新規Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤
【課題】ＨＣＶの複製またはＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす薬剤であるＨＣＶ阻害剤を提供する。
【解決手段】以下に示す式（I）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかの化合物を含むＣ型肝炎ウイルス阻害剤。（式中、Ｒ１，Ｒ２は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基等から選択される任意の基を表す。）
【解決手段】以下に示す式（I）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかの化合物を含むＣ型肝炎ウイルス阻害剤。（式中、Ｒ１，Ｒ２は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基等から選択される任意の基を表す。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＣ型肝炎ウイルス阻害剤に関する。より詳しくは、Ｃ型肝炎ウイルスの感染、細胞への侵入、複製又はＣ型肝炎ウイルスタンパク質の翻訳、成熟、ウイルス粒子の組み立て、放出過程に影響を及ぼす各種物質を探索して検出された新規Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：hepatitis C virus）は、一本鎖ＲＮＡウイルスで、フラビウイルス科ヘパシウイルス属に属する。 ＨＣＶ１〜６までの６種の遺伝子型に分類される。さらにそれらの遺伝子型がいくつかのサブタイプに分類される(Hepatology, 10: p1321-1324 (1994); Hepatology, 42: p962-973 (2005))。現在では、ＨＣＶの複数の遺伝子型についてゲノム全長の塩基配列が決定されている(Science,244: p359-362 (1989); J.Med.Virol., p334-339 (1992); J.Gen Virol.,73: p673-679 (1992); Hepatology, 16, 293-299 (1992))。
【０００３】
ＨＣＶは、約９．４ｋｂの一本鎖ＲＮＡをゲノムとする。ゲノムの両端に存在する非翻訳領域は二次構造にとみ、５’末端には通常のｍＲＮＡで観察されるキャップ構造がなく、そのかわりにキャップ非依存的にｒＲＮＡがＲＮＡの翻訳を開始可能なＩＲＥＳ(Internal Ribosomal Entry Site)が存在する。ウイルスＲＮＡから約3000アミノ酸からなる巨大な前駆体タンパク質が翻訳され、宿主細胞由来のタンパク質分解酵素によりウイルスの粒子を構成するコアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）に、また粒子には取り込まれないが、複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）は、ＮＳ２とＮＳ３が有するタンパク質分解酵素によって各タンパク質に切断される。
【０００４】
ＨＡＡＲＴ(Highly active antiretroviral therapy)の導入によって、エイズ患者の予後が大幅に改善された結果、わが国を含む先進国では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Human Immunodeficiency Virus）感染者においてもエイズ以外の病因で死亡するケースが急増している。特に共感染したＨＣＶによる肝障害・肝不全の合併が死因の重要な部分をしめるようになっている。特に、非加熱凝固因子製剤によるＨＩＶ感染者では、ＨＩＶとＨＣＶの共感染は９７％にもおよび、ＨＣＶ感染症の治療はポストＨＡＡＲＴ時代の医療課題として重要なものとなっている。現在、ＨＣＶ感染症に対して、インターフェロンとリバビリン（Ribavirin(1-β-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-tri-azole-3-carboxamide)）の併用療法が一般的であるが、患者全体の５０％にしか有効ではなく、また、血球減少症・溶血性貧血など重篤な副作用をおこすことが知られている。
【０００５】
これまではＨＣＶにはウイルス培養系と実験用の感染小動物が存在しないことがＨＣＶの基礎研究の妨げになってきた。KolyhalovらはＨＣＶと同じフラビウイルス科に属するKunjinウイルスのレプリコンシステムを報告した（非特許文献１）。このシステムはKunjinウイルスの構造領域を取り除き、3'utrを脳心筋炎ウイルス（encephalomyocarditis virus:ＥＭＣＶ）のＩＲＥＳとネオマイシン耐性遺伝子に置き換えたものであり、この遺伝子構築から作られたＲＮＡを培養細胞に導入し、ネオマイシンで選択培養することにより、KunjinウイルスＲＮＡの持続的な複製とタンパク質発現が観察されるという実験系であった。そして、1999年、LohamannらによりＨＣＶのレプリコンシステムが報告された（非特許文献２）。このシステムはＨＣＶの構造領域の一部（ＮＳ２）を取り除き、その部分にＥＭＣＶのＩＲＥＳとネオマイシン耐性遺伝子を挿入したものである。この構造物を鋳型として試験管内でＲＮＡを合成し、Ｈｕｈ７細胞に導入した後にネオマイシン選択培地で選択培養し、この遺伝子構造から作られたＲＮＡを培養細胞に導入し、ネオマイシンで選択培養することにより、複製したＨＣＶレプリコンＲＮＡからネオマイシン耐性遺伝子が発現され、その遺伝子の働きでレプリコンが複製している細胞のみが生存可能となり、増殖したコロニーを形成する。レプリコン複製細胞では、ＨＣＶレプリコンＲＮＡが非常に高レベルで複製しており、複製しているＲＮＡや発現しているＨＣＶタンパク質を持続して安定して検出することができる。
【０００６】
しかし、それまではレプリコンとして増殖が報告されたＨＣＶ株は、全て遺伝子型１の株であった。さらにこれらの株は培養細胞内での増殖時にその複製効率を増強する適応変異を持ち、その適応変異の多くは患者血清から分離されたＨＣＶ株では認められない変異であった。また、その適応範囲を感染性クローンに導入し、そのＲＮＡをチンパンジーの肝臓に接種したところ、感染性が失われていることが明らかとなった。
【０００７】
遺伝子型が異なるＨＣＶでは、コードされるウイルスタンパク質にも違いがあることが報告されており、遺伝子型１ｂのＨＣＶ由来のサブゲノムレプリコンの解析だけでは、ＨＣＶの複製機構を十分に解明することは難しいと考えられる。さらに、インターフェロンの治療効果がＨＣＶの遺伝子型によって異なることから、遺伝子型１ｂのＨＣＶのサブゲノムレプリコンを含むＨＣＶ複製系のみを用いて様々なタイプのＨＣＶに効果を及ぼす抗ＨＣＶ薬を開発することは特に難しいと考えられる。したがって、数多くの遺伝子型のＨＣＶのレプリコンを作製して、ＨＣＶ複製機構、及び抗ＨＣＶ薬の研究を行う必要があると考えられる。
【０００８】
その後、他の遺伝子型のＨＣＶ株の遺伝子を用いたＨＣＶレプリコンが各種報告されている。特に感染性クローンのＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成するＨＣＶレプリコンについて報告がある（非特許文献３、４、特許文献１）。しかし、従来のレプリコンシステムでは、ＨＣＶ感染後の後期過程に作用する阻害剤であれば検出することが可能であったが、増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とするＨＣＶの阻害剤・治療剤を検出するには不十分であった。そこで、増殖環の全過程の何れかの過程を標的とする新たなＨＣＶ阻害剤の開発が望まれていた。
