向上した安定性を有する脂肪分解酵素変異体、及びこれをコードするポリヌクレオチド
本発明は、洗剤中で向上した安定性を有する脂質分解酵素変異体及びこれをコードするポリヌクレオチドを提供する。洗剤中で向上した安定性を有する脂質分解酵素変異体は、親脂質分解酵素におけるある特定のアミノ酸残基を置換することにより得られる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗剤中で向上した安定性を有する脂質分解酵素変異体、及びその調製方法に関する。それは、特に、サーモマイセス・ラヌギノーサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの脂質分解酵素変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な工業目的、例えば、洗剤の効率の向上のために、真菌性脂肪分解酵素、例えば、サーモマイセス・ラヌギノーサス（別名、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）の使用が知られている。サーモマイセス・ラヌギノーサス（別名、フミコラ・ラヌギノーサ、ＥＰ ２５８ ０６８及びＥＰ ３０５ ２１６）由来のリパーゼが、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓの製品）の商標名で、洗浄剤としての用途で販売されている。ＷＯ ００６００６３には、洗浄溶液において特に良好な第一洗浄機能を有するＴ．ラヌギノーサスリパーゼの変異体が記載されている。衣服及び他の織物から、脂質又は脂肪の染みを除去するための、洗剤酵素としてのリパーゼの使用に加え、これらは、パン及び他の焼き製品用のパン生地を作製するための添加剤としても、及びパルプ及び紙製品におけるピッチ（ｐｉｔｃｈ）問題の除去においても使用される。ある出願によれば、熱安定性が向上した脂質分解酵素が所望され（ＥＰ ３７４７００、ＷＯ ９２１３１３０）、一方、他の出願によれば、洗剤中の安定性が所望される。ＷＯ ９２／０５２４９、ＷＯ９２／１９７２６及びＷＯ ９７／０７２０２は、Ｔ．ラヌギノーサス（Ｈ．ラヌギノーサ）の変異体を開示している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
第一の態様によれば、本発明は、（ａ）親脂肪分解酵素と比較して、配列番号２のアミノ酸２７、２１６、２２７、２３１、２３３及び２５６のいずれかに対応するアミノ酸残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を有し；及び（ｂ）当該親脂肪分解酵素よりも洗剤中でより安定である、親脂肪分解酵素の変異体に関する。
【０００４】
さらなる態様によれば、本発明は、前記変異体をコードする単離ポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、当該核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター、及び当該核酸構築物又は組換え発現ベクターを含んでなる形質転換宿主細胞に関する。
【０００５】
さらなる態様によれば、本発明は、（ａ）前記変異体の作製に適する条件下で、前記ポリペプチドを含んでなる前記核酸構築物又は組換え発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞を培養するステップ；及び（ｂ）前記変異体を回収するステップ、を含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体の調製方法に関する。
【０００６】
さらなる態様によれば、本発明は、カルボン酸エステルの加水分解における、又はエステルの加水分解、合成又はエステル交換における脂質分解酵素変異体の使用に関する。
【０００７】
さらなる態様によれば、本発明は、脂質分解酵素変異体を含んでなる調製物に関する。
【０００８】
さらなる態様によれば、本発明は、洗剤中で安定な調製物の製造のための、脂質分解酵素変異体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−Ａ】図１は、リパーゼのアラインメントを示す。
【図１−Ｂ】図１は、リパーゼのアラインメントを示す。
【図１−Ｃ】図１は、リパーゼのアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
アミノ酸修飾のための命名法
本発明のリパーゼ変異体について記載する場合、参照の容易のために以下の命名法を使用する：
（１又は複数の）本来のアミノ酸：（１又は複数の）位置：（１又は複数の）置換アミノ酸
【００１１】
この命名法によれば、例えば、位置１９５におけるグリシンのグルタミン酸への置換は、Ｇ１９５Ｅと示される。同じ位置でのグリシンの欠失は、Ｇ１９５*と示され、そして付加的なアミノ酸残基の挿入、例えばリジンならば、Ｇ１９５ＧＫと示される。他のリパーゼとの比較で「欠失」を含む特定のリパーゼの場合、このような位置での挿入は、位置３６におけるアスパラギン酸の挿入であれば、*３６Ｄのように示される。
【００１２】
多重変異はプラスにより分けられる。すなわち：Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅは、位置１７０及び１９５での、それぞれアルギニン及びグリシンからチロシン及びグルタミン酸への置換を表す変異である。
【００１３】
記載するアラインメント方法を適用する場合、Ｘ２３１は、位置２３１に対応する親脂肪分解酵素におけるアミノ酸を示す。Ｘ２３１Ｒは、このアミノ酸がＲで置換されることを示す。配列番号２について、ＸはＴであり、そしてＸ２３１Ｒは、位置２３１のＴをＲで置換することを示す。ある位置（例えば２３１）でのアミノ酸が、アミノ酸群、例えば、Ｒ及びＰ及びＹからなる群から選択される別のアミノ酸により置換されてもよく、これはＸ２３１Ｒ／Ｐ／Ｙと示されることになる。
【００１４】
全ての場合において、一般に認められるＩＵＰＡＣの１文字又は３文字アミノ酸の略記が使用される。
【００１５】
同一性：本明細書で使用される場合「同一性」なる用語は、２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の同系性を意味し、「同一性」というパラメータにより記載される。
【００１６】
本発明の目的によれば、２つのアミノ酸配列のアラインメントは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（http://emboss.org）第２.８.０版のＮｅｅｄｌｅプログラムを用いて決定される。このＮｅｅｄｌｅプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３に記載される国際的なアラインメントアルゴリズムを実施する。使用される置換マトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２であり、ギャップ・オープニング・ペナルティが１０、及びギャップ・エクステンション・ペナルティが０．５である。
【００１７】
本発明のアミノ酸配列（「発明配列」；例えば、配列番号２のアミノ酸１〜２６９）と、異なるアミノ酸配列（「外来配列」）との間の同一性の度合いは、２つの配列のアラインメントにおける正確な一致の数を、「発明配列」の長さ又は「外来配列」の長さのいずれか短い方で除して計算される。この結果は、同一性の割合で表される。
【００１８】
「発明配列」及び「外来配列」が重複する同じ位置に、同一のアミノ酸残基を有する場合、正確な一致となる。配列の長さは、配列におけるアミノ酸残基の数である（例えば、配列番号２の長さは２６９である）。
【００１９】
上記手法は、アラインメントのための、同一性及び相同性の計算のために使用されてもよい。本発明において相同性及びアラインメントは、下記の通り計算している。
【００２０】
相同性及びアラインメント
本発明の目的によれば、相同性の度合いを、当該技術分野で既知のコンピュータプログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８，４４３−４５）から提供されるＧＡＰ等を用い、ポリペプチド配列比較のための以下の設定：ＧＡＰクリエーション・ペナルティ３．０及びＧＡＰエクステンション・ペナルティ０．１でＧＡＰを用いることにより、好適に決定してもよい。
【００２１】
本発明において、以下のリパーゼにおける対応する（又は相同である）位置は、図１に示すアラインメントにより定義される。前記リパーゼは、アブシディア・レフレクサ（Ａｂｓｉｄｉａ ｒｅｆｌｅｘａ）、アブシディア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、リゾプス・デレマル（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｒｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・カメンバーティレクサ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｌｅｘａ）、アスペルギルス・ホエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、サーモマイセス・ラヌギノーサス（別名、フミコラ・ラヌギノーサ）及びランデリナ・ペニサポラ（Ｌａｎｄｅｒｉｎａ ｐｅｎｉｓａｐｏｒａ）である。
