トリプトファン含有ダイズ、およびその利用
【課題】 高濃度のトリプトファンを含有し、良質の家畜飼料、水産飼料あるいは食品となる、ダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織を実現する。
【解決手段】 ダイズで発現可能なプロモータと共に、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子であるＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織は、高濃度のトリプトファンを含有している。
【解決手段】 ダイズで発現可能なプロモータと共に、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子であるＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織は、高濃度のトリプトファンを含有している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプトファン含有ダイズ、およびその利用に関するものであり、特にイネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子を導入したダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織、およびそれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
トリプトファンはタンパク質を構成する必須アミノ酸の１つであり、生物が生きていくうえで不可欠なものである。動物はトリプトファンを体内で合成できないため、食物から摂取しなければならない。
【０００３】
例えば、トリプトファンを家畜に適量与えることによって、家畜の体重増加を向上させる効果があることが知られている。加えて、アミノ酸バランスの改善により飼料の給与総量を減らし、家畜排泄物を削減させる効果も知られている。
【０００４】
しかし、ダイズなどの穀物はトリプトファンの含有量が少ないため、通常穀物飼料には工業的に製造されたトリプトファンを添加する必要がある。なお、ダイズはそれ自体だけでなく、脱脂ダイズ粉（油を絞った残渣）としても家畜飼料となっている。
【０００５】
また、トリプトファンは人への鎮静やストレス緩和のためのサプリメントとしても市販されている。
【０００６】
トリプトファンの生合成経路は、図１１に示すように、コリスミン酸からアントラニル酸が生合成される。アントラニル酸の生成は、アントラニル酸合成酵素（ＡＳ）の触媒作用が関与しており、これによってアントラニル酸が生成し、さらにアントラニル酸から６段階の酵素反応によりインドールを経てトリプトファンが生成する。そして、最終産物であるトリプトファンが増加すると、フィードバック制御によりトリプトファン代謝の鍵酵素であるアントラニル酸合成酵素の酵素活性が阻害され、トリプトファンの合成量が制御される（例えば、非特許文献１参照）。
【０００７】
発明者らは、既にイネアントラニル酸合成酵素αサブユニット遺伝子としてＯＡＳＡ１およびＯＡＳＡ２が存在することを見出し、これらを単離した（例えば、特許文献１参照）。そして、イネアントラニル酸合成酵素遺伝子の改変に関しては、例えばイネアントラニル酸合成酵素第１アイソザイムαサブユニットであるＯＡＳＡ１タンパク質の３２３番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に置換（Ｄ３２３Ｎ）することで得られたトリプトファンフィードバック阻害抵抗性変異体ＯＡＳＡ１Ｄを形質転換すると、野生型よりもカルスで１８０倍、組換体イネで３５倍、遊離のトリプトファン量が増加することが、発明者らにより報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００８】
また、アグロバクテリウムなどに由来するフィードバック低感受性アントラニル酸合成酵素遺伝子をダイズに導入したことが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９９／１１８００号（１９９９年３月１１日公開）
【非特許文献１】生化学実験講座、第１１巻、東京化学同人、１９７６年、６５２頁〜６５３頁
【非特許文献２】Tozawa Y, Hasegawa H, Terakawa T and Wakasa K (2001) Characterization of rice anthranilate synthase alfa subunit genes OSASA1 and OSASA2: tryptophan accumulation in transgenic rice expressing a feedback-insensitive mutant of OASA1. Plant Physiology 126: 1493-1506
【非特許文献３】Vaduva G, Oulmassov T, Lewis Y, Kan S, Weaver L, Back S, Brown W, Chen R, Jeong S, Slater S, Mitsky T, Rapp W, Liang J, Gruys K, Chloroplast-targeted variants of Anthranilate Synthase lead to accumulation of tryptophan in soybean. Plant Genetics 2003 Mechanisms of Genetic Variation. Abstract 131 October 22-26, 2003 Snowbird Resort & Conference Center, Snowbird, Utah
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、穀物飼料には工業的に製造されたトリプトファンを添加しているが、トリプトファンは他のアミノ酸に比べて高価である。そのため、トリプトファン含有量の高い穀物の作出が期待されている。特に、トリプトファン含有量の多いダイズは、ダイズが本来有する高い栄養価に上記トリプトファンの効果が加わるため良質の家畜飼料となり、また、ダイズから油を絞った脱脂ダイズ粉は家畜の飼料や養殖魚の餌として大量に使用されているため、作出が望まれている。
【００１０】
また、ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したイネにおいて、稔性が低下する傾向があることが報告されている（文献、Tetsuya Yamada, Yuzuru Tozawa, Hisakazu Hasegawa, Teruhiko Terakawa, Yasunobu Ohkawa, Kyo Wakasa Usee of a feedback-insensitive a subunit of anthranilate synthase as a selectable marker for transformation of rice and potato. Molecular Breeding Prepublication Date: 05/06/2004）。そのため、遺伝子導入による利用部以外の器官への影響が少なくなるようにする必要がある。
【００１１】
また、これまでに、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子が導入されたダイズは作出が報告されていない。
【００１２】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、高濃度のトリプトファンを含有し、良質の家畜飼料、水産飼料あるいは食品となるダイズを実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ダイズ種子特異的なプロモータと共に、イネ改変型ＡＳαサブユニット遺伝子ＯＡＳＡ１Ｄ（ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子）をダイズに導入することにより、高トリプトファン含有ダイズを創出することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、ダイズで発現可能なプロモータと共に、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子が発現可能に導入されていることを特徴としている。
【００１５】
上記イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子は、細胞内のトリプトファン濃度が上昇してもトリプトファンを合成することができるポリペプチドを発現するそのため、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子が導入されたダイズ細胞、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織は、高濃度のトリプトファンを含有する栄養価の高いものとして有用となる。
【００１６】
上記プロモータは、ダイズで発現可能であるので、利用部でのトリプトファンの蓄積を制御することに優れており、他の器官への影響を少なくすることができる。つまり、例えば、ダイズの種子特異的なプロモータを用いれば、種子以外の器官への影響を軽減することができる。ダイズは、主に種子を利用するため、上記プロモータは、種子特異的であることが好ましい。また、上記プロモータは、配列番号１３に記載の塩基配列を有していてもかまわない。
【００１７】
また、本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであり、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、をコードしているポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
【００１８】
また、本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、が導入されていることを特徴としている。
【００１９】
上記ポリヌクレオチドは、トリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドを発現するため、ダイズ細胞、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織は、高濃度のトリプトファンを含有する栄養価の高いものとして有用となる。
【００２０】
また、本発明に係るトリプトファン含有ダイズには、細胞、植物個体、その子孫、あるいはこれら由来の組織が含まれることを特徴としている。
【００２１】
上記のポリペプチドを生産するためのポリペプチドの生産方法は、上記トリプトファン含有ダイズを用いることを特徴とする。
【００２２】
上記方法によると、トリプトファン生成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドを低コストで容易に提供することができる。
【００２３】
本発明に係るトリプトファンの生産方法は、上記トリプトファン含有ダイズを用いることを特徴としている。
【００２４】
上記方法によると、ダイズ細胞、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織、の内でトリプトファンを生成することができるので、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでトリプトファンを生産することができる。
【００２５】
本発明に係る家畜飼料、水産飼料、食品、または栄養補助剤は、上記トリプトファン含有ダイズを含むことを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る家畜飼料、水産飼料、食品、または栄養補助剤は、上記トリプトファンの生産方法により得られたトリプトファンを含むことを特徴としている。
【００２７】
本発明に係るトリプトファン生産装置は、上記生産方法によりトリプトファンを生産することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２８】
本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、トリプトファン含量が高く栄養価に優れた家畜飼料、食品、栄養補助剤、または工業製品として利用することができる。さらに、トリプトファン含量の高い飼料用ダイズを作出することにより、トリプトファンを添加する必要がないため家畜用飼料ならびに養殖魚用飼料のコストを低下するこができる。
【００２９】
また、本発明に係るダイズ細胞、または、含有ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織を用いれば、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでトリプトファンの生産をすることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００３１】
（１）本発明に用いられるポリヌクレオチド
本発明に用いられる（導入される）ポリヌクレオチドは、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子であればよい。例えば、次のポリヌペプチドをコードするポリペプヌクレオチドであればよい。
【００３２】
すなわち、トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであり、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、もしくは付加ができる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００３３】
なお、上記ポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００３４】
本発明に用いられるポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドのいずれかをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであればよく、具体的な塩基配列は特に限定されるものではないが、例えば、下記の（ｃ）または（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも90％の同一性、好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、60℃で2×SSC 洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。
【００３５】
また、本発明に用いられるポリヌクレオチドには、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列が含まれていてもよい。
【００３６】
ここで、植物体中のトリプトファンの生合成経路においては、コリスミン酸からアントラニル酸が生成し、さらにアントラニル酸から５段階の酵素反応によりインドールを経てトリプトファンが生成する（非特許文献１参照）。アントラニル酸合成酵素は、上記経路中、コリスミン酸からアントラニル酸の生成を触媒する。また、アントラニル酸合成酵素は最終生成物であるトリプトファンによりフィードバック阻害を受け、細胞中のトリプトファン濃度が上昇するに伴い、酵素活性が低下する。したがって、トリプトファンがある一定量細胞に蓄積すると、それ以上トリプトファンが合成されなくなる。本発明に導入されるポリヌクレオチドは、上述のようにトリプトファンによるフィードバック阻害に対して抵抗性を有するポリペプチドをコードしているため、このポリペプチドが発現すると、細胞中のトリプトファン濃度が上昇してもトリプトファンを合成することができ、トリプトファン含量の高いダイズを作出することが可能となる。
【００３７】
本発明に用いられるポリヌクレオチドの取得方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、非特許文献２に記載された方法を用いることができる。
【００３８】
（２）形質転換ダイズ
本発明に係るトリプトファン含有ダイズ（形質転換ダイズ）は、上記（１）に記載したポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組換えベクターが導入されており、かつ、トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドが発現していれば、特に限定されるものではない。
【００３９】
ここで「形質転換ダイズ」とは、細胞・組織・器官、生物個体を含む意味である。つまり、本発明において形質転換の対象となるダイズは、ダイズ全体、ダイズ器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、ダイズ組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）またはダイズ培養細胞、あるいは種々の形態のダイズ細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。
【００４０】
本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、トリプトファンの含有量が高く、栄養価の高い食品原料や飼料として高い利用価値を有する。
【００４１】
本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、上記（１）に記載したポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該遺伝子が発現し得るようにダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織中に導入することにより得ることができる。
【００４２】
本発明に係るダイズの形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、ダイズ内で上記（１）に記載したポリヌクレオチドを発現させることが可能であり、ダイズで発現可能なプロモータを有するベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモータ（例えば、配列番号１３に記載の塩基配列を有するダイズ１１Ｓグロブリン（ｇｙ２）プロモータ）を有するベクター、が挙げられる。
【００４３】