【非特許文献１】J. Virol., 71, 1497-1505 (1997)
【非特許文献２】Science 285, p.110-113 (1999)
【非特許文献３】Nature Medicine 11, Number 7, July p.791-796 (2005)
【非特許文献４】ウイルス第５５巻第２号 pp.287-296 (2005)
【特許文献１】国際公開WO2005/028652号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規なＨＣＶ阻害剤を提供することを課題とする。より詳しくは、ＨＣＶの複製又はＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす薬剤であるＨＣＶ阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体及び感染性ＨＣＶを接触させたのちにＨＣＶを測定し、ＨＣＶの複製又はＨＣＶタンパク質の翻訳などに影響を及ぼす各物質を探索することにより、新規なＨＣＶ阻害剤を検出することができた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の１）〜４）で示されるいずれかの化合物からなる、宿主細胞においてＨＣＶの産生を抑制しうるＨＣＶ阻害剤：
１）以下に示す一般式（I）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（I）：
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
２）以下に示す一般式（II）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（II）：
【化２】
（式中、Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
３）以下に示す一般式（III）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（III）：
【化３】
（式中、Ｒ４は、式（IV）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
式（IV）：
【化４】
４）以下に示す一般式（V）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（V）：
【化５】
（式中、Ｒ７は、式（VI）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ８及びＲ９は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
式（VI）：
【化６】
（式中、Ｒ１０は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
２．一般式（I）で示される化合物が、以下の式（VII）又は式（VIII）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、前項１に記載のＨＣＶ阻害剤。
式（VII）：
【化７】
式（VIII）：
【化８】
３．一般式（II）で示される化合物が、以下の式（IX）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、前項１に記載のＨＣＶ阻害剤。
式（IX）：
【化９】
４．一般式（III）で示される化合物が、以下の式（X）又は式（XI）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、前項１に記載のＨＣＶ阻害剤。
式（X）：
【化１０】
式（XI）：
【化１１】
５．一般式（V）で示される化合物が、以下の式（XII）又は式（XIII）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、前項１に記載のＨＣＶ阻害剤。
式（XII）：
【化１２】
式（XIII）：
【化１３】
６．前項１〜５に示されるいずれかの化合物からなるＨＣＶ阻害剤を有効量含み、さらに、薬学的に許容し得る担体を含んでなる医薬組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＨＣＶ阻害剤は、ＨＣＶ増殖に対する高い阻害活性（ＩＣ５０＝〜７０ｎＭ、ＣＣ５０＝〜３５μＭ；ＳＩ(selective index)＝〜５００）を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、詳細に本発明の内容を説明する。
（ＨＣＶ阻害剤）
本発明は、宿主細胞において、ＨＣＶの産生を抑制しうるＨＣＶ阻害剤であり、以下の１．〜５．で示される化合物から選択されるいずれかの化合物で示すことができる。本発明において、宿主細胞とは、ＨＣＶが感染しうる細胞をいい、例えば肝細胞が挙げられる。この宿主細胞は、in vitro又はin vivoの系は、いずれであっても良い。ＨＣＶの産生を抑制しうるとは、例えば後述するスクリーニング方法により、細胞におけるＨＣＶの産生、具体的にはコアタンパク質の産生を抑制しうる系でアッセイすることにより、選別することができる。
本発明で化合物としては、具体的に構造式で示す化合物の他、Ｌ体、Ｄ体又はラセミ体が挙げられ、好ましくはＬ体が挙げられる。また本発明の化合物をさらに化学修飾して、別の化合物に誘導化することも可能である。
【００１４】
１．以下に示す一般式（I）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかの化合物である。
式（I）：
【化１４】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【００１５】
２．以下に示す一般式（II）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかの化合物である。
式（II）：
【化１５】
（式中、Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【００１６】
４．以下に示す一般式（III）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかの化合物である。
式（III）：
【化１６】
（式中、Ｒ４は、式（IV）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【００１７】
式（IV）：
【化１７】
【００１８】
５．ＨＣＶ阻害剤が、以下に示す一般式（V）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかの化合物である。
式（V）：
【化１８】
（式中、Ｒ７は、式（VI）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ８及びＲ９は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【００１９】
式（VI）：
【化１９】
（式中、Ｒ１０は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【００２０】
上記において、「置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基」における置換基としては、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子、ハロアルキル基、アミノ基、置換 アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、カルバモイル基等が挙げられる。