【００２２】
アラインメントにおいて示されないリパーゼ配列における、相同位置を見つけるために、注目の配列を、図１に示す配列と並べる。新規な配列は、ＧＡＰアラインメントを用いることにより、ＧＡＰプログラムにより発見される最も相同性の高い配列と、図１における現在のアラインメントとを配列する。ＧＡＰは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８，４４３−４５）において提供される。ポリペプチド配列比較のために、以下の設定を用いる：ＧＡＰクリエーション・ペナルティ３．０及びＧＡＰエクステンション・ペナルティ０．１。
【００２３】
親リパーゼ
任意の好適な脂肪分解酵素を、親リパーゼとも呼ばれる親脂肪分解酵素として使用してよい。ある実施態様によれば、脂肪分解酵素は、真菌脂肪分解酵素であってよい。
【００２４】
脂肪分解酵素は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）等の属起源の酵母脂肪分解酵素；又はより好ましくは、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオプソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、サーモマイセス又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）等の属起源の糸状菌脂肪分解酵素でもよい。
【００２５】
脂肪分解酵素は、さらに、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、又はサッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）脂肪分解酵素でもよい。
【００２６】
あるいは、脂肪分解酵素は、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ホエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・タービゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｒｂｉｇｅｎｓｉｓ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クルークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリチオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、サーモマイセス・ラヌギノーサス（別名、フミコラ・ラヌギノーサス）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリフソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・ハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）脂肪分解酵素である。
【００２７】
ある実施態様によれば、本発明は、サーモマイセス・リパーゼ又はサーモマイセス・ラヌギノーサス・リパーゼである脂肪分解酵素変異体に関する。
【００２８】
ある実施態様によれば、本発明は、脂肪分解酵素変異体に関し、ここで当該変異体は、配列番号２と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一である。
【００２９】
洗剤中の安定性が向上した脂質分解酵素変異体における変更の確認
以下に述べる位置は、配列番号２におけるアミノ酸残基の位置である。「相同性及びアラインメント」の段落には、異なるリパーゼにおけるアミノ酸残基の対応する又は相同の位置をどのように発見するかが記載されている。
【００３０】
驚くべきことに、本発明の脂肪分解酵素変異体、脂肪分解変異体、又は端的に変異体は、親脂肪分解酵素よりも、洗剤中でより安定であることがわかった。洗剤中の安定性は、洗剤の存在下、脂肪分解／リパーゼ活性を維持する量として定義される。リパーゼ活性は、全体的又は部分的に維持されてよい。すなわち、本発明の変異体は、その由来である親リパーゼと比較して、洗剤の存在下、そのリパーゼ活性を、全体的又は部分的のいずれかで維持する能力の向上を示す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「リパーゼ活性」なる用語は、ジアクリルグリセロール及びカルボキシレートの形成のもと、トリアシルグリセロールの加水分解を触媒する、カルボン酸エステル加水分解酵素活性を意味する。本発明の目的によれば、リパーゼ活性は、以下の方法により決定される：リパーゼのための基質は、乳化剤としてアラビアゴムを用いて、トリブチリン（トリブチル酸グリセリン）を乳化することにより調製される。３０℃、ｐＨ７又は９でのトリブチリンの加水分解は、ｐＨスタット滴定実験において行われる。リパーゼ活性の１単位（１ＬＵ）は、３０℃、ｐＨ７で、１分当たり１マイクロモルのブチル酸を放出できる酵素量として定義される。
【００３２】
ある実施態様によれば、本発明の変異体は、参照酵素と比較している。本明細書で使用される場合「参照酵素」又は「参照リパーゼ」なる用語は、置換Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒを有する配列番号２の成熟部分を意味する。
【００３３】
ある実施態様によれば、本発明は、（ａ）親脂肪分解酵素と比較して、配列番号２のアミノ酸２７、２１６、２２７、２３１、２３３及び２５６のいずれかに対応するアミノ酸残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を有し；及び（ｂ）当該親脂肪分解酵素よりも洗剤中でより安定である、親脂肪分解酵素の変異体に関する。
【００３４】
ある実施態様によれば、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基２３１及び２３３を含んでなり、且つ親脂肪分解酵素と比較して、アミノ酸２７、２１６、２２７及び２５６のいずれかに対応するアミノ酸残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を有し；及び（ｂ）親脂肪分解酵素よりも洗剤中でより安定である、親脂肪酸分解酵素の変異体に関する。
【００３５】
ある実施態様によれば、本発明は、配列番号２に対応する位置である、位置２３１＋２３３、及び（ａ）２７；（ｂ）２１６；又は（ｃ）２５６；のうちの１つにおけるアミノ酸変更を有し、任意に、２２７をさらに含んでなる、親脂肪酸分解酵素の変異体に関する。
【００３６】
ある実施態様によれば、本発明は、アミノ酸の置換が、配列番号２の２７Ｒ、２１６Ｐ、２２７Ｇ、２３１Ｒ、２３３Ｒ又は２５６Ｋのうちの１つである変異体に関する。
【００３７】
ある実施態様によれば、本発明は、アミノ酸置換が、配列番号２のＤ２７Ｒ、Ｓ２１６Ｐ、Ｌ２２７Ｇ、Ｔ２３１Ｒ、Ｎ２３３Ｒ又はＰ２５６Ｋのうちの１つである変異体に関する。
【００３８】
ある実施態様によれば、本発明は、（ａ）Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ;（ｂ）Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；（ｃ）Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｄ）Ｄ２７Ｒ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；（ｅ）Ｄ２７Ｒ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；及び（ｆ）Ｓ２１６Ｐ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、からなる群から選択される置換を含んでなる変異体に関する。
【００３９】
ある実施態様によれば、本発明は、親脂肪分解酵素が、配列番号２と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％同一である変異体に関する。
【００４０】
ある実施態様によれば、本発明は、親脂肪分解酵素が、サーモマイセス・ラヌギノーサス ＤＳＭ ４１０９により作製され、配列番号２のアミノ酸を有する変異体に関する。
【００４１】
ある実施態様によれば、本発明は、洗剤が液体洗剤状態である変異体に関する。
【００４２】
【表１】
【００４３】
ある実施態様によれば、本発明は、脂肪分解酵素変異体を含んでなる調製物に関する。
【００４４】
ある実施態様によれば、本発明は、液体調製物であってよい調製物に関する。
【００４５】
脂肪分解酵素変異体のポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、作製
