精巣精上皮腫の診断方法
精巣精上皮腫（TS）を検出および診断する客観的な方法を本明細書において記述する。一つの態様において、本診断法は、TS細胞と正常細胞とを識別するTS関連遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む。本発明は、TSの治療において有用な治療薬剤をスクリーニングする方法、TSを治療する方法、およびTSに対するワクチンを被験者に接種する方法をさらに提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、精巣精上皮腫を診断する方法に関する。
【０００２】
優先権に関する情報
本出願は、2002年9月30日に提出された米国特許出願第60/414,677号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
精巣の生殖細胞腫瘍（TGCT）が男性の全ての癌に占める割合は約1〜2％であるが、それらは、年齢20〜40歳群の男性において認められる最も一般的な癌であり（1）、その発生率は過去数十年のあいだにますます増加しつつある（2,3）。TGCTは、二つの主な組織学タイプに分類され、一つは、未分化の生殖細胞に類似する精上皮腫であり、もう一つはいずれの経路にも分化能を有するために胚および胚体外組織の双方に類似しうる非精上皮腫である（7）。精上皮腫は、TGCTにおける最も一般的な組織学的精巣腫瘍であり、TGCTの全症例の約60％〜65％を占める（8）。現在、αフェトプロテイン（AFP）、ヒトβサブユニット絨毛性性腺刺激ホルモン（HCGβ）、および乳酸脱水素酵素（LDH）が、TGCTの診断マーカーとして用いられている（9）。しかし、合胞体栄養性巨細胞を含まない精上皮腫の特異的腫瘍マーカーは同定されていない。
【０００４】
cDNAマイクロアレイ技術によって、正常および悪性細胞における包括的遺伝子発現プロファイルを得て、悪性細胞および対応する正常細胞における遺伝子発現を比較することが可能となった（Okabeら、Cancer Res. 61：2129〜37（2001）；Kitaharaら、Cancer Res. 61：3544〜9（2001）；Linら、Oncogene 21：4120〜8（2002）；Hasegawaら、Cancer Res. 62：7012〜7（2002））。このアプローチにより、癌細胞の複雑な特性を明らかにすることが可能となり、これは発癌のメカニズムを理解するために役立つ。腫瘍において脱制御される遺伝子を同定することによって、個々の癌のより精密で正確な診断を得ることができ、新規治療標的を開発することができる（Bienz and Clevers、Cell 103：311〜20（2000））。ゲノム全体での観点から腫瘍の基礎となるメカニズムを明らかにするため、そして診断のための標的分子の発見および新規治療薬の開発のために、本発明者らは、遺伝子23040個のcDNAマイクロアレイを用いて腫瘍細胞の発現プロファイルを解析している（Okabeら、Cancer Res. 61：2129〜37（2001）；Kitaharaら、Cancer Res. 61：3544〜9（2001）；Linら、Oncogene 21：4120〜8（2002）；Hasegawaら、Cancer Res. 62：7012〜7（2002））。
【０００５】
発癌メカニズムを解明するように計画された研究によって、抗腫瘍薬剤の分子標的の同定が既に促進されている。例えば、Rasに関連する増殖-シグナル伝達経路を阻害するように当初開発されたファルネキシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）（この活性は翻訳後のファルネシル化に依存する）は、動物モデルにおいてRas依存性腫瘍を治療するために有効である（Heら、Cell 99：335〜45（1999））。抗癌剤と、癌原遺伝子受容体HER2/neuに拮抗するための抗HER-2モノクローナル抗体トラスツズマブを併用したヒトに対する臨床試験が実施されており、乳癌患者の臨床応答および総生存率の改善が得られている（Linら、Cancer Res. 61：6345〜9（2001））。bcr-abl融合タンパク質を選択的に不活化するチロシンキナーゼ阻害剤STI-571は、bcr-ablチロシンキナーゼの構成的活性化が白血球の形質転換において重要な役割を果たしている慢性骨髄性白血病を治療するために開発されている。これらの種類の薬剤は、特定の遺伝子産物の発癌活性を抑制するように設計されている（Fujitaら、Cancer Res. 61：7722〜6（2001））。したがって、癌性細胞において一般的に上方制御される遺伝子産物は、新規抗癌剤を開発するための潜在的な標的として役立つ可能性がある。
【０００６】
CD8+細胞障害性Tリンパ球（CTL）は、MHCクラスI分子上に提示された腫瘍関連抗原（TAA）に由来するエピトープペプチドを認識して、腫瘍細胞を溶解することが証明されている。TAAの最初の例としてMAGEファミリーが発見されて以来、免疫学的アプローチを用いて他にも多くのTAAが発見されている（Boon、Int. J. Cancer 54：177〜80（1993）；Boonおよびvan der Bruggen、J. Exp. Med. 183：725〜9（1996）；van der Bruggenら、Science 254：1643〜7（1991）；Brichardら、J. Exp. Med.178：489〜95（1993）；Kawakamiら、J. Exp. Med. 180：347〜52（1994））。発見されたTAAのいくつかは、現在免疫治療の標的として臨床開発段階にある。これまで発見されたTAAには、MAGE（van der Bruggenら、Science 254：1643〜7（1991））、gp100（Kawakamiら、J. Exp. Med. 180：347〜52（1994））、SART（Shichijoら、J. Exp. Med. 187：277〜88（1998）、およびNY-ESO-1（Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：1914〜8（1997））が含まれる。一方、腫瘍細胞において特に過剰発現されることが示されている遺伝子産物は、細胞性免疫応答を誘導する標的として認識されることが示されている。そのような遺伝子産物には、p53（Umanoら、Brit. J. Cancer 84：1052〜7（2001））、HER2/neu（Tanakaら、Brit. J. Cancer 84：94〜9（2001））、CEA（Nukayaら、Int. J. Cancer 80：92〜7（1999））等が含まれる。
【０００７】
TAAに関する基礎および臨床研究における有意な進歩にもかかわらず（Rosenbergら、Nature Med. 4：321〜7（1998）；Mukherjiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：8078〜82（1995）；Huら、Cancer Res. 56：2479〜83（1996））、結腸癌を含む腺癌の治療に利用できるのは、ごく限られた数の候補TAAに過ぎない。癌細胞において豊富に発現されると共にその発現が癌細胞に限定されるTAAは、免疫療法の標的として有望な候補薬剤となるであろう。さらに、強力で特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導する新規TAAが同定されれば、様々なタイプの癌におけるペプチドワクチン接種法の臨床利用を促進すると期待される（Boonおよびvan der Bruggen、J. Exp. Med. 183：725〜9（1996）；van der Bruggenら、Science 254：1643〜7（1991）；Brichardら、J. Exp. Med.178：489〜95（1993）；Kawakamiら、J. Exp. Med. 180：347〜52（1994）；Shichijoら、J. Exp. Med. 187：277〜88（1998）；Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：1914〜8（1997）；Harris、J. Natl. Cancer Inst. 88：1442〜5（1996）；Butterfieldら、Cancer Res. 59：3134〜42（1999）；Vissersら、Cancer Res. 59：5554〜9（1999）；van der Burgら、J. Immunol. 156：3308〜14（1996）；Tanakaら、Cancer Res. 57：4465〜8（1997）；Fujieら、Int. J. Cancer 80：169〜72（1999）；Kikuchiら、Int. J. Cancer 81：459〜66（1999）；Oisoら、Int. J. Cancer 81：387〜94（1999））。
【０００８】
特定の健康なドナーからのペプチド刺激された末梢血単核球細胞（PBMC）は、ペプチドに応答して著しいIFN-γレベルを産生するが、51Cr-放出アッセイによるとHLA-A24または-A0201拘束的に腫瘍細胞に対して細胞障害性を発揮することはまれであることは繰り返し報告されている（Kawanoら、Cancer Res. 60：3550〜8（2000）；Nishizakaら、Cancer Res. 60：4830〜7（2000）；Tamuraら、Jpn. J. Cancer Res. 92：762〜7（2001））。しかし、HLA-A24およびHLA-A0201はいずれも、白人のみならず、日本人における一般的なHLA対立遺伝子の一つである（Dateら、Tissue Antigens 47：93〜101（1996）；Kondoら、J. Immunol. 155：4307〜12（1995）；Kuboら、J. Immunol. 152：3913〜24（1994）；Imanishiら、Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference、オックスフォード大学出版、オックスフォード、1065（1992）；Williamsら、Tissue Antigen 49：129（1997））。このように、これらのHLAによって提示される癌の抗原性ペプチドは、日本人および白人における癌の治療において特に有用となる可能性がある。さらに、インビトロでの低親和性CTLの誘導は、通常高濃度のペプチドを利用し、高レベルの特異的なペプチド／MHC複合体を、CTLを効果的に活性化する抗原提示細胞（APCs）上に生成することに起因することは知られている（Alexander-Millerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：4102〜7（1996））。
【０００９】
PYRIN含有Apaf-1様タンパク質（PYPAFs）は、最近同定されたタンパク質である（37）。ヒトには、PYPAF遺伝子14個が存在することが報告されている（38）。ロイシンリッチリピート、PYRIN、NACHT、およびNACHT関連ドメインを含むPYPAFタンパク質は全て、アポトーシスおよび炎症性シグナル伝達経路において機能を有すると考えられている。N末端のPYRINドメインは、タンパク質-タンパク質相互作用に関連することが報告されている（38）。さらに、NACHTドメインは、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子1（APAF-1）のヌクレオチド結合モチーフと配列相同性を有し、ATPに結合すると予想される（37）。しかし、PYRIN含有Apaf-1様タンパク質は腫瘍発生に決して関与していなかった。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、精巣精上皮腫（TS）に関連した遺伝子発現パターンの発見に基づく。TSにおいて発現に差のある遺伝子は、本明細書において集合的に「TS核酸」または「TSポリヌクレオチド」と呼ばれ、対応するコードされたポリペプチドは、「TSポリペプチド」または「TSタンパク質」と呼ばれる。
【００１１】
したがって、本発明は、組織試料のような患者に由来する生物学的試料におけるTS関連遺伝子の発現レベルを決定することによって、被験者におけるTSに対する素因を診断または決定する方法を特徴とする。TS関連遺伝子とは、正常細胞と比較して精巣生殖細胞腫瘍細胞から得られた細胞において発現レベルが異なることを特徴とする遺伝子を意味する。正常細胞は、精巣組織から得られた細胞である。TS関連遺伝子は、TS 1〜939の一つまたは複数である。遺伝子の正常対照レベルと比較して遺伝子の発現レベルが変化する、例えば増加または減少すれば、被験者がTSを有するか、または発症のリスクを有することを示している。
【００１２】
正常な対照レベルとは、正常な健康個体またはTSを有しないことがわかっている個体集団において検出された遺伝子発現レベルを意味する。対照レベルは、単一の参照集団または複数の発現パターンに由来する単一の発現パターンである。例えば、対照レベルは、既に試験された細胞からの発現パターンのデータベースでありうる。正常な個体は、TSの臨床症状を有しない個体である。
【００１３】
正常対照レベルと比較して被験試料においてTS 1〜346レベルの増加が検出されれば、（試料を採取した）被験者がTSを有するか、または発症するリスクを有することを示している。対照的に、正常な対照レベルと比較して被験試料においてTS 347〜939レベルの減少が検出されれば、被験者がTSを有する、または発症のリスクを有することを示している。
【００１４】
または、試料におけるTS関連遺伝子パネルの発現を、同じ遺伝子パネルのTS対照レベルと比較する。TS対照レベルとは、TSを有する集団において認められるTS関連遺伝子の発現プロファイルを意味する。
【００１５】
遺伝子発現は、対照レベルと比較して10％、25％、50％増加または減少する。または、遺伝子発現は、対照レベルと比較して0.1、0.2、1、2、5、10倍またはそれ以上増加または減少する。発現は、患者由来組織試料の遺伝子転写物に対するTS関連遺伝子プローブの、例えばアレイ上でのハイブリダイゼーションを検出することによって決定される。
【００１６】
患者由来組織試料は、試験被験者、例えばTSを有することがわかっているかまたは疑われる患者からの任意の組織である。例えば、組織は精巣生殖細胞腫瘍細胞を含む。例えば、組織は、精巣由来の細胞である。
【００１７】
本発明はまた、TS 1〜346の二つまたはそれ以上の遺伝子発現レベルのTS参照発現プロファイルを提供する。または、本発明は、TS 1〜346またはTS 347〜939の二つまたはそれ以上の発現レベルのTS参照発現プロファイルを提供する。
【００１８】
本発明はさらに、TS関連遺伝子を発現する被験細胞を試験薬剤に接触させる段階、およびTS関連遺伝子の発現レベルを決定する段階によって、TS関連遺伝子、例えばTS 1〜939の発現または活性を阻害または増強する薬剤を同定する方法を提供する。被験細胞は、精巣生殖細胞腫瘍由来の精巣細胞のような精巣細胞である。遺伝子の対照レベルと比較してレベルが減少すれば、試験薬剤がTS関連遺伝子の阻害剤であり、TSの症状を減少させることを示している。または、遺伝子の対照レベルまたは活性と比較してレベルまたは活性が増加すれば、その試験薬剤が、TS関連遺伝子の発現または機能のエンハンサーであり、TSの症状、例えばTS 347〜939を減少させることを示している。
【００１９】
本発明はまた、二つもしくはそれ以上のTS核酸配列に結合するか、または核酸配列にコードされる遺伝子産物に結合する検出試薬を有するキットを提供する。同様に、二つまたはそれ以上のTS核酸に結合する核酸のアレイも提供する。
【００２０】
治療法には、被験者にアンチセンス組成物を投与することによって被験者におけるTSを治療または予防する方法が含まれる。アンチセンス組成物は、特異的標的遺伝子の発現を減少させ、例えばアンチセンス組成物は、TS 1〜346からなる群より選択される配列と相補的であるヌクレオチドを含む。もう一つの方法には、短鎖干渉RNA（siRNA）組成物を被験者に投与する段階が含まれる。siRNA組成物は、TS 1〜346からなる群より選択される核酸の発現を減少させる。本発明者らは、精巣精上皮腫においてPYPAF3が一般的に上方制御されること、および低分子干渉RNAによるPYPAF3転写物のノックダウンで精巣生殖細胞腫瘍細胞の細胞増殖が阻害されることを立証した。
【００２１】
もう一つの方法において、被験者におけるTSの治療または予防は、被験者にリボザイム組成物を投与することによって行われる。核酸特異的リボザイム組成物は、TS 1〜346からなる群より選択される核酸の発現を減少させる。他の治療法には、TS 347〜939の発現またはTS 347〜939にコードされるポリペプチドの活性を増加させる化合物を被験者に投与する方法が含まれる。さらにTSは、TS 347〜939によりコードされるタンパク質を投与することによって治療することができる。タンパク質は患者に直接投与してもよく、または例えば目的の下方制御されたマーカー遺伝子を有する発現ベクターもしくは宿主細胞を投与することにより患者へ導入した後に、インビボで発現させてもよい。目的の遺伝子をインビボで発現させるための適切な手法は当技術分野で公知である。
【００２２】
本発明にはまた、ワクチンおよびワクチン接種法が含まれる。例えば、被験者におけるTSを治療または予防する方法は、TS 1〜346からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチドまたはそのようなポリペプチドの免疫学的活性断片を含むワクチンを被験者に投与することによって行われる。免疫学的活性断片は、完全長の天然に存在するタンパク質より長さが短く、免疫応答を誘導するポリペプチドである。例えば、免疫学的活性断片は、長さが少なくとも8残基であって、T細胞またはB細胞のような免疫細胞を刺激する。免疫細胞の刺激は、細胞増殖、サイトカイン（例えば、IL-2）の産生、または抗体の産生を検出することによって測定される。
【００２３】
特に定義していなければ、本明細書において用いた科学技術用語は全て、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記述の方法および材料と類似または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験において用いることができるが、適した方法および材料を下記に記述する。本明細書において言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および例は、一例に過ぎず、制限することを意図しない。
【００２４】
本明細書に記述の方法の一つの長所は、明白な臨床症状を検出する前に疾患が同定されることである。本発明のその他の特徴および長所は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００２５】
詳細な説明
本発明は、TS患者の精巣由来の細胞における多数の核酸配列発現パターンに変化を発見したことに一部基づいている。遺伝子発現の差は、包括的cDNAマイクロアレイシステムを用いて同定した。
【００２６】
遺伝子23,040個を含むcDNAマイクロアレイを用いて、患者13人の包括的遺伝子発現プロフィールを構築した。特定の遺伝子が、TS患者において低レベルまたは高レベルで発現される。本方法において、患者の血清または喀痰において癌関連タンパク質を検出する可能性のある候補分子マーカーを選択し、ヒト精巣癌におけるシグナル抑制戦略を開発するためのいくつかの可能性のある標的を発見した。
【００２７】
本明細書において同定された発現差のある遺伝子は、TSのマーカーとして、およびその発現がTSの症状を治療または軽減するために改変される遺伝子標的として、診断目的のために用いられる。
【００２８】
TS患者においてその発現レベルが変調している（すなわち、増加または減少している）遺伝子を、表2、3に要約し、本明細書において総称して「TS関連遺伝子」TS関連遺伝子「TS核酸」、または「TSポリヌクレオチド」と呼び、対応するコードされたポリペプチドを「TSポリペプチド」または「TSタンパク質」と呼ぶ。特に明記していなければ、「TS」は、本明細書に開示の任意の配列（例えば、TS 1〜939）を指すことを意味する。遺伝子は、以前に記述されており、データベースのアクセッション番号とともに示される。
【００２９】
細胞試料における様々な遺伝子の発現を測定することによって、TSが診断される。同様に、様々な薬剤に応答したこれらの遺伝子の発現を測定することによって、TSを治療するための薬剤を同定することができる。
【００３０】
本発明は、表2、3に記載したTS配列の少なくとも一つから全てまでの発現を決定する（例えば、測定する）ことを含む。既知の配列に関するGenBank（登録商標）データベース登録項目に提供された配列情報を用いて、TS関連遺伝子を当業者に周知である技術を用いて検出および測定する。例えば、TS配列に対応する配列データベース登録項目内の配列を用いて、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析においてTS RNA配列を検出するためのプローブを構築する。プローブには、参照配列の少なくとも10、20、50、100、200ヌクレオチドが含まれる。もう一つの例として、配列を用いて、例えば、逆転写を利用したポリメラーゼ連鎖反応のような増幅に基づく検出法においてTS配列を特異的に増幅するためのプライマーを構築することができる。
【００３１】
次に、被験細胞集団、例えば患者由来の組織試料におけるTS配列の一つまたは複数の発現レベルを、参照集団におけるいくつかの配列の発現レベルと比較する。参照細胞集団には、比較されるパラメータが既知である一つまたは複数の細胞、すなわち、TS細胞または非TS細胞が含まれる。
【００３２】
参照細胞集団と比較した被験細胞集団における遺伝子発現レベルがTSまたはそれに対する素因を示すか否かは、参照細胞集団の組成に依存する。例えば、参照細胞集団が非TS細胞からなる場合、被験細胞集団と参照細胞集団とにおける遺伝子発現パターンが類似であれば、被験細胞集団が非TSであることを示している。逆に、参照細胞集団がTS細胞で構成されている場合、被験細胞集団と参照細胞集団のあいだの遺伝子発現プロファイルが類似であれば、被験細胞集団にTS細胞が含まれることを示している。
【００３３】
被験細胞集団におけるTSマーカー遺伝子の発現レベルは、発現レベルが、参照細胞集団における対応するTS配列の発現レベルから1.0、1.5、2.0、5.0、10.0倍またはそれ以上参照細胞集団と異なる場合、発現レベルが変化していると見なされる。
【００３４】
被験細胞集団と参照細胞集団との遺伝子発現の差を、対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子に対して標準化する。例えば、対照核酸は、細胞の精巣腫瘍または非精巣腫瘍状態に応じて差がないことが知られている核酸である。試験核酸および参照核酸における対照核酸の発現レベルを用いて、比較される集団におけるシグナルレベルを標準化することができる。対照遺伝子には、β-アクチン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、またはリボソームタンパク質P1が含まれる。
【００３５】
被験細胞集団を複数の参照細胞集団と比較する。複数の参照集団のそれぞれは、既知のパラメータが異なってもよい。このように、被験細胞集団を、例えばTS細胞を含むことがわかっている第一の参照細胞集団と共に、例えば非TS細胞（正常細胞）を含むことがわかっている第二の参照集団と比較してもよい。被験細胞は、TS細胞を含むことがわかっているか、または含むことが疑われる被験者からの組織タイプまたは細胞試料に含まれる。
【００３６】
被験細胞は、生体組織または体液、例えば生物学的液体（血液または尿）から得る。例えば、被験細胞は、組織から精製される。好ましくは、被験細胞集団は上皮細胞を含む。上皮細胞は、TSであることがわかっているか、または疑われる組織から得る。
【００３７】
参照細胞集団における細胞は、被験細胞と類似の組織タイプに由来する。選択的に、参照細胞集団は、細胞株、例えばTS細胞株（陽性対照）または正常な非TS細胞株（陰性対照）である。または、対照細胞集団は、アッセイされるパラメータまたは条件が既知である細胞に由来する分子情報のデータベースに由来する。
【００３８】
被験者は好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、例えばヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシでありうる。
【００３９】
本明細書に開示される遺伝子の発現は、当技術分野において既知の方法を用いてタンパク質または核酸レベルで決定される。例えば、これらの配列の一つまたは複数を特異的に認識するプローブを用いるノーザンハイブリダイゼーション解析を用いて、遺伝子発現を決定することができる。または、発現は、例えば発現に差のある配列に対して特異的なプライマーを用いて、逆転写を利用したPCRアッセイを用いて測定される。発現はまた、タンパク質レベルで、すなわち本明細書に記載の遺伝子産物にコードされるポリペプチドのレベルまたはその生物学的活性を測定することによって決定される。そのような方法は当技術分野で周知であり、例えば遺伝子にコードされるタンパク質に対する抗体を利用したイムノアッセイが含まれる。遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性も同様に周知である。
【００４０】
TSの診断
TSは、被験細胞集団（すなわち患者に由来する生物学的試料）からの一つまたは複数のTS核酸配列の発現レベルを測定することによって診断される。好ましくは、被験細胞集団は、上皮細胞、例えば精巣組織から得た細胞を含む。遺伝子発現はまた、血液、または尿のような他の体液から測定される。他の生物学的試料は、タンパク質レベルを測定するために用いることができる。例えば、診断される被験者に由来する血液、または血清におけるタンパク質レベルは、イムノアッセイまたは生物学的アッセイによって測定することができる。
【００４１】
一つまたは複数のTS関連遺伝子、例えばTS 1〜939の発現を、被験細胞または生物学的試料において決定して、正常対照レベルの発現と比較する。正常対照レベルは、TSを有しないことがわかっている集団において典型的に認められるTS関連遺伝子の発現プロファイルである。TS関連遺伝子の患者由来組織試料における発現レベルが増加または減少すれば、被験者がTSを有するか、またはTS発症のリスクを有することを示している。例えば、正常対照レベルと比較して被験集団におけるTS 1〜346のレベルが増加すれば、被験者がTSを有するか、またはTS発症のリスクを有することを示している。逆に、正常対照レベルと比較して被験集団におけるTS 347〜939の発現が減少すれば、被験者がTSを有するか、または発症のリスクを有することを示している。
【００４２】
一つまたは複数のTS関連遺伝子が、正常対照レベルと比較して被験集団において変化している場合、被験者がTSを有するか、またはTS発症のリスクを有することを示している。例えば、TS関連遺伝子のパネル（TS 1〜346、TS 347〜939、またはTS 1〜939）の少なくとも1％、5％、25％、50％、60％、80％、90％またはそれ以上が変化している。
【００４３】
TS関連遺伝子の発現を阻害または増強する薬剤の同定
TS関連遺伝子の発現または活性を阻害する薬剤は、上方制御されたTS関連遺伝子を発現する被験細胞集団を試験薬剤に接触させ、TS関連遺伝子の発現レベルを決定することによって同定される。対照レベルと比較して（または試験薬剤の非存在下でのレベルと比較して）薬剤の存在下で発現が減少すれば、その薬剤が上方制御されたTS関連遺伝子の阻害剤であり、TSを阻害するのに有用であることを示している。
【００４４】
または、下方制御されたTS関連遺伝子の発現または活性を増強する薬剤は、TS関連遺伝子を発現する被験細胞集団を試験薬剤に接触させ、下方制御されたTS関連遺伝子の発現レベルまたは活性を決定することによって同定される。TS関連遺伝子の対照発現レベルまたは活性と比較して発現または活性が増加すれば、試験薬剤が下方制御されたTS関連遺伝子の発現または活性を増強することを示している。
【００４５】
被験細胞集団は、TS関連遺伝子を発現する任意の細胞である。例えば、被験細胞集団は、精巣に由来する細胞のような、上皮細胞を含む。例えば、被験細胞は、精巣生殖細胞腫瘍に由来する不死化細胞株である。または、被験細胞は、TS関連遺伝子を導入した細胞、またはレポーター遺伝子に機能的に結合したTS関連遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター配列）を導入した細胞である。
【００４６】
被験者におけるTS治療の有効性の評価
本明細書において同定された発現差のあるTS配列によって、TSの治療経過をモニターすることもできる。この方法において、被験細胞集団は、TSの治療を受けている被験者から提供される。望ましければ、被験細胞集団は、治療前、治療中、または治療後の様々な時点で被験者から得られる。次に、細胞集団における一つまたは複数のTS配列の発現を決定して、TS状態が既知である細胞を含む参照細胞集団と比較する。参照細胞は治療を受けていない。
【００４７】
参照細胞集団がTS細胞を含まない場合、被験細胞集団と参照細胞集団におけるTS配列の発現が類似であれば、治療が有効であることを示している。しかし、被験集団と正常対照参照細胞集団におけるTS配列の発現に差があれば、あまり好ましくない臨床転帰または予後を示している。
【００４８】
「有効」とは、治療によって、病理学的に上方制御された遺伝子の発現が減少するか、病理学的に下方制御された遺伝子の発現が増加するか、または被験者における精巣腫瘍の大きさ、発生率、もしくは転移能が減少することを意味する。治療を予防的に適用する場合、「有効である」とは、治療がTSの形成を遅らせるかもしくは防止すること、または臨床的なTSの症状を遅らせるか、予防するか、もしくは軽減することを意味する。精巣腫瘍の評価は、標準的な臨床プロトコールを用いて行われる。
【００４９】
有効性は、TSを診断または治療する任意の既知の方法に関連して決定される。TSは、例えば症候性の異常、例えば精巣の無痛腫脹を同定することによって診断される。
【００５０】
特定の個体にとって適切なTS治療用の治療薬剤の選択
個体における遺伝的構成の差によって、個体が様々な薬剤を代謝する相対的能力に差が起こりうる。被験者において代謝されて抗TS薬剤として作用する薬剤は、被験者の細胞において、TS状態に特徴的な遺伝子発現パターンから非TS状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの変化を誘導することによって顕在化しうる。したがって、薬剤が被験者において適したTS阻害剤であるか否かを決定するために、本明細書に開示される発現差のあるTS配列によって、選択された被験者からの被験細胞集団において推定の治療的または予防的なTS阻害剤を調べることができる。
【００５１】
