新規なコプリヌス・コマトゥスおよびトレメッラ・メセンテリカキノコ菌株、それらの生産物および抽出物、ならびにそれらを含む組成物
それぞれブダペスト条約下、Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）にアクセション番号ＣＢＳ１２３４０１で寄託されたコプリヌス・コマトュスＨＡＩ−１２３７、およびブダペスト条約下、Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）にアクセション番号ＣＢＳ１２３２９６で寄託されたトレメッラ・メセンテリカＨＡＩ−１７（以下、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６）から選択される、新規で明確な品種の高等担子菌類キノコ、そのバイオマスおよび抽出物、ならびにｂ−グルカン、フコガラクタンおよびグルクロノキシロマンナンなどの単離構成成分が開示され、ならびに自然食品サプリメント、栄養補給剤、プレバイオティクス、飲料製品、美容品、ペットフードとしてのそれらの使用、ならびに農業用殺虫剤および抗植物ウイルス組成物が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬用キノコ、より具体的には、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）およびトレメッラ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ）属の種のキノコ、ならびにコプリヌス・コマトゥス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６と命名された、新規で明確な高等担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）の菌株に関する。本発明はさらに、種々の生物活性化合物を含むこれらの新規な菌株由来の、子実体、液内培養菌糸体または単細胞バイオマス、および抽出物、ならびにヒトおよび動物の食餌療法用サプリメント、プレバイオティクス（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）、美容食品として、およびいくつかの疾患および状態の処置におけるそれらの使用、ならびに抗植物ウイルス剤に関する。
【０００２】
背景技術
キノコのバイオテクノロジー生産物は、人間の福祉に対して、例えば、食品、健康強壮剤および薬剤、飼料および肥料として、ならびに環境を保護および再生するために、多くの有益な効果を有する。強力で、独特な健康増強特性を持つ医薬物質が、薬用キノコから最近単離され、世界中に広まっている。それらの多くは、医薬品であるが、他のものとしては、新規なクラスの食餌療法用サプリメント、または「キノコ栄養補給剤」もしくは「栄養補助剤」、菌化学物質、植物化学物質、およびデザイナー食品が示される。いくつかの抗腫瘍多糖類、例えば、ヘテロ−β−グルカンおよびそれらのタンパク質複合体（例えば、キシログルカン、およびウロン酸を含有する酸性β−グルカン）、ならびに食物繊維、レクチン、およびトリテルペノイドが、薬用キノコから単離されている。
【０００３】
高等担子菌類キノコは、多量の多糖類、特に種々の種類のタイプのβ−グルカンを含有する。β−グルカンの抗腫瘍効果は、それらの分子量および溶解度に関係していると思われる。例えば、低分子量レチナンだけが高い抗腫瘍活性を示す。可溶性β−グルカンは不溶性のものよりも強い免疫刺激剤のようであるが、これは驚くべきことではない。
【０００４】
トレメッラ属の一部の種、液内培養単細胞バイオマスおよび子実体、特に、Ｔ．メセンテリカの菌株は、高レベルのグルクロノキシロマンナンおよびβ−グルカンを含有し、そのバイオマスおよび精製多糖類は両方とも、血糖降下およびトリグリセリド降下の活性を有することが示された（米国特許第６，３８３，７９９号；米国特許第６，３６２，３９７号）。
【０００５】
高等担子菌類キノコは、多量の多糖類、タンパク質、バランスの取れた必須アミノ酸、メラニン、必須脂肪酸を含む脂質、トリテルペノイド、抗酸化剤、ビタミン、および他の生物活性物質を含有する。また、グルカン、キチン、およびヘテロ多糖類（ペクチン物質、ヘミセルロースまたはポリウロニドを含む）に属する食物繊維は、キノコすべての組織に豊富にあり、これらは、腸内の胆汁酸または有害物質を吸収することができ、したがって、制癌物質として作用し、且つ様々な種類の毒作用を低下させることができる。
【０００６】
さらに、菌類物質は、（ｉ）様々な生理学的および病理学的過程で重要な役割を果たすＮＦ−κＢ活性化経路のモジュレータ；（ｉｉ）酸化性ストレス反応によって引き起こされる酸化損傷を防止または減少させるためのヒト用食餌におけるサプリメントとして適切な抗酸化物質；（ｉｉｉ）免疫モジュレータとして；および炎症過程に影響を与えることで知られている。
【０００７】
発明の概要
本発明は、ブダペスト条約下、Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）にアクセション番号ＣＢＳ１２３４０１で寄託されたコプリヌス・コマトュスＨＡＩ−１２３７（以下、コプリヌス・コマトュスＣＢＳ１２３４０１）、およびブダペスト条約下、Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）にアクセション番号ＣＢＳ１２３２９６で寄託されたトレメッラ・メセンテリカＨＡＩ−１７（以下、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６）から選択される、新規で明確な品種の高等担子菌類キノコを対象とする。
【０００８】
他の側面では、本発明は、炭水化物、必須アミノ酸に富んだタンパク質、ビタミン、必須脂肪酸に富んだ脂質、抗酸化剤およびミネラルを包含する、栄養補給剤および生物活性物質に富んだ本発明のキノコのバイオマスに関する。このバイオマスは、コプリヌス・コマトュスＣＢＳ１２３４０１の子実体もしくは菌糸体、またはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から得ることができる。トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体培養物は、単細胞バイオマスの形態である。
【０００９】
さらなる側面では、本発明は、栄養補給剤活性および生物活性を有する本発明のキノコからの抽出物に関する。抽出物は、このキノコの菌糸体または子実体から得ることができる。
【００１０】
さらに他の側面では、本発明は、抽出物から単離された新規な炭水化物、本発明のキノコ由来のバイオマスもしくは抽出物、または該抽出物から単離された新規な炭水化物を含む組成物、本発明の組成物を含む自然食品サプリメント、医薬、プレバイオティクス、栄養補給剤、飲料または美容製品、薬学的に許容される担体ならびに本発明の組成物および新規な炭水化物の１種から選択される活性成分を含む医薬組成物、ならびに該バイオマスおよび抽出物を生産する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】発酵装置中、またはバイオリアクター技術におけるコプリヌス・コマトゥスまたはトレメッラ・メセンテリカの液内培養菌糸体生産のための全般的な方法論のスキームを示す図である：ａ−ペトリ皿用の標準寒天培地の調製；ｂ−培養物の調製に用いられる胞子または子実体の部分；ｃ−ペトリ皿上の培養物；ｄ−チューブ中寒天斜面上の培地；ｅ−培地の顕微鏡調査；ｆ−２５０ｍＬ三角フラスコ中接種前培養物；ｇ−接種前培養物の均質化；ｈ−２Ｌ三角フラスコ中における均質化菌糸体バイオマスの培養；ｉ−接種発酵装置培地用の菌糸体バイオマスの均質化；ｊ−発酵装置用の発育培地；ｋ−発酵装置中菌糸体バイオマスの培養；ｌ−菌糸体バイオマスの収穫；ｍ−食餌療法用サプリメント（ＤＳ）、医薬品および他の製品のための乾燥バイオマス処方物；ＨＭ、収穫菌糸体。
【図２】ウエスタン免疫ブロットにより決定したｐＩκＢαレベルに対するＥ１およびＥ２の抽出物の効果を示す図である。この図は、同様の結果を有する２つの独立した実験を代表する。Ｅ１−培養液（水）抽出物；Ｅ２−酢酸エチル抽出物。
【図３】１００μＭのＨ２Ｏ２効果と比較したｐＩκＢαに対するＥ１およびＥ２の抽出物の効果を示す図２のウエスタン免疫ブロットのデンシトメトリー分析を示す図である。（結果は、Ｈ２Ｏ２のみ−処理の平均値±標準偏差に対する２つの独立した実験の倍数として示す）。
【図４】コプリヌス・コマトゥス抽出物Ｅ１およびＥ２のＩＫＫβ阻害活性を示す図である。抽出物Ｅ１およびＥ２（１００および２００μｇ／ｍｌ）ならびに６００ｎＭのＩＫＫ−β阻害剤Ｆｕｃｔ（１μＭ）を、１００ｎｇのＧＳＴ−ＩκＢα基質および５ｎｇのＩＫＫ−β酵素とともにインキュベートし、それらのＩＫＫ−β活性を阻害する能力について、材料および方法において記載されるとおりにＥＬＩＳＡベースキナーゼ活性アッセイを用いて試験した。Ｅ１−培養液（水）粗抽出物；Ｅ２−酢酸エチル粗抽出物。
【図５】コプリヌス水抽出物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図６Ａ】水抽出物の単糖含有量のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を示す図である。
【図６Ｂ】全細胞の単糖含有量のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を示す図である。
【図６Ｃ】水抽出後の細胞の単糖含有量のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を示す図である。
【図６Ｄ】ＮａＯＨ抽出後の細胞の単糖含有量のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を示す図である。
【図７】Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０上でサイズ排除クロマトグラフィーにより部分的に分離された、コプリヌス・コマトゥスの水およびＮａＯＨ抽出物由来の多糖類のサイズ分離クロマトグラムを示す図である。
【図８Ａ】ガノデルマ属の種（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）から抽出したβ−グルカンのメチル化分析を示す図である。
【図８Ｂ】コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１から抽出したβ−グルカンのメチル化分析を示す図である。
【図９】トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６から単離したβ−グルカンから得られたメチル化糖類のＧＣトレースを示す図である。
【図１０Ａ】トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の新たに単離した菌株から得られたメチル化糖類のＧＣトレースを示す図である。
【図１０Ｂ】純粋グルクロノキシロマンナンのＧＣトレースを示す図である。
【図１１】タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）と比べて品種Ｉｍｍｕｎｅ５８０のタバコ植物の敏感さに対するＧＸＭ（１０００μｇ／ｍＬ）の効果を示す図である。横座標：ＧＸＭの導入とＴＭＶの接種との間の間隔（日）。縦座標：実験（暗色無地のバー）と対照（織り目のある淡いバー）における局所損傷の数の比（％）。
【図１２】ＴＭＶと比べて品種Ｉｍｍｕｎｅ５８０のニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）植物の敏感さに対するＧＸＭ（２５００μｇ／ｍｌ）の影響を示す図である。横座標：ＧＸＭの導入とＴＭＶの接種との間の間隔（日）。縦座標：実験（暗色無地のバー）と対照（織り目のある淡いバー）における局所損傷の数の比（％）。
【図１３】品種Ｉｍｍｕｎｅ５８０のニコチアナ・タバクム植物においてＴＭＶにより誘導された、局所損傷の増大に対するＧＸＭ（２５００μｇ／ｍｌ）の影響を示す図である。横座標：ＧＸＭの導入とＴＭＶの接種の間の間隔（日）。縦座標：実験（暗色無地のバー）と対照（織り目のある淡いバー）における局所損傷の大きさ（ｍｍ）。
【図１４】ＴＭＶを接種した品種Ｉｍｍｕｎｅ５８０のニコチアナ・タバクム植物において誘導されたＧＸＭ抵抗性に対するアクチノマイシンＤ（ＡＭＤ）の影響を示す図である。横座標：実験変異：１−ＧＸＭ；２−ＧＸＭおよびＡＭＤの混合物（１０μｇ／ｍＬ）；３−ＧＸＭ２日後に導入したＡＭＤ（１０μｇ／ｍＬ）；４−ＧＸＭ２日後に導入したＡＭＤ（２０μｇ／ｍＬ）；５−ＡＭＤ（１０μｇ／ｍＬ）。縦座標：実験（暗色無地のバー）と対照（織り目のある淡いバー）における局所損傷の量の比（％）。
【００１２】
発明の詳細な説明
一側面では、本発明は、必須アミノ酸に富んだタンパク質および炭水化物を包含し、且つビタミン、必須脂肪酸に富んだ脂質、抗酸化剤、およびミネラルをさらに含む、栄養補給剤および生物活性化合物に富んだ、担子菌類キノコのコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のバイオマスに関する。
【００１３】
一態様では、該バイオマスは、例えば、栄養培地での液内培養における菌株の培養によって、単細胞バイオマスの形態でコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の子実体もしくは菌糸体、またはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から得られる。
【００１４】
本発明はさらに、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体培養物が、単細胞バイオマスの形態である、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の純粋液内菌糸体培養物に関する。トレメッラ・メセンテリカ菌糸体培養物が、酵母のように単細胞生物として発育することは、非常に高い発育速度、および担子菌類キノコすべての中で最も高いバイオマス生産性を与え、培地１リットル当たり最大２７ｇの乾燥バイオマスに達する。
【００１５】
本発明の２種のキノコの菌糸体の化学組成は、例４および例７で示されるとおりに決定された。本明細書で示される、本発明のキノコに存在すべき構成成分の多くは、抗癌活性、免疫調節活性、抗血糖、抗糖尿病および殺虫活性などの多くの有益な特性を有する。
【００１６】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の菌糸体バイオマスは、菌糸体の乾燥重量の、約３９％の炭水化物および約３７％のタンパク質を有し、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のそれは、約５４％の炭水化物および約２０％のタンパク質を有する。キノコ多糖類生産体の液内培養により、特定組成物の培地を用いて短期間で特定組成の制御された条件下での生産が可能になる。
【００１７】
バイオマス中の炭水化物は、多糖類ならびに二糖類および単糖類の両方を包含する。コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１のバイオマスの多糖類の例には、β−グルカン、好ましくは低分子量の水溶性β−グルカン、およびガラクタン、好ましくは中性フコガラクタンが包含される。
【００１８】
したがって、本発明は、本明細書で例４．２に示す、β−１−６−Ｄ−グルコース残基の側鎖をいくつかの６位に有する、β−１−３−結合Ｄ−グルコース残基の骨格構造から構成される新規な低分子量の水溶性β−グルカンに関する。β−グルカンは、コプリヌス・コマトゥス、好ましくはコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１から得られ、１０，０００Ｄａ未満、好ましくは約１０００から約１０，０００Ｄａの分子量を有する。
【００１９】
トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のバイオマスの多糖類の例には、β−グルカン、好ましくは直鎖状３，４β−グルカン、およびグルクロノキシロマンナンが包含される。したがって、本発明はさらに、本明細書で例７．４に示されるとおりにトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６から得られる、新規な水不溶性の直鎖状３，４β−グルカン、およびグルクロノキシロマンナンに関する。このグルクロノキシロマンナンは、キシロースおよびグルクロン酸のβ−（１→２）（１→４）−結合オリゴ糖によってグリコール化された、α−（１→３）−結合マンナンの直鎖状骨格からなり、これは、ポリアニオン特性を与え、抗血糖および抗糖尿病剤として使用され得る。
【００２０】
本発明のβ−グルカンは、抗腫瘍および免疫調節、特に免疫刺激活性を有し、本発明のグルクロノキシロマンナンは、血糖降下、免疫刺激、およびコレステロール低下の活性を有し、免疫系の強化が、糖尿病、癌、ＡＩＤＳなどのウイルス性疾患、心疾患、血圧を予防および処置するために、および高コレステロール状態を処置するためのコレステロール低下剤として重要である疾患および状態を予防および処置する薬草剤として有望である。両方の種の多糖類は、新規なプレバイオティクスの供給源であり得る。「プレバイオティック剤」は、本明細書では、宿主の福祉および健康に利益を与える胃腸微生物叢において、組成および／または活性の両方において特異的な変化を可能にする選択的に発酵された成分として定義される。また本バイオマス中に存在するキチンは、食物繊維の重要な構成成分である。
【００２１】
本菌糸体バイオマス中に見出される単糖類および二糖類には、グルコース、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコサミンおよびトレハロースが包含される。これらの単糖類および二糖類のすべては、健康に重要である。さらに、マンノースは、尿路および膀胱の組織への細菌の付着を防止することが示されており、グルコサミンは、骨関節炎の処置に、および軟骨を再構築するために有用であることが知られている。
【００２２】
本発明のキノコの菌糸体バイオマスタンパク質は、グルタミン酸、アスパラギン酸、ロイシン、システイン、メチオニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リシンおよびヒスチジンに富んでいる。Ｃ．コマトゥスは、γ−アミノ酪酸をさらに含有する。したがって、菌糸体のタンパク質は、１１種の必須アミノ酸；トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、リシン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンのうちの１０種を含有する。したがって、本発明のバイオマスは、必須アミノ酸に富んだタンパク質の存在により、重要な食餌療法用サプリメントの構成要素となる。
【００２３】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１のバイオマスは、ビタミン：Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ、およびＥを含み、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のバイオマスは、ビタミン：Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ７、Ｃ、およびＥを含む。したがって、高レベルの重要なビタミンを含有する本発明のキノコのバイオマスおよび抽出物は、ビタミンの優れた供給源として役立ち、栄養補給剤として使用することができ、および／または食餌療法用サプリメントとして食品および飲料品に添加することができる。
【００２４】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の菌糸体バイオマスは、脂肪酸であるペンタデカン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ６）、α−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ３）、γ−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ６）、アラキジン酸、ヘンエイコ酸、ベヘン酸、およびリグノセリン酸を包含する脂質をさらに含み；トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のバイオマスは、脂肪酸であるオレイン酸−（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ６）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトオレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）およびミリスチン酸を含む。脂肪酸は、それらのグリセロールとのエステルの形態でキノコ中に見出される。このキノコの高い栄養価は、必須不飽和脂肪酸であるα−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ３）およびリノール酸（Ｃ１８：２ｎ６）の存在によって明らかとなる。後者は、多価不飽和脂肪酸のオメガ−６シリーズを生じさせ、これらのリン脂質への取り込みは、流動性、柔軟性、透過性および膜結合酵素の活性などの細胞膜特性に影響を与える。
【００２５】
本発明のキノコの菌糸体バイオマスは、アルミニウム、銅、鉄、カリウム、マグネシウム、マンガン、リン、ケイ素、ナトリウム、チタンおよび亜鉛を含む、マクロ元素およびミクロ元素の両方のミネラルも含む。本発明の２種のキノコのいずれか１種のバイオマスの１日用量は、鉄および他のミネラルの優れた供給源を与える。
【００２６】
本発明のコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１菌株の菌糸体およびバイオマスは、抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤、メラニン（皮膚の光老化に対して保護を与え、特に太陽のＵＶ線から皮膚を保護し、電離放射線により生じた内部臓器に対する損傷に対しても保護し、そのカルボキシレート基およびフェノールヒドロキシル基によって潜在的に毒性である金属イオンを封鎖するのに役立ち得る）およびレクチン（例４．３を参照）、特にラクトース、ガラクトースおよびグルコサミン結合性レクチンを含み、これらは、多糖類および糖タンパク質の糖部分の同定に関わるアッセイに有用であり得ることも本発明によって見出された。
【００２７】
本発明のキノコのバイオマスは、プレバイオティクスまたは栄養補給剤組成物でさらに使用され得る。「キノコ栄養補給剤」は、本キノコの菌糸体または子実体のいずれか由来の精製されたまたは部分的に精製された抽出物または乾燥バイオマスと定義され、これは、食餌療法用サプリメント（従来の食品ではない）としてカプセルまたは錠剤の形態で消費され、潜在的な治療上の利用性を有する。通常の摂取は、人体の免疫応答を強化し、それにより、疾患に対する抵抗性を増加させ、一部の場合には、疾患状態の退行を生じさせ得る。
【００２８】
別の側面では、本発明は、栄養補給剤および生物活性を有する本発明のキノコの抽出物を提供する。一態様では、該抽出物は、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１由来である。別の態様では、抽出物は、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６由来である。該抽出物は、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の子実体もしくは菌糸体、またはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から得られる。好ましい態様では、本発明のキノコの抽出物は、純粋液内菌糸体培養物から得られる。
【００２９】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１培養物から得られる抽出物は、低分子量の水溶性β−グルカンおよび／またはガラクタン、好ましくは中性フコガラクタンに富んでおり、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６培養物から得られる抽出物は、直鎖状３，４β−グルカンおよび／またはグルクロノキシロマンナンに富んでおり、これは、抗血糖および抗糖尿病活性を有する。
【００３０】
一態様では、本発明のキノコの抽出物に存在する生物活性は、ＮＦ−κＢ経路調節活性、抗酸化活性、遊離ラジカル捕捉活性、抗放射線活性、金属イオン捕捉活性、インターフェロン生成活性、免疫調節活性、抗血糖活性、抗糖尿病活性、コレステロール低下活性、抗アレルギー活性、抗寄生虫活性、殺虫活性および／または抗植物ウイルス活性である。
【００３１】
本明細書で使用される「インターフェロン生成活性」および「インターフェロン生成剤」という用語は、哺乳動物の血漿中のインターフェロンの濃度を増加させる活性または剤を指す。
【００３２】
本明細書で使用される「免疫調節活性」および「免疫調節剤」という用語は、分裂促進性、造血幹細胞の刺激、代替補体活性化経路の活性化、ならびにＴＨ細胞、Ｔｃ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞の活性化を指すが、これらに限定されない。
【００３３】
「抗血糖活性」および「抗血糖剤」という用語は、血中グルコース濃度を減少させる活性または剤を指すが、「抗糖尿病活性」および「抗糖尿病剤」という用語は、血中グルコース濃度を低下させることによって糖尿病を処置する活性または剤を指す。
【００３４】
殺虫活性は、オオアリ、ヒアリ、イエシロアリ（ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、イエシロアリ（Ｆｏｒｍｏｓａｎ ｔｅｒｍｉｔｅｓ）およびレティクリテルメス・テルミテス（ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｔｅｒｍｉｔｅｓ）などの社会性昆虫を誘引し、感染させ、そしてこれらの昆虫を死滅させることを含む。
【００３５】
特に、および本明細書で以下に例で示されるとおりに、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１酢酸エチル抽出物は、ＮＦ−κＢ経路調節活性（例３）、ならびに抗酸化活性および／またはフリーラジカル捕捉性（例２）を有する。このような抽出物は、例えば、限定されないが、癌、免疫不全、敗血症性ショック、移植による拒絶反応、放射線損傷、虚血後の再潅流傷害、動脈硬化および神経変性疾患などのＮＦ−κＢ依存性疾患の処置に有用であり得る。
【００３６】
トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６培養物から得られる抽出物は、グルクロノキシロマンナンを含む、したがって、抗糖尿病活性を有し、免疫調節活性、例えば、マクロファージの機能リザーブ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅｒｖｅ）の増加を引き起こす活性、ならびにインターフェロン生成活性（例８参照）および／または抗植物ウイルス活性（例９参照）などをさらに含む。本明細書で使用される「機能活性」という用語は、自発的な活性および刺激（ＮＢＴ試験）を受けた活性指数間の差、すなわち、例えば、病原菌への曝露による活性化後のその活性と比較して、その休止態でのマクロファージなどの食細胞の活性を指す。
【００３７】
さらに別の側面では、本発明は、本発明によるバイオマスまたは抽出物を含む組成物に関する。ある種の態様では、本組成物は、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６から得られるバイオマスの混合物、またはコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６から得られる抽出物の混合物を含む。一態様では、本組成物は、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の菌糸体もしくは子実体から得られる栄養補給剤および生物活性物質に富んだバイオマス、または前記バイオマスの抽出物を含む。別の態様では、本組成物は、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から得られる栄養補給剤および生物活性物質に富んだバイオマス、または前記バイオマスの抽出物を含む。
【００３８】
なおさらに別の側面では、本発明は、それらのすべてが本明細書で上記におよび本明細書で以下の例に定義されるとおりの、低分子量の水溶性β−グルカン、水不溶性直鎖状３，４β−グルカン、グルクロノキシロマンナンから選択される炭水化物、またはこれらの炭水化物の少なくとも２種の組合せを含む組成物に関する。上記の観点から、本発明では、さらなる側面で、本発明の組成物を含む、自然食品サプリメント、プレバイオティクス、栄養補給剤、飲料品および美容品が提供される。本発明ではさらに、本発明の組成物を含む、ペットフード、殺虫剤、抗寄生虫剤および抗植物ウイルス製品が提供される。
【００３９】
なおさらなる側面では、本発明では、薬学的に許容される担体、および（ａ）本発明の組成物；（ｂ）低分子量の水溶性β−グルカン；（ｃ）水不溶性直鎖状３，４β−グルカン；（ｄ）グルクロノキシロマンナン；（これらのすべては、本明細書で上記におよび本明細書で下記の例に定義されるとおりである）；または（ｅ）（ｂ）から（ｄ）の活性成分の少なくとも２種の組合せから選択される活性成分を含む医薬組成物が提供される。
【００４０】
ある種の態様では、本発明の自然食品サプリメント、プレバイオティクスまたは栄養補給剤製品、および医薬組成物は、（ａ）糖尿病を処置し、または血中グルコース濃度を低下させる；（ｂ）免疫調節性応答を誘導する；または（ｃ）血中コレステロール濃度を低下させ、もしくはコレステロールの蓄積を減少させるために使用され得る。
【００４１】
本発明の自然食品サプリメント、プレバイオティクスまたは栄養補給剤製品、および医薬組成物は、単独でまたは制癌剤と組み合わせて、癌を処置するために、免疫調節性応答を誘導するために癌患者に投与され得る。
【００４２】
本明細書で使用される「処置する」という用語は、疾患もしくは障害の緩和、進行の低下もしくは完全な治癒、または疾患もしくは障害に関連したもしくはそれらによって引き起こされた症状の低減を指す。
【００４３】
本発明による使用のための医薬組成物は、賦形剤および補助剤を含む１種または２種以上の薬学的に許容される担体を用いて従来の方法で製剤化され得る。薬剤の製剤化および投与の技術は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版に見出すことができる。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば、経口送達、非経口送達（筋内、静脈内、皮下、髄腔内、または腹腔内注射を包含する）による全身投与のために、または局部薬剤送達による局所投与のために製剤化される。
【００４５】