ある実施態様によれば、本発明は、脂肪分解酵素変異体をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、非常に低ストリンジェンシー条件、好ましくは低ストリンジェンシー条件、より好ましくは中ストリンジェンシー条件、より好ましくは中−高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは非常に高ストリンジェンシー条件下で、（i）配列番号１のヌクレオチド１７８〜６６０、（ii）配列番号１のヌクレオチド１７８〜６６０に含まれるｃＤＮＡ、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）又は（iii）の相補鎖とハイブリダイズできる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。配列番号１のサブ配列は、少なくとも１００個の連続ヌクレオチド、又は好ましくは少なくとも２００個の連続ヌクレオチドを含む。さらに、当該サブ配列は、リパーゼ活性を有するポリペプチド断片をコードしてよい。
【００４６】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、非常に低〜非常に高のストリンジェンシー条件は、以下の溶液中での、４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義され、当該溶液は、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００ｕｇ／ｍｌ剪断及び変性させたサケ精子ＤＮＡに加え、２５％ホルムアミドの場合は、非常に低及び低ストリンジェンシー、３５％ホルムアミドの場合は、中及び中−高ストリンジェンシー、又は５０％ホルムアミドの場合は、高及び非常に高ストリンジェンシー条件であり、その後、標準的サザンブロット法を、好ましくは１２〜２４時間行う。
【００４７】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、担体物質は、以下の溶液を用いて、各々１５分間、最終的に３回洗浄され、ここで溶液とは、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳであり、これが、好ましくは少なくとも４５℃（非常に低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中−高ストリンジェンシー）、さらにより好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、及び最も好ましくは７０℃（非常に高ストリンジェンシー）でなされる。
【００４８】
ある実施態様によれば、本発明は、発現宿主において、脂肪分解酵素変異体ポリペプチドの作製を指示する少なくとも１つの調節配列と作動的に結合するポリヌクレオチドを含んでなる、核酸構築物に関する。
【００４９】
ある実施態様によれば、本発明は、前記核酸構築物を含んでなる、組換え発現ベクターに関する。
【００５０】
ある実施態様によれば、本発明は、前記核酸構築物又は前記組換え発現ベクターを含んでなる、形質転換宿主細胞に関する。
【００５１】
脂肪分解酵素変異体をコードする単離ポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、当該核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター、及び当該核酸構築物又は当該組換え発現ベクターを含んでなる形質転換宿主細胞は、全て、当該技術分野で既知の方法により得てもよい。
【００５２】
洗剤中で安定な脂肪分解酵素変異体を得るための方法
脂肪分解酵素の変異体は、当該技術分野で既知の方法、例えばＷＯ ９５２２６１５又はＷＯ ００３２７５８に記載されるような、例えば、部位特異的変異導入、ランダム変異導入又は局在化変異導入等により得てもよい。親脂肪分解酵素から得られる洗剤中で安定な変異体は、以下の一般的方法により得てもよい。
【００５３】
・変異導入（エラープローン、ドープオリゴ、スパイクオリゴ）
・一次スクリーニング
・洗剤中でより安定な突然変異体の確認
・メンテナンス（グリセロール培養、ＬＢ−Ａｍｐプレート、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ）
・他のアッセイプレートへのストリーキングアウト（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ ｏｕｔ）
−二次スクリーニング（一次スクリーニングより１段高い）
・ＤＮＡ配列決定
・宿主細胞、例えばアスペルギルス等への形質転換
・１００ｍｌスケールでの培養、精製、ＤＳＣ
【００５４】
ある実施態様によれば、本発明は、（ａ）前記脂肪分解酵素変異体の作製に適する条件下、核酸構築物又は核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクターを含んでなる、形質転換宿主細胞を培養するステップ；及び（ｂ）前記脂肪分解酵素変異体を回収するステップ、を含んでなる脂肪分解酵素変異体の調製方法に関する。この方法は、当該技術分野で既知の原理に従って実施されてよい。
【００５５】
ある実施態様によれば、本発明は、（ａ）親脂肪分解酵素を選択するステップ、（ｂ）親脂肪分解酵素において、配列番号２の２７、２１６、２２７、２３１、２３３及び２５６のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップ、（ｃ）任意に、（ｂ）で記載したもの以外の１又は複数のアミノ酸を変更するステップ、（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）から得られる変異体を調製するステップ、（ｅ）変異体の洗剤中での安定性を試験するステップ、（ｆ）洗剤中での安定性が向上した変異体を選択するステップ、（ｇ）選択した変異体を作製するステップ、を含んでなる変異体を調製する方法に関する。
【００５６】
使用
本発明の変異体は、親脂肪分解酵素の類似体を使用してもよく、そしていくつかの目的について、当該変異体は、洗剤中での安定性が向上するために好まれる可能性がある。すなわち、ある実施態様によれば、本発明は、カルボン酸エステルの加水分解、又はエステルの加水分解、合成もしくはエステル交換における当該変異体の使用に関する。
【００５７】
ある実施態様によれば、本発明は、洗剤中安定な調製物の製造のための、前記変異体の使用に関する。
【実施例】
【００５８】
本発明は、以下の実施例によりさらに記載され、これは本発明の範囲を制限すると解されるべきではない。
【００５９】
緩衝剤及び基質として使用される化学物質は、少なくとも試薬級の市販品であった。
【００６０】
実施例１−リパーゼ変異体の発現
脂肪分解酵素変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドを構築し、そして当該技術分野の標準的方法を用いて、好適な宿主細胞に形質転換する。
【００６１】
実施例２−リパーゼ変異体の作製
発酵は、一定の培地温度３４℃、開始容量１．２リットルを用いる硫加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵として行われる。培地の初期ｐＨを６．５に設定する。ｐＨが７．０まで上昇したら、１０％のＨ3ＰＯ4を添加して、この値を維持する。培地中の溶解酸素レベルを、攪拌速度を変えながら、且つ培地１リットル当たり１分当たり１．０リットルの固定通気速度を用いることにより制御する。フィード（ｆｅｅｄ）添加速度を、硫加段階全体で一定レベルに維持する。
【００６２】
バッチ培地は、炭素源としてマルトース、窒素源として尿素及び酵母抽出物、及び微量金属及び塩の混合物を含有する。硫加段階の間、連続的に添加したフィードは、炭素源としてマルトースシロップを含み、一方、十分な窒素供給を確実にするため、酵母抽出物及び尿素を添加する。
【００６３】
脂肪分解酵素変異体の精製は、当該技術分野で既知の標準的方法、例えば、発酵上清の濾過及び続く疎水性クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィによりなされてもよく、例えばＥＰ ０ ８５１ ９１３ ＥＰ、実施例３に記載されている。
【００６４】
実施例３−脂肪分解酵素変異体の洗剤中の安定性
以下の脂肪分解酵素変異体を、安定性について試験し、且つ参照脂肪分解酵素、配列番号２と比較した。
【００６５】
【表２】
【００６６】
脂肪分解酵素変異体及び参照を、１グラムの市販の洗剤当たり、０．０６５ｍｇ酵素タンパク質濃度で投入した。
【００６７】
【表３】
【００６８】
洗剤及び脂肪分解酵素変異体又は参照酵素を含んでなるサンプルを、ｐＨ＝７.７でトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝剤に溶解させ、そして−１８℃及び３５℃で、それぞれ２週間及び４週間保存した。残存酵素活性は、３５℃でインキュベーション後のリパーゼ活性を、−１８℃で保存したサンプルのリパーゼ活性で除したものとして計算した。安定性データを以下の表４に示す。全ての６つの脂肪分解酵素変異体は、参照リパーゼと比較して、洗剤中での安定性の向上を示した。
【００６９】
リパーゼ活性を、古草酸塩及びｐ−ニトロフェニル産物を生じさせる、基質ｐ−ニトロフェニル−古草酸塩（ｐＮｐ−Ｖａｌ）の加水分解を追跡することにより測定した。検出波長＝４０５ｎｍ；ｐＨ＝７.７；及び温度＝３７℃。このｐＨでエステラーゼ活性を有する全てのリパーゼは、この方法で解析できる。
