中枢及び末梢神経系疾患の治療のための組成物
【課題】非シナプス的機構を用いる中枢及び末梢神経系の選択された容態を治療するための方法と組成物の提供。
【解決手段】中枢神経系のイオン濃度とイオン平衡を改変する試剤の投与。特にイオン依存性又はカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストの投与。具体的にはループ利尿薬が挙げられる。これは、発作、発作性障害、てんかん、てんかん重積状態、片頭痛、痛みの治療のため、頭部の外傷、卒中、虚血、低酸素症の病態生理学的な影響の治療のため、エタノールのような神経毒性の病態生理学的な影響を治療し保護するため及び精神神経疾患及び中枢神経系水腫の治療のために用いることができる。
【解決手段】中枢神経系のイオン濃度とイオン平衡を改変する試剤の投与。特にイオン依存性又はカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストの投与。具体的にはループ利尿薬が挙げられる。これは、発作、発作性障害、てんかん、てんかん重積状態、片頭痛、痛みの治療のため、頭部の外傷、卒中、虚血、低酸素症の病態生理学的な影響の治療のため、エタノールのような神経毒性の病態生理学的な影響を治療し保護するため及び精神神経疾患及び中枢神経系水腫の治療のために用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非シナプス的機構を用いて中枢及び末梢神経系の選択された容態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を治療するための方法と組成物に関する。より明確には本発明の１の局面は、中枢神経系のイオン濃度とイオン平衡を改変する試剤（ａｇｅｎｔ）を投与することにより、発作、発作性障害、てんかん、てんかん重積状態、片頭痛、皮質拡延性抑制、頭蓋内高血圧、精神神経疾患及び中枢神経系水腫の治療のための方法と材料と、エタノールのような毒物及びある種の感染因子の病態生理学的な効果を治療しあるいはこれらの効果から保護するための方法と材料と、頭部外傷、脳卒中、虚血及び低酸素症の病態生理学的な効果を治療するための方法と材料と、認知、学習及び記憶のようなある種の脳機能を改善するための方法と材料とに関する。イオン濃度と勾配を改変するため及びさまざまな容態を治療するための、ループ利尿薬を含む特異的な治療組成物と、かかる組成物の類似体及び誘導体とが、かかる組成物と他の因子との併用とともに開示される。末梢神経系のイオン濃度と勾配を改変する因子を投与することにより痛みを治療するための材料と方法も開示される。試験管内の（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び生体の（ｉｎ ｖｉｖｏ）のシステムを用いて所望の活性について薬物候補組成物をスクリーニングするための方法とシステムが開示される。
【背景技術】
【０００２】
発作性障害、てんかん等のような神経疾患の通常の治療法は、神経伝達物質又は阻害剤の放出又は活性の改変によってのように、興奮経路に影響を及ぼすシナプス機構を標的とする。発作性障害の通常の治療用試剤と治療方式は、ニューロンの興奮性を減少し、シナプスの発火（ｆｉｒｉｎｇ）を抑制する。このアプローチの重篤な欠点は、てんかんは一般に局部的であるのに、その治療法は無差別にニューロン活動に影響を与え（減退させる）ことである。この理由により重篤な副作用があり、通常の薬剤の反復投与は認知、学習及び記憶のような正常で望ましい脳機能の意図しない障害をもたらすことがある。個々の関心のある障害についてのさらに詳細な情報は以下に提供される。
【０００３】
てんかん
てんかんは、大脳ニューロンの異常な放電が特徴で、典型的にはさまざまなタイプの発作として現れる。てんかん発作様活動は、電気生理学的技術を用いて計測可能な、ニューロン集団の自発的に発生する協調的放電と同一とみなされる。てんかん発作様活動を非てんかん発作様活動から区別するこの協調的な活動は、個々のニューロンが段々と時限ロックの鍵のようなやり方で互いに放電しやすくなる状態を表現するため、「過同期化（ｈｙｐｅｒｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）」と呼ばれる。
【０００４】
てんかんは最もありふれた神経疾患で、人口の約１％が罹患する。特発性、症候性及び潜在性を含むさまざまなてんかんの病型がある。遺伝的素因は特発性てんかんの主要な病因因子であると考えられている。症候性てんかんは通例脳の構造的な異常の結果発症する。
【０００５】
てんかん重積状態は、特に重篤な発作の病型で、著しく長時間持続する多発性発作又は発作と発作の間に意識の回復が全くみられない連続的な発作として出現する。てんかん重積状態の成人の全死亡率は約２０％である。最初のエピソードがあった患者は将来のエピソードと慢性てんかん発症のリスクが相当ある。米国でのてんかん重積状態の発生率は毎年約１５０，０００件で、毎年約５５，０００人の死がてんかん重積状態と関係ある。てんかん重積状態と関連する急性の経過は、難治性てんかん、代謝障害（例、電解質異常、腎臓障害及び敗血症）、中枢神経系感染症（髄膜炎又は脳炎）、卒中、成人病、頭部外傷、薬剤毒性及び低酸素症を含む。てんかん重積状態の病態生理学の基礎には単発の発作を正常なら中断させる機構の機能不全が関与する。この機能不全は、異常に持続的な過剰興奮又は無効な抑制の動員から生じる。これまでの研究は興奮性アミノ酸レセプターの過剰活性化が持続性発作を惹起することを示してきて、興奮性アミノ酸は病因であることを示唆する。てんかん重積状態はまた、脳の主要な抑制的神経伝達物質である、γ―アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の効果と拮抗するペニシリン及び類似の組成物によっても惹起される。
【０００６】
てんかんの１つの初期の診断手順は、同時に発生する利尿を防止するために大量の水の経口投与をバソプレッシンの注射とともに行うことを伴う。この治療法はてんかん患者には発作を誘導するがてんかんでない人間にはほとんど誘導しないことが見つけられた（Ｇａｒｌａｎｄら、Ｌａｎｃｅｔ、２：５６６、１９４３）。てんかん重積状態は、カイニン酸処理ラットにおいてマンニトール静注により阻止できる（Ｂａｒａｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２１：６７９、１９８７）。この効果は人間の患者に尿素を静注することにより達成される効果と同様である（Ｃａｒｔｅｒ、Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ、３：１９８、１９６２）。これらのケースのそれぞれの治療法は血液と細胞外液の浸透圧を上昇させ、細胞からの水の流出と脳内の細胞外空間の増加をもたらす。別の作用機序（炭酸脱水酵素の阻害）を持つ別の利尿剤であるアセタゾラミド（ａｃｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ、ＡＣＺ）は抗けいれん薬として実験的に研究されてきて（Ｗｈｉｔｅら、Ａｄｖａｎｃｅ Ｎｅｕｒｏｌ．、４４：６９５、１９８６及びＧｕｉｌｌａｕｍｅら、Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ、３２：１０、１９９１）、臨床的には限定的に使用されてきた（Ｔａｎｉｍｕｋａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．、１４：９６１、１９６５及びＦｏｒｓｙｔｈｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．、２３：７６１、１９８１）。抗けいれん作用機序は不明だが、ＡＣＺは大脳細胞外空間には明らかな効果がある。
【０００７】
伝統的な抗けいれん薬は、（ａ）電位依存性ナトリウムチャンネルを阻害することによる反復性の高周期ニューロン発火の抑制と、（ｂ）γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）性（ＧＡＢＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）後シナプス抑制と、（ｃ）Ｔ型カルシウムチャンネルの阻害の３つの機序のうちの１つにより主要な効果を奏する。フェニトイン（ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）とカルバマゼピン（ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ）は、ニューロンの規則的な発火には感知できるほどの影響を与えない一方で、持続的な高周期ニューロン脱分極を減少又は除去することにより細胞レベルで効果を奏するナトリウムチャンネルアンタゴニストの例である。フェノバルビタールとベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）のようなバルビツレートは、ＧＡＢＡ性シナプス抑制を増強することにより作用する。両方のクラスの組成物はシナプス後膜の過分極を増大し、結果として抑制を増大する。エトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）とバルプロ酸（ｖａｌｐｏｒａｔｅ）はＴ型電位依存性カルシウムチャンネルを介するカルシウムのニューロンへの流入を減少する薬剤の例である。
【０００８】
現在の抗けいれん薬療法は発作活動への関与の有無に関わらず全ての脳細胞に薬理学的効果を奏する。ありふれた副作用は過度の鎮静、眩暈感、記憶喪失及び肝臓障害である。さらに、てんかん患者の２０ないし３０％は耐療性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）を示す。
【０００９】
シナプス過興奮性に焦点を絞ることはてんかん発生機序の基礎研究と新規抗てんかん薬の設計と発見におけるこれまでの主導的な原理であった。このアプローチの欠点の１つは、今日の大抵の抗てんかん薬が脳内のてんかん発作発現性領域と正常な領域の両方に無差別的にその影響を及ぼすことである。本発明の組成物は、非シナプス経路により作用するためもあって、発作の治療に新規なアプローチを提供する。
【００１０】
片頭痛
片頭痛は米国の人口の１０ないし２０％が罹患しており、毎年推定６４００万労働日が失われている。片頭痛は、時たま起こり、片側性又は両側性で、４から７２時間持続し、しばしば悪心、嘔吐及び光及び／又は音に対する過敏性を伴う、拍動性の頭部の痛みにより特徴づけられる。視覚、感覚、発語又は運動の徴候のような前駆症状を伴うときは、前記の頭痛は、古典的な片頭痛として以前は知られていた「前兆を伴う片頭痛」と呼ばれる。かかる徴候を伴わないときは、前記の頭痛は、普通の片頭痛として以前は知られていた「前兆を伴わない片頭痛」と呼ばれる。両タイプとも強い遺伝的な要素の証拠があり、両方とも女性のほうが男性より３倍罹患しやすい。片頭痛の正確な病因はまだ不明である。片頭痛になりやすい人は、おそらく抑制的神経伝達物質γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の活性低下のために、神経興奮の閾値が低下しているとの学説が立てられている。ＧＡＢＡは正常では、ともに片頭痛発作に関与するとみられる神経伝達物質セロトニン（５−ＨＴ）とグルタミン酸の活性を抑制する。興奮性神経伝達物質グルタミン酸は片頭痛発作を始動する皮質拡延性抑制と呼ばれる電気的な現象に関与し、セロトニンは片頭痛の進行とともに起こる血管の変化に関与する。
【００１１】
皮質拡延性抑制（ＣＳＤ）は後頭部皮質の強烈な脱分極の短い突発波と、それに続く大脳皮質表面を前方に進むニューロンの沈黙と減退した誘発電位の波で特徴づけられる。後頭部皮質ニューロンの増大した興奮性がＣＳＤの基礎であると提案されている。視覚領は興奮性の閾値が比較的低いために最もＣＳＤを起こしやすい。ミトコンドリア疾患、マグネシウム欠乏症及びシナプス前カルシウムチャンネル異常はニューロン過興奮性の原因かもしれない（Ｗｅｌｃｈ、 Ｋ．Ｍ．Ａ．、「片頭痛の病因論（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｇｒａｉｎｅ）」、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１７：４、１９９７）。拡延性抑制が起こっている間、間質の酸性化、細胞外カリウムの蓄積及び細胞内コンパートメントへのナトリウムと塩素イオンの再分布を含む、甚大なイオンの混乱が生じる。さらに、持続的なグリアの膨張が、変更された細胞外のイオン液組成及び間質の神経伝達物質と脂肪酸蓄積に対する恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）反応として起こる。これまでの研究はフロセミド（ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）が麻酔したネコで再生的な皮質拡延性抑制を抑制することを示している（Ｒｅａｄ、Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｅｐｈａｌａｇｉａ、１７：８２６、１９９７）。
【００１２】
抗療性の転換型片頭痛タイプの慢性連日性頭痛（ＣＤＨ）患者８５人の研究は、急性の頭痛の悪化はエルゴタミン（ｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ）、ジヒドロエルゴタミン（ｄｉｈｙｄｒｏｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ、ＤＨＥ）及びスマトリプタン（ｓｕｍａｔｒｉｐｔａｎ）のような特定の抗てんかん薬に反応し、頭蓋内圧の上昇の診断後のアセタゾラミン（ａｃｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ）及びフロセミド（ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）のような試剤の追加投与が症状の改善（ｂｅｔｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｙｍｐｔｏｍｓ）をもたらしたと結論した（Ｍａｔｈｅｗ、 Ｎ．Ｔ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ４６：１２２６−１２３０、１９９６）。前記論文の著者たちは、この結果はさらに研究を要する片頭痛と特発性頭蓋内高血圧との関連を示唆していると注記している。
【００１３】
薬物療法は片頭痛の重篤度と頻度にあわせて処方される。時折頭痛が起こる場合には病勢を頓挫させる治療法が必要とされるが、月に２回以上頭痛が起こる場合又は頭痛が患者の日常生活に重大な影響を与える場合には、予防療法が必要とされる。スマトリプタンのようなセロトニン受容体アゴニストが病勢頓挫療法に処方されてきた。セロトニン受容体アゴニストは拡張した脳血管を収縮させてこれに伴う痛みを軽減すると考えられている。この療法に伴う副作用は刺痛、眩暈感、火照り感（ｗａｒｍ−ｈｏｔ ｓｅｎｓａｔｉｏｎ）及び注射部位反応（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ−ｓｉｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を含む。静脈投与は冠状動脈の血管けいれんのおそれのため禁忌である。エルゴタミンにもとづく薬剤は、主に外部頸動脈の分枝である一部の動脈と小動脈の拡張を特異的に抑える血管収縮剤に分類される。エルゴタミンのリバウンド現象を防止するため、エルゴタミンは片頭痛発症の第２日又は第３日に反復すべきではない。しかし、前記薬剤の使用を急に中止する場合には患者は重篤なリバウンドによる頭痛を経験する。エルゴタミンの過剰消費は冷たく湿った四肢のような血管収縮の徴候を惹起し、麦角中毒につながる。
【００１４】
予防療法に用いる薬剤は、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）のようなアドレナリン作動性ベータ遮断薬、カルシウムチャンネル遮断薬又は低投与量の抗てんかん薬を含む。特に、ＧＡＢＡ合成を増加させるかその分解を減少させるかのいずれかにより、脳内ＧＡＢＡレベルを増加させる抗てんかん薬はある人々には片頭痛を防止する上で有効のようにみえる。一部の患者には、アミトリプチリン（ａｍｉｔｒｉｐｔｌｉｎｅ）のような三環系抗うつ薬（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ａｎａｌｇｅｓｉｃｓ）が有効である。脳内グルタミン酸受容体サブタイプの１つに作用するＮＭＤＡ受容体アンタゴニストはＣＳＤを抑制する。弱いＮＭＤＡ受容体アンタゴニストとして機能すると現在信じられている薬剤又は物質は、デキストロメトルファン（ｄｅｘｔｒｏｍｅｔｈｏｒａｐｈａｎ）、マグネシウム及びケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）を含む。静脈内マグネシウムは片頭痛の発作を頓挫させるために使用することに成功してきた。
【００１５】
さまざまな化学因子及び生物学的因子といくつかの病原因子は神経毒効果がある。ありふれた例は急性エタノール摂取の病態生理学的効果である。エピソード的なエタノール中毒と過度のアルコール中毒に特徴的な禁断は脳障害を起こす。アルコールのヒトへの影響を模倣するように設計された動物モデルは、５ないし１０日間続けて１回量与えることで、大脳皮質の水腫と電解質（Ｎａ＋及びＫ＋）の蓄積を伴った嗅脳溝内皮質、歯状回及び嗅球の神経変性が起こることを証明した。他の神経変性状態と同様、過度のグルタミン酸作動性活動と細胞内カルシウムの増大とγアミノ酪酸の減少とが関与するシナプスにもとづくエキサイトトキシンによる事象に研究の焦点が主に当てられてきた。エピソード的なアルコール被曝により誘導された脳損傷をＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、非ＮＭＤＡ受容体及びＣａ２＋チャンネルアンタゴニストとフロセミドとで共に治療することにより、脳の水分過剰と電解質上昇を防止する一方、アルコール依存性の大脳皮質の損傷は７５ないし８５％減少する（Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｍ．ら、ＦＡＳＥＢ、１２巻１９９８年２月号）。著者らは前記の結果はフロセミド及び関連試剤はアルコール乱用での神経保護剤として有用ではないかと示唆するものであることを観察した。
【００１６】
認知、学習及び記憶
哺乳類の認知能力は皮質のプロセシングに依存すると考えられている。皮質の機能を記述し理解するための最も適切なパラメーターは活動の時空的なパターンであるということは一般的に受け入れられている。特に、長期増強と長期減退は記憶と学習に関係があるとされてきて、認知にも役割を果たすかもしれない。哺乳類の脳の振動的で同期的な活動は特定の行動状態と相関があるとされてきた。
【００１７】
自発的なニューロンの発火活動の同期化が中枢神経系の数多くの正常及び病態生理学的な過程の重要な特徴であると考えられている。例は、認知に関与すると考えられている新皮質のガンマ波のような集団活動の同期化された振動（ＳｉｎｇｅｒとＧｒａｙ、１９９５）と、空間記憶及びシナプス可塑性誘導に役割を果たすと考えられている海馬のシータ波（ＨｅｕｒｔａとＬｉｓｍａｎ、１９９５、ＨｅｕｒｔａとＬｉｓｍａｎ、１９９６、Ｏ’ｋｅｅｆｅ、１９９３）を含む。今日まで、自発的な同調化した活動の発生と維持の基礎となる過程についての大抵の研究はシナプス的機構に焦点を当ててきた。しかし、非シナプス的機構も中枢神経系の正常及び病理学的活動における同調化の改変に重要な役割を果たすかもしれない。
【００１８】
候補組成物のスクリーニングと治療法の効能の評価
薬剤開発プログラムは、被検者を用いる臨床治験を行う前に薬剤候補を評価するために、試験管内でのスクリーニング検定法とその後の適切な動物モデルでの試験に依存する。現在用いられているスクリーニング方法は、伝統的手段及びコンピュータによる手段により生成される無数の候補化合物を試験するために必要なハイスループットスクリーニングを用意するためにスケールアップすることが一般には困難である。さらに、細胞培養系と動物モデルの反応に関する研究は、ヒトの臨床治験の間に観察される反応と副作用を正確には予測しない。
【００１９】
さまざまな因子又は生理活性が試験管内及び生体のシステムの両方において生物材料に及ぼす影響を評価するための通常の方法は、感度が高いわけでも多くの情報を与えるわけでもない。例えば、薬剤のような生理学的な因子が培養下で増殖された細胞又は組織の集団に与える効果を評価することは、ある特定の時点のみにおける細胞又は組織の集団に前記因子が与える効果に関する情報を提供するのが常である。さらに、現在に評価技術は一般に単一又は少数のパラメーターに関する情報を提供する。候補試剤は、濃度との相関関係で決定される細胞毒性について系統的にテストされる。細胞集団が処理され、処理後の１つ又はいくつかの時点で細胞の生存率が計測される。一般的には、細胞毒性は細胞死の原因又は時間経過に関する情報は全く提供しない。
【００２０】
同様に因子は、例えば特定の代謝機能又は代謝産物に与える生理学的な効果にもとづいてしばしば評価される。ある因子が細胞集団又は組織試料に投与されて、関心のある代謝機能又は代謝産物が当該因子の影響を評価するために検定される。このタイプの検定法は有用な情報を提供するが、これは作用機序、他の代謝産物又は代謝機能への影響、生理学的効果の時間経過、一般的な細胞又は組織の健康状態等に関する情報は提供しない。
【００２１】
米国特許第５，９０２，７３２及び５，９７６，８２５号明細書は、培養グリア細胞を用いて、グリア細胞に浸透圧ショックを与えること、薬剤候補を導入すること、該薬剤候補がグリア細胞の膨張を抑制可能かどうか評価することにより、抗けいれん活性について薬剤候補化合物をスクリーニングするための方法を開示する。この特許はまた、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導可能な増感因子と浸透圧ストレスを与える因子とをＣＮＳ細胞に加えること、前記薬剤候補を加えること、前記薬剤候補が細胞膨張を抑制可能かどうか評価することにより、アルツハイマー病の徴候を防止又は治療するためあるいは虚血の結果起こるＣＮＳ損傷を防止するための活性について薬剤候補化合物をスクリーニングするための方法をも開示する。高分子の組織インプラントの内部の生細胞の寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）を計測すること、該細胞に浸透圧でショックを与えること、細胞膨張の変化を評価することを伴う、高分子組織インプラントの内部の生細胞の生存能力と健康状態を決定するための方法も開示される。細胞膨張活性の評価は内在性光学信号を光学的な検出システムを用いて計測することにより達成される。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の選択された治療用組成物及び方法は、発作、発作性障害、てんかん重積状態を含むてんかん、片頭痛、皮質拡延性抑制、頭蓋内高血圧、精神神経疾患及び中枢神経系水腫を含む中枢神経系の容態の治療のために有用である。本発明の選択された治療用組成物と方法は、エタノールとある種の感染因子のような神経毒性因子の病態生理学的な効果を治療しその効果から保護するため及び頭部外傷、卒中、虚血及び低酸素症の病態生理学的な効果を治療するためにも適している。別の実施態様によると、本発明の治療試剤と方法は、認知、学習及び記憶の皮質中枢のようなある種の皮質組織の機能を改善する。さらに、本発明の治療試剤と方法は、末梢神経系の痛みに伴うインパルスの伝導に影響を与え又は改変することにより、痛みを治療するためにも有用である。本発明の治療用組成物と方法はエピソードごとにあるいは予防的に使用でき、ヒト及び獣医学への応用の両方に適している。
【００２３】
本発明の方法と組成物は、非シナプス的機序により、より明確には、ニューロン集団活動の同期化を改変することにより、中枢及び末梢神経系のさまざまな容態の治療することに関与する。好ましい実施態様によると、ニューロン集団活動の同期化は中枢及び／又は末梢神経系のアニオン濃度と勾配を改変することにより操作される。イオン依存性共輸送体アンタゴニストは適切な治療用組成物であり、アニオン共輸送体アンタゴニストは好ましい治療用組成物であり。カチオン−塩素共輸送体アンタゴニストは特に好ましい治療用組成物である。１の実施態様によれば、Ｎａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−塩素共輸送体アンタゴニストは、ニューロン集団活動の同期化を改変するための特に好ましい治療用試剤である。アニオン共輸送体アンタゴニストは、発作、てんかん及びてんかん重積状態、皮質拡延性抑制及び片頭痛、頭蓋内高血圧、精神神経疾患、中枢神経系水腫の治療のような状態を治療するためと、エタノールとある種の感染因子のような神経毒性因子の病態生理学的な影響を治療しその影響から保護するためと、痛みの知覚の減少のためとに有用である。例えば認知、学習及び記憶に関連する皮質領域の機能を改善するために、塩素共輸送体アゴニストは好ましい治療用試剤であり、カチオン−塩素共輸送体アゴニストは特に好ましい治療用試剤である。イオン依存性共輸送体アゴニスト及びアンタゴニスト活性及びさまざまな容態と障害を治療する効能について候補化合物をスクリーニングするための方法も提供される。
【００２４】
「非シナプス的」機序を用いる本発明の方法と化合物への言及は、神経伝達物質の放出又は活性あるいは抑制物質の放出又は活性のようなニューロン興奮性に関連する機序は本発明の方法と試剤によって影響を受けないということを意味する。同様に、イオンチャンネル及び受容体は本発明の方法と組成物によって直接影響を受けることはない。むしろ、本発明の方法と治療用試剤はニューロン集団活動の同期化又は相対的同期性に影響を与える。本発明の好ましい方法と治療用試剤は、ニューロンの興奮性に影響を与えることなく、中枢又は末梢神経系での細胞外アニオン塩素の濃度及び／又は勾配を改変する。
【００２５】
本発明の１つの局面は、発作その他の中枢神経系の病態生理学的な状態に関連したニューロン集団活動の過同期化を減少又は除去することによりニューロンの放電の同期化を改変するための治療用試剤と方法に関する。１の実施態様では、前記治療用組成物は中枢神経系内の細胞外空間でのアニオン濃度、好ましくは塩素濃度を改変可能である。好ましい実施態様では、治療用試剤は塩素共輸送体アンタゴニストである。別の好ましい実施態様では、治療用試剤はカチオン塩素共輸送体アンタゴニストであり、特に好ましい実施態様では、治療用試剤はグリア細胞Ｎａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体アンタゴニストである。さらに別の好ましい実施態様によれば、治療用試剤はグリア細胞において高レベルのカチオン−塩素共輸送体アンタゴニスト活性を有し、ニューロンと腎臓細胞において低レベルのイオン依存性共輸送体活性を有する。好ましい中枢神経系の治療用試剤は血液脳関門を通過でき、あるいは中枢神経系への試剤の送達を促進する送達システムを用いて投与されることが好ましい。
【００２６】
一般には、フロセミド、ブメタニド（ｂｕｍｅｔａｎｉｄｅ）、エタクリン酸（ｅｔｈａｃｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ）等のようなループ利尿薬は、イオン依存性共輸送体アンタゴニスト活性を示し、本発明の治療用組成物として用いるのに適している。かかるループ利尿薬は細胞外アニオン塩素濃度とイオン勾配の所望の改変を起こし、ニューロン集団活動の同期化の改変を起こすが、これらはまた他の望ましくない効果も起こす。例えばフロセミドはグリアとニューロン細胞の両方とともに腎臓においてもカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストとして作用する。イオン依存性共輸送体アンタゴニスト活性を示す特に好ましい本発明の治療用試剤は、グリア細胞集団では高い活性を示すがニューロンと腎臓の細胞集団ではより低い活性を示す。
【００２７】
てんかん重積状態の治療法は、他の治療用試剤とともに、イオン依存性共輸送体アンタゴニストを、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを投与することを伴う。フロセミドその他のループ利尿薬は適切なカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストである。実験的研究は、フロセミド処理はニューロン集団活動の同期化の一時的で早い増大とその後に続くてんかん発作様の活動に特徴的な過同期化の持続的で完全な中断を起こすことを示した。本発明によると、てんかん重積状態の治療はイオン依存性共輸送体アンタゴニストを、好ましくはフロセミドのようなカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを、フロセミドの投与により観察されるニューロン集団活動の一時的で早い増大に関連する症状を治療することができる、バルビツレートのような他の試剤とともに投与することを伴う。
【００２８】
発作及び発作性障害、てんかん、片頭痛、皮質拡延性抑制、頭蓋内高血圧、精神神経疾患のため及び神経毒性因子、頭部外傷、卒中、虚血及び低酸素症の病態生理学的な影響を治療しこれらの影響から保護するための方法と治療用組成物は、好ましくは中枢神経系内のイオン勾配の改変によりニューロン集団活動の同期化を改変することを伴う。イオン依存性共輸送体アンタゴニストは好ましい治療用組成物であり、カチオン−塩素共輸送体アンタゴニストは特に好ましい治療用組成物である。前記イオン依存性共輸送体アンタゴニスト治療用組成物が例えばグリア細胞に関しては活性を有するがニューロン細胞に関してはより低い活性を有するか全く活性を有しない場合は、それは単独投与に適する。前記イオン依存性共輸送体アンタゴニスト治療用組成物がニューロンに関して他のタイプの細胞とともに活性を有する場合は、それは通常の抗てんかん薬又は抗けいれん薬のような他の試剤とともに投与されることが好ましい。
【００２９】
本発明の別の局面は、末梢神経系のある種の神経繊維における活動電位の伝播又はインパルスの伝導に影響を与え又は改変することによる痛み又は痛みの知覚の緩和のための方法と試剤に関する。より明確には、イオン依存性共輸送体への作用により、末梢神経系の細胞におけるイオン濃度とイオン勾配変化が痛みの知覚又は感覚を減少する。末梢神経系に送達されたイオン依存性共輸送体アンタゴニストと、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストが痛みの減少のための好ましい治療用組成物である。
【００３０】
さらに別の本発明の局面は、中枢神経系の認知、学習及び記憶中枢の機能を増強するための方法と試剤に関する。ニューロン集団活動の増強された同期化は中枢神経系皮質の認知能力、学習及び記憶機能に関連した中枢での機能を改善する。認知、学習及び記憶機能を増強するための本発明の治療用組成物と方法は、好ましくは同期化とタイミングの同調を増強することにより、ニューロン集団活動の同期化とタイミングを改変することを伴う。１の実施態様によると、同期化の増強は、脳内の細胞外アニオン塩素濃度とイオン勾配を改変できる試剤を投与することにより達成される。イオン依存性共輸送体アゴニストは好ましい治療用試剤であり、カチオン−塩素共輸送体アゴニストは特に好ましい治療用試剤である。イオン依存性共輸送体アゴニスト活性について候補組成物をスクリーニングするための方法も提供される。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法とシステムは、細胞、組織、細胞下の構成要素及び個体全体を含む生物学的材料の生理状態を評価するための光学的な、あるいは分光学的な技術を用いる。前記生物学的材料はヒト、動物又は植物由来のものであってもよく、いかなるかかる材料由来であってもよい。生理学的なチャレンジ又はテスト用試剤の投与に対する反応として生じる前記生物学的材料の幾何学的構造及び／又は内在性光学的特性の静的及び動的な変化は、前記生物学的材料の生理状態及び健康状態の変化を表示し予言する。
【００３２】
（１）直径、体積、立体的な位置関係（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、個々の細胞の細胞内空間又は個々の細胞の周囲の細胞外空間の幾何学的変化と、（２）光散乱、反射、吸収、屈折、回折、複屈折、屈折率、Ｋｅｒｒ効果等のような、個々の細胞あるいは細胞集団の１以上の内在性光学的特性の変化という、２つの異なるクラスの動的現象が光学的な検出技術を用いて生きたままの生物学的材料で観察される。両方のクラスの現象とも、コントラスト増強剤の助けを借りてあるいは借りずに、静的又は動的に観察できる。幾何学的な変化は、直接的に個々の細胞の幾何学的な特性を測定する（又は近似値を求める）ことにより、あるいは間接的に細胞の光学的特性の変化を観察することにより評価できる。個々の細胞又は細胞集団の光学的特性の変化は本発明のシステムを用いて直接的に評価できる。
【００３３】
個々の細胞又は細胞集団の幾何学的及び／又は内在性光学的特性の観察と解釈は、試験管内と生体内のシステムの両方ともにおいて、固定剤のような生理学的に侵襲する材料を適用することにより試料の特性を変更することなく達成される。生体染色色素のような生理学的に非侵襲的なコントラスト増強剤は所望の応用において光学的検出技術の感度を上げるために用いてもよい。コントラスト増強剤を用いる応用では、光学的検出技術は生物学的材料の外在性光学的特性を評価するのに用いられる。
【００３４】
個々の細胞又は試料細胞集団の幾何学的及び／又は内在性光学的特性の検出と解析は、個々の細胞又は試料細胞集団の生理状態の分類を可能にする情報を提供する。試料細胞集団の幾何学的及び／又は光学的特性の解析にもとづいて、前記試料は、生存可能か生存不可能か、アポトーシス状態、壊死状態、増殖中、活動、抑制、同期化又はこれらに類する状態、あるいはさまざまな生理状態のいずれかであって、その全てが明瞭な幾何学的及び／又は光学的プロフィールを生じる状態として分類できる。したがって本発明の方法とシステムは試料集団の生理状態の同定とさまざまな生理状態の鑑別のために提供される。
【００３５】
本発明の方法とシステムの重要な応用は、さまざまなテスト用試剤とテスト用条件に曝露することの効果を評価するために細胞集団をスクリーニングすることに関する。さまざまなテスト用試剤と条件の効果は正常及び病理的な試料集団にもとづいて評価できる。安全性及び細胞毒性テストは、試料集団をテスト用試剤又はテスト用条件に曝露すること、該テスト用試剤又はテスト用条件の投与後の１以上の時点で光学的技術を用いて該試料集団の生理状態を評価することにより行われる。かかる試験はテスト用試剤又は条件が所望の標的試料集団にいかなる効果を与えるかを決定するため、そしてテスト用試剤又は条件が該テスト用試剤又は条件の標的でない試料集団に生理的な副作用を起こすかどうかを予測するため、さまざまな試料集団について行われる。
【００３６】
好ましい実施態様によると、テスト用試剤又は条件の投与前に生物学的材料に病理的状態がシミュレーションされて、その病的状態又は問題のある（ｃｏｍｐｒｏｍｉｚｅｄ）状態を治療するために前記テスト用試剤又は条件がふさわしいかどうか評価する。細胞外浸透圧又はイオン濃度の変化、酸素又は栄養又は代謝産物の条件の変更、薬剤又は診断用又は治療用試剤、イオン恒常性の乱れ、電気的刺激、炎症、さまざまな因子の感染、放射線被曝等の生理学的なチャレンジに試料集団を曝露することは細胞又は組織レベルで病理的な状態をシミュレーションする。その後に前記試料集団にテスト用試剤又は条件を曝露すること、前記試料集団に幾何学的及び／又は光学的特性の変化を検出し解析することにより、該テスト用試剤又は条件により生じた前記試料集団の生理状態に関する情報が与えられる。スクリーニング技術は、ハイスループット用の自動化されたスクリーニングシステムを用意すべく適当な細胞培養条件下で試験管内で維持された、さまざまなタイプの細胞試料集団に使用するために改変されてもよい。代替策として、スクリーニング技術は、生理学的なチャレンジ及び／又はテスト用試剤の投与が動物モデルでの自然位での（ｉｎ ｓｉｔｕ）さまざまな細胞集団に与える効果を評価すべくさまざまな動物モデルを用いて細胞及び組織集団を調べるために改変されてもよい。さらに本発明のスクリーニング技術は、生理学的に非侵襲的であり分光学的技術を用いるため、患者の状態を評価し監視すべく、そして治療用試剤又は治療方式の効能を評価し監視すべく、ヒトの自然位での細胞及び組織集団を調べるために改変されてもよい。
【００３７】
個々の細胞又は細胞集団の幾何学的及び／又は光学的特性の変化は、特定の細胞タイプ、細胞密度及びさまざまな生理学的な状態について経験的に決定された基準との関連で決定され、あるいは直接比較するデータを提供するために前記テスト用試料と同時に並べて（ｉｎ ｔａｎｄｅｍ）適当な対照実験を行ってもよい。テスト用試剤又は条件が試料集団に与える効果の時間経過に関係するデータを提供するため、複数の時点でデータが収集され好ましくは記録される。適切な対照実験、さまざまな投与量、活性等をスクリーニングするための複数の試料を含むスクリーニングプロトコールを設計するための戦略は当業者に周知であり、本発明の方法とシステムとともに用いるために改変してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、ラット海馬スライス標本における放電活動後に誘発された刺激に対するフロセミドの効果を示す。
【図２】図２Ａ〜Ｒは、試験管内のモデルの自発的てんかん様バースト放電のフロセミドによるブロックを示す。
【図３】ウレタン麻酔されたラットにおけるカイニン酸により誘発された電気的な「てんかん重積状態」のフロセミドによるブロックを示し、上のトレースはＥＫＧ記録を示し、下のトレースは皮質のＥＥＧ記録を示す。
【図４】図４Ａ及びＢは、減少した塩素濃度条件下でのイオン共輸送の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の好ましい治療用試剤と方法は、発作その他の中枢神経系の病態生理学的な障害を治療するために、てんかん性焦点のような同期化が亢進した領域でのニューロン集団活動の同期性を改変し又は中断する。以下に詳細に説明され実施例に示されたように、イオン依存性共輸送体、好ましくはカチオン−塩素共輸送体によるイオンの移動とイオン勾配の変動はニューロンの同期化の調節にとって重要である。塩素共輸送体機能は長い間主に塩素を細胞外に移動することを目的とすると考えられてきた。ニューロンに局在することが示されてきたナトリウム非依存性輸送体は塩素イオンをニューロンの外に移動する。ループ利尿薬フロセミドの投与のようなこの輸送体のブロックは、フロセミドのようなカチオン−塩素共輸送体に対する短期的な反応である過興奮を起こす。しかし、フロセミドの長期的な反応は、グリア関連Ｎａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体を介した塩素イオンの細胞内へのナトリウム依存性移動が、興奮性と刺激喚起性細胞活動とに影響を与えることなくニューロン同期化と発作をブロックするうえで積極的な役割を果たすことを証明する。
【００４０】
１の実施態様によると、発作と、発作、発作性障害、てんかん重積状態を含むてんかん、片頭痛、皮質拡延性抑制、頭蓋内高血圧、精神神経疾患、中枢神経系水腫、アルコール曝露により誘導された毒性のような神経毒性、頭部外傷の病態生理学的な影響、卒中、虚血及び低酸素症、その他の中枢神経系内のイオンの平衡失調を原因あるいは結果とする状態又はニューロン集団の同期化した放電のようなある種の皮質の容態との治療のための本発明の組成物と方法は、イオン依存性共輸送体活性を改変する。発作性障害その他の皮質の状態を治療ための本発明の治療用試剤はイオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。好ましい実施態様によると、本発明の試剤と方法はグリア細胞のＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−塩素依存性共輸送体システムに優先的に作用し、ニューロン及び腎臓細胞のような他の細胞タイプの塩素依存性共輸送体システムには弱い活性を有する。
【００４１】
別の実施態様では、本発明の材料と方法は片頭痛とその前駆症状である皮質拡延性抑制（ＣＳＤ）を治療するために用いられる。拡延性抑制の間、間質の酸性化、細胞外カリウム蓄積及びナトリウムと塩素イオンの細胞内コンパートメントへの再分布を含む重大な混乱が発生する。さらに、細胞外液イオン組成の変化及び間質の神経伝達物質と脂肪酸の蓄積に対する恒常性反応として、持続的なグリアの膨張が起こる。本発明の材料と方法は塩素依存性共輸送体を介する塩素イオンの細胞内へのナトリウム依存性移動をブロックすることによりＣＳＤの発生と持続を抑制する。片頭痛と皮質拡延性抑制を治療するための本発明の治療用組成物はカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。好ましい実施態様によると、片頭痛と皮質拡延性抑制を治療ための本発明の試剤と方法はグリア細胞のＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−塩素依存性共輸送体システムに優先的に作用し他の細胞タイプ、特にニューロンと腎臓細胞の塩素依存性共輸送体システムには弱い活性を有する。
【００４２】
さらに別の本発明の局面はさまざまな化学的及び生物学的因子といくつかの感染因子による神経毒性の治療に関する。本発明の組成物と方法は急性エタノール摂取の神経変性的効果を減らすうえで特に有効である。さらに、本発明の組成物は例えば急性エタノール摂取による神経毒性の効果から皮質組織を保護するために予防的に投与されてもよい。治療のため又は神経毒性の効果から保護すべく予防的投与のための本発明の治療用組成物はイオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。好ましい実施態様によると、片頭痛と皮質拡延性抑制を治療するための本発明の試剤と方法は、グリア細胞のＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−塩素依存性共輸送体システムに優先的に作用し、他の細胞タイプ、特にニューロンと腎臓細胞の塩素依存性共輸送体システムには弱い活性を有する。