本発明の方法における使用のための任意の組成物について、治療有効量または用量は、インビトロおよび細胞培養アッセイから初期に推定され得る。例えば、用量は、所望の濃度または力価を得るために動物モデルにおいて製剤化され得る。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【００４６】
なおさらなる側面では、本発明は、農業用担体、および本発明の組成物または本明細書で定義されるとおりのグルクロノキシロマンナンから選択される活性成分を含む農業用組成物に関する。ある種の態様では、農業用組成物は、植物ウイルスなどの植物病原菌に対する植物の抵抗性を誘導するためのものである。
【００４７】
一態様では、植物ウイルスは、感染植物に過敏な応答を誘導することができる植物ウイルス、例えば、タバコモザイクウイルス、および他のタバモウイルス、例えば、トマトモザイクウイルス、トウガラシ緑斑モットルウイルスおよびオンドントグロッスム輪点ウイルスを包含する植物ウイルスである。ある種の形態では、該ウイルスは、タバコモザイクウイルスである。
【００４８】
本発明の農業用組成物は、不活性添加物をさらに含み得る。このような添加物には、増粘剤、流動増強剤、湿潤剤、消泡剤、緩衝剤、潤沢剤、充填剤、飛散制御剤、沈着増強剤、アジュバント、蒸発遅延剤、霜よけ剤、昆虫誘引臭気剤、ＵＶ保護剤、芳香剤などが包含される。増粘剤は、水に可溶性または膨潤し得る化合物、例えば、キサンタンの多糖類（例えば、アニオン性ヘテロ多糖類）、アルジネート、グアールもしくはセルロース；合成巨大分子、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、膨潤性構造生成性シリケート（発熱性または沈降ケイ酸など）のポリカルボキシレート、ベントナイト、モンモリロナイト、ヘクトナイト、もしくはアタパルガイト；またはケイ酸アルミニウムの有機誘導体などであり得る。霜よけ剤は、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、尿素、またはそれらの混合物であり得る。消泡剤は、例えば、ポリジメチルシロキサンであり得る。本農業用組成物は、本技術分野で一般に知られているように、水系または油系製品に適合させた界面活性剤系も含み得る。
【００４９】
本発明ではさらに、生物活性が、ＮＦ−κＢ経路調節活性、抗酸化活性、フリーラジカル捕捉活性、抗放射線活性、金属イオン捕捉活性、インターフェロン生成、免疫調節、抗血糖、抗糖尿病、コレステロール低下活性、抗アレルギー活性、抗寄生虫活性、または抗植物ウイルス活性である、生物活性を有する本発明のキノコ由来の抽出物を製造する方法であって、栄養培地における液内培養で菌類コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１またはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６を培養する工程、結果として得られた、該培養ブロスから、食用菌類の得られたバイオマスを単離する工程、乾燥させる工程、および前記バイオマスを微粉末に粉砕し、溶媒抽出に付し、凍結乾燥させる工程を含む方法が提供される。特に、該方法は、グルクロノキシロマンナンに富んだトレメッラ・メセンテリカ、好ましくはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の抽出物を生産するためのものである。
【００５０】
さらなる方法では、多糖類、単糖類、タンパク質、必須アミノ酸、ビタミン、必須脂肪酸、ミネラルおよび微量元素に富んだ本発明のキノコ由来のバイオマスを生産する方法であって、栄養培地での液内培養で前記キノコを培養する工程、該培養ブロスから、食用菌類の得られたバイオマスを単離する工程、および前記バイオマスを乾燥させ微粉末に粉砕する工程を含む方法が提供される。
【００５１】
特に重要なことは、トレメッラ・メセンテリカ、トレメッラ・フキホルミス（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ）、およびトレメッラ・アウランティア（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａ）から選択されるトレメッラ属、好ましくはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６を含むキノコの単細胞液内培養物を栄養培地で培養するさらなる方法が、本発明によって提供されることである。
【００５２】
上に定義された方法のためにコプリヌス・コマトゥスを培養するために使用される栄養培地が、以下の組成（蒸留水のｇ／Ｌ）：グルコース、１５；ペプトン、３；酵母エキス、５；ＫＨ２ＰＯ４、０．８；Ｋ２ＨＰＯ４、０．２；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５からなるべきであること、および上に定義された方法のためにトレメッラ・メセンテリカを培養するために使用される栄養培地が、以下の組成（蒸留水のｇ／Ｌ）：スクロース、５０；酵母エキス、０．５；ＫＣｌ、１；酢酸Ｍｇ・４Ｈ２Ｏ、１．０；ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．５；Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０からなることが本発明によって見出された。
【００５３】
これから、本発明は、以下の非限定的な例によって例証される。
【００５４】
例
材料および方法
１．三角フラスコおよび発酵装置におけるコプリヌス・コマトゥスの菌糸体バイオマスの液内培養
図１は、発酵装置またはバイオリアクター技術を用いて、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の液内培養菌糸体生産のための全般的な方法論を示す。
【００５５】
キノコの液内培養菌糸体（ＳＣＭ）生産の全般的なスキームは、培養物発育の５工程を包含する：
培地培養物（Ｉ）→中間培養物（ＩＩ）→接種前培養物（ＩＩＩ）→接種培養物（ＩＶ）→発酵培養物（Ｖ）。
【００５６】
３種類の培地をＳＣＭ生産のために使用する：標準寒天培地（工程Ｉおよび工程ＩＩ）、液体標準接種培地（工程ＩＩＩおよび工程ＩＶ）、および発酵培地（工程Ｖ）。培地培養物は、チューブ中寒天斜面上で発生させる；中間培養物は、チューブまたはペトリ皿中の寒天斜面上で発生させる。接種前および接種培養物は、回転式振とう器を用いて三角フラスコ中で発生させる。発酵培養物は、撹拌、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度（ｐＯ２）、および泡状物の測定および／または制御のための装置を備えている発酵装置Ｂｉｏｆｌｏ２０００（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）中で発生させる。
【００５７】
最初の接種前培養物について、２５０ｍｌの三角フラスコにペトリ皿からの１から３週齢のキノコ菌糸体により接種する。寒天プレートの端で発育する菌糸体からの５から６片（直径５〜７ｍｍ）を三角フラスコに移し、フラスコ壁上で小片に切断し、菌糸体の発育点の数を増加させた。１００ｍｌの特定合成培地で満たした２５０ｍＬの三角フラスコに、菌糸体を接種した。菌接種物は、以下の成分（蒸留水のｇ／Ｌ）：（ｇｌ−１）：グルコース、１５；ペプトン、３．０；酵母エキス、５．０；ＫＨ２ＰＯ４、０．８；Ｋ２ＨＰＯ４、０．２；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５からなる合成培地上で発育させた。培地の初期のｐＨは、６．０であった。ホスフェート塩は、別個に滅菌した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）。接種したフラスコの培養は、回転式振とう器上で、１００ｒｐｍおよび２７℃で６〜７日間行う。培養の最後に、１ｍｌの試料を培養純度の顕微鏡観察のために培養物から採取する。
【００５８】
第２の接種培養物について、第１の接種前培養物（ペレット）由来のバイオマスを、Ｗａｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｗａｒｉｎｇ、米国）を用いて２×３０秒均質化し、７００ｍＬの同じ培地が入っている２Ｌのフラスコに接種した。
【００５９】
培養５〜７日後、菌糸体バイオマス（ペレット）を均質化し、上記の同じ合成培地上で１０Ｌの使用容積を有する発酵装置（Ｂｉｏｆｌｏ２０００ １０Ｌ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）中で発育のための接種培養物として使用した。培養の初期パラメータは以下のとおりである：温度２７℃；ｐＨ−６．１；撹拌−１００ｒｐｍ、通気−０．２ｖ／ｖ／分。用いた消泡剤は、ポリプロピレングリコール２０００であった；４％ＮａＯＨおよび４％ＨＣｌを用いて、ｐＨを調節した。
【表１】
【００６０】
当初は、培地のｐＨは調節しなかった。しかし、それが５．２に低下する場合、菌発育に有利になるように、ｐＨは６．０のレベルで自動的に一定に保持した。２４時間後、撹拌速度を２００ｒｐｍに、次いで、４８時間後に３００ｒｐｍに増加させた。４８時間後、培地の通気の速度は、０．４に増加させ、次いで（７２時間後）０．５ｖ／ｖ／分に増加させた。
【００６１】
菌糸体バイオマスの最大収量は、菌培養の７日目に達成された９３ｇ／Ｌの湿潤バイオマスまたは９．３ｇの乾燥バイオマスであった。培養の条件は表１で規定される。コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の菌糸体バイオマスのクランプ連結を有する空胞化菌糸が、菌培養７日後に見られる（図示せず）。
【００６２】
２．コプリヌス・コマトゥス抗酸化活性の評価
バイオマス推定。Ｃ．コマトゥス液内培養８〜１１日後に、菌糸体バイオマスをろ過により収穫し、恒量まで５０℃で乾燥させた。乾燥菌糸体を抽出のために粉末形態に摩砕した。
【００６３】
Ｃ．コマトゥスバイオマスからの抗酸化物質の抽出。収穫したキノコ菌糸体を５０℃で乾燥させ、粉末に摩砕した（４〜１０ｇ）。３種の異なる溶媒（水の代わりに培養液、エタノール、および酢酸エチル）を用いて、上行性極性でキノコ菌糸体から抗酸化化合物を抽出した。担子菌類培養の間の培養液中の抗酸化物質の存在に関する文献データは存在しなかったが、これらのキノコは、これらの化合物を細胞外に蓄積することができると想定される。したがって、選別したキノコの全抗酸化活性を正確に評価するために、菌バイオマスからの抗酸化物質の抽出のために水の代わりに適当な培養液を用いることを決定した。
【００６４】
最初の段階で、菌糸体を、培養液（１ｇ／１０ｍｌ）によって８０℃で（水浴を用いて）３時間抽出した。抽出後、不溶性化合物を６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離によって分離させ、ＷａｔｈｍａｎフィルターペーパーＮ４を通してろ過した。ろ液を蒸発させた。次いで、遠心分離後の残渣を、１５０ｒｐｍで回転式振とう器上、エタノール（８０％）によって２７℃で３時間連続的に抽出した。抽出後、溶液を遠心分離にかけ、ろ過し、有機溶媒を抽出物から蒸発させた。
【００６５】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の培養液からの抗酸化物質の抽出。バイオマスろ過後、培養物の発育培地のｐＨは、９６％硫酸を用いて２．０に低下させた。１菌株当たり１リットルの発育培地を５００ｍｌの酢酸エチルで３回分離させ、抽出物−溶媒混合物を、ガラス製化学的分離器を用いて０．５ｌの蒸留水で１回洗浄した。樹脂（または粉末）が生成されるまで、抽出物−溶媒混合物を溶媒蒸発用の化学フード中に放置し、これは、予め計量した４ｍｌのプラスチック管に採取した、実際の粗菌類抽出物に相当した。抽出物すべてを、最終濃度５０ｍｇ／ｍｌに９９．９％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、エッペンドルフチューブ中に分配し、使用前に７０℃で保った。
【００６６】
抗酸化活性アッセイ
β−カロテン漂白法。Ｃ．コマトゥス抽出物の抗酸化活性は、β−カロテン漂白法に従って決定した。１ｍｌのβ−カロテン（Ｓｉｇｍａ）溶液（クロロホルム中０．２ｍｇ／ｍｌ）、０．０２ｍｌのリノール酸（Ｓｉｇｍａ）、および０．２ｍｌのＴｗｅｅｎ８０（Ｓｉｇｍａ）を含有する試薬混合物を窒素の流れ下で蒸発乾固させた。５０ミリリットルの含酸素蒸留水および異なる濃度（２〜８ｍｇ／ｍｌ）を有する０．２ｍｌのキノコ粗抽出物（エタノールまたは培養液）を添加した。純メタノールまたは水（０．２ｍｌ）を対照として用い、そのブランクは、β−カロテンを除く当初の化学物質すべてを含有した。次いで、これらの混合物すべてを振とうして、リポソーム溶液を生成させ、次いで、５０℃で２時間インキュベートした。これらのリポソーム溶液のアリコート（１ｍｌ）の４７０ｎｍでの吸光度を、２０分の時間間隔で分光光度計によりモニターした。ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）（Ｓｉｇｍａ）（メタノール中２ｍｇ／ｍｌ）を標準として用いた。β−カロテンの漂白速度（Ｒ）を標準として用いた。β−カロテンの漂白速度（Ｒ）は、式（１）によって計算した
Ｒ＝ｌｎ（ａ／ｂ）／ｔ 式（１）
（ここで：ｌｎ−自然対数、ａ−時間０における吸光度、ｂ−時間ｔにおける吸光度、およびｔ−インキュベーション間隔２０、４０、６０、８０、１００、または１２０分）。
【００６７】
抗酸化活性（ＡＯＡ）は、対照に対する阻害パーセントに関して、式（２）を用いて計算した
ＡＯＡ＝［（Ｒ対照−Ｒ試料）／Ｒ対照］×１００ 式（２）
【００６８】
１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジルに対する捕捉活性。Ｃ．コマトゥス由来の抽出物の捕捉活性は、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカルに対して測定した。メタノール中０．１ｍＭのＤＰＰＨラジカル（Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｌのアリコートを、異なる濃度（０．５から９ｍｇ／ｍＬ）のキノコのエタノールまたは水抽出物１ｍＬを有する試験管に添加した。対照として、キノコ試料の代わりにメタノールまたは水を用いた。この反応混合物を室温で、ボルテックスにより混合し、分光光度計によって５２０ｎｍで測定することによって、吸光度を混合直後に決定した。ＤＰＰＨによるフリーラジカルの阻害は、以下のとおりに計算した：Ｉ（％）＝（Ａブランク−Ａ試料／Ａブランク）×１００（ここで、Ｉは、阻害（％）、Ａブランクは、対照反応物（試験化合物を除くすべての試薬を含有する）の吸光度、Ａ試料は、試験化合物の吸光度である。５０％阻害（ＥＣ５０）を与える抽出物濃度は、抽出物濃度に対するラジカルパーセンテージの捕捉活性のグラフから計算した。１ｍｇ／１ｍｌのメタノールの濃度におけるブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）を標準として用いた。各値を、平均±標準偏差（ｎ＝３）として表す。
【００６９】
３．液内コプリヌス・コマトゥス由来の抽出物の生物活性についての試験
実験作業のための細胞培養物の調製。癌細胞培養物に関する実験作業すべては、滅菌生物学的フード内で行った。各実験の前に、細胞をトリプシン処理し、採取し、与えられた実験の必要性に応じて適当な細胞量を播種するために数えた。
【００７０】
ＭＣＦ７乳癌細胞培養物は通常、フラスコ底に付着して増殖する。使用のためにこれらの細胞を調製するために、使い捨てピペットを用いて培地をフラスコから廃棄し、次いで、１〜２ｍｌのトリプシンを２〜３分間添加した。トリプシン処理の間、細胞を、加湿インキュベータ中３７℃で保持した。トリプシン処理を停止させるために、フラスコ底から細胞を分離させ、用いたフラスコの大きさに応じて５〜１０ｍｌの新鮮な培地を加えた。細胞をマルチピペット採取によって十分混合し、１００μｌの細胞懸濁液を０．４％のトリパンブルー溶液１００μｌで染色し、十分に混合し、トリパンブルー排除法に従って血球計を用いて顕微鏡下で数えた。
【００７１】
利用できる細胞数を確立後、細胞懸濁液をさらに希釈し、各実験の要件に応じて特定数の細胞を播種した。さらなる実験作業のために利用できる細胞系を再増殖および維持させるために、一部の細胞を常に保持した。細胞系すべてのストック懸濁液を液体窒素で保持し、実験細胞培養物を２〜３ヶ月ごとに１回更新した。
【００７２】
細胞溶解、全細胞溶解物の調製。粗菌類抽出処理への応答として特定のタンパク質の細胞内レベルを測定するために、細胞を採取した後に毎回、全細胞の溶解を行った。全細胞溶解の抽出手順を、以下に記載する。
【００７３】
細胞を採取し、３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離によって冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。最終の細胞量をエッペンドルフチューブに採取し、最後の洗浄から残ったＰＢＳを廃棄し、その結果、細胞ペレットだけを各チューブに残した。細胞溶解に関して、毎回、新たに調製した溶解緩衝液を、以下の含有量で用いた：試料の数に依存して５００〜１０００μＬの細胞溶解試薬、タンパク質分解酵素抑制剤カクテル、および１％の最終濃度でホスファターゼ阻害剤カクテル１およびカクテル２の両方、ならびに０．３Ｍのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）。溶解緩衝液５０μＬを添加し、試料を１０分ごとに激しくボルテックスして氷上で３０分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間最終の遠心分離にかけた。全細胞溶解物に相当する上清を、新しいエッペンドルフチューブに移し、−７０℃で保存する一方、細胞ペレットは廃棄した。
【００７４】
Ｈ２Ｏ２刺激によるＰＩκＢα動力学。２５ｍｌのプラスチック製フラスコを用いて、ＭＣＦ７乳癌細胞（２×１０５個）を５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に播種し、３７℃に維持した。２４時間後、血清中に示される増殖因子によるシグナル伝達カスケードの活性化を最小化するために、増殖培地を、０．５％ＦＣＳを含有する培地と置き換えた。２４時間後、細胞に５０または１００μＭのＨ２Ｏ２を５分、１０分、２０分、３０分、４０分、および６０分間補給して、ＭＣＦ７乳癌細胞系におけるＨ２Ｏ２刺激後の阻害タンパク質カッパＢ（ＩκＢα）リン酸化を検出した。
【００７５】
対照として、Ｈ２Ｏ２処理なしを用い、それによってｐＩκＢαの動力学を決定した。細胞を採取し、洗浄し、前に記載したとおりに溶解させた。実験を二通りで行った。
【００７６】
ＩＫＫキナーゼアッセイ。ＩκＢキナーゼ複合体（ＩＫＫ−β）活性は、Ｓｅｒ３２およびＳｅｒ３６のＩＫＫ−βリン酸化部位を包含する５０アミノ酸ＧＳＴ−ＩκＢα融合ポリペプチド基質を用いるＥＬＩＳＡベース活性アッセイである、ＩＫＫ−β−阻害剤選別キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国）によって評価した。１００ｎｇのＧＳＴ−ＩκＢα基質および５ｎｇの組換えＩＫＫ−βを、６００ｎＭのＩＫＫ−β阻害剤５−（ｐ−フルオロフェニル）−２−ウレイド］チオフェン−３−カルボキサミド（Ｆｕｃｔ）、および１００または２００μｇ／ｍｌのコプリヌス・コマトゥス抽出物の存在下でインキュベートした。反応混合物を、グルタチオンで前コートしたウェルに添加し、ＧＳＴ−ＩκＢαの捕獲を可能にした。抗ホスホ−ＩκＢα（Ｓｅｒ３２／Ｓｅｒ３６）抗体を用いて、リン酸化ＧＳＴ−ＩκＢα基質を検出し、続いて、ＨＲＰ共役化し、ＴＭＢ基質で発色させた。吸光度を４５０ｎｍでモニターし、ＩＫＫ−β活性のレベルと直接関係づける。
【００７７】
デンシトメトリー分析。ウエスタンブロットにより検出した、タンパク質バンドのデンシトメトリー定量分析は、ＴｏｔａｌＬａｂソフトウェアを用いて行っており、タンパク質バンドの容量の倍数として示す。菌類抽出物の作用への応答におけるｐＩκＢαレベルに対するウエスタンブロットのデンシトメトリー分析は、対照値の平均±ＳＤとして示す。
【００７８】
４．コプリヌス・コマトゥスの内容物および化学組成
コプリヌス・コマトゥスの多糖類組成の分析
ＣＢＳ１２３４０１の液内培養菌糸体バイオマス（１０ｇ）を、沸騰９６％エタノール（３００ｍｌ）で２時間洗浄した。不溶性残渣（８．２ｇ、８２％）を、オートクレーブ中水（３００ｍｌ）によって１２０℃で１時間、２回抽出した。抽出物のごく一部を乾燥させ、ＮＭＲで分析し、残部を透析し、１００ｍｌに濃縮し、１２００００ｇで３時間、超遠心分離機にかけ、脱色のために数滴の臭素で溶液を処理し（この後、一部のタンパク質を沈殿させ、遠心分離で除去した）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０上でゲルクロマトグラフィーにより分離して、様々な割合でデンプン、β−グルカンおよびガラクタンを含有する３画分（１５０、２２０、および１３０ｍｇ）を得た。不溶性残渣（５．８ｇ）を沸騰５％ＫＯＨで３時間抽出し、溶液を透析し、上記のとおりに処理して、タンパク質−β−グルカン混合物（３００ｍｇ）を得た。
【００７９】
メチル化分析。試料（１〜３ｍｇ）を１ｍｌの乾燥ＤＭＳＯに１００℃で溶解させた。不溶性グルカンを一晩そのままにしたが、依然として完全に溶解しなかった。室温に冷却後、粉末にしたＮａＯＨ（約３０ｍｇ）を添加し、混合物を３０分間撹拌し、０．５ｍｌのＭｅＩを添加し、３０分間撹拌を続け、過剰のＭｅＩを空気流で除去し、水（５ｍｌ）を添加した。可溶性試料について、生成物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、水で洗浄し、３Ｍ ＴＦＡで加水分解し（１２０℃、３時間）、ＮａＢＤ４で還元し、アセチル化し、ＧＣ−ＭＳで分析した。不溶性化合物は、透析により回収し、もう一度メチル化した。
【００８０】
ＮＭＲ実験は、標準パルスシーケンスＤＱＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ（混合時間１２０ミリ秒）、ＮＯＥＳＹ（混合時間２００ミリ秒）、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣ（１００ミリ秒 長期トランスファディレイ）を用いて、アセトン内部標準（１Ｈについて２．２２５ｐｐｍおよび１３Ｃについて３１．５ｐｐｍ）を有する２５℃でのＶａｒｉａｎ Ｚ勾配プローブを備えたＶａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ ５００ＭＨｚ分光計によって行った。データ処理は、Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｏｐｓｐｉｎプログラムで行った。
【００８１】
単糖類分析。試料（１〜５ｍｇ）を、濃ＨＣｌ（０．２ｍｌ）に４０℃で１時間溶解させ、イノシトール標準（０．５ｍｇ）を添加し、混合物を水（０．４ｍｌ）で希釈し、１００℃で２時間加熱した。酸を空気流下で蒸発させ、糖をＮａＢＨ４（１０ｍｇ、３０分）で還元し、ＡｃＯＨ（０．５ｍｌ）を添加し、試料を乾燥させ、次いで、ＭｅＯＨ（１ｍｌ）から２度乾燥させ、０．５ｍｌのＡｃ２Ｏでアセチル化し、乾燥させ、ＧＣで分析した。この手順により、不溶性ポリマーからのグルコースおよびグルコサミンの回収は改善されるが、ペントースおよび６−デオキシヘキソースは部分的に分解する。それらの正確な定量化を得るために、加水分解を３Ｍ ＴＦＡで行った（１２０℃、３時間）。
【００８２】
メガザイムキットによるβ−グルカン決定。全般説明：すべてのグルカンを濃（３７％；１０Ｎ）塩酸に可溶化し、次いで、１．３Ｎ ＨＣｌにより１００℃で２時間、十分に加水分解した。Ｄ−グルコースへの加水分解は、高精製ｅｘｏ−１，３−β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼの混合物によるインキュベーションで完了させる。この手順は、製造者指図書に対して１０分の１で規模を縮小した。
【００８３】
オリゴ糖中の全グルカン（α−グルカン＋β−グルカン）プラスＤ−グルコース、スクロースおよび遊離のＤ−グルコースの測定。グルカンを、試料（約１０ｍｇ）から、時々ボルテックス撹拌して、濃塩酸（０．２ｍｌ）で３０℃にて４５分間抽出した。酸を水で５倍に希釈し、加水分解を１００℃で２時間行った。酸を１ｍｌの２Ｍ ＫＯＨで中和し、混合物を２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ｍｌに希釈し、１５００ｇで１０分間の遠心分離で清澄化した。０．０１ｍＬの抽出物に、０．１ｍｌの水および０．１ｍｌの、ｅｘｏ−１，３−β−グルカナーゼ（２０Ｕ／ｍＬ）プラスβ−フルコシダーゼ（４Ｕ／ｍｌ）の２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中混合物を添加し、混合物を４０℃で６０分間インキュベートした。３．０ｍＬのグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ混合物（ＧＯＰＯＤ）を添加し、４０℃で２０分間インキュベートした。５１０ｎｍでの吸光度をその試薬ブランクに対して測定した。
【００８４】
スクロース中α−グルカン（フィトグリコーゲンおよびデンプン）＋グルコース、および遊離のｄ−グルコースの測定。試料（１０ｍｇ）を、撹拌しながら、０．２ｍｌの２Ｍ ＫＯＨで２０分間抽出した。０．８ｍＬの１．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）、続いて０．０２ｍＬのアミログルコシダーゼ（１６３０Ｕ／ｍｌ）プラス転化酵素（５００Ｕ／ｍＬ）を添加し、断続的に混合しながら４０℃で３０分間インキュベートした。試料を水で１０ｍｌに希釈し、遠心分離で清澄化し、０．０１ｍｌの試料を、０．０１ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ５．０）および０．３ｍＬのＧＯＰＯＤ試薬と混合し、４０℃で２０分間インキュベートし、５１０ｎｍにおける吸光度を試薬ブランクに対して測定した。試薬ブランクは、０．２ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ５．０）＋３．０ｍＬのグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ試薬からなる。Ｄ−グルコース標準は、０．１ｍＬのＤ−グルコース標準（１ｍｇ／ｍＬ）＋０．１ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ５．０）＋３．０ｍＬのグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ試薬からなる。
【００８５】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の液内培養菌糸体由来のレクチン画分の抽出。
５０ｇの湿重量を有するコプリヌス・コマトゥス菌糸体バイオマスを、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有するＰＢＳ（４０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）下で均質化した（１／６ ｗ／ｖ）。ホモジェネートを４℃で２時間保ち、次いで、８０００ｇで２０分間遠心分離にかけた。８０％飽和の（ＮＨ４）ＳＯ４を、タンパク質画分の沈殿のために用いた。混合物を一晩４℃で放置させた。沈殿物を、１２０００ｇで２０分間の遠心分離処理により採取し、最小容量のＰＢＳに溶解させ、蒸留水中、次いでＰＢＳ中で連続的に透析した。得られた抽出物を、タンパク質の量、レクチン活性、および糖特異性について分析した。
【００８６】
レクチンの赤血球凝集能のアッセイ。レクチンの赤血球凝集能を測定するために、トリプシン処理した赤血球懸濁液を用いた。ウサギの血液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１５０ｍＭクエン酸三ナトリウム緩衝液中に採取した。１０容量の洗浄緩衝液（ＰＢＳ）で３回赤血球を洗浄することによって、赤血球懸濁液を新たに調製した。次に、４％赤血球懸濁液のトリプシン処理を３７℃で１時間行い；次いで、赤血球を洗浄し、同じ緩衝液中に２％懸濁液（ｖ／ｖ）として懸濁させた。
【００８７】
レクチン（赤血球凝集）活性のアッセイでは、レクチン溶液のマイクロタイターＵ−プレート（５０μｌ）中連続的２倍希釈液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中ウサギ赤血球細胞の２％懸濁液５０μＬと２０℃で混合した。結果を１時間後に記録した。赤血球凝集を示す最大希釈の逆数として定義される、赤血球凝集力価は、１赤血球凝集単位に等しかった。特異性活性は、タンパク質１ｍｇ当たり赤血球凝集単位の数である。
【００８８】
レクチンの糖結合特異性。様々な炭水化物による、レクチン誘導赤血球凝集の阻害の調査は、赤血球凝集試験と類似の方法で行った。糖試料（０．３Ｍ）は、リン酸緩衝生理食塩水中で調製した。希釈液のすべては、等容量（２５μＬ）のレクチン溶液と混合した。混合物を室温で３０分間放置させ、次いで、５０μＬの２％ウサギ赤血球懸濁液と混合した。糖結合特異性は、力価４のレクチンの赤血球凝集の阻害に必要とされる各糖の最小濃度として表した。Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）；Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ（＋）ガラクトース（Ｇａｌ）；Ｄ（＋）グルコース、Ｄ（＋）ラクトース（Ｌａｃ）；Ｄ（＋）マンノース、キシロース、セロビオース、およびズルシトールを、レクチンの糖結合特異性の検出について試験した。
【００８９】
５．品種トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の特性；三角フラスコおよび発酵装置中単細胞バイオマスの液内培養。
トレメッラ・メセンテリカの培養物の調製。トレメッラ・メセンテリカの子実体を、イスラエルでカシ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｐ．）の種の朽ちた木の上で採取した。担子菌類紋は、保湿室内の滅菌ペトリ皿下に置いた新鮮な子実体から、湿度をゆっくり低下させることによって得た。滅菌水中のその胞子懸濁液をペトリ皿中の麦芽寒天の表面上に広げて、単胞子培養物を担子菌類紋から発生させた。発芽担子菌類を立体顕微鏡下で調べ、酵母様出芽性細胞由来の若いコロニーを麦芽寒天（ＭＡ）の斜面上に移した。
【００９０】
第１工程の液内培養物のためのトレメッラ・メセンテリカ菌株の酵母様１倍体細胞の接種物を、滅菌水中ＭＡ斜面上の８日齢培養細胞の懸濁液として調製した。発酵培地を、液内培養物で接種して、多糖類生産のための処理を冷蔵の軌道式振とう器中２２０ｒｐｍ、２７℃で行った。
【００９１】
多糖類生産は、遠心分離により菌株生産体の細胞を分離後に、２容量のエチルアルコールによる培養ブロス上清のアルコール沈殿によって推定した。発酵の最後に培養ブロスから得た粗沈殿物は、細胞外多糖類および菌株生産体の細胞の両方を含有する。
【００９２】