【００７０】
【表４】
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１は、サーモマイセス・ラヌギノーサス由来のリパーゼをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号２は、サーモマイセス・ラヌギノーサス由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、アブシディア・レフレクサ（Ａｂｓｉｄｉａ ｒｅｆｌｅｘａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、アブシディア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｒｕｍ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、ペニシリウム・カメンバーティレクサ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｌｅｘａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、アスペルギルス・ホエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、ランデリナ・ペニサポラ（Ｌａｎｄｅｒｉｎａ ｐｅｎｉｓａｐｏｒａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１−１】
【図１−２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗剤中で向上した安定性を有する脂質分解酵素変異体、及びその調製方法に関する。それは、特に、サーモマイセス・ラヌギノーサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼの脂質分解酵素変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な工業目的、例えば、洗剤の効率の向上のために、真菌性脂肪分解酵素、例えば、サーモマイセス・ラヌギノーサス（別名、フミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）の使用が知られている。サーモマイセス・ラヌギノーサス（別名、フミコラ・ラヌギノーサ、ＥＰ ２５８ ０６８及びＥＰ ３０５ ２１６）由来のリパーゼが、Ｌｉｐｏｌａｓｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓの製品）の商標名で、洗浄剤としての用途で販売されている。ＷＯ ００６００６３には、洗浄溶液において特に良好な第一洗浄機能を有するＴ．ラヌギノーサスリパーゼの変異体が記載されている。衣服及び他の織物から、脂質又は脂肪の染みを除去するための、洗剤酵素としてのリパーゼの使用に加え、これらは、パン及び他の焼き製品用のパン生地を作製するための添加剤としても、及びパルプ及び紙製品におけるピッチ（ｐｉｔｃｈ）問題の除去においても使用される。ある出願によれば、熱安定性が向上した脂質分解酵素が所望され（ＥＰ ３７４７００、ＷＯ ９２１３１３０）、一方、他の出願によれば、洗剤中の安定性が所望される。ＷＯ ９２／０５２４９、ＷＯ９２／１９７２６及びＷＯ ９７／０７２０２は、Ｔ．ラヌギノーサス（Ｈ．ラヌギノーサ）の変異体を開示している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
第一の態様によれば、本発明は、（ａ）親脂肪分解酵素と比較して、配列番号２のアミノ酸２７、２１６、２２７、２３１、２３３及び２５６のいずれかに対応するアミノ酸残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を有し；及び（ｂ）当該親脂肪分解酵素よりも洗剤中でより安定である、親脂肪分解酵素の変異体に関する。
【０００４】
さらなる態様によれば、本発明は、前記変異体をコードする単離ポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、当該核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター、及び当該核酸構築物又は組換え発現ベクターを含んでなる形質転換宿主細胞に関する。
【０００５】
さらなる態様によれば、本発明は、（ａ）前記変異体の作製に適する条件下で、前記ポリペプチドを含んでなる前記核酸構築物又は組換え発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞を培養するステップ；及び（ｂ）前記変異体を回収するステップ、を含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体の調製方法に関する。
【０００６】
さらなる態様によれば、本発明は、カルボン酸エステルの加水分解における、又はエステルの加水分解、合成又はエステル交換における脂質分解酵素変異体の使用に関する。
【０００７】
さらなる態様によれば、本発明は、脂質分解酵素変異体を含んでなる調製物に関する。
【０００８】
さらなる態様によれば、本発明は、洗剤中で安定な調製物の製造のための、脂質分解酵素変異体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−Ａ】図１は、リパーゼのアラインメントを示す。
【図１−Ｂ】図１は、リパーゼのアラインメントを示す。
【図１−Ｃ】図１は、リパーゼのアラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
アミノ酸修飾のための命名法
本発明のリパーゼ変異体について記載する場合、参照の容易のために以下の命名法を使用する：
（１又は複数の）本来のアミノ酸：（１又は複数の）位置：（１又は複数の）置換アミノ酸
【００１１】
この命名法によれば、例えば、位置１９５におけるグリシンのグルタミン酸への置換は、Ｇ１９５Ｅと示される。同じ位置でのグリシンの欠失は、Ｇ１９５*と示され、そして付加的なアミノ酸残基の挿入、例えばリジンならば、Ｇ１９５ＧＫと示される。他のリパーゼとの比較で「欠失」を含む特定のリパーゼの場合、このような位置での挿入は、位置３６におけるアスパラギン酸の挿入であれば、*３６Ｄのように示される。
【００１２】
多重変異はプラスにより分けられる。すなわち：Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅは、位置１７０及び１９５での、それぞれアルギニン及びグリシンからチロシン及びグルタミン酸への置換を表す変異である。
【００１３】
記載するアラインメント方法を適用する場合、Ｘ２３１は、位置２３１に対応する親脂肪分解酵素におけるアミノ酸を示す。Ｘ２３１Ｒは、このアミノ酸がＲで置換されることを示す。配列番号２について、ＸはＴであり、そしてＸ２３１Ｒは、位置２３１のＴをＲで置換することを示す。ある位置（例えば２３１）でのアミノ酸が、アミノ酸群、例えば、Ｒ及びＰ及びＹからなる群から選択される別のアミノ酸により置換されてもよく、これはＸ２３１Ｒ／Ｐ／Ｙと示されることになる。
【００１４】
全ての場合において、一般に認められるＩＵＰＡＣの１文字又は３文字アミノ酸の略記が使用される。
【００１５】
同一性：本明細書で使用される場合「同一性」なる用語は、２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の同系性を意味し、「同一性」というパラメータにより記載される。
【００１６】
本発明の目的によれば、２つのアミノ酸配列のアラインメントは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（http://emboss.org）第２.８.０版のＮｅｅｄｌｅプログラムを用いて決定される。このＮｅｅｄｌｅプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３に記載される国際的なアラインメントアルゴリズムを実施する。使用される置換マトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２であり、ギャップ・オープニング・ペナルティが１０、及びギャップ・エクステンション・ペナルティが０．５である。
【００１７】
本発明のアミノ酸配列（「発明配列」；例えば、配列番号２のアミノ酸１〜２６９）と、異なるアミノ酸配列（「外来配列」）との間の同一性の度合いは、２つの配列のアラインメントにおける正確な一致の数を、「発明配列」の長さ又は「外来配列」の長さのいずれか短い方で除して計算される。この結果は、同一性の割合で表される。
【００１８】
「発明配列」及び「外来配列」が重複する同じ位置に、同一のアミノ酸残基を有する場合、正確な一致となる。配列の長さは、配列におけるアミノ酸残基の数である（例えば、配列番号２の長さは２６９である）。
【００１９】
上記手法は、アラインメントのための、同一性及び相同性の計算のために使用されてもよい。本発明において相同性及びアラインメントは、下記の通り計算している。
【００２０】
相同性及びアラインメント
