人参果から得られる抗ＴＮＦ−α作用剤及び肝保護作用剤、ヒト又は動物用医薬、新規サポニン化合物、及び新規ポリフェノール化合物
【課題】バラ科植物である人参果（トウツルキンバイ塊根）より得られる抗ＴＮＦ−α作用剤及び肝保護作用剤、及びこの抗ＴＮＦ−α作用剤又は肝保護作用剤を含有するヒト又は動物用医薬、並びに、人参果に含まれている新規なサポニン化合物及びポリフェノール化合物を提供する。
【解決手段】人参果そのもの、水もしくは低級脂肪族アルコールの含水物等により人参果を抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は該抽出液もしくは抽出エキスを分離、精製して得られる化合物を含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤及び肝保護作用剤、さらに、この抗ＴＮＦ−α作用剤又は肝保護作用剤を含有するヒト又は動物用医薬、並びに、人参果に含まれている新規なサポニン化合物及びポリフェノール化合物。
【解決手段】人参果そのもの、水もしくは低級脂肪族アルコールの含水物等により人参果を抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は該抽出液もしくは抽出エキスを分離、精製して得られる化合物を含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤及び肝保護作用剤、さらに、この抗ＴＮＦ−α作用剤又は肝保護作用剤を含有するヒト又は動物用医薬、並びに、人参果に含まれている新規なサポニン化合物及びポリフェノール化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）植物である人参果、その抽出液もしくは抽出エキス、又はこれらから分離、精製して得られるサポニン化合物（トリテルペン化合物）もしくはポリフェノール化合物を有効成分として含有する抗ＴＮＦ-α作用剤及び肝保護作用剤、該抗ＴＮＦ-α作用剤又は肝保護作用剤を含有するヒト又は動物用医薬に関する。又、本発明は、人参果の抽出液もしくは抽出エキスから分離、精製して得られる新規なサポニン化合物及びポリフェノール化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
トウツルキンバイ（学名：Ｐｏｔｅｎｔｉｌｌａ ａｎｓｅｒｉｎａ）塊根は、蕨麻（ケツマ）又は人参果と称され、中国北部から南西部にかけて自生する多年生草本である。人参果は、中医学では下痢や貧血の治療に用いられる（非特許文献１）。一方、ドイツでは本植物の全草が、歯痛、月経不順及び胃腸障害の改善に利用されている（非特許文献２）。しかしながら人参果及びその含有成分に、抗ＴＮＦ−α作用及び肝保護作用は、これまで見出されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】上海科学技術出版社 編、中薬大辞典、小学館（東京）、１９８５，ｐｐ．６５６−６５７
【非特許文献２】Ｋｏｍｂａｌ Ｒ．， Ｇｌａｓｌ Ｈ．， Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ．， Ｖｏｌ．６１， ｐｐ．４８４−４８５（１９９５）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、人参果に関する、含有成分の薬剤としての作用についての研究に基づいてなされたもので、種々の疾病（リウマチ、糖尿病、メタボリックシンドローム等）の発症及び進展に関わる炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの作用を抑制する抗ＴＮＦ−α作用剤であって、人参果由来のものを提供することを目的とする。本発明は、又、人参果由来の肝保護作用剤を提供することを目的とする。本発明は、さらに、この抗ＴＮＦ−α作用剤又は肝保護作用剤を含有するヒト又は動物用医薬を提供することを目的とする。本発明は、さらに又、人参果に含まれ、抗ＴＮＦ−α作用及び／又は肝保護作用を示す新規なサポニン化合物及びポリフェノール化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、人参果を水や低級脂肪族アルコール等により抽出して得られた抽出液、又は当該抽出液を濃縮して得られる抽出エキスについて、ＴＮＦ−α感受性細胞であるＬ９２９細胞を用いた細胞障害抑制作用を、抗ＴＮＦ−α作用剤としての活性評価の指標として検討した。その結果、人参果、その抽出液、及び該抽出液を濃縮して得られる抽出エキスが、抗ＴＮＦ−α作用を示すことを見出し、以下に示す態様の発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、その第１の態様として、人参果、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、を有効成分として含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤（請求項１）を提供する。
【０００７】
本発明者は、さらに、前記の抽出液又は抽出エキスを分離、精製し、含有成分の詳細な探索等を行うとともに、この分離、精製により得られた化合物について、Ｌ９２９細胞を用いた抗ＴＮＦ−α作用を検討したところ、いくつかの化合物が抗ＴＮＦ−α作用を示すことを見出し、以下に示す態様の発明を完成した。
【０００８】
即ち本発明は第２の態様として、
下記の構造式（１）で表される化合物：
【０００９】
【化１】
下記の構造式（１０）で表される化合物：
【００１０】
【化２】
下記の構造式（１３）で表される化合物：
【００１１】
【化３】
下記の構造式（１５）で表される化合物：
【００１２】
【化４】
下記の構造式（２０）で表される化合物：
【００１３】
【化５】
下記の構造式（２５）で表される化合物：
【００１４】
【化６】
下記の構造式（２６）で表される化合物：
【００１５】
【化７】
下記の構造式（２９）で表される化合物：
【００１６】
【化８】
下記の構造式（３０）で表される化合物：
【００１７】
【化９】
下記の構造式（３１）で表される化合物：
【００１８】
【化１０】
及び、
下記の構造式（３２）で表される化合物：
【００１９】
【化１１】
からなる群の中から選ばれる１以上の化合物を有効成分として含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤（請求項２）を提供する。
【００２０】
前記の第１の態様及び第２の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤は、ＴＮＦ−αにより惹起される生物学的応答を抑制することから、これを含有させることにより、体内での過剰なＴＮＦ−αの産生により発症及び憎悪が報告されている各種疾病（リウマチ、糖尿病、メタボリックシンドローム等）の、改善又は予防効果を有する医薬や医薬組成物（以後、医薬組成物を含めて医薬と言う。）等を得ることができる。即ち、本発明はその第３の態様として、前記の第１の態様及び第２の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤を含有することを特徴とするヒト又は動物用の医薬（請求項３）を提供する。
【００２１】
前記の抽出液又は抽出エキスからの分離、精製により得られ、かつ抗ＴＮＦ−α作用を示す化合物の中で、構造式（１）で表される化合物は、新規な化合物である。本発明者はさらに、前記の抽出液又は抽出エキスからの分離、精製により得られる化合物の中に、下記の構造式（２）、構造式（３）、構造式（４）及び構造式（５）から選ばれるいずれかの構造式で表わされる新規サポニン化合物、及び下記の構造式（６）、構造式（７）及び構造式（８）から選ばれるいずれかの構造式で表わされる新規ポリフェノール化合物が含まれること、そしてこの構造式（１）〜（８）のいずれかで表わされる新規化合物は、ＴＮＦ−αの作用により、発症及び増悪が明らかになっている疾病、具体的には、糖尿病、クローン病、慢性関節リウマチ、アルコール性肝障害や肝炎などの各種臓器障害に対する予防剤または治療剤として使用できること、さらに、ガラクトサミンにより惹起される肝細胞障害を抑制する作用を有し肝保護作用剤として使用できることを見出した。従って、構造式（１）〜（８）のいずれかで表わされる新規化合物を含有する、人参果、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスも、肝保護作用剤として使用できる。
【００２２】
本発明はその第４の態様として、前記構造式（１）及び下記構造式（２）〜（８）からなる群より選ばれるいずれかの構造式で表わされることを特徴とする新規サポニン化合物又は新規ポリフェノール化合物（請求項４）を提供する。
【００２３】
【化１２】
【００２４】
【化１３】
【００２５】
【化１４】
【００２６】
【化１５】
【００２７】
【化１６】
【００２８】
【化１７】
【００２９】
【化１８】
【００３０】
さらに本発明は、その第５の態様として、人参果、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は前記構造式（１）〜（８）のいずれかで表わされる新規サポニン化合物及び新規ポリフェノール化合物からなる群より選ばれる１以上の化合物を有効成分として含むことを特徴とする肝保護作用剤（請求項５）を提供する。
【００３１】
前記の第５の態様の肝保護作用剤は、ガラクトサミンにより惹起される肝細胞障害を抑制する作用を有するので、これを含有させることにより、肝保護作用を有する医薬等を得ることができる。即ち、本発明は、その第６の態様として、前記の第５の態様の肝保護作用剤を含有することを特徴とするヒト又は動物用の医薬（請求項６）を提供する。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の第１の態様、即ち、人参果、その水、低級脂肪族アルコールもしくはその含水物により抽出して得られる抽出液又は当該抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として含有する抗ＴＮＦ−α作用剤、又は第２の態様、即ち構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）もしくは（３２）のいずれかで表される化合物を有効成分として含有する抗ＴＮＦ−α作用剤は、ＴＮＦ−α感受性細胞として知られているＬ９２９細胞のＴＮＦ−αにより惹起される細胞死に対する抑制作用を示し、抗ＴＮＦ−α作用剤としての優れた活性を有する。
【００３３】
この抗ＴＮＦ−α作用剤を含有させたヒト又は動物用医薬（本発明の第３の態様）は、優れた抗ＴＮＦ−α作用を示すヒト又は動物用医薬である。
【００３４】
本発明の第５の態様の肝保護作用剤は、ガラクトサミンにより惹起される肝細胞障害を抑制する作用を示し、肝保護作用剤としての優れた活性を有する。
【００３５】
この肝保護作用剤を含有させたヒト又は動物用医薬（本発明の第６の態様）は、優れた肝保護作用を示す。
【００３６】
本発明の第４の態様である新規化合物は、前記のように、優れた抗ＴＮＦ−α作用及び／又は肝保護作用を示す化合物であり、ヒト又は動物用医薬の有効成分として利用できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
次に、本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明の範囲はこの実施の形態のみに限定されるものではない。
【００３８】
本発明の態様の第１の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤としては、
１）人参果を（抽出等の処理を行わずに）有効成分として用いるもの、
２）人参果を、水、低級脂肪族アルコ−ルもしくは低級脂肪族アルコ−ルの含水物等により抽出して得られる抽出液を有効成分として用いるもの、及び
３）前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として用いるもの、
を例示することができる。人参果を用いる場合は、人参果をそのまま用いることができるし、又は、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの、もしくは、乾燥等の調製を実施したものを用いることもできる。
【００３９】
抽出液は、人参果をそのまま、水、低級脂肪族アルコール及び低級脂肪族アルコールの含水物より選ばれる抽出溶媒により抽出して得ることもできる。しかし、人参果を、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったものを用いて抽出する方法が、抽出効率の面で望ましい。
【００４０】
抽出溶媒として用いられるアルコールとしては、炭素数１〜４の低級アルコール類が挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール又はこれらの混液が挙げられる。抽出溶媒としては、好ましくはこれらのアルコール、又はこれらのアルコールに３０容量％までの水を含有する含水アルコールが用いられる。前記のアルコールの中でもメタノール又はエタノールが好ましい。これらの抽出溶媒は、抽出材料に対して、１〜５０倍（重量）程度、好ましくは１０〜３０倍程度用いられる。
【００４１】
抽出温度は、室温〜溶媒の沸点の間で任意に設定できるが、５０℃〜抽出溶媒の沸点の温度が好ましい。抽出は、振盪下もしくは非振盪下又は還流下に、前記の抽出材料、即ち、人参果そのもの、又は、それを粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの等を、前記の抽出溶媒に浸漬することによって行うのが適当である。
【００４２】
好ましい抽出時間は、抽出温度や抽出の際の振盪の有無等により変動し、特に限定されない。例えば、抽出材料を振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜１０時間程度行うのが適当であり、非振盪下に浸漬する場合には、１時間〜２０日間程度行うのが適当である。又、抽出溶媒の還流下に抽出するときは、３０分間〜数時間加熱還流するのが好ましい。なお、５０℃より低い温度で浸漬して抽出することも可能であるが、その場合には、前記の時間よりも長時間浸漬するのが好ましい。抽出操作は、同一材料について１回だけ行ってもよいが、複数回、例えば２〜５回程度繰り返すのが好ましい。
【００４３】
前記の抽出工程により得られた抽出液には、人参果の含有成分が溶出されている。本発明の抗ＴＮＦ−α作用剤（又は第５の態様の肝保護作用剤）には、このようにして得られた抽出液をそのまま加えてもよいが、前記抽出液を濃縮して抽出エキスにして抗ＴＮＦ−α作用剤（又は第５の態様の肝保護作用剤）としてもよい。濃縮は、低温で減圧下に行うのが好ましい。なお、濃縮する前に濾過して濾液を濃縮してもよい。抽出エキスは、濃縮したままの状態で抗ＴＮＦ−α作用剤（又は第５の態様の肝保護作用剤）として用いてもよい。また、濃縮は乾固するまで行ってもよく、粉末状又は凍結乾燥品等として用いてもよい。濃縮する方法、粉末状及び凍結乾燥品とする方法は当該分野での公知の方法を用いることができる。
【００４４】
このようにして得られる抽出液又は抽出エキスを、精製処理に付し、含有される各成分に分離することができる。前記の、構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）又は（３２）のいずれかで表される化合物は、この分離により得ることができる。そして、この分離により得られた抗ＴＮＦ−α作用を有する化合物も、抗ＴＮＦ−α作用剤として用いることができる（本発明の第２の態様）。前記の構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）又は（８）のいずれかで表される新規化合物も、この分離により得ることができ、肝保護作用剤として用いることができる。
【００４５】
精製処理は、例えば、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法、溶媒による分配抽出等を、単独又は組み合わせて採用することができる。クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのいずれか、又はそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宣選択することができる。
【００４６】
前記のように、人参果そのもの、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、及び、前記構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）もしくは（３２）で表される化合物は、抗ＴＮＦ−α作用剤としての活性評価の指標として実施したＬ９２９細胞を用いたＴＮＦ−α誘発細胞障害抑制活性試験において、活性が見出された。さらに、新規化合物として見出された前記構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）又は（８）で表される化合物は、肝保護作用剤としての活性評価の指標として実施したマウス肝細胞を用いたガラクトサミン誘発肝細胞障害抑制活性試験において、活性が見出された。
【００４７】
本発明の第１の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤及び第２の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤は、ヒト又は動物用の医薬に適用することができ、この抗ＴＮＦ−α作用剤を含有させることにより優れた抗ＴＮＦ−α作用を有するヒト又は動物用の医薬を製造することができる。又、本発明の第５の態様の肝保護作用剤は、ヒト又は動物用の医薬に適用することができ、この肝保護作用剤を含有させることにより優れた肝保護作用を有するヒト又は動物用の医薬を製造することができる。
【００４８】
例えば、人参果そのもの、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、もしくは前記構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）もしくは（３２）で表される化合物（抗ＴＮＦ−α作用剤）、又は、人参果そのもの、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、もしくは前記構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）もしくは（８）で表される化合物（肝保護作用剤）を、そのままの状態で又は適当な媒体で希釈して、医薬品等の製造分野における公知の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等の種々の形態にして、医薬品として使用することができる。
【００４９】
これらの形態においては、適当な媒体を添加してもよい。適当な媒体としては、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）、錠剤用滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等が挙げられる。
【００５０】
錠剤とする場合は、通常の製薬における周知の方法でコートしてもよい。液体製剤とする場合は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよい。又、使用前に水や他の適切な賦形剤と混合する乾燥製品として提供してもよい。
【００５１】
こうした液体製剤は、通常の添加剤、例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂等の懸濁化剤、レシチン、ソルビタンモノオレエート、アラビアゴム等の乳化剤（食用脂を含んでもよい）、アーモンド油、分画ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコールやエチレングリコールのような油性エステル等の非水性賦形剤、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル又はソルビン酸等の保存剤を含んでもよく、さらに所望により着色剤又は香料等を含んでもよい。
