ての方法は標準的な手順を用いて、適用可能な製造者の指示書に従って行われる。ＰＣＲ、分子クローニング、操作と配列決定、および細胞培養を含む種々の手法についての標準的手順は、McPherson, M.J.ら、(1991, PCR: A practical approach, Oxford University Press, Oxford), Sambrook, J.およびRussell, D., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 第三版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 2001), HuynhおよびDavis (1985, "DNA Cloning Vol I - A Practical Approach", IRL Press, Oxford, Ed. D.M. Glover), Sanger, F.ら、(1977, PNAS USA 74(12): 5463-5467), Harlow, R.およびLane, D. ("Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 1998), Harris, M.A.およびRae, I.F. ("General Techniques of Cell Culture", 1997, Cambridge University Press, ISBN 0521 573645)。
【００４７】
他のもののうち、本明細書中で詳述された方法中で有用な試薬および装置は、Amersham (www.amersham.co.uk), Boehringer Mannheim (www.boehringer-ingeltheim.com), Clontech (www.clontech.com), Genosys (www.genosys.com), Millipore (www.millipore.com), Novagen (www.novagen.com), Perkin Elmer (www.perkinelmer.com), Pharmacia (www.pharmacia.com), Promega (www.promega.com), Qiagen (www.qiagen.com), Sigma (www.sigma-aldrich.com)およびStratagene (www.stratagene.com)のようなものから入手できる。
【００４８】
刊行物に対して「ＰＭＩＤ」参照番号が付与されている場合、これらは、US National Library of Medicineによりそれらに割り当てられたPubMed識別番号であり、それから各々の刊行物に対する完全な文献情報および要旨がwww.ncbi.nlm.nih.govで入手できる。これはまた、特に、例えば、ＰＮＡＳ、ＪＢＣおよびＭＢＣ刊行物の場合に、完全な刊行物の電子コピーに直接アクセスすることができる。
【００４９】
本明細書中で議論された参考文献の各々の内容は、それらの中で引用された参考文献のそれを含めて、それらの全体がここに参照として取り込まれる。
方 法
試 料
【００５０】
血清試料および大便標本を採取し、それぞれ、−２０℃および４℃で保存した。
Ｃ．ディフィシル Tox AB II試験
【００５１】
このキットは、Tec Lab Inc., USAから購入した。液状便５０μｌを希釈剤２００μｌに加え、混合物１００μｌをマイクロタイタープレート中のコンジュゲート５０μｌに加え、３５℃で５０分間インキュベートし、その後、４回洗浄した。基質ＡおよびＢをプレートに加え、混合し、室温で１０分間インキュベートした。停止溶液をプレートに加え、さらに１０分間インキュベートし、光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を４５０ｎｍで測定した。
培養と同定
【００５２】
陽性標本を、Ｃ．ディフィシル選択サプリメント、Ｄ−シクロセリンおよびセフォキチン（Oxoid）を含むＣ．ディフィシル寒天ベース(Oxoid)を用いて培養し、嫌気性条件下で４８時間生育した。陽性標本の特性は、酵素的加水分解ＰＲＯ試験（Key Scientific Products, USA）およびラテックス凝集試験（Microscreen C. Difficile, Microgen Bioproducts Ltd, UK）を用いて確認した。
抗原調製
【００５３】
Ｃ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４は、２％（ｗ／ｖ）プロテアーゼペプトンと１％（ｗ／ｖ）酵母エキスを含む培地中、３７℃で４８時間、嫌気性条件下で培養した。細胞は、遠心分離により収集し、滅菌食塩水中で３回洗浄した。その後、細胞ペーストをBio X-presser 細胞ディスインテグレーター (LKB Instruments Sweden) に入れ、破砕の前に、−２０℃で一晩放置した。試料を破砕し、洗浄し、ついでＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化した。
試料の可視化およびタンパク質の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【００５４】
プレートを、製造者の指示書に従って集め、溶解ゲル（３０％アクリルアミド／ビス２５ｍｌ、分離ゲルバッファー１４．０６ｍｌ（蒸留水１００ｍｌ（ｐＨ８．８）で１００ｍｌにしたトリスベース２４．２２ｇ、１０％ＳＤＳ７５０μｌ、蒸留水３５．２ｍｌ、１０％過硫酸アンモニウム３７５μｌ、ＴＥＭＥＤ３７．５μｌ）を注いだ。一旦セットし、スタッキングゲル（３０％アクリルアミド／ビス３．６ｍｌ、スタッキングゲルバッファー７．３ｍｌ（蒸留水１００ｍｌ（ｐＨ６．８）で１００ｍｌにしたトリスベース６．０５ｇ、１０％ＳＤＳ３００μｌ、蒸留水１９ｍｌ、１０％過硫酸アンモニウム３００μｌ、ＴＥＭＥＤ３０μｌ）を注ぎ、くしを挿入し、センター取りした。ゲルをセットし、くしを取り除き、ウエルを蒸留水で洗浄した。ゲルをタンクホルダーに入れ、タンクに入れた。試料（Ｃ．ディフィシル１０μｌ）を各々のウエルに加え、電気泳動バッファー（トリスベース１８．９６ｇ、グリシン１２ｇ、ＳＤＳ３ｇ、蒸留水３Ｌ）をトップに積層した。タンクを電気泳動バッファーで満たし、水を出し、８０〜１００ｍＡの電流で１〜２時間運転した。
タンパク質可視化
【００５５】
タンパク質のバンドを、メタノール１００ｍｌ、氷酢酸２０ｍｌ中、４℃で一晩ゲルを固定し、ＯＷＬ銀染色キット（NBS Biologicals, Huntington）を用いて銀染色することにより可視化した。
ウエスタンブロッティング
【００５６】
ゲルホルダーを製造者の指示書に従って集めて、サンドィッチを以下のように生成した：Scotchbrite、2 xろ紙、ニトロセルロース／ＰＶＤＦ、ゲル、2 xろ紙、Scotchbrite、（the Scotchbrite、ろ紙、およびニトロセルロース／ＰＶＤＦはすべて、トランスブロッティングバッファー（トリスベース９．０７ｇ、グリシン４３．２ｇ、蒸留水３Ｌ、メタノール７５０ｍｌ中で浸漬した）。ホルダーをタンクに組み込み、１００Ａで４５分間運転した。
【００５７】
血清は、臨床的にＣ．ディフィシル大腸炎であって糞便で陽性の毒性アッセイを示した患者２４人から、および大腸炎の証拠がなく、陰性の毒性アッセイを示した患者２０人から入手した。血清を、トランスブロッティングした抗原ストリップに加え、室温で２時間、振盪しながらインキュベートした。５回の５分間ずつの洗浄ののち、アルカリ性ホスファターゼとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭと共に１時間インキュベートした。ストリップを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴを用いる可視化の前に、洗浄した。
タンパク質配列決定
【００５８】
適切なバンドを、ＰＶＤＦ膜上にトランスブロッティングし、直接的アミノ酸配列決定を標準的な方法を用いて行った。
ライブラリーの構築とクローンの分析
ゲノムライブラリーの構築
【００５９】
Ｃ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４を嫌気性条件下、３７℃で一晩、ＬＢブロス１０ｍｌ中で培養した。細菌を遠心分離により収集し、ペレットを滅菌食塩水で２回洗浄し、ＴＥバッファー１ｍｌに再懸濁した。リゾチーム１μｌを細胞に加え、その後、３７℃で１５分間インキュベートした。プロテイナーゼＫ２０μｌと１０％ＳＤＳ５０μｌを混合物に加え、それを反転させて混合し、５５℃で４５分間放置した。混合物をマイクロヒュージ中で脈動させ、上清を等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２５：１）を含む管に移し、１０分間反転させて混合し、タンパク質を析出させた。これを、次いで、１２０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上層のＤＮＡ含有水層を取り除き、上記の工程を繰り返した。水層と等量のイソプロパノールとを混合し、混合物を室温で１５分間放置し、次いで、１２，０００ｇで２０分間遠心分離することにより、ＤＮＡを析出させた。細菌性ＤＮＡを含有するペレットを氷冷７０％エタノール中で洗浄して過剰の塩を除去し、超純水２００μｌ中に再懸濁した。
細菌性ゲノムＤＮＡの部分的消化
【００６０】
制限消化は、製造者の指示書に従って使用した、ＨｉｎｄＩＩＩを含んでセットアップし、次いで、アリコート５μｌを、ある時間間隔で収集し、６５℃１０分間加熱することにより不活性化した。ＤＮＡ試料をエタノール析出し、アガロースゲル電気泳動で可視化した。２〜５Ｋｂに対応するフラグメントをゲルから切り取って、Genecleanプロトコル（Anachem, UK）を用いて清浄化した。ＤＮＡを滅菌超純水２０μｌ中で溶出し、−２０℃で保存した。
プラスミドＤＮＡの精製
【００６１】
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢブロス５ｍｌにプラスミドｐＴＺ１８Ｒを含有する大腸菌で接種し、振盪プラットフォームインキュベーター中で、３７℃で一晩培養した。細菌細胞を遠心分離により採集し、QIAprep Spin Miniprep キット（QIAgen）を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、精製した。
プラスミド消化、リン酸化および連結
【００６２】
ｐＴＺ１８Ｒ ＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、５’リン酸基は、４μｌの１０ｘアルカリ性ホスファターゼバッファー（Promega）および１μｌのアルカリ性ホスファターゼ（Promega）を試料３５μｌに加え、次いで３７℃で２時間インキュベートすることにより除去した。試料は、アガロースゲル上で可視化し、前述のGenecleanキットを用いて清浄化した。部分的に消化されたゲノムＤＮＡを、製造者の指示書に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（Progema）を用いて、４℃で一晩、小容量で、ｐＴＺ１８Ｒと連結した。
形質転換
【００６３】
プラスミドＤＮＡは、以下の細菌株にエレクトロポレーション(２００オーム／２５μＦ ２．５ＫＶ）することにより形質転換した：
大腸菌ＪＭ１０９
大腸菌ｌｄｈ―ＤＣ１３６８（乳酸脱水素酵素欠損株)ＩａｈＡ： Kanpfi,com (Gupta, S.,およびClark, D.P., 1989, J.of Bacteriology, 171, p3650-3655)。
大腸菌Ｗ１４８５(野生型)
形質転換細菌細胞は、Ｍ９培地上に載せ、次いで、好気性および嫌気性の両条件下、３７℃で一晩、インキュベートした。
ＤＮＡ配列決定
【００６４】
個々のクローンは、MegaBACE10001ＤＮＡシーケンサー(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて配列決定した。プラスミドＤＮＡ（１００〜５００ｎｇ）を、DYEnamic ETターミネーター試薬プレミックス８μｌとＭ１３フォワードプライマー（配列番号５）またはＭ１３リバースプライマー（配列番号６）１μｌ（５μＭ）に、全量２０μｌで加えた。サイクリング条件は、９５℃で２０秒；５０℃で１５秒；および６０℃で６０秒の３０サイクルであった。組み込まれていない染料ターミネーターはエタノール析出により除去し、ＤＮＡをローディングバッファー２０μｌ中に再懸濁した。反応物は、２ＫＶの注入パラメーターを３０秒間および６ＫＶで２００分間の電気泳動を用いて、ＤＮＡシーケンサー上にロードした。