本発明の目的によれば、相同性の度合いを、当該技術分野で既知のコンピュータプログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８，４４３−４５）から提供されるＧＡＰ等を用い、ポリペプチド配列比較のための以下の設定：ＧＡＰクリエーション・ペナルティ３．０及びＧＡＰエクステンション・ペナルティ０．１でＧＡＰを用いることにより、好適に決定してもよい。
【００２１】
本発明において、以下のリパーゼにおける対応する（又は相同である）位置は、図１に示すアラインメントにより定義される。前記リパーゼは、アブシディア・レフレクサ（Ａｂｓｉｄｉａ ｒｅｆｌｅｘａ）、アブシディア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、リゾプス・デレマル（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｒｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・カメンバーティレクサ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｌｅｘａ）、アスペルギルス・ホエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、サーモマイセス・ラヌギノーサス（別名、フミコラ・ラヌギノーサ）及びランデリナ・ペニサポラ（Ｌａｎｄｅｒｉｎａ ｐｅｎｉｓａｐｏｒａ）である。
【００２２】
アラインメントにおいて示されないリパーゼ配列における、相同位置を見つけるために、注目の配列を、図１に示す配列と並べる。新規な配列は、ＧＡＰアラインメントを用いることにより、ＧＡＰプログラムにより発見される最も相同性の高い配列と、図１における現在のアラインメントとを配列する。ＧＡＰは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８，Ａｕｇｕｓｔ １９９４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ． ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０），Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８，４４３−４５）において提供される。ポリペプチド配列比較のために、以下の設定を用いる：ＧＡＰクリエーション・ペナルティ３．０及びＧＡＰエクステンション・ペナルティ０．１。
【００２３】
親リパーゼ
任意の好適な脂肪分解酵素を、親リパーゼとも呼ばれる親脂肪分解酵素として使用してよい。ある実施態様によれば、脂肪分解酵素は、真菌脂肪分解酵素であってよい。
【００２４】
脂肪分解酵素は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）等の属起源の酵母脂肪分解酵素；又はより好ましくは、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、オウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオプソラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ネウロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、パエシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロマイセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、サーモマイセス又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）等の属起源の糸状菌脂肪分解酵素でもよい。
【００２５】
脂肪分解酵素は、さらに、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、又はサッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）又はサッカロマイセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）脂肪分解酵素でもよい。
【００２６】
あるいは、脂肪分解酵素は、アスペルギルス・アクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ホエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・タービゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｒｂｉｇｅｎｓｉｓ）、フサリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウム・クルークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フサリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フサリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フサリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・レチクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フサリウム・ロセウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウム・サムブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フサリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フサリウム・スポロトリチオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フサリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フサリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フサリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、サーモマイセス・ラヌギノーサス（別名、フミコラ・ラヌギノーサス）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリフソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ネウロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・ハージアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラチアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）脂肪分解酵素である。
【００２７】
ある実施態様によれば、本発明は、サーモマイセス・リパーゼ又はサーモマイセス・ラヌギノーサス・リパーゼである脂肪分解酵素変異体に関する。
【００２８】
ある実施態様によれば、本発明は、脂肪分解酵素変異体に関し、ここで当該変異体は、配列番号２と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％同一である。
【００２９】
洗剤中の安定性が向上した脂質分解酵素変異体における変更の確認
以下に述べる位置は、配列番号２におけるアミノ酸残基の位置である。「相同性及びアラインメント」の段落には、異なるリパーゼにおけるアミノ酸残基の対応する又は相同の位置をどのように発見するかが記載されている。
【００３０】
驚くべきことに、本発明の脂肪分解酵素変異体、脂肪分解変異体、又は端的に変異体は、親脂肪分解酵素よりも、洗剤中でより安定であることがわかった。洗剤中の安定性は、洗剤の存在下、脂肪分解／リパーゼ活性を維持する量として定義される。リパーゼ活性は、全体的又は部分的に維持されてよい。すなわち、本発明の変異体は、その由来である親リパーゼと比較して、洗剤の存在下、そのリパーゼ活性を、全体的又は部分的のいずれかで維持する能力の向上を示す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「リパーゼ活性」なる用語は、ジアクリルグリセロール及びカルボキシレートの形成のもと、トリアシルグリセロールの加水分解を触媒する、カルボン酸エステル加水分解酵素活性を意味する。本発明の目的によれば、リパーゼ活性は、以下の方法により決定される：リパーゼのための基質は、乳化剤としてアラビアゴムを用いて、トリブチリン（トリブチル酸グリセリン）を乳化することにより調製される。３０℃、ｐＨ７又は９でのトリブチリンの加水分解は、ｐＨスタット滴定実験において行われる。リパーゼ活性の１単位（１ＬＵ）は、３０℃、ｐＨ７で、１分当たり１マイクロモルのブチル酸を放出できる酵素量として定義される。
【００３２】