特定の被験者にとって適当であるTSの阻害剤または増強剤を同定するために、被験者からの被験細胞集団を治療薬剤に曝露して、TS 1〜939配列の一つまたは複数の発現を決定する。
【００５２】
被験細胞集団は、TS関連遺伝子を発現するTS細胞を含む。好ましくは、被験細胞は上皮細胞である。例えば、被験細胞集団を候補薬剤の存在下でインキュベートし、被験試料の遺伝子発現パターンを測定して、一つまたは複数の参照プロファイル、例えばTS参照発現プロファイルまたは非TS参照発現プロファイルと比較する。
【００５３】
TSを含む参照細胞集団と比較して、被験細胞集団におけるTS 1〜346の一つもしくは複数の発現が減少するか、またはTS 347〜939の一つもしくは複数の発現が増加すれば、薬剤が治療効果があることを示している。
【００５４】
試験薬剤はいかなる化合物または組成物であってよい。例えば、試験薬剤は免疫調節剤である。
【００５５】
治療薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイ
本明細書に開示される発現差のある配列はまた、TSを治療するための候補治療薬剤を同定するためにも用いることができる。この方法は、候補治療薬剤をスクリーニングし、その薬剤がTS状態に特徴的なTS 1〜939配列の発現プロファイルを非TS状態を示すパターンに変換させるか否かを決定することに基づく。
【００５６】
この方法において、細胞を、試験薬剤または試験薬剤の組み合わせ（連続的または結果的に）に曝露して、細胞における一つまたは複数のTS 1〜939配列の発現を測定する。被験集団におけるTS配列の発現プロファイルを、試験薬剤に曝露していない参照細胞集団におけるTS配列の発現レベルと比較する。
【００５７】
過小発現された遺伝子の発現を刺激するために、または過剰発現された遺伝子の発現を抑制するために有効な薬剤は、臨床上の利益をもたらすと思われ、そのような化合物を、動物または試験被験者における精巣上皮、例えば精巣上皮の腺および／または支質の増殖の予防能に関してさらに試験する。
【００５８】
さらなる態様において、本発明は、TSの治療における潜在的な標的である候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。先に詳細に考察したように、マーカー遺伝子の発現レベルまたは活性を制御することによって、TSの発症および進行を制御することができる。このように、TSの治療における潜在的な標的である候補薬剤は、マーカー遺伝子の発現レベルおよび活性を指標として用いるスクリーニングによって同定することができる。本発明の状況において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含んでよい：
a）TS 1〜939にコードされるポリペプチドに被験化合物を接触させる段階；
b）ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階；および
c）ポリペプチドに結合する化合物を選択する段階。
【００５９】
または、本発明のスクリーニング法は、以下の段階を含んでもよい：
a）TS 1〜939からなる群より選択される一つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる段階；および
b）TS 1〜346からなる群より選択される一つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを減少させるか、またはTS 347〜939からなる群より選択される一つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する段階。
マーカー遺伝子を発現する細胞には、例えばTSから確立された細胞株が含まれ；そのような細胞は本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。
【００６０】
または、本発明のスクリーニング法は、以下の段階を含んでもよい：
a）TS 1〜939からなる群より選択される遺伝子にコードされるポリペプチドに被験化合物を接触させる段階；
b）段階（a）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
c）被験化合物の非存在下で検出された生物学的活性と比較して、TS 1〜346にコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制するか、または被験化合物の非存在下で検出された生物学的活性と比較して、TS 347〜939にコードされるポリペプチドの生物学的活性を増強する化合物を選択する段階。
スクリーニングに必要なタンパク質は、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列を用いて、組み換え型タンパク質として得ることができる。マーカー遺伝子の情報に基づいて、当業者は、タンパク質の任意の生物学的活性を選択し、選択された生物学的活性に基づいて、スクリーニングおよび測定法を行うことができる。
【００６１】
または、本発明のスクリーニング法は以下の段階を含んでもよい：
a）TS 1〜939からなる群より選択される一つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域と、転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている細胞に候補化合物を接触させる段階；
b）該レポーター遺伝子の活性を測定する段階；および
c）該マーカー遺伝子がTS 1〜346からなる群より選択される上方制御されたマーカー遺伝子である場合には、対照と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物、または該マーカー遺伝子がTS 347〜939からなる群より選択される下方制御されたマーカー遺伝子である場合には、対照と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを増強する化合物を選択する段階。
適したレポーター遺伝子および宿主細胞は当技術分野で周知である。スクリーニングのために必要なレポーター構築物は、マーカー遺伝子の転写調節領域を用いて調製することができる。マーカー遺伝子の転写調節領域が当業者に既知である場合、レポーター構築物は、これまでの配列情報を用いて調製することができる。マーカー遺伝子の転写調節領域がまだ同定されていない場合、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいて、転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントをゲノムライブラリから単離することができる。
【００６２】
スクリーニングによって単離された化合物は、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質の活性を阻害し、かつTSの治療または予防に適用することができる候補薬物である。
【００６３】
その上、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質の活性を阻害する化合物の構造の一部が、付加、欠失、および／または置換によって変換されている化合物も同様に、本発明のスクリーニング法によって得ることができる化合物に含まれる。
【００６４】
本発明の方法によって単離された化合物をヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーのような他の哺乳動物のための薬剤として投与する場合、単離された化合物を直接投与してもよく、または既知の薬学的調製法を用いて投与剤形に調製してもよい。例えば、必要に応じて、薬物は、糖衣錠、カプセル剤、エリキシル剤およびマイクロカプセルとして経口摂取されるか、または水もしくは他の任意の薬学的に許容される液体との滅菌溶液もしくは懸濁液の注射剤形で非経口摂取されうる。例えば、化合物は、薬学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩液、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、着香料、賦形剤、溶剤、保存剤、結合剤などと共に、一般的に許容される投薬実施に必要な単位投与剤形で混合することができる。これらの調製物における活性成分の量によって、指示範囲内の適した用量を得ることができる。
【００６５】
錠剤およびカプセル剤に混合することができる添加剤の例は、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、およびアラビアゴムのような結合剤；結晶セルロースのような賦形剤；コーンスターチ、ゼラチンおよびアルギン酸のような膨張剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、乳糖、またはサッカリンのような甘味料；ならびにペパーミント、アカモノ油、およびチェリーのような着香料である。単位投与剤形がカプセル剤である場合、油のような液体担体も同様に上記の成分にさらに含めることができる。注射用滅菌組成物は、注射用蒸留水のような溶剤を用いて通常の投薬実施に従って調製することができる。
【００６６】
生理食塩液、グルコース、ならびにD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムのような補助剤を含む他の等張液は、注射用水溶液として用いることができる。これらは、アルコール、特にエタノール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような多価アルコール、ポリソルベート80（商標）およびHCO-50のような非イオン性界面活性剤のような適した溶解剤と共に用いることができる。
【００６７】
ゴマ油または大豆油を油脂性液体として用いることができ、かつ安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールを溶解剤として共に用いてもよく、リン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液のような緩衝液；塩酸プロカインのような鎮痛剤；ベンジルアルコールおよびフェノールのような安定化剤、ならびに抗酸化剤と共に調製してもよい。調製された注射剤は適したアンプルに充填してもよい。
【００６８】
当業者に周知の方法を用いて、本発明の薬学的組成物を患者に、例えば動脈内、静脈内、または経皮注射として投与してもよく、同様に鼻腔内、気管支内、筋肉内、または経口投与としても投与してもよい。投与の用量および方法は、患者の体重および年齢ならびに投与法に応じて変化する；しかし、当業者は、適した投与法を日常的に選択することができる。該化合物がDNAによってコードされうる場合、DNAを遺伝子治療のベクターに挿入して、治療を行うためにベクターを患者に投与することができる。投与の用量および方法は、患者の体重、年齢、および症状に応じて変化するが、当業者はそれらを適切に選択することができる。
【００６９】
例えば、本発明のタンパク質に結合してその活性を調節する化合物の用量は、症状に依存するが、用量は、正常な成人（体重60 kg）に経口投与する場合、約0.1 mg〜約100 mg/日、好ましくは約1.0 mg〜約50 mg/日、より好ましくは約1.0 mg〜約20 mg/日である。
【００７０】
正常な成人（体重60 kg）に注射剤形で非経口投与する場合、患者、標的臓器、症状および投与法によって多少の差があるが、約0.01 mg〜約30 mg/日、好ましくは約0.1〜約20 mg/日、およびより好ましくは約0.1〜約10 mg/日を静脈内注射することが都合がよい。同様に、他の動物の場合においても、体重60 kgに変換した量を投与することが可能である。
【００７１】
TSを有する被験者の予後の評価
被験細胞集団における一つまたは複数のTS配列の発現を、患者に由来する参照細胞集団における配列の発現と、病期のスペクトルについて比較することによって、TSを有する被験者の予後を評価する方法も同様に提供される。被験細胞集団と参照細胞集団における一つもしくは複数のTS配列の遺伝子発現を比較することによって、または被験者に由来する被験細胞集団における経時的な遺伝子発現パターンを比較することによって、被験者の予後を評価することができる。
【００７２】
正常対照と比較してTS 347〜939配列の一つもしくは複数の発現の減少、または正常対照と比較してTS 1〜346配列の一つもしくは複数の発現の増加は、予後があまり好ましくないことを示している。TS 347〜939配列の一つまたは複数の発現が増加していれば、より好ましい予後を示し、TS 1〜346配列の発現が減少していれば、被験者にとってより好ましい予後を示している。
【００７３】
キット
本発明にはまた、TS検出試薬、例えばオリゴヌクレオチド配列のような一つまたは複数のTS核酸に特異的に結合するか、またはこれを同定する核酸であって、TS核酸の一部と相補的である核酸またはTS核酸にコードされるタンパク質に結合する抗体が含まれる。試薬は、キットの形で共に包装される。試薬、例えば核酸または抗体（固相マトリクスに結合させるか、またはそれらをマトリクスに結合させるための試薬とは別に包装される）、対照試薬（陽性および／または陰性）、ならびに／または検出標識は異なる容器に包装される。アッセイを行うための説明書（例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROM等）がキットに含まれる。キットのアッセイ形式は、当技術分野で既知のノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAである。
【００７４】
例えば、TS検出試薬は、少なくとも一つのTS検出部位を形成するために多孔性ストリップのような固相マトリクスに固定する。多孔性ストリップの測定または検出領域には、核酸を含む多数の部位が含まれてもよい。試験ストリップはまた、陰性および／または陽性対照のための部位を含んでもよい。または、対照部位は、試験ストリップとは異なるストリップに存在する。任意で、異なる検出部位は、異なる量の固定された核酸を含んでもよく、すなわち第一の検出部位はより多い量を含み、それに続く部位ではより少ない量を含んでもよい。被験試料を加えると、検出可能なシグナルを示す部位の数が、試料に存在するTSの量の定量的な指標となる。検出部位は、任意の適した検出可能な形状で構成されてもよく、一般的には試験ストリップの幅に及ぶバーまたはドットの形状である。
【００７５】
または、キットは、一つまたは複数の核酸配列を含む核酸基質アレイを含む。アレイ上の核酸は、TS 1〜939によって示される一つまたは複数の核酸配列を特異的に同定する。TS 1〜939によって表される配列の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、または50個またはそれ以上の発現は、アレイ試験小片またはチップへの結合レベルによって同定される。基質アレイは、例えば固相基質上、例えば米国特許第5,744,305号に記載される「チップ」上に存在しうる。
【００７６】
アレイと複数性
本発明にはまた、一つまたは複数の核酸を含む核酸基質アレイも含まれる。アレイ上の核酸は、TS 1〜939によって示される一つまたは複数の核酸配列に特異的に対応する。TS 1〜939によって表される配列の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、または50個またはそれ以上の発現レベルは、アレイに結合する核酸を検出することによって同定される。
【００７７】
本発明にはまた、単離された複数の核酸配列（すなわち、二つまたはそれ以上の核酸の混合物）が含まれる。核酸配列は、液相または固相に存在し、例えばニトロセルロースメンブレンのような固相支持体に固定される。複数には、TS 1〜939によって示される核酸配列の一つまたは複数が含まれる。様々な態様において、複数には、TS 1〜939によって表される配列の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、または50個またはそれ以上が含まれる。
【００７８】
TSを阻害する方法
本発明は、TS 1〜346の発現もしくは活性を減少させること、またはTS 347〜939の発現もしくは活性を増加させることによって、被験者におけるTSの症状を治療または軽減する方法を提供する。治療化合物は、TSを有する、発症のリスクを有する（または感受性がある）被験者に対して予防的または治療的に投与される。そのような被験者は、標準的な臨床的方法を用いて、または（例えばTS 1〜939の）発現もしくは活性の異常なレベルを検出することによって同定される。治療薬剤には、細胞周期調節、細胞増殖、およびタンパク質キナーゼ活性の阻害剤が含まれる。
【００７９】
治療法には、TS細胞が由来する同じ組織型の正常細胞と比較して、TS細胞において発現が減少している遺伝子（「過小発現遺伝子」）の一つまたは複数の遺伝子産物の発現、機能、またはその両者を増加させることが含まれる。これらの方法において、被験者において過小発現されている遺伝子の一つまたは複数の量を増加させる化合物の有効量によって被験者を治療する。投与は全身または局所的となりうる。治療化合物には、過小発現遺伝子のポリペプチド産物、またはその生物学的活性断片、過小発現遺伝子をコードし、TS細胞における発現を許容する発現制御因子を有する核酸、例えばTS細胞に対して内因性のそのような遺伝子の発現レベルを増加させる（すなわち、一つまたは複数の過小発現遺伝子の発現を上方制御する）薬剤が含まれる。そのような化合物の投与は、被験者の精巣胞における一つまたは複数の異常に過小発現された遺伝子の効果に対抗して、被験者の臨床状態を改善する。
【００８０】
本方法にはまた、精巣細胞においてその発現が異常に増加している遺伝子（「過剰発現遺伝子」）の一つまたは複数の遺伝子産物の発現、機能、またはその双方を減少させることが含まれる。発現は、当業者に既知のいくつかの任意の方法によって阻害される。例えば、一つまたは複数の過剰発現された遺伝子の発現を阻害またはこれに拮抗する核酸、例えば一つまたは複数の過剰発現された遺伝子の発現を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNAを被験者に投与することによって発現は阻害される。
【００８１】
先に述べたように、TS 1〜346のヌクレオチド配列に対応するアンチセンス核酸を用いて、TS 1〜346の発現レベルを減少させることができる。TSにおいて上方制御されるTS 1〜346に対応するアンチセンス核酸は、TSの治療において有用である。具体的には、本発明のアンチセンス核酸は、TS 1〜346またはそれに対応するmRNAに結合して、それによって遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつ／またはTS 1〜346にコードされるタンパク質の発現を阻害して、最終的にタンパク質の機能を阻害することによって作用してもよい。本明細書において用いられる「アンチセンス核酸」という用語は、アンチセンス核酸が標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる限り、標的配列と完全に相補的であるヌクレオチドおよび一つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するヌクレオチドの双方を含む。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、少なくとも15連続ヌクレオチドの長さにわたって少なくとも70％またはそれ以上、好ましくは80％またはそれ以上、より好ましくは90％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。当技術分野で既知のアルゴリズムを用いて相同性を決定することができる。
【００８２】
本発明のアンチセンス核酸誘導体は、タンパク質をコードするDNAまたはmRNAに結合し、転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつタンパク質の発現を阻害し、それによってタンパク質の機能を阻害することによって、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質を産生する細胞に作用する。
【００８３】
本発明のアンチセンス核酸誘導体は、誘導体に対して不活性な適した基剤と混合することによって、リニメントまたは湿布剤のような外用調製物に調製することができる。
【００８４】
同様に、必要に応じて、誘導体は、賦形剤、等張剤、溶解剤、安定化剤、保存剤、鎮痛剤等を加えることによって、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル、注射剤、溶液、点鼻液、および凍結乾燥剤に調製することができる。これらは以下の既知の方法によって調製することができる。
【００８５】
アンチセンス核酸誘導体は、患部に直接適用することによって、または患部に達するように血管に注入することによって、患者に投与される。アンチセンス封入剤も、持続性および膜透過性を増加するために用いることができる。例としては、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチンまたはこれらの誘導体である。
【００８６】
本発明のアンチセンス核酸誘導体の用量は、患者の病態に応じて適切に調節して、所望の量で用いることができる。例えば、0.1〜100 mg/kg、好ましくは0.1〜50 mg/kgの用量範囲を投与することができる。
【００８７】
本発明のアンチセンス核酸は、本発明のタンパク質の発現を阻害するので、本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制するのに有用である。同様に、本発明のアンチセンス核酸を含む発現阻害剤は、それらが本発明のタンパク質の生物学的活性を阻害できることから有用である。
【００８８】
本発明のアンチセンス核酸には、修飾オリゴヌクレオチドが含まれる。例えば、チオエート型オリゴヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ抵抗性を付与してもよい。
【００８９】
同様に、マーカー遺伝子に対するsiRNAを用いて、マーカー遺伝子の発現レベルを減少させることができる。「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨げる二本鎖RNA分子を意味する。DNAがRNAを転写する鋳型となる技術を含む、siRNAを細胞に導入する標準的な方法が用いられる。本発明の状況において、siRNAは、TS 1〜346のような、上方制御されたマーカー遺伝子に対するセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列を含む。siRNAは、単一の転写物が、標的遺伝子からのセンス配列および相補的アンチセンス配列の双方を有するように、例えばヘアピンを有するように構築される。
【００９０】
この方法は、例えば細胞の悪性形質転換の結果として上方制御された細胞内の発現を変化させるために用いられる。標的細胞におけるTS 1〜346の一つに対応する転写物に対するsiRNAの結合によって、細胞によるタンパク質産生の減少が起こる。オリゴヌクレオチドの長さは少なくとも10ヌクレオチドであり、天然に存在する転写物と同じ長さであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが19〜25ヌクレオチドである。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドが長さが75、50、25ヌクレオチド未満である。例えば、PYPAF3に対するsiRNAは標的配列として配列番号：85または86の核酸配列を含み、TSの細胞増殖を阻害する。
【００９１】
siRNAのヌクレオチド配列は、アンビオン（Ambion）のウェブサイト（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）から入手できるsiRNA設計コンピュータープログラムを用いて設計した。コンピュータープログラムは、以下のプロトコールに基づいてsiRNA合成のためのヌクレオチド配列を選択する。
【００９２】
siRNA標的部位の選択：
1．対象となる転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列を求めて下流にスキャンする。潜在的なsiRNA標的部位として、各AAおよび3'隣接ヌクレオチド19個の出現を記録する。Tuschlらは、5'および3'非翻訳領域（UTR）および開始コドン近傍（75塩基以内）の領域が、調節タンパク質結合部位により富んでいる可能性があることから、これらに対してsiRNAを設計しないことを推奨している。UTR-結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害しうる。
2．潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較して、他のコード配列と有意な相同性を有する如何なる標的配列も検討から除外する。相同性検索は、NCBIサーバー、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/において認められうるBLASTを用いて行うことができる。
3．合成のために適格な標的配列を選択する。アンビオンでは、好ましくは、評価すべき遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択することができる。
【００９３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、本発明のポリペプチドの発現を阻害するので、本発明のポリペプチドの生物学的活性を抑制するのに有用である。同様に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む発現阻害剤は、それらが本発明のポリペプチドの生物学的活性を阻害できるという点において有用である。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む組成物は、TSを治療するのに有用である。
【００９４】
または、一つまたは複数の過剰発現された遺伝子の遺伝子産物の機能は、遺伝子産物に結合する化合物、さもなければ遺伝子産物の機能を阻害する化合物を投与することによって阻害される。例えば、化合物は、一つまたは複数の過剰発現された遺伝子産物に結合する抗体である。
【００９５】
本発明は、抗体、特に上方制御されたマーカー遺伝子にコードされるタンパク質に対する抗体、または抗体の断片を用いることに言及する。本明細書において用いられるように、「抗体」という用語は、抗体を合成するために用いられる抗原（すなわち、上方制御されたマーカー遺伝子産物）またはそれに近縁の抗原のみと相互作用する（すなわち結合する）、特異的構造を有する免疫グロブリン分子を指す。さらに抗体は、それがマーカー遺伝子にコードされるタンパク質の一つまたは複数に結合する限り、抗体断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、またはHおよびL鎖からのFv断片が適当なリンカーによって連結されている一本鎖Fv（scFv）であってもよい（Huston, J.S.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85：5879〜5883（1988））。より詳しく述べると、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンのような酵素によって処理することによって産生してもよい。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築して、発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞において発現させてもよい（例えば、Co M.S.ら、J. Immunol. 152：2968〜2976（1994）；Better M.およびHorwitz A.H.、Methods Enzymol. 178：476〜496（1989）；Pluckthun A.およびSkerra A.、Methods Enzymol. 178：497〜515（1989）；Lamoyi E.、Methods Enzymol. 121：652〜663（1986）；Rousseaux J.ら、Methods Enzymol. 121：663〜669（1986）；Bird R.E.およびWalker B.W.、Trends Biotechnol. 9：132〜137（1991）を参照されたい）。
【００９６】
抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）のような多様な分子に結合させることによって修飾してもよい。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で常套的である。
【００９７】
または、抗体は、ヒト以外の抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域とのキメラ抗体として、またはヒト以外の抗体に由来する相補性決定領域（CDR）、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（FR）、および定常領域を含むヒト化抗体として得てもよい。そのような抗体は、既知の技術を用いて調製することができる。
【００９８】