また、上記（１）記載のポリヌクレオチドがダイズ細胞に導入されたか否か、さらにはダイズ中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ハイグロマイシンのような抗生物質に抵抗性を与える薬剤耐性遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと上記（１）記載のポリヌクレオチドとを含むプラスミド等を発現ベクターとしてダイズに導入してもよい。これによってマーカー遺伝子の発現から上記（１）記載のポリヌクレオチドの導入を確認することができる。
【００４４】
ダイズへの遺伝子の導入には、遺伝子を直接ダイズ細胞またはダイズ組織に導入するのが好ましく、当業者に公知の形質転換方法、例えば、パーティクルガン（遺伝子銃）、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００４５】
遺伝子銃を用いる場合は、ダイズ体、ダイズ器官、ダイズ組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（商品名、バイオ・ラッド社製）など）を用いて処理することができる。処理条件は試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【００４６】
遺伝子が導入されたダイズ細胞または組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。
【００４７】
ダイズ培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【００４８】
遺伝子がダイズに導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換ダイズからＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００４９】
なお、具体的に記載した個々のベクター種および導入方法は単なる例示であり、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した形質転換ダイズまたは細胞も本発明の技術的範囲に属する。
【００５０】
本発明に係るダイズがいったん得られれば、当該ダイズの有性生殖または無性生殖によって、上記（１）記載のポリペヌクレオチドが導入された子孫を得ることができる。また、当該ダイズまたはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該ダイズ、つまり、高トリプトファン含量ダイズを量産することができる。
【００５１】
したがって、本発明には、上記（１）記載のポリヌクレオチドを導入されたダイズ、もしくは、当該ダイズと同一の性質を有する当該ダイズの子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
【００５２】
本発明に係るダイズを作製する一実施形態を以下に記載する。
【００５３】
初めに、ダイズを室温、自然日長下で栽培する。登熟中の莢表面を滅菌し、その莢から未熟子葉を取り出し、種皮と胚軸を取り除く。そして処理された未熟子葉を、不定胚誘導培地に置床し培養して不定胚を生じさせる。次に、誘導された不定胚をフラスコ中に不定胚増殖培地に移し、振とう培養することで、次々と不定胚を発生させ、増殖、維持させる。なお、不定胚は１週間毎に新しい不定胚増殖培地に継代培養し、不定胚の量が増えたときは２本のフラスコに分ける。このようにすることで、不定胚は再分化能を保ったまま、数ヶ月間の継続培養が可能である。そして、増殖した不定胚を遺伝子導入培地に広げ、表面を乾燥させる。この不定胚にパーティクルガン法を用いて、ダイズ内で上記（１）に記載したポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターを導入する。本実施形態ではベクターに抗生物質耐性遺伝子として、ハイグロマイシン耐性遺伝子が組み込まれているものを用いる。
【００５４】
そして、ベクターを導入した不定胚は不定胚増殖培地で培養した後、抗生物質を添加した選抜培地で８週間培養する。この間、培地は毎週交換する。抗生物質（ハイグロマイシン）添加培地において８週間培養することにより、ほとんどの不定胚は白化するので、緑色を維持している遺伝子組換えダイズを容易に識別することができる。
【００５５】
なお、上記ベクター例えば、ＧＦＰ発現遺伝子を組み込んでおき、ハイグロマイシンで遺伝子組換えダイズを選抜するのに加え、実体蛍光顕微鏡等によって、ＧＦＰの発現により、ベクターの導入を確認して遺伝子組換えダイズを選抜してもよい。
【００５６】
次に、緑色の不定胚塊を選抜培地で十分に増殖させ、過剰液体を除去して、増殖した不定胚を胚成熟培地に移し、３〜５週間振とう培養する。このことにより、子葉状の胚へと成熟する。この間、培地は交換しない。
【００５７】
次に、成熟した胚は、過度の乾燥を防ぐため、発芽培地片の入ったシャーレで３〜７日間乾燥させる。乾燥させた成熟胚は、その後、発芽培地で発芽させる。そして、発芽した個体は発根培地で十分に生長させ、順化させた後に、培養土を充填したポットに移植し、高湿度で順応させ、閉鎖系温室内で栽培する。次第に周囲の湿度に順応するようにする。
【００５８】
以上の方法により、不定胚の誘導から約６ヶ月間で遺伝子組換えダイズが育成できる。
【００５９】
この遺伝子組換えダイズの各細胞、各組織、各器官、を用いてトリプトファンの含有量やタンパク質組成を調べることができる。
【００６０】
トリプトファンの含有量は、例えば種子や葉等を用いて測定することができる。トリプトファン含有量の測定方法の一例を以下に記す。
【００６１】
種子あるいは乾燥させた葉を粉砕し粉砕物を得る。この粉砕物に１６％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）溶液を加え、混合する。次に、リン酸カリウムバッファーを加え振とうする。遠心後、上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、遊離アミノ酸を含む抽出物を得る。高速アミノ酸分析計でこの抽出物のアミノ酸含量（トリプトファンを含む）を測定する。また、この抽出物のトリプトファン含量は一般的な紫外分光光度計を装備した高速液体クロマト装置(ＨＰＬＣ)で測定してもよい。
【００６２】
さらに、以下の方法による測定も可能である。
【００６３】
ホモジナイザーを用いて種子あるいは乾燥葉をエタノール中で破砕する。これを遠心後、上清をデカントし、ペレットは再度エタノール中で破砕する。ペレットの破砕後、上清を混合し、混合試料を遠心して新しい上清を得る。新しい上清を蒸留水で５倍に希釈して遠心し、０．２μｍの使い捨てフィルター（例えば、ワットマン製）を用いて濾過する。濾過した抽出物をアミノ酸分析システム（例えば、Ｐｉｃｏ Ｔａｇ；ウォーターズ、ミルフォード製）で分析する。
【００６４】
上記トリプトファン含有量の測定方法や記載された数値等は単なる例示であり、限定されることはない。
【００６５】
タンパク質組成の分析は、例えば、電気泳動のバンド染色にクーマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ，Coomassie Brilliant Blue）を用いて、非組み換え体と各バンド比較することによって行うことができる。
【００６６】
また、サザンブロット法を用いて上記（１）記載のポリペプチドが発現しているか否かを確認することができる。これらタンパク質組成の分析も記載されたものに、限定はされない。
【００６７】
（３）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて上記（１）のポリペプチドを生産する方法を提供する
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いる。上記（１）に記載のポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能にダイズに導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、ダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターをダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に導入する工程を包含する。
【００６８】
このようにダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するようにダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織内で機能するプロモータを組み込んであることが好ましい。
【００６９】
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズの抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００７０】
上記方法によると、ダイズ細胞、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織、の内で上記（１）のポリペプチドを生成することができるので、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスで上記（１）のポリペプチドを生産することができる。
【００７１】
（４）トリプトファンの生産方法
本発明は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いてトリプトファンを生産する方法を提供する。
【００７２】
本実施形態に係るトリプトファンの生産方法は、組換え発現系を用いる。上記（１）のポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能にダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に導入する。そして、細胞内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドは、トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するため、細胞内でトリプトファンのが増幅して生成される。この遊離トリプトファンを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、ダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターをダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に導入する工程を包含する。
【００７３】
このようにダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するようにダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織内で機能するプロモータを組み込んであることが好ましい。
【００７４】
本実施形態に係るトリプトファンの生産方法は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズの抽出液から遊離トリプトファンを精製する工程をさらに包含することが好ましい。トリプトファンを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００７５】
よって、これらトリプトファンの生産方法によりトリプトファンを生産するための装置も本発明に含まれる。
【００７６】
上記方法によると、ダイズ細胞、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織、の内でトリプトファンを生成することができるので、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでトリプトファンを生産することができる。
【００７７】
（５）家畜飼料、水産飼料、食品、および栄養補助剤
本発明は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて製造される家畜飼料、水産飼料、食品、栄養補助剤、および工業製品を提供する。また、上述のトリプトファンの生産方法により得られたトリプトファンを用いて製造される家畜飼料、水産飼料、食品、および栄養補助剤を提供する。
【００７８】
本項で記載する家畜飼料、水産飼料、食品、栄養補助剤は、上述したダイズの種子、果実、葉、塊茎、および／または塊根であっても、上述したダイズから抽出されたトリプトファンを用いて製造された家畜飼料、水産飼料、食品、栄養補助剤、であってもよい。
【００７９】
上記家畜飼料、水産飼料あるいは食品は、高濃度のトリプトファンが含有されているため栄養価が高い良質のものとなる。
【００８０】
また、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて製造される家畜飼料は、ダイズが本来有する高い栄養価に、トリプトファンが家畜に与える効果が加わるため良質の穀物飼料となる。また、ダイズから油を絞った脱脂ダイズ粉も家畜あるいは養殖魚の飼料に使用することができる。この脱脂ダイズ粉にも高濃度のトリプトファンが含有されているため栄養価が高い良質の家畜飼料となる。
【００８１】
本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて製造される家畜飼料、水産飼料、食品、あるいは、上述のトリプトファンの生産方法により得られたトリプトファンを用いて製造される家畜飼料、水産飼料、食品の具体的な構成は特に限定されるものではなく、用途や目的に応じて様々に加工されてもよい。
【００８２】
また、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて製造される栄養補助剤、あるいは、上述のトリプトファンの生産方法により得られたトリプトファンを用いて製造される栄養補助剤の具体的な構成は特に限定されるものではなく、用途や目的に応じて、種々の添加剤や緩衝液を加えればよい。この栄養補助剤は、人の鎮静やストレス緩和のために用いることができる。
【００８３】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８４】
本実施例では、具体的にイネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子としてイネ改変型ＡＳαサブユニット遺伝子ＯＡＳＡ１Ｄ（ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子）をダイズに導入した。
【００８５】
〔実施例１：ダイズにＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入するためのベクターの作成〕
非特許文献１に記載された方法により取得したＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を、図１（ａ），（ｂ）に示すように、恒常的プロモータであるカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータ、あるいは子葉特異的プロモータであるダイズ１１Ｓグロブリン（ｇｙ２）プロモータと接続し、ノパリン合成酵素のターミネーター配列と接続させた。
【００８６】
パーティクルガン法のように物理的な遺伝子導入法では、導入遺伝子の断片化や多コピー化によって導入遺伝子が発現しなくなる現象、いわゆるジーンサイレンシングが発生することが報告されている。そこで、同図に示すように抗生物質耐性遺伝子であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）とレポーター遺伝子である改変型緑色蛍光タンパク質遺伝子（ｓＧＦＰ（Ｓ６５４Ｔ））との間に、ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子発現カセットを挿入した。
【００８７】
以上のように、２種類のプラスミド（ｐＵＨＧ：３５ＳｐｒｏＯＡＳＡ１Ｄあるいは、ｐＵＨＧ：ｇｙ２ｐｒｏＯＡＳＡ１Ｄ）を構築した。
【００８８】
なお、１１Ｓグロブリン（ｇｙ２）プロモータについては、ダイズＡ２Ｂ１ａプログリシニン遺伝子（ｇｙ２遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｘ５３４０４）の、５'非翻訳配列（転写開始サイトに相対的な−１０２６から−４のヌクレオチド）を、以下のプライマー１、プライマー２を用いたＰＣＲにより品種ボンミノリのゲノムＤＮＡから単離した（参考文献１：Kitamura Y., Arahira M., Itoh Y. and Fukazawa C. 1990. The complete nucleotide sequence of soybean glycinin A2B1a gene spanning to another glycinin gene A1aB1b. Nucleic Acids Res. 18: 4245）。
【００８９】
また、ＧＦＰについては、隣接したＣａＭＶ３５ＳｐｒｏとＮｏｓＴ配列を有する形質転換されたクラゲのＧＦＰ翻訳領域［ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ），０．８ｋｂ］を、以下のプライマー３、プライマー４をを用いたＰＣＲによりｐＴＨ−２から増幅した（参考文献２：Chiu, W., Y. Niwa, W. Zeng, T. Hirano, H. Kobayashi and J. Sheen (1996) Engineered GFP as a vital reporters in plants. Curr. Biol 3: 325-330）。
【００９０】
ここで用いたプライマーは、
プライマー１：5'-GCGAAGCTTAGAATCCGTTGCATTCACTA-3'（配列番号３）
プライマー２：5'-CGCTCTAGAGTGATGAGTGTTCAAAGACA-3'（配列番号４）
プライマー３：：5'-AAGGTACCGGATCCCCCCTCAGAA-3'（配列番号５）
プライマー４：5'-AAGAGCTCCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3'（配列番号６）
である。
【００９１】
〔実施例２：ダイズの形質転換〕
＜不定胚の誘導と増殖＞
ダイズの形質転換および再生システムについては、次の参考文献３〜６を利用した。
参考文献３：Finer J.J. and Nagasawa A. 1988. Development of an embryogenic suspension culture of soybean [Glycine max (L.) Merrill]. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 15: 125-136.