５．０ｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．６２５ｇ／ｌのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．４３５ｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび０．２ｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（ｇ／ｌ）から構成される微量元素混合物（微量栄養素）を別に調製し、滅菌培地に添加した。微量元素混合物を培地に１：１００に希釈して添加し、最終カチオン濃度（ｍｇ／ｌ）：Ｆｅ＋＋−１０．０；Ｍｎ＋＋−２．０；Ｚｎ＋＋−１．０；Ｃｕ＋＋−０．５を得た。
【００９３】
微量元素の水酸化物の沈殿生成を防止するために、オートクレーブ処理による滅菌前に、微量元素溶液のｐＨを５０％Ｈ２ＳＯ４で１．６〜１．８に調整する。
【００９４】
決定した組成の培地を、ペプトンおよび酵母抽出物（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ）ならびにミネラル塩（Ｓｉｇｍａ）から発生させた。
【００９５】
６．トレメッラ・メセンテリカの内容物および化学組成
トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の酸性グルコロノキシロマンナンの決定。発酵培地上の培養の最後の培養ブロスを脱イオン水で３倍に希釈した。菌株生産体細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４０３遠心分離機中５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離により分離させた。上清を、２容量のエチルアルコールと混合し、粗多糖類を沈殿させた。培養ブロスから沈殿した多糖類の混合物を水に溶解させ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｈ＋−型）で満たしたクロマトグラフィーガラス製カラムを通過させた。酸性グルコロノキシロマンナンを、沈殿物が生成されなくなるまで、１０％のセチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）水溶液を徐々に添加することによって、採取画分から沈殿させた。不溶性ＣＰＣ複合体は、遠心分離で採取し、１０％塩化ナトリウム中に溶解させた。不溶性粒子を遠心分離で分離後、酸性多糖類を２容量のエタノールを添加して沈殿させた。
【００９６】
精製多糖類を、沈殿物を水に溶解させ、続いてアルコールで繰り返し沈殿させることによって得た。
【００９７】
７．トレメッラ・メセンテリカ調製物のインターフェロン生成および免疫調節特性。
血漿中のＩＦＮレベルおよび食細胞の機能活性の決定。血漿中のＩＦＮレベルは、マウス線維芽細胞Ｌ−９２９の培養物中試験ウイルス（水疱性口内炎のウイルス、Ｉｎｄｉａｎａ菌株−ＶＳＶ）の細胞変性影響の抑圧により推定した。９６小孔培養パネルの小孔を、１００μＬの細胞懸濁液（１×１０６個細胞／ｍＬ）で満たし、５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃で１８時間インキュベートし、次いで、１００μＬの２倍希釈試験試料を添加した。１８時間後、予め滴定したＶＳＶ作業用希釈物５０μＬを添加した。パネルを同一条件下でインキュベートした。結果を顕微鏡下で評価した。試験ウイルスの細胞変性影響に対して５０％の細胞防護を与えた、最終ＩＦＮ希釈の逆数を、ＩＦＮ活性単位と仮定した。ＩＦＮ力価は、単位／ｍｌで表した。
【００９８】
血漿中のＴＮＦの生物活性は、マウス線維芽細胞Ｌ−９２９上の細胞溶解作用により評価した。指標細胞懸濁液（５×１０６個細胞／ｍｌ）を、１００μＬを複数回に分けて、フラット底９６小孔培養パネル中に導入し、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で２４時間培養した。次いで、培地を小孔から除去し、１００μＬの試験試料および１００μＬの、アクチノマイシンＤ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を含有する培地を、細胞の単層に添加した。試験試料なしで培養した細胞は、対照としての役目をした。インキュベーション２４時間後に、培地を除去し、細胞を、クリスタルバイオレットの０．２％溶液によって室温で１０分の間染色し、水で３回洗い落とし、３７℃で乾燥させた。
【００９９】
波長５５０ｎｍでＭｕｌｔｉ−ｓｃａｎ ＤＹＮＡＲＥＣＨ（Ｓｗｉｓｓ）を用いて、結果を評価した。
【０１００】
ＴＮＦ活性は、細胞毒性指数（ＣＩ）以外を評価し、これは、以下の式：ＣＩ＝（Ｋ−Ｄ）／Ｋ×１００％（ここで、Ｋは、対照小孔における光学密度であり、Ｄは、試験小孔における光学密度である）を用いて計算した。
【０１０１】
「ＶＥＣＴＯＲ］（Ｕｋｒａｉｎｅ）により作製したＴＮＦ組換え調製物「Ｒｉｆｎａｍｅｎ」を、ＴＮＦ試験に用いた。
【０１０２】
食作用系の機能活性は、細胞化学法によってニトロブルーテトラゾリウム回収（ＮＢＴ試験）で調査した。
【０１０３】
８．トレメッラ抽出物、および植物ウイルスに対する植物抵抗性
ウイルス：タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、菌株Ｕ１；
植物：自然の照明、湿度、および温度の条件下の温室で栽培された、タバコ（ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）品種Ｉｍｍｕｎｅ５８０およびシロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ Ｌ．）。４〜６葉期の植物を実験に用いた。
【０１０４】
一部修正したＫｏｖａｌｅｎｋｏ法を用いて、トレメッラ・メセンテリカの培養液から抽出した多糖類を本試験で用いた。中性多糖類から酸性グルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）を単離するために、本発明者らは、０．０５Ｍ ＣａＣｌ２の存在下でアセトンと水の溶液（１：１）からのその沈殿を適用した。ガスクロマトグラフィーを、ピリジニウム−アセテート緩衝液、ｐＨ４．５（１Ｌ水中４ｍＬピリジンおよび１０ｍＬ ＡｃＯＨ）中Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（２．５×８０ｃｍ）上で行い、溶出液を屈折率検出器でモニターした。
【０１０５】
インビトロの実験において、全調製物、中性多糖調製物、ならびに１０、１００、５００、および１，０００μｇ／ｍＬの濃度の純粋ＧＸＭの水溶液を、ＴＭＶ（１０μｇ／ｍＬ）の懸濁液に添加した。３０分かけてインキュベートした後、チョウセンアサガオ属の葉の左半分にこの混合物を接種した。葉の右半分に多糖類なしの同じ濃度でのＴＭＶを接種した。ウイルス感染の阻害度、またはＶＩＲを、以下の式：Ｉ＝（（Ｋ−Ｄ）／Ｋ）１００％（ここで、Ｉは、ウイルス阻害度またはＡＶＲのレベル、％であり；Ｋは、対照における局所損傷の数（大きさ）であり；Ｄは、実験における局所損傷の数（大きさ）である）で、葉の、実験の半分および対照の半分上の局所損傷の数によって（パーセンテージで）数えた。
【０１０６】
ＧＸＭの誘導特性の調査は、タバコおよびチョウセンアサガオ属の植物で行った。この目的のために、１０００〜２５００μｇ／ｍＬの濃度での多糖類の水素溶液を、葉の左半分の細胞間空間中に１ｍＬ（インスリン）注射器で注射した。葉の２つの半分にＴＭＶ（１〜５μｇ／ｍＬ）を接種した。ＡＶＲの程度は、上記の式によって考慮した。
【０１０７】
植物抵抗性のＧＸＭ誘導機構を研究する場合、本発明者らは、ＲＮＡ−ポリメラーゼを遮断することによりｍＲＮＡのＤＮＡ依存性合成を阻害するアクチノマイシンＤ（ＡＭＤ）を用いた。１０および２０μｇ／ｍＬの濃度でのＡＭＤならびにラムノリピド（ＲＬ）−１ｍｇ／ｍＬの溶液を、同時にまたはＧＸＭ後の一定時間を経て、表皮下に導入した。局所損傷の数および大きさの差は、スチューデント（ｔ）検定の基準で評価し；得られたα−値は、以下の記号：＋＋＋Ｐ≦０．０１％；＋＋０．１＜Ｐ≦１％：＋１％≦Ｐ≦５％；０ｐ＞５％で表に示す。
【０１０８】
（例１）
品種コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の特性
純粋培養における植物性菌糸体。菌糸体コロニーは、白く、綿状で、しばしば、「タフト」（菌糸集合体）を成熟とともに発達させる。非対称に形状化して、通常、外側端部に沿って菌糸体マットを形成する。クランプ連結、融着、および髪様結晶がしばしば、菌糸上に存在する。
【０１０９】
菌傘３〜１５ｃｍ；若いときに卵形から丸みを帯びた円筒形、つり上げ縁を有する鐘形状に膨張する；年齢が増すとともに黒色の「インク（ｉｎｋ）」に変化する；乾いている；茶色がかった中心を有して白っぽい；大きくて、毛羽だった鱗片；成熟時にしわを寄せた縁。茎をもたないラメラ；白色、ピンクがかって、次いで、黒色になる；黒色「インク」に変わる；非常に混んでいる。柄５〜２０ｃｍ長；１〜２ｃｍ厚さ；しばしば頂点まで先細になる；滑らか；白色；傘から容易に分離できる；中空、内部に垂れ下がる繊維の筋様ストランド；内容物は全体に白色で、軟らかい。胞子紋は黒色。担子胞子 ９〜１３×７〜９μｍ；楕円形；滑らか；中心からわずかに偏心した孔。担子器 ４胞子、２８〜４３×１０〜１３μｍ、５〜８個の偽副生体で囲まれる。側シスチジアなし。縁シスチジア 様々な形状；最大６０×４０μｍ。毛状被は、７〜３０μ幅の円筒要素でできている。不完全なクランプだけが存在する。
【０１１０】
生息場所。しばしば予期されない場所、例えば、街の緑地などに群で生育する。草地および牧草地に広く出現する。
【０１１１】
（例２）
コプリヌス・コマトゥスの抗酸化活性の評価
２．１ 乾燥させた液内培養キノコ菌糸体からのバイオマスおよび抽出物の収量
選別日程の間に高等担子菌類キノコの液内培養のために選択した栄養培地は、選択した種すべての発育を確実にした。しかし、同一の培養条件におけるコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１キノコ培養８〜１１日後の菌糸体バイオマスの収量は、６．８ｇ／ｌであった（表１）。
【０１１２】
乾燥させ摩砕したキノコ菌糸体からの可溶性化合物の抽出は、培養液（水に代えて）およびエタノールで行った。種々の菌株から得られた抽出物の中での収量の有意差が明らかになった。さらに、キノコバイオマスから得られた抽出物の収量は、使用した溶媒に有意に依存した。コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１バイオマスの培養液による抽出は、２３．２％の抽出物を生じさせた。
【０１１３】
エタノールによる抽出は、あまり有効でなく、試験菌株上で用いた弱い可溶化剤は、単に８．５％を生じさせただけであった。
【０１１４】
２．２ 液内培養コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１キノコ菌糸体からの水（培養液）およびエタノール抽出物の抗酸化活性
表２に示すデータは、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１から得られた水（培養液）抽出物の抗酸化活性（ＡＯＡ）を示す。２ｍｇ／ｍＬの濃度のＣ．コマトゥスＣＢＳ１２３４０１水抽出物を用いた場合、非常に高いＡＯＡが明らかになった。わずかに低いＡＯＡが、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１菌糸体バイオマスからの水抽出物で観察された。これら抽出物すべての阻害値は、事実、試薬混合物中のそれらの濃度の増加に伴って変化しなかった。
【０１１５】
キノコバイオマスからのエタノール抽出物のＡＯＡは、高等担子菌類の種に大きく依存しただけでなく、試薬混合物中の抽出物濃度の変化にも依存した。エタノール抽出物の濃度が、２ｍｇ／ｍｌから４〜８ｍｇ／ｍｌに増加した場合、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１からの抽出物のＡＯＡは、７４．４から８６．４％に増加した（表３）。
【表２】
【表３】
【０１１６】
２．３ 液内培養キノコ菌糸体からの水（培養液）およびエタノール抽出物のフリーラジカル捕捉活性
フリーラジカル捕捉は、公知の機構の１つであり、それにより抗酸化物質は、脂質酸化を阻害する。１，１−ジフェニルピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカルを捕捉する方法を用いて、抗酸化活性を評価した。５２０ｎｍにおける特徴的な吸収を有する安定なフリーラジカル生成物質であるＤＰＰＨを用いて、抽出物のラジカル捕捉効果を試験した。吸光度の低下は、ラジカル捕捉の程度の指標と考えられる。
【０１１７】
水およびエタノールの抽出物の最も高いフリーラジカル捕捉活性が、０．５ｍｇ／ｍｌ（それぞれ、２７．０％および２２．０％）の試料濃度で測定されたが、それらの値は、標準（９２．０％）のものより非常に低かった（表４および表５）。
【０１１８】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１のエタノール抽出物のフリーラジカル捕捉能は、２２から１に低下し、試料濃度は、０．５から９ｍｇ／ｍｌ％に、それぞれ増加した（表５）。
【表４】
【０１１９】
表５および表６に示されるＤＰＰＨ捕捉効果に対する効果濃度の値は、水およびエタノールの抽出物の両方のＥＣ５０が、１ｍｇ／ｍＬ付近であるようにみえた証拠を示す。
【表５】
【０１２０】
（例３）
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の液内培養菌糸体からの水（培養液）および酢酸エチル抽出物の生物活性についての試験
３．１ Ｈ２Ｏ２による、ＭＣＦ７細胞におけるＮＦ−κＢ刺激後のｐＩκＢαレベル
薬用キノコについての多くの研究により、食餌療法用サプリメントおよび免疫促進物質としてだけでなく、様々な細胞応答のモジュレータの供給源としても、それらの外にない潜在性が分かった。その化学療法計画の大部分の実際の成功にもかかわらず、細胞適応は、腫瘍細胞を多くの化学療法剤に対して抵抗性にさせることを可能にしてきた。これらの細胞化学物質抵抗性因子の１つは、核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）であり、これは、腫瘍増殖を促進することが示された。ＮＦ−κＢの活性は、ＩκＢタンパク質との相互作用によって強固に制御される。ＮＦ−κＢタンパク質と同様に、個々のＮＦ−κＢ複合体に対する異なる親和性を有するいくつかのＩκＢタンパク質があるが、いくらか異なって制御され、組織特異的様式で発現される。
【０１２１】
細胞外刺激は、２種の保存セリン（ＩκＢαにおけるＳｅｒ３２およびＳｅｒ３６）上のＩκＢをリン酸化するＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）の活性化をもたらす。このリン酸化は、プロテアソームの分解に対するＩκＢを特徴づけ、核転座およびＮＦ−κＢの活性化を引き起こす。これは、ＮＦ−κＢ活性化の古典的経路と考えられる。ＮＦ−κＢ活性化のいくつかの代替経路が、説明されてきた。ＮＦ−κＢの活性化の現在の研究では、過酸化水素が用いられ、これは、周知のＮＦ−κＢ活性化剤であり、強力な酸化試薬である。予備データにより、１００μＭのＨ２Ｏ２による１０分の処理は、最高レベルのｐＩκＢαをもたらし、１０μＭの、公知の抗酸化物質および抗癌試薬であるクルクミンによる処理は、ｐＩκＢαレベルを著しく阻害したことが示された。ＭＣＦ７細胞を、増加する期間、５０および１００μＭのＨ２Ｏ２で刺激した。２０分間および４０分間の５０μＭのＨ２Ｏ２刺激は、Ｈ２Ｏ２が添加されていないＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）処理細胞である対照と比較して、高レベルのｐＩκＢαを示した。最高レベルのｐＩκＢαは、１０分の刺激における１００μＭのＨ２Ｏ２処理細胞により示された（図示せず）。したがって、ｐＩκＢαレベルに対する抽出物の潜在効果を調べる最良の条件は、選択された菌類抽出物と一緒の１０分のＨ２Ｏ２刺激において確立された。
【０１２２】
（ＭＣＦ７細胞を、増加する期間、５０および１００μＭのＨ２Ｏ２で刺激した。１０分間隔における１００μＭのＨ２Ｏ２による刺激により、Ｈ２Ｏ２が添加されないＤＭＳＯ処理細胞を用いる対照と比較して、最高レベルのｐＩκＢαが示された。データは、２つの同様の実験の１つの結果を示す）。
【０１２３】
３．２ 細胞生存度に対するコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１粗抽出物の効果
現実験では、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１を調べた。Ｃ．コマトゥス培養液（水）（Ｅ１）および酢酸エチル（Ｅ２）の粗抽出物を、それらのＭＣＦ７細胞系の細胞生存度に影響を与える能力について試験し、ＩＣ５０を計算した。抽出物Ｅ２は、最も強力であるようにみえ、ＩＣ５０は３２μｇ／ｍｌであり、Ｅ１が続き、ＩＣ５０は７６μｇ／ｍｌであった（表６）。これらの結果は、Ｃ．コマトゥスＣＢＳ１２３４０１抽出物の活性部分が、抽出物Ｅ２で濃縮されることを示す。抽出物Ｅ１は、有意な仕方で細胞生存度に影響を与えなかったが、このアッセイにより、抽出物Ｅ２が、Ｅ１よりもより高い増殖阻害活性を示すことが明らかとなっており、Ｅ２が、抗癌活性可能性を有する一部の生物活性化合物を保有し得ることが主張される。
【表６】
【０１２４】
細胞を、増加する濃度のコプリヌス・コマトゥス抽出物で処理した。４８時間後、細胞を採取し、０．４％トリパンブルー溶液（１：１）で染色し、血球計を用いて数えた。細胞生存度の阻害パーセントは、ＤＭＳＯ処理した対照に対して計算した。値（μｇ／ｍｌ）は、２通りの実験の平均ＩＣ５０±標準偏差として表す。
【０１２５】
３．３ ＩκＢαリン酸化に対するコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１粗抽出物の効果
ＮＦ−κＢ経路は、制癌剤発見における最も有望な目標の１つとして浮上してきている。コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１抽出物は、ＮＦ−κＢ活性化経路を調節することが見出された。ｐＩκＢαレベルに対する、Ｃ．コマトゥスの２種の抽出物、Ｅ１およびＥ２の効果を確立するために、ＭＣＦ７細胞を上記のとおりに１００μＭのＨ２Ｏ２で１０分間刺激した。予備データは、１００μＭのＨ２Ｏ２による１０分の処理が、最高レベルのｐＩκＢαを引き起こすことを示した（図示せず）。Ｃ．コマトゥス抽出物を、それらの、Ｈ２Ｏ２による１０分の細胞刺激でＩκＢαリン酸化に影響を与える能力について試験した。結果は、両方の抽出物が、用量依存性様式でＩκＢαリン酸化に有意に影響を与えることを示した。有機抽出物Ｅ２は、用いた両方の濃度（１００および２００μｇ／ｍＬ）でＩκＢαリン酸化の最も活性な阻害剤であるように思われた。図２に示すとおりに、抽出物Ｅ２は、濃度２００μｇ／ｍＬでＩκＢαリン酸化をほぼ完全に阻害し、１００μｇ／ｍＬの濃度でリン−ＩκＢαレベルの部分的な阻害を引き起こした。抽出物の効果は、それもまた高いリン−ＩκＢα阻害効果を実証したクルクミンの効果に匹敵する（図２）。
【０１２６】
これらの結果と対照的に、１００および２００μｇ／ｍｌの濃度での抽出物Ｅ１は、ＩκＢαのリン酸化を部分的に阻害しただけであった（図３）。
【０１２７】
Ｅ２抽出物が、Ｅ１抽出物よりも非常により強力な阻害剤であったということは、脂質可溶性物質が、ＮＦ−κＢ経路の非常に強力な阻害剤であることを示す。
【０１２８】
３．４ ＩＫＫ活性に対するコプリヌス・コマトゥスＥ１およびＥ２抽出物の効果
ＮＦ−κＢの主要な活性化剤は、ＩκＢキナーゼ複合体（ＩＫＫ）である。この複合体は、２つの触媒サブユニット、ＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−β、ならびに調節サブユニット、ＩＫＫ−ｃ（ＮＥＭＯとしても知られる）を包含する。ＮＦ−κＢ経路は、細菌およびウイルス感染、ならびに炎症促進性サイトカインおよびケモカイン（例えば、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−ａ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−６）など）（これらのすべては、ＩκＢαのＮ末端に近い２個の特定のセリンのＩＫＫβによってＩＫＫ複合体リン酸化を活性化し、これは、プロテアソームによるユビキチン化および分解についてＩκＢαを標的とする）によって誘導される。ＮＦ−κＢの活性化をもたらすほとんどすべてのシグナルは、セリン特異的ＩＫＫを含有する高分子量複合体の活性化に集中している。ＩＫＫ複合体の活性化は、ＩκＢαのＮ末端の近くの２つの特定のセリンのＩＫＫβによるリン酸化をもたらし、これは、プロテアソームによるユビキチン化および分解についてＩκＢαを標的とする。
【０１２９】
上記の結果に基づいて、本活性抽出物のＮＦ−κＢ阻害効果は、ＩκＢαリン酸化の上流にあるＮＦ−κＢ経路の調節によると思われた。ＩＫＫ複合体は、セリン３２および３６でＩκＢαをリン酸化し、これは、２６ＳプロテアソームによるＩκＢαのユビキチン化および分解をもたらす。Ｅ１およびＥ２がＩＫＫ活性に影響を与えるかどうかを確立するために、ＥＬＩＳＡベースＩＫＫ活性アッセイを適用した。ＩＫＫ活性に対するＥ１およびＥ２の抽出物の効果は、図４に示す。得られたデータは、Ｅ２抽出物だけが、未処理試料の対照と比較して、ＩＫＫ複合体の活性を阻害することを示した。さらに、Ｅ２は、用いた正の対照、５−（ｐ−フルオロフェニル）−２−ウレイド］チオフェン−３カルボキサミド（Ｆｕｃｔ）の効果、およびＭＯ０４−マラスミウス・オレアデス（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ｏｒｅａｄｅｓ）酢酸エチル粗抽出物に匹敵する、強力な効果を示した。
【０１３０】
（例４）
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の液内培養菌糸体の内容物および化学組成
コプリヌス・コマトゥスの液内培養菌糸体の化学組成は、本技術で周知の従来の方法によって確立し、表７および表８に開示する。
【０１３１】
４．１ 化学内容物
【表７−１】
【表７−２】
【０１３２】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の菌糸体は、１７の遊離のアミノ酸を含有したが、その内の１０個は、必須アミノ酸である（星印を有するもの）：γ−アミノ酪酸＊、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン＊、イソレイシン＊、ロイシン＊、リシン＊、メチオニン＊、フェニルアラニン＊、セリン、トレオニン＊、トリプトファン＊、チロシン、およびバリン＊。
【表８】
【０１３３】
４．２ コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１液内培養バイオマスの多糖類組成の分析
洗浄した細胞を、オートクレーブ中熱水によって１２０℃で１時間抽出した；沈殿物を遠心分離により除去した。少量の溶液を乾燥させ、ＮＭＲで分析した。スペクトル（図５）は、低分子量質量成分の強いシャープなシグナルおよび典型的なタンパク質−多糖類バックグラウンドを示した。この生成物の２次元スペクトルを記録し、低分子量質量成分を、モル比約１：１のトレハロース（α−Ｇｌｃ−１−１−α−Ｇｌｃ、キノコ、例えば、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ）、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｏｎｄｏｓａ）、ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｎａｍｅｋｏ）、およびユダの耳（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａ−ｊｕｄａｅ）などのキノコの特徴的成分（これらは、乾燥重量形態で１％から１７％パーセントのトレハロースを含み得る））、およびマンニトールと同定した。マンニトール含有量は、ＧＣ分析により推定した。マンニトール含有量は、ＧＣ分析により推定した：１％ｗ／ｗのイノシトール（内部標準）を新鮮な細胞に添加し、混合物を無水酢酸ピリジンによって１００℃で１時間アセチル化した。ＧＣ分析は、細胞のマンニトール含有量が３重量％であることを示したが、その結果としてトレハロース含有量は６％である（それは、マンニトールの分子質量の２倍の分子質量を有する）。
【０１３４】
水抽出後の残渣は、５％ＮａＯＨで処理した（１００℃、３時間）；沈殿物を遠心分離により除去した；溶液を透析し、乾燥させた；収量は４００ｍｇであった；タンパク質含有量は３０％であり、炭水化物含有量は５５％であった。
【０１３５】
全細胞、抽出物、および抽出後の残渣の単糖類の分析を行った；結果は表９および図６に示す。細胞および固形物残渣を、濃ＨＣｌに４０℃で１時間溶解させ、次いで、最終酸濃度２Ｍまで水で希釈した。他の試料は、２Ｍ ＨＣｌに直接溶解させた。加水分解を１００℃で２時間行い、生成物を乾燥させ、糖をアルジトールアセテートに変換し（ＮａＢＨ４還元およびＡｃ２Ｏによるアセチル化）、ＧＣで分析した。不溶性β−グルカンは残渣中にそのまま残り、可溶性成分は抽出により徐々に除去されるので、抽出後の固形物残渣のグルコース含有量は増加する。
【表９】
【０１３６】
透析により水抽出物から低分子質量成分を除去することにより、比色試験により決定して２５％炭水化物および４０％タンパク質を含有する生成物が残った（多糖類に対しフェノール硫酸およびタンパク質に対しローリー法）。多糖類は、ＮＭＲスペクトルに基づいて、デンプン、β−グルカン、およびフコガラクタンと同定した。デンプンアミロース（細胞からの２％ｗ／ｗ）は、ＣａＣｌ２沈殿により純粋形態で単離した。ガラクタン含有量は、単糖類分析から３％と推定した。全抽出物、および細胞のフコース含有量は、定量化には低すぎた。ガラクタンの構造は、ＮＭＲおよびメチル化により分析し、以下に示す：
【化１】
【０１３７】
水およびＮａＯＨの抽出物由来の多糖類は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０上でサイズ排除クロマトグラフィーにより部分的に分離した（図７）。デンプンは最初に溶出され、１Ｈ ＮＭＲスペクトルで同定した。ガラクタンも、空隙容積の近くに溶出され、これは、１０，０００Ｄａと推定された、その分子質量についての公表データと一致した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０についての空隙容積（排除容積）は、デキストランについて１０，０００Ｄａである。ガラクタンは、卵形に近く溶出されたが、わずかに保持され（したがって、その分子質量は、排除質量より大きくなかった）、したがって、それは、１０，０００Ｄａの最大質量を有した。それは、より低い質量画分にも示された。
【０１３８】
可溶性β−グルカンは、明確で支配的な質量はもたずに１０，０００から１０００未満の広い分布の分子質量を有した。クロマトグラフ（図７）からわかるように、β−グルカンは、Ｓｅｐｈａｆｅｘ Ｇ−５０の全分画範囲にわたって、空隙容積から塩までの非常に広いピークとして選定された（５００〜１０，０００Ｄａ）。純粋なβ−グルカンを調製することはできなかった；それは、いくらかの量のデンプン、ガラクタン、およびタンパク質を含有した。アニオン交換クロマトグラフィーでは、タンパク質の部分の除去のために、スペクトル品質が改善されたが、多糖類は完全に分離しなかった。グルカンの低分子質量のために、いくらかの量のグルカンは、透析およびゲルクロマトグラフィーの間に失われた。
【０１３９】
β−グルカンのメチル化分析により、末端、３−、４−、６−、および３，６−置換グルコース残基の２：１：０．３：３：１の比での存在が示された。メチル化分析により、側鎖は、主鎖のあらゆる第３のグルコースに結合していること、および側鎖の平均長は、３糖（ｔ−Ｇｌｃ：６−Ｇｌｃ 約１：２、３−Ｇｌｃ：３，６−Ｇｌｃ 約２：１）であることが示唆される。４−および４，６−置換Ｇｌｃの存在は、デンプンに由来し得る。２−および２，６−置換Ｇａｌのピークは、ガラクタンに属した。
【０１４０】
β−グルカン画分のＮＭＲ分析は、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）グルカンに対するその類似性を示した（図８および表１０）。その構造を以下に示す：
【化２】
（式中、ｍは、１から約１０の間の整数であり、ｎは、約３に等しい整数である）。
【０１４１】
デンプンおよび不溶性β−グルカンの含有量の定量化について、Ｍｅｇａｚｙｍｅアッセイ「Ｍｕｓｈｒｏｏｍ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎ」を用いた。測定は、製造者の説明書に従って行った。細胞、水抽出細胞、水およびＮａＯＨ抽出細胞、水抽出物ならびにＮａＯＨ抽出物の試料を分析した。結果は、表１１に示す。Ｍｅｇａｚｙｍｅアッセイ「Ｍｕｓｈｒｏｏｍ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎ」は、加水分解および酵素処理の組合せにより放出された全グルコースの測定、ならびにデンプン含有量の別個の測定に基づく。β−グルカン含有量は、最初の２つの数字の差として計算する。β−グルカンの直接の測定は、用いなかった。
【表１０】
【表１１】
【０１４２】
結論
この試験の結果は、コプリヌス・コマトゥスが、ガノデルマ・ルキドゥム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）キノコから抽出された可溶性β−グルカンと類似している、１，６−結合側鎖を有するβ−１−３−グルコース主鎖を有するβ−グルカンを産生することを示す。Ｃ．コマトゥスは、フコガラクタン、デンプン、トレハロースおよびマンニトールも産生し；これらの成分のすべては、キノコに以前に見出されたものである。可溶性β−グルカンは、低分子質量を有し、熱水で容易に抽出可能である。
【０１４３】
４．３ レクチン含有量。試験した種コルピヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１バイオマスは、赤血球凝集能を有する（表１２）。非常に高いレクチンの赤血球凝集力価（１８５８５）が、Ｃ．コマトゥスからのバイオマス抽出物から明らかになった。Ｃ．コマトゥスの特異的な赤血球凝集能は、６２７００Ｕｍｇ−１に達した。
【表１２】
【０１４４】
データは、ラクトース、続いてＧａｌＮＡｃおよびガラクトースが、試験キノコのレクチンの赤血球凝集能の最も広範囲に及ぶ阻害剤であることを示す。ラクトースは、菌類の最も強力な阻害剤であった。ラクトースは、０．７８ｍＭの濃度でＣ．コマトゥスのレクチン活性を阻害した。同時に、キシロース、セロビオース、およびズルシトールは、コプリヌス・コマトゥスバイオマスのレクチン赤血球凝集能を阻害しなかった。
【０１４５】
得られた結果は、Ｃ．コマトゥスは、バイオマスおよび子実体におけるレクチンを蓄積する能力を有することを示した。特に、高い赤血球凝集能が、Ｃ．コマトゥスで明らかとなった。キノコレクチンに対する糖特異性の決定は、ラクトース結合レクチンが、試験菌株の中で最も広範囲に及ぶことを示した。