ある実施態様によれば、本発明の変異体は、参照酵素と比較している。本明細書で使用される場合「参照酵素」又は「参照リパーゼ」なる用語は、置換Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒを有する配列番号２の成熟部分を意味する。
【００３３】
ある実施態様によれば、本発明は、（ａ）親脂肪分解酵素と比較して、配列番号２のアミノ酸２７、２１６、２２７、２３１、２３３及び２５６のいずれかに対応するアミノ酸残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を有し；及び（ｂ）当該親脂肪分解酵素よりも洗剤中でより安定である、親脂肪分解酵素の変異体に関する。
【００３４】
ある実施態様によれば、本発明は、（ａ）配列番号２のアミノ酸残基２３１及び２３３を含んでなり、且つ親脂肪分解酵素と比較して、アミノ酸２７、２１６、２２７及び２５６のいずれかに対応するアミノ酸残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を有し；及び（ｂ）親脂肪分解酵素よりも洗剤中でより安定である、親脂肪酸分解酵素の変異体に関する。
【００３５】
ある実施態様によれば、本発明は、配列番号２に対応する位置である、位置２３１＋２３３、及び（ａ）２７；（ｂ）２１６；又は（ｃ）２５６；のうちの１つにおけるアミノ酸変更を有し、任意に、２２７をさらに含んでなる、親脂肪酸分解酵素の変異体に関する。
【００３６】
ある実施態様によれば、本発明は、アミノ酸の置換が、配列番号２の２７Ｒ、２１６Ｐ、２２７Ｇ、２３１Ｒ、２３３Ｒ又は２５６Ｋのうちの１つである変異体に関する。
【００３７】
ある実施態様によれば、本発明は、アミノ酸置換が、配列番号２のＤ２７Ｒ、Ｓ２１６Ｐ、Ｌ２２７Ｇ、Ｔ２３１Ｒ、Ｎ２３３Ｒ又はＰ２５６Ｋのうちの１つである変異体に関する。
【００３８】
ある実施態様によれば、本発明は、（ａ）Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ;（ｂ）Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；（ｃ）Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；（ｄ）Ｄ２７Ｒ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；（ｅ）Ｄ２７Ｒ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；及び（ｆ）Ｓ２１６Ｐ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、からなる群から選択される置換を含んでなる変異体に関する。
【００３９】
ある実施態様によれば、本発明は、親脂肪分解酵素が、配列番号２と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％同一である変異体に関する。
【００４０】
ある実施態様によれば、本発明は、親脂肪分解酵素が、サーモマイセス・ラヌギノーサス ＤＳＭ ４１０９により作製され、配列番号２のアミノ酸を有する変異体に関する。
【００４１】
ある実施態様によれば、本発明は、洗剤が液体洗剤状態である変異体に関する。
【００４２】
【表１】
【００４３】
ある実施態様によれば、本発明は、脂肪分解酵素変異体を含んでなる調製物に関する。
【００４４】
ある実施態様によれば、本発明は、液体調製物であってよい調製物に関する。
【００４５】
脂肪分解酵素変異体のポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞、作製
ある実施態様によれば、本発明は、脂肪分解酵素変異体をコードする単離ポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、非常に低ストリンジェンシー条件、好ましくは低ストリンジェンシー条件、より好ましくは中ストリンジェンシー条件、より好ましくは中−高ストリンジェンシー条件、さらにより好ましくは高ストリンジェンシー条件、及び最も好ましくは非常に高ストリンジェンシー条件下で、（i）配列番号１のヌクレオチド１７８〜６６０、（ii）配列番号１のヌクレオチド１７８〜６６０に含まれるｃＤＮＡ、（iii）（i）又は（ii）のサブ配列、又は（iv）（i）、（ii）又は（iii）の相補鎖とハイブリダイズできる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。配列番号１のサブ配列は、少なくとも１００個の連続ヌクレオチド、又は好ましくは少なくとも２００個の連続ヌクレオチドを含む。さらに、当該サブ配列は、リパーゼ活性を有するポリペプチド断片をコードしてよい。
【００４６】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、非常に低〜非常に高のストリンジェンシー条件は、以下の溶液中での、４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義され、当該溶液は、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００ｕｇ／ｍｌ剪断及び変性させたサケ精子ＤＮＡに加え、２５％ホルムアミドの場合は、非常に低及び低ストリンジェンシー、３５％ホルムアミドの場合は、中及び中−高ストリンジェンシー、又は５０％ホルムアミドの場合は、高及び非常に高ストリンジェンシー条件であり、その後、標準的サザンブロット法を、好ましくは１２〜２４時間行う。
【００４７】
少なくとも１００ヌクレオチド長の長いプローブについて、担体物質は、以下の溶液を用いて、各々１５分間、最終的に３回洗浄され、ここで溶液とは、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳであり、これが、好ましくは少なくとも４５℃（非常に低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中−高ストリンジェンシー）、さらにより好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、及び最も好ましくは７０℃（非常に高ストリンジェンシー）でなされる。
【００４８】
ある実施態様によれば、本発明は、発現宿主において、脂肪分解酵素変異体ポリペプチドの作製を指示する少なくとも１つの調節配列と作動的に結合するポリヌクレオチドを含んでなる、核酸構築物に関する。
【００４９】
ある実施態様によれば、本発明は、前記核酸構築物を含んでなる、組換え発現ベクターに関する。
【００５０】
ある実施態様によれば、本発明は、前記核酸構築物又は前記組換え発現ベクターを含んでなる、形質転換宿主細胞に関する。
【００５１】
脂肪分解酵素変異体をコードする単離ポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物、当該核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクター、及び当該核酸構築物又は当該組換え発現ベクターを含んでなる形質転換宿主細胞は、全て、当該技術分野で既知の方法により得てもよい。
【００５２】
洗剤中で安定な脂肪分解酵素変異体を得るための方法
脂肪分解酵素の変異体は、当該技術分野で既知の方法、例えばＷＯ ９５２２６１５又はＷＯ ００３２７５８に記載されるような、例えば、部位特異的変異導入、ランダム変異導入又は局在化変異導入等により得てもよい。親脂肪分解酵素から得られる洗剤中で安定な変異体は、以下の一般的方法により得てもよい。
【００５３】
・変異導入（エラープローン、ドープオリゴ、スパイクオリゴ）
・一次スクリーニング
・洗剤中でより安定な突然変異体の確認
・メンテナンス（グリセロール培養、ＬＢ−Ａｍｐプレート、Ｍｉｎｉ−Ｐｒｅｐ）
・他のアッセイプレートへのストリーキングアウト（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ ｏｕｔ）
−二次スクリーニング（一次スクリーニングより１段高い）
・ＤＮＡ配列決定
・宿主細胞、例えばアスペルギルス等への形質転換
・１００ｍｌスケールでの培養、精製、ＤＳＣ
【００５４】
ある実施態様によれば、本発明は、（ａ）前記脂肪分解酵素変異体の作製に適する条件下、核酸構築物又は核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクターを含んでなる、形質転換宿主細胞を培養するステップ；及び（ｂ）前記脂肪分解酵素変異体を回収するステップ、を含んでなる脂肪分解酵素変異体の調製方法に関する。この方法は、当該技術分野で既知の原理に従って実施されてよい。
【００５５】
ある実施態様によれば、本発明は、（ａ）親脂肪分解酵素を選択するステップ、（ｂ）親脂肪分解酵素において、配列番号２の２７、２１６、２２７、２３１、２３３及び２５６のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップ、（ｃ）任意に、（ｂ）で記載したもの以外の１又は複数のアミノ酸を変更するステップ、（ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）から得られる変異体を調製するステップ、（ｅ）変異体の洗剤中での安定性を試験するステップ、（ｆ）洗剤中での安定性が向上した変異体を選択するステップ、（ｇ）選択した変異体を作製するステップ、を含んでなる変異体を調製する方法に関する。