参考文献４：Sato S., Newell C., Kolacz K., Tredo L., Finer J. and Hinchee M. 1993. Stable transformation via particle bombardment in two different soybean regeneration systems. Plant Cell Rep. 12: 408-413.
参考文献５：Parrott W.A., All J.N., Adang M.J., Bailey M.A., Boerma H.R. and Stewart C.N.J. 1994. Recovery and evaluation of soybean plants transgenic for a Bacillus thuringiensis var. Kurstaki insecticidal gene. In Vitro Cell. Dev. Biol. 30: 144-149.
参考文献６：Hadi M.Z., McMullen M.D. and Finer J.J. 1996. Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment. Plant Cell Rep. 15: 500-505
不定胚形成能に優れたダイズ品種ＪａｃｋあるいはＪＱ系統を温室内で栽培した。栽培は室温２５℃、自然日長下で行った。登熟中の莢表面を７０％エタノールで２分間滅菌し、滅菌水で３回洗浄した後、未熟子葉（３〜５ｍｍ）を取り出し、種皮と胚軸を取り除いた。そして処理された未熟子葉を、向軸側を上にして不定胚誘導培地（ＭＳＤ４０）に置床し、温度２５℃、日長２３時間、寒白色蛍光灯を用いて光強度５〜１０μｍｏｌｍ-1ｓ-2で培養した。すると、図２（ａ），（ｂ）に示すように、３〜４週間で不定胚を生じた。
【００９２】
なお、不定胚誘導培地は、ＭＳ塩（参考文献７：Murashige T. and Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum 15: 473-497.）とビタミンＢ５（参考文献８：Gamborg O., Miller R. and Ojima K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151-158.）とから形成し、３％ショ糖と２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ，４０ｍｇｍｌ-1）とを補充し、ｐＨ７．０に調整し、０．２％Gelrite（商品名、和光製）で凝固させた。また、９０×２０ｍｍの使い捨てプラスチックシャーレを用いた。
【００９３】
誘導された不定胚を不定胚増殖培地（ＦＮ Ｌｉｔｅ、２５ｍｌ／１００ｍｌ三角フラスコ）に移し、回転数９０〜９５ｒｐｍ／分で振とう培養することで、図２（ｃ）に示すように、次々と不定胚を発生させ、増殖、維持することができた。不定胚増殖培地は、ＦＮ Ｌｉｔｅマクロ塩、ＭＳミクロ塩、およびビタミンＢ５から形成し、アスパラギン（１ｇＬ-1）と２，４−Ｄ（５ｍｇｍｌ-1）と３％ショ糖とを補充し、ｐＨ５．８に調整した。
【００９４】
不定胚は１週間毎に新しい不定胚増殖培地に継代培養し、不定胚の量が増えたときは２本のフラスコに分けた。不定胚は再分化能を保ったまま、数ヶ月間の継続培養が可能であった。
【００９５】
＜パーティクルガンによる遺伝子の導入＞
増殖した不定胚（約０．８ｇ）を遺伝子導入培地（ＭＳＤ２０、プラスチックシャーレの大きさ９０×２０ｍｍ）の中央、直径約２５ｍｍにまんべんなく広げ、表面を乾燥させた。なお、遺伝子導入培地（ＭＳＤ２０）は、ＭＳ塩とビタミンＢ５とから形成し、３％ショ糖とアスパラギン（１ｇＬ-1）と２，４−Ｄ，２０ｍｇｍｌ-1とを補充し、ｐＨ５．８に調整し、０．２％Gelriteで凝固した。
【００９６】
実施例１で作成した導入遺伝子を含むプラスミドＤＮＡはPlasmid Midi Kit（商品名、キアゲン製）を用いて、ｐＵＨＧ：３５ＳｐｒｏＯＡＳＡ１Ｄ（以下、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ）あるいは、ｐＵＨＧ：ｇｙ２ｐｒｏＯＡＳＡ１Ｄ（以下、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ）を大腸菌ＤＨ５αから単離して、滅菌水に１μｇ／μｌの濃度で溶かした。パーティクルガン（ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ；商品名、日本バイオ・ラッド社製）による遺伝子の導入は、機器に添付のプロトコルに従った。
【００９７】
３ｍｇの直径１μｍ金粒子（マイクロキャリア）と５μｇの実施例１で作成したプラスミドＤＮＡとをよく混合し、塩化カルシウム／スペルミジン法（参考文献９：Klein T.M., Gradziel T., Fromm M.E. and Sanford J.C. 1988. Factors influencing gene delivery into Zea mays cells by high-velocity microprojectiles. Bio/technology 6: 559-563.）で、金粒子表面にＤＮＡをコーティングした。３ｍｇの金粒子で６枚のマクロキャリアを調整、すなわち６回の撃ち込みを行うことができる。
【００９８】
パーティクルガンによって、マイクロキャリアをヘリウムガス圧１３５０ｐｓｉ、６ｃｍの距離で培地上の不定胚へ撃ち込んだ。金粒子の分布を均一にするため、プレートの向きを換え、２回撃ち込んだ。
【００９９】
＜遺伝子組換え体の選抜＞
遺伝子を導入した不定胚は不定胚増殖培地で１週間培養した後、１５ｍｌ／Ｌハイグロマイシンを添加した選抜培地で２週間、３０ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを添加した選抜培地で４週間、４５ｍｌ／Ｌハイグロマイシンを含む選抜培地で２週間培養した。この間、培地は毎週交換した。ハイグロマイシン添加培地において８週間培養することにより、ほとんどの不定胚は白化し、図２（ｄ）に示すように、緑色を維持している遺伝子組換え体を容易に識別することができた。
【０１００】
＜植物体の再分化＞
参考文献１０（Samoylov VM, Tucker DM, Parrott WA (1998) Liquid medium-based protocol for rapid regeneration from embryogenic soybean cultures. Plant Cell Rep 18:49-54）に記載された方法により、不定胚魂を回復させた。
【０１０１】
緑色の不定胚塊を１５ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを添加した選抜培地で十分に増殖させた。無菌のろ紙を用いて過剰液体を除去して、増殖した不定胚の一部（約２０ｍｇ）を胚成熟培地（ＦＮＬ０Ｓ３Ｓ３、２５ｍｌ／１００ｍｌ三角フラスコ）に移し、回転数１００ｒｐｍで３〜５週間振とう培養した。このことにより、図２（ｅ）に示すように子葉状の胚が発達した。この間、培地は交換しなかった。ここで、胚成熟培地は、ＦＮ Ｌｉｔｅマクロ塩、ＭＳミクロ塩、およびビタミンＢ５から形成し、アスパラギン（１ｇＬ-1）と３％ショ糖とソルビートとを補充し、ｐＨ５．８に調整した。
【０１０２】
成熟した胚は、過度の乾燥を防ぐため、約１ｃｍ3の発芽培地（ＭＳ０）片の入ったシャーレで３〜７日間乾燥させた。乾燥させた成熟胚は、図２（ｆ）に示される。その後、淡い黄色になった胚を、図２（ｇ）に示すように発芽培地で発芽させる。発芽培地は、０．５×Ｂ５塩、０．５×ビタミンＢ５、２％ショ糖、および０．０５％ＭＥＳ緩衝液から形成し、ｐＨ５．８に調整し、０．２％Gelriteで凝固させた。
【０１０３】
発芽した個体は発根培地（１／２Ｂ５）で十分に生長させ、順化させた後に、図２（ｈ）に示すように培養土を充填したポットに移植し、高湿度で順応させ、図２（ｉ）に示すように閉鎖系温室（ガラス温室）内で栽培した。次第に周囲の湿度に順応するようにした。
【０１０４】
以上の方法により、不定胚の誘導から約６ヶ月間で遺伝子組換え体が育成できた。
【０１０５】
〔実施例３：ＧＦＰの発現を確認による遺伝子導入胚の選抜〕
遺伝子組換え不定胚は実施例２にようにハイグロマイシンで選抜するのに加え、実体蛍光顕微鏡（ＭＺ ＦＬIII；商品名、ライカ製）等によって、ＧＦＰの発現を確認することでさらに選抜した。図３（Ａ−ｗ），（Ａ−ｂ），（Ｂ−ｗ），（Ｂ−ｂ）に遺伝子が導入された不定胚と、図３（Ｃ−ｗ），（Ｃ−ｂ）に成熟胚とが示される。青色光を照射することで、図３（Ａ−ｂ），（Ｂ−ｂ），（Ｃ−ｂ）に示すように、遺伝子が導入された箇所（細胞）が分かった。
【０１０６】
〔実施例４：ＲＴ−ＰＣＲによる導入遺伝子の発現の確認〕
成熟胚の段階で導入遺伝子の発現とトリプトファン含量の増加とを調査した。以下に導入遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認する方法を記す。
【０１０７】
成熟胚（１００ｍｇ）を液体窒素中で、乳鉢と乳棒を用いてすりつぶし、１ｍＬトリゾール試薬（商品名、インビトロジェン製）を加えて、すりつぶした試料を強力に振とうした。この試料を室温で５分間インキュベートし、２００μｌクロロホルムを添加して１５０００×ｇで１０分間遠心した。
【０１０８】
イソプロパノールを用いて上清から総ＲＮＡを沈殿させ、１００μｌのＲＮａｓｅフリーの水で懸濁した。ＲＮＡ（５００ｎｇ）の一部を、３７℃で３０分、ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ（ＲＱ１；商品名、プロメガ製）を３Ｕ用いて、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１０ｍＭのＭｇ2ＳＯ4と１ｍＭのＣａＣｌ2とを含む３０μｌの溶液中で、インキュベートした。この反応を、３μｌ、２０ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）を添加することにより停止させ、ＲＮＡをフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。
【０１０９】
単離したＲＮＡをＲＡａｓｅフリー水に再懸濁し、ＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン製）とオリゴ（ｄＴ）２０プライマーを用いた第１鎖ｃＤＮＡ合成に利用した。ＲＮＡを初めに、５０ｐｍｏｌのプライマーとそれぞれ２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰとを含む１２μｌの溶液で、５分間、６５℃でインキュベートした。その後、８μｌのｃＤＮＡ合成ミックス（４μｌの５×ｃＤＮＡ合成緩衝液、０．１ｎｍｏｌのジチオスレイトール、４０ＵのＲＮａｓｅアウト、および１５Ｕのサーモスクリプト逆転写酵素を含む）を添加して６０分間、５０℃でインキュベートした。
【０１１０】
産物ｃＤＮＡをＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（商品名、アプライドバイオシステム製）を用いて９４℃で１分、５５〜６０℃で１分、および７２℃で１分、の３０サイクルでＰＣＲを行い増幅させた。ダイズアクチン１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｊ０１２９８）をＲＴ−ＰＣＲの内部コントロールとして用いた。増幅した生成物は、ｐＣＲ２．１ベクター（インビトロジェン製）に複製し、生成物の確認のために電気泳動によりシークエンシングを行った。その結果、図４に示すように、複数の成熟胚にＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子が導入されていることわかった。なお、図４における２−１、４８−１，５１−２といった、数字は、異なる遺伝子導入から得られた由来の異なる遺伝子組換え成熟胚を識別するための数字である。以下で説明する図６〜９についても同様である。
【０１１１】
なお、上記ＰＣＲにおいて、アクチン１遺伝子に対しては、下記のプライマー５、プライマー６のペア、ｈｐｔ遺伝子に対しては、プライマー７、プライマー８のペア、ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子に対してはプライマー９、プライマー１０のペアを用いた。
【０１１２】
用いたプライマーは、
プライマー５：5'-GACGCTGAGGATATTCAACC-3'（配列番号７）
プライマー６：5'-AGAAATCTGTGAGGTCACGA-3'（配列番号８）
プライマー７：5'-CTGAACTCACCGCGACGTCT-3'（配列番号９）
プライマー８：5'-AGTCCTCGGCCCAAAGCATC-3'（配列番号１０）
プライマー９：5'-ACCGCTGCCTCGTCAGGGAGGACG-3'（配列番号１１）
プライマー１０：5'-CTCAAAACGCTGGCTTAAGAC-3'（配列番号１２）
である。
【０１１３】
〔実施例５：トリプトファンが増加した種子の栽培と固定系統の育成〕
上記実施例３を繰り返し行った。つまり、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄプラスミドを用いた遺伝子導入は５６回、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄプラスミドを用いた遺伝子導入は４８回行った。
【０１１４】
その結果が、図５である。各々、２個と１４個のトリプトファンが増加したＴ0個体を得た。そして、トリプトファンが増加した種子を閉鎖系温室内で栽培し、固定系統を育成した。
【０１１５】
〔実施例６：非組み換え体と組み換え体（ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体）との比較〕
＜種子のトリプトファン含量＞
非組み換え体（コントロール）、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体において、種子のトリプトファン含量を調べた。
【０１１６】
初めに、個体毎に３粒のダイズ種子をコーヒーミルで粉砕し種子粉砕物を得た。次に、種子粉砕物１５０ｍｇに１６％のＴＣＡ６００μｌを加え混合し、その後、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ５．６）６００μｌを加え１時間振とうした。そして、１５００ｒｐｍで１０分間遠心後、上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、遊離アミノ酸を含む抽出物を得た。この抽出物のアミノ酸含量（トリプトファンを含む）を、高速アミノ酸分析計（L-8500やL-8800等、日立製）等で測定し、分析を行った。その分析結果を図６に示す。
【０１１７】