癌細胞において起こる特異的な分子変化に対する癌治療は、進行乳癌を治療するためのトラスツズマブ（ヘルセプチン）、慢性骨髄性白血病のためのイマチニブメチレート（グリーベック）、非小細胞肺癌（NSCLC）のためのゲフィチニブ（イレッサ）、ならびにB細胞リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫のためのリツキシマブ（抗CD20 mAb）のような抗癌剤の臨床開発および規制認可によって確認されている（Ciardiello F, Tortora G. A novel approach in the treatment of cancer: targeting the epidermal growth factor receptor. Clin Cancer Res. 2001 10月；7(10)：2958〜70. Review.；Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A, Fleming T, Eiermann W, Wolter J, Pegram M, Baselga J, Norton L. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med. 2001 3月15日；344(11)：783〜92.；Rehwald U, Schulz H, Reiser M, Sieber M, Staak JO, Morschhauser F, Driessen C, Rudiger T, Muller-Hermelink K, Diehl V, Engert A. Treatment of relapsed CD20+ Hodgkin lymphoma with the monoclonal antibody rituximab is effective and well tolerated：results of a phase 2 trial of the German Hodgkin Lymphoma Study Group. Blood. 2003 1月15日；101(2)：420〜424.；Fang G, Kim CN, Perkins CL, Ramadevi N, Winton E, Wittmann SおよびBhalla KN. (2000). Blood, 96, 2246〜2253.）。これらの薬剤は、形質転換した細胞のみを標的とすることから、臨床的に有効であり、従来の抗癌剤より許容性が良好である。したがって、そのような薬剤は、癌患者の生存および生活の質を改善するのみならず、分子標的癌治療の考え方が正当であることをを証明している。さらに、標的特異的薬剤は、標準的な化学療法と併用して用いた場合に、その有効性を増強することができる（Gianni, L.（2002）、Oncology 63 補遺1、47〜56；Klejman A., Rushen L., Morrione A., Slupianek AおよびSkorski T.（2002）、Oncogene 21：5868〜5876）。したがって、将来の癌治療はおそらく、従来の薬剤を血管新生および浸潤性のような腫瘍細胞の異なる特徴をねらった標的特異的薬剤と併用することを含むであろう。
【００９９】
これらの調節法は、エクスビボまたはインビトロで（例えば、細胞を薬剤と共に培養することによって）、またはインビボで（例えば被験者に薬剤を投与することによって）行われる。この方法は、発現差のある遺伝子の異常な発現または活性を相殺する治療として、タンパク質もしくはタンパク質の組み合わせ、または核酸分子もしくは核酸分子の組み合わせを投与することを含む。
【０１００】
遺伝子のレベルまたは生物学的活性の増加（疾患または障害を有しない被験者と比較して）を特徴とする疾患または障害は、一つまたは複数の過剰発現された遺伝子の活性に拮抗する（すなわち、減少または阻害する）治療剤によって治療してもよい。活性に拮抗する治療剤を治療または予防目的で投与する。
【０１０１】
利用してもよい治療剤には、例えば、（i）一つまたは複数の過小発現された配列のポリペプチド、またはその類似体、誘導体、断片、もしくは相同体、（ii）一つまたは複数の過剰発現された配列に対する抗体、（iii）一つまたは複数の過小発現された配列をコードする核酸、（iv）アンチセンス核酸または「機能欠損」核酸（すなわち、一つまたは複数の過剰発現配列のコード配列内への異種挿入による）；（v）低分子干渉RNA（siRNA）；または（vi）調節因子（すなわち、過剰／過小発現ポリペプチドとその結合パートナーとの相互作用を変化させる阻害剤、アゴニスト、およびアンタゴニスト）。機能欠損アンチセンス分子は、相同的組み換えによってポリペプチドの内因性の機能を「ノックアウト」するために利用される（例えば、Capecchi、Science 244：1288〜1292（1989）を参照されたい）。
【０１０２】
レベルまたは生物学的活性の減少（疾患または障害を有しない被験者と比較して）を特徴とする疾患および障害は、活性を増加させる（すなわちアゴニストである）治療剤によって治療してもよい。活性を上方制御する治療剤は、治療または予防目的で投与してもよい。利用してもよい治療剤には、ポリペプチド（またはその類似体、誘導体、断片もしくは相同体）または生物学的利用能を増加させるアゴニストが含まれるがこれらに限定されない。
【０１０３】
レベルの増加または減少は、ペプチドおよび／またはRNAを定量することによって、患者の組織試料を採取し（例えば、生検組織から）、これをRNAまたはペプチドのレベル、発現されたペプチドの構造および／または活性（またはその発現が変化している遺伝子のmRNA）に関してインビトロでアッセイすることによって、容易に検出することができる。当技術分野において周知である方法には、イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学等）、および／またはmRNAの発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチューハイブリダイゼーション等）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０４】
予防目的の投与は、疾患もしくは障害が予防されるように、またはその進行が遅れるように、疾患の明白な臨床症状が発現する前に行われる。
【０１０５】
治療法には、発現差のある遺伝子の遺伝子産物の活性の一つまたは複数を調節する薬剤に細胞を接触させることが含まれる。タンパク質活性を調節する薬剤には、核酸またはタンパク質、これらのタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、または他の低分子の、天然に存在する同起源のリガンドが含まれる。例えば、薬剤は、一つまたは複数の異なるように過小発現される遺伝子の一つまたは複数のタンパク質活性を刺激する。
【０１０６】
本発明はまた、TS 1〜346からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチド、もしくは該ポリペプチドの免疫学的活性断片、またはポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法にも関する。ポリペプチドの投与は、被験者において抗腫瘍免疫を誘導する。抗腫瘍免疫を誘導するために、TS 1〜346からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチド、もしくは該ポリペプチドの免疫学的活性断片、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与する。ポリペプチドまたはその免疫学的活性断片はTSに対するワクチンとして有用である。場合によっては、タンパク質またはその断片は、T細胞受容体（TCR）に結合した形で投与してもよく、またはマクロファージ、樹状細胞（DC）、もしくはB細胞のような抗原提示細胞（APC）によって提示された形で投与してもよい。DCの強い抗原提示能のため、APCの中では、DCを用いることが最も好ましい。
【０１０７】
本発明において、TSに対するワクチンとは、動物に接種すると抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。本発明によると、TS 1〜346にコードされるポリペプチドまたはその断片は、TS 1〜346を発現するTS細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導する可能性があるHLA-A24またはHLA-A*0201拘束性エピトープであることが示唆された。このように、本発明はまた、ポリペプチドを用いて抗腫瘍免疫を誘導する方法も含む。一般的に、抗腫瘍免疫には、以下のような免疫応答が含まれる：
−腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導、
−腫瘍を認識する抗体の誘導、および
−抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
【０１０８】
したがって、あるタンパク質が、動物への接種時にこれらの免疫応答のいずれか一つを誘導する場合、そのタンパク質は、抗腫瘍免疫誘導効果を有すると判定される。タンパク質による抗腫瘍免疫の誘導は、宿主におけるタンパク質に対する免疫系の反応をインビボまたはインビトロで観察することによって検出することができる。
【０１０９】
例えば、細胞障害性Tリンパ球の誘導を検出する方法は周知である。生体内に入る外来物質は、抗原提示細胞（APC）の作用によってT細胞およびB細胞に提示される。APCによって提示された抗原に対して抗原特異的に応答するT細胞は、抗原による刺激によって細胞障害性T細胞（または細胞障害性Tリンパ球；CTL）に分化した後増殖する（これはT細胞の活性化と呼ばれる）。したがって、あるペプチドによるCTL誘導は、APCによるT細胞へのペプチドの提示およびCTLの誘導を検出することによって評価することができる。さらに、APCは、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、マクロファージ、好酸球、およびNK細胞を活性化する効果を有する。CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞も同様に抗腫瘍免疫において重要であることから、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用は、これらの細胞の活性化効果を指標として用いて評価することができる。
【０１１０】
APCとして樹状細胞（DC）を用いてCTLの誘導作用を評価する方法は、当技術分野で周知である。DCは、APCの中でも最も強力なCTL誘導作用を有する代表的なAPCである。この方法では、被験ポリペプチドをまずDCに接触させて、このDCをT細胞に接触させる。DCに接触させた後に、対象細胞に対して細胞障害作用を有するT細胞が検出されれば、被験ポリペプチドが細胞障害性T細胞の誘導活性を有することを示している。腫瘍に対するCTLの活性は、例えば51Cr標識腫瘍細胞の溶解を指標として用いて検出することができる。または、3H-チミジン取り込み活性またはLDH（乳糖デヒドロゲナーゼ）放出を指標として用いて腫瘍細胞の損傷の程度を評価する方法も同様に周知である。
【０１１１】
DCとは別に、末梢血単核球（PBMC）も同様にAPCとして用いてもよい。CTLの誘導は、GM-CSFおよびIL-4の存在下でPBMCを培養することによって増強されうることが報告されている。同様に、CTLは、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびIL-7の存在下でPBMCを培養することによって誘導されることが示されている。
【０１１２】
これらの方法によってCTL誘導活性を有することが確認された被験ポリペプチドは、DC活性化効果およびその後のCTL誘導活性を有するポリペプチドである。したがって、腫瘍細胞に対してCTLを誘導するポリペプチドは、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、ポリペプチドに接触させることによって腫瘍に対するCTLの誘導能を獲得したAPCは、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、APCによるポリペプチドの抗原提示により細胞障害性を獲得したCTLも同様に、腫瘍に対するワクチンとして用いることができる。APCおよびCTLによる抗腫瘍免疫を用いるそのような腫瘍の治療法は、細胞免疫療法と呼ばれる。
【０１１３】
一般的に、細胞免疫療法のためにポリペプチドを用いる場合、CTL誘導効率は、異なる構造を有する複数のポリペプチドを組み合わせて、それらをDCに接触させることによって増加することが知られている。したがって、DCをタンパク質断片によって刺激する場合、複数のタイプの断片の混合物を用いることが有利である。
【０１１４】
または、ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することによって確認することができる。例えば、ポリペプチドに対する抗体が、そのポリペプチドで免疫した実験動物において誘導される場合、そして腫瘍細胞の増殖がそれらの抗体によって抑制される場合、ポリペプチドは、抗腫瘍免疫の誘導能を有すると判定することができる。
【０１１５】
抗腫瘍免疫は本発明のワクチンを投与することによって誘導され、抗腫瘍免疫の誘導によって、TSを治療および予防することができる。癌の治療または癌の発症の予防には、癌性細胞の増殖の阻害、癌の退縮、および癌の発生抑制のような段階のいずれかが含まれる。癌を有する個体の死亡率の低下、血液中の腫瘍マーカーの減少、癌に伴う検出可能な症状の軽減等も同様に、癌の治療または予防に含まれる。そのような治療および予防効果は好ましくは統計学的に有意である。例えば、細胞増殖疾患に対するワクチンの治療または予防効果を、ワクチン投与を行わない対照と比較する観察において、5％以下は有意水準である。例えば、スチューデントのt-検定、マン-ホイットニーのU検定、またはANOVAを統計解析に用いてもよい。
【０１１６】
免疫学的活性を有する上記のタンパク質またはそのタンパク質をコードするベクターをアジュバントと併用してもよい。アジュバントは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合にタンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。アジュバントの例には、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバン等が含まれるがこれらに限定されない。さらに、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体と適切に組み合わせてもよい。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩液、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、ワクチンは必要に応じて、安定化剤、懸濁剤、保存剤、界面活性剤等を含んでもよい。ワクチンは、全身または局所投与される。ワクチン投与は、1回投与によって行ってもよく、または複数回投与によって追加免疫してもよい。
【０１１７】
本発明のワクチンとしてAPCまたはCTLを用いる場合、腫瘍を例えばエクスビボ法によって治療または予防することができる。より詳しく述べると、治療または予防を受けている被験者のPBMCを採取して、細胞をエクスビボでポリペプチドに接触させて、APCまたはCTLの誘導後、細胞を被験者に投与してもよい。APCはまた、ポリペプチドをコードするベクターをエクスビボでPBMCに導入することによって誘導することができる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLは、投与前にクローニングすることができる。標的細胞を損傷する高い活性を有する細胞をクローニングして増殖させることによって、細胞免疫療法をより効率よく行うことができる。さらに、このようにして単離されたAPCおよびCTLを用いて、細胞が由来する個体に対してのみならず、他の個体からの類似のタイプの腫瘍に対する細胞免疫療法のために用いてもよい。
【０１１８】
さらに、本発明のポリペプチドの薬学的有効量を含む、癌のような細胞増殖疾患を治療または予防するための薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、抗腫瘍免疫を惹起するために用いてもよい。
【０１１９】
TSを阻害するための薬学的組成物
薬学的製剤には、経口、直腸内、鼻腔内、局所（口腔内および舌下を含む）、膣内、もしくは非経口（筋肉内、皮下、および静脈内を含む）投与に適した製剤、または吸入もしくは吹入による投与に適した製剤が含まれる。好ましくは、投与は静脈内である。製剤は任意で個別の用量単位に包装される。
【０１２０】
経口投与に適した薬学的製剤には、それぞれが活性成分の規定量を含むカプセル剤、カシェ剤、または錠剤が含まれる。製剤にはまた、粉剤、顆粒剤、または溶液、懸濁液、または乳液が含まれる。活性成分は、任意でボーラス舐剤またはペーストとして投与される。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、または湿潤剤のような通常の賦形剤を含んでもよい。錠剤は、任意で一つまたは複数の製剤成分との圧縮または成形によって作製してもよい。圧縮錠は、粉剤または顆粒剤のような流動状の活性成分を、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、または分散剤と混合して、適した装置において圧縮することによって調製してもよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤によって湿らせた粉末化合物の混合物を適した機械において成形することによって作製してもよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法に従ってコーティングしてもよい。経口液体調製物は、例えば、水性もしくは油性懸濁液、溶液、乳液、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形であってもよく、または使用前に水もしくは他の適した溶剤によって構成するための乾燥製品として提供してもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性溶剤（食用油が含まれてもよい）、または保存剤のような通常の添加剤を含んでもよい。錠剤は任意で、活性成分の徐放または制御放出を提供するように調製してもよい。錠剤の包装は、毎月服用される錠剤1錠を含んでよい。
【０１２１】
非経口投与用製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌注射剤、ならびに懸濁剤および濃化剤を含んでもよい水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数回用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに入れてもよく、滅菌液体担体、例えば生理食塩液、注射用水を使用直前に加えるだけでよい凍結乾燥状態で保存してもよい。または、製剤は、連続注入用であってもよい。即時調合注射溶液および懸濁液は、既に記述した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製してもよい。
【０１２２】
直腸投与用製剤には、カカオバターまたはポリエチレングリコールのような標準的な担体を含む坐剤が含まれる。口内への、例えば口腔内または舌下への局所投与用製剤には、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントのような着香基剤に活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチンとグリセリンまたはショ糖とアカシアのような基剤に活性成分を含む香錠が含まれる。鼻腔内投与の場合、本発明の化合物を液体スプレー、もしくは分散性の粉末として、または点鼻剤の形態で用いてもよい。点鼻剤は、一つまたは複数の分散剤、溶解剤、または懸濁剤も含む水性または非水性基剤によって調製してもよい。
【０１２３】
吸入による投与の場合、吸入器、ネブライザー、加圧パックまたはエアロゾルスプレーを送達するための他の便利な手段によって化合物を適宜送達する。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適したガスのような適した噴射剤を含んでもよい。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、一定量を送達するための弁を提供することによって決定してもよい。
【０１２４】
あるいは、吸入または吹入による投与の場合、化合物は、乾燥粉末組成物、例えば化合物と、乳糖またはデンプンのような適した粉末基剤との粉末混合物の形状をとってもよい。粉末組成物は、単位投与剤形、例えば、粉末が吸入器または吹入器を利用して投与されうるカプセル剤、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパックの形としてもよい。
【０１２５】
他の製剤には、治療薬剤を放出する埋め込み可能装置および接着パッチが含まれる。
【０１２６】
望ましければ、活性成分を持続的に放出するように適合された上記の製剤を用いてもよい。薬学的組成物はまた、抗菌剤、免疫抑制剤、または保存剤のような他の活性成分を含んでもよい。
【０１２７】
上記で特に言及した成分の他に、本発明の製剤には、当該製剤のタイプに関して当技術分野において通常の他の薬剤が含まれてもよいと理解すべきであり、例えば経口投与に適した製剤は着香料を含んでもよい。
【０１２８】
好ましい単位投与製剤は、下記に引用するように、活性成分またはその適当な分画の有効量を含む製剤である。
【０１２９】
上記の条件のそれぞれに関して、組成物、例えばポリペプチドおよび有機化合物は、約0.1〜約250 mg/kg/日の用量で経口または注射によって投与される。成人ヒトの用量範囲は一般的に、約5 mg〜約17.5 g/日、好ましくは約5 mg〜約10 g/日、および最も好ましくは約100 mg〜約3 g/日である。錠剤または個別の単位で提供される他の単位投与剤形は、便宜上、同一単位量を複数回投与した量で有効性を示すような単位量、例えば約5 mg〜約500 mg、通常約100 mg〜約500 mgを含みうる。
【０１３０】
用いられる用量は、被験者の年齢および性別、治療される正確な障害、およびその重症度を含む多数の要因によって左右されると考えられる。同様に、投与経路も、病態およびその重症度に依存して変化してもよい。
【０１３１】
本発明はさらに、添付の請求の範囲に記述される本発明の範囲を制限しない以下の実施例において説明される。以下の実施例は、TS細胞において発現に差のある遺伝子の同定および特徴付けを説明する。
【０１３２】
実施例1：被験試料の調製
疾患状態（例えば、TS）で発現に差のある遺伝子を同定するために、疾患組織（例えば、精巣生殖細胞腫瘍からの精巣細胞）から得た組織および正常組織を評価した。アッセイは以下のように実施した。
【０１３３】
患者、組織試料、およびレーザー捕獲顕微解剖（LCM）
TGCT試料を、精巣摘除術を受けた患者13人から得た。これらの患者の臨床特徴を表1に要約する。精上皮腫と診断された試料12例および精上皮腫と卵黄嚢腫瘍の双方を有する試料1例を用いた。
【０１３４】
試料は全て、-80℃で凍結してから、TissueTek OCT培地（Sakura）に抱埋した。凍結した標本を低温槽（Sakura）において厚さ8 μmの連続切片にして、分析した領域を明らかにするために、ヘマトキシリン-エオジンによって染色した。次に、精上皮腫細胞を、いくつかの改変を加えた製造元のプロトコールに従って、PixCell II LCMシステム（Arcturus Engineering）によって各染色組織から選択的に顕微解剖した（21）。
【０１３５】
（表１）精巣精上皮腫患者13人の臨床特徴
【０１３６】
RNAの抽出と精製およびT7に基づくRNA増幅
捕獲した細胞からの総RNAを、RLT溶解緩衝液（QIAGEN）350 μlにおいて抽出した。抽出したRNAを、DNアーゼI（QIAGEN）30単位で室温にて15分間処理した。DNアーゼIで処理した全てのRNAに、Ampliscribe T7転写キット（Epicentre Technologies）を用いてT7に基づく増幅を行った（20）。2回の増幅によって、各組織に関して増幅RNA（aRNA）30〜238 μgが得られた。対照プローブとして、正常なヒトポリ(A)+RNA（Clontech）を、T7に基づく増幅によって2回増幅した。各癌様組織および対照からのaRNAのアリコート2.5μgをそれぞれ、Cy5-dCTPおよびCy3-dCTPの存在下で逆転写した（22）。
【０１３７】
cDNAマイクロアレイの調製
米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のUniGeneデータベース（構築#131）から選択したcDNA 23,040個を含む「ゲノム全体」のcDNAマイクロアレイシステムを確立した。簡単に説明すると、様々なヒト臓器から単離したポリ(A)+RNAを鋳型として用いて、RT-PCRによってcDNAを増幅した。アンプリコンの長さは、反復またはポリ（A）配列を除き、200〜1,100 bpの範囲であった。PCR産物を、マイクロアレイスポッター、ジェネレーションIII（Amersham Biosciences）を用いて、7型スライドガラス上にスポットした；遺伝子4608個をスライドガラス1枚に2連にスポットした。異なる5つのスライドガラスを調製して（すなわち、全体で遺伝子23,040個）、そのそれぞれの上に同じハウスキーピング遺伝子52個と陰性対照遺伝子2個も同様にスポットした（23）。
【０１３８】
ハイブリダイゼーションおよびデータの獲得
ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、全ての過程を自動スライドプロセッサ（Amersham Biosciences）によって実施したことを除き、既に記述されているプロトコールに従って行った。各ハイブリダイゼーションシグナルの強度は、アレイビジョンコンピュータープログラム（Amersham Biosciences）によって測光法によって計算し、バックグラウンドの強度を差し引いた。各Cy3およびCy5シグナル強度の標準化は、ハウスキーピング遺伝子52個のシグナルの平均値を用いて行った。各発現レベルのカットオフ値は、バックグラウンドの変動に従って自動的に計算した。Cy5/Cy3を相対的発現比として計算した。Cy3およびCy5シグナル強度がいずれもカットオフ値より低い場合、その試料における対応する遺伝子の発現は、これまでの報告に従ってなしと評価された（23）。他の遺伝子に関して、Cy5/Cy3比は、各試料の生データを用いて計算した。
【０１３９】
実施例2：TS関連遺伝子の同定
TSにおいて一般的に上方制御または下方制御される遺伝子が同定されたとき、それらの遺伝子は以下の基準に従って分析された。まず、50％を超える症例についてその相対的発現比を計算することができる遺伝子、および70％を超える症例においてその発現が上方制御または下方制御される遺伝子を選択した。その上、35〜50％の症例について相対的発現比を計算することができれば、遺伝子は、全ての症例で上方制御または下方制御されると評価された。各遺伝子の相対的発現比（Cy5/Cy3強度比）は、以下のように4つのカテゴリーのうちの1つに分類された：（1）上方制御される（発現比は5.0より大きい）；（2）下方制御される（発現比は0.2未満）；（3）発現に変化なし（発現比は0.2〜5.0）；および（4）発現されない（またはわずかに発現されるが検出用のカットオフ値未満である）。これらのカテゴリーを用いて、発現比の変化が特定のサブグループに対して特異的であると共に試料において一般的である遺伝子の組を検出した。精上皮腫細胞において一般的に上方制御または下方制御される候補遺伝子を検出するために、遺伝子23,040個の全体的な発現パターンをスクリーニングして、5.0より大きい、または0.2より小さい発現比を有する遺伝子を選択した。
【０１４０】
TS細胞において臨床的に関連する発現パターンを有する遺伝子の同定
TGCTの発症および進行の基礎となる遺伝子事象を解明するために、本発明者らは、ゲノム全体のcDNAマイクロアレイによって臨床材料における遺伝子発現を分析した。マイクロアレイ技術によって、1回の実験で何千もの遺伝子の発現を分析することが可能となり、癌の分子機構に対する新しい洞察を得ることができる。そのようなデータは、臨床管理の改善に関与し、それによって癌患者のよりよい生活水準が提供されると期待される。
【０１４１】
ある研究グループは、第17染色体の長腕がしばしばTGCTにおいて過剰発現されていることから、第17染色体に存在する遺伝子の注文製作したcDNAマイクロアレイを用いて、遺伝子発現プロフィールを分析した（13）。しかし、その試験では、第17染色体上の遺伝子636個およびゲノムの他からの遺伝子512個を分析したにすぎなかった。本発明者らの知る限り、本発明者らの試験は、TGCTに関する最初のゲノム全体のcDNAマイクロアレイ分析である。
【０１４２】
本発明者らは、LCMによって精製した精上皮腫細胞の集団を調べるために遺伝子23,040個を含む包括的cDNAマイクロアレイシステムを用いて、特にTSを重点的に調べた。顕微鏡的な視覚化により、本手順により選択された癌細胞集団がほぼ100％であると推定した。
【０１４３】
発現比が5.0を超える上方制御された遺伝子346個が同定され（表2）、発現比が0.2未満である下方制御された遺伝子593個が同定された（表3）。さらに、発現比が10.0を超える特に高度に上方制御された遺伝子213個が同定された（データは示していない）。一方、発現比が0.1未満である下方制御された遺伝子376個が同定された（データは示していない）。
【０１４４】
それらのいくつかは、新規治療剤の分子標的となる可能性があり、かつ／または診断的腫瘍マーカーとして役立つ可能性がある。表4における遺伝子のリストには、TSの発癌または細胞増殖に関係することが既に知られている遺伝子である、CCND2（1）、POV1（24）、PIM2（25）、JUP（26）、およびMYCN（14）が含まれる。例えば、RBタンパク質のリン酸化を調節して、G1-S細胞周期チェックポイントを制御するCCND2は、TSにおいてしばしば高度に発現されている；D型サイクリンの過剰発現によるこのチェックポイントの破壊は、ヒトにおける腫瘍発生の主要な経路の一つである（1）。前立腺癌において過剰発現される遺伝子として初めて同定されたPOV1（24）は後に、精巣の上皮内癌と共に全てのTSにおいて高度に発現されることが示された。この遺伝子は、膜貫通ドメイン12個を有する膜輸送タンパク質をコードして、細胞増殖にとって必須の栄養および／または代謝物を輸送する可能性がある（27）。したがって、その産物は、TSおよび前立腺癌を治療するための抗癌剤の分子標的となる可能性がある。セリントレオニンキナーゼをコードする癌原遺伝子であるPIM2は、これまでに、造血幹細胞、白血球細胞株およびリンパ腫細胞株、ならびにTSにおいて高度に発現されることが報告された；その産物は、造血および腫瘍形成性形質転換において重要な役割を有するように思われる（25）。γカテニンとしても知られるJUPは、細胞接着およびWntシグナル伝達経路において重要な役割を果たす；JUPは、APC腫瘍抑制遺伝子によって調節され、結腸癌におけるその腫瘍形成活性は、βカテニンの活性とは異なると考えられる（26）。MYCN遺伝子の増幅は、多様なヒト腫瘍において認められており、神経芽腫において最も頻繁であり、その過剰発現は、精上皮腫および非精上皮腫の双方において報告されている（14）。このように、これらの腫瘍形成機能の抑制は、TSの治療に対する新規アプローチとなる可能性がある。その上、これらの上方制御されたエレメントには、シグナル伝達経路、腫瘍遺伝子、細胞周期、ならびに細胞接着および細胞骨格に関与する有意な遺伝子が含まれていた（表4）。
【０１４５】
