新規生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４とその製造方法
ユビキチン活性化酵素の阻害活性と、細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害活性と、抗腫瘍活性とその他の種々な生物学的活性とを示し且つ新しい分子骨格を有する生理活性物質として、次式（Ｉ）
〔式中、２位、３位、４位および７位の立体配置はそれぞれＳ、Ｓ、Ｒ、Ｒである〕で表される化合物であるＲＳ−Ｋ３５７４物質がヒラタケ科カワキタケ属アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）・Ｋ−３５７４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６５）の培養により製造された。ＲＳ−Ｋ３５７４物質はユビキチン活性化酵素の阻害活性と細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害活性とを有し、また細胞内のタンパク質の生合成を阻害する活性を有し、さらに抗腫瘍活性、抗癌活性および抗炎症活性ならびに抗ウィルス活性を有する生理活性物質である。
〔式中、２位、３位、４位および７位の立体配置はそれぞれＳ、Ｓ、Ｒ、Ｒである〕で表される化合物であるＲＳ−Ｋ３５７４物質がヒラタケ科カワキタケ属アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）・Ｋ−３５７４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６５）の培養により製造された。ＲＳ−Ｋ３５７４物質はユビキチン活性化酵素の阻害活性と細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害活性とを有し、また細胞内のタンパク質の生合成を阻害する活性を有し、さらに抗腫瘍活性、抗癌活性および抗炎症活性ならびに抗ウィルス活性を有する生理活性物質である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ユビキチン活性化酵素に対する阻害活性と細胞内タンパク質のユビキチン化に対する阻害活性とを有し、また細胞内のタンパク質の生合成を阻害する活性を有し、さらに抗腫瘍または抗癌活性を示す新規な生理活性物質であるＲＳ−Ｋ３５７４物質に関する。また、本発明は前記の生理活性物質、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の製造法に関する。さらに本発明は、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ユビキチン活性化酵素の阻害剤、ならびに生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害剤に関し、また生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分とする抗腫瘍剤組成物、抗炎症剤組成物および抗ウィルス剤組成物に関する。また、本発明は、新規生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞に対する殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線のアポトーシス誘発作用の増強剤、および癌細胞内のタンパク質生合成の阻害剤、ならびにＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化に対する阻害剤を包含する。
【背景技術】
種々な多数の酵素阻害剤が知られており、また種々な多数の生理活性物質が知られている。これら酵素阻害剤あるいは生理活性物質を、様々な疾病の治療薬として応用するための取り組みがなされている。また細胞の増殖、分化、生育ならびに細胞死などにおける極めて重要かつ必須の制御機構の一つとして、細胞内のタンパク質のユビキチン化反応があることが知られる。この細胞内タンパク質のユビキチン化反応を抑制できる活性をもつ物質は、疾病の治療と予防に広く応用されることが期待されるので要望されているが、現在まで、その細胞内タンパク質のユビキチン化反応を阻害できる活性をもつ物質は発見されていない。
癌細胞や免疫細胞での細胞増殖や細胞死が起こる際に、急性または慢性の炎症が起こる際に、免疫過敏や免疫不全などの免疫応答が起こる際に、アルツハイマー症を含む神経疾患が起こる際に、ならびにＨＩＶウィルスを含む病原ウィルスの感染や増殖が起こる際に、さらに卵子の受精や発生などでの、正常な分化が起きる際に、極めて重要かつ必須な役割を果たす機構の一つとして、ユビキチンを活性化する酵素が関与するところの細胞内タンパク質のユビキチン化機構があることが知られる。
例えば、ＨＩＶ−１ウィルスまたはＨＩＶ−２ウィルスが感染している細胞内では、これらＨＩＶウイルスの出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）、成熟化、感染力獲得にタンパク質のユビキチン化が関与することが知られ、また細胞内に在る酵素であるユビキチン活性化酵素がユビキチンの活性化に関与することが知られる。さらにＨＩＶウィルスが感染している細胞内で、プロテアソームを阻害することによって、ＨＩＶ由来のユビキチン化されたタンパク質の限定的な分解を止めると、ＨＩＶウィルスの出芽、成熟化、感染力獲得、増殖を阻害できることが知られる〔ＰＮＡＳ，９７巻２４号１３０５７〜１３０６２頁（２０００年１１月）〕。
さらに、急性または慢性の炎症が起こる際には、必らず、炎症性サイトカインによるＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化が起こることが知られ、このＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化は、その活性化に伴って、遺伝子ＭＡＤ−３を発現する〔Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．６５，ｐｐ１２８１−１２８９頁（１９９１）〕。
因みに、カワキタケ（Ｐａｎｕｓ）属に属するパヌス・ルジス（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）ＮＲＲＬ３８２１とパヌス・コンシャタス（Ｐａｎｕｓｃｏｎｃｈａｔｕｓ）ＮＲＲＬ３２５３により産生される次式（Ａ）
で表されるパネポキシドン（ｐａｎｅｐｏｘｙｄｏｎｅ）が知られる〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２２６号２１４〜２２１頁（１９９６）〕。そして、この文献には、パネポキシドンが炎症の惹起に関与するＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化を阻害できる活性をもつことが記載されるが、パネポキシドンは細胞内のタンパク質、ＲＮＡまたはＤＮＡの生合成を阻害する活性を示さないことが記載される。パネポキシドン分子の立体的化学構造の研究は、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，５３巻Ｆａｓｃ．７（１９７０），第１８６号１５７７〜１５９７頁に記載されてあり、この後者の文献１５７８頁の表２および１５７９頁の記載によれば、パネポキシドンは比旋光度［α］Ｄ２０−６１°（溶媒、ジクロロメタン）を示す淡黄色の粘稠な油状物質である。
前述したように、細胞内のタンパク質のユビキチン化反応は、重要な生化学反応であるが、しかし、細胞内のタンパク質のユビキチン化反応を直接に阻害できる活性をもつ物質は、現在のところ未だ発見されていないので、そのような活性の新しい物質が現在も要望されている。細胞内のタンパク質をユビキチン化する機構を阻害できる活性をもつ新しい物質を提供することができるならば、そのような新しい物質は、従来知られているまたは使用されているところの既知の抗腫瘍性化合物、消炎・鎮痛性化合物、抗リウマチ薬、抗悪疫質剤、免疫抑制物質または免疫活性化物質、抗ウィルス薬、抗痴ほう薬、抗心筋症薬、抗肥満薬、抗糖尿病薬、臓器不全対処薬とは、異なる作用点を有し且つ新規な化学構造を有した化合物として利用できることが期待される。上記のような阻害活性をもつ新しい物質を求めるための研究が行われている。
【発明の開示】
本発明者らは、上記の要望に応えることができる細胞内ユビキチン活性化酵素の阻害活性ならびに細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害活性をもつと共に、抗腫瘍活性および抗ウィルス活性を持つ新規な物質を提供することを目的に、有用な生理活性物質の開発と実用化の研究を促進してきた。その研究の結果、ヒラタケ科カワキタケ属に属するアラゲカワキタケの一菌株が新しい構造骨格を有する生理活性物質を生産していることを見い出した。この新規生理活性物質を単離することに成功し、下記の物理化学的性質を有し且つ下記の式（Ｉ）で示した立体的化学構造を有することを確認し、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４と命名した。更に、この新規な生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４がユビキチン活性化酵素に対する阻害活性および細胞内タンパク質のユビキチン化に対する阻害活性、ならびに抗腫瘍活性および抗炎症活性および抗ウィルス活性を有すことを見い出した。
すなわち、第１の本発明においては、このＲＳ−Ｋ３５７４物質が次式（Ｉ）
〔式中、２位、３位、４位および７位の立体配置はそれぞれＳ、Ｓ、Ｒ、Ｒである〕で表される化合物であり、しかも比旋光度〔α〕Ｄ２６−６２．３°（ｃ１．０，ジクロロメタン）を示す無色粘稠な油状物質であって、またシリカゲル薄層クロマトグラフィーでクロロホルム−メタノール（１０：１）よりなる展開溶媒で展開して測定した場合に本ＲＳ−Ｋ３５７４物質は０．３９のＲｆ値を示し、さらに本ＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルにおける主なピークはλｍａｘｎｍ（ε）；２０９（８３００）および２４１（５７００）にあり；赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤法）における主な吸収帯はνｍａｘ（ｃｍ−１）；３３００〜３５００、２９７９、２９１１、１６８１、１４４６、１３７９、１０４３、９９５、８５０、８１７、５７０にあり；重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で１２５ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質のプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は３．４７（ｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、３．８１（ｄｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、４．６９（ｂｒ ｓ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、６．７１（ｄｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、５．２９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、５．０２（ｄｔ，９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）であり、また重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で１２５ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質の炭素１３核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は、１９４．６（ｓ）、５３．９（ｄ）、５７．７（ｄ）、６３．２（ｄ）、１３７．８（ｄ）、１３９．０（ｓ）、６５．３（ｓ）、１２３．６（ｄ）、１３８．４（ｓ）、２５．８（ｑ）、１８．４（ｑ）であることを特徴とする、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４が提供される。
次に、第１の本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の物理化学的性状を記載する。
Ａ）外観及び性質：無色粘稠な油状物質
Ｂ）比旋光度［α］Ｄ２６−６２．３°（ｃ１．０、ジクロロメタン）
Ｃ）ＴＬＣのＲｆ値：０．３９
シリカゲル（Ａｒｔ．１０５７１５、メルク社製）の薄層クロマトグラフィーでクロロホルム−メタノール（１０：１）よりなる展開溶媒で展開して測定した場合
Ｄ）ＦＡＢマススペクトル（ｍ／ｚ）：２３３（Ｍ＋Ｎａ）＋
なお、Ｍ＋は観察されず、（Ｍ−１８）＋が観察された。
Ｅ）分子式：Ｃ１１Ｈ１４Ｏ４
Ｆ）紫外線吸収スペクトル
（ｉ）メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは添付図面の第１図に示す。主なピークは次のとおりである。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０９（８３００）、２４１（５７００）
（ｉｉ）メタノール−ＨＣｌ溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは添付図面の第２図に示す。主なピークは次のとおりである。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０５（１４２００）、２４０（ｓｈ５５００）
（ｉｉｉ）メタノール−ＮａＯＨ溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは添付図面の第３図に示す。主なピークは次のとおりである。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０６（１６４００）、２４０（ｓｈ５３００）、３０４（２４００）
