生理活性ポリペプチドとその抗体及びそれらの用途
哺乳類の皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現及び／又は造血細胞の増殖を効果的に調節する手段を提供することを課題とし、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列において、哺乳類の皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現増強作用若しくは造血細胞の増殖促進作用などの生物作用を実質的に失わない範囲でアミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドとその抗体及びそれらの用途を提供することによって上記課題を解決する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は生理活性ポリペプチドとその抗体及びそれらの用途に関するものである。
【背景技術】
ヒトに代表される多細胞生物は、体組織が傷を負ったり、火傷などの皮膚細胞の炎症が起こった際にその創傷を自ら治癒し、体組織を修復する能力を有している。このような能力を何らかの手段で増強することができれば、傷の早期修復、治療が可能となり、その手段は医療をはじめとする幅広い分野において有用なものとなり得る。
細胞の発生分化、組織形成や形態変化あるいは創傷治癒や組織修復にはマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ＭＭＰ））が極めて重要な役割を果たしていることが知られている（例えば、岡本竜哉、『マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性化機構』、生化学、１９９９年、第７１巻、第１２号、１３８７乃至１４０１頁などを参照）。ＭＭＰは中性ｐＨ環境下で細胞外マトリックス構成蛋白質を加水分解する亜鉛要求性蛋白質分解酵素の総称であって、結合組織細胞（線維芽細胞）、上皮細胞、炎症細胞及び転移癌細胞などにより産生され、現在までに２６種以上の酵素が報告されている。ＭＭＰの１種であるゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）は、ゼラチンや上皮細胞層と結合組織の間に存在する基底膜の主要成分であるＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン及びエラスチンを分解する作用を有している。ゼラチナーゼＡは線維芽細胞や単球系細胞において微量ながら継続的に発現されており、表皮細胞の伸張や癌組織での血管新生を抑制する生理作用を有している。ゼラチナーゼＡをはじめとするゼラチナーゼの発現を効果的に増強できる因子は創傷治癒や組織再構築においてその有用性が期待できるものの、このような因子は従来知られていなかった。
一方、近年、白血病や再生不良性貧血などの血液疾患を治療する目的で、健常者の骨髄細胞を患者へ移植し、新しい、新鮮な血液を作り出す骨髄移植が頻繁に行われるようになった。周知のとおり、骨髄移植は、患者と骨髄提供者における組織適合抗原の型が一致しなければならないことから、欧米においては、骨髄を提供する意志がある健常者の氏名と、その組織適合抗原の型をあらかじめ登録しておく「骨髄バンク」の組織作りが早くから始まり、我が国においても、１９９０年、「骨髄バンク連絡協議会」が発足し、全国的なネットワーク作りが始まった。しかしながら、骨髄移植は、骨髄提供者に対して、心身両面で少なからぬ負担を強いることから、骨髄提供の意志を事前に表明していた健常者であっても、実際に骨髄提供を要請されると、提供を躊躇したり、断ったりするケースが多々あり、その結果として、医療の現場においては、必要なときに必要な骨髄を入手できない状況にあると言われている。
骨髄移植におけるこの問題を解決するために、健常な骨髄細胞を一旦生体から取り出し、これを生体外で増殖させた後、患者へ移植する方法が鋭意検討されている。この方法が実用化すれば、骨髄の確保が容易になるというだけではなく、骨髄提供者から取り出す骨髄の量を大幅に少なくすることができることから、骨髄提供者における心身の負担を軽減したり、骨髄提供そのものの安全性を著しく改善できるものと期待される。
現在、斯界においては、幹細胞因子、Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３リガンド、インターロイキン６、トロンボポエチン、インターロイキン３などのサイトカイン類を用いる造血細胞の増殖が鋭意試みられているけれども、これらのサイトカインはいずれも造血細胞の増殖のみならず、造血幹細胞の分化を誘導する性質をも具備することから、未だこの方法によって所望量の造血細胞を獲得できるにはいたらない状況にある（例えば、『造血幹細胞をめぐる研究の新展開‘９９−２０００幹細胞発生・分化の新事実と治療への応用』、実験医学（増刊）、１９９９年、羊土社、第１７巻、第５号、１４９乃至１５０頁などを参照）。
【発明の開示】
斯かる状況に鑑み、本発明の目的は、哺乳類の皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現を効果的に増強又は調節する手段を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、哺乳類の造血細胞の増殖を効果的に促進又は調節する手段を提供することにある。
本発明者が哺乳類皮膚細胞又は胎盤細胞に由来するＤＮＡに着目し、そのＤＮＡがコードする生理活性ポリペプチドについて鋭意研究したところ、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドは、生体外で哺乳類の皮膚細胞へ作用させると、ゼラチナーゼの発現を顕著に増強することを見出し、さらに、生体の皮膚の創傷部に塗布すると、細胞におけるゼラチナーゼの発現を増強し、また、創傷の治癒を促進することを見出した。一方、当該ポリペプチドを生体外で哺乳類由来の造血細胞へ作用させると、その増殖を著明に促進することを見出した。さらに、本発明者は、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡの解明、ポリペプチドの製造方法、さらには、斯かるポリペプチドに対する抗体を確立し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列において、前記した所期の生物作用を実質的に失わない範囲でアミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供することによって上記課題を解決するものである。
さらに、本発明は、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することによって前記課題を解決するものである。
さらに、本発明は、斯かるポリペプチドを産生し得る細胞又は微生物を培養する工程と、産生したポリペプチドを培養物から採取する工程とを含んでなるポリペプチドの製造方法を提供することによって前記課題を解決するものである。
さらに、本発明は、斯かるポリペプチドに対する抗体を提供することによって前記課題を解決するものである。
さらに、本発明は、配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列における連続する１０個以上のアミノ酸残基からなるペプチド断片を提供することによって前記課題を解決するものである。
本発明は、哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現を増強するか、及び／又は、造血細胞の増殖を促進するポリペプチドの発見に基づくものである。本発明のポリペプチドは、皮膚細胞において顕著なゼラチナーゼ発現増強能を発揮するので、皮膚における創傷の早期修復・治療及び再生医療において有用である。また、本発明のポリペプチドは、ヒトをはじめとする哺乳類の造血細胞の増殖を効果的に促進するので、研究用途をはじめ、医薬品の分野で化学療法・放射線療法による癌治療時、骨随移植時、生体外での造血細胞の増幅時の造血細胞増殖促進剤などとして有用である。さらに、本発明の抗体は上記ポリペプチドの精製、検出はもとより、本発明のポリペプチドが有する生物作用の調節、抑制に有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は発現ベクターｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ａＦＬの構造を示す図である。
第２図は発現ベクターｐＶＬ１３９３−ｈＡｇＫ１１４ａＦＬの構造を示す図である。
第３図は発現ベクターｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ｂＦＬの構造を示す図である。
第４図は発現ベクターｐＲＥＲ−ｈａｍＡｇＫ１１４ｄ２ＦＬの構造を示す図である。
第５図は発現ベクターｐＲＥＲ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬの構造を示す図である。
第６図は発現ベクターｐＲＥＲ−ｍＡｇＫ１１４ｂの構造を示す図である。
【符号の説明】
ｈＡｇＫ１１４−１ａ ｃＤＮＡ：配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ｈＡｇＫ１１４−１ｂ ｃＤＮＡ：配列表における配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ＦＬＡＧ：ＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ
ＳＶ４０ ｉｎｔｒｏｎ／ｐＡ：シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）スプライス、ポリＡ付加シグナル
Ｐｏｌｙｏｍａ ｏｒｉ：ポリオーマウィルスＤＮＡ複製起点とエンハンサー
ＳＶ４０ ｏｒｉ：ＳＶ４０ＤＮＡ複製起点（エンハンサーを含まない）
ＣｏｌＥ１：コリシンＥ１
Ｍ１３ ｏｒｉ：Ｍ１３ファージＤＮＡ複製起点
ＳｕｐＦ：アンバーサプレッサー遺伝子
ＰＣＭＶ：サイトメガロウィルスプロモーター
ｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ ＤＮＡ：配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ｍＡｇＫ１１４−１ ＤＮＡ：配列表における配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ｍＡｇＫ１１４−１ｂ ＤＮＡ：配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ｐｏｌｙＡ：ポリＡ付加シグナル
Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子
Ｎｅｏ：ネオマイシン耐性遺伝子
ＥＦ−１α ｐｒｏｍｏｔｅｒ：延長因子１αプロモーター
ｄｈｆｒ：デヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
Ｐｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ：ポリヘドリンプロモーター
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列において、生物作用を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに関するものである。本発明でいうポリペプチドは、それが上記した部分アミノ酸配列を有し、且つ、生体において皮膚細胞のゼラチナーゼ発現増強作用若しくは造血細胞の増殖促進作用を発揮するものであるかぎり、その純度、由来、調製方法は問わない。なお、本発明において皮膚細胞とは上皮細胞、線維芽細胞、間葉系細胞などの皮膚細胞を意味し、造血細胞とは造血幹細胞や造血系前駆細胞を含む細胞を意味する。より具体的なポリペプチドとしては、例えば、配列表における配列番号４乃至１０のいずれかに示すアミノ酸配列を有するものが挙げられ、斯かるアミノ酸配列を有するポリペプチドはいずれも生体において皮膚細胞のゼラチナーゼ発現増強作用若しくは造血細胞の増殖促進作用が顕著であり、この発明において極めて有用である。なお、配列表における配列番号１、２及び３に示されるアミノ酸配列はそれぞれ配列表における配列番号４及び５、配列番号６及び７、及び、配列番号８乃至１０で示されるアミノ酸配列に共通する部分アミノ酸配列であり、配列表における配列番号４及び５、配列番号６及び７、配列番号８乃至１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドがそれぞれ所期の生物作用を有することから、これらに共通する部分アミノ酸配列である配列表における配列番号１乃至３は所期の生物活性の発現に深く関与しているものと考えられる。配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するこれらのポリペプチドは単なる例であって、本発明でいうポリペプチドは決してこれらに限定されてはならず、例えば、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて、ゼラチナーゼ発現増強作用若しくは造血細胞増殖促進作用を実質的に失わない範囲でその構成するアミノ酸の１個又は２個以上が欠失するか、他のアミノ酸で置換されるか、さらには、アミノ酸の１個又は２個以上が付加された変異体であってもよい。このような変異体としては、生物作用を実質的に失わない範囲で、例えば、アラニンなどを１個乃至１０個欠失させるか、あるいは斯かるアラニンなどの一部又は全部を、例えばグリシンなどの他のアミノ酸で置換してなるアミノ酸配列、さらには、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列におけるＮ末端、Ｃ末端又は内部に、１乃至６０個のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列を有するものが挙げられ、部位特異的変異やランダム変異などのプロテインエンジニアリングの手法を用いて得ることができる。なお、哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現を増強する作用の有無は、例えば、ヒト新生児由来の線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ハムスター由来線維芽細胞、若しくはマウス由来間葉系細胞を対象ポリペプチドの存在下又は非存在下で培養した後、それぞれの培養物上清中におけるゼラチナーゼの発現量を酵素活性測定や免疫学的測定方法などによって判定することができる。また、哺乳類の造血細胞の増殖を促進する作用の有無は、例えば、骨髄由来の造血細胞を対象ポリペプチドの存在下又は非存在下で培養した後、それぞれの培養物における造血細胞の個数を比較するなどの方法によって判定することができる。
本発明のポリペプチドは、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列において、生物作用を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有しており、哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現を増強するか若しくは造血細胞の増殖を促進する限り、いかなるポリペプチドであろうと包含され、例えば、組換えＤＮＡ技術により創製されたポリペプチド、天然の給源由来のポリペプチド、又は化学的に合成されたポリペプチドなどのいずれであってもよく、さらには、当該ポリペプチドを、例えば、平均分子量５，０００乃至１０，０００のデキストラン、プルラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性の天然高分子若しくは合成高分子を結合させるなどして人為的に化学修飾したものであってもよい。
本発明のポリペプチドの内、配列表における配列番号１で示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドは本来、ヒト由来のポリペプチドであり、また、配列表における配列番号２及び３に示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドはそれぞれハムスター由来及びマウス由来のポリペプチドである。これらの部分アミノ酸配列を有するポリペプチドは、それぞれをコードするＤＮＡを用い、組換えＤＮＡ技術により斯かるポリペプチドの産生能を有する形質転換細胞や形質転換微生物を作製し、培養して細胞又は菌体内外に当該ポリペプチドを産生させ、製造することができる。本発明におけるＤＮＡとは、前記本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡを意味する。本発明のＤＮＡの一例としては、配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む配列表における配列番号１１乃至１７のいずれかで表される塩基配列か、コードするアミノ酸配列を変えない範囲で配列表における配列番号１１乃至１７のいずれかで表される塩基配列の１個又は２個以上の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、あるいはそれらに相補的な塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。上記の本発明のポリペプチドの変異体をコードするＤＮＡも勿論含まれる。
本発明のＤＮＡは、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。本発明のＤＮＡの、天然の給源としては、例えば、ヒトの胎盤細胞、ハムスターの皮膚細胞、及びマウスの皮膚細胞が挙げられ、それらの細胞からは本発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、例えば、ヒトの胎盤細胞を破砕後、蔗糖密度勾配超遠心分離などにより分画して全ＲＮＡを調製し、この全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース、オリゴ（ｄＴ）ラテックスなどで処理してｍＲＮＡを単離する。このｍＲＮＡを鋳型に逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを作用させて二重鎖ｃＤＮＡとし、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。これを自律複製可能な適宜のクローニングベクターに挿入し、得られた組換えクローニングベクターを大腸菌などの適宜の宿主に導入して形質転換体とする。この形質転換体を栄養培地で培養し、培養物にコロニーハイブリダイゼーション法を適用して本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を採取する。斯くして得られた形質転換体を通常一般の方法により処理すれば、本発明のＤＮＡを得ることができる。現在では各種細胞由来のｃＤＮＡライブラリーが市販されており、このような市販のライブラリーを利用することもできる。一方、本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号１１乃至１７のいずれかで示される塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えベクターとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含むベクターを採取すればよい。
斯かるＤＮＡは、通常、斯かるＤＮＡを含んでなる発現ベクターの形態で宿主に導入される。発現ベクターは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、例えば、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢｌ１２１、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターが挙げられ、このうち、本発明のＤＮＡを大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物で発現させるにはｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−１３８、ｐＢＴｒｐ２、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３が、また、動植物由来の細胞で発現させるにはＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢｌ１２１、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶが好適である。
斯かるベクターに本発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、本発明のＤＮＡを含む遺伝子とベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｅｃｏ ＲＶ、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られた本発明に用いる発現ベクターは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
上記のような本発明のＤＮＡを導入する宿主細胞としては、形質転換体の作製に斯界で慣用される、大腸菌、枯草菌、酵母、黴などの適宜の微生物や、さらには、昆虫などの無脊椎動物、植物、脊椎動物などの細胞のいずれも用いることができる。形質転換体を得るためには、宿主が大腸菌や枯草菌の場合には、宿主を発現ベクターとカルシウムイオンの存在下で培養するか、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。一方、宿主が動物細胞の場合には、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ウィルス感染法、更には必要に応じてＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などを適宜適用すればよい。斯くして生成される形質転換体から目的とするクローンを選択するには、導入されたＤＮＡの有無や本発明のポリペプチドの産生能を指標として試験すればよい。なお、以上述べたベクター及び形質転換体に関しては、ジェイ・サムブルック等、『モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル』、第３版（２００１年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行）などに慣用の材料及び方法が種々詳述されている。
形質転換体の培養に用いる培地には、宿主細胞やベクターの種類にもよるけれども、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の培地を使用することができる。個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖、トレハロースなどの糖源が、又、窒素源としては、例えば、アンモニア乃至アンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。宿主細胞やベクターの種類にもよるけれども、通常、２０乃至６０℃、ｐＨ２乃至１０に保ちつつ、約１乃至６日間培養すれば、本発明のポリペプチドを含む培養物が得られる。
本発明のポリペプチドを天然の給源を用いて製造するには、例えば、本発明のポリペプチドを産生し得る細胞を培養し、培養物から目的とするポリペプチドを採取すればよい。個々の細胞としては、ヒト由来の細胞である、例えば、子宮頚部癌由来の株化細胞であるＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）細胞、前立腺癌由来の株化細胞であるＰＣ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）細胞、胆管由来の株化細胞であるＨｕＣＣＴ１（ＪＣＲＢ ０４２５）細胞、肺癌由来の株化細胞であるＣａｌｕ−３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−５５）細胞、口腔内類表皮癌由来の株化細胞であるＫＢ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７）細胞などが、ハムスター由来の細胞である、例えば、卵巣由来上皮細胞であるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）細胞、腎臓由来線維芽細胞であるＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）細胞などが、及び、マウスの細胞である、例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）細胞などが挙げられる。
上記の細胞は、動物細胞の培養に斯界で一般に用いられる固相培養法、液体培養法により増幅することができる。また、本出願人と同じ出願人による特開昭５４−９８３０７号公報に開示されているインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）細胞増殖法によりヒト以外の温血動物の体内で増幅することができる。
前記インビボ細胞増殖法を用いて本発明のポリペプチド産生能を有する哺乳類由来の細胞を増幅する場合、使用する温血動物は、哺乳類由来の細胞が増殖しうるものであればよく、例えば、ニワトリ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスター、普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳類などが使用できる。増殖させた哺乳類由来の細胞は、例えば、腹腔内の腹水に浮遊して増殖した細胞を採取し、又は、皮下で増殖した腫瘤を摘出し、分散させた後、採取し、必要に応じて増強剤などの存在下で培養して本発明のポリペプチドを産生させればよい。
また、本発明のポリペプチドは、配列表における配列番号１乃至３若しくは配列番号４乃至１０のいずれかに示されるアミノ酸配列に従い化学的に合成することにより調製することもできる。ペプチド合成法としては斯界で一般に用いられるペプチド自動合成装置を用いて全合成する方法か、又は、予めペプチド断片をいくつかのブロックに分けて合成しておき、酵素的に縮合させて目的とするポリペプチドを得る方法のいずれもが、必要に応じて、有利に実施できる。
組換えＤＮＡ技術による調製、天然の給源からの調製、又はペプチド合成法による調製のいずれかによって得られる本発明のポリペプチドの粗調製品は哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現増強剤若しくは造血細胞増殖促進剤としてそのまま使用可能ではあるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、精製して用いる。本発明のポリペプチドの精製には、細胞又は菌体破砕物を除去した培養物に、例えば、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性ポリペプチドを精製するための斯界における通常一般の方法が採用でき、必要に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状若しくは固状にすればよい。
また、本発明のポリペプチドを用いて、本発明のポリペプチドに対する抗体を調製することができる。本発明の抗体は上記本発明のポリペプチドに対するイムノグロブリン全般を包含し、特定の起源・クラス・形態（ポリクローナル及びモノクローナル）に限定されるものではない。本発明の抗体は該ポリペプチド配列の一部又は全部を含むポリペプチドで免疫感作した温血動物あるいはその培養細胞から得ることができる。本発明でいう、温血動物あるいはその培養細胞から得ることができる、とは、本発明の抗体が、所望のポリペプチドで免疫感作した温血動物から得られた抗体そのものと、調製方法に関わらず、該温血動物から得られた抗体と免疫反応性（後述）において同等の性質を有するイムノグロブリンを包含することを意味する。さらに、本発明の抗体は蛋白質工学によって得られた、例えば、ヒト化抗体、キメラ抗体、さらにはイムノグロブリン遺伝子をヒト由来のものに置き換えたジェノマウスなどを用いたヒト抗体などの抗体も包含する。ここでいう免疫反応とは、抗体と該抗体によって認識され得る物質との間の結合反応、すなわち、通常、抗原抗体反応とも呼ばれる反応を意味し、免疫反応性とは、斯かる免疫反応の強度を意味する。
免疫感作は慣用の方法によればよく、例えば、本発明のポリペプチド又はその断片を抗原として単独か、あるいは適宜アジュバントとともに温血動物の静脈、皮内、皮下又は腹腔内に注射接種し、その後一定期間飼育する。免疫感作の対象とする温血動物に特に制限はなく、所期の抗体を産生し得るかぎり、温血動物の種類、雌雄などにかかわりなく本発明の抗体の調製に利用できる。通常、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモットなどの齧歯類、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄類を含む哺乳物や、ニワトリ、ウズラなどのキジ類を含む鳥類などが用いられ、用いる抗原の起源や調製する抗体の形態・用途などを勘案して最適のものを選択すれば良い。齧歯類を免疫感作する場合、通常、抗原の総接種量を約５乃至５００μｇ／匹とし、これを約１乃至４週間の間隔をおいて２乃至２０回に分けて接種する（一般に、初回の接種は「初回免疫」、２回目以降の接種は「追加免疫」、最後の接種は「最終免疫」と呼ばれる。）。そして、通常、免疫感作の期間中及び／又は終了後に、免疫感作に用いたのと同じ抗原を使用して酵素抗体法など慣用の方法により免疫感作動物における抗体価の上昇を確認する。
本発明の抗体の一形態であるポリクローナル抗体（抗血清）を得るには、上記のような免疫感作の後、通常、１乃至４週間程度経過した免疫感作動物から、その動物の種に応じて選択される適宜の部位より血清（抗血清）を採取すればよい。斯くして得られる抗血清を、さらに必要に応じて、イムノグロブリンを精製するための慣用の方法に供すれば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなどの所望のクラスにまで分離された抗体を得ることもできる。
本発明の抗体は、斯かる抗体を産生し得る単離された細胞からも得ることができる。ここでいう単離された細胞とは、生体から単離された形態にある細胞を意味し、具体的には、この発明の抗体を産生し得る、ハイブリドーマ、生体から単離された脾細胞やリンパ球、形質転換体細胞などが挙げられる。これらの単離された細胞はいずれも本発明の抗体の製造に用いることができ、ハイブリドーマとしての斯かる細胞は、本発明の抗体の一形態であるモノクローナル抗体の製造にとりわけ有用である。斯かるハイブリドーマを得るには、先ず、上記のような免疫感作の後、通常、３乃至５日程度経過後、免疫感作動物から脾臓を摘出し、分散して、脾細胞を抗体産生細胞として得る。脾細胞は、必要に応じて生体外でさらに免疫感作することもできる。斯くして得られる脾細胞を、次に温血動物起源の無限増殖可能な細胞と融合させる。無限増殖可能な細胞としては、例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）、Ｙ３−Ａｇ１．２．３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）及びＰ３×６３Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−９）などのマウス又はラット骨髄腫由来の細胞株ないしはその変異株が挙げられ、上記脾細胞との適合性などを勘案して、より適したものが選択される。細胞の融合には、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスを始めとする融合促進剤や電気パルスによる慣用の方法が適宜採用される。次に、細胞融合産物を、常法にしたがってＨＡＴ培地などの選択培地中で培養し、融合した細胞すなわちハイブリドーマを選択的に増殖させる。増殖したハイブリドーマを慣用の方法にしたがって、その培養上清を用いて、本発明のポリペプチドに対する免疫反応性の有無を試験し、所期の免疫反応性を示したものを選択すれば、本発明によるハイブリドーマが得られる。選択されたハイブリドーマに限界希釈法など慣用の方法を適用すれば、目的とするハイブリドーマのクローンが得られる。斯くしてクローンとして得られるハイブリドーマを生体内又は生体外で培養し、必要に応じて、その体液又は培養物に、目的とするイムノグロブリンを採取・精製するための慣用の方法を適用すれば、所望のレベルにまで精製された本発明によるモノクローナル抗体が得られる。
前述の通り、本発明のモノクローナル抗体は、通常、蛋白質工学の手法によって調製される、いわゆる「ヒト化抗体」をも包含する。ヒト化抗体を調製するには、例えば上述のようにして得た哺乳動物由来のハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡとし、ＰＣＲ反応により増幅した後、クローニングして、本発明のモノクローナル抗体における重鎖及び軽鎖の塩基配列、とりわけ、重鎖及び軽鎖における可変領域の塩基配列をそれぞれ決定する。次いで、それらの可変領域とヒト抗体の定常領域を融合させたポリペプチドをコードするキメラ遺伝子を作製する。このキメラ遺伝子は適宜宿主中で発現させると、元のモノクローナル抗体と同様の結合特異性を示しつつ、ヒトに対する抗原性が顕著に低下したモノクローナル抗体を産生する。なお、哺乳動物由来の抗体をヒト化する方法自体は公知であり、例えば、エス・ポール監修『メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー』、第５１巻、１９９５年、ヒューマナ・プレス発行には関連する種々の技法が記載されている。
上記で説明した、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体としての形態を含む本発明の抗体は、抗体一般を精製するための斯界における慣用の精製方法により、所望のレベルにまで精製された標品として得ることができる。個々の精製方法としては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動が挙げられ、これらは必要に応じて適宜組合せて用いられる。精製した抗体は、その後用途に応じて濃縮・乾燥し、液状又は固状とする。
本発明でいうペプチド断片とは、本発明のポリペプチドの一部であり、例えば、配列表における配列番号４乃至１０又のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはその変異体において、抗原決定基として抗体に認識される上で充分と言われている、通常、１０残基以上、好ましくは２０残基以上の連続した部分アミノ酸配列を有するペプチド断片を意味する。本発明のペプチド断片は、天然又は組換えＤＮＡ技術によって人為的に発現させたポリペプチドを、酸又は各種プロテアーゼなどのポリペプチド分解酵素などで部分分解したものであっても、ペプチド合成によって人為的に合成したものであっても、さらには組換えＤＮＡ技術によって人為的に発現させて調製したものであっても良い。このようにして得られるペプチド断片は、実質的にヒトを含む哺乳類の皮膚細胞においてゼラチナーゼの発現を増強するか、又は造血細胞の増殖を促進する限り本発明のポリペプチドと同様に用いることができる。また、ペプチド断片が所期の生物作用を有していない場合においても本発明のポリペプチドに対する抗体を作製するための抗原として利用することができる。
本発明のポリペプチドは哺乳類の皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現増強作用を有していることから、医薬品の分野においては、皮膚における創傷の治療時、炎症の治療時の治癒促進剤として、また、再生医療における組織再構築の際に有用である。さらには、美容整形においてもケロイド状となる傷跡の軽減に用いることができる。本発明のポリペプチドの効果が期待できる、より具体的な症例としては、切り傷、擦り傷などの創傷、火傷などによる皮膚の損傷、ケロイド、褥瘡、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、自家感作性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、口囲皮膚炎、剥脱性皮膚炎（紅皮症）、老人性乾皮症、限局性強皮症、貨幣状湿疹、蕁麻疹、肥厚性瘢痕、ふけ症、にきび、そばかす、あせもなどが挙げられる。化粧品の分野においては、例えば、頭髪化粧品、基礎化粧品などに使用することもできる。
また、本発明のポリペプチドは哺乳類の造血細胞の増殖を促進する作用を有することから、医薬品の分野においては、化学療法・放射線療法による悪性腫瘍治療時、再生不良性貧血などの血液疾患や重症複合性免疫不全症などの免疫疾患治療のための骨髄移植時、さらには骨髄移植のための造血細胞の増幅時などにおいて造血細胞の増殖促進剤として有用である。本発明のポリペプチドの効果が期待できる、より具体的な症例としては、腎性貧血、悪性貧血、再生不良性貧血、骨髄異形性症候群、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病などが挙げられる。また、造血細胞を扱う研究分野において、造血細胞を増幅するための研究用試薬としても用いることもできる。なお、本発明におけるポリペプチドは本来哺乳類に由来するものであることから、毒性も極めて低く安全な物質である。
本発明の抗体は本発明のポリペプチドに特異的に結合することから、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明のポリペプチドを皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現増強剤として用いた際には、ゼラチナーゼの過剰発現を抑制する目的で用いることもできる。さらには、ゼラチナーゼの過剰発現に伴う疾病、病気を診断若しくは治療する目的で用いることもできる。一方、本発明のポリペプチドを造血細胞の増殖促進剤として用いた際には、造血細胞の過剰増殖を抑制する目的で用いることができ、さらには、造血細胞の過剰増殖に伴う疾病、病気を診断若しくは治療する目的で用いることもできる。
本発明のポリペプチドはそのまま単独で使用できるものの、他の成分を配合した組成物の形態でも用いることができる。本発明のポリペプチドを配合してなる組成物は、化粧品、医薬品及び試薬の形態としても有利に利用できる。本発明の組成物には、必要に応じて本発明のポリペプチド以外のもの、すなわち、ヒトを含む哺乳類のための化粧品及び医薬品への適用が許容される成分として、個々の利用分野で通常使用される、例えば、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、アミノ酸、線維質、糖質、脂質、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、香辛料、安定化剤、防腐剤、乳化剤、界面活性剤、賦形剤、増量剤、増粘剤、保存剤などの成分を１種または２種以上含有させることも有利に実施できる。これらの成分は、通常、本発明の組成物の、各々の利用分野における必要性に応じて適宜選択される。以上のような成分を含む本発明の組成物の形態には特に制限はなく、粉末、顆粒、錠剤、ペースト、ゼリー、乳液、溶液などの所望の形態で提供される。
前記糖質としては、ブドウ糖、果糖、ラクトース、トレハロース、マルトース、蔗糖、ラクトスクロース、水飴などの糖類、サイクロデキストリン、環状四糖などの環状の糖類、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、還元水飴などの糖アルコール類、プルラン、カラギーナン、などの天然多糖類、天然ガム類、カルボキシメチルセルロースなどの１種または２種以上を添加することにより、固状のものにあってはその賦形性に有利に利用できるだけでなく、本発明のポリペプチドの安定化、呈味改善などに有利に利用できる。
本発明のポリペプチドを配合してなる組成物を製造するには、対象とする動物類やその投与方法などに応じて選ばれる適宜の組成にしたがって、本発明のポリペプチドと、以上に示したような、化粧品、医薬品の分野のいずれかにおいて使用が認められている１種又は２種以上の成分とを、個々の配合量に基づいて、目的に応じて混合し、希釈、濃縮、乾燥、濾過、遠心分離などの工程を適宜実施し、ポリペプチドを配合してなる組成物を調製し、必要に応じて所望の形状に成形すればよい。各成分を配合する順序や、上記の各工程を実施する時期は、ポリペプチドの所期の生物作用の低下をきたさないのであれば特に制限はなく、必要に応じて上記のいずれかの工程を適宜単独乃至は組合わせて実施すればよい。