精巣癌に何らかの関与を有することが知られている遺伝子の他に、本発明者らは、PIM-1、PET、およびVAV2を含む他の腫瘍遺伝子の過剰発現を認めた。セリン／トレオニンキナーゼをコードするPIM-1（28）は、本発明者らのマイクロアレイにおいて調べられた情報の得られた精上皮腫11例全てにおいて過剰発現されていた。RETも同様に、情報の得られた精上皮腫6例全てにおいて過剰発現されていた。RET遺伝子は、細胞の増殖および分化のためのシグナルを伝達する細胞表面分子である受容体チロシンキナーゼをコードする；RET遺伝子における生殖系列変異は、二つの遺伝性の癌症候群、すなわち多発性内分泌新生物2A型および2B型に関与している（29）。VAV腫瘍遺伝子ファミリーのメンバーであるVAV2は、本発明者らのマイクロアレイにおいて調べられた情報の得られた精上皮腫症例12例中11例において過剰発現されていた。VAVタンパク質は、細胞の形質転換および腫瘍形成に関連している；これは、形質転換した細胞の転移特性を増強するか、またはRasのような腫瘍遺伝子タンパク質の形質転換活性に関与する補助因子として作用するように思われる（30）。
【０１４６】
一方、本発明者らのリストにおける下方制御される遺伝子には、少なくとも一つの既知の腫瘍抑制因子であるWT1が含まれ、それが不活化されるとウィルムス腫瘍および、ウィルムス腫瘍に対する感受性、無虹彩症、尿性器異常、および精神遅滞を特徴とするWAGR症候群を引き起こす（31）。WT1を有する染色体領域でのヘテロ接合性の喪失が、精巣生殖細胞腫瘍においてしばしば認められている（32）。さらに、ウィルムス腫瘍1関連タンパク質（KIAA0105、WTAP）、WT1結合パートナーも同様に、本発明者らの研究において下方制御された。WT1は、尿性器系の正常な発達に関連していることから、その産物は、精巣の腫瘍形成に関与する一つの候補物質となる可能性があるが、その分子機構はまだ不明である。
【０１４７】
分子標的薬を用いて、臨床上の改善が最近得られたことにより、特定の癌を治療する薬物を開発するための新規分子標的を発見する重要性が強調されてきた。例えば、抗HER-2モノクローナル抗体であるトラスツズマブは、抗癌剤と併用して、癌原遺伝子受容体HER2/neuに拮抗させ、何人かの乳癌患者の臨床反応および生存の改善をもたらした（33）。bcr-ablを標的とするチロシンキナーゼ阻害剤であるSTI-571は、今では慢性骨髄性白血病の治療にとって第一選択薬であり（34）、上皮細胞増殖因子受容体阻害剤であるゲフィチニブは、肺の非小細胞癌の治療にとって有用である（35）。抗CD20モノクローナル抗体であるリツキシマブは、B細胞リンパ腫またはマントル細胞リンパ腫の患者において完全寛解率および全体的な生存率を改善した（36）。したがって、本明細書において同定された細胞増殖に関連する上方制御される遺伝子の産物は、TSを治療する新規物質を設計するための有望な標的となる可能性がある。特に、自己分泌細胞増殖経路において機能する分泌型タンパク質は、薬物を開発するための良好な候補物質となるはずであり、このタイプの癌の新規診断マーカーとなりうるであろう。
【０１４８】
本研究において分析した症例13例中11例が、臨床病理的にI期であると分類された。したがって、本発明らのマイクロアレイにおいて一般的に上方制御または下方制御される遺伝子は、腫瘍形成の比較的初期段階に関連する可能性がある。その結果、本発明者らのデータは、癌関連遺伝子に関する新規情報を提供するのみならず、既知の遺伝子と腫瘍形成との新規相関を提供する。それにもかかわらず、本明細書に記述された情報は、TS発症の際の遺伝子活性の変化における複雑度が高度であることを開示した；結果は、このタイプの癌に関して可能性のある治療標的および／またはバイオマーカーの長大なリストである。
【０１４９】
（表２）精巣精上皮腫において5倍またはそれ以上一般的に上方制御される遺伝子346個
【０１５０】
（表３）精巣精上皮腫において0.2倍またはそれ未満一般的に下方制御される遺伝子593個
【０１５１】
（表４）精巣精上皮腫における既知機能を有する代表的な上方制御される遺伝子
【０１５２】
半定量的RT-PCR
上方制御された遺伝子29個を選択して、半定量的RT-PCR実験を適用することによってその発現レベルを調べた。各試料からのaRNAのアリコート3μgをランダムプライマー（Roche）およびスーパースクリプトII（Life Technologies, Inc.）を用いて一本鎖cDNAを得るために逆転写した。各cDNA混合物を、標的DNAまたはαチューブリン特異的反応のために調製した同じプライマーの組によるその後のPCR増幅のために希釈した。プライマー配列を表5に記載する。αチューブリンの発現を内部対照とした。PCR反応は、増幅の直線相内で産物の強度を確保するためにサイクル数に関して最適にした。情報の得られた全ての症例のほとんどにおいてその発現が過剰発現であった上方制御された遺伝子29個（CCND2、GIP、H1F2、NMA、PIM2、POV1、PRDM4、PTMS、RAI3、PYPAF3、T1A-2、TCOF1、TGIF2、FLJ10713、FLJ20069、KIAA0456、KIAA1198、DKFZp434K0621、EST(270)、FLJ13352、FLJ12195、EST(285)、NCOA6IP、EST(295)、PLXNA2、EST(311)、EST(320)、LOC152217、EST(341)）の発現レベルの比を比較したところ、結果は、調べた症例の大多数においてマイクロアレイ分析の結果と高度に類似であった（図1、図2A）。
【０１５３】
（表５）RT-PCRのプライマー配列
【０１５４】
実施例3：PYPAF3の発現を減少させるように設計されたsiRNAの増殖阻害作用
cDNAマイクロアレイによるゲノム全体の発現プロフィールの分析を通して、本発明者らは、診断腫瘍マーカーに関する新規分子標的を単離し、精巣生殖細胞腫瘍を治療および予防するために応用した。精巣精上皮腫において一般的に上方制御される遺伝子において、本発明者らは、半定量的RT-PCR分析によって、精巣、心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、および骨髄を含む正常なヒト臓器と比較して、精巣精上皮腫症例8例中7例において有意に上方制御されたPYRIN含有Apaf-1様タンパク質3（PYPAF3（NM_139176））を重点的に調べた。本発明者らは、今では、精巣精上皮腫において上方制御された遺伝子としてPYPAF3を同定したが（構築#160）、本発明者らは当初、米国国立バイオテクノロジー情報センターのUniGeneデータベース（構築#131）から検索した遺伝子23,040個を表すcDNAマイクロアレイを用いた発現プロフィールを通してこの遺伝子をRMP：RMB5介在タンパク質であると記載した。
【０１５５】
プローブとしてPYPAF3 cDNA断片を用いる多組織ノーザンブロット分析から、精巣に限って発現される約3.3 kbの転写物が判明した。免疫細胞化学試験から、PYPAF3タンパク質が細胞質全体に存在することが判明した。PYPAF3の低分子干渉RNA（siRNA）の導入は、PYPAF3のmRNAの発現を阻害して、精巣生殖細胞腫瘍細胞の細胞増殖を阻害した。これらの知見は、PYPAF3が、精巣精上皮腫の腫瘍発生に関与する可能性があること、そして精巣生殖細胞腫瘍の標的化治療を開発するための有望な候補物質となることを示唆している。
【０１５６】
細胞株および組織標本
COS-7細胞およびTera-2細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、ロックビル、メリーランド州）から得た。細胞株は全て、10％ウシ胎児血清および1％抗生物質／抗真菌剤溶液（Sigma、セントルイス、ミズーリ州）を添加した適当な培地において、COS-7 McCoy's5A（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州）に関してはダルベッコ改変イーグル培地（Sigma）において単層で増殖させ、5％CO2を含む湿潤大気中、37℃で維持した。
【０１５７】
半定量的RT-PCR
正常なヒト精巣、心臓、肺、腎臓、肝臓、脳、および骨髄のポリ(A)+RNAをClontech（パロアルト、カリフォルニア州）から得た。各試料からの増幅RNAのアリコート3 μgをランダムプライマー（Roche）およびスーパースクリプトII逆転写酵素（Invitrogen）を用いて一本鎖cDNAに逆転写した。各一本鎖cDNAをその後のPCR増幅のために希釈した。20 ml容積のPCR緩衝液（タカラ、京都、日本）において標準的なRT-PCR技法を行い、変性用に94℃で5分間、続けて94℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で30秒間を22サイクル（TUBA3に関して）または31サイクル（PYPAF3に関して）行うことによって増幅した。プライマー配列は以下の通りであった：TUBA3に関しては、フォワード5'-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3'（配列番号：59）、およびリバース5'-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3'（配列番号：60）；PYPAF3に関しては、フォワード5'-TGGGGTTCTAAGACAAAGAACTG-3'（配列番号：19）およびリバース5'-GTGAGAAAACCAGTGTCAAATCC-3'（配列番号：20）。
【０１５８】
ノーザンブロット分析
ヒトの多組織ブロット（Clontech）を、プローブとして32P標識PYPAF3 cDNA断片にハイブリダイズさせた。cDNAは、上記のようにRT-PCRによって調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、製造元の推奨に従って行った。ブロットについては、-80℃にて7日間増感スクリーンを用いてオートラジオグラフィーを行った。
【０１５９】
免疫細胞化学染色
PYPAF3の全コード領域は、RT-PCRによってフォワードプライマー5'-CGCGGATCCCACTATGACATCGCCCCAGC-3'（配列番号：63）およびリバースプライマー5'-CCGCTCGAGGCAAAAAAAGTCACAGCACGG-3'（配列番号：64）を用いて増幅した。PCR産物をBamHIおよびXhoIによって消化した後、これを、プラスミドベクターpcDNA3.1-myc/His（Invitrogen）の適当なクローニング部位にクローニングした。COS7細胞に、FuGENE6トランスフェクション試薬（Roche、バーゼル、スイス）と混合したpcDNA3.1(+)-PYPAF3-myc/His（Invitrogen）を導入した。COS7に由来する一過性のトランスフェクタントをPBS（-）で2回洗浄して、4％パラホルムアルデヒド溶液によって4℃で15分間固定して、0.1％トライトンX-100を含むPBS（-）によって2.5分間透過性にした。細胞を3％BSAのPBS（-）溶液で60分間覆って、一次抗体による反応の前に非特異的抗体結合部位をブロックした。PYPAF3タンパク質は、一次抗体としてマウス抗ヒトc-Myc 9E10抗体（Santa Cruz Biotechnology、サンタクルズ、カリフォルニア州）を用いて、二次抗体としてヤギ抗マウスFITC（Jackson ImmunoReserach、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）を用いて検出した。核は、4',6'-ジアミジン-2'-フェニルインドールジヒドロクロリド（Vector Laboratories、バーリンガム、カリフォルニア州）によって対比染色した。蛍光像は、エクリプスE800顕微鏡（ニコン、東京、日本）によって得た。
【０１６０】
低分子干渉RNA（siRNA）による精巣生殖細胞腫瘍細胞の処置
RNAポリメラーゼIIIによるU6RNA遺伝子の転写によって、3'末端でウリジンを有する短い転写物が生成される。本発明者らは、プライマー5'-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3'（配列番号：65）および5'-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3'（配列番号：66）、ならびに鋳型としてヒト胎盤DNAを用いて、U6RNAのプロモーター領域を含むゲノム断片をPCRによって増幅した。産物を精製して、TAクローニングキットを用いて製造元のプロトコール（Invitrogen）に従ってpCR2.1プラスミドベクターにクローニングした。U6RNAを含むBamHI、XhoI断片を精製して、pcDNA(+)のヌクレオチド1257位と56位の間にクローニングして、プライマー5'-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3'（配列番号：67）および5'-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3'（配列番号：68）を用いて、断片をPCRによって増幅した。ライゲーションしたDNAは、プライマー5'-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACA-3'（配列番号：69）および5'-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3'（配列番号：70）を用いたPCR増幅のための鋳型となった。産物をHindIIIによって消化し、その後自己ライゲーションさせてpsiU6BXベクタープラスミドを生成した。PYPAF3に対するsiRNA発現ベクター（psiU6BX-PYPAF3）および対照プラスミド（psiU6BX-EGFP、psiU6BX-ルシフェラーゼ）は、以下の表6のような二本鎖オリゴヌクレオチドを、psiU6BXベクターのBbsI部位にクローニングすることによって調製した。各siRNA発現ベクターを、内因性にPYPAF3を発現する精巣生殖細胞腫瘍細胞株Tera-2にFuGENE6（Roche）と共に導入した。ジェネテシン（Invitrogen）によって選択した後、細胞の増殖を、ギムザ染色を用いるコロニー形成アッセイによって2週間後に評価し、そして細胞計数キット8（同仁化学研究所、熊本、日本）によって1週間後に評価した（39）。PYPAF3 mRNAのノックダウン効果を半定量的RT-PCRによって同定した。
【０１６１】
半定量的RT-PCRによる精巣精上皮腫におけるPYPAF3発現の確認
本発明者らは、患者13人からの精巣精上皮腫における遺伝子23,040個の遺伝子発現を分析するためにcDNAマイクロアレイを用いている（12）。上方制御された遺伝子の中で、本発明者らは、その遺伝子のシグナル強度が精巣精上皮腫を有する患者においてカットオフ値より高かった有益な症例8例中7例において過剰発現されたPYPAF3を重点的に調べた。さらに、本発明者らは、半定量的RT-PCR分析を行って、正常なヒト精巣、心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、および骨髄と比較して精巣精上皮腫8例中7例においてPYPAF3の発現が上昇していることを確認した（図2A）。
【０１６２】
多組織ノーザンブロット分析とPYPAF3タンパク質の細胞下局在
PYPAF3 cDNA断片をプローブとして用いたノーザンブロット分析（材料および方法を参照されたい）から、精巣に限って発現される約3.3 kbの転写物が明らかとなった（図2B）。さらに、哺乳動物細胞におけるPYPAF3タンパク質の役割を調べるために、本発明者らは、myc標識PYPAF3タンパク質の発現を目的としたプラスミドを構築した（材料および方法を参照されたい）。プラスミドDNAをCOS-7細胞に一過性に導入した場合、標識PYPAF3タンパク質は導入した細胞の細胞質全体に存在していた（図3）。
【０１６３】
PYPAF3の発現を減少させるように設計された低分子干渉RNA（siRNA）の増殖阻害効果
PYPAF3の増殖促進的な役割を評価するために、本発明者らは、哺乳動物ベクターに基づくRNA干渉（RNAi）技術により、精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2細胞における内因性のPYPAF3の発現をノックダウンして、細胞増殖に及ぼす影響を調べた（材料および方法を参照されたい）。図4aに示すように、psiU6BX-PYPAF3（Si4）の導入は、Tera-2細胞株におけるPYPAF3転写物の発現を明らかに減少させたが、対照プラスミド（psiU6BX-EGFPおよびpsiU6BX-ルシフェラーゼsiRNA発現ベクター）を導入した細胞では作用が認められなかった。psiU6BX-PYPAF3による遺伝子特異的増殖抑制を確認するために、本発明者らは、同じ二つの細胞株のコロニー形成アッセイを行った；図4bおよび4cに示すように、psiU6BX-PYPAF3（Si4）の導入は、Tera-2細胞の増殖を有意に抑制し、上記の発現の減少結果と一致した。一方、Si3の導入は、PYPAF3転写物レベルのノックダウンでは減少がほとんど示されなかったものの、Tera-2の増殖を顕著に抑制した。その上、MTTアッセイではまた、PYPAF3発現をpsiU6BX-PYPAF3を用いて抑制した場合にTera-2細胞の有意な増殖阻害を示した（Si3およびSi4）（図4a、b）。それぞれの結果は、独立した三回の実験によって確認した。
【０１６４】
（表６）PYPAF3の低分子干渉RNAのオリゴヌクレオチド配列
【０１６５】
産業上の利用可能性
レーザー捕獲顕微解剖とゲノム全体のcDNAマイクロアレイとの併用によって得られた本明細書に記載のTSにおける遺伝子発現分析によって、癌の予防および治療のための標的としての特異的遺伝子が同定された。これらの発現に差のある遺伝子サブセットの発現に基づいて、本発明者らは、TSを同定または検出するための分子診断マーカーを提供する。
【０１６６】
本明細書に記載の方法はまた、TSの予防、診断、および治療のためのさらなる分子標的を同定するために有用である。本明細書において報告したデータは、TSの包括的な理解を補足し、新規診断戦略の開発を促進させ、治療薬および予防薬のための分子標的を同定する手がかりを提供する。そのような情報は、精巣腫瘍形成のより深い理解に貢献して、TSの診断、治療、および最終的には予防における新規戦略を開発するための指標を提供する。
【０１６７】
本明細書において引用した全ての特許、特許出願、および出版物は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。さらに、本発明は、詳細にその特定の態様に関して記述してきたが、本発明には様々な変更および改変が施されてもよく、それらも本発明の趣旨および範囲に含まれることは、当業者に明らかであると考えられる。
【０１６８】
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【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】増幅されたRNAから調製したcDNAを用い、半定量的RT-PCRによって調べた代表的な遺伝子28個およびTUBAの発現を示すDNAアガロースゲルの写真を示す。最初の11個のレーンは、異なるTS患者における遺伝子の発現レベルを示す。最後のレーンは、正常な個体からの精巣における各遺伝子の発現レベルを示す。遺伝子に関して遺伝子の記号を示す。
【図２】図2Aは、精巣精上皮腫臨床試料（1、2、7、8、9、10、11および13）、正常ヒト精巣（TES）、心臓（HER）、肺（LUN）、肝臓（LIV）、腎臓（KID）、脳（BRA）、および骨髄（BM）における半定量的RT-PCRによって調べたPYPAF3の発現を示す。TUBA3の発現を内部対照とした。図2Bは、プローブとしてPYPAFs cDNA断片を用いた多組織ブロットによるノーザン分析を示す。
【図３】myc標識PYPAF3タンパク質の細胞下局在を示す。pcDNA3.1-myc/His-PYPAF3プラスミドを導入したCOS-7細胞。導入した細胞を、マウス抗mycモノクローナル抗体によって染色し、FITC結合抗マウスIgG二次抗体によって可視化した。核は、DAPIによって対比染色した。
【図４】精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2におけるPYPAF3の発現を減少させるように設計された低分子干渉RNA（siRNA）の増殖阻害作用を示す。（A）2週目での精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2におけるPYPAF3の内因性発現の抑制を示す半定量的RT-PCR（精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2細胞へのsiRNAの導入後、ネオマイシンを含む選択培地において培養）。β2-ミクログロブリン（β2MG）を内部対照として用いた。（B）対照としてのpsiU6BX-EGFP（siEGFP）、psiU6BX-ルシフェラーゼ（siLuc）と比較して、2週間での精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2細胞におけるPYPAF3のノックダウン（Si1、Si2、Si3、Si4、およびSi5）によるコロニー数の減少を示すコロニー形成アッセイ。（C）psiU6BX-PYPAF3（Si1、Si2、Si3、Si4、およびSi5）、psiU6BX-EGFP（siEGFP）、psiU6BX-ルシフェラーゼ（siLuc）のいずれかを処置した精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2細胞の、細胞計数キット8を用いた1週間でのMTTアッセイ。これらの実験も同様に3回実施した。
【図１−１】
【図１−２】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、精巣精上皮腫を診断する方法に関する。
【０００２】
優先権に関する情報
本出願は、2002年9月30日に提出された米国特許出願第60/414,677号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
精巣の生殖細胞腫瘍（TGCT）が男性の全ての癌に占める割合は約1〜2％であるが、それらは、年齢20〜40歳群の男性において認められる最も一般的な癌であり（1）、その発生率は過去数十年のあいだにますます増加しつつある（2,3）。TGCTは、二つの主な組織学タイプに分類され、一つは、未分化の生殖細胞に類似する精上皮腫であり、もう一つはいずれの経路にも分化能を有するために胚および胚体外組織の双方に類似しうる非精上皮腫である（7）。精上皮腫は、TGCTにおける最も一般的な組織学的精巣腫瘍であり、TGCTの全症例の約60％〜65％を占める（8）。現在、αフェトプロテイン（AFP）、ヒトβサブユニット絨毛性性腺刺激ホルモン（HCGβ）、および乳酸脱水素酵素（LDH）が、TGCTの診断マーカーとして用いられている（9）。しかし、合胞体栄養性巨細胞を含まない精上皮腫の特異的腫瘍マーカーは同定されていない。
【０００４】
cDNAマイクロアレイ技術によって、正常および悪性細胞における包括的遺伝子発現プロファイルを得て、悪性細胞および対応する正常細胞における遺伝子発現を比較することが可能となった（Okabeら、Cancer Res. 61：2129〜37（2001）；Kitaharaら、Cancer Res. 61：3544〜9（2001）；Linら、Oncogene 21：4120〜8（2002）；Hasegawaら、Cancer Res. 62：7012〜7（2002））。このアプローチにより、癌細胞の複雑な特性を明らかにすることが可能となり、これは発癌のメカニズムを理解するために役立つ。腫瘍において脱制御される遺伝子を同定することによって、個々の癌のより精密で正確な診断を得ることができ、新規治療標的を開発することができる（Bienz and Clevers、Cell 103：311〜20（2000））。ゲノム全体での観点から腫瘍の基礎となるメカニズムを明らかにするため、そして診断のための標的分子の発見および新規治療薬の開発のために、本発明者らは、遺伝子23040個のcDNAマイクロアレイを用いて腫瘍細胞の発現プロファイルを解析している（Okabeら、Cancer Res. 61：2129〜37（2001）；Kitaharaら、Cancer Res. 61：3544〜9（2001）；Linら、Oncogene 21：4120〜8（2002）；Hasegawaら、Cancer Res. 62：7012〜7（2002））。
【０００５】
発癌メカニズムを解明するように計画された研究によって、抗腫瘍薬剤の分子標的の同定が既に促進されている。例えば、Rasに関連する増殖-シグナル伝達経路を阻害するように当初開発されたファルネキシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）（この活性は翻訳後のファルネシル化に依存する）は、動物モデルにおいてRas依存性腫瘍を治療するために有効である（Heら、Cell 99：335〜45（1999））。抗癌剤と、癌原遺伝子受容体HER2/neuに拮抗するための抗HER-2モノクローナル抗体トラスツズマブを併用したヒトに対する臨床試験が実施されており、乳癌患者の臨床応答および総生存率の改善が得られている（Linら、Cancer Res. 61：6345〜9（2001））。bcr-abl融合タンパク質を選択的に不活化するチロシンキナーゼ阻害剤STI-571は、bcr-ablチロシンキナーゼの構成的活性化が白血球の形質転換において重要な役割を果たしている慢性骨髄性白血病を治療するために開発されている。これらの種類の薬剤は、特定の遺伝子産物の発癌活性を抑制するように設計されている（Fujitaら、Cancer Res. 61：7722〜6（2001））。したがって、癌性細胞において一般的に上方制御される遺伝子産物は、新規抗癌剤を開発するための潜在的な標的として役立つ可能性がある。
【０００６】
CD8+細胞障害性Tリンパ球（CTL）は、MHCクラスI分子上に提示された腫瘍関連抗原（TAA）に由来するエピトープペプチドを認識して、腫瘍細胞を溶解することが証明されている。TAAの最初の例としてMAGEファミリーが発見されて以来、免疫学的アプローチを用いて他にも多くのTAAが発見されている（Boon、Int. J. Cancer 54：177〜80（1993）；Boonおよびvan der Bruggen、J. Exp. Med. 183：725〜9（1996）；van der Bruggenら、Science 254：1643〜7（1991）；Brichardら、J. Exp. Med.178：489〜95（1993）；Kawakamiら、J. Exp. Med. 180：347〜52（1994））。発見されたTAAのいくつかは、現在免疫治療の標的として臨床開発段階にある。これまで発見されたTAAには、MAGE（van der Bruggenら、Science 254：1643〜7（1991））、gp100（Kawakamiら、J. Exp. Med. 180：347〜52（1994））、SART（Shichijoら、J. Exp. Med. 187：277〜88（1998）、およびNY-ESO-1（Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：1914〜8（1997））が含まれる。一方、腫瘍細胞において特に過剰発現されることが示されている遺伝子産物は、細胞性免疫応答を誘導する標的として認識されることが示されている。そのような遺伝子産物には、p53（Umanoら、Brit. J. Cancer 84：1052〜7（2001））、HER2/neu（Tanakaら、Brit. J. Cancer 84：94〜9（2001））、CEA（Nukayaら、Int. J. Cancer 80：92〜7（1999））等が含まれる。
【０００７】
TAAに関する基礎および臨床研究における有意な進歩にもかかわらず（Rosenbergら、Nature Med. 4：321〜7（1998）；Mukherjiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：8078〜82（1995）；Huら、Cancer Res. 56：2479〜83（1996））、結腸癌を含む腺癌の治療に利用できるのは、ごく限られた数の候補TAAに過ぎない。癌細胞において豊富に発現されると共にその発現が癌細胞に限定されるTAAは、免疫療法の標的として有望な候補薬剤となるであろう。さらに、強力で特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導する新規TAAが同定されれば、様々なタイプの癌におけるペプチドワクチン接種法の臨床利用を促進すると期待される（Boonおよびvan der Bruggen、J. Exp. Med. 183：725〜9（1996）；van der Bruggenら、Science 254：1643〜7（1991）；Brichardら、J. Exp. Med.178：489〜95（1993）；Kawakamiら、J. Exp. Med. 180：347〜52（1994）；Shichijoら、J. Exp. Med. 187：277〜88（1998）；Chenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：1914〜8（1997）；Harris、J. Natl. Cancer Inst. 88：1442〜5（1996）；Butterfieldら、Cancer Res. 59：3134〜42（1999）；Vissersら、Cancer Res. 59：5554〜9（1999）；van der Burgら、J. Immunol. 156：3308〜14（1996）；Tanakaら、Cancer Res. 57：4465〜8（1997）；Fujieら、Int. J. Cancer 80：169〜72（1999）；Kikuchiら、Int. J. Cancer 81：459〜66（1999）；Oisoら、Int. J. Cancer 81：387〜94（1999））。
【０００８】
特定の健康なドナーからのペプチド刺激された末梢血単核球細胞（PBMC）は、ペプチドに応答して著しいIFN-γレベルを産生するが、51Cr-放出アッセイによるとHLA-A24または-A0201拘束的に腫瘍細胞に対して細胞障害性を発揮することはまれであることは繰り返し報告されている（Kawanoら、Cancer Res. 60：3550〜8（2000）；Nishizakaら、Cancer Res. 60：4830〜7（2000）；Tamuraら、Jpn. J. Cancer Res. 92：762〜7（2001））。しかし、HLA-A24およびHLA-A0201はいずれも、白人のみならず、日本人における一般的なHLA対立遺伝子の一つである（Dateら、Tissue Antigens 47：93〜101（1996）；Kondoら、J. Immunol. 155：4307〜12（1995）；Kuboら、J. Immunol. 152：3913〜24（1994）；Imanishiら、Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference、オックスフォード大学出版、オックスフォード、1065（1992）；Williamsら、Tissue Antigen 49：129（1997））。このように、これらのHLAによって提示される癌の抗原性ペプチドは、日本人および白人における癌の治療において特に有用となる可能性がある。さらに、インビトロでの低親和性CTLの誘導は、通常高濃度のペプチドを利用し、高レベルの特異的なペプチド／MHC複合体を、CTLを効果的に活性化する抗原提示細胞（APCs）上に生成することに起因することは知られている（Alexander-Millerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：4102〜7（1996））。