ｌｄｈ遺伝子のサブクローン化
【００６５】
ｌｄｈ遺伝子は、以下の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ easy ベクター（Promega, Southampton, UK）にサブクローン化した部分的に消化されたＤＮＡから再増幅した：ＤＮＡ１μｇ、Ｌ１フォワードプライマー（配列番号３）またはＬ２リバースプライマー（配列番号４）の各々２５ｐｍｏｌ、２００μＭｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2および５単位のＴａｑポリメラーゼ。サイクリング条件は、９４℃で５分間の初期変性工程、次いで９４℃で６０秒；５５℃で６０秒；および７２℃で６０秒の２５サイクル、７２℃で７分間と４℃で保持の最終伸長工程を使用した。試料は、アガロースゲル電気泳動により可視化した。ｌｄｈ遺伝子は、以下のように、ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にサブクローン化した：GenecleanedＰＣＲ生成物（上記）２μｌをｐＢＡＤ−ＴＯＰＯベクター１μｌと供給された塩溶液１μｌに、５μｌの最終反応容量で加え、室温で５分間インキュベートした。大腸菌ＴＯＰ１０−Ｆ’コンピーテントな細胞を、最終反応物２μｌを用いて熱ショックにより形質転換し、ＳＯＣ培地中で３７℃１時間インキュベートしたのち、細胞を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足した乾燥ＬＢアガープレート上に載せ、プレートを３７℃で一晩、反転位置でインキュベートした。
陽性クローン
【００６６】
陽性クローンをＰＣＲで増幅した。一コロニーを、ｐＢＡＤフォワードプライマー（配列番号７）またはＬ１リバースプライマーを各々５０ｐｍｏｌ、２００μＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2および５単位のＴａｑポリメラーゼを含有するＰＣＲマスターミックスに加えた。サイクリング条件は、９４℃で５分間の初期変性工程、次いで９４℃で６０秒；５５℃で６０秒；および７２℃で６０秒の２５サイクル、７２℃で７分間と４℃で保持の最終伸長工程を使用した。試料は、アガロースゲル電気泳動により可視化した。
組換えＬＤＨタンパク質の発現
【００６７】
各陽性形質転換体を、振盪しながら、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢ１０ｍｌ中で、３７℃で一晩培養した。培養物１００μｌを、翌朝新鮮なブロス１０ｍｌに接種するのに使用し、それを引き続き、振盪しながら、０．５のＯＤ600が得られるまで培養した。タンパク質発現は、２０％（ｗ／ｖ）Ｌ−アラビノースを添加し、次いでさらに３７℃で４時間インキュベートすることにより誘起した。細胞は、４０００ｘｇで１５分間遠心分離してペレット化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー１００μｌ中に再懸濁した。試料を７０℃で５分間加熱し、５μｌをゲル上に分画し、前記と同様にトランスブロッティングした。タンパク質のバンドを、抗Ｖ５エピトープｔａｇ抗体の１：５０００希釈物を用い、次いで、抗マウスアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートとＢＣＩＰ／ＮＢＴ株でインキュベートすることにより検出した。
組換えタンパク質の精製
【００６８】
培養物５０ｍｌを培養し、タンパク質発現を上記のように誘起した。回収された細胞は、Bio X-presser 細胞ディスインテグレーター (LKB Instruments)を用いて溶解した。タンパク質を、製造者の指示書に従って用いた、ProBond 精製システム（Invitrogen）を用いて精製した。タンパク質を、５０ｍＭ、２００ｍＭ，３５０ｍＭおよび５００ｍＭイミダゾール溶出バッファー５ｍｌを連続的に用いてイミダゾール濃度を連続的に増大させて１ｍｌの分画を集めるか、あるいは元来のｐＨ溶出バッファー５ｍｌを適用して１ｍｌの分画を集めるかの何れかにより溶出した。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより、特に前記したように、分析した。
患者の血清を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング
【００６９】
組換えタンパク質を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で操作し、確認されたＣ．ディフィシル感染症の患者１０人からの血清と４つの対照用血清を用いて、免疫ブロッティングした。
患者の血清を用いる２Ｄゲル電気泳動およびウエスタンブロッティング
試料調整
【００７０】
１０ｎＭＰＢＳ中に懸濁したＣ．ディフィシル細胞を、氷上で、５回の１分間バーストで超音波処理した。得られた細胞を、１３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清３００μｌを、冷アセトン中で４５分間、２０ｍｌの１０％トリクロロ酢酸／２０ｍＭＤＴＴ中で析出させた。タンパク質を１３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して回収し、得られたペレットを、２０ｍＭＤＴＴを含有する冷アセトンで洗浄した。遠心分離と洗浄工程をさらに２回繰り返し、２Ｄゲル電気泳動により分画する前に、タンパク質を前と同様に遠心分離して回収した。
２Ｄゲル電気泳動
【００７１】
タンパク質ペレットを試料再加水分解溶液に溶解し、同じ溶液で、等電点電気泳動用の適切な濃度に希釈した。等電点電気泳動は、各々のストリップ上にタンパク質約１５μｇを載せて、３〜１０（７ｃｍ）の非直線的なｐＨ範囲にわたって、合計１７００Ｖｈで、Zoom（登録商標）IPGRunner（商標）システム（Invitrogen Ltd, Carlsbad, CA, USA）を用いて行った。二次元分離の前に、ストリップを６５ｍＤＴＴを含む平衡化バッファー中で１５分間、次いで、１２５ｍＭヨードアセトアミドを含む同じバッファー中でさらに１５分間平衡化した。
【００７２】
二次元分離は、NuPage４〜１２％Bis-TrisZoom gel（Invitrogen Ltd, Carlsbad, Ca, USA）ゲルを用いて行った。タンパク質は、Invitrolon PVDF膜（Invitrogen Ltd, Carlsbad, Ca, USA）上にトランスブロッティングし、５％スキムミルク／０．１％Tween 20を含む１０ｍＭ ＰＢＳ中で１時間ブロックした。
ウエスタンブロッティング
【００７３】
ＬＤＨの位置を同定するために、膜を１時間、ウサギの筋肉からＬＤＨに対して生育されたポリクローナル抗ＬＤＨワサビペルオキシダーゼ抗体コンジュゲート（Abcam Limited, Cambridge, UK）と共にインキュベートした。抗体は、１０ｍＭ ＰＢＳ／０．１％Tween 20中で希釈した（１：５００）。ＰＢＳ−Ｔ中で洗浄したのち、ブロットをSigmaFast（商標）３，３’−ジアミノベンジジン錠（ＤＡＢ）を用いて現像した。
【００７４】
３０〜４０ｋＤａのＣ．ディフィシルタンパク質（一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより決定された）に免疫反応性であることが知られており、それ故、潜在的にＬＤＨ免疫反応性である、患者の血清は、ＬＤＨの同定について上記したと同じ方法で、二次元ブロットを探査するために選択された。膜は、ＰＢＳ−Ｔ中、血清で希釈されて（１：２０）、５０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ中でブロットを洗浄した後、一次抗体は、二次抗ヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼコンジュゲート（Ｆｃ特異的）を用いて検出した。一次／二次抗体複合体は、SigmaFast（商標）リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル／ニトロブルーテトラゾリウム錠を用いて検出した。
結 果
試 料
【００７５】
試験した試料のうち２４個がＣ．ディフィシルＴＯＸ Ａ／ＢＩＩ試験で陽性であり、黄色（陽性）反応を与えた。特性は、コロニーおよびグラムモルホロジー（血液寒天上で大きな楕円形のサブ末端芽胞を有するグラム陽性バシルス（Bacillus））、酵素的加水分解ＰＲＯ試験（暗ピンク色〜赤色の外観）により確認され、またラテックス凝集試験は、２分以内に目に見える凝集塊を与え、Ｃ．ディフィシルの存在を示した。全抗原は、臨床的単離物およびＣ．ディフィシルの標準（National Collection of Type Culture (NCTC) 11204, PHILS, London, UK）株の双方の培養物から提供された。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【００７６】
Ｃ．ディフィシル全細胞抽出物のＯＷＬ銀染色は、２０〜２００ｋＤａの分子サイズを有するタンパク質バンドを示した。
ウエスタンブロッティング
患者と対照血清試料を用いるＣ．ディフィシルの全細胞抽出物のＩｇＧブロッティングの結果、二つの群の間で統計的に有意な差異を有する見かけ上の分子量３６ｋＤａのタンパク質が検出された。このタンパク質は、２０の対照試料中では７つであるのに対して、２４の患者試料中のうちの２１で検出された（c 2＝１２．３７、Ｐ値０．００１）。他の免疫優位な抗原は、４３、５５および７０ｋＤａに明らかに見出された（表１）
【００７７】
【表１】
タンパク質の配列決定
【００７８】
３６ｋＤａのバンドからの最初の１０アミノ酸残基は、Ｎ−末端配列決定により得られ、表２に示す。このアミノ酸配列は、BCM Search Launcher (www.searchlauncher.bcm.tmc.edu/)に入っており、それは、合致性を戻してきて、表３に示すように、ｌｄｈと６０％の相同性を示す。
【００７９】
【表２】
【００８０】
【表３】
ゲノムライブラリー
【００８１】
ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化して、２〜５Ｋｂｐの範囲のＤＮＡフラグメントを製造した。部分的に消化されたＤＮＡはｐＴＺ１８Ｒに連結し、大腸菌に形質転換した。組換えクローンを生育についてスクリーニングし、配列決定した。これに由来するプライマーは、ｐＧＥＭ−Ｔ easy（Promega）中で調製されたライブラリーからのｌｄｈ遺伝子をＰＣＲするために使用し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。組換えクローンは、ＰＣＲで確認し、配列決定のために選択した。
ＤＮＡ配列決定
【００８２】
双方の生成物の配列決定は、ｌｄｈ遺伝子を含むオープン・リーディング・フレームを明らかにした。インサートは、９５０塩基対の長さであり、３１０アミノ酸をコードしていた。これは、７つの他のＬＤＨタンパク質と部分的に合致（２９〜４２％の相同性）した（ラクトバシルス（Lactobacillus spp.）、ペディコッカス・アシディラクチシ（Pediococcus acidilactici）、リューコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）および大腸菌を含む）。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング
【００８３】
組換えＬＤＨタンパク質は、１０の患者抗血清のうち８つの中に含有される抗体により認識された。対照的に、組換えタンパク質は、４つの対照血清のいずれを用いても、ウエスタンブロットにおいて検出されなかった。
２Ｄゲル電気泳動および免疫ブロッティング
【００８４】