【０１４６】
（例５）
品種トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の特性
純粋培養における植物性菌糸体。菌糸体コロニーは、白く、綿状で、しばしば、「タフト」（菌糸集合体）を成熟とともに発達させる。非対称に形状化して、通常、外側端部に沿って菌糸体マットを形成する。クランプ連結、融着、および髪様結晶がしばしば、菌糸上にしばしば存在する。
【０１４７】
担子果はしばしば、大きく且つ顕著であり、２〜１０ｃｍ幅および最大５ｃｍの高さ、ほとんど単独、ゼラチン質、若いとき脳の形をしており、湿っており、その後、葉状であり、不規則なクラスター襞を有し、いくつかの波状のひだのある列片からなり、新鮮な標本は黄色から黄色っぽいオレンジ色であり、湿潤のまたは暗い環境で、時に白っぽくまたは全体に無着色および老齢で白色であり、乾燥時に黄色がかったオレジン色からより暗色になる。子実層表面は滑らか、大体つややか。葉肉はゼラチン質で軟らかい。菌糸系は、単一菌糸型。菌糸は、豊富なクランプ連結を有し、ガラス質、薄肉から厚肉、ほとんど１．５〜３μｍ幅、担子果の内部はいくらか広く、ゼラチン化。吸収管細胞は、球形から長楕円、３〜６×２〜４μｍ幅、通常、若い試料を除いて存在し、付着点の近くに豊富。担子器、２種類：１）広く楕円からゆがんだ球形、１０〜２５×１０〜２２μｍ；２）卵形からこん棒形、２０〜３０（〜３５）×１２〜２０μｍ；垂直方向にまたは斜めに隔壁、４胞子、小柄１００〜１５０×２〜３μｍ幅を有し、最大７μｍまで先端に膨らんでいる。担子胞子は、広く楕円から長楕円、（８〜）１０〜１６（〜１８）×（５〜）７〜１０（〜１２）μｍ、滑らか、ガラス質、薄肉、明らかな尖端、メルツァー試薬（Ｍｅｌｚｅｒ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）に陰性。分生子柄は、密集して分岐、しばしば子実層に豊富、特に若い標本に存在。分生子は、ゆがんだ球形から卵形、および３〜５×２．５〜３．５μｍ、または楕円から円筒形、直径３〜５×（１〜）２μｍ、滑らか、ガラス質、しばしば多数。嚢状体は、通常なし、時に発育の早期に存在、薄肉からわずかに厚肉、最大３．５（〜４）μｍ幅。小胞は、形状および大きさが変わりやすく、球形から楕円形、大部分２０〜３０×５〜１０μｍ、厚肉。胞子紋は、白っぽいまたは浅黄色っぽい。
【０１４８】
生息場所：広葉樹材の朽ちた枝、幹、および切り取った枝の上。
【０１４９】
トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６は、特別の生活環を有する。他の高等担子菌類キノコと対照的に、単一の担子胞子が、菌糸および酵母様出芽性細胞によって栄養培地ブロス上で発芽する。モノ担子菌（Ｍｏｎｏｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｕｓ）培養物は１倍体であり、すなわち、各細胞に１個の核のみを含有する。異なる担子胞子に由来する、２つの和合性１倍体細胞は、接触すると、細胞質体融合および核合体が生じ、核異型菌糸体が発生する。核異型菌糸体は、培養のいかなる条件下でも、出芽性細胞の形態で発育できず、したがって、発育の酵母様型は、キノコ培養物の１倍体状態によって遺伝学的に決定される。貧培地上または枯渇酵母様細胞の状態下で、細胞は１倍体菌糸を生成し得るので、１倍体培養物は、より形成性である。他の微生物のように、単細胞菌類培養物は、菌糸体のものよりバイオテクノロジー処理をより受け入れられる。これは、滅菌菌糸体の形態で発育する担子菌類核異型培養物に特に重要であり、核異型菌糸体の均質化を包含する、担子菌類接種物を調製するための特別の手順が必要とされる。本発明の１倍体酵母様出芽性培養物は、バイオテクノロジーの考慮からだけでなく、菌糸体形態よりも大量の多糖類を生産するその生理学的属性で規定されるように、発育の最適な形態である。
【０１５０】
（例６）
薬用ゼリー状キノコのトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６純粋培養物の発育および生合成活性の制御
トレメッラ・メセンテリカの子実体は、担子胞子紋発達のために採取した。子実体は、クェルクス属の種の死んだ小枝上のペニオポラ属の種（Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ ｓｐ．）に関係した。この標本から得られた１倍体酵母様培養物は、寒天培地上で速い発育を示し、それらの１４個を液内培養条件で一次選別のために用いた。選択された菌株は、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の名称下で、Ｈａｉｆａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＨＡＩ）に寄託されている。
【０１５１】
液内培養条件における選択菌株バイオマス発育のための最適なｐＨ値は、５．５から中性を意味する値（ｎｅｕｔｒａｌ ｍｅａｎｉｎｇ）の範囲で決定された。バイオマスの最大収量は、ｐＨ６．３５を有する液体麦芽抽出物培地上で得られた。
【０１５２】
バイオマス蓄積に好適な培地組成物の最適化により、スクロースが、グルコースと同様に適切な炭素源であることが実証された。
【０１５３】
ペプトンおよび酵母抽出物の混合物は、良い窒素源であるが、前に調べたアンモニウム塩は、培地のｐＨを非常に急速に低下させた。リン塩の添加は、バイオマスの収量増加をもたらさなかったので、それらは、細胞成長のためのリンも十分に含有した。酢酸マグネシウムは、ＭｇＳＯ４より生理学的にアルカリ性と考えられ、事実、培地の急速な酸性化を防止した。
【０１５４】
わずかに改変した培地は、以下の組成（ｇ／ｌ）：スクロース−２０．０；ペプトン−２．０；酵母抽出物−２．２５；酢酸Ｍｇ−１．０；ＫＣｌ−１．０の標準「接種培地」としてさらに用いた。１２０℃で３０分間滅菌後の培地のｐＨは、６．５に近い。
【０１５５】
「発酵培地」の最適組成は、以下のとおりであることが見出された：トレメッラ・メセンテリカを、部分Ａ（（ｇ／Ｌ）スクロース、５０．０；酵母抽出物 ０．５；ＫＣｌ、１．０；酢酸Ｍｇ・４Ｈ２Ｏ、１．０からなる）と部分Ｂ（（ｇ／Ｌ）ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．５およびＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０からなる）を混合することにより調製した培地中で培養した。
【０１５６】
溶液が、滅菌後に室温まで冷えたときに、部分Ｂを、部分Ａを含むフラスコに添加した。
【０１５７】
Ｔ．メセンテリカの培養は、７２時間継続し、その時点で、培養液中のＴＭＰは、２７．０ｇ／ｌに達した（表１３）。沈殿後、分離させ、乾燥させて、１７０ｇのＴＭＰ調製物が得られた。
【表１３】
【０１５８】
（例７）
トレメッラ・メセンテリカの内容物および化学組成
７．１一般的組成。トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６液内培養粗生産物は、等しい割合の菌株生産体および細胞外多糖グルコロノキシロマンナンの、細胞バイオマスからなった。この場合の一般的組成を、表１４に示す。
【表１４】
【０１５９】
化学組成は、イスラエルにおける２つの異なった、独立した施設（Ｂａｃｔｃｈｅｍ ＣＯ．およびＡｍｉｎｏｌａｂｓ Ｃｏ．）で決定し、表１５から表１７に開示する。
【表１５】
【表１６】
【０１６０】
７．２ 粗食物繊維は、ヘミセルロース、低分子多糖類（デキストリンなど）、および細胞壁成分（β−（１−３）−グルカンなど）を包含する。
【０１６１】
７．３ ビタミン。トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のバイオマスでは、ビタミンＡ（レチノール）、Ｃ（アルコルビン酸）、Ｅ（α−トコフェロール）、およびビタミンＢ群が見出された。
【表１７】
【０１６２】
ビタミンＢ群の中で、感受性栄養要求体微生物の成長特性の推定に基づく、微生物学的方法で決定して、Ｔ．メセンテリカバイオマスは、ナイアシンに特に富んでおり、且つビタミンＡに富んでいる。
【０１６３】
７．４ トレメッラ・メセンテリカ（ＣＢＳ１２３２９６）中グルカンおよびグルクロノキシロマンナン
組成は、全トレメッラ・メセンテリカ液内バイオマス、および超遠心分離後に得られた画分のＧＣ分析（グルコース、マンノースおよびキシロースの含有量）により決定した。グルカンは、１２００００ｇで完全に沈殿し、グルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）は溶液中に大部分残存するが、同様に部分的に沈殿する。ＧＸＭは、多糖バイオマスの乾燥重量の約７０％、グルカンは約３０％を構成することがわかった。
【０１６４】
ＧＸＭを含まない純粋グルカンは、高出力超音波により処理したトレメッラ・メセンテリカの分離により得た。超音波処理ＧＸＭは、水により良く可溶性であり、超遠心分離で沈殿せず、したがって、純粋β−グルカンは、２回の再沈殿後に単離することができる。１．２ｇのトレメッラ・メセンテリカの分離により、４００ｍｇの沈殿物（約１０％のＧＸＭを含むグルカン）および８００ｍｇの可溶性生成物（ＧＸＭ）が得られた。
【０１６５】
ＧＣ分析において、ＧＸＭ含有量は、（Ｍａｎ＋Ｘｙｌ）＊１．３（１．３は、ＧｌｃＡおよび酢酸塩を補償するために用いた）と見なした。新たに単離したトレメッラ・メセンテリカ（ＣＢＳ１２３２９６）中のグルクロノキシロマンナンの構造は、他のトレメッラ・メセンテリカ菌株から単離したグルクロノキシロマンナンといくらか異なっていることがわかった（図示せず）。グルカンは、グルコース含有量から推定した。グルクロノラクトンのＧｌｃへの還元を避けるために、加水分解は、ＮａＢＨ４による還元前に２４％ＮＨ３で処理した。グルカンは、加水分解に用いた３Ｍ ＴＦＡに十分可溶性でないので、他の組の試料を加水分解前に濃ＨＣｌで処理した（４０℃、１時間）。この手順は、Ｇｌｃ回収の増加をもたらすが、キシロースは、一部分は分解する。
【０１６６】
β−グルカンのメチル化により、これは３−および４−置換グルコースを主成分として有する直鎖状構造を有することが示された（図９および図１０）。したがって、グルカンは、３，４−β−グルカンである。グルカンは、ＤＭＳＯに十分可溶性ではなく、したがって、それを２回メチル化した；依然として一部の部分は、溶解しなかったが、これは、結果に影響し得る。グルカンは水に可溶性ではない。
【０１６７】
（例８）
トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６調製物のインターフェロン生成および免疫調節特性
１８〜２０ｇの体重の雑種マウスを試験に用いた。これらのマウスに、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の液内単細胞バイオマスによって、餌を経口で与えた。
【０１６８】
マウスを、本調製物で処理６時間後、２４時間後および４８時間後に殺し、次いで、血漿を採取し、インターフェロン（ＩＦＮ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レベルを決定し、腹膜の滲出液のマクロファージは、本調製物に対する食作用系機能活性応答を調査することを目的とした。
【０１６９】
８．１ 血漿ＩＦＮレベル
インターフェロン生成特性は、表１８に示し、経口によりマウスに投与した４ｍｇ／動物でのバイオマスの単回用量は、２４時間後に低力価（８０単位／ｍｌ）の内因性ＩＦＮの合成を誘導したことを示す。上記用量のトレメッラ・メセンテリカバイオマスで処置した動物の血清中のＩＦＮレベルは、４８時間後に８０単位／ｍｌに増加したままであった。
【０１７０】
１０ｍｇ／動物の用量でのトレメッラ・メセンテリカバイオマスは、より活性であるように見え、投与６時間後に８０単位／ｍｌの内因性ＩＦＮ力価の生成を生じさせた。本調製物投与２４時間後に、動物血清中のＩＦＮ力価は、最大１６０〜３２０単位／ｍｌに達した。さらに（４８時間で）、血清ＩＦＮのレベルは、低下したが、対照の指数と比較して上昇したまま（８０単位／ｍｌ）であった。
【表１８】
【０１７１】
本試験で決定された血漿中の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レベルによれば、トレメッラ・メセンテリカバイオマスは、インビボでこのサイトカインの合成をもたらさなかった（図示せず）。同時に、これらの調製物は、内因性の体中毒を低下させることを補助し得る。これは、対照マウスの血漿中で検出されたＴＮＦによって証明される（生理溶液の導入で）。本調製物の使用は、対照動物の血漿中のＴＮＦの量の低下をもたらした。
【０１７２】
８．２ トレメッラ・メセンテリカバイオマスに対する腹膜滲出液のマクロファージの機能活性の応答。腹膜浸出液のマクロファージの機能活性は、ニトロブルーテトラゾリウムの非基質還元の反応である、Ｎｉｔｒｏ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）試験で評価した。ＮＢＴ試験は、マクロファージのＮＢＴ還元能の低下が、それらの酸素依存性殺生物特性の病理学と同時に起こるため、マクロファージの機能活性の調査によく使用される。ＮＢＴ試験におけるマクロファージの活性は、インビトロでの追加の細胞刺激なしで（自発的試験）およびＳｔ．アウレアス（Ｓｔ．ａｕｒｅａｓ）細胞と一緒のインビトロでのそれらの刺激によって（刺激試験）調査した。刺激ＮＢＴ試験は、食作用を完了するための容易性の細胞化学的基準と見なされる。自発的および刺激ＮＢＴ試験の指数の間の差は、細胞機能リザーブ（ＦＲ）とみなし、これは、一般的な免疫リザーブ（ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｒｅｓｅｒｖｅ）についての概念に良く当てはまる、食細胞系のエフェクター潜在性を反映する。
【０１７３】
経口で投与された４および１０ｍｇ／動物でのトレメッラ・メセンテリカバイオマスの単回用量は、自発的および刺激ＮＢＴ試験における腹膜滲出液のマクロファージの酸素依存性殺生物活性指数を変更することが見出された（表１９）。トレメラスチン（Ｔｒｅｍｅｌｌａｓｔｉｎ）の食細胞活性応答は、用量および観察時間に依存したことが言及されるべきである。例えば、４ｍｇ／動物用量のトレメッラ・メセンテリカバイオマスを投与して６時間後に、酸素依存性殺生物活性およびマクロファージのＦＲのわずかな低下が、自発的および刺激ＮＢＴ試験の両方で生じた。表１９に示すデータは、２４時間後および４８時間後に、自発的ＮＢＴ試験の指数は増加して、４ｍｇ／動物でのトレメッラ・メセンテリカバイオマスの応答における対照指数値に達したことを示す。しかし、対照と比較して、示された観察期間（２４時間および４８時間における）の間に刺激ＮＢＴ試験において、マクロファージ活性の酸素依存性殺生物活性の劇的な増加が生じ、これは、それらのＦＲの顕著な増加をもたらした。
【表１９】
【０１７４】
トレメッラ・メセンテリカバイオマスの１０ｍｇ／動物の単回用量に対する応答において、自発的ＮＧＴ試験の指数のわずかな増加が６時間後に観察されたが、２４時間後および４８時間後に、その値は対照指数レベルまで低下した。同時に、マクロファージ活性の顕著な増加が、刺激ＮＢＴ試験で全体の観察期間の間に、６時間、２４時間および４８時間で観察された。１０ｍｇ／動物のトレメッラ・メセンテリカバイオマスで処理されたマウスマクロファージの刺激ＮＢＴ試験指数の増加は、ＦＲ細胞の劇的な増加をもたらした。表１９からのとおりに、ＦＲ増加は６時間後に起こり、４８時間で最大に達した。
【０１７５】
本発明者らの研究から分かるように、トレメッラ・メセンテリカバイオマスは、自発的ＮＢＴ試験の指数に対して影響は少なかったが、それは、刺激ＮＢＴ試験で、マクロファージ活性の顕著な増加を引き起こし、このようにして、食細胞系のリザーブ潜在力を増加させた。
【０１７６】
本発明者らの調査の結果から分かるように、自発的ＮＢＴ試験における６時間後のマクロファージの酸素依存性殺菌活性は、対照と比較して変わらないままであった。同時に、刺激ＮＢＴ試験指数は、６時間後に増加し、これは、細胞ＦＲの顕著な増加をもたらした。２４時間後、自発的ＮＢＴ試験指数は、対照と比べて変わらないままであり、刺激試験の指数は、増加する傾向があり、細胞のＦＲも変わらないままであった。
【０１７７】
８．３要約。本調査の結果の分析によれば、トレメッラ・メセンテリカバイオマス調製物の４および１０ｍｇ／動物の単回用量により、少しのインターフェロン生成活性がもたらされ、「遅い」内因性インターフェロンの生成が誘導される。トレメッラ・メセンテリカバイオマス調製物は、より活性なインターフェロノージェンであるように見え、さらに、それは、１０ｍｇ／動物に濃縮した場合、最も効率的である。トレメッラ・メセンテリカバイオマス調製物の１０ｍｇ／動物に対する応答では、血清中のインターフェロン力価のピーク値（１６０〜３２０単位／ｍｌ）に２４時間で到達し、次いで、これは、観察の全期間中に依然として高いままで低下した。トレメッラ・メセンテリカバイオマスは、動物体におけるインターフェロンの少量の生成を準備し、開始させる、すなわち、他のインターフェロノージェンと一緒に注射される場合、インターフェロン合成を強化することが予期される。
【０１７８】
トレメッラ・メセンテリカバイオマスへの応答におけるＮＢＴ試験での腹膜滲出液マクロファージの機能活性強化が観察された。１０ｍｇ／動物に濃縮されたトレメッラ・メセンテリカバイオマスは、マクロファージの酸素依存性殺生物活性の最も効率的な活性化剤であると思われた。本調製物は、刺激ＮＢＴ試験指数の増加をもたらし（自発的ＮＴ試験の変わらない指数において）、これは、食細胞系の機能リザーブの劇的な増加をもたらした。食細胞系のリザーブ潜在力の増加は、日和見細菌またはウイルス誘導感染の発生を予防するために重要であることが言及されるべきである。体のさらなる病原菌誘導の汚染を予防する可能性もある。マクロファージのより高い殺菌活性ならびにより高い機能リザーブ（自発的および刺激ＮＢＴ試験の指数の間の差を有する）は、体におけるインターフェロン生成と相関したトレメッラ・メセンテリカバイオマス調製物を説明するものであった。これに関しては、食細胞が体におけるＩＦＮ作用の主な標的であるので、酸素依存性マクロファージ殺生物活性の活性化は、トレメッラ・メセンテリカバイオマス（および、恐らくは他のサイトカイン、これには、さらに調査が必要である）による内因性ＩＦＮの誘導と関連する。さらに、本調製物で活性化された食細胞は、自己分泌および傍分泌の活性化技術によって内因性ＩＦＮの生成に関与することができることがあり得る。
【０１７９】
（例９）
植物ウイルスに対する植物抵抗性に対するトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６抽出物およびグルクロノキシロマンナンの効果
担子菌類の培養液および子実体から単離した多糖類の化学特性を研究したとき、本発明者らは、中性および酸性多糖類を明らかにした。特に、トレメッラ・メセンテリカにより産生されるグルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）の酸性多糖は、キシロースおよびグルクロン酸のβ−（１→２）（１→４）−結合オリゴ糖によりグリコール化された、α−（１→３）−結合マンナンの直鎖状骨格からなり、これは、ポリアニオン特性を与える。既知のデータに基づいて、中性および酸性グルカンは、抗植物ウイルス活性の異なる特性を有すると想定することが可能である。
【０１８０】
実際、調査した多糖類は、チョウセンアサガオ植物に対してＴＭＶにより誘導された局所損傷の発生を異なって阻害した（表２０）。
【０１８１】
中性多糖類は、最も活性であることが証明された。局所損傷形成の低下は、最大８０および９９．４％（１００〜１０００μｇ／ｍＬの濃度において）であった。ＧＸＭは、活性がかなり低く、この場合、全調製物は、中間位置を占め、ＴＭＶの感染性に対する全調製物の活性は、中性多糖類によってより大きな程度に誘導されることの証拠を明らかにした。後者により、超感受性植物におけるウイルス感染性に対する中性多糖類が、それらの硫酸塩誘導体よりもより活性である、文献からのデータが確認され、これは、新たに植物のウイルス抵抗性を主に誘導する。得られた結果に基づいて、硫酸化マンナンと類似であるＧＸＭが、ウイルスに対する植物の遺伝学的依存抵抗性を誘導し得るかどうか調査することが重要である。１０００〜２５００μｇ／ｍＬの濃度でのＧＸＭは、ＴＭＶに対するタバコおよびチョウセンアサガオ植物の抵抗性を誘導し得ることがわかった（表２１）。この場合、ＡＶＲは、チョウセンアサガオ植物におけるよりもタバコ植物においてより高いようにみえた。言い換えれば、本多糖類によるＡＶＲの活性化は、超感受性宿主植物の遺伝子型に、その結果として、抵抗性の適切な遺伝子の活性に依存する。
【表２０】
【０１８２】
抵抗性発生の調査により、１０００および２５００μｇ／ｍＬの濃度でのＧＸＭは、誘導剤による接種後の最初の日に既にタバコ植物におけるＴＭＶに対するＡＶＲの発生を誘導することが示された（図１１および図１２）。植物組織における継続した多糖類存在下で１０００μｇ／ｍＬに等しかった、ＧＸＭの濃度について、抵抗性のレベルは、３０％に−第５日目において、および２０％に−第７日目において徐々に低下する（図１１）。２５００μｇ／ｍＬに等しかった、ＧＸＭの濃度について、このような傾向は観察されない（図１２）。対照的に、この事実は、遺伝子レベルでのＡＶＲの多糖類誘導の濃度依存性対してだけでなく、より低いおよびより高い濃度のＧＸＭに適合する植物の種々の能力について証拠を与え得る。
【表２１】
【０１８３】
実験および対照の半分の葉上のＴＭＶ局所損傷の大きさの測定に基づいて、２５００μｇ／ｍＬの濃度で、ＧＸＭは、ウイルス損傷の増大を強めることが明らかになった（図１３）。このＧＸＭの濃度で、壊死の増加の確実な刺激が、植物組織中へ誘導剤を接種してからわずか７日後に観察されるが、このような傾向は、多糖類使用の他の期間に観察される。１０００μｇ／ｍＬの濃度のＧＸＭで処理した半部の葉について、実験と対照の間の局所損傷の大きさの確実な差は、観察されなかった。
【０１８４】
局所壊死の増大に対する同様の影響が、酵母ＲＮＡによってもたらされることが知られている。この現象は、誘導剤の影響下での抵抗性の超感受性機構の植物における活性化によって説明され得る。
【０１８５】
アクチノマイシンＤ（ＡＭＤ）による実験において、この抗生物質が、植物のＧＸＭ誘導ウイルス抵抗性の発生を阻害することが確立された（図１４）。その適用の方法に係わらず（ＧＸＭの導入と同時にまたは２日後に）、ＡＭＤは、部分的に（２０μｇ／ｍＬ）または完全に（１０μｇ／ｍＬ）のいずれかで、ポリアニオンで誘導されたＡＶＲの発生を阻害した。２０μｇ／ｍＬの濃度のアクチノマイシンＤによるＡＶＲの不完全な阻害は、植物組織に対する抗生物質毒性に起因し得る。後者は、ＡＭＤがＧＸＭの不存在下で葉に注射された、対照における壊死の数の低下で確認される。
【０１８６】
全体として、得られた結果は、ＧＸＭによって超感受性植物中に接種されたＡＶＲは、細胞ＤＮＡのマトリックス上の新たなＲＮＡの合成に依存するという結論になる。言い換えれば、ＤＮＡが、新たにウイルスに対する植物抵抗性を活性化させるそれら誘導剤に帰することができる。
【０１８７】
したがって、ＧＸＭは、新たにウイルス感染の作用に対する超感受性タバコ植物の抵抗性を誘導するが、この抵抗性は、アクチノマイシンＤの作用に感受性であるからであることが確立された。一方、その活性は、以前に研究した硫酸化多糖類および酵母ＲＮＡの作用と同様であり；他方、その活性は、タンパク質−炭水化物相互作用に基づく超感受性機構を活性化する中性多糖類と同様である。
【０１８８】
植物における自然なおよび誘導された抵抗性の機構が、全体として、総合的に研究されてこなかったことを考慮して、自然なウイルス抵抗性を増加させることができる物質の探索が有望である。本発明者らの見解では、このような研究の結果は、多糖類およびまた糖タンパク質が、超感受性植物におけるＡＶＲの活性化に関与する内因性誘因のモデルとして将来使用することができるので、重要性を有する。このような物質は、農業および観賞植物生育におけるウイルス感染の損傷を低下させる目的をもつ実際の適用にとっても興味深い。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬用キノコ、より具体的には、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）およびトレメッラ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ）属の種のキノコ、ならびにコプリヌス・コマトゥス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６と命名された、新規で明確な高等担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）の菌株に関する。本発明はさらに、種々の生物活性化合物を含むこれらの新規な菌株由来の、子実体、液内培養菌糸体または単細胞バイオマス、および抽出物、ならびにヒトおよび動物の食餌療法用サプリメント、プレバイオティクス（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃｓ）、美容食品として、およびいくつかの疾患および状態の処置におけるそれらの使用、ならびに抗植物ウイルス剤に関する。
【０００２】
背景技術
キノコのバイオテクノロジー生産物は、人間の福祉に対して、例えば、食品、健康強壮剤および薬剤、飼料および肥料として、ならびに環境を保護および再生するために、多くの有益な効果を有する。強力で、独特な健康増強特性を持つ医薬物質が、薬用キノコから最近単離され、世界中に広まっている。それらの多くは、医薬品であるが、他のものとしては、新規なクラスの食餌療法用サプリメント、または「キノコ栄養補給剤」もしくは「栄養補助剤」、菌化学物質、植物化学物質、およびデザイナー食品が示される。いくつかの抗腫瘍多糖類、例えば、ヘテロ−β−グルカンおよびそれらのタンパク質複合体（例えば、キシログルカン、およびウロン酸を含有する酸性β−グルカン）、ならびに食物繊維、レクチン、およびトリテルペノイドが、薬用キノコから単離されている。
【０００３】
高等担子菌類キノコは、多量の多糖類、特に種々の種類のタイプのβ−グルカンを含有する。β−グルカンの抗腫瘍効果は、それらの分子量および溶解度に関係していると思われる。例えば、低分子量レチナンだけが高い抗腫瘍活性を示す。可溶性β−グルカンは不溶性のものよりも強い免疫刺激剤のようであるが、これは驚くべきことではない。
【０００４】
トレメッラ属の一部の種、液内培養単細胞バイオマスおよび子実体、特に、Ｔ．メセンテリカの菌株は、高レベルのグルクロノキシロマンナンおよびβ−グルカンを含有し、そのバイオマスおよび精製多糖類は両方とも、血糖降下およびトリグリセリド降下の活性を有することが示された（米国特許第６，３８３，７９９号；米国特許第６，３６２，３９７号）。
【０００５】
高等担子菌類キノコは、多量の多糖類、タンパク質、バランスの取れた必須アミノ酸、メラニン、必須脂肪酸を含む脂質、トリテルペノイド、抗酸化剤、ビタミン、および他の生物活性物質を含有する。また、グルカン、キチン、およびヘテロ多糖類（ペクチン物質、ヘミセルロースまたはポリウロニドを含む）に属する食物繊維は、キノコすべての組織に豊富にあり、これらは、腸内の胆汁酸または有害物質を吸収することができ、したがって、制癌物質として作用し、且つ様々な種類の毒作用を低下させることができる。
【０００６】
さらに、菌類物質は、（ｉ）様々な生理学的および病理学的過程で重要な役割を果たすＮＦ−κＢ活性化経路のモジュレータ；（ｉｉ）酸化性ストレス反応によって引き起こされる酸化損傷を防止または減少させるためのヒト用食餌におけるサプリメントとして適切な抗酸化物質；（ｉｉｉ）免疫モジュレータとして；および炎症過程に影響を与えることで知られている。
【０００７】
発明の概要
本発明は、ブダペスト条約下、Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）にアクセション番号ＣＢＳ１２３４０１で寄託されたコプリヌス・コマトュスＨＡＩ−１２３７（以下、コプリヌス・コマトュスＣＢＳ１２３４０１）、およびブダペスト条約下、Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）にアクセション番号ＣＢＳ１２３２９６で寄託されたトレメッラ・メセンテリカＨＡＩ−１７（以下、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６）から選択される、新規で明確な品種の高等担子菌類キノコを対象とする。
【０００８】
他の側面では、本発明は、炭水化物、必須アミノ酸に富んだタンパク質、ビタミン、必須脂肪酸に富んだ脂質、抗酸化剤およびミネラルを包含する、栄養補給剤および生物活性物質に富んだ本発明のキノコのバイオマスに関する。このバイオマスは、コプリヌス・コマトュスＣＢＳ１２３４０１の子実体もしくは菌糸体、またはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から得ることができる。トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体培養物は、単細胞バイオマスの形態である。
【０００９】
さらなる側面では、本発明は、栄養補給剤活性および生物活性を有する本発明のキノコからの抽出物に関する。抽出物は、このキノコの菌糸体または子実体から得ることができる。
【００１０】
さらに他の側面では、本発明は、抽出物から単離された新規な炭水化物、本発明のキノコ由来のバイオマスもしくは抽出物、または該抽出物から単離された新規な炭水化物を含む組成物、本発明の組成物を含む自然食品サプリメント、医薬、プレバイオティクス、栄養補給剤、飲料または美容製品、薬学的に許容される担体ならびに本発明の組成物および新規な炭水化物の１種から選択される活性成分を含む医薬組成物、ならびに該バイオマスおよび抽出物を生産する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】発酵装置中、またはバイオリアクター技術におけるコプリヌス・コマトゥスまたはトレメッラ・メセンテリカの液内培養菌糸体生産のための全般的な方法論のスキームを示す図である：ａ−ペトリ皿用の標準寒天培地の調製；ｂ−培養物の調製に用いられる胞子または子実体の部分；ｃ−ペトリ皿上の培養物；ｄ−チューブ中寒天斜面上の培地；ｅ−培地の顕微鏡調査；ｆ−２５０ｍＬ三角フラスコ中接種前培養物；ｇ−接種前培養物の均質化；ｈ−２Ｌ三角フラスコ中における均質化菌糸体バイオマスの培養；ｉ−接種発酵装置培地用の菌糸体バイオマスの均質化；ｊ−発酵装置用の発育培地；ｋ−発酵装置中菌糸体バイオマスの培養；ｌ−菌糸体バイオマスの収穫；ｍ−食餌療法用サプリメント（ＤＳ）、医薬品および他の製品のための乾燥バイオマス処方物；ＨＭ、収穫菌糸体。
【図２】ウエスタン免疫ブロットにより決定したｐＩκＢαレベルに対するＥ１およびＥ２の抽出物の効果を示す図である。この図は、同様の結果を有する２つの独立した実験を代表する。Ｅ１−培養液（水）抽出物；Ｅ２−酢酸エチル抽出物。
【図３】１００μＭのＨ２Ｏ２効果と比較したｐＩκＢαに対するＥ１およびＥ２の抽出物の効果を示す図２のウエスタン免疫ブロットのデンシトメトリー分析を示す図である。（結果は、Ｈ２Ｏ２のみ−処理の平均値±標準偏差に対する２つの独立した実験の倍数として示す）。