図６に示すように、非組換え体（コントロール）の種子の遊離トリプトファン含量は０．０７ｍｇ／ｇＤＷであるのに対し、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導個体の遊離トリプトファン含量は１．９〜３．３ｍｇ／ｇＤＷ、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体の遊離トリプトファン含量は３．０〜６．４ｍｇ／ｇＤＷであった。
【０１１８】
組み換え体の遊離トリプトファン含量は、非組換え体の遊離トリプトファンに比べ、約１００〜２６０倍程度にまで増加した。また、組換え体の遊離トリプトファンは、最大で種子乾物重当たり約０．６％に達していた。このように必須アミノ酸であるトリプトファンを高濃度で含むダイズ種子は飼料あるいは食糧としての有用性が高いものなる。
【０１１９】
また、図７に示すように、遺伝子導入された種子では遊離トリプトファンが際だって増加していた。遺伝子導入された種子でアスパラギン（Ａｓｎ）がやや減少していたが、他のアミノ酸はあまり変動しなかった。
【０１２０】
＜タンパク質組成＞
非組み換え体（コントロール）、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導個体、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体における、種子のタンパク質組成を比較した。
【０１２１】
図８に示すように、クーマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）染色を行ったところ、各種子のタンパク質組成に大きな変化は認められなかった。
【０１２２】
また、抗ＯＡＳＡ１Ｄ抗体を用いてウエスタンプロット法を行うと、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導個体、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体、にＯＡＳＡ１Ｄの発現が観測された。
【０１２３】
＜葉のトリプトファン含量＞
非組み換え体（コントロール）、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体において、葉のトリプトファン含量を調べた。個体毎に１ｇの葉を凍結乾燥させ、乾燥葉をコーヒーミルで粉砕し乾燥葉粉砕物を得た。この乾燥葉粉砕物からの遊離アミノ酸の抽出と分析は、上記＜種子のトリプトファン含量＞に記載した方法と同様に行った。その分析結果を図９に示す。
【０１２４】
図９に示すように、特に３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体で、トリプトファン含量が増加しているものがあった。非組換え体が０．１６５ｍｇ／ｇＤＷであるのに対し、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体の一つは、４．０９２ｍｇ／ｇＤＷであることから、ダイズの茎葉を家畜飼料として使用する場合も栄養価は高いと考えられる。一方、子葉特異的プロモータであるｇｙ２では葉のトリプトファン含量を上昇させることはなかった。
【０１２５】
〔実施例７：品種ＪＱへの遺伝子導入〕
高遊離アミノ酸系統であるＪＱへのＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入を、実施例３と同様に行った。ここでは、実施例１のｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄプラスミドを用いた。
【０１２６】
本実施例でも、ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子が導入された組換え体を得ることができた。図１０に示すように、ＪＱの場合もＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子の導入により種子における遊離トリプトファン含量が増加していた。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明により、高トリプトファン含有ダイズの作出が可能となる。したがって、本発明は広く農業に利用することができ、また高トリプトファンダイズは家畜飼料、養殖魚用の餌や食品に適しているため、本発明は畜産業、水産業や食品産業にも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を有する導入遺伝子の構造を表す図であり、（ａ）はｐＵＨＧ：３５ＳｐｒｏＯＡＳＡ１Ｄ、（ｂ）はｐＵＨＧ：ｇｙ２ＯＡＳＡ１Ｄプラスミドの構造を表す図である、。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は培養されたダイズの不定胚、（ｄ）はＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入された不定胚、（ｅ）はＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入された不定胚あるいは体細胞胚、（ｆ）および（ｇ）はＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入された成熟胚、（ｈ）は発芽したダイズ個体、（ｉ）は成長したダイズ個体を表す画像である。
【図３】緑色蛍光タンパク質（ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ））による形質転換体の選抜の過程を示す図であり、（Ａ−ｗ）および（Ｂ−ｗ）は白色光を照射された不定胚、（Ｃ−ｗ）は白色光を照射された成熟胚、（Ａ−ｂ）および（Ｂ−ｂ）は青色光を照射された不定胚、（Ｃ−ｂ）は青色光を照射された成熟胚を示す画像である。
【図４】形質転換成熟胚における導入遺伝子の発現を解析した結果を示す画像である。
【図５】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入されたダイズの胚、再生個体、成長個体、の数を示す表である。
【図６】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ（Ｔ3世代）の種子における遊離トリプトファンの量を表すグラフである。
【図７】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ（Ｔ3世代）の種子における遊離アミノ酸組成を表すグラフである。
【図８】（ａ）はＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ（Ｔ3世代）の種子における貯蔵タンパク質組成を解析した結果を示す画像であり、（ｂ）はＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ（Ｔ3世代）の種子におけるＯＡＳＡ１Ｄの検出結果を示す画像である。
【図９】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ（Ｔ3世代）の植物体（葉）における遊離トリプトファンの量を表すグラフである。
【図１０】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したＪＱ系統におけるダイズ（Ｔ1世代）の種子における遊離アミノ酸組成を表すグラフである。
【図１１】トリプトファンの生合成経路を表す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプトファン含有ダイズ、およびその利用に関するものであり、特にイネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子を導入したダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織、およびそれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
トリプトファンはタンパク質を構成する必須アミノ酸の１つであり、生物が生きていくうえで不可欠なものである。動物はトリプトファンを体内で合成できないため、食物から摂取しなければならない。
【０００３】
例えば、トリプトファンを家畜に適量与えることによって、家畜の体重増加を向上させる効果があることが知られている。加えて、アミノ酸バランスの改善により飼料の給与総量を減らし、家畜排泄物を削減させる効果も知られている。
【０００４】
しかし、ダイズなどの穀物はトリプトファンの含有量が少ないため、通常穀物飼料には工業的に製造されたトリプトファンを添加する必要がある。なお、ダイズはそれ自体だけでなく、脱脂ダイズ粉（油を絞った残渣）としても家畜飼料となっている。
【０００５】
また、トリプトファンは人への鎮静やストレス緩和のためのサプリメントとしても市販されている。
【０００６】
トリプトファンの生合成経路は、図１１に示すように、コリスミン酸からアントラニル酸が生合成される。アントラニル酸の生成は、アントラニル酸合成酵素（ＡＳ）の触媒作用が関与しており、これによってアントラニル酸が生成し、さらにアントラニル酸から６段階の酵素反応によりインドールを経てトリプトファンが生成する。そして、最終産物であるトリプトファンが増加すると、フィードバック制御によりトリプトファン代謝の鍵酵素であるアントラニル酸合成酵素の酵素活性が阻害され、トリプトファンの合成量が制御される（例えば、非特許文献１参照）。
【０００７】
発明者らは、既にイネアントラニル酸合成酵素αサブユニット遺伝子としてＯＡＳＡ１およびＯＡＳＡ２が存在することを見出し、これらを単離した（例えば、特許文献１参照）。そして、イネアントラニル酸合成酵素遺伝子の改変に関しては、例えばイネアントラニル酸合成酵素第１アイソザイムαサブユニットであるＯＡＳＡ１タンパク質の３２３番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に置換（Ｄ３２３Ｎ）することで得られたトリプトファンフィードバック阻害抵抗性変異体ＯＡＳＡ１Ｄを形質転換すると、野生型よりもカルスで１８０倍、組換体イネで３５倍、遊離のトリプトファン量が増加することが、発明者らにより報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【０００８】
また、アグロバクテリウムなどに由来するフィードバック低感受性アントラニル酸合成酵素遺伝子をダイズに導入したことが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ９９／１１８００号（１９９９年３月１１日公開）
【非特許文献１】生化学実験講座、第１１巻、東京化学同人、１９７６年、６５２頁〜６５３頁
【非特許文献２】Tozawa Y, Hasegawa H, Terakawa T and Wakasa K (2001) Characterization of rice anthranilate synthase alfa subunit genes OSASA1 and OSASA2: tryptophan accumulation in transgenic rice expressing a feedback-insensitive mutant of OASA1. Plant Physiology 126: 1493-1506
【非特許文献３】Vaduva G, Oulmassov T, Lewis Y, Kan S, Weaver L, Back S, Brown W, Chen R, Jeong S, Slater S, Mitsky T, Rapp W, Liang J, Gruys K, Chloroplast-targeted variants of Anthranilate Synthase lead to accumulation of tryptophan in soybean. Plant Genetics 2003 Mechanisms of Genetic Variation. Abstract 131 October 22-26, 2003 Snowbird Resort & Conference Center, Snowbird, Utah
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のように、穀物飼料には工業的に製造されたトリプトファンを添加しているが、トリプトファンは他のアミノ酸に比べて高価である。そのため、トリプトファン含有量の高い穀物の作出が期待されている。特に、トリプトファン含有量の多いダイズは、ダイズが本来有する高い栄養価に上記トリプトファンの効果が加わるため良質の家畜飼料となり、また、ダイズから油を絞った脱脂ダイズ粉は家畜の飼料や養殖魚の餌として大量に使用されているため、作出が望まれている。
【００１０】
また、ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したイネにおいて、稔性が低下する傾向があることが報告されている（文献、Tetsuya Yamada, Yuzuru Tozawa, Hisakazu Hasegawa, Teruhiko Terakawa, Yasunobu Ohkawa, Kyo Wakasa Usee of a feedback-insensitive a subunit of anthranilate synthase as a selectable marker for transformation of rice and potato. Molecular Breeding Prepublication Date: 05/06/2004）。そのため、遺伝子導入による利用部以外の器官への影響が少なくなるようにする必要がある。
【００１１】
また、これまでに、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子が導入されたダイズは作出が報告されていない。
【００１２】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、高濃度のトリプトファンを含有し、良質の家畜飼料、水産飼料あるいは食品となるダイズを実現することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ダイズ種子特異的なプロモータと共に、イネ改変型ＡＳαサブユニット遺伝子ＯＡＳＡ１Ｄ（ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子）をダイズに導入することにより、高トリプトファン含有ダイズを創出することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、ダイズで発現可能なプロモータと共に、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子が発現可能に導入されていることを特徴としている。
【００１５】