前述のとおり、本発明のポリペプチドは、哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現を増強するか、及び／又は哺乳類の造血細胞の増殖を促進する作用を有することから、本発明のポリペプチドを配合してなる組成物は、例えば、医薬品、化粧品などの分野において斯かる作用を有する物質を必要とする用途において有利に利用できる。
本発明の組成物は、有効成分であるポリペプチドの含量が高いほど著明なゼラチナーゼ発現増強作用を示す。ポリペプチドは高度に精製したものであっても、また、部分精製したものであっても良いものの、顕著なゼラチナーゼ発現増強作用を有する組成物を得るためには、後記実施例で示すように、ゼラチナーゼ発現増強試験において、濃度１０μｇ／ｍｌのポリペプチドを用いた場合、ポリペプチドを添加しない場合に比べてゼラチナーゼの相対発現量を１．２倍以上増加させるレベルにまでポリペプチドの含量を高めるのが望ましい。
本発明の組成物は経皮的に使用すれば、著明なゼラチナーゼ発現増強作用を発揮する。本発明の組成物の有効な投与量は、対象とするヒトをはじめとする哺乳動物の種類、年齢、性別などによって異なるものの、本発明の組成物における有効成分であるポリペプチドとしての重量換算で、成人あたり、通常、１乃至１０００μｇ／回、望ましくは、１０乃至５００μｇ／回、１日１回または数回に分けて、症状、投与形態に応じて、連日または１日以上の間隔をおいて投与すればよい。投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じて経皮、経粘膜、場合によっては経口、経管などによる方法を適宜選択して使用すればよい。
また、本発明のポリペプチドを配合してなる組成物を、化粧品などの皮膚外用剤として皮膚に直接塗布する場合には、本発明の組成物における有効成分であるポリペプチドは重量換算で、皮膚外用剤全量中、０．０００１乃至１０質量％、好ましくは、０．００１乃至１質量％であり、１日１回または数回に分けて、効果に応じて、連日または１日以上の間隔をおいて直接皮膚に塗布すればよい。なお、０．０００１質量％未満では、その効果は発揮され難くなり、１０質量％を越える製品にあっては、それ以上の効果が望めず好ましくない。
本発明の組成物をゼラチナーゼ発現増強剤として用いる化粧品の形態としては、例えば、ローション、クリーム、乳液、ゲル、粉末、ペースト、ブロックなどの形態で、石けん、化粧石けん、肌洗い粉、洗顔クリーム、洗顔フォーム、フェイシャルリンス、ボディーシャンプー、ボディーリンス、シャンプー、リンス、髪洗い粉などの清浄用化粧品、セットローション、ヘアブロー、チック、ヘアクリーム、ポマード、ヘアスプレー、ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアローション、養毛料、染毛料、頭皮用トリートメント、びん付油、つや出し油、髪油、スキ油などの頭髪化粧品、化粧水、バニシングクリーム、エモリエントクリーム、エモリエントローション、パック用化粧料（ゼリー状ピールオフタイプ、ゼリー状ふきとり型、ペースト状洗い流し型、粉末状など）、クレンジングクリーム、コールドクリーム、ハンドクリーム、ハンドローション、乳液、保湿液、アフターシェービングローション、シェービングローション、プレシェーブローション、アフターシェービングクリーム、アフターシェービングフォーム、プレシェーブクリーム、化粧用油、ベビーオイルなどの基礎化粧品、ファンデーション（液状、クリーム状、固型など）、タルカムパウダー、ベビーパウダー、ボディパウダー、パヒュームパウダー、メークアップベース、おしろい（クリーム状、ペースト状、液状、固型、粉末など）、アイシャドウ、アイクリーム、マスカラ、眉墨、まつげ化粧料、頬紅、頬化粧水などのメークアップ化粧品、香水、練香水、粉末香水、オーデコロン、パフュームコロン、オードトワレなどの芳香化粧品、日焼けクリーム、日焼けローション、日焼けオイル、日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼け止めオイルなどの日焼け・日焼け止め化粧品、マニキュア、ペディキュア、ネイルカラー、ネイルラッカー、エナメルリムーバー、ネイルクリーム、爪化粧料などの爪化粧品、アイライナー化粧品、口紅、リップクリーム、練紅、リップグロスなどの口唇化粧品、練歯磨、マウスウォッシュなどの口腔化粧品、バスソルト、バスオイル、浴用化粧料などの入浴用化粧品などが挙げられる。
医薬品の形態として用いる場合には、例えば、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、眼軟膏剤、口腔粘膜貼付剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤、トローチ剤、軟膏剤、芳香水剤、鼻用噴霧剤、リモナーデ剤、リニメント剤、流エキス剤、ローション剤、湿布剤、噴霧剤、塗布剤、浴剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤などが挙げられる。
また、本発明の組成物は哺乳類由来の造血細胞の増殖促進剤として用いることもできる。生体外で造血細胞を増殖させる目的で用いる場合、本発明のポリペプチドの起源や適用する造血細胞の起源によって異なるものの、本発明の組成物における有効成分であるポリペプチドとしての重量換算で、造血細胞の１×１０５個あたり、通常、０．１μｇ以上、望ましくは、１μｇ以上を培養液中に含有させて造血細胞を培養、増幅すればよい。また、剤の形態としては造血細胞増殖促進剤としての使用目的に支障を与えない範囲で前記ゼラチナーゼ発現増強剤と同様な形態で用いることができる。
以上のような形態の本発明のポリペプチドを配合してなる組成物を製造するには、目的とする製品を慣用の製造方法にしたがって製造する過程の適宜の時期に本発明のポリペプチドを添加すればよい。添加の時期に特に制限はないけれども、目的とする製品が加熱工程を経て製造されるものの場合には、加熱工程の後、常温、望ましくは、３０℃以下に冷却した後に添加することにより、製造工程における本発明のポリペプチドが有する所期の生物作用の減衰を防ぐことができる。以上のような本発明の組成物は、本発明のポリペプチドを、製品重量あたり、通常、０．００１質量％以上、望ましくは、０．０１乃至１００質量％含有する。
以上のように本発明のポリペプチドを有効成分として含む組成物は、哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現増強作用を示すので、日常的に利用することにより、利用した生体においてゼラチナーゼ発現増強作用が効果的に発揮され、重篤な副作用を惹起することなく、創傷の早期緩和、治療などが達成される。また、本発明の組成物は、哺乳類の造血細胞の増殖促進作用を示すので、研究用の試薬として、又は、骨髄移植などを目的とした、生体外で骨髄由来造血細胞を増幅する際の造血細胞増殖促進剤などとして有用である。
一方、本発明のポリペプチドに対する抗体を有効成分として含む組成物もまた、本発明のポリペプチドの場合と同様に調製することができる。本発明のヒト由来ポリペプチドに対するヒト化抗体、キメラ抗体、さらにはヒト抗体を有効成分として含む組成物を医療目的で使用する場合には、ヒトにおける本発明のポリペプチドの過剰発現に伴う疾患の治療に効果を発揮する。当該組成物の用量は通常、疾患患者の体内における本発明のポリペプチドレベルに基づき選定される。体内における本発明のポリペプチドレベルは、例えば、患者より採取される体液などの生物学的試料を、例えば、本発明のポリペプチドに対するマウス抗体などを用いる免疫学的な検出法などに供して測定することができる。測定値を、同様にして測定される健常者における基準値と比較すれば、斯かる患者における本発明のポリペプチドの過剰量が推測される。患者の体内におけるこの過剰量を中和し得る量の本発明の抗体を含む組成物をその患者に投与すればよい。中和し得る抗体の量は組成物の形態やその投与経路により異なるものの、通常、本発明のポリペプチドの量に対してモル比で１／２乃至それ以上である。このようにして選定される用量の当該組成物を疾患の種類や症状、部位を勘案して、１度に又は２回以上に分けて投与すればよく、通常は、当該抗体量として成人あたり約１μｇ乃至１ｇ／回、より望ましくは、約１０μｇ乃至１００ｍｇ／回の用量で１乃至４回／日又は１乃至５回／週の頻度で１日乃至１年間にわたって投与すれば良い。本発明の抗体は後述する実施例にも示すように、血管内皮細胞の増殖及び／又は皮脂細胞の形成を抑制することから、本発明の抗体を有効成分として含む感受性疾患剤は血管新生抑制剤や皮脂産生抑制剤として有用である。
以下に、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
＜ヒト由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定＞
＜実施例１−１：ヒト由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング＞
市販のヒト胎盤由来ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ、日本ベクトン・ディッキンソン（株）製）を鋳型とし、配列表における配列番号１８又は配列番号１９で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡ、及び、配列表における配列番号２０で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＰＣＲプライマーとして用い、ＰＣＲサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００）を用いて常法により１次ＰＣＲを行った。次いで、増幅して得られた１次ＰＣＲ産物を含む反応液の一部を鋳型とし、配列表における配列番号２１又は配列番号２２、及び、配列表における配列番号２３で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＰＣＲプライマーとして用いて、同様に２次ＰＣＲを行った。その結果、１次ＰＣＲにおいて配列表における配列番号１８で示される塩基配列を有するＰＣＲプライマーを用い、２次ＰＣＲにおいて配列表における配列番号２１で示される塩基配列を有するＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ増幅により０．５ｋｂｐ及び１．５ｋｂｐのサイズを示す２種のＰＣＲ産物が得られた。この内、０．５ｋｂｐのものをＲ２７Ｌと、また、１．５ｋｂｐのものをＲ２７Ｈと命名した。一方、１次ＰＣＲにおいて配列表における配列番号１９で示される塩基配列を有するＰＣＲプライマーを用い、２次ＰＣＲにおいて配列表における配列番号２２で示される塩基配列を有するＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ増幅からは０．３ｋｂｐのサイズを示す１種のＰＣＲ産物が得られ、Ｒ２３と命名した。
ＰＣＲにより得た増幅断片Ｒ２３、Ｒ２７Ｌ、Ｒ２７Ｈをそれぞれポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、制限酵素Ｅｃｏ ＲＶで消化したプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（ストラタジーン製）にＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）製）を用いて、常法によりクローン化した。次いで、得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌コンピテントセル（ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｋａｎｒ、ストラタジーン製）を形質転換した。得られた形質転換体をＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間振盪培養した後、培養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してプラスミドＤＮＡを調製し、目的のＰＣＲ増幅断片を保持する３種の形質転換体をそれぞれ選択した。
得られた３種の形質転換体より、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣＲ増幅断片Ｒ２３、Ｒ２７Ｌ、Ｒ２７Ｈの塩基配列をＤＮＡシーケンサー（モデル３７３Ａ、アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）により分析したところ、Ｒ２３とＲ２７ＬあるいはＲ２３とＲ２７Ｈは一部重複する塩基配列を有しており、それぞれｃＤＮＡの部分塩基配列であることが判明した。これらがそれぞれ一つのｍＲＮＡに由来することを確認するためにＲ２３の開始コドンと予測される塩基配列の近傍の塩基配列をもとに、順鎖プライマーとして配列表における配列番号２４で示される塩基配列を有するＤＮＡを、また、Ｒ２７Ｌ又はＲ２７Ｈの終始コドンと予測される配列の近傍の配列をもとに、相補鎖プライマーとして配列表における配列番号２５又は配列番号２６で示される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。次いで、配列表における配列番号１８で示される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして１次ＰＣＲを行った反応液を鋳型として、配列表における配列番号２４と配列番号２５で示される塩基配列を有するプライマー又は配列表における配列番号２４と配列番号２６で示される塩基配列を有するプライマーの組合せで再度２次ＰＣＲを行った。その結果、配列表における配列番号２４と配列番号２５で示される塩基配列を有するプライマーを組合せたＰＣＲにより０．５ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られ、Ｒ４８と命名した。また、配列表における配列番号２４と配列番号２６で示される塩基配列を有するプライマーを組合せたＰＣＲにより０．６ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られ、Ｒ５０と命名した。ＰＣＲ増幅断片Ｒ４８とＲ５０をそれぞれ上記と同様に制限酵素Ｅｃｏ ＲＶで消化したプラスミドベクター「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）」にクローン化し、塩基配列を分析した結果、Ｒ４８はＲ２３とＲ２７Ｌより構成されるｃＤＮＡの部分塩基配列であった。また、Ｒ５０はＲ２３とＲ２７Ｈより構成されるｃＤＮＡの部分塩基配列であった。
＜実施例１−２：塩基配列の決定とコードされるアミノ酸配列＞
実施例１−１の結果から、Ｒ２３とＲ２７Ｌ、及び、Ｒ２３とＲ２７Ｈはそれぞれ同じｍＲＮＡに由来することが判明した。Ｒ２３とＲ２７Ｌより構成されるｃＤＮＡは配列表における配列番号１１で、また、Ｒ２３とＲ２７Ｈより構成されるｃＤＮＡは配列表における配列番号１２で示される塩基配列を有していた。配列表における配列番号１１で示される塩基配列は、配列表における配列番号１１で示される塩基配列に併記した１５５残基からなるアミノ酸配列を、また、配列表における配列番号１２で示される塩基配列は配列表における配列番号１２で示される塩基配列に併記した１７６残基からなるアミノ酸配列をそれぞれコードしていた。これらのアミノ酸配列においては、その第１乃至１４９番目までの部分アミノ酸配列は完全に一致していた。
【実施例２】
＜ハムスター由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定＞
＜実施例２−１：ハムスター毛包構成細胞に対する抗体の調製＞
４日齢ハムスターの背部皮膚から調製した表皮細胞のケラチノサイト画分を、ケラチノサイト用培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。この細胞を回収し、１乃至４×１０６個／匹でＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に免疫した。この操作を２週間隔で計３回行った後、尾静脈より採血を行い、血清を分離して抗体価測定に用いた。さらに細胞融合３日前に、同様に４日齢ハムスター皮膚より回収したケラチノサイト画分を２×１０７個／匹で腹腔に最終免疫した。抗体価測定及びスクリーニングは、同様に調製したハムスターケラチノサイト画分及びＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞を９６穴プレートに播き、４％パラホルムアルデヒドで固定化した細胞を抗原とするＣＥＬＬ ＥＩＡ法を用いた。このＣＥＬＬ ＥＩＡ法により特にケラチノサイトに対して強い反応性を示す血清のマウスから脾臓を摘出し、この脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０とを常法により細胞融合した後、上記ＣＥＬＬ ＥＩＡ法でクローンの選択を行い、目的とするハムスター毛包構成細胞に対するモノクローナル抗体産生クローンを得て、ｍＡｂＫ１１４−１と命名した。
＜実施例２−２：ハムスター表皮細胞ｃＤＮＡの合成＞
４日齢ハムスターの背部皮膚から調製した表皮細胞を、ケラチノサイト用培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一日培養して得た６．６×１０７個の培養表皮細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（（株）キアゲン製）を用いて全ＲＮＡを調製した。次いで、得られた全ＲＮＡを、ｍＲＮＡ精製キット（タカラバイオ（株）製、オリゴテックス−ｄＴ３０＜スーパー＞）及び常法を用いて精製し、ｍＲＮＡを調製した。次いで、ｍＲＮＡ１０μｇを鋳型として、逆転写酵素（インビトロジェン（株）製、商品名「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ」）とランダムプライマー（インビトロジェン（株）製）を用いてｃＤＮＡを合成した。さらに、合成したｃＤＮＡに制限酵素Ｂｓｔ ＸＩアダプター（インビトロジェン（株）製）を付加した後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、１ｋｂｐ以上のｃＤＮＡを回収した。得られたｃＤＮＡは予めＢｓｔ ＸＩで消化したプラスミドベクターｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン（株）製）とＴ４ ＤＮＡリガーゼにて連結させた後、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ ｐｈａｇｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｅｌｌｓ（インビトロジェン（株）製）に、ジーンパルサーユニット（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ（株）製）を用い、２．５ｋＶ、２５μＦ、１００Ωの条件のエレクトロポレーション法にて導入した。その結果５．１×１０５個の形質転換体を得た。
＜実施例２−３：ハムスター由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング＞
細胞膜蛋白質をコードする遺伝子を、その蛋白質に対する抗体を用いてクローニングするパニング法（Ｂ．シードら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），１９８７年、８４巻、３３６５乃至３３６９頁）に従ってスクリーニングを行った。まず１０群に分けたパニング用ライブラリーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−プレートに播き、３７℃で一晩培養を行った。得られたコロニー（５．１×１０４クローン／群）を５０ｍｌのＬ−培地を用いて回収し、さらに３７℃で２時間培養を行った。集菌後、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（（株）キアゲン製）によりプラスミドＤＮＡの調製を行った。得られた１０群のＤＮＡはジーンパルサーユニット（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ（株）製）を用いて２２０Ｖ、９６０μＦの条件でエレクトロポレーションを行うことによりＣＯＳ−１細胞に導入した。２乃至３日後、付着したＣＯＳ−１細胞を５ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム溶液を用いて回収し、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液に実施例２−１で調製したモノクローナル抗体ｍＡｂＫ１１４−１を５０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、氷上で１時間反応させた後、結合しなかった抗体を遠心洗浄することにより除去した。次いで、抗体が結合した細胞をヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチ製、１０μｇ／ｍｌ）でコートした６ｃｍディッシュに播き、室温で３時間吸着処理を行った。吸着しない細胞を洗い去った後、残りの吸着細胞をハート溶液（０．６％ＳＤＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ）で溶解し、終濃度１Ｍの塩化ナトリウム水溶液を添加し４℃で一晩放置した。これを１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収し、フェノール処理した後、１μｇの酵母ｔＲＮＡを添加しＤＮＡをエタノール沈殿法にて回収した。回収したＤＮＡは実施例２−２で示したエレクトロポレーションにより大腸菌に導入し、コロニーを形成させた。この一連の操作を１回のパニングサイクルとし、１０群のライブラリーについてそれぞれ３回パニングを繰り返した。パニング操作によって濃縮された目的遺伝子を含むＤＮＡより、単クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡは、リポフェクション用遺伝子導入剤（商品名「リポフェクトアミン２０００」、インビトロジェン（株）製）を用いてＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションし、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ培地、日水製薬（株）製）により培養を行った。培養２乃至３日後、細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定した後、５０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ｍＡｂＫ１１４−１を含む５％ＦＣＳ含有リン酸緩衝液を加え、室温で１時間反応させた。リン酸緩衝液で洗浄した後、アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（シグマアルドリッチ（株）製）と室温で１時間反応させた。リン酸緩衝液で洗浄した後、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ／ＡＳ−ＭＸ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（ピアス製）により染色を行い、染色された陽性形質転換体を得た。
＜実施例２−４：塩基配列の決定とコードされるアミノ酸配列＞
得られた陽性形質転換体より、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製し、ｐｃＤ−ｈａｍＡｇＫ１１４と命名した。挿入されたｃＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー（モデル３７３Ａ、アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）により分析したところ、配列表における配列番号１３で示される７２９塩基からなるオープンリーディングフレームを有しており、配列表における配列番号１３で示される塩基配列に併記した２４２残基からなるアミノ酸配列をコードしていた。このアミノ酸配列を有するポリペプチドをｈａｍＡｇＫ１１４−１と命名した。ｈａｍＡｇＫ１１４−１のアミノ酸残基２２５乃至２４１番目のアミノ酸配列はそのアミノ酸配列の特徴から膜貫通領域を形成していると予測され、ｈａｍＡｇＫ１１４−１はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型の膜蛋白質と推定された。ｈａｍＡｇＫ１１４−１が有する配列表における配列番号１３で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列をもとにデータベース検索したところ、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは存在せず、ｈａｍＡｇＫ１１４−１は新規な物質であった。
【実施例３】
＜マウス由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定＞
＜実施例３−１：データベース検索＞
実施例２で得られたハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列表における配列番号１３）をもとにデータベース検索（ＢＬＡＳＴ解析）を行ったところ、マウス由来のホモログをコードしていると考えられる４つの塩基配列（アクセッション番号ＡＫ００５５５８、ＢＣ００６９５８、ＡＫ００２７６７及びＡＫ００９３３６）が得られた。マウス由来のホモログをコードするｃＤＮＡをクローニングするため、ＡＫ００５５５８（マウス成獣雌胎盤ｃＤＮＡ）の開始コドン上流の塩基配列を基に、配列表における配列番号２７で示される塩基配列を有する順鎖プライマーを合成した。
＜実施例３−２：マウス表皮細胞ｃＤＮＡの合成＞
ＢＡＬＢ／ｃマウスの耳から調製した表皮細胞を、ケラチノサイト用培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養して得た８．８×１０６個の培養表皮細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（（株）キアゲン製）を用いて全ＲＮＡを調製した。次いで、得られた全ＲＮＡ２μｇを鋳型として、逆転写酵素（インビトロジェン（株）製、商品名「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ」）と配列表における配列番号２８で示される塩基配列を有するオリゴｄＴアンカープライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。
＜実施例３−３：マウス由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング＞
上記で合成したｃＤＮＡを鋳型とし、配列表における配列番号２７で示される塩基配列を有する順鎖プライマーと配列表における配列番号２９で示されるＰＣＲアンカープライマーの組合せで、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製、商品名「ＴａＫａＲａ Ｅｘ ｔａｑ」）を用いて常法の３′ＲＡＣＥ法によりポリ（Ａ）配列までのＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は９４℃、３０秒→６０℃、４５秒→７２℃、３分の条件で３０サイクル行った。このＰＣＲにより、１．３ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物（ＰＣＲ１３と命名）を得た。得られたＰＣＲ１３をポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、制限酵素Ｅｃｏ ＲＶで消化したプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルク（株）製）にＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）製）を用いて、常法によりクローン化し、組換えプラスミド（ｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１３と命名）を得た。得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌コンピテントセル（ＪＭ１０９、タカラバイオ（株）製）を形質転換した。得られた形質転換体をＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間振盪培養した後、培養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してプラスミドＤＮＡを調製し、目的のＰＣＲ増幅断片を保持するクローンを選択した。
＜実施例３−４：塩基配列の決定とコードされるアミノ酸配列＞
得られた形質転換体より、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣＲ増幅断片ＰＣＲ１３の塩基配列をＤＮＡシーケンサー（モデル３７３Ａ、アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）により分析したところ、配列表における配列番号１５で示される塩基配列を有していた。この塩基配列は、７１４塩基からなるオープンリーディングフレームを有しており、配列表における配列番号１５で示される塩基配列に併記した２３７残基からなるアミノ酸配列をコードしていた。マウス由来の配列表における配列番号１５で示される塩基配列を有するｃＤＮＡと実施例２で得たハムスター由来の配列番号１３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡとの相同性は７５％であった。また、本ｃＤＮＡにコードされる配列表における配列番号１５で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列とハムスター由来ポリペプチドのアミノ酸配列（配列表における配列番号１３で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列）との相同性は６０％であった。マウス由来ポリペプチドの２２０乃至２２６残基のアミノ酸配列はハムスター由来ポリペプチドと同様に膜貫通領域を形成していると予測され、マウス由来ポリペプチドもグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型の膜蛋白質と推定された。マウス由来ポリペプチドが有する配列表における配列番号１５で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列をもとにデータベース検索したところ、アクセッション番号ＡＡＨ１７６２４で開示されているｃＤＮＡがコードする機能未知のポリペプチドのアミノ酸配列と完全に一致した。
【実施例４】
＜マウス由来分泌型ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定＞
＜実施例４−１：マウス由来分泌型ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング＞
より低分子の分泌型ポリペプチドをクローニングする目的で、実施例３において３′ＲＡＣＥ法にて増幅したＰＣＲ産物を２％アガロース電気泳動に供し、約８００ｂｐに相当する位置のＤＮＡバンド（ＰＣＲ１８１と命名）を切り出し、ＤＮＡ抽出キット（（株）キアゲン製、商品名「ＱＩＡＥＸ ＩＩ」）を用いて抽出し、ＤＮＡを精製した。次いで、得られたＤＮＡ断片（ＰＣＲ１８１）を制限酵素Ｅｃｏ ＲＶで消化したプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルク（株）製）にＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）製）を用いて、常法によりクローン化し、組換えＤＮＡ（ｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１８１と命名）を得た。得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌コンピテントセル（ＪＭ１０９、タカラバイオ（株）製）を形質転換した。得られた形質転換体をＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間振盪培養した後、培養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してプラスミドＤＮＡを調製し、目的のｃＤＮＡを保持するクローンを選択した。
＜実施例４−２：塩基配列の決定とコードされるアミノ酸配列＞
得られた形質転換体より、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣＲ増幅断片ＰＣＲ１８１の塩基配列をＤＮＡシーケンサー（モデル３７３Ａ、アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）により分析したところ、配列表における配列番号１７で示される塩基配列を有していた。配列表における配列番号１７で示される塩基配列は、５８５塩基からなるオープンリーディングフレームを有しており、配列表における配列番号１７で示される塩基配列に併記した１９４残基からなるアミノ酸配列をコードしていた。実施例３で得たマウス由来の配列表における配列番号１５で示される塩基配列を有するｃＤＮＡとの相同性は７５％であった。また、本ｃＤＮＡにコードされる配列表における配列番号１７で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列と実施例３のポリペプチドのアミノ酸配列（配列表における配列番号１５で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列）とは１乃至１４８残基までは完全に一致していたもののそれ以降の配列は全く異なっていた。本ポリペプチドにはアミノ酸配列上ＧＰＩアンカー型の膜貫通領域と推定される部分が存在しないため、分泌型のポリペプチドと考えられた。本ポリペプチドが有する配列表における配列番号１７で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列をもとにデータベース検索したところアクセッション番号ＡＫ００２７６７で開示されているｃＤＮＡがコードする機能未知のポリペプチドのアミノ酸配列と完全に一致した。
【実施例５】
＜ヒト由来ポリペプチドの製造＞
＜実施例５−１：発現ベクターの構築＞
配列表における配列番号１１で示される塩基配列を有するｃＤＮＡの５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列を作製し、３′末端に配列表における配列番号３０で示されるアミノ酸配列（ＦＬＡＧ配列）をコードする塩基配列及びＮｏｔ Ｉ認識配列を作製することを目的とし、配列表における配列番号１１で示される塩基配列を有するｃＤＮＡが挿入されたプラスミドＤＮＡ １０ｎｇを鋳型にして、配列表における配列番号３１で示される塩基配列を有する順鎖プライマーと配列表における配列番号３２に示される塩基配列を有する相補鎖プライマーの組み合わせでＰＣＲを行った。得られた増幅断片は、ポリエチレングリコール沈澱法により精製後、プラスミド（「ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）」、（株）ストラタジーン製）のＳｒｆ Ｉ部位にクローニングを行った。常法により塩基配列の確認を行った結果、計画通り５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列、３′末端にＦＬＡＧ配列をコードする塩基配列、Ｎｏｔ Ｉ認識配列を有するプラスミドが得られた。得られたプラスミドＤＮＡをＸｈｏ ＩとＮｏｔ Ｉで消化し、配列表における配列番号１１で示される塩基配列を有するｃＤＮＡを含むＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ断片を調製後、発現ベクターｐＣＤＭ８（インビトロジェン（株）製）のＣＭＶプロモーターの下流、Ｘｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入した。得られた発現ベクターをｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ａＦＬと命名した。本発現ベクターを用いれば発現するポリペプチドは配列表における配列番号１１で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端部位にＦＬＡＧ配列を有する融合ポリペプチドとして得られる。構築した発現ベクターｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ａＦＬの基本構造を図１に示した。
＜実施例５−２：ＣＯＳ−１細胞の形質転換と培養＞
実施例５−１で得た発現ベクターｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ａＦＬを、リポフェクション法にて以下のようにＣＯＳ−１細胞に導入し細胞を形質転換した。まず、プラスミドＤＮＡ１０μｇをＤ−ＭＥＭ培地で希釈して１．５ｍｌとしたものと、リポフェクション法用遺伝子導入試薬（商品名『リポフェクトアミン２０００』、インビトロジェン（株）製、以下、ＬＦ２０００と略称する。）６０μｌをＤ−ＭＥＭ培地で希釈して１．５ｍｌとし、室温で５分間放置したものを合わせ室温で２０分間反応させ、ＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体を形成させた。次いで、１０ｃｍプラスチックシャーレ上に４．８×１０６個／１０ｍｌの１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地で接種し、一晩培養しておいたＣＯＳ−１細胞の培養液上清を取り除き、５ｍｌのＤ−ＭＥＭ培地を加え、ＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体３ｍｌを添加した。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で５時間培養した後に上清を取り除き、１０ｍｌの１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に培地を交換して再び培養した。一晩培養後、動物細胞用無血清培地ＡＳＦ（味の素（株）製）５ｍｌに培地交換し、さらに３日間培養を行った。
＜実施例５−３：ポリペプチドの精製＞
形質転換したＣＯＳ−１細胞の培養液１０００ｍｌを精製原料として、配列表における配列番号１１で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドの精製を以下のように行った。培養液を遠心分離して得た培養上清を０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）で予め平衡化しておいた抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースカラム（容量５ｍｌ、シグマアルドリッチ（株）製）にかけ、ＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドを特異的に吸着させた。同バッファーで充分洗浄し非吸着成分を除去した後、０．１Ｍグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ３．５）を用いて吸着成分を溶出した。ポリペプチド溶出フラクションは１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を添加することにより中和した。回収フラクションは限外ろ過膜（商品名『ウルトラフリー』、ミリポア（株）製）にて濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．１）で予め平衡化しておいた容量１２０ｍｌのゲルろ過カラム（商品名『スーパーデックス２００』、アマシャムバイオサイエンス（株）製）にかけ、同バッファーにて溶出した。２８０ｎｍの吸光度を指標にポリペプチドを回収し、約０．１５ｍｇのポリペプチドを収率約８０％で得た。このポリペプチドをｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬと命名した。