市販の抗乳酸脱水素酵素抗体を用いて、２Ｄブロット上でＬＤＨタンパク質を同定することが可能であった。強いスポットが２個のみ、抗体により可視化され、そのうちの１個のみが、推定された分子量（約３４ｋＤａ）および推定された等電点（４．９５と算定）を示した。分析された３つの患者血清のうち、それらの全てがＬＤＨへの抗体を含んでいた。１つの患者の抗体は、ほぼ排他的にＬＤＨに反応性であった。
要 約
【００８５】
これらの実験は、Ｃ．ディフィシルに感染した患者から得られた血清中の抗体により認識されるタンパク質としてのＬＤＨの同定について記述している。
実 施 例
【００８６】
Ｃ．ディフィシルに感染した患者を処置するために、細菌性ＬＤＨタンパク質またはＬＤＨタンパク質由来のエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントが経口的にまたは経静脈的に投与される。好適な用量は、用量反応アッセイを用いて容易に決定される。
【００８７】
患者は、抗体および糖ペプチド抗生物質、例えばバンコマイシンの治療上有効な組み合わせを用いて処置される。糖ペプチド抗生物質は、経口的に、例えば錠剤またはカプセルとして投与される。糖ペプチド抗生物質の好適な用量は、当業者に周知である。抗生物質は、例えば同じ処方物中で抗体と共に投与されるか、あるいは抗生物質は、抗体の投与とほぼ同時に投与される。細菌性ＬＤＨタンパク質またはＬＤＨタンパク質由来のエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントは、経口的にまたは経静脈的に投与される。好適な用量は、用量反応アッセイを用いて容易に決定される。
【００８８】
Ｃ．ディフィシル感染への感受性を減少または除去するようにヒトにワクチン接種するためにあるいは細菌に対する患者の免疫応答を促進するために、ワクチンを、細菌への免疫応答を組み込み得るか組み込み得ない患者、例えばＣＤＡＤまたはＣ．ディフィシル大腸炎を患っている患者に投与する。ワクチンは、細菌抽出物、または組換えＬＤＨタンパク質、またはそのタンパク質由来のエピトープ、あるいはそれらの組み合わせを含んでなる。細菌への免疫応答を組み込むことができないそれらの患者に対しては、ＬＤＨまたはそのエピトープを含むワクチンは、それによって患者の免疫系が好適な応答を取り込むことを促進する手段を意味する。抗体応答は、患者からの試料における抗ＬＤＨ抗体のレベルをモニターすることにより決定される。ワクチンは、ワクチン成分の免疫原性を向上または改善するアジュバントを含む。免疫応答が弱い患者は、ワクチンの多数回用量を一定の期間をおいて投与するような、再チャレンジを受ける。
【００８９】
Ｃ．ディフィシルは、患者から例えば血液試料を採り、それをＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させることにより、患者の試料中で検出される。例えば、特異的な抗ＬＤＨ抗体を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングが、試料中にＣ．ディフィシルが存在するか否かを決定するために使用され、ウエスタンブロッティングにより決定された陽性反応、すなわち、ＬＤＨの分子量に対応するタンパク質の検出が、試料中のＣ．ディフィシルの存在を示す。
【００９０】
Ｃ．ディフィシル抗原に特異的な抗体は、患者から採られた試料中で、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて検出される。例えば、組換え細菌性ＬＤＨ、その抗原性フラグメント、または細菌抽出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画され、患者の抗血清で探査される。ウエスタンブロッティングにより決定された陽性反応、すなわち、ＬＤＨの分子量に対応するタンパク質の検出が、患者試料中の抗Ｃ．ディフィシル抗体の存在を示す。
【００９１】
Ｃ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントは、診断試験キット中に含まれている。同様に、診断試験キットは、組換え細菌性ＬＤＨ、そのフラグメント、または細菌抽出物を含んでなる。
【００９２】
Ｃ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントは、クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置用の医薬パック中に含まれる。その医薬パックは、治療上有効量の糖ペプチド抗生物質、例えばバンコマイシンを含んでなる。
【配列表】
【背景技術】
【０００１】
クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）は、グラム陽性の嫌気性細菌であり、中程度の下痢から劇症の偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）の範囲の−総称して、Ｃ．ディフィシル抗生物質関連下痢（ＣＤＡＤ）と称される一連の疾患を引き起こす重要なヒト病原菌と考えられている。ＣＤＡＤは、特に高齢者において、かなりの罹患率および死亡率を伴う、一般的で、医原性の院内疾患である。二つの要因、抗生物質の投与による常在腸内細菌叢の抑制およびその細菌による２種の高分子量毒素、毒素Ａおよび毒素Ｂの製造が、ＣＤＡＤの病原性において主要な役割を果たしているとされている。
【０００２】
その細菌は、病院内に特有のものであり、研究では、急性期治療用病棟において抗生物質処置を受けた患者の約３分の１が、病院にいる間に、Ｃ．ディフィシルに感染することが示されている（Kyne, L.ら、2002, Clin. Infect. Dis. 34(3), pp346-53, PMID: 11774082）。これらの患者のうち、半数以上がＣＤＡＤを発症し、残りは、症状のない保菌者であった。ＣＤＡＤは、患者の病院滞在時間を延長させる主要な要因であり、米国におけるこの疾患のコストは、１１億ドル／年を超えると推定されている（Kyne, L.ら、上記文献）。ＣＤＡＤを患う患者は、誘因抗生物質の中断と抗生物質メトロニダゾールおよびバンコマイシンの何れかでの処置を含む処置によく反応する。しかしながら、バンコマイシン等の使用は、いくつかの問題を伴うため、最後の手段の一つである。腎毒性、耳毒性、骨髄毒性、およびレッドマン（red man）症候群を引き起こすのみならず、この処置法での問題は、初期の発症を成功裡に処置したのちに、ＣＤＡＤがしばしば再発することであり、この再発は、重大な臨床上の問題を提起する。加えて、Ｃ．ディフィシルはメトロニダゾールに耐性になりつつあり、またバンコマイシンに対して一部耐性になりつつあるという兆候があり、ＣＤＡＤの処置において新規な代替法が必要であることを示している。
【０００３】
その細菌の病原性株により製造される外毒素ＡおよびＢは、細胞毒性、腸管毒性、および炎症性であり、この非侵襲性微生物の主要な病原性の要因であると考えられる。しかしながら、毒素産生株での感染が全て疾患を発症するものではなく、さらなる病原性要因の探索が推進されている。細菌表面に発現した抗原は、病原性要因の候補を提示し、また、そのようなタンパク質は、コロニー形成の第一ステップにおける腸の上皮層への接着または局所免疫のメディエーターとの相互作用等の必須の機能をおそらくは仲介するため、重要であると考えられている。他の多くの細菌に共通して、Ｃ．ディフィシルは、外側の細胞表面上で結晶性またはパラ結晶性表面層（Ｓ層）を発現する。そのようなＳ層は、細菌の外表面上に規則的に配列した格子を形成するタンパク質または糖タンパク質を含み、また、アエロマナス・サルモニシダ（Aeromanas salmonicida）およびカンピロバクター・フェタス（Campylobacter fetus）等の病原菌の病原性に必須であることが既に示されている。一つのＳ層を含む大部分の細菌とは対照的に、Ｃ．ディフィシルは、Ｃ．ディフィシル株の間で見かけ上の分子量が各々若干異なる糖タンパク質からなる、２種の重ね合わせられたパラ結晶性Ｓ層を含むことが知られている。Ｃ．ディフィシルの大部分の株は、３２〜３８ｋＤａのもの（低分子量ＳＬＰ）と４２〜４８ｋＤａの二番目のもの（高分子量ＳＬＰ）２個の主たるＳ層タンパク質（ＳＬＰｓ）を発現する。低分子量ＳＬＰは、免疫優位であるようであり、ＣＤＡＤを患う患者に最も一般的に認められる抗原であり、全Ｃ．ディフィシル細胞に対してウサギ中で育てられた抗血清による細菌のＥＤＴＡ抽出物中で認められる唯一の抗原である（Calabi, E.ら、2001, Mol. Microbiol., 40(5) p1187-99, PMID: 11401722）。
【０００４】
Ｃ．ディフィシル感染症の処置／予防に対する抗生物質に基づかない他の治療法は、受動免疫化およびワクチン接種に基づく。受動的免疫化は、（ＷＯ９９／２０３０４に開示のような）毒素中和抗体または（ＷＯ９６／０７４３０に開示のような）細菌全体と毒素に対して育てられた抗体の患者への投与による。ワクチン接種処置は、Ｃ．ディフィシル表面層タンパク質もしくは変異株もしくは同族体の免疫原性フラグメントをコードする核酸配列または（ＷＯ０２／０６２３７９に開示のような）均等なポリペプチドフラグメントのいずれかを患者に投与することを含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者等は、低分子量ＳＬＰが、（患者の抗血清をプローブとする細菌抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより決定された）これまでに同定されていなかった３６ｋＤａの細菌性タンパク質を覆い隠していることを発見した。このタンパク質は、クロストリジウム・ディフィシルに感染した患者から単離された血清中に存在する抗体により認識されるという事実は、ＣＤＡＤの病原性にそのタンパク質が関与している可能性がある。このように、このタンパク質およびそのエピトープは、潜在的に広範囲の用途を提供するものであり、それらは治療上、免疫原、例えば、ワクチンとして使用され、あるいは診断上、それらに特異的に結合する薬剤（例えば、抗体）を検出するために使用しうる。それらはまた、治療上または診断上、それ自体であるいは、例えば受動免疫化に使用される他の抗体と組み合わせて使用しうる、中和剤、例えば抗体を製造するために使用しうる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、Ｃ．ディフィシル乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）が提供される。Ｃ．ディフィシルにより示される株間変異に従って、アミノ酸配列内でいくつかの変異が存在しうる。例えば、本発明に係るタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは９９．５％の同一性を示しうる。
【０００７】
配列の相同性／同一性は、National Center for Biotechnology Information, USA (www.ncbi.nlm.nih.gov)でのＢＬＡＳＴ２プログラム（Tatusova TAら、FEMS Microbiol Lett. 1999 May 15; 174(2); 247-50; PMID: 10339815）を用いて決定される。本明細書中、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と均等である。
【０００８】
同様に本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルをコードする単離核酸分子である。
【０００９】
例えば、単離核酸分子は、配列番号１の核酸配列を含んでなる。Ｃ．ディフィシルにより示される株間変異に従って、配列内でいくつかの変異が存在しうる。例えば、配列は、配列番号１の核酸配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは９９．５％の同一性を示しうる。
【００１０】