【００２１】
「低級アルキル」とは、炭素数１〜８個の直鎖状又は分岐状のアルキル基を意味し、具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソぺンチル、ネオぺンチル、tert−ぺンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等が挙げられる。
【００２２】
「低級アルコキシ」とは、炭素数１〜６個の直鎖状又は分岐状のアルコキシ基を意味し、具体的にはメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシが挙げられる。
【００２３】
「アリール」としては、フェニル、ナフチル又は多環芳香族炭化水素基（フェナンスリル等）が挙げられる。
【００２４】
「ヘテロアリール」としては、Ｎ、Ｏ、Ｓ、からなる群から選択されるヘテロ原子を１〜４個含む５〜６員の芳香環基（例えば、フラン、チオフェン、ピロール、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン）であるが、好ましくはＮ原子を含む環基（ピリジン、ピラジン等）を挙げることができる。
【００２５】
「アラルキル」とは、上記の低級アルキル基に上記アリールが置換 して形成される基であり、ベンジル、メチルベンジル、ナフチルメチルが例示される。
【００２６】
「アラルキルオキシカルボニル」とは、カルボニル基に上記のアラルキルがＯ原子を介して結合して形成される基であり、ベンジルオキシカルボニル等が例示される。
【００２７】
「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
【００２８】
「低級アルキルカルボニル」、「アリールカルボニル」又は「ヘテロアリールカルボニル」とは、それぞれ、カルボニル基に上記の低級アルキル、アリール又はヘテロアリールが置換 して形成される基である。アセチル、ベンゾイル、ナフチルカルボニル等が例示される
【００２９】
「低級アルキルスルホニル」、「アリールスルホニル」又は「ヘテロアリールスルホニル」とは、それぞれ、スルホニル基に上記の低級アルキル、アリール又はヘテロアリールが置換 して形成される基である。
【００３０】
「脂肪族ヘテロ環」とは、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択されるヘテロ原子を１〜４個含む５〜６員の脂肪族環であり、ピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリル、チアゾリル等が例示される。
【００３１】
本発明のＨＣＶ阻害剤としては、具体的には、以下の化合物１Ａ〜４Ｂ（式VII〜XIII）で示される化合物が特に好適である。
【００３２】
【化２０】
【００３３】
本発明において、薬学上許容される塩とは、以下が挙げられる。
塩基性付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；例えばアンモニウム塩；例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩；ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩；たとえばＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；例えばピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩；例えばテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩；リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００３４】
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、りん酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、りんご酸塩、くえん酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等を挙げることができる。
【００３５】
（ＨＣＶ阻害剤を含む医薬組成物）
本発明は、上記に示すいずれかの化合物で示されるＨＣＶ阻害剤を有効量含み、さらに、薬学的に許容し得る担体を含んでなる医薬組成物も含まれる。かかる医薬組成物は、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与による場合、本発明化合物は通常の製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合、本発明化合物は、水性又は油性懸濁注射剤、点鼻液として用いることができる。その調製に際しては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等を任意に用いることができる。
【００３６】
（本発明のＨＣＶ阻害剤のスクリーニング方法）
本発明に係るＨＣＶ阻害剤をスクリーニングは、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体及び感染性ＨＣＶを接触させたのち、ＨＣＶを測定することにより行うことができる。
【００３７】
感染性ＨＣＶは、PNAS Vol.102, no.26 p.9294-9299 (2005)に記載の方法に従い、ＲＮＡ PolIプロモーター／ターミネーター系を利用したＪＦＨ１株（genotype 2a)のｃＤＮＡ発現プラスミド導入細胞株（Huh7.5.1/JFH1 zeo R細胞）を用いて、図１に示す感染性ＨＣＶレプリコンゲノムから作製することができる。ＨＣＶストック液は、分注した後、−８０℃で保存する。
【００３８】
より具体的には、以下のようにして行うことができる。
１）ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７．５．１細胞を、播種する工程；
２）試験検体を上記播種した細胞を含む培養液に加える工程；
３）さらに感染性ＨＣＶを播種する工程；
４）３７±１℃で加温する工程；
５）培養上清を採取し、ＨＣＶを測定する工程。
【００３９】
上記スクリーニング方法について、さらに詳しく説明する。
１）上記ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７．５．１細胞を、該細胞培養用培地に懸濁し、例えば９６穴のマイクロプレートなどのスクリーニング用容器に播種する。
２）スクリーニング候補化合物を、細胞を含むスクリーニング用容器に加える。
３）さらに上記感染性ＨＣＶを播種し、スクリーニング候補化合物と感染性ＨＣＶを含む複製細胞を培養し、得られる培養物中の感染性ＨＣＶを検出する。
４）感染性ＨＣＶを細胞中で培養するために、３〜１０日間、３７±１℃で加温することができる。
５）上記培養後、培養上清を採取し、ＨＣＶを測定することにより本発明のアッセイを行うことができる。ＨＣＶの測定は、ＨＣＶの複製の促進又は抑制を確認しうる方法であれば良く、特に限定されるものではないが、例えば市販のキットを用いてＨＣＶコアタンパクの産生量をＥＬＩＳＡ法などにより確認することができる。
【００４０】
本発明のＨＣＶ阻害剤は、上記のスクリーニング方法に加えて、候補化合物のＨＣＶの複製の促進又は抑制に及ぼす影響をより確実に確認するために、非特異作用を排除するために並行して細胞毒性試験を行い、毒性の低いものを選定して得た。ＨＣＶの増殖を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にＨＣＶの増殖に影響を及ぼす有機化合物、あるいはＨＣＶゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりＨＣＶの増殖若しくはＨＣＶタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４２】