【００４３】
さらに別の実施態様によると、本発明の組成物と方法は痛みの知覚と感覚を軽減するために用いることもできる。この実施態様において、本発明の組成物と方法は末梢神経系の無髄性繊維の活動電位の伝播を改変し、これにより痛みの知覚と感覚を軽減する。痛みを治療し又は痛みから保護するために予防的に投与するための本発明の試剤は、末梢神経系において細胞外イオン濃度及び／又はイオン勾配を改変するイオン依存性塩素共輸送体アンタゴニストを含み、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。好ましい実施態様によると、痛みを治療する本発明の組成物は優先的にグリア細胞又はシュワン細胞のカチオン−塩素共輸送体システムに優先的に作用し、ニューロンと腎臓細胞のような他の細胞タイプの塩素依存性共輸送体システムには弱い活性を有する。
【００４４】
さらにべつの実施態様では、本発明の材料と方法は認知、学習及び記憶のようなある種の皮質機能を増強するための用いることもできる。この応用のためには、本発明の組成物と方法はニューロン集団活動の同期化を中断するというよりもむしろ改変し増強する。認知、学習及び記憶のような皮質機能を増強するための本発明の組成物はイオン依存性共輸送体アゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。
【００４５】
本発明の組成物はヒト及び獣医学的応用に適しており、薬事的な組成物として送達されることが好ましい。薬事的な組成物は１以上の治療用試剤と生理学的に容認できる担体を含む。本発明の薬事的な組成物は生物学的に活性又は不活性な他の組成物をも含んでもよい。例えば、塩素共輸送体アゴニスト又はアンタゴニストのクラスからの１以上の組成物が別の試剤との併用治療として組み合わせることもでき、本発明の治療方式に従って投与できる。かかる併用は分離した組成物として投与してもよく、相補的な送達システムで送達するために組み合わされてもよく、あるいは混合物又は融合化合物のように組合せられた組成物として処方通り調製され（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）てもよい。
【００４６】
当業者に周知のいかなる適当な担体でも本発明の薬事的な組成物に用いることができるが、好ましい担体は好ましい投与モードに依存する。本発明の組成物は、例えば局部的、口、鼻、直腸、静脈内、頭蓋内、腰椎穿刺、腹腔内、経皮的、皮下又は筋肉内投与を含む、いかなる適当な投与モード用の処方に合わせてでも調製できる。皮下注射のような非経口的投与用には、担体は水、生理食塩水、グリセリン、プロピレングリコール、アルコール、脂肪、ロウ及び／又は緩衝液を含むのが好ましい。経口投与用には、上記のいずれかの担体又はマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、ケイ酸塩、ポリエチレングリコール、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、色素及び炭酸マグネシウムのような固体の担体が用いられる。直腸投与用には、水性ゲル剤又は他の当業者に周知の適当な処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を投与できる。固体の組成物も軟らかい及び堅い充填されたゼラチンカプセルの充填剤として用いることができる。これに好ましい材料は、ラクトース又は乳糖（ｍｉｌｄ ｓｕｇａｒ）及び高分子量ポリエチレングリコールを含む。水溶液又はエリキシルが経口投与用に望ましいときは、本質的な活性成分はさまざまな甘味料又は香料、着色剤又は色素、そして所望なら、乳状化剤又は沈殿防止剤を、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン及びこれらの組合せのような希釈液とともに併用することができる。
【００４７】
治療用組成物の全身への分布を減らす局部的脳内投与は浸透圧ポンプのような機械化された送達システムにより灌流することによりあるいは脳内の限局された領域に一定の時間経過にわたり治療用組成物の制御された拡散を提供するために非反応性の担体に取り込まれた治療用組成物の一投与量を埋め込むことにより提供される。他のタイプの長期間にわたって放出する（ｔｉｍｅ ｒｅｌｅａｓｅ）処方も要件を満たす。さらに、注射、浸透圧ポンプ又はその他の手段による脳脊髄液への直接投与もある種の応用には好ましい。
【００４８】
ここに説明した組成物は持続的放出処方の一部として投与できる。一般的にはかかる処方は周知の技術を用いて調製され、例えば経口、直腸、経皮送達システム又は処方又は治療装置の１以上の所望の標的部位への埋め込みにより投与される。持続放出処方は、イオン依存性共輸送体アゴニスト又はアンタゴニストを単独で含むか第２の治療用試剤と組み合わせて含み、担体マトリクスに分散され及び／又は放出速度制御膜に囲まれた貯蔵庫に収容された、治療用組成物を含むものであってもよい。かかる処方とともに用いられる担体は生物適合性を有し生分解性もあるものでもよい。１の実施態様によると、前記持続的放出処方は活性組成物の放出が比較的一定レベルに保たれる。別の実施態様によると、前記持続的放出処方は、例えばある種の症状の立ち上がりと同時に、治療用組成物の前もって決められた投与量を送達するために、患者本人又は医療関係者によって作動させることができる装置に収容されている。持続的放出処方に収容された治療用組成物の量は埋め込まれた部位、放出速度と予想持続時間及び治療又は防止される状態の性質に依存する。
【００４９】
発作、発作性障害、てんかん、てんかん重積状態、片頭痛、拡延性抑制、その他のニューロン集団活動の同期化により特徴づけられる容態と、頭蓋内高血圧、中枢神経系水腫、神経毒性等の皮質障害又は容態の治療のための本発明の組成物は、中枢神経系に前記治療用組成物が送達されるのを促進する処方と投与経路を用いて投与されるのが好ましい。イオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストのような治療用組成物は血液脳関門の通過を促進するように処方され、あるいは血液脳関門を通過する試剤とともに共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）されるのがよい。治療用組成物は、血液脳関門を通過する例えばリポソーム処方で送達されてもよく、あるいは血液脳関門を通過する例えばブラジキニン、ブラジキニン類似体又は誘導体、又はＳＥＲＡＰＯＲＴのような他の化合物のような他の化合物とともに共投与されてもよい。代替策として、本発明の治療用組成物は循環する脳脊髄液中に直接前記治療用組成物を入れる脊髄穿刺を用いて送達されてもよい。慢性てんかんと、エピソード的発作と、拡延性抑制及び片頭痛のエピソードの間のようないくつかの治療状態については、血液脳関門の一時的又は永続的な破壊があるかもしれないので、前記治療用組成物が血液脳関門を通過するための特別な処方を不要である。
【００５０】
ここに開示された治療用組成物の投与の経路と頻度は、投与量とともに、適応症により、個人個人で異なり、標準的な技術を用いて容易に確定できる。一般的には、適切な投与量と治療方式は治療及び／又は予防療法の便益を生じるために十分な量の活性の組成物を提供する。投与量と治療方式は治療を受けていない患者と比較した治療を受けた患者の臨床的な転帰の改善を監視することにより確立できる。適切な投与量は上記の通り投与されたときに患者に治療の反応が見られる組成物の量をいう。治療上有効な投与量と治療方式は治療を受ける患者の容態、状態の重篤度及び一般状態に依存する。本発明の治療用組成物の薬物動力学及び薬力学は患者によって異なるため、ある患者について治療上有効な投与量を決定するための好ましい方法は徐々に投与量を上げていき臨床的及び検査結果の兆候を監視することである。急性のエピソード的な状態、慢性状態又は予防法の治療のための適切な投与量と治療方式は前記患者の状態に適合させるため必然的に違ってくる。
【００５１】
代表的な治療方式においては、本発明の薬事的製剤は、単独で又は任意的に第２の試剤との併用で投与される。発作とてんかんのような発作関連障害の併用治療においては、イオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む本発明の治療用組成物は１以上の抗けいれん薬又は抗てんかん薬との併用で中枢神経系に前記治療用組成物を送達する送達システムを用いて投与される。しばしば前記第２の試剤の投与量は、前記イオン依存性共輸送体アンタゴニストの神経生理学的な活性の結果として、標準的な投与量以下となることがある。イオン依存性アンタゴニストを含む対象組成物と併用される第２の試剤の例示は、フェニトイン、カルバマゼピン、バルビツレート、フェノバルビタール、ペントバルビタール（ｐｅｎｔｂａｒｂｉｔａｌ）、メフォバルビタール（ｍｅｐｈｏｂａｒｂｉｔａｌ）、トリメタジオン（ｔｒｉｍｅｔｈａｄｉｏｎｅ）、メフェニトイン（ｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）、パラメタジオン（ｐａｒａｍｅｔｈａｄｉｏｎｅ）、フェンテニレート（ｐｈｅｎｔｈｅｎｙｌａｔｅ）、フェナセミド、メタルビタール（ｍｅｔｈａｒｂｉｔａｌ）、ベンズクロロプロパンミド（ｂｅｎｚｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｎｍｉｄｅ）、フェンスクシミド（ｐｈｅｎｓｕｘｉｍｉｄｅ）、プリミドン（ｐｒｉｍｉｄｏｎｅ）、メトスクシミド（ｍｅｔｈｓｕｘｉｍｉｄｅ）、エトトイン（ｅｔｈｏｔｏｉｎ）、アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ジアゼパム（ｄｉａｚｅｐａｍ）、クロナゼパム（ｃｌｏｎａｚｅｐａｍ）、クロラゼパート（ｃｌｏｒａｚｅｐａｔｅ）、フォスフェニトイン（ｆｏｓｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）、エトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、バルポレート（ｖａｌｐｏｒａｔｅ）、フェルバマート（ｆｅｌｂａｍａｔｅ）、ガバペンチン（ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ）、ラモトリジン（ｌａｍｏｔｒｉｇｉｎｅ）、トピラマート（ｔｏｐｉｒａｍａｔｅ）、ビグラバトリン（ｖｉｇｒａｂａｔｒｉｎ）、チアガビン（ｔｉａｇａｂｉｎｅ）、ゾニサミド（ｚｏｎｉｓａｍｉｄｅ）、クロバザム（ｃｌｏｂａｚａｍ）、チオペンタール（ｔｈｉｏｐｅｎｔａｌ）、ミダゾプラム（ｍｉｄａｚｏｐｌａｍ）、プロポフォール（ｐｒｏｐｏｆｏｌ）、レベチラセタム（ｌｅｖｅｔｉｒａｃｅｔａｍ）、オキシカルバゼピン（ｏｘｃａｒｂａｚｅｐｉｎｅ）、ＣＣＰエン（ＣＣＰｅｎｅ）、ＧＹＫ１５２４６６及びスマトリプタンを含む。容易に理解できる通り、上記の化合物は適する併用治療の例に過ぎず、他の化合物又は同様のクラスの化合物も適する。
【００５２】
てんかん重積状態を治療するための１の好ましい実施態様において、イオン依存性共輸送体アンタゴニスト活性、好ましくはフロセミド又は他のループ利尿薬のようなカチオン−塩素共輸送体活性を有する本発明の治療用組成物はバルビツレートのような伝統的な抗発作薬と併用して投与される。この治療方式では、バルビツレート又は他の抗発作薬は、ニューロン集団活動の過興奮を減衰させ、発作の症状を治療するためにシナプス的機序で作用する。イオン依存性共輸送体アンタゴニストは、発作活動の領域でのニューロン集団活動の過同期化を減衰するために非シナプス的機序で作用する。この治療用組成物の組合せは緊急事態ごとにてんかん重積状態の治療のために投与でき、中枢神経系に治療用組成物を送達するさまざまな送達技術を用いて投与できる。したがって、本発明は１以上のイオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくは１以上のカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを、例えばフェニトイン、カルバマゼピン、バルビツレート、フェノバルビタール、ペントバルビタール、メフォバルビタール、トリメタジオン、メフェニトイン、パラメタジオン、フェンテニレート、フェナセミド、メタルビタール、ベンズクロロプロパンミド、フェンスクシミド、プリミドン、メトスクシミド、エトトイン、アミノグルテチミド、ジアゼパム、クロナゼパム、クロラゼパート、フォスフェニトイン、エトスクシミド、バルポレート、フェルバマート、ガバペンチン、ラモトリジン、トピラマート、ビグラバトリン、チアガビン、ゾニサミド、クロバザム、チオペンタール、ミダゾプラム、プロポフォール、レベチラセタム、オキシカルバゼピン、ＣＣＰエン（ＣＣＰｅｎｅ）、ＧＹＫ１５２４６６及びスマトリプタンのうち１つから選択された１以上の伝統的な抗発作薬と併用して投与することを伴う治療方式を意図する。本発明は１以上の塩素共輸送体アンタゴニストを１以上の抗けいれん薬又は抗発作薬とともに含む組合せも意図する。１の実施態様によると、前記組合せは２時間以下の期間過興奮を減らすのに十分な前もって選択された投与量の１以上の抗けいれん薬又は抗発作薬を、２時間以上の期間ニューロン集団活動の過同期化を減らすのに十分な前もって選択された投与量の１以上のアニオン依存性共輸送体アンタゴニストとともに含む。
【００５３】
好ましい実施態様によると、本発明は前もって選択された投与量のフロセミド又は他のイオン依存性共輸送体アンタゴニストとバルビツレートとの組合せを有する容器を意図する。「容器」という用語は、その中に前もって選択された投与量の本発明の併用試剤を格納した、小箱（ｐａｃｋｅｔ）、瓶（ｊａｒ）、薬瓶（ｖｉａｌ）、ボトル（ｂｏｔｔｌｅ）及びその他の固体又は微粒子送達システムにおける治療用組成物のための容器を、注射器及びその他の袋（ｂａｇ）、薬瓶、ボトル等のような液体格納手段とともに意図する。前記組合せは、組合せの各々の組成物が別々に包装され投与されるか、あるいは組成物が同時に投与するための混合剤として包装され投与されてもよい。本発明は前もって選択された投与量のイオン依存性共輸送体アンタゴニストと抗けいれん薬又は抗てんかん薬との組合せを有する１以上の容器を設置した、病院、診療所、移動式ユニット（ｍｏｂｉｌｅ ｕｎｉｔ）等の救命用又は外科用スイート（ｓｕｉｔｅ）も意図する。
【００５４】
片頭痛と皮質拡延性抑制の治療のための本発明の治療用組成物は、任意的に１以上の他の治療用組成物と組み合わせた、イオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。前記イオン依存性共輸送体アンタゴニストは他の治療方式と一緒に又は関連してか、例えば違う時間に又は違う送達技術を使って別々にかのいずれかで、投与されてもよい。イオン依存性共輸送体アンタゴニストの投与と併用されるときは、しばしば片頭痛又は拡延性抑制の通常の治療用組成物の投与量は標準的な投与量以下に減らされる。したがって本発明は、例えば、エルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン、スマトリプタン、プロプラノロール、（ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ）、アテノロール（ａｔｅｎｏｌｏｌ）、チモロール（ｔｉｍｏｌｏｌ）、ナドロール（ｎａｄｏｌｏｌ）、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｄｉｐｉｎｅ）、ニモジピン（ｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅ）ベラパミル、（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、アスピリン（ａｓｐｉｒｉｎ）、ケトプロフェン（ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、トフェナム酸（ｔｏｆｅｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、（ｍｅｆｅｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ナプロキセン（ｎａｐｒｏｘｅｎ）、メチセルギド（ｍｅｔｈｙｓｅｒｇｉｄｅ）、パラセタモール（ｐａｒａｃｅｔａｍｏｌ）、クロニジン（ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ）、リスリド（ｌｉｓｕｒｉｄｅ）、イプラゾクロム（ｉｐｒａｚｏｃｈｒｏｍｅ）、ブタルビタール（ｂｕｔａｌｂｉｔａｌ）、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）及びジバルルロエックスナトリウム（ｄｉｖａｌｐｒｏｅｘ ｓｏｄｉｕｍ）のうちの１つのセロトニン受容体アゴニストから選択された１以上の伝統的な片頭痛又は拡延性抑制の薬とともに１以上のイオン依存性共輸送体アンタゴニストを併用する投与を伴う治療方式を意図する。容易に理解できる通り、以上の化合物は適する併用治療の例に過ぎず、他の化合物又は同様のクラスの化合物は等しく適する。
【００５５】
頭蓋内高血圧、神経精神性疾患、中枢神経系水腫の治療のためと、エタノール、感染因子等のような神経毒性因子への曝露の結果起こる神経毒性を治療し又は神経毒性から保護するための、本発明の治療用組成物はイオン依存性共輸送体アンタゴニストを含む。前記治療用組成物は、任意的に１以上の他の治療用組成物と併用して投与されてもよい。イオン依存性共輸送体アンタゴニスト組成物の中枢神経系への送達を提供する送達システムが好ましい。
【００５６】
痛みを減らすための本発明の治療用組成物は、１以上の他の治療用組成物と任意的に併用したイオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。かかる治療用組成物は、血液脳関門を通過する能力がなく、末梢神経系のみに循環することが好ましい。前記イオン依存性共輸送体アンタゴニスト組成物の末梢神経系への送達を提供する送達システムが好ましい。
【００５７】
認知、学習及び記憶中枢のような領域での皮質機能を増強するための本発明の治療用組成物は、１以上の他の治療用組成物と任意的に併用したイオン依存性共輸送体アゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アゴニストを含む。適する送達システムは、優先的には中枢神経系への、より優先的には認知、学習及び／又は記憶の局在した皮質中枢への、前記イオン依存性共輸送体アゴニスト治療用組成物の送達を提供する。
【００５８】
本発明の方法とシステムは、さまざまな障害と状態の診断と治療のための候補化合物と治療方式を評価するためにも用いられる。所望のイオン依存性共輸送体アゴニスト又はアンタゴニスト活性を有する可能性のある候補化合物を生成するためのさまざまな技術が用いられる。候補化合物は、フロセミド、ブメタニド、エタクリン酸等と関連化合物を含むループ利尿薬のような既知のイオン依存性共輸送体アンタゴニストから出発して、所望の活性と特異性を与えることが期待されるやり方でこれらの化合物を改変する周知のコンビナトリアルケミストリー又は分子モデリング技術を用いて生成できる。同様に候補となる塩素共輸送体アゴニスト化合物は、既知のイオン依存性共輸送体アゴニストと関連化合物から出発してこれらの化合物を所望の活性と特異性を与えるようなやり方で改変する周知のコンビナトリアルケミストリー又は分子モデリング技術を用いて生成できる。所望の活性について候補化合物をスクリーニングするための方法は以下に説明する。
【００５９】
１の実施態様によると、本発明の方法とシステムは、個々の細胞又は細胞試料の１以上の寸法についての特性を表すデータを取得し比較する。光学的特性に関するデータの取得、処理及び解析のための技術は既知であり、例えば米国特許明細書第５，４３８，９８９号、第５，４６５，７１８号、第５，８４５，６３９号、第５，６９９，７９８号、第５，９０２，７３２号及び第５，９７６，８２５号に説明されており、これらのそれぞれはここにその全体が引用により取り込まれている。個々の細胞の寸法についての特性に関するデータの取得は以下に説明する。寸法についての特性に関するデータの取得と解析は光学的特性に関して説明されたものと同一又は類似の方法及び装置を用いて達成できる。
【００６０】
細胞密度の低い細胞試料においては、細胞面積は単一焦点面を用いて近似できる。体積を計算したいときは、ｚ軸（焦点）も自動的に調整できる。例えば、自動化され制御されたステージが移動するにつれて、各々の画像が前もって決定された焦点面で取得されて、複数の空間的に分析された関心のある面積についての一連のデータセットが取得できるように、試料集団が入った光学的に透明な容器は位置決めされる。それぞれのｚ平面の体積は近似され（以下のアルゴリズムを参照せよ）、各ｚ座標についての体積が加算される。
【００６１】
Ｄｏｕｇｈｔｙ、Ｓ．による“回転固体の解析学的特性（Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｆｏｒ ｓｏｌｉｄｓ ｏｆ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）”、Ｍａｃｈｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ、１９８１年１２月１０日、１８４−１８６頁にもとづく細胞面積と体積を近似するための一般的な技術が以下に説明されている。これらの技術はグリーンの定理にもとづく。
【００６２】
【数１】
【００６３】
個々の細胞は適当な拡大装置を用いて調べられる。細胞境界のエッジ検出は例えばソーベルオペレータを用いて達成された。前記境界は「ｎ」個の線分の複数の線分に「ｎ」個の節で内接することにより近似させる。境界の積分は以下の通り「ｎ」個の線積分として見られる。
【００６４】
【数２】
【００６５】
３つの場合がある。
第１の場合： 垂直線、ｘ＝一定
第２の場合： 水平線、ｙ＝一定
第３の場合： 斜線、ｙ＝５ｉ（ｘ−ｘｉ）＋ｙｉ
面積はしたがって、
【００６６】
【数３】
【００６７】
グリーンの定理を適用するために、積分はδＱ／δｘ−δＰ／δｙの形式で考慮され、適切な関数、例えばＰ（ｘ，ｙ）とＱ（ｘ，ｙ）が与えられる。面積積分については、Ｑ（ｘ，ｙ）＝０であれば∫Ｑｄｙ＝０、Ｐ＝−ｙとすると、δＰ／δｙ＝−１となる。すると、面積は以下の通り計算できる。
【００６８】
【数４】
【００６９】
体積計算のためには、例えばソーベルオペレータを用いる通常のエッジ検出が、複数（ｎ個）の個々の平面切片に分割される個々の細胞を通して焦点を当てるのに用いることができる。前記「ｎ」個の切片のそれぞれの体積はΔＶｉ；＝Δｚｉ； ・ ΔＡ；と計算され、細胞全体の体積はＶ＝ΣΔＶｉと近似できる。細胞面積と体積の決定と比較はコンピュータハードウェア及び／又はソフトウェアの実行により達成されるのが好ましい。
【００７０】
別の実施態様によると、本発明の方法とシステムは細胞試料集団における個々の細胞又は関心のある領域の１以上の光学的特性を表すデータを取得し比較する。生理活性を表示し検出できる光学的特性の変化は、例えば反射、屈折、回折、吸収、散乱、複屈折、屈折率、Ｋｅｒｒ効果等を含む。光学的特性の変化は光子感受性素子と、任意的には検出された光学的特性を増強する光学素子とを用いて直接的に検出される。
【００７１】
ここに引用により取り込まれた米国特許明細書に明示された通り、本発明の方法と装置によると、生理活性を表示する動的な幾何学的及び光学的特性の高解像度検出は色素又はその他のタイプのコントラスト増強剤を用いないで達成できる。本発明の評価技術と装置の多くは、幾何学的及び／又は内在性光学的情報の検出と解析が、色素、油、装置等のいかなる因子とも関心のある領域が直接接触することを要しないという点で、生理学的に非侵襲的である。しかし、特定の応用にとっては、生理活性と関連して検出される光学的特性の相違を増幅するコントラスト増強剤を、その後のデータ取得と比較の前に投与することは有用であるかもしれない。コントラスト増強剤の使用は、ここに引用によりその全体を取り込まれた米国特許明細書第５，４６５，７１８号及び第５，４３８，９８９号に腫瘍及び非腫瘍組織の光学的画像化に関して詳細に説明されている。適当なコントラスト増強剤は蛍光及び燐光物質、細胞膜に結合する色素、血液又は細胞間空間に優先的に蓄積する光学プローブ、相共鳴色素対（ｐｈａｓｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｄｙｅ ｐａｉｒｓ）等を含む。かかるコントラスト増強剤とともに用いるために適切な検出器は当業者に周知である。
【００７２】
培養下の細胞試料集団あるいは動物モデル又はヒト被検材料の自然位での関心のある領域の１以上の幾何学的及び／又は光学的特性を表すデータを取得し、処理し及び表示するための数多くの装置が用いられる。１の好ましい装置は、生理活性又は機能不全を示す幾何学的及び／又は光学的特性の変化の領域を同定するために比較できる前もって決定された時間間隔で、１以上の関心のある領域の画像を取得するカメラである。前記データ取得装置は顕微鏡のように関心のある領域を拡大する装置を取り込むか、かかる装置と接続して使用することが好ましい。個々の細胞が識別できる解像度を提供するのに十分な倍率が好ましい。ニコンＤｉｏｐｈｏｔ３００のような倒立顕微鏡が適している。
【００７３】
培養条件下で維持された細胞試料集団を用いるハイスループットスクリーニング技術のためには、フラスコ、プレート、マルチウェルプレートのような光学的に透明な容器に入った試料は、プログラム化されたスケジュールに従って個々の細胞又は細胞集団の定期的検査を可能にするために、プログラム化された手法で制御され移動される自動化されたステージの上に置かれる。例えば、複数の細胞試料を有するマルチウェルプレートは自動化され制御可能な顕微鏡ステージに置かれる。該ステージは、自動的に各々の培養ウェルの位置に移動するように、自動化されたマイクロコントローラーにより制御される。個々の細胞又は細胞集団の幾何学的及び／又は光学的特性に関するデータセットはそれぞれのポジションごとに取得される。このようにして、システムは迅速かつ系統的に多くの試料に関するデータを取得できる。選択されたウェルの生理環境は、生理学的なチャレンジ、試験因子又は試験条件に曝露することにより変更でき、システムはそれぞれの培養プレートの同じウェルからのデータを処理後前もって決定された時間間隔で自動的に取得でき、さまざまな処理を施されたウェルから取得されたデータはさまざまな対照実験ウェルから取得されたデータ又は経験的に決定された対照と比較される。
【００７４】
１以上の幾何学的及び／又は光学的特性を表すデータの取得は、特定の空間的な場所に関する幾何学的又は光学的データが比較のためさまざまな時間間隔で取得されるように、高い空間分解能も提供することが好ましい。このやり方では、単一細胞又は細胞試料集団の中の関心のある非常に限局された領域から取得されたデータは、前記試料集団の生理状態又は条件に関する信頼でき非常に感度の高い情報を提供するために比較される。高い空間分解能は、例えば高解像度カメラと電荷結合デバイス（ＣＣＤｓ）を使用することにより提供される。かかる画像を得るために適した装置はここに引用により取り込まれた前記特許に説明されている。
【００７５】
さまざまなデータ処理技術は、本発明の通りに収集されたデータを評価するために都合良く利用できる。比較用データはさまざまな形式で評価又は提示されてもよい。処理は、対照用の、逐次的な、そしてさまざまな比較用のデータセットを作成するために複数のデータセットを平均化すること、あるいはその逆に、組み合わせることを含む。データは、処理のためアナログからデジタル形式に変換され、画像として表示するためのアナログ形式に再変換されてもよい。代替策としては、データは取得され、処理され、解析され、そしてデジタル形式で出力されてもよい。
【００７６】
データ処理は、データセット比較において見られるコントラストを増強するため、及び幾何学的及び／又は光学的特性の変化が進行する細胞又は細胞集団を高度の空間分解能で同定するためのある種の信号又はデータセット（例えば画像の領域）の増幅をも含む。例えば、１の実施態様によると、画像はより広いダイナミックレンジをカバーするように画像のピクセルの明度の値が再度マッピングされる変換を用いて処理される。ある「低い」値が選択されてゼロにマップされ、その低い値以下の全てのピクセル明度値はゼロに設定され、ある「高い」値が選択されて選択された値にマップされ、その高い値以上の全てのピクセル明度値はその高い値にマップされる。ニューロン活動を示す明度の動的な変動を表す中間の明度値を有するピクセルは直線的又は対数曲線的に増加する明度値にマップされる。このタイプの処理操作はしばしば「ヒストグラム伸縮」と呼ばれ、ニューロン活動の変動を表す画像のようなデータセットのコントラストを増強するために本発明の通り用いられる。
【００７７】
データ処理技術はより正確な組み合わされた及び比較のデータを用意すべくデータセットを操作するためにも用いられる。例えば、生体内での応用については、動作、呼吸、心拍、発作又は反射活動がデータ取得中に関心のある領域の位置を変えることがある。正確な組合せで比較されたデータを提供するためにはデータセットにおける対応するデータポイントが空間的に分析されて正確に並べられることが重要である。光学的マーカーは、データセットを手作業で並べるか又は数学的に操作するのを補助するために、関心のある領域に固定されてそのデータが収集されるときに検出される。さまざまな処理技術は以下及び引用によりここに取り込まれた特許に説明される。
【００７８】
比較データはさまざまな方法で表示される。比較用データは、例えば生理学的な変化を示す幾何学的又は光学的特性を強調するグラフ形式で表示されてもよい。比較用データを提示し表示するための好ましい技術は、空間的な分解能のある関心のある領域に対応する視覚的な画像又は写真のフレームの形式のものである。この形式は解析される細胞集団の（２ないし３次元の）視覚化可能な空間的な位置を提供する。生理活性又は機能不全をあらわす幾何学的及び／又は光学的特性の変化を示すコントラストの高い領域のより良い視覚化を増強し提供するために、比較用データは処理されてコントラストの増強されたグレースケール又はカラーの画像を提供する。例えばそれぞれのピクセルのグレースケールの値を異なる（よりコントラストの高い）グレースケール値又はカラー値に変換する参照表（ｌｏｏｋ ｕｐ ｔａｂｌｅ、ＬＵＴ）が用意される。カラー値はグレースケール値の範囲にマップされ又はカラーが幾何学的又は光学的な陽性への変化と陰性への変化との間を区別するために用いられる。一般に、カラー変換された画像は生理活性、機能又は機能不全を表す光学的特性の変化を強調するコントラストのより高い画像を提供する。
【００７９】
本発明のシステムは生物学的材料を照らすための光源と、該生物学的材料の幾何学的又は光学的特性に関するデータを取得するための光学的検出器と、該生物学的材料の幾何学的又は光学的特性に関するデータを記録しさまざまなデータセット及び／又は対照実験のデータプロフィールを比較して試料集団の生理状態の変化を表す幾何学的及び／又は光学的特性の変化に関する比較用データを作成し有用な形式で出力データを提供又は表示するためのデータ記録解析出力装置とを含むのが一般的である。
【００８０】
関心のある領域の細胞又は組織の１以上の寸法の又は内在性光学的特性を表すデータの取得の間に関心のある領域を照らすためにｅｍｒ光源が用いられる。ｅｍｒ光源は、光学的に透明な容器に維持された試験管内の細胞培養に照明を当てるとき又は外科手術と関係ある場合のように組織が露出しているときのように関心のある領域に直接照明を当てるのに用いることができ、あるいは骨、硬膜、皮膚、筋肉等のような隣接し又は被覆した組織を通して間接的に関心のある領域に照明を当てるのに用いることができる。本発明に用いるｅｍｒ光源は、高照度の光源でも低照度の光源でもよく、連続照明を提供するものでも不連続照明を提供するものでもよい。適切な光源は、高照度の光源、スペクトルが広い光源、無色度の（ｎｏｎ−ｃｈｒｏｍａｔｉｃ）光源、タングステン−ハロゲンランプ、レーザー、発光ダイオード等を含む。選択された波長以上又は以下の全ての波長を選択的に透過させるためのカットオフフィルターを用いてもよい。好ましいカットオフフィルターは約６９５ｎｍ以下の全ての波長を除外する。
【００８１】
内在性光学信号に関するデータを取得するためのｅｍｒ波長は、例えば約４５０ｎｍから約２５００ｎｍを含むのが好ましく、約７００ｎｍから約２５００ｎｍの近赤外スペクトルの波長が最も好ましい。より長波長（例えば約８００ｎｍ）が、細胞又は組織の下にあるあるいは皮膚、骨、硬膜等のような他の材料の下にある細胞又は組織の状態を検出するために用いられることが一般的である。皮質活動。選択されたｅｍｒの波長は例えばさまざまなタイプのコントラスト増強剤が投与されたときにも用いることができる。前記ｅｍｒ光源はいかなる適当な手段で関心のある領域を照射してもよい。一部の応用では、光ファイバーの利用が好ましい。１の好ましい配置は直流制御された電源（Ｌａｍｂｄａ、Ｉｎｃ社）で制御されたビーム分割器を用いて光ファイバーの撚り糸を通してｅｍｒ光源を提供する。
【００８２】
本発明の光学的検出方法には非連続的な照明及び検出の技術も有用である。例えば、短パルス（時間領域）、パルスドタイム及び振幅変調（周波数領域）光源が適当な検出器とともに用いられることもある（Ｙｏｄｈ、 Ａ．とＣｈａｎｃｅ、 Ｂ．、Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｔｏｄａｙ、１９９５年３月参照）。周波数領域光源は、それぞれの素子は隣の素子に対して１８０°位相がずれて変調されたレーザーダイオードのような複数の光源素子のアレイを含むのが典型的である（Ｃｈａｎｃｅ、 Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：３４２３−３４２７、１９９３参照）。直交する２つの平面の４個以上の素子を含む２次元アレイは２次元の局在情報を得るために用いることができる。かかる技術は引用によりここにその全体を取り込んだ米国特許明細書第４，９７２，３３１号と第５，１８７，６７２号に説明される。
【００８３】
飛行時間と吸収の技術（Ｂｅｎａｒｏｎ、 Ｄ．Ａ．とＳｔｅｖｅｎｓｏｎ、 Ｄ．Ｋ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１４６３−１４６６、１９９３）も本発明に有用に利用できる。さらに別の本発明の実施態様では、スキャニングレーザービームが光増幅管のような適当な検出器とともに好ましくは関心のある領域の形態の高解像度のデータ画像を得るために用いられる。
【００８４】
赤外スペクトルの一部による照明は、関心のある領域に隣接し又は被覆する硬膜と頭蓋骨のような組織を通した、内在性光学的信号の検出を可能にする。関心のある領域を被覆し又は隣接する組織を通して内在的な光学的信号を検出するのに適した１の例示的な赤外ｅｍｒ光源はフロリダ州ＯｒｌａｎｄｏのＬａｓｅｒ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社からのＴｕｎａｂｌｅ ＩＲ Ｄｉｏｄｅ Ｌａｓｅｒである。遠赤外波長のこの範囲を用いるときは光学的検出器は赤外（ＩＲ）検出器として提供されることが好ましい。ＩＲ検出器はヒ化インジウム、ゲルマニウム及び水銀テルル化カドミウムのような材料から構築され、赤外放射の小さな変化に対する感受性を増強するために一般的には低温に冷却される。本発明に有用に利用できるＩＲ検出システムの１つの例はＩＲＣ−６４赤外カメラ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社、オハイオ州Ｍａｓｏｎ）である。
【００８５】
関心のある領域は、以下に説明する通り、信号をダイナミックレンジの全域にわたるように調整するために均一に照明されることが好ましい。照明の不均一さは光源のゆらぎと組織表面の３次元的性質からくる照度の変化が原因であることが一般的である。関心のある領域へのより均一な照明は、例えば拡散照明すること、光学的検出器及び／又はｅｍｒ光源の前に波長カットオフフィルターをマウントすることあるいはこれらの組合せを用いることにより提供できる。光源自体のゆらぎは光源の電源を調節するための光フィードバック機構により防止するのが好ましい。さらに、より平らな外形の表面を検出するために無菌で光学的に透明な板を関心のある領域に接触して覆うこともできる。照明のゆらぎは、関心のある領域に対照ポイントとして一定の陰影の灰色の画像マーカーポイントを置くことを含む検出処理アルゴリズムを用いて補正できる。
【００８６】
前記システムは、関心のある領域の１以上の光学的特性を表す信号を取得するための光学的検出器も含む。いかなる光子検出器でも光学的検出器として用いることができる。適切な光学的検出器は例えばフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＣＤ装置に提供されるような光子感受性シリコン検出器チップ等を含む。複数のｅｍｒ光源及び／又は複数の光子検出器が提供されてもよく、いかなる適当な配置で並べられてもよい。選択された光学的特性を検出するための特別な検出器が用いられてもよい。アナログビデオ信号の形式でデータを取得するための１の好ましい光学的検出器は、例えば標準的なＲＳ１７０規格を用いるフレームあたり５１２本の走査線を有する出力ビデオ信号を３０Ｈｚで作成するＣＣＤビデオカメラである。１の適当な装置はＣＣＤ−７２ソリッドステートカメラ（Ｄａｇｅ−ＭＴＩ Ｉｎｃ．、インディアナ州、Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｃｉｔｙ）である。別の適当な装置は、ＣＯＨＵ ６５００電子制御ボックス付きＣＯＨＵ６５１０ ＣＣＤモノクロカメラ（ＣＯＨＵ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓカリフォルニア州、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）である。一部のカメラでは、前記アナログ信号はＡＤＩ基板（アナログからデジタルへの変換）上で８ビットデジタル信号に変換される。前記ＣＣＤは、必要な場合には熱雑音を減らすために冷却される。
【００８７】
データ処理は、本発明の光学的な検出と解析の技術とシステムの重要な特徴である。使用に際して、例えばＣＣＤ装置は、装置の感度を最大化するために、（アナログ信号のレベルでデジタル化前に）前記信号を増幅し、該信号を可能な全ダイナミックレンジに拡散する（ｓｐｒｅａｄ）ように調節されることが好ましい。全ダイナミックレンジにわたる感度で光学的信号を検出する具体的な方法は、ここに引用により取り込まれた特許に詳細に説明されている。差分フレームのヒストグラム伸縮を実行するための手段（例えば、ヒストグラム／フィーチャーエキストラクターＨＦ １５１-１-Ｖモデュール、Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州、Ｗｏｂｕｒｎ）が、例えば、それぞれの差分画像をそのダイナミックレンジにわてって増強するために提供される。例示的な線形ヒストグラム伸縮はＧｒｅｅｎ、「デジタル画像処理：系統的アプローチ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ： Ａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３年に説明されている。ヒストグラム伸縮は、最も明るいピクセル又は比較画像中の最高値のピクセルをとって、それを最大値に割り当てる。最低のピクセル値は最小値に割り当てられ、その間の他の全ての値は最大値と最小値の間の線形の値（線形ヒストグラム伸縮の場合）又は対数の値（対数ヒストグラム伸縮の場合）を割り当てられる。これは比較画像が全ダイナミックレンジを利用してニューロン活動又は不活動の領域を明確に同定するコントラストの高い画像を提供することを可能にする。
【００８８】
（交流電灯線からの６０Ｈｚのような）雑音は、アナログフィルターにより制御ボックス内で除去される。追加的な調整が、ＣＣＤ検出器からのアナログ信号をさらに増強し、増幅し及び条件付ける。入力アナログ信号を調整するための１つの手段は、ビデオ速度（３０Ｈｚ）でこの信号をデジタル化し、その後アナログ形式に再変換されるデジタル化画像として関心のある領域を視覚化することである。
【００８９】
特定の関心のある領域に対応する逐次的なデータセットのようなデータは、同一の空間的に分析された場所に対応するデータが比較されるように、並べられることが重要である。データセットが比較の前に誤って並べられた場合には、アーチファクトが導入され、結果として生じる比較用データセットは雑音及びエッジ情報を増幅することがある。データを誤って並べることは試料の運動又は動作、心拍、呼吸等によって起こる。解析される関心のある領域の細胞の大きな運動は、前記検出器の新たな方向定位を必要とする。関心のある領域の細胞の小さな運動を、機械的又はコンピュータによる手段あるいはその両方の組合せによって補正することは可能である。
【００９０】
リアルタイムの動作の補正と幾何学的な変換も対応するデータを並べるために用いられる。データの単純な機械的翻訳又はより複雑な（そして一般的にはより正確な）幾何学的変換技術は、入力データの収集の速度と量及びデータ処理のタイプに依存して実施される。多くのタイプの画像データについては、ｘ−ｙ平面の翻訳により画像を変換する幾何学的な補正により補正可能である。これを可能にするようなアルゴリズムのためには、コンピューターとして効率的で（整数演算が実行可能であることが好ましい）、記憶効率が良く、そして周囲の光の変化に対して強い（ｒｏｂｕｓｔ）ものでなければならない。
【００９１】
例えば、機能的な対照点又は数が関心のある領域に位置づけられ、三角法タイプのアルゴリズムがこれらの対照点の運動を補正するのに用いられる。Ｇｏｓｈｔａｓｂｙ（「画像の位置決めのための部分毎の線形マッピング関数（Ｐｉｅｃｅｗｉｓｅ Ｌｉｎｅａｒ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ１９：４５９−６６、１９８６）は、画像が対照点を用いて三角形の部域に分割される方法を説明する。それぞれの三角形の部域ごとに別々の幾何学的変換が施されてそれぞれの対照点が対応する対照画像の三角形の部域に位置決めされる。
【００９２】