【００５２】
本発明の医薬における、前記抽出液、抽出エキス、構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）もしくは（３２）で表される化合物（ＴＮＦ−α作用剤）、又は構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）もしくは（８）の使用量は、濃縮、精製の程度、活性の強さ等、使用目的、対象疾患や自覚症状の程度、使用者の体重、年齢等によって適宣調整される。例えば、医薬として成人について使用する場合は、１回の投与毎に、抽出液又は抽出エキスでは、１ｍｇ〜２０ｇ程度の範囲で使用し、この範囲内で精製度や水分含量等に応じて調整することが適当な場合が多い。又、前記化合物を使用する場合は、１ｍｇ〜１ｇ程度が適当な場合が多い。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例では、特に記載がない限り、以下に示す各種溶媒、濾紙、クロマトグラフィー用担体及びＨＰＬＣカラムを用いた。また、特に明記しない試薬については、和光純薬工業社製試薬（特級）を用いた。
【００５４】
［溶媒］
メタノール：ナカライテスク社製、一級
ＨＰＬＣ用メタノール：関東化学社製、特級
【００５５】
［濾紙］ アドバンテック社製：Ｎｏ．２
【００５６】
［クロマトグラフィー用担体］
順相シリカゲルカラムクロマトグラフ用担体：富士シリシア社製、ＢＷ−２００、１５０〜３００メッシュ
逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフ用担体：富士シリシア社製、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ１０２０Ｔ、１００〜２００メッシュ
多孔質ポリマーカラムクロマトグラフ用担体：日本練水社製、ダイアイオンＨＰ−２０
【００５７】
［ＨＰＬＣカラム］
ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、２０ｍｍ（ｉ．ｄ．）×２５０ｍｍ（実施例中カラムＡと略記）
又は、ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＰＡＱ、２０ｍｍ（ｉ．ｄ．）×２５０ｍｍ（実施例中カラムＢと略記）
【００５８】
実施例１ 人参果抽出エキスの調製及び含有成分の単離
中国産人参果（Ｐｏｔｅｎｔｉｌｌａ ａｎｓｅｒｉｎａ、塊根）９.７ｋｇを粉砕後、５０Ｌ（５倍量）のメタノールで３時間還流下抽出し、その後抽出液を濾取し、メタノール抽出液を得た。濾過残渣にメタノールを加え、同様の抽出操作を計３回行い、それぞれメタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液を合わせた後、減圧下溶媒留去しメタノール抽出エキス（２.２３ｋｇ、植物からの収率２３．０％）を得た。
【００５９】
実施例２ 人参果抽出液の分離及び精製
実施例１で得られたメタノール抽出エキス（２１３０ｇ）を、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）と水で分配抽出した。得られたＡｃＯＥｔ移行部を減圧下溶媒留去し、ＡｃＯＥｔ可溶部（５３．３ｇ、植物からの収率０．５８％）を得た。さらに、水可溶部をＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィーに付し、水及びメタノールで順次、成分を溶出させて水溶出部（１．９９ｋｇ、植物からの収率２１．４％）及びメタノール溶出部（６７．３ｇ、植物からの収率０．７３％）を得た。
【００６０】
実施例３ ＡｃＯＥｔ可溶部の精製
ＡｃＯＥｔ可溶部（４３．３ｇ）を、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１．３ｋｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝（１０：１→２：１→２：５）→メタノール］で順次溶出し、溶出画分Ｅ１（１．１１ｇ）、Ｅ２（５．０８ｇ）、Ｅ３（７．１２ｇ）、Ｅ４（８７１．１ｍｇ）、Ｅ５（７０２．２ｍｇ）、Ｅ６（９４３．２ｍｇ）、Ｅ７（４６５．５ｍｇ）、Ｅ８（２．７４ｇ）、Ｅ９（３．５８ｇ）、Ｅ１０（８．００ｇ）及びＥ１１（８．７９ｇ）を得た。
【００６１】
実施例４
溶出画分Ｅ４（８７１．１ｍｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［２．６ｇ、メタノール：水＝（７０：３０→８０：２０→９０：１０）→メタノール→ａｃｅｔｏｎｅ］にて画分し、溶出画分Ｅ４−１（１４２．９ｍｇ）、Ｅ４−２（１１３．１ｍｇ）、Ｅ４−３（３４５．２ｍｇ）、Ｅ４−４（１４２．６ｍｇ）及びＥ４−５（１４２．９ｍｇ）を得た。
【００６２】
画分Ｅ４−２（１１３．１ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝８０：２０］を用いて分離精製し、化合物ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（９）（９．５ｍｇ，０．０００１％（植物からの化合物の単離収率。以下同様））、ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ ａｃｉｄ（１１）（５．１ｍｇ、０．０００１％）及び２−ｏｘｏ−ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（１６）（４．６ｍｇ，０．０００１％）を単離した。なお、「化合物」との用語の後又は化合物名の後の括弧内の数字は、当該化合物を表す構造式の番号を示し、又「化合物」との用語とその後に記載の括弧内の数字との組合せで、当該数字の番号の構造式で表わされる化合物を示す。以下の実施例においても同様である。
【００６３】
実施例５
溶出画分Ｅ５（７０２．２ｍｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［２３ｇ、メタノール：水＝（６０：４０→７０：３０→８０：２０→９０：１０）→メタノール→ａｃｅｔｏｎｅ］にて画分し、溶出画分Ｅ５−１（１０１．５ｍｇ）、Ｅ５−２（１０４．５ｍｇ）、Ｅ５−３（２１７．８ｍｇ）、Ｅ５−４（６７．５ｍｇ）、Ｅ５−５（５３９．１ｍｇ）Ｅ５−６（１１４．４ｍｇ）、Ｅ５−７（７８．８ｍｇ）、Ｅ５−８（３０９．９ｍｇ）、及びＥ５−９（２５．２ｍｇ）を得た。
【００６４】
画分Ｅ５−２（１０４．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝７０：３０］を用いて分離精製し、化合物ｃｅｃｒｏｐｉａｃｉｃ ａｃｉｄ（１９）（７．２ｍｇ、０．０００１％）を単離した。
【００６５】
画分Ｅ５−３（２１７．８ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝７０：３０］を用いて分離精製し、化合物ｅｕｓｃａｐｈｉｃ ａｃｉｄ（１３）（１７．８ｍｇ、０．０００２％），２α，１１α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−ｕｒｓ−１２−ｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ（１５）（５７．２ｍｇ，０．０００８％）及びｃｅｃｒｏｐｉａｃｉｃ ａｃｉｄ（１９）（５．３ｍｇ、０．０００１％）を単離した。
【００６６】
画分Ｅ５−４（６７．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝８０：２０］を用いて分離精製し、化合物ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（９）（５０．８ｍｇ、０．０００９％），ｅｕｓｃａｐｈｉｃ ａｃｉｄ（１３）（１０．０ｍｇ，０．０００１％）、２α，１１α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−ｕｒｓ−１２−ｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ（１５）（８．３ｍｇ，０．０００２％）、２α−ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ（１８）（１５．０ｍｇ，０．０００２８％）、ｍａｓｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ（２０）（２１．６ｍｇ，０．０００４％）及びａｌｐｈｉｔｏｌｉｃ ａｃｉｄ（２３）（３．２ｍｇ，０．０００１％）を得た。
【００６７】
実施例６
溶出画分Ｅ８（２．７４ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［２４０ｇ、メタノール：水＝（１０：９０→３０：７０→７０：３０）→メタノール→ａｃｅｔｏｎｅ］にて画分し、溶出画分Ｅ８−１（３６８．０ｍｇ）、Ｅ８−２（３３１．２ｍｇ）、Ｅ８−３（２４０．０ｍｇ）、Ｅ８−４（６０．３ｍｇ）、Ｅ８−５（５１．６ｍｇ）Ｅ８−６（５５０．１ｍｇ）、Ｅ８−７（６３６．０ｍｇ）、Ｅ８−８（２９７．２ｍｇ）、及びＥ８−９（１６８．７ｍｇ）を得た。
【００６８】
画分Ｅ８−１（３６８．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝１０：９０］を用いて分離精製し、化合物ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（２５）（７．８ｍｇ、０．０００１％）及び（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（３０）（８６．９ｍｇ、０．０００３％）を単離した。
【００６９】
画分Ｅ８−３（２４０．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝１０：９０］を用いて分離精製し、化合物（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ（２９）（３７．２ｍｇ、０．０００５％）及び（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（３０）（２０．０ｍｇ、０．０００３％）を単離した。
【００７０】
画分Ｅ８−６（５５０．１ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５０：５０、１％酢酸］を用いて分離精製し、化合物ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（１１２．３ｍｇ、０．００１５％）及び２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２１）（３７．１ｍｇ、０．０００５％）を単離した。
【００７１】
画分Ｅ８−７（６３６．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝７０：３０］を用いて分離精製し、化合物ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（２０３．３ｍｇ、０．００２７％）、ｋａｊｉ−ｉｃｈｉｇｏｓｉｄｅ Ｆ１（１４）（１４３．９ｍｇ、０．００１９％）及び２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２１）（１１．６ｍｇ、０．０００２％）を単離した。
【００７２】
実施例７
溶出画分Ｅ９（３．５８ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［１３０ｇ、メタノール：水＝（５０：５０→７０：３０→８０：２０）→メタノール］にて画分し、溶出画分Ｅ９−１（３４４．４ｍｇ）、Ｅ９−２（１１１．１ｍｇ）、Ｅ９−３（１．８５ｇ）、Ｅ９−４（２４６．３ｍｇ）、Ｅ９−５（６１．６ｍｇ）及びＥ９−６（３６０．２ｍｇ）を得た。
【００７３】
画分Ｅ９−１（３４４．４ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝１５：８５］を用いて分離精製し、化合物ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ（２４）（２３．９ｍｇ，０．０００３％）、ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（２５）（５．５ｍｇ，０．０００１％）、（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ（２９）（６．３ｍｇ，０．０００１％）、及び（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（３０）（８１．７ｍｇ，０．００１１％）を単離した。
【００７４】
画分Ｅ９−３（５３０．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５５：４５］を用いて分離精製し、化合物（１）（２７３．９ｍｇ，０．０１３％）、（２）（１４．３ｍｇ，０．０００７％）、ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（４６．１ｍｇ，０．００２２％）、及びｋａｊｉ−ｉｃｈｉｇｏｓｉｄｅ Ｆ１（１４）（５７．０ｍｇ，０．００２７％）を単離した。
【００７５】
画分Ｅ９−４（２４６．３ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝６０：４０］を用いて分離精製し、化合物（３）（３．８ｍｇ，０．０００１％）、２８−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（１０）（２４．６ｍｇ，０．０００３％），ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（１１５．８ｍｇ，０．００１６％）及び２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２１）（１４．６ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【００７６】
画分Ｅ９−５（６１．６ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝７０：３０］を用いて分離精製し、化合物ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（９．２ｍｇ，０．０００１％）及びｋａｊｉ−ｉｃｈｉｇｏｓｉｄｅ Ｆ１（１４）（１０．８ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【００７７】
実施例８
溶出画分Ｅ１０（８．００ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［２４０ｇ、メタノール：水＝（５０：５０→６０：４０→８０：２０）→メタノール］にて画分し、溶出画分Ｅ１０−１（９６７．４ｍｇ）、Ｅ１０−２（２３３．０ｍｇ）、Ｅ１０−３（１９５．８ｍｇ）、Ｅ１０−４（２２．７ｍｇ）、Ｅ１０−５（５．９７ｇ）、Ｅ１０−６（３０８．１ｍｇ）及びＥ１０−７（１９１．１ｍｇ）を得た。
【００７８】
画分Ｅ１０−３（１９５．８ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３５：６５］を用いて分離精製し、化合物（８）（７３．４ｍｇ，０．００１０％）及びｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ（２６）（２１．３ｍｇ，０．０００３）％）を単離した。
【００７９】
画分Ｅ１０−５（１２５．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５５：４５、１％酢酸］を用いて分離精製し、ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（７９．８ｍｇ，０．０５１％）、ｋａｊｉ−ｉｃｈｉｇｏｓｉｄｅ Ｆ１（１４）（５．９ｍｇ，０．００３８％）及び２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２１）（１５．４ｍｇ，０．００９９％）を単離した。
【００８０】
実施例９ メタノール溶出部の精製
メタノール溶出部（５５．０ｇ）を、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［２．０ｋｇ、クロロホルム：メタノール：水＝（１５：３：０．３→１０：３：０．４→７：３：０．５→６：４：１→５：５：１）→メタノール］で順次溶出し、溶出画分Ｍ１（２０．４４ｇ）、Ｍ２（８．４７ｇ）、Ｍ３（２．２１ｇ）、Ｍ４（４．０５ｇ）、Ｍ５（３．４９ｇ）、Ｍ６（５．４９ｇ）、Ｍ７（３．１１ｇ）、及びＭ８（２．５３ｇ）を得た。
【００８１】
実施例１０
溶出画分Ｍ１（２０．４４ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［６２０ｇ、メタノール：水＝（６０：４０→７０：３０→７５：２５→９０：１０→メタノール）→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ１−１（３００．２ｍｇ）、Ｍ１−２（１０４．９ｍｇ）、Ｍ１−３（５５２．２ｍｇ）、Ｍ１−４（１１８．８ｍｇ）、Ｍ１−５（７３７．４ｍｇ）、Ｍ１−６（４９２．１ｍｇ）、Ｍ１−７（３．０３ｇ）、Ｍ１−８（６．３１ｇ）、Ｍ１−９（３．８４ｇ）及びＭ１−１０（２．１４ｇ）を得た。
【００８２】
画分Ｍ１−２（１０４．９ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５５：４５］を用いて分離精製し、化合物（４）（２８．８ｍｇ，０．０００４％）を単離した。
【００８３】
画分Ｍ１−３（５５２．２ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝６０：４０］を用いて分離精製し、化合物（５）（４４．６ｍｇ，０．０００６％）、ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（２１６．５ｍｇ，０．００２９％）、２−ｏｘｏ−ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ ２８−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｅｓｔｅｒ（１７）（３６．８ｍｇ，０．０００５％）及びｃｅｃｒｏｐｉａｃｉｃ ａｃｉｄ（１９）（２２．３ｍｇ，０．０００３％）を単離した。
【００８４】
画分Ｍ１−４（１１８．８ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝６０：４０］を用いて分離精製し、化合物（４）（５．９ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【００８５】
画分Ｍ１−５をメタノールにて再結晶して、析出した結晶を濾取して化合物ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ ａｃｉｄ（１１）（５５３．２ｍｇ，０．００７３％）を単離した。
【００８６】
画分Ｍ１−６（４９２．１ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝８０：２０］を用いて分離精製し、化合物ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（９）（１４１．３ｍｇ，０．００１９％）を単離した。
【００８７】
実施例１１