（実施例及び比較例）
Enamine社（ナミキ商事）が保有する化合物について、本発明のＨＣＶ阻害剤のスクリーニング方法に従い、スクリーニングを行い、以下の化合物１Ａ〜４Ｂ（式VII〜XIII）で示される化合物及び１Ｃ〜３Ｃ（式XIV〜XVIII）で示される各化合物を選定した。
【化２１】
【００４３】
【化２２】
【００４４】
（実験例１）ＨＣＶ阻害効果及び細胞毒性試験結果
上記で得られた各化合物（実施例１〜７、比較例１〜５）及びリバビリン（Ribavirin (1-β-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-tri-azole-3-carboxamide)）についての、以下に示す方法にて抗ＨＣＶ作用、毒性、並びにセレクティブインデクス（ＳＩ）を測定した。結果を表１に示した。
【００４５】
１）抗ＨＣＶ作用
Ｈｕｈ７．５．１細胞（継代数が第４３回目までのものを使用）を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に1×104cells/100μl/ウェルとなるように懸濁したものを９６ウェルのマイクロプレートに播種し、１日培養後に培地を交換した。この細胞に、各試験化合物を検体として５μＭとなるように添加した。リバビリンについても同様の濃度で行った。１５分間静置した後に、上記１）により得た感染性ＨＣＶ（ＨＣＶコアタンパク質量として、約0.2fmol/ウェル）をＨｕｈ７．５．１細胞に播種して感染させ、３７℃、５％CO2にて５〜６日間培養した。培養後、上清中のＨＣＶコアタンパク質量をオーソＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストにより定量し、各化合物のＨＣＶ増殖阻害効果を評価した。該ＨＣＶ増殖阻害効果から、ＩＣ５０値を求めた。ＩＣ５０値は、ウイルスの増殖を５０％抑制する薬剤の濃度で表す。
表１において、（−）と示しているのは、ＩＣ５０値及び細胞毒性の結果から判断したものである。
【００４６】
２）細胞毒性試験
上記の各化合物について、テトラゾリウム塩WST-8の生成したホルマザンの吸光度を直接測定するＷＳＴ法により、Ｈｕｈ７．５．１細胞に対する細胞毒性試験を行った。該細胞毒性試験結果から、ＣＣ５０値を求めた。ＣＣ５０値は、細胞が５０％傷害を受ける薬剤の濃度で表す。
【００４７】
３）ＳＩ
ＩＣ５０値は抗ウイルス効果を発揮する薬剤濃度で、ＣＣ５０値はその薬剤が安全に使える濃度である。ＣＣ５０値をＩＣ５０値で割った値をＳＩといい、その値が大きいほど、細胞を傷つけずにウイルスの増殖のみを抑える効果が高いとみなせる。
【００４８】
４）結果
【表１】
【００４９】
上記の試験結果を表１に示した。本発明のＨＣＶ阻害剤のうち、上記各実施例に記載の各化合物は、ＩＣ５０はリバビリンに比べて低値であった。また、ＣＣ５０（毒性）を測定したものについては、その値は同等又はやや低い値を示した。ＳＩ値は、リバビリンでは２．０であったのに対し、実施例１、３、４及び６に記載の化合物については、いずれも３０以上の値を示し、ＨＣＶ阻害剤として優れていることが確認された。特に実施例１に記載の化合物は、ＨＣＶ増殖に対する高い阻害活性（ＩＣ５０＝〜７０ｎＭ、ＣＣ５０＝〜３５μＭ；ＳＩ＝〜５００）を示し、抗ＨＣＶ阻害剤として特に優れていることが考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上詳述したように、本発明の化合物は、優れた抗ＨＣＶ作用を示すことが確認された。本発明のＨＣＶ阻害剤を構成する化合物は、薬学上許容しうる担体とともに医薬用組成物としての利用が可能である他、より優れた効果の抗ＨＣＶ阻害剤を選別するためのリード化合物としても利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明におけるスクリーニング方法に使用される感染性ＨＣＶのレプリコンゲノムの構造及びプラスミドを示す図である。
【図２】本発明におけるスクリーニング方法に使用されるアッセイ方法を示す図である。
【符号の説明】
【００５２】
ａ（図２） スクリーニングしようとする試験検体。例えば低分子化合物ライブラリー及び他の試験検体(0.5μM)
ｂ（図２） Huh7.5.1/pHH-JFH1 zeo R細胞の培養上清
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＣ型肝炎ウイルス阻害剤に関する。より詳しくは、Ｃ型肝炎ウイルスの感染、細胞への侵入、複製又はＣ型肝炎ウイルスタンパク質の翻訳、成熟、ウイルス粒子の組み立て、放出過程に影響を及ぼす各種物質を探索して検出された新規Ｃ型肝炎ウイルス阻害剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：hepatitis C virus）は、一本鎖ＲＮＡウイルスで、フラビウイルス科ヘパシウイルス属に属する。 ＨＣＶ１〜６までの６種の遺伝子型に分類される。さらにそれらの遺伝子型がいくつかのサブタイプに分類される(Hepatology, 10: p1321-1324 (1994); Hepatology, 42: p962-973 (2005))。現在では、ＨＣＶの複数の遺伝子型についてゲノム全長の塩基配列が決定されている(Science,244: p359-362 (1989); J.Med.Virol., p334-339 (1992); J.Gen Virol.,73: p673-679 (1992); Hepatology, 16, 293-299 (1992))。
【０００３】
ＨＣＶは、約９．４ｋｂの一本鎖ＲＮＡをゲノムとする。ゲノムの両端に存在する非翻訳領域は二次構造にとみ、５’末端には通常のｍＲＮＡで観察されるキャップ構造がなく、そのかわりにキャップ非依存的にｒＲＮＡがＲＮＡの翻訳を開始可能なＩＲＥＳ(Internal Ribosomal Entry Site)が存在する。ウイルスＲＮＡから約3000アミノ酸からなる巨大な前駆体タンパク質が翻訳され、宿主細胞由来のタンパク質分解酵素によりウイルスの粒子を構成するコアタンパク質と２つのエンベロープタンパク質（Ｅ１、Ｅ２）に、また粒子には取り込まれないが、複製に必要な非構造タンパク質（ＮＳタンパク質）は、ＮＳ２とＮＳ３が有するタンパク質分解酵素によって各タンパク質に切断される。
【０００４】
ＨＡＡＲＴ(Highly active antiretroviral therapy)の導入によって、エイズ患者の予後が大幅に改善された結果、わが国を含む先進国では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：Human Immunodeficiency Virus）感染者においてもエイズ以外の病因で死亡するケースが急増している。特に共感染したＨＣＶによる肝障害・肝不全の合併が死因の重要な部分をしめるようになっている。特に、非加熱凝固因子製剤によるＨＩＶ感染者では、ＨＩＶとＨＣＶの共感染は９７％にもおよび、ＨＣＶ感染症の治療はポストＨＡＡＲＴ時代の医療課題として重要なものとなっている。現在、ＨＣＶ感染症に対して、インターフェロンとリバビリン（Ribavirin(1-β-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-tri-azole-3-carboxamide)）の併用療法が一般的であるが、患者全体の５０％にしか有効ではなく、また、血球減少症・溶血性貧血など重篤な副作用をおこすことが知られている。
【０００５】