得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量３０乃至１００ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。分子量の幅が広い理由として糖鎖修飾の影響が考えられた。
【実施例６】
＜ヒト由来ポリペプチドの製造＞
＜実施例６−１：組換えバキュロウィルスの調製＞
ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬをコードするｃＤＮＡと、ＢＤファーミンジェン社製の『ＢＤバキュロゴールド・トランスフェクション・キット（ＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）』を用い、昆虫細胞でのポリペプチド発現用組換えバキュロウィルスを調製した。実施例５−１で得た５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列を、３′末端にＦＬＡＧ配列をコードする塩基配列とＮｏｔ Ｉ認識配列を有するＤＮＡが挿入されたｐｃＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて消化し、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を調製した後、これを、バキュロウィルス・トランスファーベクター『ｐＶＬ１３９３』のポリヘドリン・プロモーター下流のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位に連結させた。得られた組換えベクターを『ｐＶＬ１３９３−ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ』と命名した。構築した発現ベクターｐＶＬ１３９３−ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬの基本構造を図２に示した。次に、キットの添付説明書の操作方法に従い、Ｓｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７１１、ヨトウガ由来）を用いて、組換えウィルスの作製を行った。Ｓｆ９は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ添加のＴＣ１００培地（インビトロジェン（株）製）を用い、６穴プレートに１×１０６個／ウェルで播種し、１０分間付着させ、上清除去後、０．５ｍｌのトランスフェクション・バッファーＡ液（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ含有グレース培地）に置換した。これに、あらかじめ１．５μｇのｐＶＬ１３９３−ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬと０．２５μｇのＢＤバキュロゴールド・バキュロウィルスＤＮＡを混合して５分間反応させた後に、０．５ｍｌのトランスフェクション・バッファーＢ液（１２５ｍＭ塩化カルシウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．１）を添加した混合液を、０．５ｍｌ／ウェルで添加し、２７℃で４時間感染させた。次に、各ウェルを１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ添加ＴＣ−１００培地で１回洗浄後、同培地２ｍｌを添加し、更に２７℃で６日間培養を行った。各培養液を１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を回収し、ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ組換えバキュロウィルス調製液とした。更にウィルスの力価を上げるため、Ｓｆ９細胞１×１０７個に上記の調製液を５０乃至２００μｌ添加し、２７℃で１週間感染させ、遠心分離して得た上清を、ポリペプチド発現用の組換えウィルス液として調製した。
＜実施例６−２：昆虫細胞のトランスフェクションと培養＞
ポリペプチド発現用細胞として、昆虫細胞株『Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ』（インビトロジェン（株）製、イラクサギンウワバ由来）を用いた。昆虫細胞株は、Ｌ−グルタミン（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）を添加したエクスプレスファイブ無血清培地（インビトロジェン（株）製）を用いて１×１０８個／１０ｍｌに調製し、実施例６−１で得た組換えウィルス液を２００μｌ添加し、１０分毎に攪拌しながら１時間感染させた。次に、エクスプレスファイブ無血清培地を３０ｍｌ添加後、２７℃で３日間培養を行いトランスフェクション液を得た。
＜実施例６−３：ポリペプチドの精製＞
実施例６−２で得たトランスフェクション液７４０ｍｌを精製原料として、Ｃ末端部分にＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドの精製を以下のように行った。トランスフェクション液を１５，０００ｒｐｍで４５分間遠心分離して得た上清を、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）で予め平衡化しておいた抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースカラム（容量５ｍｌ、シグマアルドリッチ（株）製）にかけ、ＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドを特異的に吸着させた。同バッファーで充分洗浄し非吸着成分を除去した後、０．１Ｍグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ３．５）を用いて吸着成分を溶出した。ポリペプチド溶出フラクションは１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を添加することにより中和した。回収フラクションは限外ろ過膜（商品名『ウルトラフリー』、ミリポア（株）製）にて濃縮することによりポリペプチドを回収し、約５３０μｇのポリペプチドを得た。
得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量２０乃至３５ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。常法により、この精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を５残基調べたところ、配列表における配列番号３９で示されるアミノ酸配列を有していることが判明し、このアミノ酸配列は配列表における配列番号１１に示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の第２６乃至第３０番目のアミノ酸配列と完全に一致した。このことから配列表における配列番号１１に示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の内、第１乃至第２５番目までのアミノ酸配列は分泌のためのシグナル配列であり、第２６番目以降のアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列が成熟ポリペプチドのアミノ酸配列であることが確認された。
【実施例７】
＜ヒト由来ポリペプチドの製造＞
＜実施例７−１：発現ベクターの構築＞
相補鎖プライマーとして配列表における配列番号３３で示される塩基配列を有するプライマーを用い、配列表における配列番号１２で示される塩基配列を有するｃＤＮＡ挿入プラスミドＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った以外は実施例５−１と同様に操作することにより発現ベクターを得て、ｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ｂＦＬと命名した。本発現ベクターを用いれば発現するポリペプチドは配列表における配列番号１２で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列を有する融合ポリペプチドとして得られる。構築した発現ベクターｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ｂＦＬの基本構造を図３に示した。
＜実施例７−２：ＣＯＳ−１細胞の形質転換と培養＞
発現ベクターとして実施例７−１で得たｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ｂＦＬを用いた以外は実施例５−２と同様にＣＯＳ−１細胞を形質転換し、細胞培養を行なった。
＜実施例７−３：ポリペプチドの精製＞
実施例５−３と同様に操作し、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドの精製を行ったところ、約０．１ｍｇのポリペプチドを収率約８０％で得た。得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量３０乃至１００ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。常法により、この精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を５残基調べたところ、配列表における配列番号３９で示されるアミノ酸配列を有していることが判明し、このアミノ酸配列は配列表における配列番号１２に示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の第２６乃至第３０番目のアミノ酸配列と完全に一致した。このことから配列表における配列番号１２に示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の内、第１乃至第２５番目までのアミノ酸配列は分泌のためのシグナル配列であり、第２６番目以降のアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号５で示されるアミノ酸配列が成熟ポリペプチドのアミノ酸配列であることが確認された。なお、配列表における配列番号４及び５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列表における配列番号１で示される部分アミノ酸配列を共通に有することになり、このアミノ酸配列が生物作用に重要と判断された。
【実施例８】
＜ハムスター由来Ｃ末端ＦＬＡＧ付加分泌変異型ポリペプチドの製造＞
＜実施例８−１：発現ベクターの構築＞
実施例２でクローニングした配列表における配列番号１３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡは、配列表における配列番号１３で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列を有する膜結合型のハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１をコードしているところ、分泌型のポリペプチドを得るため膜結合に関与すると予測されるＣ末端領域（配列表における配列番号１３で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における２２３番目のセリン残基以降のＣ末端側の領域）を削除し、さらに、実施例５及び６と同様にＣ末端部分にＦＬＡＧ配列を有する組換え融合ポリペプチドが得られるようにｃＤＮＡを改変した発現ベクターを構築することにした。
実施例２で得た、組換えプラスミドｐｃＤ−ｈａｍＡｇＫ１１４ １０ｎｇを鋳型とし、配列表における配列番号３４で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを順鎖プライマーとし、配列表における配列番号３５で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを相補鎖プライマーとしたＰＣＲを行った。得られた増幅断片は、ポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、プラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）（（株）ストラタジーン製）のＳｒｆ Ｉ部位にクローニングした。常法により塩基配列の確認を行ったところ、計画通り配列表における配列番号１４で示される塩基配列の５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列が、及び３′末端にＮｏｔ Ｉ認識配列が付加された配列を有していた。このＤＮＡは配列表における配列番号１４で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列をコードしていたことから、当初の目的通りｈａｍＡｇＫ１１４−１の１乃至２２２番目までのアミノ酸配列とＦＬＡＧ配列が融合した組換え変異型融合ポリペプチド（ｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬと命名。）をコードするｃＤＮＡが調製されたことを確認した。このｃＤＮＡを含むＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ断片を再度切り出し、発現ベクターｐＲＥＦ−ＸＮ（谷口ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ），１９９８年，２１７巻，９７乃至１０２頁）のＥＦ−１αプロモーターの下流、Ｘｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入することにより調製した発現ベクターをｐＲＥＲ−ｈａｍＡｇＫ１１４ｄ２ＦＬと命名した。構築した発現ベクターｐＲＥＲ−ｈａｍＡｇＫ１１４ｄ２ＦＬの基本構造を図４に示した。
＜実施例８−２：ＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質転換と培養＞
実施例８−１で得た発現ベクターｐＲＥＲ−ｈａｍＡｇＫ１１４ｄ２ＦＬを、エレクトロポレーション法にて以下のようにＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し細胞を形質転換した。まず、プラスミドＤＮＡ１０μｇと、予め常法により調製しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞を１×１０６個含む液８００μｌとをエレクトロポレーション用キュベット内で混合し、氷温で１０分間放置した。次いで、２５μＦＤ、１０００Ｖの電気パルスを１分間間隔で２回負荷することによりエレクトロポレーションを行った。形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞を５％ＦＣＳ−Ｈａｍ’ｓＦ１２培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間培養した後、培地を４００μｇ／ｍｌのＧ−４１８（商品名「ジェネティシン」、インビトロジェン（株）製）を含む５％ＦＣＳ−Ｈａｍ’ｓＦ１２培地に交換し、２日に一度培地を交換しながら１４日間培養した。ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を用いた培養上清のＥＩＡにより、形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞からｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬを高発現する形質転換ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１株選択し、常法によりシングルクローン化し、ＣＨＯ−ｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬと命名した。この細胞を３４．５ｍｇ／ｌのＬ−プロリンを含有する５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地に播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。細胞がコンフルエント状態になった後、培地をＡＳＦ培地に交換し３日間培養した。
＜実施例８−３：ポリペプチドの精製＞
ＣＨＯ−ｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬ細胞の培養液２０ｌを精製原料として、ＦＬＡＧ付加型変異ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬの精製を以下のように行った。培養液を遠心分離して得た培養上清を限外ろ過膜（商品名『マイクローザ』、旭化成（株）製）にて１００倍濃縮した後、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）で予め平衡化しておいた抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースカラム（容量５ｍｌ、シグマアルドリッチ（株）製）にかけ、ＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドを特異的に吸着させた。同バッファーで充分洗浄し非吸着成分を除去した後、０．１Ｍグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ３．５）を用いて吸着成分を溶出した。ポリペプチド溶出フラクションは１Ｍトリス−塩峻バッファー（ｐＨ８．０）を添加することにより中和した。回収フラクションは限外ろ過膜（商品名『ウルトラフリー』、ミリポア（株）製）にて濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．１）で予め平衡化しておいた容量１２０ｍｌのゲルろ過カラム（商品名『スーパーデックス２００』、アマシャムバイオサイエンス（株）製）にかけ、同バッファーにて溶出した。２８０ｎｍの吸光度を指標にポリペプチドを回収し、約１．８ｍｇのｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬを得た。
得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量５０乃至１００ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。分子量の幅が広い理由として糖鎖修飾の影響が考えられた。常法により、この精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を５残基調べたところ、配列表における配列番号４０で示されるアミノ酸配列を有していることが判明し、このアミノ酸配列は配列表における配列番号１４で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の第２７乃至第３１番目のアミノ酸配列と完全に一致した。このことから配列表における配列番号１４で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の内、第１乃至第２６番目までのアミノ酸配列は分泌のためのシグナル配列であり、第２７乃至第２２２番目のアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列が成熟ポリペプチドのアミノ酸配列であることが確認された。なお、配列表における配列番号６及び７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列表における配列番号２で示される部分アミノ酸配列を共通に有することになり、このアミノ酸配列が生物作用に重要と判断された。
【実施例９】
＜マウス由来Ｃ末端ＦＬＡＧ付加分泌変異型ポリペプチドの製造＞
＜実施例９−１：発現ベクターの構築＞
実施例３でクローニングした配列表における配列番号１５の塩基配列を有するｃＤＮＡは、膜結合型のマウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１をコードしているところ、分泌型のポリペプチドを得るため、実施例８のハムスターの場合と同様に、膜結合に関与するＣ末端領域（配列表における配列番号１５で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における２１９番目プロリン残基以降のＣ末端側の領域）を削除し、実施例５、７及び８と同様にＣ末端にＦＬＡＧ配列を有する組換え融合ポリペプチドが得られるようにｃＤＮＡを改変した発現ベクターを構築することにした。
実施例３で得た、組換えプラスミドｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１３ １０ｎｇを鋳型とし、配列表における配列番号３６で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを順鎖プライマーとし、配列表における配列番号３７で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを相補鎖プライマーとしたＰＣＲを行った。得られた増幅断片は、ポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、プラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）（（株）ストラタジーン製）のＳｒｆ Ｉ部位にクローニングした。常法により塩基配列の確認を行った結果、計画通り配列表における配列番号１６で示される塩基配列の５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列、及び３′末端にＮｏｔ Ｉ認識配列がそれぞれ付加された塩基配列を有していた。このＤＮＡは配列表における配列番号１６で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列をコードしていたことから、当初の目的通りｍＡｇＫ１１４−１の１乃至２１８番目までのアミノ酸配列のＣ末端にＦＬＡＧ配列を有する組換え分泌変異型融合ポリペプチド（ｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬと命名。）をコードするｃＤＮＡが調製されたことを確認した。このｃＤＮＡを含むＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ断片を再度切り出し、実施例８−１と同様に発現ベクターｐＲＥＦ−ＸＮのＥＦ−１αプロモーターの下流、Ｘｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入することにより調製した発現ベクターをｐＲＥＲ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬと命名した。構築した発現ベクターｐＲＥＲ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬの基本構造を図５に示した。
＜実施例９−２：ＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質転換と培養＞
実施例９−１で得た発現ベクターｐＲＥＲ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬを、エレクトロポレーション法にて以下のようにＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し細胞を形質転換した。まず、プラスミドＤＮＡ１０μｇと、予め常法により調製しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞を１×１０６個含む液８００μｌとをエレクトロポレーション用キュベット内で混合し、氷温で１０分間放置した。次いで、２５μＦＤ、１０００Ｖの電気パルスを１分間間隔で２回負荷することによりエレクトロポレーションを行った。形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞を５％ＦＣＳ−Ｈａｍ’ｓＦ１２培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間培養した後、培地を４００μｇ／ｍｌのＧ−４１８を含む５％ＦＣＳ−Ｈａｍ’ｓＦ１２培地に交換し、２日に一度培地を交換しながら８日間培養した。ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を用いた培養上清のＥＩＡにより、形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞からｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを高発現する形質転換ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１株選択し、常法によりシングルクローン化し、ＣＨＯ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬＢＰ２３−１と命名した。この細胞を３４．５ｍｇ／ｌのＬ−プロリンを含有する５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地に播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。細胞がコンフルエント状態になった後、培地をＡＳＦ培地に交換し３日間培養した。
＜実施例９−３：ポリペプチドの精製＞
ＣＨＯ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬＢＰ２３−１細胞の培養液２０ｌを精製原料として、配列表における配列番号１６で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列を有する変異型融合ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬの精製を以下のように行った。培養液を遠心分離して得た培養上清を限外ろ過膜（商品名『マイクローザ』、旭化成（株）製）にて１００倍濃縮した後、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩峻バッファー（ｐＨ７．４）で予め平衡化しておいた抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースカラム（容量５ｍｌ、シグマアルドリッチ（株）製）にかけ、ＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドを特異的に吸着させた。同バッファーで充分洗浄し非吸着成分を除去した後、０．１Ｍグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ３．５）を用いて吸着成分を溶出した。ポリペプチド溶出フラクションは１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を添加することにより中和した。回収フラクションは限外ろ過膜（商品名『ウルトラフリー』、ミリポア（株）製）にて濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．１）で予め平衡化しておいた容量１２０ｍｌのゲルろ過カラム（商品名『スーパーデックス２００』、アマシャムバイオサイエンス（株）製）にかけ、同バッファーにて溶出した。２８０ｎｍの吸光度を指標にポリペプチドを回収し、約８．６ｍｇのｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを得た。
得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量５０乃至１００ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。分子量の幅が広い理由として糖鎖修飾の影響が考えられた。常法により、この精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を５残基調べたところ、配列表における配列番号４１で示されるアミノ酸配列を有していることが判明し、このアミノ酸配列は配列表における配列番号１６で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の第２７乃至第３１番目のアミノ酸配列と完全に一致した。このことから配列表における配列番号１６で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の内、第１乃至第２６番目までのアミノ酸配列は分泌のためのシグナル配列であり、第２７乃至第２１８番目のアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号９で示されるアミノ酸配列が成熟ポリペプチドのアミノ酸配列であることが確認された。
【実施例１０】
＜マウス由来分泌型ポリペプチドの製造＞
＜実施例１０−１：発現ベクターの構築＞
実施例４で得た、組換えプラスミドｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１８１ １０ｎｇを鋳型とし、配列表における配列番号３６で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを順鎖プライマーとし、配列表における配列番号３８で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを相補鎖プライマーとしたＰＣＲを行った。得られた増幅断片は、ポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、プラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）（（株）ストラタジーン製）のＳｒｆ Ｉ部位にクローニングした。常法により塩基配列の確認を行った結果、計画通り配列表における配列番号１７で示される塩基配列の５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列、及び３′末端にＮｏｔ Ｉ認識配列がそれぞれ付加された塩基配列を有していた。このＤＮＡは配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列をコードしていたことから、分泌型ポリペプチド（ｍＡｇＫ１１４−１ｂと命名。）をコードするｃＤＮＡが調製されたことを確認した。このｃＤＮＡを含むＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ断片を再度切り出し、実施例８−１と同様に発現ベクターｐＲＥＦ−ＸＮのＥＦ−１αプロモーターの下流、Ｘｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入することにより調製した発現ベクターをｐＲＥＲ−ｍＡｇＫ１１４ｂと命名した。構築した発現ベクターｐＲＥＲ−ｍＡｇＫ１１４ｂの基本構造を図６に示した。
＜実施例１０−２：ＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質転換と培養＞
実施例１０−１で得た発現ベクターｐＲＥＲ−ｍＡｇＫ１１４ｂを用い、形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞からマウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬに対するラット抗血清を用いたＥＩＡによりｍＡｇＫ１１４−１ｂを高発現する形質転換ＣＨＯ−Ｋ１細胞を選択した以外は実施例９と同様にして、形質転換ＣＨＯ−Ｋ１細胞を得てＣＨＯ−ｍＡｇＫ１１４ｂ１６−３８と命名した。この細胞を３４．５ｍｇ／ｌのＬ−プロリンを含有する５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地に播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。細胞がコンフルエント状態になった後、培地をＡＳＦ培地に交換し３日間培養した。
＜実施例１０−３：ポリペプチドの精製＞
ＣＨＯ−ｍＡｇＫ１１４ｂ１６−３８細胞の培養液２０ｌを精製原料として、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂの精製を以下のように行った。培養液を遠心分離して得た培養上清を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．５）で予め平衡化しておいた容量３６０ｍｌのＷＧＬ−セファロース（アマシャムバイオサイエンス（株）製）カラムにかけ、ポリペプチドを特異的に吸着させた。同バッファーで充分洗浄し非吸着成分を除去した後、０．４Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミン−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いて吸着成分を溶出した。ポリペプチド溶出フラクションは限外ろ過膜（商品名『ウルトラフリー』、ミリポア（株）製）にて濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で予め平衡化しておいた容量５０ｍｌのキレート（Ｃｕ２＋）−セファロース（アマシャムバイオサイエンス（株）製）カラムにかけ、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）にて溶出した。２８０ｎｍの吸光度を指標にポリペプチドを回収したところ、約０．５ｍｇのポリペプチドが得られた。
得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量３５乃至７０ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。常法により、この精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を５残基調べたところ、配列表における配列番号４１で示されるアミノ酸配列を有していることが判明し、このアミノ酸配列は配列表における配列番号１７で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の第２７乃至第３１番目のアミノ酸配列と完全に一致した。このことから配列表における配列番号１７で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の内、第１乃至第２６番目までのアミノ酸配列は分泌のためのシグナル配列であり、第２７番目以降のアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列が成熟ポリペプチドのアミノ酸配列であることが確認された。なお、配列表における配列番号８乃至１０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列表における配列番号３で示される部分アミノ酸配列を共通に有することになり、このアミノ酸配列が生物作用に重要と判断された。
【実施例１１】
＜ヒト由来ポリペプチドのヒト由来線維芽細胞のゼラチナーゼ発現増強作用＞
実施例５−３の方法で得たヒト由来組換えポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を用い、ヒト由来線維芽細胞のゼラチナーゼ発現増強作用を検討した。常法に従い、１２穴マイクロプレートに正常ヒト新生児包皮皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を３×１０４個／ｍｌの濃度で１ｍｌのＭｅｄｉｕｍ １０６培地（カスケードバイオロジクス製）に播き込み、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下で２日間培養した。次いで、増殖したＮＨＤＦに、実施例５−３の方法で得た組換え型ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を終濃度１μｇ／ｍｌ若しくは１０μｇ／ｍｌになるよう調整した無血清Ｄ−ＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下でさらに２日間培養した。培養終了後、遠心分離により培養上清を回収し、ゼラチナーゼ活性及びゼラチーナーゼＡ蛋白の測定に用いた。なお、組換え型ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品の代わりにＦＬＡＧペプチドを終濃度１μｇ／ｍｌになるよう添加した以外は、同様に培養して得た培養上清を対照として用いた。
ゼラチナーゼ活性は、活性染色法により評価した。すなわち、それぞれの培養上清を１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含有する活性染色用ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供し、泳動後、ゲルをインキュベーションバッファー中で一晩処理することによりゼラチナーゼを活性化し反応させた。次いで、ゲル中のゼラチンをクーマシーブリリアントブルーで染色することにより、ゼラチンが分解したことにより生ずる白く抜けたバンドを検出した。このバンドの強度をデンシトメーターにて測定し、対照を１００として試験系のゼラチンを分解する活性を相対評価した。また、ゼラチナーゼＡ蛋白の発現量は、常法のウェスタンブロッティング法により評価した。すなわち、それぞれの培養上清１２μｌをアクリルアミド４乃至２０％のグラジエントゲル（第一化学薬品（株）製）を用い、常法により還元剤存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、蛋白質を常法に従ってニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜を、ブロッキング剤（商品名「ブロックエース」、大日本製薬（株）製）を用いてブロックした後、一次抗体として１μｇ／ｍｌの抗ゼラチナーゼＡ抗体（第一ファインケミカル（株）製、商品名『抗ヒトＭＭＰ−２抗体』）で処理し、さらに二次抗体として１０００倍に希釈した抗マウス免疫グロブリン−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体（ダコ・ジャパン（株）製）で処理し、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（アマシャムバイオサイセンス（株）製）によりゼラチナーゼＡ蛋白を検出した。ウェスタンブロッティング法により検出されたバンドの強度をデンシトメーターにて測定し、対照におけるゼラチナーゼＡ蛋白の発現量を１００として相対評価した。結果を表１に示す。
表１の結果から明らかなように、無添加系（対照）に比べヒト由来組換え型ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬは、１μｇ／ｍｌの濃度で約３倍、１０μｇ／ｍｌの濃度で９倍以上と、用量依存的にＮＨＤＦにおけるゼラチナーゼＡ蛋白の発現を顕著に増強した。一方、活性染色法により評価したゼラチナーゼ活性では、組換え型ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬは、１μｇ／ｍｌの濃度で対照とほぼ同程度、１０μｇ／ｍｌの濃度では対照の約１．５倍であった。本試験において、組換え型ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬは用量依存的にＮＨＤＦにおけるゼラチナーゼＡ蛋白の発現を顕著に増強することにより、ゼラチナーゼ活性を増強することが判明した。本発明のポリペプチドは、ヒト由来線維芽細胞のゼラチナーゼ発現を顕著に増強することから、皮膚における創傷や炎症の治癒を促進するために用いることができる。
【実施例１２】
＜ポリペプチドの哺乳類由来線維芽細胞及び間葉系細胞のゼラチナーゼ発現増強作用＞