溶出画分Ｍ２（８．４７ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［２５５ｇ、メタノール：水＝（１０：９０→３０：７０→４０：６０→５０：５０→６０：４０）→メタノール→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ２−１（３７９．５ｍｇ）、Ｍ２−２（５８１．０ｍｇ）、Ｍ２−３（３７６．５ｍｇ）、Ｍ２−４（１２３．６ｍｇ）、Ｍ２−５（３３１．３ｍｇ）、Ｍ２−６（２０４．５ｍｇ）、Ｍ２−７（３．３７ｇ）及びＭ２−８（２．２１ｇ）を得た。
【００８８】
画分Ｍ２−３（３７６．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝２０：８０］を用いて分離精製し、化合物ｄｕｃｈｅｓｉｄｅ Ｂ（２８）（７５．０ｍｇ，０．００１０％）を単離した。
【００８９】
画分Ｍ２−５（３３１．３ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５０：５０］を用いて分離精製し、化合物（５）（５８．４ｍｇ，０．０００８％）及びａｒｊｕｎｇｌｕｃｏｓｉｄｅ Ｉ（２２）（７．６ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【００９０】
画分Ｍ２−６（２０４．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５５：４５］を用いて分離精製し、化合物（５）（９．４ｍｇ，０．０００１％）、ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（５７．０ｍｇ，０．０００８％）及び２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２１）（１１．４ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【００９１】
実施例１２
溶出画分Ｍ３（２．２１ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［７０ｇ、メタノール：水＝（１０：９０→３０：７０→４０：６０→６０：４０→９０：１０）→メタノール→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ３−１（２３０．４ｍｇ）、Ｍ３−２（２５２．７ｍｇ）、Ｍ３−３（４２．４ｍｇ）、Ｍ３−４（８２．１ｍｇ）、Ｍ３−５（１１４．０ｍｇ）、Ｍ３−６（１５９．３ｍｇ）、Ｍ３−７（３８１．１ｍｇ）及びＭ３−８（２６８．７ｍｇ）を得た。
【００９２】
画分Ｍ３−１（２３０．４ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＢ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５：９５］を用いて分離精製し、化合物（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（３０）（２４．０ｍｇ，０．０００３％）及びＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（３７）（６．２ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【００９３】
実施例１３
溶出画分Ｍ４（４．０５ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［１２５ｇ、メタノール：水＝（２０：８０→３０：７０→４０：６０→６０：４０→９５：５）→メタノール→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ４−１（２３８．５ｍｇ）、Ｍ４−２（３３４．３ｍｇ）、Ｍ４−３（１．１７ｇ）、Ｍ４−４（２９５．６ｍｇ）、Ｍ４−５（３３４．９ｍｇ）、Ｍ４−６（１２８．６ｍｇ）、Ｍ４−７（７８．５ｍｇ）、Ｍ４−８（６３２．８ｍｇ）、Ｍ４−９（３２１．２ｍｇ）、Ｍ４−１０（１３４．４ｍｇ）及びＭ４−１１（１３７．５ｍｇ）を得た。また、ここで得られた画分Ｍ４−３は、Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（３７）（１．１７ｇ，０．０１６％）であった。
【００９４】
画分Ｍ４−４（２９５．６ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝２０：８０］を用いて分離精製し、化合物６−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌｓｕｃｒｏｓｅ（３５）（５０．６ｍｇ，０．０００７％）、６−ｆｅｒｕｌｏｙｌｓｕｃｒｏｓｅ（３６）（８．２ｍｇ，０．０００１％）及びＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（３７）（５．７ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【００９５】
画分Ｍ４−５（３３４．９ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物（７）（２０．６ｍｇ，０．０００３％）及びｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−ｓａｍｂｕｂｉｏｓｉｄｅ（３４）（１１．０ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【００９６】
画分Ｍ４−６（１２８．６ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物（６）（１８．３ｍｇ，０．０００２％）及びｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（２２．６ｍｇ，０．０００３％）を単離した。
【００９７】
実施例１４
溶出画分Ｍ５（３．４９ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［１１０ｇ、メタノール：水＝（５：９５→２０：８０→５０：５０→８０：２０）→メタノール→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ５−１（２１０．８ｍｇ）、Ｍ５−２（２２３．７ｍｇ）、Ｍ５−３（５２３．８ｍｇ）、Ｍ５−４（３５８．５ｍｇ）、Ｍ５−５（２７５．２ｍｇ）、Ｍ５−６（３４５．４ｍｇ）、Ｍ５−７（４０２．２ｍｇ）及びＭ５−８（４４８．５ｍｇ）を得た。
【００９８】
画分Ｍ５−３（５２３．８ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＢ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５：９５］を用いて分離精製し、化合物（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ ７−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３１）（１１４．３ｍｇ，０．００１５％）を単離した。
【００９９】
画分Ｍ５−４（３５８．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（１０．４ｍｇ，０．０００１％）及びｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３２）（１３．７ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【０１００】
画分Ｍ５−５（２７５．２ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物（６）（１０．４ｍｇ，０．０００１％）、化合物（７）（４．３ｍｇ，０．０００１％）、ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ（２６）（２４．３ｍｇ，０．０００３％）、ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（１４．５ｍｇ，０．０００２％）及びｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−ｓａｍｂｉｏｓｉｄｅ−３’−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３４）（１０．５ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【０１０１】
実施例１５
溶出画分Ｍ６（５．４９ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［１８０ｇ、メタノール：水＝（１０：９０→３０：７０→５０：５０）→メタノール→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ６−１（２．３６ｇ）、Ｍ６−２（４９０．０ｍｇ）、Ｍ６−３（７５７．１ｍｇ）、Ｍ６−４（４０９．５ｍｇ）、Ｍ６−５（１５５．０ｍｇ）、Ｍ６−６（１．０３ｇ）及びＭ６−７（４２３．０ｍｇ）を得た。
【０１０２】
画分Ｍ６−３（５００．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（９．４ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【０１０３】
画分Ｍ６−４（４０９．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ（２６）（１０．０ｍｇ，０．０００１％）及びｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（１４．０ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【０１０４】
画分Ｍ６−５（１５５．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３５：６５］を用いて分離精製し、化合物（６）（６．８ｍｇ，０．０００１％）及びｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ（２６）（５．０ｍｇ，０．０００１％）及びｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（４．７ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【０１０５】
実施例１６
実施例４〜１５で得られた化合物（９）〜（３７）について［α］Ｄ、ＭＳ、ＲＩ、ＵＶ、ＩＲ及び１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ等の測定を、下記実施例１７における測定と同様にして行った。それらの測定値と、公知文献記載の物理化学的データの数値との比較から、化合物（９）〜（３７）は、それぞれ、以下に示す公知の化合物であることが確認された。それぞれを表す化学構造式及び化合物名（［ ］内）を示す（構造式の後の（ ）内は構造式の番号を示す）。
化合物（９） ［ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ポモリクアシッド）］
【０１０６】
【化１９】
【０１０７】
化合物（１０） ［２８−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（２８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルポモリクアシッド）］
前記の構造式（１０）で表わされる化合物である。
化合物（１１） ［ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ ａｃｉｄ（トルメンティックアシッド）］
【０１０８】
【化２０】
化合物（１２） ［ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（ロサムチン）］
【０１０９】
【化２１】
【０１１０】
化合物（１３） ［ｅｕｓｃａｐｈｉｃ ａｃｉｄ（ユースカフィクアシッド）］
前記の構造式（１３）で表わされる化合物である。
化合物（１４） ［ｋａｊｉ−ｉｃｈｉｇｏｓｉｄｅ Ｆ１（カジ−イチゴシド Ｆ１）］
【０１１１】
【化２２】
【０１１２】
化合物（１５） ［２α，１９α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−ｕｒｓ−１２−ｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ（２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイク アシッド）］
前記の構造式（１５）で表わされる化合物である。
化合物（１６） ［２−ｏｘｏ−ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（２−オキソ−ポモリクアシッド）］
【０１１３】
【化２３】
化合物（１７） ［２−ｏｘｏ−ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｅｓｔｅｒ（２−オキソ−ポモリクアシッド β−Ｄ−グルコピラノシド）］
【０１１４】
【化２４】
化合物（１８） ［２−α−ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ（２−α−ヒドロキシウルソリックアシッド）］
【０１１５】
【化２５】
化合物（１９） ［ｃｅｃｒｏｐｉａｃｉｃ ａｃｉｄ（セクロピアシクアシッド）］
【０１１６】
【化２６】
【０１１７】
化合物（２０） ［ｍａｓｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ（マスリニクアシッド）］
前記の構造式（２０）で表わされる化合物である。
化合物（２１） ［２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２４−デオキシ−セリコシド）］
【０１１８】
【化２７】
化合物（２２） ［ａｒｊｕｎｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（アルジュングルコシド）］
【０１１９】
【化２８】
化合物（２３） ［ａｌｐｈｉｔｏｌｉｃ ａｃｉｄ（アルフィトリクアシッド）］
【０１２０】
【化２９】
化合物（２４） ［ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ（没食子酸）］
【０１２１】
【化３０】
【０１２２】
化合物（２５） ［ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（没食子酸メチルエステル）］
前記の構造式（２５）で表わされる化合物である。
【０１２３】
化合物（２６） ［ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ（エラグ酸）］
前記の構造式（２６）で表わされる化合物である。
化合物（２７） ［ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−Ｏ−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（エラグ酸 ４−Ｏ−α−Ｌ−アラビノフラノシド）］
【０１２４】
【化３１】
化合物（２８） ［ｄｕｃｈｅｓｉｄｅ Ｂ（ヅチェシド B）］
【０１２５】
【化３２】
【０１２６】
化合物（２９） ［（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ（（＋）−カテキン）］
前記の構造式（２９）で表わされる化合物である。
【０１２７】
化合物（３０） ［（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（（＋）−ガロカテキン）］
前記の構造式（３０）で表わされる化合物である。
【０１２８】
化合物（３１） ［（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ ７−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（（＋）−カテキン ７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）］
前記の構造式（３１）で表わされる化合物である。
【０１２９】
化合物（３２） ［ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ケルセチン ３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）］
前記の構造式（３２）で表わされる化合物である。
化合物（３３） ［ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−ｓａｍｂｕｂｉｏｓｉｄｅ（ケルセチン ３−Ｏ−サンブビオシド）］
【０１３０】
【化３３】
化合物（３４） ［ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−ｓａｍｂｕｂｉｏｓｉｄｅ−３’−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ケルセチン ３−Ｏ−サンブビオシド−３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）］
【０１３１】
【化３４】
化合物（３５） ［６−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌｓｕｃｒｏｓｅ（６−ｐ−クマロイルスクロース）］
【０１３２】
【化３５】
化合物（３６） ［６−ｆｅｒｕｌｏｙｌｓｕｃｒｏｓｅ（６−フェルロイルスクロース）］
【０１３３】
【化３６】
化合物（３７） ［Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（Ｌ−トリプトファン）］
【０１３４】
【化３７】
【０１３５】
実施例１７
さらに実施例４〜１５で得られた化合物（１）〜（８）については、化合物の諸物性を測定して、化学構造の解析を行った結果、それぞれ、前記の構造式（１）〜（８）のいずれかで表される新規な化合物であることが明らかになった。従って、人参果抽出液中には、化合物（１）〜（８）で表わされる新規な化合物と（９）〜（３７）で表わされる公知の化合物が存在していることが明らかになった。
【０１３６】
実施例で得られた化合物（１）〜（８）の諸物性の測定結果を以下に示す。なお、実施例で得られた化合物（１）〜（８）は、いずれも不定形粉末であった。
【０１３７】
化合物（１）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：＋２０．４ （ｃ＝０．１１，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析（Ｈｉｇｈ-ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ：以下の化合物（２）〜（８）についても同様）
理論値 Ｃ３６Ｈ５６Ｏ１０（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：６７１．３７７１
実測値 ：６７１．３７６７
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４７０，１７２５，１６８６，１６５５，１４０１，１０７３
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ６７１ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδを表１に、１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδｃを表２に記載する。
以上の結果より、前記構造式（１）で表される化合物であることが判った。
【０１３８】