「画像ワーピング（ｉｍａｇｅ ｗａｒｐｉｎｇ）」技術は、運動を補正するためそれぞれの引き続く画像が平均化された対照画像に幾何学的に位置決めされることにより実施される。（例えば、Ｗｏｌｂｅｒｇ、「デジタル画像ワーピング（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｗａｒｐｉｎｇ）」ＩＥＥＥ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｌｏｓ Ａｌａｍｉｔｏｓ、１９９０に説明された）画像ワーピング技術が用いられれもよい。画像ワーピング技術は、有効な補正のためには運動が大きすぎて新たな平均化された対照画像が取得されなければならない時を示すこともできる。
【００９３】
データ記録処理と解析の機能は一般的にはホストコンピューターにより実行され制御される。前記ホストコンピューターは、前記ｅｍｒ光源及び／又は光学的検出器とインターフェースをとり、データの取得と流入、比較演算、解析、出力等を制御する、（Ｉｎｔｅｌ３８６、４８６、Ｐｅｎｔｉｕｍ又は同様のマイクロプロセッサ又はＳｕｎ ＳＰＡＲＣのような）いかなる一般的なコンピューターをも含む。したがって、前記ホストコンピューターはデータの取得と解析を制御しユーザーインターフェースを提供する。
【００９４】
前記ホストコンピューターは、バスの帯域幅の考慮次第で、ＶＭＥ６４インターフェース又は標準的な（ＩＥＥＥ１０１４−１９８７）ＶＭＥインターフェースを有する単一基板の組み込み式コンピューターを含むものでもよい。本発明に用いられてもよいホストコンピューター基板は、例えばＦｏｒｃｅ社ＳＰＡＲＣ／ＣＰＵ−２Ｅ及びＨＰ９０００モデル７４７１を含む。ユーザーインターフェースは、例えばＵｎｉｘ／Ｘ−Ｗｉｎｄｏｗ環境でよい。画像処理基板は、外科手術中に見るための高品質差分画像を作成するために必要な、リアルタイム画像平均化、位置決めその他の処理を提供する、例えばＴｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＭＶＰその他のチップにもとづくものでよい。この基板は、腫瘍組織を強調するため疑似カラーマッピングで差分画像の時間的配列を示すために１２０ｘ１０２４ＲＧＢディスプレイも駆動する。前記ホストコンピューターが全体としてのスクリーンの表示面積（ｒｅａｌ ｅｓｔａｔｅ）を増加させユーザーインターフェースを円滑にするために第２のモニターが用いられるのが好ましい。（完全にプログラム可能な）プロセシング基板は、他の基板とのデータのやりとりを制御するためにＶＭＥマスターインターフェースをサポートできる。最後に、周辺制御基板は、前記ホストコンピューターから機械的インターフェースを制御するために電気的なインターフェースを提供することができる。かかる機械的インターフェースは例えば光源と光学的検出器制御ボックスを含むことができる。
【００９５】
リアルタイムデータ取得及び表示システムは、例えば取得、画像処理、周辺制御及びホストコンピューター用の４枚の基板を含むものでもよい。縮小された処理能力の最小限の構成は、取得とホストコンピューター基板だけを含む。前記取得基板は、入ってくるビデオフレームのリアルタイムでの平均化を行い、平均化されたフレームの最大バス速度での読み出しを可能にする回路を含む。ＶＭＥバスは、ピーク帯域幅が高く多数の既存のＶＭＥ製品との互換性があるために好ましい。前記取得基板は、可変スキャンインターフェースを介して多くの異なるタイプの光学的検出器をもサポートすべきである。ドーターボードは、多くの異なるタイプの光学的検出器のインターフェース面のニーズをサポートし、可変スキャン信号を取得マザーボードに供給する。前記ユニットは、広範囲のカメラをサポートするためにＲＳ−１７０Ａビデオ信号とインターフェースをとるドーターボードを含むことが好ましい。より高い空間／コントラスト解像度及び／又はより良い信号雑音比を有する低速走査カメラのような他のカメラタイプを開発し、かかる改良カメラに適合するように改良されたドーターボードとともに本発明の装置に取り込むことができる。
【００９６】
例えばアナログビデオ信号として取得された試料集団の寸法及び／又は内在性光学的特性に関するデータは、例えば画像解析器（例えばシリーズ１５１Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、Ｗｏｂｕｒｎ）を用いて連続的に処理される。画像解析器はアナログビデオ信号を受け取りアナログからデジタルへの変換インターフェースでデジタル化し、約３０分の１秒のフレーム速度（例えば３０Ｈｚ又は「ビデオ速度」）で実行する。信号の処理は、まずそのピクセルに割り当てられた関心のある領域の部分からの組織で反射された光子の数（例えばｅｍｒの数量）に依存する（二進法での）数値を割り当てられた一連のピクセル又は小さな正方形に前記信号をデジタル化することを伴う。例えば、ＣＣＤカメラからの標準的な５１２ｘ５１２画像では、画像当たり２６２，１４４個のピクセルがある。８ビットシステムでは、それぞれのピクセルは灰色の２５６個の階調レベルの１つに対応する８ビットで表される。
【００９７】
前記信号処理器は、白黒画像を表す灰色のコード化されたピクセル値をカラーのコード化された値にそれぞれの灰色でコード化された値の強度にもとづいて変換するための値で初期化されたプログラム化可能な参照表（例えばＣＭ１５０−ＬＵＴ１６、Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州、Ｗｏｂｕｒｎ）を含んでもよい。画像伸縮技術を用いて、デジタル化された画像フレーム中のそれぞれのピクセルを表す最高及び最低のピクセル強度値が、伸縮される画像フレームの部域にわたって決定される。選択された部域をより大きな数値範囲に伸縮することは、例えば雑音由来の比較的高い偽性の数値のより容易な同定と除去を可能にする。
【００９８】
前記信号処理器の手段は、前記Ａ／Ｄインターフェースから受け取ったデジタル化画像データのフレームを記録するためのフレーム記録領域を有する複数のフレームバッファも含む。前記フレーム記録領域は少なくとも１メガバイトのメモリスペースで、好ましくは少なくとも８メガバイトの記録スペースを含む。追加の１６ビットフレーム記録領域が、８ビット以上で表されたピクセル強度を有する処理された画像フレームを記録する累算器として提供される。前記処理器手段は、１つは前記平均化された対照画像の記録用、もう１つは逐次画像の記録用、３番目は比較画像の記録用の、少なくとも３つのフレームバッファを含むのが好ましい。
【００９９】
前記信号処理器は、１以上のフレームバッファに位置づけられたデータに算術及び論理関数を実行するための（例えばＡＬＵ−１５０パイプラインプロセッサ）算術演算装置も含む。ＡＬＵは例えば、リアルタイムでの画像（データ）平均化を提供する。新規に取得されたデジタル化画像は直接前記ＡＬＵに送られてフレームバッファに記録された対照画像と組合せられる。１６ビットの結果は、この結果をある定数（つまり全画像数）で割るＡＬＵを通して処理される。該ＡＬＵからの出力はフレームバッファに記録されても、さらに処理されても、又は入力として用いられて別の画像と組み合わされてもよい。
【０１００】
正常では、生理活性が増大した領域は、細胞試料又は組織のｅｍｒ吸収能力の増加を示す（つまり、可視光がｅｍｒ照射に用いられる場合には細胞試料が暗くなり、表された内在性信号は正の方向に増加する）。同様に、生理活性の減少は組織のｅｍｒ吸収能力の減少に一般的には対応する（つまり、該組織はより明るく見え、又は内在性信号は負になる）。例えば、データセットＡは次の平均化された画像でデータセットＢは平均化された対照画像である。正常では、データセットＡのピクセルがデータセットＢのピクセルから引き算されて負の数値になったときは、この数値はゼロとして処理される。ゆえに、差分画像は抑制領域を説明できない。本発明は、（ａ）データセットＡ（次の平均化された画像）をデータセットＢ（平均化された対照画像）から引き算して全ての負のピクセル値がゼロである第１の差分データセットを作ること、（ｂ）データセットＢをデータセットＡから引き算してすべての負のピクセル値がゼロとなる第２の差分データセットをつくることにより負と正の内在的信号の両方を同定するため及び第１と第２の差分画像データセットを加えて「和差分データセット」をつくるための方法を提供する。該和差分データセットは活性が増大した（つまり、黄、オレンジ、赤のような暖色でカラーコード化された）領域を示し、活性が減少又は抑制された（つまり、緑、青、紫のような寒色でカラーコード化された）画像領域として可視化することも可能である。代替的には、第１の差分データセットを第２の差分データセットに重ねることができる。差分出力は画像として可視化でき、チャレンジ、刺激、パラダイム等に対する反応としての内在的信号が存在する場所を指示するためにカラーコード化された差分フレームでスーパーインポーズされた関心のある領域（例えば皮質表面）の画像を提供するために、リアルタイムのアナログ画像にスーパーインポーズされる。
【０１０１】
前記の比較（例えば差分）データは、さらにデータを平滑化して高周波雑音を除去するために処理される。ローパス空間フィルタは、ダイナミックレンジのいずれかの端の高周波雑音を除去するために高空間周波及び／又は低空間周波を遮断する。これは平滑化処理された差分データセットを（デジタル形式で）提供する。前記デジタル処理された差分データセットは、画像として提供でき、色スペクトルを異なるグレーの陰影に割り当てることにより、カラーコード化される。この画像はアナログ画像に（ＡＤＩ基板により）再変換され、平均化された対照画像とその次の画像の間の差分をリアルタイム可視化のために表示される。さらに前記処理された差分画像は、コントラスト増強剤（ａ ｃｏｎｔｒａｃｔ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）が早く取り込まれるか内在性信号がある特定の組織部位を表示するために、前記アナログ画像にスーパーインポーズできる。
【０１０２】
処理速度はリアルタイムモデュラープロセッサ又はより高速のＣＰＵチップを前記画像プロセッサに追加することにより増強できる。本発明に用いることのできるリアルタイムモデュラープロセッサの１つの例は、１５０ＲＴＭＰ−１５０リアルタイムモデュラープロセッサ（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、マサチューセッツ州、Ｗｏｂｕｒｎ）である。前記プロセッサはさらに、デジタルデータ記録用光ディスク、前記デジタル及び／又はアナログデータのハードコピー提供用のプリンタ及びユーザが連続的に前記比較用データ出力を監視できるようにするためのビデオモニタのような表示装置を含んでもよい。
【０１０３】
本発明によると単一のシャーシが、画像形式のような容易に解釈できる形式で光学的検出と解析を提供するのに必要な全てのモデュールを格納することもできる。どの程度統合されているかにかかわらず、必要な構成要素は、表示用モニタと周辺入出力装置とともに容易に運搬可能なラックに取り付けられてもよい。
【０１０４】
ＰｅｎｔａＭＡＸ ５７６ｘ３８４ＦＴ ＬＣＤシステム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージ州）を含む好ましい高解像度高性能システムはチップ上でデータをデジタル化し大きなダイナミックレンジと軽減された雑音を提供する。このシステムはＰＣＩバスを用いてウィンドウズＮＴを走らせたデュアル４００ＭＨｚＰｅｎｔｉｕｍ ＰＣにインターフェースをとられてもよい。画像解析アルゴリズムはＭｉｃｒｏｓｏｆｔビジュアルＣ＋＋バージョン５．０コンパイラを用いてＣ言語で書かれてもよい。さらに迅速なオンライン処理のためには、前記データは前記ＰＣコンピュータに常設された専用画像化ハードウェアに配送されてもよい。例えばＩＭ−ＰＣＩハードウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．社製、マサチューセッツ州、Ｂｅｄｆｏｒｄ）が使用できる。１つのかかる構成は、ＩＭ−ＰＣＩ、ＡＭＶＳ及びＣＭＡＬＵのＩＭ−ＰＣＩ基板とモデュールからなる。
【０１０５】
生体内の応用に用いられた前記画像化方法は関心のある領域の表面のデータを取得できる。引用によりここの取り込まれた特許に説明された通り、長波長ｅｍｒ（赤外領域）が深部の組織又は被覆組織の下にある関心のある領域を画像化するために用いられる。体内の一部の領域では、長波長可視光と近赤外ｅｍｒは容易にかかる画像化のための組織を透過できる。さらに、差分画像が、５００ｎｍのｅｍｒで取得された画像と７００ｎｍのｅｍｒで取得された画像のように、２つの異なる照射波長で取得された画像の間で作成される場合には、差分画像は組織の光学的スライスを表す。さらに、さらに、特定のｅｍｒ波長を吸収するコントラスト増強剤の投与は、関心のある領域のフィルタとして作用する。この場合には、持続的に組織に残留するコントラスト増強剤を用いることが望ましい。
【０１０６】
動物モデルの自然位の細胞集団又は組織培養モデルの細胞集団を評価するために適した簡単なシステムでは、本発明のシステムは、細胞又は組織を照射するｅｍｒ光源に動作可能に接続された１以上の光ファイバーと、照射された細胞又は組織の１以上の光学的特性を検出する、フォトダイオードのような光学的検出器に動作可能に接続された別の光ファイバーを含む。前記検出器は、試料集団の「正常」又は「バックグランド」の光学的特性を表す対照用データを取得するため及びテスト用試剤又はテスト用条件の投与中又は投与後の試料集団の光学的特性を表す逐次的データを取得するために用いられる。疾病又は病理的状態を刺激する生理学的なチャレンジ及び／又は刺激は治療用試剤又は治療条件の投与前に投与される。システムは、個々の細胞又は細胞集団の幾何学的及び／又は光学的特性を、経験的に決定された基準又は異なる時点で取得されたデータと比較するために十分な情報記録及び処理能力を有するデータ記録及び処理のシステムを含むかあるいはかかるシステムと通信している。
【０１０７】
動作中は、試験管内又は生体内の細胞試料が電磁放射（ｅｍｒ）で照射され、空間的に分析された関心のある領域の１以上の幾何学的及び／又は光学的特性を表す単一又は一連のデータポイント又はデータセットが、「正常な」生理活性の間隔の間中取得される。このデータは、これらの特定の生理条件下での特定の細胞試料についての対照又はバックグランドのデータプロフィールを表す。一連のデータセットは、例えば平均化により、対照用データプロフィールを取得するために組み合わせられるのが好ましい。前記対照用データプロフィールは他のデータセットとの比較用に記録される。同様に、特定の生理条件下での特定の細胞タイプについてのバックグランドデータプロフィールを表す対照用データセットが収集され記録されてもよい。
【０１０８】
同一の空間的に分析された関心のある領域での試料集団の対応する幾何学的及び／又は光学的特性を表すデータセットは、次の期間（ｔｉｍｅ ｐｅｒｉｏｄ）に取得される。監視用の応用については、データは、細胞試料の状態を監視し基線量のプロフィールからの異常を検出するために、定期的な時間間隔で収集される。スクリーニング用の応用については、例えばテスト用組成物の導入又はテスト用条件への曝露により誘発された、生理学的な活性化又は抑制の後の期間中１以上の逐次的なデータセットが収集される。生理学的な活性化又は抑制は、動物モデルでの発作又は卒中のように「自然な（ｎａｔｕｒａｌ）」出来事により誘発されることもあり、あるいは生理学的な活性化又は抑制を示す細胞試料の幾何学的及び／又は光学的特性の変化を刺激するために生体内又は試験管内の細胞試料にパラダイム又は因子を投与することによって誘発されることもある。監視間隔又は内在的生理反応の刺激期間中、前記関心のある領域の１以上の検出された幾何学的又は光学的特性を表す単一又は一連の逐次的データセットが取得される。一連の逐次的データセットは、逐次的なデータセットを取得するために例えば平均化により組み合わせられるのが好ましい。前記逐次的データセットは、比較用データセット、好ましくは差分データセットを取得するために対照用データセットと比較される。比較用データセットは、関心のある領域内での生理学的な活性化又は抑制を表す幾何学的及び／又は光学的特性の変化の証拠を求めて解析される。
【０１０９】
細胞集団は、薄い密度の懸濁液中の細胞、コンフルエントの単層細胞、その他の前もって決定された細胞密度の多層細胞又は組織スライス標本のような組織試料を含むものであってもよい。広範囲の細胞及び組織試料の細胞培養条件下で維持することは当業者に周知である。
【０１１０】
前記試料集団は顕微鏡のステージのような試料台の上の前もって決定された位置に置かれる。１つの例示的な組織試料は、浸漬下の灌流チャンバーに維持された急性ラット海馬スライス標本である。代替策としては、試料はフラスコ、マルチウェルプレート等で細胞培養培地中に維持された細胞試料であってもよい。マルチウェル組織培養プレートは、前もって決定された間隔で個々のウェルの細胞試料の位置決めをするための自動化ステージとともに併用して、ハイスループットスクリーニング用に使用できる。プログラム化できる自動化位置決め装置は当業者に周知である。
【０１１１】
（ＣＣＤカメラのような）光学的検出器は顕微鏡のカメラポートに接続される。１以上の対照期間と１以上のテスト用期間の間中、個々の細胞又は細胞試料中の関心のある領域の寸法及び／又は光学的特性に関するデータは取得、記録及び処理される。データの取得と処理は以下及び実施例に説明された通りに達成される。
【０１１２】
右上のグレースケール画像はＣＣＤカメラで見た組織スライス標本の未処理画像である。該組織スライス標本は、ニューロンとシナプスの活動の少しの増加を起こす低強度電気刺激及びニューロンとシナプスの活動のより大きな増加を起こす高強度電気刺激という２つの異なる強度で電気的に刺激される。
【０１１３】
疑似カラー画像は以下に説明する通りに生成される。簡潔には、前記電気刺激中に取得された画像は対照状態で取得された画像から引き算される。この画像はローパスフィルタを通し、ヒストグラム伸縮され、そして疑似カラー着色される。色は活性により喚起された光学的変化の強度を示すようにコード化される。
【０１１４】
上記に説明された通りに作成された画像に表された動的な光学的変化はグラフにプロットすることもできる。グラフ形式では、それぞれのデータポイントは疑似カラー画像に示した単位（ｕｎｉｔｅ）を通して光透過の平均化された変化を表す。時間間隔で分離された一連の画像は取得され平均化された値がそれぞれの画像について計算されグラフ上での点としてプロットされる。直線で示された場所で２秒間電気的に刺激された。小さなピークは第１の小さな電気刺激により誘導された最大の光学的変化を示し、大きい方のピークは第２のより大きな刺激からのものを示す。前記電気刺激は２秒後に停止され、組織は回復させられた。該回復のプロットは前記組織のイオン恒常性機構に特徴的である。この回復は例えば回復期間に最もうまく当てはまる対数曲線を見つけることにより、定量化できた。
【０１１５】
候補化合物は、培養下あるいは動物モデルで自然位の、グリア細胞、ニューロン細胞、腎臓細胞等のようなさまざまなタイプの細胞を本発明のスクリーニング方法を用いてカチオン−塩素共輸送体アゴニスト及び／又はアンタゴニスト活性についてスクリーニングされる。例えば塩素共輸送体アンタゴニスト活性を同定するためのスクリーニング技術は「正常」より高濃度のアニオン塩素濃度にすることにより、組織培養試料又は動物モデルでの自然位の細胞外空間のイオン平衡を変更することを伴う。この変更されたイオン平衡に置かれた細胞又は組織試料の幾何学的及び／又は光学的特性は決定され、候補試剤が投与される。前記候補化合物の投与後、対応する細胞又は組織試料の幾何学的及び／又は光学的特性が、前記イオン平衡失調がそのままかどうかあるいは前記細胞は細胞外及び細胞内空間のイオン平衡を変更することにより反応したかどうか決定するために監視される。前記イオン平衡失調がそのままである場合には、候補試剤は塩素共輸送体アンタゴニストの可能性がある。さまざまなタイプの細胞又は組織を用いてスクリーニングすることにより、高レベルのグリア細胞の塩素共輸送体アンタゴニスト活性を有しそれより低いレベルのニューロン細胞と腎臓細胞の塩素共輸送体アンタゴニスト活性を有する候補化合物が同定できる。同様に、異なるタイプの細胞と組織システムへの影響も評価できる。
【０１１６】
さらに、中枢及び末梢神経系のさまざまな状態を治療するための候補化合物の効能は、発作、中枢神経系水腫、エタノール神経毒性、皮質拡延性抑制等のような状態を組織試料又は動物モデルの自然位でシミュレーションするか誘発すること、容態のシミュレーション（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）中の細胞又は組織試料の幾何学的及び／又は光学的特性を監視すること、候補化合物を投与すること、前記候補化合物の投与後の細胞又は組織試料の幾何学的及び／又は光学的特性を監視すること、前記候補化合物の効果を決定するために細胞又は組織試料の幾何学的及び／又は光学的特性を比較することにより評価できる。同様に、動物又はヒト被検材料での治療用組成物の効能は本発明の光学的方法とシステムを用いて自然位で監視できる。
【０１１７】
本発明の治療用組成物と方法は上記に好ましい実施態様について説明されてきた。以下に明らかにする実施例は具体的な実験結果を説明するが、本発明をいかなる意味でも限定することを意図するものではない。
【０１１８】
（実施例１）
フロセミドの海馬スライス標本におけるてんかん発作様放電への影響
以下の研究では自発性てんかん発作様活動はさまざまな処理により誘発された。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（オス及びメス、２５ないし３５日齢）は断頭され、頭蓋頂は迅速に除去され、脳は氷冷酸素添加スライス標本培養液で冷やされた。スライス標本培養液は、２２０ｍＭスクロース、３ｍＭ ＫＣＩ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ デキストロース（２９５ないし３０５ｍＯｓｍ）からなるスクロースを基本とする人工脳脊髄液（ｓＡＣＳＦ）であった。海馬を含む脳半球はブロック状に切り出されＶｉｂｒｏｓｌｉｃｅｒ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｈａｅｒ社、メイン州、Ｂｒｕｎｓｉｃｋ）のステージに（シアノアクリレート系接着剤で）のり付けされた。厚さ４００μｍの水平断又は横断スライス標本が４°Ｃの酸素加（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）スライス標本培養液中で薄切された。前記スライス標本は直ちに、保持チャンバーに移され、その中で、２４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭデキストロース（２９５ないし３０５ｍＯｓｍ）からなる酸素加浴培養液（ＡＣＳＦ）中に浸漬された。前記スライス標本は浸漬型（ｓｕｂｍｅｒｓｉｏｎ−ｓｔｙｌｅ）記録チャンバーに移される前に少なくとも４５分間室温に保たれた（全ての他の実験）。前記記録チャンバー中で前記スライス標本は３４ないし３５°Ｃの酸素加された記録培養液で灌流された。全ての動物のケアはＮＩＨとワシントン大学の動物ケアガイドラインに従って実施された。
【０１１９】
大抵のスライス標本実験では、同時細胞外電場電極記録がＣＡ１及びＣＡ３領域から取られた。双極性タングステン刺激電極が、シナプス的に駆動されたＣＡ１での電場反応を喚起するためにシャファー側枝に置かれた。刺激は１００ないし３００マイクロ秒（ ｓｅｃ）持続パルスで集団スパイク閾値（ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｓｐｉｋｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）の４倍の強度からなった。後放電は６０Ｈｚで送達されたかかる刺激の２秒間の連続により喚起された。自発性発作間様バーストは、前記浴培養液を、１０ｍＭ カリウム（動物４匹、スライス標本６枚、平均−８１バースト／秒）、２００−３００μＭ（ Ｍ）４−アミノピリジン（４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）（動物２匹、スライス標本４枚、平均−３３バースト／秒）、５０−１００μＭ（ Ｍ）ビククリン（ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ）（動物３匹、スライス標本４枚、平均−１４バースト／秒）、Ｍ Ｍｇ＋＋（灌流１時間、動物２匹、スライス標本３枚、平均−２０バースト／秒、又は灌流３時間、動物２匹、スライス標本２枚）、ゼロカルシウム／６ｍＭ ＫＣＩ及び２ｍＭ ＥＧＴＡ（動物３匹、スライス標本４枚）により改変又は追加することにより処理されたスライス標本で観察された。全ての処理において、一旦持続的なバースト発生レベルが確立されたときは、記録用培養液にフロセミドが添加された。
【０１２０】
これらの手順の最初として、後放電のエピソードはシャファー側枝の電気刺激で喚起され（Ｓｔａｓｈｅｆｆら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３４４：２９６、１９８５）、ＣＡ１錐体細胞領域において細胞外電場反応が監視された（動物８匹、スライス標本１３枚）。前記浴培養液中のＭｇ＋＋濃度は０．９ｍＭに減少され、後放電は６０Ｈｚ、２秒間、集団スパイク閾値の４倍の強度での刺激で喚起された（集団スパイク閾値強度は持続時間１００ないし３００マイクロ秒で２０ないし１５０μＡの間で変わった）。前記組織は刺激試行と試行の間１０分間回復させた。それぞれの実験では、ＣＡ１のシナプス入力への初期応答が、単一刺激パルスにより喚起された電場電位を記録することにより、最初に試験された。対照条件では、シャファー側枝刺激は単一の集団スパイクを喚起した（図１Ａ、差し込み図）。放電後約３０秒で喚起されたテタヌス様刺激（図１Ａ、左）は内在性信号の大きな変化を伴っていた（図１Ａ、右）。
【０１２１】
内在性光学的信号の画像化のためには、前記組織は正立顕微鏡のステージの上に位置決めされた灌流チャンバー内に置かれ、前記顕微鏡のコンデンサーを通して導かれた白色光（タングステンフィラメント光及びレンズシステム、Ｄｅｄｏ Ｉｎｃ．）のビームで照射された。光はゆらぎを最小にするために、制御され調節され（電源、Ｌａｍｄａ Ｉｎｃ．）、前記スライス標本が長波長（赤色）で透過照明されるように、フィルター（６９５ｎｍロングパス）を通された。視野と倍率は顕微鏡対物レンズ（スライス標本全体を監視するためには４ｘ）の選択で決定された。画像フレームは電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ（Ｄａｇｅ ＭＴＩ Ｉｎｃ）を３０Ｈｚでもちいて取得され、カメラ制御ボックスとＡ／Ｄ基板のゲインとオフセットがシステムの感度を最適化するように調整されたＩｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．社製シリーズ１５１画像化システムを用いて８ビット、空間分解能５１２ｘ４８０ピクセルでデジタル化された。画像化ハードウェアは４８６−ＰＣ互換コンピューターにより制御された。信号／雑音比を増大させるために、平均化された画像は、０．５秒にわたって積分され一体として平均化された１６枚の個別の画像フレームから作成された。実験系列は、一連の平均化された画像の数分間にわたる時間の連続的取得を典型的には伴い、刺激前に対照画像として、少なくとも１０枚のこれらの平均化された画像が取得された。疑似カラー化画像は、最初の対照画像を逐次的に取得された画像から引き算すること及びカラー参照表を前記ピクセル値に割り当てることにより演算された。これらの画像のために、通常は、線形ローパスフィルターが高周波雑音を除去するのに用いられ、線形ヒストグラム伸縮がピクセル値をシステムのダイナミックレンジにわたってマップするために用いられた。これらの画像についての全ての操作は、定量的な情報が保存されるように線形であった。雑音はある取得シリーズの中の対照画像の系列のＡＲ／Ｒのゆらぎの最大標準偏差として定義されたが、ここでＡＲ／Ｒは組織を透過する光の変化の振幅を表す。デルタＲ／Ｒは、全ての差分画像をとり最初の対照画像で割り算をすることにより（逐次画像−最初の対照画像）／最初の対照画像として計算された。雑音はそれぞれの選ばれた画像系列についていつでも０．０１以下であった。組織を透過する光の絶対的な変化は、カメラと光源の間にニューロン密度フィルターを置いた後に画像を取得することにより、一部の実験の際に推定された。平均して、カメラ電子装置と画像化システム電子装置は、組織透過光のピークの絶対変化が通常１％と２％との間となるように、信号をデジタル化前に１０倍増幅した。
【０１２２】
図１Ｄに示すグレイスケール写真は、典型的な記録チャンバー内の海馬スライス標本のビデオ画像である。組織を保持するために用いられる細い金のワイヤメッシュがスライス標本に斜めに走る黒い線として見える。刺激電極はＣＡ１の放線状層右上に見える。記録電極（薄すぎて写真では見えない）は白い矢印で指示された位置に挿入された。図１Ａは、２秒間６０Ｈｚの刺激が後放電を喚起したことを示し、細胞外電極によって記録された典型的な後放電エピソードを示す。図１Ａの差し込み図は、シャファー側枝から送達された単一の２００秒テスト用パルス（矢印のアーティファクト）に対するＣＡ１野の応答を示す。図１Ａ１はシャファー側枝刺激喚起性組織透過光のピーク変化のマップを示す。光学的変化が最大となる領域は、刺激電極のいずれかの側のＣＡ１の先端及び基底樹状突起領域に対応する。図１Ｂは、２．５ｍＭフロセミド含有培養液で２０分灌流後の刺激に対する応答を表すサンプルトレース（ｓａｍｐｌｅ ｔｒａｃｅｓ）を示す。電気的後放電活動（図１Ｂに示す）及び刺激喚起性光学的変化（図１Ｂ１に示す）の両方ともブロックされた。しかし、テスト用パルスに対する過興奮的な電場応答（多発性集団スパイク）が存在した（差し込み図）。図１Ｃ及び図１Ｃ１は、初期の応答パターンの回復が正常な浴培養液で４５分灌流した後に見られたことを示す。
【０１２３】
刺激喚起性後放電のフロセミドによるブロック及び随伴するテスト用パルスに対するシナプス応答の増大という相反する効果は、（１）フロセミドはてんかん様活動をブロックしたこと及び（２）（自発性てんかん様活動に反映される）同期化と（単一シナプス入力に対する応答に反映される）興奮とが分離されたことという２つの鍵となる結果を示す。フロセミドの投与量依存性が調べられた実験は、１．２５ｍＭの最低濃度が後放電と光学的変化の両方をブロックするために必要であったことを決定した。
【０１２４】
（実施例２）
高濃度Ｋ＋（１０ｍＭ）浴培養液で灌流された海馬スライス標本におけるてんかん様後放電に対するフロセミドの効果
上記の通り調製されたラット海馬スライス標本は、自発的な発作間様バースト発生の拡張期間がＣＡ３（上のトレース）及びＣＡ１（下のトレース）錐体細胞領域で同時に記録されるまで、高濃度Ｋ＋溶液に灌流された（図２Ａ及び２Ｂ）。フロセミド添加培養液（２．５ｍＭフロセミド）で１５分灌流後、バースト放電は振幅が増加した（図２Ｃ及び２Ｄ）。しかし、フロセミド灌流４５分後にバーストは可逆的にブロックされた（図２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ）。フロセミド灌流のこの全系列の間、シャファー側枝に送達された単一テスト用パルスに対するシナプス応答は変化しなかったか又は増大した（データ示さず）。放電振幅の初期の増加はフロセミドに誘発された抑制の減少を反映したものである可能性がある（Ｍｉｓｇｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：１４１３、１９８６、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．６０：１０５、１９８８、ＴｈｏｍｐｓｏｎとＧａｅｈｗｉｌｅｒ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｙｓｉｏｌ．６１：５１２、１９８９及びＰｅａｒｃｅ、Ｎｅｕｒｏｎ １０：１８９、１９９３）。ここで観察された興奮の増大の立ち上がり時間と同様の潜伏時間（１５分以内）でフロセミドが海馬スライス標本の抑制電流の要素をブロックすることは過去に報告された（Ｐｅａｒｃｅ、Ｎｅｕｒｏｎ １０：１８９、１９９３）。自発性バーストのフロセミドによるブロックに要する長い潜伏時間は高濃度Ｋ＋条件下でのフロセミド感受性細胞体積調節機構の十分なブロックに要する追加の時間に対応するかもしれない。
【０１２５】
高濃度Ｋ＋で灌流されたスライス標本に対するフロセミドの効果を試験した後、同様の研究がさまざまな他の一般に研究されたてんかん様放電の試験管内のモデルで行われた（Ｇａｌｖａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２４１：７５、１９８２、ＳｃｈｗａｒｔｚｋｒｏｉｎとＰｒｉｎｃｅ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１８３：６１、１９８０、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３９８：２１５、１９８６及びＺｈａｎｇら、Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｒｅｓ．２０：１０５、１９９５）。マグネシウムフリー培養液（０−Ｍｇ＋＋）への持続的な曝露（２ないし３時間）の後、スライス標本は一般に臨床で用いられる抗けいれん薬に対する耐性を有するてんかん様放電を起こすようになることが示された（Ｚｈａｎｇら、Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｒｅｓ．２０：１０５、１９９５）。嗅脳溝内皮質（図２Ｉ）と支脚（データ示さず）からの記録は、０−Ｍｇ＋＋の３時間灌流後スライス標本は前記「抗けいれん薬耐性」バーストと一見同様のバーストパターンを示すようになったことを表した。浴培養液へのフロセミド添加１時間後これらのバーストはブロックされた（図２Ｊ）。（１）２００−３００μＭ ４−アミノピリジン（４−ＡＰ、カリウムチャンネル遮断薬）の追加（図２Ｋと２Ｌ）、（２）５０−１００μＭ ビククリン（ＧＡＢＡアンタゴニスト）の追加（図２Ｍと２Ｎ）、（３）マグネシウム除去（０−Ｍｇ＋＋）と１時間の灌流（図２Ｏと２Ｐ）及び（４）カルシウム除去と細胞外キレート剤処理（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｈｅｌａｔｉｏｎ）（０−Ｃａ＋＋）（図２Ｑと２Ｒ）の浴培養液の追加／改変で観察された自発性バースト放電もフロセミドはブロックした。これらの操作のそれぞれで、自発性発作間様パターンはＣＡ１及びＣＡ３サブ領域から同時に記録された。（図２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ及び２ＮはＣＡ３トレースのみを示し、図２Ｏ、２Ｐ、２Ｑ及び２ＲはＣＡ１トレースのみを示す）。前記０−Ｍｇ＋＋実験では、５ｍＭフロセミドは１５ないし２０分の潜伏時間でバースト発生をブロックした。他の全てのプロトコールについてｍバースト発生は２．５ｍＭフロセミドで２０ないし６０分の潜伏時間でブロックされた。フロセミドは全ての実験で、ＣＡ１及びＣＡ３の両方の自発性バースト発生を可逆的にブロックした（図２Ｌ、２Ｎ、２Ｐ及び２Ｒ）。
【０１２６】
（実施例３）
カイニン酸静脈注射により麻酔ラットに誘発されたてんかん様活動に対するフロセミドの効果
本実施例は、てんかん様活動が麻酔ラットへのカイニン酸（ＫＡ）の静脈注射により誘発される試験管内のモデルを示す（Ｌｏｔｈｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ３１：８０６、１９８１）。結果は図３Ａないし３Ｈに示す。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（４匹、体重２５０−２７０ｇ）はウレタン（１．２５ｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で麻酔され、必要に応じウレタン追加注射（０２５ｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で麻酔は維持された。体温は直腸温度計を用いて監視され３５ないし３７°Ｃを保温パッドで維持され、拍動数（ＥＫＧ）は連続的に監視された。頚静脈は一方から静脈内薬剤投与用にカニューレが挿入された。ラットはＫｏｐｆ脳定位装置に固定し（頭蓋頂レベルで）、先端０．５ｍｍまで絶縁された双極ステンレス微小電極が、前頭頭頂皮質の脳波（ＥＥＧ）活動を記録するために、皮質表面から深さ０．５ないし１．２ｍｍまで刺入された。一部の実験では、海馬ＥＥＧを記録するために、２Ｍ ＮａＣｌを含むピペットが深さ２．５ないし３．０ｍｍまで下げられた。データがＶＨＳビデオテープに記録されオフラインで解析された。
【０１２７】
前記の外科的準備と電極設置の後、動物はカイニン酸（１０ないし１２ｍｇ／ｋｇ、静脈注射）が注入される前３０分間回復させた。強烈な発作活動、心拍数の増加及び鼻毛の急な運動は約３０分の潜伏時間で誘発された。一旦安定な電気的発作が明らかになると、フロセミドは２０ｍｇ／ｋｇ濃縮塊として３０分毎に３回の注射により送達された。実験はウレタンの静脈投与で終了した。動物のケアはＮＩＨガイドラインに従って行われ、ワシントン大学動物ケア委員会により承認された。
【０１２８】
図３Ａないし３Ｈはウレタン麻酔ラットにカイニン酸で喚起された電気的「てんかん重積状態」のフロセミドによるブロックを示す。ＥＫＧ記録は上のトレースに示され、ＥＥＧ記録は下のトレースに示された。このモデルでは、強烈な電気放電（電気的「てんかん重積状態」）はＫＡ（１０ないし１２ｍｇ／ｋｇ）注射後３０ないし６０分で皮質（又は深部海馬電極）から記録された（図３Ｃと３Ｄ）。対照実験（及びＬｏｔｈｍａｎらの過去の報告Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、３１：８０６、１９８１）ではこのてんかん重積状態様活動は３時間以上維持された。逐次的なフロセミド静脈注射（蓄積量４０ないし６０ｍｇ／ｋｇ）は発作活動を３０ないし４５分の潜伏時間でブロックし、しばしば比較的平坦なＥＥＧ（図３Ｅ、３Ｆ、３Ｇ及び３Ｈ）となる。フロセミド注射後９０分でも皮質活動はほぼ正常な基線レベル（つまり、ＫＡ及びフロセミド注射以前に観察されたレベル）にとどまった。ラットにおけるフロセミドの薬物動力学に関する研究は、本実施例に用いられた投与量が毒性レベルをはるかに下回っていたことを明らかにしている（ＨａｍｍａｒｌｕｎｄとＰａａｌｚｏｗ、Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ、３：３４５、１９８２）。
【０１２９】
（実施例４ないし７の実験方法）
海馬スライス標本はＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット成獣から前記の通り調製された。厚さ１００μｍの海馬横断スライス標本がビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｃｕｔｔｅｒ）で薄切された。スライス標本は、典型的には海馬全域と支脚を含んだ。薄切後、スライス標本は室温の酸素加したホールディングチャンバーに少なくとも記録前１時間保存された。全ての記録は酸素加された（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）３４ないし３５°Ｃの人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）の入ったインターフェースタイプチャンバーの中で行われた。正常ＡＣＳＦは、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ デキストロースを含む。
【０１３０】
ＣＡ１及びＣＡ３錐体細胞からの細胞内記録用の先の尖った電極は４Ｍ 酢酸カリウムで満たされた。ＣＡ１及びＣＡ３細胞体層からの電場記録は２Ｍ ＮａＣｌで満たされた抵抗の低いガラス電極を用いて取得された。シャファー側枝又は肺門経路（ｈｉｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ）の刺激には、小型単極タングステン電極がスライス標本の表面に設置された。電場及び細胞内記録からの自発性及び刺激喚起性活動はデジタル化され（Ｎｅｕｒｏｃｏｒｄｅｒ、Ｎｅｕｒｏｄａｔａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ニューヨーク州Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ビデオテープに記録された。パソコン上のＡｘｏＳｃｏｐｅソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）はデータのオフラインでの解析に用いられた。
【０１３１】
一部の実験では、ビククリン（２０μＭ）、４アミノピリジン（４ＡＰ）（１００μＭ）又は高Ｋ＋濃度（７．５又は１２ｍＭ）含有正常培養液又は低塩素濃度培養液が用いられた。全ての実験で、低塩素溶液（７又は２１ｍＭ［Ｃｌ−］Ｏ）はＮａＣｌをＮａ＋グルコン酸（Ｓｉｇｍａ）に等モル置換することにより調製された。全ての溶液は３５°Ｃで約ｐＨ７．４、重量モル浸透圧濃度２９０ないし３００ｍＯｓｍで９５％Ｏ２５％ＣＯ２で炭酸ガス飽和されるように調製された。
【０１３２】
インターフェースチャンバーに置いた後スライス標本は約１ｍｌ／分で灌流された。この流速では灌流培養液の完全な変化が起こるのに８ないし１０分かかる。ここで報告された全ての時間はこの遅れを考慮に入れ約±２分の誤差がある。
【０１３３】
（実施例４）
ＣＡ１及びＣＡ３領域での自発性てんかん様バースト発生の停止のタイミング
同期化された活動を改変する因子の相対的貢献はＣＡ１及びＣＡ３領域の間で相違がある。これらの因子は局部的な回路の相違と細胞の密度及び細胞外空間の体積比の領域特異的な相違を含む。アニオン塩素共輸送拮抗現象の抗てんかん効果はニューロン放電のタイミングの脱同期化が原因である場合には、塩素共輸送ブロックはＣＡ１及びＣＡ３領域で効果が異なることが予想される。この仮説を検証すべく、一連の実験がＣＡ１及びＣＡ３領域での自発性てんかん様活動のブロックのタイミングの相違を特徴づけるために行われた。
【０１３４】