【００５６】
使用
本発明の変異体は、親脂肪分解酵素の類似体を使用してもよく、そしていくつかの目的について、当該変異体は、洗剤中での安定性が向上するために好まれる可能性がある。すなわち、ある実施態様によれば、本発明は、カルボン酸エステルの加水分解、又はエステルの加水分解、合成もしくはエステル交換における当該変異体の使用に関する。
【００５７】
ある実施態様によれば、本発明は、洗剤中安定な調製物の製造のための、前記変異体の使用に関する。
【実施例】
【００５８】
本発明は、以下の実施例によりさらに記載され、これは本発明の範囲を制限すると解されるべきではない。
【００５９】
緩衝剤及び基質として使用される化学物質は、少なくとも試薬級の市販品であった。
【００６０】
実施例１−リパーゼ変異体の発現
脂肪分解酵素変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドを構築し、そして当該技術分野の標準的方法を用いて、好適な宿主細胞に形質転換する。
【００６１】
実施例２−リパーゼ変異体の作製
発酵は、一定の培地温度３４℃、開始容量１．２リットルを用いる硫加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵として行われる。培地の初期ｐＨを６．５に設定する。ｐＨが７．０まで上昇したら、１０％のＨ3ＰＯ4を添加して、この値を維持する。培地中の溶解酸素レベルを、攪拌速度を変えながら、且つ培地１リットル当たり１分当たり１．０リットルの固定通気速度を用いることにより制御する。フィード（ｆｅｅｄ）添加速度を、硫加段階全体で一定レベルに維持する。
【００６２】
バッチ培地は、炭素源としてマルトース、窒素源として尿素及び酵母抽出物、及び微量金属及び塩の混合物を含有する。硫加段階の間、連続的に添加したフィードは、炭素源としてマルトースシロップを含み、一方、十分な窒素供給を確実にするため、酵母抽出物及び尿素を添加する。
【００６３】
脂肪分解酵素変異体の精製は、当該技術分野で既知の標準的方法、例えば、発酵上清の濾過及び続く疎水性クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィによりなされてもよく、例えばＥＰ ０ ８５１ ９１３ ＥＰ、実施例３に記載されている。
【００６４】
実施例３−脂肪分解酵素変異体の洗剤中の安定性
以下の脂肪分解酵素変異体を、安定性について試験し、且つ参照脂肪分解酵素、配列番号２と比較した。
【００６５】
【表２】
【００６６】
脂肪分解酵素変異体及び参照を、１グラムの市販の洗剤当たり、０．０６５ｍｇ酵素タンパク質濃度で投入した。
【００６７】
【表３】
【００６８】
洗剤及び脂肪分解酵素変異体又は参照酵素を含んでなるサンプルを、ｐＨ＝７.７でトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝剤に溶解させ、そして−１８℃及び３５℃で、それぞれ２週間及び４週間保存した。残存酵素活性は、３５℃でインキュベーション後のリパーゼ活性を、−１８℃で保存したサンプルのリパーゼ活性で除したものとして計算した。安定性データを以下の表４に示す。全ての６つの脂肪分解酵素変異体は、参照リパーゼと比較して、洗剤中での安定性の向上を示した。
【００６９】
リパーゼ活性を、古草酸塩及びｐ−ニトロフェニル産物を生じさせる、基質ｐ−ニトロフェニル−古草酸塩（ｐＮｐ−Ｖａｌ）の加水分解を追跡することにより測定した。検出波長＝４０５ｎｍ；ｐＨ＝７.７；及び温度＝３７℃。このｐＨでエステラーゼ活性を有する全てのリパーゼは、この方法で解析できる。
【００７０】
【表４】
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１は、サーモマイセス・ラヌギノーサス由来のリパーゼをコードするＤＮＡ配列を示す。
配列番号２は、サーモマイセス・ラヌギノーサス由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、アブシディア・レフレクサ（Ａｂｓｉｄｉａ ｒｅｆｌｅｘａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、アブシディア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、アスペルギルス・ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、フサリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｒｕｍ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、フサリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、ペニシリウム・カメンバーティレクサ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｌｅｘａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、アスペルギルス・ホエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、ランデリナ・ペニサポラ（Ｌａｎｄｅｒｉｎａ ｐｅｎｉｓａｐｏｒａ）由来のリパーゼのアミノ酸配列を示す。
【図１−１】
【図１−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）親脂肪分解酵素と比較して、配列番号２のアミノ酸２７、２１６、２２７、２３１、２３３及び２５６のいずれかに対応するアミノ酸残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を有し；及び
ｂ）当該親脂肪分解酵素よりも洗剤中でより安定である、
親脂肪分解酵素の変異体。
【請求項２】
ａ）配列番号２のアミノ酸残基２３１及び２３３を含んでなり、且つ親脂肪分解酵素と比較して、アミノ酸２７、２１６、２２７及び２５６のいずれかに対応するアミノ酸残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を有し；及び
ｂ）親脂肪分解酵素よりも洗剤中でより安定である、
親脂肪酸分解酵素の変異体。
【請求項３】
配列番号２に対応する位置である、位置２３１＋２３３、及び
ａ）２７；
ｂ）２１６；又は
ｃ）２５６；
のうちの１つにおいてアミノ酸変更を有し、任意に、２２７をさらに含んでなる、親脂肪酸分解酵素の変異体。
【請求項４】
前記アミノ酸置換が、配列番号２の２７Ｒ、２１６Ｐ、２２７Ｇ、２３１Ｒ、２３３Ｒ又は２５６Ｋのうちの１つである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、配列番号２のＤ２７Ｒ、Ｓ２１６Ｐ、Ｌ２２７Ｇ、Ｔ２３１Ｒ、Ｎ２３３Ｒ又はＰ２５６Ｋのうちの１つである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項６】
ａ）Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ;
ｂ）Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；
ｃ）Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｄ）Ｄ２７Ｒ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；
ｅ）Ｄ２７Ｒ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；及び
ｆ）Ｓ２１６Ｐ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
からなる群から選択される置換を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項７】
前記親脂肪分解酵素が、配列番号２と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％同一である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項８】
前記親脂肪分解酵素が、サーモマイセス・ラヌギノーサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）ＤＳＭ ４１０９により作製され、配列番号２のアミノ酸を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項９】
前記洗剤が液体洗剤状態である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異体をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
発現宿主において、前記変異体の作製を指示する少なくとも１つの調節配列と作動的に結合する、請求項１０の単離ポリヌクレオチドを含んでなる、核酸構築物。
【請求項１２】