Ｇ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤法）を添付図面の第４図に示す。主な吸収帯は次のとおりである。
νｍａｘ（ｃｍ−１）：３３００〜３５００、２９７９、２９１１、１６８１、１４４６、１３７９、１０４３、９９５、８５０、８１７、５７０
Ｈ）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム中／内部標準テトラメチルシラン）を添付図面の第５図に示す。
重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で５００ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質のプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は３．４７（ｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、３．８１（ｄｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、４．６９（ｂｒ ｓ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、６．７１（ｄｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、５．２９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、５．０２（ｄｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）である。
Ｉ）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム中／内部標準テトラメチルシラン）を添付図面の第６図に示す。
重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で１２５ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質の炭素１３核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は、１９４．６（ｓ）、５３．９（ｄ）、６３．２（ｄ）、１３７．８（ｄ）、１３９．０（ｓ）、６５．３（ｓ）、１２３．６（ｄ）、１３８．４（ｓ）、２５．８（ｑ）、１８．４（ｑ）である。
なお、本発明のＲＳ−Ｋ３５７４物質の立体的化学構造は、上記の式（Ｉ）に示すとおりであることは、ＲＳ−Ｋ３５７４物質からの或る誘導体の結晶を粉末Ｘ線回析法で分析することによって確認できたのである。
前記の式（Ａ）
のパネポキシドン（ｐａｎｅｐｏｘｙｄｏｎｅ）の立体的化学構造と比較すると、本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、既知の物質パネポキシドンの新しい立体異性体（７−エピマー）であると認められる。
さらに、本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生物学的性質を次に記載する。
Ａ）ユビキチン活性化酵素に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害活性の測定
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４のユビキチン活性化酵素に対する阻害活性は、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の１００μｇ／ｍｌ以上の濃度でユビキチン活性化酵素を完全に阻害する強さをもつ。
ユビキチン活性化酵素に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害活性は、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，６５巻，１４９１−１４９３頁（２００２）に記載の方法に準じて測定した。すなわち、ヒト由来のユビキチン活性化酵素を、組換遺伝子工学法で大腸菌に発現させ、この大腸菌からユビキチン活性化酵素を採取および精製することによってユビキチン活性化酵素試料を調製した。またウシ由来のユビキチンをビオチン化することによって調製されたビオチン化ユビキチンを、基質として用いた。前記のユビキチン活性化酵素と前記の基質をＡＴＰ（アデノシン−５’−３リン酸）とともに、供試のＲＳ−Ｋ３５７４物質の存在下または非存在下で３７℃にて１５分間反応させた。
得られた反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて、ゲル内の分画されたところの、ビチオン化ユビキチンと結合した酵素タンパク質を、エレクトロブロットによりポリビニリデンジフロライド膜に吸着させた。この膜上におけるビオチン化ユビキチンに結合した酵素タンパク質の量をＥＣＬ法（「Ｃｈｉｎ．Ｃｈｅｍ．」２５巻、１５３１〜１５４６頁（１９７９年）参照）を用いて検定した。ＲＳ−Ｋ３５７４物質の存在下に上記の酵素反応を行った試験区において検出されたビオチン化ユビキチンに結合した酵素タンパク質の量と、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の非存在下で酵素反応を行った対照試験区において検出されたビオチン化ユビキチンに結合した酵素タンパク質の量との比較によって、ビオチン化ユビキチンに結合したユビキチン活性化酵素の結合生成物の生成量がＲＳ−Ｋ３５７４物質によって抑制される程度を判定した。
Ｂ）細胞内タンパク質のユビキチン化に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害活性の測定
細胞内におけるタンパク質ユビキチン化に対する本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の阻害活性は、２μｇ／ｍｌ以上の濃度のＲＳ−Ｋ３５７４物質で細胞内に惹起されるユビキチン化タンパク質の生成を完全に阻害する強さをもつ。
この細胞内でのユビキチン化タンパク質の生成は次のようにして検出した。すなわち、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７を含む培地中にあらかじめＲＳ−Ｋ３５７４物質を各種濃度で添加した。その添加から３０分経過後、さらに癌細胞内のプロテアソームに対する阻害物質であるＭＧ−１３２を１μＭの濃度で培地に添加した（ＭＧ−１３２の添加により、プロテアソームを完全に阻害し、このことにより、プロテアソームにより分解されるべきユビキチン化タンパク質が細胞に蓄積できる）。その後、培地で３時間癌細胞を培養した後に、癌細胞を可溶化した。得られた細胞可溶性画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲル内の分画されたタンパク質をエレクトロブロットによりポリビニリデンジフロライド膜に吸着させ、この膜上の吸着されてあるユビキチン化されたタンパク質を、抗ユビキチン抗体と反応させることにより選択的に検出した。検出にはＥＣＬ法（「Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．」２５巻、１５３１〜１５４６頁（１９７９年）参照）を用いた。
また、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７を含む培地にＲＳ−Ｋ３５７４物質を添加することなく、上記と同様に試験した。この後者の対照試験のように、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の非存在下で試験した場合には、ユビキチン化されたタンパク質が蓄積してくるが、前記の培地にＲＳ−Ｋ３５７４物質を添加してその存在下に試験を行った場合に、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の存在下でその濃度に依存して、ユビキチン化されたタンパク質の蓄積が抑えられたことが確認された。このことから明らかなように、ＲＳ−Ｋ３５７４物質は、細胞内でユビキチン化されることによって直接または間接的に制御される性質をもつ機能性の細胞内タンパク質の生成を抑制することに有効である。
Ｃ）癌または腫瘍細胞増殖に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の抑制活性
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は癌または腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する。ＲＳ−Ｋ３５７４物質が各種癌細胞の増殖を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０値）を、ＭＴＴ法（「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」６５巻、５５〜６０頁（１９８３年）参照）で測定した。その結果を次の第１表に示す。
第１表の結果から明らかなように、本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、各種の癌細胞の増殖を抑制する抗腫瘍活性を有するのであり、このことから抗腫瘍剤として有用である。
Ｄ）ＲＳ−Ｋ３５７４物質の制癌活性
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、制癌活性を有する。ＲＳ−Ｋ３５７４物質は例えばエーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）腹水癌を移植したマウスに対して延命効果を有する。この担癌マウスにＲＳ−Ｋ３５７４物質を１日あたり２５０μｇ／ｍｏｕｓｅの投与量で連続９日間投与した場合、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を投与しない場合に比べて延命効果が２００％に達する。この延命効果は以下のようにして判定した。
すなわち、４週齢のＩＣＲマウスにＥｈｒｌｉｃｈ癌細胞の２×１０６個を腹腔に移植し、翌日から生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を１日あたり２５０または６２．５μｇ／匹の投与量を腹腔に９日間毎日投与し続けた。無投与群では、腹腔内にＥｈｒｌｉｃｈ癌に誘因された腹水が溜まり全例が約２週間後に死亡した。そこでＲＳ−Ｋ３５７４物質を投与した処理群の平均生存日数を、無投与群の平均生存日数で除した商の値で延命効果を評価した。ＲＳ−Ｋ３５７４物質による処理群では、腹水の蓄積が顕著に抑制され、その結果、１日あたり２５０μｇ／ｍｏｕｓｅの投与量で９日間投与した場合に２００％の延命効果が、また６２．５μｇ／ｍｏｕｓｅの投与量で９日間投与した場合でも１６０％以上の延命効果が認められた。
この結果から明らかなように、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は生体での癌または腫瘍の悪性化に対する抑制効果を有するのであり、このことから、抗腫瘍剤、抗癌剤、または抗悪疫質剤として有用である。
Ｅ）殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線による癌細胞のアポトーシス感受性に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の増強効果
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線が癌細胞に対して有するアポトーシス誘発効果を増強し、抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用に照射される放射線、例えばγ線、Ｘ線、α線の抗腫瘍活性または抗癌活性を増大させる活性を有する。
試験管内でヒト白血病細胞Ｕ９３７を、これに殺細胞性抗癌剤であるＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えて４時間処理した場合にはＵ９３７細胞のアポトーシスは観察されない。他方、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の５μｇ／ｍｌであらかじめＵ９３７細胞を処理した上で、ＴＮＦの１０ｎｇ／ｍｌでＵ９３７細胞を処理する場合には、４時間後に顕著なアポトーシスがＵ９３７細胞で観察される。
このアポトーシスは、アポトーシスに特徴的であるＤＮＡの段階的な分解（ｌａｄｄｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）をＢＢＲＣ．ｖｏｌ．２０９，９０７−９１５頁（１９９５）に用いられた方法で測定することにより確認した。ＴＮＦによる癌細胞アポトーシスに対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の増強活性は、ＴＮＦに代えてＴＮＦ様アポトーシス誘導物質（ＴＲＡＩＬ；ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）を用いて試験した場合でも、全く同様に認められる。
また、ヒト子宮癌由来ＨｅＬａ細胞を、殺細胞性抗癌剤として用いられるアドリアマイシンで処理して試験管内でアポトーシスに導く際、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を同時に加えることによりＨｅＬａ細胞の生存細胞数を顕著に減少させることができる。すなわち、ＨｅＬａ細胞をアドリアマイシンの１μｇ／ｍｌで２４時間処理した場合の生存細胞数が１００％であるのに対し、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の５μｇ／ｍｌとアドリアマイシンの１μｇ／ｍｌとで同時にＨｅＬａ細胞を処理した場合では、生存細胞数は５０％にまで減少する。