電場活動はＣＡ１及びＣＡ３（ＣＡ３領域の最近位と最遠位のおおよそ中間）領域で同時に記録され、自発性バースト発生は高［Ｋ＋］Ｏ（１２μＭ、ｎ＝１２）、ビククリン（２０ｍＭ、ｎ＝１２）又は４−ＡＰ（１００μＭ、ｎ＝５）の処理により誘発された。ＣＡ１及びＣＡ３領域の電場応答がそれぞれの実験の継続中監視できるように、３０秒毎に単一電気刺激がＣＡ１及びＣＡ３領域の中間のシャファー側枝に送達された。全ての実験で、少なくとも２０分の連続した自発性てんかん様バースト発生が低［Ｃｌ−］Ｏ（２１ｍＭ）又はフロセミド含有（２．５ｍＭ）培養液に切り替える前に観察された。
【０１３５】
全ての場合でフロセミド又は低塩素濃度培養液への曝露後３０ないし４０分で自発性バースト発生はＣＡ３領域での停止前にＣＡ１領域で停止した。典型的に観察された事象の時間系列は、自発性電場事象のバースト発生頻度と振幅の初期の増加と、ＣＡ３でのバースト放電振幅の減少より迅速なＣＡ１でのよりバースト放電振幅の減少を含む。ＣＡ１が沈黙した後ＣＡ３はもはや自発性てんかん様事象を示さなくなるまで、５ないし１０分間放電を継続する。
【０１３６】
このバースト停止の時間的パターンは、自発性バースト発生のブロックに用いられた試剤がフロセミドであったか低［Ｃｌ−］Ｏ培養液であったかにかかわらず、試験した全てのてんかん様状態を誘発する処理で観察された。これらの実験の全ての段階を通じて、シャファー側枝の刺激はＣＡ１及びＣＡ３細胞体層の両方で過興奮性電場応答を喚起した。自発性バースト発生がＣＡ１及びＣＡ３領域の両方でブロックされた直後には過興奮性集団スパイクはまだ喚起できた。
【０１３７】
我々は、観察されたＣＡ３に先だつＣＡ１でのバースト停止は、我々の記録部位の選択に対するこれらの領域の間のシナプス接続の配置から生じるアーティファクトである可能性を考慮した。さまざまなＣＡ３サブ領域の投射はＣＡ１にまとまって終末すること、すなわち歯状回（ＣＡ３近位）に近いＣＡ３細胞はＣＡ１の遠位部分（支脚の境界の近く）に最も多く投射するが、ＣＡ３のより遠位に位置する細胞から発するＣＡ３投射はＣＡ２境界の近くに位置するＣＡ１の部分により多く終末することが知られている。バーストの停止がＣＡ３の異なるサブ領域で異なる時に起こる場合には、上記の実験結果はＣＡ１及びＣＡ３領域の相違として生じるのではなく、むしろＣＡ３サブ領域にわたるバースト活動のばらつきの相関として生じる。我々はこの可能性を３つの異なる実験で検証した。ＣＡ１で自発性バーストが停止した直後に我々はＣＡ３領域を記録電極を用いて探索した。いくつかの異なるＣＡ３部位（ＣＡ３の最も近位から最も遠位の部分まで）からの記録は、ＣＡ３領域の全てのサブ領域はＣＡ１が沈黙したこの時間の間中自発的にバーストを発生していたことを明らかにした。
【０１３８】
ＣＡ３の集団放電は興奮性シナプス伝達を介してＣＡ１での放電を喚起すると一般には考えられていたため、ＣＡ１が沈黙した後ＣＡ３が自発的に放電を継続したという観察は予想外であった。前記の通り、シャファー側枝に送達された単一パルス刺激は、自発性バーストのブロック後でさえもＣＡ１において多発性集団スパイクを喚起し、よってＣＡ３からＣＡ１へのシナプスでの過興奮した興奮性シナプス伝達は無傷であった。このシナプス伝達の効能が維持されており、ＣＡ３の自発性電場放電が継続していることから、我々はＣＡ１における自発性バースト発生がなくなるのは到来する興奮性入力の同期化が弱まったためであると仮定した。さらに、ＣＡ３での自発性てんかん様放電もやがて停止することから、たぶんこの脱同期化の過程は２つの海馬のサブ領域で異なる時に起こった。
【０１３９】
（実施例５）
ＣＡ１及びＣＡ３領域集団放電の同期化に対する塩素共輸送拮抗現象の効果
実施例４からの観察は、低［Ｃｌ−］Ｏ又はフロセミド含有培養液への曝露と自発性バースト活動の特徴との時間的関係を示唆した。さらに、この関係はＣＡ１領域とＣＡ３領域とでは異なる。前記時間的関係の特徴をより解明するために、我々は自発性及び刺激喚起性バースト放電の際のＣＡ１活動電位の発生と、ＣＡ１及びＣＡ３サブ領域の電場応答における集団スパイク事象とを比較した。
【０１４０】
細胞内記録は、細胞内電極をＣＡ１電場電極の近傍（１００μｍ以内）に設置して、ＣＡ１錐体細胞から取得された。スライス標本は２０秒毎にシャファー側枝に送達された単一の刺激により刺激された。連続的な自発性バースト発生が少なくとも２０分間確立された後に浴培養液はビククリン含有低［Ｃｌ−］Ｏ（２１ｍＭ）培養液に切り替えられた。約２０分後にバースト頻度と振幅は最大となった。このときの電場及び細胞内の同時記録はＣＡ１の電場及び細胞内の記録はＣＡ３の電場放電と緊密に同期していることを明らかにした。それぞれの自発性放電の際、ＣＡ３電場応答はＣＡ１放電より数ミリ秒先に起こった。刺激喚起性事象の際には、ＣＡ１錐体細胞の活動電位放電はＣＡ３及びＣＡ１電場放電の両方に緊密に同期していた。
【０１４１】
低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への持続的曝露により、ＣＡ１及びＣＡ３領域の自発性放電の間の潜伏時間が増加し、ビククリン含有低塩素培養液への曝露の３０ないし４０分後に最大潜伏時間が３０ないし４０ミリ秒となった。この間ＣＡ１及びＣＡ３自発性電場放電の両方の振幅とも減少した。この間刺激喚起性放電は波形及び相対的な潜伏時間の点で自発的に発生する放電に似ていた。しかし、初期の刺激喚起性ニューロンの脱分極（おそらく単シナプス性ＥＰＳＰ）は潜伏時間の有意な増加を伴わずに開始した。これらのデータが取得された時間間隔はＣＡ１での自発性バースト停止の直前に対応する。
【０１４２】
低［Ｃｌ−］Ｏ培養液での灌流４０ないし５０分後、自発性バーストはＣＡ１ではほとんど消失したが、ＣＡ３では変化が見られなかった。この間のシャファー側枝刺激は、単一シナプス的に誘発された（ｍｏｎｏｓｙｎａｐｔｉｃａｌｌｙ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）ＣＡ１錐体細胞の応答は有意な潜伏時間の増加を全くともなわずに起こるが刺激喚起性電場応答はほとんど消失することを示した。これらのデータが取得された時間間隔はＣＡ３での自発性バーストの停止の直前に対応した。
【０１４３】
低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への持続的な曝露の後、シャファー側枝刺激とその結果起こるＣＡ３電場放電との間の潜伏時間に大きな増加（３０ミリ秒以上）が生じた。やがてはシャファー側枝刺激によってＣＡ１及びＣＡ３領域とも全く電場応答が喚起できなくなった。しかし、シャファー側枝刺激に対するＣＡ１錐体細胞からの活動電位放電は反応潜伏時間にほとんど変化なく喚起できた。実際、実験の継続時間全体の間（２時間以上）、ＣＡ１錐体細胞からの活動電位放電はシャファー側枝刺激により短い潜伏時間で喚起できた。さらに、ＣＡ３の刺激喚起性過興奮性放電はやがては低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への持続的な曝露の後にはブロックされたが、ＣＡ３の逆行性応答は保存されたようであった。
【０１４４】
（実施例６）
ＣＡ１錐体細胞のバースト放電の同期化への塩素共輸送拮抗現象の効果
前述のデータは、電場応答の消失はニューロン間の活動電位の発生の脱同期化が原因であることを示唆する。すなわち、ＣＡ１錐体細胞のシナプス駆動性興奮は保存されなかったが、ＣＡ１ニューロン集団の間の活動電位の同期性は測定可能な直流電場応答に蓄積するのに十分ではなかった。この仮説を検証するためにＣＡ１錐体細胞の対になった細胞内記録がＣＡ１電場応答と同時に取得された。これらの実験で、細胞内電極と電場記録電極の両方ともが互いに２００μｍ以内に設置された。
【０１４５】
ビククリン含有低［Ｃｌ−］Ｏ培養液により誘発された自発性活動が最大の期間中、記録はＣＡ１ニューロンとＣＡ１電場の放電は自発性又は刺激喚起性放電の両方の場合とも緊密に同期していたことを示した。低［Ｃｌ−］Ｏ培養液に継続して曝露した後、ＣＡ１電場放電の振幅が広がって消失したとき、自発性及び刺激喚起性放電の両方が、ＣＡ１ニューロンの対の間及び活動電位と電場応答の間での活動電位の発生のタイミングの脱同期化を示した。この脱同期化はＣＡ１電場振幅の抑制と同時に起こった。その自発的なＣＡ１のバーストが停止したときまでに、有意な潜伏時間の増加がシャファー側枝刺激とＣＡ１電場放電との間で起こった。このとき、対になった細胞内記録は、ニューロンの対の間及び活動電位とシャファー側枝刺激により喚起された電場放電との間での活動電位のタイミングの劇的な脱同期化を示した。
【０１４６】
ＣＡ１活動電位放電の観察された脱同期化は、シナプス放出のタイミングの破壊又は神経突起でのランダムな伝導異常のような、シナプス駆動性活動電位発生に必要な機構のランダム化が原因であることもありえる。そうである場合には、特定のニューロンの対の間の活動電位の発生は互いに状況ごとでランダムにばらつきが生じることを予想できる。我々はこれを、シャファー側枝の多発性の逐次刺激の間のニューロンの対の活動電位放電パターンを比較することにより検証した。それぞれの刺激事象の間、活動電位は互いに対してほとんど同時に発生し、状況ごとでほとんど同一のバースト波形（ｂｕｒｓｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を示した。我々は、自発的な電場放電の際のあるニューロンの対の間での活動電位の発生が時間的に固定しているかどうかを知るために調べた。あるＣＡ１ニューロンの対からの活動電位放電のパターンが、活動電位の発生が明らかに脱同期化した時期の逐次的な自発的な電場バーストの間で比較された。上記の刺激喚起性活動電位放電の場合と全く同様に、自発的な集団放電の際に生成した活動電位は、互いに対してほとんど同一の時に起こり、ある自発性放電から次の放電までほとんど同一のバースト波形を示した。
【０１４７】
（実施例７）
自発性シナプス活動に対する低塩素処理の効果
塩素共輸送拮抗現象と関連する抗てんかん効果は神経伝達物質放出への何らかの作用により仲介されている可能性がある。塩素共輸送のブロックが神経終末から放出された神経伝達物質の量とタイミングを変化させ、ニューロン同期化に影響を与えることがありうる。低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露が神経伝達物質放出に関連する機構に影響を与えたかどうかを検証するために、シナプス前終末からの神経伝達物質の自発的なシナプス放出を劇的に増大させる処理中の細胞内ＣＡ１応答がＣＡ１及びＣＡ３の電場応答と同時に記録された。
【０１４８】
自発性神経伝達物質放出の増大は４−ＡＰ（１００μＭ）処理により誘発された。４−ＡＰ含有培養液への４０分曝露後、自発性同期化バースト放電がＣＡ１及びＣＡ３領域で記録された。４−ＡＰ含有低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への切替は、前記の通り初めは自発性バーストの増大をもたらした。高利得（ｈｉｇｈ−ｇｒａｉｎ）細胞内記録は高振幅自発性シナプス活動が４−ＡＰ処理により誘発されたことを示した。低塩素培養液への更なる曝露はＣＡ１での自発性バースト放電はブロックしたが、ＣＡ３は自発的な放電を継続した。このときＣＡ１細胞内記録は、自発的なシナプス雑音がさらに増大し、４−ＡＰ含有低塩素培養液への持続的な曝露の期間中そのままであったことを示した。これらのデータは、神経終末からのシナプス放出の原因となる機構が、４−ＡＰにより誘発されたＣＡ１の自発性バーストのブロックを説明できる方法で低塩素曝露による悪影響を被らなかったことを示唆した。これらの結果は、低［Ｃｌ−］Ｏ曝露の効果がＰＳＰｓを細胞体に伝導する効率を悪化させるようなＣＡ１樹状突起の性質の変化が原因であるという可能性も除外した。
【０１４９】
（実施例８ないし１２の実験方法）
以下の全ての実験では、［Ｃｌ−］ＯはＮａＣｌをＮａ＋−グルコン酸で等モル置換することにより減少された。いくつかの理由から他の代替アニオンではなくグルコン酸が用いられた。まず、パッチクランプ法の研究がグルコン酸は事実上塩素チャンネルを透過できないが、他のアニオン（メチル硫酸、硫酸、イセチオン酸及び酢酸）はさまざまな程度で透過できることを証明してきた。第２に、細胞外カリウムのグリアのＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ共輸送を通しての輸送は細胞外塩素がグルコン酸に置換されるとブロックされるが、イセチオン酸で置換された場合は完全にはブロックされない。このフロセミド感受性共輸送体は細胞膨張と細胞外空間（ＥＣＳ）の体積変化に意義深い役割を果たすため、我々は、我々の処理の効果が過興奮性のフロセミドの実験と比較できるように適切な代替アニオンを用いることを望んだ。［Ｈｏｃｈｍａｎ、Ｄ．Ｗ．、Ｂａｒａｂａｎ、Ｓ．Ｃ．、Ｏｗｅｎｓ、Ｊ．Ｗ．Ｍ．及びＳｃｈｗａｒｔｚｋｒｏｉｎ、Ｐ．Ａ．、「フロセミドによるてんかん様活動ブロックにおける同期化と興奮性の分離」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：９９−１０２、１９９５及び米国特許明細書第５，９０２，７３２号］第３に、ギ酸、酢酸及びプロプリオン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）はＣｌ−の代替として用いると弱酸となり細胞内ｐＨを急速に下降させるが、グルコン酸は細胞外にとどまり細胞内ｐＨの変化は報告されていない。第４に、比較のために我々は低［Ｃｌ−］Ｏの活動喚起性ＥＣＳ変化への影響を調べた過去の研究で用いられたのと同じ代替アニオンを用いることを望んだ。
【０１５０】
ある種の代替アニオンはカルシウムをキレートするとの示唆がある。その後の研究は代替アニオンのカルシウムキレート能を証明できなかったが、いまだにこの問題に関する関心が文献に存在する。休止期の膜電位は正常のままであり、［Ｃｌ−］Ｏがグルコン酸置換により低下した培養液に曝露後数時間経過してもシナプス応答（実際には過興奮性シナプス応答）は誘発されることから、カルシウムキレート作用は以下の実験では問題とはならないようである。さらに我々は、Ｃａ２＋選択的微小電極を用いた測定によって、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液のカルシウム濃度が対照の培養液のカルシウム濃度と同一であることを確認した。
【０１５１】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット成獣は前記の通りに準備された。簡潔には、厚さ４００μｍの海馬横断スライス標本はビブラトームを用いて薄切された。スライス標本は典型的には海馬全体と支脚が含まれた。薄切後スライス標本は酸素加されたホールディングチャンバーに少なくとも記録前１時間保存された。全ての記録は酸素加された（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）３４ないし３５°Ｃの人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）の入ったインターフェースタイプチャンバーの中で行われた。正常ＡＣＳＦは、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ デキストロースを含む。一部の実験では、ビククリン（２０μＭ）、４アミノピリジン（４ＡＰ）（１００μＭ）又は高Ｋ＋濃度（７．５又は１２ｍＭ）含有正常培養液又は低塩素濃度培養液が用いられた。低塩素溶液（７又は２１ｍＭ［Ｃｌ−］Ｏ）は、ＮａＣｌをＮａ＋グルコン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）に等モル置換することにより調製された。全ての溶液は３５°Ｃで約ｐＨ７．４、重量モル浸透圧濃度２９０ないし３００ｍＯｓｍで９５％Ｏ２５％ＣＯ２で炭酸ガス飽和されるように調製された。
【０１５２】
ＣＡ１錐体細胞からの細胞内記録用の先の尖った電極は４Ｍ 酢酸カリウムで満たされた。ＣＡ１及びＣＡ３細胞体層からの電場記録はＮａＣｌ（２Ｍ）で満たされた抵抗の低いガラス電極を用いて取得された。シャファー側枝の刺激には、小型単極タングステン電極がＣＡ１及びＣＡ３領域の中間のスライス標本の表面に設置された。電場及び細胞内記録からの自発性及び刺激喚起性活動はデジタル化され（Ｎｅｕｒｏｃｏｒｄｅｒ、Ｎｅｕｒｏｄａｔａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ニューヨーク州Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ビデオテープに記録された。パソコン上のＡｘｏＳｃｏｐｅソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．社）はデータのオフラインでの解析に用いられた。
【０１５３】
イオン選択的微小電極は当業者に周知の標準的な方法に従って作製された。二連銃型（Ｄｏｕｂｌｅ−ｂａｒｒｅｌｅｄ）ピペットが引かれ、先端の直径が約３．０μｍになるように割られた。基準バレル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂａｒｒｅｌ）はＡＣＳＦで満たされ、他のバレルはシラン処理され（ｓｙｌａｎｉｚｅｄ）、先端にＫ＋選択的な樹脂（Ｃｏｒｎｉｎｇ ４７７３１７）が後ろから充填された。該シラン処理されたバレルの残りはＫＣｌ（１４０ｍＭ）で満たされた。それぞれのバレルはＡｇ／ＡｇＣｌ線を介して高インピーダンスデュアル差動アンプ（ＷＰＩ ＦＤ２２３）に接続された。それぞれのイオン選択的微小電極は既知のイオン組成の溶液を用いて較正され、ネルンスト曲線に近い応答性を示し実験期間中安定である場合に適すると判断された。
【０１５４】
インターフェースチャンバーに置いた後スライス標本は約１ｍｌ／分で灌流された。この流速では灌流培養液の完全な変化が起こるのに８ないし１０分かかる。ここで報告された全ての時間はこの遅れを考慮に入れ約±２分の誤差がある。
【０１５５】
（実施例８）
ＣＡ１電場記録への低［Ｃｌ−］Ｏの効果
他の研究は、皮質及び海馬のスライス標本の低［Ｃｌ−］Ｏへの持続的な曝露は入力抵抗、休止膜電位、脱分極誘発性活動電位発生又は興奮性シナプス伝導のような基本的な内在性及びシナプス性の性質は影響を与えないことを示した。ある過去の研究は海馬ＣＡ１領域への低［Ｃｌ−］Ｏのてんかん発作発現の特徴も部分的に明らかにした。以下の研究は、低［Ｃｌ−］Ｏ誘発性の過興奮と過同期化の立ち上がりと停止の時間を観察するために行われた。スライス標本（ｎ＝６）ははじめＣＡ１錐体細胞及びＣＡ１細胞体層で安定な細胞内及び電場の記録が確立するまで正常培養液で灌流された。２つの実験においては、同一細胞が実験の全期間中（２時間以上）保持された。残りの実験（ｎ＝４）では、培養液交換の過程で最初の細胞内記録は失われ、追加の記録が異なる細胞から取得された。これらの実験におけるニューロン活動パターンは単一細胞が観察されたときにみられたものと同一であった。
【０１５６】
電場及び細胞内電極はいつも互いに近接して（２００μｍ以下）設置された。それぞれの場合で、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液（７ｍＭ）への曝露約１５ないし２０分後自発性バーストが最初に細胞レベルで、それから電場で始まった。ニューロンの大集団での同期化したバースト放電を表すこの自発性の電場活動は、５ないし１０分継続し、その後電場記録は静かになった。電場が最初に静かになったときは細胞は自発的な放電を続けていた。この結果は、個々の細胞の放電能力は損なわれずに集団活動が「脱同期化」したことを示唆する。低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露約３０分後、細胞内記録は、電場は静かなままだが細胞は自発的に放電し続けることを示した。２つの時点での細胞内電流注入に対する細胞の応答は、細胞の活動電位発生能力は低［Ｃｌ−］Ｏ曝露によっては損なわれなかったことを証明した。さらに、ＣＡ１放線状層での電気刺激はバースト放電を誘発し、この組織では過興奮性状態が維持されていたことを示した。
【０１５７】
（実施例９）
高［Ｋ＋］Ｏにより誘発されたＣＡ１でのてんかん様活動への低［Ｃｌ−］Ｏの効果
前記の実験は、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への組織の曝露は１０分以内に停止する短期の自発的な電場電位バースト発生を誘発したことを示した。［Ｃｌ−］Ｏの減少が本当に自発的てんかん様（つまり同期化した）バースト発生をやがてブロックできる場合は、これらの結果はこの初期のバースト活動が停止した後にのみ抗てんかん効果が観察可能であることを示唆する。そこで、我々は低［Ｃｌ−］Ｏ処理の高［Ｋ＋］Ｏ誘発性バースト活動への一時的効果を調べた。スライス標本（ｎ＝１２）は［Ｋ＋］Ｏが１２ｍＭに増加された培養液に曝露され電場電位がＣＡ１細胞体層内の電場電極で記録された。自発性電場電位バースト発生は少なくとも２０分間観察され、その後前記スライス標本は［Ｋ＋］Ｏは１２ｍＭに維持されるが［Ｃｌ−］Ｏが２１ｍＭに減少した培養液に曝露された。組織が低［Ｃｌ−］Ｏ／高［Ｋ＋］Ｏ培養液に曝露された後１５ないし２０分以内にバースト振幅が増大しそれぞれ電場事象がより長い間継続した。この電場活動が促進された短い期間（５ないし１０分持続）の後バースト発生は停止した。このブロックが可逆的かどうか検証するために、電場電位の沈黙の少なくとも１０分後に我々は高［Ｋ＋］Ｏ培養液を正常［Ｃｌ−］Ｏ培養液に戻した。２０ないし４０分後にバースト発生が再開した。それぞれの実験を通してシャファー側枝刺激に対するＣＡ１電場応答が監視された。最大の電場応答は、自発的バーストが最大の振幅となる自発的バーストの停止の直前に記録された。しかし、自発的バースト発生のブロックの後であってもシャファー側枝刺激によって多発性集団スパイクは誘発され、シナプス伝達は無傷であり組織はまだ過興奮されうる状態のままであることを示した。
【０１５８】
４枚のスライス標本では、ＣＡ１錐体細胞からの細胞内記録はＣＡ１電場記録とともに取得された。高［Ｋ＋］Ｏ誘発性自発的バースト発生の期間中、シナプス後電位（ＰＳＰｓ）がよく観察できるように過興奮を起こさせる電流が細胞に注入された。自発的バースト発生の低［Ｃｌ−］Ｏによるブロックの後でも自発的に起こる活動電位とＰＳＰｓはまだ観察された。これらの観察はシナプス活動自体は前記の低［Ｃｌ−］Ｏ処理によってはブロックされなかったという見解をさらに支持する。
【０１５９】
（実施例１０）
４−ＡＰ、高［Ｋ＋］Ｏ、及びビククリンによりＣＡ１及びＣＡ３に誘発されたてんかん様活動の低［Ｃｌ−］Ｏによるブロック
我々は次に低［Ｃｌ−］Ｏ処理は、フロセミド処理について示したようにさまざまな薬理学的処理により誘発されたＣＡ１及びＣＡ３領域におけるてんかん様活動をブロックできるかどうか検証した。この実験のために我々は低［Ｃｌ−］Ｏ処理が高［Ｋ＋］Ｏ（１２ｍＭ）（ｎ＝５）、４−ＡＰ（１００μＭ）（ｎ＝４）及びビククリン（２０と１００μＭ）（ｎ＝５）によって誘発された自発的バースト発生に及ぼす効果を検証することにした。それぞれの実験で電場応答はＣＡ１及びＣＡ３領域から同時に記録され、それぞれの場合にＣＡ１及びＣＡ３領域の両方での自発性てんかん様活動は、灌流培養液の［Ｃｌ−］Ｏが２１ｍＭに減少された後３０分以内に可逆的にブロックされた。これらのデータは、フロセミドのように低［Ｃｌ−］Ｏは、最も普通に研究されたてんかん様活動の試験管内のモデルのいくつかにおける自発的バースト発生を可逆的にブロックすることを示唆する。
【０１６０】
（実施例１１）
高［Ｋ＋］Ｏに誘発されたてんかん様活動のブロックについての低［Ｃｌ−］Ｏとフロセミドの比較
前記の実験からのデータは、低［Ｃｌ−］Ｏとフロセミドの両方の抗てんかん効果は同じ生理機構への作用により仲介されているとする仮説と矛盾しない。この仮説をさらに検証するために、我々は、ＣＡ１での電場電極で記録された、低［Ｃｌ−］Ｏ（ｎ＝１２）とフロセミド（２．５及び５ｍＭ）（ｎ＝４）の高［Ｋ＋］Ｏに誘発されたバーストへの効果の時系列を比較した。我々は、低［Ｃｌ−］Ｏとフロセミドの処理の両方とも、短い初期の電場活動振幅の増大と自発的な電場活動の（可逆的な）ブロックという、同様の時系列の効果を誘発することをみつけた。両方の場合でシャファー側枝の電気刺激は、自発的バースト発生がブロックされた後であっても、過興奮性応答を誘発した。
【０１６１】
（実施例１２）
さまざまな［Ｋ＋］Ｏの低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への持続的な曝露の結果
前記の実験では、我々は低［Ｃｌ−］Ｏ曝露により自発的バースト発生がブロックされた後１時間以上一部のスライス標本の電場活動を監視した。かかる持続的な低［Ｃｌ−］Ｏ曝露の後、自発的な長時間持続する脱分極を起こさせるシフトが発生した。これらの後期に起こる電場の事象の波形と頻度は細胞外カリウム及び塩素濃度と関連があるようにみえた。これらの観察に動機づけられて、我々は系統的に［Ｃｌ−］Ｏと［Ｋ＋］Ｏを変化させてこれらのイオン変化の前記の後期に起こる自発性電場事象への効果を観察する実験を行った。
【０１６２】
最初の実験では、スライス標本は低［Ｃｌ−］Ｏ（７ｍＭ）と［Ｋ＋］Ｏ（３ｍＭ）含有培養液に曝露された（ｎ＝６）。この培養液に５０ないし７０分曝露後自発性事象をＣＡ１領域で記録したところ、これらの事象は、最初のエピソードが３０ないし６０秒継続する直流電場での５ないし１０ｍＶの負のシフトのようであった。それぞれの次のエピソードは前のエピソードよりも長かった。この観察は、浴培養液中のイオン濃度のせいでイオン恒常性機構が時間とともに減衰したことを示唆した。これらの負の直流電場シフトが誘発された一部の実験（ｎ＝２）では、ＣＡ１錐体細胞からの細胞内記録はＣＡ１電場記録と同時に取得された。
【０１６３】
これらの実験については、細胞内及び電場記録は互いに近接して（２００μｍ以内）取得された。それぞれの負の電場シフトの前（１０ないし２０秒）、ニューロンは脱分極を開始した。細胞脱分極は、休止膜電位の低下、自発的発火頻度の増加及び活動電位振幅の減少により示された。負の電場シフトの立ち上がりと同時に、細胞が自発性又は電流誘発性（データ示さず）活動電位を発火できないほど十分に脱分極した。おそらく、ニューロン脱分極は電場シフトの１０ないし２０秒前に開始するため、細胞外カリウムの段階的増加の結果ニューロン集団の脱分極が起こり、これらの電場事象を開始したのかもしれない。かかる［Ｋ＋］Ｏの増加は、正常ではカリウムを細胞外から細胞内空間に移動する塩素依存性グリア共輸送機構の変化が原因であるかもしれない。［Ｋ＋］Ｏの増加がこれらの負の電場シフト（及び並行した細胞脱分極）に先立つかどうかを検証するため、Ｋ＋選択的な微小電極が［Ｋ＋］Ｏの変化を記録するのに用いられた実験が行われた。
【０１６４】
それぞれの実験において、前記のＫ＋選択的微小電極と電場電極がＣＡ１錐体層に互いに近接して（２００μｍ以内）に設置され、集団スパイクの振幅を監視できるように、刺激パルスがシャファー側枝に２０秒毎に送達された。多発性の自発的に起こる負の電場シフトが低［Ｃｌ−］Ｏ（７ｍＭ）培養液の灌流により誘発された。それぞれの事象は［Ｋ＋］Ｏの有意な増加と関連し、該［Ｋ＋］Ｏの増加は負の電場シフトの立ち上がりの数秒前に開始した。それぞれの事象の立ち上がりの数秒前に、［Ｋ＋］Ｏの１．５ないし２．０ｍＭのゆっくりとした増加が約１ないし２分の時間間隔にわたり起こった。この刺激誘発性電場応答は時とともに増加する［Ｋ＋］Ｏを伴って、負の電場シフトの直前まで振幅が増大した。
【０１６５】
第２の実験（ｎ＝４）においては、［Ｋ＋］Ｏは１２ｍＭまで増加され［Ｃｌ−］Ｏは１６ｍＭまで増加された。この培養液への曝露の５０ないし９０分後、ゆっくりとした振動がＣＡ１領域で記録された。これらの振動は電場電位の５ないし１０ｍＶの負の直流シフトで特徴づけられ、約１サイクル／４０秒の周期であった。はじめはこれらの振動はときどき途切れながら起こり不規則な波形であった。時とともに、これらの振動は連続して規則的な波形になった。フロセミド（２．５ｍＭ）曝露と同時に振動の振幅は段階的に減少し、振動が完全にブロックされるまで頻度は増加した。かかる組織スライス標本での低［Ｃｌ−］Ｏ誘発性振動は過去に報告されていなかった。しかし、前記の振動する事象の時間的特徴は、これまで純粋な軸索標本で記載されていた低［Ｃｌ−］Ｏで誘発される［Ｋ＋］Ｏの振動に著しい類似性がある。
【０１６６】
第３の実験（ｎ＝５）においては、［Ｃｌ−］Ｏはさらに２１ｍＭまで増加され［Ｋ＋］Ｏはもとの３ｍＭに減少された。これらの実験では、単発で希にしか起こらない負の電場電位のシフトが４０ないし７０分後に発生した（データ示さず）。４０ないし６０秒間持続するこれらの事象（５ないし１０ｍＶ）はランダムな間隔で起こり、実験を通して比較的一定した持続時間を維持した。これらの事象は時にはシャファー側枝に送達された単一の電気刺激により誘発できた。
【０１６７】
最後の実験（ｎ＝５）では、［Ｃｌ−］Ｏは２１ｍＭに保たれ［Ｋ＋］Ｏは１２ｍＭに上昇された。これらの実験では、実験期間（２ないし３時間）の間に後期に発生する自発性電場事象は観察されなかった。
【０１６８】
（実施例１３）
低塩素曝露中の［Ｋ＋］Ｏの変化
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット成獣は前記の通りに準備された。簡潔には、厚さ４００μｍの海馬横断スライス標本はビブラトームを用いて薄切された。薄切後スライス標本は酸素加されたホールディングチャンバーに少なくとも記録前１時間保存された。Ｋ＋選択的な微小電極記録には浸漬型チャンバーが用いられた。スライス標本は酸素加された（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）３４ないし３５°Ｃの人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で灌流された。正常ＡＣＳＦは、１０ｍＭ デキストロース、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３及び２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む。一部の実験では、４アミノピリジン（４ＡＰ）を１００μＭ含む正常培養液又は低塩素濃度培養液が用いられた。低塩素溶液（２１ｍＭ［Ｃｌ−］Ｏ）は、ＮａＣｌをＮａ＋グルコン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社）に等モル置換することにより調製された。
【０１６９】
ＣＡ１又はＣＡ３細胞体層からの電場記録はＮａＣｌ（２Ｍ）で満たされた抵抗の低いガラス電極を用いて取得された。シャファー側枝経路の刺激には、単極ステンレス電極がＣＡ１及びＣＡ３領域の中間のスライドの表面に設置された。全ての記録はデジタル化され（Ｎｅｕｒｏｃｏｒｄｅｒ、Ｎｅｕｒｏｄａｔａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ニューヨーク州Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ビデオテープに記録された。
【０１７０】
Ｋ＋選択的微小電極は標準的な方法に従って作製された。簡潔には、二連銃型ピペットの基準バレルはＡＣＳＦで満たされ、他のバレルはシラン処理され、先端にＫ＋選択的な樹脂（Ｃｏｒｎｉｎｇ ４７７３１７）が後ろから充填された。イオン選択的微小電極は既知のイオン組成の溶液を用いて較正され、ネルンスト曲線に近い応答性を示し実験期間中安定である場合に適すると判断された。
【０１７１】
海馬スライス標本の低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露は、前記の通り、３つの特徴的な相を有するＣＡ１錐体細胞の活動の時間依存性の変化の系列を含むことが示されてきた。簡潔には、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露は、短期的な過興奮性と自発的てんかん様放電の増大をもたらす。さらなる低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露で自発的てんかん様活動はブロックされるが細胞の過興奮はそのまま続き、活動電位発火時間は互いに同期しなくなっていく。最後に、持続的な曝露で、刺激誘発性電場応答は完全に消失するように活動電位発火時間は十分に脱同期化するが、個々の細胞はシャファー側枝刺激に対する単シナプス誘発性応答を示し続ける。以下の結果は、フロセミドの塩素共輸送拮抗現象に対する抗てんかん効果が興奮性シナプス伝導に対する直接作用とは独立で、関連した興奮性の低下を伴うことのない（ｗｉｔｈ ｏｕｒ）集団活動の脱同期化の結果であることを証明する。
【０１７２】
６枚の海馬スライス標本において、Ｋ＋選択的電極と電場電極はＣＡ１細胞体層に設置され、刺激電極はシャファー側枝経路に設置され、単一パルス刺激（３００μｓ）が２０秒毎に送達された（図１９）。安定的な基線［Ｋ＋］Ｏが少なくとも２０分間観察された後、灌流は低［Ｃｌ−］Ｏ培養液に切り替えられた。低［Ｃｌ−］Ｏ培養液の曝露から１ないし２分以内に、［Ｋ＋］Ｏが上昇しはじめるにつれて電場応答は過興奮性になった。低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露の約４ないし５分後、電場応答の振幅が減退し、完全に消失した。対応する［Ｋ＋］Ｏの記録は、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露直後にカリウムは上昇を開始し、この［Ｋ＋］Ｏの上昇のピークは時間的に過興奮性のＣＡ１電場応答の最大に対応することを示した。電場応答の振幅の減衰と同時に［Ｋ＋］Ｏは減少を開始し、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液曝露から８ないし１０分後には１．８ないし２．５ｍＭ対照レベルより上で実験の残りの間一定になった。４枚のスライス標本は対照培養液に戻され、完全に回復させられた。実験はその後放線状層に設置されたＫ＋選択的微小電極で繰り返された。［Ｋ＋］Ｏの同様の変化の順序は前記の細胞体層で観察された［Ｋ＋］Ｏ値よりも０．２ないし０．３ｍＭ低い値で樹状層で観察された。
【０１７３】
４枚の海馬スライス標本においては、刺激喚起性の［Ｋ＋］Ｏの対照条件と低［Ｃｌ−］Ｏ曝露によりＣＡ１電場応答が完全に消失した後との間の変化に対する応答が比較された。それぞれのスライス標本において、［Ｋ＋］Ｏ選択的な測定は最初は細胞体層で取得され、対照培養液での完全な回復後、実験がＫ＋選択的電極を放線状層に移動させて繰り返された。それぞれ刺激の試行はシャファー側枝に送達された５秒間１０Ｈｚの連続射撃（ｖｏｌｌｅｙ）からなっていた。［Ｋ＋］Ｏのピーク上昇は、対照条件と長時間の低［Ｃｌ−］Ｏ曝露の後との間及び細胞体層と樹状層との間で同様であった。しかし、持続的な低［Ｃｌ−］Ｏ曝露の後に観察された回復時間は対照条件で観察された回復時間より著しく長かった。
【０１７４】
これらの結果は、フロセミドの投与は細胞外空間の［Ｋ＋］Ｏの増加をもたらすことを証明する。脳組織の低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露は直ちに１ないし２ｍＭの［Ｋ＋］Ｏの上昇を誘発し、曝露期間中そのままであり、初期の興奮性の増大及びその後のＣＡ１電場応答の消失と同時に起こった。低［Ｃｌ−］Ｏ曝露中のこのＣＡ１電場応答の消失はニューロン発火時間の脱同期化が原因である可能性が最も高い。意義深いことには、細胞体層と樹状層の両方での［Ｋ＋］Ｏの刺激喚起性増加は、ＣＡ１電場応答の低［Ｃｌ−］Ｏによる完全なブロックの前後でほとんど同一であった。このデータは、同等の刺激喚起性シナプス駆動及び活動電位発生が対照条件と低［Ｃｌ−］Ｏによる完全なブロックの後とで起こったことを示唆する。これらのデータはともに、塩素共輸送体アンタゴニストフロセミドの抗てんかん効果及び脱同期化効果が興奮性シナプス伝導への直接作用とは独立であり、興奮性の減退を伴わない集団活動の脱同期化の結果であることを証明する。
【０１７５】
（実施例１４）
低塩素曝露中の細胞外ｐＨの変化
フロセミドと低［Ｃｌ−］Ｏのようなアニオン／塩素依存性共輸送体のアンタゴニストは、同期化された集団活動の維持に貢献する細胞外ｐＨのトランシェントに影響を与えるかもしれない。ラット海馬脳スライス標本は、ＮａＨＣＯ３が等モル量のＨＥＰＥＳ（２６ｍＭ）に置換されインターフェース型チャンバーが用いられたことを除いて、実施例１３に記載の通り準備された。
【０１７６】
海馬脳スライス標本４枚において、連続した自発的バースト発生は実施例１３に記載の通り１００μＭ ４−ＡＰ含有培養液への曝露により誘発された。電場記録はＣＡ１及びＣＡ３領域の細胞体層から同時に取得された。実験継続中刺激は３０秒毎にシャファー側枝に送達された。少なくとも２０分連続バースト発生が観察された後、スライス標本は名目上重炭酸塩フリーの４−ＡＰ含有ＨＥＰＥＳ培養液に曝露された。ＨＥＰＥＳ培養液への持続的な曝露（０．２時間）からもたらされる自発性又は刺激喚起性の電場応答には、観察される有意な変化はなかった。前記スライス標本が少なくとも２時間ＨＥＰＥＳ培養液に曝露された後、灌流は［Ｃｌ−］Ｏが２１ｍＭに減少された４−ＡＰ含有ＨＥＰＥＳ培養液に切り替えられた。前記低［Ｃｌ−］ＯＨＥＰＥＳ培養液への曝露は、過去に低［Ｃｌ−］ＯＮａＨＣＯ３含有培養液で観察されたのと同一の事象の順序及び同じ時間経過を誘発した。自発的バースト発生の完全なブロックの後、灌流培養液は正常［Ｃｌ−］Ｏ含有ＨＥＰＥＳ培養液に戻された。２０ないし４０分以内に自発的バースト発生が再開した。自発的バースト発生が再開した時には前記スライス標本は名目的に重炭酸塩フリーＨＥＰＥＳ培養液に３時間以上灌流されていた。
【０１７７】
このデータは、同期化及び興奮性に対する塩素共輸送拮抗現象の作用は細胞外ｐＨの変動（ｄｙｎａｍｉｃｓ）への効果とは独立であることを示唆する。
【０１７８】
図４は減少された［Ｃｌ−］Ｏ条件下でのイオン共輸送を示すモデルである。図４Ａの左のパネルは、ニューロンのＩＰＳＰｓの発生に必要な塩素勾配がフロセミド感受性のＫ＋、Ｃｌ−共輸送体を通したイオンの流出によって維持されることを示す。正常条件下では、高濃度の細胞内カリウム（３Ｎａ＋、２Ｋ＋ＡＴＰａｓｅポンプにより維持される）は濃度勾配に対してＣｌ−を排除するための駆動力としての役割を果たす。グリア細胞では、図４Ａの右のパネルに示す通り、フロセミド感受性Ｎａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体を通るイオンの移動は細胞外空間から細胞内空間へである。この共輸送に必要なイオン勾配は、部分的には、低濃度の細胞内ナトリウムを維持できるようにＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体を通してグリア細胞に取り込まれたナトリウムイオンが常に３Ｎａ＋、２Ｋ＋ＡＴＰａｓｅポンプによって排除される、「膜間ナトリウムサイクル」によって維持される。フロセミド依存性共輸送体を通るイオンの流れの速度と方向は、ニューロンのＫ＋、Ｃｌ−共輸送体については（［Ｋ＋］ｉ ｘ ［Ｃｌ−］ｉ − ［Ｋ＋］Ｏ ｘ ［Ｃｌ−］Ｏ）と、グリアのＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体については（［Ｎａ＋］ｉ ｘ ［Ｋ＋］ｉ ｘ ［Ｃｌ−］２ｉ − ［Ｎａ＋］Ｏ ｘ ［Ｋ＋］Ｏ ｘ ［Ｃｌ−］２ｏ）と書き表せるこのイオン産物の差と機能的に比例する。これらのイオン産物の差の符号は、正が細胞内空間から細胞外空間へという、イオン輸送の方向を示す。
【０１７９】
図４Ｂは、持続的な低［Ｃｌ−］Ｏ曝露の結果として生じる、後期に起こる自発性電場事象の出現を説明する現象論的なモデルを示す。ニューロン及びグリアのイオン産物の差をそれぞれＱＮ及びＱＧで表す。対照条件下（１）では、ニューロンについてのイオン産物の差はＮａ＋、Ｋ＋及びＣｌ−が細胞内空間から細胞外空間へ共輸送されるようになり（ＱＮ＞０）、グリア細胞についてのイオン産物の差はＮａ＋、Ｋ＋及びＣｌ−が細胞外空間から細胞内コンパートメントへ共輸送されるようになる（ＱＧ＜０）。［Ｃｌ−］Ｏが減少されたとき（２）は、イオン産物の差はニューロンのＫＣｌの流出は増加するように変化するが、細胞内空間から細胞外空間へのＫＣｌとＮａＣｌの全体としての流出（ｎｅｔ ｅｆｆｌｕｘ）があるように（ＱＧ＞０）グリアのイオン共輸送は逆転する。これらの変化は時とともに細胞外カリウムの蓄積をもたらす。やがて［Ｋ＋］Ｏはニューロン集団の脱分極を誘発するレベルに達し、さらに大きな［Ｋ＋］Ｏの蓄積をもたらす。この細胞外イオンの大量の蓄積は、ＫＣｌが細胞外空間から細胞内空間へ移動するように（ＱＮ＜０、ＱＧ＜０）、イオン産物の差を逆転させるのに役立つ（３）。さらに細胞外カリウムが除去されることにより、やがて膜間イオン勾配は最初の状態に復帰する。この過程を循環することにより、反復的な負の電場事象が発生する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非シナプス的機構を用いて中枢及び末梢神経系の選択された容態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を治療するための方法と組成物に関する。より明確には本発明の１の局面は、中枢神経系のイオン濃度とイオン平衡を改変する試剤（ａｇｅｎｔ）を投与することにより、発作、発作性障害、てんかん、てんかん重積状態、片頭痛、皮質拡延性抑制、頭蓋内高血圧、精神神経疾患及び中枢神経系水腫の治療のための方法と材料と、エタノールのような毒物及びある種の感染因子の病態生理学的な効果を治療しあるいはこれらの効果から保護するための方法と材料と、頭部外傷、脳卒中、虚血及び低酸素症の病態生理学的な効果を治療するための方法と材料と、認知、学習及び記憶のようなある種の脳機能を改善するための方法と材料とに関する。イオン濃度と勾配を改変するため及びさまざまな容態を治療するための、ループ利尿薬を含む特異的な治療組成物と、かかる組成物の類似体及び誘導体とが、かかる組成物と他の因子との併用とともに開示される。末梢神経系のイオン濃度と勾配を改変する因子を投与することにより痛みを治療するための材料と方法も開示される。試験管内の（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及び生体の（ｉｎ ｖｉｖｏ）のシステムを用いて所望の活性について薬物候補組成物をスクリーニングするための方法とシステムが開示される。