請求項１１の核酸構築物を含んでなる、組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１の核酸構築物又は請求項１２の組換え発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項１４】
ａ）前記変異体の作製に適する条件下で、前記ポリペプチドを含んでなる前記核酸構築物又は組換え発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞を培養するステップ；及び
ｂ）前記変異体を回収するステップ、
を含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変種の調製方法。
【請求項１５】
ａ）親脂肪分解酵素を選択するステップ、
ｂ）親脂肪分解酵素において、配列番号２の２７、２１６、２２７、２３１、２３３及び２５６のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップ、
ｃ）任意に、（ｂ）で記載したもの以外の１又は複数のアミノ酸を変更するステップ、
ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）から得られる変異体を調製するステップ、
ｅ）変異体の洗剤中での安定性を試験するステップ、
ｆ）洗剤中での安定性が向上した変異体を選択するステップ、
ｇ）選択した変異体を作製するステップ、
を含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体の調製方法。
【請求項１６】
カルボン酸エステルの加水分解における、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体の使用。
【請求項１７】
エステルの加水分解、合成又はエステル交換における、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体の使用。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体を含んでなる調製物。
【請求項１９】
液体調製物であってよい、請求項１８に記載の調製物。
【請求項２０】
洗剤中で安定な調製物の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体の使用。
【請求項１】
ａ）親脂肪分解酵素と比較して、配列番号２のアミノ酸２７、２１６、２２７、２３１、２３３及び２５６のいずれかに対応するアミノ酸残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を有し；及び
ｂ）当該親脂肪分解酵素よりも洗剤中でより安定である、
親脂肪分解酵素の変異体。
【請求項２】
ａ）配列番号２のアミノ酸残基２３１及び２３３を含んでなり、且つ親脂肪分解酵素と比較して、アミノ酸２７、２１６、２２７及び２５６のいずれかに対応するアミノ酸残基の置換を含んでなるアミノ酸配列を有し；及び
ｂ）親脂肪分解酵素よりも洗剤中でより安定である、
親脂肪酸分解酵素の変異体。
【請求項３】
配列番号２に対応する位置である、位置２３１＋２３３、及び
ａ）２７；
ｂ）２１６；又は
ｃ）２５６；
のうちの１つにおいてアミノ酸変更を有し、任意に、２２７をさらに含んでなる、親脂肪酸分解酵素の変異体。
【請求項４】
前記アミノ酸置換が、配列番号２の２７Ｒ、２１６Ｐ、２２７Ｇ、２３１Ｒ、２３３Ｒ又は２５６Ｋのうちの１つである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項５】
前記アミノ酸置換が、配列番号２のＤ２７Ｒ、Ｓ２１６Ｐ、Ｌ２２７Ｇ、Ｔ２３１Ｒ、Ｎ２３３Ｒ又はＰ２５６Ｋのうちの１つである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項６】
ａ）Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ;
ｂ）Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；
ｃ）Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ＋Ｐ２５６Ｋ；
ｄ）Ｄ２７Ｒ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；
ｅ）Ｄ２７Ｒ＋Ｌ２２７Ｇ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ；及び
ｆ）Ｓ２１６Ｐ＋Ｔ２３１Ｒ＋Ｎ２３３Ｒ、
からなる群から選択される置換を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項７】
前記親脂肪分解酵素が、配列番号２と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％同一である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項８】
前記親脂肪分解酵素が、サーモマイセス・ラヌギノーサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）ＤＳＭ ４１０９により作製され、配列番号２のアミノ酸を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項９】
前記洗剤が液体洗剤状態である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の変異体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の変異体をコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
発現宿主において、前記変異体の作製を指示する少なくとも１つの調節配列と作動的に結合する、請求項１０の単離ポリヌクレオチドを含んでなる、核酸構築物。
【請求項１２】
請求項１１の核酸構築物を含んでなる、組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１の核酸構築物又は請求項１２の組換え発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞。
【請求項１４】
ａ）前記変異体の作製に適する条件下で、前記ポリペプチドを含んでなる前記核酸構築物又は組換え発現ベクターを含んでなる、組換え宿主細胞を培養するステップ；及び
ｂ）前記変異体を回収するステップ、
を含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変種の調製方法。
【請求項１５】
ａ）親脂肪分解酵素を選択するステップ、
ｂ）親脂肪分解酵素において、配列番号２の２７、２１６、２２７、２３１、２３３及び２５６のいずれかに対応する少なくとも１つのアミノ酸残基を置換するステップ、
ｃ）任意に、（ｂ）で記載したもの以外の１又は複数のアミノ酸を変更するステップ、
ｄ）ステップ（ａ）〜（ｃ）から得られる変異体を調製するステップ、
ｅ）変異体の洗剤中での安定性を試験するステップ、
ｆ）洗剤中での安定性が向上した変異体を選択するステップ、
ｇ）選択した変異体を作製するステップ、
を含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体の調製方法。
【請求項１６】
カルボン酸エステルの加水分解における、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体の使用。
【請求項１７】
エステルの加水分解、合成又はエステル交換における、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体の使用。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体を含んでなる調製物。
【請求項１９】
液体調製物であってよい、請求項１８に記載の調製物。
【請求項２０】
洗剤中で安定な調製物の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の脂肪分解酵素変異体の使用。
【図１−Ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５１４８０５（Ｐ２０１１−５１４８０５Ａ）
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４８１０１（Ｐ２０１０−５４８１０１）
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２２４７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０６５５３
【国際公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５２２４７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１０６５５３
【国際公開日】平成２１年９月３日（２００９．９．３）
【出願人】（５００５８６２９９）ノボザイムス アクティーゼルスカブ (164)
【Ｆターム（参考）】
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