上記イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子は、細胞内のトリプトファン濃度が上昇してもトリプトファンを合成することができるポリペプチドを発現するそのため、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子が導入されたダイズ細胞、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織は、高濃度のトリプトファンを含有する栄養価の高いものとして有用となる。
【００１６】
上記プロモータは、ダイズで発現可能であるので、利用部でのトリプトファンの蓄積を制御することに優れており、他の器官への影響を少なくすることができる。つまり、例えば、ダイズの種子特異的なプロモータを用いれば、種子以外の器官への影響を軽減することができる。ダイズは、主に種子を利用するため、上記プロモータは、種子特異的であることが好ましい。また、上記プロモータは、配列番号１３に記載の塩基配列を有していてもかまわない。
【００１７】
また、本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであり、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、をコードしているポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
【００１８】
また、本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、が導入されていることを特徴としている。
【００１９】
上記ポリヌクレオチドは、トリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドを発現するため、ダイズ細胞、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織は、高濃度のトリプトファンを含有する栄養価の高いものとして有用となる。
【００２０】
また、本発明に係るトリプトファン含有ダイズには、細胞、植物個体、その子孫、あるいはこれら由来の組織が含まれることを特徴としている。
【００２１】
上記のポリペプチドを生産するためのポリペプチドの生産方法は、上記トリプトファン含有ダイズを用いることを特徴とする。
【００２２】
上記方法によると、トリプトファン生成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドを低コストで容易に提供することができる。
【００２３】
本発明に係るトリプトファンの生産方法は、上記トリプトファン含有ダイズを用いることを特徴としている。
【００２４】
上記方法によると、ダイズ細胞、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織、の内でトリプトファンを生成することができるので、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでトリプトファンを生産することができる。
【００２５】
本発明に係る家畜飼料、水産飼料、食品、または栄養補助剤は、上記トリプトファン含有ダイズを含むことを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る家畜飼料、水産飼料、食品、または栄養補助剤は、上記トリプトファンの生産方法により得られたトリプトファンを含むことを特徴としている。
【００２７】
本発明に係るトリプトファン生産装置は、上記生産方法によりトリプトファンを生産することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２８】
本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、トリプトファン含量が高く栄養価に優れた家畜飼料、食品、栄養補助剤、または工業製品として利用することができる。さらに、トリプトファン含量の高い飼料用ダイズを作出することにより、トリプトファンを添加する必要がないため家畜用飼料ならびに養殖魚用飼料のコストを低下するこができる。
【００２９】
また、本発明に係るダイズ細胞、または、含有ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織を用いれば、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでトリプトファンの生産をすることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【００３１】
（１）本発明に用いられるポリヌクレオチド
本発明に用いられる（導入される）ポリヌクレオチドは、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子であればよい。例えば、次のポリヌペプチドをコードするポリペプヌクレオチドであればよい。
【００３２】
すなわち、トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであり、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
上記「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により欠失、置換、もしくは付加ができる程度の数（例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下、特に好ましくは３個以下）のアミノ酸が置換、欠失、もしくは付加されることを意味する。このような変異ポリペプチドは、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００３３】
なお、上記ポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合してなるポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含むものであってもよい。ここでいうポリペプチド以外の構造としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００３４】
本発明に用いられるポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドのいずれかをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドであればよく、具体的な塩基配列は特に限定されるものではないが、例えば、下記の（ｃ）または（ｄ）のいずれかのポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｄ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド
上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも90％の同一性、好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましくは少なくとも97％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、60℃で2×SSC 洗浄条件下で結合することを意味する。上記ハイブリダイゼーションは、「Molecular Cloning (Third Edition)」 (J. Sambrook & D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる。
【００３５】
また、本発明に用いられるポリヌクレオチドには、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列が含まれていてもよい。
【００３６】
ここで、植物体中のトリプトファンの生合成経路においては、コリスミン酸からアントラニル酸が生成し、さらにアントラニル酸から５段階の酵素反応によりインドールを経てトリプトファンが生成する（非特許文献１参照）。アントラニル酸合成酵素は、上記経路中、コリスミン酸からアントラニル酸の生成を触媒する。また、アントラニル酸合成酵素は最終生成物であるトリプトファンによりフィードバック阻害を受け、細胞中のトリプトファン濃度が上昇するに伴い、酵素活性が低下する。したがって、トリプトファンがある一定量細胞に蓄積すると、それ以上トリプトファンが合成されなくなる。本発明に導入されるポリヌクレオチドは、上述のようにトリプトファンによるフィードバック阻害に対して抵抗性を有するポリペプチドをコードしているため、このポリペプチドが発現すると、細胞中のトリプトファン濃度が上昇してもトリプトファンを合成することができ、トリプトファン含量の高いダイズを作出することが可能となる。
【００３７】
本発明に用いられるポリヌクレオチドの取得方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、非特許文献２に記載された方法を用いることができる。
【００３８】
（２）形質転換ダイズ
本発明に係るトリプトファン含有ダイズ（形質転換ダイズ）は、上記（１）に記載したポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む組換えベクターが導入されており、かつ、トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドが発現していれば、特に限定されるものではない。
【００３９】
ここで「形質転換ダイズ」とは、細胞・組織・器官、生物個体を含む意味である。つまり、本発明において形質転換の対象となるダイズは、ダイズ全体、ダイズ器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、ダイズ組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）またはダイズ培養細胞、あるいは種々の形態のダイズ細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。
【００４０】
本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、トリプトファンの含有量が高く、栄養価の高い食品原料や飼料として高い利用価値を有する。
【００４１】
本発明に係るトリプトファン含有ダイズは、上記（１）に記載したポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該遺伝子が発現し得るようにダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織中に導入することにより得ることができる。
【００４２】
本発明に係るダイズの形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、ダイズ内で上記（１）に記載したポリヌクレオチドを発現させることが可能であり、ダイズで発現可能なプロモータを有するベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモータ（例えば、配列番号１３に記載の塩基配列を有するダイズ１１Ｓグロブリン（ｇｙ２）プロモータ）を有するベクター、が挙げられる。
【００４３】
また、上記（１）記載のポリヌクレオチドがダイズ細胞に導入されたか否か、さらにはダイズ中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。例えば、ハイグロマイシンのような抗生物質に抵抗性を与える薬剤耐性遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと上記（１）記載のポリヌクレオチドとを含むプラスミド等を発現ベクターとしてダイズに導入してもよい。これによってマーカー遺伝子の発現から上記（１）記載のポリヌクレオチドの導入を確認することができる。
【００４４】
ダイズへの遺伝子の導入には、遺伝子を直接ダイズ細胞またはダイズ組織に導入するのが好ましく、当業者に公知の形質転換方法、例えば、パーティクルガン（遺伝子銃）、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００４５】
遺伝子銃を用いる場合は、ダイズ体、ダイズ器官、ダイズ組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（商品名、バイオ・ラッド社製）など）を用いて処理することができる。処理条件は試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【００４６】
遺伝子が導入されたダイズ細胞または組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。
【００４７】
ダイズ培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【００４８】
遺伝子がダイズに導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換ダイズからＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００４９】
なお、具体的に記載した個々のベクター種および導入方法は単なる例示であり、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した形質転換ダイズまたは細胞も本発明の技術的範囲に属する。
【００５０】
本発明に係るダイズがいったん得られれば、当該ダイズの有性生殖または無性生殖によって、上記（１）記載のポリペヌクレオチドが導入された子孫を得ることができる。また、当該ダイズまたはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該ダイズ、つまり、高トリプトファン含量ダイズを量産することができる。
【００５１】
したがって、本発明には、上記（１）記載のポリヌクレオチドを導入されたダイズ、もしくは、当該ダイズと同一の性質を有する当該ダイズの子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
【００５２】
本発明に係るダイズを作製する一実施形態を以下に記載する。
【００５３】
初めに、ダイズを室温、自然日長下で栽培する。登熟中の莢表面を滅菌し、その莢から未熟子葉を取り出し、種皮と胚軸を取り除く。そして処理された未熟子葉を、不定胚誘導培地に置床し培養して不定胚を生じさせる。次に、誘導された不定胚をフラスコ中に不定胚増殖培地に移し、振とう培養することで、次々と不定胚を発生させ、増殖、維持させる。なお、不定胚は１週間毎に新しい不定胚増殖培地に継代培養し、不定胚の量が増えたときは２本のフラスコに分ける。このようにすることで、不定胚は再分化能を保ったまま、数ヶ月間の継続培養が可能である。そして、増殖した不定胚を遺伝子導入培地に広げ、表面を乾燥させる。この不定胚にパーティクルガン法を用いて、ダイズ内で上記（１）に記載したポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターを導入する。本実施形態ではベクターに抗生物質耐性遺伝子として、ハイグロマイシン耐性遺伝子が組み込まれているものを用いる。