化合物（２）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：＋２９．８ （ｃ＝０．６２，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ３６Ｈ５６Ｏ１０（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：６７１．３７７１
実測値 ：６７１．３７６４
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４７０，１７１９，１６８６，１６５５，１３９７，１０７５
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ６７１ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδを表１に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδｃを表２に記載する。
以上の結果より、前記構造式（２）で表される化合物であることが判った。
【０１３９】
化合物（３）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：＋１２．８ （ｃ＝０．１３，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ３８Ｈ６０Ｏ１１（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：７１５．４０３３
実測値 ：７１５．４０４２
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４７０，１７２１，１６８６，１６５５，１３９７，１０７６
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ７１５ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδを表１に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδｃを表２に記載する。
以上の結果より、前記構造式（３）で表される化合物であることが判った。
【０１４０】
化合物（４）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：＋２２．６ （ｃ＝０．１５，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ３６Ｈ５６Ｏ１２（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：７０３．３６６９
実測値 ：７０３．３６７６
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４７０，１７２５，１３９０，１０７５
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ７０３ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδを表３に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδｃを表４に記載する。
以上の結果より、前記構造式（４）で表される化合物であることが判った。
【０１４１】
化合物（５）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：＋２２．２ （ｃ＝０．１３，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ３７Ｈ５８Ｏ１２（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：７１７．３８２６
実測値 ：７１７．３８２２
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４７０，１７２０，１０７５，９３４
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ７１７ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδを表３に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδｃを表４に記載する。
以上の結果より、前記構造式（５）で表される化合物であることが判った。
【０１４２】
化合物（６）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：−２．２ （ｃ＝０．１１，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ２０Ｈ１６Ｏ１２（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：４７１．０５３９
実測値 ：４７１．０５４４
・紫外吸収スペクトル（ＭｅＯＨ，ｎｍ，（ｌｏｇε））：３６８（４．０９），２５１（４．８１）
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３３４０，１７２５，１６１０，１０６３
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ４７１ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδを、表５に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδｃを表６に記載する。
以上の結果より、前記構造式（６）で表される化合物であることが判った。
【０１４３】
化合物（７）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２８：−５２．９ （ｃ＝０．０５，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ２５Ｈ２４Ｏ１６（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：６０３．０５３９
実測値 ：６０３．０５４４
・紫外吸収スペクトル（ＭｅＯＨ，ｎｍ，（ｌｏｇε））：３５２（４．１７，ｓｈ），２３７（４．９８）
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３３４０，１７２５，１６１０，１０６３
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ６０３ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδを表５に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδｃを表６に記載する。
以上の結果より、前記構造式（７）で表される化合物であることが判った。
【０１４４】
化合物（８）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２８：＋２７．０ （ｃ＝０．１０，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ２５Ｈ２４Ｏ１６（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：４７１．０５３９
実測値 ：４７１．０５４７
・紫外吸収スペクトル（ＭｅＯＨ，ｎｍ，（ｌｏｇε））：３５４（４．０３），３１５（３．９７，ｓｈ），２５４（４．５３）
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３３８５，１７１０，１６１１，１０７８
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ４７１ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδを表５に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδｃを表６に記載する。
以上の結果より、前記構造式（８）で表される化合物であることが判った。
【０１４５】
なお表１〜６中の「位置」の欄に記載された数字は、各Ｈ及びＣの位置を示す数字であり、その対応関係は、化合物（１）及び化合物（６）ついては以下に示すとおりである。又、化合物（２）〜（５）における位置と数字の対応関係は化合物（１）と、化合物（７）、（８）における対応関係は化合物（６）と同様である。また、表中の略記Ｇｌｃ，Ｒｈａ及びＡｒａ（ｆ）は、それぞれβ−Ｄ−グルコピラノシル基、α−Ｌ−ラムノピラノシル基及びα−Ｌ−アラビノフラノシル基を意味する。
【０１４６】
【化３８】
化合物（１）
【０１４７】
【化３９】
化合物（６）
【０１４８】
【表１】
【０１４９】
【表２】
【０１５０】
【表３】
【０１５１】
【表４】
【０１５２】
【表５】
【０１５３】
【表６】
【０１５４】
実施例１８ Ｌ９２９細胞を用いたＴＮＦ−α誘発細胞傷害抑制作用試験
実施例１〜２で得られたメタノール抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、メタノール溶出部及び水溶出部、並びに化合物（１）、（４）〜（１５）、（１７）〜（２１）、（２４）〜（３３）及び（３５）〜（３７）について、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験における抗ＴＮＦ−α作用の指標として、Ｌ９２９細胞を用いたＴＮＦ−α誘発細胞障害に対する保護作用試験を実施した。試験方法を以下に示す。
【０１５５】
大日本住友製薬社より購入したＬ９２９細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸（インビトロジェン社製）を含むｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、シグマ−アルドリッチ社製）培地を用いて培養して、本実験に使用した。９６穴平底マイクロプレートに１×１０４細胞／１００μＬ／穴の割合で細胞を播種した後、５％の二酸化炭素雰囲気下、３７℃において２０時間培養した。その後、前記培地に１ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−α（シグマ−アルドリッチ社製）及び被験物質のＤＭＳＯ溶液をそれぞれ含有する培地を加えた。ここで、被験物質のＤＭＳＯ溶液は、培地中のＤＭＳＯ濃度が０．５％になるように添加した。４４時間培養した後、０．５ｍｇ／ｍＬの３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）を含有する培地と交換し、さらに４時間培養した。培地を除去後、生成したホルマザンを０．０４Ｎ塩酸含有イソプロピルアルコール１００μＬ／穴で溶解した後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（測定波長５７０ｎｍ、参照波長６６０ｎｍ、Ｏ．Ｄ．）を測定した。測定された吸光度を用い、以下の式に従って、ＴＮＦ−αによる細胞の障害抑制率を算出した。
【０１５６】
【数１】
【０１５７】
式中、Ｏ．Ｄ．Ｎｏｒｍａｌは、被験物質を含まない培地（即ち、培地中に０．５％ＤＭＳＯのみを含むもの）で測定される吸光度を示し、Ｏ．Ｄ．Ｃｏｎｔｒｏｌは、培地中に０．５％ＤＭＳＯ及び１ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αを含有する場合に測定される吸光度を、Ｏ．Ｄ．Ｓａｍｐｌｅは、培地中に被験物質及び１ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αを含有する場合に測定される吸光度を意味する。結果を以下の表７及び８に示す。結果はいずれも平均値と標準誤差で表し、対照群との有意差検定には、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。
【０１５８】
【表７】
【０１５９】
【表８】
【０１６０】
前記表７及び８中、障害抑制率の結果の末尾の符号「＊」及び「＊＊」は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で検定した対照との有意差：ｐが０．０５及び０．０１未満であったことを表す。
【０１６１】
前記表７及び８の結果より、人参果から調製されるメタノール抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部及びＭｅＯＨ溶出部は、Ｌ９２９細胞を用いたＴＮＦ−α誘発細胞傷害抑制作用試験において有意な抗ＴＮＦ−α作用を有することが示されている。また、化合物（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）及び（３２）は有意な抗ＴＮＦ−α作用を有することが示されている。
【０１６２】
実施例１８は、抗ＴＮＦ−α作用剤について、ＴＮＦ−α感受性でマウス由来細胞であるＬ９２９細胞を用い、被験物質共存下、培養液中にＴＮＦ−αを添加した場合に観察される細胞死又は細胞増殖（細胞障害）を抑制する活性について、ＭＴＴアッセイ法を利用して判定したものである。この方法により、培養液中のＴＮＦ−αにより惹起される細胞障害を抑制すると判定された物質は、ＴＮＦ−αによる生物学的な応答を抑制している。即ち、ＴＮＦ−αによる発症及び増悪が考えられる疾病群の治療剤又は予防剤として利用できる。従って、人参果そのもの、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、及び、前記構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）又は（３２）で表される化合物は、抗ＴＮＦ−α作用剤として用いることができる。
【０１６３】
実施例１９ マウス肝細胞を用いたガラクトサミン誘発肝細胞傷害抑制作用試験
実施例１〜２で得られたメタノール抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、メタノール溶出部及び水溶出部、並びに化合物（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）及び（８）について、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験における肝保護作用の指標として、マウス肝細胞を用いたガラクトサミン誘発肝細胞障害に対する保護作用試験を実施した。試験方法を以下に示す。
【０１６４】
ｄｄＹ系雄性マウスを、ペントバルビタール麻酔下で開腹し、４０℃に保温したＬｉｖｅｒ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を門脈より灌流して肝臓を脱血した。前記灌流液を、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−Ｔｙｐｅ Ｉ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するｐＨ７．５の灌流液（塩化ナトリウム：８ｇ／Ｌ、塩化カリウム：０．４ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物：０．７４ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム・一水和物：７８ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム・十二水和物：１５１ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ：２．３８ｇ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム：３５０ｍｇ／Ｌ、フェノールレッド：６ｇ／Ｌ）と交換した後、さらに１０分間灌流した。この肝臓をろ過して得られた肝実質細胞を実験に供した。
【０１６５】
前記肝実質細胞を、１０％牛胎児血清を含むウイリアムズ培地Ｅ（シグマーアルドリッチ社製）に懸濁し、９６穴平底マイクロプレートに４×１０４細胞／１００μＬ／穴の割合で細胞を播種した後、５％の二酸化炭素雰囲気下、３７℃において４時間培養した。その後、前記培地を１ｍＭ Ｄ−ＧａｌＮ及び被験物質のＤＭＳＯ溶液をそれぞれ含有する培地に変えた。ここで、被験物質のＤＭＳＯ溶液は、培地中のＤＭＳＯ濃度が０．５％になるように添加した。４４時間培養した後、０．５ｍｇ／ｍＬの３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）を含有する培地と交換し、さらに４時間培養した。培地を除去後、生成したホルマザンを０．０４Ｎ塩酸含有イソプロピルアルコール１００μＬ／穴で溶解した後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（測定波長５７０ｎｍ、参照波長６６０ｎｍ）を測定した。測定された吸光度を用い、以下の式に従って、肝細胞の障害抑制率を算出した。
【０１６６】
【数２】
【０１６７】
式中、Ｏ．Ｄ．Ｎｏｒｍａｌは、被験物質を含まない培地（即ち、培地中に０．５％ＤＭＳＯのみを含むもの）で測定される吸光度を示し、Ｏ．Ｄ．Ｃｏｎｔｒｏｌは、培地中に０．５％ＤＭＳＯ及び１ｍＭ Ｄ−ＧａｌＮを含有する場合に測定される吸光度を、Ｏ．Ｄ．Ｓａｍｐｌｅは、培地中に被験物質及び１ｍＭ Ｄ−ＧａｌＮを含有する場合に測定される吸光度を意味する。結果を以下の表９及び表１０に示す。結果はいずれも平均値と標準誤差で表し、対照群との有意差検定には、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。
【０１６８】
【表９】
【０１６９】
【表１０】
【０１７０】
前記表９及び１０中、障害抑制率の結果の末尾の符号「＊」及び「＊＊」は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で検定した対照との有意差：ｐが０．０５及び０．０１未満であったことを表す。
【０１７１】
前記表９及び１０の結果より、人参果のメタノール抽出エキス及び該抽出エキスより調製した各分画は、マウス肝初代培養細胞を用いたガラクトサミン誘発肝細胞障害に対する保護作用試験において有意な肝保護作用を有することが示されている。又、構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）及び（８）で表される化合物からなる群の中から選ばれる化合物も有意な肝保護作用を有することが示されている。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）植物である人参果、その抽出液もしくは抽出エキス、又はこれらから分離、精製して得られるサポニン化合物（トリテルペン化合物）もしくはポリフェノール化合物を有効成分として含有する抗ＴＮＦ-α作用剤及び肝保護作用剤、該抗ＴＮＦ-α作用剤又は肝保護作用剤を含有するヒト又は動物用医薬に関する。又、本発明は、人参果の抽出液もしくは抽出エキスから分離、精製して得られる新規なサポニン化合物及びポリフェノール化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
トウツルキンバイ（学名：Ｐｏｔｅｎｔｉｌｌａ ａｎｓｅｒｉｎａ）塊根は、蕨麻（ケツマ）又は人参果と称され、中国北部から南西部にかけて自生する多年生草本である。人参果は、中医学では下痢や貧血の治療に用いられる（非特許文献１）。一方、ドイツでは本植物の全草が、歯痛、月経不順及び胃腸障害の改善に利用されている（非特許文献２）。しかしながら人参果及びその含有成分に、抗ＴＮＦ−α作用及び肝保護作用は、これまで見出されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】上海科学技術出版社 編、中薬大辞典、小学館（東京）、１９８５，ｐｐ．６５６−６５７