【背景技術】
【０００２】
発作性障害、てんかん等のような神経疾患の通常の治療法は、神経伝達物質又は阻害剤の放出又は活性の改変によってのように、興奮経路に影響を及ぼすシナプス機構を標的とする。発作性障害の通常の治療用試剤と治療方式は、ニューロンの興奮性を減少し、シナプスの発火（ｆｉｒｉｎｇ）を抑制する。このアプローチの重篤な欠点は、てんかんは一般に局部的であるのに、その治療法は無差別にニューロン活動に影響を与え（減退させる）ことである。この理由により重篤な副作用があり、通常の薬剤の反復投与は認知、学習及び記憶のような正常で望ましい脳機能の意図しない障害をもたらすことがある。個々の関心のある障害についてのさらに詳細な情報は以下に提供される。
【０００３】
てんかん
てんかんは、大脳ニューロンの異常な放電が特徴で、典型的にはさまざまなタイプの発作として現れる。てんかん発作様活動は、電気生理学的技術を用いて計測可能な、ニューロン集団の自発的に発生する協調的放電と同一とみなされる。てんかん発作様活動を非てんかん発作様活動から区別するこの協調的な活動は、個々のニューロンが段々と時限ロックの鍵のようなやり方で互いに放電しやすくなる状態を表現するため、「過同期化（ｈｙｐｅｒｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）」と呼ばれる。
【０００４】
てんかんは最もありふれた神経疾患で、人口の約１％が罹患する。特発性、症候性及び潜在性を含むさまざまなてんかんの病型がある。遺伝的素因は特発性てんかんの主要な病因因子であると考えられている。症候性てんかんは通例脳の構造的な異常の結果発症する。
【０００５】
てんかん重積状態は、特に重篤な発作の病型で、著しく長時間持続する多発性発作又は発作と発作の間に意識の回復が全くみられない連続的な発作として出現する。てんかん重積状態の成人の全死亡率は約２０％である。最初のエピソードがあった患者は将来のエピソードと慢性てんかん発症のリスクが相当ある。米国でのてんかん重積状態の発生率は毎年約１５０，０００件で、毎年約５５，０００人の死がてんかん重積状態と関係ある。てんかん重積状態と関連する急性の経過は、難治性てんかん、代謝障害（例、電解質異常、腎臓障害及び敗血症）、中枢神経系感染症（髄膜炎又は脳炎）、卒中、成人病、頭部外傷、薬剤毒性及び低酸素症を含む。てんかん重積状態の病態生理学の基礎には単発の発作を正常なら中断させる機構の機能不全が関与する。この機能不全は、異常に持続的な過剰興奮又は無効な抑制の動員から生じる。これまでの研究は興奮性アミノ酸レセプターの過剰活性化が持続性発作を惹起することを示してきて、興奮性アミノ酸は病因であることを示唆する。てんかん重積状態はまた、脳の主要な抑制的神経伝達物質である、γ―アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の効果と拮抗するペニシリン及び類似の組成物によっても惹起される。
【０００６】
てんかんの１つの初期の診断手順は、同時に発生する利尿を防止するために大量の水の経口投与をバソプレッシンの注射とともに行うことを伴う。この治療法はてんかん患者には発作を誘導するがてんかんでない人間にはほとんど誘導しないことが見つけられた（Ｇａｒｌａｎｄら、Ｌａｎｃｅｔ、２：５６６、１９４３）。てんかん重積状態は、カイニン酸処理ラットにおいてマンニトール静注により阻止できる（Ｂａｒａｎら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２１：６７９、１９８７）。この効果は人間の患者に尿素を静注することにより達成される効果と同様である（Ｃａｒｔｅｒ、Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ、３：１９８、１９６２）。これらのケースのそれぞれの治療法は血液と細胞外液の浸透圧を上昇させ、細胞からの水の流出と脳内の細胞外空間の増加をもたらす。別の作用機序（炭酸脱水酵素の阻害）を持つ別の利尿剤であるアセタゾラミド（ａｃｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ、ＡＣＺ）は抗けいれん薬として実験的に研究されてきて（Ｗｈｉｔｅら、Ａｄｖａｎｃｅ Ｎｅｕｒｏｌ．、４４：６９５、１９８６及びＧｕｉｌｌａｕｍｅら、Ｅｐｉｌｅｐｓｉａ、３２：１０、１９９１）、臨床的には限定的に使用されてきた（Ｔａｎｉｍｕｋａｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．、１４：９６１、１９６５及びＦｏｒｓｙｔｈｅら、Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．、２３：７６１、１９８１）。抗けいれん作用機序は不明だが、ＡＣＺは大脳細胞外空間には明らかな効果がある。
【０００７】
伝統的な抗けいれん薬は、（ａ）電位依存性ナトリウムチャンネルを阻害することによる反復性の高周期ニューロン発火の抑制と、（ｂ）γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）性（ＧＡＢＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）後シナプス抑制と、（ｃ）Ｔ型カルシウムチャンネルの阻害の３つの機序のうちの１つにより主要な効果を奏する。フェニトイン（ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）とカルバマゼピン（ｃａｒｂａｍａｚｅｐｉｎｅ）は、ニューロンの規則的な発火には感知できるほどの影響を与えない一方で、持続的な高周期ニューロン脱分極を減少又は除去することにより細胞レベルで効果を奏するナトリウムチャンネルアンタゴニストの例である。フェノバルビタールとベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）のようなバルビツレートは、ＧＡＢＡ性シナプス抑制を増強することにより作用する。両方のクラスの組成物はシナプス後膜の過分極を増大し、結果として抑制を増大する。エトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）とバルプロ酸（ｖａｌｐｏｒａｔｅ）はＴ型電位依存性カルシウムチャンネルを介するカルシウムのニューロンへの流入を減少する薬剤の例である。
【０００８】
現在の抗けいれん薬療法は発作活動への関与の有無に関わらず全ての脳細胞に薬理学的効果を奏する。ありふれた副作用は過度の鎮静、眩暈感、記憶喪失及び肝臓障害である。さらに、てんかん患者の２０ないし３０％は耐療性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）を示す。
【０００９】
シナプス過興奮性に焦点を絞ることはてんかん発生機序の基礎研究と新規抗てんかん薬の設計と発見におけるこれまでの主導的な原理であった。このアプローチの欠点の１つは、今日の大抵の抗てんかん薬が脳内のてんかん発作発現性領域と正常な領域の両方に無差別的にその影響を及ぼすことである。本発明の組成物は、非シナプス経路により作用するためもあって、発作の治療に新規なアプローチを提供する。
【００１０】
片頭痛
片頭痛は米国の人口の１０ないし２０％が罹患しており、毎年推定６４００万労働日が失われている。片頭痛は、時たま起こり、片側性又は両側性で、４から７２時間持続し、しばしば悪心、嘔吐及び光及び／又は音に対する過敏性を伴う、拍動性の頭部の痛みにより特徴づけられる。視覚、感覚、発語又は運動の徴候のような前駆症状を伴うときは、前記の頭痛は、古典的な片頭痛として以前は知られていた「前兆を伴う片頭痛」と呼ばれる。かかる徴候を伴わないときは、前記の頭痛は、普通の片頭痛として以前は知られていた「前兆を伴わない片頭痛」と呼ばれる。両タイプとも強い遺伝的な要素の証拠があり、両方とも女性のほうが男性より３倍罹患しやすい。片頭痛の正確な病因はまだ不明である。片頭痛になりやすい人は、おそらく抑制的神経伝達物質γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の活性低下のために、神経興奮の閾値が低下しているとの学説が立てられている。ＧＡＢＡは正常では、ともに片頭痛発作に関与するとみられる神経伝達物質セロトニン（５−ＨＴ）とグルタミン酸の活性を抑制する。興奮性神経伝達物質グルタミン酸は片頭痛発作を始動する皮質拡延性抑制と呼ばれる電気的な現象に関与し、セロトニンは片頭痛の進行とともに起こる血管の変化に関与する。
【００１１】
皮質拡延性抑制（ＣＳＤ）は後頭部皮質の強烈な脱分極の短い突発波と、それに続く大脳皮質表面を前方に進むニューロンの沈黙と減退した誘発電位の波で特徴づけられる。後頭部皮質ニューロンの増大した興奮性がＣＳＤの基礎であると提案されている。視覚領は興奮性の閾値が比較的低いために最もＣＳＤを起こしやすい。ミトコンドリア疾患、マグネシウム欠乏症及びシナプス前カルシウムチャンネル異常はニューロン過興奮性の原因かもしれない（Ｗｅｌｃｈ、 Ｋ．Ｍ．Ａ．、「片頭痛の病因論（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｇｒａｉｎｅ）」、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１７：４、１９９７）。拡延性抑制が起こっている間、間質の酸性化、細胞外カリウムの蓄積及び細胞内コンパートメントへのナトリウムと塩素イオンの再分布を含む、甚大なイオンの混乱が生じる。さらに、持続的なグリアの膨張が、変更された細胞外のイオン液組成及び間質の神経伝達物質と脂肪酸蓄積に対する恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）反応として起こる。これまでの研究はフロセミド（ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）が麻酔したネコで再生的な皮質拡延性抑制を抑制することを示している（Ｒｅａｄ、Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｅｐｈａｌａｇｉａ、１７：８２６、１９９７）。
【００１２】
抗療性の転換型片頭痛タイプの慢性連日性頭痛（ＣＤＨ）患者８５人の研究は、急性の頭痛の悪化はエルゴタミン（ｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ）、ジヒドロエルゴタミン（ｄｉｈｙｄｒｏｅｒｇｏｔａｍｉｎｅ、ＤＨＥ）及びスマトリプタン（ｓｕｍａｔｒｉｐｔａｎ）のような特定の抗てんかん薬に反応し、頭蓋内圧の上昇の診断後のアセタゾラミン（ａｃｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ）及びフロセミド（ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ）のような試剤の追加投与が症状の改善（ｂｅｔｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｙｍｐｔｏｍｓ）をもたらしたと結論した（Ｍａｔｈｅｗ、 Ｎ．Ｔ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ４６：１２２６−１２３０、１９９６）。前記論文の著者たちは、この結果はさらに研究を要する片頭痛と特発性頭蓋内高血圧との関連を示唆していると注記している。
【００１３】
薬物療法は片頭痛の重篤度と頻度にあわせて処方される。時折頭痛が起こる場合には病勢を頓挫させる治療法が必要とされるが、月に２回以上頭痛が起こる場合又は頭痛が患者の日常生活に重大な影響を与える場合には、予防療法が必要とされる。スマトリプタンのようなセロトニン受容体アゴニストが病勢頓挫療法に処方されてきた。セロトニン受容体アゴニストは拡張した脳血管を収縮させてこれに伴う痛みを軽減すると考えられている。この療法に伴う副作用は刺痛、眩暈感、火照り感（ｗａｒｍ−ｈｏｔ ｓｅｎｓａｔｉｏｎ）及び注射部位反応（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ−ｓｉｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を含む。静脈投与は冠状動脈の血管けいれんのおそれのため禁忌である。エルゴタミンにもとづく薬剤は、主に外部頸動脈の分枝である一部の動脈と小動脈の拡張を特異的に抑える血管収縮剤に分類される。エルゴタミンのリバウンド現象を防止するため、エルゴタミンは片頭痛発症の第２日又は第３日に反復すべきではない。しかし、前記薬剤の使用を急に中止する場合には患者は重篤なリバウンドによる頭痛を経験する。エルゴタミンの過剰消費は冷たく湿った四肢のような血管収縮の徴候を惹起し、麦角中毒につながる。
【００１４】
予防療法に用いる薬剤は、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）のようなアドレナリン作動性ベータ遮断薬、カルシウムチャンネル遮断薬又は低投与量の抗てんかん薬を含む。特に、ＧＡＢＡ合成を増加させるかその分解を減少させるかのいずれかにより、脳内ＧＡＢＡレベルを増加させる抗てんかん薬はある人々には片頭痛を防止する上で有効のようにみえる。一部の患者には、アミトリプチリン（ａｍｉｔｒｉｐｔｌｉｎｅ）のような三環系抗うつ薬（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ａｎａｌｇｅｓｉｃｓ）が有効である。脳内グルタミン酸受容体サブタイプの１つに作用するＮＭＤＡ受容体アンタゴニストはＣＳＤを抑制する。弱いＮＭＤＡ受容体アンタゴニストとして機能すると現在信じられている薬剤又は物質は、デキストロメトルファン（ｄｅｘｔｒｏｍｅｔｈｏｒａｐｈａｎ）、マグネシウム及びケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）を含む。静脈内マグネシウムは片頭痛の発作を頓挫させるために使用することに成功してきた。
【００１５】
さまざまな化学因子及び生物学的因子といくつかの病原因子は神経毒効果がある。ありふれた例は急性エタノール摂取の病態生理学的効果である。エピソード的なエタノール中毒と過度のアルコール中毒に特徴的な禁断は脳障害を起こす。アルコールのヒトへの影響を模倣するように設計された動物モデルは、５ないし１０日間続けて１回量与えることで、大脳皮質の水腫と電解質（Ｎａ＋及びＫ＋）の蓄積を伴った嗅脳溝内皮質、歯状回及び嗅球の神経変性が起こることを証明した。他の神経変性状態と同様、過度のグルタミン酸作動性活動と細胞内カルシウムの増大とγアミノ酪酸の減少とが関与するシナプスにもとづくエキサイトトキシンによる事象に研究の焦点が主に当てられてきた。エピソード的なアルコール被曝により誘導された脳損傷をＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、非ＮＭＤＡ受容体及びＣａ２＋チャンネルアンタゴニストとフロセミドとで共に治療することにより、脳の水分過剰と電解質上昇を防止する一方、アルコール依存性の大脳皮質の損傷は７５ないし８５％減少する（Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｍ．ら、ＦＡＳＥＢ、１２巻１９９８年２月号）。著者らは前記の結果はフロセミド及び関連試剤はアルコール乱用での神経保護剤として有用ではないかと示唆するものであることを観察した。
【００１６】
認知、学習及び記憶
哺乳類の認知能力は皮質のプロセシングに依存すると考えられている。皮質の機能を記述し理解するための最も適切なパラメーターは活動の時空的なパターンであるということは一般的に受け入れられている。特に、長期増強と長期減退は記憶と学習に関係があるとされてきて、認知にも役割を果たすかもしれない。哺乳類の脳の振動的で同期的な活動は特定の行動状態と相関があるとされてきた。
【００１７】
自発的なニューロンの発火活動の同期化が中枢神経系の数多くの正常及び病態生理学的な過程の重要な特徴であると考えられている。例は、認知に関与すると考えられている新皮質のガンマ波のような集団活動の同期化された振動（ＳｉｎｇｅｒとＧｒａｙ、１９９５）と、空間記憶及びシナプス可塑性誘導に役割を果たすと考えられている海馬のシータ波（ＨｅｕｒｔａとＬｉｓｍａｎ、１９９５、ＨｅｕｒｔａとＬｉｓｍａｎ、１９９６、Ｏ’ｋｅｅｆｅ、１９９３）を含む。今日まで、自発的な同調化した活動の発生と維持の基礎となる過程についての大抵の研究はシナプス的機構に焦点を当ててきた。しかし、非シナプス的機構も中枢神経系の正常及び病理学的活動における同調化の改変に重要な役割を果たすかもしれない。
【００１８】
候補組成物のスクリーニングと治療法の効能の評価
薬剤開発プログラムは、被検者を用いる臨床治験を行う前に薬剤候補を評価するために、試験管内でのスクリーニング検定法とその後の適切な動物モデルでの試験に依存する。現在用いられているスクリーニング方法は、伝統的手段及びコンピュータによる手段により生成される無数の候補化合物を試験するために必要なハイスループットスクリーニングを用意するためにスケールアップすることが一般には困難である。さらに、細胞培養系と動物モデルの反応に関する研究は、ヒトの臨床治験の間に観察される反応と副作用を正確には予測しない。
【００１９】
さまざまな因子又は生理活性が試験管内及び生体のシステムの両方において生物材料に及ぼす影響を評価するための通常の方法は、感度が高いわけでも多くの情報を与えるわけでもない。例えば、薬剤のような生理学的な因子が培養下で増殖された細胞又は組織の集団に与える効果を評価することは、ある特定の時点のみにおける細胞又は組織の集団に前記因子が与える効果に関する情報を提供するのが常である。さらに、現在に評価技術は一般に単一又は少数のパラメーターに関する情報を提供する。候補試剤は、濃度との相関関係で決定される細胞毒性について系統的にテストされる。細胞集団が処理され、処理後の１つ又はいくつかの時点で細胞の生存率が計測される。一般的には、細胞毒性は細胞死の原因又は時間経過に関する情報は全く提供しない。
【００２０】
同様に因子は、例えば特定の代謝機能又は代謝産物に与える生理学的な効果にもとづいてしばしば評価される。ある因子が細胞集団又は組織試料に投与されて、関心のある代謝機能又は代謝産物が当該因子の影響を評価するために検定される。このタイプの検定法は有用な情報を提供するが、これは作用機序、他の代謝産物又は代謝機能への影響、生理学的効果の時間経過、一般的な細胞又は組織の健康状態等に関する情報は提供しない。
【００２１】
米国特許第５，９０２，７３２及び５，９７６，８２５号明細書は、培養グリア細胞を用いて、グリア細胞に浸透圧ショックを与えること、薬剤候補を導入すること、該薬剤候補がグリア細胞の膨張を抑制可能かどうか評価することにより、抗けいれん活性について薬剤候補化合物をスクリーニングするための方法を開示する。この特許はまた、アポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導可能な増感因子と浸透圧ストレスを与える因子とをＣＮＳ細胞に加えること、前記薬剤候補を加えること、前記薬剤候補が細胞膨張を抑制可能かどうか評価することにより、アルツハイマー病の徴候を防止又は治療するためあるいは虚血の結果起こるＣＮＳ損傷を防止するための活性について薬剤候補化合物をスクリーニングするための方法をも開示する。高分子の組織インプラントの内部の生細胞の寸法（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）を計測すること、該細胞に浸透圧でショックを与えること、細胞膨張の変化を評価することを伴う、高分子組織インプラントの内部の生細胞の生存能力と健康状態を決定するための方法も開示される。細胞膨張活性の評価は内在性光学信号を光学的な検出システムを用いて計測することにより達成される。
【発明の概要】
【００２２】
本発明の選択された治療用組成物及び方法は、発作、発作性障害、てんかん重積状態を含むてんかん、片頭痛、皮質拡延性抑制、頭蓋内高血圧、精神神経疾患及び中枢神経系水腫を含む中枢神経系の容態の治療のために有用である。本発明の選択された治療用組成物と方法は、エタノールとある種の感染因子のような神経毒性因子の病態生理学的な効果を治療しその効果から保護するため及び頭部外傷、卒中、虚血及び低酸素症の病態生理学的な効果を治療するためにも適している。別の実施態様によると、本発明の治療試剤と方法は、認知、学習及び記憶の皮質中枢のようなある種の皮質組織の機能を改善する。さらに、本発明の治療試剤と方法は、末梢神経系の痛みに伴うインパルスの伝導に影響を与え又は改変することにより、痛みを治療するためにも有用である。本発明の治療用組成物と方法はエピソードごとにあるいは予防的に使用でき、ヒト及び獣医学への応用の両方に適している。
【００２３】
本発明の方法と組成物は、非シナプス的機序により、より明確には、ニューロン集団活動の同期化を改変することにより、中枢及び末梢神経系のさまざまな容態の治療することに関与する。好ましい実施態様によると、ニューロン集団活動の同期化は中枢及び／又は末梢神経系のアニオン濃度と勾配を改変することにより操作される。イオン依存性共輸送体アンタゴニストは適切な治療用組成物であり、アニオン共輸送体アンタゴニストは好ましい治療用組成物であり。カチオン−塩素共輸送体アンタゴニストは特に好ましい治療用組成物である。１の実施態様によれば、Ｎａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−塩素共輸送体アンタゴニストは、ニューロン集団活動の同期化を改変するための特に好ましい治療用試剤である。アニオン共輸送体アンタゴニストは、発作、てんかん及びてんかん重積状態、皮質拡延性抑制及び片頭痛、頭蓋内高血圧、精神神経疾患、中枢神経系水腫の治療のような状態を治療するためと、エタノールとある種の感染因子のような神経毒性因子の病態生理学的な影響を治療しその影響から保護するためと、痛みの知覚の減少のためとに有用である。例えば認知、学習及び記憶に関連する皮質領域の機能を改善するために、塩素共輸送体アゴニストは好ましい治療用試剤であり、カチオン−塩素共輸送体アゴニストは特に好ましい治療用試剤である。イオン依存性共輸送体アゴニスト及びアンタゴニスト活性及びさまざまな容態と障害を治療する効能について候補化合物をスクリーニングするための方法も提供される。
【００２４】
「非シナプス的」機序を用いる本発明の方法と化合物への言及は、神経伝達物質の放出又は活性あるいは抑制物質の放出又は活性のようなニューロン興奮性に関連する機序は本発明の方法と試剤によって影響を受けないということを意味する。同様に、イオンチャンネル及び受容体は本発明の方法と組成物によって直接影響を受けることはない。むしろ、本発明の方法と治療用試剤はニューロン集団活動の同期化又は相対的同期性に影響を与える。本発明の好ましい方法と治療用試剤は、ニューロンの興奮性に影響を与えることなく、中枢又は末梢神経系での細胞外アニオン塩素の濃度及び／又は勾配を改変する。
【００２５】
本発明の１つの局面は、発作その他の中枢神経系の病態生理学的な状態に関連したニューロン集団活動の過同期化を減少又は除去することによりニューロンの放電の同期化を改変するための治療用試剤と方法に関する。１の実施態様では、前記治療用組成物は中枢神経系内の細胞外空間でのアニオン濃度、好ましくは塩素濃度を改変可能である。好ましい実施態様では、治療用試剤は塩素共輸送体アンタゴニストである。別の好ましい実施態様では、治療用試剤はカチオン塩素共輸送体アンタゴニストであり、特に好ましい実施態様では、治療用試剤はグリア細胞Ｎａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体アンタゴニストである。さらに別の好ましい実施態様によれば、治療用試剤はグリア細胞において高レベルのカチオン−塩素共輸送体アンタゴニスト活性を有し、ニューロンと腎臓細胞において低レベルのイオン依存性共輸送体活性を有する。好ましい中枢神経系の治療用試剤は血液脳関門を通過でき、あるいは中枢神経系への試剤の送達を促進する送達システムを用いて投与されることが好ましい。
【００２６】
一般には、フロセミド、ブメタニド（ｂｕｍｅｔａｎｉｄｅ）、エタクリン酸（ｅｔｈａｃｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ）等のようなループ利尿薬は、イオン依存性共輸送体アンタゴニスト活性を示し、本発明の治療用組成物として用いるのに適している。かかるループ利尿薬は細胞外アニオン塩素濃度とイオン勾配の所望の改変を起こし、ニューロン集団活動の同期化の改変を起こすが、これらはまた他の望ましくない効果も起こす。例えばフロセミドはグリアとニューロン細胞の両方とともに腎臓においてもカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストとして作用する。イオン依存性共輸送体アンタゴニスト活性を示す特に好ましい本発明の治療用試剤は、グリア細胞集団では高い活性を示すがニューロンと腎臓の細胞集団ではより低い活性を示す。
【００２７】
てんかん重積状態の治療法は、他の治療用試剤とともに、イオン依存性共輸送体アンタゴニストを、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを投与することを伴う。フロセミドその他のループ利尿薬は適切なカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストである。実験的研究は、フロセミド処理はニューロン集団活動の同期化の一時的で早い増大とその後に続くてんかん発作様の活動に特徴的な過同期化の持続的で完全な中断を起こすことを示した。本発明によると、てんかん重積状態の治療はイオン依存性共輸送体アンタゴニストを、好ましくはフロセミドのようなカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを、フロセミドの投与により観察されるニューロン集団活動の一時的で早い増大に関連する症状を治療することができる、バルビツレートのような他の試剤とともに投与することを伴う。
【００２８】
発作及び発作性障害、てんかん、片頭痛、皮質拡延性抑制、頭蓋内高血圧、精神神経疾患のため及び神経毒性因子、頭部外傷、卒中、虚血及び低酸素症の病態生理学的な影響を治療しこれらの影響から保護するための方法と治療用組成物は、好ましくは中枢神経系内のイオン勾配の改変によりニューロン集団活動の同期化を改変することを伴う。イオン依存性共輸送体アンタゴニストは好ましい治療用組成物であり、カチオン−塩素共輸送体アンタゴニストは特に好ましい治療用組成物である。前記イオン依存性共輸送体アンタゴニスト治療用組成物が例えばグリア細胞に関しては活性を有するがニューロン細胞に関してはより低い活性を有するか全く活性を有しない場合は、それは単独投与に適する。前記イオン依存性共輸送体アンタゴニスト治療用組成物がニューロンに関して他のタイプの細胞とともに活性を有する場合は、それは通常の抗てんかん薬又は抗けいれん薬のような他の試剤とともに投与されることが好ましい。
【００２９】
本発明の別の局面は、末梢神経系のある種の神経繊維における活動電位の伝播又はインパルスの伝導に影響を与え又は改変することによる痛み又は痛みの知覚の緩和のための方法と試剤に関する。より明確には、イオン依存性共輸送体への作用により、末梢神経系の細胞におけるイオン濃度とイオン勾配変化が痛みの知覚又は感覚を減少する。末梢神経系に送達されたイオン依存性共輸送体アンタゴニストと、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストが痛みの減少のための好ましい治療用組成物である。
【００３０】
さらに別の本発明の局面は、中枢神経系の認知、学習及び記憶中枢の機能を増強するための方法と試剤に関する。ニューロン集団活動の増強された同期化は中枢神経系皮質の認知能力、学習及び記憶機能に関連した中枢での機能を改善する。認知、学習及び記憶機能を増強するための本発明の治療用組成物と方法は、好ましくは同期化とタイミングの同調を増強することにより、ニューロン集団活動の同期化とタイミングを改変することを伴う。１の実施態様によると、同期化の増強は、脳内の細胞外アニオン塩素濃度とイオン勾配を改変できる試剤を投与することにより達成される。イオン依存性共輸送体アゴニストは好ましい治療用試剤であり、カチオン−塩素共輸送体アゴニストは特に好ましい治療用試剤である。イオン依存性共輸送体アゴニスト活性について候補組成物をスクリーニングするための方法も提供される。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法とシステムは、細胞、組織、細胞下の構成要素及び個体全体を含む生物学的材料の生理状態を評価するための光学的な、あるいは分光学的な技術を用いる。前記生物学的材料はヒト、動物又は植物由来のものであってもよく、いかなるかかる材料由来であってもよい。生理学的なチャレンジ又はテスト用試剤の投与に対する反応として生じる前記生物学的材料の幾何学的構造及び／又は内在性光学的特性の静的及び動的な変化は、前記生物学的材料の生理状態及び健康状態の変化を表示し予言する。
【００３２】
（１）直径、体積、立体的な位置関係（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、個々の細胞の細胞内空間又は個々の細胞の周囲の細胞外空間の幾何学的変化と、（２）光散乱、反射、吸収、屈折、回折、複屈折、屈折率、Ｋｅｒｒ効果等のような、個々の細胞あるいは細胞集団の１以上の内在性光学的特性の変化という、２つの異なるクラスの動的現象が光学的な検出技術を用いて生きたままの生物学的材料で観察される。両方のクラスの現象とも、コントラスト増強剤の助けを借りてあるいは借りずに、静的又は動的に観察できる。幾何学的な変化は、直接的に個々の細胞の幾何学的な特性を測定する（又は近似値を求める）ことにより、あるいは間接的に細胞の光学的特性の変化を観察することにより評価できる。個々の細胞又は細胞集団の光学的特性の変化は本発明のシステムを用いて直接的に評価できる。
【００３３】
個々の細胞又は細胞集団の幾何学的及び／又は内在性光学的特性の観察と解釈は、試験管内と生体内のシステムの両方ともにおいて、固定剤のような生理学的に侵襲する材料を適用することにより試料の特性を変更することなく達成される。生体染色色素のような生理学的に非侵襲的なコントラスト増強剤は所望の応用において光学的検出技術の感度を上げるために用いてもよい。コントラスト増強剤を用いる応用では、光学的検出技術は生物学的材料の外在性光学的特性を評価するのに用いられる。
【００３４】
個々の細胞又は試料細胞集団の幾何学的及び／又は内在性光学的特性の検出と解析は、個々の細胞又は試料細胞集団の生理状態の分類を可能にする情報を提供する。試料細胞集団の幾何学的及び／又は光学的特性の解析にもとづいて、前記試料は、生存可能か生存不可能か、アポトーシス状態、壊死状態、増殖中、活動、抑制、同期化又はこれらに類する状態、あるいはさまざまな生理状態のいずれかであって、その全てが明瞭な幾何学的及び／又は光学的プロフィールを生じる状態として分類できる。したがって本発明の方法とシステムは試料集団の生理状態の同定とさまざまな生理状態の鑑別のために提供される。
【００３５】
本発明の方法とシステムの重要な応用は、さまざまなテスト用試剤とテスト用条件に曝露することの効果を評価するために細胞集団をスクリーニングすることに関する。さまざまなテスト用試剤と条件の効果は正常及び病理的な試料集団にもとづいて評価できる。安全性及び細胞毒性テストは、試料集団をテスト用試剤又はテスト用条件に曝露すること、該テスト用試剤又はテスト用条件の投与後の１以上の時点で光学的技術を用いて該試料集団の生理状態を評価することにより行われる。かかる試験はテスト用試剤又は条件が所望の標的試料集団にいかなる効果を与えるかを決定するため、そしてテスト用試剤又は条件が該テスト用試剤又は条件の標的でない試料集団に生理的な副作用を起こすかどうかを予測するため、さまざまな試料集団について行われる。
【００３６】
好ましい実施態様によると、テスト用試剤又は条件の投与前に生物学的材料に病理的状態がシミュレーションされて、その病的状態又は問題のある（ｃｏｍｐｒｏｍｉｚｅｄ）状態を治療するために前記テスト用試剤又は条件がふさわしいかどうか評価する。細胞外浸透圧又はイオン濃度の変化、酸素又は栄養又は代謝産物の条件の変更、薬剤又は診断用又は治療用試剤、イオン恒常性の乱れ、電気的刺激、炎症、さまざまな因子の感染、放射線被曝等の生理学的なチャレンジに試料集団を曝露することは細胞又は組織レベルで病理的な状態をシミュレーションする。その後に前記試料集団にテスト用試剤又は条件を曝露すること、前記試料集団に幾何学的及び／又は光学的特性の変化を検出し解析することにより、該テスト用試剤又は条件により生じた前記試料集団の生理状態に関する情報が与えられる。スクリーニング技術は、ハイスループット用の自動化されたスクリーニングシステムを用意すべく適当な細胞培養条件下で試験管内で維持された、さまざまなタイプの細胞試料集団に使用するために改変されてもよい。代替策として、スクリーニング技術は、生理学的なチャレンジ及び／又はテスト用試剤の投与が動物モデルでの自然位での（ｉｎ ｓｉｔｕ）さまざまな細胞集団に与える効果を評価すべくさまざまな動物モデルを用いて細胞及び組織集団を調べるために改変されてもよい。さらに本発明のスクリーニング技術は、生理学的に非侵襲的であり分光学的技術を用いるため、患者の状態を評価し監視すべく、そして治療用試剤又は治療方式の効能を評価し監視すべく、ヒトの自然位での細胞及び組織集団を調べるために改変されてもよい。
【００３７】
個々の細胞又は細胞集団の幾何学的及び／又は光学的特性の変化は、特定の細胞タイプ、細胞密度及びさまざまな生理学的な状態について経験的に決定された基準との関連で決定され、あるいは直接比較するデータを提供するために前記テスト用試料と同時に並べて（ｉｎ ｔａｎｄｅｍ）適当な対照実験を行ってもよい。テスト用試剤又は条件が試料集団に与える効果の時間経過に関係するデータを提供するため、複数の時点でデータが収集され好ましくは記録される。適切な対照実験、さまざまな投与量、活性等をスクリーニングするための複数の試料を含むスクリーニングプロトコールを設計するための戦略は当業者に周知であり、本発明の方法とシステムとともに用いるために改変してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１Ａ〜Ｄは、ラット海馬スライス標本における放電活動後に誘発された刺激に対するフロセミドの効果を示す。
【図２】図２Ａ〜Ｒは、試験管内のモデルの自発的てんかん様バースト放電のフロセミドによるブロックを示す。
【図３】ウレタン麻酔されたラットにおけるカイニン酸により誘発された電気的な「てんかん重積状態」のフロセミドによるブロックを示し、上のトレースはＥＫＧ記録を示し、下のトレースは皮質のＥＥＧ記録を示す。
【図４】図４Ａ及びＢは、減少した塩素濃度条件下でのイオン共輸送の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明の好ましい治療用試剤と方法は、発作その他の中枢神経系の病態生理学的な障害を治療するために、てんかん性焦点のような同期化が亢進した領域でのニューロン集団活動の同期性を改変し又は中断する。以下に詳細に説明され実施例に示されたように、イオン依存性共輸送体、好ましくはカチオン−塩素共輸送体によるイオンの移動とイオン勾配の変動はニューロンの同期化の調節にとって重要である。塩素共輸送体機能は長い間主に塩素を細胞外に移動することを目的とすると考えられてきた。ニューロンに局在することが示されてきたナトリウム非依存性輸送体は塩素イオンをニューロンの外に移動する。ループ利尿薬フロセミドの投与のようなこの輸送体のブロックは、フロセミドのようなカチオン−塩素共輸送体に対する短期的な反応である過興奮を起こす。しかし、フロセミドの長期的な反応は、グリア関連Ｎａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体を介した塩素イオンの細胞内へのナトリウム依存性移動が、興奮性と刺激喚起性細胞活動とに影響を与えることなくニューロン同期化と発作をブロックするうえで積極的な役割を果たすことを証明する。
【００４０】
１の実施態様によると、発作と、発作、発作性障害、てんかん重積状態を含むてんかん、片頭痛、皮質拡延性抑制、頭蓋内高血圧、精神神経疾患、中枢神経系水腫、アルコール曝露により誘導された毒性のような神経毒性、頭部外傷の病態生理学的な影響、卒中、虚血及び低酸素症、その他の中枢神経系内のイオンの平衡失調を原因あるいは結果とする状態又はニューロン集団の同期化した放電のようなある種の皮質の容態との治療のための本発明の組成物と方法は、イオン依存性共輸送体活性を改変する。発作性障害その他の皮質の状態を治療ための本発明の治療用試剤はイオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。好ましい実施態様によると、本発明の試剤と方法はグリア細胞のＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−塩素依存性共輸送体システムに優先的に作用し、ニューロン及び腎臓細胞のような他の細胞タイプの塩素依存性共輸送体システムには弱い活性を有する。
【００４１】
別の実施態様では、本発明の材料と方法は片頭痛とその前駆症状である皮質拡延性抑制（ＣＳＤ）を治療するために用いられる。拡延性抑制の間、間質の酸性化、細胞外カリウム蓄積及びナトリウムと塩素イオンの細胞内コンパートメントへの再分布を含む重大な混乱が発生する。さらに、細胞外液イオン組成の変化及び間質の神経伝達物質と脂肪酸の蓄積に対する恒常性反応として、持続的なグリアの膨張が起こる。本発明の材料と方法は塩素依存性共輸送体を介する塩素イオンの細胞内へのナトリウム依存性移動をブロックすることによりＣＳＤの発生と持続を抑制する。片頭痛と皮質拡延性抑制を治療するための本発明の治療用組成物はカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。好ましい実施態様によると、片頭痛と皮質拡延性抑制を治療ための本発明の試剤と方法はグリア細胞のＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−塩素依存性共輸送体システムに優先的に作用し他の細胞タイプ、特にニューロンと腎臓細胞の塩素依存性共輸送体システムには弱い活性を有する。
【００４２】
さらに別の本発明の局面はさまざまな化学的及び生物学的因子といくつかの感染因子による神経毒性の治療に関する。本発明の組成物と方法は急性エタノール摂取の神経変性的効果を減らすうえで特に有効である。さらに、本発明の組成物は例えば急性エタノール摂取による神経毒性の効果から皮質組織を保護するために予防的に投与されてもよい。治療のため又は神経毒性の効果から保護すべく予防的投与のための本発明の治療用組成物はイオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。好ましい実施態様によると、片頭痛と皮質拡延性抑制を治療するための本発明の試剤と方法は、グリア細胞のＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−塩素依存性共輸送体システムに優先的に作用し、他の細胞タイプ、特にニューロンと腎臓細胞の塩素依存性共輸送体システムには弱い活性を有する。
【００４３】
さらに別の実施態様によると、本発明の組成物と方法は痛みの知覚と感覚を軽減するために用いることもできる。この実施態様において、本発明の組成物と方法は末梢神経系の無髄性繊維の活動電位の伝播を改変し、これにより痛みの知覚と感覚を軽減する。痛みを治療し又は痛みから保護するために予防的に投与するための本発明の試剤は、末梢神経系において細胞外イオン濃度及び／又はイオン勾配を改変するイオン依存性塩素共輸送体アンタゴニストを含み、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。好ましい実施態様によると、痛みを治療する本発明の組成物は優先的にグリア細胞又はシュワン細胞のカチオン−塩素共輸送体システムに優先的に作用し、ニューロンと腎臓細胞のような他の細胞タイプの塩素依存性共輸送体システムには弱い活性を有する。
【００４４】
さらにべつの実施態様では、本発明の材料と方法は認知、学習及び記憶のようなある種の皮質機能を増強するための用いることもできる。この応用のためには、本発明の組成物と方法はニューロン集団活動の同期化を中断するというよりもむしろ改変し増強する。認知、学習及び記憶のような皮質機能を増強するための本発明の組成物はイオン依存性共輸送体アゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。
【００４５】
本発明の組成物はヒト及び獣医学的応用に適しており、薬事的な組成物として送達されることが好ましい。薬事的な組成物は１以上の治療用試剤と生理学的に容認できる担体を含む。本発明の薬事的な組成物は生物学的に活性又は不活性な他の組成物をも含んでもよい。例えば、塩素共輸送体アゴニスト又はアンタゴニストのクラスからの１以上の組成物が別の試剤との併用治療として組み合わせることもでき、本発明の治療方式に従って投与できる。かかる併用は分離した組成物として投与してもよく、相補的な送達システムで送達するために組み合わされてもよく、あるいは混合物又は融合化合物のように組合せられた組成物として処方通り調製され（ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）てもよい。
【００４６】
当業者に周知のいかなる適当な担体でも本発明の薬事的な組成物に用いることができるが、好ましい担体は好ましい投与モードに依存する。本発明の組成物は、例えば局部的、口、鼻、直腸、静脈内、頭蓋内、腰椎穿刺、腹腔内、経皮的、皮下又は筋肉内投与を含む、いかなる適当な投与モード用の処方に合わせてでも調製できる。皮下注射のような非経口的投与用には、担体は水、生理食塩水、グリセリン、プロピレングリコール、アルコール、脂肪、ロウ及び／又は緩衝液を含むのが好ましい。経口投与用には、上記のいずれかの担体又はマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、ケイ酸塩、ポリエチレングリコール、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、色素及び炭酸マグネシウムのような固体の担体が用いられる。直腸投与用には、水性ゲル剤又は他の当業者に周知の適当な処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を投与できる。固体の組成物も軟らかい及び堅い充填されたゼラチンカプセルの充填剤として用いることができる。これに好ましい材料は、ラクトース又は乳糖（ｍｉｌｄ ｓｕｇａｒ）及び高分子量ポリエチレングリコールを含む。水溶液又はエリキシルが経口投与用に望ましいときは、本質的な活性成分はさまざまな甘味料又は香料、着色剤又は色素、そして所望なら、乳状化剤又は沈殿防止剤を、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン及びこれらの組合せのような希釈液とともに併用することができる。