【００５４】
そして、ベクターを導入した不定胚は不定胚増殖培地で培養した後、抗生物質を添加した選抜培地で８週間培養する。この間、培地は毎週交換する。抗生物質（ハイグロマイシン）添加培地において８週間培養することにより、ほとんどの不定胚は白化するので、緑色を維持している遺伝子組換えダイズを容易に識別することができる。
【００５５】
なお、上記ベクター例えば、ＧＦＰ発現遺伝子を組み込んでおき、ハイグロマイシンで遺伝子組換えダイズを選抜するのに加え、実体蛍光顕微鏡等によって、ＧＦＰの発現により、ベクターの導入を確認して遺伝子組換えダイズを選抜してもよい。
【００５６】
次に、緑色の不定胚塊を選抜培地で十分に増殖させ、過剰液体を除去して、増殖した不定胚を胚成熟培地に移し、３〜５週間振とう培養する。このことにより、子葉状の胚へと成熟する。この間、培地は交換しない。
【００５７】
次に、成熟した胚は、過度の乾燥を防ぐため、発芽培地片の入ったシャーレで３〜７日間乾燥させる。乾燥させた成熟胚は、その後、発芽培地で発芽させる。そして、発芽した個体は発根培地で十分に生長させ、順化させた後に、培養土を充填したポットに移植し、高湿度で順応させ、閉鎖系温室内で栽培する。次第に周囲の湿度に順応するようにする。
【００５８】
以上の方法により、不定胚の誘導から約６ヶ月間で遺伝子組換えダイズが育成できる。
【００５９】
この遺伝子組換えダイズの各細胞、各組織、各器官、を用いてトリプトファンの含有量やタンパク質組成を調べることができる。
【００６０】
トリプトファンの含有量は、例えば種子や葉等を用いて測定することができる。トリプトファン含有量の測定方法の一例を以下に記す。
【００６１】
種子あるいは乾燥させた葉を粉砕し粉砕物を得る。この粉砕物に１６％ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）溶液を加え、混合する。次に、リン酸カリウムバッファーを加え振とうする。遠心後、上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、遊離アミノ酸を含む抽出物を得る。高速アミノ酸分析計でこの抽出物のアミノ酸含量（トリプトファンを含む）を測定する。また、この抽出物のトリプトファン含量は一般的な紫外分光光度計を装備した高速液体クロマト装置(ＨＰＬＣ)で測定してもよい。
【００６２】
さらに、以下の方法による測定も可能である。
【００６３】
ホモジナイザーを用いて種子あるいは乾燥葉をエタノール中で破砕する。これを遠心後、上清をデカントし、ペレットは再度エタノール中で破砕する。ペレットの破砕後、上清を混合し、混合試料を遠心して新しい上清を得る。新しい上清を蒸留水で５倍に希釈して遠心し、０．２μｍの使い捨てフィルター（例えば、ワットマン製）を用いて濾過する。濾過した抽出物をアミノ酸分析システム（例えば、Ｐｉｃｏ Ｔａｇ；ウォーターズ、ミルフォード製）で分析する。
【００６４】
上記トリプトファン含有量の測定方法や記載された数値等は単なる例示であり、限定されることはない。
【００６５】
タンパク質組成の分析は、例えば、電気泳動のバンド染色にクーマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ，Coomassie Brilliant Blue）を用いて、非組み換え体と各バンド比較することによって行うことができる。
【００６６】
また、サザンブロット法を用いて上記（１）記載のポリペプチドが発現しているか否かを確認することができる。これらタンパク質組成の分析も記載されたものに、限定はされない。
【００６７】
（３）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて上記（１）のポリペプチドを生産する方法を提供する
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いる。上記（１）に記載のポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能にダイズに導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、ダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターをダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に導入する工程を包含する。
【００６８】
このようにダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するようにダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織内で機能するプロモータを組み込んであることが好ましい。
【００６９】
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズの抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００７０】
上記方法によると、ダイズ細胞、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織、の内で上記（１）のポリペプチドを生成することができるので、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスで上記（１）のポリペプチドを生産することができる。
【００７１】
（４）トリプトファンの生産方法
本発明は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いてトリプトファンを生産する方法を提供する。
【００７２】
本実施形態に係るトリプトファンの生産方法は、組換え発現系を用いる。上記（１）のポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能にダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に導入する。そして、細胞内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドは、トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するため、細胞内でトリプトファンのが増幅して生成される。この遊離トリプトファンを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、ダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターをダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に導入する工程を包含する。
【００７３】
このようにダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するようにダイズ細胞、または、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織内で機能するプロモータを組み込んであることが好ましい。
【００７４】
本実施形態に係るトリプトファンの生産方法は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズの抽出液から遊離トリプトファンを精製する工程をさらに包含することが好ましい。トリプトファンを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【００７５】
よって、これらトリプトファンの生産方法によりトリプトファンを生産するための装置も本発明に含まれる。
【００７６】
上記方法によると、ダイズ細胞、ダイズ、もしくはその子孫、あるいはこれら由来の組織、の内でトリプトファンを生成することができるので、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでトリプトファンを生産することができる。
【００７７】
（５）家畜飼料、水産飼料、食品、および栄養補助剤
本発明は、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて製造される家畜飼料、水産飼料、食品、栄養補助剤、および工業製品を提供する。また、上述のトリプトファンの生産方法により得られたトリプトファンを用いて製造される家畜飼料、水産飼料、食品、および栄養補助剤を提供する。
【００７８】
本項で記載する家畜飼料、水産飼料、食品、栄養補助剤は、上述したダイズの種子、果実、葉、塊茎、および／または塊根であっても、上述したダイズから抽出されたトリプトファンを用いて製造された家畜飼料、水産飼料、食品、栄養補助剤、であってもよい。
【００７９】
上記家畜飼料、水産飼料あるいは食品は、高濃度のトリプトファンが含有されているため栄養価が高い良質のものとなる。
【００８０】
また、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて製造される家畜飼料は、ダイズが本来有する高い栄養価に、トリプトファンが家畜に与える効果が加わるため良質の穀物飼料となる。また、ダイズから油を絞った脱脂ダイズ粉も家畜あるいは養殖魚の飼料に使用することができる。この脱脂ダイズ粉にも高濃度のトリプトファンが含有されているため栄養価が高い良質の家畜飼料となる。
【００８１】
本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて製造される家畜飼料、水産飼料、食品、あるいは、上述のトリプトファンの生産方法により得られたトリプトファンを用いて製造される家畜飼料、水産飼料、食品の具体的な構成は特に限定されるものではなく、用途や目的に応じて様々に加工されてもよい。
【００８２】
また、本発明に係るトリプトファン含有ダイズを用いて製造される栄養補助剤、あるいは、上述のトリプトファンの生産方法により得られたトリプトファンを用いて製造される栄養補助剤の具体的な構成は特に限定されるものではなく、用途や目的に応じて、種々の添加剤や緩衝液を加えればよい。この栄養補助剤は、人の鎮静やストレス緩和のために用いることができる。
【００８３】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００８４】
本実施例では、具体的にイネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子としてイネ改変型ＡＳαサブユニット遺伝子ＯＡＳＡ１Ｄ（ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子）をダイズに導入した。
【００８５】
〔実施例１：ダイズにＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入するためのベクターの作成〕
非特許文献１に記載された方法により取得したＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を、図１（ａ），（ｂ）に示すように、恒常的プロモータであるカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータ、あるいは子葉特異的プロモータであるダイズ１１Ｓグロブリン（ｇｙ２）プロモータと接続し、ノパリン合成酵素のターミネーター配列と接続させた。
【００８６】
パーティクルガン法のように物理的な遺伝子導入法では、導入遺伝子の断片化や多コピー化によって導入遺伝子が発現しなくなる現象、いわゆるジーンサイレンシングが発生することが報告されている。そこで、同図に示すように抗生物質耐性遺伝子であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）とレポーター遺伝子である改変型緑色蛍光タンパク質遺伝子（ｓＧＦＰ（Ｓ６５４Ｔ））との間に、ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子発現カセットを挿入した。
【００８７】
以上のように、２種類のプラスミド（ｐＵＨＧ：３５ＳｐｒｏＯＡＳＡ１Ｄあるいは、ｐＵＨＧ：ｇｙ２ｐｒｏＯＡＳＡ１Ｄ）を構築した。
【００８８】
なお、１１Ｓグロブリン（ｇｙ２）プロモータについては、ダイズＡ２Ｂ１ａプログリシニン遺伝子（ｇｙ２遺伝子）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｘ５３４０４）の、５'非翻訳配列（転写開始サイトに相対的な−１０２６から−４のヌクレオチド）を、以下のプライマー１、プライマー２を用いたＰＣＲにより品種ボンミノリのゲノムＤＮＡから単離した（参考文献１：Kitamura Y., Arahira M., Itoh Y. and Fukazawa C. 1990. The complete nucleotide sequence of soybean glycinin A2B1a gene spanning to another glycinin gene A1aB1b. Nucleic Acids Res. 18: 4245）。
【００８９】
また、ＧＦＰについては、隣接したＣａＭＶ３５ＳｐｒｏとＮｏｓＴ配列を有する形質転換されたクラゲのＧＦＰ翻訳領域［ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ），０．８ｋｂ］を、以下のプライマー３、プライマー４をを用いたＰＣＲによりｐＴＨ−２から増幅した（参考文献２：Chiu, W., Y. Niwa, W. Zeng, T. Hirano, H. Kobayashi and J. Sheen (1996) Engineered GFP as a vital reporters in plants. Curr. Biol 3: 325-330）。
【００９０】
ここで用いたプライマーは、
プライマー１：5'-GCGAAGCTTAGAATCCGTTGCATTCACTA-3'（配列番号３）
プライマー２：5'-CGCTCTAGAGTGATGAGTGTTCAAAGACA-3'（配列番号４）
プライマー３：：5'-AAGGTACCGGATCCCCCCTCAGAA-3'（配列番号５）
プライマー４：5'-AAGAGCTCCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3'（配列番号６）
である。
【００９１】
〔実施例２：ダイズの形質転換〕
＜不定胚の誘導と増殖＞
ダイズの形質転換および再生システムについては、次の参考文献３〜６を利用した。
参考文献３：Finer J.J. and Nagasawa A. 1988. Development of an embryogenic suspension culture of soybean [Glycine max (L.) Merrill]. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 15: 125-136.