【０００９】
PYRIN含有Apaf-1様タンパク質（PYPAFs）は、最近同定されたタンパク質である（37）。ヒトには、PYPAF遺伝子14個が存在することが報告されている（38）。ロイシンリッチリピート、PYRIN、NACHT、およびNACHT関連ドメインを含むPYPAFタンパク質は全て、アポトーシスおよび炎症性シグナル伝達経路において機能を有すると考えられている。N末端のPYRINドメインは、タンパク質-タンパク質相互作用に関連することが報告されている（38）。さらに、NACHTドメインは、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子1（APAF-1）のヌクレオチド結合モチーフと配列相同性を有し、ATPに結合すると予想される（37）。しかし、PYRIN含有Apaf-1様タンパク質は腫瘍発生に決して関与していなかった。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、精巣精上皮腫（TS）に関連した遺伝子発現パターンの発見に基づく。TSにおいて発現に差のある遺伝子は、本明細書において集合的に「TS核酸」または「TSポリヌクレオチド」と呼ばれ、対応するコードされたポリペプチドは、「TSポリペプチド」または「TSタンパク質」と呼ばれる。
【００１１】
したがって、本発明は、組織試料のような患者に由来する生物学的試料におけるTS関連遺伝子の発現レベルを決定することによって、被験者におけるTSに対する素因を診断または決定する方法を特徴とする。TS関連遺伝子とは、正常細胞と比較して精巣生殖細胞腫瘍細胞から得られた細胞において発現レベルが異なることを特徴とする遺伝子を意味する。正常細胞は、精巣組織から得られた細胞である。TS関連遺伝子は、TS 1〜939の一つまたは複数である。遺伝子の正常対照レベルと比較して遺伝子の発現レベルが変化する、例えば増加または減少すれば、被験者がTSを有するか、または発症のリスクを有することを示している。
【００１２】
正常な対照レベルとは、正常な健康個体またはTSを有しないことがわかっている個体集団において検出された遺伝子発現レベルを意味する。対照レベルは、単一の参照集団または複数の発現パターンに由来する単一の発現パターンである。例えば、対照レベルは、既に試験された細胞からの発現パターンのデータベースでありうる。正常な個体は、TSの臨床症状を有しない個体である。
【００１３】
正常対照レベルと比較して被験試料においてTS 1〜346レベルの増加が検出されれば、（試料を採取した）被験者がTSを有するか、または発症するリスクを有することを示している。対照的に、正常な対照レベルと比較して被験試料においてTS 347〜939レベルの減少が検出されれば、被験者がTSを有する、または発症のリスクを有することを示している。
【００１４】
または、試料におけるTS関連遺伝子パネルの発現を、同じ遺伝子パネルのTS対照レベルと比較する。TS対照レベルとは、TSを有する集団において認められるTS関連遺伝子の発現プロファイルを意味する。
【００１５】
遺伝子発現は、対照レベルと比較して10％、25％、50％増加または減少する。または、遺伝子発現は、対照レベルと比較して0.1、0.2、1、2、5、10倍またはそれ以上増加または減少する。発現は、患者由来組織試料の遺伝子転写物に対するTS関連遺伝子プローブの、例えばアレイ上でのハイブリダイゼーションを検出することによって決定される。
【００１６】
患者由来組織試料は、試験被験者、例えばTSを有することがわかっているかまたは疑われる患者からの任意の組織である。例えば、組織は精巣生殖細胞腫瘍細胞を含む。例えば、組織は、精巣由来の細胞である。
【００１７】
本発明はまた、TS 1〜346の二つまたはそれ以上の遺伝子発現レベルのTS参照発現プロファイルを提供する。または、本発明は、TS 1〜346またはTS 347〜939の二つまたはそれ以上の発現レベルのTS参照発現プロファイルを提供する。
【００１８】
本発明はさらに、TS関連遺伝子を発現する被験細胞を試験薬剤に接触させる段階、およびTS関連遺伝子の発現レベルを決定する段階によって、TS関連遺伝子、例えばTS 1〜939の発現または活性を阻害または増強する薬剤を同定する方法を提供する。被験細胞は、精巣生殖細胞腫瘍由来の精巣細胞のような精巣細胞である。遺伝子の対照レベルと比較してレベルが減少すれば、試験薬剤がTS関連遺伝子の阻害剤であり、TSの症状を減少させることを示している。または、遺伝子の対照レベルまたは活性と比較してレベルまたは活性が増加すれば、その試験薬剤が、TS関連遺伝子の発現または機能のエンハンサーであり、TSの症状、例えばTS 347〜939を減少させることを示している。
【００１９】
本発明はまた、二つもしくはそれ以上のTS核酸配列に結合するか、または核酸配列にコードされる遺伝子産物に結合する検出試薬を有するキットを提供する。同様に、二つまたはそれ以上のTS核酸に結合する核酸のアレイも提供する。
【００２０】
治療法には、被験者にアンチセンス組成物を投与することによって被験者におけるTSを治療または予防する方法が含まれる。アンチセンス組成物は、特異的標的遺伝子の発現を減少させ、例えばアンチセンス組成物は、TS 1〜346からなる群より選択される配列と相補的であるヌクレオチドを含む。もう一つの方法には、短鎖干渉RNA（siRNA）組成物を被験者に投与する段階が含まれる。siRNA組成物は、TS 1〜346からなる群より選択される核酸の発現を減少させる。本発明者らは、精巣精上皮腫においてPYPAF3が一般的に上方制御されること、および低分子干渉RNAによるPYPAF3転写物のノックダウンで精巣生殖細胞腫瘍細胞の細胞増殖が阻害されることを立証した。
【００２１】
もう一つの方法において、被験者におけるTSの治療または予防は、被験者にリボザイム組成物を投与することによって行われる。核酸特異的リボザイム組成物は、TS 1〜346からなる群より選択される核酸の発現を減少させる。他の治療法には、TS 347〜939の発現またはTS 347〜939にコードされるポリペプチドの活性を増加させる化合物を被験者に投与する方法が含まれる。さらにTSは、TS 347〜939によりコードされるタンパク質を投与することによって治療することができる。タンパク質は患者に直接投与してもよく、または例えば目的の下方制御されたマーカー遺伝子を有する発現ベクターもしくは宿主細胞を投与することにより患者へ導入した後に、インビボで発現させてもよい。目的の遺伝子をインビボで発現させるための適切な手法は当技術分野で公知である。
【００２２】
本発明にはまた、ワクチンおよびワクチン接種法が含まれる。例えば、被験者におけるTSを治療または予防する方法は、TS 1〜346からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチドまたはそのようなポリペプチドの免疫学的活性断片を含むワクチンを被験者に投与することによって行われる。免疫学的活性断片は、完全長の天然に存在するタンパク質より長さが短く、免疫応答を誘導するポリペプチドである。例えば、免疫学的活性断片は、長さが少なくとも8残基であって、T細胞またはB細胞のような免疫細胞を刺激する。免疫細胞の刺激は、細胞増殖、サイトカイン（例えば、IL-2）の産生、または抗体の産生を検出することによって測定される。
【００２３】
特に定義していなければ、本明細書において用いた科学技術用語は全て、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記述の方法および材料と類似または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験において用いることができるが、適した方法および材料を下記に記述する。本明細書において言及した全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および例は、一例に過ぎず、制限することを意図しない。
【００２４】
本明細書に記述の方法の一つの長所は、明白な臨床症状を検出する前に疾患が同定されることである。本発明のその他の特徴および長所は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００２５】
詳細な説明
本発明は、TS患者の精巣由来の細胞における多数の核酸配列発現パターンに変化を発見したことに一部基づいている。遺伝子発現の差は、包括的cDNAマイクロアレイシステムを用いて同定した。
【００２６】
遺伝子23,040個を含むcDNAマイクロアレイを用いて、患者13人の包括的遺伝子発現プロフィールを構築した。特定の遺伝子が、TS患者において低レベルまたは高レベルで発現される。本方法において、患者の血清または喀痰において癌関連タンパク質を検出する可能性のある候補分子マーカーを選択し、ヒト精巣癌におけるシグナル抑制戦略を開発するためのいくつかの可能性のある標的を発見した。
【００２７】
本明細書において同定された発現差のある遺伝子は、TSのマーカーとして、およびその発現がTSの症状を治療または軽減するために改変される遺伝子標的として、診断目的のために用いられる。
【００２８】
TS患者においてその発現レベルが変調している（すなわち、増加または減少している）遺伝子を、表2、3に要約し、本明細書において総称して「TS関連遺伝子」TS関連遺伝子「TS核酸」、または「TSポリヌクレオチド」と呼び、対応するコードされたポリペプチドを「TSポリペプチド」または「TSタンパク質」と呼ぶ。特に明記していなければ、「TS」は、本明細書に開示の任意の配列（例えば、TS 1〜939）を指すことを意味する。遺伝子は、以前に記述されており、データベースのアクセッション番号とともに示される。
【００２９】
細胞試料における様々な遺伝子の発現を測定することによって、TSが診断される。同様に、様々な薬剤に応答したこれらの遺伝子の発現を測定することによって、TSを治療するための薬剤を同定することができる。
【００３０】
本発明は、表2、3に記載したTS配列の少なくとも一つから全てまでの発現を決定する（例えば、測定する）ことを含む。既知の配列に関するGenBank（登録商標）データベース登録項目に提供された配列情報を用いて、TS関連遺伝子を当業者に周知である技術を用いて検出および測定する。例えば、TS配列に対応する配列データベース登録項目内の配列を用いて、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション解析においてTS RNA配列を検出するためのプローブを構築する。プローブには、参照配列の少なくとも10、20、50、100、200ヌクレオチドが含まれる。もう一つの例として、配列を用いて、例えば、逆転写を利用したポリメラーゼ連鎖反応のような増幅に基づく検出法においてTS配列を特異的に増幅するためのプライマーを構築することができる。
【００３１】
次に、被験細胞集団、例えば患者由来の組織試料におけるTS配列の一つまたは複数の発現レベルを、参照集団におけるいくつかの配列の発現レベルと比較する。参照細胞集団には、比較されるパラメータが既知である一つまたは複数の細胞、すなわち、TS細胞または非TS細胞が含まれる。
【００３２】
参照細胞集団と比較した被験細胞集団における遺伝子発現レベルがTSまたはそれに対する素因を示すか否かは、参照細胞集団の組成に依存する。例えば、参照細胞集団が非TS細胞からなる場合、被験細胞集団と参照細胞集団とにおける遺伝子発現パターンが類似であれば、被験細胞集団が非TSであることを示している。逆に、参照細胞集団がTS細胞で構成されている場合、被験細胞集団と参照細胞集団のあいだの遺伝子発現プロファイルが類似であれば、被験細胞集団にTS細胞が含まれることを示している。
【００３３】
被験細胞集団におけるTSマーカー遺伝子の発現レベルは、発現レベルが、参照細胞集団における対応するTS配列の発現レベルから1.0、1.5、2.0、5.0、10.0倍またはそれ以上参照細胞集団と異なる場合、発現レベルが変化していると見なされる。
【００３４】
被験細胞集団と参照細胞集団との遺伝子発現の差を、対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子に対して標準化する。例えば、対照核酸は、細胞の精巣腫瘍または非精巣腫瘍状態に応じて差がないことが知られている核酸である。試験核酸および参照核酸における対照核酸の発現レベルを用いて、比較される集団におけるシグナルレベルを標準化することができる。対照遺伝子には、β-アクチン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、またはリボソームタンパク質P1が含まれる。
【００３５】
被験細胞集団を複数の参照細胞集団と比較する。複数の参照集団のそれぞれは、既知のパラメータが異なってもよい。このように、被験細胞集団を、例えばTS細胞を含むことがわかっている第一の参照細胞集団と共に、例えば非TS細胞（正常細胞）を含むことがわかっている第二の参照集団と比較してもよい。被験細胞は、TS細胞を含むことがわかっているか、または含むことが疑われる被験者からの組織タイプまたは細胞試料に含まれる。
【００３６】
被験細胞は、生体組織または体液、例えば生物学的液体（血液または尿）から得る。例えば、被験細胞は、組織から精製される。好ましくは、被験細胞集団は上皮細胞を含む。上皮細胞は、TSであることがわかっているか、または疑われる組織から得る。
【００３７】
参照細胞集団における細胞は、被験細胞と類似の組織タイプに由来する。選択的に、参照細胞集団は、細胞株、例えばTS細胞株（陽性対照）または正常な非TS細胞株（陰性対照）である。または、対照細胞集団は、アッセイされるパラメータまたは条件が既知である細胞に由来する分子情報のデータベースに由来する。
【００３８】
被験者は好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、例えばヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシでありうる。
【００３９】
本明細書に開示される遺伝子の発現は、当技術分野において既知の方法を用いてタンパク質または核酸レベルで決定される。例えば、これらの配列の一つまたは複数を特異的に認識するプローブを用いるノーザンハイブリダイゼーション解析を用いて、遺伝子発現を決定することができる。または、発現は、例えば発現に差のある配列に対して特異的なプライマーを用いて、逆転写を利用したPCRアッセイを用いて測定される。発現はまた、タンパク質レベルで、すなわち本明細書に記載の遺伝子産物にコードされるポリペプチドのレベルまたはその生物学的活性を測定することによって決定される。そのような方法は当技術分野で周知であり、例えば遺伝子にコードされるタンパク質に対する抗体を利用したイムノアッセイが含まれる。遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性も同様に周知である。
【００４０】
TSの診断
TSは、被験細胞集団（すなわち患者に由来する生物学的試料）からの一つまたは複数のTS核酸配列の発現レベルを測定することによって診断される。好ましくは、被験細胞集団は、上皮細胞、例えば精巣組織から得た細胞を含む。遺伝子発現はまた、血液、または尿のような他の体液から測定される。他の生物学的試料は、タンパク質レベルを測定するために用いることができる。例えば、診断される被験者に由来する血液、または血清におけるタンパク質レベルは、イムノアッセイまたは生物学的アッセイによって測定することができる。
【００４１】
一つまたは複数のTS関連遺伝子、例えばTS 1〜939の発現を、被験細胞または生物学的試料において決定して、正常対照レベルの発現と比較する。正常対照レベルは、TSを有しないことがわかっている集団において典型的に認められるTS関連遺伝子の発現プロファイルである。TS関連遺伝子の患者由来組織試料における発現レベルが増加または減少すれば、被験者がTSを有するか、またはTS発症のリスクを有することを示している。例えば、正常対照レベルと比較して被験集団におけるTS 1〜346のレベルが増加すれば、被験者がTSを有するか、またはTS発症のリスクを有することを示している。逆に、正常対照レベルと比較して被験集団におけるTS 347〜939の発現が減少すれば、被験者がTSを有するか、または発症のリスクを有することを示している。
【００４２】
一つまたは複数のTS関連遺伝子が、正常対照レベルと比較して被験集団において変化している場合、被験者がTSを有するか、またはTS発症のリスクを有することを示している。例えば、TS関連遺伝子のパネル（TS 1〜346、TS 347〜939、またはTS 1〜939）の少なくとも1％、5％、25％、50％、60％、80％、90％またはそれ以上が変化している。
【００４３】
TS関連遺伝子の発現を阻害または増強する薬剤の同定
TS関連遺伝子の発現または活性を阻害する薬剤は、上方制御されたTS関連遺伝子を発現する被験細胞集団を試験薬剤に接触させ、TS関連遺伝子の発現レベルを決定することによって同定される。対照レベルと比較して（または試験薬剤の非存在下でのレベルと比較して）薬剤の存在下で発現が減少すれば、その薬剤が上方制御されたTS関連遺伝子の阻害剤であり、TSを阻害するのに有用であることを示している。
【００４４】
または、下方制御されたTS関連遺伝子の発現または活性を増強する薬剤は、TS関連遺伝子を発現する被験細胞集団を試験薬剤に接触させ、下方制御されたTS関連遺伝子の発現レベルまたは活性を決定することによって同定される。TS関連遺伝子の対照発現レベルまたは活性と比較して発現または活性が増加すれば、試験薬剤が下方制御されたTS関連遺伝子の発現または活性を増強することを示している。
【００４５】
被験細胞集団は、TS関連遺伝子を発現する任意の細胞である。例えば、被験細胞集団は、精巣に由来する細胞のような、上皮細胞を含む。例えば、被験細胞は、精巣生殖細胞腫瘍に由来する不死化細胞株である。または、被験細胞は、TS関連遺伝子を導入した細胞、またはレポーター遺伝子に機能的に結合したTS関連遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター配列）を導入した細胞である。
【００４６】
被験者におけるTS治療の有効性の評価
本明細書において同定された発現差のあるTS配列によって、TSの治療経過をモニターすることもできる。この方法において、被験細胞集団は、TSの治療を受けている被験者から提供される。望ましければ、被験細胞集団は、治療前、治療中、または治療後の様々な時点で被験者から得られる。次に、細胞集団における一つまたは複数のTS配列の発現を決定して、TS状態が既知である細胞を含む参照細胞集団と比較する。参照細胞は治療を受けていない。
【００４７】
参照細胞集団がTS細胞を含まない場合、被験細胞集団と参照細胞集団におけるTS配列の発現が類似であれば、治療が有効であることを示している。しかし、被験集団と正常対照参照細胞集団におけるTS配列の発現に差があれば、あまり好ましくない臨床転帰または予後を示している。
【００４８】
「有効」とは、治療によって、病理学的に上方制御された遺伝子の発現が減少するか、病理学的に下方制御された遺伝子の発現が増加するか、または被験者における精巣腫瘍の大きさ、発生率、もしくは転移能が減少することを意味する。治療を予防的に適用する場合、「有効である」とは、治療がTSの形成を遅らせるかもしくは防止すること、または臨床的なTSの症状を遅らせるか、予防するか、もしくは軽減することを意味する。精巣腫瘍の評価は、標準的な臨床プロトコールを用いて行われる。
【００４９】
有効性は、TSを診断または治療する任意の既知の方法に関連して決定される。TSは、例えば症候性の異常、例えば精巣の無痛腫脹を同定することによって診断される。
【００５０】
特定の個体にとって適切なTS治療用の治療薬剤の選択
個体における遺伝的構成の差によって、個体が様々な薬剤を代謝する相対的能力に差が起こりうる。被験者において代謝されて抗TS薬剤として作用する薬剤は、被験者の細胞において、TS状態に特徴的な遺伝子発現パターンから非TS状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの変化を誘導することによって顕在化しうる。したがって、薬剤が被験者において適したTS阻害剤であるか否かを決定するために、本明細書に開示される発現差のあるTS配列によって、選択された被験者からの被験細胞集団において推定の治療的または予防的なTS阻害剤を調べることができる。
【００５１】
特定の被験者にとって適当であるTSの阻害剤または増強剤を同定するために、被験者からの被験細胞集団を治療薬剤に曝露して、TS 1〜939配列の一つまたは複数の発現を決定する。
【００５２】
被験細胞集団は、TS関連遺伝子を発現するTS細胞を含む。好ましくは、被験細胞は上皮細胞である。例えば、被験細胞集団を候補薬剤の存在下でインキュベートし、被験試料の遺伝子発現パターンを測定して、一つまたは複数の参照プロファイル、例えばTS参照発現プロファイルまたは非TS参照発現プロファイルと比較する。
【００５３】
TSを含む参照細胞集団と比較して、被験細胞集団におけるTS 1〜346の一つもしくは複数の発現が減少するか、またはTS 347〜939の一つもしくは複数の発現が増加すれば、薬剤が治療効果があることを示している。
【００５４】
試験薬剤はいかなる化合物または組成物であってよい。例えば、試験薬剤は免疫調節剤である。
【００５５】
治療薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイ
本明細書に開示される発現差のある配列はまた、TSを治療するための候補治療薬剤を同定するためにも用いることができる。この方法は、候補治療薬剤をスクリーニングし、その薬剤がTS状態に特徴的なTS 1〜939配列の発現プロファイルを非TS状態を示すパターンに変換させるか否かを決定することに基づく。
【００５６】
この方法において、細胞を、試験薬剤または試験薬剤の組み合わせ（連続的または結果的に）に曝露して、細胞における一つまたは複数のTS 1〜939配列の発現を測定する。被験集団におけるTS配列の発現プロファイルを、試験薬剤に曝露していない参照細胞集団におけるTS配列の発現レベルと比較する。
【００５７】
過小発現された遺伝子の発現を刺激するために、または過剰発現された遺伝子の発現を抑制するために有効な薬剤は、臨床上の利益をもたらすと思われ、そのような化合物を、動物または試験被験者における精巣上皮、例えば精巣上皮の腺および／または支質の増殖の予防能に関してさらに試験する。
【００５８】
さらなる態様において、本発明は、TSの治療における潜在的な標的である候補薬剤をスクリーニングする方法を提供する。先に詳細に考察したように、マーカー遺伝子の発現レベルまたは活性を制御することによって、TSの発症および進行を制御することができる。このように、TSの治療における潜在的な標的である候補薬剤は、マーカー遺伝子の発現レベルおよび活性を指標として用いるスクリーニングによって同定することができる。本発明の状況において、そのようなスクリーニングは、例えば以下の段階を含んでよい：
a）TS 1〜939にコードされるポリペプチドに被験化合物を接触させる段階；
b）ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階；および
c）ポリペプチドに結合する化合物を選択する段階。
【００５９】
または、本発明のスクリーニング法は、以下の段階を含んでもよい：
a）TS 1〜939からなる群より選択される一つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる段階；および
b）TS 1〜346からなる群より選択される一つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを減少させるか、またはTS 347〜939からなる群より選択される一つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する段階。
マーカー遺伝子を発現する細胞には、例えばTSから確立された細胞株が含まれ；そのような細胞は本発明の上記のスクリーニングに用いることができる。
【００６０】
または、本発明のスクリーニング法は、以下の段階を含んでもよい：
a）TS 1〜939からなる群より選択される遺伝子にコードされるポリペプチドに被験化合物を接触させる段階；
b）段階（a）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
c）被験化合物の非存在下で検出された生物学的活性と比較して、TS 1〜346にコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制するか、または被験化合物の非存在下で検出された生物学的活性と比較して、TS 347〜939にコードされるポリペプチドの生物学的活性を増強する化合物を選択する段階。
スクリーニングに必要なタンパク質は、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列を用いて、組み換え型タンパク質として得ることができる。マーカー遺伝子の情報に基づいて、当業者は、タンパク質の任意の生物学的活性を選択し、選択された生物学的活性に基づいて、スクリーニングおよび測定法を行うことができる。
【００６１】
または、本発明のスクリーニング法は以下の段階を含んでもよい：
a）TS 1〜939からなる群より選択される一つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域と、転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている細胞に候補化合物を接触させる段階；
b）該レポーター遺伝子の活性を測定する段階；および
c）該マーカー遺伝子がTS 1〜346からなる群より選択される上方制御されたマーカー遺伝子である場合には、対照と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを減少させる化合物、または該マーカー遺伝子がTS 347〜939からなる群より選択される下方制御されたマーカー遺伝子である場合には、対照と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを増強する化合物を選択する段階。
適したレポーター遺伝子および宿主細胞は当技術分野で周知である。スクリーニングのために必要なレポーター構築物は、マーカー遺伝子の転写調節領域を用いて調製することができる。マーカー遺伝子の転写調節領域が当業者に既知である場合、レポーター構築物は、これまでの配列情報を用いて調製することができる。マーカー遺伝子の転写調節領域がまだ同定されていない場合、マーカー遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づいて、転写調節領域を含むヌクレオチドセグメントをゲノムライブラリから単離することができる。
【００６２】
スクリーニングによって単離された化合物は、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質の活性を阻害し、かつTSの治療または予防に適用することができる候補薬物である。
【００６３】
その上、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質の活性を阻害する化合物の構造の一部が、付加、欠失、および／または置換によって変換されている化合物も同様に、本発明のスクリーニング法によって得ることができる化合物に含まれる。
【００６４】
本発明の方法によって単離された化合物をヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーのような他の哺乳動物のための薬剤として投与する場合、単離された化合物を直接投与してもよく、または既知の薬学的調製法を用いて投与剤形に調製してもよい。例えば、必要に応じて、薬物は、糖衣錠、カプセル剤、エリキシル剤およびマイクロカプセルとして経口摂取されるか、または水もしくは他の任意の薬学的に許容される液体との滅菌溶液もしくは懸濁液の注射剤形で非経口摂取されうる。例えば、化合物は、薬学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩液、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、着香料、賦形剤、溶剤、保存剤、結合剤などと共に、一般的に許容される投薬実施に必要な単位投与剤形で混合することができる。これらの調製物における活性成分の量によって、指示範囲内の適した用量を得ることができる。
【００６５】
錠剤およびカプセル剤に混合することができる添加剤の例は、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、およびアラビアゴムのような結合剤；結晶セルロースのような賦形剤；コーンスターチ、ゼラチンおよびアルギン酸のような膨張剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、乳糖、またはサッカリンのような甘味料；ならびにペパーミント、アカモノ油、およびチェリーのような着香料である。単位投与剤形がカプセル剤である場合、油のような液体担体も同様に上記の成分にさらに含めることができる。注射用滅菌組成物は、注射用蒸留水のような溶剤を用いて通常の投薬実施に従って調製することができる。
【００６６】
生理食塩液、グルコース、ならびにD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムのような補助剤を含む他の等張液は、注射用水溶液として用いることができる。これらは、アルコール、特にエタノール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールのような多価アルコール、ポリソルベート80（商標）およびHCO-50のような非イオン性界面活性剤のような適した溶解剤と共に用いることができる。
【００６７】
ゴマ油または大豆油を油脂性液体として用いることができ、かつ安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールを溶解剤として共に用いてもよく、リン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液のような緩衝液；塩酸プロカインのような鎮痛剤；ベンジルアルコールおよびフェノールのような安定化剤、ならびに抗酸化剤と共に調製してもよい。調製された注射剤は適したアンプルに充填してもよい。