実施例５乃至１０の方法で得たヒト、ハムスター及びマウス由来組換えポリペプチド精製標品を用い、ヒト及びハムスター由来線維芽細胞、及びマウス由来間葉系細胞のゼラチナーゼ発現増強作用を検討した。常法に従い、１２穴マイクロプレートに正常ヒト新生児包皮皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ハムスター新生児皮膚由来線維芽細胞（ＦＢ）又はマウス胎児大動脈由来間葉系細胞（ＳＣ９−１９）を３×１０４個／ｍｌの濃度で１ｍｌの増殖因子を含む培地に播き込み、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２日間培養した。次いで、増殖したＮＨＤＦ、ＦＢ又はＳＣ９−１９に、実施例５乃至１０の方法で得たポリペプチド精製標品をそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌになるよう調整した無血清Ｄ−ＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下でさらに２日間培養した。培養終了後、遠心分離により培養上清を回収し、ゼラチナーゼ活性の測定に用いた。なお、組換え型ポリペプチド精製標品の代わりにＦＬＡＧペプチドを終濃度１０μｇ／ｍｌになるよう添加した以外は、同様に培養して得た培養上清を対照として用いた。
線維芽細胞又は間葉系細胞で発現するゼラチナーゼ活性は、実施例１１で用いた活性染色法により評価した。すなわち、それぞれの培養上清を１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含有する活性染色用ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供し、泳動後、ゲルをインキュベーションバッファー中で一晩処理することにより酵素を活性化し反応させた。次いで、ゲル中のゼラチンをクーマシーブリリアントブルーで染色し、ゼラチンが分解したことにより生ずる白く抜けたバンドを検出した。このバンドの強度をデンシトメーターにて測定し、対照を１００として試験系のゼラチンを分解する活性を相対評価した。結果を表２に示す。
表２の結果から明らかなように、活性染色法により評価したゼラチナーゼ活性では、ＦＬＡＧペプチド添加系（対照）に比べ、ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ及びｈＡｇＫ１１４−１ｂＦＬは、ＮＨＤＦにおけるゼラチナーゼ活性を１．５倍及び１．４倍に、ハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬは、ＦＢにおけるゼラチナーゼ活性を１．２４倍に、また、マウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬ及びｍＡｇＫ１１４−１ｂは、いずれもＳＣ９−１９におけるゼラチナーゼ活性を約１．３倍に増強した。また、ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ及びハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬは、いずれもマウス由来間葉系細胞ＳＣ９−１９に対し、弱いながらもゼラチナーゼの発現を増強したことから、これらポリペプチドは種を越えてゼラチナーゼの発現増強能を発揮するものと推察された。本試験において、本発明における組換え型ポリペプチドは終濃度１０μｇ／ｍｌの添加条件下で線維芽細胞又は間葉系細胞におけるゼラチナーゼの発現を対照の１．２倍以上増強することが判明した。本発明のポリペプチドは、線維芽細胞又は間葉系細胞のゼラチナーゼ発現を顕著に増強することから、皮膚における創傷や炎症の治癒を促進するために用いることができる。
【実施例１３】
＜マウス由来ポリペプチドのゼラチナーゼ発現増強及び創傷治癒促進作用＞
８週齢の雄ＣＤ−１マウス２４匹を麻酔し、背部皮膚を脱毛した後、それぞれの正中線上の前後に１２ｍｍの線状創を２ヶ所、正中線をはさんで左右に８ｍｍ２の開放創２ヶ所を作製した。内８匹について、創傷作製直後、１日後、２日後に創傷１ヶ所につき実施例９−３の方法で調製したマウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを４μｇ（１０μｌのリン酸緩衝液に溶解したもの）ずつ塗布した。また、残り１６匹については、８匹にＦＬＡＧペプチドを０．２μｇ、８匹にウシ血清アルブミン４μｇをそれぞれ同様に塗布して対照とした。創傷作製７日後にそれぞれの創傷の大きさを測定するとともに、創傷部位の皮膚細胞を採取し、細胞を破砕した後、遠心分離上清についてゼラチナーゼの発現を実施例１１と同様にして活性染色法にて評価した。結果を表３に示す。
表３の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬ塗布群では８匹中５匹においてゼラチナーゼの発現増強効果が認められ、発現増強の程度は約１．７倍であった。また、マウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬ塗布群は創傷７日後において、線状創及び開放創のいずれの面積においても対照群（ウシ血清アルブミン群）に比べ顕著に小さい値を示した。また、ＦＬＡＧペプチド塗布群はゼラチナーゼの発現及び創傷面積のいずれもが対照群との比較において有意な差は認められなかった。マウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬはマウス皮膚細胞におけるゼラチナーゼの発現を増強し、その結果として皮膚創傷の治癒を促進するものと判断された。
【実施例１４】
＜ヒト由来ポリペプチドのゼラチナーゼ発現増強及び創傷治癒促進作用＞
７週齢の雄ＣＤ−１マウス２２匹を麻酔し、背部皮膚を脱毛した後、それぞれの正中線の左に１５ｍｍの線状創２ヶ所を作製した。内１２匹について、創傷作製直後、１日後、２日後に創傷１ヶ所につき実施例５−３の方法で調製したヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬを１０μｇ（１０μｌの１０％グリセリン−ＰＢＳに溶解したもの）ずつ塗布した。また、残り１０匹についてはウシ血清アルブミン１０μｇ／１０μｌ−１０％グリセリンＰＢＳをそれぞれ同様に添加、塗布して対照とした。創傷作製７日後に創傷の大きさを測定した。また、マウス創傷部位におけるゼラチナーゼＡの発現を以下に示す免疫染色法にて評価した。まず、マウスの創傷部位の表皮組織を切り出し、１０％ホルマリンで固定した後、常法によりパラフィン包埋処理した。次いで、パラフィン切片を作製し、キシレンによる脱パラフィン処理後、水−アルコール混液で洗浄することにより段階的に有機溶媒濃度を下げて最終的にＰＢＳで洗浄した。続いて、０．３％の過酸化水素を含むメタノールで処理することにより内因性のパーオキシダーゼを失活させた後、ブロッキング剤（商品名「ブロックエースＴＭ」、大日本製薬（株）製）で室温で３０分間ブロッキングを行った。次いで、一次抗体として２５０倍希釈したマウス抗ヒトＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）抗体（第一ファインケミカル（株）製）を組織切片にのせ、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで一次抗体を洗い去り、続いてパーオキシダーゼでラベルしたヤギ抗マウスイムノグロブリン（商品名「ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ＴＭ」、ダコ・ジャパン（株）製）を二次抗体として室温で１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、パーオキシダーゼ発色試薬（Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ−Ｂｌａｃｋ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ、ザイメッド製）で発色処理を行った。水洗により発色を停止させ、常法によりヘマトキシリン（和光純薬工業（株）製）で核を染色した後、封入剤（商品名「エンテラン」、メルク（株）製）で封入処理し顕微鏡下で染色を観察した。免疫染色の結果は染色の程度を肉眼で観察し、「−」（染色されない）、「＋」（僅かに染色される）、「＋＋」（弱く染色される）及び「＋＋＋」（強く染色される）の４段階で評価した。結果を表４に示す。
表４の結果から明らかなように、創傷部におけるゼラチナーゼＡ蛋白の発現は、対照群では１０例中９例において１例が「＋＋＋」、５例が「＋＋」、３例が「＋」を示したのに対して、ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ塗布群では１２例中１１匹において６例が「＋＋＋」、４例が「＋＋」、１例が「＋」を示し、ヒト由来ポリペプチドの塗布によるゼラチナーゼＡ蛋白の発現増強作用が明らかに認められた。また、線状創の面積においてヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ塗布群は創傷７日後において６．０ｍｍ２と、対照群（ウシ血清アルブミン群）の１０．５ｍｍ２に比べ顕著に小さい値を示した。ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬはマウス皮膚細胞におけるゼラチナーゼの発現を増強し、その結果として皮膚創傷の治癒を促進するものと判断された。
【実施例１５】
＜ハムスター由来ポリペプチドによるハムスター骨髄細胞の増殖促進作用＞
ハムスター成獣（８週齢、雌）の大腿骨から調製した骨髄細胞を１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて１×１０６個／ｍｌの濃度に調製し、コラーゲンでコートした９６ウェルのマイクロプレートに、１００μｌずつ播きこんだ。次いで、実施例８の方法で得たハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬを同様に１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて１２．５、２５μｇ／ｍｌの各濃度に調製し、これを１００μｌずつ添加し、総液量２００μｌとした（ポリペプチドの終濃度は６．２５、１２．５μｇ／ｍｌとなる）。６日間培養した後に、酸化−還元インディケーターである色素（トレック・ダイアグノスティック（株）製、商品名『アラマー・ブルー（ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）』）を用いて５４４ｎｍを励起波長とし、５９０ｎｍを測定波長として蛍光強度を測定し、この蛍光強度を細胞増殖の指標として評価した。ポリペプチドを加えずに行ったものを対照とし、対照の蛍光強度を１００％としてポリペプチドを用いた場合の相対的な蛍光強度を相対細胞増殖率としてパーセントで表した。結果を表５に示した。
表５の結果から明らかなように、ポリペプチド濃度６．２５μｇ／ｍｌ及び１２．５μｇ／ｍｌのとき、骨髄細胞の増殖は対照を１００％とした場合、それぞれ約２２５％、３６８％であり、試験したハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬは用量依存的にハムスター骨髄細胞の増殖を促進した。本ポリペプチドはハムスターをはじめとする哺乳類由来の造血細胞の増殖を顕著に促進する生物作用を有している。
【実施例１６】
＜マウス由来ポリペプチドによるマウス骨髄細胞の増殖促進作用＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、雌）の大腿骨から調製した骨髄細胞を２０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むα最小培地（αＭＥＭ培地）を用いて７．６×１０６個／ｍｌの濃度に調製し、コラーゲンでコートした４ウェルのチャンバーに、１００μｌずつ播きこんだ。次いで、実施例９で得たマウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを同様に２０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むαＭＥＭ培地を用いて１００μｇ／ｍｌの濃度に調製し、これを１００μｌ添加し、総液量２００μｌとした（ポリペプチドの終濃度は５０μｇ／ｍｌとなる）。４日間培養した後、増殖した細胞を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、常法に従いメタノール処理した後、ギムザ染色を行った。次いで、この顕微鏡写真を撮影し、無作為に４視野を選択して細胞数を数え、１視野当たりの平均細胞数を算出した。ポリペプチドを加えずに同様に行ったものを対照とし、対照の細胞数を１００％としてポリペプチドを用いた場合の相対細胞数をパーセントで表した。結果を表６に示した。
表６の結果から明らかなように、ポリペプチド濃度５０μｇ／ｍｌの条件下で、骨髄細胞の増殖は対照を１００％とした時、約２６８％であり、試験したマウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬはマウス骨髄細胞の増殖を顕著に促進した。本ポリペプチドはマウスをはじめとする哺乳類由来の造血細胞の増殖を顕著に促進する生物作用を有している。
【実施例１７】
＜ハムスター由来ポリペプチドによるマウス骨髄細胞の増殖促進作用＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、雌）の大腿骨から調製した骨髄細胞を１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて１×１０６個／ｍｌの濃度に調製し、コラーゲンでコートした９６ウェルのマイクロプレートに、１００μｌずつ播きこんだ。次いで、実施例８で得たハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬを同様に１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて２５μｇ／ｍｌの濃度に調製し、これを１００μｌ添加し、総液量２００μｌとした（ポリペプチドの終濃度は１２．５μｇ／ｍｌとなる）。６日間培養した後、増殖した細胞を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、常法に従いメタノール処理した後、ギムザ染色を行った。次いで、この顕微鏡写真を撮影し、無作為に４視野を選択して細胞数を数え、１視野当たりの平均細胞数を算出した。ポリペプチドを加えずに同様に行ったものを対照とし、対照の細胞数を１００％としてポリペプチドを用いた場合の相対細胞数をパーセントで表した。結果を表７に示した。
表７の結果から明らかなように、ポリペプチド濃度１２．５μｇ／ｍｌの条件下で、骨髄細胞の増殖は対照を１００％とした時、約３７０％であり、試験したハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬは種の異なるマウス由来の骨髄細胞の増殖をも顕著に促進した。本ポリペプチドはハムスター、マウスをはじめとする哺乳類由来の造血細胞の増殖を顕著に促進する生物作用を有している。
【実施例１８】
＜ヒト由来ポリペプチドによるマウス骨髄細胞の増殖促進作用＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、雌）の大腿骨から調製した造血細胞を含む骨髄由来細胞を２０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて７．５×１０５個／ｍｌの濃度に調製し、コラーゲンでコートした８ウェルのチャンバースライド（ナルジェ ヌンク インターナショナル（株）製）に、２００μｌずつ播きこんだ。次いで、実施例５の方法で得たヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬの精製標品を同様に２０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて５μｇ／ｍｌの濃度に調製し、これを２００μｌ添加し、総液量４００μｌとした（細胞の終濃度は３．７５×１０５個／ｍｌポリペプチドの終濃度は２．５μｇ／ｍｌとなる）。３７℃、５％ＣＯ２存在下で６日間培養した後、増殖した細胞を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、常法に従いメタノール処理した後、ギムザ染色を行った。次いで、この顕微鏡写真を撮影し、無作為に１２視野を選択して細胞数を数え、１視野当たりの平均細胞数を算出した。ポリペプチドを加えずに同様に行ったものを対照とし、対照の細胞数を１００％としてポリペプチドを用いた場合の相対細胞数をパーセントで表した。結果を表８に示した。
表８の結果から明らかなように、ポリペプチド濃度２．５μｇ／ｍｌの条件下で、骨髄細胞の増殖は対照を１００％とした時、約１４４％であり、試験したヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬは種の異なるマウス由来の骨髄由来細胞の増殖を顕著に促進した。本ポリペプチドはヒト、マウスをはじめとする哺乳類由来の造血細胞の増殖を顕著に促進する生物作用を有している。
【実施例１９】
＜急性毒性試験＞
５％（ｗ／ｗ）アラビアガムを含む生理食塩水に、実施例５−３の方法で得たヒト由来ポリペプチド、実施例８−３の方法で得たハムスター由来ポリペプチド又は実施例９−３の方法で得たマウス由来のポリペプチドの適量をそれぞれ溶解した後、常法に従いろ過除菌した。これらを体重２０乃至２５ｇのｄｄＹマウス（１０匹／群）の腹腔内に注射投与するか、胃ゾンデにより経口投与した後、７日間に亙って経過を観察した。その結果、いずれの試料、いずれの投与経路によっても、試みた最大投与量である２０ｍｇ／ｋｇ体重においても死亡例が認められなかった。この結果は本発明のポリペプチドが、ヒトを含む哺乳類に常用しても安全な物質であることを示している。
【実施例２０】
＜マウス皮膚パッチテスト＞
実施例５で得たヒト由来ポリペプチド、実施例８の方法で得たハムスター由来ポリペプチド又は実施例１０の方法で得たマウス由来のポリペプチドの適量をそれぞれ生理食塩水に溶解した後、それぞれパッチテスト用絆創膏（大正製薬（株）製）の円形のろ紙に５０μｌ滴下した。これらを予め背部を常法通り脱毛クリームで脱毛した体重２０乃至２５ｇのｄｄＹマウス（１０匹／群）の皮膚に２４時間貼付した。次いで、貼付試料を除去し、３０分経過後に肉眼判定を行い、紅斑、浮腫、丘疹などの有無を調べた。その結果、いずれの試料によっても、試みた最大投与量である５０μｇ／パッチにおいても皮膚に異常は認められなかった。この結果は本発明のポリペプチドが、ヒトを含む哺乳類の皮膚に常用しても安全な物質であることを示している。
【実施例２１】
＜ポリクローナル抗体の調製＞
ＪＷウサギ（雌、体重２．５ｋｇ）を以下のスケジュールで免疫感作した。初回免疫として、常法により完全フロイントアジュバントとともに実施例５−３の方法で得たヒト由来組換えポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬを抗原として２００μｇ／匹の用量で皮下に注射投与した。その後２週間おきに、追加免疫として、不完全フロイントアジュバントとともに同じ抗原を同じ用量で皮下に計２回注射投与した。常法によりウサギの耳静脈より血液を採取し、その血液から分離した血清の該抗原との免疫反応性を常法により調べ、所期の抗体価の上昇を確認した。引き続いて抗原を、アジュバントを用いずに１００μｇ／匹の用量で静脈内に１回注射投与した。最終免疫の終了後７日目に頸動脈より全採血を行い抗血清を得た。なお、上記の操作により、ウサギの血清において所期の抗体価の上昇が確認されたことは、この血清が本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体を含む抗血清であることを示している。したがって、本実施例の方法によれば本発明のポリペプチドと反応するポリクローナル抗体を調製することができる。
本例のポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明のポリペプチドの生物作用を抑制・調節する上で有用である。
【実施例２２】
＜モノクローナル抗体の調製＞
８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを実施例７−３の方法で得たヒト由来組換えポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ｂＦＬを用いて免疫感作し、免疫感作したマウスより脾臓を摘出して抗体産生細胞を得た。次いで、抗体産生細胞とマウス骨髄腫由来のＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）を無血清培地に浮遊させ、両細胞を十分に混和した。洗浄した細胞を常法により細胞融合させ、ハイブリドーマを選択的に培養した結果、本発明のポリペプチドに対して免疫反応性を示す培養上清液が認められた。ハイブリドーマを採取し、限界希釈法を適用してハイブリドーマのクローンを樹立した。樹立したハイブリドーマを常法にしたがって培養し、分析したところ、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するものであった。
本例のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明のポリペプチドの生物作用を抑制・調節する上で有用である。
【実施例２３】
＜ポリクローナル抗体の調製＞
免疫感作に用いる抗原として実施例９−３の方法で得たマウス由来組換えポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを用いた以外は実施例２１と同様に操作して組換えポリペプチドに対するポリクローナル抗体を含む抗血清を得た。
本例のポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明のポリペプチドの生物作用を抑制・調節する上で有用である。
【実施例２４】
＜モノクローナル抗体の調製＞
免疫感作に用いる抗原として実施例９−３の方法で得たマウス由来組換えポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを用い、ラットを免疫した以外は実施例２２と同様に操作し、ハイブリドーマのクローンを樹立した。樹立したハイブリドーマを常法にしたがって培養し、分析したところ、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するものであった。
本例のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明のポリペプチドの生物作用を抑制調節する上で有用である。
【実施例２５】
＜抗体の血管内皮細胞の増殖抑制作用＞
ＣＤ−１マウス（８週齢、雄）を麻酔し、背部大動脈を無菌的に取り出した。得られた大動脈をＰＢＳで洗浄した後、滅菌したメスで幅約１ｍｍの輪状に細切りした。次いで、この大動脈片をゼラチンコートした６穴プレート内に静置し、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地で常法により２４時間培養した。培養後、培地を除去し、実施例２４の方法で得たマウスポリペプチドに対するモノクローナル抗体を５μｇ／ｍｌ含む内皮細胞増殖用無血清培地を新たに加え、さらに１０日間培養した。抗体を含まない培地を用い同様に処理したものを対照とした。培養後、血管内から増殖して出てくる内皮細胞の増殖性を、位相差顕微鏡を用いて肉眼観察した。その結果、抗体を添加した試験群では対照に比べ内皮細胞の増殖が明らかに抑制されていた。本発明の抗体は血管新生を抑制する作用を有する可能性があり、血管新生による癌や癌転移による疾患に有用である。
【実施例２６】
＜抗体の皮脂産生抑制作用＞
ＣＤ−１マウス（５週齢、雄）の背部皮膚から常法により皮脂細胞を調製した。この皮脂細胞を、６％ＦＣＳと２％ヒト血清を含むＤ−ＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ１２（１：１）混合培地を用いて１×１０３個／ｃｍ２に調整し、径６０ｍｍのディッシュに播きこんだ。これに、実施例２４の方法で得たマウスポリペプチドに対するモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、常法により１４日間培養した。抗体を含まない培地を用い同様に処理したものを対照とした。培養後、回収した皮脂細胞にＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調整したナイルレッド染色液を加え、暗所にて室温で２０分間反応させた。反応終了後、フローサイトメトリー分析により、細胞内に脂肪球（主にトリグリセリド、遊離脂肪酸、コレステロール、ワックスエステル類などから構成される）を形成した細胞の割合を調べた。その結果、抗体を添加した群は対照群に比べ皮脂細胞内に形成される脂肪球を形成する割合が低いことが分かった。このことから、本発明の抗体は皮脂細胞における脂肪球の生成を抑制しニキビなどの皮膚炎の緩和に有用である。
【実施例２７】
＜キメラ抗体及びヒト化抗体＞
キメラ抗体としての形態の本発明の抗体は以下のようにして調製する。まず、実施例２２の方法で得た本発明のヒト由来ポリペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンを常法に従って培養し、バイオテクス社製のＲＮＡ調製用試薬『ウルトラスペック ＬＳ ＩＩ』などを用いて常法によりハイブリドーマ由来の全ＲＮＡを調製し、この全ＲＮＡを用いて常法通り逆転写酵素を作用させｃＤＮＡを得る。次いで、エス・タラン・ジョーンズら、『バイオテクノロジー』、第９巻、８８乃至８９頁（１９９１年）に記載されたＰＣＲプライマーを参考にしてＰＣＲプライマーを設計し、抗体の軽鎖における可変領域をコードするｃＤＮＡ断片と抗体の重鎖における可変領域をコードするｃＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲにより増幅する。次いで、それぞれのＰＣＲ産物より、増幅されたｃＤＮＡをポリエチレングリコール沈殿などにより回収し、『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）』などのプラスミドベクターにクローン化する。この得られたベクターを用いて大腸菌を形質転換し、形質転換体を培養して菌体を採取し、次いで、菌体から組換えＤＮＡを採取する。通常のジデオキシ法により抗体の軽鎖における可変領域をコードするｃＤＮＡ及び抗体の重鎖における可変領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列を解読し、コードしているアミノ酸配列を解明する。次いで、明らかにしたアミノ酸配列とマウス抗体についてすでに報告されている可変領域のアミノ酸配列とを比較・照合することにより本発明のマウス抗体における軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定する。
引き続き、ヒトイムノグロブリンの軽鎖（κ鎖）の定常領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡを、ピー・エー・ハイターら、『セル』、第２２巻、１９７乃至２０７頁（１９８０年）に記載の方法に従って、ヒト遺伝子ライブラリーより単離する。次に、単離したＤＮＡを鋳型として、通常のＰＣＲにより、実質的に軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡのみからなるＤＮＡ（「ヒト軽鎖定常領域ＤＮＡ」という。）を得る。引き続いて、前記でクローン化したマウス抗体の軽鎖における可変領域をコードするＤＮＡ（「マウス軽鎖可変領域ＤＮＡ」という。）を得る。これらのヒト軽鎖定常領域ＤＮＡ及びマウス軽鎖可変領域ＤＮＡを鋳型として、ロバート・エム・ホートンら、『メソッズ・インエンザイモロジー』、第２１７巻、２７０乃至２７９頁（１９９３年）に記載の『オーバーラップ・エクステンション法』を適用して、マウス軽鎖可変領域ＤＮＡの下流にヒト軽鎖定常領域ＤＮＡが連結され、５′末端及び３′末端部分に制限酵素認識配列を含んでなるＤＮＡを得る。一方、発現ベクターとして、『ｐＳＶ２−ｎｅｏ』（ＡＴＣＣ ３７１４９）などのような、大腸菌における複製開始点、哺乳類の細胞内で機能するプロモーター及び／又はエンハンサー、それらの制御下に位置する制限酵素認識配列、選択配列などを含むＤＮＡを準備する。この発現ベクターと、上記で得たヒト軽鎖定常領域ＤＮＡ及びマウス軽鎖可変領域ＤＮＡを含むＤＮＡとを、それぞれ制限酵素で切断した後、混合し、リガーゼを用いて連結して、キメラ抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡを得る。
これとは別途、ＩｇＧのクラスに属するヒトイムノグロブリンの重鎖（γ鎖）の定常領域をコードするＤＮＡを、エヌ・タカハシら、『セル』、第２９巻、６７１乃至６７９頁（１９８２年）に記載の方法に従って、ヒト遺伝子ライブラリーより単離する。単離したＤＮＡにおいて、重鎖の定常領域をコードする部分は、当該論文に記載のとおり、４個の独立したエクソンからなる。単離したＤＮＡを錆型として、前記『オーバーラップ・エクステンション法』を適用して、４個のエクソンを連結してなるＤＮＡ（「ヒト重鎖定常領域ＤＮＡ」という。）を得る。引き続いて、前記でクローン化したマウス抗体の重鎖における可変領域をコードするＤＮＡ（「マウス重鎖可変領域ＤＮＡ」という。）を得る。これらのヒト重鎖定常領域ＤＮＡ及びマウス重鎖可変領域ＤＮＡを鋳型として、前記『オーバーラップ・エクステンション法』を適用して、マウス重鎖可変領域ＤＮＡの下流にヒト重鎖定常領域ＤＮＡが連結され、５′末端及び３′末端部分に制限酵素認識配列を含んでなるＤＮＡを得る。一方、発現ベクターとして、『ｐＳＶ２−ｇｐｔ』（ＡＴＣＣ ３７１４５）などのような、大腸菌における複製開始点、哺乳類の細胞内で機能するプロモーター及び／又はエンハンサー、それらの制御下に位置する制限酵素認識配列、選択配列などを含むＤＮＡを準備する。この発現ベクターと、上記で得たヒト重鎖定常領域ＤＮＡ及びマウス重鎖可変領域ＤＮＡを含むＤＮＡとを、それぞれ制限酵素で切断した後、混合し、リガーゼを用いて連結して、キメラ抗体の重鎖をコードするＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡを得る。
次に、以上の、キメラ抗体の軽鎖と重鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ含んでなる組換えＤＮＡを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）などの哺乳類の株化細胞にエレクトロポレーション法により同時に導入する。ＤＮＡの導入の結果得られる細胞群を、発現ベクターにおける選択配列に基づいて選択し、選択された細胞をそれぞれ培養する。それぞれの培養上清につき、実施例１１又は実施例１８に記載の方法により本発明のヒト由来ポリペプチドの生物作用の中和能の有無を調べる。所期の中和能が認められた培養上清の由来する細胞に限界希釈法を適用し、単一細胞とし、キメラ抗体の形態の本発明の抗体を産生する形質転換体を得る。この形質転換体を、培養規模を拡大しつつ培養して、その培養上清から、通常の抗体の精製方法に従って抗体を精製し、キメラ抗体の形態の本発明の抗体を得る。かくして得られる本発明の抗体は本発明のポリペプチドに対するマウス抗体と同様に、効果的に本発明のヒト由来ポリペプチドの中和能を発揮する。また、本キメラ抗体の枠組構造と相同性を有するヒト起源の抗体の枠組構造を、データベースを用いて検索し、相同性の認められたヒト起源の枠組構造と同様のアミノ酸配列を有するよう、本実施例におけるＤＮＡを改変し、発現させれば、ヒト起源の枠組み構造を有するヒト化抗体としての抗体が得られる。さらに、斯くして得られるヒト化抗体のアミノ酸配列に基づいて、慣用の蛋白構造解析用のソフトウェアを用いて立体構造を予測し、元のモノクローナル抗体のアミノ酸配列から同様にして予測される立体構造と比較し、元のマウス抗体により近い立体構造を持つようにさらにＤＮＡを改変し、発現させれば、元のマウスモノクローナル抗体と実質的に同等の機能を有するヒト化抗体が得られる。本実施例にしたがって得られるキメラ抗体並びに、斯かる抗体を改変して得られるヒト化抗体は、感受性疾患の治療に有用である。
【実施例２８】
＜液状組成物＞
生理食塩水に実施例５の方法で調製した組換え型融合ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を０．１質量％及びヒト血清アルブミンを０．１質量％になるよう溶解した後、溶液を常法に従って精密濾過により滅菌して液状の組成物を得た。
本品は、創傷や炎症などの皮膚の障害部位に適用すると細胞におけるゼラチナーゼの発現を増強し、皮膚の創傷治療やアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎などの各種皮膚障害を改善するための外用剤などとして有用である。また、造血細胞の培養時に培地に添加すると造血細胞の増殖を顕著に促進することから骨髄移植時などにおける造血細胞の増幅などに有用である。
【実施例２９】
＜皮膚外用クリーム＞
以下の成分を、以下の配合に従って、常法により加熱しつつ混合した。
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン
２．０質量部
自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ５．０質量部
ベヘニン酸エイコサニル １．０質量部
流動パラフィン １．９質量部
トリオクタン酸トリメチロールプロパン １０．０質量部
上記の混合物に、液状組成物を除く以下の成分を以下の配合に従って添加・混合し、３０℃以下にまで冷却した後に、さらに実施例２８で得た液状組成物を以下の配合で加え、ホモジナイザーによリ乳化して、皮膚外用クリームを製造した。
１，３−ブチレングリコール ５．０質量部
乳酸ナトリウム液 １０．０質量部
パラオキシ安息香酸メチル ０．１質量部
モモ葉エキス １．５質量部
精製水 ５２．２質量部
実施例２８の方法で得た液状組成物 １０．０質量部
本クリームは、優れた保湿性を示す上、皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現を増強することから、創傷の治癒を促進し、皮膚炎などの症状を緩和するための皮膚外用クリームとして有用である。
【実施例３０】
＜液剤＞
安定剤として高純度含水結晶トレハロース（（株）林原商事販売、登録商標「トレハ」）を１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水に、実施例２２の方法で調製した抗体を濃度１ｍｇ／ｍｌになるよう溶解し、常法によりパイロジェンを除去し、精密濾過により除菌して液剤を得た。安定性に優れた本品は、本発明のポリペプチドによる皮膚細胞におけるゼラチナーゼの過剰発現や造血細胞の過剰増殖の抑制剤として有用である。
【実施例３１】
＜乾燥注射剤＞
安定化剤としてスクロースを１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水１００ｍｌに実施例２７の方法に従って得られるヒト化抗体１００ｍｇを溶解し、常法に従って精密濾過により除菌した後、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥した後、密栓する。
安定性に優れた本品は、感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。また、本品は血管新生抑制剤や皮脂産生抑制剤として有用である。
【産業上の利用可能性】
本発明のポリペプチドは、哺乳類の皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現増強作用を有しており、皮膚の創傷を治療するため、又は紫外線による皮膚炎、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎などの様々な皮膚障害を改善するため、さらには再生医療のための医薬品などとして極めて有用である。また、化粧品として利用する場合には、皮膚疾患に対する治療効果の改善などに奏効する。また、本発明のポリペプチドは造血細胞の増殖を顕著に促進する作用を有しており、研究用途をはじめ、医薬品の分野では化学療法・放射線療法による癌治療時、骨随移植時、生体外での造血細胞の増幅時の造血細胞増殖促進剤などとして用いることができる。一方、本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明の抗体は皮膚細胞におけるゼラチナーゼの過剰発現や、造血細胞の過剰増殖を抑制する目的で用いることができる。さらには、本発明の抗体は感受性疾患の冶療・予防剤としても用いることができる。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【技術分野】
本発明は生理活性ポリペプチドとその抗体及びそれらの用途に関するものである。
【背景技術】
ヒトに代表される多細胞生物は、体組織が傷を負ったり、火傷などの皮膚細胞の炎症が起こった際にその創傷を自ら治癒し、体組織を修復する能力を有している。このような能力を何らかの手段で増強することができれば、傷の早期修復、治療が可能となり、その手段は医療をはじめとする幅広い分野において有用なものとなり得る。
細胞の発生分化、組織形成や形態変化あるいは創傷治癒や組織修復にはマトリックスメタロプロテアーゼ（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ＭＭＰ））が極めて重要な役割を果たしていることが知られている（例えば、岡本竜哉、『マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性化機構』、生化学、１９９９年、第７１巻、第１２号、１３８７乃至１４０１頁などを参照）。ＭＭＰは中性ｐＨ環境下で細胞外マトリックス構成蛋白質を加水分解する亜鉛要求性蛋白質分解酵素の総称であって、結合組織細胞（線維芽細胞）、上皮細胞、炎症細胞及び転移癌細胞などにより産生され、現在までに２６種以上の酵素が報告されている。ＭＭＰの１種であるゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）は、ゼラチンや上皮細胞層と結合組織の間に存在する基底膜の主要成分であるＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン及びエラスチンを分解する作用を有している。ゼラチナーゼＡは線維芽細胞や単球系細胞において微量ながら継続的に発現されており、表皮細胞の伸張や癌組織での血管新生を抑制する生理作用を有している。ゼラチナーゼＡをはじめとするゼラチナーゼの発現を効果的に増強できる因子は創傷治癒や組織再構築においてその有用性が期待できるものの、このような因子は従来知られていなかった。
一方、近年、白血病や再生不良性貧血などの血液疾患を治療する目的で、健常者の骨髄細胞を患者へ移植し、新しい、新鮮な血液を作り出す骨髄移植が頻繁に行われるようになった。周知のとおり、骨髄移植は、患者と骨髄提供者における組織適合抗原の型が一致しなければならないことから、欧米においては、骨髄を提供する意志がある健常者の氏名と、その組織適合抗原の型をあらかじめ登録しておく「骨髄バンク」の組織作りが早くから始まり、我が国においても、１９９０年、「骨髄バンク連絡協議会」が発足し、全国的なネットワーク作りが始まった。しかしながら、骨髄移植は、骨髄提供者に対して、心身両面で少なからぬ負担を強いることから、骨髄提供の意志を事前に表明していた健常者であっても、実際に骨髄提供を要請されると、提供を躊躇したり、断ったりするケースが多々あり、その結果として、医療の現場においては、必要なときに必要な骨髄を入手できない状況にあると言われている。
骨髄移植におけるこの問題を解決するために、健常な骨髄細胞を一旦生体から取り出し、これを生体外で増殖させた後、患者へ移植する方法が鋭意検討されている。この方法が実用化すれば、骨髄の確保が容易になるというだけではなく、骨髄提供者から取り出す骨髄の量を大幅に少なくすることができることから、骨髄提供者における心身の負担を軽減したり、骨髄提供そのものの安全性を著しく改善できるものと期待される。
現在、斯界においては、幹細胞因子、Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３リガンド、インターロイキン６、トロンボポエチン、インターロイキン３などのサイトカイン類を用いる造血細胞の増殖が鋭意試みられているけれども、これらのサイトカインはいずれも造血細胞の増殖のみならず、造血幹細胞の分化を誘導する性質をも具備することから、未だこの方法によって所望量の造血細胞を獲得できるにはいたらない状況にある（例えば、『造血幹細胞をめぐる研究の新展開‘９９−２０００幹細胞発生・分化の新事実と治療への応用』、実験医学（増刊）、１９９９年、羊土社、第１７巻、第５号、１４９乃至１５０頁などを参照）。