【図４】コプリヌス・コマトゥス抽出物Ｅ１およびＥ２のＩＫＫβ阻害活性を示す図である。抽出物Ｅ１およびＥ２（１００および２００μｇ／ｍｌ）ならびに６００ｎＭのＩＫＫ−β阻害剤Ｆｕｃｔ（１μＭ）を、１００ｎｇのＧＳＴ−ＩκＢα基質および５ｎｇのＩＫＫ−β酵素とともにインキュベートし、それらのＩＫＫ−β活性を阻害する能力について、材料および方法において記載されるとおりにＥＬＩＳＡベースキナーゼ活性アッセイを用いて試験した。Ｅ１−培養液（水）粗抽出物；Ｅ２−酢酸エチル粗抽出物。
【図５】コプリヌス水抽出物の１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図６Ａ】水抽出物の単糖含有量のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を示す図である。
【図６Ｂ】全細胞の単糖含有量のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を示す図である。
【図６Ｃ】水抽出後の細胞の単糖含有量のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を示す図である。
【図６Ｄ】ＮａＯＨ抽出後の細胞の単糖含有量のガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析を示す図である。
【図７】Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０上でサイズ排除クロマトグラフィーにより部分的に分離された、コプリヌス・コマトゥスの水およびＮａＯＨ抽出物由来の多糖類のサイズ分離クロマトグラムを示す図である。
【図８Ａ】ガノデルマ属の種（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）から抽出したβ−グルカンのメチル化分析を示す図である。
【図８Ｂ】コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１から抽出したβ−グルカンのメチル化分析を示す図である。
【図９】トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６から単離したβ−グルカンから得られたメチル化糖類のＧＣトレースを示す図である。
【図１０Ａ】トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の新たに単離した菌株から得られたメチル化糖類のＧＣトレースを示す図である。
【図１０Ｂ】純粋グルクロノキシロマンナンのＧＣトレースを示す図である。
【図１１】タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）と比べて品種Ｉｍｍｕｎｅ５８０のタバコ植物の敏感さに対するＧＸＭ（１０００μｇ／ｍＬ）の効果を示す図である。横座標：ＧＸＭの導入とＴＭＶの接種との間の間隔（日）。縦座標：実験（暗色無地のバー）と対照（織り目のある淡いバー）における局所損傷の数の比（％）。
【図１２】ＴＭＶと比べて品種Ｉｍｍｕｎｅ５８０のニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）植物の敏感さに対するＧＸＭ（２５００μｇ／ｍｌ）の影響を示す図である。横座標：ＧＸＭの導入とＴＭＶの接種との間の間隔（日）。縦座標：実験（暗色無地のバー）と対照（織り目のある淡いバー）における局所損傷の数の比（％）。
【図１３】品種Ｉｍｍｕｎｅ５８０のニコチアナ・タバクム植物においてＴＭＶにより誘導された、局所損傷の増大に対するＧＸＭ（２５００μｇ／ｍｌ）の影響を示す図である。横座標：ＧＸＭの導入とＴＭＶの接種の間の間隔（日）。縦座標：実験（暗色無地のバー）と対照（織り目のある淡いバー）における局所損傷の大きさ（ｍｍ）。
【図１４】ＴＭＶを接種した品種Ｉｍｍｕｎｅ５８０のニコチアナ・タバクム植物において誘導されたＧＸＭ抵抗性に対するアクチノマイシンＤ（ＡＭＤ）の影響を示す図である。横座標：実験変異：１−ＧＸＭ；２−ＧＸＭおよびＡＭＤの混合物（１０μｇ／ｍＬ）；３−ＧＸＭ２日後に導入したＡＭＤ（１０μｇ／ｍＬ）；４−ＧＸＭ２日後に導入したＡＭＤ（２０μｇ／ｍＬ）；５−ＡＭＤ（１０μｇ／ｍＬ）。縦座標：実験（暗色無地のバー）と対照（織り目のある淡いバー）における局所損傷の量の比（％）。
【００１２】
発明の詳細な説明
一側面では、本発明は、必須アミノ酸に富んだタンパク質および炭水化物を包含し、且つビタミン、必須脂肪酸に富んだ脂質、抗酸化剤、およびミネラルをさらに含む、栄養補給剤および生物活性化合物に富んだ、担子菌類キノコのコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のバイオマスに関する。
【００１３】
一態様では、該バイオマスは、例えば、栄養培地での液内培養における菌株の培養によって、単細胞バイオマスの形態でコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の子実体もしくは菌糸体、またはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から得られる。
【００１４】
本発明はさらに、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体培養物が、単細胞バイオマスの形態である、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の純粋液内菌糸体培養物に関する。トレメッラ・メセンテリカ菌糸体培養物が、酵母のように単細胞生物として発育することは、非常に高い発育速度、および担子菌類キノコすべての中で最も高いバイオマス生産性を与え、培地１リットル当たり最大２７ｇの乾燥バイオマスに達する。
【００１５】
本発明の２種のキノコの菌糸体の化学組成は、例４および例７で示されるとおりに決定された。本明細書で示される、本発明のキノコに存在すべき構成成分の多くは、抗癌活性、免疫調節活性、抗血糖、抗糖尿病および殺虫活性などの多くの有益な特性を有する。
【００１６】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の菌糸体バイオマスは、菌糸体の乾燥重量の、約３９％の炭水化物および約３７％のタンパク質を有し、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のそれは、約５４％の炭水化物および約２０％のタンパク質を有する。キノコ多糖類生産体の液内培養により、特定組成物の培地を用いて短期間で特定組成の制御された条件下での生産が可能になる。
【００１７】
バイオマス中の炭水化物は、多糖類ならびに二糖類および単糖類の両方を包含する。コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１のバイオマスの多糖類の例には、β−グルカン、好ましくは低分子量の水溶性β−グルカン、およびガラクタン、好ましくは中性フコガラクタンが包含される。
【００１８】
したがって、本発明は、本明細書で例４．２に示す、β−１−６−Ｄ−グルコース残基の側鎖をいくつかの６位に有する、β−１−３−結合Ｄ−グルコース残基の骨格構造から構成される新規な低分子量の水溶性β−グルカンに関する。β−グルカンは、コプリヌス・コマトゥス、好ましくはコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１から得られ、１０，０００Ｄａ未満、好ましくは約１０００から約１０，０００Ｄａの分子量を有する。
【００１９】
トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のバイオマスの多糖類の例には、β−グルカン、好ましくは直鎖状３，４β−グルカン、およびグルクロノキシロマンナンが包含される。したがって、本発明はさらに、本明細書で例７．４に示されるとおりにトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６から得られる、新規な水不溶性の直鎖状３，４β−グルカン、およびグルクロノキシロマンナンに関する。このグルクロノキシロマンナンは、キシロースおよびグルクロン酸のβ−（１→２）（１→４）−結合オリゴ糖によってグリコール化された、α−（１→３）−結合マンナンの直鎖状骨格からなり、これは、ポリアニオン特性を与え、抗血糖および抗糖尿病剤として使用され得る。
【００２０】
本発明のβ−グルカンは、抗腫瘍および免疫調節、特に免疫刺激活性を有し、本発明のグルクロノキシロマンナンは、血糖降下、免疫刺激、およびコレステロール低下の活性を有し、免疫系の強化が、糖尿病、癌、ＡＩＤＳなどのウイルス性疾患、心疾患、血圧を予防および処置するために、および高コレステロール状態を処置するためのコレステロール低下剤として重要である疾患および状態を予防および処置する薬草剤として有望である。両方の種の多糖類は、新規なプレバイオティクスの供給源であり得る。「プレバイオティック剤」は、本明細書では、宿主の福祉および健康に利益を与える胃腸微生物叢において、組成および／または活性の両方において特異的な変化を可能にする選択的に発酵された成分として定義される。また本バイオマス中に存在するキチンは、食物繊維の重要な構成成分である。
【００２１】
本菌糸体バイオマス中に見出される単糖類および二糖類には、グルコース、アラビノース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコサミンおよびトレハロースが包含される。これらの単糖類および二糖類のすべては、健康に重要である。さらに、マンノースは、尿路および膀胱の組織への細菌の付着を防止することが示されており、グルコサミンは、骨関節炎の処置に、および軟骨を再構築するために有用であることが知られている。
【００２２】
本発明のキノコの菌糸体バイオマスタンパク質は、グルタミン酸、アスパラギン酸、ロイシン、システイン、メチオニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リシンおよびヒスチジンに富んでいる。Ｃ．コマトゥスは、γ−アミノ酪酸をさらに含有する。したがって、菌糸体のタンパク質は、１１種の必須アミノ酸；トレオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、ヒスチジン、リシン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンのうちの１０種を含有する。したがって、本発明のバイオマスは、必須アミノ酸に富んだタンパク質の存在により、重要な食餌療法用サプリメントの構成要素となる。
【００２３】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１のバイオマスは、ビタミン：Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｃ、およびＥを含み、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のバイオマスは、ビタミン：Ａ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ６、Ｂ７、Ｃ、およびＥを含む。したがって、高レベルの重要なビタミンを含有する本発明のキノコのバイオマスおよび抽出物は、ビタミンの優れた供給源として役立ち、栄養補給剤として使用することができ、および／または食餌療法用サプリメントとして食品および飲料品に添加することができる。
【００２４】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の菌糸体バイオマスは、脂肪酸であるペンタデカン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ６）、α−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ３）、γ−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ６）、アラキジン酸、ヘンエイコ酸、ベヘン酸、およびリグノセリン酸を包含する脂質をさらに含み；トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のバイオマスは、脂肪酸であるオレイン酸−（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２ｎ６）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトオレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）およびミリスチン酸を含む。脂肪酸は、それらのグリセロールとのエステルの形態でキノコ中に見出される。このキノコの高い栄養価は、必須不飽和脂肪酸であるα−リノレン酸（Ｃ１８：３ｎ３）およびリノール酸（Ｃ１８：２ｎ６）の存在によって明らかとなる。後者は、多価不飽和脂肪酸のオメガ−６シリーズを生じさせ、これらのリン脂質への取り込みは、流動性、柔軟性、透過性および膜結合酵素の活性などの細胞膜特性に影響を与える。
【００２５】
本発明のキノコの菌糸体バイオマスは、アルミニウム、銅、鉄、カリウム、マグネシウム、マンガン、リン、ケイ素、ナトリウム、チタンおよび亜鉛を含む、マクロ元素およびミクロ元素の両方のミネラルも含む。本発明の２種のキノコのいずれか１種のバイオマスの１日用量は、鉄および他のミネラルの優れた供給源を与える。
【００２６】
本発明のコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１菌株の菌糸体およびバイオマスは、抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤、メラニン（皮膚の光老化に対して保護を与え、特に太陽のＵＶ線から皮膚を保護し、電離放射線により生じた内部臓器に対する損傷に対しても保護し、そのカルボキシレート基およびフェノールヒドロキシル基によって潜在的に毒性である金属イオンを封鎖するのに役立ち得る）およびレクチン（例４．３を参照）、特にラクトース、ガラクトースおよびグルコサミン結合性レクチンを含み、これらは、多糖類および糖タンパク質の糖部分の同定に関わるアッセイに有用であり得ることも本発明によって見出された。
【００２７】
本発明のキノコのバイオマスは、プレバイオティクスまたは栄養補給剤組成物でさらに使用され得る。「キノコ栄養補給剤」は、本キノコの菌糸体または子実体のいずれか由来の精製されたまたは部分的に精製された抽出物または乾燥バイオマスと定義され、これは、食餌療法用サプリメント（従来の食品ではない）としてカプセルまたは錠剤の形態で消費され、潜在的な治療上の利用性を有する。通常の摂取は、人体の免疫応答を強化し、それにより、疾患に対する抵抗性を増加させ、一部の場合には、疾患状態の退行を生じさせ得る。
【００２８】
別の側面では、本発明は、栄養補給剤および生物活性を有する本発明のキノコの抽出物を提供する。一態様では、該抽出物は、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１由来である。別の態様では、抽出物は、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６由来である。該抽出物は、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の子実体もしくは菌糸体、またはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から得られる。好ましい態様では、本発明のキノコの抽出物は、純粋液内菌糸体培養物から得られる。
【００２９】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１培養物から得られる抽出物は、低分子量の水溶性β−グルカンおよび／またはガラクタン、好ましくは中性フコガラクタンに富んでおり、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６培養物から得られる抽出物は、直鎖状３，４β−グルカンおよび／またはグルクロノキシロマンナンに富んでおり、これは、抗血糖および抗糖尿病活性を有する。
【００３０】
一態様では、本発明のキノコの抽出物に存在する生物活性は、ＮＦ−κＢ経路調節活性、抗酸化活性、遊離ラジカル捕捉活性、抗放射線活性、金属イオン捕捉活性、インターフェロン生成活性、免疫調節活性、抗血糖活性、抗糖尿病活性、コレステロール低下活性、抗アレルギー活性、抗寄生虫活性、殺虫活性および／または抗植物ウイルス活性である。
【００３１】
本明細書で使用される「インターフェロン生成活性」および「インターフェロン生成剤」という用語は、哺乳動物の血漿中のインターフェロンの濃度を増加させる活性または剤を指す。
【００３２】
本明細書で使用される「免疫調節活性」および「免疫調節剤」という用語は、分裂促進性、造血幹細胞の刺激、代替補体活性化経路の活性化、ならびにＴＨ細胞、Ｔｃ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞の活性化を指すが、これらに限定されない。
【００３３】
「抗血糖活性」および「抗血糖剤」という用語は、血中グルコース濃度を減少させる活性または剤を指すが、「抗糖尿病活性」および「抗糖尿病剤」という用語は、血中グルコース濃度を低下させることによって糖尿病を処置する活性または剤を指す。
【００３４】
殺虫活性は、オオアリ、ヒアリ、イエシロアリ（ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、イエシロアリ（Ｆｏｒｍｏｓａｎ ｔｅｒｍｉｔｅｓ）およびレティクリテルメス・テルミテス（ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｔｅｒｍｉｔｅｓ）などの社会性昆虫を誘引し、感染させ、そしてこれらの昆虫を死滅させることを含む。
【００３５】
特に、および本明細書で以下に例で示されるとおりに、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１酢酸エチル抽出物は、ＮＦ−κＢ経路調節活性（例３）、ならびに抗酸化活性および／またはフリーラジカル捕捉性（例２）を有する。このような抽出物は、例えば、限定されないが、癌、免疫不全、敗血症性ショック、移植による拒絶反応、放射線損傷、虚血後の再潅流傷害、動脈硬化および神経変性疾患などのＮＦ−κＢ依存性疾患の処置に有用であり得る。
【００３６】
トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６培養物から得られる抽出物は、グルクロノキシロマンナンを含む、したがって、抗糖尿病活性を有し、免疫調節活性、例えば、マクロファージの機能リザーブ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅｒｖｅ）の増加を引き起こす活性、ならびにインターフェロン生成活性（例８参照）および／または抗植物ウイルス活性（例９参照）などをさらに含む。本明細書で使用される「機能活性」という用語は、自発的な活性および刺激（ＮＢＴ試験）を受けた活性指数間の差、すなわち、例えば、病原菌への曝露による活性化後のその活性と比較して、その休止態でのマクロファージなどの食細胞の活性を指す。
【００３７】
さらに別の側面では、本発明は、本発明によるバイオマスまたは抽出物を含む組成物に関する。ある種の態様では、本組成物は、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６から得られるバイオマスの混合物、またはコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６から得られる抽出物の混合物を含む。一態様では、本組成物は、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の菌糸体もしくは子実体から得られる栄養補給剤および生物活性物質に富んだバイオマス、または前記バイオマスの抽出物を含む。別の態様では、本組成物は、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から得られる栄養補給剤および生物活性物質に富んだバイオマス、または前記バイオマスの抽出物を含む。
【００３８】
なおさらに別の側面では、本発明は、それらのすべてが本明細書で上記におよび本明細書で以下の例に定義されるとおりの、低分子量の水溶性β−グルカン、水不溶性直鎖状３，４β−グルカン、グルクロノキシロマンナンから選択される炭水化物、またはこれらの炭水化物の少なくとも２種の組合せを含む組成物に関する。上記の観点から、本発明では、さらなる側面で、本発明の組成物を含む、自然食品サプリメント、プレバイオティクス、栄養補給剤、飲料品および美容品が提供される。本発明ではさらに、本発明の組成物を含む、ペットフード、殺虫剤、抗寄生虫剤および抗植物ウイルス製品が提供される。
【００３９】
なおさらなる側面では、本発明では、薬学的に許容される担体、および（ａ）本発明の組成物；（ｂ）低分子量の水溶性β−グルカン；（ｃ）水不溶性直鎖状３，４β−グルカン；（ｄ）グルクロノキシロマンナン；（これらのすべては、本明細書で上記におよび本明細書で下記の例に定義されるとおりである）；または（ｅ）（ｂ）から（ｄ）の活性成分の少なくとも２種の組合せから選択される活性成分を含む医薬組成物が提供される。
【００４０】
ある種の態様では、本発明の自然食品サプリメント、プレバイオティクスまたは栄養補給剤製品、および医薬組成物は、（ａ）糖尿病を処置し、または血中グルコース濃度を低下させる；（ｂ）免疫調節性応答を誘導する；または（ｃ）血中コレステロール濃度を低下させ、もしくはコレステロールの蓄積を減少させるために使用され得る。
【００４１】
本発明の自然食品サプリメント、プレバイオティクスまたは栄養補給剤製品、および医薬組成物は、単独でまたは制癌剤と組み合わせて、癌を処置するために、免疫調節性応答を誘導するために癌患者に投与され得る。
【００４２】
本明細書で使用される「処置する」という用語は、疾患もしくは障害の緩和、進行の低下もしくは完全な治癒、または疾患もしくは障害に関連したもしくはそれらによって引き起こされた症状の低減を指す。
【００４３】
本発明による使用のための医薬組成物は、賦形剤および補助剤を含む１種または２種以上の薬学的に許容される担体を用いて従来の方法で製剤化され得る。薬剤の製剤化および投与の技術は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版に見出すことができる。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば、経口送達、非経口送達（筋内、静脈内、皮下、髄腔内、または腹腔内注射を包含する）による全身投与のために、または局部薬剤送達による局所投与のために製剤化される。
【００４５】
本発明の方法における使用のための任意の組成物について、治療有効量または用量は、インビトロおよび細胞培養アッセイから初期に推定され得る。例えば、用量は、所望の濃度または力価を得るために動物モデルにおいて製剤化され得る。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。
【００４６】
なおさらなる側面では、本発明は、農業用担体、および本発明の組成物または本明細書で定義されるとおりのグルクロノキシロマンナンから選択される活性成分を含む農業用組成物に関する。ある種の態様では、農業用組成物は、植物ウイルスなどの植物病原菌に対する植物の抵抗性を誘導するためのものである。
【００４７】
一態様では、植物ウイルスは、感染植物に過敏な応答を誘導することができる植物ウイルス、例えば、タバコモザイクウイルス、および他のタバモウイルス、例えば、トマトモザイクウイルス、トウガラシ緑斑モットルウイルスおよびオンドントグロッスム輪点ウイルスを包含する植物ウイルスである。ある種の形態では、該ウイルスは、タバコモザイクウイルスである。
【００４８】
本発明の農業用組成物は、不活性添加物をさらに含み得る。このような添加物には、増粘剤、流動増強剤、湿潤剤、消泡剤、緩衝剤、潤沢剤、充填剤、飛散制御剤、沈着増強剤、アジュバント、蒸発遅延剤、霜よけ剤、昆虫誘引臭気剤、ＵＶ保護剤、芳香剤などが包含される。増粘剤は、水に可溶性または膨潤し得る化合物、例えば、キサンタンの多糖類（例えば、アニオン性ヘテロ多糖類）、アルジネート、グアールもしくはセルロース；合成巨大分子、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、膨潤性構造生成性シリケート（発熱性または沈降ケイ酸など）のポリカルボキシレート、ベントナイト、モンモリロナイト、ヘクトナイト、もしくはアタパルガイト；またはケイ酸アルミニウムの有機誘導体などであり得る。霜よけ剤は、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、尿素、またはそれらの混合物であり得る。消泡剤は、例えば、ポリジメチルシロキサンであり得る。本農業用組成物は、本技術分野で一般に知られているように、水系または油系製品に適合させた界面活性剤系も含み得る。
【００４９】
本発明ではさらに、生物活性が、ＮＦ−κＢ経路調節活性、抗酸化活性、フリーラジカル捕捉活性、抗放射線活性、金属イオン捕捉活性、インターフェロン生成、免疫調節、抗血糖、抗糖尿病、コレステロール低下活性、抗アレルギー活性、抗寄生虫活性、または抗植物ウイルス活性である、生物活性を有する本発明のキノコ由来の抽出物を製造する方法であって、栄養培地における液内培養で菌類コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１またはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６を培養する工程、結果として得られた、該培養ブロスから、食用菌類の得られたバイオマスを単離する工程、乾燥させる工程、および前記バイオマスを微粉末に粉砕し、溶媒抽出に付し、凍結乾燥させる工程を含む方法が提供される。特に、該方法は、グルクロノキシロマンナンに富んだトレメッラ・メセンテリカ、好ましくはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の抽出物を生産するためのものである。
【００５０】
さらなる方法では、多糖類、単糖類、タンパク質、必須アミノ酸、ビタミン、必須脂肪酸、ミネラルおよび微量元素に富んだ本発明のキノコ由来のバイオマスを生産する方法であって、栄養培地での液内培養で前記キノコを培養する工程、該培養ブロスから、食用菌類の得られたバイオマスを単離する工程、および前記バイオマスを乾燥させ微粉末に粉砕する工程を含む方法が提供される。
【００５１】
特に重要なことは、トレメッラ・メセンテリカ、トレメッラ・フキホルミス（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ）、およびトレメッラ・アウランティア（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａ）から選択されるトレメッラ属、好ましくはトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６を含むキノコの単細胞液内培養物を栄養培地で培養するさらなる方法が、本発明によって提供されることである。
【００５２】
上に定義された方法のためにコプリヌス・コマトゥスを培養するために使用される栄養培地が、以下の組成（蒸留水のｇ／Ｌ）：グルコース、１５；ペプトン、３；酵母エキス、５；ＫＨ２ＰＯ４、０．８；Ｋ２ＨＰＯ４、０．２；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５からなるべきであること、および上に定義された方法のためにトレメッラ・メセンテリカを培養するために使用される栄養培地が、以下の組成（蒸留水のｇ／Ｌ）：スクロース、５０；酵母エキス、０．５；ＫＣｌ、１；酢酸Ｍｇ・４Ｈ２Ｏ、１．０；ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．５；Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０からなることが本発明によって見出された。
【００５３】
これから、本発明は、以下の非限定的な例によって例証される。
【００５４】
例
材料および方法
１．三角フラスコおよび発酵装置におけるコプリヌス・コマトゥスの菌糸体バイオマスの液内培養
図１は、発酵装置またはバイオリアクター技術を用いて、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１およびトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の液内培養菌糸体生産のための全般的な方法論を示す。
【００５５】
キノコの液内培養菌糸体（ＳＣＭ）生産の全般的なスキームは、培養物発育の５工程を包含する：
培地培養物（Ｉ）→中間培養物（ＩＩ）→接種前培養物（ＩＩＩ）→接種培養物（ＩＶ）→発酵培養物（Ｖ）。
【００５６】
３種類の培地をＳＣＭ生産のために使用する：標準寒天培地（工程Ｉおよび工程ＩＩ）、液体標準接種培地（工程ＩＩＩおよび工程ＩＶ）、および発酵培地（工程Ｖ）。培地培養物は、チューブ中寒天斜面上で発生させる；中間培養物は、チューブまたはペトリ皿中の寒天斜面上で発生させる。接種前および接種培養物は、回転式振とう器を用いて三角フラスコ中で発生させる。発酵培養物は、撹拌、温度、ｐＨ、溶存酸素濃度（ｐＯ２）、および泡状物の測定および／または制御のための装置を備えている発酵装置Ｂｉｏｆｌｏ２０００（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）中で発生させる。
【００５７】
最初の接種前培養物について、２５０ｍｌの三角フラスコにペトリ皿からの１から３週齢のキノコ菌糸体により接種する。寒天プレートの端で発育する菌糸体からの５から６片（直径５〜７ｍｍ）を三角フラスコに移し、フラスコ壁上で小片に切断し、菌糸体の発育点の数を増加させた。１００ｍｌの特定合成培地で満たした２５０ｍＬの三角フラスコに、菌糸体を接種した。菌接種物は、以下の成分（蒸留水のｇ／Ｌ）：（ｇｌ−１）：グルコース、１５；ペプトン、３．０；酵母エキス、５．０；ＫＨ２ＰＯ４、０．８；Ｋ２ＨＰＯ４、０．２；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５からなる合成培地上で発育させた。培地の初期のｐＨは、６．０であった。ホスフェート塩は、別個に滅菌した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）。接種したフラスコの培養は、回転式振とう器上で、１００ｒｐｍおよび２７℃で６〜７日間行う。培養の最後に、１ｍｌの試料を培養純度の顕微鏡観察のために培養物から採取する。
【００５８】
第２の接種培養物について、第１の接種前培養物（ペレット）由来のバイオマスを、Ｗａｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｗａｒｉｎｇ、米国）を用いて２×３０秒均質化し、７００ｍＬの同じ培地が入っている２Ｌのフラスコに接種した。
【００５９】