【００６８】
当業者に周知の方法を用いて、本発明の薬学的組成物を患者に、例えば動脈内、静脈内、または経皮注射として投与してもよく、同様に鼻腔内、気管支内、筋肉内、または経口投与としても投与してもよい。投与の用量および方法は、患者の体重および年齢ならびに投与法に応じて変化する；しかし、当業者は、適した投与法を日常的に選択することができる。該化合物がDNAによってコードされうる場合、DNAを遺伝子治療のベクターに挿入して、治療を行うためにベクターを患者に投与することができる。投与の用量および方法は、患者の体重、年齢、および症状に応じて変化するが、当業者はそれらを適切に選択することができる。
【００６９】
例えば、本発明のタンパク質に結合してその活性を調節する化合物の用量は、症状に依存するが、用量は、正常な成人（体重60 kg）に経口投与する場合、約0.1 mg〜約100 mg/日、好ましくは約1.0 mg〜約50 mg/日、より好ましくは約1.0 mg〜約20 mg/日である。
【００７０】
正常な成人（体重60 kg）に注射剤形で非経口投与する場合、患者、標的臓器、症状および投与法によって多少の差があるが、約0.01 mg〜約30 mg/日、好ましくは約0.1〜約20 mg/日、およびより好ましくは約0.1〜約10 mg/日を静脈内注射することが都合がよい。同様に、他の動物の場合においても、体重60 kgに変換した量を投与することが可能である。
【００７１】
TSを有する被験者の予後の評価
被験細胞集団における一つまたは複数のTS配列の発現を、患者に由来する参照細胞集団における配列の発現と、病期のスペクトルについて比較することによって、TSを有する被験者の予後を評価する方法も同様に提供される。被験細胞集団と参照細胞集団における一つもしくは複数のTS配列の遺伝子発現を比較することによって、または被験者に由来する被験細胞集団における経時的な遺伝子発現パターンを比較することによって、被験者の予後を評価することができる。
【００７２】
正常対照と比較してTS 347〜939配列の一つもしくは複数の発現の減少、または正常対照と比較してTS 1〜346配列の一つもしくは複数の発現の増加は、予後があまり好ましくないことを示している。TS 347〜939配列の一つまたは複数の発現が増加していれば、より好ましい予後を示し、TS 1〜346配列の発現が減少していれば、被験者にとってより好ましい予後を示している。
【００７３】
キット
本発明にはまた、TS検出試薬、例えばオリゴヌクレオチド配列のような一つまたは複数のTS核酸に特異的に結合するか、またはこれを同定する核酸であって、TS核酸の一部と相補的である核酸またはTS核酸にコードされるタンパク質に結合する抗体が含まれる。試薬は、キットの形で共に包装される。試薬、例えば核酸または抗体（固相マトリクスに結合させるか、またはそれらをマトリクスに結合させるための試薬とは別に包装される）、対照試薬（陽性および／または陰性）、ならびに／または検出標識は異なる容器に包装される。アッセイを行うための説明書（例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROM等）がキットに含まれる。キットのアッセイ形式は、当技術分野で既知のノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAである。
【００７４】
例えば、TS検出試薬は、少なくとも一つのTS検出部位を形成するために多孔性ストリップのような固相マトリクスに固定する。多孔性ストリップの測定または検出領域には、核酸を含む多数の部位が含まれてもよい。試験ストリップはまた、陰性および／または陽性対照のための部位を含んでもよい。または、対照部位は、試験ストリップとは異なるストリップに存在する。任意で、異なる検出部位は、異なる量の固定された核酸を含んでもよく、すなわち第一の検出部位はより多い量を含み、それに続く部位ではより少ない量を含んでもよい。被験試料を加えると、検出可能なシグナルを示す部位の数が、試料に存在するTSの量の定量的な指標となる。検出部位は、任意の適した検出可能な形状で構成されてもよく、一般的には試験ストリップの幅に及ぶバーまたはドットの形状である。
【００７５】
または、キットは、一つまたは複数の核酸配列を含む核酸基質アレイを含む。アレイ上の核酸は、TS 1〜939によって示される一つまたは複数の核酸配列を特異的に同定する。TS 1〜939によって表される配列の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、または50個またはそれ以上の発現は、アレイ試験小片またはチップへの結合レベルによって同定される。基質アレイは、例えば固相基質上、例えば米国特許第5,744,305号に記載される「チップ」上に存在しうる。
【００７６】
アレイと複数性
本発明にはまた、一つまたは複数の核酸を含む核酸基質アレイも含まれる。アレイ上の核酸は、TS 1〜939によって示される一つまたは複数の核酸配列に特異的に対応する。TS 1〜939によって表される配列の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、または50個またはそれ以上の発現レベルは、アレイに結合する核酸を検出することによって同定される。
【００７７】
本発明にはまた、単離された複数の核酸配列（すなわち、二つまたはそれ以上の核酸の混合物）が含まれる。核酸配列は、液相または固相に存在し、例えばニトロセルロースメンブレンのような固相支持体に固定される。複数には、TS 1〜939によって示される核酸配列の一つまたは複数が含まれる。様々な態様において、複数には、TS 1〜939によって表される配列の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、または50個またはそれ以上が含まれる。
【００７８】
TSを阻害する方法
本発明は、TS 1〜346の発現もしくは活性を減少させること、またはTS 347〜939の発現もしくは活性を増加させることによって、被験者におけるTSの症状を治療または軽減する方法を提供する。治療化合物は、TSを有する、発症のリスクを有する（または感受性がある）被験者に対して予防的または治療的に投与される。そのような被験者は、標準的な臨床的方法を用いて、または（例えばTS 1〜939の）発現もしくは活性の異常なレベルを検出することによって同定される。治療薬剤には、細胞周期調節、細胞増殖、およびタンパク質キナーゼ活性の阻害剤が含まれる。
【００７９】
治療法には、TS細胞が由来する同じ組織型の正常細胞と比較して、TS細胞において発現が減少している遺伝子（「過小発現遺伝子」）の一つまたは複数の遺伝子産物の発現、機能、またはその両者を増加させることが含まれる。これらの方法において、被験者において過小発現されている遺伝子の一つまたは複数の量を増加させる化合物の有効量によって被験者を治療する。投与は全身または局所的となりうる。治療化合物には、過小発現遺伝子のポリペプチド産物、またはその生物学的活性断片、過小発現遺伝子をコードし、TS細胞における発現を許容する発現制御因子を有する核酸、例えばTS細胞に対して内因性のそのような遺伝子の発現レベルを増加させる（すなわち、一つまたは複数の過小発現遺伝子の発現を上方制御する）薬剤が含まれる。そのような化合物の投与は、被験者の精巣胞における一つまたは複数の異常に過小発現された遺伝子の効果に対抗して、被験者の臨床状態を改善する。
【００８０】
本方法にはまた、精巣細胞においてその発現が異常に増加している遺伝子（「過剰発現遺伝子」）の一つまたは複数の遺伝子産物の発現、機能、またはその双方を減少させることが含まれる。発現は、当業者に既知のいくつかの任意の方法によって阻害される。例えば、一つまたは複数の過剰発現された遺伝子の発現を阻害またはこれに拮抗する核酸、例えば一つまたは複数の過剰発現された遺伝子の発現を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子干渉RNAを被験者に投与することによって発現は阻害される。
【００８１】
先に述べたように、TS 1〜346のヌクレオチド配列に対応するアンチセンス核酸を用いて、TS 1〜346の発現レベルを減少させることができる。TSにおいて上方制御されるTS 1〜346に対応するアンチセンス核酸は、TSの治療において有用である。具体的には、本発明のアンチセンス核酸は、TS 1〜346またはそれに対応するmRNAに結合して、それによって遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつ／またはTS 1〜346にコードされるタンパク質の発現を阻害して、最終的にタンパク質の機能を阻害することによって作用してもよい。本明細書において用いられる「アンチセンス核酸」という用語は、アンチセンス核酸が標的配列に特異的にハイブリダイズすることができる限り、標的配列と完全に相補的であるヌクレオチドおよび一つまたは複数のヌクレオチドのミスマッチを有するヌクレオチドの双方を含む。例えば、本発明のアンチセンス核酸には、少なくとも15連続ヌクレオチドの長さにわたって少なくとも70％またはそれ以上、好ましくは80％またはそれ以上、より好ましくは90％またはそれ以上、さらにより好ましくは95％またはそれ以上の相同性を有するポリヌクレオチドが含まれる。当技術分野で既知のアルゴリズムを用いて相同性を決定することができる。
【００８２】
本発明のアンチセンス核酸誘導体は、タンパク質をコードするDNAまたはmRNAに結合し、転写または翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、かつタンパク質の発現を阻害し、それによってタンパク質の機能を阻害することによって、マーカー遺伝子にコードされるタンパク質を産生する細胞に作用する。
【００８３】
本発明のアンチセンス核酸誘導体は、誘導体に対して不活性な適した基剤と混合することによって、リニメントまたは湿布剤のような外用調製物に調製することができる。
【００８４】
同様に、必要に応じて、誘導体は、賦形剤、等張剤、溶解剤、安定化剤、保存剤、鎮痛剤等を加えることによって、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル、注射剤、溶液、点鼻液、および凍結乾燥剤に調製することができる。これらは以下の既知の方法によって調製することができる。
【００８５】
アンチセンス核酸誘導体は、患部に直接適用することによって、または患部に達するように血管に注入することによって、患者に投与される。アンチセンス封入剤も、持続性および膜透過性を増加するために用いることができる。例としては、リポソーム、ポリ-L-リジン、脂質、コレステロール、リポフェクチンまたはこれらの誘導体である。
【００８６】
本発明のアンチセンス核酸誘導体の用量は、患者の病態に応じて適切に調節して、所望の量で用いることができる。例えば、0.1〜100 mg/kg、好ましくは0.1〜50 mg/kgの用量範囲を投与することができる。
【００８７】
本発明のアンチセンス核酸は、本発明のタンパク質の発現を阻害するので、本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制するのに有用である。同様に、本発明のアンチセンス核酸を含む発現阻害剤は、それらが本発明のタンパク質の生物学的活性を阻害できることから有用である。
【００８８】
本発明のアンチセンス核酸には、修飾オリゴヌクレオチドが含まれる。例えば、チオエート型オリゴヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ抵抗性を付与してもよい。
【００８９】
同様に、マーカー遺伝子に対するsiRNAを用いて、マーカー遺伝子の発現レベルを減少させることができる。「siRNA」という用語は、標的mRNAの翻訳を妨げる二本鎖RNA分子を意味する。DNAがRNAを転写する鋳型となる技術を含む、siRNAを細胞に導入する標準的な方法が用いられる。本発明の状況において、siRNAは、TS 1〜346のような、上方制御されたマーカー遺伝子に対するセンス核酸配列およびアンチセンス核酸配列を含む。siRNAは、単一の転写物が、標的遺伝子からのセンス配列および相補的アンチセンス配列の双方を有するように、例えばヘアピンを有するように構築される。
【００９０】
この方法は、例えば細胞の悪性形質転換の結果として上方制御された細胞内の発現を変化させるために用いられる。標的細胞におけるTS 1〜346の一つに対応する転写物に対するsiRNAの結合によって、細胞によるタンパク質産生の減少が起こる。オリゴヌクレオチドの長さは少なくとも10ヌクレオチドであり、天然に存在する転写物と同じ長さであってもよい。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、長さが19〜25ヌクレオチドである。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドが長さが75、50、25ヌクレオチド未満である。例えば、PYPAF3に対するsiRNAは標的配列として配列番号：85または86の核酸配列を含み、TSの細胞増殖を阻害する。
【００９１】
siRNAのヌクレオチド配列は、アンビオン（Ambion）のウェブサイト（http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html）から入手できるsiRNA設計コンピュータープログラムを用いて設計した。コンピュータープログラムは、以下のプロトコールに基づいてsiRNA合成のためのヌクレオチド配列を選択する。
【００９２】
siRNA標的部位の選択：
1．対象となる転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列を求めて下流にスキャンする。潜在的なsiRNA標的部位として、各AAおよび3'隣接ヌクレオチド19個の出現を記録する。Tuschlらは、5'および3'非翻訳領域（UTR）および開始コドン近傍（75塩基以内）の領域が、調節タンパク質結合部位により富んでいる可能性があることから、これらに対してsiRNAを設計しないことを推奨している。UTR-結合タンパク質および／または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害しうる。
2．潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較して、他のコード配列と有意な相同性を有する如何なる標的配列も検討から除外する。相同性検索は、NCBIサーバー、www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/において認められうるBLASTを用いて行うことができる。
3．合成のために適格な標的配列を選択する。アンビオンでは、好ましくは、評価すべき遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択することができる。
【００９３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAは、本発明のポリペプチドの発現を阻害するので、本発明のポリペプチドの生物学的活性を抑制するのに有用である。同様に、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む発現阻害剤は、それらが本発明のポリペプチドの生物学的活性を阻害できるという点において有用である。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはsiRNAを含む組成物は、TSを治療するのに有用である。
【００９４】
または、一つまたは複数の過剰発現された遺伝子の遺伝子産物の機能は、遺伝子産物に結合する化合物、さもなければ遺伝子産物の機能を阻害する化合物を投与することによって阻害される。例えば、化合物は、一つまたは複数の過剰発現された遺伝子産物に結合する抗体である。
【００９５】
本発明は、抗体、特に上方制御されたマーカー遺伝子にコードされるタンパク質に対する抗体、または抗体の断片を用いることに言及する。本明細書において用いられるように、「抗体」という用語は、抗体を合成するために用いられる抗原（すなわち、上方制御されたマーカー遺伝子産物）またはそれに近縁の抗原のみと相互作用する（すなわち結合する）、特異的構造を有する免疫グロブリン分子を指す。さらに抗体は、それがマーカー遺伝子にコードされるタンパク質の一つまたは複数に結合する限り、抗体断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')2、Fv、またはHおよびL鎖からのFv断片が適当なリンカーによって連結されている一本鎖Fv（scFv）であってもよい（Huston, J.S.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85：5879〜5883（1988））。より詳しく述べると、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンのような酵素によって処理することによって産生してもよい。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築して、発現ベクターに挿入し、適当な宿主細胞において発現させてもよい（例えば、Co M.S.ら、J. Immunol. 152：2968〜2976（1994）；Better M.およびHorwitz A.H.、Methods Enzymol. 178：476〜496（1989）；Pluckthun A.およびSkerra A.、Methods Enzymol. 178：497〜515（1989）；Lamoyi E.、Methods Enzymol. 121：652〜663（1986）；Rousseaux J.ら、Methods Enzymol. 121：663〜669（1986）；Bird R.E.およびWalker B.W.、Trends Biotechnol. 9：132〜137（1991）を参照されたい）。
【００９６】
抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）のような多様な分子に結合させることによって修飾してもよい。本発明は、そのような修飾抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学修飾することによって得ることができる。これらの修飾法は、当技術分野で常套的である。
【００９７】
または、抗体は、ヒト以外の抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域とのキメラ抗体として、またはヒト以外の抗体に由来する相補性決定領域（CDR）、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域（FR）、および定常領域を含むヒト化抗体として得てもよい。そのような抗体は、既知の技術を用いて調製することができる。
【００９８】
癌細胞において起こる特異的な分子変化に対する癌治療は、進行乳癌を治療するためのトラスツズマブ（ヘルセプチン）、慢性骨髄性白血病のためのイマチニブメチレート（グリーベック）、非小細胞肺癌（NSCLC）のためのゲフィチニブ（イレッサ）、ならびにB細胞リンパ腫およびマントル細胞リンパ腫のためのリツキシマブ（抗CD20 mAb）のような抗癌剤の臨床開発および規制認可によって確認されている（Ciardiello F, Tortora G. A novel approach in the treatment of cancer: targeting the epidermal growth factor receptor. Clin Cancer Res. 2001 10月；7(10)：2958〜70. Review.；Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A, Fleming T, Eiermann W, Wolter J, Pegram M, Baselga J, Norton L. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med. 2001 3月15日；344(11)：783〜92.；Rehwald U, Schulz H, Reiser M, Sieber M, Staak JO, Morschhauser F, Driessen C, Rudiger T, Muller-Hermelink K, Diehl V, Engert A. Treatment of relapsed CD20+ Hodgkin lymphoma with the monoclonal antibody rituximab is effective and well tolerated：results of a phase 2 trial of the German Hodgkin Lymphoma Study Group. Blood. 2003 1月15日；101(2)：420〜424.；Fang G, Kim CN, Perkins CL, Ramadevi N, Winton E, Wittmann SおよびBhalla KN. (2000). Blood, 96, 2246〜2253.）。これらの薬剤は、形質転換した細胞のみを標的とすることから、臨床的に有効であり、従来の抗癌剤より許容性が良好である。したがって、そのような薬剤は、癌患者の生存および生活の質を改善するのみならず、分子標的癌治療の考え方が正当であることをを証明している。さらに、標的特異的薬剤は、標準的な化学療法と併用して用いた場合に、その有効性を増強することができる（Gianni, L.（2002）、Oncology 63 補遺1、47〜56；Klejman A., Rushen L., Morrione A., Slupianek AおよびSkorski T.（2002）、Oncogene 21：5868〜5876）。したがって、将来の癌治療はおそらく、従来の薬剤を血管新生および浸潤性のような腫瘍細胞の異なる特徴をねらった標的特異的薬剤と併用することを含むであろう。
【００９９】
これらの調節法は、エクスビボまたはインビトロで（例えば、細胞を薬剤と共に培養することによって）、またはインビボで（例えば被験者に薬剤を投与することによって）行われる。この方法は、発現差のある遺伝子の異常な発現または活性を相殺する治療として、タンパク質もしくはタンパク質の組み合わせ、または核酸分子もしくは核酸分子の組み合わせを投与することを含む。
【０１００】
遺伝子のレベルまたは生物学的活性の増加（疾患または障害を有しない被験者と比較して）を特徴とする疾患または障害は、一つまたは複数の過剰発現された遺伝子の活性に拮抗する（すなわち、減少または阻害する）治療剤によって治療してもよい。活性に拮抗する治療剤を治療または予防目的で投与する。
【０１０１】
利用してもよい治療剤には、例えば、（i）一つまたは複数の過小発現された配列のポリペプチド、またはその類似体、誘導体、断片、もしくは相同体、（ii）一つまたは複数の過剰発現された配列に対する抗体、（iii）一つまたは複数の過小発現された配列をコードする核酸、（iv）アンチセンス核酸または「機能欠損」核酸（すなわち、一つまたは複数の過剰発現配列のコード配列内への異種挿入による）；（v）低分子干渉RNA（siRNA）；または（vi）調節因子（すなわち、過剰／過小発現ポリペプチドとその結合パートナーとの相互作用を変化させる阻害剤、アゴニスト、およびアンタゴニスト）。機能欠損アンチセンス分子は、相同的組み換えによってポリペプチドの内因性の機能を「ノックアウト」するために利用される（例えば、Capecchi、Science 244：1288〜1292（1989）を参照されたい）。
【０１０２】
レベルまたは生物学的活性の減少（疾患または障害を有しない被験者と比較して）を特徴とする疾患および障害は、活性を増加させる（すなわちアゴニストである）治療剤によって治療してもよい。活性を上方制御する治療剤は、治療または予防目的で投与してもよい。利用してもよい治療剤には、ポリペプチド（またはその類似体、誘導体、断片もしくは相同体）または生物学的利用能を増加させるアゴニストが含まれるがこれらに限定されない。
【０１０３】
レベルの増加または減少は、ペプチドおよび／またはRNAを定量することによって、患者の組織試料を採取し（例えば、生検組織から）、これをRNAまたはペプチドのレベル、発現されたペプチドの構造および／または活性（またはその発現が変化している遺伝子のmRNA）に関してインビトロでアッセイすることによって、容易に検出することができる。当技術分野において周知である方法には、イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降後のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学等）、および／またはmRNAの発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチューハイブリダイゼーション等）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０４】
予防目的の投与は、疾患もしくは障害が予防されるように、またはその進行が遅れるように、疾患の明白な臨床症状が発現する前に行われる。
【０１０５】
治療法には、発現差のある遺伝子の遺伝子産物の活性の一つまたは複数を調節する薬剤に細胞を接触させることが含まれる。タンパク質活性を調節する薬剤には、核酸またはタンパク質、これらのタンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体、または他の低分子の、天然に存在する同起源のリガンドが含まれる。例えば、薬剤は、一つまたは複数の異なるように過小発現される遺伝子の一つまたは複数のタンパク質活性を刺激する。
【０１０６】
本発明はまた、TS 1〜346からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチド、もしくは該ポリペプチドの免疫学的活性断片、またはポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法にも関する。ポリペプチドの投与は、被験者において抗腫瘍免疫を誘導する。抗腫瘍免疫を誘導するために、TS 1〜346からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチド、もしくは該ポリペプチドの免疫学的活性断片、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与する。ポリペプチドまたはその免疫学的活性断片はTSに対するワクチンとして有用である。場合によっては、タンパク質またはその断片は、T細胞受容体（TCR）に結合した形で投与してもよく、またはマクロファージ、樹状細胞（DC）、もしくはB細胞のような抗原提示細胞（APC）によって提示された形で投与してもよい。DCの強い抗原提示能のため、APCの中では、DCを用いることが最も好ましい。
【０１０７】
本発明において、TSに対するワクチンとは、動物に接種すると抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する物質を指す。本発明によると、TS 1〜346にコードされるポリペプチドまたはその断片は、TS 1〜346を発現するTS細胞に対して強力かつ特異的な免疫応答を誘導する可能性があるHLA-A24またはHLA-A*0201拘束性エピトープであることが示唆された。このように、本発明はまた、ポリペプチドを用いて抗腫瘍免疫を誘導する方法も含む。一般的に、抗腫瘍免疫には、以下のような免疫応答が含まれる：
−腫瘍に対する細胞障害性リンパ球の誘導、
−腫瘍を認識する抗体の誘導、および
−抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
【０１０８】
したがって、あるタンパク質が、動物への接種時にこれらの免疫応答のいずれか一つを誘導する場合、そのタンパク質は、抗腫瘍免疫誘導効果を有すると判定される。タンパク質による抗腫瘍免疫の誘導は、宿主におけるタンパク質に対する免疫系の反応をインビボまたはインビトロで観察することによって検出することができる。
【０１０９】
例えば、細胞障害性Tリンパ球の誘導を検出する方法は周知である。生体内に入る外来物質は、抗原提示細胞（APC）の作用によってT細胞およびB細胞に提示される。APCによって提示された抗原に対して抗原特異的に応答するT細胞は、抗原による刺激によって細胞障害性T細胞（または細胞障害性Tリンパ球；CTL）に分化した後増殖する（これはT細胞の活性化と呼ばれる）。したがって、あるペプチドによるCTL誘導は、APCによるT細胞へのペプチドの提示およびCTLの誘導を検出することによって評価することができる。さらに、APCは、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、マクロファージ、好酸球、およびNK細胞を活性化する効果を有する。CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞も同様に抗腫瘍免疫において重要であることから、ペプチドの抗腫瘍免疫誘導作用は、これらの細胞の活性化効果を指標として用いて評価することができる。
【０１１０】
APCとして樹状細胞（DC）を用いてCTLの誘導作用を評価する方法は、当技術分野で周知である。DCは、APCの中でも最も強力なCTL誘導作用を有する代表的なAPCである。この方法では、被験ポリペプチドをまずDCに接触させて、このDCをT細胞に接触させる。DCに接触させた後に、対象細胞に対して細胞障害作用を有するT細胞が検出されれば、被験ポリペプチドが細胞障害性T細胞の誘導活性を有することを示している。腫瘍に対するCTLの活性は、例えば51Cr標識腫瘍細胞の溶解を指標として用いて検出することができる。または、3H-チミジン取り込み活性またはLDH（乳糖デヒドロゲナーゼ）放出を指標として用いて腫瘍細胞の損傷の程度を評価する方法も同様に周知である。
【０１１１】
DCとは別に、末梢血単核球（PBMC）も同様にAPCとして用いてもよい。CTLの誘導は、GM-CSFおよびIL-4の存在下でPBMCを培養することによって増強されうることが報告されている。同様に、CTLは、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）およびIL-7の存在下でPBMCを培養することによって誘導されることが示されている。
【０１１２】
これらの方法によってCTL誘導活性を有することが確認された被験ポリペプチドは、DC活性化効果およびその後のCTL誘導活性を有するポリペプチドである。したがって、腫瘍細胞に対してCTLを誘導するポリペプチドは、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、ポリペプチドに接触させることによって腫瘍に対するCTLの誘導能を獲得したAPCは、腫瘍に対するワクチンとして有用である。さらに、APCによるポリペプチドの抗原提示により細胞障害性を獲得したCTLも同様に、腫瘍に対するワクチンとして用いることができる。APCおよびCTLによる抗腫瘍免疫を用いるそのような腫瘍の治療法は、細胞免疫療法と呼ばれる。