これまではＨＣＶにはウイルス培養系と実験用の感染小動物が存在しないことがＨＣＶの基礎研究の妨げになってきた。KolyhalovらはＨＣＶと同じフラビウイルス科に属するKunjinウイルスのレプリコンシステムを報告した（非特許文献１）。このシステムはKunjinウイルスの構造領域を取り除き、3'utrを脳心筋炎ウイルス（encephalomyocarditis virus:ＥＭＣＶ）のＩＲＥＳとネオマイシン耐性遺伝子に置き換えたものであり、この遺伝子構築から作られたＲＮＡを培養細胞に導入し、ネオマイシンで選択培養することにより、KunjinウイルスＲＮＡの持続的な複製とタンパク質発現が観察されるという実験系であった。そして、1999年、LohamannらによりＨＣＶのレプリコンシステムが報告された（非特許文献２）。このシステムはＨＣＶの構造領域の一部（ＮＳ２）を取り除き、その部分にＥＭＣＶのＩＲＥＳとネオマイシン耐性遺伝子を挿入したものである。この構造物を鋳型として試験管内でＲＮＡを合成し、Ｈｕｈ７細胞に導入した後にネオマイシン選択培地で選択培養し、この遺伝子構造から作られたＲＮＡを培養細胞に導入し、ネオマイシンで選択培養することにより、複製したＨＣＶレプリコンＲＮＡからネオマイシン耐性遺伝子が発現され、その遺伝子の働きでレプリコンが複製している細胞のみが生存可能となり、増殖したコロニーを形成する。レプリコン複製細胞では、ＨＣＶレプリコンＲＮＡが非常に高レベルで複製しており、複製しているＲＮＡや発現しているＨＣＶタンパク質を持続して安定して検出することができる。
【０００６】
しかし、それまではレプリコンとして増殖が報告されたＨＣＶ株は、全て遺伝子型１の株であった。さらにこれらの株は培養細胞内での増殖時にその複製効率を増強する適応変異を持ち、その適応変異の多くは患者血清から分離されたＨＣＶ株では認められない変異であった。また、その適応範囲を感染性クローンに導入し、そのＲＮＡをチンパンジーの肝臓に接種したところ、感染性が失われていることが明らかとなった。
【０００７】
遺伝子型が異なるＨＣＶでは、コードされるウイルスタンパク質にも違いがあることが報告されており、遺伝子型１ｂのＨＣＶ由来のサブゲノムレプリコンの解析だけでは、ＨＣＶの複製機構を十分に解明することは難しいと考えられる。さらに、インターフェロンの治療効果がＨＣＶの遺伝子型によって異なることから、遺伝子型１ｂのＨＣＶのサブゲノムレプリコンを含むＨＣＶ複製系のみを用いて様々なタイプのＨＣＶに効果を及ぼす抗ＨＣＶ薬を開発することは特に難しいと考えられる。したがって、数多くの遺伝子型のＨＣＶのレプリコンを作製して、ＨＣＶ複製機構、及び抗ＨＣＶ薬の研究を行う必要があると考えられる。
【０００８】
その後、他の遺伝子型のＨＣＶ株の遺伝子を用いたＨＣＶレプリコンが各種報告されている。特に感染性クローンのＲＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成するＨＣＶレプリコンについて報告がある（非特許文献３、４、特許文献１）。しかし、従来のレプリコンシステムでは、ＨＣＶ感染後の後期過程に作用する阻害剤であれば検出することが可能であったが、増殖環の全過程から選択される何れかの過程を標的とするＨＣＶの阻害剤・治療剤を検出するには不十分であった。そこで、増殖環の全過程の何れかの過程を標的とする新たなＨＣＶ阻害剤の開発が望まれていた。
【非特許文献１】J. Virol., 71, 1497-1505 (1997)
【非特許文献２】Science 285, p.110-113 (1999)
【非特許文献３】Nature Medicine 11, Number 7, July p.791-796 (2005)
【非特許文献４】ウイルス第５５巻第２号 pp.287-296 (2005)
【特許文献１】国際公開WO2005/028652号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規なＨＣＶ阻害剤を提供することを課題とする。より詳しくは、ＨＣＶの複製又はＨＣＶタンパク質の翻訳に影響を及ぼす薬剤であるＨＣＶ阻害剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体及び感染性ＨＣＶを接触させたのちにＨＣＶを測定し、ＨＣＶの複製又はＨＣＶタンパク質の翻訳などに影響を及ぼす各物質を探索することにより、新規なＨＣＶ阻害剤を検出することができた。
【００１１】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の１）〜４）で示されるいずれかの化合物からなる、宿主細胞においてＨＣＶの産生を抑制しうるＨＣＶ阻害剤：
１）以下に示す一般式（I）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（I）：
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
２）以下に示す一般式（II）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（II）：
【化２】
（式中、Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
３）以下に示す一般式（III）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（III）：
【化３】
（式中、Ｒ４は、式（IV）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
式（IV）：
【化４】
４）以下に示す一般式（V）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（V）：
【化５】
（式中、Ｒ７は、式（VI）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ８及びＲ９は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
式（VI）：
【化６】
（式中、Ｒ１０は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
２．一般式（I）で示される化合物が、以下の式（VII）又は式（VIII）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、前項１に記載のＨＣＶ阻害剤。
式（VII）：
【化７】
式（VIII）：
【化８】
３．一般式（II）で示される化合物が、以下の式（IX）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、前項１に記載のＨＣＶ阻害剤。
式（IX）：
【化９】
４．一般式（III）で示される化合物が、以下の式（X）又は式（XI）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、前項１に記載のＨＣＶ阻害剤。
式（X）：
【化１０】
式（XI）：
【化１１】
５．一般式（V）で示される化合物が、以下の式（XII）又は式（XIII）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、前項１に記載のＨＣＶ阻害剤。
式（XII）：
【化１２】
式（XIII）：
【化１３】
６．前項１〜５に示されるいずれかの化合物からなるＨＣＶ阻害剤を有効量含み、さらに、薬学的に許容し得る担体を含んでなる医薬組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＨＣＶ阻害剤は、ＨＣＶ増殖に対する高い阻害活性（ＩＣ５０＝〜７０ｎＭ、ＣＣ５０＝〜３５μＭ；ＳＩ(selective index)＝〜５００）を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、詳細に本発明の内容を説明する。