【非特許文献２】Ｋｏｍｂａｌ Ｒ．， Ｇｌａｓｌ Ｈ．， Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ．， Ｖｏｌ．６１， ｐｐ．４８４−４８５（１９９５）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、人参果に関する、含有成分の薬剤としての作用についての研究に基づいてなされたもので、種々の疾病（リウマチ、糖尿病、メタボリックシンドローム等）の発症及び進展に関わる炎症性サイトカインであるＴＮＦ−αの作用を抑制する抗ＴＮＦ−α作用剤であって、人参果由来のものを提供することを目的とする。本発明は、又、人参果由来の肝保護作用剤を提供することを目的とする。本発明は、さらに、この抗ＴＮＦ−α作用剤又は肝保護作用剤を含有するヒト又は動物用医薬を提供することを目的とする。本発明は、さらに又、人参果に含まれ、抗ＴＮＦ−α作用及び／又は肝保護作用を示す新規なサポニン化合物及びポリフェノール化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、人参果を水や低級脂肪族アルコール等により抽出して得られた抽出液、又は当該抽出液を濃縮して得られる抽出エキスについて、ＴＮＦ−α感受性細胞であるＬ９２９細胞を用いた細胞障害抑制作用を、抗ＴＮＦ−α作用剤としての活性評価の指標として検討した。その結果、人参果、その抽出液、及び該抽出液を濃縮して得られる抽出エキスが、抗ＴＮＦ−α作用を示すことを見出し、以下に示す態様の発明を完成した。
【０００６】
即ち、本発明は、その第１の態様として、人参果、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、を有効成分として含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤（請求項１）を提供する。
【０００７】
本発明者は、さらに、前記の抽出液又は抽出エキスを分離、精製し、含有成分の詳細な探索等を行うとともに、この分離、精製により得られた化合物について、Ｌ９２９細胞を用いた抗ＴＮＦ−α作用を検討したところ、いくつかの化合物が抗ＴＮＦ−α作用を示すことを見出し、以下に示す態様の発明を完成した。
【０００８】
即ち本発明は第２の態様として、
下記の構造式（１）で表される化合物：
【０００９】
【化１】
下記の構造式（１０）で表される化合物：
【００１０】
【化２】
下記の構造式（１３）で表される化合物：
【００１１】
【化３】
下記の構造式（１５）で表される化合物：
【００１２】
【化４】
下記の構造式（２０）で表される化合物：
【００１３】
【化５】
下記の構造式（２５）で表される化合物：
【００１４】
【化６】
下記の構造式（２６）で表される化合物：
【００１５】
【化７】
下記の構造式（２９）で表される化合物：
【００１６】
【化８】
下記の構造式（３０）で表される化合物：
【００１７】
【化９】
下記の構造式（３１）で表される化合物：
【００１８】
【化１０】
及び、
下記の構造式（３２）で表される化合物：
【００１９】
【化１１】
からなる群の中から選ばれる１以上の化合物を有効成分として含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤（請求項２）を提供する。
【００２０】
前記の第１の態様及び第２の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤は、ＴＮＦ−αにより惹起される生物学的応答を抑制することから、これを含有させることにより、体内での過剰なＴＮＦ−αの産生により発症及び憎悪が報告されている各種疾病（リウマチ、糖尿病、メタボリックシンドローム等）の、改善又は予防効果を有する医薬や医薬組成物（以後、医薬組成物を含めて医薬と言う。）等を得ることができる。即ち、本発明はその第３の態様として、前記の第１の態様及び第２の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤を含有することを特徴とするヒト又は動物用の医薬（請求項３）を提供する。
【００２１】
前記の抽出液又は抽出エキスからの分離、精製により得られ、かつ抗ＴＮＦ−α作用を示す化合物の中で、構造式（１）で表される化合物は、新規な化合物である。本発明者はさらに、前記の抽出液又は抽出エキスからの分離、精製により得られる化合物の中に、下記の構造式（２）、構造式（３）、構造式（４）及び構造式（５）から選ばれるいずれかの構造式で表わされる新規サポニン化合物、及び下記の構造式（６）、構造式（７）及び構造式（８）から選ばれるいずれかの構造式で表わされる新規ポリフェノール化合物が含まれること、そしてこの構造式（１）〜（８）のいずれかで表わされる新規化合物は、ＴＮＦ−αの作用により、発症及び増悪が明らかになっている疾病、具体的には、糖尿病、クローン病、慢性関節リウマチ、アルコール性肝障害や肝炎などの各種臓器障害に対する予防剤または治療剤として使用できること、さらに、ガラクトサミンにより惹起される肝細胞障害を抑制する作用を有し肝保護作用剤として使用できることを見出した。従って、構造式（１）〜（８）のいずれかで表わされる新規化合物を含有する、人参果、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスも、肝保護作用剤として使用できる。
【００２２】
本発明はその第４の態様として、前記構造式（１）及び下記構造式（２）〜（８）からなる群より選ばれるいずれかの構造式で表わされることを特徴とする新規サポニン化合物又は新規ポリフェノール化合物（請求項４）を提供する。
【００２３】
【化１２】
【００２４】
【化１３】
【００２５】
【化１４】
【００２６】
【化１５】
【００２７】
【化１６】
【００２８】
【化１７】
【００２９】
【化１８】
【００３０】
さらに本発明は、その第５の態様として、人参果、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は前記構造式（１）〜（８）のいずれかで表わされる新規サポニン化合物及び新規ポリフェノール化合物からなる群より選ばれる１以上の化合物を有効成分として含むことを特徴とする肝保護作用剤（請求項５）を提供する。
【００３１】
前記の第５の態様の肝保護作用剤は、ガラクトサミンにより惹起される肝細胞障害を抑制する作用を有するので、これを含有させることにより、肝保護作用を有する医薬等を得ることができる。即ち、本発明は、その第６の態様として、前記の第５の態様の肝保護作用剤を含有することを特徴とするヒト又は動物用の医薬（請求項６）を提供する。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の第１の態様、即ち、人参果、その水、低級脂肪族アルコールもしくはその含水物により抽出して得られる抽出液又は当該抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として含有する抗ＴＮＦ−α作用剤、又は第２の態様、即ち構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）もしくは（３２）のいずれかで表される化合物を有効成分として含有する抗ＴＮＦ−α作用剤は、ＴＮＦ−α感受性細胞として知られているＬ９２９細胞のＴＮＦ−αにより惹起される細胞死に対する抑制作用を示し、抗ＴＮＦ−α作用剤としての優れた活性を有する。
【００３３】
この抗ＴＮＦ−α作用剤を含有させたヒト又は動物用医薬（本発明の第３の態様）は、優れた抗ＴＮＦ−α作用を示すヒト又は動物用医薬である。
【００３４】
本発明の第５の態様の肝保護作用剤は、ガラクトサミンにより惹起される肝細胞障害を抑制する作用を示し、肝保護作用剤としての優れた活性を有する。
【００３５】
この肝保護作用剤を含有させたヒト又は動物用医薬（本発明の第６の態様）は、優れた肝保護作用を示す。
【００３６】
本発明の第４の態様である新規化合物は、前記のように、優れた抗ＴＮＦ−α作用及び／又は肝保護作用を示す化合物であり、ヒト又は動物用医薬の有効成分として利用できるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
次に、本発明を実施するための最良の形態について説明するが、本発明の範囲はこの実施の形態のみに限定されるものではない。
【００３８】
本発明の態様の第１の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤としては、
１）人参果を（抽出等の処理を行わずに）有効成分として用いるもの、
２）人参果を、水、低級脂肪族アルコ−ルもしくは低級脂肪族アルコ−ルの含水物等により抽出して得られる抽出液を有効成分として用いるもの、及び
３）前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として用いるもの、
を例示することができる。人参果を用いる場合は、人参果をそのまま用いることができるし、又は、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの、もしくは、乾燥等の調製を実施したものを用いることもできる。
【００３９】
抽出液は、人参果をそのまま、水、低級脂肪族アルコール及び低級脂肪族アルコールの含水物より選ばれる抽出溶媒により抽出して得ることもできる。しかし、人参果を、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったものを用いて抽出する方法が、抽出効率の面で望ましい。
【００４０】
抽出溶媒として用いられるアルコールとしては、炭素数１〜４の低級アルコール類が挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール又はこれらの混液が挙げられる。抽出溶媒としては、好ましくはこれらのアルコール、又はこれらのアルコールに３０容量％までの水を含有する含水アルコールが用いられる。前記のアルコールの中でもメタノール又はエタノールが好ましい。これらの抽出溶媒は、抽出材料に対して、１〜５０倍（重量）程度、好ましくは１０〜３０倍程度用いられる。
【００４１】
抽出温度は、室温〜溶媒の沸点の間で任意に設定できるが、５０℃〜抽出溶媒の沸点の温度が好ましい。抽出は、振盪下もしくは非振盪下又は還流下に、前記の抽出材料、即ち、人参果そのもの、又は、それを粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの等を、前記の抽出溶媒に浸漬することによって行うのが適当である。
【００４２】
好ましい抽出時間は、抽出温度や抽出の際の振盪の有無等により変動し、特に限定されない。例えば、抽出材料を振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜１０時間程度行うのが適当であり、非振盪下に浸漬する場合には、１時間〜２０日間程度行うのが適当である。又、抽出溶媒の還流下に抽出するときは、３０分間〜数時間加熱還流するのが好ましい。なお、５０℃より低い温度で浸漬して抽出することも可能であるが、その場合には、前記の時間よりも長時間浸漬するのが好ましい。抽出操作は、同一材料について１回だけ行ってもよいが、複数回、例えば２〜５回程度繰り返すのが好ましい。
【００４３】
前記の抽出工程により得られた抽出液には、人参果の含有成分が溶出されている。本発明の抗ＴＮＦ−α作用剤（又は第５の態様の肝保護作用剤）には、このようにして得られた抽出液をそのまま加えてもよいが、前記抽出液を濃縮して抽出エキスにして抗ＴＮＦ−α作用剤（又は第５の態様の肝保護作用剤）としてもよい。濃縮は、低温で減圧下に行うのが好ましい。なお、濃縮する前に濾過して濾液を濃縮してもよい。抽出エキスは、濃縮したままの状態で抗ＴＮＦ−α作用剤（又は第５の態様の肝保護作用剤）として用いてもよい。また、濃縮は乾固するまで行ってもよく、粉末状又は凍結乾燥品等として用いてもよい。濃縮する方法、粉末状及び凍結乾燥品とする方法は当該分野での公知の方法を用いることができる。
【００４４】
このようにして得られる抽出液又は抽出エキスを、精製処理に付し、含有される各成分に分離することができる。前記の、構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）又は（３２）のいずれかで表される化合物は、この分離により得ることができる。そして、この分離により得られた抗ＴＮＦ−α作用を有する化合物も、抗ＴＮＦ−α作用剤として用いることができる（本発明の第２の態様）。前記の構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）又は（８）のいずれかで表される新規化合物も、この分離により得ることができ、肝保護作用剤として用いることができる。
【００４５】
精製処理は、例えば、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法、溶媒による分配抽出等を、単独又は組み合わせて採用することができる。クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのいずれか、又はそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宣選択することができる。
【００４６】
前記のように、人参果そのもの、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、及び、前記構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）もしくは（３２）で表される化合物は、抗ＴＮＦ−α作用剤としての活性評価の指標として実施したＬ９２９細胞を用いたＴＮＦ−α誘発細胞障害抑制活性試験において、活性が見出された。さらに、新規化合物として見出された前記構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）又は（８）で表される化合物は、肝保護作用剤としての活性評価の指標として実施したマウス肝細胞を用いたガラクトサミン誘発肝細胞障害抑制活性試験において、活性が見出された。
【００４７】
本発明の第１の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤及び第２の態様の抗ＴＮＦ−α作用剤は、ヒト又は動物用の医薬に適用することができ、この抗ＴＮＦ−α作用剤を含有させることにより優れた抗ＴＮＦ−α作用を有するヒト又は動物用の医薬を製造することができる。又、本発明の第５の態様の肝保護作用剤は、ヒト又は動物用の医薬に適用することができ、この肝保護作用剤を含有させることにより優れた肝保護作用を有するヒト又は動物用の医薬を製造することができる。
【００４８】
例えば、人参果そのもの、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、もしくは前記構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）もしくは（３２）で表される化合物（抗ＴＮＦ−α作用剤）、又は、人参果そのもの、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、もしくは前記構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）もしくは（８）で表される化合物（肝保護作用剤）を、そのままの状態で又は適当な媒体で希釈して、医薬品等の製造分野における公知の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又は液剤等の種々の形態にして、医薬品として使用することができる。
【００４９】
これらの形態においては、適当な媒体を添加してもよい。適当な媒体としては、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）、錠剤用滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）等が挙げられる。
【００５０】
錠剤とする場合は、通常の製薬における周知の方法でコートしてもよい。液体製剤とする場合は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよい。又、使用前に水や他の適切な賦形剤と混合する乾燥製品として提供してもよい。
【００５１】
こうした液体製剤は、通常の添加剤、例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂等の懸濁化剤、レシチン、ソルビタンモノオレエート、アラビアゴム等の乳化剤（食用脂を含んでもよい）、アーモンド油、分画ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコールやエチレングリコールのような油性エステル等の非水性賦形剤、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル又はソルビン酸等の保存剤を含んでもよく、さらに所望により着色剤又は香料等を含んでもよい。
【００５２】
本発明の医薬における、前記抽出液、抽出エキス、構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）もしくは（３２）で表される化合物（ＴＮＦ−α作用剤）、又は構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）もしくは（８）の使用量は、濃縮、精製の程度、活性の強さ等、使用目的、対象疾患や自覚症状の程度、使用者の体重、年齢等によって適宣調整される。例えば、医薬として成人について使用する場合は、１回の投与毎に、抽出液又は抽出エキスでは、１ｍｇ〜２０ｇ程度の範囲で使用し、この範囲内で精製度や水分含量等に応じて調整することが適当な場合が多い。又、前記化合物を使用する場合は、１ｍｇ〜１ｇ程度が適当な場合が多い。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例では、特に記載がない限り、以下に示す各種溶媒、濾紙、クロマトグラフィー用担体及びＨＰＬＣカラムを用いた。また、特に明記しない試薬については、和光純薬工業社製試薬（特級）を用いた。
【００５４】
［溶媒］
メタノール：ナカライテスク社製、一級
ＨＰＬＣ用メタノール：関東化学社製、特級
【００５５】
［濾紙］ アドバンテック社製：Ｎｏ．２
【００５６】
［クロマトグラフィー用担体］
順相シリカゲルカラムクロマトグラフ用担体：富士シリシア社製、ＢＷ−２００、１５０〜３００メッシュ
逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフ用担体：富士シリシア社製、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳ１０２０Ｔ、１００〜２００メッシュ
多孔質ポリマーカラムクロマトグラフ用担体：日本練水社製、ダイアイオンＨＰ−２０
【００５７】
［ＨＰＬＣカラム］
ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、２０ｍｍ（ｉ．ｄ．）×２５０ｍｍ（実施例中カラムＡと略記）
又は、ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＰＡＱ、２０ｍｍ（ｉ．ｄ．）×２５０ｍｍ（実施例中カラムＢと略記）
【００５８】
実施例１ 人参果抽出エキスの調製及び含有成分の単離
中国産人参果（Ｐｏｔｅｎｔｉｌｌａ ａｎｓｅｒｉｎａ、塊根）９.７ｋｇを粉砕後、５０Ｌ（５倍量）のメタノールで３時間還流下抽出し、その後抽出液を濾取し、メタノール抽出液を得た。濾過残渣にメタノールを加え、同様の抽出操作を計３回行い、それぞれメタノール抽出液を得た。得られたメタノール抽出液を合わせた後、減圧下溶媒留去しメタノール抽出エキス（２.２３ｋｇ、植物からの収率２３．０％）を得た。
【００５９】
実施例２ 人参果抽出液の分離及び精製
実施例１で得られたメタノール抽出エキス（２１３０ｇ）を、酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）と水で分配抽出した。得られたＡｃＯＥｔ移行部を減圧下溶媒留去し、ＡｃＯＥｔ可溶部（５３．３ｇ、植物からの収率０．５８％）を得た。さらに、水可溶部をＤｉａｉｏｎ ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィーに付し、水及びメタノールで順次、成分を溶出させて水溶出部（１．９９ｋｇ、植物からの収率２１．４％）及びメタノール溶出部（６７．３ｇ、植物からの収率０．７３％）を得た。