同じく本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨをコードする核酸分子を含んでなる核酸ベクターである。用語「ベクター」は、核酸分子を運ぶことができる、ビヒクル、好ましくは核酸分子を意味する。ベクターが核酸分子である場合、核酸分子は、ベクター核酸に共有結合的に結合している。本発明のこの観点で、ベクターは、例えば、プラスミド、一本鎖もしくは二本鎖のファージ、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡウイルスベクター、または人工染色体、例えばＢＡＣ、ＰＡＣ、ＹＡＣ、もしくはＭＡＣであることができる。ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり、原核細胞もしくは真核細胞または両者（例えば、シャトルベクター）中で機能しうる。原核生物宿主および真核生物宿主に対する好適なクローニング、発現およびシャトルベクターは、Sambrook, J.およびRussell, D., "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual", 第三版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 2001に記載されている。
【００１１】
同じく本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨをコードするベクターを含む宿主細胞である。ベクターは、核酸分子のさらなるコピーを複製し製造する染色体外因子として宿主細胞内に保持されることができる。あるいは、ベクターは、宿主細胞ゲノムに統合され、宿主細胞が複製される際に、核酸分子のさらなるコピーを製造する。
【００１２】
同じく本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨを含んでなるポリペプチドの製造方法であり、そのポリペプチドの製造に十分な条件下に宿主細胞を培養することおよびそのポリペプチドを回収することを含んでなる方法である。
【００１３】
それに由来するLDHタンパク質またはペプチド配列は、それを発現するように改変された細胞（組換え体）で発現され精製されるか、あるいは公知のタンパク質合成方法を用いて合成される。例えば、タンパク質またはペプチド配列をコードする核酸分子が発現ベクターにクローン化され、その発現ベクターは宿主細胞に導入され、次いでタンパク質が宿主細胞中で発現される。タンパク質は、次いで、標準的なタンパク質精製法を用いて、適当な精製スキームにより細胞から単離することができる。
【００１４】
同じく本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨまたはその抗原フラグメントをコードするベクターであり、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨを含んでなるポリペプチドまたはその抗原フラグメントがそのベクターで形質転換された細胞により発現されるように、単離核酸分子が適正な配向と正しいリーディング・フレームでベクターに挿入されている。
【００１５】
本明細書に記載された単離核酸分子は、プロモーター配列に動作可能なように結合されている。
【００１６】
発現ベクターは、核酸分子の転写が宿主細胞内でなされるように、核酸分子にベクター中で動作可能なように結合されるシス作動性調節領域を含んでいる。核酸分子は、転写に影響を与えることができる別の核酸分子で宿主細胞に導入することができる。そこで、第二の核酸分子は、ベクターから核酸分子を転写させるシス制御性調節領域と相互作用するトランス作動性因子を提供しうる。あるいは、トランス作動性因子は、宿主細胞により供給されうる。最後に、トランス作動性因子は、ベクターそれ自体から製造することができる。しかしながら、いくつかの実施態様において、核酸分子の転写および／または翻訳は無細胞系で起こりうる。
【００１７】
本明細書に記載の核酸分子が動作可能なように結合できる調節配列は、ｍＲＮＡ転写を方向付けるプロモーターを含む。これらには、限定されるものではないが、バクテリオファージλからの左プロモーター、大腸菌からのｌａｃ、ＴＲＰ、およびＴＡＣプロモーター、ＳＶ４０からの初期および後期プロモーター、ＣＭＶ即時型初期プロモーター、アデノウイルス初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルス長期リピートが包含される。
【００１８】
転写をプロモートする調節領域に加えて、発現ベクターは、また、転写をモジュレートする領域、例えばリプレッサー結合部位およびエンハンサーを含みうる。例として、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー、およびレトロウイルスＬＴＲエンハンサーが挙げられる。
【００１９】
転写開始および調節用部位を含むことに加えて、発現ベクターは、また、転写終止に必要な配列および、転写された領域中にリボソーム翻訳用結合部位を含むことができる。発現用の他の調節制御因子は、開始コドンおよび終止コドンならびにポリアデニル化シグナルを含む。当業者は、発現ベクター中で有用な多数の調節配列を知っているであろう。そのような調節配列は、例えば、Sambrook, J.およびRussell, D., "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual", 第三版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 2001に記載されている。
【００２０】
調節配列は、１以上の宿主細胞中での構成性発現をもたらし（すなわち、組織特異的）、あるいは、例えば温度、栄養添加物、またはホルモンもしくは他のリガンド等の外因性因子により、１以上の細胞型中で誘発発現をもたらしうる。原核生物宿主および真核生物宿主中での構成性および誘発性発現をもたらす多種のベクターが、当業者に周知である。
【００２１】
核酸分子は、周知の方法により、ベクター核酸に挿入することができる。一般的に、究極的に発現されるであろうＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列と発現ベクターを１以上の制限酵素で切断し、次いでフラグメントを一緒に連結することにより、発現ベクターに結合される。制限酵素での消化および連結の手順は、当業者に周知である。適当な核酸分子を含むベクターは、周知の手法を用いて、増殖用または発現用の適切な宿主細胞に導入することができる。細菌細胞としては、限定されるものではないが、大腸菌、ストレプトミセス（Streptomyces）、およびサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurim）が挙げられる。真核細胞としては、限定されるものではないが、酵母、ショウジョウバエ等の昆虫細胞、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞等の動物細胞、ならびにＨｅＬａまたはＨｕＨ−７等のヒト細胞が挙げられる。
【００２２】
同じく本発明により提供されるものは、本発明のＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な、抗体またはその抗原結合性フラグメントである。例えば、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２からなるＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的でありうる。
【００２３】
抗体は、周知である（Harlow, E.およびLane, D., "Using Antibodies - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 1998）。その種々の文法上の形態での用語「抗体」は、本明細書中、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫的に活性な部分、すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子を指すものとして使用される。そのような分子は、また、免疫グロブリン分子の「抗原結合性フラグメント」と称される。
【００２４】
例示される抗体分子は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子ならびに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦ（ｖ）としてこの分野で公知であるそれらの部分を包含する、パラトープを含む免疫グロブリン分子のそれらの部分である。
【００２５】
本発明に係る結合剤は、ＬＤＨに結合するだけではなく、細菌感染症を中和あるいは緩和しうる。
【００２６】
本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な、抗体またはその抗原結合性フラグメントは、人体または動物体の処置方法または診断方法において使用しうる。
【００２７】
同じく本発明により提供されるものは、本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用を含んでなる、感染症の処置用の医薬の製造方法である。
【００２８】
ＬＤＨタンパク質またはＬＤＨタンパク質に由来するエピトープは、抗体を発生させるために使用しうる。細菌性ＬＤＨタンパク質のエピトープは、標準的な手順を用いて決定しうる（例えば、Geysen, H.M.,ら、J. Immunol. Methods, 1987, 102(2):259-74, PMID: 2443575; Geysen, H.M.,ら、J Mol. Recognit., 1988, 1(1):32-41, PMID: 2483922; Jung, G.,およびBeck-Sickinger, A.G., 1992, Angew. Chem. Int. Ed. Eng., 31:367-486; Beck-Sickinger, A.G.,およびJung, G., Pharm. Acta. Helv. 1993; 68(1):3-20; PMID: 7692453）。抗体またはその抗原結合性フラグメントは、当業者に周知の確立された免疫学的手法を用いて調製されうる（例えば、Harlow, E.およびLane, D., "Using Antibodies - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 1998参照）。そこで、例えば、任意の好適な宿主にタンパク質を注入し、血液を採取して、適当な精製および／または濃縮後に、所望のポリクローナル抗体が得られる（例えば、親和性媒体として固定化タンパク質を用いるアフィニティー・クロマトグラフィーにより）。あるいは、脾細胞またはリンパ細胞をタンパク質注入宿主から回収し、例えばKohlerらの方法（1976, Eur. J. Immunol., 6: 511）を用いて固定化し、得られた細胞を分離してモノクローナル抗体を産生する単一遺伝子系を得る。抗体フラグメントは、慣用の手法、例えば、ペプシンまたはパパインでの酵素的消化により製造しうる。本発明に係る組換え抗体を製造することが所望される場合は、これらは、例えば、ＥＰ１７１４６９、ＥＰ１７３４９４、ＥＰ１９４２７６およびＥＰ２３９４００に記載の方法を用いて、製造しうる。
【００２９】
医薬は、ワクチンでありうる。ワクチンは、免疫系を病原体由来の抗原でふさぐことにより、感染から保護する。ワクチン接種は、病原体由来の抗原に一回または繰り返し暴露することにより達成され、本格的な感染プロセスの有害な作用を伴わずに、抗体の成熟およびＢ細胞クローン性発現をもたらす。ＬＤＨタンパク質またはそのタンパク質に由来するエピトープを、ワクチン中で使用しうる。１以上のそのようなエピトープを含むワクチンを、ヒトを免疫化するために使用することができ、これにより、Ｃ．ディフィシル感染への感受性が減少する。タンパク質および／またはエピトープは免疫原性であるか、あるいはそれらは、例えばアジュバントを含む免疫原性組成物として投与しうる。ワクチンは、ＤＮＡワクチンであってもよい。ＤＮＡワクチンは、十分に認知されており、当業者に公知であろう。
【００３０】