これらの結果から明らかなように、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、癌細胞に対する殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤のアポトーシス誘発作用を増強する活性を有し、このことで抗腫瘍剤または抗癌剤の抗腫瘍効果を増大させる。また、癌治療用に照射される放射線による癌細胞アポトーシスを同様に増強させる作用をＲＳ−Ｋ３５７４物質が有すると期待できる。従って抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用に照射される放射線の癌細胞アポトーシス誘発作用の増強剤として利用でき、癌治療において抗腫瘍剤または抗癌剤の治療効果を増強するための併用剤として、ＲＳ−Ｋ３５７４物質は有用である。
Ｆ）ＲＳ−Ｋ３５７４物質のタンパク質生合成に対する阻害活性
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２２６巻、２１４−２２１頁（１９９６）で述べられる通り、既知物質パネポキシドンはタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡのいずれの生合成も阻害しない。本発明のＲＳ−Ｋ３５７４物質は細胞内のタンパク質生合成を顕著にかつ特異的に阻害する活性を有する。その阻害活性は、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の５０％阻害濃度が４．５μｇ／ｍｌである強さのものである。その阻害活性は次のように測定した。
すなわち、ヒト乳癌由来ＭＣＦ７細胞２×１０５を、血清含有培地を入れた２４穴プレートに撒き、２４時間培養した。血清を含まない培地に交換し、各種の濃度のＲＳ−Ｋ３５７４物質を添加した。ここに、トリチウム標識したロイシンを１μＣｉ／ｍｌの濃度で加えた。さらに１時間培養すると、この間にロイシンが細胞に取りこまれ、細胞内でタンパク質の生合成が進む。そののち、培地を除去し、培養されたＭＣＦ７細胞に対して氷冷した１０％トリフルオロ酢酸水溶液を加えた。培養プレートを氷上で３０分間放置した後、氷冷した１０％トリフルオロ酢酸水溶液で２回洗浄した。この操作で細胞は破壊された。この洗浄後に、不溶性であったタンパク質を含む画分を集めて、０．１Ｎの水酸化ナトリウム水で溶解し、得られた溶液の放射活性を測定した。
この得られた溶液の放射活性測定値は、細胞内で生合成されたタンパク質の生成量を指示するものである。添加されたＲＳ−Ｋ３５７４物質の１０μｇ／ｍｌの濃度の存在下にＭＣＦ７細胞を培養する上記の試験を行った場合には、放射活性の測定値は１８０ｃｐｍであった。これに比較して、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の非存在下でＭＣＦ７細胞を培養して対照試験を行った場合には、放射活性の測定値は７００ｃｐｍであった。これらの結果から、ＭＣＦ７細胞内のタンパク質生合成を５０％阻害するＲＳ−Ｋ３５７４物質の濃度（ＩＣ５０値）は４．５μｇ／ｍｌであると計算された。
Ｇ）ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害効果
生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化を４μｇ／ｍｌの濃度で完全に阻害する活性を有する。この活性は以下のように判定した。
すなわち、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７の培養培地中に炎症性サイトカインとして作用するＴＮＦを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、またはＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１（ＩＬ−１）を２ｎｇ／ｍｌの濃度で添加すると、約１時間後にＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化が観察される。このＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化は、その活性化に伴って発現するところの遺伝子であるＭＡＤ−３（Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．６５，１２８１−１２８９頁、１９９１）のｍＲＮＡが特異的に増加していることをＲＴ−ＰＣＲ法によって測定することで確認できる。この時、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を４μｇ／ｍｌの濃度で培養培地中にあらかじめ添加すると、遺伝子ＭＡＤ−３の発現は全く見られず、ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化を完全に阻害できた。この結果から、ＲＳ−Ｋ３５７４物質は急性および慢性の炎症の惹起に必要であるＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化を阻害する活性を有することが認められ、抗炎症剤として有用である。
さらに第２の本発明によれば、前記の式（Ｉ）で表される生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を生産するアラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）を栄養培地に培養し、培養物から生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を採取することを特徴とする、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の製造法が提供される。
第２の本発明の方法で使用できる生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生産菌の一例として、ヒラタケ科カワキタケ属アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）Ｋ−３５７４株がある。尚、本菌株は２００１年７月より約１０年以上前に、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）から分譲されたアラゲカワキタケ菌糸を、その分譲から以後約１０年間以上にわたりポテト・デキストロース・アガー培地上でタカラアグリ株式会社の研究所にて、継代培養された菌株である。本Ｋ−３５７４株は、前記継代中に変異しており、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されてあるアラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓ ｒｕｄｉｓ）ＩＦＯ８９９４株に比べると生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生産量が多く、また他の代謝物の組成も異なる。このことから、本Ｋ−３５７４株はＰａｎｕｓｒｕｄｉｓ ＩＦＯ ８９９４株とは別異の菌株である。
アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）Ｋ−３５７４株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１、中央第６に在る独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２００１年６月２６日に寄託申請し、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３９７として寄託を受理された。また、２００２年１２月２５日の移管受託日でブダペスト条約の規約下にアラゲカワキタケＫ−３５７４株はＦＥＲＭ ＢＰ−８２６５の受託番号で前記の寄託所に寄託された。
なお、アラゲカワキタケは既知のキノコ（担子菌）であり、ほとんど世界中に分布して生えるが、日本ではブナ科の樹木に比較的普通に発生する。アラゲカワキタケのキノコ菌学的性状は次のとおりである。その子実体の傘は径１．５〜５ｃｍ、初めは饅頭形、後に開いてやや漏斗形となり、強じんな肉質〜やや革質、表面は粗い毛を密生し、初め褐紫色、ときにやや紫色を帯びる。縁はほぼ平坦であり、柄は一般に短く（０．５〜２ｃｍ）、偏心性〜中心性、まれに側性、表面はほぼ傘と同様である。胞子紋は白色である。胞子は４．５〜５．５×２〜２．５μｍ、挟楕円形であり、担子器は４胞子性である。厚膜シスチジアは５３〜７０×９．５〜１４μｍ、棍棒形〜円柱形、または紡錘形である。ｈｙｐｈａｌ ｐｅｇはない。肉組織の菌糸構成はｄｉｍｉｔｉｃである（「原色日本新菌類図鑑（１）」）３２頁、今関六也、本郷次雄、保育社、昭和６２年６月３０日発行）。
第２の本発明の方法を実施するに当たっては、ヒラタケ科カワキタケ属に属する生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生産株として、前記のアラゲカワキタケＫ−３５７４株を栄養培地に接種し、培養する。ここで用いる栄養培地は、前記の生産株が資化できる炭素源と窒素源を栄養成分として含有するものである。
その培地の栄養源としては、担子菌株の栄養源として通常使用されるもの、例えば炭素源、窒素源、無機塩などの同化できる栄養源を使用できる。例えば、ぶどう糖、麦芽糖、糖蜜、デキストリン、グリセリン、澱粉などの炭水化物や、大豆油、落花生油などの油脂のごとき炭素源、ならびにペプトン、肉エキス、綿実粉、大豆粉、酵母エキス、カゼイン、コーン・スチープ・リカー、ＮＺ−アミン、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの窒素源を使用でき、さらに燐酸二カリウム、燐酸ナトリウム、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガンなどの無機塩が配合できる。必要により微量金属例えばコバルト、鉄などを添加することができる。栄養源としては、その他、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を生産するのに、使用されるＲＳ−Ｋ３５７４生産菌株が利用しうるものであれば、いずれの公知の栄養源でも使用できる。
培地における上記のごとき栄養源の配合割合は特に制約されるものでなく、広範囲に亘って変えることができ、使用するＲＳ−Ｋ３５７４物質生産菌株によって、最適の栄養源の組成及び配合割合は、当事者であれば簡単な小規模実験により容易に決定することができる。また、上記の栄養源からなる栄養培地は、培養に先立ち殺菌することができ、この殺菌の前又は後で、培地のｐＨを５〜７の範囲、特にｐＨ５．５〜６．５の範囲に調節するのが有利である。
かかる栄養培地でのＲＳ−Ｋ３５７４物質生産菌株の培養は、一般のキノコによる生理活性物質の製造において通常使用されている方法に準じて行なうことができる。通常は好気条件下に培養するのが好適であり、通常、攪拌しながら及び／又は通気しながら培養を行なうことができる。また、培養方法としては静置培養、振とう培養、通気攪拌をともなう液体培養のいずれも使用可能であるが、液体培養がＲＳ−Ｋ３５７４物質の大量生産に適している。
使用しうる培養温度はＲＳ−Ｋ３５７４物質生産菌株の発育が実質的に阻害されず、該生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を生産しうる範囲であれば、特に制限されるものではなく、使用する生産菌株に応じて適宜選択できるが、特に好ましいのは２５〜３０℃の範囲内の培養温度を使用することができる。培養は通常はＲＳ−Ｋ３５７４物質が十分に蓄積するまで継続することができる。その培養時間は培地の組成や培養温度、使用温度、使用生産菌株などにより異なるが、通常１４〜３０日間の培養で目的のＲＳ−Ｋ３５７４物質を得ることができる。
培養中の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の蓄積量は、上記したユビキチン活性化酵素の阻害活性の測定方法によって定量することができる。
培養により得た培養物中に蓄積されたＲＳ−Ｋ３５７４物質は、これを培養物から採取する。培養後、必要により、濾過、遠心分離などのそれ自体公知の分離方法によって菌体細胞を除去した後、その培養濾液を、有機溶媒、特に酢酸ブチルなどを用いた溶媒抽出や、吸着や、イオン交換能を利用したクロマトグラフィー、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィーを単独でまたは、組み合わせて処理することにより、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を単離し、さらに精製して採取することができる。吸着に用いる担体あるいはイオン交換能を有するクロマトグラフィーに用いる担体としては、活性炭、シリカゲル、多孔性ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂もしくは各種のイオン交換樹脂を用いることができる。かくして、前記した特性を有する新規生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４が得られる。
さらに、第３の本発明では、前記の式（Ｉ）で表わされる生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ユビキチン活性化酵素の阻害剤が提供される。
さらにまた、第４の本発明では、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害剤が提供される。
さらに、第５の本発明では、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合されて製薬学的に許容できる担体を含有する抗腫瘍剤組成物が提供される。
さらに、第６の本発明では、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合されて製薬学的に許容できる担体を含有する抗炎症剤組成物が提供される。