【００４７】
治療用組成物の全身への分布を減らす局部的脳内投与は浸透圧ポンプのような機械化された送達システムにより灌流することによりあるいは脳内の限局された領域に一定の時間経過にわたり治療用組成物の制御された拡散を提供するために非反応性の担体に取り込まれた治療用組成物の一投与量を埋め込むことにより提供される。他のタイプの長期間にわたって放出する（ｔｉｍｅ ｒｅｌｅａｓｅ）処方も要件を満たす。さらに、注射、浸透圧ポンプ又はその他の手段による脳脊髄液への直接投与もある種の応用には好ましい。
【００４８】
ここに説明した組成物は持続的放出処方の一部として投与できる。一般的にはかかる処方は周知の技術を用いて調製され、例えば経口、直腸、経皮送達システム又は処方又は治療装置の１以上の所望の標的部位への埋め込みにより投与される。持続放出処方は、イオン依存性共輸送体アゴニスト又はアンタゴニストを単独で含むか第２の治療用試剤と組み合わせて含み、担体マトリクスに分散され及び／又は放出速度制御膜に囲まれた貯蔵庫に収容された、治療用組成物を含むものであってもよい。かかる処方とともに用いられる担体は生物適合性を有し生分解性もあるものでもよい。１の実施態様によると、前記持続的放出処方は活性組成物の放出が比較的一定レベルに保たれる。別の実施態様によると、前記持続的放出処方は、例えばある種の症状の立ち上がりと同時に、治療用組成物の前もって決められた投与量を送達するために、患者本人又は医療関係者によって作動させることができる装置に収容されている。持続的放出処方に収容された治療用組成物の量は埋め込まれた部位、放出速度と予想持続時間及び治療又は防止される状態の性質に依存する。
【００４９】
発作、発作性障害、てんかん、てんかん重積状態、片頭痛、拡延性抑制、その他のニューロン集団活動の同期化により特徴づけられる容態と、頭蓋内高血圧、中枢神経系水腫、神経毒性等の皮質障害又は容態の治療のための本発明の組成物は、中枢神経系に前記治療用組成物が送達されるのを促進する処方と投与経路を用いて投与されるのが好ましい。イオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストのような治療用組成物は血液脳関門の通過を促進するように処方され、あるいは血液脳関門を通過する試剤とともに共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）されるのがよい。治療用組成物は、血液脳関門を通過する例えばリポソーム処方で送達されてもよく、あるいは血液脳関門を通過する例えばブラジキニン、ブラジキニン類似体又は誘導体、又はＳＥＲＡＰＯＲＴのような他の化合物のような他の化合物とともに共投与されてもよい。代替策として、本発明の治療用組成物は循環する脳脊髄液中に直接前記治療用組成物を入れる脊髄穿刺を用いて送達されてもよい。慢性てんかんと、エピソード的発作と、拡延性抑制及び片頭痛のエピソードの間のようないくつかの治療状態については、血液脳関門の一時的又は永続的な破壊があるかもしれないので、前記治療用組成物が血液脳関門を通過するための特別な処方を不要である。
【００５０】
ここに開示された治療用組成物の投与の経路と頻度は、投与量とともに、適応症により、個人個人で異なり、標準的な技術を用いて容易に確定できる。一般的には、適切な投与量と治療方式は治療及び／又は予防療法の便益を生じるために十分な量の活性の組成物を提供する。投与量と治療方式は治療を受けていない患者と比較した治療を受けた患者の臨床的な転帰の改善を監視することにより確立できる。適切な投与量は上記の通り投与されたときに患者に治療の反応が見られる組成物の量をいう。治療上有効な投与量と治療方式は治療を受ける患者の容態、状態の重篤度及び一般状態に依存する。本発明の治療用組成物の薬物動力学及び薬力学は患者によって異なるため、ある患者について治療上有効な投与量を決定するための好ましい方法は徐々に投与量を上げていき臨床的及び検査結果の兆候を監視することである。急性のエピソード的な状態、慢性状態又は予防法の治療のための適切な投与量と治療方式は前記患者の状態に適合させるため必然的に違ってくる。
【００５１】
代表的な治療方式においては、本発明の薬事的製剤は、単独で又は任意的に第２の試剤との併用で投与される。発作とてんかんのような発作関連障害の併用治療においては、イオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む本発明の治療用組成物は１以上の抗けいれん薬又は抗てんかん薬との併用で中枢神経系に前記治療用組成物を送達する送達システムを用いて投与される。しばしば前記第２の試剤の投与量は、前記イオン依存性共輸送体アンタゴニストの神経生理学的な活性の結果として、標準的な投与量以下となることがある。イオン依存性アンタゴニストを含む対象組成物と併用される第２の試剤の例示は、フェニトイン、カルバマゼピン、バルビツレート、フェノバルビタール、ペントバルビタール（ｐｅｎｔｂａｒｂｉｔａｌ）、メフォバルビタール（ｍｅｐｈｏｂａｒｂｉｔａｌ）、トリメタジオン（ｔｒｉｍｅｔｈａｄｉｏｎｅ）、メフェニトイン（ｍｅｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）、パラメタジオン（ｐａｒａｍｅｔｈａｄｉｏｎｅ）、フェンテニレート（ｐｈｅｎｔｈｅｎｙｌａｔｅ）、フェナセミド、メタルビタール（ｍｅｔｈａｒｂｉｔａｌ）、ベンズクロロプロパンミド（ｂｅｎｚｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｎｍｉｄｅ）、フェンスクシミド（ｐｈｅｎｓｕｘｉｍｉｄｅ）、プリミドン（ｐｒｉｍｉｄｏｎｅ）、メトスクシミド（ｍｅｔｈｓｕｘｉｍｉｄｅ）、エトトイン（ｅｔｈｏｔｏｉｎ）、アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、ジアゼパム（ｄｉａｚｅｐａｍ）、クロナゼパム（ｃｌｏｎａｚｅｐａｍ）、クロラゼパート（ｃｌｏｒａｚｅｐａｔｅ）、フォスフェニトイン（ｆｏｓｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）、エトスクシミド（ｅｔｈｏｓｕｘｉｍｉｄｅ）、バルポレート（ｖａｌｐｏｒａｔｅ）、フェルバマート（ｆｅｌｂａｍａｔｅ）、ガバペンチン（ｇａｂａｐｅｎｔｉｎ）、ラモトリジン（ｌａｍｏｔｒｉｇｉｎｅ）、トピラマート（ｔｏｐｉｒａｍａｔｅ）、ビグラバトリン（ｖｉｇｒａｂａｔｒｉｎ）、チアガビン（ｔｉａｇａｂｉｎｅ）、ゾニサミド（ｚｏｎｉｓａｍｉｄｅ）、クロバザム（ｃｌｏｂａｚａｍ）、チオペンタール（ｔｈｉｏｐｅｎｔａｌ）、ミダゾプラム（ｍｉｄａｚｏｐｌａｍ）、プロポフォール（ｐｒｏｐｏｆｏｌ）、レベチラセタム（ｌｅｖｅｔｉｒａｃｅｔａｍ）、オキシカルバゼピン（ｏｘｃａｒｂａｚｅｐｉｎｅ）、ＣＣＰエン（ＣＣＰｅｎｅ）、ＧＹＫ１５２４６６及びスマトリプタンを含む。容易に理解できる通り、上記の化合物は適する併用治療の例に過ぎず、他の化合物又は同様のクラスの化合物も適する。
【００５２】
てんかん重積状態を治療するための１の好ましい実施態様において、イオン依存性共輸送体アンタゴニスト活性、好ましくはフロセミド又は他のループ利尿薬のようなカチオン−塩素共輸送体活性を有する本発明の治療用組成物はバルビツレートのような伝統的な抗発作薬と併用して投与される。この治療方式では、バルビツレート又は他の抗発作薬は、ニューロン集団活動の過興奮を減衰させ、発作の症状を治療するためにシナプス的機序で作用する。イオン依存性共輸送体アンタゴニストは、発作活動の領域でのニューロン集団活動の過同期化を減衰するために非シナプス的機序で作用する。この治療用組成物の組合せは緊急事態ごとにてんかん重積状態の治療のために投与でき、中枢神経系に治療用組成物を送達するさまざまな送達技術を用いて投与できる。したがって、本発明は１以上のイオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくは１以上のカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを、例えばフェニトイン、カルバマゼピン、バルビツレート、フェノバルビタール、ペントバルビタール、メフォバルビタール、トリメタジオン、メフェニトイン、パラメタジオン、フェンテニレート、フェナセミド、メタルビタール、ベンズクロロプロパンミド、フェンスクシミド、プリミドン、メトスクシミド、エトトイン、アミノグルテチミド、ジアゼパム、クロナゼパム、クロラゼパート、フォスフェニトイン、エトスクシミド、バルポレート、フェルバマート、ガバペンチン、ラモトリジン、トピラマート、ビグラバトリン、チアガビン、ゾニサミド、クロバザム、チオペンタール、ミダゾプラム、プロポフォール、レベチラセタム、オキシカルバゼピン、ＣＣＰエン（ＣＣＰｅｎｅ）、ＧＹＫ１５２４６６及びスマトリプタンのうち１つから選択された１以上の伝統的な抗発作薬と併用して投与することを伴う治療方式を意図する。本発明は１以上の塩素共輸送体アンタゴニストを１以上の抗けいれん薬又は抗発作薬とともに含む組合せも意図する。１の実施態様によると、前記組合せは２時間以下の期間過興奮を減らすのに十分な前もって選択された投与量の１以上の抗けいれん薬又は抗発作薬を、２時間以上の期間ニューロン集団活動の過同期化を減らすのに十分な前もって選択された投与量の１以上のアニオン依存性共輸送体アンタゴニストとともに含む。
【００５３】
好ましい実施態様によると、本発明は前もって選択された投与量のフロセミド又は他のイオン依存性共輸送体アンタゴニストとバルビツレートとの組合せを有する容器を意図する。「容器」という用語は、その中に前もって選択された投与量の本発明の併用試剤を格納した、小箱（ｐａｃｋｅｔ）、瓶（ｊａｒ）、薬瓶（ｖｉａｌ）、ボトル（ｂｏｔｔｌｅ）及びその他の固体又は微粒子送達システムにおける治療用組成物のための容器を、注射器及びその他の袋（ｂａｇ）、薬瓶、ボトル等のような液体格納手段とともに意図する。前記組合せは、組合せの各々の組成物が別々に包装され投与されるか、あるいは組成物が同時に投与するための混合剤として包装され投与されてもよい。本発明は前もって選択された投与量のイオン依存性共輸送体アンタゴニストと抗けいれん薬又は抗てんかん薬との組合せを有する１以上の容器を設置した、病院、診療所、移動式ユニット（ｍｏｂｉｌｅ ｕｎｉｔ）等の救命用又は外科用スイート（ｓｕｉｔｅ）も意図する。
【００５４】
片頭痛と皮質拡延性抑制の治療のための本発明の治療用組成物は、任意的に１以上の他の治療用組成物と組み合わせた、イオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。前記イオン依存性共輸送体アンタゴニストは他の治療方式と一緒に又は関連してか、例えば違う時間に又は違う送達技術を使って別々にかのいずれかで、投与されてもよい。イオン依存性共輸送体アンタゴニストの投与と併用されるときは、しばしば片頭痛又は拡延性抑制の通常の治療用組成物の投与量は標準的な投与量以下に減らされる。したがって本発明は、例えば、エルゴタミン、ジヒドロエルゴタミン、スマトリプタン、プロプラノロール、（ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ）、アテノロール（ａｔｅｎｏｌｏｌ）、チモロール（ｔｉｍｏｌｏｌ）、ナドロール（ｎａｄｏｌｏｌ）、ニフェジピン（ｎｉｆｅｄｄｉｐｉｎｅ）、ニモジピン（ｎｉｍｏｄｉｐｉｎｅ）ベラパミル、（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）、アスピリン（ａｓｐｉｒｉｎ）、ケトプロフェン（ｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、トフェナム酸（ｔｏｆｅｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、（ｍｅｆｅｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）、ナプロキセン（ｎａｐｒｏｘｅｎ）、メチセルギド（ｍｅｔｈｙｓｅｒｇｉｄｅ）、パラセタモール（ｐａｒａｃｅｔａｍｏｌ）、クロニジン（ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ）、リスリド（ｌｉｓｕｒｉｄｅ）、イプラゾクロム（ｉｐｒａｚｏｃｈｒｏｍｅ）、ブタルビタール（ｂｕｔａｌｂｉｔａｌ）、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）及びジバルルロエックスナトリウム（ｄｉｖａｌｐｒｏｅｘ ｓｏｄｉｕｍ）のうちの１つのセロトニン受容体アゴニストから選択された１以上の伝統的な片頭痛又は拡延性抑制の薬とともに１以上のイオン依存性共輸送体アンタゴニストを併用する投与を伴う治療方式を意図する。容易に理解できる通り、以上の化合物は適する併用治療の例に過ぎず、他の化合物又は同様のクラスの化合物は等しく適する。
【００５５】
頭蓋内高血圧、神経精神性疾患、中枢神経系水腫の治療のためと、エタノール、感染因子等のような神経毒性因子への曝露の結果起こる神経毒性を治療し又は神経毒性から保護するための、本発明の治療用組成物はイオン依存性共輸送体アンタゴニストを含む。前記治療用組成物は、任意的に１以上の他の治療用組成物と併用して投与されてもよい。イオン依存性共輸送体アンタゴニスト組成物の中枢神経系への送達を提供する送達システムが好ましい。
【００５６】
痛みを減らすための本発明の治療用組成物は、１以上の他の治療用組成物と任意的に併用したイオン依存性共輸送体アンタゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む。かかる治療用組成物は、血液脳関門を通過する能力がなく、末梢神経系のみに循環することが好ましい。前記イオン依存性共輸送体アンタゴニスト組成物の末梢神経系への送達を提供する送達システムが好ましい。
【００５７】
認知、学習及び記憶中枢のような領域での皮質機能を増強するための本発明の治療用組成物は、１以上の他の治療用組成物と任意的に併用したイオン依存性共輸送体アゴニスト、好ましくはカチオン−塩素共輸送体アゴニストを含む。適する送達システムは、優先的には中枢神経系への、より優先的には認知、学習及び／又は記憶の局在した皮質中枢への、前記イオン依存性共輸送体アゴニスト治療用組成物の送達を提供する。
【００５８】
本発明の方法とシステムは、さまざまな障害と状態の診断と治療のための候補化合物と治療方式を評価するためにも用いられる。所望のイオン依存性共輸送体アゴニスト又はアンタゴニスト活性を有する可能性のある候補化合物を生成するためのさまざまな技術が用いられる。候補化合物は、フロセミド、ブメタニド、エタクリン酸等と関連化合物を含むループ利尿薬のような既知のイオン依存性共輸送体アンタゴニストから出発して、所望の活性と特異性を与えることが期待されるやり方でこれらの化合物を改変する周知のコンビナトリアルケミストリー又は分子モデリング技術を用いて生成できる。同様に候補となる塩素共輸送体アゴニスト化合物は、既知のイオン依存性共輸送体アゴニストと関連化合物から出発してこれらの化合物を所望の活性と特異性を与えるようなやり方で改変する周知のコンビナトリアルケミストリー又は分子モデリング技術を用いて生成できる。所望の活性について候補化合物をスクリーニングするための方法は以下に説明する。
【００５９】
１の実施態様によると、本発明の方法とシステムは、個々の細胞又は細胞試料の１以上の寸法についての特性を表すデータを取得し比較する。光学的特性に関するデータの取得、処理及び解析のための技術は既知であり、例えば米国特許明細書第５，４３８，９８９号、第５，４６５，７１８号、第５，８４５，６３９号、第５，６９９，７９８号、第５，９０２，７３２号及び第５，９７６，８２５号に説明されており、これらのそれぞれはここにその全体が引用により取り込まれている。個々の細胞の寸法についての特性に関するデータの取得は以下に説明する。寸法についての特性に関するデータの取得と解析は光学的特性に関して説明されたものと同一又は類似の方法及び装置を用いて達成できる。
【００６０】
細胞密度の低い細胞試料においては、細胞面積は単一焦点面を用いて近似できる。体積を計算したいときは、ｚ軸（焦点）も自動的に調整できる。例えば、自動化され制御されたステージが移動するにつれて、各々の画像が前もって決定された焦点面で取得されて、複数の空間的に分析された関心のある面積についての一連のデータセットが取得できるように、試料集団が入った光学的に透明な容器は位置決めされる。それぞれのｚ平面の体積は近似され（以下のアルゴリズムを参照せよ）、各ｚ座標についての体積が加算される。
【００６１】
Ｄｏｕｇｈｔｙ、Ｓ．による“回転固体の解析学的特性（Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｆｏｒ ｓｏｌｉｄｓ ｏｆ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）”、Ｍａｃｈｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ、１９８１年１２月１０日、１８４−１８６頁にもとづく細胞面積と体積を近似するための一般的な技術が以下に説明されている。これらの技術はグリーンの定理にもとづく。
【００６２】
【数１】
【００６３】
個々の細胞は適当な拡大装置を用いて調べられる。細胞境界のエッジ検出は例えばソーベルオペレータを用いて達成された。前記境界は「ｎ」個の線分の複数の線分に「ｎ」個の節で内接することにより近似させる。境界の積分は以下の通り「ｎ」個の線積分として見られる。
【００６４】
【数２】
【００６５】
３つの場合がある。
第１の場合： 垂直線、ｘ＝一定
第２の場合： 水平線、ｙ＝一定
第３の場合： 斜線、ｙ＝５ｉ（ｘ−ｘｉ）＋ｙｉ
面積はしたがって、
【００６６】
【数３】
【００６７】
グリーンの定理を適用するために、積分はδＱ／δｘ−δＰ／δｙの形式で考慮され、適切な関数、例えばＰ（ｘ，ｙ）とＱ（ｘ，ｙ）が与えられる。面積積分については、Ｑ（ｘ，ｙ）＝０であれば∫Ｑｄｙ＝０、Ｐ＝−ｙとすると、δＰ／δｙ＝−１となる。すると、面積は以下の通り計算できる。
【００６８】
【数４】
【００６９】
体積計算のためには、例えばソーベルオペレータを用いる通常のエッジ検出が、複数（ｎ個）の個々の平面切片に分割される個々の細胞を通して焦点を当てるのに用いることができる。前記「ｎ」個の切片のそれぞれの体積はΔＶｉ；＝Δｚｉ； ・ ΔＡ；と計算され、細胞全体の体積はＶ＝ΣΔＶｉと近似できる。細胞面積と体積の決定と比較はコンピュータハードウェア及び／又はソフトウェアの実行により達成されるのが好ましい。
【００７０】
別の実施態様によると、本発明の方法とシステムは細胞試料集団における個々の細胞又は関心のある領域の１以上の光学的特性を表すデータを取得し比較する。生理活性を表示し検出できる光学的特性の変化は、例えば反射、屈折、回折、吸収、散乱、複屈折、屈折率、Ｋｅｒｒ効果等を含む。光学的特性の変化は光子感受性素子と、任意的には検出された光学的特性を増強する光学素子とを用いて直接的に検出される。
【００７１】
ここに引用により取り込まれた米国特許明細書に明示された通り、本発明の方法と装置によると、生理活性を表示する動的な幾何学的及び光学的特性の高解像度検出は色素又はその他のタイプのコントラスト増強剤を用いないで達成できる。本発明の評価技術と装置の多くは、幾何学的及び／又は内在性光学的情報の検出と解析が、色素、油、装置等のいかなる因子とも関心のある領域が直接接触することを要しないという点で、生理学的に非侵襲的である。しかし、特定の応用にとっては、生理活性と関連して検出される光学的特性の相違を増幅するコントラスト増強剤を、その後のデータ取得と比較の前に投与することは有用であるかもしれない。コントラスト増強剤の使用は、ここに引用によりその全体を取り込まれた米国特許明細書第５，４６５，７１８号及び第５，４３８，９８９号に腫瘍及び非腫瘍組織の光学的画像化に関して詳細に説明されている。適当なコントラスト増強剤は蛍光及び燐光物質、細胞膜に結合する色素、血液又は細胞間空間に優先的に蓄積する光学プローブ、相共鳴色素対（ｐｈａｓｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｄｙｅ ｐａｉｒｓ）等を含む。かかるコントラスト増強剤とともに用いるために適切な検出器は当業者に周知である。
【００７２】
培養下の細胞試料集団あるいは動物モデル又はヒト被検材料の自然位での関心のある領域の１以上の幾何学的及び／又は光学的特性を表すデータを取得し、処理し及び表示するための数多くの装置が用いられる。１の好ましい装置は、生理活性又は機能不全を示す幾何学的及び／又は光学的特性の変化の領域を同定するために比較できる前もって決定された時間間隔で、１以上の関心のある領域の画像を取得するカメラである。前記データ取得装置は顕微鏡のように関心のある領域を拡大する装置を取り込むか、かかる装置と接続して使用することが好ましい。個々の細胞が識別できる解像度を提供するのに十分な倍率が好ましい。ニコンＤｉｏｐｈｏｔ３００のような倒立顕微鏡が適している。
【００７３】
培養条件下で維持された細胞試料集団を用いるハイスループットスクリーニング技術のためには、フラスコ、プレート、マルチウェルプレートのような光学的に透明な容器に入った試料は、プログラム化されたスケジュールに従って個々の細胞又は細胞集団の定期的検査を可能にするために、プログラム化された手法で制御され移動される自動化されたステージの上に置かれる。例えば、複数の細胞試料を有するマルチウェルプレートは自動化され制御可能な顕微鏡ステージに置かれる。該ステージは、自動的に各々の培養ウェルの位置に移動するように、自動化されたマイクロコントローラーにより制御される。個々の細胞又は細胞集団の幾何学的及び／又は光学的特性に関するデータセットはそれぞれのポジションごとに取得される。このようにして、システムは迅速かつ系統的に多くの試料に関するデータを取得できる。選択されたウェルの生理環境は、生理学的なチャレンジ、試験因子又は試験条件に曝露することにより変更でき、システムはそれぞれの培養プレートの同じウェルからのデータを処理後前もって決定された時間間隔で自動的に取得でき、さまざまな処理を施されたウェルから取得されたデータはさまざまな対照実験ウェルから取得されたデータ又は経験的に決定された対照と比較される。
【００７４】
１以上の幾何学的及び／又は光学的特性を表すデータの取得は、特定の空間的な場所に関する幾何学的又は光学的データが比較のためさまざまな時間間隔で取得されるように、高い空間分解能も提供することが好ましい。このやり方では、単一細胞又は細胞試料集団の中の関心のある非常に限局された領域から取得されたデータは、前記試料集団の生理状態又は条件に関する信頼でき非常に感度の高い情報を提供するために比較される。高い空間分解能は、例えば高解像度カメラと電荷結合デバイス（ＣＣＤｓ）を使用することにより提供される。かかる画像を得るために適した装置はここに引用により取り込まれた前記特許に説明されている。
【００７５】
さまざまなデータ処理技術は、本発明の通りに収集されたデータを評価するために都合良く利用できる。比較用データはさまざまな形式で評価又は提示されてもよい。処理は、対照用の、逐次的な、そしてさまざまな比較用のデータセットを作成するために複数のデータセットを平均化すること、あるいはその逆に、組み合わせることを含む。データは、処理のためアナログからデジタル形式に変換され、画像として表示するためのアナログ形式に再変換されてもよい。代替策としては、データは取得され、処理され、解析され、そしてデジタル形式で出力されてもよい。
【００７６】
データ処理は、データセット比較において見られるコントラストを増強するため、及び幾何学的及び／又は光学的特性の変化が進行する細胞又は細胞集団を高度の空間分解能で同定するためのある種の信号又はデータセット（例えば画像の領域）の増幅をも含む。例えば、１の実施態様によると、画像はより広いダイナミックレンジをカバーするように画像のピクセルの明度の値が再度マッピングされる変換を用いて処理される。ある「低い」値が選択されてゼロにマップされ、その低い値以下の全てのピクセル明度値はゼロに設定され、ある「高い」値が選択されて選択された値にマップされ、その高い値以上の全てのピクセル明度値はその高い値にマップされる。ニューロン活動を示す明度の動的な変動を表す中間の明度値を有するピクセルは直線的又は対数曲線的に増加する明度値にマップされる。このタイプの処理操作はしばしば「ヒストグラム伸縮」と呼ばれ、ニューロン活動の変動を表す画像のようなデータセットのコントラストを増強するために本発明の通り用いられる。
【００７７】
データ処理技術はより正確な組み合わされた及び比較のデータを用意すべくデータセットを操作するためにも用いられる。例えば、生体内での応用については、動作、呼吸、心拍、発作又は反射活動がデータ取得中に関心のある領域の位置を変えることがある。正確な組合せで比較されたデータを提供するためにはデータセットにおける対応するデータポイントが空間的に分析されて正確に並べられることが重要である。光学的マーカーは、データセットを手作業で並べるか又は数学的に操作するのを補助するために、関心のある領域に固定されてそのデータが収集されるときに検出される。さまざまな処理技術は以下及び引用によりここに取り込まれた特許に説明される。
【００７８】
比較データはさまざまな方法で表示される。比較用データは、例えば生理学的な変化を示す幾何学的又は光学的特性を強調するグラフ形式で表示されてもよい。比較用データを提示し表示するための好ましい技術は、空間的な分解能のある関心のある領域に対応する視覚的な画像又は写真のフレームの形式のものである。この形式は解析される細胞集団の（２ないし３次元の）視覚化可能な空間的な位置を提供する。生理活性又は機能不全をあらわす幾何学的及び／又は光学的特性の変化を示すコントラストの高い領域のより良い視覚化を増強し提供するために、比較用データは処理されてコントラストの増強されたグレースケール又はカラーの画像を提供する。例えばそれぞれのピクセルのグレースケールの値を異なる（よりコントラストの高い）グレースケール値又はカラー値に変換する参照表（ｌｏｏｋ ｕｐ ｔａｂｌｅ、ＬＵＴ）が用意される。カラー値はグレースケール値の範囲にマップされ又はカラーが幾何学的又は光学的な陽性への変化と陰性への変化との間を区別するために用いられる。一般に、カラー変換された画像は生理活性、機能又は機能不全を表す光学的特性の変化を強調するコントラストのより高い画像を提供する。
【００７９】
本発明のシステムは生物学的材料を照らすための光源と、該生物学的材料の幾何学的又は光学的特性に関するデータを取得するための光学的検出器と、該生物学的材料の幾何学的又は光学的特性に関するデータを記録しさまざまなデータセット及び／又は対照実験のデータプロフィールを比較して試料集団の生理状態の変化を表す幾何学的及び／又は光学的特性の変化に関する比較用データを作成し有用な形式で出力データを提供又は表示するためのデータ記録解析出力装置とを含むのが一般的である。
【００８０】
関心のある領域の細胞又は組織の１以上の寸法の又は内在性光学的特性を表すデータの取得の間に関心のある領域を照らすためにｅｍｒ光源が用いられる。ｅｍｒ光源は、光学的に透明な容器に維持された試験管内の細胞培養に照明を当てるとき又は外科手術と関係ある場合のように組織が露出しているときのように関心のある領域に直接照明を当てるのに用いることができ、あるいは骨、硬膜、皮膚、筋肉等のような隣接し又は被覆した組織を通して間接的に関心のある領域に照明を当てるのに用いることができる。本発明に用いるｅｍｒ光源は、高照度の光源でも低照度の光源でもよく、連続照明を提供するものでも不連続照明を提供するものでもよい。適切な光源は、高照度の光源、スペクトルが広い光源、無色度の（ｎｏｎ−ｃｈｒｏｍａｔｉｃ）光源、タングステン−ハロゲンランプ、レーザー、発光ダイオード等を含む。選択された波長以上又は以下の全ての波長を選択的に透過させるためのカットオフフィルターを用いてもよい。好ましいカットオフフィルターは約６９５ｎｍ以下の全ての波長を除外する。
【００８１】
内在性光学信号に関するデータを取得するためのｅｍｒ波長は、例えば約４５０ｎｍから約２５００ｎｍを含むのが好ましく、約７００ｎｍから約２５００ｎｍの近赤外スペクトルの波長が最も好ましい。より長波長（例えば約８００ｎｍ）が、細胞又は組織の下にあるあるいは皮膚、骨、硬膜等のような他の材料の下にある細胞又は組織の状態を検出するために用いられることが一般的である。皮質活動。選択されたｅｍｒの波長は例えばさまざまなタイプのコントラスト増強剤が投与されたときにも用いることができる。前記ｅｍｒ光源はいかなる適当な手段で関心のある領域を照射してもよい。一部の応用では、光ファイバーの利用が好ましい。１の好ましい配置は直流制御された電源（Ｌａｍｂｄａ、Ｉｎｃ社）で制御されたビーム分割器を用いて光ファイバーの撚り糸を通してｅｍｒ光源を提供する。
【００８２】
本発明の光学的検出方法には非連続的な照明及び検出の技術も有用である。例えば、短パルス（時間領域）、パルスドタイム及び振幅変調（周波数領域）光源が適当な検出器とともに用いられることもある（Ｙｏｄｈ、 Ａ．とＣｈａｎｃｅ、 Ｂ．、Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｔｏｄａｙ、１９９５年３月参照）。周波数領域光源は、それぞれの素子は隣の素子に対して１８０°位相がずれて変調されたレーザーダイオードのような複数の光源素子のアレイを含むのが典型的である（Ｃｈａｎｃｅ、 Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：３４２３−３４２７、１９９３参照）。直交する２つの平面の４個以上の素子を含む２次元アレイは２次元の局在情報を得るために用いることができる。かかる技術は引用によりここにその全体を取り込んだ米国特許明細書第４，９７２，３３１号と第５，１８７，６７２号に説明される。
【００８３】
飛行時間と吸収の技術（Ｂｅｎａｒｏｎ、 Ｄ．Ａ．とＳｔｅｖｅｎｓｏｎ、 Ｄ．Ｋ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：１４６３−１４６６、１９９３）も本発明に有用に利用できる。さらに別の本発明の実施態様では、スキャニングレーザービームが光増幅管のような適当な検出器とともに好ましくは関心のある領域の形態の高解像度のデータ画像を得るために用いられる。
【００８４】
赤外スペクトルの一部による照明は、関心のある領域に隣接し又は被覆する硬膜と頭蓋骨のような組織を通した、内在性光学的信号の検出を可能にする。関心のある領域を被覆し又は隣接する組織を通して内在的な光学的信号を検出するのに適した１の例示的な赤外ｅｍｒ光源はフロリダ州ＯｒｌａｎｄｏのＬａｓｅｒ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ社からのＴｕｎａｂｌｅ ＩＲ Ｄｉｏｄｅ Ｌａｓｅｒである。遠赤外波長のこの範囲を用いるときは光学的検出器は赤外（ＩＲ）検出器として提供されることが好ましい。ＩＲ検出器はヒ化インジウム、ゲルマニウム及び水銀テルル化カドミウムのような材料から構築され、赤外放射の小さな変化に対する感受性を増強するために一般的には低温に冷却される。本発明に有用に利用できるＩＲ検出システムの１つの例はＩＲＣ−６４赤外カメラ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社、オハイオ州Ｍａｓｏｎ）である。
【００８５】
関心のある領域は、以下に説明する通り、信号をダイナミックレンジの全域にわたるように調整するために均一に照明されることが好ましい。照明の不均一さは光源のゆらぎと組織表面の３次元的性質からくる照度の変化が原因であることが一般的である。関心のある領域へのより均一な照明は、例えば拡散照明すること、光学的検出器及び／又はｅｍｒ光源の前に波長カットオフフィルターをマウントすることあるいはこれらの組合せを用いることにより提供できる。光源自体のゆらぎは光源の電源を調節するための光フィードバック機構により防止するのが好ましい。さらに、より平らな外形の表面を検出するために無菌で光学的に透明な板を関心のある領域に接触して覆うこともできる。照明のゆらぎは、関心のある領域に対照ポイントとして一定の陰影の灰色の画像マーカーポイントを置くことを含む検出処理アルゴリズムを用いて補正できる。
【００８６】
前記システムは、関心のある領域の１以上の光学的特性を表す信号を取得するための光学的検出器も含む。いかなる光子検出器でも光学的検出器として用いることができる。適切な光学的検出器は例えばフォトダイオード、光電子増倍管、ＣＣＤ装置に提供されるような光子感受性シリコン検出器チップ等を含む。複数のｅｍｒ光源及び／又は複数の光子検出器が提供されてもよく、いかなる適当な配置で並べられてもよい。選択された光学的特性を検出するための特別な検出器が用いられてもよい。アナログビデオ信号の形式でデータを取得するための１の好ましい光学的検出器は、例えば標準的なＲＳ１７０規格を用いるフレームあたり５１２本の走査線を有する出力ビデオ信号を３０Ｈｚで作成するＣＣＤビデオカメラである。１の適当な装置はＣＣＤ−７２ソリッドステートカメラ（Ｄａｇｅ−ＭＴＩ Ｉｎｃ．、インディアナ州、Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｃｉｔｙ）である。別の適当な装置は、ＣＯＨＵ ６５００電子制御ボックス付きＣＯＨＵ６５１０ ＣＣＤモノクロカメラ（ＣＯＨＵ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓカリフォルニア州、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）である。一部のカメラでは、前記アナログ信号はＡＤＩ基板（アナログからデジタルへの変換）上で８ビットデジタル信号に変換される。前記ＣＣＤは、必要な場合には熱雑音を減らすために冷却される。
【００８７】
データ処理は、本発明の光学的な検出と解析の技術とシステムの重要な特徴である。使用に際して、例えばＣＣＤ装置は、装置の感度を最大化するために、（アナログ信号のレベルでデジタル化前に）前記信号を増幅し、該信号を可能な全ダイナミックレンジに拡散する（ｓｐｒｅａｄ）ように調節されることが好ましい。全ダイナミックレンジにわたる感度で光学的信号を検出する具体的な方法は、ここに引用により取り込まれた特許に詳細に説明されている。差分フレームのヒストグラム伸縮を実行するための手段（例えば、ヒストグラム／フィーチャーエキストラクターＨＦ １５１-１-Ｖモデュール、Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州、Ｗｏｂｕｒｎ）が、例えば、それぞれの差分画像をそのダイナミックレンジにわてって増強するために提供される。例示的な線形ヒストグラム伸縮はＧｒｅｅｎ、「デジタル画像処理：系統的アプローチ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ： Ａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｖａｎ Ｎｏｓｔｒａｎｄ Ｒｅｉｎｈｏｌｄ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３年に説明されている。ヒストグラム伸縮は、最も明るいピクセル又は比較画像中の最高値のピクセルをとって、それを最大値に割り当てる。最低のピクセル値は最小値に割り当てられ、その間の他の全ての値は最大値と最小値の間の線形の値（線形ヒストグラム伸縮の場合）又は対数の値（対数ヒストグラム伸縮の場合）を割り当てられる。これは比較画像が全ダイナミックレンジを利用してニューロン活動又は不活動の領域を明確に同定するコントラストの高い画像を提供することを可能にする。
【００８８】
（交流電灯線からの６０Ｈｚのような）雑音は、アナログフィルターにより制御ボックス内で除去される。追加的な調整が、ＣＣＤ検出器からのアナログ信号をさらに増強し、増幅し及び条件付ける。入力アナログ信号を調整するための１つの手段は、ビデオ速度（３０Ｈｚ）でこの信号をデジタル化し、その後アナログ形式に再変換されるデジタル化画像として関心のある領域を視覚化することである。
【００８９】
特定の関心のある領域に対応する逐次的なデータセットのようなデータは、同一の空間的に分析された場所に対応するデータが比較されるように、並べられることが重要である。データセットが比較の前に誤って並べられた場合には、アーチファクトが導入され、結果として生じる比較用データセットは雑音及びエッジ情報を増幅することがある。データを誤って並べることは試料の運動又は動作、心拍、呼吸等によって起こる。解析される関心のある領域の細胞の大きな運動は、前記検出器の新たな方向定位を必要とする。関心のある領域の細胞の小さな運動を、機械的又はコンピュータによる手段あるいはその両方の組合せによって補正することは可能である。
【００９０】
リアルタイムの動作の補正と幾何学的な変換も対応するデータを並べるために用いられる。データの単純な機械的翻訳又はより複雑な（そして一般的にはより正確な）幾何学的変換技術は、入力データの収集の速度と量及びデータ処理のタイプに依存して実施される。多くのタイプの画像データについては、ｘ−ｙ平面の翻訳により画像を変換する幾何学的な補正により補正可能である。これを可能にするようなアルゴリズムのためには、コンピューターとして効率的で（整数演算が実行可能であることが好ましい）、記憶効率が良く、そして周囲の光の変化に対して強い（ｒｏｂｕｓｔ）ものでなければならない。
【００９１】
例えば、機能的な対照点又は数が関心のある領域に位置づけられ、三角法タイプのアルゴリズムがこれらの対照点の運動を補正するのに用いられる。Ｇｏｓｈｔａｓｂｙ（「画像の位置決めのための部分毎の線形マッピング関数（Ｐｉｅｃｅｗｉｓｅ Ｌｉｎｅａｒ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ１９：４５９−６６、１９８６）は、画像が対照点を用いて三角形の部域に分割される方法を説明する。それぞれの三角形の部域ごとに別々の幾何学的変換が施されてそれぞれの対照点が対応する対照画像の三角形の部域に位置決めされる。
【００９２】
「画像ワーピング（ｉｍａｇｅ ｗａｒｐｉｎｇ）」技術は、運動を補正するためそれぞれの引き続く画像が平均化された対照画像に幾何学的に位置決めされることにより実施される。（例えば、Ｗｏｌｂｅｒｇ、「デジタル画像ワーピング（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｗａｒｐｉｎｇ）」ＩＥＥＥ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州Ｌｏｓ Ａｌａｍｉｔｏｓ、１９９０に説明された）画像ワーピング技術が用いられれもよい。画像ワーピング技術は、有効な補正のためには運動が大きすぎて新たな平均化された対照画像が取得されなければならない時を示すこともできる。
【００９３】
データ記録処理と解析の機能は一般的にはホストコンピューターにより実行され制御される。前記ホストコンピューターは、前記ｅｍｒ光源及び／又は光学的検出器とインターフェースをとり、データの取得と流入、比較演算、解析、出力等を制御する、（Ｉｎｔｅｌ３８６、４８６、Ｐｅｎｔｉｕｍ又は同様のマイクロプロセッサ又はＳｕｎ ＳＰＡＲＣのような）いかなる一般的なコンピューターをも含む。したがって、前記ホストコンピューターはデータの取得と解析を制御しユーザーインターフェースを提供する。
【００９４】
前記ホストコンピューターは、バスの帯域幅の考慮次第で、ＶＭＥ６４インターフェース又は標準的な（ＩＥＥＥ１０１４−１９８７）ＶＭＥインターフェースを有する単一基板の組み込み式コンピューターを含むものでもよい。本発明に用いられてもよいホストコンピューター基板は、例えばＦｏｒｃｅ社ＳＰＡＲＣ／ＣＰＵ−２Ｅ及びＨＰ９０００モデル７４７１を含む。ユーザーインターフェースは、例えばＵｎｉｘ／Ｘ−Ｗｉｎｄｏｗ環境でよい。画像処理基板は、外科手術中に見るための高品質差分画像を作成するために必要な、リアルタイム画像平均化、位置決めその他の処理を提供する、例えばＴｅｘａｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＭＶＰその他のチップにもとづくものでよい。この基板は、腫瘍組織を強調するため疑似カラーマッピングで差分画像の時間的配列を示すために１２０ｘ１０２４ＲＧＢディスプレイも駆動する。前記ホストコンピューターが全体としてのスクリーンの表示面積（ｒｅａｌ ｅｓｔａｔｅ）を増加させユーザーインターフェースを円滑にするために第２のモニターが用いられるのが好ましい。（完全にプログラム可能な）プロセシング基板は、他の基板とのデータのやりとりを制御するためにＶＭＥマスターインターフェースをサポートできる。最後に、周辺制御基板は、前記ホストコンピューターから機械的インターフェースを制御するために電気的なインターフェースを提供することができる。かかる機械的インターフェースは例えば光源と光学的検出器制御ボックスを含むことができる。
【００９５】
リアルタイムデータ取得及び表示システムは、例えば取得、画像処理、周辺制御及びホストコンピューター用の４枚の基板を含むものでもよい。縮小された処理能力の最小限の構成は、取得とホストコンピューター基板だけを含む。前記取得基板は、入ってくるビデオフレームのリアルタイムでの平均化を行い、平均化されたフレームの最大バス速度での読み出しを可能にする回路を含む。ＶＭＥバスは、ピーク帯域幅が高く多数の既存のＶＭＥ製品との互換性があるために好ましい。前記取得基板は、可変スキャンインターフェースを介して多くの異なるタイプの光学的検出器をもサポートすべきである。ドーターボードは、多くの異なるタイプの光学的検出器のインターフェース面のニーズをサポートし、可変スキャン信号を取得マザーボードに供給する。前記ユニットは、広範囲のカメラをサポートするためにＲＳ−１７０Ａビデオ信号とインターフェースをとるドーターボードを含むことが好ましい。より高い空間／コントラスト解像度及び／又はより良い信号雑音比を有する低速走査カメラのような他のカメラタイプを開発し、かかる改良カメラに適合するように改良されたドーターボードとともに本発明の装置に取り込むことができる。