【発明の開示】
斯かる状況に鑑み、本発明の目的は、哺乳類の皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現を効果的に増強又は調節する手段を提供することにある。
また、本発明の別の目的は、哺乳類の造血細胞の増殖を効果的に促進又は調節する手段を提供することにある。
本発明者が哺乳類皮膚細胞又は胎盤細胞に由来するＤＮＡに着目し、そのＤＮＡがコードする生理活性ポリペプチドについて鋭意研究したところ、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドは、生体外で哺乳類の皮膚細胞へ作用させると、ゼラチナーゼの発現を顕著に増強することを見出し、さらに、生体の皮膚の創傷部に塗布すると、細胞におけるゼラチナーゼの発現を増強し、また、創傷の治癒を促進することを見出した。一方、当該ポリペプチドを生体外で哺乳類由来の造血細胞へ作用させると、その増殖を著明に促進することを見出した。さらに、本発明者は、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡの解明、ポリペプチドの製造方法、さらには、斯かるポリペプチドに対する抗体を確立し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列において、前記した所期の生物作用を実質的に失わない範囲でアミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供することによって上記課題を解決するものである。
さらに、本発明は、斯かるポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することによって前記課題を解決するものである。
さらに、本発明は、斯かるポリペプチドを産生し得る細胞又は微生物を培養する工程と、産生したポリペプチドを培養物から採取する工程とを含んでなるポリペプチドの製造方法を提供することによって前記課題を解決するものである。
さらに、本発明は、斯かるポリペプチドに対する抗体を提供することによって前記課題を解決するものである。
さらに、本発明は、配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列における連続する１０個以上のアミノ酸残基からなるペプチド断片を提供することによって前記課題を解決するものである。
本発明は、哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現を増強するか、及び／又は、造血細胞の増殖を促進するポリペプチドの発見に基づくものである。本発明のポリペプチドは、皮膚細胞において顕著なゼラチナーゼ発現増強能を発揮するので、皮膚における創傷の早期修復・治療及び再生医療において有用である。また、本発明のポリペプチドは、ヒトをはじめとする哺乳類の造血細胞の増殖を効果的に促進するので、研究用途をはじめ、医薬品の分野で化学療法・放射線療法による癌治療時、骨随移植時、生体外での造血細胞の増幅時の造血細胞増殖促進剤などとして有用である。さらに、本発明の抗体は上記ポリペプチドの精製、検出はもとより、本発明のポリペプチドが有する生物作用の調節、抑制に有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は発現ベクターｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ａＦＬの構造を示す図である。
第２図は発現ベクターｐＶＬ１３９３−ｈＡｇＫ１１４ａＦＬの構造を示す図である。
第３図は発現ベクターｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ｂＦＬの構造を示す図である。
第４図は発現ベクターｐＲＥＲ−ｈａｍＡｇＫ１１４ｄ２ＦＬの構造を示す図である。
第５図は発現ベクターｐＲＥＲ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬの構造を示す図である。
第６図は発現ベクターｐＲＥＲ−ｍＡｇＫ１１４ｂの構造を示す図である。
【符号の説明】
ｈＡｇＫ１１４−１ａ ｃＤＮＡ：配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ｈＡｇＫ１１４−１ｂ ｃＤＮＡ：配列表における配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ＦＬＡＧ：ＦＬＡＧペプチドをコードするＤＮＡ
ＳＶ４０ ｉｎｔｒｏｎ／ｐＡ：シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）スプライス、ポリＡ付加シグナル
Ｐｏｌｙｏｍａ ｏｒｉ：ポリオーマウィルスＤＮＡ複製起点とエンハンサー
ＳＶ４０ ｏｒｉ：ＳＶ４０ＤＮＡ複製起点（エンハンサーを含まない）
ＣｏｌＥ１：コリシンＥ１
Ｍ１３ ｏｒｉ：Ｍ１３ファージＤＮＡ複製起点
ＳｕｐＦ：アンバーサプレッサー遺伝子
ＰＣＭＶ：サイトメガロウィルスプロモーター
ｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ ＤＮＡ：配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ｍＡｇＫ１１４−１ ＤＮＡ：配列表における配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ｍＡｇＫ１１４−１ｂ ＤＮＡ：配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ｐｏｌｙＡ：ポリＡ付加シグナル
Ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子
Ｎｅｏ：ネオマイシン耐性遺伝子
ＥＦ−１α ｐｒｏｍｏｔｅｒ：延長因子１αプロモーター
ｄｈｆｒ：デヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
Ｐｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ：ポリヘドリンプロモーター
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列において、生物作用を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに関するものである。本発明でいうポリペプチドは、それが上記した部分アミノ酸配列を有し、且つ、生体において皮膚細胞のゼラチナーゼ発現増強作用若しくは造血細胞の増殖促進作用を発揮するものであるかぎり、その純度、由来、調製方法は問わない。なお、本発明において皮膚細胞とは上皮細胞、線維芽細胞、間葉系細胞などの皮膚細胞を意味し、造血細胞とは造血幹細胞や造血系前駆細胞を含む細胞を意味する。より具体的なポリペプチドとしては、例えば、配列表における配列番号４乃至１０のいずれかに示すアミノ酸配列を有するものが挙げられ、斯かるアミノ酸配列を有するポリペプチドはいずれも生体において皮膚細胞のゼラチナーゼ発現増強作用若しくは造血細胞の増殖促進作用が顕著であり、この発明において極めて有用である。なお、配列表における配列番号１、２及び３に示されるアミノ酸配列はそれぞれ配列表における配列番号４及び５、配列番号６及び７、及び、配列番号８乃至１０で示されるアミノ酸配列に共通する部分アミノ酸配列であり、配列表における配列番号４及び５、配列番号６及び７、配列番号８乃至１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドがそれぞれ所期の生物作用を有することから、これらに共通する部分アミノ酸配列である配列表における配列番号１乃至３は所期の生物活性の発現に深く関与しているものと考えられる。配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するこれらのポリペプチドは単なる例であって、本発明でいうポリペプチドは決してこれらに限定されてはならず、例えば、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドにおいて、ゼラチナーゼ発現増強作用若しくは造血細胞増殖促進作用を実質的に失わない範囲でその構成するアミノ酸の１個又は２個以上が欠失するか、他のアミノ酸で置換されるか、さらには、アミノ酸の１個又は２個以上が付加された変異体であってもよい。このような変異体としては、生物作用を実質的に失わない範囲で、例えば、アラニンなどを１個乃至１０個欠失させるか、あるいは斯かるアラニンなどの一部又は全部を、例えばグリシンなどの他のアミノ酸で置換してなるアミノ酸配列、さらには、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示されるアミノ酸配列におけるＮ末端、Ｃ末端又は内部に、１乃至６０個のアミノ酸が付加してなるアミノ酸配列を有するものが挙げられ、部位特異的変異やランダム変異などのプロテインエンジニアリングの手法を用いて得ることができる。なお、哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現を増強する作用の有無は、例えば、ヒト新生児由来の線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ハムスター由来線維芽細胞、若しくはマウス由来間葉系細胞を対象ポリペプチドの存在下又は非存在下で培養した後、それぞれの培養物上清中におけるゼラチナーゼの発現量を酵素活性測定や免疫学的測定方法などによって判定することができる。また、哺乳類の造血細胞の増殖を促進する作用の有無は、例えば、骨髄由来の造血細胞を対象ポリペプチドの存在下又は非存在下で培養した後、それぞれの培養物における造血細胞の個数を比較するなどの方法によって判定することができる。
本発明のポリペプチドは、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するか、又は配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列において、生物作用を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有しており、哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現を増強するか若しくは造血細胞の増殖を促進する限り、いかなるポリペプチドであろうと包含され、例えば、組換えＤＮＡ技術により創製されたポリペプチド、天然の給源由来のポリペプチド、又は化学的に合成されたポリペプチドなどのいずれであってもよく、さらには、当該ポリペプチドを、例えば、平均分子量５，０００乃至１０，０００のデキストラン、プルラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性の天然高分子若しくは合成高分子を結合させるなどして人為的に化学修飾したものであってもよい。
本発明のポリペプチドの内、配列表における配列番号１で示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドは本来、ヒト由来のポリペプチドであり、また、配列表における配列番号２及び３に示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチドはそれぞれハムスター由来及びマウス由来のポリペプチドである。これらの部分アミノ酸配列を有するポリペプチドは、それぞれをコードするＤＮＡを用い、組換えＤＮＡ技術により斯かるポリペプチドの産生能を有する形質転換細胞や形質転換微生物を作製し、培養して細胞又は菌体内外に当該ポリペプチドを産生させ、製造することができる。本発明におけるＤＮＡとは、前記本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡを意味する。本発明のＤＮＡの一例としては、配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む配列表における配列番号１１乃至１７のいずれかで表される塩基配列か、コードするアミノ酸配列を変えない範囲で配列表における配列番号１１乃至１７のいずれかで表される塩基配列の１個又は２個以上の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、あるいはそれらに相補的な塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。上記の本発明のポリペプチドの変異体をコードするＤＮＡも勿論含まれる。
本発明のＤＮＡは、それが天然に由来するものか人為的に合成されたものであるかは問わない。本発明のＤＮＡの、天然の給源としては、例えば、ヒトの胎盤細胞、ハムスターの皮膚細胞、及びマウスの皮膚細胞が挙げられ、それらの細胞からは本発明のＤＮＡを含む遺伝子が得られる。すなわち、例えば、ヒトの胎盤細胞を破砕後、蔗糖密度勾配超遠心分離などにより分画して全ＲＮＡを調製し、この全ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース、オリゴ（ｄＴ）ラテックスなどで処理してｍＲＮＡを単離する。このｍＲＮＡを鋳型に逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを作用させて二重鎖ｃＤＮＡとし、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。これを自律複製可能な適宜のクローニングベクターに挿入し、得られた組換えクローニングベクターを大腸菌などの適宜の宿主に導入して形質転換体とする。この形質転換体を栄養培地で培養し、培養物にコロニーハイブリダイゼーション法を適用して本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体を採取する。斯くして得られた形質転換体を通常一般の方法により処理すれば、本発明のＤＮＡを得ることができる。現在では各種細胞由来のｃＤＮＡライブラリーが市販されており、このような市販のライブラリーを利用することもできる。一方、本発明のＤＮＡを人為的に合成するには、例えば、配列表における配列番号１１乃至１７のいずれかで示される塩基配列に基づいて化学合成するか、配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを自律複製可能な適宜ベクターに挿入して組換えベクターとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を分離し、その菌体から当該ＤＮＡを含むベクターを採取すればよい。
斯かるＤＮＡは、通常、斯かるＤＮＡを含んでなる発現ベクターの形態で宿主に導入される。発現ベクターは、通常、ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなり、ＤＮＡが入手できれば、通常一般の組換えＤＮＡ技術により比較的容易に調製することができる。斯かるベクターの例としては、例えば、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−λ、ｐＢＴｒｐ２、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢｌ１２１、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶなどのプラスミドベクターが挙げられ、このうち、本発明のＤＮＡを大腸菌、枯草菌、酵母などの微生物で発現させるにはｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＲＬ−１３８、ｐＢＴｒｐ２、ｐＵＢ１１０、ＹＥｐ１３が、また、動植物由来の細胞で発現させるにはＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、ｐＢｌ１２１、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶが好適である。
斯かるベクターに本発明のＤＮＡを挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、本発明のＤＮＡを含む遺伝子とベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断し、次に、生成したＤＮＡ断片とベクター断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＩＩ型の制限酵素、詳細には、Ｓａｕ ３ＡＩ、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｅｃｏ ＲＶ、Ｈｉｎ ｄＩＩＩ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｐｓｔ Ｉなどを使用すれば、ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。ＤＮＡ断片とベクター断片を連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られた本発明に用いる発現ベクターは、適宜宿主に導入して形質転換体とし、これを培養することにより無限に複製可能である。
上記のような本発明のＤＮＡを導入する宿主細胞としては、形質転換体の作製に斯界で慣用される、大腸菌、枯草菌、酵母、黴などの適宜の微生物や、さらには、昆虫などの無脊椎動物、植物、脊椎動物などの細胞のいずれも用いることができる。形質転換体を得るためには、宿主が大腸菌や枯草菌の場合には、宿主を発現ベクターとカルシウムイオンの存在下で培養するか、コンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。一方、宿主が動物細胞の場合には、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、ウィルス感染法、更には必要に応じてＤＥＡＥ−デキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などを適宜適用すればよい。斯くして生成される形質転換体から目的とするクローンを選択するには、導入されたＤＮＡの有無や本発明のポリペプチドの産生能を指標として試験すればよい。なお、以上述べたベクター及び形質転換体に関しては、ジェイ・サムブルック等、『モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュアル』、第３版（２００１年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー発行）などに慣用の材料及び方法が種々詳述されている。
形質転換体の培養に用いる培地には、宿主細胞やベクターの種類にもよるけれども、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の培地を使用することができる。個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖、トレハロースなどの糖源が、又、窒素源としては、例えば、アンモニア乃至アンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカー、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。宿主細胞やベクターの種類にもよるけれども、通常、２０乃至６０℃、ｐＨ２乃至１０に保ちつつ、約１乃至６日間培養すれば、本発明のポリペプチドを含む培養物が得られる。
本発明のポリペプチドを天然の給源を用いて製造するには、例えば、本発明のポリペプチドを産生し得る細胞を培養し、培養物から目的とするポリペプチドを採取すればよい。個々の細胞としては、ヒト由来の細胞である、例えば、子宮頚部癌由来の株化細胞であるＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）細胞、前立腺癌由来の株化細胞であるＰＣ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４３５）細胞、胆管由来の株化細胞であるＨｕＣＣＴ１（ＪＣＲＢ ０４２５）細胞、肺癌由来の株化細胞であるＣａｌｕ−３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−５５）細胞、口腔内類表皮癌由来の株化細胞であるＫＢ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１７）細胞などが、ハムスター由来の細胞である、例えば、卵巣由来上皮細胞であるＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）細胞、腎臓由来線維芽細胞であるＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）細胞などが、及び、マウスの細胞である、例えば、ＮＩＨ−３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）細胞などが挙げられる。
上記の細胞は、動物細胞の培養に斯界で一般に用いられる固相培養法、液体培養法により増幅することができる。また、本出願人と同じ出願人による特開昭５４−９８３０７号公報に開示されているインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）細胞増殖法によりヒト以外の温血動物の体内で増幅することができる。
前記インビボ細胞増殖法を用いて本発明のポリペプチド産生能を有する哺乳類由来の細胞を増幅する場合、使用する温血動物は、哺乳類由来の細胞が増殖しうるものであればよく、例えば、ニワトリ、ハトなどの鳥類、イヌ、ネコ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ラット、ハムスター、普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳類などが使用できる。増殖させた哺乳類由来の細胞は、例えば、腹腔内の腹水に浮遊して増殖した細胞を採取し、又は、皮下で増殖した腫瘤を摘出し、分散させた後、採取し、必要に応じて増強剤などの存在下で培養して本発明のポリペプチドを産生させればよい。
また、本発明のポリペプチドは、配列表における配列番号１乃至３若しくは配列番号４乃至１０のいずれかに示されるアミノ酸配列に従い化学的に合成することにより調製することもできる。ペプチド合成法としては斯界で一般に用いられるペプチド自動合成装置を用いて全合成する方法か、又は、予めペプチド断片をいくつかのブロックに分けて合成しておき、酵素的に縮合させて目的とするポリペプチドを得る方法のいずれもが、必要に応じて、有利に実施できる。
組換えＤＮＡ技術による調製、天然の給源からの調製、又はペプチド合成法による調製のいずれかによって得られる本発明のポリペプチドの粗調製品は哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現増強剤若しくは造血細胞増殖促進剤としてそのまま使用可能ではあるものの、通常は使用に先立ち、必要に応じて、精製して用いる。本発明のポリペプチドの精製には、細胞又は菌体破砕物を除去した培養物に、例えば、濃縮、塩析、透析、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの生理活性ポリペプチドを精製するための斯界における通常一般の方法が採用でき、必要に応じて、これら方法を適宜組合せればよい。そして、最終使用形態に応じて、精製したポリペプチドを濃縮・凍結乾燥して液状若しくは固状にすればよい。
また、本発明のポリペプチドを用いて、本発明のポリペプチドに対する抗体を調製することができる。本発明の抗体は上記本発明のポリペプチドに対するイムノグロブリン全般を包含し、特定の起源・クラス・形態（ポリクローナル及びモノクローナル）に限定されるものではない。本発明の抗体は該ポリペプチド配列の一部又は全部を含むポリペプチドで免疫感作した温血動物あるいはその培養細胞から得ることができる。本発明でいう、温血動物あるいはその培養細胞から得ることができる、とは、本発明の抗体が、所望のポリペプチドで免疫感作した温血動物から得られた抗体そのものと、調製方法に関わらず、該温血動物から得られた抗体と免疫反応性（後述）において同等の性質を有するイムノグロブリンを包含することを意味する。さらに、本発明の抗体は蛋白質工学によって得られた、例えば、ヒト化抗体、キメラ抗体、さらにはイムノグロブリン遺伝子をヒト由来のものに置き換えたジェノマウスなどを用いたヒト抗体などの抗体も包含する。ここでいう免疫反応とは、抗体と該抗体によって認識され得る物質との間の結合反応、すなわち、通常、抗原抗体反応とも呼ばれる反応を意味し、免疫反応性とは、斯かる免疫反応の強度を意味する。
免疫感作は慣用の方法によればよく、例えば、本発明のポリペプチド又はその断片を抗原として単独か、あるいは適宜アジュバントとともに温血動物の静脈、皮内、皮下又は腹腔内に注射接種し、その後一定期間飼育する。免疫感作の対象とする温血動物に特に制限はなく、所期の抗体を産生し得るかぎり、温血動物の種類、雌雄などにかかわりなく本発明の抗体の調製に利用できる。通常、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモットなどの齧歯類、ヤギ、ヒツジなどの偶蹄類を含む哺乳物や、ニワトリ、ウズラなどのキジ類を含む鳥類などが用いられ、用いる抗原の起源や調製する抗体の形態・用途などを勘案して最適のものを選択すれば良い。齧歯類を免疫感作する場合、通常、抗原の総接種量を約５乃至５００μｇ／匹とし、これを約１乃至４週間の間隔をおいて２乃至２０回に分けて接種する（一般に、初回の接種は「初回免疫」、２回目以降の接種は「追加免疫」、最後の接種は「最終免疫」と呼ばれる。）。そして、通常、免疫感作の期間中及び／又は終了後に、免疫感作に用いたのと同じ抗原を使用して酵素抗体法など慣用の方法により免疫感作動物における抗体価の上昇を確認する。
本発明の抗体の一形態であるポリクローナル抗体（抗血清）を得るには、上記のような免疫感作の後、通常、１乃至４週間程度経過した免疫感作動物から、その動物の種に応じて選択される適宜の部位より血清（抗血清）を採取すればよい。斯くして得られる抗血清を、さらに必要に応じて、イムノグロブリンを精製するための慣用の方法に供すれば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなどの所望のクラスにまで分離された抗体を得ることもできる。
本発明の抗体は、斯かる抗体を産生し得る単離された細胞からも得ることができる。ここでいう単離された細胞とは、生体から単離された形態にある細胞を意味し、具体的には、この発明の抗体を産生し得る、ハイブリドーマ、生体から単離された脾細胞やリンパ球、形質転換体細胞などが挙げられる。これらの単離された細胞はいずれも本発明の抗体の製造に用いることができ、ハイブリドーマとしての斯かる細胞は、本発明の抗体の一形態であるモノクローナル抗体の製造にとりわけ有用である。斯かるハイブリドーマを得るには、先ず、上記のような免疫感作の後、通常、３乃至５日程度経過後、免疫感作動物から脾臓を摘出し、分散して、脾細胞を抗体産生細胞として得る。脾細胞は、必要に応じて生体外でさらに免疫感作することもできる。斯くして得られる脾細胞を、次に温血動物起源の無限増殖可能な細胞と融合させる。無限増殖可能な細胞としては、例えば、ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）、Ｙ３−Ａｇ１．２．３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３１）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１８）及びＰ３×６３Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−９）などのマウス又はラット骨髄腫由来の細胞株ないしはその変異株が挙げられ、上記脾細胞との適合性などを勘案して、より適したものが選択される。細胞の融合には、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスを始めとする融合促進剤や電気パルスによる慣用の方法が適宜採用される。次に、細胞融合産物を、常法にしたがってＨＡＴ培地などの選択培地中で培養し、融合した細胞すなわちハイブリドーマを選択的に増殖させる。増殖したハイブリドーマを慣用の方法にしたがって、その培養上清を用いて、本発明のポリペプチドに対する免疫反応性の有無を試験し、所期の免疫反応性を示したものを選択すれば、本発明によるハイブリドーマが得られる。選択されたハイブリドーマに限界希釈法など慣用の方法を適用すれば、目的とするハイブリドーマのクローンが得られる。斯くしてクローンとして得られるハイブリドーマを生体内又は生体外で培養し、必要に応じて、その体液又は培養物に、目的とするイムノグロブリンを採取・精製するための慣用の方法を適用すれば、所望のレベルにまで精製された本発明によるモノクローナル抗体が得られる。
前述の通り、本発明のモノクローナル抗体は、通常、蛋白質工学の手法によって調製される、いわゆる「ヒト化抗体」をも包含する。ヒト化抗体を調製するには、例えば上述のようにして得た哺乳動物由来のハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡとし、ＰＣＲ反応により増幅した後、クローニングして、本発明のモノクローナル抗体における重鎖及び軽鎖の塩基配列、とりわけ、重鎖及び軽鎖における可変領域の塩基配列をそれぞれ決定する。次いで、それらの可変領域とヒト抗体の定常領域を融合させたポリペプチドをコードするキメラ遺伝子を作製する。このキメラ遺伝子は適宜宿主中で発現させると、元のモノクローナル抗体と同様の結合特異性を示しつつ、ヒトに対する抗原性が顕著に低下したモノクローナル抗体を産生する。なお、哺乳動物由来の抗体をヒト化する方法自体は公知であり、例えば、エス・ポール監修『メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー』、第５１巻、１９９５年、ヒューマナ・プレス発行には関連する種々の技法が記載されている。
上記で説明した、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体としての形態を含む本発明の抗体は、抗体一般を精製するための斯界における慣用の精製方法により、所望のレベルにまで精製された標品として得ることができる。個々の精製方法としては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動が挙げられ、これらは必要に応じて適宜組合せて用いられる。精製した抗体は、その後用途に応じて濃縮・乾燥し、液状又は固状とする。
本発明でいうペプチド断片とは、本発明のポリペプチドの一部であり、例えば、配列表における配列番号４乃至１０又のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチド若しくはその変異体において、抗原決定基として抗体に認識される上で充分と言われている、通常、１０残基以上、好ましくは２０残基以上の連続した部分アミノ酸配列を有するペプチド断片を意味する。本発明のペプチド断片は、天然又は組換えＤＮＡ技術によって人為的に発現させたポリペプチドを、酸又は各種プロテアーゼなどのポリペプチド分解酵素などで部分分解したものであっても、ペプチド合成によって人為的に合成したものであっても、さらには組換えＤＮＡ技術によって人為的に発現させて調製したものであっても良い。このようにして得られるペプチド断片は、実質的にヒトを含む哺乳類の皮膚細胞においてゼラチナーゼの発現を増強するか、又は造血細胞の増殖を促進する限り本発明のポリペプチドと同様に用いることができる。また、ペプチド断片が所期の生物作用を有していない場合においても本発明のポリペプチドに対する抗体を作製するための抗原として利用することができる。
本発明のポリペプチドは哺乳類の皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現増強作用を有していることから、医薬品の分野においては、皮膚における創傷の治療時、炎症の治療時の治癒促進剤として、また、再生医療における組織再構築の際に有用である。さらには、美容整形においてもケロイド状となる傷跡の軽減に用いることができる。本発明のポリペプチドの効果が期待できる、より具体的な症例としては、切り傷、擦り傷などの創傷、火傷などによる皮膚の損傷、ケロイド、褥瘡、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、自家感作性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、口囲皮膚炎、剥脱性皮膚炎（紅皮症）、老人性乾皮症、限局性強皮症、貨幣状湿疹、蕁麻疹、肥厚性瘢痕、ふけ症、にきび、そばかす、あせもなどが挙げられる。化粧品の分野においては、例えば、頭髪化粧品、基礎化粧品などに使用することもできる。
また、本発明のポリペプチドは哺乳類の造血細胞の増殖を促進する作用を有することから、医薬品の分野においては、化学療法・放射線療法による悪性腫瘍治療時、再生不良性貧血などの血液疾患や重症複合性免疫不全症などの免疫疾患治療のための骨髄移植時、さらには骨髄移植のための造血細胞の増幅時などにおいて造血細胞の増殖促進剤として有用である。本発明のポリペプチドの効果が期待できる、より具体的な症例としては、腎性貧血、悪性貧血、再生不良性貧血、骨髄異形性症候群、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人Ｔ細胞白血病などが挙げられる。また、造血細胞を扱う研究分野において、造血細胞を増幅するための研究用試薬としても用いることもできる。なお、本発明におけるポリペプチドは本来哺乳類に由来するものであることから、毒性も極めて低く安全な物質である。
本発明の抗体は本発明のポリペプチドに特異的に結合することから、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明のポリペプチドを皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現増強剤として用いた際には、ゼラチナーゼの過剰発現を抑制する目的で用いることもできる。さらには、ゼラチナーゼの過剰発現に伴う疾病、病気を診断若しくは治療する目的で用いることもできる。一方、本発明のポリペプチドを造血細胞の増殖促進剤として用いた際には、造血細胞の過剰増殖を抑制する目的で用いることができ、さらには、造血細胞の過剰増殖に伴う疾病、病気を診断若しくは治療する目的で用いることもできる。
本発明のポリペプチドはそのまま単独で使用できるものの、他の成分を配合した組成物の形態でも用いることができる。本発明のポリペプチドを配合してなる組成物は、化粧品、医薬品及び試薬の形態としても有利に利用できる。本発明の組成物には、必要に応じて本発明のポリペプチド以外のもの、すなわち、ヒトを含む哺乳類のための化粧品及び医薬品への適用が許容される成分として、個々の利用分野で通常使用される、例えば、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、アミノ酸、線維質、糖質、脂質、脂肪酸、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、香辛料、安定化剤、防腐剤、乳化剤、界面活性剤、賦形剤、増量剤、増粘剤、保存剤などの成分を１種または２種以上含有させることも有利に実施できる。これらの成分は、通常、本発明の組成物の、各々の利用分野における必要性に応じて適宜選択される。以上のような成分を含む本発明の組成物の形態には特に制限はなく、粉末、顆粒、錠剤、ペースト、ゼリー、乳液、溶液などの所望の形態で提供される。
前記糖質としては、ブドウ糖、果糖、ラクトース、トレハロース、マルトース、蔗糖、ラクトスクロース、水飴などの糖類、サイクロデキストリン、環状四糖などの環状の糖類、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、還元水飴などの糖アルコール類、プルラン、カラギーナン、などの天然多糖類、天然ガム類、カルボキシメチルセルロースなどの１種または２種以上を添加することにより、固状のものにあってはその賦形性に有利に利用できるだけでなく、本発明のポリペプチドの安定化、呈味改善などに有利に利用できる。
本発明のポリペプチドを配合してなる組成物を製造するには、対象とする動物類やその投与方法などに応じて選ばれる適宜の組成にしたがって、本発明のポリペプチドと、以上に示したような、化粧品、医薬品の分野のいずれかにおいて使用が認められている１種又は２種以上の成分とを、個々の配合量に基づいて、目的に応じて混合し、希釈、濃縮、乾燥、濾過、遠心分離などの工程を適宜実施し、ポリペプチドを配合してなる組成物を調製し、必要に応じて所望の形状に成形すればよい。各成分を配合する順序や、上記の各工程を実施する時期は、ポリペプチドの所期の生物作用の低下をきたさないのであれば特に制限はなく、必要に応じて上記のいずれかの工程を適宜単独乃至は組合わせて実施すればよい。
前述のとおり、本発明のポリペプチドは、哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現を増強するか、及び／又は哺乳類の造血細胞の増殖を促進する作用を有することから、本発明のポリペプチドを配合してなる組成物は、例えば、医薬品、化粧品などの分野において斯かる作用を有する物質を必要とする用途において有利に利用できる。
本発明の組成物は、有効成分であるポリペプチドの含量が高いほど著明なゼラチナーゼ発現増強作用を示す。ポリペプチドは高度に精製したものであっても、また、部分精製したものであっても良いものの、顕著なゼラチナーゼ発現増強作用を有する組成物を得るためには、後記実施例で示すように、ゼラチナーゼ発現増強試験において、濃度１０μｇ／ｍｌのポリペプチドを用いた場合、ポリペプチドを添加しない場合に比べてゼラチナーゼの相対発現量を１．２倍以上増加させるレベルにまでポリペプチドの含量を高めるのが望ましい。
本発明の組成物は経皮的に使用すれば、著明なゼラチナーゼ発現増強作用を発揮する。本発明の組成物の有効な投与量は、対象とするヒトをはじめとする哺乳動物の種類、年齢、性別などによって異なるものの、本発明の組成物における有効成分であるポリペプチドとしての重量換算で、成人あたり、通常、１乃至１０００μｇ／回、望ましくは、１０乃至５００μｇ／回、１日１回または数回に分けて、症状、投与形態に応じて、連日または１日以上の間隔をおいて投与すればよい。投与形態としては、特に限定はなく、必要に応じて経皮、経粘膜、場合によっては経口、経管などによる方法を適宜選択して使用すればよい。
また、本発明のポリペプチドを配合してなる組成物を、化粧品などの皮膚外用剤として皮膚に直接塗布する場合には、本発明の組成物における有効成分であるポリペプチドは重量換算で、皮膚外用剤全量中、０．０００１乃至１０質量％、好ましくは、０．００１乃至１質量％であり、１日１回または数回に分けて、効果に応じて、連日または１日以上の間隔をおいて直接皮膚に塗布すればよい。なお、０．０００１質量％未満では、その効果は発揮され難くなり、１０質量％を越える製品にあっては、それ以上の効果が望めず好ましくない。
本発明の組成物をゼラチナーゼ発現増強剤として用いる化粧品の形態としては、例えば、ローション、クリーム、乳液、ゲル、粉末、ペースト、ブロックなどの形態で、石けん、化粧石けん、肌洗い粉、洗顔クリーム、洗顔フォーム、フェイシャルリンス、ボディーシャンプー、ボディーリンス、シャンプー、リンス、髪洗い粉などの清浄用化粧品、セットローション、ヘアブロー、チック、ヘアクリーム、ポマード、ヘアスプレー、ヘアリキッド、ヘアトニック、ヘアローション、養毛料、染毛料、頭皮用トリートメント、びん付油、つや出し油、髪油、スキ油などの頭髪化粧品、化粧水、バニシングクリーム、エモリエントクリーム、エモリエントローション、パック用化粧料（ゼリー状ピールオフタイプ、ゼリー状ふきとり型、ペースト状洗い流し型、粉末状など）、クレンジングクリーム、コールドクリーム、ハンドクリーム、ハンドローション、乳液、保湿液、アフターシェービングローション、シェービングローション、プレシェーブローション、アフターシェービングクリーム、アフターシェービングフォーム、プレシェーブクリーム、化粧用油、ベビーオイルなどの基礎化粧品、ファンデーション（液状、クリーム状、固型など）、タルカムパウダー、ベビーパウダー、ボディパウダー、パヒュームパウダー、メークアップベース、おしろい（クリーム状、ペースト状、液状、固型、粉末など）、アイシャドウ、アイクリーム、マスカラ、眉墨、まつげ化粧料、頬紅、頬化粧水などのメークアップ化粧品、香水、練香水、粉末香水、オーデコロン、パフュームコロン、オードトワレなどの芳香化粧品、日焼けクリーム、日焼けローション、日焼けオイル、日焼け止めクリーム、日焼け止めローション、日焼け止めオイルなどの日焼け・日焼け止め化粧品、マニキュア、ペディキュア、ネイルカラー、ネイルラッカー、エナメルリムーバー、ネイルクリーム、爪化粧料などの爪化粧品、アイライナー化粧品、口紅、リップクリーム、練紅、リップグロスなどの口唇化粧品、練歯磨、マウスウォッシュなどの口腔化粧品、バスソルト、バスオイル、浴用化粧料などの入浴用化粧品などが挙げられる。