また、第７の本発明においては、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合されて製薬学的に許容できる担体を含有する抗ウィルス剤組成物が提供される。
第３の本発明によるユビキチン活性化酵素の阻害剤および第４の本発明による細胞内タンパク質のユビキチン化阻害剤は、それぞれＲＳ−Ｋ３５７４物質の単独から成ることができるものである。さらに、第５の本発明による抗腫瘍剤組成物、第６の本発明による抗炎症剤組成物ならびに第７の本発明による抗ウィルス剤組成物は、それぞれ、その有効成分であるＲＳ−Ｋ３５７４物質を、製薬学的に許容できる常用の固体または液体担体と混合してなる組成物の形であることができる。
さらに、第１の本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、抗リウマチ薬、抗悪疫質剤、免疫抑制または免疫活性化物質、抗痴ほう薬、抗心筋症薬、抗肥満薬または抗糖尿病薬としても利用できることが期待される。
さらに、第８の本発明においては、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞に対する殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線の癌細胞アポトーシス誘発作用の増強剤が提供される。第８の本発明に言われる殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤とは、ＴＮＦ、ＴＮＦ様アポトーシス誘導物質、アドリアマイシンおよびその他の臨床用抗癌剤を指す。
また、第９の本発明においては、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞内のタンパク質生合成の阻害剤が提供される。
さらに、第１０の本発明においては、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化に対する阻害剤が提供される。
なお、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と０．５％ Ｔｗｅｅｎ８０（界面活性剤）を含む水にＲＳ−Ｋ３５７４物質を溶解した水溶液を、マウス１匹あたり２ｍｇまたはそれ以上のＲＳ−Ｋ３５７４物質投与量でマウス（４週齢、メス、平均体重２１．６ｇ、１群５匹）に尾静脈から静脈注射したが、投与後の２週間目に全例が生存して異常が認められなかった。１ｍｇ〜５０００ｍｇの投与量でＲＳ−Ｋ３５７４物質をヒト成人（体重６０ｋｇ）に静脈内投与しても、急性毒性の所見はないと予想される。ヒトに対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の投与量は、治療すべき病気の種類、症状、その他の因子に応じて、専門家により予備試験を通じて適当な量に調整することができる。
本発明による抗腫瘍剤組成物、抗炎症剤組成物または抗ウイルス剤組成物のような医薬組成物においては、有効成分としてのＲＳ−Ｋ３５７４物質を、製薬学的に許容できる常用の液状担体、例えばエタノール、含水エタノール、水、生理食塩水、もしくは固体担体、例えば結晶セルロース、でん粉等と混和してＲＳ−Ｋ３５７４物質を含有する組成物の形にすることができる。
本発明により医薬組成物で用いる有効成分であるＲＳ−Ｋ３５７４物質は、経口的に投与できる。あるいは静脈内または筋肉内または皮下内注射、もしくは腹腔内または直腸内投与などにより非経口的にも投与することができる。
経口投与用の場合には、本発明による医薬組成物では、有効成分としてＲＳ−Ｋ３５７４物質を、薬学的に許容できる慣用の固体または液体状の担体と混和して、その得られた混合物を散剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤等の形で製剤とすることができる。
本発明による医薬組成物を注射用に製剤する場合には、望ましい注射製剤の形態には、有効成分としてのＲＳ−Ｋ３５７４物質を含む無菌の含水溶液あるいは無菌の凍結乾燥剤がある。注射製剤に用いる液体担体は例えば水、生理食塩水、エタノール、含水エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、植物油などであるのが好ましい。
本発明による前記の如き医薬組成物に配合される有効成分としてのＲＳ−Ｋ３５７４物質の割合は、剤形によっても異なるが、例えば、有効成分の含量割合は、投与単位物の重量の約１〜９５％の範囲にあることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール溶液中の紫外線吸収スペクトルである。
第２図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール−ＨＣｌ溶液中の紫外線吸収スペクトルである。
第３図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール溶液中−ＮａＯＨの紫外線吸収スペクトルである。
第４図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
第５図はＲＳ−Ｋ３５７４物質の重クロロホルム溶液（内部標準：テトラメチルシラン）にて５００ＭＨｚで測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
第６図はＲＳ−Ｋ３５７４物質の重クロロホルム溶液（内部標準：テトラメチルシラン）にて１２５ＭＨｚで測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルである。
【発明を実施するための最良の形態】
次に実施例により、本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の製造例を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
実施例１ 生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の製造
グルコース１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４０．３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１％、を含む液体培地（ｐＨ無調整）を振盪フラスコ（５００ｍｌ容）に２００ｍｌずつ分注し、常法により１２０℃で２０分滅菌した。滅菌された該液体培地に対して、寒天斜面培地に培養したヒラタケ科カワキタケ属アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）Ｋ−３５７４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６５）の菌糸を接種した。その後に、液体培地中で、２７℃で３日間静置培養した。その後に、２７℃で２日間にわたり回転攪拌下に培養した。ここで得た培養液を種母培養液として次に用いた。
グルコース１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４０．３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１％、を含む液体培地（ｐＨ無調整）を振盤フラスコ（５００ｍｌ容）に２００ｍｌずつ分注し、常法により１２０℃で２０分間滅菌した。その後、滅菌された液体培地に、上記で得た種母培養液をそれぞれ７ｍｌずつ接種し、２７℃で１５日間静置培養した。
このようにして得られた培養液１０Ｌ（リットル）をろ過し、培養ろ液を分離した。培養ろ液を酢酸エチルで抽出し、その酢酸エチル層を減圧下に濃縮乾固した。得られた残渣をクロロホルムに溶かした溶液を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（８０ｇ）に付し、クロロホルム−メタノール（１００：０〜５０：１、容量比）、により段階的に溶出した。クロロホルム−メタノール（２００：１〜１００：１）で溶出された画分にＲＳ−Ｋ３５７４物質が含まれた。ＲＳ−Ｋ３５７４物質を含む画分を集めて濃縮乾固して粗精製物１．１７ｇを得た。この粗精製物を、さらにクロロホルム−メタノール−水（５：６：４）からなる液相を用いた上昇法による液々遠心分配クロマトグラフィー（２５０ｍＬ容）に付し、溶出液を１０ｍｌ−画分で集めて、それによって不要な成分と所要な成分とを分離した。ＲＳ−Ｋ３５７４物質を含む画分は１０ｍｌづつ分画した時に、２４〜２７番目の画分として得られた。これら活性画分を、減圧下で濃縮乾固して、本発明のＲＳ−Ｋ３５７４物質の精製品の７１６ｍｇを得た。
【産業上の利用可能性】
前記に説明したとおり、本発明によって新規な生理活性物質、ＲＳ−Ｋ３５７４物質が提供された。このＲＳ−Ｋ３５７４物質は、癌細胞または免疫細胞の細胞増殖またはアポトーシス、あるいは炎症の生起に関与するところの、細胞内酵素であるユビキチン活性化酵素を阻害する活性をもつのみならず、抗腫瘍活性、抗癌活性および抗炎症活性をもち、また細胞内のタンパク質の生合成を阻害する活性を示す。本発明によるＲＳ−Ｋ３５７４物質は、抗腫瘍剤、抗癌剤、抗炎症剤あるいは抗ウイルス剤として有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【技術分野】
本発明は、ユビキチン活性化酵素に対する阻害活性と細胞内タンパク質のユビキチン化に対する阻害活性とを有し、また細胞内のタンパク質の生合成を阻害する活性を有し、さらに抗腫瘍または抗癌活性を示す新規な生理活性物質であるＲＳ−Ｋ３５７４物質に関する。また、本発明は前記の生理活性物質、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の製造法に関する。さらに本発明は、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ユビキチン活性化酵素の阻害剤、ならびに生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害剤に関し、また生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分とする抗腫瘍剤組成物、抗炎症剤組成物および抗ウィルス剤組成物に関する。また、本発明は、新規生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞に対する殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線のアポトーシス誘発作用の増強剤、および癌細胞内のタンパク質生合成の阻害剤、ならびにＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化に対する阻害剤を包含する。
【背景技術】
種々な多数の酵素阻害剤が知られており、また種々な多数の生理活性物質が知られている。これら酵素阻害剤あるいは生理活性物質を、様々な疾病の治療薬として応用するための取り組みがなされている。また細胞の増殖、分化、生育ならびに細胞死などにおける極めて重要かつ必須の制御機構の一つとして、細胞内のタンパク質のユビキチン化反応があることが知られる。この細胞内タンパク質のユビキチン化反応を抑制できる活性をもつ物質は、疾病の治療と予防に広く応用されることが期待されるので要望されているが、現在まで、その細胞内タンパク質のユビキチン化反応を阻害できる活性をもつ物質は発見されていない。
癌細胞や免疫細胞での細胞増殖や細胞死が起こる際に、急性または慢性の炎症が起こる際に、免疫過敏や免疫不全などの免疫応答が起こる際に、アルツハイマー症を含む神経疾患が起こる際に、ならびにＨＩＶウィルスを含む病原ウィルスの感染や増殖が起こる際に、さらに卵子の受精や発生などでの、正常な分化が起きる際に、極めて重要かつ必須な役割を果たす機構の一つとして、ユビキチンを活性化する酵素が関与するところの細胞内タンパク質のユビキチン化機構があることが知られる。
例えば、ＨＩＶ−１ウィルスまたはＨＩＶ−２ウィルスが感染している細胞内では、これらＨＩＶウイルスの出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）、成熟化、感染力獲得にタンパク質のユビキチン化が関与することが知られ、また細胞内に在る酵素であるユビキチン活性化酵素がユビキチンの活性化に関与することが知られる。さらにＨＩＶウィルスが感染している細胞内で、プロテアソームを阻害することによって、ＨＩＶ由来のユビキチン化されたタンパク質の限定的な分解を止めると、ＨＩＶウィルスの出芽、成熟化、感染力獲得、増殖を阻害できることが知られる〔ＰＮＡＳ，９７巻２４号１３０５７〜１３０６２頁（２０００年１１月）〕。
さらに、急性または慢性の炎症が起こる際には、必らず、炎症性サイトカインによるＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化が起こることが知られ、このＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化は、その活性化に伴って、遺伝子ＭＡＤ−３を発現する〔Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．６５，ｐｐ１２８１−１２８９頁（１９９１）〕。
因みに、カワキタケ（Ｐａｎｕｓ）属に属するパヌス・ルジス（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）ＮＲＲＬ３８２１とパヌス・コンシャタス（Ｐａｎｕｓｃｏｎｃｈａｔｕｓ）ＮＲＲＬ３２５３により産生される次式（Ａ）
で表されるパネポキシドン（ｐａｎｅｐｏｘｙｄｏｎｅ）が知られる〔Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．２２６号２１４〜２２１頁（１９９６）〕。そして、この文献には、パネポキシドンが炎症の惹起に関与するＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化を阻害できる活性をもつことが記載されるが、パネポキシドンは細胞内のタンパク質、ＲＮＡまたはＤＮＡの生合成を阻害する活性を示さないことが記載される。パネポキシドン分子の立体的化学構造の研究は、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，５３巻Ｆａｓｃ．７（１９７０），第１８６号１５７７〜１５９７頁に記載されてあり、この後者の文献１５７８頁の表２および１５７９頁の記載によれば、パネポキシドンは比旋光度［α］Ｄ２０−６１°（溶媒、ジクロロメタン）を示す淡黄色の粘稠な油状物質である。