（ＨＣＶ阻害剤）
本発明は、宿主細胞において、ＨＣＶの産生を抑制しうるＨＣＶ阻害剤であり、以下の１．〜５．で示される化合物から選択されるいずれかの化合物で示すことができる。本発明において、宿主細胞とは、ＨＣＶが感染しうる細胞をいい、例えば肝細胞が挙げられる。この宿主細胞は、in vitro又はin vivoの系は、いずれであっても良い。ＨＣＶの産生を抑制しうるとは、例えば後述するスクリーニング方法により、細胞におけるＨＣＶの産生、具体的にはコアタンパク質の産生を抑制しうる系でアッセイすることにより、選別することができる。
本発明で化合物としては、具体的に構造式で示す化合物の他、Ｌ体、Ｄ体又はラセミ体が挙げられ、好ましくはＬ体が挙げられる。また本発明の化合物をさらに化学修飾して、別の化合物に誘導化することも可能である。
【００１４】
１．以下に示す一般式（I）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかの化合物である。
式（I）：
【化１４】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【００１５】
２．以下に示す一般式（II）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかの化合物である。
式（II）：
【化１５】
（式中、Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【００１６】
４．以下に示す一般式（III）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかの化合物である。
式（III）：
【化１６】
（式中、Ｒ４は、式（IV）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【００１７】
式（IV）：
【化１７】
【００１８】
５．ＨＣＶ阻害剤が、以下に示す一般式（V）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかの化合物である。
式（V）：
【化１８】
（式中、Ｒ７は、式（VI）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ８及びＲ９は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【００１９】
式（VI）：
【化１９】
（式中、Ｒ１０は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【００２０】
上記において、「置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基」における置換基としては、低級アルキル基、低級アルコキシ基、水酸基、ハロゲン原子、ハロアルキル基、アミノ基、置換 アミノ基、シアノ基、ニトロ基、カルボキシ基、カルバモイル基等が挙げられる。
【００２１】
「低級アルキル」とは、炭素数１〜８個の直鎖状又は分岐状のアルキル基を意味し、具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ｎ−ぺンチル、イソぺンチル、ネオぺンチル、tert−ぺンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等が挙げられる。
【００２２】
「低級アルコキシ」とは、炭素数１〜６個の直鎖状又は分岐状のアルコキシ基を意味し、具体的にはメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシが挙げられる。
【００２３】
「アリール」としては、フェニル、ナフチル又は多環芳香族炭化水素基（フェナンスリル等）が挙げられる。
【００２４】
「ヘテロアリール」としては、Ｎ、Ｏ、Ｓ、からなる群から選択されるヘテロ原子を１〜４個含む５〜６員の芳香環基（例えば、フラン、チオフェン、ピロール、オキサゾール、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、トリアジン）であるが、好ましくはＮ原子を含む環基（ピリジン、ピラジン等）を挙げることができる。
【００２５】
「アラルキル」とは、上記の低級アルキル基に上記アリールが置換 して形成される基であり、ベンジル、メチルベンジル、ナフチルメチルが例示される。
【００２６】
「アラルキルオキシカルボニル」とは、カルボニル基に上記のアラルキルがＯ原子を介して結合して形成される基であり、ベンジルオキシカルボニル等が例示される。
【００２７】
「ハロゲン」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が挙げられる。
【００２８】
「低級アルキルカルボニル」、「アリールカルボニル」又は「ヘテロアリールカルボニル」とは、それぞれ、カルボニル基に上記の低級アルキル、アリール又はヘテロアリールが置換 して形成される基である。アセチル、ベンゾイル、ナフチルカルボニル等が例示される
【００２９】
「低級アルキルスルホニル」、「アリールスルホニル」又は「ヘテロアリールスルホニル」とは、それぞれ、スルホニル基に上記の低級アルキル、アリール又はヘテロアリールが置換 して形成される基である。
【００３０】
「脂肪族ヘテロ環」とは、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から選択されるヘテロ原子を１〜４個含む５〜６員の脂肪族環であり、ピロリジニル、チアゾリジニル、オキサゾリジニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピロリル、チアゾリル等が例示される。
【００３１】
本発明のＨＣＶ阻害剤としては、具体的には、以下の化合物１Ａ〜４Ｂ（式VII〜XIII）で示される化合物が特に好適である。
【００３２】
【化２０】
【００３３】
本発明において、薬学上許容される塩とは、以下が挙げられる。
塩基性付加塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；例えばアンモニウム塩；例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩；ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩；たとえばＮ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩；例えばピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩；例えばテトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩；アルギニン塩；リジン塩等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００３４】
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、りん酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩；例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマール酸塩、酒石酸塩、りんご酸塩、くえん酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩；例えばメタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩；例えばアスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等を挙げることができる。