【００６０】
実施例３ ＡｃＯＥｔ可溶部の精製
ＡｃＯＥｔ可溶部（４３．３ｇ）を、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［１．３ｋｇ、ｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝（１０：１→２：１→２：５）→メタノール］で順次溶出し、溶出画分Ｅ１（１．１１ｇ）、Ｅ２（５．０８ｇ）、Ｅ３（７．１２ｇ）、Ｅ４（８７１．１ｍｇ）、Ｅ５（７０２．２ｍｇ）、Ｅ６（９４３．２ｍｇ）、Ｅ７（４６５．５ｍｇ）、Ｅ８（２．７４ｇ）、Ｅ９（３．５８ｇ）、Ｅ１０（８．００ｇ）及びＥ１１（８．７９ｇ）を得た。
【００６１】
実施例４
溶出画分Ｅ４（８７１．１ｍｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［２．６ｇ、メタノール：水＝（７０：３０→８０：２０→９０：１０）→メタノール→ａｃｅｔｏｎｅ］にて画分し、溶出画分Ｅ４−１（１４２．９ｍｇ）、Ｅ４−２（１１３．１ｍｇ）、Ｅ４−３（３４５．２ｍｇ）、Ｅ４−４（１４２．６ｍｇ）及びＥ４−５（１４２．９ｍｇ）を得た。
【００６２】
画分Ｅ４−２（１１３．１ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝８０：２０］を用いて分離精製し、化合物ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（９）（９．５ｍｇ，０．０００１％（植物からの化合物の単離収率。以下同様））、ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ ａｃｉｄ（１１）（５．１ｍｇ、０．０００１％）及び２−ｏｘｏ−ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（１６）（４．６ｍｇ，０．０００１％）を単離した。なお、「化合物」との用語の後又は化合物名の後の括弧内の数字は、当該化合物を表す構造式の番号を示し、又「化合物」との用語とその後に記載の括弧内の数字との組合せで、当該数字の番号の構造式で表わされる化合物を示す。以下の実施例においても同様である。
【００６３】
実施例５
溶出画分Ｅ５（７０２．２ｍｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［２３ｇ、メタノール：水＝（６０：４０→７０：３０→８０：２０→９０：１０）→メタノール→ａｃｅｔｏｎｅ］にて画分し、溶出画分Ｅ５−１（１０１．５ｍｇ）、Ｅ５−２（１０４．５ｍｇ）、Ｅ５−３（２１７．８ｍｇ）、Ｅ５−４（６７．５ｍｇ）、Ｅ５−５（５３９．１ｍｇ）Ｅ５−６（１１４．４ｍｇ）、Ｅ５−７（７８．８ｍｇ）、Ｅ５−８（３０９．９ｍｇ）、及びＥ５−９（２５．２ｍｇ）を得た。
【００６４】
画分Ｅ５−２（１０４．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝７０：３０］を用いて分離精製し、化合物ｃｅｃｒｏｐｉａｃｉｃ ａｃｉｄ（１９）（７．２ｍｇ、０．０００１％）を単離した。
【００６５】
画分Ｅ５−３（２１７．８ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝７０：３０］を用いて分離精製し、化合物ｅｕｓｃａｐｈｉｃ ａｃｉｄ（１３）（１７．８ｍｇ、０．０００２％），２α，１１α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−ｕｒｓ−１２−ｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ（１５）（５７．２ｍｇ，０．０００８％）及びｃｅｃｒｏｐｉａｃｉｃ ａｃｉｄ（１９）（５．３ｍｇ、０．０００１％）を単離した。
【００６６】
画分Ｅ５−４（６７．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝８０：２０］を用いて分離精製し、化合物ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（９）（５０．８ｍｇ、０．０００９％），ｅｕｓｃａｐｈｉｃ ａｃｉｄ（１３）（１０．０ｍｇ，０．０００１％）、２α，１１α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−ｕｒｓ−１２−ｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ（１５）（８．３ｍｇ，０．０００２％）、２α−ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ（１８）（１５．０ｍｇ，０．０００２８％）、ｍａｓｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ（２０）（２１．６ｍｇ，０．０００４％）及びａｌｐｈｉｔｏｌｉｃ ａｃｉｄ（２３）（３．２ｍｇ，０．０００１％）を得た。
【００６７】
実施例６
溶出画分Ｅ８（２．７４ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［２４０ｇ、メタノール：水＝（１０：９０→３０：７０→７０：３０）→メタノール→ａｃｅｔｏｎｅ］にて画分し、溶出画分Ｅ８−１（３６８．０ｍｇ）、Ｅ８−２（３３１．２ｍｇ）、Ｅ８−３（２４０．０ｍｇ）、Ｅ８−４（６０．３ｍｇ）、Ｅ８−５（５１．６ｍｇ）Ｅ８−６（５５０．１ｍｇ）、Ｅ８−７（６３６．０ｍｇ）、Ｅ８−８（２９７．２ｍｇ）、及びＥ８−９（１６８．７ｍｇ）を得た。
【００６８】
画分Ｅ８−１（３６８．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝１０：９０］を用いて分離精製し、化合物ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（２５）（７．８ｍｇ、０．０００１％）及び（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（３０）（８６．９ｍｇ、０．０００３％）を単離した。
【００６９】
画分Ｅ８−３（２４０．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝１０：９０］を用いて分離精製し、化合物（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ（２９）（３７．２ｍｇ、０．０００５％）及び（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（３０）（２０．０ｍｇ、０．０００３％）を単離した。
【００７０】
画分Ｅ８−６（５５０．１ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５０：５０、１％酢酸］を用いて分離精製し、化合物ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（１１２．３ｍｇ、０．００１５％）及び２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２１）（３７．１ｍｇ、０．０００５％）を単離した。
【００７１】
画分Ｅ８−７（６３６．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝７０：３０］を用いて分離精製し、化合物ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（２０３．３ｍｇ、０．００２７％）、ｋａｊｉ−ｉｃｈｉｇｏｓｉｄｅ Ｆ１（１４）（１４３．９ｍｇ、０．００１９％）及び２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２１）（１１．６ｍｇ、０．０００２％）を単離した。
【００７２】
実施例７
溶出画分Ｅ９（３．５８ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［１３０ｇ、メタノール：水＝（５０：５０→７０：３０→８０：２０）→メタノール］にて画分し、溶出画分Ｅ９−１（３４４．４ｍｇ）、Ｅ９−２（１１１．１ｍｇ）、Ｅ９−３（１．８５ｇ）、Ｅ９−４（２４６．３ｍｇ）、Ｅ９−５（６１．６ｍｇ）及びＥ９−６（３６０．２ｍｇ）を得た。
【００７３】
画分Ｅ９−１（３４４．４ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝１５：８５］を用いて分離精製し、化合物ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ（２４）（２３．９ｍｇ，０．０００３％）、ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（２５）（５．５ｍｇ，０．０００１％）、（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ（２９）（６．３ｍｇ，０．０００１％）、及び（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（３０）（８１．７ｍｇ，０．００１１％）を単離した。
【００７４】
画分Ｅ９−３（５３０．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５５：４５］を用いて分離精製し、化合物（１）（２７３．９ｍｇ，０．０１３％）、（２）（１４．３ｍｇ，０．０００７％）、ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（４６．１ｍｇ，０．００２２％）、及びｋａｊｉ−ｉｃｈｉｇｏｓｉｄｅ Ｆ１（１４）（５７．０ｍｇ，０．００２７％）を単離した。
【００７５】
画分Ｅ９−４（２４６．３ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝６０：４０］を用いて分離精製し、化合物（３）（３．８ｍｇ，０．０００１％）、２８−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（１０）（２４．６ｍｇ，０．０００３％），ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（１１５．８ｍｇ，０．００１６％）及び２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２１）（１４．６ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【００７６】
画分Ｅ９−５（６１．６ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝７０：３０］を用いて分離精製し、化合物ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（９．２ｍｇ，０．０００１％）及びｋａｊｉ−ｉｃｈｉｇｏｓｉｄｅ Ｆ１（１４）（１０．８ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【００７７】
実施例８
溶出画分Ｅ１０（８．００ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［２４０ｇ、メタノール：水＝（５０：５０→６０：４０→８０：２０）→メタノール］にて画分し、溶出画分Ｅ１０−１（９６７．４ｍｇ）、Ｅ１０−２（２３３．０ｍｇ）、Ｅ１０−３（１９５．８ｍｇ）、Ｅ１０−４（２２．７ｍｇ）、Ｅ１０−５（５．９７ｇ）、Ｅ１０−６（３０８．１ｍｇ）及びＥ１０−７（１９１．１ｍｇ）を得た。
【００７８】
画分Ｅ１０−３（１９５．８ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３５：６５］を用いて分離精製し、化合物（８）（７３．４ｍｇ，０．００１０％）及びｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ（２６）（２１．３ｍｇ，０．０００３）％）を単離した。
【００７９】
画分Ｅ１０−５（１２５．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５５：４５、１％酢酸］を用いて分離精製し、ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（７９．８ｍｇ，０．０５１％）、ｋａｊｉ−ｉｃｈｉｇｏｓｉｄｅ Ｆ１（１４）（５．９ｍｇ，０．００３８％）及び２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２１）（１５．４ｍｇ，０．００９９％）を単離した。
【００８０】
実施例９ メタノール溶出部の精製
メタノール溶出部（５５．０ｇ）を、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー［２．０ｋｇ、クロロホルム：メタノール：水＝（１５：３：０．３→１０：３：０．４→７：３：０．５→６：４：１→５：５：１）→メタノール］で順次溶出し、溶出画分Ｍ１（２０．４４ｇ）、Ｍ２（８．４７ｇ）、Ｍ３（２．２１ｇ）、Ｍ４（４．０５ｇ）、Ｍ５（３．４９ｇ）、Ｍ６（５．４９ｇ）、Ｍ７（３．１１ｇ）、及びＭ８（２．５３ｇ）を得た。
【００８１】
実施例１０
溶出画分Ｍ１（２０．４４ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［６２０ｇ、メタノール：水＝（６０：４０→７０：３０→７５：２５→９０：１０→メタノール）→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ１−１（３００．２ｍｇ）、Ｍ１−２（１０４．９ｍｇ）、Ｍ１−３（５５２．２ｍｇ）、Ｍ１−４（１１８．８ｍｇ）、Ｍ１−５（７３７．４ｍｇ）、Ｍ１−６（４９２．１ｍｇ）、Ｍ１−７（３．０３ｇ）、Ｍ１−８（６．３１ｇ）、Ｍ１−９（３．８４ｇ）及びＭ１−１０（２．１４ｇ）を得た。
【００８２】
画分Ｍ１−２（１０４．９ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５５：４５］を用いて分離精製し、化合物（４）（２８．８ｍｇ，０．０００４％）を単離した。
【００８３】
画分Ｍ１−３（５５２．２ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝６０：４０］を用いて分離精製し、化合物（５）（４４．６ｍｇ，０．０００６％）、ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（２１６．５ｍｇ，０．００２９％）、２−ｏｘｏ−ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ ２８−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｅｓｔｅｒ（１７）（３６．８ｍｇ，０．０００５％）及びｃｅｃｒｏｐｉａｃｉｃ ａｃｉｄ（１９）（２２．３ｍｇ，０．０００３％）を単離した。
【００８４】
画分Ｍ１−４（１１８．８ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝６０：４０］を用いて分離精製し、化合物（４）（５．９ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【００８５】
画分Ｍ１−５をメタノールにて再結晶して、析出した結晶を濾取して化合物ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ ａｃｉｄ（１１）（５５３．２ｍｇ，０．００７３％）を単離した。
【００８６】
画分Ｍ１−６（４９２．１ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝８０：２０］を用いて分離精製し、化合物ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（９）（１４１．３ｍｇ，０．００１９％）を単離した。
【００８７】
実施例１１
溶出画分Ｍ２（８．４７ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［２５５ｇ、メタノール：水＝（１０：９０→３０：７０→４０：６０→５０：５０→６０：４０）→メタノール→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ２−１（３７９．５ｍｇ）、Ｍ２−２（５８１．０ｍｇ）、Ｍ２−３（３７６．５ｍｇ）、Ｍ２−４（１２３．６ｍｇ）、Ｍ２−５（３３１．３ｍｇ）、Ｍ２−６（２０４．５ｍｇ）、Ｍ２−７（３．３７ｇ）及びＭ２−８（２．２１ｇ）を得た。
【００８８】
画分Ｍ２−３（３７６．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝２０：８０］を用いて分離精製し、化合物ｄｕｃｈｅｓｉｄｅ Ｂ（２８）（７５．０ｍｇ，０．００１０％）を単離した。
【００８９】
画分Ｍ２−５（３３１．３ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５０：５０］を用いて分離精製し、化合物（５）（５８．４ｍｇ，０．０００８％）及びａｒｊｕｎｇｌｕｃｏｓｉｄｅ Ｉ（２２）（７．６ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【００９０】
画分Ｍ２−６（２０４．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５５：４５］を用いて分離精製し、化合物（５）（９．４ｍｇ，０．０００１％）、ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（１２）（５７．０ｍｇ，０．０００８％）及び２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２１）（１１．４ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【００９１】
実施例１２
溶出画分Ｍ３（２．２１ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［７０ｇ、メタノール：水＝（１０：９０→３０：７０→４０：６０→６０：４０→９０：１０）→メタノール→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ３−１（２３０．４ｍｇ）、Ｍ３−２（２５２．７ｍｇ）、Ｍ３−３（４２．４ｍｇ）、Ｍ３−４（８２．１ｍｇ）、Ｍ３−５（１１４．０ｍｇ）、Ｍ３−６（１５９．３ｍｇ）、Ｍ３−７（３８１．１ｍｇ）及びＭ３−８（２６８．７ｍｇ）を得た。
【００９２】
画分Ｍ３−１（２３０．４ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＢ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５：９５］を用いて分離精製し、化合物（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（３０）（２４．０ｍｇ，０．０００３％）及びＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（３７）（６．２ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【００９３】
実施例１３