エンテロコッカス・ファエシウム（Enterococcus faecium）（Bugg, T.D.,ら、1999, Biochemistry, 30(43), pp10408-15, PMID: 1931965）およびスタフィロコッカス・オウレウス（Staphylococcus aureus）（Milewski, W.M.ら、1996, Antimicrob Agents Chemother 40(1), pp166-72, PMID: 8787900）等の細菌において、乳酸脱水素酵素はバンコマイシン等の抗生物質への耐性メカニズムにおいて重要な役割を果たしているという証拠があるため、本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントと、抗生物質、例えば、バンコマイシン等の糖タンパク質抗生物質とを共に組み合わせることは、Ｃ．ディフィシルによる感染症をさらに成功裡に処置しうる手段を提示しうる。あるいは、糖タンパク質抗生物質は、例えば、ラモプラニンまたはテイコプラニンであってもよい。抗生物質は、時折、ＣＤＡＤの処置に使用されるメトロニダゾールであってもよい。
【００３１】
医薬は、Ｃ．ディフィシル感染症の処置に使用することができ、治療上有効量の、本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントあるいはそれを糖タンパク質抗生物質、例えばバンコマイシン、または抗生物質メトロニダゾールと組み合わせて含みうる。抗体またはその抗原結合性フラグメントは、抗生物質と相乗的に作用して、向上した治療効果、すなわち、組み合わせ治療を用いた処置で期待されるよりもさらに大きな効果をもたらす。
【００３２】
医薬は、人体または動物体の処置方法または診断方法において使用しうる。
【００３３】
医薬は、細菌が糖タンパク質抗生物質処置または抗生物質処置に耐性である、Ｃ．ディフィシル感染症の処置に使用しうる。
【００３４】
同じく本発明により提供されるものは、治療上有効量の抗生物質、例えば糖タンパク質抗生物質および本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用を特徴とする、Ｃ．ディフィシル感染症の処置用の医薬の製造方法である。抗生物質は、バンコマイシン、ラモプラニンまたはテイコプラニン等の糖タンパク質抗生物質でありうる。あるいは、抗生物質は、メトロニダゾールでありうる。
【００３５】
同じく本発明により提供されるものは、治療上有効量の抗生物質、例えば糖タンパク質抗生物質および本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントを、それを必要とする患者に投与する工程を含んでなる、Ｃ．ディフィシル感染症の処置方法である。抗生物質は、バンコマイシン、ラモプラニンまたはテイコプラニン等の糖タンパク質抗生物質でありうる。あるいは、抗生物質は、メトロニダゾールでありうる。
【００３６】
本発明に係る医薬および処置方法は、当業者には容易に明白であろう。医薬は、薬学的に許容しうる担体、希釈剤または助剤を用いて調製しうる（Remigton's: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Mack Publishing Company, Easton, PA, USA）。医薬および処置方法は、薬学上有効量のエピトープまたは抗体／抗体結合性フラグメントを用いて達成される。適切な用量は、当業者には容易に明白であり、例えば、用量反応実験により、容易に決定しうる。
【００３７】
同じく本発明により提供されるものは、上記Ｃ．ディフィシルＬＤＨの試料中での存在を検出する診断試験方法であって、
ｉ）試料と、本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントとを接触させ、
ｉｉ）抗体−抗原結合反応を検出し；
ｉｉｉ）検出工程（ｉｉ）の結果を、その試料中のそのＣ．ディフィシルＬＤＨの存在と関連付ける、
工程を含んでなる方法である。
【００３８】
同じく本発明により提供されるものは、本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体の試料中での存在を検出する診断試験方法であって、
ｉ）試料とそのＣ．ディフィシルＬＤＨとを接触させ、
ｉｉ）抗体−抗原結合反応を検出し；
ｉｉｉ）検出工程（ｉｉ）の結果を、その試料中のそのＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体の存在と関連付ける、
工程を含んでなる方法である。
【００３９】
試料は、患者からのもの、例えば、血清試料または腹膜透析物であり、ただし、抗Ｃ．ディフィシル抗体を有するあるいは有すると期待される全ての他の試料が、当然のことながら、使用しうる。
【００４０】
同じく本発明により提供されるものは、本発明に係る診断試験方法を行うための診断試験キットである。診断試験キットは、周知であり、例えば、ＷＯ８８／０８５３４に記載の浸漬スティック試験を包含する。試験キットは、本発明に係る診断試験方法でのその使用についての指示書を含みうる。
【００４１】
同じく本発明により提供されるものは、治療上有効量の抗生物質および本発明に係るＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる、Ｃ．ディフィシル感染症の処置用の医薬パックである。
【００４２】
抗生物質は、メトロニダゾールでありうるか、または抗生物質は、糖タンパク質抗生物質、例えば、バンコマイシン、ラモプラニンまたはテイコプラニンでありうる。
【００４３】
感染症は、抗生物質のみによる処置に耐性である、Ｃ．ディフィシルによるものでありうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明は、Ｃ．ディフィシルＬＤＨの単離および同定を記載する、以下の実験から、さらに明らかになるであろう。
実 験
【００４５】
以下に詳述する実験は、Ｃ．ディフィシルに感染した患者から得られた分画されたＣ．ディフィシルタンパク質抽出物および抗血清を用いた免疫ブロッティング実験において、見かけ上の分子量３６ｋＤａのタンパク質が大部分の患者により認められることを実証する。アミノ酸配列決定を使用して、このタンパク質が乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）であることが決定された。Ｃ．ディフィシルＬＤＨタンパク質をコードする遺伝子をクローン化し、次いで、組換えＬＤＨタンパク質発現用の細菌性発現ベクターにサブクローン化した。精製した組換えＬＤＨタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび２Ｄ電気泳動により分画し、Ｃ．ディフィシルに感染した患者から得られた抗血清で探査する（probing）前に、免疫ブロッティングした。
【００４６】
他に特記しない限り、本明細書中に詳述した全ての方法は標準的な手順を用いて、適用可能な製造者の指示書に従って行われる。ＰＣＲ、分子クローニング、操作と配列決定、および細胞培養を含む種々の手法についての標準的手順は、McPherson, M.J.ら、(1991, PCR: A practical approach, Oxford University Press, Oxford), Sambrook, J.およびRussell, D., ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 第三版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 2001), HuynhおよびDavis (1985, "DNA Cloning Vol I - A Practical Approach", IRL Press, Oxford, Ed. D.M. Glover), Sanger, F.ら、(1977, PNAS USA 74(12): 5463-5467), Harlow, R.およびLane, D. ("Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, New York, 1998), Harris, M.A.およびRae, I.F. ("General Techniques of Cell Culture", 1997, Cambridge University Press, ISBN 0521 573645)。
【００４７】
他のもののうち、本明細書中で詳述された方法中で有用な試薬および装置は、Amersham (www.amersham.co.uk), Boehringer Mannheim (www.boehringer-ingeltheim.com), Clontech (www.clontech.com), Genosys (www.genosys.com), Millipore (www.millipore.com), Novagen (www.novagen.com), Perkin Elmer (www.perkinelmer.com), Pharmacia (www.pharmacia.com), Promega (www.promega.com), Qiagen (www.qiagen.com), Sigma (www.sigma-aldrich.com)およびStratagene (www.stratagene.com)のようなものから入手できる。
【００４８】
刊行物に対して「ＰＭＩＤ」参照番号が付与されている場合、これらは、US National Library of Medicineによりそれらに割り当てられたPubMed識別番号であり、それから各々の刊行物に対する完全な文献情報および要旨がwww.ncbi.nlm.nih.govで入手できる。これはまた、特に、例えば、ＰＮＡＳ、ＪＢＣおよびＭＢＣ刊行物の場合に、完全な刊行物の電子コピーに直接アクセスすることができる。
【００４９】
本明細書中で議論された参考文献の各々の内容は、それらの中で引用された参考文献のそれを含めて、それらの全体がここに参照として取り込まれる。
方 法
試 料
【００５０】
血清試料および大便標本を採取し、それぞれ、−２０℃および４℃で保存した。
Ｃ．ディフィシル Tox AB II試験
【００５１】
このキットは、Tec Lab Inc., USAから購入した。液状便５０μｌを希釈剤２００μｌに加え、混合物１００μｌをマイクロタイタープレート中のコンジュゲート５０μｌに加え、３５℃で５０分間インキュベートし、その後、４回洗浄した。基質ＡおよびＢをプレートに加え、混合し、室温で１０分間インキュベートした。停止溶液をプレートに加え、さらに１０分間インキュベートし、光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を４５０ｎｍで測定した。
培養と同定
【００５２】
陽性標本を、Ｃ．ディフィシル選択サプリメント、Ｄ−シクロセリンおよびセフォキチン（Oxoid）を含むＣ．ディフィシル寒天ベース(Oxoid)を用いて培養し、嫌気性条件下で４８時間生育した。陽性標本の特性は、酵素的加水分解ＰＲＯ試験（Key Scientific Products, USA）およびラテックス凝集試験（Microscreen C. Difficile, Microgen Bioproducts Ltd, UK）を用いて確認した。
抗原調製
【００５３】
Ｃ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４は、２％（ｗ／ｖ）プロテアーゼペプトンと１％（ｗ／ｖ）酵母エキスを含む培地中、３７℃で４８時間、嫌気性条件下で培養した。細胞は、遠心分離により収集し、滅菌食塩水中で３回洗浄した。その後、細胞ペーストをBio X-presser 細胞ディスインテグレーター (LKB Instruments Sweden) に入れ、破砕の前に、−２０℃で一晩放置した。試料を破砕し、洗浄し、ついでＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化した。
試料の可視化およびタンパク質の同定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【００５４】