参考文献４：Sato S., Newell C., Kolacz K., Tredo L., Finer J. and Hinchee M. 1993. Stable transformation via particle bombardment in two different soybean regeneration systems. Plant Cell Rep. 12: 408-413.
参考文献５：Parrott W.A., All J.N., Adang M.J., Bailey M.A., Boerma H.R. and Stewart C.N.J. 1994. Recovery and evaluation of soybean plants transgenic for a Bacillus thuringiensis var. Kurstaki insecticidal gene. In Vitro Cell. Dev. Biol. 30: 144-149.
参考文献６：Hadi M.Z., McMullen M.D. and Finer J.J. 1996. Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment. Plant Cell Rep. 15: 500-505
不定胚形成能に優れたダイズ品種ＪａｃｋあるいはＪＱ系統を温室内で栽培した。栽培は室温２５℃、自然日長下で行った。登熟中の莢表面を７０％エタノールで２分間滅菌し、滅菌水で３回洗浄した後、未熟子葉（３〜５ｍｍ）を取り出し、種皮と胚軸を取り除いた。そして処理された未熟子葉を、向軸側を上にして不定胚誘導培地（ＭＳＤ４０）に置床し、温度２５℃、日長２３時間、寒白色蛍光灯を用いて光強度５〜１０μｍｏｌｍ-1ｓ-2で培養した。すると、図２（ａ），（ｂ）に示すように、３〜４週間で不定胚を生じた。
【００９２】
なお、不定胚誘導培地は、ＭＳ塩（参考文献７：Murashige T. and Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum 15: 473-497.）とビタミンＢ５（参考文献８：Gamborg O., Miller R. and Ojima K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50: 151-158.）とから形成し、３％ショ糖と２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ，４０ｍｇｍｌ-1）とを補充し、ｐＨ７．０に調整し、０．２％Gelrite（商品名、和光製）で凝固させた。また、９０×２０ｍｍの使い捨てプラスチックシャーレを用いた。
【００９３】
誘導された不定胚を不定胚増殖培地（ＦＮ Ｌｉｔｅ、２５ｍｌ／１００ｍｌ三角フラスコ）に移し、回転数９０〜９５ｒｐｍ／分で振とう培養することで、図２（ｃ）に示すように、次々と不定胚を発生させ、増殖、維持することができた。不定胚増殖培地は、ＦＮ Ｌｉｔｅマクロ塩、ＭＳミクロ塩、およびビタミンＢ５から形成し、アスパラギン（１ｇＬ-1）と２，４−Ｄ（５ｍｇｍｌ-1）と３％ショ糖とを補充し、ｐＨ５．８に調整した。
【００９４】
不定胚は１週間毎に新しい不定胚増殖培地に継代培養し、不定胚の量が増えたときは２本のフラスコに分けた。不定胚は再分化能を保ったまま、数ヶ月間の継続培養が可能であった。
【００９５】
＜パーティクルガンによる遺伝子の導入＞
増殖した不定胚（約０．８ｇ）を遺伝子導入培地（ＭＳＤ２０、プラスチックシャーレの大きさ９０×２０ｍｍ）の中央、直径約２５ｍｍにまんべんなく広げ、表面を乾燥させた。なお、遺伝子導入培地（ＭＳＤ２０）は、ＭＳ塩とビタミンＢ５とから形成し、３％ショ糖とアスパラギン（１ｇＬ-1）と２，４−Ｄ，２０ｍｇｍｌ-1とを補充し、ｐＨ５．８に調整し、０．２％Gelriteで凝固した。
【００９６】
実施例１で作成した導入遺伝子を含むプラスミドＤＮＡはPlasmid Midi Kit（商品名、キアゲン製）を用いて、ｐＵＨＧ：３５ＳｐｒｏＯＡＳＡ１Ｄ（以下、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ）あるいは、ｐＵＨＧ：ｇｙ２ｐｒｏＯＡＳＡ１Ｄ（以下、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ）を大腸菌ＤＨ５αから単離して、滅菌水に１μｇ／μｌの濃度で溶かした。パーティクルガン（ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ；商品名、日本バイオ・ラッド社製）による遺伝子の導入は、機器に添付のプロトコルに従った。
【００９７】
３ｍｇの直径１μｍ金粒子（マイクロキャリア）と５μｇの実施例１で作成したプラスミドＤＮＡとをよく混合し、塩化カルシウム／スペルミジン法（参考文献９：Klein T.M., Gradziel T., Fromm M.E. and Sanford J.C. 1988. Factors influencing gene delivery into Zea mays cells by high-velocity microprojectiles. Bio/technology 6: 559-563.）で、金粒子表面にＤＮＡをコーティングした。３ｍｇの金粒子で６枚のマクロキャリアを調整、すなわち６回の撃ち込みを行うことができる。
【００９８】
パーティクルガンによって、マイクロキャリアをヘリウムガス圧１３５０ｐｓｉ、６ｃｍの距離で培地上の不定胚へ撃ち込んだ。金粒子の分布を均一にするため、プレートの向きを換え、２回撃ち込んだ。
【００９９】
＜遺伝子組換え体の選抜＞
遺伝子を導入した不定胚は不定胚増殖培地で１週間培養した後、１５ｍｌ／Ｌハイグロマイシンを添加した選抜培地で２週間、３０ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを添加した選抜培地で４週間、４５ｍｌ／Ｌハイグロマイシンを含む選抜培地で２週間培養した。この間、培地は毎週交換した。ハイグロマイシン添加培地において８週間培養することにより、ほとんどの不定胚は白化し、図２（ｄ）に示すように、緑色を維持している遺伝子組換え体を容易に識別することができた。
【０１００】
＜植物体の再分化＞
参考文献１０（Samoylov VM, Tucker DM, Parrott WA (1998) Liquid medium-based protocol for rapid regeneration from embryogenic soybean cultures. Plant Cell Rep 18:49-54）に記載された方法により、不定胚魂を回復させた。
【０１０１】
緑色の不定胚塊を１５ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを添加した選抜培地で十分に増殖させた。無菌のろ紙を用いて過剰液体を除去して、増殖した不定胚の一部（約２０ｍｇ）を胚成熟培地（ＦＮＬ０Ｓ３Ｓ３、２５ｍｌ／１００ｍｌ三角フラスコ）に移し、回転数１００ｒｐｍで３〜５週間振とう培養した。このことにより、図２（ｅ）に示すように子葉状の胚が発達した。この間、培地は交換しなかった。ここで、胚成熟培地は、ＦＮ Ｌｉｔｅマクロ塩、ＭＳミクロ塩、およびビタミンＢ５から形成し、アスパラギン（１ｇＬ-1）と３％ショ糖とソルビートとを補充し、ｐＨ５．８に調整した。
【０１０２】
成熟した胚は、過度の乾燥を防ぐため、約１ｃｍ3の発芽培地（ＭＳ０）片の入ったシャーレで３〜７日間乾燥させた。乾燥させた成熟胚は、図２（ｆ）に示される。その後、淡い黄色になった胚を、図２（ｇ）に示すように発芽培地で発芽させる。発芽培地は、０．５×Ｂ５塩、０．５×ビタミンＢ５、２％ショ糖、および０．０５％ＭＥＳ緩衝液から形成し、ｐＨ５．８に調整し、０．２％Gelriteで凝固させた。
【０１０３】
発芽した個体は発根培地（１／２Ｂ５）で十分に生長させ、順化させた後に、図２（ｈ）に示すように培養土を充填したポットに移植し、高湿度で順応させ、図２（ｉ）に示すように閉鎖系温室（ガラス温室）内で栽培した。次第に周囲の湿度に順応するようにした。
【０１０４】
以上の方法により、不定胚の誘導から約６ヶ月間で遺伝子組換え体が育成できた。
【０１０５】
〔実施例３：ＧＦＰの発現を確認による遺伝子導入胚の選抜〕
遺伝子組換え不定胚は実施例２にようにハイグロマイシンで選抜するのに加え、実体蛍光顕微鏡（ＭＺ ＦＬIII；商品名、ライカ製）等によって、ＧＦＰの発現を確認することでさらに選抜した。図３（Ａ−ｗ），（Ａ−ｂ），（Ｂ−ｗ），（Ｂ−ｂ）に遺伝子が導入された不定胚と、図３（Ｃ−ｗ），（Ｃ−ｂ）に成熟胚とが示される。青色光を照射することで、図３（Ａ−ｂ），（Ｂ−ｂ），（Ｃ−ｂ）に示すように、遺伝子が導入された箇所（細胞）が分かった。
【０１０６】
〔実施例４：ＲＴ−ＰＣＲによる導入遺伝子の発現の確認〕
成熟胚の段階で導入遺伝子の発現とトリプトファン含量の増加とを調査した。以下に導入遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認する方法を記す。
【０１０７】
成熟胚（１００ｍｇ）を液体窒素中で、乳鉢と乳棒を用いてすりつぶし、１ｍＬトリゾール試薬（商品名、インビトロジェン製）を加えて、すりつぶした試料を強力に振とうした。この試料を室温で５分間インキュベートし、２００μｌクロロホルムを添加して１５０００×ｇで１０分間遠心した。
【０１０８】
イソプロパノールを用いて上清から総ＲＮＡを沈殿させ、１００μｌのＲＮａｓｅフリーの水で懸濁した。ＲＮＡ（５００ｎｇ）の一部を、３７℃で３０分、ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ（ＲＱ１；商品名、プロメガ製）を３Ｕ用いて、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と１０ｍＭのＭｇ2ＳＯ4と１ｍＭのＣａＣｌ2とを含む３０μｌの溶液中で、インキュベートした。この反応を、３μｌ、２０ｍＭのＥＧＴＡ（ｐＨ８．０）を添加することにより停止させ、ＲＮＡをフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させた。
【０１０９】
単離したＲＮＡをＲＡａｓｅフリー水に再懸濁し、ＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン製）とオリゴ（ｄＴ）２０プライマーを用いた第１鎖ｃＤＮＡ合成に利用した。ＲＮＡを初めに、５０ｐｍｏｌのプライマーとそれぞれ２０ｎｍｏｌのｄＮＴＰとを含む１２μｌの溶液で、５分間、６５℃でインキュベートした。その後、８μｌのｃＤＮＡ合成ミックス（４μｌの５×ｃＤＮＡ合成緩衝液、０．１ｎｍｏｌのジチオスレイトール、４０ＵのＲＮａｓｅアウト、および１５Ｕのサーモスクリプト逆転写酵素を含む）を添加して６０分間、５０℃でインキュベートした。
【０１１０】
産物ｃＤＮＡをＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（商品名、アプライドバイオシステム製）を用いて９４℃で１分、５５〜６０℃で１分、および７２℃で１分、の３０サイクルでＰＣＲを行い増幅させた。ダイズアクチン１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｊ０１２９８）をＲＴ−ＰＣＲの内部コントロールとして用いた。増幅した生成物は、ｐＣＲ２．１ベクター（インビトロジェン製）に複製し、生成物の確認のために電気泳動によりシークエンシングを行った。その結果、図４に示すように、複数の成熟胚にＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子が導入されていることわかった。なお、図４における２−１、４８−１，５１−２といった、数字は、異なる遺伝子導入から得られた由来の異なる遺伝子組換え成熟胚を識別するための数字である。以下で説明する図６〜９についても同様である。
【０１１１】
なお、上記ＰＣＲにおいて、アクチン１遺伝子に対しては、下記のプライマー５、プライマー６のペア、ｈｐｔ遺伝子に対しては、プライマー７、プライマー８のペア、ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子に対してはプライマー９、プライマー１０のペアを用いた。
【０１１２】
用いたプライマーは、
プライマー５：5'-GACGCTGAGGATATTCAACC-3'（配列番号７）
プライマー６：5'-AGAAATCTGTGAGGTCACGA-3'（配列番号８）
プライマー７：5'-CTGAACTCACCGCGACGTCT-3'（配列番号９）
プライマー８：5'-AGTCCTCGGCCCAAAGCATC-3'（配列番号１０）
プライマー９：5'-ACCGCTGCCTCGTCAGGGAGGACG-3'（配列番号１１）
プライマー１０：5'-CTCAAAACGCTGGCTTAAGAC-3'（配列番号１２）
である。
【０１１３】
〔実施例５：トリプトファンが増加した種子の栽培と固定系統の育成〕
上記実施例３を繰り返し行った。つまり、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄプラスミドを用いた遺伝子導入は５６回、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄプラスミドを用いた遺伝子導入は４８回行った。
【０１１４】
その結果が、図５である。各々、２個と１４個のトリプトファンが増加したＴ0個体を得た。そして、トリプトファンが増加した種子を閉鎖系温室内で栽培し、固定系統を育成した。
【０１１５】
〔実施例６：非組み換え体と組み換え体（ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体）との比較〕
＜種子のトリプトファン含量＞
非組み換え体（コントロール）、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体において、種子のトリプトファン含量を調べた。