溶出画分Ｍ４（４．０５ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［１２５ｇ、メタノール：水＝（２０：８０→３０：７０→４０：６０→６０：４０→９５：５）→メタノール→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ４−１（２３８．５ｍｇ）、Ｍ４−２（３３４．３ｍｇ）、Ｍ４−３（１．１７ｇ）、Ｍ４−４（２９５．６ｍｇ）、Ｍ４−５（３３４．９ｍｇ）、Ｍ４−６（１２８．６ｍｇ）、Ｍ４−７（７８．５ｍｇ）、Ｍ４−８（６３２．８ｍｇ）、Ｍ４−９（３２１．２ｍｇ）、Ｍ４−１０（１３４．４ｍｇ）及びＭ４−１１（１３７．５ｍｇ）を得た。また、ここで得られた画分Ｍ４−３は、Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（３７）（１．１７ｇ，０．０１６％）であった。
【００９４】
画分Ｍ４−４（２９５．６ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝２０：８０］を用いて分離精製し、化合物６−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌｓｕｃｒｏｓｅ（３５）（５０．６ｍｇ，０．０００７％）、６−ｆｅｒｕｌｏｙｌｓｕｃｒｏｓｅ（３６）（８．２ｍｇ，０．０００１％）及びＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（３７）（５．７ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【００９５】
画分Ｍ４−５（３３４．９ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物（７）（２０．６ｍｇ，０．０００３％）及びｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−ｓａｍｂｕｂｉｏｓｉｄｅ（３４）（１１．０ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【００９６】
画分Ｍ４−６（１２８．６ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物（６）（１８．３ｍｇ，０．０００２％）及びｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（２２．６ｍｇ，０．０００３％）を単離した。
【００９７】
実施例１４
溶出画分Ｍ５（３．４９ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［１１０ｇ、メタノール：水＝（５：９５→２０：８０→５０：５０→８０：２０）→メタノール→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ５−１（２１０．８ｍｇ）、Ｍ５−２（２２３．７ｍｇ）、Ｍ５−３（５２３．８ｍｇ）、Ｍ５−４（３５８．５ｍｇ）、Ｍ５−５（２７５．２ｍｇ）、Ｍ５−６（３４５．４ｍｇ）、Ｍ５−７（４０２．２ｍｇ）及びＭ５−８（４４８．５ｍｇ）を得た。
【００９８】
画分Ｍ５−３（５２３．８ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＢ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝５：９５］を用いて分離精製し、化合物（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ ７−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３１）（１１４．３ｍｇ，０．００１５％）を単離した。
【００９９】
画分Ｍ５−４（３５８．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（１０．４ｍｇ，０．０００１％）及びｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３２）（１３．７ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【０１００】
画分Ｍ５−５（２７５．２ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物（６）（１０．４ｍｇ，０．０００１％）、化合物（７）（４．３ｍｇ，０．０００１％）、ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ（２６）（２４．３ｍｇ，０．０００３％）、ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（１４．５ｍｇ，０．０００２％）及びｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−ｓａｍｂｉｏｓｉｄｅ−３’−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（３４）（１０．５ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【０１０１】
実施例１５
溶出画分Ｍ６（５．４９ｇ）を、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィー［１８０ｇ、メタノール：水＝（１０：９０→３０：７０→５０：５０）→メタノール→アセトン］にて画分し、溶出画分Ｍ６−１（２．３６ｇ）、Ｍ６−２（４９０．０ｍｇ）、Ｍ６−３（７５７．１ｍｇ）、Ｍ６−４（４０９．５ｍｇ）、Ｍ６−５（１５５．０ｍｇ）、Ｍ６−６（１．０３ｇ）及びＭ６−７（４２３．０ｍｇ）を得た。
【０１０２】
画分Ｍ６−３（５００．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（９．４ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【０１０３】
画分Ｍ６−４（４０９．５ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３０：７０］を用いて分離精製し、化合物ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ（２６）（１０．０ｍｇ，０．０００１％）及びｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（１４．０ｍｇ，０．０００２％）を単離した。
【０１０４】
画分Ｍ６−５（１５５．０ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［カラムＡ、移動相 ＭｅＯＨ：１％酢酸＝３５：６５］を用いて分離精製し、化合物（６）（６．８ｍｇ，０．０００１％）及びｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ（２６）（５．０ｍｇ，０．０００１％）及びｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（２７）（４．７ｍｇ，０．０００１％）を単離した。
【０１０５】
実施例１６
実施例４〜１５で得られた化合物（９）〜（３７）について［α］Ｄ、ＭＳ、ＲＩ、ＵＶ、ＩＲ及び１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ等の測定を、下記実施例１７における測定と同様にして行った。それらの測定値と、公知文献記載の物理化学的データの数値との比較から、化合物（９）〜（３７）は、それぞれ、以下に示す公知の化合物であることが確認された。それぞれを表す化学構造式及び化合物名（［ ］内）を示す（構造式の後の（ ）内は構造式の番号を示す）。
化合物（９） ［ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ポモリクアシッド）］
【０１０６】
【化１９】
【０１０７】
化合物（１０） ［２８−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（２８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシルポモリクアシッド）］
前記の構造式（１０）で表わされる化合物である。
化合物（１１） ［ｔｏｒｍｅｎｔｉｃ ａｃｉｄ（トルメンティックアシッド）］
【０１０８】
【化２０】
化合物（１２） ［ｒｏｓａｍｕｔｉｎ（ロサムチン）］
【０１０９】
【化２１】
【０１１０】
化合物（１３） ［ｅｕｓｃａｐｈｉｃ ａｃｉｄ（ユースカフィクアシッド）］
前記の構造式（１３）で表わされる化合物である。
化合物（１４） ［ｋａｊｉ−ｉｃｈｉｇｏｓｉｄｅ Ｆ１（カジ−イチゴシド Ｆ１）］
【０１１１】
【化２２】
【０１１２】
化合物（１５） ［２α，１９α−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−ｕｒｓ−１２−ｅｎ−２８−ｏｉｃ ａｃｉｄ（２α，１９α−ジヒドロキシ−３−オキソ−ウルス−１２−エン−２８−オイク アシッド）］
前記の構造式（１５）で表わされる化合物である。
化合物（１６） ［２−ｏｘｏ−ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ（２−オキソ−ポモリクアシッド）］
【０１１３】
【化２３】
化合物（１７） ［２−ｏｘｏ−ｐｏｍｏｌｉｃ ａｃｉｄ β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ ｅｓｔｅｒ（２−オキソ−ポモリクアシッド β−Ｄ−グルコピラノシド）］
【０１１４】
【化２４】
化合物（１８） ［２−α−ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ（２−α−ヒドロキシウルソリックアシッド）］
【０１１５】
【化２５】
化合物（１９） ［ｃｅｃｒｏｐｉａｃｉｃ ａｃｉｄ（セクロピアシクアシッド）］
【０１１６】
【化２６】
【０１１７】
化合物（２０） ［ｍａｓｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ（マスリニクアシッド）］
前記の構造式（２０）で表わされる化合物である。
化合物（２１） ［２４−ｄｅｏｘｙ−ｓｅｒｉｃｏｓｉｄｅ（２４−デオキシ−セリコシド）］
【０１１８】
【化２７】
化合物（２２） ［ａｒｊｕｎｇｌｕｃｏｓｉｄｅ（アルジュングルコシド）］
【０１１９】
【化２８】
化合物（２３） ［ａｌｐｈｉｔｏｌｉｃ ａｃｉｄ（アルフィトリクアシッド）］
【０１２０】
【化２９】
化合物（２４） ［ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ（没食子酸）］
【０１２１】
【化３０】
【０１２２】
化合物（２５） ［ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ（没食子酸メチルエステル）］
前記の構造式（２５）で表わされる化合物である。
【０１２３】
化合物（２６） ［ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ（エラグ酸）］
前記の構造式（２６）で表わされる化合物である。
化合物（２７） ［ｅｌｌａｇｉｃ ａｃｉｄ ４−Ｏ−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｉｄｅ（エラグ酸 ４−Ｏ−α−Ｌ−アラビノフラノシド）］
【０１２４】
【化３１】
化合物（２８） ［ｄｕｃｈｅｓｉｄｅ Ｂ（ヅチェシド B）］
【０１２５】
【化３２】
【０１２６】
化合物（２９） ［（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ（（＋）−カテキン）］
前記の構造式（２９）で表わされる化合物である。
【０１２７】
化合物（３０） ［（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（（＋）−ガロカテキン）］
前記の構造式（３０）で表わされる化合物である。
【０１２８】
化合物（３１） ［（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ ７−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（（＋）−カテキン ７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）］
前記の構造式（３１）で表わされる化合物である。
【０１２９】
化合物（３２） ［ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ケルセチン ３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）］
前記の構造式（３２）で表わされる化合物である。
化合物（３３） ［ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−ｓａｍｂｕｂｉｏｓｉｄｅ（ケルセチン ３−Ｏ−サンブビオシド）］
【０１３０】
【化３３】
化合物（３４） ［ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ３−Ｏ−ｓａｍｂｕｂｉｏｓｉｄｅ−３’−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ケルセチン ３−Ｏ−サンブビオシド−３’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド）］
【０１３１】
【化３４】
化合物（３５） ［６−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌｓｕｃｒｏｓｅ（６−ｐ−クマロイルスクロース）］
【０１３２】
【化３５】
化合物（３６） ［６−ｆｅｒｕｌｏｙｌｓｕｃｒｏｓｅ（６−フェルロイルスクロース）］
【０１３３】
【化３６】
化合物（３７） ［Ｌ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（Ｌ−トリプトファン）］
【０１３４】
【化３７】
【０１３５】
実施例１７
さらに実施例４〜１５で得られた化合物（１）〜（８）については、化合物の諸物性を測定して、化学構造の解析を行った結果、それぞれ、前記の構造式（１）〜（８）のいずれかで表される新規な化合物であることが明らかになった。従って、人参果抽出液中には、化合物（１）〜（８）で表わされる新規な化合物と（９）〜（３７）で表わされる公知の化合物が存在していることが明らかになった。
【０１３６】
実施例で得られた化合物（１）〜（８）の諸物性の測定結果を以下に示す。なお、実施例で得られた化合物（１）〜（８）は、いずれも不定形粉末であった。
【０１３７】
化合物（１）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：＋２０．４ （ｃ＝０．１１，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析（Ｈｉｇｈ-ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ：以下の化合物（２）〜（８）についても同様）
理論値 Ｃ３６Ｈ５６Ｏ１０（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：６７１．３７７１
実測値 ：６７１．３７６７
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４７０，１７２５，１６８６，１６５５，１４０１，１０７３
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ６７１ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδを表１に、１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδｃを表２に記載する。
以上の結果より、前記構造式（１）で表される化合物であることが判った。
【０１３８】
化合物（２）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：＋２９．８ （ｃ＝０．６２，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ３６Ｈ５６Ｏ１０（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：６７１．３７７１
実測値 ：６７１．３７６４
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４７０，１７１９，１６８６，１６５５，１３９７，１０７５
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ６７１ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδを表１に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδｃを表２に記載する。
以上の結果より、前記構造式（２）で表される化合物であることが判った。
【０１３９】
化合物（３）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：＋１２．８ （ｃ＝０．１３，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ３８Ｈ６０Ｏ１１（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：７１５．４０３３
実測値 ：７１５．４０４２
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４７０，１７２１，１６８６，１６５５，１３９７，１０７６
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ７１５ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδを表１に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδｃを表２に記載する。
以上の結果より、前記構造式（３）で表される化合物であることが判った。
【０１４０】
化合物（４）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：＋２２．６ （ｃ＝０．１５，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ３６Ｈ５６Ｏ１２（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：７０３．３６６９
実測値 ：７０３．３６７６
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４７０，１７２５，１３９０，１０７５
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ７０３ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδを表３に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδｃを表４に記載する。
以上の結果より、前記構造式（４）で表される化合物であることが判った。
【０１４１】
化合物（５）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：＋２２．２ （ｃ＝０．１３，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ３７Ｈ５８Ｏ１２（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：７１７．３８２６
実測値 ：７１７．３８２２
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３４７０，１７２０，１０７５，９３４