培養５〜７日後、菌糸体バイオマス（ペレット）を均質化し、上記の同じ合成培地上で１０Ｌの使用容積を有する発酵装置（Ｂｉｏｆｌｏ２０００ １０Ｌ、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）中で発育のための接種培養物として使用した。培養の初期パラメータは以下のとおりである：温度２７℃；ｐＨ−６．１；撹拌−１００ｒｐｍ、通気−０．２ｖ／ｖ／分。用いた消泡剤は、ポリプロピレングリコール２０００であった；４％ＮａＯＨおよび４％ＨＣｌを用いて、ｐＨを調節した。
【表１】
【００６０】
当初は、培地のｐＨは調節しなかった。しかし、それが５．２に低下する場合、菌発育に有利になるように、ｐＨは６．０のレベルで自動的に一定に保持した。２４時間後、撹拌速度を２００ｒｐｍに、次いで、４８時間後に３００ｒｐｍに増加させた。４８時間後、培地の通気の速度は、０．４に増加させ、次いで（７２時間後）０．５ｖ／ｖ／分に増加させた。
【００６１】
菌糸体バイオマスの最大収量は、菌培養の７日目に達成された９３ｇ／Ｌの湿潤バイオマスまたは９．３ｇの乾燥バイオマスであった。培養の条件は表１で規定される。コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の菌糸体バイオマスのクランプ連結を有する空胞化菌糸が、菌培養７日後に見られる（図示せず）。
【００６２】
２．コプリヌス・コマトゥス抗酸化活性の評価
バイオマス推定。Ｃ．コマトゥス液内培養８〜１１日後に、菌糸体バイオマスをろ過により収穫し、恒量まで５０℃で乾燥させた。乾燥菌糸体を抽出のために粉末形態に摩砕した。
【００６３】
Ｃ．コマトゥスバイオマスからの抗酸化物質の抽出。収穫したキノコ菌糸体を５０℃で乾燥させ、粉末に摩砕した（４〜１０ｇ）。３種の異なる溶媒（水の代わりに培養液、エタノール、および酢酸エチル）を用いて、上行性極性でキノコ菌糸体から抗酸化化合物を抽出した。担子菌類培養の間の培養液中の抗酸化物質の存在に関する文献データは存在しなかったが、これらのキノコは、これらの化合物を細胞外に蓄積することができると想定される。したがって、選別したキノコの全抗酸化活性を正確に評価するために、菌バイオマスからの抗酸化物質の抽出のために水の代わりに適当な培養液を用いることを決定した。
【００６４】
最初の段階で、菌糸体を、培養液（１ｇ／１０ｍｌ）によって８０℃で（水浴を用いて）３時間抽出した。抽出後、不溶性化合物を６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離によって分離させ、ＷａｔｈｍａｎフィルターペーパーＮ４を通してろ過した。ろ液を蒸発させた。次いで、遠心分離後の残渣を、１５０ｒｐｍで回転式振とう器上、エタノール（８０％）によって２７℃で３時間連続的に抽出した。抽出後、溶液を遠心分離にかけ、ろ過し、有機溶媒を抽出物から蒸発させた。
【００６５】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の培養液からの抗酸化物質の抽出。バイオマスろ過後、培養物の発育培地のｐＨは、９６％硫酸を用いて２．０に低下させた。１菌株当たり１リットルの発育培地を５００ｍｌの酢酸エチルで３回分離させ、抽出物−溶媒混合物を、ガラス製化学的分離器を用いて０．５ｌの蒸留水で１回洗浄した。樹脂（または粉末）が生成されるまで、抽出物−溶媒混合物を溶媒蒸発用の化学フード中に放置し、これは、予め計量した４ｍｌのプラスチック管に採取した、実際の粗菌類抽出物に相当した。抽出物すべてを、最終濃度５０ｍｇ／ｍｌに９９．９％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈し、エッペンドルフチューブ中に分配し、使用前に７０℃で保った。
【００６６】
抗酸化活性アッセイ
β−カロテン漂白法。Ｃ．コマトゥス抽出物の抗酸化活性は、β−カロテン漂白法に従って決定した。１ｍｌのβ−カロテン（Ｓｉｇｍａ）溶液（クロロホルム中０．２ｍｇ／ｍｌ）、０．０２ｍｌのリノール酸（Ｓｉｇｍａ）、および０．２ｍｌのＴｗｅｅｎ８０（Ｓｉｇｍａ）を含有する試薬混合物を窒素の流れ下で蒸発乾固させた。５０ミリリットルの含酸素蒸留水および異なる濃度（２〜８ｍｇ／ｍｌ）を有する０．２ｍｌのキノコ粗抽出物（エタノールまたは培養液）を添加した。純メタノールまたは水（０．２ｍｌ）を対照として用い、そのブランクは、β−カロテンを除く当初の化学物質すべてを含有した。次いで、これらの混合物すべてを振とうして、リポソーム溶液を生成させ、次いで、５０℃で２時間インキュベートした。これらのリポソーム溶液のアリコート（１ｍｌ）の４７０ｎｍでの吸光度を、２０分の時間間隔で分光光度計によりモニターした。ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）（Ｓｉｇｍａ）（メタノール中２ｍｇ／ｍｌ）を標準として用いた。β−カロテンの漂白速度（Ｒ）を標準として用いた。β−カロテンの漂白速度（Ｒ）は、式（１）によって計算した
Ｒ＝ｌｎ（ａ／ｂ）／ｔ 式（１）
（ここで：ｌｎ−自然対数、ａ−時間０における吸光度、ｂ−時間ｔにおける吸光度、およびｔ−インキュベーション間隔２０、４０、６０、８０、１００、または１２０分）。
【００６７】
抗酸化活性（ＡＯＡ）は、対照に対する阻害パーセントに関して、式（２）を用いて計算した
ＡＯＡ＝［（Ｒ対照−Ｒ試料）／Ｒ対照］×１００ 式（２）
【００６８】
１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジルに対する捕捉活性。Ｃ．コマトゥス由来の抽出物の捕捉活性は、１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）ラジカルに対して測定した。メタノール中０．１ｍＭのＤＰＰＨラジカル（Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｌのアリコートを、異なる濃度（０．５から９ｍｇ／ｍＬ）のキノコのエタノールまたは水抽出物１ｍＬを有する試験管に添加した。対照として、キノコ試料の代わりにメタノールまたは水を用いた。この反応混合物を室温で、ボルテックスにより混合し、分光光度計によって５２０ｎｍで測定することによって、吸光度を混合直後に決定した。ＤＰＰＨによるフリーラジカルの阻害は、以下のとおりに計算した：Ｉ（％）＝（Ａブランク−Ａ試料／Ａブランク）×１００（ここで、Ｉは、阻害（％）、Ａブランクは、対照反応物（試験化合物を除くすべての試薬を含有する）の吸光度、Ａ試料は、試験化合物の吸光度である。５０％阻害（ＥＣ５０）を与える抽出物濃度は、抽出物濃度に対するラジカルパーセンテージの捕捉活性のグラフから計算した。１ｍｇ／１ｍｌのメタノールの濃度におけるブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）を標準として用いた。各値を、平均±標準偏差（ｎ＝３）として表す。
【００６９】
３．液内コプリヌス・コマトゥス由来の抽出物の生物活性についての試験
実験作業のための細胞培養物の調製。癌細胞培養物に関する実験作業すべては、滅菌生物学的フード内で行った。各実験の前に、細胞をトリプシン処理し、採取し、与えられた実験の必要性に応じて適当な細胞量を播種するために数えた。
【００７０】
ＭＣＦ７乳癌細胞培養物は通常、フラスコ底に付着して増殖する。使用のためにこれらの細胞を調製するために、使い捨てピペットを用いて培地をフラスコから廃棄し、次いで、１〜２ｍｌのトリプシンを２〜３分間添加した。トリプシン処理の間、細胞を、加湿インキュベータ中３７℃で保持した。トリプシン処理を停止させるために、フラスコ底から細胞を分離させ、用いたフラスコの大きさに応じて５〜１０ｍｌの新鮮な培地を加えた。細胞をマルチピペット採取によって十分混合し、１００μｌの細胞懸濁液を０．４％のトリパンブルー溶液１００μｌで染色し、十分に混合し、トリパンブルー排除法に従って血球計を用いて顕微鏡下で数えた。
【００７１】
利用できる細胞数を確立後、細胞懸濁液をさらに希釈し、各実験の要件に応じて特定数の細胞を播種した。さらなる実験作業のために利用できる細胞系を再増殖および維持させるために、一部の細胞を常に保持した。細胞系すべてのストック懸濁液を液体窒素で保持し、実験細胞培養物を２〜３ヶ月ごとに１回更新した。
【００７２】
細胞溶解、全細胞溶解物の調製。粗菌類抽出処理への応答として特定のタンパク質の細胞内レベルを測定するために、細胞を採取した後に毎回、全細胞の溶解を行った。全細胞溶解の抽出手順を、以下に記載する。
【００７３】
細胞を採取し、３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離によって冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。最終の細胞量をエッペンドルフチューブに採取し、最後の洗浄から残ったＰＢＳを廃棄し、その結果、細胞ペレットだけを各チューブに残した。細胞溶解に関して、毎回、新たに調製した溶解緩衝液を、以下の含有量で用いた：試料の数に依存して５００〜１０００μＬの細胞溶解試薬、タンパク質分解酵素抑制剤カクテル、および１％の最終濃度でホスファターゼ阻害剤カクテル１およびカクテル２の両方、ならびに０．３Ｍのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）。溶解緩衝液５０μＬを添加し、試料を１０分ごとに激しくボルテックスして氷上で３０分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間最終の遠心分離にかけた。全細胞溶解物に相当する上清を、新しいエッペンドルフチューブに移し、−７０℃で保存する一方、細胞ペレットは廃棄した。
【００７４】
Ｈ２Ｏ２刺激によるＰＩκＢα動力学。２５ｍｌのプラスチック製フラスコを用いて、ＭＣＦ７乳癌細胞（２×１０５個）を５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地に播種し、３７℃に維持した。２４時間後、血清中に示される増殖因子によるシグナル伝達カスケードの活性化を最小化するために、増殖培地を、０．５％ＦＣＳを含有する培地と置き換えた。２４時間後、細胞に５０または１００μＭのＨ２Ｏ２を５分、１０分、２０分、３０分、４０分、および６０分間補給して、ＭＣＦ７乳癌細胞系におけるＨ２Ｏ２刺激後の阻害タンパク質カッパＢ（ＩκＢα）リン酸化を検出した。
【００７５】
対照として、Ｈ２Ｏ２処理なしを用い、それによってｐＩκＢαの動力学を決定した。細胞を採取し、洗浄し、前に記載したとおりに溶解させた。実験を二通りで行った。
【００７６】
ＩＫＫキナーゼアッセイ。ＩκＢキナーゼ複合体（ＩＫＫ−β）活性は、Ｓｅｒ３２およびＳｅｒ３６のＩＫＫ−βリン酸化部位を包含する５０アミノ酸ＧＳＴ−ＩκＢα融合ポリペプチド基質を用いるＥＬＩＳＡベース活性アッセイである、ＩＫＫ−β−阻害剤選別キット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国）によって評価した。１００ｎｇのＧＳＴ−ＩκＢα基質および５ｎｇの組換えＩＫＫ−βを、６００ｎＭのＩＫＫ−β阻害剤５−（ｐ−フルオロフェニル）−２−ウレイド］チオフェン−３−カルボキサミド（Ｆｕｃｔ）、および１００または２００μｇ／ｍｌのコプリヌス・コマトゥス抽出物の存在下でインキュベートした。反応混合物を、グルタチオンで前コートしたウェルに添加し、ＧＳＴ−ＩκＢαの捕獲を可能にした。抗ホスホ−ＩκＢα（Ｓｅｒ３２／Ｓｅｒ３６）抗体を用いて、リン酸化ＧＳＴ−ＩκＢα基質を検出し、続いて、ＨＲＰ共役化し、ＴＭＢ基質で発色させた。吸光度を４５０ｎｍでモニターし、ＩＫＫ−β活性のレベルと直接関係づける。
【００７７】
デンシトメトリー分析。ウエスタンブロットにより検出した、タンパク質バンドのデンシトメトリー定量分析は、ＴｏｔａｌＬａｂソフトウェアを用いて行っており、タンパク質バンドの容量の倍数として示す。菌類抽出物の作用への応答におけるｐＩκＢαレベルに対するウエスタンブロットのデンシトメトリー分析は、対照値の平均±ＳＤとして示す。
【００７８】
４．コプリヌス・コマトゥスの内容物および化学組成
コプリヌス・コマトゥスの多糖類組成の分析
ＣＢＳ１２３４０１の液内培養菌糸体バイオマス（１０ｇ）を、沸騰９６％エタノール（３００ｍｌ）で２時間洗浄した。不溶性残渣（８．２ｇ、８２％）を、オートクレーブ中水（３００ｍｌ）によって１２０℃で１時間、２回抽出した。抽出物のごく一部を乾燥させ、ＮＭＲで分析し、残部を透析し、１００ｍｌに濃縮し、１２００００ｇで３時間、超遠心分離機にかけ、脱色のために数滴の臭素で溶液を処理し（この後、一部のタンパク質を沈殿させ、遠心分離で除去した）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０上でゲルクロマトグラフィーにより分離して、様々な割合でデンプン、β−グルカンおよびガラクタンを含有する３画分（１５０、２２０、および１３０ｍｇ）を得た。不溶性残渣（５．８ｇ）を沸騰５％ＫＯＨで３時間抽出し、溶液を透析し、上記のとおりに処理して、タンパク質−β−グルカン混合物（３００ｍｇ）を得た。
【００７９】
メチル化分析。試料（１〜３ｍｇ）を１ｍｌの乾燥ＤＭＳＯに１００℃で溶解させた。不溶性グルカンを一晩そのままにしたが、依然として完全に溶解しなかった。室温に冷却後、粉末にしたＮａＯＨ（約３０ｍｇ）を添加し、混合物を３０分間撹拌し、０．５ｍｌのＭｅＩを添加し、３０分間撹拌を続け、過剰のＭｅＩを空気流で除去し、水（５ｍｌ）を添加した。可溶性試料について、生成物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、水で洗浄し、３Ｍ ＴＦＡで加水分解し（１２０℃、３時間）、ＮａＢＤ４で還元し、アセチル化し、ＧＣ−ＭＳで分析した。不溶性化合物は、透析により回収し、もう一度メチル化した。
【００８０】
ＮＭＲ実験は、標準パルスシーケンスＤＱＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ（混合時間１２０ミリ秒）、ＮＯＥＳＹ（混合時間２００ミリ秒）、ＨＳＱＣおよびＨＭＢＣ（１００ミリ秒 長期トランスファディレイ）を用いて、アセトン内部標準（１Ｈについて２．２２５ｐｐｍおよび１３Ｃについて３１．５ｐｐｍ）を有する２５℃でのＶａｒｉａｎ Ｚ勾配プローブを備えたＶａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ ５００ＭＨｚ分光計によって行った。データ処理は、Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｏｐｓｐｉｎプログラムで行った。
【００８１】
単糖類分析。試料（１〜５ｍｇ）を、濃ＨＣｌ（０．２ｍｌ）に４０℃で１時間溶解させ、イノシトール標準（０．５ｍｇ）を添加し、混合物を水（０．４ｍｌ）で希釈し、１００℃で２時間加熱した。酸を空気流下で蒸発させ、糖をＮａＢＨ４（１０ｍｇ、３０分）で還元し、ＡｃＯＨ（０．５ｍｌ）を添加し、試料を乾燥させ、次いで、ＭｅＯＨ（１ｍｌ）から２度乾燥させ、０．５ｍｌのＡｃ２Ｏでアセチル化し、乾燥させ、ＧＣで分析した。この手順により、不溶性ポリマーからのグルコースおよびグルコサミンの回収は改善されるが、ペントースおよび６−デオキシヘキソースは部分的に分解する。それらの正確な定量化を得るために、加水分解を３Ｍ ＴＦＡで行った（１２０℃、３時間）。
【００８２】
メガザイムキットによるβ−グルカン決定。全般説明：すべてのグルカンを濃（３７％；１０Ｎ）塩酸に可溶化し、次いで、１．３Ｎ ＨＣｌにより１００℃で２時間、十分に加水分解した。Ｄ−グルコースへの加水分解は、高精製ｅｘｏ−１，３−β−グルカナーゼおよびβ−グルコシダーゼの混合物によるインキュベーションで完了させる。この手順は、製造者指図書に対して１０分の１で規模を縮小した。
【００８３】
オリゴ糖中の全グルカン（α−グルカン＋β−グルカン）プラスＤ−グルコース、スクロースおよび遊離のＤ−グルコースの測定。グルカンを、試料（約１０ｍｇ）から、時々ボルテックス撹拌して、濃塩酸（０．２ｍｌ）で３０℃にて４５分間抽出した。酸を水で５倍に希釈し、加水分解を１００℃で２時間行った。酸を１ｍｌの２Ｍ ＫＯＨで中和し、混合物を２００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で１０ｍｌに希釈し、１５００ｇで１０分間の遠心分離で清澄化した。０．０１ｍＬの抽出物に、０．１ｍｌの水および０．１ｍｌの、ｅｘｏ−１，３−β−グルカナーゼ（２０Ｕ／ｍＬ）プラスβ−フルコシダーゼ（４Ｕ／ｍｌ）の２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中混合物を添加し、混合物を４０℃で６０分間インキュベートした。３．０ｍＬのグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ混合物（ＧＯＰＯＤ）を添加し、４０℃で２０分間インキュベートした。５１０ｎｍでの吸光度をその試薬ブランクに対して測定した。
【００８４】
スクロース中α−グルカン（フィトグリコーゲンおよびデンプン）＋グルコース、および遊離のｄ−グルコースの測定。試料（１０ｍｇ）を、撹拌しながら、０．２ｍｌの２Ｍ ＫＯＨで２０分間抽出した。０．８ｍＬの１．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）、続いて０．０２ｍＬのアミログルコシダーゼ（１６３０Ｕ／ｍｌ）プラス転化酵素（５００Ｕ／ｍＬ）を添加し、断続的に混合しながら４０℃で３０分間インキュベートした。試料を水で１０ｍｌに希釈し、遠心分離で清澄化し、０．０１ｍｌの試料を、０．０１ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ５．０）および０．３ｍＬのＧＯＰＯＤ試薬と混合し、４０℃で２０分間インキュベートし、５１０ｎｍにおける吸光度を試薬ブランクに対して測定した。試薬ブランクは、０．２ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ５．０）＋３．０ｍＬのグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ試薬からなる。Ｄ−グルコース標準は、０．１ｍＬのＤ−グルコース標準（１ｍｇ／ｍＬ）＋０．１ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ５．０）＋３．０ｍＬのグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ試薬からなる。
【００８５】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の液内培養菌糸体由来のレクチン画分の抽出。
５０ｇの湿重量を有するコプリヌス・コマトゥス菌糸体バイオマスを、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリドを含有するＰＢＳ（４０ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）下で均質化した（１／６ ｗ／ｖ）。ホモジェネートを４℃で２時間保ち、次いで、８０００ｇで２０分間遠心分離にかけた。８０％飽和の（ＮＨ４）ＳＯ４を、タンパク質画分の沈殿のために用いた。混合物を一晩４℃で放置させた。沈殿物を、１２０００ｇで２０分間の遠心分離処理により採取し、最小容量のＰＢＳに溶解させ、蒸留水中、次いでＰＢＳ中で連続的に透析した。得られた抽出物を、タンパク質の量、レクチン活性、および糖特異性について分析した。
【００８６】
レクチンの赤血球凝集能のアッセイ。レクチンの赤血球凝集能を測定するために、トリプシン処理した赤血球懸濁液を用いた。ウサギの血液を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する１５０ｍＭクエン酸三ナトリウム緩衝液中に採取した。１０容量の洗浄緩衝液（ＰＢＳ）で３回赤血球を洗浄することによって、赤血球懸濁液を新たに調製した。次に、４％赤血球懸濁液のトリプシン処理を３７℃で１時間行い；次いで、赤血球を洗浄し、同じ緩衝液中に２％懸濁液（ｖ／ｖ）として懸濁させた。
【００８７】
レクチン（赤血球凝集）活性のアッセイでは、レクチン溶液のマイクロタイターＵ−プレート（５０μｌ）中連続的２倍希釈液を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中ウサギ赤血球細胞の２％懸濁液５０μＬと２０℃で混合した。結果を１時間後に記録した。赤血球凝集を示す最大希釈の逆数として定義される、赤血球凝集力価は、１赤血球凝集単位に等しかった。特異性活性は、タンパク質１ｍｇ当たり赤血球凝集単位の数である。
【００８８】
レクチンの糖結合特異性。様々な炭水化物による、レクチン誘導赤血球凝集の阻害の調査は、赤血球凝集試験と類似の方法で行った。糖試料（０．３Ｍ）は、リン酸緩衝生理食塩水中で調製した。希釈液のすべては、等容量（２５μＬ）のレクチン溶液と混合した。混合物を室温で３０分間放置させ、次いで、５０μＬの２％ウサギ赤血球懸濁液と混合した。糖結合特異性は、力価４のレクチンの赤血球凝集の阻害に必要とされる各糖の最小濃度として表した。Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）；Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｄ（＋）ガラクトース（Ｇａｌ）；Ｄ（＋）グルコース、Ｄ（＋）ラクトース（Ｌａｃ）；Ｄ（＋）マンノース、キシロース、セロビオース、およびズルシトールを、レクチンの糖結合特異性の検出について試験した。
【００８９】
５．品種トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の特性；三角フラスコおよび発酵装置中単細胞バイオマスの液内培養。
トレメッラ・メセンテリカの培養物の調製。トレメッラ・メセンテリカの子実体を、イスラエルでカシ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｓｐ．）の種の朽ちた木の上で採取した。担子菌類紋は、保湿室内の滅菌ペトリ皿下に置いた新鮮な子実体から、湿度をゆっくり低下させることによって得た。滅菌水中のその胞子懸濁液をペトリ皿中の麦芽寒天の表面上に広げて、単胞子培養物を担子菌類紋から発生させた。発芽担子菌類を立体顕微鏡下で調べ、酵母様出芽性細胞由来の若いコロニーを麦芽寒天（ＭＡ）の斜面上に移した。
【００９０】
第１工程の液内培養物のためのトレメッラ・メセンテリカ菌株の酵母様１倍体細胞の接種物を、滅菌水中ＭＡ斜面上の８日齢培養細胞の懸濁液として調製した。発酵培地を、液内培養物で接種して、多糖類生産のための処理を冷蔵の軌道式振とう器中２２０ｒｐｍ、２７℃で行った。
【００９１】
多糖類生産は、遠心分離により菌株生産体の細胞を分離後に、２容量のエチルアルコールによる培養ブロス上清のアルコール沈殿によって推定した。発酵の最後に培養ブロスから得た粗沈殿物は、細胞外多糖類および菌株生産体の細胞の両方を含有する。
【００９２】
５．０ｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．６２５ｇ／ｌのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ；０．４３５ｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび０．２ｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（ｇ／ｌ）から構成される微量元素混合物（微量栄養素）を別に調製し、滅菌培地に添加した。微量元素混合物を培地に１：１００に希釈して添加し、最終カチオン濃度（ｍｇ／ｌ）：Ｆｅ＋＋−１０．０；Ｍｎ＋＋−２．０；Ｚｎ＋＋−１．０；Ｃｕ＋＋−０．５を得た。
【００９３】
微量元素の水酸化物の沈殿生成を防止するために、オートクレーブ処理による滅菌前に、微量元素溶液のｐＨを５０％Ｈ２ＳＯ４で１．６〜１．８に調整する。
【００９４】
決定した組成の培地を、ペプトンおよび酵母抽出物（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ）ならびにミネラル塩（Ｓｉｇｍａ）から発生させた。
【００９５】
６．トレメッラ・メセンテリカの内容物および化学組成
トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の酸性グルコロノキシロマンナンの決定。発酵培地上の培養の最後の培養ブロスを脱イオン水で３倍に希釈した。菌株生産体細胞を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４０３遠心分離機中５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離により分離させた。上清を、２容量のエチルアルコールと混合し、粗多糖類を沈殿させた。培養ブロスから沈殿した多糖類の混合物を水に溶解させ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ−１２０（Ｈ＋−型）で満たしたクロマトグラフィーガラス製カラムを通過させた。酸性グルコロノキシロマンナンを、沈殿物が生成されなくなるまで、１０％のセチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）水溶液を徐々に添加することによって、採取画分から沈殿させた。不溶性ＣＰＣ複合体は、遠心分離で採取し、１０％塩化ナトリウム中に溶解させた。不溶性粒子を遠心分離で分離後、酸性多糖類を２容量のエタノールを添加して沈殿させた。
【００９６】
精製多糖類を、沈殿物を水に溶解させ、続いてアルコールで繰り返し沈殿させることによって得た。
【００９７】
７．トレメッラ・メセンテリカ調製物のインターフェロン生成および免疫調節特性。
血漿中のＩＦＮレベルおよび食細胞の機能活性の決定。血漿中のＩＦＮレベルは、マウス線維芽細胞Ｌ−９２９の培養物中試験ウイルス（水疱性口内炎のウイルス、Ｉｎｄｉａｎａ菌株−ＶＳＶ）の細胞変性影響の抑圧により推定した。９６小孔培養パネルの小孔を、１００μＬの細胞懸濁液（１×１０６個細胞／ｍＬ）で満たし、５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃で１８時間インキュベートし、次いで、１００μＬの２倍希釈試験試料を添加した。１８時間後、予め滴定したＶＳＶ作業用希釈物５０μＬを添加した。パネルを同一条件下でインキュベートした。結果を顕微鏡下で評価した。試験ウイルスの細胞変性影響に対して５０％の細胞防護を与えた、最終ＩＦＮ希釈の逆数を、ＩＦＮ活性単位と仮定した。ＩＦＮ力価は、単位／ｍｌで表した。
【００９８】
血漿中のＴＮＦの生物活性は、マウス線維芽細胞Ｌ−９２９上の細胞溶解作用により評価した。指標細胞懸濁液（５×１０６個細胞／ｍｌ）を、１００μＬを複数回に分けて、フラット底９６小孔培養パネル中に導入し、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で２４時間培養した。次いで、培地を小孔から除去し、１００μＬの試験試料および１００μＬの、アクチノマイシンＤ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を含有する培地を、細胞の単層に添加した。試験試料なしで培養した細胞は、対照としての役目をした。インキュベーション２４時間後に、培地を除去し、細胞を、クリスタルバイオレットの０．２％溶液によって室温で１０分の間染色し、水で３回洗い落とし、３７℃で乾燥させた。
【００９９】
波長５５０ｎｍでＭｕｌｔｉ−ｓｃａｎ ＤＹＮＡＲＥＣＨ（Ｓｗｉｓｓ）を用いて、結果を評価した。
【０１００】
ＴＮＦ活性は、細胞毒性指数（ＣＩ）以外を評価し、これは、以下の式：ＣＩ＝（Ｋ−Ｄ）／Ｋ×１００％（ここで、Ｋは、対照小孔における光学密度であり、Ｄは、試験小孔における光学密度である）を用いて計算した。
【０１０１】
「ＶＥＣＴＯＲ］（Ｕｋｒａｉｎｅ）により作製したＴＮＦ組換え調製物「Ｒｉｆｎａｍｅｎ」を、ＴＮＦ試験に用いた。
【０１０２】
食作用系の機能活性は、細胞化学法によってニトロブルーテトラゾリウム回収（ＮＢＴ試験）で調査した。
【０１０３】
８．トレメッラ抽出物、および植物ウイルスに対する植物抵抗性
ウイルス：タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、菌株Ｕ１；
植物：自然の照明、湿度、および温度の条件下の温室で栽培された、タバコ（ニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）品種Ｉｍｍｕｎｅ５８０およびシロバナヨウシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ Ｌ．）。４〜６葉期の植物を実験に用いた。
【０１０４】
一部修正したＫｏｖａｌｅｎｋｏ法を用いて、トレメッラ・メセンテリカの培養液から抽出した多糖類を本試験で用いた。中性多糖類から酸性グルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）を単離するために、本発明者らは、０．０５Ｍ ＣａＣｌ２の存在下でアセトンと水の溶液（１：１）からのその沈殿を適用した。ガスクロマトグラフィーを、ピリジニウム−アセテート緩衝液、ｐＨ４．５（１Ｌ水中４ｍＬピリジンおよび１０ｍＬ ＡｃＯＨ）中Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０（２．５×８０ｃｍ）上で行い、溶出液を屈折率検出器でモニターした。
【０１０５】
インビトロの実験において、全調製物、中性多糖調製物、ならびに１０、１００、５００、および１，０００μｇ／ｍＬの濃度の純粋ＧＸＭの水溶液を、ＴＭＶ（１０μｇ／ｍＬ）の懸濁液に添加した。３０分かけてインキュベートした後、チョウセンアサガオ属の葉の左半分にこの混合物を接種した。葉の右半分に多糖類なしの同じ濃度でのＴＭＶを接種した。ウイルス感染の阻害度、またはＶＩＲを、以下の式：Ｉ＝（（Ｋ−Ｄ）／Ｋ）１００％（ここで、Ｉは、ウイルス阻害度またはＡＶＲのレベル、％であり；Ｋは、対照における局所損傷の数（大きさ）であり；Ｄは、実験における局所損傷の数（大きさ）である）で、葉の、実験の半分および対照の半分上の局所損傷の数によって（パーセンテージで）数えた。
【０１０６】
ＧＸＭの誘導特性の調査は、タバコおよびチョウセンアサガオ属の植物で行った。この目的のために、１０００〜２５００μｇ／ｍＬの濃度での多糖類の水素溶液を、葉の左半分の細胞間空間中に１ｍＬ（インスリン）注射器で注射した。葉の２つの半分にＴＭＶ（１〜５μｇ／ｍＬ）を接種した。ＡＶＲの程度は、上記の式によって考慮した。
【０１０７】
植物抵抗性のＧＸＭ誘導機構を研究する場合、本発明者らは、ＲＮＡ−ポリメラーゼを遮断することによりｍＲＮＡのＤＮＡ依存性合成を阻害するアクチノマイシンＤ（ＡＭＤ）を用いた。１０および２０μｇ／ｍＬの濃度でのＡＭＤならびにラムノリピド（ＲＬ）−１ｍｇ／ｍＬの溶液を、同時にまたはＧＸＭ後の一定時間を経て、表皮下に導入した。局所損傷の数および大きさの差は、スチューデント（ｔ）検定の基準で評価し；得られたα−値は、以下の記号：＋＋＋Ｐ≦０．０１％；＋＋０．１＜Ｐ≦１％：＋１％≦Ｐ≦５％；０ｐ＞５％で表に示す。
【０１０８】
（例１）
品種コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の特性
純粋培養における植物性菌糸体。菌糸体コロニーは、白く、綿状で、しばしば、「タフト」（菌糸集合体）を成熟とともに発達させる。非対称に形状化して、通常、外側端部に沿って菌糸体マットを形成する。クランプ連結、融着、および髪様結晶がしばしば、菌糸上に存在する。