医薬品の形態として用いる場合には、例えば、エキス剤、エリキシル剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、眼軟膏剤、口腔粘膜貼付剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、酒精剤、錠剤、シロップ剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤、トローチ剤、軟膏剤、芳香水剤、鼻用噴霧剤、リモナーデ剤、リニメント剤、流エキス剤、ローション剤、湿布剤、噴霧剤、塗布剤、浴剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤などが挙げられる。
また、本発明の組成物は哺乳類由来の造血細胞の増殖促進剤として用いることもできる。生体外で造血細胞を増殖させる目的で用いる場合、本発明のポリペプチドの起源や適用する造血細胞の起源によって異なるものの、本発明の組成物における有効成分であるポリペプチドとしての重量換算で、造血細胞の１×１０５個あたり、通常、０．１μｇ以上、望ましくは、１μｇ以上を培養液中に含有させて造血細胞を培養、増幅すればよい。また、剤の形態としては造血細胞増殖促進剤としての使用目的に支障を与えない範囲で前記ゼラチナーゼ発現増強剤と同様な形態で用いることができる。
以上のような形態の本発明のポリペプチドを配合してなる組成物を製造するには、目的とする製品を慣用の製造方法にしたがって製造する過程の適宜の時期に本発明のポリペプチドを添加すればよい。添加の時期に特に制限はないけれども、目的とする製品が加熱工程を経て製造されるものの場合には、加熱工程の後、常温、望ましくは、３０℃以下に冷却した後に添加することにより、製造工程における本発明のポリペプチドが有する所期の生物作用の減衰を防ぐことができる。以上のような本発明の組成物は、本発明のポリペプチドを、製品重量あたり、通常、０．００１質量％以上、望ましくは、０．０１乃至１００質量％含有する。
以上のように本発明のポリペプチドを有効成分として含む組成物は、哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現増強作用を示すので、日常的に利用することにより、利用した生体においてゼラチナーゼ発現増強作用が効果的に発揮され、重篤な副作用を惹起することなく、創傷の早期緩和、治療などが達成される。また、本発明の組成物は、哺乳類の造血細胞の増殖促進作用を示すので、研究用の試薬として、又は、骨髄移植などを目的とした、生体外で骨髄由来造血細胞を増幅する際の造血細胞増殖促進剤などとして有用である。
一方、本発明のポリペプチドに対する抗体を有効成分として含む組成物もまた、本発明のポリペプチドの場合と同様に調製することができる。本発明のヒト由来ポリペプチドに対するヒト化抗体、キメラ抗体、さらにはヒト抗体を有効成分として含む組成物を医療目的で使用する場合には、ヒトにおける本発明のポリペプチドの過剰発現に伴う疾患の治療に効果を発揮する。当該組成物の用量は通常、疾患患者の体内における本発明のポリペプチドレベルに基づき選定される。体内における本発明のポリペプチドレベルは、例えば、患者より採取される体液などの生物学的試料を、例えば、本発明のポリペプチドに対するマウス抗体などを用いる免疫学的な検出法などに供して測定することができる。測定値を、同様にして測定される健常者における基準値と比較すれば、斯かる患者における本発明のポリペプチドの過剰量が推測される。患者の体内におけるこの過剰量を中和し得る量の本発明の抗体を含む組成物をその患者に投与すればよい。中和し得る抗体の量は組成物の形態やその投与経路により異なるものの、通常、本発明のポリペプチドの量に対してモル比で１／２乃至それ以上である。このようにして選定される用量の当該組成物を疾患の種類や症状、部位を勘案して、１度に又は２回以上に分けて投与すればよく、通常は、当該抗体量として成人あたり約１μｇ乃至１ｇ／回、より望ましくは、約１０μｇ乃至１００ｍｇ／回の用量で１乃至４回／日又は１乃至５回／週の頻度で１日乃至１年間にわたって投与すれば良い。本発明の抗体は後述する実施例にも示すように、血管内皮細胞の増殖及び／又は皮脂細胞の形成を抑制することから、本発明の抗体を有効成分として含む感受性疾患剤は血管新生抑制剤や皮脂産生抑制剤として有用である。
以下に、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
＜ヒト由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定＞
＜実施例１−１：ヒト由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング＞
市販のヒト胎盤由来ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｃｅｎｔａ Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ、日本ベクトン・ディッキンソン（株）製）を鋳型とし、配列表における配列番号１８又は配列番号１９で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡ、及び、配列表における配列番号２０で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＰＣＲプライマーとして用い、ＰＣＲサーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００）を用いて常法により１次ＰＣＲを行った。次いで、増幅して得られた１次ＰＣＲ産物を含む反応液の一部を鋳型とし、配列表における配列番号２１又は配列番号２２、及び、配列表における配列番号２３で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡをＰＣＲプライマーとして用いて、同様に２次ＰＣＲを行った。その結果、１次ＰＣＲにおいて配列表における配列番号１８で示される塩基配列を有するＰＣＲプライマーを用い、２次ＰＣＲにおいて配列表における配列番号２１で示される塩基配列を有するＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ増幅により０．５ｋｂｐ及び１．５ｋｂｐのサイズを示す２種のＰＣＲ産物が得られた。この内、０．５ｋｂｐのものをＲ２７Ｌと、また、１．５ｋｂｐのものをＲ２７Ｈと命名した。一方、１次ＰＣＲにおいて配列表における配列番号１９で示される塩基配列を有するＰＣＲプライマーを用い、２次ＰＣＲにおいて配列表における配列番号２２で示される塩基配列を有するＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ増幅からは０．３ｋｂｐのサイズを示す１種のＰＣＲ産物が得られ、Ｒ２３と命名した。
ＰＣＲにより得た増幅断片Ｒ２３、Ｒ２７Ｌ、Ｒ２７Ｈをそれぞれポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、制限酵素Ｅｃｏ ＲＶで消化したプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（ストラタジーン製）にＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）製）を用いて、常法によりクローン化した。次いで、得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌コンピテントセル（ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ Ｋａｎｒ、ストラタジーン製）を形質転換した。得られた形質転換体をＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間振盪培養した後、培養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してプラスミドＤＮＡを調製し、目的のＰＣＲ増幅断片を保持する３種の形質転換体をそれぞれ選択した。
得られた３種の形質転換体より、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣＲ増幅断片Ｒ２３、Ｒ２７Ｌ、Ｒ２７Ｈの塩基配列をＤＮＡシーケンサー（モデル３７３Ａ、アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）により分析したところ、Ｒ２３とＲ２７ＬあるいはＲ２３とＲ２７Ｈは一部重複する塩基配列を有しており、それぞれｃＤＮＡの部分塩基配列であることが判明した。これらがそれぞれ一つのｍＲＮＡに由来することを確認するためにＲ２３の開始コドンと予測される塩基配列の近傍の塩基配列をもとに、順鎖プライマーとして配列表における配列番号２４で示される塩基配列を有するＤＮＡを、また、Ｒ２７Ｌ又はＲ２７Ｈの終始コドンと予測される配列の近傍の配列をもとに、相補鎖プライマーとして配列表における配列番号２５又は配列番号２６で示される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。次いで、配列表における配列番号１８で示される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして１次ＰＣＲを行った反応液を鋳型として、配列表における配列番号２４と配列番号２５で示される塩基配列を有するプライマー又は配列表における配列番号２４と配列番号２６で示される塩基配列を有するプライマーの組合せで再度２次ＰＣＲを行った。その結果、配列表における配列番号２４と配列番号２５で示される塩基配列を有するプライマーを組合せたＰＣＲにより０．５ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られ、Ｒ４８と命名した。また、配列表における配列番号２４と配列番号２６で示される塩基配列を有するプライマーを組合せたＰＣＲにより０．６ｋｂｐのＰＣＲ産物が得られ、Ｒ５０と命名した。ＰＣＲ増幅断片Ｒ４８とＲ５０をそれぞれ上記と同様に制限酵素Ｅｃｏ ＲＶで消化したプラスミドベクター「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）」にクローン化し、塩基配列を分析した結果、Ｒ４８はＲ２３とＲ２７Ｌより構成されるｃＤＮＡの部分塩基配列であった。また、Ｒ５０はＲ２３とＲ２７Ｈより構成されるｃＤＮＡの部分塩基配列であった。
＜実施例１−２：塩基配列の決定とコードされるアミノ酸配列＞
実施例１−１の結果から、Ｒ２３とＲ２７Ｌ、及び、Ｒ２３とＲ２７Ｈはそれぞれ同じｍＲＮＡに由来することが判明した。Ｒ２３とＲ２７Ｌより構成されるｃＤＮＡは配列表における配列番号１１で、また、Ｒ２３とＲ２７Ｈより構成されるｃＤＮＡは配列表における配列番号１２で示される塩基配列を有していた。配列表における配列番号１１で示される塩基配列は、配列表における配列番号１１で示される塩基配列に併記した１５５残基からなるアミノ酸配列を、また、配列表における配列番号１２で示される塩基配列は配列表における配列番号１２で示される塩基配列に併記した１７６残基からなるアミノ酸配列をそれぞれコードしていた。これらのアミノ酸配列においては、その第１乃至１４９番目までの部分アミノ酸配列は完全に一致していた。
【実施例２】
＜ハムスター由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定＞
＜実施例２−１：ハムスター毛包構成細胞に対する抗体の調製＞
４日齢ハムスターの背部皮膚から調製した表皮細胞のケラチノサイト画分を、ケラチノサイト用培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養した。この細胞を回収し、１乃至４×１０６個／匹でＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に免疫した。この操作を２週間隔で計３回行った後、尾静脈より採血を行い、血清を分離して抗体価測定に用いた。さらに細胞融合３日前に、同様に４日齢ハムスター皮膚より回収したケラチノサイト画分を２×１０７個／匹で腹腔に最終免疫した。抗体価測定及びスクリーニングは、同様に調製したハムスターケラチノサイト画分及びＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞を９６穴プレートに播き、４％パラホルムアルデヒドで固定化した細胞を抗原とするＣＥＬＬ ＥＩＡ法を用いた。このＣＥＬＬ ＥＩＡ法により特にケラチノサイトに対して強い反応性を示す血清のマウスから脾臓を摘出し、この脾臓細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０とを常法により細胞融合した後、上記ＣＥＬＬ ＥＩＡ法でクローンの選択を行い、目的とするハムスター毛包構成細胞に対するモノクローナル抗体産生クローンを得て、ｍＡｂＫ１１４−１と命名した。
＜実施例２−２：ハムスター表皮細胞ｃＤＮＡの合成＞
４日齢ハムスターの背部皮膚から調製した表皮細胞を、ケラチノサイト用培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一日培養して得た６．６×１０７個の培養表皮細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（（株）キアゲン製）を用いて全ＲＮＡを調製した。次いで、得られた全ＲＮＡを、ｍＲＮＡ精製キット（タカラバイオ（株）製、オリゴテックス−ｄＴ３０＜スーパー＞）及び常法を用いて精製し、ｍＲＮＡを調製した。次いで、ｍＲＮＡ１０μｇを鋳型として、逆転写酵素（インビトロジェン（株）製、商品名「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ」）とランダムプライマー（インビトロジェン（株）製）を用いてｃＤＮＡを合成した。さらに、合成したｃＤＮＡに制限酵素Ｂｓｔ ＸＩアダプター（インビトロジェン（株）製）を付加した後、１％アガロースゲル電気泳動を行い、１ｋｂｐ以上のｃＤＮＡを回収した。得られたｃＤＮＡは予めＢｓｔ ＸＩで消化したプラスミドベクターｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン（株）製）とＴ４ ＤＮＡリガーゼにて連結させた後、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ ｐｈａｇｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｅｌｌｓ（インビトロジェン（株）製）に、ジーンパルサーユニット（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ（株）製）を用い、２．５ｋＶ、２５μＦ、１００Ωの条件のエレクトロポレーション法にて導入した。その結果５．１×１０５個の形質転換体を得た。
＜実施例２−３：ハムスター由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング＞
細胞膜蛋白質をコードする遺伝子を、その蛋白質に対する抗体を用いてクローニングするパニング法（Ｂ．シードら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），１９８７年、８４巻、３３６５乃至３３６９頁）に従ってスクリーニングを行った。まず１０群に分けたパニング用ライブラリーを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ−プレートに播き、３７℃で一晩培養を行った。得られたコロニー（５．１×１０４クローン／群）を５０ｍｌのＬ−培地を用いて回収し、さらに３７℃で２時間培養を行った。集菌後、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（（株）キアゲン製）によりプラスミドＤＮＡの調製を行った。得られた１０群のＤＮＡはジーンパルサーユニット（日本バイオ・ラッド ラボラトリーズ（株）製）を用いて２２０Ｖ、９６０μＦの条件でエレクトロポレーションを行うことによりＣＯＳ−１細胞に導入した。２乃至３日後、付着したＣＯＳ−１細胞を５ｍＭＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム溶液を用いて回収し、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液に実施例２−１で調製したモノクローナル抗体ｍＡｂＫ１１４−１を５０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、氷上で１時間反応させた後、結合しなかった抗体を遠心洗浄することにより除去した。次いで、抗体が結合した細胞をヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソンイムノリサーチ製、１０μｇ／ｍｌ）でコートした６ｃｍディッシュに播き、室温で３時間吸着処理を行った。吸着しない細胞を洗い去った後、残りの吸着細胞をハート溶液（０．６％ＳＤＳ、１０ｍＭＥＤＴＡ）で溶解し、終濃度１Ｍの塩化ナトリウム水溶液を添加し４℃で一晩放置した。これを１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を回収し、フェノール処理した後、１μｇの酵母ｔＲＮＡを添加しＤＮＡをエタノール沈殿法にて回収した。回収したＤＮＡは実施例２−２で示したエレクトロポレーションにより大腸菌に導入し、コロニーを形成させた。この一連の操作を１回のパニングサイクルとし、１０群のライブラリーについてそれぞれ３回パニングを繰り返した。パニング操作によって濃縮された目的遺伝子を含むＤＮＡより、単クローンのプラスミドＤＮＡを調製した。得られたＤＮＡは、リポフェクション用遺伝子導入剤（商品名「リポフェクトアミン２０００」、インビトロジェン（株）製）を用いてＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションし、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ培地、日水製薬（株）製）により培養を行った。培養２乃至３日後、細胞を２％パラホルムアルデヒドで固定した後、５０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ｍＡｂＫ１１４−１を含む５％ＦＣＳ含有リン酸緩衝液を加え、室温で１時間反応させた。リン酸緩衝液で洗浄した後、アルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（シグマアルドリッチ（株）製）と室温で１時間反応させた。リン酸緩衝液で洗浄した後、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲ／ＡＳ−ＭＸ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（ピアス製）により染色を行い、染色された陽性形質転換体を得た。
＜実施例２−４：塩基配列の決定とコードされるアミノ酸配列＞
得られた陽性形質転換体より、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製し、ｐｃＤ−ｈａｍＡｇＫ１１４と命名した。挿入されたｃＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシーケンサー（モデル３７３Ａ、アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）により分析したところ、配列表における配列番号１３で示される７２９塩基からなるオープンリーディングフレームを有しており、配列表における配列番号１３で示される塩基配列に併記した２４２残基からなるアミノ酸配列をコードしていた。このアミノ酸配列を有するポリペプチドをｈａｍＡｇＫ１１４−１と命名した。ｈａｍＡｇＫ１１４−１のアミノ酸残基２２５乃至２４１番目のアミノ酸配列はそのアミノ酸配列の特徴から膜貫通領域を形成していると予測され、ｈａｍＡｇＫ１１４−１はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型の膜蛋白質と推定された。ｈａｍＡｇＫ１１４−１が有する配列表における配列番号１３で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列をもとにデータベース検索したところ、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドは存在せず、ｈａｍＡｇＫ１１４−１は新規な物質であった。
【実施例３】
＜マウス由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定＞
＜実施例３−１：データベース検索＞
実施例２で得られたハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１をコードするｃＤＮＡの塩基配列（配列表における配列番号１３）をもとにデータベース検索（ＢＬＡＳＴ解析）を行ったところ、マウス由来のホモログをコードしていると考えられる４つの塩基配列（アクセッション番号ＡＫ００５５５８、ＢＣ００６９５８、ＡＫ００２７６７及びＡＫ００９３３６）が得られた。マウス由来のホモログをコードするｃＤＮＡをクローニングするため、ＡＫ００５５５８（マウス成獣雌胎盤ｃＤＮＡ）の開始コドン上流の塩基配列を基に、配列表における配列番号２７で示される塩基配列を有する順鎖プライマーを合成した。
＜実施例３−２：マウス表皮細胞ｃＤＮＡの合成＞
ＢＡＬＢ／ｃマウスの耳から調製した表皮細胞を、ケラチノサイト用培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で一晩培養して得た８．８×１０６個の培養表皮細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（（株）キアゲン製）を用いて全ＲＮＡを調製した。次いで、得られた全ＲＮＡ２μｇを鋳型として、逆転写酵素（インビトロジェン（株）製、商品名「ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ」）と配列表における配列番号２８で示される塩基配列を有するオリゴｄＴアンカープライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。
＜実施例３−３：マウス由来ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング＞
上記で合成したｃＤＮＡを鋳型とし、配列表における配列番号２７で示される塩基配列を有する順鎖プライマーと配列表における配列番号２９で示されるＰＣＲアンカープライマーの組合せで、ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ（株）製、商品名「ＴａＫａＲａ Ｅｘ ｔａｑ」）を用いて常法の３′ＲＡＣＥ法によりポリ（Ａ）配列までのＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は９４℃、３０秒→６０℃、４５秒→７２℃、３分の条件で３０サイクル行った。このＰＣＲにより、１．３ｋｂｐのＰＣＲ増幅産物（ＰＣＲ１３と命名）を得た。得られたＰＣＲ１３をポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、制限酵素Ｅｃｏ ＲＶで消化したプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルク（株）製）にＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）製）を用いて、常法によりクローン化し、組換えプラスミド（ｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１３と命名）を得た。得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌コンピテントセル（ＪＭ１０９、タカラバイオ（株）製）を形質転換した。得られた形質転換体をＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間振盪培養した後、培養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してプラスミドＤＮＡを調製し、目的のＰＣＲ増幅断片を保持するクローンを選択した。
＜実施例３−４：塩基配列の決定とコードされるアミノ酸配列＞
得られた形質転換体より、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣＲ増幅断片ＰＣＲ１３の塩基配列をＤＮＡシーケンサー（モデル３７３Ａ、アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）により分析したところ、配列表における配列番号１５で示される塩基配列を有していた。この塩基配列は、７１４塩基からなるオープンリーディングフレームを有しており、配列表における配列番号１５で示される塩基配列に併記した２３７残基からなるアミノ酸配列をコードしていた。マウス由来の配列表における配列番号１５で示される塩基配列を有するｃＤＮＡと実施例２で得たハムスター由来の配列番号１３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡとの相同性は７５％であった。また、本ｃＤＮＡにコードされる配列表における配列番号１５で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列とハムスター由来ポリペプチドのアミノ酸配列（配列表における配列番号１３で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列）との相同性は６０％であった。マウス由来ポリペプチドの２２０乃至２２６残基のアミノ酸配列はハムスター由来ポリペプチドと同様に膜貫通領域を形成していると予測され、マウス由来ポリペプチドもグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型の膜蛋白質と推定された。マウス由来ポリペプチドが有する配列表における配列番号１５で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列をもとにデータベース検索したところ、アクセッション番号ＡＡＨ１７６２４で開示されているｃＤＮＡがコードする機能未知のポリペプチドのアミノ酸配列と完全に一致した。
【実施例４】
＜マウス由来分泌型ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定＞
＜実施例４−１：マウス由来分泌型ポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニング＞
より低分子の分泌型ポリペプチドをクローニングする目的で、実施例３において３′ＲＡＣＥ法にて増幅したＰＣＲ産物を２％アガロース電気泳動に供し、約８００ｂｐに相当する位置のＤＮＡバンド（ＰＣＲ１８１と命名）を切り出し、ＤＮＡ抽出キット（（株）キアゲン製、商品名「ＱＩＡＥＸ ＩＩ」）を用いて抽出し、ＤＮＡを精製した。次いで、得られたＤＮＡ断片（ＰＣＲ１８１）を制限酵素Ｅｃｏ ＲＶで消化したプラスミドベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ（メルク（株）製）にＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）製）を用いて、常法によりクローン化し、組換えＤＮＡ（ｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１８１と命名）を得た。得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌コンピテントセル（ＪＭ１０９、タカラバイオ（株）製）を形質転換した。得られた形質転換体をＬ−ブロス培地（ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で１８時間振盪培養した後、培養物から形質転換体を採取し、通常のアルカリ−ＳＤＳ法により処理してプラスミドＤＮＡを調製し、目的のｃＤＮＡを保持するクローンを選択した。
＜実施例４−２：塩基配列の決定とコードされるアミノ酸配列＞
得られた形質転換体より、上記と同様にプラスミドＤＮＡを調製し、ＰＣＲ増幅断片ＰＣＲ１８１の塩基配列をＤＮＡシーケンサー（モデル３７３Ａ、アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）により分析したところ、配列表における配列番号１７で示される塩基配列を有していた。配列表における配列番号１７で示される塩基配列は、５８５塩基からなるオープンリーディングフレームを有しており、配列表における配列番号１７で示される塩基配列に併記した１９４残基からなるアミノ酸配列をコードしていた。実施例３で得たマウス由来の配列表における配列番号１５で示される塩基配列を有するｃＤＮＡとの相同性は７５％であった。また、本ｃＤＮＡにコードされる配列表における配列番号１７で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列と実施例３のポリペプチドのアミノ酸配列（配列表における配列番号１５で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列）とは１乃至１４８残基までは完全に一致していたもののそれ以降の配列は全く異なっていた。本ポリペプチドにはアミノ酸配列上ＧＰＩアンカー型の膜貫通領域と推定される部分が存在しないため、分泌型のポリペプチドと考えられた。本ポリペプチドが有する配列表における配列番号１７で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列をもとにデータベース検索したところアクセッション番号ＡＫ００２７６７で開示されているｃＤＮＡがコードする機能未知のポリペプチドのアミノ酸配列と完全に一致した。
【実施例５】
＜ヒト由来ポリペプチドの製造＞
＜実施例５−１：発現ベクターの構築＞
配列表における配列番号１１で示される塩基配列を有するｃＤＮＡの５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列を作製し、３′末端に配列表における配列番号３０で示されるアミノ酸配列（ＦＬＡＧ配列）をコードする塩基配列及びＮｏｔ Ｉ認識配列を作製することを目的とし、配列表における配列番号１１で示される塩基配列を有するｃＤＮＡが挿入されたプラスミドＤＮＡ １０ｎｇを鋳型にして、配列表における配列番号３１で示される塩基配列を有する順鎖プライマーと配列表における配列番号３２に示される塩基配列を有する相補鎖プライマーの組み合わせでＰＣＲを行った。得られた増幅断片は、ポリエチレングリコール沈澱法により精製後、プラスミド（「ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）」、（株）ストラタジーン製）のＳｒｆ Ｉ部位にクローニングを行った。常法により塩基配列の確認を行った結果、計画通り５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列、３′末端にＦＬＡＧ配列をコードする塩基配列、Ｎｏｔ Ｉ認識配列を有するプラスミドが得られた。得られたプラスミドＤＮＡをＸｈｏ ＩとＮｏｔ Ｉで消化し、配列表における配列番号１１で示される塩基配列を有するｃＤＮＡを含むＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ断片を調製後、発現ベクターｐＣＤＭ８（インビトロジェン（株）製）のＣＭＶプロモーターの下流、Ｘｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入した。得られた発現ベクターをｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ａＦＬと命名した。本発現ベクターを用いれば発現するポリペプチドは配列表における配列番号１１で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端部位にＦＬＡＧ配列を有する融合ポリペプチドとして得られる。構築した発現ベクターｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ａＦＬの基本構造を図１に示した。
＜実施例５−２：ＣＯＳ−１細胞の形質転換と培養＞
実施例５−１で得た発現ベクターｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ａＦＬを、リポフェクション法にて以下のようにＣＯＳ−１細胞に導入し細胞を形質転換した。まず、プラスミドＤＮＡ１０μｇをＤ−ＭＥＭ培地で希釈して１．５ｍｌとしたものと、リポフェクション法用遺伝子導入試薬（商品名『リポフェクトアミン２０００』、インビトロジェン（株）製、以下、ＬＦ２０００と略称する。）６０μｌをＤ−ＭＥＭ培地で希釈して１．５ｍｌとし、室温で５分間放置したものを合わせ室温で２０分間反応させ、ＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体を形成させた。次いで、１０ｃｍプラスチックシャーレ上に４．８×１０６個／１０ｍｌの１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地で接種し、一晩培養しておいたＣＯＳ−１細胞の培養液上清を取り除き、５ｍｌのＤ−ＭＥＭ培地を加え、ＤＮＡ−ＬＦ２０００複合体３ｍｌを添加した。この細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で５時間培養した後に上清を取り除き、１０ｍｌの１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に培地を交換して再び培養した。一晩培養後、動物細胞用無血清培地ＡＳＦ（味の素（株）製）５ｍｌに培地交換し、さらに３日間培養を行った。
＜実施例５−３：ポリペプチドの精製＞
形質転換したＣＯＳ−１細胞の培養液１０００ｍｌを精製原料として、配列表における配列番号１１で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドの精製を以下のように行った。培養液を遠心分離して得た培養上清を０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）で予め平衡化しておいた抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースカラム（容量５ｍｌ、シグマアルドリッチ（株）製）にかけ、ＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドを特異的に吸着させた。同バッファーで充分洗浄し非吸着成分を除去した後、０．１Ｍグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ３．５）を用いて吸着成分を溶出した。ポリペプチド溶出フラクションは１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を添加することにより中和した。回収フラクションは限外ろ過膜（商品名『ウルトラフリー』、ミリポア（株）製）にて濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．１）で予め平衡化しておいた容量１２０ｍｌのゲルろ過カラム（商品名『スーパーデックス２００』、アマシャムバイオサイエンス（株）製）にかけ、同バッファーにて溶出した。２８０ｎｍの吸光度を指標にポリペプチドを回収し、約０．１５ｍｇのポリペプチドを収率約８０％で得た。このポリペプチドをｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬと命名した。
得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量３０乃至１００ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。分子量の幅が広い理由として糖鎖修飾の影響が考えられた。
【実施例６】
＜ヒト由来ポリペプチドの製造＞
＜実施例６−１：組換えバキュロウィルスの調製＞
ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬをコードするｃＤＮＡと、ＢＤファーミンジェン社製の『ＢＤバキュロゴールド・トランスフェクション・キット（ＢＤ ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）』を用い、昆虫細胞でのポリペプチド発現用組換えバキュロウィルスを調製した。実施例５−１で得た５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列を、３′末端にＦＬＡＧ配列をコードする塩基配列とＮｏｔ Ｉ認識配列を有するＤＮＡが挿入されたｐｃＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩにて消化し、ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ断片を調製した後、これを、バキュロウィルス・トランスファーベクター『ｐＶＬ１３９３』のポリヘドリン・プロモーター下流のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位に連結させた。得られた組換えベクターを『ｐＶＬ１３９３−ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ』と命名した。構築した発現ベクターｐＶＬ１３９３−ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬの基本構造を図２に示した。次に、キットの添付説明書の操作方法に従い、Ｓｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７１１、ヨトウガ由来）を用いて、組換えウィルスの作製を行った。Ｓｆ９は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ添加のＴＣ１００培地（インビトロジェン（株）製）を用い、６穴プレートに１×１０６個／ウェルで播種し、１０分間付着させ、上清除去後、０．５ｍｌのトランスフェクション・バッファーＡ液（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ含有グレース培地）に置換した。これに、あらかじめ１．５μｇのｐＶＬ１３９３−ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬと０．２５μｇのＢＤバキュロゴールド・バキュロウィルスＤＮＡを混合して５分間反応させた後に、０．５ｍｌのトランスフェクション・バッファーＢ液（１２５ｍＭ塩化カルシウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．１）を添加した混合液を、０．５ｍｌ／ウェルで添加し、２７℃で４時間感染させた。次に、各ウェルを１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ添加ＴＣ−１００培地で１回洗浄後、同培地２ｍｌを添加し、更に２７℃で６日間培養を行った。各培養液を１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を回収し、ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ組換えバキュロウィルス調製液とした。更にウィルスの力価を上げるため、Ｓｆ９細胞１×１０７個に上記の調製液を５０乃至２００μｌ添加し、２７℃で１週間感染させ、遠心分離して得た上清を、ポリペプチド発現用の組換えウィルス液として調製した。
＜実施例６−２：昆虫細胞のトランスフェクションと培養＞