前述したように、細胞内のタンパク質のユビキチン化反応は、重要な生化学反応であるが、しかし、細胞内のタンパク質のユビキチン化反応を直接に阻害できる活性をもつ物質は、現在のところ未だ発見されていないので、そのような活性の新しい物質が現在も要望されている。細胞内のタンパク質をユビキチン化する機構を阻害できる活性をもつ新しい物質を提供することができるならば、そのような新しい物質は、従来知られているまたは使用されているところの既知の抗腫瘍性化合物、消炎・鎮痛性化合物、抗リウマチ薬、抗悪疫質剤、免疫抑制物質または免疫活性化物質、抗ウィルス薬、抗痴ほう薬、抗心筋症薬、抗肥満薬、抗糖尿病薬、臓器不全対処薬とは、異なる作用点を有し且つ新規な化学構造を有した化合物として利用できることが期待される。上記のような阻害活性をもつ新しい物質を求めるための研究が行われている。
【発明の開示】
本発明者らは、上記の要望に応えることができる細胞内ユビキチン活性化酵素の阻害活性ならびに細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害活性をもつと共に、抗腫瘍活性および抗ウィルス活性を持つ新規な物質を提供することを目的に、有用な生理活性物質の開発と実用化の研究を促進してきた。その研究の結果、ヒラタケ科カワキタケ属に属するアラゲカワキタケの一菌株が新しい構造骨格を有する生理活性物質を生産していることを見い出した。この新規生理活性物質を単離することに成功し、下記の物理化学的性質を有し且つ下記の式（Ｉ）で示した立体的化学構造を有することを確認し、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４と命名した。更に、この新規な生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４がユビキチン活性化酵素に対する阻害活性および細胞内タンパク質のユビキチン化に対する阻害活性、ならびに抗腫瘍活性および抗炎症活性および抗ウィルス活性を有すことを見い出した。
すなわち、第１の本発明においては、このＲＳ−Ｋ３５７４物質が次式（Ｉ）
〔式中、２位、３位、４位および７位の立体配置はそれぞれＳ、Ｓ、Ｒ、Ｒである〕で表される化合物であり、しかも比旋光度〔α〕Ｄ２６−６２．３°（ｃ１．０，ジクロロメタン）を示す無色粘稠な油状物質であって、またシリカゲル薄層クロマトグラフィーでクロロホルム−メタノール（１０：１）よりなる展開溶媒で展開して測定した場合に本ＲＳ−Ｋ３５７４物質は０．３９のＲｆ値を示し、さらに本ＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルにおける主なピークはλｍａｘｎｍ（ε）；２０９（８３００）および２４１（５７００）にあり；赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤法）における主な吸収帯はνｍａｘ（ｃｍ−１）；３３００〜３５００、２９７９、２９１１、１６８１、１４４６、１３７９、１０４３、９９５、８５０、８１７、５７０にあり；重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で１２５ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質のプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は３．４７（ｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、３．８１（ｄｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、４．６９（ｂｒ ｓ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、６．７１（ｄｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、５．２９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、５．０２（ｄｔ，９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）であり、また重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で１２５ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質の炭素１３核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は、１９４．６（ｓ）、５３．９（ｄ）、５７．７（ｄ）、６３．２（ｄ）、１３７．８（ｄ）、１３９．０（ｓ）、６５．３（ｓ）、１２３．６（ｄ）、１３８．４（ｓ）、２５．８（ｑ）、１８．４（ｑ）であることを特徴とする、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４が提供される。
次に、第１の本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の物理化学的性状を記載する。
Ａ）外観及び性質：無色粘稠な油状物質
Ｂ）比旋光度［α］Ｄ２６−６２．３°（ｃ１．０、ジクロロメタン）
Ｃ）ＴＬＣのＲｆ値：０．３９
シリカゲル（Ａｒｔ．１０５７１５、メルク社製）の薄層クロマトグラフィーでクロロホルム−メタノール（１０：１）よりなる展開溶媒で展開して測定した場合
Ｄ）ＦＡＢマススペクトル（ｍ／ｚ）：２３３（Ｍ＋Ｎａ）＋
なお、Ｍ＋は観察されず、（Ｍ−１８）＋が観察された。
Ｅ）分子式：Ｃ１１Ｈ１４Ｏ４
Ｆ）紫外線吸収スペクトル
（ｉ）メタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは添付図面の第１図に示す。主なピークは次のとおりである。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０９（８３００）、２４１（５７００）
（ｉｉ）メタノール−ＨＣｌ溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは添付図面の第２図に示す。主なピークは次のとおりである。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０５（１４２００）、２４０（ｓｈ５５００）
（ｉｉｉ）メタノール−ＮａＯＨ溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルは添付図面の第３図に示す。主なピークは次のとおりである。
λｍａｘｎｍ（ε）：２０６（１６４００）、２４０（ｓｈ５３００）、３０４（２４００）
Ｇ）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤法）を添付図面の第４図に示す。主な吸収帯は次のとおりである。
νｍａｘ（ｃｍ−１）：３３００〜３５００、２９７９、２９１１、１６８１、１４４６、１３７９、１０４３、９９５、８５０、８１７、５７０
Ｈ）１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム中／内部標準テトラメチルシラン）を添付図面の第５図に示す。
重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で５００ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質のプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は３．４７（ｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、３．８１（ｄｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、４．６９（ｂｒ ｓ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、６．７１（ｄｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、５．２９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、５．０２（ｄｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）である。
Ｉ）１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（重クロロホルム中／内部標準テトラメチルシラン）を添付図面の第６図に示す。
重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で１２５ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質の炭素１３核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は、１９４．６（ｓ）、５３．９（ｄ）、６３．２（ｄ）、１３７．８（ｄ）、１３９．０（ｓ）、６５．３（ｓ）、１２３．６（ｄ）、１３８．４（ｓ）、２５．８（ｑ）、１８．４（ｑ）である。
なお、本発明のＲＳ−Ｋ３５７４物質の立体的化学構造は、上記の式（Ｉ）に示すとおりであることは、ＲＳ−Ｋ３５７４物質からの或る誘導体の結晶を粉末Ｘ線回析法で分析することによって確認できたのである。
前記の式（Ａ）
のパネポキシドン（ｐａｎｅｐｏｘｙｄｏｎｅ）の立体的化学構造と比較すると、本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、既知の物質パネポキシドンの新しい立体異性体（７−エピマー）であると認められる。
さらに、本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生物学的性質を次に記載する。
Ａ）ユビキチン活性化酵素に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害活性の測定
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４のユビキチン活性化酵素に対する阻害活性は、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の１００μｇ／ｍｌ以上の濃度でユビキチン活性化酵素を完全に阻害する強さをもつ。
ユビキチン活性化酵素に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害活性は、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，６５巻，１４９１−１４９３頁（２００２）に記載の方法に準じて測定した。すなわち、ヒト由来のユビキチン活性化酵素を、組換遺伝子工学法で大腸菌に発現させ、この大腸菌からユビキチン活性化酵素を採取および精製することによってユビキチン活性化酵素試料を調製した。またウシ由来のユビキチンをビオチン化することによって調製されたビオチン化ユビキチンを、基質として用いた。前記のユビキチン活性化酵素と前記の基質をＡＴＰ（アデノシン−５’−３リン酸）とともに、供試のＲＳ−Ｋ３５７４物質の存在下または非存在下で３７℃にて１５分間反応させた。
得られた反応液をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて、ゲル内の分画されたところの、ビチオン化ユビキチンと結合した酵素タンパク質を、エレクトロブロットによりポリビニリデンジフロライド膜に吸着させた。この膜上におけるビオチン化ユビキチンに結合した酵素タンパク質の量をＥＣＬ法（「Ｃｈｉｎ．Ｃｈｅｍ．」２５巻、１５３１〜１５４６頁（１９７９年）参照）を用いて検定した。ＲＳ−Ｋ３５７４物質の存在下に上記の酵素反応を行った試験区において検出されたビオチン化ユビキチンに結合した酵素タンパク質の量と、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の非存在下で酵素反応を行った対照試験区において検出されたビオチン化ユビキチンに結合した酵素タンパク質の量との比較によって、ビオチン化ユビキチンに結合したユビキチン活性化酵素の結合生成物の生成量がＲＳ−Ｋ３５７４物質によって抑制される程度を判定した。
Ｂ）細胞内タンパク質のユビキチン化に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害活性の測定
細胞内におけるタンパク質ユビキチン化に対する本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の阻害活性は、２μｇ／ｍｌ以上の濃度のＲＳ−Ｋ３５７４物質で細胞内に惹起されるユビキチン化タンパク質の生成を完全に阻害する強さをもつ。
この細胞内でのユビキチン化タンパク質の生成は次のようにして検出した。すなわち、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７を含む培地中にあらかじめＲＳ−Ｋ３５７４物質を各種濃度で添加した。その添加から３０分経過後、さらに癌細胞内のプロテアソームに対する阻害物質であるＭＧ−１３２を１μＭの濃度で培地に添加した（ＭＧ−１３２の添加により、プロテアソームを完全に阻害し、このことにより、プロテアソームにより分解されるべきユビキチン化タンパク質が細胞に蓄積できる）。その後、培地で３時間癌細胞を培養した後に、癌細胞を可溶化した。得られた細胞可溶性画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。ゲル内の分画されたタンパク質をエレクトロブロットによりポリビニリデンジフロライド膜に吸着させ、この膜上の吸着されてあるユビキチン化されたタンパク質を、抗ユビキチン抗体と反応させることにより選択的に検出した。検出にはＥＣＬ法（「Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．」２５巻、１５３１〜１５４６頁（１９７９年）参照）を用いた。