【０１０９】
菌傘３〜１５ｃｍ；若いときに卵形から丸みを帯びた円筒形、つり上げ縁を有する鐘形状に膨張する；年齢が増すとともに黒色の「インク（ｉｎｋ）」に変化する；乾いている；茶色がかった中心を有して白っぽい；大きくて、毛羽だった鱗片；成熟時にしわを寄せた縁。茎をもたないラメラ；白色、ピンクがかって、次いで、黒色になる；黒色「インク」に変わる；非常に混んでいる。柄５〜２０ｃｍ長；１〜２ｃｍ厚さ；しばしば頂点まで先細になる；滑らか；白色；傘から容易に分離できる；中空、内部に垂れ下がる繊維の筋様ストランド；内容物は全体に白色で、軟らかい。胞子紋は黒色。担子胞子 ９〜１３×７〜９μｍ；楕円形；滑らか；中心からわずかに偏心した孔。担子器 ４胞子、２８〜４３×１０〜１３μｍ、５〜８個の偽副生体で囲まれる。側シスチジアなし。縁シスチジア 様々な形状；最大６０×４０μｍ。毛状被は、７〜３０μ幅の円筒要素でできている。不完全なクランプだけが存在する。
【０１１０】
生息場所。しばしば予期されない場所、例えば、街の緑地などに群で生育する。草地および牧草地に広く出現する。
【０１１１】
（例２）
コプリヌス・コマトゥスの抗酸化活性の評価
２．１ 乾燥させた液内培養キノコ菌糸体からのバイオマスおよび抽出物の収量
選別日程の間に高等担子菌類キノコの液内培養のために選択した栄養培地は、選択した種すべての発育を確実にした。しかし、同一の培養条件におけるコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１キノコ培養８〜１１日後の菌糸体バイオマスの収量は、６．８ｇ／ｌであった（表１）。
【０１１２】
乾燥させ摩砕したキノコ菌糸体からの可溶性化合物の抽出は、培養液（水に代えて）およびエタノールで行った。種々の菌株から得られた抽出物の中での収量の有意差が明らかになった。さらに、キノコバイオマスから得られた抽出物の収量は、使用した溶媒に有意に依存した。コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１バイオマスの培養液による抽出は、２３．２％の抽出物を生じさせた。
【０１１３】
エタノールによる抽出は、あまり有効でなく、試験菌株上で用いた弱い可溶化剤は、単に８．５％を生じさせただけであった。
【０１１４】
２．２ 液内培養コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１キノコ菌糸体からの水（培養液）およびエタノール抽出物の抗酸化活性
表２に示すデータは、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１から得られた水（培養液）抽出物の抗酸化活性（ＡＯＡ）を示す。２ｍｇ／ｍＬの濃度のＣ．コマトゥスＣＢＳ１２３４０１水抽出物を用いた場合、非常に高いＡＯＡが明らかになった。わずかに低いＡＯＡが、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１菌糸体バイオマスからの水抽出物で観察された。これら抽出物すべての阻害値は、事実、試薬混合物中のそれらの濃度の増加に伴って変化しなかった。
【０１１５】
キノコバイオマスからのエタノール抽出物のＡＯＡは、高等担子菌類の種に大きく依存しただけでなく、試薬混合物中の抽出物濃度の変化にも依存した。エタノール抽出物の濃度が、２ｍｇ／ｍｌから４〜８ｍｇ／ｍｌに増加した場合、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１からの抽出物のＡＯＡは、７４．４から８６．４％に増加した（表３）。
【表２】
【表３】
【０１１６】
２．３ 液内培養キノコ菌糸体からの水（培養液）およびエタノール抽出物のフリーラジカル捕捉活性
フリーラジカル捕捉は、公知の機構の１つであり、それにより抗酸化物質は、脂質酸化を阻害する。１，１−ジフェニルピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカルを捕捉する方法を用いて、抗酸化活性を評価した。５２０ｎｍにおける特徴的な吸収を有する安定なフリーラジカル生成物質であるＤＰＰＨを用いて、抽出物のラジカル捕捉効果を試験した。吸光度の低下は、ラジカル捕捉の程度の指標と考えられる。
【０１１７】
水およびエタノールの抽出物の最も高いフリーラジカル捕捉活性が、０．５ｍｇ／ｍｌ（それぞれ、２７．０％および２２．０％）の試料濃度で測定されたが、それらの値は、標準（９２．０％）のものより非常に低かった（表４および表５）。
【０１１８】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１のエタノール抽出物のフリーラジカル捕捉能は、２２から１に低下し、試料濃度は、０．５から９ｍｇ／ｍｌ％に、それぞれ増加した（表５）。
【表４】
【０１１９】
表５および表６に示されるＤＰＰＨ捕捉効果に対する効果濃度の値は、水およびエタノールの抽出物の両方のＥＣ５０が、１ｍｇ／ｍＬ付近であるようにみえた証拠を示す。
【表５】
【０１２０】
（例３）
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の液内培養菌糸体からの水（培養液）および酢酸エチル抽出物の生物活性についての試験
３．１ Ｈ２Ｏ２による、ＭＣＦ７細胞におけるＮＦ−κＢ刺激後のｐＩκＢαレベル
薬用キノコについての多くの研究により、食餌療法用サプリメントおよび免疫促進物質としてだけでなく、様々な細胞応答のモジュレータの供給源としても、それらの外にない潜在性が分かった。その化学療法計画の大部分の実際の成功にもかかわらず、細胞適応は、腫瘍細胞を多くの化学療法剤に対して抵抗性にさせることを可能にしてきた。これらの細胞化学物質抵抗性因子の１つは、核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）であり、これは、腫瘍増殖を促進することが示された。ＮＦ−κＢの活性は、ＩκＢタンパク質との相互作用によって強固に制御される。ＮＦ−κＢタンパク質と同様に、個々のＮＦ−κＢ複合体に対する異なる親和性を有するいくつかのＩκＢタンパク質があるが、いくらか異なって制御され、組織特異的様式で発現される。
【０１２１】
細胞外刺激は、２種の保存セリン（ＩκＢαにおけるＳｅｒ３２およびＳｅｒ３６）上のＩκＢをリン酸化するＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）の活性化をもたらす。このリン酸化は、プロテアソームの分解に対するＩκＢを特徴づけ、核転座およびＮＦ−κＢの活性化を引き起こす。これは、ＮＦ−κＢ活性化の古典的経路と考えられる。ＮＦ−κＢ活性化のいくつかの代替経路が、説明されてきた。ＮＦ−κＢの活性化の現在の研究では、過酸化水素が用いられ、これは、周知のＮＦ−κＢ活性化剤であり、強力な酸化試薬である。予備データにより、１００μＭのＨ２Ｏ２による１０分の処理は、最高レベルのｐＩκＢαをもたらし、１０μＭの、公知の抗酸化物質および抗癌試薬であるクルクミンによる処理は、ｐＩκＢαレベルを著しく阻害したことが示された。ＭＣＦ７細胞を、増加する期間、５０および１００μＭのＨ２Ｏ２で刺激した。２０分間および４０分間の５０μＭのＨ２Ｏ２刺激は、Ｈ２Ｏ２が添加されていないＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）処理細胞である対照と比較して、高レベルのｐＩκＢαを示した。最高レベルのｐＩκＢαは、１０分の刺激における１００μＭのＨ２Ｏ２処理細胞により示された（図示せず）。したがって、ｐＩκＢαレベルに対する抽出物の潜在効果を調べる最良の条件は、選択された菌類抽出物と一緒の１０分のＨ２Ｏ２刺激において確立された。
【０１２２】
（ＭＣＦ７細胞を、増加する期間、５０および１００μＭのＨ２Ｏ２で刺激した。１０分間隔における１００μＭのＨ２Ｏ２による刺激により、Ｈ２Ｏ２が添加されないＤＭＳＯ処理細胞を用いる対照と比較して、最高レベルのｐＩκＢαが示された。データは、２つの同様の実験の１つの結果を示す）。
【０１２３】
３．２ 細胞生存度に対するコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１粗抽出物の効果
現実験では、コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１を調べた。Ｃ．コマトゥス培養液（水）（Ｅ１）および酢酸エチル（Ｅ２）の粗抽出物を、それらのＭＣＦ７細胞系の細胞生存度に影響を与える能力について試験し、ＩＣ５０を計算した。抽出物Ｅ２は、最も強力であるようにみえ、ＩＣ５０は３２μｇ／ｍｌであり、Ｅ１が続き、ＩＣ５０は７６μｇ／ｍｌであった（表６）。これらの結果は、Ｃ．コマトゥスＣＢＳ１２３４０１抽出物の活性部分が、抽出物Ｅ２で濃縮されることを示す。抽出物Ｅ１は、有意な仕方で細胞生存度に影響を与えなかったが、このアッセイにより、抽出物Ｅ２が、Ｅ１よりもより高い増殖阻害活性を示すことが明らかとなっており、Ｅ２が、抗癌活性可能性を有する一部の生物活性化合物を保有し得ることが主張される。
【表６】
【０１２４】
細胞を、増加する濃度のコプリヌス・コマトゥス抽出物で処理した。４８時間後、細胞を採取し、０．４％トリパンブルー溶液（１：１）で染色し、血球計を用いて数えた。細胞生存度の阻害パーセントは、ＤＭＳＯ処理した対照に対して計算した。値（μｇ／ｍｌ）は、２通りの実験の平均ＩＣ５０±標準偏差として表す。
【０１２５】
３．３ ＩκＢαリン酸化に対するコプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１粗抽出物の効果
ＮＦ−κＢ経路は、制癌剤発見における最も有望な目標の１つとして浮上してきている。コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１抽出物は、ＮＦ−κＢ活性化経路を調節することが見出された。ｐＩκＢαレベルに対する、Ｃ．コマトゥスの２種の抽出物、Ｅ１およびＥ２の効果を確立するために、ＭＣＦ７細胞を上記のとおりに１００μＭのＨ２Ｏ２で１０分間刺激した。予備データは、１００μＭのＨ２Ｏ２による１０分の処理が、最高レベルのｐＩκＢαを引き起こすことを示した（図示せず）。Ｃ．コマトゥス抽出物を、それらの、Ｈ２Ｏ２による１０分の細胞刺激でＩκＢαリン酸化に影響を与える能力について試験した。結果は、両方の抽出物が、用量依存性様式でＩκＢαリン酸化に有意に影響を与えることを示した。有機抽出物Ｅ２は、用いた両方の濃度（１００および２００μｇ／ｍＬ）でＩκＢαリン酸化の最も活性な阻害剤であるように思われた。図２に示すとおりに、抽出物Ｅ２は、濃度２００μｇ／ｍＬでＩκＢαリン酸化をほぼ完全に阻害し、１００μｇ／ｍＬの濃度でリン−ＩκＢαレベルの部分的な阻害を引き起こした。抽出物の効果は、それもまた高いリン−ＩκＢα阻害効果を実証したクルクミンの効果に匹敵する（図２）。
【０１２６】
これらの結果と対照的に、１００および２００μｇ／ｍｌの濃度での抽出物Ｅ１は、ＩκＢαのリン酸化を部分的に阻害しただけであった（図３）。
【０１２７】
Ｅ２抽出物が、Ｅ１抽出物よりも非常により強力な阻害剤であったということは、脂質可溶性物質が、ＮＦ−κＢ経路の非常に強力な阻害剤であることを示す。
【０１２８】
３．４ ＩＫＫ活性に対するコプリヌス・コマトゥスＥ１およびＥ２抽出物の効果
ＮＦ−κＢの主要な活性化剤は、ＩκＢキナーゼ複合体（ＩＫＫ）である。この複合体は、２つの触媒サブユニット、ＩＫＫ−αおよびＩＫＫ−β、ならびに調節サブユニット、ＩＫＫ−ｃ（ＮＥＭＯとしても知られる）を包含する。ＮＦ−κＢ経路は、細菌およびウイルス感染、ならびに炎症促進性サイトカインおよびケモカイン（例えば、腫瘍壊死因子ａ（ＴＮＦ−ａ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−６）など）（これらのすべては、ＩκＢαのＮ末端に近い２個の特定のセリンのＩＫＫβによってＩＫＫ複合体リン酸化を活性化し、これは、プロテアソームによるユビキチン化および分解についてＩκＢαを標的とする）によって誘導される。ＮＦ−κＢの活性化をもたらすほとんどすべてのシグナルは、セリン特異的ＩＫＫを含有する高分子量複合体の活性化に集中している。ＩＫＫ複合体の活性化は、ＩκＢαのＮ末端の近くの２つの特定のセリンのＩＫＫβによるリン酸化をもたらし、これは、プロテアソームによるユビキチン化および分解についてＩκＢαを標的とする。
【０１２９】
上記の結果に基づいて、本活性抽出物のＮＦ−κＢ阻害効果は、ＩκＢαリン酸化の上流にあるＮＦ−κＢ経路の調節によると思われた。ＩＫＫ複合体は、セリン３２および３６でＩκＢαをリン酸化し、これは、２６ＳプロテアソームによるＩκＢαのユビキチン化および分解をもたらす。Ｅ１およびＥ２がＩＫＫ活性に影響を与えるかどうかを確立するために、ＥＬＩＳＡベースＩＫＫ活性アッセイを適用した。ＩＫＫ活性に対するＥ１およびＥ２の抽出物の効果は、図４に示す。得られたデータは、Ｅ２抽出物だけが、未処理試料の対照と比較して、ＩＫＫ複合体の活性を阻害することを示した。さらに、Ｅ２は、用いた正の対照、５−（ｐ−フルオロフェニル）−２−ウレイド］チオフェン−３カルボキサミド（Ｆｕｃｔ）の効果、およびＭＯ０４−マラスミウス・オレアデス（Ｍａｒａｓｍｉｕｓ ｏｒｅａｄｅｓ）酢酸エチル粗抽出物に匹敵する、強力な効果を示した。
【０１３０】
（例４）
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の液内培養菌糸体の内容物および化学組成
コプリヌス・コマトゥスの液内培養菌糸体の化学組成は、本技術で周知の従来の方法によって確立し、表７および表８に開示する。
【０１３１】
４．１ 化学内容物
【表７−１】
【表７−２】
【０１３２】
コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１の菌糸体は、１７の遊離のアミノ酸を含有したが、その内の１０個は、必須アミノ酸である（星印を有するもの）：γ−アミノ酪酸＊、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン＊、イソレイシン＊、ロイシン＊、リシン＊、メチオニン＊、フェニルアラニン＊、セリン、トレオニン＊、トリプトファン＊、チロシン、およびバリン＊。
【表８】
【０１３３】
４．２ コプリヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１液内培養バイオマスの多糖類組成の分析
洗浄した細胞を、オートクレーブ中熱水によって１２０℃で１時間抽出した；沈殿物を遠心分離により除去した。少量の溶液を乾燥させ、ＮＭＲで分析した。スペクトル（図５）は、低分子量質量成分の強いシャープなシグナルおよび典型的なタンパク質−多糖類バックグラウンドを示した。この生成物の２次元スペクトルを記録し、低分子量質量成分を、モル比約１：１のトレハロース（α−Ｇｌｃ−１−１−α−Ｇｌｃ、キノコ、例えば、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ）、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｏｎｄｏｓａ）、ナメコ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ ｎａｍｅｋｏ）、およびユダの耳（Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ ａｕｒｉｃｕｌａ−ｊｕｄａｅ）などのキノコの特徴的成分（これらは、乾燥重量形態で１％から１７％パーセントのトレハロースを含み得る））、およびマンニトールと同定した。マンニトール含有量は、ＧＣ分析により推定した。マンニトール含有量は、ＧＣ分析により推定した：１％ｗ／ｗのイノシトール（内部標準）を新鮮な細胞に添加し、混合物を無水酢酸ピリジンによって１００℃で１時間アセチル化した。ＧＣ分析は、細胞のマンニトール含有量が３重量％であることを示したが、その結果としてトレハロース含有量は６％である（それは、マンニトールの分子質量の２倍の分子質量を有する）。
【０１３４】
水抽出後の残渣は、５％ＮａＯＨで処理した（１００℃、３時間）；沈殿物を遠心分離により除去した；溶液を透析し、乾燥させた；収量は４００ｍｇであった；タンパク質含有量は３０％であり、炭水化物含有量は５５％であった。
【０１３５】
全細胞、抽出物、および抽出後の残渣の単糖類の分析を行った；結果は表９および図６に示す。細胞および固形物残渣を、濃ＨＣｌに４０℃で１時間溶解させ、次いで、最終酸濃度２Ｍまで水で希釈した。他の試料は、２Ｍ ＨＣｌに直接溶解させた。加水分解を１００℃で２時間行い、生成物を乾燥させ、糖をアルジトールアセテートに変換し（ＮａＢＨ４還元およびＡｃ２Ｏによるアセチル化）、ＧＣで分析した。不溶性β−グルカンは残渣中にそのまま残り、可溶性成分は抽出により徐々に除去されるので、抽出後の固形物残渣のグルコース含有量は増加する。
【表９】
【０１３６】
透析により水抽出物から低分子質量成分を除去することにより、比色試験により決定して２５％炭水化物および４０％タンパク質を含有する生成物が残った（多糖類に対しフェノール硫酸およびタンパク質に対しローリー法）。多糖類は、ＮＭＲスペクトルに基づいて、デンプン、β−グルカン、およびフコガラクタンと同定した。デンプンアミロース（細胞からの２％ｗ／ｗ）は、ＣａＣｌ２沈殿により純粋形態で単離した。ガラクタン含有量は、単糖類分析から３％と推定した。全抽出物、および細胞のフコース含有量は、定量化には低すぎた。ガラクタンの構造は、ＮＭＲおよびメチル化により分析し、以下に示す：
【化１】
【０１３７】
水およびＮａＯＨの抽出物由来の多糖類は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０上でサイズ排除クロマトグラフィーにより部分的に分離した（図７）。デンプンは最初に溶出され、１Ｈ ＮＭＲスペクトルで同定した。ガラクタンも、空隙容積の近くに溶出され、これは、１０，０００Ｄａと推定された、その分子質量についての公表データと一致した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０についての空隙容積（排除容積）は、デキストランについて１０，０００Ｄａである。ガラクタンは、卵形に近く溶出されたが、わずかに保持され（したがって、その分子質量は、排除質量より大きくなかった）、したがって、それは、１０，０００Ｄａの最大質量を有した。それは、より低い質量画分にも示された。
【０１３８】
可溶性β−グルカンは、明確で支配的な質量はもたずに１０，０００から１０００未満の広い分布の分子質量を有した。クロマトグラフ（図７）からわかるように、β−グルカンは、Ｓｅｐｈａｆｅｘ Ｇ−５０の全分画範囲にわたって、空隙容積から塩までの非常に広いピークとして選定された（５００〜１０，０００Ｄａ）。純粋なβ−グルカンを調製することはできなかった；それは、いくらかの量のデンプン、ガラクタン、およびタンパク質を含有した。アニオン交換クロマトグラフィーでは、タンパク質の部分の除去のために、スペクトル品質が改善されたが、多糖類は完全に分離しなかった。グルカンの低分子質量のために、いくらかの量のグルカンは、透析およびゲルクロマトグラフィーの間に失われた。
【０１３９】
β−グルカンのメチル化分析により、末端、３−、４−、６−、および３，６−置換グルコース残基の２：１：０．３：３：１の比での存在が示された。メチル化分析により、側鎖は、主鎖のあらゆる第３のグルコースに結合していること、および側鎖の平均長は、３糖（ｔ−Ｇｌｃ：６−Ｇｌｃ 約１：２、３−Ｇｌｃ：３，６−Ｇｌｃ 約２：１）であることが示唆される。４−および４，６−置換Ｇｌｃの存在は、デンプンに由来し得る。２−および２，６−置換Ｇａｌのピークは、ガラクタンに属した。
【０１４０】
β−グルカン画分のＮＭＲ分析は、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）グルカンに対するその類似性を示した（図８および表１０）。その構造を以下に示す：
【化２】
（式中、ｍは、１から約１０の間の整数であり、ｎは、約３に等しい整数である）。
【０１４１】
デンプンおよび不溶性β−グルカンの含有量の定量化について、Ｍｅｇａｚｙｍｅアッセイ「Ｍｕｓｈｒｏｏｍ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎ」を用いた。測定は、製造者の説明書に従って行った。細胞、水抽出細胞、水およびＮａＯＨ抽出細胞、水抽出物ならびにＮａＯＨ抽出物の試料を分析した。結果は、表１１に示す。Ｍｅｇａｚｙｍｅアッセイ「Ｍｕｓｈｒｏｏｍ ａｎｄ ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎ」は、加水分解および酵素処理の組合せにより放出された全グルコースの測定、ならびにデンプン含有量の別個の測定に基づく。β−グルカン含有量は、最初の２つの数字の差として計算する。β−グルカンの直接の測定は、用いなかった。
【表１０】
【表１１】
【０１４２】
結論
この試験の結果は、コプリヌス・コマトゥスが、ガノデルマ・ルキドゥム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）キノコから抽出された可溶性β−グルカンと類似している、１，６−結合側鎖を有するβ−１−３−グルコース主鎖を有するβ−グルカンを産生することを示す。Ｃ．コマトゥスは、フコガラクタン、デンプン、トレハロースおよびマンニトールも産生し；これらの成分のすべては、キノコに以前に見出されたものである。可溶性β−グルカンは、低分子質量を有し、熱水で容易に抽出可能である。
【０１４３】
４．３ レクチン含有量。試験した種コルピヌス・コマトゥスＣＢＳ１２３４０１バイオマスは、赤血球凝集能を有する（表１２）。非常に高いレクチンの赤血球凝集力価（１８５８５）が、Ｃ．コマトゥスからのバイオマス抽出物から明らかになった。Ｃ．コマトゥスの特異的な赤血球凝集能は、６２７００Ｕｍｇ−１に達した。
【表１２】
【０１４４】
データは、ラクトース、続いてＧａｌＮＡｃおよびガラクトースが、試験キノコのレクチンの赤血球凝集能の最も広範囲に及ぶ阻害剤であることを示す。ラクトースは、菌類の最も強力な阻害剤であった。ラクトースは、０．７８ｍＭの濃度でＣ．コマトゥスのレクチン活性を阻害した。同時に、キシロース、セロビオース、およびズルシトールは、コプリヌス・コマトゥスバイオマスのレクチン赤血球凝集能を阻害しなかった。
【０１４５】
得られた結果は、Ｃ．コマトゥスは、バイオマスおよび子実体におけるレクチンを蓄積する能力を有することを示した。特に、高い赤血球凝集能が、Ｃ．コマトゥスで明らかとなった。キノコレクチンに対する糖特異性の決定は、ラクトース結合レクチンが、試験菌株の中で最も広範囲に及ぶことを示した。
【０１４６】
（例５）
品種トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の特性
純粋培養における植物性菌糸体。菌糸体コロニーは、白く、綿状で、しばしば、「タフト」（菌糸集合体）を成熟とともに発達させる。非対称に形状化して、通常、外側端部に沿って菌糸体マットを形成する。クランプ連結、融着、および髪様結晶がしばしば、菌糸上にしばしば存在する。
【０１４７】
担子果はしばしば、大きく且つ顕著であり、２〜１０ｃｍ幅および最大５ｃｍの高さ、ほとんど単独、ゼラチン質、若いとき脳の形をしており、湿っており、その後、葉状であり、不規則なクラスター襞を有し、いくつかの波状のひだのある列片からなり、新鮮な標本は黄色から黄色っぽいオレンジ色であり、湿潤のまたは暗い環境で、時に白っぽくまたは全体に無着色および老齢で白色であり、乾燥時に黄色がかったオレジン色からより暗色になる。子実層表面は滑らか、大体つややか。葉肉はゼラチン質で軟らかい。菌糸系は、単一菌糸型。菌糸は、豊富なクランプ連結を有し、ガラス質、薄肉から厚肉、ほとんど１．５〜３μｍ幅、担子果の内部はいくらか広く、ゼラチン化。吸収管細胞は、球形から長楕円、３〜６×２〜４μｍ幅、通常、若い試料を除いて存在し、付着点の近くに豊富。担子器、２種類：１）広く楕円からゆがんだ球形、１０〜２５×１０〜２２μｍ；２）卵形からこん棒形、２０〜３０（〜３５）×１２〜２０μｍ；垂直方向にまたは斜めに隔壁、４胞子、小柄１００〜１５０×２〜３μｍ幅を有し、最大７μｍまで先端に膨らんでいる。担子胞子は、広く楕円から長楕円、（８〜）１０〜１６（〜１８）×（５〜）７〜１０（〜１２）μｍ、滑らか、ガラス質、薄肉、明らかな尖端、メルツァー試薬（Ｍｅｌｚｅｒ’ｓ ｒｅａｇｅｎｔ）に陰性。分生子柄は、密集して分岐、しばしば子実層に豊富、特に若い標本に存在。分生子は、ゆがんだ球形から卵形、および３〜５×２．５〜３．５μｍ、または楕円から円筒形、直径３〜５×（１〜）２μｍ、滑らか、ガラス質、しばしば多数。嚢状体は、通常なし、時に発育の早期に存在、薄肉からわずかに厚肉、最大３．５（〜４）μｍ幅。小胞は、形状および大きさが変わりやすく、球形から楕円形、大部分２０〜３０×５〜１０μｍ、厚肉。胞子紋は、白っぽいまたは浅黄色っぽい。
【０１４８】
生息場所：広葉樹材の朽ちた枝、幹、および切り取った枝の上。
【０１４９】
トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６は、特別の生活環を有する。他の高等担子菌類キノコと対照的に、単一の担子胞子が、菌糸および酵母様出芽性細胞によって栄養培地ブロス上で発芽する。モノ担子菌（Ｍｏｎｏｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｕｓ）培養物は１倍体であり、すなわち、各細胞に１個の核のみを含有する。異なる担子胞子に由来する、２つの和合性１倍体細胞は、接触すると、細胞質体融合および核合体が生じ、核異型菌糸体が発生する。核異型菌糸体は、培養のいかなる条件下でも、出芽性細胞の形態で発育できず、したがって、発育の酵母様型は、キノコ培養物の１倍体状態によって遺伝学的に決定される。貧培地上または枯渇酵母様細胞の状態下で、細胞は１倍体菌糸を生成し得るので、１倍体培養物は、より形成性である。他の微生物のように、単細胞菌類培養物は、菌糸体のものよりバイオテクノロジー処理をより受け入れられる。これは、滅菌菌糸体の形態で発育する担子菌類核異型培養物に特に重要であり、核異型菌糸体の均質化を包含する、担子菌類接種物を調製するための特別の手順が必要とされる。本発明の１倍体酵母様出芽性培養物は、バイオテクノロジーの考慮からだけでなく、菌糸体形態よりも大量の多糖類を生産するその生理学的属性で規定されるように、発育の最適な形態である。
【０１５０】
（例６）
薬用ゼリー状キノコのトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６純粋培養物の発育および生合成活性の制御
トレメッラ・メセンテリカの子実体は、担子胞子紋発達のために採取した。子実体は、クェルクス属の種の死んだ小枝上のペニオポラ属の種（Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ ｓｐ．）に関係した。この標本から得られた１倍体酵母様培養物は、寒天培地上で速い発育を示し、それらの１４個を液内培養条件で一次選別のために用いた。選択された菌株は、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の名称下で、Ｈａｉｆａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＨＡＩ）に寄託されている。
【０１５１】
液内培養条件における選択菌株バイオマス発育のための最適なｐＨ値は、５．５から中性を意味する値（ｎｅｕｔｒａｌ ｍｅａｎｉｎｇ）の範囲で決定された。バイオマスの最大収量は、ｐＨ６．３５を有する液体麦芽抽出物培地上で得られた。
【０１５２】
バイオマス蓄積に好適な培地組成物の最適化により、スクロースが、グルコースと同様に適切な炭素源であることが実証された。
【０１５３】
ペプトンおよび酵母抽出物の混合物は、良い窒素源であるが、前に調べたアンモニウム塩は、培地のｐＨを非常に急速に低下させた。リン塩の添加は、バイオマスの収量増加をもたらさなかったので、それらは、細胞成長のためのリンも十分に含有した。酢酸マグネシウムは、ＭｇＳＯ４より生理学的にアルカリ性と考えられ、事実、培地の急速な酸性化を防止した。
【０１５４】
わずかに改変した培地は、以下の組成（ｇ／ｌ）：スクロース−２０．０；ペプトン−２．０；酵母抽出物−２．２５；酢酸Ｍｇ−１．０；ＫＣｌ−１．０の標準「接種培地」としてさらに用いた。１２０℃で３０分間滅菌後の培地のｐＨは、６．５に近い。
【０１５５】
「発酵培地」の最適組成は、以下のとおりであることが見出された：トレメッラ・メセンテリカを、部分Ａ（（ｇ／Ｌ）スクロース、５０．０；酵母抽出物 ０．５；ＫＣｌ、１．０；酢酸Ｍｇ・４Ｈ２Ｏ、１．０からなる）と部分Ｂ（（ｇ／Ｌ）ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．５およびＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０からなる）を混合することにより調製した培地中で培養した。
【０１５６】
溶液が、滅菌後に室温まで冷えたときに、部分Ｂを、部分Ａを含むフラスコに添加した。
【０１５７】
Ｔ．メセンテリカの培養は、７２時間継続し、その時点で、培養液中のＴＭＰは、２７．０ｇ／ｌに達した（表１３）。沈殿後、分離させ、乾燥させて、１７０ｇのＴＭＰ調製物が得られた。
【表１３】
【０１５８】
（例７）
トレメッラ・メセンテリカの内容物および化学組成
７．１一般的組成。トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６液内培養粗生産物は、等しい割合の菌株生産体および細胞外多糖グルコロノキシロマンナンの、細胞バイオマスからなった。この場合の一般的組成を、表１４に示す。
【表１４】
【０１５９】
化学組成は、イスラエルにおける２つの異なった、独立した施設（Ｂａｃｔｃｈｅｍ ＣＯ．およびＡｍｉｎｏｌａｂｓ Ｃｏ．）で決定し、表１５から表１７に開示する。
【表１５】
【表１６】
【０１６０】
７．２ 粗食物繊維は、ヘミセルロース、低分子多糖類（デキストリンなど）、および細胞壁成分（β−（１−３）−グルカンなど）を包含する。
【０１６１】
７．３ ビタミン。トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６のバイオマスでは、ビタミンＡ（レチノール）、Ｃ（アルコルビン酸）、Ｅ（α−トコフェロール）、およびビタミンＢ群が見出された。
【表１７】
【０１６２】
ビタミンＢ群の中で、感受性栄養要求体微生物の成長特性の推定に基づく、微生物学的方法で決定して、Ｔ．メセンテリカバイオマスは、ナイアシンに特に富んでおり、且つビタミンＡに富んでいる。
【０１６３】
７．４ トレメッラ・メセンテリカ（ＣＢＳ１２３２９６）中グルカンおよびグルクロノキシロマンナン
組成は、全トレメッラ・メセンテリカ液内バイオマス、および超遠心分離後に得られた画分のＧＣ分析（グルコース、マンノースおよびキシロースの含有量）により決定した。グルカンは、１２００００ｇで完全に沈殿し、グルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）は溶液中に大部分残存するが、同様に部分的に沈殿する。ＧＸＭは、多糖バイオマスの乾燥重量の約７０％、グルカンは約３０％を構成することがわかった。
【０１６４】