プレートを、製造者の指示書に従って集め、溶解ゲル（３０％アクリルアミド／ビス２５ｍｌ、分離ゲルバッファー１４．０６ｍｌ（蒸留水１００ｍｌ（ｐＨ８．８）で１００ｍｌにしたトリスベース２４．２２ｇ、１０％ＳＤＳ７５０μｌ、蒸留水３５．２ｍｌ、１０％過硫酸アンモニウム３７５μｌ、ＴＥＭＥＤ３７．５μｌ）を注いだ。一旦セットし、スタッキングゲル（３０％アクリルアミド／ビス３．６ｍｌ、スタッキングゲルバッファー７．３ｍｌ（蒸留水１００ｍｌ（ｐＨ６．８）で１００ｍｌにしたトリスベース６．０５ｇ、１０％ＳＤＳ３００μｌ、蒸留水１９ｍｌ、１０％過硫酸アンモニウム３００μｌ、ＴＥＭＥＤ３０μｌ）を注ぎ、くしを挿入し、センター取りした。ゲルをセットし、くしを取り除き、ウエルを蒸留水で洗浄した。ゲルをタンクホルダーに入れ、タンクに入れた。試料（Ｃ．ディフィシル１０μｌ）を各々のウエルに加え、電気泳動バッファー（トリスベース１８．９６ｇ、グリシン１２ｇ、ＳＤＳ３ｇ、蒸留水３Ｌ）をトップに積層した。タンクを電気泳動バッファーで満たし、水を出し、８０〜１００ｍＡの電流で１〜２時間運転した。
タンパク質可視化
【００５５】
タンパク質のバンドを、メタノール１００ｍｌ、氷酢酸２０ｍｌ中、４℃で一晩ゲルを固定し、ＯＷＬ銀染色キット（NBS Biologicals, Huntington）を用いて銀染色することにより可視化した。
ウエスタンブロッティング
【００５６】
ゲルホルダーを製造者の指示書に従って集めて、サンドィッチを以下のように生成した：Scotchbrite、2 xろ紙、ニトロセルロース／ＰＶＤＦ、ゲル、2 xろ紙、Scotchbrite、（the Scotchbrite、ろ紙、およびニトロセルロース／ＰＶＤＦはすべて、トランスブロッティングバッファー（トリスベース９．０７ｇ、グリシン４３．２ｇ、蒸留水３Ｌ、メタノール７５０ｍｌ中で浸漬した）。ホルダーをタンクに組み込み、１００Ａで４５分間運転した。
【００５７】
血清は、臨床的にＣ．ディフィシル大腸炎であって糞便で陽性の毒性アッセイを示した患者２４人から、および大腸炎の証拠がなく、陰性の毒性アッセイを示した患者２０人から入手した。血清を、トランスブロッティングした抗原ストリップに加え、室温で２時間、振盪しながらインキュベートした。５回の５分間ずつの洗浄ののち、アルカリ性ホスファターゼとコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭと共に１時間インキュベートした。ストリップを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴを用いる可視化の前に、洗浄した。
タンパク質配列決定
【００５８】
適切なバンドを、ＰＶＤＦ膜上にトランスブロッティングし、直接的アミノ酸配列決定を標準的な方法を用いて行った。
ライブラリーの構築とクローンの分析
ゲノムライブラリーの構築
【００５９】
Ｃ．ディフィシルＮＣＴＣ１１２０４を嫌気性条件下、３７℃で一晩、ＬＢブロス１０ｍｌ中で培養した。細菌を遠心分離により収集し、ペレットを滅菌食塩水で２回洗浄し、ＴＥバッファー１ｍｌに再懸濁した。リゾチーム１μｌを細胞に加え、その後、３７℃で１５分間インキュベートした。プロテイナーゼＫ２０μｌと１０％ＳＤＳ５０μｌを混合物に加え、それを反転させて混合し、５５℃で４５分間放置した。混合物をマイクロヒュージ中で脈動させ、上清を等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２５：１）を含む管に移し、１０分間反転させて混合し、タンパク質を析出させた。これを、次いで、１２０００ｘｇで１０分間遠心分離した。上層のＤＮＡ含有水層を取り除き、上記の工程を繰り返した。水層と等量のイソプロパノールとを混合し、混合物を室温で１５分間放置し、次いで、１２，０００ｇで２０分間遠心分離することにより、ＤＮＡを析出させた。細菌性ＤＮＡを含有するペレットを氷冷７０％エタノール中で洗浄して過剰の塩を除去し、超純水２００μｌ中に再懸濁した。
細菌性ゲノムＤＮＡの部分的消化
【００６０】
制限消化は、製造者の指示書に従って使用した、ＨｉｎｄＩＩＩを含んでセットアップし、次いで、アリコート５μｌを、ある時間間隔で収集し、６５℃１０分間加熱することにより不活性化した。ＤＮＡ試料をエタノール析出し、アガロースゲル電気泳動で可視化した。２〜５Ｋｂに対応するフラグメントをゲルから切り取って、Genecleanプロトコル（Anachem, UK）を用いて清浄化した。ＤＮＡを滅菌超純水２０μｌ中で溶出し、−２０℃で保存した。
プラスミドＤＮＡの精製
【００６１】
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢブロス５ｍｌにプラスミドｐＴＺ１８Ｒを含有する大腸菌で接種し、振盪プラットフォームインキュベーター中で、３７℃で一晩培養した。細菌細胞を遠心分離により採集し、QIAprep Spin Miniprep キット（QIAgen）を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、精製した。
プラスミド消化、リン酸化および連結
【００６２】
ｐＴＺ１８Ｒ ＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、５’リン酸基は、４μｌの１０ｘアルカリ性ホスファターゼバッファー（Promega）および１μｌのアルカリ性ホスファターゼ（Promega）を試料３５μｌに加え、次いで３７℃で２時間インキュベートすることにより除去した。試料は、アガロースゲル上で可視化し、前述のGenecleanキットを用いて清浄化した。部分的に消化されたゲノムＤＮＡを、製造者の指示書に従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（Progema）を用いて、４℃で一晩、小容量で、ｐＴＺ１８Ｒと連結した。
形質転換
【００６３】
プラスミドＤＮＡは、以下の細菌株にエレクトロポレーション(２００オーム／２５μＦ ２．５ＫＶ）することにより形質転換した：
大腸菌ＪＭ１０９
大腸菌ｌｄｈ―ＤＣ１３６８（乳酸脱水素酵素欠損株)ＩａｈＡ： Kanpfi,com (Gupta, S.,およびClark, D.P., 1989, J.of Bacteriology, 171, p3650-3655)。
大腸菌Ｗ１４８５(野生型)
形質転換細菌細胞は、Ｍ９培地上に載せ、次いで、好気性および嫌気性の両条件下、３７℃で一晩、インキュベートした。
ＤＮＡ配列決定
【００６４】
個々のクローンは、MegaBACE10001ＤＮＡシーケンサー(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて配列決定した。プラスミドＤＮＡ（１００〜５００ｎｇ）を、DYEnamic ETターミネーター試薬プレミックス８μｌとＭ１３フォワードプライマー（配列番号５）またはＭ１３リバースプライマー（配列番号６）１μｌ（５μＭ）に、全量２０μｌで加えた。サイクリング条件は、９５℃で２０秒；５０℃で１５秒；および６０℃で６０秒の３０サイクルであった。組み込まれていない染料ターミネーターはエタノール析出により除去し、ＤＮＡをローディングバッファー２０μｌ中に再懸濁した。反応物は、２ＫＶの注入パラメーターを３０秒間および６ＫＶで２００分間の電気泳動を用いて、ＤＮＡシーケンサー上にロードした。
ｌｄｈ遺伝子のサブクローン化
【００６５】
ｌｄｈ遺伝子は、以下の条件下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、ｐＧＥＭ−Ｔ easy ベクター（Promega, Southampton, UK）にサブクローン化した部分的に消化されたＤＮＡから再増幅した：ＤＮＡ１μｇ、Ｌ１フォワードプライマー（配列番号３）またはＬ２リバースプライマー（配列番号４）の各々２５ｐｍｏｌ、２００μＭｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2および５単位のＴａｑポリメラーゼ。サイクリング条件は、９４℃で５分間の初期変性工程、次いで９４℃で６０秒；５５℃で６０秒；および７２℃で６０秒の２５サイクル、７２℃で７分間と４℃で保持の最終伸長工程を使用した。試料は、アガロースゲル電気泳動により可視化した。ｌｄｈ遺伝子は、以下のように、ｐＢＡＤ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にサブクローン化した：GenecleanedＰＣＲ生成物（上記）２μｌをｐＢＡＤ−ＴＯＰＯベクター１μｌと供給された塩溶液１μｌに、５μｌの最終反応容量で加え、室温で５分間インキュベートした。大腸菌ＴＯＰ１０−Ｆ’コンピーテントな細胞を、最終反応物２μｌを用いて熱ショックにより形質転換し、ＳＯＣ培地中で３７℃１時間インキュベートしたのち、細胞を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足した乾燥ＬＢアガープレート上に載せ、プレートを３７℃で一晩、反転位置でインキュベートした。
陽性クローン
【００６６】
陽性クローンをＰＣＲで増幅した。一コロニーを、ｐＢＡＤフォワードプライマー（配列番号７）またはＬ１リバースプライマーを各々５０ｐｍｏｌ、２００μＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．８、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2および５単位のＴａｑポリメラーゼを含有するＰＣＲマスターミックスに加えた。サイクリング条件は、９４℃で５分間の初期変性工程、次いで９４℃で６０秒；５５℃で６０秒；および７２℃で６０秒の２５サイクル、７２℃で７分間と４℃で保持の最終伸長工程を使用した。試料は、アガロースゲル電気泳動により可視化した。
組換えＬＤＨタンパク質の発現
【００６７】
各陽性形質転換体を、振盪しながら、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを補足したＬＢ１０ｍｌ中で、３７℃で一晩培養した。培養物１００μｌを、翌朝新鮮なブロス１０ｍｌに接種するのに使用し、それを引き続き、振盪しながら、０．５のＯＤ600が得られるまで培養した。タンパク質発現は、２０％（ｗ／ｖ）Ｌ−アラビノースを添加し、次いでさらに３７℃で４時間インキュベートすることにより誘起した。細胞は、４０００ｘｇで１５分間遠心分離してペレット化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファー１００μｌ中に再懸濁した。試料を７０℃で５分間加熱し、５μｌをゲル上に分画し、前記と同様にトランスブロッティングした。タンパク質のバンドを、抗Ｖ５エピトープｔａｇ抗体の１：５０００希釈物を用い、次いで、抗マウスアルカリ性ホスファターゼコンジュゲートとＢＣＩＰ／ＮＢＴ株でインキュベートすることにより検出した。
組換えタンパク質の精製
【００６８】
培養物５０ｍｌを培養し、タンパク質発現を上記のように誘起した。回収された細胞は、Bio X-presser 細胞ディスインテグレーター (LKB Instruments)を用いて溶解した。タンパク質を、製造者の指示書に従って用いた、ProBond 精製システム（Invitrogen）を用いて精製した。タンパク質を、５０ｍＭ、２００ｍＭ，３５０ｍＭおよび５００ｍＭイミダゾール溶出バッファー５ｍｌを連続的に用いてイミダゾール濃度を連続的に増大させて１ｍｌの分画を集めるか、あるいは元来のｐＨ溶出バッファー５ｍｌを適用して１ｍｌの分画を集めるかの何れかにより溶出した。画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより、特に前記したように、分析した。
患者の血清を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング
【００６９】
組換えタンパク質を含有する画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で操作し、確認されたＣ．ディフィシル感染症の患者１０人からの血清と４つの対照用血清を用いて、免疫ブロッティングした。
患者の血清を用いる２Ｄゲル電気泳動およびウエスタンブロッティング
試料調整
【００７０】
１０ｎＭＰＢＳ中に懸濁したＣ．ディフィシル細胞を、氷上で、５回の１分間バーストで超音波処理した。得られた細胞を、１３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清３００μｌを、冷アセトン中で４５分間、２０ｍｌの１０％トリクロロ酢酸／２０ｍＭＤＴＴ中で析出させた。タンパク質を１３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して回収し、得られたペレットを、２０ｍＭＤＴＴを含有する冷アセトンで洗浄した。遠心分離と洗浄工程をさらに２回繰り返し、２Ｄゲル電気泳動により分画する前に、タンパク質を前と同様に遠心分離して回収した。