【００３５】
（ＨＣＶ阻害剤を含む医薬組成物）
本発明は、上記に示すいずれかの化合物で示されるＨＣＶ阻害剤を有効量含み、さらに、薬学的に許容し得る担体を含んでなる医薬組成物も含まれる。かかる医薬組成物は、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与による場合、本発明化合物は通常の製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合、本発明化合物は、水性又は油性懸濁注射剤、点鼻液として用いることができる。その調製に際しては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等を任意に用いることができる。
【００３６】
（本発明のＨＣＶ阻害剤のスクリーニング方法）
本発明に係るＨＣＶ阻害剤をスクリーニングは、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞、試験検体及び感染性ＨＣＶを接触させたのち、ＨＣＶを測定することにより行うことができる。
【００３７】
感染性ＨＣＶは、PNAS Vol.102, no.26 p.9294-9299 (2005)に記載の方法に従い、ＲＮＡ PolIプロモーター／ターミネーター系を利用したＪＦＨ１株（genotype 2a)のｃＤＮＡ発現プラスミド導入細胞株（Huh7.5.1/JFH1 zeo R細胞）を用いて、図１に示す感染性ＨＣＶレプリコンゲノムから作製することができる。ＨＣＶストック液は、分注した後、−８０℃で保存する。
【００３８】
より具体的には、以下のようにして行うことができる。
１）ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７．５．１細胞を、播種する工程；
２）試験検体を上記播種した細胞を含む培養液に加える工程；
３）さらに感染性ＨＣＶを播種する工程；
４）３７±１℃で加温する工程；
５）培養上清を採取し、ＨＣＶを測定する工程。
【００３９】
上記スクリーニング方法について、さらに詳しく説明する。
１）上記ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７．５．１細胞を、該細胞培養用培地に懸濁し、例えば９６穴のマイクロプレートなどのスクリーニング用容器に播種する。
２）スクリーニング候補化合物を、細胞を含むスクリーニング用容器に加える。
３）さらに上記感染性ＨＣＶを播種し、スクリーニング候補化合物と感染性ＨＣＶを含む複製細胞を培養し、得られる培養物中の感染性ＨＣＶを検出する。
４）感染性ＨＣＶを細胞中で培養するために、３〜１０日間、３７±１℃で加温することができる。
５）上記培養後、培養上清を採取し、ＨＣＶを測定することにより本発明のアッセイを行うことができる。ＨＣＶの測定は、ＨＣＶの複製の促進又は抑制を確認しうる方法であれば良く、特に限定されるものではないが、例えば市販のキットを用いてＨＣＶコアタンパクの産生量をＥＬＩＳＡ法などにより確認することができる。
【００４０】
本発明のＨＣＶ阻害剤は、上記のスクリーニング方法に加えて、候補化合物のＨＣＶの複製の促進又は抑制に及ぼす影響をより確実に確認するために、非特異作用を排除するために並行して細胞毒性試験を行い、毒性の低いものを選定して得た。ＨＣＶの増殖を抑制する物質としては、例えば、直接的若しくは間接的にＨＣＶの増殖に影響を及ぼす有機化合物、あるいはＨＣＶゲノム若しくはその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることによりＨＣＶの増殖若しくはＨＣＶタンパク質の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４２】
（実施例及び比較例）
Enamine社（ナミキ商事）が保有する化合物について、本発明のＨＣＶ阻害剤のスクリーニング方法に従い、スクリーニングを行い、以下の化合物１Ａ〜４Ｂ（式VII〜XIII）で示される化合物及び１Ｃ〜３Ｃ（式XIV〜XVIII）で示される各化合物を選定した。
【化２１】
【００４３】
【化２２】
【００４４】
（実験例１）ＨＣＶ阻害効果及び細胞毒性試験結果
上記で得られた各化合物（実施例１〜７、比較例１〜５）及びリバビリン（Ribavirin (1-β-D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-tri-azole-3-carboxamide)）についての、以下に示す方法にて抗ＨＣＶ作用、毒性、並びにセレクティブインデクス（ＳＩ）を測定した。結果を表１に示した。
【００４５】
１）抗ＨＣＶ作用
Ｈｕｈ７．５．１細胞（継代数が第４３回目までのものを使用）を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に1×104cells/100μl/ウェルとなるように懸濁したものを９６ウェルのマイクロプレートに播種し、１日培養後に培地を交換した。この細胞に、各試験化合物を検体として５μＭとなるように添加した。リバビリンについても同様の濃度で行った。１５分間静置した後に、上記１）により得た感染性ＨＣＶ（ＨＣＶコアタンパク質量として、約0.2fmol/ウェル）をＨｕｈ７．５．１細胞に播種して感染させ、３７℃、５％CO2にて５〜６日間培養した。培養後、上清中のＨＣＶコアタンパク質量をオーソＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストにより定量し、各化合物のＨＣＶ増殖阻害効果を評価した。該ＨＣＶ増殖阻害効果から、ＩＣ５０値を求めた。ＩＣ５０値は、ウイルスの増殖を５０％抑制する薬剤の濃度で表す。
表１において、（−）と示しているのは、ＩＣ５０値及び細胞毒性の結果から判断したものである。
【００４６】
２）細胞毒性試験
上記の各化合物について、テトラゾリウム塩WST-8の生成したホルマザンの吸光度を直接測定するＷＳＴ法により、Ｈｕｈ７．５．１細胞に対する細胞毒性試験を行った。該細胞毒性試験結果から、ＣＣ５０値を求めた。ＣＣ５０値は、細胞が５０％傷害を受ける薬剤の濃度で表す。
【００４７】
３）ＳＩ
ＩＣ５０値は抗ウイルス効果を発揮する薬剤濃度で、ＣＣ５０値はその薬剤が安全に使える濃度である。ＣＣ５０値をＩＣ５０値で割った値をＳＩといい、その値が大きいほど、細胞を傷つけずにウイルスの増殖のみを抑える効果が高いとみなせる。
【００４８】
４）結果
【表１】
【００４９】
上記の試験結果を表１に示した。本発明のＨＣＶ阻害剤のうち、上記各実施例に記載の各化合物は、ＩＣ５０はリバビリンに比べて低値であった。また、ＣＣ５０（毒性）を測定したものについては、その値は同等又はやや低い値を示した。ＳＩ値は、リバビリンでは２．０であったのに対し、実施例１、３、４及び６に記載の化合物については、いずれも３０以上の値を示し、ＨＣＶ阻害剤として優れていることが確認された。特に実施例１に記載の化合物は、ＨＣＶ増殖に対する高い阻害活性（ＩＣ５０＝〜７０ｎＭ、ＣＣ５０＝〜３５μＭ；ＳＩ＝〜５００）を示し、抗ＨＣＶ阻害剤として特に優れていることが考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
以上詳述したように、本発明の化合物は、優れた抗ＨＣＶ作用を示すことが確認された。本発明のＨＣＶ阻害剤を構成する化合物は、薬学上許容しうる担体とともに医薬用組成物としての利用が可能である他、より優れた効果の抗ＨＣＶ阻害剤を選別するためのリード化合物としても利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明におけるスクリーニング方法に使用される感染性ＨＣＶのレプリコンゲノムの構造及びプラスミドを示す図である。