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ７１７ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδを表３に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ピリジン-ｄ５）のδｃを表４に記載する。
以上の結果より、前記構造式（５）で表される化合物であることが判った。
【０１４２】
化合物（６）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２６：−２．２ （ｃ＝０．１１，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ２０Ｈ１６Ｏ１２（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：４７１．０５３９
実測値 ：４７１．０５４４
・紫外吸収スペクトル（ＭｅＯＨ，ｎｍ，（ｌｏｇε））：３６８（４．０９），２５１（４．８１）
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３３４０，１７２５，１６１０，１０６３
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ４７１ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδを、表５に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδｃを表６に記載する。
以上の結果より、前記構造式（６）で表される化合物であることが判った。
【０１４３】
化合物（７）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２８：−５２．９ （ｃ＝０．０５，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ２５Ｈ２４Ｏ１６（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：６０３．０５３９
実測値 ：６０３．０５４４
・紫外吸収スペクトル（ＭｅＯＨ，ｎｍ，（ｌｏｇε））：３５２（４．１７，ｓｈ），２３７（４．９８）
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３３４０，１７２５，１６１０，１０６３
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ６０３ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδを表５に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδｃを表６に記載する。
以上の結果より、前記構造式（７）で表される化合物であることが判った。
【０１４４】
化合物（８）の物性測定値
・旋光度： ［α］Ｄ２８：＋２７．０ （ｃ＝０．１０，ＭｅＯＨ）
・高分解能質量分析
理論値 Ｃ２５Ｈ２４Ｏ１６（Ｍ＋Ｎａ）＋ ：４７１．０５３９
実測値 ：４７１．０５４７
・紫外吸収スペクトル（ＭｅＯＨ，ｎｍ，（ｌｏｇε））：３５４（４．０３），３１５（３．９７，ｓｈ），２５４（４．５３）
・赤外吸収スペクトル（ＫＢｒ，ｃｍ−１）：３３８５，１７１０，１６１１，１０７８
・質量分析 ｐｏｓｉｔｉｖｅ-ｉｏｎ ＦＡＢ-ＭＳ ：ｍ／ｚ ４７１ ［Ｍ＋Ｎａ］
・磁気共鳴スペクトル：１Ｈ-ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδを表５に１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-ｄ６）のδｃを表６に記載する。
以上の結果より、前記構造式（８）で表される化合物であることが判った。
【０１４５】
なお表１〜６中の「位置」の欄に記載された数字は、各Ｈ及びＣの位置を示す数字であり、その対応関係は、化合物（１）及び化合物（６）ついては以下に示すとおりである。又、化合物（２）〜（５）における位置と数字の対応関係は化合物（１）と、化合物（７）、（８）における対応関係は化合物（６）と同様である。また、表中の略記Ｇｌｃ，Ｒｈａ及びＡｒａ（ｆ）は、それぞれβ−Ｄ−グルコピラノシル基、α−Ｌ−ラムノピラノシル基及びα−Ｌ−アラビノフラノシル基を意味する。
【０１４６】
【化３８】
化合物（１）
【０１４７】
【化３９】
化合物（６）
【０１４８】
【表１】
【０１４９】
【表２】
【０１５０】
【表３】
【０１５１】
【表４】
【０１５２】
【表５】
【０１５３】
【表６】
【０１５４】
実施例１８ Ｌ９２９細胞を用いたＴＮＦ−α誘発細胞傷害抑制作用試験
実施例１〜２で得られたメタノール抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、メタノール溶出部及び水溶出部、並びに化合物（１）、（４）〜（１５）、（１７）〜（２１）、（２４）〜（３３）及び（３５）〜（３７）について、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験における抗ＴＮＦ−α作用の指標として、Ｌ９２９細胞を用いたＴＮＦ−α誘発細胞障害に対する保護作用試験を実施した。試験方法を以下に示す。
【０１５５】
大日本住友製薬社より購入したＬ９２９細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１００ ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリンＧ、１００ μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び０．１ｍＭ非必須アミノ酸（インビトロジェン社製）を含むｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、シグマ−アルドリッチ社製）培地を用いて培養して、本実験に使用した。９６穴平底マイクロプレートに１×１０４細胞／１００μＬ／穴の割合で細胞を播種した後、５％の二酸化炭素雰囲気下、３７℃において２０時間培養した。その後、前記培地に１ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−α（シグマ−アルドリッチ社製）及び被験物質のＤＭＳＯ溶液をそれぞれ含有する培地を加えた。ここで、被験物質のＤＭＳＯ溶液は、培地中のＤＭＳＯ濃度が０．５％になるように添加した。４４時間培養した後、０．５ｍｇ／ｍＬの３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）を含有する培地と交換し、さらに４時間培養した。培地を除去後、生成したホルマザンを０．０４Ｎ塩酸含有イソプロピルアルコール１００μＬ／穴で溶解した後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（測定波長５７０ｎｍ、参照波長６６０ｎｍ、Ｏ．Ｄ．）を測定した。測定された吸光度を用い、以下の式に従って、ＴＮＦ−αによる細胞の障害抑制率を算出した。
【０１５６】
【数１】
【０１５７】
式中、Ｏ．Ｄ．Ｎｏｒｍａｌは、被験物質を含まない培地（即ち、培地中に０．５％ＤＭＳＯのみを含むもの）で測定される吸光度を示し、Ｏ．Ｄ．Ｃｏｎｔｒｏｌは、培地中に０．５％ＤＭＳＯ及び１ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αを含有する場合に測定される吸光度を、Ｏ．Ｄ．Ｓａｍｐｌｅは、培地中に被験物質及び１ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αを含有する場合に測定される吸光度を意味する。結果を以下の表７及び８に示す。結果はいずれも平均値と標準誤差で表し、対照群との有意差検定には、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。
【０１５８】
【表７】
【０１５９】
【表８】
【０１６０】
前記表７及び８中、障害抑制率の結果の末尾の符号「＊」及び「＊＊」は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で検定した対照との有意差：ｐが０．０５及び０．０１未満であったことを表す。
【０１６１】
前記表７及び８の結果より、人参果から調製されるメタノール抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部及びＭｅＯＨ溶出部は、Ｌ９２９細胞を用いたＴＮＦ−α誘発細胞傷害抑制作用試験において有意な抗ＴＮＦ−α作用を有することが示されている。また、化合物（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）及び（３２）は有意な抗ＴＮＦ−α作用を有することが示されている。
【０１６２】
実施例１８は、抗ＴＮＦ−α作用剤について、ＴＮＦ−α感受性でマウス由来細胞であるＬ９２９細胞を用い、被験物質共存下、培養液中にＴＮＦ−αを添加した場合に観察される細胞死又は細胞増殖（細胞障害）を抑制する活性について、ＭＴＴアッセイ法を利用して判定したものである。この方法により、培養液中のＴＮＦ−αにより惹起される細胞障害を抑制すると判定された物質は、ＴＮＦ−αによる生物学的な応答を抑制している。即ち、ＴＮＦ−αによる発症及び増悪が考えられる疾病群の治療剤又は予防剤として利用できる。従って、人参果そのもの、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、及び、前記構造式（１）、（１０）、（１３）、（１５）、（２０）、（２５）、（２６）、（２９）、（３０）、（３１）又は（３２）で表される化合物は、抗ＴＮＦ−α作用剤として用いることができる。
【０１６３】
実施例１９ マウス肝細胞を用いたガラクトサミン誘発肝細胞傷害抑制作用試験
実施例１〜２で得られたメタノール抽出エキス、ＡｃＯＥｔ移行部、メタノール溶出部及び水溶出部、並びに化合物（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）及び（８）について、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験における肝保護作用の指標として、マウス肝細胞を用いたガラクトサミン誘発肝細胞障害に対する保護作用試験を実施した。試験方法を以下に示す。
【０１６４】
ｄｄＹ系雄性マウスを、ペントバルビタール麻酔下で開腹し、４０℃に保温したＬｉｖｅｒ Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を門脈より灌流して肝臓を脱血した。前記灌流液を、Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−Ｔｙｐｅ Ｉ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有するｐＨ７．５の灌流液（塩化ナトリウム：８ｇ／Ｌ、塩化カリウム：０．４ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物：０．７４ｇ／Ｌ、リン酸二水素ナトリウム・一水和物：７８ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム・十二水和物：１５１ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ：２．３８ｇ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム：３５０ｍｇ／Ｌ、フェノールレッド：６ｇ／Ｌ）と交換した後、さらに１０分間灌流した。この肝臓をろ過して得られた肝実質細胞を実験に供した。
【０１６５】
前記肝実質細胞を、１０％牛胎児血清を含むウイリアムズ培地Ｅ（シグマーアルドリッチ社製）に懸濁し、９６穴平底マイクロプレートに４×１０４細胞／１００μＬ／穴の割合で細胞を播種した後、５％の二酸化炭素雰囲気下、３７℃において４時間培養した。その後、前記培地を１ｍＭ Ｄ−ＧａｌＮ及び被験物質のＤＭＳＯ溶液をそれぞれ含有する培地に変えた。ここで、被験物質のＤＭＳＯ溶液は、培地中のＤＭＳＯ濃度が０．５％になるように添加した。４４時間培養した後、０．５ｍｇ／ｍＬの３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−２−ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）を含有する培地と交換し、さらに４時間培養した。培地を除去後、生成したホルマザンを０．０４Ｎ塩酸含有イソプロピルアルコール１００μＬ／穴で溶解した後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（測定波長５７０ｎｍ、参照波長６６０ｎｍ）を測定した。測定された吸光度を用い、以下の式に従って、肝細胞の障害抑制率を算出した。
【０１６６】
【数２】
【０１６７】
式中、Ｏ．Ｄ．Ｎｏｒｍａｌは、被験物質を含まない培地（即ち、培地中に０．５％ＤＭＳＯのみを含むもの）で測定される吸光度を示し、Ｏ．Ｄ．Ｃｏｎｔｒｏｌは、培地中に０．５％ＤＭＳＯ及び１ｍＭ Ｄ−ＧａｌＮを含有する場合に測定される吸光度を、Ｏ．Ｄ．Ｓａｍｐｌｅは、培地中に被験物質及び１ｍＭ Ｄ−ＧａｌＮを含有する場合に測定される吸光度を意味する。結果を以下の表９及び表１０に示す。結果はいずれも平均値と標準誤差で表し、対照群との有意差検定には、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いた。
【０１６８】
【表９】
【０１６９】
【表１０】
【０１７０】
前記表９及び１０中、障害抑制率の結果の末尾の符号「＊」及び「＊＊」は、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定で検定した対照との有意差：ｐが０．０５及び０．０１未満であったことを表す。
【０１７１】
前記表９及び１０の結果より、人参果のメタノール抽出エキス及び該抽出エキスより調製した各分画は、マウス肝初代培養細胞を用いたガラクトサミン誘発肝細胞障害に対する保護作用試験において有意な肝保護作用を有することが示されている。又、構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）及び（８）で表される化合物からなる群の中から選ばれる化合物も有意な肝保護作用を有することが示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人参果、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、を有効成分として含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤。
【請求項２】
下記の構造式（１）で表される化合物：
【化１】
下記の構造式（１０）で表される化合物：
【化２】
下記の構造式（１３）で表される化合物：
【化３】
下記の構造式（１５）で表される化合物：
【化４】
下記の構造式（２０）で表される化合物：
【化５】
下記の構造式（２５）で表される化合物：
【化６】
下記の構造式（２６）で表される化合物：
【化７】
下記の構造式（２９）で表される化合物：
【化８】
下記の構造式（３０）で表される化合物：
【化９】
下記の構造式（３１）で表される化合物：
【化１０】
及び、
下記の構造式（３２）で表される化合物：
【化１１】
からなる群の中から選ばれる１以上の化合物を有効成分として含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の抗ＴＮＦ−α作用剤を含有することを特徴とするヒト又は動物用の医薬。
【請求項４】
下記構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）及び（８）からなる群より選ばれるいずれかの構造式で表わされることを特徴とする新規サポニン化合物又は新規ポリフェノール化合物。
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【請求項５】
人参果、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は 請求項４に記載の新規サポニン化合物又は新規ポリフェノール化合物を有効成分として含むことを特徴とする肝保護作用剤。
【請求項６】
請求項５に記載の抗ＴＮＦ−α作用剤を含有することを特徴とするヒト又は動物用の医薬。
【請求項１】
人参果、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、又は前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、を有効成分として含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤。
【請求項２】
下記の構造式（１）で表される化合物：
【化１】
下記の構造式（１０）で表される化合物：
【化２】
下記の構造式（１３）で表される化合物：
【化３】
下記の構造式（１５）で表される化合物：
【化４】
下記の構造式（２０）で表される化合物：
【化５】
下記の構造式（２５）で表される化合物：
【化６】
下記の構造式（２６）で表される化合物：
【化７】
下記の構造式（２９）で表される化合物：
【化８】
下記の構造式（３０）で表される化合物：
【化９】
下記の構造式（３１）で表される化合物：
【化１０】
及び、
下記の構造式（３２）で表される化合物：
【化１１】
からなる群の中から選ばれる１以上の化合物を有効成分として含むことを特徴とする抗ＴＮＦ−α作用剤。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の抗ＴＮＦ−α作用剤を含有することを特徴とするヒト又は動物用の医薬。
【請求項４】
下記構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）及び（８）からなる群より選ばれるいずれかの構造式で表わされることを特徴とする新規サポニン化合物又は新規ポリフェノール化合物。
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【化１５】
【化１６】
【化１７】
【化１８】
【化１９】
【請求項５】
人参果、水、低級脂肪族アルコールもしくは低級脂肪族アルコールの含水物により人参果を抽出して得られる抽出液、前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキス、又は 請求項４に記載の新規サポニン化合物又は新規ポリフェノール化合物を有効成分として含むことを特徴とする肝保護作用剤。
【請求項６】
請求項５に記載の抗ＴＮＦ−α作用剤を含有することを特徴とするヒト又は動物用の医薬。
【公開番号】特開２０１１−２１９３７０（Ｐ２０１１−２１９３７０Ａ）
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−８６６１２（Ｐ２０１０−８６６１２）
【出願日】平成２２年４月３日（２０１０．４．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名 ：日本生薬学会 第５６回年会 主催者名 ：日本生薬学会 開催日 ：２００９年１０月４日
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【出願人】（３０４０２６１８０）株式会社ダイアベティム (12)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月３日（２０１０．４．３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 研究集会名 ：日本生薬学会 第５６回年会 主催者名 ：日本生薬学会 開催日 ：２００９年１０月４日
【出願人】（０００１２５３４７）学校法人近畿大学 (389)
【出願人】（３０４０２６１８０）株式会社ダイアベティム (12)
【Ｆターム（参考）】
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