２Ｄゲル電気泳動
【００７１】
タンパク質ペレットを試料再加水分解溶液に溶解し、同じ溶液で、等電点電気泳動用の適切な濃度に希釈した。等電点電気泳動は、各々のストリップ上にタンパク質約１５μｇを載せて、３〜１０（７ｃｍ）の非直線的なｐＨ範囲にわたって、合計１７００Ｖｈで、Zoom（登録商標）IPGRunner（商標）システム（Invitrogen Ltd, Carlsbad, CA, USA）を用いて行った。二次元分離の前に、ストリップを６５ｍＤＴＴを含む平衡化バッファー中で１５分間、次いで、１２５ｍＭヨードアセトアミドを含む同じバッファー中でさらに１５分間平衡化した。
【００７２】
二次元分離は、NuPage４〜１２％Bis-TrisZoom gel（Invitrogen Ltd, Carlsbad, Ca, USA）ゲルを用いて行った。タンパク質は、Invitrolon PVDF膜（Invitrogen Ltd, Carlsbad, Ca, USA）上にトランスブロッティングし、５％スキムミルク／０．１％Tween 20を含む１０ｍＭ ＰＢＳ中で１時間ブロックした。
ウエスタンブロッティング
【００７３】
ＬＤＨの位置を同定するために、膜を１時間、ウサギの筋肉からＬＤＨに対して生育されたポリクローナル抗ＬＤＨワサビペルオキシダーゼ抗体コンジュゲート（Abcam Limited, Cambridge, UK）と共にインキュベートした。抗体は、１０ｍＭ ＰＢＳ／０．１％Tween 20中で希釈した（１：５００）。ＰＢＳ−Ｔ中で洗浄したのち、ブロットをSigmaFast（商標）３，３’−ジアミノベンジジン錠（ＤＡＢ）を用いて現像した。
【００７４】
３０〜４０ｋＤａのＣ．ディフィシルタンパク質（一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより決定された）に免疫反応性であることが知られており、それ故、潜在的にＬＤＨ免疫反応性である、患者の血清は、ＬＤＨの同定について上記したと同じ方法で、二次元ブロットを探査するために選択された。膜は、ＰＢＳ−Ｔ中、血清で希釈されて（１：２０）、５０分間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ中でブロットを洗浄した後、一次抗体は、二次抗ヒトＩｇＧアルカリ性ホスファターゼコンジュゲート（Ｆｃ特異的）を用いて検出した。一次／二次抗体複合体は、SigmaFast（商標）リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル／ニトロブルーテトラゾリウム錠を用いて検出した。
結 果
試 料
【００７５】
試験した試料のうち２４個がＣ．ディフィシルＴＯＸ Ａ／ＢＩＩ試験で陽性であり、黄色（陽性）反応を与えた。特性は、コロニーおよびグラムモルホロジー（血液寒天上で大きな楕円形のサブ末端芽胞を有するグラム陽性バシルス（Bacillus））、酵素的加水分解ＰＲＯ試験（暗ピンク色〜赤色の外観）により確認され、またラテックス凝集試験は、２分以内に目に見える凝集塊を与え、Ｃ．ディフィシルの存在を示した。全抗原は、臨床的単離物およびＣ．ディフィシルの標準（National Collection of Type Culture (NCTC) 11204, PHILS, London, UK）株の双方の培養物から提供された。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【００７６】
Ｃ．ディフィシル全細胞抽出物のＯＷＬ銀染色は、２０〜２００ｋＤａの分子サイズを有するタンパク質バンドを示した。
ウエスタンブロッティング
患者と対照血清試料を用いるＣ．ディフィシルの全細胞抽出物のＩｇＧブロッティングの結果、二つの群の間で統計的に有意な差異を有する見かけ上の分子量３６ｋＤａのタンパク質が検出された。このタンパク質は、２０の対照試料中では７つであるのに対して、２４の患者試料中のうちの２１で検出された（c 2＝１２．３７、Ｐ値０．００１）。他の免疫優位な抗原は、４３、５５および７０ｋＤａに明らかに見出された（表１）
【００７７】
【表１】
タンパク質の配列決定
【００７８】
３６ｋＤａのバンドからの最初の１０アミノ酸残基は、Ｎ−末端配列決定により得られ、表２に示す。このアミノ酸配列は、BCM Search Launcher (www.searchlauncher.bcm.tmc.edu/)に入っており、それは、合致性を戻してきて、表３に示すように、ｌｄｈと６０％の相同性を示す。
【００７９】
【表２】
【００８０】
【表３】
ゲノムライブラリー
【００８１】
ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消化して、２〜５Ｋｂｐの範囲のＤＮＡフラグメントを製造した。部分的に消化されたＤＮＡはｐＴＺ１８Ｒに連結し、大腸菌に形質転換した。組換えクローンを生育についてスクリーニングし、配列決定した。これに由来するプライマーは、ｐＧＥＭ−Ｔ easy（Promega）中で調製されたライブラリーからのｌｄｈ遺伝子をＰＣＲするために使用し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。組換えクローンは、ＰＣＲで確認し、配列決定のために選択した。
ＤＮＡ配列決定
【００８２】
双方の生成物の配列決定は、ｌｄｈ遺伝子を含むオープン・リーディング・フレームを明らかにした。インサートは、９５０塩基対の長さであり、３１０アミノ酸をコードしていた。これは、７つの他のＬＤＨタンパク質と部分的に合致（２９〜４２％の相同性）した（ラクトバシルス（Lactobacillus spp.）、ペディコッカス・アシディラクチシ（Pediococcus acidilactici）、リューコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）および大腸菌を含む）。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティング
【００８３】
組換えＬＤＨタンパク質は、１０の患者抗血清のうち８つの中に含有される抗体により認識された。対照的に、組換えタンパク質は、４つの対照血清のいずれを用いても、ウエスタンブロットにおいて検出されなかった。
２Ｄゲル電気泳動および免疫ブロッティング
【００８４】
市販の抗乳酸脱水素酵素抗体を用いて、２Ｄブロット上でＬＤＨタンパク質を同定することが可能であった。強いスポットが２個のみ、抗体により可視化され、そのうちの１個のみが、推定された分子量（約３４ｋＤａ）および推定された等電点（４．９５と算定）を示した。分析された３つの患者血清のうち、それらの全てがＬＤＨへの抗体を含んでいた。１つの患者の抗体は、ほぼ排他的にＬＤＨに反応性であった。
要 約
【００８５】
これらの実験は、Ｃ．ディフィシルに感染した患者から得られた血清中の抗体により認識されるタンパク質としてのＬＤＨの同定について記述している。
実 施 例
【００８６】
Ｃ．ディフィシルに感染した患者を処置するために、細菌性ＬＤＨタンパク質またはＬＤＨタンパク質由来のエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントが経口的にまたは経静脈的に投与される。好適な用量は、用量反応アッセイを用いて容易に決定される。
【００８７】
患者は、抗体および糖ペプチド抗生物質、例えばバンコマイシンの治療上有効な組み合わせを用いて処置される。糖ペプチド抗生物質は、経口的に、例えば錠剤またはカプセルとして投与される。糖ペプチド抗生物質の好適な用量は、当業者に周知である。抗生物質は、例えば同じ処方物中で抗体と共に投与されるか、あるいは抗生物質は、抗体の投与とほぼ同時に投与される。細菌性ＬＤＨタンパク質またはＬＤＨタンパク質由来のエピトープに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントは、経口的にまたは経静脈的に投与される。好適な用量は、用量反応アッセイを用いて容易に決定される。
【００８８】
Ｃ．ディフィシル感染への感受性を減少または除去するようにヒトにワクチン接種するためにあるいは細菌に対する患者の免疫応答を促進するために、ワクチンを、細菌への免疫応答を組み込み得るか組み込み得ない患者、例えばＣＤＡＤまたはＣ．ディフィシル大腸炎を患っている患者に投与する。ワクチンは、細菌抽出物、または組換えＬＤＨタンパク質、またはそのタンパク質由来のエピトープ、あるいはそれらの組み合わせを含んでなる。細菌への免疫応答を組み込むことができないそれらの患者に対しては、ＬＤＨまたはそのエピトープを含むワクチンは、それによって患者の免疫系が好適な応答を取り込むことを促進する手段を意味する。抗体応答は、患者からの試料における抗ＬＤＨ抗体のレベルをモニターすることにより決定される。ワクチンは、ワクチン成分の免疫原性を向上または改善するアジュバントを含む。免疫応答が弱い患者は、ワクチンの多数回用量を一定の期間をおいて投与するような、再チャレンジを受ける。
【００８９】
Ｃ．ディフィシルは、患者から例えば血液試料を採り、それをＣ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントと接触させることにより、患者の試料中で検出される。例えば、特異的な抗ＬＤＨ抗体を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングが、試料中にＣ．ディフィシルが存在するか否かを決定するために使用され、ウエスタンブロッティングにより決定された陽性反応、すなわち、ＬＤＨの分子量に対応するタンパク質の検出が、試料中のＣ．ディフィシルの存在を示す。
【００９０】
Ｃ．ディフィシル抗原に特異的な抗体は、患者から採られた試料中で、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングを用いて検出される。例えば、組換え細菌性ＬＤＨ、その抗原性フラグメント、または細菌抽出物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画され、患者の抗血清で探査される。ウエスタンブロッティングにより決定された陽性反応、すなわち、ＬＤＨの分子量に対応するタンパク質の検出が、患者試料中の抗Ｃ．ディフィシル抗体の存在を示す。
【００９１】
Ｃ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントは、診断試験キット中に含まれている。同様に、診断試験キットは、組換え細菌性ＬＤＨ、そのフラグメント、または細菌抽出物を含んでなる。
【００９２】
Ｃ．ディフィシルＬＤＨに特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントは、クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置用の医薬パック中に含まれる。その医薬パックは、治療上有効量の糖ペプチド抗生物質、例えばバンコマイシンを含んでなる。
【配列表】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは９９．５％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、クロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素。
【請求項２】
請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素をコードする単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号１の核酸配列を含んでなる、請求項２記載の単離核酸分子。
【請求項４】
請求項２または３の何れか一項の核酸分子を含んでなる、核酸ベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素を含んでなるポリペプチドの製造方法であって、そのポリペプチドの製造に十分な条件下に請求項５の宿主細胞を培養することおよびそのポリペプチドを回収することを含んでなる方法。
【請求項７】
ベクターが、プラスミド、ウイルス、およびバクテリオファージよりなる群から選択されるものである、請求項４に記載のベクター。
【請求項８】
クロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素を含んでなるポリペプチドをそのベクターで形質転換された細胞により発現できるように、その単離核酸分子が適正な配向と正しいリーディング・フレームでベクターに挿入されている、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
その単離核酸分子がプロモーター配列に動作可能なように結合されている、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
人体または動物体の処置方法または診断方法において使用する、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用を含んでなる、クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置用医薬の製造方法。
【請求項１３】
治療上有効量の抗生物質および請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる、医薬。
【請求項１４】
人体または動物体の処置方法または診断方法において使用する、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置用である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１６】
治療上有効量の抗生物質および請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用を特徴とする、クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置用医薬の製造方法。
【請求項１７】
治療上有効量の抗生物質および請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントを、それを必要とする患者に投与する工程を含んでなる、クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素の試料中での存在を検出する診断試験方法であって、
ｉ）試料とそのクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントとを接触させ、
ｉｉ）抗体−抗原結合反応を検出し；
ｉｉｉ）検出工程（ｉｉ）の結果を、その試料中のそのクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素の存在と関連付ける、
工程を含んでなる方法。
【請求項１９】
請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体の試料中での存在を検出する診断試験方法であって、
ｉ）試料とそのクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素とを接触させ、
ｉｉ）抗体−抗原結合反応を検出し；
ｉｉｉ）検出工程（ｉｉ）の結果を、その試料中のそのクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体の存在と関連付ける、
工程を含んでなる方法。
【請求項２０】
試料が患者からの試料である、請求項１８または１９のいずれか一項に記載の診断試験方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の診断試験方法を行うための診断試験キット。
【請求項２２】
治療上有効量の抗生物質および請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる、クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置用の医薬パック。
【請求項２３】
その抗生物質がバンコマイシン、ラモプラニン、テイコプラニン、またはメトロニダゾールである、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の医薬、製造方法、処置方法、診断試験方法、診断試験キット、または医薬パック。
【請求項２４】
その感染症がクロストリジウム・ディフィシルによるものである、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の医薬、製造方法、処置方法、診断試験方法、診断試験キット、または医薬パック。
【請求項２５】
その細菌がその抗生物質のみでの処置に耐性である、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の医薬、製造方法、処置方法、診断試験方法、診断試験キット、または医薬パック。
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは９９．５％の同一性を示すアミノ酸配列を含んでなる、クロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素。
【請求項２】
請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素をコードする単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号１の核酸配列を含んでなる、請求項２記載の単離核酸分子。
【請求項４】
請求項２または３の何れか一項の核酸分子を含んでなる、核酸ベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素を含んでなるポリペプチドの製造方法であって、そのポリペプチドの製造に十分な条件下に請求項５の宿主細胞を培養することおよびそのポリペプチドを回収することを含んでなる方法。
【請求項７】
ベクターが、プラスミド、ウイルス、およびバクテリオファージよりなる群から選択されるものである、請求項４に記載のベクター。
【請求項８】
クロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素を含んでなるポリペプチドをそのベクターで形質転換された細胞により発現できるように、その単離核酸分子が適正な配向と正しいリーディング・フレームでベクターに挿入されている、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
その単離核酸分子がプロモーター配列に動作可能なように結合されている、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な、抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
人体または動物体の処置方法または診断方法において使用する、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用を含んでなる、クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置用医薬の製造方法。
【請求項１３】
治療上有効量の抗生物質および請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる、医薬。
【請求項１４】
人体または動物体の処置方法または診断方法において使用する、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置用である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１６】
治療上有効量の抗生物質および請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用を特徴とする、クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置用医薬の製造方法。
【請求項１７】
治療上有効量の抗生物質および請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントを、それを必要とする患者に投与する工程を含んでなる、クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置方法。
【請求項１８】
請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素の試料中での存在を検出する診断試験方法であって、
ｉ）試料とそのクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントとを接触させ、
ｉｉ）抗体−抗原結合反応を検出し；
ｉｉｉ）検出工程（ｉｉ）の結果を、その試料中のそのクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素の存在と関連付ける、
工程を含んでなる方法。
【請求項１９】
請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体の試料中での存在を検出する診断試験方法であって、
ｉ）試料とそのクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素とを接触させ、
ｉｉ）抗体−抗原結合反応を検出し；
ｉｉｉ）検出工程（ｉｉ）の結果を、その試料中のそのクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体の存在と関連付ける、
工程を含んでなる方法。
【請求項２０】
試料が患者からの試料である、請求項１８または１９のいずれか一項に記載の診断試験方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の診断試験方法を行うための診断試験キット。
【請求項２２】
治療上有効量の抗生物質および請求項１に記載のクロストリジウム・ディフィシル乳酸脱水素酵素に特異的な抗体またはその抗原結合性フラグメントを含んでなる、クロストリジウム・ディフィシル感染症の処置用の医薬パック。
【請求項２３】
その抗生物質がバンコマイシン、ラモプラニン、テイコプラニン、またはメトロニダゾールである、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の医薬、製造方法、処置方法、診断試験方法、診断試験キット、または医薬パック。
【請求項２４】
その感染症がクロストリジウム・ディフィシルによるものである、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の医薬、製造方法、処置方法、診断試験方法、診断試験キット、または医薬パック。
【請求項２５】
その細菌がその抗生物質のみでの処置に耐性である、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の医薬、製造方法、処置方法、診断試験方法、診断試験キット、または医薬パック。
【公表番号】特表２００６−５２４５０１（Ｐ２００６−５２４５０１Ａ）
【公表日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０６０６１（Ｐ２００６−５０６０６１）
【出願日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００１３８３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５６３７
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（５０００３０１７２）ニュウテック ファーマ パブリック リミテッド カンパニー (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月２日（２００６．１１．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００１３８３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８５６３７
【国際公開日】平成１６年１０月７日（２００４．１０．７）
【出願人】（５０００３０１７２）ニュウテック ファーマ パブリック リミテッド カンパニー (6)
【Ｆターム（参考）】
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