【図２】本発明におけるスクリーニング方法に使用されるアッセイ方法を示す図である。
【符号の説明】
【００５２】
ａ（図２） スクリーニングしようとする試験検体。例えば低分子化合物ライブラリー及び他の試験検体(0.5μM)
ｂ（図２） Huh7.5.1/pHH-JFH1 zeo R細胞の培養上清
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の１）〜４）で示されるいずれかの化合物からなる、宿主細胞においてＣ型肝炎ウイルスの産生を抑制しうるＣ型肝炎ウイルス阻害剤：
１）以下に示す一般式（I）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（I）：
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
２）以下に示す一般式（II）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（II）：
【化２】
（式中、Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
３）以下に示す一般式（III）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（III）：
【化３】
（式中、Ｒ４は、式（IV）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
式（IV）：
【化４】
４）以下に示す一般式（V）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（V）：
【化５】
（式中、Ｒ７は、式（VI）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ８及びＲ９は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
式（VI）：
【化６】
（式中、Ｒ１０は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【請求項２】
一般式（I）で示される化合物が、以下の式（VII）又は式（VIII）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス阻害剤。
式（VII）：
【化７】
式（VIII）：
【化８】
【請求項３】
一般式（II）で示される化合物が、以下の式（IX）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス阻害剤。
式（IX）：
【化９】
【請求項４】
一般式（III）で示される化合物が、以下の式（X）又は式（XI）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス阻害剤。
式（X）：
【化１０】
式（XI）：
【化１１】
【請求項５】
一般式（V）で示される化合物が、以下の式（XII）又は式（XIII）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス阻害剤。
式（XII）：
【化１２】
式（XIII）：
【化１３】
【請求項６】
請求項１〜５に示されるいずれかの化合物からなるＣ型肝炎ウイルス阻害剤を有効量含み、さらに、薬学的に許容し得る担体を含んでなる医薬組成物。
【請求項１】
以下の１）〜４）で示されるいずれかの化合物からなる、宿主細胞においてＣ型肝炎ウイルスの産生を抑制しうるＣ型肝炎ウイルス阻害剤：
１）以下に示す一般式（I）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（I）：
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
２）以下に示す一般式（II）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（II）：
【化２】
（式中、Ｒ３は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
３）以下に示す一般式（III）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（III）：
【化３】
（式中、Ｒ４は、式（IV）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ５及びＲ６は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
式（IV）：
【化４】
４）以下に示す一般式（V）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである；
式（V）：
【化５】
（式中、Ｒ７は、式（VI）の（ａ）又は（ｂ）から選択される。式中、Ｒ８及びＲ９は、同一又は異なって、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
式（VI）：
【化６】
（式中、Ｒ１０は、水素原子、ハロゲン原子、直鎖状若しくは分岐状の飽和若しくは不飽和脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アルキルオキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基、アリールオキシ基及びアラルキルオキシ基から選択される任意の基を表す。）
【請求項２】
一般式（I）で示される化合物が、以下の式（VII）又は式（VIII）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス阻害剤。
式（VII）：
【化７】
式（VIII）：
【化８】
【請求項３】
一般式（II）で示される化合物が、以下の式（IX）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス阻害剤。
式（IX）：
【化９】
【請求項４】
一般式（III）で示される化合物が、以下の式（X）又は式（XI）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス阻害剤。
式（X）：
【化１０】
式（XI）：
【化１１】
【請求項５】
一般式（V）で示される化合物が、以下の式（XII）又は式（XIII）で示される化合物、その薬学上許容される塩及び溶媒和物から選択されるいずれかである、請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルス阻害剤。
式（XII）：
【化１２】
式（XIII）：
【化１３】
【請求項６】
請求項１〜５に示されるいずれかの化合物からなるＣ型肝炎ウイルス阻害剤を有効量含み、さらに、薬学的に許容し得る担体を含んでなる医薬組成物。
【図２】
【図１】
【図１】
【公開番号】特開２００８−１８４４０３（Ｐ２００８−１８４４０３Ａ）
【公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１８１４５（Ｐ２００７−１８１４５）
【出願日】平成１９年１月２９日（２００７．１．２９）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２９日（２００７．１．２９）
【出願人】（８０３００００５６）財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 (341)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]