ＧＸＭを含まない純粋グルカンは、高出力超音波により処理したトレメッラ・メセンテリカの分離により得た。超音波処理ＧＸＭは、水により良く可溶性であり、超遠心分離で沈殿せず、したがって、純粋β−グルカンは、２回の再沈殿後に単離することができる。１．２ｇのトレメッラ・メセンテリカの分離により、４００ｍｇの沈殿物（約１０％のＧＸＭを含むグルカン）および８００ｍｇの可溶性生成物（ＧＸＭ）が得られた。
【０１６５】
ＧＣ分析において、ＧＸＭ含有量は、（Ｍａｎ＋Ｘｙｌ）＊１．３（１．３は、ＧｌｃＡおよび酢酸塩を補償するために用いた）と見なした。新たに単離したトレメッラ・メセンテリカ（ＣＢＳ１２３２９６）中のグルクロノキシロマンナンの構造は、他のトレメッラ・メセンテリカ菌株から単離したグルクロノキシロマンナンといくらか異なっていることがわかった（図示せず）。グルカンは、グルコース含有量から推定した。グルクロノラクトンのＧｌｃへの還元を避けるために、加水分解は、ＮａＢＨ４による還元前に２４％ＮＨ３で処理した。グルカンは、加水分解に用いた３Ｍ ＴＦＡに十分可溶性でないので、他の組の試料を加水分解前に濃ＨＣｌで処理した（４０℃、１時間）。この手順は、Ｇｌｃ回収の増加をもたらすが、キシロースは、一部分は分解する。
【０１６６】
β−グルカンのメチル化により、これは３−および４−置換グルコースを主成分として有する直鎖状構造を有することが示された（図９および図１０）。したがって、グルカンは、３，４−β−グルカンである。グルカンは、ＤＭＳＯに十分可溶性ではなく、したがって、それを２回メチル化した；依然として一部の部分は、溶解しなかったが、これは、結果に影響し得る。グルカンは水に可溶性ではない。
【０１６７】
（例８）
トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６調製物のインターフェロン生成および免疫調節特性
１８〜２０ｇの体重の雑種マウスを試験に用いた。これらのマウスに、トレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６の液内単細胞バイオマスによって、餌を経口で与えた。
【０１６８】
マウスを、本調製物で処理６時間後、２４時間後および４８時間後に殺し、次いで、血漿を採取し、インターフェロン（ＩＦＮ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レベルを決定し、腹膜の滲出液のマクロファージは、本調製物に対する食作用系機能活性応答を調査することを目的とした。
【０１６９】
８．１ 血漿ＩＦＮレベル
インターフェロン生成特性は、表１８に示し、経口によりマウスに投与した４ｍｇ／動物でのバイオマスの単回用量は、２４時間後に低力価（８０単位／ｍｌ）の内因性ＩＦＮの合成を誘導したことを示す。上記用量のトレメッラ・メセンテリカバイオマスで処置した動物の血清中のＩＦＮレベルは、４８時間後に８０単位／ｍｌに増加したままであった。
【０１７０】
１０ｍｇ／動物の用量でのトレメッラ・メセンテリカバイオマスは、より活性であるように見え、投与６時間後に８０単位／ｍｌの内因性ＩＦＮ力価の生成を生じさせた。本調製物投与２４時間後に、動物血清中のＩＦＮ力価は、最大１６０〜３２０単位／ｍｌに達した。さらに（４８時間で）、血清ＩＦＮのレベルは、低下したが、対照の指数と比較して上昇したまま（８０単位／ｍｌ）であった。
【表１８】
【０１７１】
本試験で決定された血漿中の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レベルによれば、トレメッラ・メセンテリカバイオマスは、インビボでこのサイトカインの合成をもたらさなかった（図示せず）。同時に、これらの調製物は、内因性の体中毒を低下させることを補助し得る。これは、対照マウスの血漿中で検出されたＴＮＦによって証明される（生理溶液の導入で）。本調製物の使用は、対照動物の血漿中のＴＮＦの量の低下をもたらした。
【０１７２】
８．２ トレメッラ・メセンテリカバイオマスに対する腹膜滲出液のマクロファージの機能活性の応答。腹膜浸出液のマクロファージの機能活性は、ニトロブルーテトラゾリウムの非基質還元の反応である、Ｎｉｔｒｏ Ｂｌｕｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）試験で評価した。ＮＢＴ試験は、マクロファージのＮＢＴ還元能の低下が、それらの酸素依存性殺生物特性の病理学と同時に起こるため、マクロファージの機能活性の調査によく使用される。ＮＢＴ試験におけるマクロファージの活性は、インビトロでの追加の細胞刺激なしで（自発的試験）およびＳｔ．アウレアス（Ｓｔ．ａｕｒｅａｓ）細胞と一緒のインビトロでのそれらの刺激によって（刺激試験）調査した。刺激ＮＢＴ試験は、食作用を完了するための容易性の細胞化学的基準と見なされる。自発的および刺激ＮＢＴ試験の指数の間の差は、細胞機能リザーブ（ＦＲ）とみなし、これは、一般的な免疫リザーブ（ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｒｅｓｅｒｖｅ）についての概念に良く当てはまる、食細胞系のエフェクター潜在性を反映する。
【０１７３】
経口で投与された４および１０ｍｇ／動物でのトレメッラ・メセンテリカバイオマスの単回用量は、自発的および刺激ＮＢＴ試験における腹膜滲出液のマクロファージの酸素依存性殺生物活性指数を変更することが見出された（表１９）。トレメラスチン（Ｔｒｅｍｅｌｌａｓｔｉｎ）の食細胞活性応答は、用量および観察時間に依存したことが言及されるべきである。例えば、４ｍｇ／動物用量のトレメッラ・メセンテリカバイオマスを投与して６時間後に、酸素依存性殺生物活性およびマクロファージのＦＲのわずかな低下が、自発的および刺激ＮＢＴ試験の両方で生じた。表１９に示すデータは、２４時間後および４８時間後に、自発的ＮＢＴ試験の指数は増加して、４ｍｇ／動物でのトレメッラ・メセンテリカバイオマスの応答における対照指数値に達したことを示す。しかし、対照と比較して、示された観察期間（２４時間および４８時間における）の間に刺激ＮＢＴ試験において、マクロファージ活性の酸素依存性殺生物活性の劇的な増加が生じ、これは、それらのＦＲの顕著な増加をもたらした。
【表１９】
【０１７４】
トレメッラ・メセンテリカバイオマスの１０ｍｇ／動物の単回用量に対する応答において、自発的ＮＧＴ試験の指数のわずかな増加が６時間後に観察されたが、２４時間後および４８時間後に、その値は対照指数レベルまで低下した。同時に、マクロファージ活性の顕著な増加が、刺激ＮＢＴ試験で全体の観察期間の間に、６時間、２４時間および４８時間で観察された。１０ｍｇ／動物のトレメッラ・メセンテリカバイオマスで処理されたマウスマクロファージの刺激ＮＢＴ試験指数の増加は、ＦＲ細胞の劇的な増加をもたらした。表１９からのとおりに、ＦＲ増加は６時間後に起こり、４８時間で最大に達した。
【０１７５】
本発明者らの研究から分かるように、トレメッラ・メセンテリカバイオマスは、自発的ＮＢＴ試験の指数に対して影響は少なかったが、それは、刺激ＮＢＴ試験で、マクロファージ活性の顕著な増加を引き起こし、このようにして、食細胞系のリザーブ潜在力を増加させた。
【０１７６】
本発明者らの調査の結果から分かるように、自発的ＮＢＴ試験における６時間後のマクロファージの酸素依存性殺菌活性は、対照と比較して変わらないままであった。同時に、刺激ＮＢＴ試験指数は、６時間後に増加し、これは、細胞ＦＲの顕著な増加をもたらした。２４時間後、自発的ＮＢＴ試験指数は、対照と比べて変わらないままであり、刺激試験の指数は、増加する傾向があり、細胞のＦＲも変わらないままであった。
【０１７７】
８．３要約。本調査の結果の分析によれば、トレメッラ・メセンテリカバイオマス調製物の４および１０ｍｇ／動物の単回用量により、少しのインターフェロン生成活性がもたらされ、「遅い」内因性インターフェロンの生成が誘導される。トレメッラ・メセンテリカバイオマス調製物は、より活性なインターフェロノージェンであるように見え、さらに、それは、１０ｍｇ／動物に濃縮した場合、最も効率的である。トレメッラ・メセンテリカバイオマス調製物の１０ｍｇ／動物に対する応答では、血清中のインターフェロン力価のピーク値（１６０〜３２０単位／ｍｌ）に２４時間で到達し、次いで、これは、観察の全期間中に依然として高いままで低下した。トレメッラ・メセンテリカバイオマスは、動物体におけるインターフェロンの少量の生成を準備し、開始させる、すなわち、他のインターフェロノージェンと一緒に注射される場合、インターフェロン合成を強化することが予期される。
【０１７８】
トレメッラ・メセンテリカバイオマスへの応答におけるＮＢＴ試験での腹膜滲出液マクロファージの機能活性強化が観察された。１０ｍｇ／動物に濃縮されたトレメッラ・メセンテリカバイオマスは、マクロファージの酸素依存性殺生物活性の最も効率的な活性化剤であると思われた。本調製物は、刺激ＮＢＴ試験指数の増加をもたらし（自発的ＮＴ試験の変わらない指数において）、これは、食細胞系の機能リザーブの劇的な増加をもたらした。食細胞系のリザーブ潜在力の増加は、日和見細菌またはウイルス誘導感染の発生を予防するために重要であることが言及されるべきである。体のさらなる病原菌誘導の汚染を予防する可能性もある。マクロファージのより高い殺菌活性ならびにより高い機能リザーブ（自発的および刺激ＮＢＴ試験の指数の間の差を有する）は、体におけるインターフェロン生成と相関したトレメッラ・メセンテリカバイオマス調製物を説明するものであった。これに関しては、食細胞が体におけるＩＦＮ作用の主な標的であるので、酸素依存性マクロファージ殺生物活性の活性化は、トレメッラ・メセンテリカバイオマス（および、恐らくは他のサイトカイン、これには、さらに調査が必要である）による内因性ＩＦＮの誘導と関連する。さらに、本調製物で活性化された食細胞は、自己分泌および傍分泌の活性化技術によって内因性ＩＦＮの生成に関与することができることがあり得る。
【０１７９】
（例９）
植物ウイルスに対する植物抵抗性に対するトレメッラ・メセンテリカＣＢＳ１２３２９６抽出物およびグルクロノキシロマンナンの効果
担子菌類の培養液および子実体から単離した多糖類の化学特性を研究したとき、本発明者らは、中性および酸性多糖類を明らかにした。特に、トレメッラ・メセンテリカにより産生されるグルクロノキシロマンナン（ＧＸＭ）の酸性多糖は、キシロースおよびグルクロン酸のβ−（１→２）（１→４）−結合オリゴ糖によりグリコール化された、α−（１→３）−結合マンナンの直鎖状骨格からなり、これは、ポリアニオン特性を与える。既知のデータに基づいて、中性および酸性グルカンは、抗植物ウイルス活性の異なる特性を有すると想定することが可能である。
【０１８０】
実際、調査した多糖類は、チョウセンアサガオ植物に対してＴＭＶにより誘導された局所損傷の発生を異なって阻害した（表２０）。
【０１８１】
中性多糖類は、最も活性であることが証明された。局所損傷形成の低下は、最大８０および９９．４％（１００〜１０００μｇ／ｍＬの濃度において）であった。ＧＸＭは、活性がかなり低く、この場合、全調製物は、中間位置を占め、ＴＭＶの感染性に対する全調製物の活性は、中性多糖類によってより大きな程度に誘導されることの証拠を明らかにした。後者により、超感受性植物におけるウイルス感染性に対する中性多糖類が、それらの硫酸塩誘導体よりもより活性である、文献からのデータが確認され、これは、新たに植物のウイルス抵抗性を主に誘導する。得られた結果に基づいて、硫酸化マンナンと類似であるＧＸＭが、ウイルスに対する植物の遺伝学的依存抵抗性を誘導し得るかどうか調査することが重要である。１０００〜２５００μｇ／ｍＬの濃度でのＧＸＭは、ＴＭＶに対するタバコおよびチョウセンアサガオ植物の抵抗性を誘導し得ることがわかった（表２１）。この場合、ＡＶＲは、チョウセンアサガオ植物におけるよりもタバコ植物においてより高いようにみえた。言い換えれば、本多糖類によるＡＶＲの活性化は、超感受性宿主植物の遺伝子型に、その結果として、抵抗性の適切な遺伝子の活性に依存する。
【表２０】
【０１８２】
抵抗性発生の調査により、１０００および２５００μｇ／ｍＬの濃度でのＧＸＭは、誘導剤による接種後の最初の日に既にタバコ植物におけるＴＭＶに対するＡＶＲの発生を誘導することが示された（図１１および図１２）。植物組織における継続した多糖類存在下で１０００μｇ／ｍＬに等しかった、ＧＸＭの濃度について、抵抗性のレベルは、３０％に−第５日目において、および２０％に−第７日目において徐々に低下する（図１１）。２５００μｇ／ｍＬに等しかった、ＧＸＭの濃度について、このような傾向は観察されない（図１２）。対照的に、この事実は、遺伝子レベルでのＡＶＲの多糖類誘導の濃度依存性対してだけでなく、より低いおよびより高い濃度のＧＸＭに適合する植物の種々の能力について証拠を与え得る。
【表２１】
【０１８３】
実験および対照の半分の葉上のＴＭＶ局所損傷の大きさの測定に基づいて、２５００μｇ／ｍＬの濃度で、ＧＸＭは、ウイルス損傷の増大を強めることが明らかになった（図１３）。このＧＸＭの濃度で、壊死の増加の確実な刺激が、植物組織中へ誘導剤を接種してからわずか７日後に観察されるが、このような傾向は、多糖類使用の他の期間に観察される。１０００μｇ／ｍＬの濃度のＧＸＭで処理した半部の葉について、実験と対照の間の局所損傷の大きさの確実な差は、観察されなかった。
【０１８４】
局所壊死の増大に対する同様の影響が、酵母ＲＮＡによってもたらされることが知られている。この現象は、誘導剤の影響下での抵抗性の超感受性機構の植物における活性化によって説明され得る。
【０１８５】
アクチノマイシンＤ（ＡＭＤ）による実験において、この抗生物質が、植物のＧＸＭ誘導ウイルス抵抗性の発生を阻害することが確立された（図１４）。その適用の方法に係わらず（ＧＸＭの導入と同時にまたは２日後に）、ＡＭＤは、部分的に（２０μｇ／ｍＬ）または完全に（１０μｇ／ｍＬ）のいずれかで、ポリアニオンで誘導されたＡＶＲの発生を阻害した。２０μｇ／ｍＬの濃度のアクチノマイシンＤによるＡＶＲの不完全な阻害は、植物組織に対する抗生物質毒性に起因し得る。後者は、ＡＭＤがＧＸＭの不存在下で葉に注射された、対照における壊死の数の低下で確認される。
【０１８６】
全体として、得られた結果は、ＧＸＭによって超感受性植物中に接種されたＡＶＲは、細胞ＤＮＡのマトリックス上の新たなＲＮＡの合成に依存するという結論になる。言い換えれば、ＤＮＡが、新たにウイルスに対する植物抵抗性を活性化させるそれら誘導剤に帰することができる。
【０１８７】
したがって、ＧＸＭは、新たにウイルス感染の作用に対する超感受性タバコ植物の抵抗性を誘導するが、この抵抗性は、アクチノマイシンＤの作用に感受性であるからであることが確立された。一方、その活性は、以前に研究した硫酸化多糖類および酵母ＲＮＡの作用と同様であり；他方、その活性は、タンパク質−炭水化物相互作用に基づく超感受性機構を活性化する中性多糖類と同様である。
【０１８８】
植物における自然なおよび誘導された抵抗性の機構が、全体として、総合的に研究されてこなかったことを考慮して、自然なウイルス抵抗性を増加させることができる物質の探索が有望である。本発明者らの見解では、このような研究の結果は、多糖類およびまた糖タンパク質が、超感受性植物におけるＡＶＲの活性化に関与する内因性誘因のモデルとして将来使用することができるので、重要性を有する。このような物質は、農業および観賞植物生育におけるウイルス感染の損傷を低下させる目的をもつ実際の適用にとっても興味深い。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記から選択される新規で明確な品種の高等担子菌類キノコ：
ブダペスト条約下、Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）にアクセション番号ＣＢＳ１２３４０１で寄託されたコプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＨＡＩ−１２３７（以下、コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１）およびブダペスト条約下、Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）にアクセション番号ＣＢＳ１２３２９６で寄託されたトレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＨＡＩ−１７（以下、トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６）。
【請求項２】
炭水化物、必須アミノ酸に富んだタンパク質、ビタミン、必須脂肪酸に富んだ脂質、抗酸化剤およびミネラルを包含する、栄養補給剤および生物活性化合物に富み、コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１の子実体もしくは菌糸体、またはトレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から、好ましくは栄養培地での液内培養におけるキノコの培養によって得られる請求項１に記載のキノコのバイオマス。
【請求項３】
コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１の炭水化物が、トレハロース、β−グルカン、好ましくは低分子量の水溶性β−グルカン、およびガラクタン、好ましくは中性フコガラクタンを包含し、トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６の炭水化物が、β−グルカン、好ましくは直鎖状３，４β−グルカン、およびグルクロノキシロマンナンを包含する、請求項２に記載の菌糸体バイオマス。
【請求項４】
コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１の子実体もしくは菌糸体、またはトレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から、好ましくはキノコの純粋液内菌糸体培養物から得られる、栄養補給および生物活性を有する請求項１に記載のキノコの抽出物。
【請求項５】
コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１培養物から得られ、且つ低分子量の水溶性β−グルカンおよび／もしくはガラクタン、好ましくは中性フコガラクタンに富んでいる、またはトレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６培養物から得られ、且つ直鎖状３，４β−グルカンおよび／もしくはグルクロノキシロマンナンに富んでいる、請求項４に記載の抽出物。
【請求項６】
請求項２もしくは３に記載のバイオマス、請求項４もしくは５に記載の抽出物、あるいは前記バイオマスまたは抽出物の混合物、を含む組成物。
【請求項７】
コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１の菌糸体もしくは子実体から得られる栄養補給剤および生物活性物質に富んだバイオマスまたは前記バイオマスの抽出物を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から得られる栄養補給剤および生物活性物質に富んだバイオマスまたは前記バイオマスの抽出物を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１の純粋液内菌糸体培養物。
【請求項１０】
トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６の純粋液内菌糸体培養物であって、単細胞バイオマスの形態である純粋液内菌糸体培養物。
【請求項１１】
β−１−６−Ｄ−グルコース残基の側鎖として下記構造をいくつかの６位に有するβ−１−３−結合Ｄ−グルコース残基の骨格構造から構成される低分子量の水溶性β−グルカンであって、好ましくは１０，０００Ｄａ未満、好ましくは約１０００から約１０，０００Ｄａの分子量を有するもの：
【化１】
式中、ｍは１から約１０の間の整数であり、ｎは約３に等しい整数である。
【請求項１２】
コプリヌス・コマトゥス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）、好ましくはコプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１から得られる、請求項１１に記載のβ−グルカン。
【請求項１３】
トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６から得られる、水不溶性直鎖状３，４β−グルカン。
【請求項１４】
トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６から得られるグルクロノキシロマンナン。
【請求項１５】
下記から選択される炭水化物を含む組成物：
（ａ）請求項１１もしくは１２に記載の低分子量の水溶性β−グルカン；
（ｂ）請求項１３に記載の水不溶性直鎖状３，４β−グルカン；
（ｃ）請求項１４に記載のグルクロノキシロマンナン；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の少なくとも２種の炭水化物の組合せ。
【請求項１６】
請求項６から８までのいずれかまたは請求項１５に記載の組成物を含む食品サプリメント、医薬、プレバイオティクス、栄養補給剤、飲料または美容製品。
【請求項１７】
請求項６から８までのいずれかまたは請求項１５に記載の組成物を含むペットフード、殺虫剤、抗寄生虫剤または抗植物ウイルス製品。
【請求項１８】
薬学的に許容される担体、および以下から選択される活性成分を含む医薬組成物：
（ａ）請求項６から８までのいずれかもしくは請求項１５に記載の組成物；
（ｂ）請求項１１もしくは１２に記載の低分子量の水溶性β−グルカン；
（ｃ）請求項１３に記載の水不溶性直鎖状３，４β−グルカン；
（ｄ）請求項１４に記載のグルクロノキシロマンナン；または
（ｅ）（ｂ）〜（ｄ）のうちの少なくとも２種の活性成分の組合せ。
【請求項１９】
糖尿病の処置；血糖値の低下；免疫調節性応答の誘導；血液コレステロールレベルの低減；またはコレステロールの蓄積の低減のための請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
担体および請求項６から８までのいずれかもしくは請求項１５に記載の組成物または請求項１５に記載のグルクロノキシロマンナンから選択される活性成分を含む農業用組成物。
【請求項２１】
植物ウイルスに対する植物の抵抗性を誘導するための請求項２０に記載の農業用組成物。
【請求項１】
下記から選択される新規で明確な品種の高等担子菌類キノコ：
ブダペスト条約下、Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）にアクセション番号ＣＢＳ１２３４０１で寄託されたコプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＨＡＩ−１２３７（以下、コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１）およびブダペスト条約下、Ｃｅｎｔｒａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）にアクセション番号ＣＢＳ１２３２９６で寄託されたトレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＨＡＩ−１７（以下、トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６）。
【請求項２】
炭水化物、必須アミノ酸に富んだタンパク質、ビタミン、必須脂肪酸に富んだ脂質、抗酸化剤およびミネラルを包含する、栄養補給剤および生物活性化合物に富み、コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１の子実体もしくは菌糸体、またはトレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から、好ましくは栄養培地での液内培養におけるキノコの培養によって得られる請求項１に記載のキノコのバイオマス。
【請求項３】
コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１の炭水化物が、トレハロース、β−グルカン、好ましくは低分子量の水溶性β−グルカン、およびガラクタン、好ましくは中性フコガラクタンを包含し、トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６の炭水化物が、β−グルカン、好ましくは直鎖状３，４β−グルカン、およびグルクロノキシロマンナンを包含する、請求項２に記載の菌糸体バイオマス。
【請求項４】
コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１の子実体もしくは菌糸体、またはトレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から、好ましくはキノコの純粋液内菌糸体培養物から得られる、栄養補給および生物活性を有する請求項１に記載のキノコの抽出物。
【請求項５】
コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１培養物から得られ、且つ低分子量の水溶性β−グルカンおよび／もしくはガラクタン、好ましくは中性フコガラクタンに富んでいる、またはトレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６培養物から得られ、且つ直鎖状３，４β−グルカンおよび／もしくはグルクロノキシロマンナンに富んでいる、請求項４に記載の抽出物。
【請求項６】
請求項２もしくは３に記載のバイオマス、請求項４もしくは５に記載の抽出物、あるいは前記バイオマスまたは抽出物の混合物、を含む組成物。
【請求項７】
コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１の菌糸体もしくは子実体から得られる栄養補給剤および生物活性物質に富んだバイオマスまたは前記バイオマスの抽出物を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６の菌糸体から得られる栄養補給剤および生物活性物質に富んだバイオマスまたは前記バイオマスの抽出物を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
コプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１の純粋液内菌糸体培養物。
【請求項１０】
トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６の純粋液内菌糸体培養物であって、単細胞バイオマスの形態である純粋液内菌糸体培養物。
【請求項１１】
β−１−６−Ｄ−グルコース残基の側鎖として下記構造をいくつかの６位に有するβ−１−３−結合Ｄ−グルコース残基の骨格構造から構成される低分子量の水溶性β−グルカンであって、好ましくは１０，０００Ｄａ未満、好ましくは約１０００から約１０，０００Ｄａの分子量を有するもの：
【化１】
式中、ｍは１から約１０の間の整数であり、ｎは約３に等しい整数である。
【請求項１２】
コプリヌス・コマトゥス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）、好ましくはコプリヌス・コマトュス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｏｍａｔｕｓ）ＣＢＳ１２３４０１から得られる、請求項１１に記載のβ−グルカン。
【請求項１３】
トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６から得られる、水不溶性直鎖状３，４β−グルカン。
【請求項１４】
トレメッラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣＢＳ１２３２９６から得られるグルクロノキシロマンナン。
【請求項１５】
下記から選択される炭水化物を含む組成物：
（ａ）請求項１１もしくは１２に記載の低分子量の水溶性β−グルカン；
（ｂ）請求項１３に記載の水不溶性直鎖状３，４β−グルカン；
（ｃ）請求項１４に記載のグルクロノキシロマンナン；または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の少なくとも２種の炭水化物の組合せ。
【請求項１６】
請求項６から８までのいずれかまたは請求項１５に記載の組成物を含む食品サプリメント、医薬、プレバイオティクス、栄養補給剤、飲料または美容製品。
【請求項１７】
請求項６から８までのいずれかまたは請求項１５に記載の組成物を含むペットフード、殺虫剤、抗寄生虫剤または抗植物ウイルス製品。
【請求項１８】
薬学的に許容される担体、および以下から選択される活性成分を含む医薬組成物：
（ａ）請求項６から８までのいずれかもしくは請求項１５に記載の組成物；
（ｂ）請求項１１もしくは１２に記載の低分子量の水溶性β−グルカン；
（ｃ）請求項１３に記載の水不溶性直鎖状３，４β−グルカン；
（ｄ）請求項１４に記載のグルクロノキシロマンナン；または
（ｅ）（ｂ）〜（ｄ）のうちの少なくとも２種の活性成分の組合せ。
【請求項１９】
糖尿病の処置；血糖値の低下；免疫調節性応答の誘導；血液コレステロールレベルの低減；またはコレステロールの蓄積の低減のための請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
担体および請求項６から８までのいずれかもしくは請求項１５に記載の組成物または請求項１５に記載のグルクロノキシロマンナンから選択される活性成分を含む農業用組成物。
【請求項２１】
植物ウイルスに対する植物の抵抗性を誘導するための請求項２０に記載の農業用組成物。
【図１】
【図３】
【図４】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図５】
【図７】
【図３】
【図４】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図５】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５２０２８９（Ｐ２０１２−５２０２８９Ａ）
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５３５９９（Ｐ２０１１−５５３５９９）
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００２０２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０３５１９
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（５１１２２０８６５）パルメッド テバ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１０日（２０１０．３．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００２０２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０３５１９
【国際公開日】平成２２年９月１６日（２０１０．９．１６）
【出願人】（５１１２２０８６５）パルメッド テバ リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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