【０１１６】
初めに、個体毎に３粒のダイズ種子をコーヒーミルで粉砕し種子粉砕物を得た。次に、種子粉砕物１５０ｍｇに１６％のＴＣＡ６００μｌを加え混合し、その後、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ５．６）６００μｌを加え１時間振とうした。そして、１５００ｒｐｍで１０分間遠心後、上清を０．２μｍのフィルターで濾過し、遊離アミノ酸を含む抽出物を得た。この抽出物のアミノ酸含量（トリプトファンを含む）を、高速アミノ酸分析計（L-8500やL-8800等、日立製）等で測定し、分析を行った。その分析結果を図６に示す。
【０１１７】
図６に示すように、非組換え体（コントロール）の種子の遊離トリプトファン含量は０．０７ｍｇ／ｇＤＷであるのに対し、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導個体の遊離トリプトファン含量は１．９〜３．３ｍｇ／ｇＤＷ、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体の遊離トリプトファン含量は３．０〜６．４ｍｇ／ｇＤＷであった。
【０１１８】
組み換え体の遊離トリプトファン含量は、非組換え体の遊離トリプトファンに比べ、約１００〜２６０倍程度にまで増加した。また、組換え体の遊離トリプトファンは、最大で種子乾物重当たり約０．６％に達していた。このように必須アミノ酸であるトリプトファンを高濃度で含むダイズ種子は飼料あるいは食糧としての有用性が高いものなる。
【０１１９】
また、図７に示すように、遺伝子導入された種子では遊離トリプトファンが際だって増加していた。遺伝子導入された種子でアスパラギン（Ａｓｎ）がやや減少していたが、他のアミノ酸はあまり変動しなかった。
【０１２０】
＜タンパク質組成＞
非組み換え体（コントロール）、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導個体、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体における、種子のタンパク質組成を比較した。
【０１２１】
図８に示すように、クーマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）染色を行ったところ、各種子のタンパク質組成に大きな変化は認められなかった。
【０１２２】
また、抗ＯＡＳＡ１Ｄ抗体を用いてウエスタンプロット法を行うと、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導個体、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体、にＯＡＳＡ１Ｄの発現が観測された。
【０１２３】
＜葉のトリプトファン含量＞
非組み換え体（コントロール）、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体、ｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体において、葉のトリプトファン含量を調べた。個体毎に１ｇの葉を凍結乾燥させ、乾燥葉をコーヒーミルで粉砕し乾燥葉粉砕物を得た。この乾燥葉粉砕物からの遊離アミノ酸の抽出と分析は、上記＜種子のトリプトファン含量＞に記載した方法と同様に行った。その分析結果を図９に示す。
【０１２４】
図９に示すように、特に３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体で、トリプトファン含量が増加しているものがあった。非組換え体が０．１６５ｍｇ／ｇＤＷであるのに対し、３５Ｓ：ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入個体の一つは、４．０９２ｍｇ／ｇＤＷであることから、ダイズの茎葉を家畜飼料として使用する場合も栄養価は高いと考えられる。一方、子葉特異的プロモータであるｇｙ２では葉のトリプトファン含量を上昇させることはなかった。
【０１２５】
〔実施例７：品種ＪＱへの遺伝子導入〕
高遊離アミノ酸系統であるＪＱへのＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子導入を、実施例３と同様に行った。ここでは、実施例１のｇｙ２：ＯＡＳＡ１Ｄプラスミドを用いた。
【０１２６】
本実施例でも、ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子が導入された組換え体を得ることができた。図１０に示すように、ＪＱの場合もＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子の導入により種子における遊離トリプトファン含量が増加していた。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明により、高トリプトファン含有ダイズの作出が可能となる。したがって、本発明は広く農業に利用することができ、また高トリプトファンダイズは家畜飼料、養殖魚用の餌や食品に適しているため、本発明は畜産業、水産業や食品産業にも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を有する導入遺伝子の構造を表す図であり、（ａ）はｐＵＨＧ：３５ＳｐｒｏＯＡＳＡ１Ｄ、（ｂ）はｐＵＨＧ：ｇｙ２ＯＡＳＡ１Ｄプラスミドの構造を表す図である、。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は培養されたダイズの不定胚、（ｄ）はＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入された不定胚、（ｅ）はＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入された不定胚あるいは体細胞胚、（ｆ）および（ｇ）はＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入された成熟胚、（ｈ）は発芽したダイズ個体、（ｉ）は成長したダイズ個体を表す画像である。
【図３】緑色蛍光タンパク質（ｓＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ））による形質転換体の選抜の過程を示す図であり、（Ａ−ｗ）および（Ｂ−ｗ）は白色光を照射された不定胚、（Ｃ−ｗ）は白色光を照射された成熟胚、（Ａ−ｂ）および（Ｂ−ｂ）は青色光を照射された不定胚、（Ｃ−ｂ）は青色光を照射された成熟胚を示す画像である。
【図４】形質転換成熟胚における導入遺伝子の発現を解析した結果を示す画像である。
【図５】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入されたダイズの胚、再生個体、成長個体、の数を示す表である。
【図６】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ（Ｔ3世代）の種子における遊離トリプトファンの量を表すグラフである。
【図７】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ（Ｔ3世代）の種子における遊離アミノ酸組成を表すグラフである。
【図８】（ａ）はＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ（Ｔ3世代）の種子における貯蔵タンパク質組成を解析した結果を示す画像であり、（ｂ）はＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ（Ｔ3世代）の種子におけるＯＡＳＡ１Ｄの検出結果を示す画像である。
【図９】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したダイズ（Ｔ3世代）の植物体（葉）における遊離トリプトファンの量を表すグラフである。
【図１０】ＯＡＳＡ１Ｄ遺伝子を導入したＪＱ系統におけるダイズ（Ｔ1世代）の種子における遊離アミノ酸組成を表すグラフである。
【図１１】トリプトファンの生合成経路を表す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイズで発現可能なプロモータと共に、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子が発現可能に導入されていることを特徴とするトリプトファン含有ダイズ。
【請求項２】
上記プロモータは、種子特異的であることを特徴とする請求項１に記載のトリプトファン含有ダイズ。
【請求項３】
上記プロモータは、配列番号１３に記載の塩基配列を有することを特徴とする請求項１また２に記載のトリプトファン含有ダイズ。
【請求項４】
上記イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子は、
トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであり、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
をコードしているポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のトリプトファン含有ダイズ。
【請求項５】
上記ポリヌクレオチドは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、
であることを特徴とする請求項４に記載のトリプトファン含有ダイズ。
【請求項６】
上記トリプトファン含有ダイズには、細胞、植物個体、その子孫、あるいはこれら由来の組織が含まれることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載のトリプトファン含有ダイズ。
【請求項７】
請求項４に記載のポリペプチドの生産に、請求項１〜６の何れかに記載のトリプトファン含有ダイズを用いることを特徴とするポリペプチドの生産方法。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか１項に記載のトリプトファン含有ダイズを用いることを特徴とするトリプトファンの生産方法。
【請求項９】
請求項１〜６の何れか１項に記載のトリプトファン含有ダイズを含むことを特徴とする家畜飼料、水産飼料、食品、または栄養補助剤。
【請求項１０】
請求項８に記載の生産方法により得られたトリプトファンを含むことを特徴とする家畜飼料、水産飼料、食品、または栄養補助剤。
【請求項１１】
請求項８に記載の生産方法によりトリプトファンを生産することを特徴とするトリプトファン生産装置。
【請求項１】
ダイズで発現可能なプロモータと共に、イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子が発現可能に導入されていることを特徴とするトリプトファン含有ダイズ。
【請求項２】
上記プロモータは、種子特異的であることを特徴とする請求項１に記載のトリプトファン含有ダイズ。
【請求項３】
上記プロモータは、配列番号１３に記載の塩基配列を有することを特徴とする請求項１また２に記載のトリプトファン含有ダイズ。
【請求項４】
上記イネ改変型アントラニル酸合成酵素遺伝子は、
トリプトファン生合成経路においてトリプトファンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有するポリペプチドであり、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
をコードしているポリヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のトリプトファン含有ダイズ。
【請求項５】
上記ポリヌクレオチドは、下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、
であることを特徴とする請求項４に記載のトリプトファン含有ダイズ。
【請求項６】
上記トリプトファン含有ダイズには、細胞、植物個体、その子孫、あるいはこれら由来の組織が含まれることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載のトリプトファン含有ダイズ。
【請求項７】
請求項４に記載のポリペプチドの生産に、請求項１〜６の何れかに記載のトリプトファン含有ダイズを用いることを特徴とするポリペプチドの生産方法。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか１項に記載のトリプトファン含有ダイズを用いることを特徴とするトリプトファンの生産方法。
【請求項９】
請求項１〜６の何れか１項に記載のトリプトファン含有ダイズを含むことを特徴とする家畜飼料、水産飼料、食品、または栄養補助剤。
【請求項１０】
請求項８に記載の生産方法により得られたトリプトファンを含むことを特徴とする家畜飼料、水産飼料、食品、または栄養補助剤。
【請求項１１】
請求項８に記載の生産方法によりトリプトファンを生産することを特徴とするトリプトファン生産装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００６−８１５１７（Ｐ２００６−８１５１７Ａ）
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２７２５４０（Ｐ２００４−２７２５４０）
【出願日】平成１６年９月１７日（２００４．９．１７）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１７日（２００４．９．１７）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・生物系特定産業技術研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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