【００９６】
例えばアナログビデオ信号として取得された試料集団の寸法及び／又は内在性光学的特性に関するデータは、例えば画像解析器（例えばシリーズ１５１Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、Ｗｏｂｕｒｎ）を用いて連続的に処理される。画像解析器はアナログビデオ信号を受け取りアナログからデジタルへの変換インターフェースでデジタル化し、約３０分の１秒のフレーム速度（例えば３０Ｈｚ又は「ビデオ速度」）で実行する。信号の処理は、まずそのピクセルに割り当てられた関心のある領域の部分からの組織で反射された光子の数（例えばｅｍｒの数量）に依存する（二進法での）数値を割り当てられた一連のピクセル又は小さな正方形に前記信号をデジタル化することを伴う。例えば、ＣＣＤカメラからの標準的な５１２ｘ５１２画像では、画像当たり２６２，１４４個のピクセルがある。８ビットシステムでは、それぞれのピクセルは灰色の２５６個の階調レベルの１つに対応する８ビットで表される。
【００９７】
前記信号処理器は、白黒画像を表す灰色のコード化されたピクセル値をカラーのコード化された値にそれぞれの灰色でコード化された値の強度にもとづいて変換するための値で初期化されたプログラム化可能な参照表（例えばＣＭ１５０−ＬＵＴ１６、Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、マサチューセッツ州、Ｗｏｂｕｒｎ）を含んでもよい。画像伸縮技術を用いて、デジタル化された画像フレーム中のそれぞれのピクセルを表す最高及び最低のピクセル強度値が、伸縮される画像フレームの部域にわたって決定される。選択された部域をより大きな数値範囲に伸縮することは、例えば雑音由来の比較的高い偽性の数値のより容易な同定と除去を可能にする。
【００９８】
前記信号処理器の手段は、前記Ａ／Ｄインターフェースから受け取ったデジタル化画像データのフレームを記録するためのフレーム記録領域を有する複数のフレームバッファも含む。前記フレーム記録領域は少なくとも１メガバイトのメモリスペースで、好ましくは少なくとも８メガバイトの記録スペースを含む。追加の１６ビットフレーム記録領域が、８ビット以上で表されたピクセル強度を有する処理された画像フレームを記録する累算器として提供される。前記処理器手段は、１つは前記平均化された対照画像の記録用、もう１つは逐次画像の記録用、３番目は比較画像の記録用の、少なくとも３つのフレームバッファを含むのが好ましい。
【００９９】
前記信号処理器は、１以上のフレームバッファに位置づけられたデータに算術及び論理関数を実行するための（例えばＡＬＵ−１５０パイプラインプロセッサ）算術演算装置も含む。ＡＬＵは例えば、リアルタイムでの画像（データ）平均化を提供する。新規に取得されたデジタル化画像は直接前記ＡＬＵに送られてフレームバッファに記録された対照画像と組合せられる。１６ビットの結果は、この結果をある定数（つまり全画像数）で割るＡＬＵを通して処理される。該ＡＬＵからの出力はフレームバッファに記録されても、さらに処理されても、又は入力として用いられて別の画像と組み合わされてもよい。
【０１００】
正常では、生理活性が増大した領域は、細胞試料又は組織のｅｍｒ吸収能力の増加を示す（つまり、可視光がｅｍｒ照射に用いられる場合には細胞試料が暗くなり、表された内在性信号は正の方向に増加する）。同様に、生理活性の減少は組織のｅｍｒ吸収能力の減少に一般的には対応する（つまり、該組織はより明るく見え、又は内在性信号は負になる）。例えば、データセットＡは次の平均化された画像でデータセットＢは平均化された対照画像である。正常では、データセットＡのピクセルがデータセットＢのピクセルから引き算されて負の数値になったときは、この数値はゼロとして処理される。ゆえに、差分画像は抑制領域を説明できない。本発明は、（ａ）データセットＡ（次の平均化された画像）をデータセットＢ（平均化された対照画像）から引き算して全ての負のピクセル値がゼロである第１の差分データセットを作ること、（ｂ）データセットＢをデータセットＡから引き算してすべての負のピクセル値がゼロとなる第２の差分データセットをつくることにより負と正の内在的信号の両方を同定するため及び第１と第２の差分画像データセットを加えて「和差分データセット」をつくるための方法を提供する。該和差分データセットは活性が増大した（つまり、黄、オレンジ、赤のような暖色でカラーコード化された）領域を示し、活性が減少又は抑制された（つまり、緑、青、紫のような寒色でカラーコード化された）画像領域として可視化することも可能である。代替的には、第１の差分データセットを第２の差分データセットに重ねることができる。差分出力は画像として可視化でき、チャレンジ、刺激、パラダイム等に対する反応としての内在的信号が存在する場所を指示するためにカラーコード化された差分フレームでスーパーインポーズされた関心のある領域（例えば皮質表面）の画像を提供するために、リアルタイムのアナログ画像にスーパーインポーズされる。
【０１０１】
前記の比較（例えば差分）データは、さらにデータを平滑化して高周波雑音を除去するために処理される。ローパス空間フィルタは、ダイナミックレンジのいずれかの端の高周波雑音を除去するために高空間周波及び／又は低空間周波を遮断する。これは平滑化処理された差分データセットを（デジタル形式で）提供する。前記デジタル処理された差分データセットは、画像として提供でき、色スペクトルを異なるグレーの陰影に割り当てることにより、カラーコード化される。この画像はアナログ画像に（ＡＤＩ基板により）再変換され、平均化された対照画像とその次の画像の間の差分をリアルタイム可視化のために表示される。さらに前記処理された差分画像は、コントラスト増強剤（ａ ｃｏｎｔｒａｃｔ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）が早く取り込まれるか内在性信号がある特定の組織部位を表示するために、前記アナログ画像にスーパーインポーズできる。
【０１０２】
処理速度はリアルタイムモデュラープロセッサ又はより高速のＣＰＵチップを前記画像プロセッサに追加することにより増強できる。本発明に用いることのできるリアルタイムモデュラープロセッサの１つの例は、１５０ＲＴＭＰ−１５０リアルタイムモデュラープロセッサ（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、マサチューセッツ州、Ｗｏｂｕｒｎ）である。前記プロセッサはさらに、デジタルデータ記録用光ディスク、前記デジタル及び／又はアナログデータのハードコピー提供用のプリンタ及びユーザが連続的に前記比較用データ出力を監視できるようにするためのビデオモニタのような表示装置を含んでもよい。
【０１０３】
本発明によると単一のシャーシが、画像形式のような容易に解釈できる形式で光学的検出と解析を提供するのに必要な全てのモデュールを格納することもできる。どの程度統合されているかにかかわらず、必要な構成要素は、表示用モニタと周辺入出力装置とともに容易に運搬可能なラックに取り付けられてもよい。
【０１０４】
ＰｅｎｔａＭＡＸ ５７６ｘ３８４ＦＴ ＬＣＤシステム（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージ州）を含む好ましい高解像度高性能システムはチップ上でデータをデジタル化し大きなダイナミックレンジと軽減された雑音を提供する。このシステムはＰＣＩバスを用いてウィンドウズＮＴを走らせたデュアル４００ＭＨｚＰｅｎｔｉｕｍ ＰＣにインターフェースをとられてもよい。画像解析アルゴリズムはＭｉｃｒｏｓｏｆｔビジュアルＣ＋＋バージョン５．０コンパイラを用いてＣ言語で書かれてもよい。さらに迅速なオンライン処理のためには、前記データは前記ＰＣコンピュータに常設された専用画像化ハードウェアに配送されてもよい。例えばＩＭ−ＰＣＩハードウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．社製、マサチューセッツ州、Ｂｅｄｆｏｒｄ）が使用できる。１つのかかる構成は、ＩＭ−ＰＣＩ、ＡＭＶＳ及びＣＭＡＬＵのＩＭ−ＰＣＩ基板とモデュールからなる。
【０１０５】
生体内の応用に用いられた前記画像化方法は関心のある領域の表面のデータを取得できる。引用によりここの取り込まれた特許に説明された通り、長波長ｅｍｒ（赤外領域）が深部の組織又は被覆組織の下にある関心のある領域を画像化するために用いられる。体内の一部の領域では、長波長可視光と近赤外ｅｍｒは容易にかかる画像化のための組織を透過できる。さらに、差分画像が、５００ｎｍのｅｍｒで取得された画像と７００ｎｍのｅｍｒで取得された画像のように、２つの異なる照射波長で取得された画像の間で作成される場合には、差分画像は組織の光学的スライスを表す。さらに、さらに、特定のｅｍｒ波長を吸収するコントラスト増強剤の投与は、関心のある領域のフィルタとして作用する。この場合には、持続的に組織に残留するコントラスト増強剤を用いることが望ましい。
【０１０６】
動物モデルの自然位の細胞集団又は組織培養モデルの細胞集団を評価するために適した簡単なシステムでは、本発明のシステムは、細胞又は組織を照射するｅｍｒ光源に動作可能に接続された１以上の光ファイバーと、照射された細胞又は組織の１以上の光学的特性を検出する、フォトダイオードのような光学的検出器に動作可能に接続された別の光ファイバーを含む。前記検出器は、試料集団の「正常」又は「バックグランド」の光学的特性を表す対照用データを取得するため及びテスト用試剤又はテスト用条件の投与中又は投与後の試料集団の光学的特性を表す逐次的データを取得するために用いられる。疾病又は病理的状態を刺激する生理学的なチャレンジ及び／又は刺激は治療用試剤又は治療条件の投与前に投与される。システムは、個々の細胞又は細胞集団の幾何学的及び／又は光学的特性を、経験的に決定された基準又は異なる時点で取得されたデータと比較するために十分な情報記録及び処理能力を有するデータ記録及び処理のシステムを含むかあるいはかかるシステムと通信している。
【０１０７】
動作中は、試験管内又は生体内の細胞試料が電磁放射（ｅｍｒ）で照射され、空間的に分析された関心のある領域の１以上の幾何学的及び／又は光学的特性を表す単一又は一連のデータポイント又はデータセットが、「正常な」生理活性の間隔の間中取得される。このデータは、これらの特定の生理条件下での特定の細胞試料についての対照又はバックグランドのデータプロフィールを表す。一連のデータセットは、例えば平均化により、対照用データプロフィールを取得するために組み合わせられるのが好ましい。前記対照用データプロフィールは他のデータセットとの比較用に記録される。同様に、特定の生理条件下での特定の細胞タイプについてのバックグランドデータプロフィールを表す対照用データセットが収集され記録されてもよい。
【０１０８】
同一の空間的に分析された関心のある領域での試料集団の対応する幾何学的及び／又は光学的特性を表すデータセットは、次の期間（ｔｉｍｅ ｐｅｒｉｏｄ）に取得される。監視用の応用については、データは、細胞試料の状態を監視し基線量のプロフィールからの異常を検出するために、定期的な時間間隔で収集される。スクリーニング用の応用については、例えばテスト用組成物の導入又はテスト用条件への曝露により誘発された、生理学的な活性化又は抑制の後の期間中１以上の逐次的なデータセットが収集される。生理学的な活性化又は抑制は、動物モデルでの発作又は卒中のように「自然な（ｎａｔｕｒａｌ）」出来事により誘発されることもあり、あるいは生理学的な活性化又は抑制を示す細胞試料の幾何学的及び／又は光学的特性の変化を刺激するために生体内又は試験管内の細胞試料にパラダイム又は因子を投与することによって誘発されることもある。監視間隔又は内在的生理反応の刺激期間中、前記関心のある領域の１以上の検出された幾何学的又は光学的特性を表す単一又は一連の逐次的データセットが取得される。一連の逐次的データセットは、逐次的なデータセットを取得するために例えば平均化により組み合わせられるのが好ましい。前記逐次的データセットは、比較用データセット、好ましくは差分データセットを取得するために対照用データセットと比較される。比較用データセットは、関心のある領域内での生理学的な活性化又は抑制を表す幾何学的及び／又は光学的特性の変化の証拠を求めて解析される。
【０１０９】
細胞集団は、薄い密度の懸濁液中の細胞、コンフルエントの単層細胞、その他の前もって決定された細胞密度の多層細胞又は組織スライス標本のような組織試料を含むものであってもよい。広範囲の細胞及び組織試料の細胞培養条件下で維持することは当業者に周知である。
【０１１０】
前記試料集団は顕微鏡のステージのような試料台の上の前もって決定された位置に置かれる。１つの例示的な組織試料は、浸漬下の灌流チャンバーに維持された急性ラット海馬スライス標本である。代替策としては、試料はフラスコ、マルチウェルプレート等で細胞培養培地中に維持された細胞試料であってもよい。マルチウェル組織培養プレートは、前もって決定された間隔で個々のウェルの細胞試料の位置決めをするための自動化ステージとともに併用して、ハイスループットスクリーニング用に使用できる。プログラム化できる自動化位置決め装置は当業者に周知である。
【０１１１】
（ＣＣＤカメラのような）光学的検出器は顕微鏡のカメラポートに接続される。１以上の対照期間と１以上のテスト用期間の間中、個々の細胞又は細胞試料中の関心のある領域の寸法及び／又は光学的特性に関するデータは取得、記録及び処理される。データの取得と処理は以下及び実施例に説明された通りに達成される。
【０１１２】
右上のグレースケール画像はＣＣＤカメラで見た組織スライス標本の未処理画像である。該組織スライス標本は、ニューロンとシナプスの活動の少しの増加を起こす低強度電気刺激及びニューロンとシナプスの活動のより大きな増加を起こす高強度電気刺激という２つの異なる強度で電気的に刺激される。
【０１１３】
疑似カラー画像は以下に説明する通りに生成される。簡潔には、前記電気刺激中に取得された画像は対照状態で取得された画像から引き算される。この画像はローパスフィルタを通し、ヒストグラム伸縮され、そして疑似カラー着色される。色は活性により喚起された光学的変化の強度を示すようにコード化される。
【０１１４】
上記に説明された通りに作成された画像に表された動的な光学的変化はグラフにプロットすることもできる。グラフ形式では、それぞれのデータポイントは疑似カラー画像に示した単位（ｕｎｉｔｅ）を通して光透過の平均化された変化を表す。時間間隔で分離された一連の画像は取得され平均化された値がそれぞれの画像について計算されグラフ上での点としてプロットされる。直線で示された場所で２秒間電気的に刺激された。小さなピークは第１の小さな電気刺激により誘導された最大の光学的変化を示し、大きい方のピークは第２のより大きな刺激からのものを示す。前記電気刺激は２秒後に停止され、組織は回復させられた。該回復のプロットは前記組織のイオン恒常性機構に特徴的である。この回復は例えば回復期間に最もうまく当てはまる対数曲線を見つけることにより、定量化できた。
【０１１５】
候補化合物は、培養下あるいは動物モデルで自然位の、グリア細胞、ニューロン細胞、腎臓細胞等のようなさまざまなタイプの細胞を本発明のスクリーニング方法を用いてカチオン−塩素共輸送体アゴニスト及び／又はアンタゴニスト活性についてスクリーニングされる。例えば塩素共輸送体アンタゴニスト活性を同定するためのスクリーニング技術は「正常」より高濃度のアニオン塩素濃度にすることにより、組織培養試料又は動物モデルでの自然位の細胞外空間のイオン平衡を変更することを伴う。この変更されたイオン平衡に置かれた細胞又は組織試料の幾何学的及び／又は光学的特性は決定され、候補試剤が投与される。前記候補化合物の投与後、対応する細胞又は組織試料の幾何学的及び／又は光学的特性が、前記イオン平衡失調がそのままかどうかあるいは前記細胞は細胞外及び細胞内空間のイオン平衡を変更することにより反応したかどうか決定するために監視される。前記イオン平衡失調がそのままである場合には、候補試剤は塩素共輸送体アンタゴニストの可能性がある。さまざまなタイプの細胞又は組織を用いてスクリーニングすることにより、高レベルのグリア細胞の塩素共輸送体アンタゴニスト活性を有しそれより低いレベルのニューロン細胞と腎臓細胞の塩素共輸送体アンタゴニスト活性を有する候補化合物が同定できる。同様に、異なるタイプの細胞と組織システムへの影響も評価できる。
【０１１６】
さらに、中枢及び末梢神経系のさまざまな状態を治療するための候補化合物の効能は、発作、中枢神経系水腫、エタノール神経毒性、皮質拡延性抑制等のような状態を組織試料又は動物モデルの自然位でシミュレーションするか誘発すること、容態のシミュレーション（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）中の細胞又は組織試料の幾何学的及び／又は光学的特性を監視すること、候補化合物を投与すること、前記候補化合物の投与後の細胞又は組織試料の幾何学的及び／又は光学的特性を監視すること、前記候補化合物の効果を決定するために細胞又は組織試料の幾何学的及び／又は光学的特性を比較することにより評価できる。同様に、動物又はヒト被検材料での治療用組成物の効能は本発明の光学的方法とシステムを用いて自然位で監視できる。
【０１１７】
本発明の治療用組成物と方法は上記に好ましい実施態様について説明されてきた。以下に明らかにする実施例は具体的な実験結果を説明するが、本発明をいかなる意味でも限定することを意図するものではない。
【０１１８】
（実施例１）
フロセミドの海馬スライス標本におけるてんかん発作様放電への影響
以下の研究では自発性てんかん発作様活動はさまざまな処理により誘発された。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（オス及びメス、２５ないし３５日齢）は断頭され、頭蓋頂は迅速に除去され、脳は氷冷酸素添加スライス標本培養液で冷やされた。スライス標本培養液は、２２０ｍＭスクロース、３ｍＭ ＫＣＩ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ デキストロース（２９５ないし３０５ｍＯｓｍ）からなるスクロースを基本とする人工脳脊髄液（ｓＡＣＳＦ）であった。海馬を含む脳半球はブロック状に切り出されＶｉｂｒｏｓｌｉｃｅｒ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｈａｅｒ社、メイン州、Ｂｒｕｎｓｉｃｋ）のステージに（シアノアクリレート系接着剤で）のり付けされた。厚さ４００μｍの水平断又は横断スライス標本が４°Ｃの酸素加（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）スライス標本培養液中で薄切された。前記スライス標本は直ちに、保持チャンバーに移され、その中で、２４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭデキストロース（２９５ないし３０５ｍＯｓｍ）からなる酸素加浴培養液（ＡＣＳＦ）中に浸漬された。前記スライス標本は浸漬型（ｓｕｂｍｅｒｓｉｏｎ−ｓｔｙｌｅ）記録チャンバーに移される前に少なくとも４５分間室温に保たれた（全ての他の実験）。前記記録チャンバー中で前記スライス標本は３４ないし３５°Ｃの酸素加された記録培養液で灌流された。全ての動物のケアはＮＩＨとワシントン大学の動物ケアガイドラインに従って実施された。
【０１１９】
大抵のスライス標本実験では、同時細胞外電場電極記録がＣＡ１及びＣＡ３領域から取られた。双極性タングステン刺激電極が、シナプス的に駆動されたＣＡ１での電場反応を喚起するためにシャファー側枝に置かれた。刺激は１００ないし３００マイクロ秒（ ｓｅｃ）持続パルスで集団スパイク閾値（ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｓｐｉｋｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）の４倍の強度からなった。後放電は６０Ｈｚで送達されたかかる刺激の２秒間の連続により喚起された。自発性発作間様バーストは、前記浴培養液を、１０ｍＭ カリウム（動物４匹、スライス標本６枚、平均−８１バースト／秒）、２００−３００μＭ（ Ｍ）４−アミノピリジン（４−ａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）（動物２匹、スライス標本４枚、平均−３３バースト／秒）、５０−１００μＭ（ Ｍ）ビククリン（ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ）（動物３匹、スライス標本４枚、平均−１４バースト／秒）、Ｍ Ｍｇ＋＋（灌流１時間、動物２匹、スライス標本３枚、平均−２０バースト／秒、又は灌流３時間、動物２匹、スライス標本２枚）、ゼロカルシウム／６ｍＭ ＫＣＩ及び２ｍＭ ＥＧＴＡ（動物３匹、スライス標本４枚）により改変又は追加することにより処理されたスライス標本で観察された。全ての処理において、一旦持続的なバースト発生レベルが確立されたときは、記録用培養液にフロセミドが添加された。
【０１２０】
これらの手順の最初として、後放電のエピソードはシャファー側枝の電気刺激で喚起され（Ｓｔａｓｈｅｆｆら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３４４：２９６、１９８５）、ＣＡ１錐体細胞領域において細胞外電場反応が監視された（動物８匹、スライス標本１３枚）。前記浴培養液中のＭｇ＋＋濃度は０．９ｍＭに減少され、後放電は６０Ｈｚ、２秒間、集団スパイク閾値の４倍の強度での刺激で喚起された（集団スパイク閾値強度は持続時間１００ないし３００マイクロ秒で２０ないし１５０μＡの間で変わった）。前記組織は刺激試行と試行の間１０分間回復させた。それぞれの実験では、ＣＡ１のシナプス入力への初期応答が、単一刺激パルスにより喚起された電場電位を記録することにより、最初に試験された。対照条件では、シャファー側枝刺激は単一の集団スパイクを喚起した（図１Ａ、差し込み図）。放電後約３０秒で喚起されたテタヌス様刺激（図１Ａ、左）は内在性信号の大きな変化を伴っていた（図１Ａ、右）。
【０１２１】
内在性光学的信号の画像化のためには、前記組織は正立顕微鏡のステージの上に位置決めされた灌流チャンバー内に置かれ、前記顕微鏡のコンデンサーを通して導かれた白色光（タングステンフィラメント光及びレンズシステム、Ｄｅｄｏ Ｉｎｃ．）のビームで照射された。光はゆらぎを最小にするために、制御され調節され（電源、Ｌａｍｄａ Ｉｎｃ．）、前記スライス標本が長波長（赤色）で透過照明されるように、フィルター（６９５ｎｍロングパス）を通された。視野と倍率は顕微鏡対物レンズ（スライス標本全体を監視するためには４ｘ）の選択で決定された。画像フレームは電荷結合デバイス（ＣＣＤ）カメラ（Ｄａｇｅ ＭＴＩ Ｉｎｃ）を３０Ｈｚでもちいて取得され、カメラ制御ボックスとＡ／Ｄ基板のゲインとオフセットがシステムの感度を最適化するように調整されたＩｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．社製シリーズ１５１画像化システムを用いて８ビット、空間分解能５１２ｘ４８０ピクセルでデジタル化された。画像化ハードウェアは４８６−ＰＣ互換コンピューターにより制御された。信号／雑音比を増大させるために、平均化された画像は、０．５秒にわたって積分され一体として平均化された１６枚の個別の画像フレームから作成された。実験系列は、一連の平均化された画像の数分間にわたる時間の連続的取得を典型的には伴い、刺激前に対照画像として、少なくとも１０枚のこれらの平均化された画像が取得された。疑似カラー化画像は、最初の対照画像を逐次的に取得された画像から引き算すること及びカラー参照表を前記ピクセル値に割り当てることにより演算された。これらの画像のために、通常は、線形ローパスフィルターが高周波雑音を除去するのに用いられ、線形ヒストグラム伸縮がピクセル値をシステムのダイナミックレンジにわたってマップするために用いられた。これらの画像についての全ての操作は、定量的な情報が保存されるように線形であった。雑音はある取得シリーズの中の対照画像の系列のＡＲ／Ｒのゆらぎの最大標準偏差として定義されたが、ここでＡＲ／Ｒは組織を透過する光の変化の振幅を表す。デルタＲ／Ｒは、全ての差分画像をとり最初の対照画像で割り算をすることにより（逐次画像−最初の対照画像）／最初の対照画像として計算された。雑音はそれぞれの選ばれた画像系列についていつでも０．０１以下であった。組織を透過する光の絶対的な変化は、カメラと光源の間にニューロン密度フィルターを置いた後に画像を取得することにより、一部の実験の際に推定された。平均して、カメラ電子装置と画像化システム電子装置は、組織透過光のピークの絶対変化が通常１％と２％との間となるように、信号をデジタル化前に１０倍増幅した。
【０１２２】
図１Ｄに示すグレイスケール写真は、典型的な記録チャンバー内の海馬スライス標本のビデオ画像である。組織を保持するために用いられる細い金のワイヤメッシュがスライス標本に斜めに走る黒い線として見える。刺激電極はＣＡ１の放線状層右上に見える。記録電極（薄すぎて写真では見えない）は白い矢印で指示された位置に挿入された。図１Ａは、２秒間６０Ｈｚの刺激が後放電を喚起したことを示し、細胞外電極によって記録された典型的な後放電エピソードを示す。図１Ａの差し込み図は、シャファー側枝から送達された単一の２００秒テスト用パルス（矢印のアーティファクト）に対するＣＡ１野の応答を示す。図１Ａ１はシャファー側枝刺激喚起性組織透過光のピーク変化のマップを示す。光学的変化が最大となる領域は、刺激電極のいずれかの側のＣＡ１の先端及び基底樹状突起領域に対応する。図１Ｂは、２．５ｍＭフロセミド含有培養液で２０分灌流後の刺激に対する応答を表すサンプルトレース（ｓａｍｐｌｅ ｔｒａｃｅｓ）を示す。電気的後放電活動（図１Ｂに示す）及び刺激喚起性光学的変化（図１Ｂ１に示す）の両方ともブロックされた。しかし、テスト用パルスに対する過興奮的な電場応答（多発性集団スパイク）が存在した（差し込み図）。図１Ｃ及び図１Ｃ１は、初期の応答パターンの回復が正常な浴培養液で４５分灌流した後に見られたことを示す。
【０１２３】
刺激喚起性後放電のフロセミドによるブロック及び随伴するテスト用パルスに対するシナプス応答の増大という相反する効果は、（１）フロセミドはてんかん様活動をブロックしたこと及び（２）（自発性てんかん様活動に反映される）同期化と（単一シナプス入力に対する応答に反映される）興奮とが分離されたことという２つの鍵となる結果を示す。フロセミドの投与量依存性が調べられた実験は、１．２５ｍＭの最低濃度が後放電と光学的変化の両方をブロックするために必要であったことを決定した。
【０１２４】
（実施例２）
高濃度Ｋ＋（１０ｍＭ）浴培養液で灌流された海馬スライス標本におけるてんかん様後放電に対するフロセミドの効果
上記の通り調製されたラット海馬スライス標本は、自発的な発作間様バースト発生の拡張期間がＣＡ３（上のトレース）及びＣＡ１（下のトレース）錐体細胞領域で同時に記録されるまで、高濃度Ｋ＋溶液に灌流された（図２Ａ及び２Ｂ）。フロセミド添加培養液（２．５ｍＭフロセミド）で１５分灌流後、バースト放電は振幅が増加した（図２Ｃ及び２Ｄ）。しかし、フロセミド灌流４５分後にバーストは可逆的にブロックされた（図２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈ）。フロセミド灌流のこの全系列の間、シャファー側枝に送達された単一テスト用パルスに対するシナプス応答は変化しなかったか又は増大した（データ示さず）。放電振幅の初期の増加はフロセミドに誘発された抑制の減少を反映したものである可能性がある（Ｍｉｓｇｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：１４１３、１９８６、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．６０：１０５、１９８８、ＴｈｏｍｐｓｏｎとＧａｅｈｗｉｌｅｒ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｙｓｉｏｌ．６１：５１２、１９８９及びＰｅａｒｃｅ、Ｎｅｕｒｏｎ １０：１８９、１９９３）。ここで観察された興奮の増大の立ち上がり時間と同様の潜伏時間（１５分以内）でフロセミドが海馬スライス標本の抑制電流の要素をブロックすることは過去に報告された（Ｐｅａｒｃｅ、Ｎｅｕｒｏｎ １０：１８９、１９９３）。自発性バーストのフロセミドによるブロックに要する長い潜伏時間は高濃度Ｋ＋条件下でのフロセミド感受性細胞体積調節機構の十分なブロックに要する追加の時間に対応するかもしれない。
【０１２５】
高濃度Ｋ＋で灌流されたスライス標本に対するフロセミドの効果を試験した後、同様の研究がさまざまな他の一般に研究されたてんかん様放電の試験管内のモデルで行われた（Ｇａｌｖａｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２４１：７５、１９８２、ＳｃｈｗａｒｔｚｋｒｏｉｎとＰｒｉｎｃｅ、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１８３：６１、１９８０、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．３９８：２１５、１９８６及びＺｈａｎｇら、Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｒｅｓ．２０：１０５、１９９５）。マグネシウムフリー培養液（０−Ｍｇ＋＋）への持続的な曝露（２ないし３時間）の後、スライス標本は一般に臨床で用いられる抗けいれん薬に対する耐性を有するてんかん様放電を起こすようになることが示された（Ｚｈａｎｇら、Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｒｅｓ．２０：１０５、１９９５）。嗅脳溝内皮質（図２Ｉ）と支脚（データ示さず）からの記録は、０−Ｍｇ＋＋の３時間灌流後スライス標本は前記「抗けいれん薬耐性」バーストと一見同様のバーストパターンを示すようになったことを表した。浴培養液へのフロセミド添加１時間後これらのバーストはブロックされた（図２Ｊ）。（１）２００−３００μＭ ４−アミノピリジン（４−ＡＰ、カリウムチャンネル遮断薬）の追加（図２Ｋと２Ｌ）、（２）５０−１００μＭ ビククリン（ＧＡＢＡアンタゴニスト）の追加（図２Ｍと２Ｎ）、（３）マグネシウム除去（０−Ｍｇ＋＋）と１時間の灌流（図２Ｏと２Ｐ）及び（４）カルシウム除去と細胞外キレート剤処理（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｈｅｌａｔｉｏｎ）（０−Ｃａ＋＋）（図２Ｑと２Ｒ）の浴培養液の追加／改変で観察された自発性バースト放電もフロセミドはブロックした。これらの操作のそれぞれで、自発性発作間様パターンはＣＡ１及びＣＡ３サブ領域から同時に記録された。（図２Ｋ、２Ｌ、２Ｍ及び２ＮはＣＡ３トレースのみを示し、図２Ｏ、２Ｐ、２Ｑ及び２ＲはＣＡ１トレースのみを示す）。前記０−Ｍｇ＋＋実験では、５ｍＭフロセミドは１５ないし２０分の潜伏時間でバースト発生をブロックした。他の全てのプロトコールについてｍバースト発生は２．５ｍＭフロセミドで２０ないし６０分の潜伏時間でブロックされた。フロセミドは全ての実験で、ＣＡ１及びＣＡ３の両方の自発性バースト発生を可逆的にブロックした（図２Ｌ、２Ｎ、２Ｐ及び２Ｒ）。
【０１２６】
（実施例３）
カイニン酸静脈注射により麻酔ラットに誘発されたてんかん様活動に対するフロセミドの効果
本実施例は、てんかん様活動が麻酔ラットへのカイニン酸（ＫＡ）の静脈注射により誘発される試験管内のモデルを示す（Ｌｏｔｈｍａｎら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ３１：８０６、１９８１）。結果は図３Ａないし３Ｈに示す。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（４匹、体重２５０−２７０ｇ）はウレタン（１．２５ｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で麻酔され、必要に応じウレタン追加注射（０２５ｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で麻酔は維持された。体温は直腸温度計を用いて監視され３５ないし３７°Ｃを保温パッドで維持され、拍動数（ＥＫＧ）は連続的に監視された。頚静脈は一方から静脈内薬剤投与用にカニューレが挿入された。ラットはＫｏｐｆ脳定位装置に固定し（頭蓋頂レベルで）、先端０．５ｍｍまで絶縁された双極ステンレス微小電極が、前頭頭頂皮質の脳波（ＥＥＧ）活動を記録するために、皮質表面から深さ０．５ないし１．２ｍｍまで刺入された。一部の実験では、海馬ＥＥＧを記録するために、２Ｍ ＮａＣｌを含むピペットが深さ２．５ないし３．０ｍｍまで下げられた。データがＶＨＳビデオテープに記録されオフラインで解析された。
【０１２７】
前記の外科的準備と電極設置の後、動物はカイニン酸（１０ないし１２ｍｇ／ｋｇ、静脈注射）が注入される前３０分間回復させた。強烈な発作活動、心拍数の増加及び鼻毛の急な運動は約３０分の潜伏時間で誘発された。一旦安定な電気的発作が明らかになると、フロセミドは２０ｍｇ／ｋｇ濃縮塊として３０分毎に３回の注射により送達された。実験はウレタンの静脈投与で終了した。動物のケアはＮＩＨガイドラインに従って行われ、ワシントン大学動物ケア委員会により承認された。
【０１２８】
図３Ａないし３Ｈはウレタン麻酔ラットにカイニン酸で喚起された電気的「てんかん重積状態」のフロセミドによるブロックを示す。ＥＫＧ記録は上のトレースに示され、ＥＥＧ記録は下のトレースに示された。このモデルでは、強烈な電気放電（電気的「てんかん重積状態」）はＫＡ（１０ないし１２ｍｇ／ｋｇ）注射後３０ないし６０分で皮質（又は深部海馬電極）から記録された（図３Ｃと３Ｄ）。対照実験（及びＬｏｔｈｍａｎらの過去の報告Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、３１：８０６、１９８１）ではこのてんかん重積状態様活動は３時間以上維持された。逐次的なフロセミド静脈注射（蓄積量４０ないし６０ｍｇ／ｋｇ）は発作活動を３０ないし４５分の潜伏時間でブロックし、しばしば比較的平坦なＥＥＧ（図３Ｅ、３Ｆ、３Ｇ及び３Ｈ）となる。フロセミド注射後９０分でも皮質活動はほぼ正常な基線レベル（つまり、ＫＡ及びフロセミド注射以前に観察されたレベル）にとどまった。ラットにおけるフロセミドの薬物動力学に関する研究は、本実施例に用いられた投与量が毒性レベルをはるかに下回っていたことを明らかにしている（ＨａｍｍａｒｌｕｎｄとＰａａｌｚｏｗ、Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ、３：３４５、１９８２）。
【０１２９】
（実施例４ないし７の実験方法）
海馬スライス標本はＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット成獣から前記の通り調製された。厚さ１００μｍの海馬横断スライス標本がビブラトーム（ｖｉｂｒａｔｉｎｇ ｃｕｔｔｅｒ）で薄切された。スライス標本は、典型的には海馬全域と支脚を含んだ。薄切後、スライス標本は室温の酸素加したホールディングチャンバーに少なくとも記録前１時間保存された。全ての記録は酸素加された（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）３４ないし３５°Ｃの人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）の入ったインターフェースタイプチャンバーの中で行われた。正常ＡＣＳＦは、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ デキストロースを含む。
【０１３０】
ＣＡ１及びＣＡ３錐体細胞からの細胞内記録用の先の尖った電極は４Ｍ 酢酸カリウムで満たされた。ＣＡ１及びＣＡ３細胞体層からの電場記録は２Ｍ ＮａＣｌで満たされた抵抗の低いガラス電極を用いて取得された。シャファー側枝又は肺門経路（ｈｉｌａｒ ｐａｔｈｗａｙｓ）の刺激には、小型単極タングステン電極がスライス標本の表面に設置された。電場及び細胞内記録からの自発性及び刺激喚起性活動はデジタル化され（Ｎｅｕｒｏｃｏｒｄｅｒ、Ｎｅｕｒｏｄａｔａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ニューヨーク州Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ビデオテープに記録された。パソコン上のＡｘｏＳｃｏｐｅソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）はデータのオフラインでの解析に用いられた。
【０１３１】
一部の実験では、ビククリン（２０μＭ）、４アミノピリジン（４ＡＰ）（１００μＭ）又は高Ｋ＋濃度（７．５又は１２ｍＭ）含有正常培養液又は低塩素濃度培養液が用いられた。全ての実験で、低塩素溶液（７又は２１ｍＭ［Ｃｌ−］Ｏ）はＮａＣｌをＮａ＋グルコン酸（Ｓｉｇｍａ）に等モル置換することにより調製された。全ての溶液は３５°Ｃで約ｐＨ７．４、重量モル浸透圧濃度２９０ないし３００ｍＯｓｍで９５％Ｏ２５％ＣＯ２で炭酸ガス飽和されるように調製された。
【０１３２】
インターフェースチャンバーに置いた後スライス標本は約１ｍｌ／分で灌流された。この流速では灌流培養液の完全な変化が起こるのに８ないし１０分かかる。ここで報告された全ての時間はこの遅れを考慮に入れ約±２分の誤差がある。
【０１３３】
（実施例４）
ＣＡ１及びＣＡ３領域での自発性てんかん様バースト発生の停止のタイミング
同期化された活動を改変する因子の相対的貢献はＣＡ１及びＣＡ３領域の間で相違がある。これらの因子は局部的な回路の相違と細胞の密度及び細胞外空間の体積比の領域特異的な相違を含む。アニオン塩素共輸送拮抗現象の抗てんかん効果はニューロン放電のタイミングの脱同期化が原因である場合には、塩素共輸送ブロックはＣＡ１及びＣＡ３領域で効果が異なることが予想される。この仮説を検証すべく、一連の実験がＣＡ１及びＣＡ３領域での自発性てんかん様活動のブロックのタイミングの相違を特徴づけるために行われた。
【０１３４】
電場活動はＣＡ１及びＣＡ３（ＣＡ３領域の最近位と最遠位のおおよそ中間）領域で同時に記録され、自発性バースト発生は高［Ｋ＋］Ｏ（１２μＭ、ｎ＝１２）、ビククリン（２０ｍＭ、ｎ＝１２）又は４−ＡＰ（１００μＭ、ｎ＝５）の処理により誘発された。ＣＡ１及びＣＡ３領域の電場応答がそれぞれの実験の継続中監視できるように、３０秒毎に単一電気刺激がＣＡ１及びＣＡ３領域の中間のシャファー側枝に送達された。全ての実験で、少なくとも２０分の連続した自発性てんかん様バースト発生が低［Ｃｌ−］Ｏ（２１ｍＭ）又はフロセミド含有（２．５ｍＭ）培養液に切り替える前に観察された。
【０１３５】
全ての場合でフロセミド又は低塩素濃度培養液への曝露後３０ないし４０分で自発性バースト発生はＣＡ３領域での停止前にＣＡ１領域で停止した。典型的に観察された事象の時間系列は、自発性電場事象のバースト発生頻度と振幅の初期の増加と、ＣＡ３でのバースト放電振幅の減少より迅速なＣＡ１でのよりバースト放電振幅の減少を含む。ＣＡ１が沈黙した後ＣＡ３はもはや自発性てんかん様事象を示さなくなるまで、５ないし１０分間放電を継続する。
【０１３６】
このバースト停止の時間的パターンは、自発性バースト発生のブロックに用いられた試剤がフロセミドであったか低［Ｃｌ−］Ｏ培養液であったかにかかわらず、試験した全てのてんかん様状態を誘発する処理で観察された。これらの実験の全ての段階を通じて、シャファー側枝の刺激はＣＡ１及びＣＡ３細胞体層の両方で過興奮性電場応答を喚起した。自発性バースト発生がＣＡ１及びＣＡ３領域の両方でブロックされた直後には過興奮性集団スパイクはまだ喚起できた。
【０１３７】
我々は、観察されたＣＡ３に先だつＣＡ１でのバースト停止は、我々の記録部位の選択に対するこれらの領域の間のシナプス接続の配置から生じるアーティファクトである可能性を考慮した。さまざまなＣＡ３サブ領域の投射はＣＡ１にまとまって終末すること、すなわち歯状回（ＣＡ３近位）に近いＣＡ３細胞はＣＡ１の遠位部分（支脚の境界の近く）に最も多く投射するが、ＣＡ３のより遠位に位置する細胞から発するＣＡ３投射はＣＡ２境界の近くに位置するＣＡ１の部分により多く終末することが知られている。バーストの停止がＣＡ３の異なるサブ領域で異なる時に起こる場合には、上記の実験結果はＣＡ１及びＣＡ３領域の相違として生じるのではなく、むしろＣＡ３サブ領域にわたるバースト活動のばらつきの相関として生じる。我々はこの可能性を３つの異なる実験で検証した。ＣＡ１で自発性バーストが停止した直後に我々はＣＡ３領域を記録電極を用いて探索した。いくつかの異なるＣＡ３部位（ＣＡ３の最も近位から最も遠位の部分まで）からの記録は、ＣＡ３領域の全てのサブ領域はＣＡ１が沈黙したこの時間の間中自発的にバーストを発生していたことを明らかにした。
【０１３８】
ＣＡ３の集団放電は興奮性シナプス伝達を介してＣＡ１での放電を喚起すると一般には考えられていたため、ＣＡ１が沈黙した後ＣＡ３が自発的に放電を継続したという観察は予想外であった。前記の通り、シャファー側枝に送達された単一パルス刺激は、自発性バーストのブロック後でさえもＣＡ１において多発性集団スパイクを喚起し、よってＣＡ３からＣＡ１へのシナプスでの過興奮した興奮性シナプス伝達は無傷であった。このシナプス伝達の効能が維持されており、ＣＡ３の自発性電場放電が継続していることから、我々はＣＡ１における自発性バースト発生がなくなるのは到来する興奮性入力の同期化が弱まったためであると仮定した。さらに、ＣＡ３での自発性てんかん様放電もやがて停止することから、たぶんこの脱同期化の過程は２つの海馬のサブ領域で異なる時に起こった。
【０１３９】
（実施例５）
ＣＡ１及びＣＡ３領域集団放電の同期化に対する塩素共輸送拮抗現象の効果
実施例４からの観察は、低［Ｃｌ−］Ｏ又はフロセミド含有培養液への曝露と自発性バースト活動の特徴との時間的関係を示唆した。さらに、この関係はＣＡ１領域とＣＡ３領域とでは異なる。前記時間的関係の特徴をより解明するために、我々は自発性及び刺激喚起性バースト放電の際のＣＡ１活動電位の発生と、ＣＡ１及びＣＡ３サブ領域の電場応答における集団スパイク事象とを比較した。