また、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７を含む培地にＲＳ−Ｋ３５７４物質を添加することなく、上記と同様に試験した。この後者の対照試験のように、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の非存在下で試験した場合には、ユビキチン化されたタンパク質が蓄積してくるが、前記の培地にＲＳ−Ｋ３５７４物質を添加してその存在下に試験を行った場合に、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の存在下でその濃度に依存して、ユビキチン化されたタンパク質の蓄積が抑えられたことが確認された。このことから明らかなように、ＲＳ−Ｋ３５７４物質は、細胞内でユビキチン化されることによって直接または間接的に制御される性質をもつ機能性の細胞内タンパク質の生成を抑制することに有効である。
Ｃ）癌または腫瘍細胞増殖に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の抑制活性
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は癌または腫瘍細胞の増殖を抑制する活性を有する。ＲＳ−Ｋ３５７４物質が各種癌細胞の増殖を５０％抑制する濃度（ＩＣ５０値）を、ＭＴＴ法（「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」６５巻、５５〜６０頁（１９８３年）参照）で測定した。その結果を次の第１表に示す。
第１表の結果から明らかなように、本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、各種の癌細胞の増殖を抑制する抗腫瘍活性を有するのであり、このことから抗腫瘍剤として有用である。
Ｄ）ＲＳ−Ｋ３５７４物質の制癌活性
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、制癌活性を有する。ＲＳ−Ｋ３５７４物質は例えばエーリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）腹水癌を移植したマウスに対して延命効果を有する。この担癌マウスにＲＳ−Ｋ３５７４物質を１日あたり２５０μｇ／ｍｏｕｓｅの投与量で連続９日間投与した場合、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を投与しない場合に比べて延命効果が２００％に達する。この延命効果は以下のようにして判定した。
すなわち、４週齢のＩＣＲマウスにＥｈｒｌｉｃｈ癌細胞の２×１０６個を腹腔に移植し、翌日から生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を１日あたり２５０または６２．５μｇ／匹の投与量を腹腔に９日間毎日投与し続けた。無投与群では、腹腔内にＥｈｒｌｉｃｈ癌に誘因された腹水が溜まり全例が約２週間後に死亡した。そこでＲＳ−Ｋ３５７４物質を投与した処理群の平均生存日数を、無投与群の平均生存日数で除した商の値で延命効果を評価した。ＲＳ−Ｋ３５７４物質による処理群では、腹水の蓄積が顕著に抑制され、その結果、１日あたり２５０μｇ／ｍｏｕｓｅの投与量で９日間投与した場合に２００％の延命効果が、また６２．５μｇ／ｍｏｕｓｅの投与量で９日間投与した場合でも１６０％以上の延命効果が認められた。
この結果から明らかなように、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は生体での癌または腫瘍の悪性化に対する抑制効果を有するのであり、このことから、抗腫瘍剤、抗癌剤、または抗悪疫質剤として有用である。
Ｅ）殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線による癌細胞のアポトーシス感受性に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の増強効果
本発明による生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線が癌細胞に対して有するアポトーシス誘発効果を増強し、抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用に照射される放射線、例えばγ線、Ｘ線、α線の抗腫瘍活性または抗癌活性を増大させる活性を有する。
試験管内でヒト白血病細胞Ｕ９３７を、これに殺細胞性抗癌剤であるＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えて４時間処理した場合にはＵ９３７細胞のアポトーシスは観察されない。他方、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の５μｇ／ｍｌであらかじめＵ９３７細胞を処理した上で、ＴＮＦの１０ｎｇ／ｍｌでＵ９３７細胞を処理する場合には、４時間後に顕著なアポトーシスがＵ９３７細胞で観察される。
このアポトーシスは、アポトーシスに特徴的であるＤＮＡの段階的な分解（ｌａｄｄｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）をＢＢＲＣ．ｖｏｌ．２０９，９０７−９１５頁（１９９５）に用いられた方法で測定することにより確認した。ＴＮＦによる癌細胞アポトーシスに対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の増強活性は、ＴＮＦに代えてＴＮＦ様アポトーシス誘導物質（ＴＲＡＩＬ；ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ）を用いて試験した場合でも、全く同様に認められる。
また、ヒト子宮癌由来ＨｅＬａ細胞を、殺細胞性抗癌剤として用いられるアドリアマイシンで処理して試験管内でアポトーシスに導く際、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を同時に加えることによりＨｅＬａ細胞の生存細胞数を顕著に減少させることができる。すなわち、ＨｅＬａ細胞をアドリアマイシンの１μｇ／ｍｌで２４時間処理した場合の生存細胞数が１００％であるのに対し、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の５μｇ／ｍｌとアドリアマイシンの１μｇ／ｍｌとで同時にＨｅＬａ細胞を処理した場合では、生存細胞数は５０％にまで減少する。
これらの結果から明らかなように、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、癌細胞に対する殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤のアポトーシス誘発作用を増強する活性を有し、このことで抗腫瘍剤または抗癌剤の抗腫瘍効果を増大させる。また、癌治療用に照射される放射線による癌細胞アポトーシスを同様に増強させる作用をＲＳ−Ｋ３５７４物質が有すると期待できる。従って抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用に照射される放射線の癌細胞アポトーシス誘発作用の増強剤として利用でき、癌治療において抗腫瘍剤または抗癌剤の治療効果を増強するための併用剤として、ＲＳ−Ｋ３５７４物質は有用である。
Ｆ）ＲＳ−Ｋ３５７４物質のタンパク質生合成に対する阻害活性
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２２６巻、２１４−２２１頁（１９９６）で述べられる通り、既知物質パネポキシドンはタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡのいずれの生合成も阻害しない。本発明のＲＳ−Ｋ３５７４物質は細胞内のタンパク質生合成を顕著にかつ特異的に阻害する活性を有する。その阻害活性は、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の５０％阻害濃度が４．５μｇ／ｍｌである強さのものである。その阻害活性は次のように測定した。
すなわち、ヒト乳癌由来ＭＣＦ７細胞２×１０５を、血清含有培地を入れた２４穴プレートに撒き、２４時間培養した。血清を含まない培地に交換し、各種の濃度のＲＳ−Ｋ３５７４物質を添加した。ここに、トリチウム標識したロイシンを１μＣｉ／ｍｌの濃度で加えた。さらに１時間培養すると、この間にロイシンが細胞に取りこまれ、細胞内でタンパク質の生合成が進む。そののち、培地を除去し、培養されたＭＣＦ７細胞に対して氷冷した１０％トリフルオロ酢酸水溶液を加えた。培養プレートを氷上で３０分間放置した後、氷冷した１０％トリフルオロ酢酸水溶液で２回洗浄した。この操作で細胞は破壊された。この洗浄後に、不溶性であったタンパク質を含む画分を集めて、０．１Ｎの水酸化ナトリウム水で溶解し、得られた溶液の放射活性を測定した。
この得られた溶液の放射活性測定値は、細胞内で生合成されたタンパク質の生成量を指示するものである。添加されたＲＳ−Ｋ３５７４物質の１０μｇ／ｍｌの濃度の存在下にＭＣＦ７細胞を培養する上記の試験を行った場合には、放射活性の測定値は１８０ｃｐｍであった。これに比較して、ＲＳ−Ｋ３５７４物質の非存在下でＭＣＦ７細胞を培養して対照試験を行った場合には、放射活性の測定値は７００ｃｐｍであった。これらの結果から、ＭＣＦ７細胞内のタンパク質生合成を５０％阻害するＲＳ−Ｋ３５７４物質の濃度（ＩＣ５０値）は４．５μｇ／ｍｌであると計算された。
Ｇ）ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化に対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の阻害効果
生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化を４μｇ／ｍｌの濃度で完全に阻害する活性を有する。この活性は以下のように判定した。
すなわち、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ７の培養培地中に炎症性サイトカインとして作用するＴＮＦを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、またはＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１（ＩＬ−１）を２ｎｇ／ｍｌの濃度で添加すると、約１時間後にＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化が観察される。このＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化は、その活性化に伴って発現するところの遺伝子であるＭＡＤ−３（Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．６５，１２８１−１２８９頁、１９９１）のｍＲＮＡが特異的に増加していることをＲＴ−ＰＣＲ法によって測定することで確認できる。この時、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を４μｇ／ｍｌの濃度で培養培地中にあらかじめ添加すると、遺伝子ＭＡＤ−３の発現は全く見られず、ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化を完全に阻害できた。この結果から、ＲＳ−Ｋ３５７４物質は急性および慢性の炎症の惹起に必要であるＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化を阻害する活性を有することが認められ、抗炎症剤として有用である。
さらに第２の本発明によれば、前記の式（Ｉ）で表される生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を生産するアラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）を栄養培地に培養し、培養物から生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を採取することを特徴とする、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の製造法が提供される。
第２の本発明の方法で使用できる生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生産菌の一例として、ヒラタケ科カワキタケ属アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）Ｋ−３５７４株がある。尚、本菌株は２００１年７月より約１０年以上前に、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）から分譲されたアラゲカワキタケ菌糸を、その分譲から以後約１０年間以上にわたりポテト・デキストロース・アガー培地上でタカラアグリ株式会社の研究所にて、継代培養された菌株である。本Ｋ−３５７４株は、前記継代中に変異しており、財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に寄託されてあるアラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓ ｒｕｄｉｓ）ＩＦＯ８９９４株に比べると生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生産量が多く、また他の代謝物の組成も異なる。このことから、本Ｋ−３５７４株はＰａｎｕｓｒｕｄｉｓ ＩＦＯ ８９９４株とは別異の菌株である。
アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）Ｋ−３５７４株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１、中央第６に在る独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに２００１年６月２６日に寄託申請し、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８３９７として寄託を受理された。また、２００２年１２月２５日の移管受託日でブダペスト条約の規約下にアラゲカワキタケＫ−３５７４株はＦＥＲＭ ＢＰ−８２６５の受託番号で前記の寄託所に寄託された。
なお、アラゲカワキタケは既知のキノコ（担子菌）であり、ほとんど世界中に分布して生えるが、日本ではブナ科の樹木に比較的普通に発生する。アラゲカワキタケのキノコ菌学的性状は次のとおりである。その子実体の傘は径１．５〜５ｃｍ、初めは饅頭形、後に開いてやや漏斗形となり、強じんな肉質〜やや革質、表面は粗い毛を密生し、初め褐紫色、ときにやや紫色を帯びる。縁はほぼ平坦であり、柄は一般に短く（０．５〜２ｃｍ）、偏心性〜中心性、まれに側性、表面はほぼ傘と同様である。胞子紋は白色である。胞子は４．５〜５．５×２〜２．５μｍ、挟楕円形であり、担子器は４胞子性である。厚膜シスチジアは５３〜７０×９．５〜１４μｍ、棍棒形〜円柱形、または紡錘形である。ｈｙｐｈａｌ ｐｅｇはない。肉組織の菌糸構成はｄｉｍｉｔｉｃである（「原色日本新菌類図鑑（１）」）３２頁、今関六也、本郷次雄、保育社、昭和６２年６月３０日発行）。
第２の本発明の方法を実施するに当たっては、ヒラタケ科カワキタケ属に属する生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生産株として、前記のアラゲカワキタケＫ−３５７４株を栄養培地に接種し、培養する。ここで用いる栄養培地は、前記の生産株が資化できる炭素源と窒素源を栄養成分として含有するものである。
その培地の栄養源としては、担子菌株の栄養源として通常使用されるもの、例えば炭素源、窒素源、無機塩などの同化できる栄養源を使用できる。例えば、ぶどう糖、麦芽糖、糖蜜、デキストリン、グリセリン、澱粉などの炭水化物や、大豆油、落花生油などの油脂のごとき炭素源、ならびにペプトン、肉エキス、綿実粉、大豆粉、酵母エキス、カゼイン、コーン・スチープ・リカー、ＮＺ−アミン、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの窒素源を使用でき、さらに燐酸二カリウム、燐酸ナトリウム、食塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガンなどの無機塩が配合できる。必要により微量金属例えばコバルト、鉄などを添加することができる。栄養源としては、その他、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を生産するのに、使用されるＲＳ−Ｋ３５７４生産菌株が利用しうるものであれば、いずれの公知の栄養源でも使用できる。
培地における上記のごとき栄養源の配合割合は特に制約されるものでなく、広範囲に亘って変えることができ、使用するＲＳ−Ｋ３５７４物質生産菌株によって、最適の栄養源の組成及び配合割合は、当事者であれば簡単な小規模実験により容易に決定することができる。また、上記の栄養源からなる栄養培地は、培養に先立ち殺菌することができ、この殺菌の前又は後で、培地のｐＨを５〜７の範囲、特にｐＨ５．５〜６．５の範囲に調節するのが有利である。
かかる栄養培地でのＲＳ−Ｋ３５７４物質生産菌株の培養は、一般のキノコによる生理活性物質の製造において通常使用されている方法に準じて行なうことができる。通常は好気条件下に培養するのが好適であり、通常、攪拌しながら及び／又は通気しながら培養を行なうことができる。また、培養方法としては静置培養、振とう培養、通気攪拌をともなう液体培養のいずれも使用可能であるが、液体培養がＲＳ−Ｋ３５７４物質の大量生産に適している。
使用しうる培養温度はＲＳ−Ｋ３５７４物質生産菌株の発育が実質的に阻害されず、該生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を生産しうる範囲であれば、特に制限されるものではなく、使用する生産菌株に応じて適宜選択できるが、特に好ましいのは２５〜３０℃の範囲内の培養温度を使用することができる。培養は通常はＲＳ−Ｋ３５７４物質が十分に蓄積するまで継続することができる。その培養時間は培地の組成や培養温度、使用温度、使用生産菌株などにより異なるが、通常１４〜３０日間の培養で目的のＲＳ−Ｋ３５７４物質を得ることができる。
培養中の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の蓄積量は、上記したユビキチン活性化酵素の阻害活性の測定方法によって定量することができる。
培養により得た培養物中に蓄積されたＲＳ−Ｋ３５７４物質は、これを培養物から採取する。培養後、必要により、濾過、遠心分離などのそれ自体公知の分離方法によって菌体細胞を除去した後、その培養濾液を、有機溶媒、特に酢酸ブチルなどを用いた溶媒抽出や、吸着や、イオン交換能を利用したクロマトグラフィー、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィーを単独でまたは、組み合わせて処理することにより、ＲＳ−Ｋ３５７４物質を単離し、さらに精製して採取することができる。吸着に用いる担体あるいはイオン交換能を有するクロマトグラフィーに用いる担体としては、活性炭、シリカゲル、多孔性ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂もしくは各種のイオン交換樹脂を用いることができる。かくして、前記した特性を有する新規生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４が得られる。
さらに、第３の本発明では、前記の式（Ｉ）で表わされる生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ユビキチン活性化酵素の阻害剤が提供される。
さらにまた、第４の本発明では、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害剤が提供される。
さらに、第５の本発明では、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合されて製薬学的に許容できる担体を含有する抗腫瘍剤組成物が提供される。
さらに、第６の本発明では、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合されて製薬学的に許容できる担体を含有する抗炎症剤組成物が提供される。
また、第７の本発明においては、前記の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合されて製薬学的に許容できる担体を含有する抗ウィルス剤組成物が提供される。
第３の本発明によるユビキチン活性化酵素の阻害剤および第４の本発明による細胞内タンパク質のユビキチン化阻害剤は、それぞれＲＳ−Ｋ３５７４物質の単独から成ることができるものである。さらに、第５の本発明による抗腫瘍剤組成物、第６の本発明による抗炎症剤組成物ならびに第７の本発明による抗ウィルス剤組成物は、それぞれ、その有効成分であるＲＳ−Ｋ３５７４物質を、製薬学的に許容できる常用の固体または液体担体と混合してなる組成物の形であることができる。
さらに、第１の本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４は、抗リウマチ薬、抗悪疫質剤、免疫抑制または免疫活性化物質、抗痴ほう薬、抗心筋症薬、抗肥満薬または抗糖尿病薬としても利用できることが期待される。
さらに、第８の本発明においては、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞に対する殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線の癌細胞アポトーシス誘発作用の増強剤が提供される。第８の本発明に言われる殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤とは、ＴＮＦ、ＴＮＦ様アポトーシス誘導物質、アドリアマイシンおよびその他の臨床用抗癌剤を指す。
また、第９の本発明においては、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞内のタンパク質生合成の阻害剤が提供される。
さらに、第１０の本発明においては、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化に対する阻害剤が提供される。
なお、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と０．５％ Ｔｗｅｅｎ８０（界面活性剤）を含む水にＲＳ−Ｋ３５７４物質を溶解した水溶液を、マウス１匹あたり２ｍｇまたはそれ以上のＲＳ−Ｋ３５７４物質投与量でマウス（４週齢、メス、平均体重２１．６ｇ、１群５匹）に尾静脈から静脈注射したが、投与後の２週間目に全例が生存して異常が認められなかった。１ｍｇ〜５０００ｍｇの投与量でＲＳ−Ｋ３５７４物質をヒト成人（体重６０ｋｇ）に静脈内投与しても、急性毒性の所見はないと予想される。ヒトに対するＲＳ−Ｋ３５７４物質の投与量は、治療すべき病気の種類、症状、その他の因子に応じて、専門家により予備試験を通じて適当な量に調整することができる。
本発明による抗腫瘍剤組成物、抗炎症剤組成物または抗ウイルス剤組成物のような医薬組成物においては、有効成分としてのＲＳ−Ｋ３５７４物質を、製薬学的に許容できる常用の液状担体、例えばエタノール、含水エタノール、水、生理食塩水、もしくは固体担体、例えば結晶セルロース、でん粉等と混和してＲＳ−Ｋ３５７４物質を含有する組成物の形にすることができる。
本発明により医薬組成物で用いる有効成分であるＲＳ−Ｋ３５７４物質は、経口的に投与できる。あるいは静脈内または筋肉内または皮下内注射、もしくは腹腔内または直腸内投与などにより非経口的にも投与することができる。
経口投与用の場合には、本発明による医薬組成物では、有効成分としてＲＳ−Ｋ３５７４物質を、薬学的に許容できる慣用の固体または液体状の担体と混和して、その得られた混合物を散剤、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、シロップ剤等の形で製剤とすることができる。
本発明による医薬組成物を注射用に製剤する場合には、望ましい注射製剤の形態には、有効成分としてのＲＳ−Ｋ３５７４物質を含む無菌の含水溶液あるいは無菌の凍結乾燥剤がある。注射製剤に用いる液体担体は例えば水、生理食塩水、エタノール、含水エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、植物油などであるのが好ましい。
本発明による前記の如き医薬組成物に配合される有効成分としてのＲＳ−Ｋ３５７４物質の割合は、剤形によっても異なるが、例えば、有効成分の含量割合は、投与単位物の重量の約１〜９５％の範囲にあることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール溶液中の紫外線吸収スペクトルである。
第２図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール−ＨＣｌ溶液中の紫外線吸収スペクトルである。
第３図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール溶液中−ＮａＯＨの紫外線吸収スペクトルである。
第４図はＲＳ−Ｋ３５７４物質のＫＢｒ錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
第５図はＲＳ−Ｋ３５７４物質の重クロロホルム溶液（内部標準：テトラメチルシラン）にて５００ＭＨｚで測定したプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
第６図はＲＳ−Ｋ３５７４物質の重クロロホルム溶液（内部標準：テトラメチルシラン）にて１２５ＭＨｚで測定した炭素１３核磁気共鳴スペクトルである。
【発明を実施するための最良の形態】
次に実施例により、本発明の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の製造例を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
実施例１ 生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の製造
グルコース１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４０．３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１％、を含む液体培地（ｐＨ無調整）を振盪フラスコ（５００ｍｌ容）に２００ｍｌずつ分注し、常法により１２０℃で２０分滅菌した。滅菌された該液体培地に対して、寒天斜面培地に培養したヒラタケ科カワキタケ属アラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）Ｋ−３５７４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−８２６５）の菌糸を接種した。その後に、液体培地中で、２７℃で３日間静置培養した。その後に、２７℃で２日間にわたり回転攪拌下に培養した。ここで得た培養液を種母培養液として次に用いた。
グルコース１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、ＫＨ２ＰＯ４０．３％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．１％、を含む液体培地（ｐＨ無調整）を振盤フラスコ（５００ｍｌ容）に２００ｍｌずつ分注し、常法により１２０℃で２０分間滅菌した。その後、滅菌された液体培地に、上記で得た種母培養液をそれぞれ７ｍｌずつ接種し、２７℃で１５日間静置培養した。