【０１１３】
一般的に、細胞免疫療法のためにポリペプチドを用いる場合、CTL誘導効率は、異なる構造を有する複数のポリペプチドを組み合わせて、それらをDCに接触させることによって増加することが知られている。したがって、DCをタンパク質断片によって刺激する場合、複数のタイプの断片の混合物を用いることが有利である。
【０１１４】
または、ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することによって確認することができる。例えば、ポリペプチドに対する抗体が、そのポリペプチドで免疫した実験動物において誘導される場合、そして腫瘍細胞の増殖がそれらの抗体によって抑制される場合、ポリペプチドは、抗腫瘍免疫の誘導能を有すると判定することができる。
【０１１５】
抗腫瘍免疫は本発明のワクチンを投与することによって誘導され、抗腫瘍免疫の誘導によって、TSを治療および予防することができる。癌の治療または癌の発症の予防には、癌性細胞の増殖の阻害、癌の退縮、および癌の発生抑制のような段階のいずれかが含まれる。癌を有する個体の死亡率の低下、血液中の腫瘍マーカーの減少、癌に伴う検出可能な症状の軽減等も同様に、癌の治療または予防に含まれる。そのような治療および予防効果は好ましくは統計学的に有意である。例えば、細胞増殖疾患に対するワクチンの治療または予防効果を、ワクチン投与を行わない対照と比較する観察において、5％以下は有意水準である。例えば、スチューデントのt-検定、マン-ホイットニーのU検定、またはANOVAを統計解析に用いてもよい。
【０１１６】
免疫学的活性を有する上記のタンパク質またはそのタンパク質をコードするベクターをアジュバントと併用してもよい。アジュバントは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続して）投与した場合にタンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。アジュバントの例には、コレラ毒素、サルモネラ毒素、ミョウバン等が含まれるがこれらに限定されない。さらに、本発明のワクチンは、薬学的に許容される担体と適切に組み合わせてもよい。そのような担体の例は、滅菌水、生理食塩液、リン酸緩衝液、培養液等である。さらに、ワクチンは必要に応じて、安定化剤、懸濁剤、保存剤、界面活性剤等を含んでもよい。ワクチンは、全身または局所投与される。ワクチン投与は、1回投与によって行ってもよく、または複数回投与によって追加免疫してもよい。
【０１１７】
本発明のワクチンとしてAPCまたはCTLを用いる場合、腫瘍を例えばエクスビボ法によって治療または予防することができる。より詳しく述べると、治療または予防を受けている被験者のPBMCを採取して、細胞をエクスビボでポリペプチドに接触させて、APCまたはCTLの誘導後、細胞を被験者に投与してもよい。APCはまた、ポリペプチドをコードするベクターをエクスビボでPBMCに導入することによって誘導することができる。インビトロで誘導されたAPCまたはCTLは、投与前にクローニングすることができる。標的細胞を損傷する高い活性を有する細胞をクローニングして増殖させることによって、細胞免疫療法をより効率よく行うことができる。さらに、このようにして単離されたAPCおよびCTLを用いて、細胞が由来する個体に対してのみならず、他の個体からの類似のタイプの腫瘍に対する細胞免疫療法のために用いてもよい。
【０１１８】
さらに、本発明のポリペプチドの薬学的有効量を含む、癌のような細胞増殖疾患を治療または予防するための薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、抗腫瘍免疫を惹起するために用いてもよい。
【０１１９】
TSを阻害するための薬学的組成物
薬学的製剤には、経口、直腸内、鼻腔内、局所（口腔内および舌下を含む）、膣内、もしくは非経口（筋肉内、皮下、および静脈内を含む）投与に適した製剤、または吸入もしくは吹入による投与に適した製剤が含まれる。好ましくは、投与は静脈内である。製剤は任意で個別の用量単位に包装される。
【０１２０】
経口投与に適した薬学的製剤には、それぞれが活性成分の規定量を含むカプセル剤、カシェ剤、または錠剤が含まれる。製剤にはまた、粉剤、顆粒剤、または溶液、懸濁液、または乳液が含まれる。活性成分は、任意でボーラス舐剤またはペーストとして投与される。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、または湿潤剤のような通常の賦形剤を含んでもよい。錠剤は、任意で一つまたは複数の製剤成分との圧縮または成形によって作製してもよい。圧縮錠は、粉剤または顆粒剤のような流動状の活性成分を、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、または分散剤と混合して、適した装置において圧縮することによって調製してもよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤によって湿らせた粉末化合物の混合物を適した機械において成形することによって作製してもよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法に従ってコーティングしてもよい。経口液体調製物は、例えば、水性もしくは油性懸濁液、溶液、乳液、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形であってもよく、または使用前に水もしくは他の適した溶剤によって構成するための乾燥製品として提供してもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性溶剤（食用油が含まれてもよい）、または保存剤のような通常の添加剤を含んでもよい。錠剤は任意で、活性成分の徐放または制御放出を提供するように調製してもよい。錠剤の包装は、毎月服用される錠剤1錠を含んでよい。
【０１２１】
非経口投与用製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性滅菌注射剤、ならびに懸濁剤および濃化剤を含んでもよい水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数回用量容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに入れてもよく、滅菌液体担体、例えば生理食塩液、注射用水を使用直前に加えるだけでよい凍結乾燥状態で保存してもよい。または、製剤は、連続注入用であってもよい。即時調合注射溶液および懸濁液は、既に記述した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製してもよい。
【０１２２】
直腸投与用製剤には、カカオバターまたはポリエチレングリコールのような標準的な担体を含む坐剤が含まれる。口内への、例えば口腔内または舌下への局所投与用製剤には、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントのような着香基剤に活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチンとグリセリンまたはショ糖とアカシアのような基剤に活性成分を含む香錠が含まれる。鼻腔内投与の場合、本発明の化合物を液体スプレー、もしくは分散性の粉末として、または点鼻剤の形態で用いてもよい。点鼻剤は、一つまたは複数の分散剤、溶解剤、または懸濁剤も含む水性または非水性基剤によって調製してもよい。
【０１２３】
吸入による投与の場合、吸入器、ネブライザー、加圧パックまたはエアロゾルスプレーを送達するための他の便利な手段によって化合物を適宜送達する。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適したガスのような適した噴射剤を含んでもよい。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、一定量を送達するための弁を提供することによって決定してもよい。
【０１２４】
あるいは、吸入または吹入による投与の場合、化合物は、乾燥粉末組成物、例えば化合物と、乳糖またはデンプンのような適した粉末基剤との粉末混合物の形状をとってもよい。粉末組成物は、単位投与剤形、例えば、粉末が吸入器または吹入器を利用して投与されうるカプセル剤、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパックの形としてもよい。
【０１２５】
他の製剤には、治療薬剤を放出する埋め込み可能装置および接着パッチが含まれる。
【０１２６】
望ましければ、活性成分を持続的に放出するように適合された上記の製剤を用いてもよい。薬学的組成物はまた、抗菌剤、免疫抑制剤、または保存剤のような他の活性成分を含んでもよい。
【０１２７】
上記で特に言及した成分の他に、本発明の製剤には、当該製剤のタイプに関して当技術分野において通常の他の薬剤が含まれてもよいと理解すべきであり、例えば経口投与に適した製剤は着香料を含んでもよい。
【０１２８】
好ましい単位投与製剤は、下記に引用するように、活性成分またはその適当な分画の有効量を含む製剤である。
【０１２９】
上記の条件のそれぞれに関して、組成物、例えばポリペプチドおよび有機化合物は、約0.1〜約250 mg/kg/日の用量で経口または注射によって投与される。成人ヒトの用量範囲は一般的に、約5 mg〜約17.5 g/日、好ましくは約5 mg〜約10 g/日、および最も好ましくは約100 mg〜約3 g/日である。錠剤または個別の単位で提供される他の単位投与剤形は、便宜上、同一単位量を複数回投与した量で有効性を示すような単位量、例えば約5 mg〜約500 mg、通常約100 mg〜約500 mgを含みうる。
【０１３０】
用いられる用量は、被験者の年齢および性別、治療される正確な障害、およびその重症度を含む多数の要因によって左右されると考えられる。同様に、投与経路も、病態およびその重症度に依存して変化してもよい。
【０１３１】
本発明はさらに、添付の請求の範囲に記述される本発明の範囲を制限しない以下の実施例において説明される。以下の実施例は、TS細胞において発現に差のある遺伝子の同定および特徴付けを説明する。
【０１３２】
実施例1：被験試料の調製
疾患状態（例えば、TS）で発現に差のある遺伝子を同定するために、疾患組織（例えば、精巣生殖細胞腫瘍からの精巣細胞）から得た組織および正常組織を評価した。アッセイは以下のように実施した。
【０１３３】
患者、組織試料、およびレーザー捕獲顕微解剖（LCM）
TGCT試料を、精巣摘除術を受けた患者13人から得た。これらの患者の臨床特徴を表1に要約する。精上皮腫と診断された試料12例および精上皮腫と卵黄嚢腫瘍の双方を有する試料1例を用いた。
【０１３４】
試料は全て、-80℃で凍結してから、TissueTek OCT培地（Sakura）に抱埋した。凍結した標本を低温槽（Sakura）において厚さ8 μmの連続切片にして、分析した領域を明らかにするために、ヘマトキシリン-エオジンによって染色した。次に、精上皮腫細胞を、いくつかの改変を加えた製造元のプロトコールに従って、PixCell II LCMシステム（Arcturus Engineering）によって各染色組織から選択的に顕微解剖した（21）。
【０１３５】
（表１）精巣精上皮腫患者13人の臨床特徴
【０１３６】
RNAの抽出と精製およびT7に基づくRNA増幅
捕獲した細胞からの総RNAを、RLT溶解緩衝液（QIAGEN）350 μlにおいて抽出した。抽出したRNAを、DNアーゼI（QIAGEN）30単位で室温にて15分間処理した。DNアーゼIで処理した全てのRNAに、Ampliscribe T7転写キット（Epicentre Technologies）を用いてT7に基づく増幅を行った（20）。2回の増幅によって、各組織に関して増幅RNA（aRNA）30〜238 μgが得られた。対照プローブとして、正常なヒトポリ(A)+RNA（Clontech）を、T7に基づく増幅によって2回増幅した。各癌様組織および対照からのaRNAのアリコート2.5μgをそれぞれ、Cy5-dCTPおよびCy3-dCTPの存在下で逆転写した（22）。
【０１３７】
cDNAマイクロアレイの調製
米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）のUniGeneデータベース（構築#131）から選択したcDNA 23,040個を含む「ゲノム全体」のcDNAマイクロアレイシステムを確立した。簡単に説明すると、様々なヒト臓器から単離したポリ(A)+RNAを鋳型として用いて、RT-PCRによってcDNAを増幅した。アンプリコンの長さは、反復またはポリ（A）配列を除き、200〜1,100 bpの範囲であった。PCR産物を、マイクロアレイスポッター、ジェネレーションIII（Amersham Biosciences）を用いて、7型スライドガラス上にスポットした；遺伝子4608個をスライドガラス1枚に2連にスポットした。異なる5つのスライドガラスを調製して（すなわち、全体で遺伝子23,040個）、そのそれぞれの上に同じハウスキーピング遺伝子52個と陰性対照遺伝子2個も同様にスポットした（23）。
【０１３８】
ハイブリダイゼーションおよびデータの獲得
ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、全ての過程を自動スライドプロセッサ（Amersham Biosciences）によって実施したことを除き、既に記述されているプロトコールに従って行った。各ハイブリダイゼーションシグナルの強度は、アレイビジョンコンピュータープログラム（Amersham Biosciences）によって測光法によって計算し、バックグラウンドの強度を差し引いた。各Cy3およびCy5シグナル強度の標準化は、ハウスキーピング遺伝子52個のシグナルの平均値を用いて行った。各発現レベルのカットオフ値は、バックグラウンドの変動に従って自動的に計算した。Cy5/Cy3を相対的発現比として計算した。Cy3およびCy5シグナル強度がいずれもカットオフ値より低い場合、その試料における対応する遺伝子の発現は、これまでの報告に従ってなしと評価された（23）。他の遺伝子に関して、Cy5/Cy3比は、各試料の生データを用いて計算した。
【０１３９】
実施例2：TS関連遺伝子の同定
TSにおいて一般的に上方制御または下方制御される遺伝子が同定されたとき、それらの遺伝子は以下の基準に従って分析された。まず、50％を超える症例についてその相対的発現比を計算することができる遺伝子、および70％を超える症例においてその発現が上方制御または下方制御される遺伝子を選択した。その上、35〜50％の症例について相対的発現比を計算することができれば、遺伝子は、全ての症例で上方制御または下方制御されると評価された。各遺伝子の相対的発現比（Cy5/Cy3強度比）は、以下のように4つのカテゴリーのうちの1つに分類された：（1）上方制御される（発現比は5.0より大きい）；（2）下方制御される（発現比は0.2未満）；（3）発現に変化なし（発現比は0.2〜5.0）；および（4）発現されない（またはわずかに発現されるが検出用のカットオフ値未満である）。これらのカテゴリーを用いて、発現比の変化が特定のサブグループに対して特異的であると共に試料において一般的である遺伝子の組を検出した。精上皮腫細胞において一般的に上方制御または下方制御される候補遺伝子を検出するために、遺伝子23,040個の全体的な発現パターンをスクリーニングして、5.0より大きい、または0.2より小さい発現比を有する遺伝子を選択した。
【０１４０】
TS細胞において臨床的に関連する発現パターンを有する遺伝子の同定
TGCTの発症および進行の基礎となる遺伝子事象を解明するために、本発明者らは、ゲノム全体のcDNAマイクロアレイによって臨床材料における遺伝子発現を分析した。マイクロアレイ技術によって、1回の実験で何千もの遺伝子の発現を分析することが可能となり、癌の分子機構に対する新しい洞察を得ることができる。そのようなデータは、臨床管理の改善に関与し、それによって癌患者のよりよい生活水準が提供されると期待される。
【０１４１】
ある研究グループは、第17染色体の長腕がしばしばTGCTにおいて過剰発現されていることから、第17染色体に存在する遺伝子の注文製作したcDNAマイクロアレイを用いて、遺伝子発現プロフィールを分析した（13）。しかし、その試験では、第17染色体上の遺伝子636個およびゲノムの他からの遺伝子512個を分析したにすぎなかった。本発明者らの知る限り、本発明者らの試験は、TGCTに関する最初のゲノム全体のcDNAマイクロアレイ分析である。
【０１４２】
本発明者らは、LCMによって精製した精上皮腫細胞の集団を調べるために遺伝子23,040個を含む包括的cDNAマイクロアレイシステムを用いて、特にTSを重点的に調べた。顕微鏡的な視覚化により、本手順により選択された癌細胞集団がほぼ100％であると推定した。
【０１４３】
発現比が5.0を超える上方制御された遺伝子346個が同定され（表2）、発現比が0.2未満である下方制御された遺伝子593個が同定された（表3）。さらに、発現比が10.0を超える特に高度に上方制御された遺伝子213個が同定された（データは示していない）。一方、発現比が0.1未満である下方制御された遺伝子376個が同定された（データは示していない）。
【０１４４】
それらのいくつかは、新規治療剤の分子標的となる可能性があり、かつ／または診断的腫瘍マーカーとして役立つ可能性がある。表4における遺伝子のリストには、TSの発癌または細胞増殖に関係することが既に知られている遺伝子である、CCND2（1）、POV1（24）、PIM2（25）、JUP（26）、およびMYCN（14）が含まれる。例えば、RBタンパク質のリン酸化を調節して、G1-S細胞周期チェックポイントを制御するCCND2は、TSにおいてしばしば高度に発現されている；D型サイクリンの過剰発現によるこのチェックポイントの破壊は、ヒトにおける腫瘍発生の主要な経路の一つである（1）。前立腺癌において過剰発現される遺伝子として初めて同定されたPOV1（24）は後に、精巣の上皮内癌と共に全てのTSにおいて高度に発現されることが示された。この遺伝子は、膜貫通ドメイン12個を有する膜輸送タンパク質をコードして、細胞増殖にとって必須の栄養および／または代謝物を輸送する可能性がある（27）。したがって、その産物は、TSおよび前立腺癌を治療するための抗癌剤の分子標的となる可能性がある。セリントレオニンキナーゼをコードする癌原遺伝子であるPIM2は、これまでに、造血幹細胞、白血球細胞株およびリンパ腫細胞株、ならびにTSにおいて高度に発現されることが報告された；その産物は、造血および腫瘍形成性形質転換において重要な役割を有するように思われる（25）。γカテニンとしても知られるJUPは、細胞接着およびWntシグナル伝達経路において重要な役割を果たす；JUPは、APC腫瘍抑制遺伝子によって調節され、結腸癌におけるその腫瘍形成活性は、βカテニンの活性とは異なると考えられる（26）。MYCN遺伝子の増幅は、多様なヒト腫瘍において認められており、神経芽腫において最も頻繁であり、その過剰発現は、精上皮腫および非精上皮腫の双方において報告されている（14）。このように、これらの腫瘍形成機能の抑制は、TSの治療に対する新規アプローチとなる可能性がある。その上、これらの上方制御されたエレメントには、シグナル伝達経路、腫瘍遺伝子、細胞周期、ならびに細胞接着および細胞骨格に関与する有意な遺伝子が含まれていた（表4）。
【０１４５】
精巣癌に何らかの関与を有することが知られている遺伝子の他に、本発明者らは、PIM-1、PET、およびVAV2を含む他の腫瘍遺伝子の過剰発現を認めた。セリン／トレオニンキナーゼをコードするPIM-1（28）は、本発明者らのマイクロアレイにおいて調べられた情報の得られた精上皮腫11例全てにおいて過剰発現されていた。RETも同様に、情報の得られた精上皮腫6例全てにおいて過剰発現されていた。RET遺伝子は、細胞の増殖および分化のためのシグナルを伝達する細胞表面分子である受容体チロシンキナーゼをコードする；RET遺伝子における生殖系列変異は、二つの遺伝性の癌症候群、すなわち多発性内分泌新生物2A型および2B型に関与している（29）。VAV腫瘍遺伝子ファミリーのメンバーであるVAV2は、本発明者らのマイクロアレイにおいて調べられた情報の得られた精上皮腫症例12例中11例において過剰発現されていた。VAVタンパク質は、細胞の形質転換および腫瘍形成に関連している；これは、形質転換した細胞の転移特性を増強するか、またはRasのような腫瘍遺伝子タンパク質の形質転換活性に関与する補助因子として作用するように思われる（30）。
【０１４６】
一方、本発明者らのリストにおける下方制御される遺伝子には、少なくとも一つの既知の腫瘍抑制因子であるWT1が含まれ、それが不活化されるとウィルムス腫瘍および、ウィルムス腫瘍に対する感受性、無虹彩症、尿性器異常、および精神遅滞を特徴とするWAGR症候群を引き起こす（31）。WT1を有する染色体領域でのヘテロ接合性の喪失が、精巣生殖細胞腫瘍においてしばしば認められている（32）。さらに、ウィルムス腫瘍1関連タンパク質（KIAA0105、WTAP）、WT1結合パートナーも同様に、本発明者らの研究において下方制御された。WT1は、尿性器系の正常な発達に関連していることから、その産物は、精巣の腫瘍形成に関与する一つの候補物質となる可能性があるが、その分子機構はまだ不明である。
【０１４７】
分子標的薬を用いて、臨床上の改善が最近得られたことにより、特定の癌を治療する薬物を開発するための新規分子標的を発見する重要性が強調されてきた。例えば、抗HER-2モノクローナル抗体であるトラスツズマブは、抗癌剤と併用して、癌原遺伝子受容体HER2/neuに拮抗させ、何人かの乳癌患者の臨床反応および生存の改善をもたらした（33）。bcr-ablを標的とするチロシンキナーゼ阻害剤であるSTI-571は、今では慢性骨髄性白血病の治療にとって第一選択薬であり（34）、上皮細胞増殖因子受容体阻害剤であるゲフィチニブは、肺の非小細胞癌の治療にとって有用である（35）。抗CD20モノクローナル抗体であるリツキシマブは、B細胞リンパ腫またはマントル細胞リンパ腫の患者において完全寛解率および全体的な生存率を改善した（36）。したがって、本明細書において同定された細胞増殖に関連する上方制御される遺伝子の産物は、TSを治療する新規物質を設計するための有望な標的となる可能性がある。特に、自己分泌細胞増殖経路において機能する分泌型タンパク質は、薬物を開発するための良好な候補物質となるはずであり、このタイプの癌の新規診断マーカーとなりうるであろう。
【０１４８】
本研究において分析した症例13例中11例が、臨床病理的にI期であると分類された。したがって、本発明らのマイクロアレイにおいて一般的に上方制御または下方制御される遺伝子は、腫瘍形成の比較的初期段階に関連する可能性がある。その結果、本発明者らのデータは、癌関連遺伝子に関する新規情報を提供するのみならず、既知の遺伝子と腫瘍形成との新規相関を提供する。それにもかかわらず、本明細書に記述された情報は、TS発症の際の遺伝子活性の変化における複雑度が高度であることを開示した；結果は、このタイプの癌に関して可能性のある治療標的および／またはバイオマーカーの長大なリストである。
【０１４９】
（表２）精巣精上皮腫において5倍またはそれ以上一般的に上方制御される遺伝子346個
【０１５０】
（表３）精巣精上皮腫において0.2倍またはそれ未満一般的に下方制御される遺伝子593個
【０１５１】
（表４）精巣精上皮腫における既知機能を有する代表的な上方制御される遺伝子
【０１５２】
半定量的RT-PCR
上方制御された遺伝子29個を選択して、半定量的RT-PCR実験を適用することによってその発現レベルを調べた。各試料からのaRNAのアリコート3μgをランダムプライマー（Roche）およびスーパースクリプトII（Life Technologies, Inc.）を用いて一本鎖cDNAを得るために逆転写した。各cDNA混合物を、標的DNAまたはαチューブリン特異的反応のために調製した同じプライマーの組によるその後のPCR増幅のために希釈した。プライマー配列を表5に記載する。αチューブリンの発現を内部対照とした。PCR反応は、増幅の直線相内で産物の強度を確保するためにサイクル数に関して最適にした。情報の得られた全ての症例のほとんどにおいてその発現が過剰発現であった上方制御された遺伝子29個（CCND2、GIP、H1F2、NMA、PIM2、POV1、PRDM4、PTMS、RAI3、PYPAF3、T1A-2、TCOF1、TGIF2、FLJ10713、FLJ20069、KIAA0456、KIAA1198、DKFZp434K0621、EST(270)、FLJ13352、FLJ12195、EST(285)、NCOA6IP、EST(295)、PLXNA2、EST(311)、EST(320)、LOC152217、EST(341)）の発現レベルの比を比較したところ、結果は、調べた症例の大多数においてマイクロアレイ分析の結果と高度に類似であった（図1、図2A）。
【０１５３】
（表５）RT-PCRのプライマー配列
【０１５４】
実施例3：PYPAF3の発現を減少させるように設計されたsiRNAの増殖阻害作用
cDNAマイクロアレイによるゲノム全体の発現プロフィールの分析を通して、本発明者らは、診断腫瘍マーカーに関する新規分子標的を単離し、精巣生殖細胞腫瘍を治療および予防するために応用した。精巣精上皮腫において一般的に上方制御される遺伝子において、本発明者らは、半定量的RT-PCR分析によって、精巣、心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、および骨髄を含む正常なヒト臓器と比較して、精巣精上皮腫症例8例中7例において有意に上方制御されたPYRIN含有Apaf-1様タンパク質3（PYPAF3（NM_139176））を重点的に調べた。本発明者らは、今では、精巣精上皮腫において上方制御された遺伝子としてPYPAF3を同定したが（構築#160）、本発明者らは当初、米国国立バイオテクノロジー情報センターのUniGeneデータベース（構築#131）から検索した遺伝子23,040個を表すcDNAマイクロアレイを用いた発現プロフィールを通してこの遺伝子をRMP：RMB5介在タンパク質であると記載した。
【０１５５】
プローブとしてPYPAF3 cDNA断片を用いる多組織ノーザンブロット分析から、精巣に限って発現される約3.3 kbの転写物が判明した。免疫細胞化学試験から、PYPAF3タンパク質が細胞質全体に存在することが判明した。PYPAF3の低分子干渉RNA（siRNA）の導入は、PYPAF3のmRNAの発現を阻害して、精巣生殖細胞腫瘍細胞の細胞増殖を阻害した。これらの知見は、PYPAF3が、精巣精上皮腫の腫瘍発生に関与する可能性があること、そして精巣生殖細胞腫瘍の標的化治療を開発するための有望な候補物質となることを示唆している。
【０１５６】
細胞株および組織標本
COS-7細胞およびTera-2細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、ロックビル、メリーランド州）から得た。細胞株は全て、10％ウシ胎児血清および1％抗生物質／抗真菌剤溶液（Sigma、セントルイス、ミズーリ州）を添加した適当な培地において、COS-7 McCoy's5A（Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州）に関してはダルベッコ改変イーグル培地（Sigma）において単層で増殖させ、5％CO2を含む湿潤大気中、37℃で維持した。
【０１５７】
半定量的RT-PCR
正常なヒト精巣、心臓、肺、腎臓、肝臓、脳、および骨髄のポリ(A)+RNAをClontech（パロアルト、カリフォルニア州）から得た。各試料からの増幅RNAのアリコート3 μgをランダムプライマー（Roche）およびスーパースクリプトII逆転写酵素（Invitrogen）を用いて一本鎖cDNAに逆転写した。各一本鎖cDNAをその後のPCR増幅のために希釈した。20 ml容積のPCR緩衝液（タカラ、京都、日本）において標準的なRT-PCR技法を行い、変性用に94℃で5分間、続けて94℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で30秒間を22サイクル（TUBA3に関して）または31サイクル（PYPAF3に関して）行うことによって増幅した。プライマー配列は以下の通りであった：TUBA3に関しては、フォワード5'-CTTGGGTCTGTAACAAAGCATTC-3'（配列番号：59）、およびリバース5'-AAGGATTATGAGGAGGTTGGTGT-3'（配列番号：60）；PYPAF3に関しては、フォワード5'-TGGGGTTCTAAGACAAAGAACTG-3'（配列番号：19）およびリバース5'-GTGAGAAAACCAGTGTCAAATCC-3'（配列番号：20）。
【０１５８】
ノーザンブロット分析
ヒトの多組織ブロット（Clontech）を、プローブとして32P標識PYPAF3 cDNA断片にハイブリダイズさせた。cDNAは、上記のようにRT-PCRによって調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、製造元の推奨に従って行った。ブロットについては、-80℃にて7日間増感スクリーンを用いてオートラジオグラフィーを行った。
【０１５９】
免疫細胞化学染色
PYPAF3の全コード領域は、RT-PCRによってフォワードプライマー5'-CGCGGATCCCACTATGACATCGCCCCAGC-3'（配列番号：63）およびリバースプライマー5'-CCGCTCGAGGCAAAAAAAGTCACAGCACGG-3'（配列番号：64）を用いて増幅した。PCR産物をBamHIおよびXhoIによって消化した後、これを、プラスミドベクターpcDNA3.1-myc/His（Invitrogen）の適当なクローニング部位にクローニングした。COS7細胞に、FuGENE6トランスフェクション試薬（Roche、バーゼル、スイス）と混合したpcDNA3.1(+)-PYPAF3-myc/His（Invitrogen）を導入した。COS7に由来する一過性のトランスフェクタントをPBS（-）で2回洗浄して、4％パラホルムアルデヒド溶液によって4℃で15分間固定して、0.1％トライトンX-100を含むPBS（-）によって2.5分間透過性にした。細胞を3％BSAのPBS（-）溶液で60分間覆って、一次抗体による反応の前に非特異的抗体結合部位をブロックした。PYPAF3タンパク質は、一次抗体としてマウス抗ヒトc-Myc 9E10抗体（Santa Cruz Biotechnology、サンタクルズ、カリフォルニア州）を用いて、二次抗体としてヤギ抗マウスFITC（Jackson ImmunoReserach、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）を用いて検出した。核は、4',6'-ジアミジン-2'-フェニルインドールジヒドロクロリド（Vector Laboratories、バーリンガム、カリフォルニア州）によって対比染色した。蛍光像は、エクリプスE800顕微鏡（ニコン、東京、日本）によって得た。