【０１４０】
細胞内記録は、細胞内電極をＣＡ１電場電極の近傍（１００μｍ以内）に設置して、ＣＡ１錐体細胞から取得された。スライス標本は２０秒毎にシャファー側枝に送達された単一の刺激により刺激された。連続的な自発性バースト発生が少なくとも２０分間確立された後に浴培養液はビククリン含有低［Ｃｌ−］Ｏ（２１ｍＭ）培養液に切り替えられた。約２０分後にバースト頻度と振幅は最大となった。このときの電場及び細胞内の同時記録はＣＡ１の電場及び細胞内の記録はＣＡ３の電場放電と緊密に同期していることを明らかにした。それぞれの自発性放電の際、ＣＡ３電場応答はＣＡ１放電より数ミリ秒先に起こった。刺激喚起性事象の際には、ＣＡ１錐体細胞の活動電位放電はＣＡ３及びＣＡ１電場放電の両方に緊密に同期していた。
【０１４１】
低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への持続的曝露により、ＣＡ１及びＣＡ３領域の自発性放電の間の潜伏時間が増加し、ビククリン含有低塩素培養液への曝露の３０ないし４０分後に最大潜伏時間が３０ないし４０ミリ秒となった。この間ＣＡ１及びＣＡ３自発性電場放電の両方の振幅とも減少した。この間刺激喚起性放電は波形及び相対的な潜伏時間の点で自発的に発生する放電に似ていた。しかし、初期の刺激喚起性ニューロンの脱分極（おそらく単シナプス性ＥＰＳＰ）は潜伏時間の有意な増加を伴わずに開始した。これらのデータが取得された時間間隔はＣＡ１での自発性バースト停止の直前に対応する。
【０１４２】
低［Ｃｌ−］Ｏ培養液での灌流４０ないし５０分後、自発性バーストはＣＡ１ではほとんど消失したが、ＣＡ３では変化が見られなかった。この間のシャファー側枝刺激は、単一シナプス的に誘発された（ｍｏｎｏｓｙｎａｐｔｉｃａｌｌｙ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）ＣＡ１錐体細胞の応答は有意な潜伏時間の増加を全くともなわずに起こるが刺激喚起性電場応答はほとんど消失することを示した。これらのデータが取得された時間間隔はＣＡ３での自発性バーストの停止の直前に対応した。
【０１４３】
低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への持続的な曝露の後、シャファー側枝刺激とその結果起こるＣＡ３電場放電との間の潜伏時間に大きな増加（３０ミリ秒以上）が生じた。やがてはシャファー側枝刺激によってＣＡ１及びＣＡ３領域とも全く電場応答が喚起できなくなった。しかし、シャファー側枝刺激に対するＣＡ１錐体細胞からの活動電位放電は反応潜伏時間にほとんど変化なく喚起できた。実際、実験の継続時間全体の間（２時間以上）、ＣＡ１錐体細胞からの活動電位放電はシャファー側枝刺激により短い潜伏時間で喚起できた。さらに、ＣＡ３の刺激喚起性過興奮性放電はやがては低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への持続的な曝露の後にはブロックされたが、ＣＡ３の逆行性応答は保存されたようであった。
【０１４４】
（実施例６）
ＣＡ１錐体細胞のバースト放電の同期化への塩素共輸送拮抗現象の効果
前述のデータは、電場応答の消失はニューロン間の活動電位の発生の脱同期化が原因であることを示唆する。すなわち、ＣＡ１錐体細胞のシナプス駆動性興奮は保存されなかったが、ＣＡ１ニューロン集団の間の活動電位の同期性は測定可能な直流電場応答に蓄積するのに十分ではなかった。この仮説を検証するためにＣＡ１錐体細胞の対になった細胞内記録がＣＡ１電場応答と同時に取得された。これらの実験で、細胞内電極と電場記録電極の両方ともが互いに２００μｍ以内に設置された。
【０１４５】
ビククリン含有低［Ｃｌ−］Ｏ培養液により誘発された自発性活動が最大の期間中、記録はＣＡ１ニューロンとＣＡ１電場の放電は自発性又は刺激喚起性放電の両方の場合とも緊密に同期していたことを示した。低［Ｃｌ−］Ｏ培養液に継続して曝露した後、ＣＡ１電場放電の振幅が広がって消失したとき、自発性及び刺激喚起性放電の両方が、ＣＡ１ニューロンの対の間及び活動電位と電場応答の間での活動電位の発生のタイミングの脱同期化を示した。この脱同期化はＣＡ１電場振幅の抑制と同時に起こった。その自発的なＣＡ１のバーストが停止したときまでに、有意な潜伏時間の増加がシャファー側枝刺激とＣＡ１電場放電との間で起こった。このとき、対になった細胞内記録は、ニューロンの対の間及び活動電位とシャファー側枝刺激により喚起された電場放電との間での活動電位のタイミングの劇的な脱同期化を示した。
【０１４６】
ＣＡ１活動電位放電の観察された脱同期化は、シナプス放出のタイミングの破壊又は神経突起でのランダムな伝導異常のような、シナプス駆動性活動電位発生に必要な機構のランダム化が原因であることもありえる。そうである場合には、特定のニューロンの対の間の活動電位の発生は互いに状況ごとでランダムにばらつきが生じることを予想できる。我々はこれを、シャファー側枝の多発性の逐次刺激の間のニューロンの対の活動電位放電パターンを比較することにより検証した。それぞれの刺激事象の間、活動電位は互いに対してほとんど同時に発生し、状況ごとでほとんど同一のバースト波形（ｂｕｒｓｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を示した。我々は、自発的な電場放電の際のあるニューロンの対の間での活動電位の発生が時間的に固定しているかどうかを知るために調べた。あるＣＡ１ニューロンの対からの活動電位放電のパターンが、活動電位の発生が明らかに脱同期化した時期の逐次的な自発的な電場バーストの間で比較された。上記の刺激喚起性活動電位放電の場合と全く同様に、自発的な集団放電の際に生成した活動電位は、互いに対してほとんど同一の時に起こり、ある自発性放電から次の放電までほとんど同一のバースト波形を示した。
【０１４７】
（実施例７）
自発性シナプス活動に対する低塩素処理の効果
塩素共輸送拮抗現象と関連する抗てんかん効果は神経伝達物質放出への何らかの作用により仲介されている可能性がある。塩素共輸送のブロックが神経終末から放出された神経伝達物質の量とタイミングを変化させ、ニューロン同期化に影響を与えることがありうる。低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露が神経伝達物質放出に関連する機構に影響を与えたかどうかを検証するために、シナプス前終末からの神経伝達物質の自発的なシナプス放出を劇的に増大させる処理中の細胞内ＣＡ１応答がＣＡ１及びＣＡ３の電場応答と同時に記録された。
【０１４８】
自発性神経伝達物質放出の増大は４−ＡＰ（１００μＭ）処理により誘発された。４−ＡＰ含有培養液への４０分曝露後、自発性同期化バースト放電がＣＡ１及びＣＡ３領域で記録された。４−ＡＰ含有低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への切替は、前記の通り初めは自発性バーストの増大をもたらした。高利得（ｈｉｇｈ−ｇｒａｉｎ）細胞内記録は高振幅自発性シナプス活動が４−ＡＰ処理により誘発されたことを示した。低塩素培養液への更なる曝露はＣＡ１での自発性バースト放電はブロックしたが、ＣＡ３は自発的な放電を継続した。このときＣＡ１細胞内記録は、自発的なシナプス雑音がさらに増大し、４−ＡＰ含有低塩素培養液への持続的な曝露の期間中そのままであったことを示した。これらのデータは、神経終末からのシナプス放出の原因となる機構が、４−ＡＰにより誘発されたＣＡ１の自発性バーストのブロックを説明できる方法で低塩素曝露による悪影響を被らなかったことを示唆した。これらの結果は、低［Ｃｌ−］Ｏ曝露の効果がＰＳＰｓを細胞体に伝導する効率を悪化させるようなＣＡ１樹状突起の性質の変化が原因であるという可能性も除外した。
【０１４９】
（実施例８ないし１２の実験方法）
以下の全ての実験では、［Ｃｌ−］ＯはＮａＣｌをＮａ＋−グルコン酸で等モル置換することにより減少された。いくつかの理由から他の代替アニオンではなくグルコン酸が用いられた。まず、パッチクランプ法の研究がグルコン酸は事実上塩素チャンネルを透過できないが、他のアニオン（メチル硫酸、硫酸、イセチオン酸及び酢酸）はさまざまな程度で透過できることを証明してきた。第２に、細胞外カリウムのグリアのＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ共輸送を通しての輸送は細胞外塩素がグルコン酸に置換されるとブロックされるが、イセチオン酸で置換された場合は完全にはブロックされない。このフロセミド感受性共輸送体は細胞膨張と細胞外空間（ＥＣＳ）の体積変化に意義深い役割を果たすため、我々は、我々の処理の効果が過興奮性のフロセミドの実験と比較できるように適切な代替アニオンを用いることを望んだ。［Ｈｏｃｈｍａｎ、Ｄ．Ｗ．、Ｂａｒａｂａｎ、Ｓ．Ｃ．、Ｏｗｅｎｓ、Ｊ．Ｗ．Ｍ．及びＳｃｈｗａｒｔｚｋｒｏｉｎ、Ｐ．Ａ．、「フロセミドによるてんかん様活動ブロックにおける同期化と興奮性の分離」Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：９９−１０２、１９９５及び米国特許明細書第５，９０２，７３２号］第３に、ギ酸、酢酸及びプロプリオン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）はＣｌ−の代替として用いると弱酸となり細胞内ｐＨを急速に下降させるが、グルコン酸は細胞外にとどまり細胞内ｐＨの変化は報告されていない。第４に、比較のために我々は低［Ｃｌ−］Ｏの活動喚起性ＥＣＳ変化への影響を調べた過去の研究で用いられたのと同じ代替アニオンを用いることを望んだ。
【０１５０】
ある種の代替アニオンはカルシウムをキレートするとの示唆がある。その後の研究は代替アニオンのカルシウムキレート能を証明できなかったが、いまだにこの問題に関する関心が文献に存在する。休止期の膜電位は正常のままであり、［Ｃｌ−］Ｏがグルコン酸置換により低下した培養液に曝露後数時間経過してもシナプス応答（実際には過興奮性シナプス応答）は誘発されることから、カルシウムキレート作用は以下の実験では問題とはならないようである。さらに我々は、Ｃａ２＋選択的微小電極を用いた測定によって、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液のカルシウム濃度が対照の培養液のカルシウム濃度と同一であることを確認した。
【０１５１】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット成獣は前記の通りに準備された。簡潔には、厚さ４００μｍの海馬横断スライス標本はビブラトームを用いて薄切された。スライス標本は典型的には海馬全体と支脚が含まれた。薄切後スライス標本は酸素加されたホールディングチャンバーに少なくとも記録前１時間保存された。全ての記録は酸素加された（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）３４ないし３５°Ｃの人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）の入ったインターフェースタイプチャンバーの中で行われた。正常ＡＣＳＦは、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ デキストロースを含む。一部の実験では、ビククリン（２０μＭ）、４アミノピリジン（４ＡＰ）（１００μＭ）又は高Ｋ＋濃度（７．５又は１２ｍＭ）含有正常培養液又は低塩素濃度培養液が用いられた。低塩素溶液（７又は２１ｍＭ［Ｃｌ−］Ｏ）は、ＮａＣｌをＮａ＋グルコン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）に等モル置換することにより調製された。全ての溶液は３５°Ｃで約ｐＨ７．４、重量モル浸透圧濃度２９０ないし３００ｍＯｓｍで９５％Ｏ２５％ＣＯ２で炭酸ガス飽和されるように調製された。
【０１５２】
ＣＡ１錐体細胞からの細胞内記録用の先の尖った電極は４Ｍ 酢酸カリウムで満たされた。ＣＡ１及びＣＡ３細胞体層からの電場記録はＮａＣｌ（２Ｍ）で満たされた抵抗の低いガラス電極を用いて取得された。シャファー側枝の刺激には、小型単極タングステン電極がＣＡ１及びＣＡ３領域の中間のスライス標本の表面に設置された。電場及び細胞内記録からの自発性及び刺激喚起性活動はデジタル化され（Ｎｅｕｒｏｃｏｒｄｅｒ、Ｎｅｕｒｏｄａｔａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ニューヨーク州Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ビデオテープに記録された。パソコン上のＡｘｏＳｃｏｐｅソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．社）はデータのオフラインでの解析に用いられた。
【０１５３】
イオン選択的微小電極は当業者に周知の標準的な方法に従って作製された。二連銃型（Ｄｏｕｂｌｅ−ｂａｒｒｅｌｅｄ）ピペットが引かれ、先端の直径が約３．０μｍになるように割られた。基準バレル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂａｒｒｅｌ）はＡＣＳＦで満たされ、他のバレルはシラン処理され（ｓｙｌａｎｉｚｅｄ）、先端にＫ＋選択的な樹脂（Ｃｏｒｎｉｎｇ ４７７３１７）が後ろから充填された。該シラン処理されたバレルの残りはＫＣｌ（１４０ｍＭ）で満たされた。それぞれのバレルはＡｇ／ＡｇＣｌ線を介して高インピーダンスデュアル差動アンプ（ＷＰＩ ＦＤ２２３）に接続された。それぞれのイオン選択的微小電極は既知のイオン組成の溶液を用いて較正され、ネルンスト曲線に近い応答性を示し実験期間中安定である場合に適すると判断された。
【０１５４】
インターフェースチャンバーに置いた後スライス標本は約１ｍｌ／分で灌流された。この流速では灌流培養液の完全な変化が起こるのに８ないし１０分かかる。ここで報告された全ての時間はこの遅れを考慮に入れ約±２分の誤差がある。
【０１５５】
（実施例８）
ＣＡ１電場記録への低［Ｃｌ−］Ｏの効果
他の研究は、皮質及び海馬のスライス標本の低［Ｃｌ−］Ｏへの持続的な曝露は入力抵抗、休止膜電位、脱分極誘発性活動電位発生又は興奮性シナプス伝導のような基本的な内在性及びシナプス性の性質は影響を与えないことを示した。ある過去の研究は海馬ＣＡ１領域への低［Ｃｌ−］Ｏのてんかん発作発現の特徴も部分的に明らかにした。以下の研究は、低［Ｃｌ−］Ｏ誘発性の過興奮と過同期化の立ち上がりと停止の時間を観察するために行われた。スライス標本（ｎ＝６）ははじめＣＡ１錐体細胞及びＣＡ１細胞体層で安定な細胞内及び電場の記録が確立するまで正常培養液で灌流された。２つの実験においては、同一細胞が実験の全期間中（２時間以上）保持された。残りの実験（ｎ＝４）では、培養液交換の過程で最初の細胞内記録は失われ、追加の記録が異なる細胞から取得された。これらの実験におけるニューロン活動パターンは単一細胞が観察されたときにみられたものと同一であった。
【０１５６】
電場及び細胞内電極はいつも互いに近接して（２００μｍ以下）設置された。それぞれの場合で、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液（７ｍＭ）への曝露約１５ないし２０分後自発性バーストが最初に細胞レベルで、それから電場で始まった。ニューロンの大集団での同期化したバースト放電を表すこの自発性の電場活動は、５ないし１０分継続し、その後電場記録は静かになった。電場が最初に静かになったときは細胞は自発的な放電を続けていた。この結果は、個々の細胞の放電能力は損なわれずに集団活動が「脱同期化」したことを示唆する。低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露約３０分後、細胞内記録は、電場は静かなままだが細胞は自発的に放電し続けることを示した。２つの時点での細胞内電流注入に対する細胞の応答は、細胞の活動電位発生能力は低［Ｃｌ−］Ｏ曝露によっては損なわれなかったことを証明した。さらに、ＣＡ１放線状層での電気刺激はバースト放電を誘発し、この組織では過興奮性状態が維持されていたことを示した。
【０１５７】
（実施例９）
高［Ｋ＋］Ｏにより誘発されたＣＡ１でのてんかん様活動への低［Ｃｌ−］Ｏの効果
前記の実験は、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への組織の曝露は１０分以内に停止する短期の自発的な電場電位バースト発生を誘発したことを示した。［Ｃｌ−］Ｏの減少が本当に自発的てんかん様（つまり同期化した）バースト発生をやがてブロックできる場合は、これらの結果はこの初期のバースト活動が停止した後にのみ抗てんかん効果が観察可能であることを示唆する。そこで、我々は低［Ｃｌ−］Ｏ処理の高［Ｋ＋］Ｏ誘発性バースト活動への一時的効果を調べた。スライス標本（ｎ＝１２）は［Ｋ＋］Ｏが１２ｍＭに増加された培養液に曝露され電場電位がＣＡ１細胞体層内の電場電極で記録された。自発性電場電位バースト発生は少なくとも２０分間観察され、その後前記スライス標本は［Ｋ＋］Ｏは１２ｍＭに維持されるが［Ｃｌ−］Ｏが２１ｍＭに減少した培養液に曝露された。組織が低［Ｃｌ−］Ｏ／高［Ｋ＋］Ｏ培養液に曝露された後１５ないし２０分以内にバースト振幅が増大しそれぞれ電場事象がより長い間継続した。この電場活動が促進された短い期間（５ないし１０分持続）の後バースト発生は停止した。このブロックが可逆的かどうか検証するために、電場電位の沈黙の少なくとも１０分後に我々は高［Ｋ＋］Ｏ培養液を正常［Ｃｌ−］Ｏ培養液に戻した。２０ないし４０分後にバースト発生が再開した。それぞれの実験を通してシャファー側枝刺激に対するＣＡ１電場応答が監視された。最大の電場応答は、自発的バーストが最大の振幅となる自発的バーストの停止の直前に記録された。しかし、自発的バースト発生のブロックの後であってもシャファー側枝刺激によって多発性集団スパイクは誘発され、シナプス伝達は無傷であり組織はまだ過興奮されうる状態のままであることを示した。
【０１５８】
４枚のスライス標本では、ＣＡ１錐体細胞からの細胞内記録はＣＡ１電場記録とともに取得された。高［Ｋ＋］Ｏ誘発性自発的バースト発生の期間中、シナプス後電位（ＰＳＰｓ）がよく観察できるように過興奮を起こさせる電流が細胞に注入された。自発的バースト発生の低［Ｃｌ−］Ｏによるブロックの後でも自発的に起こる活動電位とＰＳＰｓはまだ観察された。これらの観察はシナプス活動自体は前記の低［Ｃｌ−］Ｏ処理によってはブロックされなかったという見解をさらに支持する。
【０１５９】
（実施例１０）
４−ＡＰ、高［Ｋ＋］Ｏ、及びビククリンによりＣＡ１及びＣＡ３に誘発されたてんかん様活動の低［Ｃｌ−］Ｏによるブロック
我々は次に低［Ｃｌ−］Ｏ処理は、フロセミド処理について示したようにさまざまな薬理学的処理により誘発されたＣＡ１及びＣＡ３領域におけるてんかん様活動をブロックできるかどうか検証した。この実験のために我々は低［Ｃｌ−］Ｏ処理が高［Ｋ＋］Ｏ（１２ｍＭ）（ｎ＝５）、４−ＡＰ（１００μＭ）（ｎ＝４）及びビククリン（２０と１００μＭ）（ｎ＝５）によって誘発された自発的バースト発生に及ぼす効果を検証することにした。それぞれの実験で電場応答はＣＡ１及びＣＡ３領域から同時に記録され、それぞれの場合にＣＡ１及びＣＡ３領域の両方での自発性てんかん様活動は、灌流培養液の［Ｃｌ−］Ｏが２１ｍＭに減少された後３０分以内に可逆的にブロックされた。これらのデータは、フロセミドのように低［Ｃｌ−］Ｏは、最も普通に研究されたてんかん様活動の試験管内のモデルのいくつかにおける自発的バースト発生を可逆的にブロックすることを示唆する。
【０１６０】
（実施例１１）
高［Ｋ＋］Ｏに誘発されたてんかん様活動のブロックについての低［Ｃｌ−］Ｏとフロセミドの比較
前記の実験からのデータは、低［Ｃｌ−］Ｏとフロセミドの両方の抗てんかん効果は同じ生理機構への作用により仲介されているとする仮説と矛盾しない。この仮説をさらに検証するために、我々は、ＣＡ１での電場電極で記録された、低［Ｃｌ−］Ｏ（ｎ＝１２）とフロセミド（２．５及び５ｍＭ）（ｎ＝４）の高［Ｋ＋］Ｏに誘発されたバーストへの効果の時系列を比較した。我々は、低［Ｃｌ−］Ｏとフロセミドの処理の両方とも、短い初期の電場活動振幅の増大と自発的な電場活動の（可逆的な）ブロックという、同様の時系列の効果を誘発することをみつけた。両方の場合でシャファー側枝の電気刺激は、自発的バースト発生がブロックされた後であっても、過興奮性応答を誘発した。
【０１６１】
（実施例１２）
さまざまな［Ｋ＋］Ｏの低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への持続的な曝露の結果
前記の実験では、我々は低［Ｃｌ−］Ｏ曝露により自発的バースト発生がブロックされた後１時間以上一部のスライス標本の電場活動を監視した。かかる持続的な低［Ｃｌ−］Ｏ曝露の後、自発的な長時間持続する脱分極を起こさせるシフトが発生した。これらの後期に起こる電場の事象の波形と頻度は細胞外カリウム及び塩素濃度と関連があるようにみえた。これらの観察に動機づけられて、我々は系統的に［Ｃｌ−］Ｏと［Ｋ＋］Ｏを変化させてこれらのイオン変化の前記の後期に起こる自発性電場事象への効果を観察する実験を行った。
【０１６２】
最初の実験では、スライス標本は低［Ｃｌ−］Ｏ（７ｍＭ）と［Ｋ＋］Ｏ（３ｍＭ）含有培養液に曝露された（ｎ＝６）。この培養液に５０ないし７０分曝露後自発性事象をＣＡ１領域で記録したところ、これらの事象は、最初のエピソードが３０ないし６０秒継続する直流電場での５ないし１０ｍＶの負のシフトのようであった。それぞれの次のエピソードは前のエピソードよりも長かった。この観察は、浴培養液中のイオン濃度のせいでイオン恒常性機構が時間とともに減衰したことを示唆した。これらの負の直流電場シフトが誘発された一部の実験（ｎ＝２）では、ＣＡ１錐体細胞からの細胞内記録はＣＡ１電場記録と同時に取得された。
【０１６３】
これらの実験については、細胞内及び電場記録は互いに近接して（２００μｍ以内）取得された。それぞれの負の電場シフトの前（１０ないし２０秒）、ニューロンは脱分極を開始した。細胞脱分極は、休止膜電位の低下、自発的発火頻度の増加及び活動電位振幅の減少により示された。負の電場シフトの立ち上がりと同時に、細胞が自発性又は電流誘発性（データ示さず）活動電位を発火できないほど十分に脱分極した。おそらく、ニューロン脱分極は電場シフトの１０ないし２０秒前に開始するため、細胞外カリウムの段階的増加の結果ニューロン集団の脱分極が起こり、これらの電場事象を開始したのかもしれない。かかる［Ｋ＋］Ｏの増加は、正常ではカリウムを細胞外から細胞内空間に移動する塩素依存性グリア共輸送機構の変化が原因であるかもしれない。［Ｋ＋］Ｏの増加がこれらの負の電場シフト（及び並行した細胞脱分極）に先立つかどうかを検証するため、Ｋ＋選択的な微小電極が［Ｋ＋］Ｏの変化を記録するのに用いられた実験が行われた。
【０１６４】
それぞれの実験において、前記のＫ＋選択的微小電極と電場電極がＣＡ１錐体層に互いに近接して（２００μｍ以内）に設置され、集団スパイクの振幅を監視できるように、刺激パルスがシャファー側枝に２０秒毎に送達された。多発性の自発的に起こる負の電場シフトが低［Ｃｌ−］Ｏ（７ｍＭ）培養液の灌流により誘発された。それぞれの事象は［Ｋ＋］Ｏの有意な増加と関連し、該［Ｋ＋］Ｏの増加は負の電場シフトの立ち上がりの数秒前に開始した。それぞれの事象の立ち上がりの数秒前に、［Ｋ＋］Ｏの１．５ないし２．０ｍＭのゆっくりとした増加が約１ないし２分の時間間隔にわたり起こった。この刺激誘発性電場応答は時とともに増加する［Ｋ＋］Ｏを伴って、負の電場シフトの直前まで振幅が増大した。
【０１６５】
第２の実験（ｎ＝４）においては、［Ｋ＋］Ｏは１２ｍＭまで増加され［Ｃｌ−］Ｏは１６ｍＭまで増加された。この培養液への曝露の５０ないし９０分後、ゆっくりとした振動がＣＡ１領域で記録された。これらの振動は電場電位の５ないし１０ｍＶの負の直流シフトで特徴づけられ、約１サイクル／４０秒の周期であった。はじめはこれらの振動はときどき途切れながら起こり不規則な波形であった。時とともに、これらの振動は連続して規則的な波形になった。フロセミド（２．５ｍＭ）曝露と同時に振動の振幅は段階的に減少し、振動が完全にブロックされるまで頻度は増加した。かかる組織スライス標本での低［Ｃｌ−］Ｏ誘発性振動は過去に報告されていなかった。しかし、前記の振動する事象の時間的特徴は、これまで純粋な軸索標本で記載されていた低［Ｃｌ−］Ｏで誘発される［Ｋ＋］Ｏの振動に著しい類似性がある。
【０１６６】
第３の実験（ｎ＝５）においては、［Ｃｌ−］Ｏはさらに２１ｍＭまで増加され［Ｋ＋］Ｏはもとの３ｍＭに減少された。これらの実験では、単発で希にしか起こらない負の電場電位のシフトが４０ないし７０分後に発生した（データ示さず）。４０ないし６０秒間持続するこれらの事象（５ないし１０ｍＶ）はランダムな間隔で起こり、実験を通して比較的一定した持続時間を維持した。これらの事象は時にはシャファー側枝に送達された単一の電気刺激により誘発できた。
【０１６７】
最後の実験（ｎ＝５）では、［Ｃｌ−］Ｏは２１ｍＭに保たれ［Ｋ＋］Ｏは１２ｍＭに上昇された。これらの実験では、実験期間（２ないし３時間）の間に後期に発生する自発性電場事象は観察されなかった。
【０１６８】
（実施例１３）
低塩素曝露中の［Ｋ＋］Ｏの変化
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット成獣は前記の通りに準備された。簡潔には、厚さ４００μｍの海馬横断スライス標本はビブラトームを用いて薄切された。薄切後スライス標本は酸素加されたホールディングチャンバーに少なくとも記録前１時間保存された。Ｋ＋選択的な微小電極記録には浸漬型チャンバーが用いられた。スライス標本は酸素加された（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）３４ないし３５°Ｃの人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）で灌流された。正常ＡＣＳＦは、１０ｍＭ デキストロース、１２４ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３及び２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む。一部の実験では、４アミノピリジン（４ＡＰ）を１００μＭ含む正常培養液又は低塩素濃度培養液が用いられた。低塩素溶液（２１ｍＭ［Ｃｌ−］Ｏ）は、ＮａＣｌをＮａ＋グルコン酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社）に等モル置換することにより調製された。
【０１６９】
ＣＡ１又はＣＡ３細胞体層からの電場記録はＮａＣｌ（２Ｍ）で満たされた抵抗の低いガラス電極を用いて取得された。シャファー側枝経路の刺激には、単極ステンレス電極がＣＡ１及びＣＡ３領域の中間のスライドの表面に設置された。全ての記録はデジタル化され（Ｎｅｕｒｏｃｏｒｄｅｒ、Ｎｅｕｒｏｄａｔａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ニューヨーク州Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ビデオテープに記録された。
【０１７０】
Ｋ＋選択的微小電極は標準的な方法に従って作製された。簡潔には、二連銃型ピペットの基準バレルはＡＣＳＦで満たされ、他のバレルはシラン処理され、先端にＫ＋選択的な樹脂（Ｃｏｒｎｉｎｇ ４７７３１７）が後ろから充填された。イオン選択的微小電極は既知のイオン組成の溶液を用いて較正され、ネルンスト曲線に近い応答性を示し実験期間中安定である場合に適すると判断された。
【０１７１】
海馬スライス標本の低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露は、前記の通り、３つの特徴的な相を有するＣＡ１錐体細胞の活動の時間依存性の変化の系列を含むことが示されてきた。簡潔には、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露は、短期的な過興奮性と自発的てんかん様放電の増大をもたらす。さらなる低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露で自発的てんかん様活動はブロックされるが細胞の過興奮はそのまま続き、活動電位発火時間は互いに同期しなくなっていく。最後に、持続的な曝露で、刺激誘発性電場応答は完全に消失するように活動電位発火時間は十分に脱同期化するが、個々の細胞はシャファー側枝刺激に対する単シナプス誘発性応答を示し続ける。以下の結果は、フロセミドの塩素共輸送拮抗現象に対する抗てんかん効果が興奮性シナプス伝導に対する直接作用とは独立で、関連した興奮性の低下を伴うことのない（ｗｉｔｈ ｏｕｒ）集団活動の脱同期化の結果であることを証明する。
【０１７２】
６枚の海馬スライス標本において、Ｋ＋選択的電極と電場電極はＣＡ１細胞体層に設置され、刺激電極はシャファー側枝経路に設置され、単一パルス刺激（３００μｓ）が２０秒毎に送達された（図１９）。安定的な基線［Ｋ＋］Ｏが少なくとも２０分間観察された後、灌流は低［Ｃｌ−］Ｏ培養液に切り替えられた。低［Ｃｌ−］Ｏ培養液の曝露から１ないし２分以内に、［Ｋ＋］Ｏが上昇しはじめるにつれて電場応答は過興奮性になった。低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露の約４ないし５分後、電場応答の振幅が減退し、完全に消失した。対応する［Ｋ＋］Ｏの記録は、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露直後にカリウムは上昇を開始し、この［Ｋ＋］Ｏの上昇のピークは時間的に過興奮性のＣＡ１電場応答の最大に対応することを示した。電場応答の振幅の減衰と同時に［Ｋ＋］Ｏは減少を開始し、低［Ｃｌ−］Ｏ培養液曝露から８ないし１０分後には１．８ないし２．５ｍＭ対照レベルより上で実験の残りの間一定になった。４枚のスライス標本は対照培養液に戻され、完全に回復させられた。実験はその後放線状層に設置されたＫ＋選択的微小電極で繰り返された。［Ｋ＋］Ｏの同様の変化の順序は前記の細胞体層で観察された［Ｋ＋］Ｏ値よりも０．２ないし０．３ｍＭ低い値で樹状層で観察された。
【０１７３】
４枚の海馬スライス標本においては、刺激喚起性の［Ｋ＋］Ｏの対照条件と低［Ｃｌ−］Ｏ曝露によりＣＡ１電場応答が完全に消失した後との間の変化に対する応答が比較された。それぞれのスライス標本において、［Ｋ＋］Ｏ選択的な測定は最初は細胞体層で取得され、対照培養液での完全な回復後、実験がＫ＋選択的電極を放線状層に移動させて繰り返された。それぞれ刺激の試行はシャファー側枝に送達された５秒間１０Ｈｚの連続射撃（ｖｏｌｌｅｙ）からなっていた。［Ｋ＋］Ｏのピーク上昇は、対照条件と長時間の低［Ｃｌ−］Ｏ曝露の後との間及び細胞体層と樹状層との間で同様であった。しかし、持続的な低［Ｃｌ−］Ｏ曝露の後に観察された回復時間は対照条件で観察された回復時間より著しく長かった。
【０１７４】
これらの結果は、フロセミドの投与は細胞外空間の［Ｋ＋］Ｏの増加をもたらすことを証明する。脳組織の低［Ｃｌ−］Ｏ培養液への曝露は直ちに１ないし２ｍＭの［Ｋ＋］Ｏの上昇を誘発し、曝露期間中そのままであり、初期の興奮性の増大及びその後のＣＡ１電場応答の消失と同時に起こった。低［Ｃｌ−］Ｏ曝露中のこのＣＡ１電場応答の消失はニューロン発火時間の脱同期化が原因である可能性が最も高い。意義深いことには、細胞体層と樹状層の両方での［Ｋ＋］Ｏの刺激喚起性増加は、ＣＡ１電場応答の低［Ｃｌ−］Ｏによる完全なブロックの前後でほとんど同一であった。このデータは、同等の刺激喚起性シナプス駆動及び活動電位発生が対照条件と低［Ｃｌ−］Ｏによる完全なブロックの後とで起こったことを示唆する。これらのデータはともに、塩素共輸送体アンタゴニストフロセミドの抗てんかん効果及び脱同期化効果が興奮性シナプス伝導への直接作用とは独立であり、興奮性の減退を伴わない集団活動の脱同期化の結果であることを証明する。
【０１７５】
（実施例１４）
低塩素曝露中の細胞外ｐＨの変化
フロセミドと低［Ｃｌ−］Ｏのようなアニオン／塩素依存性共輸送体のアンタゴニストは、同期化された集団活動の維持に貢献する細胞外ｐＨのトランシェントに影響を与えるかもしれない。ラット海馬脳スライス標本は、ＮａＨＣＯ３が等モル量のＨＥＰＥＳ（２６ｍＭ）に置換されインターフェース型チャンバーが用いられたことを除いて、実施例１３に記載の通り準備された。
【０１７６】
海馬脳スライス標本４枚において、連続した自発的バースト発生は実施例１３に記載の通り１００μＭ ４−ＡＰ含有培養液への曝露により誘発された。電場記録はＣＡ１及びＣＡ３領域の細胞体層から同時に取得された。実験継続中刺激は３０秒毎にシャファー側枝に送達された。少なくとも２０分連続バースト発生が観察された後、スライス標本は名目上重炭酸塩フリーの４−ＡＰ含有ＨＥＰＥＳ培養液に曝露された。ＨＥＰＥＳ培養液への持続的な曝露（０．２時間）からもたらされる自発性又は刺激喚起性の電場応答には、観察される有意な変化はなかった。前記スライス標本が少なくとも２時間ＨＥＰＥＳ培養液に曝露された後、灌流は［Ｃｌ−］Ｏが２１ｍＭに減少された４−ＡＰ含有ＨＥＰＥＳ培養液に切り替えられた。前記低［Ｃｌ−］ＯＨＥＰＥＳ培養液への曝露は、過去に低［Ｃｌ−］ＯＮａＨＣＯ３含有培養液で観察されたのと同一の事象の順序及び同じ時間経過を誘発した。自発的バースト発生の完全なブロックの後、灌流培養液は正常［Ｃｌ−］Ｏ含有ＨＥＰＥＳ培養液に戻された。２０ないし４０分以内に自発的バースト発生が再開した。自発的バースト発生が再開した時には前記スライス標本は名目的に重炭酸塩フリーＨＥＰＥＳ培養液に３時間以上灌流されていた。
【０１７７】
このデータは、同期化及び興奮性に対する塩素共輸送拮抗現象の作用は細胞外ｐＨの変動（ｄｙｎａｍｉｃｓ）への効果とは独立であることを示唆する。
【０１７８】
図４は減少された［Ｃｌ−］Ｏ条件下でのイオン共輸送を示すモデルである。図４Ａの左のパネルは、ニューロンのＩＰＳＰｓの発生に必要な塩素勾配がフロセミド感受性のＫ＋、Ｃｌ−共輸送体を通したイオンの流出によって維持されることを示す。正常条件下では、高濃度の細胞内カリウム（３Ｎａ＋、２Ｋ＋ＡＴＰａｓｅポンプにより維持される）は濃度勾配に対してＣｌ−を排除するための駆動力としての役割を果たす。グリア細胞では、図４Ａの右のパネルに示す通り、フロセミド感受性Ｎａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体を通るイオンの移動は細胞外空間から細胞内空間へである。この共輸送に必要なイオン勾配は、部分的には、低濃度の細胞内ナトリウムを維持できるようにＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体を通してグリア細胞に取り込まれたナトリウムイオンが常に３Ｎａ＋、２Ｋ＋ＡＴＰａｓｅポンプによって排除される、「膜間ナトリウムサイクル」によって維持される。フロセミド依存性共輸送体を通るイオンの流れの速度と方向は、ニューロンのＫ＋、Ｃｌ−共輸送体については（［Ｋ＋］ｉ ｘ ［Ｃｌ−］ｉ − ［Ｋ＋］Ｏ ｘ ［Ｃｌ−］Ｏ）と、グリアのＮａ＋、Ｋ＋、２Ｃｌ−共輸送体については（［Ｎａ＋］ｉ ｘ ［Ｋ＋］ｉ ｘ ［Ｃｌ−］２ｉ − ［Ｎａ＋］Ｏ ｘ ［Ｋ＋］Ｏ ｘ ［Ｃｌ−］２ｏ）と書き表せるこのイオン産物の差と機能的に比例する。これらのイオン産物の差の符号は、正が細胞内空間から細胞外空間へという、イオン輸送の方向を示す。
【０１７９】
図４Ｂは、持続的な低［Ｃｌ−］Ｏ曝露の結果として生じる、後期に起こる自発性電場事象の出現を説明する現象論的なモデルを示す。ニューロン及びグリアのイオン産物の差をそれぞれＱＮ及びＱＧで表す。対照条件下（１）では、ニューロンについてのイオン産物の差はＮａ＋、Ｋ＋及びＣｌ−が細胞内空間から細胞外空間へ共輸送されるようになり（ＱＮ＞０）、グリア細胞についてのイオン産物の差はＮａ＋、Ｋ＋及びＣｌ−が細胞外空間から細胞内コンパートメントへ共輸送されるようになる（ＱＧ＜０）。［Ｃｌ−］Ｏが減少されたとき（２）は、イオン産物の差はニューロンのＫＣｌの流出は増加するように変化するが、細胞内空間から細胞外空間へのＫＣｌとＮａＣｌの全体としての流出（ｎｅｔ ｅｆｆｌｕｘ）があるように（ＱＧ＞０）グリアのイオン共輸送は逆転する。これらの変化は時とともに細胞外カリウムの蓄積をもたらす。やがて［Ｋ＋］Ｏはニューロン集団の脱分極を誘発するレベルに達し、さらに大きな［Ｋ＋］Ｏの蓄積をもたらす。この細胞外イオンの大量の蓄積は、ＫＣｌが細胞外空間から細胞内空間へ移動するように（ＱＮ＜０、ＱＧ＜０）、イオン産物の差を逆転させるのに役立つ（３）。さらに細胞外カリウムが除去されることにより、やがて膜間イオン勾配は最初の状態に復帰する。この過程を循環することにより、反復的な負の電場事象が発生する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類のカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む、片頭痛、発作、発作性障害、てんかん、てんかん重積状態及び痛みからなるグループから選択される中枢神経系の容態の治療用組成物。
【請求項２】
前記カチオン−塩素共輸送体アンタゴニストはＮａ＋Ｋ＋２Ｃｌ−共輸送体アンタゴニストである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カチオン−塩素共輸送体アンタゴニストは、ループ利尿薬か、その類似体又は誘導体かである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ループ利尿薬は、フロセミドと、ブメタニドと、エタクリン酸と、それらの類似体及び誘導体とからなるグループから選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
更にバルビツレートを含む、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
更に抗発作組成物を含む、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の組成物
【請求項７】
血液脳関門の通過を促進するように処方される、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項８】
更に血液脳関門透過性の増強剤の効果的な量を含む、請求項１ないし７のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項９】
頭蓋内投与、局部的脳内投与、脊髄液への投与又は持続的放出投与のために処方される、請求項１ないし８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１】
少なくとも１種類のカチオン−塩素共輸送体アンタゴニストを含む、片頭痛、発作、発作性障害、てんかん、てんかん重積状態及び痛みからなるグループから選択される中枢神経系の容態の治療用組成物。
【請求項２】
前記カチオン−塩素共輸送体アンタゴニストはＮａ＋Ｋ＋２Ｃｌ−共輸送体アンタゴニストである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カチオン−塩素共輸送体アンタゴニストは、ループ利尿薬か、その類似体又は誘導体かである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ループ利尿薬は、フロセミドと、ブメタニドと、エタクリン酸と、それらの類似体及び誘導体とからなるグループから選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
更にバルビツレートを含む、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
更に抗発作組成物を含む、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の組成物
【請求項７】
血液脳関門の通過を促進するように処方される、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項８】
更に血液脳関門透過性の増強剤の効果的な量を含む、請求項１ないし７のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項９】
頭蓋内投与、局部的脳内投与、脊髄液への投与又は持続的放出投与のために処方される、請求項１ないし８のいずれか１つに記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−Ａ】
【図６−Ａ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５−Ａ】
【図６−Ａ】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１１−６４３８（Ｐ２０１１−６４３８Ａ）
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１７８９７７（Ｐ２０１０−１７８９７７）
【出願日】平成２２年８月９日（２０１０．８．９）
【分割の表示】特願２０００−５８９６７２（Ｐ２０００−５８９６７２）の分割
【原出願日】平成１１年１２月２２日（１９９９．１２．２２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＥＮＴＩＵＭ
２．ＵＮＩＸ
３．ウィンドウズ
【出願人】（５０１２５１２６４）シトスキャン サイエンシズ エルエルシー (1)
【出願人】（５０１２５１２９７）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月９日（２０１０．８．９）
【分割の表示】特願２０００−５８９６７２（Ｐ２０００−５８９６７２）の分割
【原出願日】平成１１年１２月２２日（１９９９．１２．２２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＥＮＴＩＵＭ
２．ＵＮＩＸ
３．ウィンドウズ
【出願人】（５０１２５１２６４）シトスキャン サイエンシズ エルエルシー (1)
【出願人】（５０１２５１２９７）
【Ｆターム（参考）】
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