ポリペプチド発現用細胞として、昆虫細胞株『Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ』（インビトロジェン（株）製、イラクサギンウワバ由来）を用いた。昆虫細胞株は、Ｌ−グルタミン（最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）を添加したエクスプレスファイブ無血清培地（インビトロジェン（株）製）を用いて１×１０８個／１０ｍｌに調製し、実施例６−１で得た組換えウィルス液を２００μｌ添加し、１０分毎に攪拌しながら１時間感染させた。次に、エクスプレスファイブ無血清培地を３０ｍｌ添加後、２７℃で３日間培養を行いトランスフェクション液を得た。
＜実施例６−３：ポリペプチドの精製＞
実施例６−２で得たトランスフェクション液７４０ｍｌを精製原料として、Ｃ末端部分にＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドの精製を以下のように行った。トランスフェクション液を１５，０００ｒｐｍで４５分間遠心分離して得た上清を、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）で予め平衡化しておいた抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースカラム（容量５ｍｌ、シグマアルドリッチ（株）製）にかけ、ＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドを特異的に吸着させた。同バッファーで充分洗浄し非吸着成分を除去した後、０．１Ｍグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ３．５）を用いて吸着成分を溶出した。ポリペプチド溶出フラクションは１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を添加することにより中和した。回収フラクションは限外ろ過膜（商品名『ウルトラフリー』、ミリポア（株）製）にて濃縮することによりポリペプチドを回収し、約５３０μｇのポリペプチドを得た。
得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量２０乃至３５ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。常法により、この精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を５残基調べたところ、配列表における配列番号３９で示されるアミノ酸配列を有していることが判明し、このアミノ酸配列は配列表における配列番号１１に示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の第２６乃至第３０番目のアミノ酸配列と完全に一致した。このことから配列表における配列番号１１に示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の内、第１乃至第２５番目までのアミノ酸配列は分泌のためのシグナル配列であり、第２６番目以降のアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号４で示されるアミノ酸配列が成熟ポリペプチドのアミノ酸配列であることが確認された。
【実施例７】
＜ヒト由来ポリペプチドの製造＞
＜実施例７−１：発現ベクターの構築＞
相補鎖プライマーとして配列表における配列番号３３で示される塩基配列を有するプライマーを用い、配列表における配列番号１２で示される塩基配列を有するｃＤＮＡ挿入プラスミドＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った以外は実施例５−１と同様に操作することにより発現ベクターを得て、ｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ｂＦＬと命名した。本発現ベクターを用いれば発現するポリペプチドは配列表における配列番号１２で示される塩基配列に併記されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列を有する融合ポリペプチドとして得られる。構築した発現ベクターｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ｂＦＬの基本構造を図３に示した。
＜実施例７−２：ＣＯＳ−１細胞の形質転換と培養＞
発現ベクターとして実施例７−１で得たｐｃＤ−ｈＡｇＫ１１４ｂＦＬを用いた以外は実施例５−２と同様にＣＯＳ−１細胞を形質転換し、細胞培養を行なった。
＜実施例７−３：ポリペプチドの精製＞
実施例５−３と同様に操作し、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドの精製を行ったところ、約０．１ｍｇのポリペプチドを収率約８０％で得た。得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量３０乃至１００ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。常法により、この精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を５残基調べたところ、配列表における配列番号３９で示されるアミノ酸配列を有していることが判明し、このアミノ酸配列は配列表における配列番号１２に示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の第２６乃至第３０番目のアミノ酸配列と完全に一致した。このことから配列表における配列番号１２に示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の内、第１乃至第２５番目までのアミノ酸配列は分泌のためのシグナル配列であり、第２６番目以降のアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号５で示されるアミノ酸配列が成熟ポリペプチドのアミノ酸配列であることが確認された。なお、配列表における配列番号４及び５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列表における配列番号１で示される部分アミノ酸配列を共通に有することになり、このアミノ酸配列が生物作用に重要と判断された。
【実施例８】
＜ハムスター由来Ｃ末端ＦＬＡＧ付加分泌変異型ポリペプチドの製造＞
＜実施例８−１：発現ベクターの構築＞
実施例２でクローニングした配列表における配列番号１３で示される塩基配列を有するｃＤＮＡは、配列表における配列番号１３で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列を有する膜結合型のハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１をコードしているところ、分泌型のポリペプチドを得るため膜結合に関与すると予測されるＣ末端領域（配列表における配列番号１３で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における２２３番目のセリン残基以降のＣ末端側の領域）を削除し、さらに、実施例５及び６と同様にＣ末端部分にＦＬＡＧ配列を有する組換え融合ポリペプチドが得られるようにｃＤＮＡを改変した発現ベクターを構築することにした。
実施例２で得た、組換えプラスミドｐｃＤ−ｈａｍＡｇＫ１１４ １０ｎｇを鋳型とし、配列表における配列番号３４で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを順鎖プライマーとし、配列表における配列番号３５で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを相補鎖プライマーとしたＰＣＲを行った。得られた増幅断片は、ポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、プラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）（（株）ストラタジーン製）のＳｒｆ Ｉ部位にクローニングした。常法により塩基配列の確認を行ったところ、計画通り配列表における配列番号１４で示される塩基配列の５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列が、及び３′末端にＮｏｔ Ｉ認識配列が付加された配列を有していた。このＤＮＡは配列表における配列番号１４で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列をコードしていたことから、当初の目的通りｈａｍＡｇＫ１１４−１の１乃至２２２番目までのアミノ酸配列とＦＬＡＧ配列が融合した組換え変異型融合ポリペプチド（ｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬと命名。）をコードするｃＤＮＡが調製されたことを確認した。このｃＤＮＡを含むＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ断片を再度切り出し、発現ベクターｐＲＥＦ−ＸＮ（谷口ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ），１９９８年，２１７巻，９７乃至１０２頁）のＥＦ−１αプロモーターの下流、Ｘｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入することにより調製した発現ベクターをｐＲＥＲ−ｈａｍＡｇＫ１１４ｄ２ＦＬと命名した。構築した発現ベクターｐＲＥＲ−ｈａｍＡｇＫ１１４ｄ２ＦＬの基本構造を図４に示した。
＜実施例８−２：ＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質転換と培養＞
実施例８−１で得た発現ベクターｐＲＥＲ−ｈａｍＡｇＫ１１４ｄ２ＦＬを、エレクトロポレーション法にて以下のようにＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し細胞を形質転換した。まず、プラスミドＤＮＡ１０μｇと、予め常法により調製しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞を１×１０６個含む液８００μｌとをエレクトロポレーション用キュベット内で混合し、氷温で１０分間放置した。次いで、２５μＦＤ、１０００Ｖの電気パルスを１分間間隔で２回負荷することによりエレクトロポレーションを行った。形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞を５％ＦＣＳ−Ｈａｍ’ｓＦ１２培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間培養した後、培地を４００μｇ／ｍｌのＧ−４１８（商品名「ジェネティシン」、インビトロジェン（株）製）を含む５％ＦＣＳ−Ｈａｍ’ｓＦ１２培地に交換し、２日に一度培地を交換しながら１４日間培養した。ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を用いた培養上清のＥＩＡにより、形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞からｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬを高発現する形質転換ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１株選択し、常法によりシングルクローン化し、ＣＨＯ−ｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬと命名した。この細胞を３４．５ｍｇ／ｌのＬ−プロリンを含有する５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地に播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。細胞がコンフルエント状態になった後、培地をＡＳＦ培地に交換し３日間培養した。
＜実施例８−３：ポリペプチドの精製＞
ＣＨＯ−ｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬ細胞の培養液２０ｌを精製原料として、ＦＬＡＧ付加型変異ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬの精製を以下のように行った。培養液を遠心分離して得た培養上清を限外ろ過膜（商品名『マイクローザ』、旭化成（株）製）にて１００倍濃縮した後、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸バッファー（ｐＨ７．４）で予め平衡化しておいた抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースカラム（容量５ｍｌ、シグマアルドリッチ（株）製）にかけ、ＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドを特異的に吸着させた。同バッファーで充分洗浄し非吸着成分を除去した後、０．１Ｍグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ３．５）を用いて吸着成分を溶出した。ポリペプチド溶出フラクションは１Ｍトリス−塩峻バッファー（ｐＨ８．０）を添加することにより中和した。回収フラクションは限外ろ過膜（商品名『ウルトラフリー』、ミリポア（株）製）にて濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．１）で予め平衡化しておいた容量１２０ｍｌのゲルろ過カラム（商品名『スーパーデックス２００』、アマシャムバイオサイエンス（株）製）にかけ、同バッファーにて溶出した。２８０ｎｍの吸光度を指標にポリペプチドを回収し、約１．８ｍｇのｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬを得た。
得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量５０乃至１００ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。分子量の幅が広い理由として糖鎖修飾の影響が考えられた。常法により、この精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を５残基調べたところ、配列表における配列番号４０で示されるアミノ酸配列を有していることが判明し、このアミノ酸配列は配列表における配列番号１４で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の第２７乃至第３１番目のアミノ酸配列と完全に一致した。このことから配列表における配列番号１４で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の内、第１乃至第２６番目までのアミノ酸配列は分泌のためのシグナル配列であり、第２７乃至第２２２番目のアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号７で示されるアミノ酸配列が成熟ポリペプチドのアミノ酸配列であることが確認された。なお、配列表における配列番号６及び７で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列表における配列番号２で示される部分アミノ酸配列を共通に有することになり、このアミノ酸配列が生物作用に重要と判断された。
【実施例９】
＜マウス由来Ｃ末端ＦＬＡＧ付加分泌変異型ポリペプチドの製造＞
＜実施例９−１：発現ベクターの構築＞
実施例３でクローニングした配列表における配列番号１５の塩基配列を有するｃＤＮＡは、膜結合型のマウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１をコードしているところ、分泌型のポリペプチドを得るため、実施例８のハムスターの場合と同様に、膜結合に関与するＣ末端領域（配列表における配列番号１５で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列における２１９番目プロリン残基以降のＣ末端側の領域）を削除し、実施例５、７及び８と同様にＣ末端にＦＬＡＧ配列を有する組換え融合ポリペプチドが得られるようにｃＤＮＡを改変した発現ベクターを構築することにした。
実施例３で得た、組換えプラスミドｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１３ １０ｎｇを鋳型とし、配列表における配列番号３６で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを順鎖プライマーとし、配列表における配列番号３７で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを相補鎖プライマーとしたＰＣＲを行った。得られた増幅断片は、ポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、プラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）（（株）ストラタジーン製）のＳｒｆ Ｉ部位にクローニングした。常法により塩基配列の確認を行った結果、計画通り配列表における配列番号１６で示される塩基配列の５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列、及び３′末端にＮｏｔ Ｉ認識配列がそれぞれ付加された塩基配列を有していた。このＤＮＡは配列表における配列番号１６で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列をコードしていたことから、当初の目的通りｍＡｇＫ１１４−１の１乃至２１８番目までのアミノ酸配列のＣ末端にＦＬＡＧ配列を有する組換え分泌変異型融合ポリペプチド（ｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬと命名。）をコードするｃＤＮＡが調製されたことを確認した。このｃＤＮＡを含むＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ断片を再度切り出し、実施例８−１と同様に発現ベクターｐＲＥＦ−ＸＮのＥＦ−１αプロモーターの下流、Ｘｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入することにより調製した発現ベクターをｐＲＥＲ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬと命名した。構築した発現ベクターｐＲＥＲ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬの基本構造を図５に示した。
＜実施例９−２：ＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質転換と培養＞
実施例９−１で得た発現ベクターｐＲＥＲ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬを、エレクトロポレーション法にて以下のようにＣＨＯ−Ｋ１細胞に導入し細胞を形質転換した。まず、プラスミドＤＮＡ１０μｇと、予め常法により調製しておいたＣＨＯ−Ｋ１細胞を１×１０６個含む液８００μｌとをエレクトロポレーション用キュベット内で混合し、氷温で１０分間放置した。次いで、２５μＦＤ、１０００Ｖの電気パルスを１分間間隔で２回負荷することによりエレクトロポレーションを行った。形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞を５％ＦＣＳ−Ｈａｍ’ｓＦ１２培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間培養した後、培地を４００μｇ／ｍｌのＧ−４１８を含む５％ＦＣＳ−Ｈａｍ’ｓＦ１２培地に交換し、２日に一度培地を交換しながら８日間培養した。ホースラディッシュパーオキシダーゼ標識した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体を用いた培養上清のＥＩＡにより、形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞からｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを高発現する形質転換ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１株選択し、常法によりシングルクローン化し、ＣＨＯ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬＢＰ２３−１と命名した。この細胞を３４．５ｍｇ／ｌのＬ−プロリンを含有する５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地に播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。細胞がコンフルエント状態になった後、培地をＡＳＦ培地に交換し３日間培養した。
＜実施例９−３：ポリペプチドの精製＞
ＣＨＯ−ｓｍＡｇＫ１１４ＦＬＢＰ２３−１細胞の培養液２０ｌを精製原料として、配列表における配列番号１６で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列を有する変異型融合ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬの精製を以下のように行った。培養液を遠心分離して得た培養上清を限外ろ過膜（商品名『マイクローザ』、旭化成（株）製）にて１００倍濃縮した後、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス−塩峻バッファー（ｐＨ７．４）で予め平衡化しておいた抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体アガロースカラム（容量５ｍｌ、シグマアルドリッチ（株）製）にかけ、ＦＬＡＧ配列を有する組換え型融合ポリペプチドを特異的に吸着させた。同バッファーで充分洗浄し非吸着成分を除去した後、０．１Ｍグリシン−塩酸バッファー（ｐＨ３．５）を用いて吸着成分を溶出した。ポリペプチド溶出フラクションは１Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐＨ８．０）を添加することにより中和した。回収フラクションは限外ろ過膜（商品名『ウルトラフリー』、ミリポア（株）製）にて濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．１）で予め平衡化しておいた容量１２０ｍｌのゲルろ過カラム（商品名『スーパーデックス２００』、アマシャムバイオサイエンス（株）製）にかけ、同バッファーにて溶出した。２８０ｎｍの吸光度を指標にポリペプチドを回収し、約８．６ｍｇのｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを得た。
得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量５０乃至１００ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。分子量の幅が広い理由として糖鎖修飾の影響が考えられた。常法により、この精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を５残基調べたところ、配列表における配列番号４１で示されるアミノ酸配列を有していることが判明し、このアミノ酸配列は配列表における配列番号１６で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の第２７乃至第３１番目のアミノ酸配列と完全に一致した。このことから配列表における配列番号１６で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の内、第１乃至第２６番目までのアミノ酸配列は分泌のためのシグナル配列であり、第２７乃至第２１８番目のアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号９で示されるアミノ酸配列が成熟ポリペプチドのアミノ酸配列であることが確認された。
【実施例１０】
＜マウス由来分泌型ポリペプチドの製造＞
＜実施例１０−１：発現ベクターの構築＞
実施例４で得た、組換えプラスミドｐＴＢ−ｍＡｇＫ１１４ＰＣＲ１８１ １０ｎｇを鋳型とし、配列表における配列番号３６で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを順鎖プライマーとし、配列表における配列番号３８で示される塩基配列を有する合成ＤＮＡを相補鎖プライマーとしたＰＣＲを行った。得られた増幅断片は、ポリエチレングリコール沈殿法により精製した後、プラスミドベクターｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）（（株）ストラタジーン製）のＳｒｆ Ｉ部位にクローニングした。常法により塩基配列の確認を行った結果、計画通り配列表における配列番号１７で示される塩基配列の５′末端にＸｈｏ Ｉ認識配列、及び３′末端にＮｏｔ Ｉ認識配列がそれぞれ付加された塩基配列を有していた。このＤＮＡは配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列をコードしていたことから、分泌型ポリペプチド（ｍＡｇＫ１１４−１ｂと命名。）をコードするｃＤＮＡが調製されたことを確認した。このｃＤＮＡを含むＸｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ断片を再度切り出し、実施例８−１と同様に発現ベクターｐＲＥＦ−ＸＮのＥＦ−１αプロモーターの下流、Ｘｈｏ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ部位に挿入することにより調製した発現ベクターをｐＲＥＲ−ｍＡｇＫ１１４ｂと命名した。構築した発現ベクターｐＲＥＲ−ｍＡｇＫ１１４ｂの基本構造を図６に示した。
＜実施例１０−２：ＣＨＯ−Ｋ１細胞の形質転換と培養＞
実施例１０−１で得た発現ベクターｐＲＥＲ−ｍＡｇＫ１１４ｂを用い、形質転換したＣＨＯ−Ｋ１細胞からマウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬに対するラット抗血清を用いたＥＩＡによりｍＡｇＫ１１４−１ｂを高発現する形質転換ＣＨＯ−Ｋ１細胞を選択した以外は実施例９と同様にして、形質転換ＣＨＯ−Ｋ１細胞を得てＣＨＯ−ｍＡｇＫ１１４ｂ１６−３８と命名した。この細胞を３４．５ｍｇ／ｌのＬ−プロリンを含有する５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０培地に播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。細胞がコンフルエント状態になった後、培地をＡＳＦ培地に交換し３日間培養した。
＜実施例１０−３：ポリペプチドの精製＞
ＣＨＯ−ｍＡｇＫ１１４ｂ１６−３８細胞の培養液２０ｌを精製原料として、マウス由来ポリペプチドｍＡｇＫ１１４−１ｂの精製を以下のように行った。培養液を遠心分離して得た培養上清を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．５）で予め平衡化しておいた容量３６０ｍｌのＷＧＬ−セファロース（アマシャムバイオサイエンス（株）製）カラムにかけ、ポリペプチドを特異的に吸着させた。同バッファーで充分洗浄し非吸着成分を除去した後、０．４Ｍ Ｎ−アセチルグルコサミン−リン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用いて吸着成分を溶出した。ポリペプチド溶出フラクションは限外ろ過膜（商品名『ウルトラフリー』、ミリポア（株）製）にて濃縮し、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）で予め平衡化しておいた容量５０ｍｌのキレート（Ｃｕ２＋）−セファロース（アマシャムバイオサイエンス（株）製）カラムにかけ、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）にて溶出した。２８０ｎｍの吸光度を指標にポリペプチドを回収したところ、約０．５ｍｇのポリペプチドが得られた。
得られた組換えポリペプチド精製標品を用い、常法に従い還元剤存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったところ、分子量３５乃至７０ｋＤａに相当する位置に単一なポリペプチドのバンドが検出された。常法により、この精製ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を５残基調べたところ、配列表における配列番号４１で示されるアミノ酸配列を有していることが判明し、このアミノ酸配列は配列表における配列番号１７で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の第２７乃至第３１番目のアミノ酸配列と完全に一致した。このことから配列表における配列番号１７で示される塩基配列に併記したアミノ酸配列の内、第１乃至第２６番目までのアミノ酸配列は分泌のためのシグナル配列であり、第２７番目以降のアミノ酸配列、すなわち配列表における配列番号１０で示されるアミノ酸配列が成熟ポリペプチドのアミノ酸配列であることが確認された。なお、配列表における配列番号８乃至１０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列表における配列番号３で示される部分アミノ酸配列を共通に有することになり、このアミノ酸配列が生物作用に重要と判断された。
【実施例１１】
＜ヒト由来ポリペプチドのヒト由来線維芽細胞のゼラチナーゼ発現増強作用＞
実施例５−３の方法で得たヒト由来組換えポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を用い、ヒト由来線維芽細胞のゼラチナーゼ発現増強作用を検討した。常法に従い、１２穴マイクロプレートに正常ヒト新生児包皮皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を３×１０４個／ｍｌの濃度で１ｍｌのＭｅｄｉｕｍ １０６培地（カスケードバイオロジクス製）に播き込み、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下で２日間培養した。次いで、増殖したＮＨＤＦに、実施例５−３の方法で得た組換え型ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を終濃度１μｇ／ｍｌ若しくは１０μｇ／ｍｌになるよう調整した無血清Ｄ−ＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２ガス存在下でさらに２日間培養した。培養終了後、遠心分離により培養上清を回収し、ゼラチナーゼ活性及びゼラチーナーゼＡ蛋白の測定に用いた。なお、組換え型ｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品の代わりにＦＬＡＧペプチドを終濃度１μｇ／ｍｌになるよう添加した以外は、同様に培養して得た培養上清を対照として用いた。
ゼラチナーゼ活性は、活性染色法により評価した。すなわち、それぞれの培養上清を１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含有する活性染色用ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供し、泳動後、ゲルをインキュベーションバッファー中で一晩処理することによりゼラチナーゼを活性化し反応させた。次いで、ゲル中のゼラチンをクーマシーブリリアントブルーで染色することにより、ゼラチンが分解したことにより生ずる白く抜けたバンドを検出した。このバンドの強度をデンシトメーターにて測定し、対照を１００として試験系のゼラチンを分解する活性を相対評価した。また、ゼラチナーゼＡ蛋白の発現量は、常法のウェスタンブロッティング法により評価した。すなわち、それぞれの培養上清１２μｌをアクリルアミド４乃至２０％のグラジエントゲル（第一化学薬品（株）製）を用い、常法により還元剤存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、蛋白質を常法に従ってニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜を、ブロッキング剤（商品名「ブロックエース」、大日本製薬（株）製）を用いてブロックした後、一次抗体として１μｇ／ｍｌの抗ゼラチナーゼＡ抗体（第一ファインケミカル（株）製、商品名『抗ヒトＭＭＰ−２抗体』）で処理し、さらに二次抗体として１０００倍に希釈した抗マウス免疫グロブリン−西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体（ダコ・ジャパン（株）製）で処理し、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（アマシャムバイオサイセンス（株）製）によりゼラチナーゼＡ蛋白を検出した。ウェスタンブロッティング法により検出されたバンドの強度をデンシトメーターにて測定し、対照におけるゼラチナーゼＡ蛋白の発現量を１００として相対評価した。結果を表１に示す。
表１の結果から明らかなように、無添加系（対照）に比べヒト由来組換え型ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬは、１μｇ／ｍｌの濃度で約３倍、１０μｇ／ｍｌの濃度で９倍以上と、用量依存的にＮＨＤＦにおけるゼラチナーゼＡ蛋白の発現を顕著に増強した。一方、活性染色法により評価したゼラチナーゼ活性では、組換え型ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬは、１μｇ／ｍｌの濃度で対照とほぼ同程度、１０μｇ／ｍｌの濃度では対照の約１．５倍であった。本試験において、組換え型ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬは用量依存的にＮＨＤＦにおけるゼラチナーゼＡ蛋白の発現を顕著に増強することにより、ゼラチナーゼ活性を増強することが判明した。本発明のポリペプチドは、ヒト由来線維芽細胞のゼラチナーゼ発現を顕著に増強することから、皮膚における創傷や炎症の治癒を促進するために用いることができる。
【実施例１２】
＜ポリペプチドの哺乳類由来線維芽細胞及び間葉系細胞のゼラチナーゼ発現増強作用＞
実施例５乃至１０の方法で得たヒト、ハムスター及びマウス由来組換えポリペプチド精製標品を用い、ヒト及びハムスター由来線維芽細胞、及びマウス由来間葉系細胞のゼラチナーゼ発現増強作用を検討した。常法に従い、１２穴マイクロプレートに正常ヒト新生児包皮皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ハムスター新生児皮膚由来線維芽細胞（ＦＢ）又はマウス胎児大動脈由来間葉系細胞（ＳＣ９−１９）を３×１０４個／ｍｌの濃度で１ｍｌの増殖因子を含む培地に播き込み、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２日間培養した。次いで、増殖したＮＨＤＦ、ＦＢ又はＳＣ９−１９に、実施例５乃至１０の方法で得たポリペプチド精製標品をそれぞれ終濃度１０μｇ／ｍｌになるよう調整した無血清Ｄ−ＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下でさらに２日間培養した。培養終了後、遠心分離により培養上清を回収し、ゼラチナーゼ活性の測定に用いた。なお、組換え型ポリペプチド精製標品の代わりにＦＬＡＧペプチドを終濃度１０μｇ／ｍｌになるよう添加した以外は、同様に培養して得た培養上清を対照として用いた。
線維芽細胞又は間葉系細胞で発現するゼラチナーゼ活性は、実施例１１で用いた活性染色法により評価した。すなわち、それぞれの培養上清を１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含有する活性染色用ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供し、泳動後、ゲルをインキュベーションバッファー中で一晩処理することにより酵素を活性化し反応させた。次いで、ゲル中のゼラチンをクーマシーブリリアントブルーで染色し、ゼラチンが分解したことにより生ずる白く抜けたバンドを検出した。このバンドの強度をデンシトメーターにて測定し、対照を１００として試験系のゼラチンを分解する活性を相対評価した。結果を表２に示す。
表２の結果から明らかなように、活性染色法により評価したゼラチナーゼ活性では、ＦＬＡＧペプチド添加系（対照）に比べ、ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ及びｈＡｇＫ１１４−１ｂＦＬは、ＮＨＤＦにおけるゼラチナーゼ活性を１．５倍及び１．４倍に、ハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬは、ＦＢにおけるゼラチナーゼ活性を１．２４倍に、また、マウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬ及びｍＡｇＫ１１４−１ｂは、いずれもＳＣ９−１９におけるゼラチナーゼ活性を約１．３倍に増強した。また、ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ及びハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬは、いずれもマウス由来間葉系細胞ＳＣ９−１９に対し、弱いながらもゼラチナーゼの発現を増強したことから、これらポリペプチドは種を越えてゼラチナーゼの発現増強能を発揮するものと推察された。本試験において、本発明における組換え型ポリペプチドは終濃度１０μｇ／ｍｌの添加条件下で線維芽細胞又は間葉系細胞におけるゼラチナーゼの発現を対照の１．２倍以上増強することが判明した。本発明のポリペプチドは、線維芽細胞又は間葉系細胞のゼラチナーゼ発現を顕著に増強することから、皮膚における創傷や炎症の治癒を促進するために用いることができる。
【実施例１３】
＜マウス由来ポリペプチドのゼラチナーゼ発現増強及び創傷治癒促進作用＞
８週齢の雄ＣＤ−１マウス２４匹を麻酔し、背部皮膚を脱毛した後、それぞれの正中線上の前後に１２ｍｍの線状創を２ヶ所、正中線をはさんで左右に８ｍｍ２の開放創２ヶ所を作製した。内８匹について、創傷作製直後、１日後、２日後に創傷１ヶ所につき実施例９−３の方法で調製したマウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを４μｇ（１０μｌのリン酸緩衝液に溶解したもの）ずつ塗布した。また、残り１６匹については、８匹にＦＬＡＧペプチドを０．２μｇ、８匹にウシ血清アルブミン４μｇをそれぞれ同様に塗布して対照とした。創傷作製７日後にそれぞれの創傷の大きさを測定するとともに、創傷部位の皮膚細胞を採取し、細胞を破砕した後、遠心分離上清についてゼラチナーゼの発現を実施例１１と同様にして活性染色法にて評価した。結果を表３に示す。
表３の結果から明らかなように、マウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬ塗布群では８匹中５匹においてゼラチナーゼの発現増強効果が認められ、発現増強の程度は約１．７倍であった。また、マウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬ塗布群は創傷７日後において、線状創及び開放創のいずれの面積においても対照群（ウシ血清アルブミン群）に比べ顕著に小さい値を示した。また、ＦＬＡＧペプチド塗布群はゼラチナーゼの発現及び創傷面積のいずれもが対照群との比較において有意な差は認められなかった。マウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬはマウス皮膚細胞におけるゼラチナーゼの発現を増強し、その結果として皮膚創傷の治癒を促進するものと判断された。
【実施例１４】
＜ヒト由来ポリペプチドのゼラチナーゼ発現増強及び創傷治癒促進作用＞