このようにして得られた培養液１０Ｌ（リットル）をろ過し、培養ろ液を分離した。培養ろ液を酢酸エチルで抽出し、その酢酸エチル層を減圧下に濃縮乾固した。得られた残渣をクロロホルムに溶かした溶液を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（８０ｇ）に付し、クロロホルム−メタノール（１００：０〜５０：１、容量比）、により段階的に溶出した。クロロホルム−メタノール（２００：１〜１００：１）で溶出された画分にＲＳ−Ｋ３５７４物質が含まれた。ＲＳ−Ｋ３５７４物質を含む画分を集めて濃縮乾固して粗精製物１．１７ｇを得た。この粗精製物を、さらにクロロホルム−メタノール−水（５：６：４）からなる液相を用いた上昇法による液々遠心分配クロマトグラフィー（２５０ｍＬ容）に付し、溶出液を１０ｍｌ−画分で集めて、それによって不要な成分と所要な成分とを分離した。ＲＳ−Ｋ３５７４物質を含む画分は１０ｍｌづつ分画した時に、２４〜２７番目の画分として得られた。これら活性画分を、減圧下で濃縮乾固して、本発明のＲＳ−Ｋ３５７４物質の精製品の７１６ｍｇを得た。
【産業上の利用可能性】
前記に説明したとおり、本発明によって新規な生理活性物質、ＲＳ−Ｋ３５７４物質が提供された。このＲＳ−Ｋ３５７４物質は、癌細胞または免疫細胞の細胞増殖またはアポトーシス、あるいは炎症の生起に関与するところの、細胞内酵素であるユビキチン活性化酵素を阻害する活性をもつのみならず、抗腫瘍活性、抗癌活性および抗炎症活性をもち、また細胞内のタンパク質の生合成を阻害する活性を示す。本発明によるＲＳ−Ｋ３５７４物質は、抗腫瘍剤、抗癌剤、抗炎症剤あるいは抗ウイルス剤として有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
このＲＳ−Ｋ３５７４物質は次式（Ｉ）
〔式中、２位、３位、４位および７位の立体配置はそれぞれＳ、Ｓ、Ｒ、Ｒである〕で表される化合物であり、しかも比旋光度〔α〕Ｄ２６−６２．３°（ｃ１．０，ジクロロメタン）を示す無色粘稠な油状物質であって、またシリカゲル薄層クロマトグラフィーでクロロホルム−メタノール（１０：１）よりなる展開溶媒で展開して測定した場合に本ＲＳ−Ｋ３５７４物質は０．３９のＲｆ値を示し、さらに本ＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルにおける主なピークはλｍａｘｎｍ（ε）；２０９（８３００）および２４１（５７００）にあり；赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤法）における主な吸収帯はνｍａｘ（ｃｍ−１）；３３００〜３５００、２９７９、２９１１、１６８１、１４４６、１３７９、１０４３、９９５、８５０、８１７、５７０にあり；重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で５００ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質のプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は３．４７（ｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、３．８１（ｄｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、４．６９（ｂｒ ｓ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、６．７１（ｄｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、５．２９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、５．０２（ｄｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）であり、また重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で１２５ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質の炭素１３核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は、１９４．６（ｓ）、５３．９（ｄ）、５７．７（ｄ）、６３．２（ｄ）、１３７．８（ｄ）、１３９．０（ｓ）、６５．３（ｓ）、１２３．６（ｄ）、１３８．４（ｓ）、２５．８（ｑ）、１８．４（ｑ）であることを特徴とする、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４。
【請求項２】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を生産するアラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）を栄養培地に培養し、その得られた培養物から生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を採取することを特徴とする、請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の製造法。
【請求項３】
生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生産菌として、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにブダペスト条約の規約下にＦＥＲＭ ＢＰ−８２６５の寄託番号で寄託されてあるアラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）・Ｋ−３５７４株を培養する、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項４】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ユビキチン活性化酵素の阻害剤。
【請求項５】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害剤。
【請求項６】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合された製薬学的に許容できる担体を含有する抗腫瘍剤組成物。
【請求項７】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合された製薬学的に許容できる担体を含有する抗炎症剤組成物。
【請求項８】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合された製薬学的に許容できる担体を含有する抗ウィルス剤組成物。
【請求項９】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞に対する殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線の癌細胞アポトーシス誘発作用の増強剤。
【請求項１０】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞内のタンパク質生合成の阻害剤。
【請求項１１】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化に対する阻害剤。
【請求項１】
このＲＳ−Ｋ３５７４物質は次式（Ｉ）
〔式中、２位、３位、４位および７位の立体配置はそれぞれＳ、Ｓ、Ｒ、Ｒである〕で表される化合物であり、しかも比旋光度〔α〕Ｄ２６−６２．３°（ｃ１．０，ジクロロメタン）を示す無色粘稠な油状物質であって、またシリカゲル薄層クロマトグラフィーでクロロホルム−メタノール（１０：１）よりなる展開溶媒で展開して測定した場合に本ＲＳ−Ｋ３５７４物質は０．３９のＲｆ値を示し、さらに本ＲＳ−Ｋ３５７４物質のメタノール溶液中で測定した紫外線吸収スペクトルにおける主なピークはλｍａｘｎｍ（ε）；２０９（８３００）および２４１（５７００）にあり；赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠剤法）における主な吸収帯はνｍａｘ（ｃｍ−１）；３３００〜３５００、２９７９、２９１１、１６８１、１４４６、１３７９、１０４３、９９５、８５０、８１７、５７０にあり；重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で５００ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質のプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は３．４７（ｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、３．８１（ｄｄｄ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、４．６９（ｂｒ ｓ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．０Ｈｚ）、６．７１（ｄｄｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝２．５Ｈｚ）、５．２９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、５．０２（ｄｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）、１．７２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ）であり、また重クロロホルムＣＤＣｌ３溶液（内部標準としてテトラメチルシランを使用）中で１２５ＭＨｚで測定したＲＳ−Ｋ３５７４物質の炭素１３核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）スペクトルにおいて、δ値（ｐｐｍ）は、１９４．６（ｓ）、５３．９（ｄ）、５７．７（ｄ）、６３．２（ｄ）、１３７．８（ｄ）、１３９．０（ｓ）、６５．３（ｓ）、１２３．６（ｄ）、１３８．４（ｓ）、２５．８（ｑ）、１８．４（ｑ）であることを特徴とする、生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４。
【請求項２】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を生産するアラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）を栄養培地に培養し、その得られた培養物から生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を採取することを特徴とする、請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の製造法。
【請求項３】
生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４の生産菌として、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターにブダペスト条約の規約下にＦＥＲＭ ＢＰ−８２６５の寄託番号で寄託されてあるアラゲカワキタケ（Ｐａｎｕｓｒｕｄｉｓ）・Ｋ−３５７４株を培養する、請求の範囲１に記載の方法。
【請求項４】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ユビキチン活性化酵素の阻害剤。
【請求項５】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、細胞内タンパク質のユビキチン化の阻害剤。
【請求項６】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合された製薬学的に許容できる担体を含有する抗腫瘍剤組成物。
【請求項７】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合された製薬学的に許容できる担体を含有する抗炎症剤組成物。
【請求項８】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４を有効成分として含有し、これに混合された製薬学的に許容できる担体を含有する抗ウィルス剤組成物。
【請求項９】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞に対する殺細胞性抗腫瘍剤または抗癌剤または癌治療用放射線の癌細胞アポトーシス誘発作用の増強剤。
【請求項１０】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、癌細胞内のタンパク質生合成の阻害剤。
【請求項１１】
請求の範囲１に記載の生理活性物質ＲＳ−Ｋ３５７４から成る、ＮＦ−ＫＢ転写因子の活性化に対する阻害剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６５６０７
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６７１３２（Ｐ２００４−５６７１３２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０００５３２
【国際出願日】平成１５年１月２２日（２００３．１．２２）
【出願人】（０００１７３９１３）財団法人微生物化学研究会 (29)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【発行日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０００５３２
【国際出願日】平成１５年１月２２日（２００３．１．２２）
【出願人】（０００１７３９１３）財団法人微生物化学研究会 (29)
【Ｆターム（参考）】
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