【０１６０】
低分子干渉RNA（siRNA）による精巣生殖細胞腫瘍細胞の処置
RNAポリメラーゼIIIによるU6RNA遺伝子の転写によって、3'末端でウリジンを有する短い転写物が生成される。本発明者らは、プライマー5'-TGGTAGCCAAGTGCAGGTTATA-3'（配列番号：65）および5'-CCAAAGGGTTTCTGCAGTTTCA-3'（配列番号：66）、ならびに鋳型としてヒト胎盤DNAを用いて、U6RNAのプロモーター領域を含むゲノム断片をPCRによって増幅した。産物を精製して、TAクローニングキットを用いて製造元のプロトコール（Invitrogen）に従ってpCR2.1プラスミドベクターにクローニングした。U6RNAを含むBamHI、XhoI断片を精製して、pcDNA(+)のヌクレオチド1257位と56位の間にクローニングして、プライマー5'-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3'（配列番号：67）および5'-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3'（配列番号：68）を用いて、断片をPCRによって増幅した。ライゲーションしたDNAは、プライマー5'-TTTAAGCTTGAAGACCATTTTTGGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACA-3'（配列番号：69）および5'-TTTAAGCTTGAAGACATGGGAAAGAGTGGTCTCA-3'（配列番号：70）を用いたPCR増幅のための鋳型となった。産物をHindIIIによって消化し、その後自己ライゲーションさせてpsiU6BXベクタープラスミドを生成した。PYPAF3に対するsiRNA発現ベクター（psiU6BX-PYPAF3）および対照プラスミド（psiU6BX-EGFP、psiU6BX-ルシフェラーゼ）は、以下の表6のような二本鎖オリゴヌクレオチドを、psiU6BXベクターのBbsI部位にクローニングすることによって調製した。各siRNA発現ベクターを、内因性にPYPAF3を発現する精巣生殖細胞腫瘍細胞株Tera-2にFuGENE6（Roche）と共に導入した。ジェネテシン（Invitrogen）によって選択した後、細胞の増殖を、ギムザ染色を用いるコロニー形成アッセイによって2週間後に評価し、そして細胞計数キット8（同仁化学研究所、熊本、日本）によって1週間後に評価した（39）。PYPAF3 mRNAのノックダウン効果を半定量的RT-PCRによって同定した。
【０１６１】
半定量的RT-PCRによる精巣精上皮腫におけるPYPAF3発現の確認
本発明者らは、患者13人からの精巣精上皮腫における遺伝子23,040個の遺伝子発現を分析するためにcDNAマイクロアレイを用いている（12）。上方制御された遺伝子の中で、本発明者らは、その遺伝子のシグナル強度が精巣精上皮腫を有する患者においてカットオフ値より高かった有益な症例8例中7例において過剰発現されたPYPAF3を重点的に調べた。さらに、本発明者らは、半定量的RT-PCR分析を行って、正常なヒト精巣、心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、および骨髄と比較して精巣精上皮腫8例中7例においてPYPAF3の発現が上昇していることを確認した（図2A）。
【０１６２】
多組織ノーザンブロット分析とPYPAF3タンパク質の細胞下局在
PYPAF3 cDNA断片をプローブとして用いたノーザンブロット分析（材料および方法を参照されたい）から、精巣に限って発現される約3.3 kbの転写物が明らかとなった（図2B）。さらに、哺乳動物細胞におけるPYPAF3タンパク質の役割を調べるために、本発明者らは、myc標識PYPAF3タンパク質の発現を目的としたプラスミドを構築した（材料および方法を参照されたい）。プラスミドDNAをCOS-7細胞に一過性に導入した場合、標識PYPAF3タンパク質は導入した細胞の細胞質全体に存在していた（図3）。
【０１６３】
PYPAF3の発現を減少させるように設計された低分子干渉RNA（siRNA）の増殖阻害効果
PYPAF3の増殖促進的な役割を評価するために、本発明者らは、哺乳動物ベクターに基づくRNA干渉（RNAi）技術により、精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2細胞における内因性のPYPAF3の発現をノックダウンして、細胞増殖に及ぼす影響を調べた（材料および方法を参照されたい）。図4aに示すように、psiU6BX-PYPAF3（Si4）の導入は、Tera-2細胞株におけるPYPAF3転写物の発現を明らかに減少させたが、対照プラスミド（psiU6BX-EGFPおよびpsiU6BX-ルシフェラーゼsiRNA発現ベクター）を導入した細胞では作用が認められなかった。psiU6BX-PYPAF3による遺伝子特異的増殖抑制を確認するために、本発明者らは、同じ二つの細胞株のコロニー形成アッセイを行った；図4bおよび4cに示すように、psiU6BX-PYPAF3（Si4）の導入は、Tera-2細胞の増殖を有意に抑制し、上記の発現の減少結果と一致した。一方、Si3の導入は、PYPAF3転写物レベルのノックダウンでは減少がほとんど示されなかったものの、Tera-2の増殖を顕著に抑制した。その上、MTTアッセイではまた、PYPAF3発現をpsiU6BX-PYPAF3を用いて抑制した場合にTera-2細胞の有意な増殖阻害を示した（Si3およびSi4）（図4a、b）。それぞれの結果は、独立した三回の実験によって確認した。
【０１６４】
（表６）PYPAF3の低分子干渉RNAのオリゴヌクレオチド配列
【０１６５】
産業上の利用可能性
レーザー捕獲顕微解剖とゲノム全体のcDNAマイクロアレイとの併用によって得られた本明細書に記載のTSにおける遺伝子発現分析によって、癌の予防および治療のための標的としての特異的遺伝子が同定された。これらの発現に差のある遺伝子サブセットの発現に基づいて、本発明者らは、TSを同定または検出するための分子診断マーカーを提供する。
【０１６６】
本明細書に記載の方法はまた、TSの予防、診断、および治療のためのさらなる分子標的を同定するために有用である。本明細書において報告したデータは、TSの包括的な理解を補足し、新規診断戦略の開発を促進させ、治療薬および予防薬のための分子標的を同定する手がかりを提供する。そのような情報は、精巣腫瘍形成のより深い理解に貢献して、TSの診断、治療、および最終的には予防における新規戦略を開発するための指標を提供する。
【０１６７】
本明細書において引用した全ての特許、特許出願、および出版物は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。さらに、本発明は、詳細にその特定の態様に関して記述してきたが、本発明には様々な変更および改変が施されてもよく、それらも本発明の趣旨および範囲に含まれることは、当業者に明らかであると考えられる。
【０１６８】
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【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】増幅されたRNAから調製したcDNAを用い、半定量的RT-PCRによって調べた代表的な遺伝子28個およびTUBAの発現を示すDNAアガロースゲルの写真を示す。最初の11個のレーンは、異なるTS患者における遺伝子の発現レベルを示す。最後のレーンは、正常な個体からの精巣における各遺伝子の発現レベルを示す。遺伝子に関して遺伝子の記号を示す。
【図２】図2Aは、精巣精上皮腫臨床試料（1、2、7、8、9、10、11および13）、正常ヒト精巣（TES）、心臓（HER）、肺（LUN）、肝臓（LIV）、腎臓（KID）、脳（BRA）、および骨髄（BM）における半定量的RT-PCRによって調べたPYPAF3の発現を示す。TUBA3の発現を内部対照とした。図2Bは、プローブとしてPYPAFs cDNA断片を用いた多組織ブロットによるノーザン分析を示す。
【図３】myc標識PYPAF3タンパク質の細胞下局在を示す。pcDNA3.1-myc/His-PYPAF3プラスミドを導入したCOS-7細胞。導入した細胞を、マウス抗mycモノクローナル抗体によって染色し、FITC結合抗マウスIgG二次抗体によって可視化した。核は、DAPIによって対比染色した。
【図４】精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2におけるPYPAF3の発現を減少させるように設計された低分子干渉RNA（siRNA）の増殖阻害作用を示す。（A）2週目での精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2におけるPYPAF3の内因性発現の抑制を示す半定量的RT-PCR（精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2細胞へのsiRNAの導入後、ネオマイシンを含む選択培地において培養）。β2-ミクログロブリン（β2MG）を内部対照として用いた。（B）対照としてのpsiU6BX-EGFP（siEGFP）、psiU6BX-ルシフェラーゼ（siLuc）と比較して、2週間での精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2細胞におけるPYPAF3のノックダウン（Si1、Si2、Si3、Si4、およびSi5）によるコロニー数の減少を示すコロニー形成アッセイ。（C）psiU6BX-PYPAF3（Si1、Si2、Si3、Si4、およびSi5）、psiU6BX-EGFP（siEGFP）、psiU6BX-ルシフェラーゼ（siLuc）のいずれかを処置した精巣生殖細胞腫瘍株Tera-2細胞の、細胞計数キット8を用いた1週間でのMTTアッセイ。これらの実験も同様に3回実施した。
【図１−１】
【図１−２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者由来の生物学的試料においてTS関連遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、被験者におけるTSを診断するか、またはTS発症の素因を診断する方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該レベルが増加または減少すれば、該被験者がTSを有するか、またはTS発症のリスクを有することを示す方法。
【請求項２】
TS関連遺伝子がTS 1〜346からなる群より選択され、正常対照レベルと比較してレベルが増加すれば、被験者がTSを有するか、またはTS発症のリスクを有することを示す、請求項1記載の方法。
【請求項３】
増加が正常対照レベルより少なくとも10％大きい、請求項2記載の方法。
【請求項４】
TS関連遺伝子が、TS 347〜939からなる群より選択され、正常対照レベルと比較してレベルが減少すれば、被験者がTSを有するか、または発症のリスクを有することを示す、請求項1記載の方法。
【請求項５】
減少が正常対照レベルより少なくとも10％低い、請求項4記載の方法。
【請求項６】
複数のTS関連遺伝子の発現レベルを決定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
発現レベルが、以下からなる群より選択される任意の一つの方法によって決定される、請求項1記載の方法：
（a）TS関連遺伝子のmRNAの検出；
（b）TS関連遺伝子にコードされるタンパク質の検出；および
（c）TS関連遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性の検出。
【請求項８】
患者由来の生物学的試料の遺伝子転写物とTS関連遺伝子プローブとのハイブリダイゼーションを検出することにより発現レベルを決定する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ハイブリダイゼーション段階がDNAアレイ上で行われる、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
生物学的試料が上皮細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
生物学的試料がTS細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
生物学的試料がTSからの上皮細胞を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
TS 1〜939からなる群より選択される二つまたはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、TS参照発現プロファイル。
【請求項１４】
TS 1〜346からなる群より選択される二つまたはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、TS参照発現プロファイル。
【請求項１５】
TS 347〜939からなる群より選択される二つまたはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、TS参照発現プロファイル。
【請求項１６】
以下の段階を含む、TSを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
a）TS 1〜939によりコードされるポリペプチドに被験化合物を接触させる段階；
b）ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階；および
c）ポリペプチドに結合する化合物を選択する段階。
【請求項１７】
以下の段階を含む、TSを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
a）TS 1〜939からなる群より選択される一つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる段階；および
b）TS 1〜346からなる群より選択される一つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを低下させるか、またはTS 347〜939からなる群より選択される一つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する段階。
【請求項１８】
以下の段階を含む、TSを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
a）TS 1〜939からなる群より選択されるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドに被験化合物を接触させる段階；
b）段階（a）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
c）被験化合物の非存在下において検出される生物学的活性と比較して、TS 1〜346によりコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制するか、または被験化合物の非存在下において検出される生物学的活性と比較して、TS 347〜939によりコードされるポリペプチドの生物学的活性を増強する化合物を選択する段階。
【請求項１９】
被験細胞が精巣精上皮腫細胞である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む、TSを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
a）TS 1〜939からなる群より選択される一つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域と、転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている細胞に候補化合物を接触させる段階；
b）レポーター遺伝子の活性を測定する段階；および
c）対照と比較して、該マーカー遺伝子がTS 1〜346からなる群より選択される上方制御されたマーカー遺伝子である場合には、該レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、または該マーカー遺伝子がTS 347〜939からなる群より選択される下方制御されたマーカー遺伝子である場合には、該レポーター遺伝子の発現レベルを増強する化合物を選択する段階。
【請求項２１】
TS 1〜939からなる群より選択される二つもしくはそれ以上の核酸配列に結合する検出試薬を含むキット。
【請求項２２】
TS 1〜939からなる群より選択される二つまたはそれ以上の核酸配列に結合する核酸を含むアレイ。
【請求項２３】
TS 1〜346からなる群より選択されるコード配列と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス組成物を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項２４】
TS 1〜346からなる群より選択される核酸配列の発現を低下させるsiRNA組成物を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項２５】
siRNAが、標的配列として配列番号：85または86のヌクレオチド配列を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
TS 1〜346からなる群より選択される任意の一つの遺伝子にコードされるタンパク質に結合する抗体またはその断片の薬学的有効量を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項２７】
TS 1〜346からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチドもしくは該ポリペプチドの免疫学的活性断片、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを被験者に投与することを含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項２８】
TS 347〜939の発現または活性を増加させる化合物を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項２９】
請求項16〜20のいずれか一項記載の方法によって得られる化合物を投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項３０】
TS 347〜939からなる群より選択されるポリヌクレオチドまたはそれにコードされるポリペプチドの薬学的有効量を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項３１】
TS 1〜346からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子干渉RNAの薬学的有効量を含む、TSを治療または予防するための組成物。
【請求項３２】
低分子干渉RNAが、標的配列として配列番号：85または86のヌクレオチド配列を含む、請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
TS 1〜346からなる群より選択される任意の一つの遺伝子にコードされるタンパク質に結合する抗体またはその断片の薬学的有効量を含む、TSを治療または予防するための組成物。
【請求項３４】
活性成分として請求項16〜20のいずれか一項記載の方法によって選択される化合物の薬学的有効量と、薬学的に許容される担体とを含む、TSを治療または予防するための組成物。
【請求項３５】
センス鎖に配列番号：85または86のヌクレオチド配列を含む、低分子干渉RNA。
【請求項１】
患者由来の生物学的試料においてTS関連遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、被験者におけるTSを診断するか、またはTS発症の素因を診断する方法であって、該遺伝子の正常対照レベルと比較して該レベルが増加または減少すれば、該被験者がTSを有するか、またはTS発症のリスクを有することを示す方法。
【請求項２】
TS関連遺伝子がTS 1〜346からなる群より選択され、正常対照レベルと比較してレベルが増加すれば、被験者がTSを有するか、またはTS発症のリスクを有することを示す、請求項1記載の方法。
【請求項３】
増加が正常対照レベルより少なくとも10％大きい、請求項2記載の方法。
【請求項４】
TS関連遺伝子が、TS 347〜939からなる群より選択され、正常対照レベルと比較してレベルが減少すれば、被験者がTSを有するか、または発症のリスクを有することを示す、請求項1記載の方法。
【請求項５】
減少が正常対照レベルより少なくとも10％低い、請求項4記載の方法。
【請求項６】
複数のTS関連遺伝子の発現レベルを決定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
発現レベルが、以下からなる群より選択される任意の一つの方法によって決定される、請求項1記載の方法：
（a）TS関連遺伝子のmRNAの検出；
（b）TS関連遺伝子にコードされるタンパク質の検出；および
（c）TS関連遺伝子にコードされるタンパク質の生物学的活性の検出。
【請求項８】
患者由来の生物学的試料の遺伝子転写物とTS関連遺伝子プローブとのハイブリダイゼーションを検出することにより発現レベルを決定する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
ハイブリダイゼーション段階がDNAアレイ上で行われる、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
生物学的試料が上皮細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
生物学的試料がTS細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
生物学的試料がTSからの上皮細胞を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
TS 1〜939からなる群より選択される二つまたはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、TS参照発現プロファイル。
【請求項１４】
TS 1〜346からなる群より選択される二つまたはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、TS参照発現プロファイル。
【請求項１５】
TS 347〜939からなる群より選択される二つまたはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、TS参照発現プロファイル。
【請求項１６】
以下の段階を含む、TSを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
a）TS 1〜939によりコードされるポリペプチドに被験化合物を接触させる段階；
b）ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階；および
c）ポリペプチドに結合する化合物を選択する段階。
【請求項１７】
以下の段階を含む、TSを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
a）TS 1〜939からなる群より選択される一つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる段階；および
b）TS 1〜346からなる群より選択される一つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを低下させるか、またはTS 347〜939からなる群より選択される一つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する段階。
【請求項１８】
以下の段階を含む、TSを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
a）TS 1〜939からなる群より選択されるポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドに被験化合物を接触させる段階；
b）段階（a）のポリペプチドの生物学的活性を検出する段階；および
c）被験化合物の非存在下において検出される生物学的活性と比較して、TS 1〜346によりコードされるポリペプチドの生物学的活性を抑制するか、または被験化合物の非存在下において検出される生物学的活性と比較して、TS 347〜939によりコードされるポリペプチドの生物学的活性を増強する化合物を選択する段階。
【請求項１９】
被験細胞が精巣精上皮腫細胞である、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
以下の段階を含む、TSを治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法：
a）TS 1〜939からなる群より選択される一つまたは複数のマーカー遺伝子の転写調節領域と、転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子とを含むベクターが導入されている細胞に候補化合物を接触させる段階；
b）レポーター遺伝子の活性を測定する段階；および
c）対照と比較して、該マーカー遺伝子がTS 1〜346からなる群より選択される上方制御されたマーカー遺伝子である場合には、該レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、または該マーカー遺伝子がTS 347〜939からなる群より選択される下方制御されたマーカー遺伝子である場合には、該レポーター遺伝子の発現レベルを増強する化合物を選択する段階。
【請求項２１】
TS 1〜939からなる群より選択される二つもしくはそれ以上の核酸配列に結合する検出試薬を含むキット。
【請求項２２】
TS 1〜939からなる群より選択される二つまたはそれ以上の核酸配列に結合する核酸を含むアレイ。
【請求項２３】
TS 1〜346からなる群より選択されるコード配列と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス組成物を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項２４】
TS 1〜346からなる群より選択される核酸配列の発現を低下させるsiRNA組成物を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項２５】
siRNAが、標的配列として配列番号：85または86のヌクレオチド配列を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
TS 1〜346からなる群より選択される任意の一つの遺伝子にコードされるタンパク質に結合する抗体またはその断片の薬学的有効量を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項２７】
TS 1〜346からなる群より選択される核酸にコードされるポリペプチドもしくは該ポリペプチドの免疫学的活性断片、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを被験者に投与することを含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項２８】
TS 347〜939の発現または活性を増加させる化合物を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項２９】
請求項16〜20のいずれか一項記載の方法によって得られる化合物を投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項３０】
TS 347〜939からなる群より選択されるポリヌクレオチドまたはそれにコードされるポリペプチドの薬学的有効量を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるTSを治療または予防する方法。
【請求項３１】
TS 1〜346からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子干渉RNAの薬学的有効量を含む、TSを治療または予防するための組成物。
【請求項３２】
低分子干渉RNAが、標的配列として配列番号：85または86のヌクレオチド配列を含む、請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
TS 1〜346からなる群より選択される任意の一つの遺伝子にコードされるタンパク質に結合する抗体またはその断片の薬学的有効量を含む、TSを治療または予防するための組成物。
【請求項３４】
活性成分として請求項16〜20のいずれか一項記載の方法によって選択される化合物の薬学的有効量と、薬学的に許容される担体とを含む、TSを治療または予防するための組成物。
【請求項３５】
センス鎖に配列番号：85または86のヌクレオチド配列を含む、低分子干渉RNA。
【図２】
【図３】
【図４】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５００９４６（Ｐ２００６−５００９４６Ａ）
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４１２２３（Ｐ２００４−５４１２２３）
【出願日】平成１５年９月１２日（２００３．９．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１１７１１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３１４１０
【国際公開日】平成１６年４月１５日（２００４．４．１５）
【出願人】（５０４４４５３５６）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (22)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月１２日（２００３．９．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１１７１１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３１４１０
【国際公開日】平成１６年４月１５日（２００４．４．１５）
【出願人】（５０４４４５３５６）オンコセラピー・サイエンス株式会社 (22)
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【Ｆターム（参考）】
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