７週齢の雄ＣＤ−１マウス２２匹を麻酔し、背部皮膚を脱毛した後、それぞれの正中線の左に１５ｍｍの線状創２ヶ所を作製した。内１２匹について、創傷作製直後、１日後、２日後に創傷１ヶ所につき実施例５−３の方法で調製したヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬを１０μｇ（１０μｌの１０％グリセリン−ＰＢＳに溶解したもの）ずつ塗布した。また、残り１０匹についてはウシ血清アルブミン１０μｇ／１０μｌ−１０％グリセリンＰＢＳをそれぞれ同様に添加、塗布して対照とした。創傷作製７日後に創傷の大きさを測定した。また、マウス創傷部位におけるゼラチナーゼＡの発現を以下に示す免疫染色法にて評価した。まず、マウスの創傷部位の表皮組織を切り出し、１０％ホルマリンで固定した後、常法によりパラフィン包埋処理した。次いで、パラフィン切片を作製し、キシレンによる脱パラフィン処理後、水−アルコール混液で洗浄することにより段階的に有機溶媒濃度を下げて最終的にＰＢＳで洗浄した。続いて、０．３％の過酸化水素を含むメタノールで処理することにより内因性のパーオキシダーゼを失活させた後、ブロッキング剤（商品名「ブロックエースＴＭ」、大日本製薬（株）製）で室温で３０分間ブロッキングを行った。次いで、一次抗体として２５０倍希釈したマウス抗ヒトＭＭＰ−２（ゼラチナーゼＡ）抗体（第一ファインケミカル（株）製）を組織切片にのせ、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで一次抗体を洗い去り、続いてパーオキシダーゼでラベルしたヤギ抗マウスイムノグロブリン（商品名「ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ＴＭ」、ダコ・ジャパン（株）製）を二次抗体として室温で１時間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、パーオキシダーゼ発色試薬（Ｌｉｑｕｉｄ ＤＡＢ−Ｂｌａｃｋ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ、ザイメッド製）で発色処理を行った。水洗により発色を停止させ、常法によりヘマトキシリン（和光純薬工業（株）製）で核を染色した後、封入剤（商品名「エンテラン」、メルク（株）製）で封入処理し顕微鏡下で染色を観察した。免疫染色の結果は染色の程度を肉眼で観察し、「−」（染色されない）、「＋」（僅かに染色される）、「＋＋」（弱く染色される）及び「＋＋＋」（強く染色される）の４段階で評価した。結果を表４に示す。
表４の結果から明らかなように、創傷部におけるゼラチナーゼＡ蛋白の発現は、対照群では１０例中９例において１例が「＋＋＋」、５例が「＋＋」、３例が「＋」を示したのに対して、ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ塗布群では１２例中１１匹において６例が「＋＋＋」、４例が「＋＋」、１例が「＋」を示し、ヒト由来ポリペプチドの塗布によるゼラチナーゼＡ蛋白の発現増強作用が明らかに認められた。また、線状創の面積においてヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ塗布群は創傷７日後において６．０ｍｍ２と、対照群（ウシ血清アルブミン群）の１０．５ｍｍ２に比べ顕著に小さい値を示した。ヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬはマウス皮膚細胞におけるゼラチナーゼの発現を増強し、その結果として皮膚創傷の治癒を促進するものと判断された。
【実施例１５】
＜ハムスター由来ポリペプチドによるハムスター骨髄細胞の増殖促進作用＞
ハムスター成獣（８週齢、雌）の大腿骨から調製した骨髄細胞を１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて１×１０６個／ｍｌの濃度に調製し、コラーゲンでコートした９６ウェルのマイクロプレートに、１００μｌずつ播きこんだ。次いで、実施例８の方法で得たハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬを同様に１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて１２．５、２５μｇ／ｍｌの各濃度に調製し、これを１００μｌずつ添加し、総液量２００μｌとした（ポリペプチドの終濃度は６．２５、１２．５μｇ／ｍｌとなる）。６日間培養した後に、酸化−還元インディケーターである色素（トレック・ダイアグノスティック（株）製、商品名『アラマー・ブルー（ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ）』）を用いて５４４ｎｍを励起波長とし、５９０ｎｍを測定波長として蛍光強度を測定し、この蛍光強度を細胞増殖の指標として評価した。ポリペプチドを加えずに行ったものを対照とし、対照の蛍光強度を１００％としてポリペプチドを用いた場合の相対的な蛍光強度を相対細胞増殖率としてパーセントで表した。結果を表５に示した。
表５の結果から明らかなように、ポリペプチド濃度６．２５μｇ／ｍｌ及び１２．５μｇ／ｍｌのとき、骨髄細胞の増殖は対照を１００％とした場合、それぞれ約２２５％、３６８％であり、試験したハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬは用量依存的にハムスター骨髄細胞の増殖を促進した。本ポリペプチドはハムスターをはじめとする哺乳類由来の造血細胞の増殖を顕著に促進する生物作用を有している。
【実施例１６】
＜マウス由来ポリペプチドによるマウス骨髄細胞の増殖促進作用＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、雌）の大腿骨から調製した骨髄細胞を２０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むα最小培地（αＭＥＭ培地）を用いて７．６×１０６個／ｍｌの濃度に調製し、コラーゲンでコートした４ウェルのチャンバーに、１００μｌずつ播きこんだ。次いで、実施例９で得たマウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを同様に２０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むαＭＥＭ培地を用いて１００μｇ／ｍｌの濃度に調製し、これを１００μｌ添加し、総液量２００μｌとした（ポリペプチドの終濃度は５０μｇ／ｍｌとなる）。４日間培養した後、増殖した細胞を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、常法に従いメタノール処理した後、ギムザ染色を行った。次いで、この顕微鏡写真を撮影し、無作為に４視野を選択して細胞数を数え、１視野当たりの平均細胞数を算出した。ポリペプチドを加えずに同様に行ったものを対照とし、対照の細胞数を１００％としてポリペプチドを用いた場合の相対細胞数をパーセントで表した。結果を表６に示した。
表６の結果から明らかなように、ポリペプチド濃度５０μｇ／ｍｌの条件下で、骨髄細胞の増殖は対照を１００％とした時、約２６８％であり、試験したマウス由来ポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬはマウス骨髄細胞の増殖を顕著に促進した。本ポリペプチドはマウスをはじめとする哺乳類由来の造血細胞の増殖を顕著に促進する生物作用を有している。
【実施例１７】
＜ハムスター由来ポリペプチドによるマウス骨髄細胞の増殖促進作用＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、雌）の大腿骨から調製した骨髄細胞を１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて１×１０６個／ｍｌの濃度に調製し、コラーゲンでコートした９６ウェルのマイクロプレートに、１００μｌずつ播きこんだ。次いで、実施例８で得たハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬを同様に１０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて２５μｇ／ｍｌの濃度に調製し、これを１００μｌ添加し、総液量２００μｌとした（ポリペプチドの終濃度は１２．５μｇ／ｍｌとなる）。６日間培養した後、増殖した細胞を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、常法に従いメタノール処理した後、ギムザ染色を行った。次いで、この顕微鏡写真を撮影し、無作為に４視野を選択して細胞数を数え、１視野当たりの平均細胞数を算出した。ポリペプチドを加えずに同様に行ったものを対照とし、対照の細胞数を１００％としてポリペプチドを用いた場合の相対細胞数をパーセントで表した。結果を表７に示した。
表７の結果から明らかなように、ポリペプチド濃度１２．５μｇ／ｍｌの条件下で、骨髄細胞の増殖は対照を１００％とした時、約３７０％であり、試験したハムスター由来ポリペプチドｈａｍＡｇＫ１１４−１ｄ２ＦＬは種の異なるマウス由来の骨髄細胞の増殖をも顕著に促進した。本ポリペプチドはハムスター、マウスをはじめとする哺乳類由来の造血細胞の増殖を顕著に促進する生物作用を有している。
【実施例１８】
＜ヒト由来ポリペプチドによるマウス骨髄細胞の増殖促進作用＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、雌）の大腿骨から調製した造血細胞を含む骨髄由来細胞を２０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて７．５×１０５個／ｍｌの濃度に調製し、コラーゲンでコートした８ウェルのチャンバースライド（ナルジェ ヌンク インターナショナル（株）製）に、２００μｌずつ播きこんだ。次いで、実施例５の方法で得たヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬの精製標品を同様に２０（ｖ／ｖ）％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて５μｇ／ｍｌの濃度に調製し、これを２００μｌ添加し、総液量４００μｌとした（細胞の終濃度は３．７５×１０５個／ｍｌポリペプチドの終濃度は２．５μｇ／ｍｌとなる）。３７℃、５％ＣＯ２存在下で６日間培養した後、増殖した細胞を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、常法に従いメタノール処理した後、ギムザ染色を行った。次いで、この顕微鏡写真を撮影し、無作為に１２視野を選択して細胞数を数え、１視野当たりの平均細胞数を算出した。ポリペプチドを加えずに同様に行ったものを対照とし、対照の細胞数を１００％としてポリペプチドを用いた場合の相対細胞数をパーセントで表した。結果を表８に示した。
表８の結果から明らかなように、ポリペプチド濃度２．５μｇ／ｍｌの条件下で、骨髄細胞の増殖は対照を１００％とした時、約１４４％であり、試験したヒト由来ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬは種の異なるマウス由来の骨髄由来細胞の増殖を顕著に促進した。本ポリペプチドはヒト、マウスをはじめとする哺乳類由来の造血細胞の増殖を顕著に促進する生物作用を有している。
【実施例１９】
＜急性毒性試験＞
５％（ｗ／ｗ）アラビアガムを含む生理食塩水に、実施例５−３の方法で得たヒト由来ポリペプチド、実施例８−３の方法で得たハムスター由来ポリペプチド又は実施例９−３の方法で得たマウス由来のポリペプチドの適量をそれぞれ溶解した後、常法に従いろ過除菌した。これらを体重２０乃至２５ｇのｄｄＹマウス（１０匹／群）の腹腔内に注射投与するか、胃ゾンデにより経口投与した後、７日間に亙って経過を観察した。その結果、いずれの試料、いずれの投与経路によっても、試みた最大投与量である２０ｍｇ／ｋｇ体重においても死亡例が認められなかった。この結果は本発明のポリペプチドが、ヒトを含む哺乳類に常用しても安全な物質であることを示している。
【実施例２０】
＜マウス皮膚パッチテスト＞
実施例５で得たヒト由来ポリペプチド、実施例８の方法で得たハムスター由来ポリペプチド又は実施例１０の方法で得たマウス由来のポリペプチドの適量をそれぞれ生理食塩水に溶解した後、それぞれパッチテスト用絆創膏（大正製薬（株）製）の円形のろ紙に５０μｌ滴下した。これらを予め背部を常法通り脱毛クリームで脱毛した体重２０乃至２５ｇのｄｄＹマウス（１０匹／群）の皮膚に２４時間貼付した。次いで、貼付試料を除去し、３０分経過後に肉眼判定を行い、紅斑、浮腫、丘疹などの有無を調べた。その結果、いずれの試料によっても、試みた最大投与量である５０μｇ／パッチにおいても皮膚に異常は認められなかった。この結果は本発明のポリペプチドが、ヒトを含む哺乳類の皮膚に常用しても安全な物質であることを示している。
【実施例２１】
＜ポリクローナル抗体の調製＞
ＪＷウサギ（雌、体重２．５ｋｇ）を以下のスケジュールで免疫感作した。初回免疫として、常法により完全フロイントアジュバントとともに実施例５−３の方法で得たヒト由来組換えポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬを抗原として２００μｇ／匹の用量で皮下に注射投与した。その後２週間おきに、追加免疫として、不完全フロイントアジュバントとともに同じ抗原を同じ用量で皮下に計２回注射投与した。常法によりウサギの耳静脈より血液を採取し、その血液から分離した血清の該抗原との免疫反応性を常法により調べ、所期の抗体価の上昇を確認した。引き続いて抗原を、アジュバントを用いずに１００μｇ／匹の用量で静脈内に１回注射投与した。最終免疫の終了後７日目に頸動脈より全採血を行い抗血清を得た。なお、上記の操作により、ウサギの血清において所期の抗体価の上昇が確認されたことは、この血清が本発明のポリペプチドに対するポリクローナル抗体を含む抗血清であることを示している。したがって、本実施例の方法によれば本発明のポリペプチドと反応するポリクローナル抗体を調製することができる。
本例のポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明のポリペプチドの生物作用を抑制・調節する上で有用である。
【実施例２２】
＜モノクローナル抗体の調製＞
８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを実施例７−３の方法で得たヒト由来組換えポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ｂＦＬを用いて免疫感作し、免疫感作したマウスより脾臓を摘出して抗体産生細胞を得た。次いで、抗体産生細胞とマウス骨髄腫由来のＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）を無血清培地に浮遊させ、両細胞を十分に混和した。洗浄した細胞を常法により細胞融合させ、ハイブリドーマを選択的に培養した結果、本発明のポリペプチドに対して免疫反応性を示す培養上清液が認められた。ハイブリドーマを採取し、限界希釈法を適用してハイブリドーマのクローンを樹立した。樹立したハイブリドーマを常法にしたがって培養し、分析したところ、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するものであった。
本例のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明のポリペプチドの生物作用を抑制・調節する上で有用である。
【実施例２３】
＜ポリクローナル抗体の調製＞
免疫感作に用いる抗原として実施例９−３の方法で得たマウス由来組換えポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを用いた以外は実施例２１と同様に操作して組換えポリペプチドに対するポリクローナル抗体を含む抗血清を得た。
本例のポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明のポリペプチドの生物作用を抑制・調節する上で有用である。
【実施例２４】
＜モノクローナル抗体の調製＞
免疫感作に用いる抗原として実施例９−３の方法で得たマウス由来組換えポリペプチドｓｍＡｇＫ１１４−１ＦＬを用い、ラットを免疫した以外は実施例２２と同様に操作し、ハイブリドーマのクローンを樹立した。樹立したハイブリドーマを常法にしたがって培養し、分析したところ、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するものであった。
本例のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明のポリペプチドの生物作用を抑制調節する上で有用である。
【実施例２５】
＜抗体の血管内皮細胞の増殖抑制作用＞
ＣＤ−１マウス（８週齢、雄）を麻酔し、背部大動脈を無菌的に取り出した。得られた大動脈をＰＢＳで洗浄した後、滅菌したメスで幅約１ｍｍの輪状に細切りした。次いで、この大動脈片をゼラチンコートした６穴プレート内に静置し、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地で常法により２４時間培養した。培養後、培地を除去し、実施例２４の方法で得たマウスポリペプチドに対するモノクローナル抗体を５μｇ／ｍｌ含む内皮細胞増殖用無血清培地を新たに加え、さらに１０日間培養した。抗体を含まない培地を用い同様に処理したものを対照とした。培養後、血管内から増殖して出てくる内皮細胞の増殖性を、位相差顕微鏡を用いて肉眼観察した。その結果、抗体を添加した試験群では対照に比べ内皮細胞の増殖が明らかに抑制されていた。本発明の抗体は血管新生を抑制する作用を有する可能性があり、血管新生による癌や癌転移による疾患に有用である。
【実施例２６】
＜抗体の皮脂産生抑制作用＞
ＣＤ−１マウス（５週齢、雄）の背部皮膚から常法により皮脂細胞を調製した。この皮脂細胞を、６％ＦＣＳと２％ヒト血清を含むＤ−ＭＥＭ：Ｈａｍ’ｓＦ１２（１：１）混合培地を用いて１×１０３個／ｃｍ２に調整し、径６０ｍｍのディッシュに播きこんだ。これに、実施例２４の方法で得たマウスポリペプチドに対するモノクローナル抗体を１０μｇ／ｍｌとなるように添加し、常法により１４日間培養した。抗体を含まない培地を用い同様に処理したものを対照とした。培養後、回収した皮脂細胞にＰＢＳで１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調整したナイルレッド染色液を加え、暗所にて室温で２０分間反応させた。反応終了後、フローサイトメトリー分析により、細胞内に脂肪球（主にトリグリセリド、遊離脂肪酸、コレステロール、ワックスエステル類などから構成される）を形成した細胞の割合を調べた。その結果、抗体を添加した群は対照群に比べ皮脂細胞内に形成される脂肪球を形成する割合が低いことが分かった。このことから、本発明の抗体は皮脂細胞における脂肪球の生成を抑制しニキビなどの皮膚炎の緩和に有用である。
【実施例２７】
＜キメラ抗体及びヒト化抗体＞
キメラ抗体としての形態の本発明の抗体は以下のようにして調製する。まず、実施例２２の方法で得た本発明のヒト由来ポリペプチドに対するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンを常法に従って培養し、バイオテクス社製のＲＮＡ調製用試薬『ウルトラスペック ＬＳ ＩＩ』などを用いて常法によりハイブリドーマ由来の全ＲＮＡを調製し、この全ＲＮＡを用いて常法通り逆転写酵素を作用させｃＤＮＡを得る。次いで、エス・タラン・ジョーンズら、『バイオテクノロジー』、第９巻、８８乃至８９頁（１９９１年）に記載されたＰＣＲプライマーを参考にしてＰＣＲプライマーを設計し、抗体の軽鎖における可変領域をコードするｃＤＮＡ断片と抗体の重鎖における可変領域をコードするｃＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲにより増幅する。次いで、それぞれのＰＣＲ産物より、増幅されたｃＤＮＡをポリエチレングリコール沈殿などにより回収し、『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ ＳＫ（＋）』などのプラスミドベクターにクローン化する。この得られたベクターを用いて大腸菌を形質転換し、形質転換体を培養して菌体を採取し、次いで、菌体から組換えＤＮＡを採取する。通常のジデオキシ法により抗体の軽鎖における可変領域をコードするｃＤＮＡ及び抗体の重鎖における可変領域をコードするｃＤＮＡの塩基配列を解読し、コードしているアミノ酸配列を解明する。次いで、明らかにしたアミノ酸配列とマウス抗体についてすでに報告されている可変領域のアミノ酸配列とを比較・照合することにより本発明のマウス抗体における軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定する。
引き続き、ヒトイムノグロブリンの軽鎖（κ鎖）の定常領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡを、ピー・エー・ハイターら、『セル』、第２２巻、１９７乃至２０７頁（１９８０年）に記載の方法に従って、ヒト遺伝子ライブラリーより単離する。次に、単離したＤＮＡを鋳型として、通常のＰＣＲにより、実質的に軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡのみからなるＤＮＡ（「ヒト軽鎖定常領域ＤＮＡ」という。）を得る。引き続いて、前記でクローン化したマウス抗体の軽鎖における可変領域をコードするＤＮＡ（「マウス軽鎖可変領域ＤＮＡ」という。）を得る。これらのヒト軽鎖定常領域ＤＮＡ及びマウス軽鎖可変領域ＤＮＡを鋳型として、ロバート・エム・ホートンら、『メソッズ・インエンザイモロジー』、第２１７巻、２７０乃至２７９頁（１９９３年）に記載の『オーバーラップ・エクステンション法』を適用して、マウス軽鎖可変領域ＤＮＡの下流にヒト軽鎖定常領域ＤＮＡが連結され、５′末端及び３′末端部分に制限酵素認識配列を含んでなるＤＮＡを得る。一方、発現ベクターとして、『ｐＳＶ２−ｎｅｏ』（ＡＴＣＣ ３７１４９）などのような、大腸菌における複製開始点、哺乳類の細胞内で機能するプロモーター及び／又はエンハンサー、それらの制御下に位置する制限酵素認識配列、選択配列などを含むＤＮＡを準備する。この発現ベクターと、上記で得たヒト軽鎖定常領域ＤＮＡ及びマウス軽鎖可変領域ＤＮＡを含むＤＮＡとを、それぞれ制限酵素で切断した後、混合し、リガーゼを用いて連結して、キメラ抗体の軽鎖をコードするＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡを得る。
これとは別途、ＩｇＧのクラスに属するヒトイムノグロブリンの重鎖（γ鎖）の定常領域をコードするＤＮＡを、エヌ・タカハシら、『セル』、第２９巻、６７１乃至６７９頁（１９８２年）に記載の方法に従って、ヒト遺伝子ライブラリーより単離する。単離したＤＮＡにおいて、重鎖の定常領域をコードする部分は、当該論文に記載のとおり、４個の独立したエクソンからなる。単離したＤＮＡを錆型として、前記『オーバーラップ・エクステンション法』を適用して、４個のエクソンを連結してなるＤＮＡ（「ヒト重鎖定常領域ＤＮＡ」という。）を得る。引き続いて、前記でクローン化したマウス抗体の重鎖における可変領域をコードするＤＮＡ（「マウス重鎖可変領域ＤＮＡ」という。）を得る。これらのヒト重鎖定常領域ＤＮＡ及びマウス重鎖可変領域ＤＮＡを鋳型として、前記『オーバーラップ・エクステンション法』を適用して、マウス重鎖可変領域ＤＮＡの下流にヒト重鎖定常領域ＤＮＡが連結され、５′末端及び３′末端部分に制限酵素認識配列を含んでなるＤＮＡを得る。一方、発現ベクターとして、『ｐＳＶ２−ｇｐｔ』（ＡＴＣＣ ３７１４５）などのような、大腸菌における複製開始点、哺乳類の細胞内で機能するプロモーター及び／又はエンハンサー、それらの制御下に位置する制限酵素認識配列、選択配列などを含むＤＮＡを準備する。この発現ベクターと、上記で得たヒト重鎖定常領域ＤＮＡ及びマウス重鎖可変領域ＤＮＡを含むＤＮＡとを、それぞれ制限酵素で切断した後、混合し、リガーゼを用いて連結して、キメラ抗体の重鎖をコードするＤＮＡを含んでなる組換えＤＮＡを得る。
次に、以上の、キメラ抗体の軽鎖と重鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ含んでなる組換えＤＮＡを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）などの哺乳類の株化細胞にエレクトロポレーション法により同時に導入する。ＤＮＡの導入の結果得られる細胞群を、発現ベクターにおける選択配列に基づいて選択し、選択された細胞をそれぞれ培養する。それぞれの培養上清につき、実施例１１又は実施例１８に記載の方法により本発明のヒト由来ポリペプチドの生物作用の中和能の有無を調べる。所期の中和能が認められた培養上清の由来する細胞に限界希釈法を適用し、単一細胞とし、キメラ抗体の形態の本発明の抗体を産生する形質転換体を得る。この形質転換体を、培養規模を拡大しつつ培養して、その培養上清から、通常の抗体の精製方法に従って抗体を精製し、キメラ抗体の形態の本発明の抗体を得る。かくして得られる本発明の抗体は本発明のポリペプチドに対するマウス抗体と同様に、効果的に本発明のヒト由来ポリペプチドの中和能を発揮する。また、本キメラ抗体の枠組構造と相同性を有するヒト起源の抗体の枠組構造を、データベースを用いて検索し、相同性の認められたヒト起源の枠組構造と同様のアミノ酸配列を有するよう、本実施例におけるＤＮＡを改変し、発現させれば、ヒト起源の枠組み構造を有するヒト化抗体としての抗体が得られる。さらに、斯くして得られるヒト化抗体のアミノ酸配列に基づいて、慣用の蛋白構造解析用のソフトウェアを用いて立体構造を予測し、元のモノクローナル抗体のアミノ酸配列から同様にして予測される立体構造と比較し、元のマウス抗体により近い立体構造を持つようにさらにＤＮＡを改変し、発現させれば、元のマウスモノクローナル抗体と実質的に同等の機能を有するヒト化抗体が得られる。本実施例にしたがって得られるキメラ抗体並びに、斯かる抗体を改変して得られるヒト化抗体は、感受性疾患の治療に有用である。
【実施例２８】
＜液状組成物＞
生理食塩水に実施例５の方法で調製した組換え型融合ポリペプチドｈＡｇＫ１１４−１ａＦＬ精製標品を０．１質量％及びヒト血清アルブミンを０．１質量％になるよう溶解した後、溶液を常法に従って精密濾過により滅菌して液状の組成物を得た。
本品は、創傷や炎症などの皮膚の障害部位に適用すると細胞におけるゼラチナーゼの発現を増強し、皮膚の創傷治療やアトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎などの各種皮膚障害を改善するための外用剤などとして有用である。また、造血細胞の培養時に培地に添加すると造血細胞の増殖を顕著に促進することから骨髄移植時などにおける造血細胞の増幅などに有用である。
【実施例２９】
＜皮膚外用クリーム＞
以下の成分を、以下の配合に従って、常法により加熱しつつ混合した。
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン
２．０質量部
自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ５．０質量部
ベヘニン酸エイコサニル １．０質量部
流動パラフィン １．９質量部
トリオクタン酸トリメチロールプロパン １０．０質量部
上記の混合物に、液状組成物を除く以下の成分を以下の配合に従って添加・混合し、３０℃以下にまで冷却した後に、さらに実施例２８で得た液状組成物を以下の配合で加え、ホモジナイザーによリ乳化して、皮膚外用クリームを製造した。
１，３−ブチレングリコール ５．０質量部
乳酸ナトリウム液 １０．０質量部
パラオキシ安息香酸メチル ０．１質量部
モモ葉エキス １．５質量部
精製水 ５２．２質量部
実施例２８の方法で得た液状組成物 １０．０質量部
本クリームは、優れた保湿性を示す上、皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現を増強することから、創傷の治癒を促進し、皮膚炎などの症状を緩和するための皮膚外用クリームとして有用である。
【実施例３０】
＜液剤＞
安定剤として高純度含水結晶トレハロース（（株）林原商事販売、登録商標「トレハ」）を１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水に、実施例２２の方法で調製した抗体を濃度１ｍｇ／ｍｌになるよう溶解し、常法によりパイロジェンを除去し、精密濾過により除菌して液剤を得た。安定性に優れた本品は、本発明のポリペプチドによる皮膚細胞におけるゼラチナーゼの過剰発現や造血細胞の過剰増殖の抑制剤として有用である。
【実施例３１】
＜乾燥注射剤＞
安定化剤としてスクロースを１％（ｗ／ｖ）含む生理食塩水１００ｍｌに実施例２７の方法に従って得られるヒト化抗体１００ｍｇを溶解し、常法に従って精密濾過により除菌した後、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥した後、密栓する。
安定性に優れた本品は、感受性疾患を治療・予防するための乾燥注射剤として有用である。また、本品は血管新生抑制剤や皮脂産生抑制剤として有用である。
【産業上の利用可能性】
本発明のポリペプチドは、哺乳類の皮膚細胞におけるゼラチナーゼ発現増強作用を有しており、皮膚の創傷を治療するため、又は紫外線による皮膚炎、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎などの様々な皮膚障害を改善するため、さらには再生医療のための医薬品などとして極めて有用である。また、化粧品として利用する場合には、皮膚疾患に対する治療効果の改善などに奏効する。また、本発明のポリペプチドは造血細胞の増殖を顕著に促進する作用を有しており、研究用途をはじめ、医薬品の分野では化学療法・放射線療法による癌治療時、骨随移植時、生体外での造血細胞の増幅時の造血細胞増殖促進剤などとして用いることができる。一方、本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドの精製や、本発明のポリペプチドを定性的又は定量的に検出するための、例えば、蛍光免疫測定法、酵素免疫測定法などにおいて極めて有用である。また、本発明の抗体は皮膚細胞におけるゼラチナーゼの過剰発現や、造血細胞の過剰増殖を抑制する目的で用いることができる。さらには、本発明の抗体は感受性疾患の冶療・予防剤としても用いることができる。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明である。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
哺乳類の皮膚細胞においてゼラチナーゼ発現を増強する生物作用、及び／又は、哺乳類の造血細胞の増殖を促進する生物作用を有する請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列において、所期の生物作用を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第２項記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
ＤＮＡが、配列表における配列番号１１乃至１７のいずれかで示される塩基配列、又はそれらの塩基配列に相補的な塩基配列を有する請求の範囲第５項記載のＤＮＡ。
【請求項７】
ＤＮＡが、コードするアミノ酸配列を変えない範囲で配列表における配列番号１１乃至１７のいずれかで示される塩基配列における１個又は２個以上の塩基が他の塩基で置換された請求の範囲第６項記載のＤＮＡ。
【請求項８】
ポリペプチドが、請求の範囲第５項乃至第７項記載のＤＮＡを人為的に発現させることにより得られるものである請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを産生し得る細胞又は微生物を培養する工程と、産生したポリペプチドを培養物から採取する工程とを含んでなるポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１１】
抗体が、ポリクローナル抗体である請求の範囲第１０項記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が、モノクローナル抗体である請求の範囲第１０項記載の抗体。
【請求項１３】
配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列における連続する１０個以上のアミノ酸残基からなるペプチド断片。
【請求項１４】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現増強方法。
【請求項１５】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする創傷の治療方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする哺乳類の造血細胞の増殖促進方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする、生体外で骨髄移植用造血細胞を増殖させる方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする哺乳類の皮膚細胞におけるゼラチナーゼの過剰発現の抑制方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とするゼラチナーゼの過剰発現に伴う疾病、病気の診断若しくは治療方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする造血細胞の過剰増殖の抑制方法。
【請求項２１】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする造血細胞の過剰増殖に伴う疾病、病気の診断若しくは治療方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含んでなる組成物。
【請求項２３】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を有効成分として含んでなる組成物。
【請求項２４】
化粧品、医薬品又は試薬の形態にある請求の範囲第２２項又は第２３項記載の組成物。
【請求項２５】
ゼラチナーゼ発現増強剤としての請求の範囲第２２項記載の組成物。
【請求項２６】
創傷治癒促進剤としての請求の範囲第２２項記載の組成物。
【請求項２７】
造血細胞増殖促進剤としての請求の範囲第２２項記載の組成物。
【請求項２８】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を有効成分として含んでなる感受性疾患剤。
【請求項２９】
抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である請求の範囲第２８項記載の感受性疾患剤。
【請求項３０】
血管新生抑制剤としての請求の範囲第２８項又は第２９項記載の感受性疾患剤。
【請求項３１】
皮脂産生抑制剤としての請求の範囲第２８項又は第２９項記載の感受性疾患剤。
【請求項１】
配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
哺乳類の皮膚細胞においてゼラチナーゼ発現を増強する生物作用、及び／又は、哺乳類の造血細胞の増殖を促進する生物作用を有する請求の範囲第１項記載のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが、配列表における配列番号１乃至３のいずれかで示される部分アミノ酸配列において、所期の生物作用を実質的に失わない範囲で、アミノ酸の１個又は２個以上が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列を有する請求の範囲第２項記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
ＤＮＡが、配列表における配列番号１１乃至１７のいずれかで示される塩基配列、又はそれらの塩基配列に相補的な塩基配列を有する請求の範囲第５項記載のＤＮＡ。
【請求項７】
ＤＮＡが、コードするアミノ酸配列を変えない範囲で配列表における配列番号１１乃至１７のいずれかで示される塩基配列における１個又は２個以上の塩基が他の塩基で置換された請求の範囲第６項記載のＤＮＡ。
【請求項８】
ポリペプチドが、請求の範囲第５項乃至第７項記載のＤＮＡを人為的に発現させることにより得られるものである請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを産生し得る細胞又は微生物を培養する工程と、産生したポリペプチドを培養物から採取する工程とを含んでなるポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１１】
抗体が、ポリクローナル抗体である請求の範囲第１０項記載の抗体。
【請求項１２】
抗体が、モノクローナル抗体である請求の範囲第１０項記載の抗体。
【請求項１３】
配列表における配列番号４乃至１０のいずれかで示されるアミノ酸配列における連続する１０個以上のアミノ酸残基からなるペプチド断片。
【請求項１４】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする哺乳類の皮膚細胞のゼラチナーゼ発現増強方法。
【請求項１５】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする創傷の治療方法。
【請求項１６】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする哺乳類の造血細胞の増殖促進方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを用いることを特徴とする、生体外で骨髄移植用造血細胞を増殖させる方法。
【請求項１８】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする哺乳類の皮膚細胞におけるゼラチナーゼの過剰発現の抑制方法。
【請求項１９】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とするゼラチナーゼの過剰発現に伴う疾病、病気の診断若しくは治療方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする造血細胞の過剰増殖の抑制方法。
【請求項２１】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする造血細胞の過剰増殖に伴う疾病、病気の診断若しくは治療方法。
【請求項２２】
請求の範囲第１項乃至第４項及び第８項のいずれかに記載のポリペプチドを有効成分として含んでなる組成物。
【請求項２３】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を有効成分として含んでなる組成物。
【請求項２４】
化粧品、医薬品又は試薬の形態にある請求の範囲第２２項又は第２３項記載の組成物。
【請求項２５】
ゼラチナーゼ発現増強剤としての請求の範囲第２２項記載の組成物。
【請求項２６】
創傷治癒促進剤としての請求の範囲第２２項記載の組成物。
【請求項２７】
造血細胞増殖促進剤としての請求の範囲第２２項記載の組成物。
【請求項２８】
請求の範囲第１０項乃至第１２項のいずれかに記載の抗体を有効成分として含んでなる感受性疾患剤。
【請求項２９】
抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である請求の範囲第２８項記載の感受性疾患剤。
【請求項３０】
血管新生抑制剤としての請求の範囲第２８項又は第２９項記載の感受性疾患剤。
【請求項３１】
皮脂産生抑制剤としての請求の範囲第２８項又は第２９項記載の感受性疾患剤。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４２０５６
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【発行日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４９６２７（Ｐ２００４−５４９６２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４１６１
【国際出願日】平成１５年１１月６日（２００３．１１．６）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【発行日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１４１６１
【国際出願日】平成１５年１１月６日（２００３．１１．６）
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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