腎線維症の治療剤又は予防剤
【課題】腎臓のＶＫＯＲを阻害することで、腎線維症を予防し、かつ、治療することができる、安全性の高い医薬品の提供。
【解決手段】化学式（ＩＩ）
［式中、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、置換アルキル基等を示し、Ｒ２は、水素原子、アルキル基、アシル基、複素環基等を示す］で示されるラクトン誘導体、環拡大した６員環ラクトン誘導体、又はそれらの薬理学的に許容しうる塩を含む腎線維症の治療剤又は予防剤。
【解決手段】化学式（ＩＩ）
［式中、Ｒ１は、水素原子、ハロゲン原子、置換アルキル基等を示し、Ｒ２は、水素原子、アルキル基、アシル基、複素環基等を示す］で示されるラクトン誘導体、環拡大した６員環ラクトン誘導体、又はそれらの薬理学的に許容しうる塩を含む腎線維症の治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎線維症の治療剤又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活を中心とした生活習慣の大きな変化により、高血圧や糖尿病などの生活習慣病罹患率が増加し、それに伴って腎疾患、延いては腎不全のリスクが増大しつつある。
従来の腎疾患の治療は、高血圧や糖尿病を対象とした間接的又は予防的なものが主であったため、直接的な病態の改善又は治癒はほとんど期待できなかった。特に、病態の進行した末期腎不全（ＥＳＲＤ）には有効な治療法がなく、病態の進行に直接作用する新たな腎疾患治療薬が望まれていた。
【０００３】
腎疾患はその症状などにより、糸球体腎炎、慢性又は急性の腎不全、ネフローゼ症候群に大別されるが、全ての腎疾患が腎臓の線維化を伴い、最終的に末期腎不全に至る。特に、慢性的な腎機能の低下は腎臓の線維化の進行と深く関わっているため、線維化の進行阻害は、慢性腎不全の進行抑制につながると考えられている（非特許文献１及び２）。
【０００４】
一般的に、腎線維症は、内皮細胞の障害を起因する炎症反応を伴い、最終的に過剰の細胞外マトリックスが線維化して起こるものである。例えば、糸球体硬化症においては、糸球体内皮細胞の障害が起因となり、サイトカイン（ケモカイン、増殖因子など）が分泌され、単細胞やマクロファージが遊走することで炎症反応が進行する。次いで、メサンギウム細胞の活性化、増殖、形質転換が起こり、メサンギウム細胞から過剰量の細胞外マトリックスが産生され、それらが線維化することで、糸球体硬化症に至る。
【０００５】
最近、ビタミンＫ依存性タンパク質であるＧａｓ６が、上記のメサンギウム細胞の働きに重要な役割を果たしていることが明らかとなった。生体内の酸化型ビタミンＫ（ビタミンＫエポキシド）は、ビタミンＫエポキシド還元酵素（以下、ＶＫＯＲ）により活性化されてビタミンＫとなるが、このＶＫＯＲはＧａｓ６を活性化する。このため、腎臓のＶＫＯＲを阻害すれば、Ｇａｓ６の活性化に基づく腎線維化は抑制され、結果として腎疾患の進展も抑制可能である（非特許文献３）。
【０００６】
実際、ＶＫＯＲ阻害活性を有する医薬品であるワルファリンは、臨床において糸球体腎炎治療薬として使用されている。しかし、ＶＫＯＲは肝臓や腎臓などの主要臓器に広く分布しているため、ワルファリンは腎臓のみならず、血液凝固因子産生の場である肝臓にも作用して肝臓の血液凝固因子産生を阻害する。このため、ワルファリンの使用は出血などを伴うリスクが高く、特に、臨床での使用に際しては投与量の厳密なコントロールが必要である。したがって、腎臓のＶＫＯＲを選択的に阻害し、かつ、安全性の高い、新たな腎線維症の治療剤及び予防剤が求められていた。
【０００７】
【非特許文献１】相川ら、「腎臓疾患の病理と臨床」、１９８０年、南山堂
【非特許文献２】Ｗａｒｄｅｎｅｒ、「腎臓」、１９７０年、医歯薬出版
【非特許文献３】Ｙａｎａｇｉｔａら、「Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ」、２００４年、８巻、ｐ．３０４−３０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、腎臓のＶＫＯＲを阻害することで、腎線維症を予防し、かつ、治療することができる、安全性の高い医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の組織線維化を伴う腎疾患について鋭意研究を重ねた結果、５又は６員環ラクトン誘導体が腎臓のＶＫＯＲ阻害活性を発揮し、腎線維化を治療、予防又は改善する効果を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、一般式（Ｉ）
【化１】
又は、一般式（ＩＩ）
【化２】
［一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、
Ｒ1は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−（ＣＨ2）q−Ｘ、−ＣＨ2−Ｏ−（ＣＨ2）r−Ｙ又は−ＣＨ＝ＣＨ−Ｚ、
Ｒ2は、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜１０のアシル基又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）であり、
Ｘは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基（該アルキル基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフロオロメチル基、メチルチオ基、フェニルチオ基又は炭素数１〜６のアルキルアミノ基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基又は炭素数１〜９のアルキル基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、炭素数２〜６のリン酸エステル基、リン酸基、炭素数１〜７のアルキルスルフォニル基、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ基、メチルスルオキシド基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｙは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基及びシアノ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｚは、それぞれ独立して、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、メチルチオ基及びフェニルチオ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）
ｑは、０〜１０の整数、ｒは、０又は１である。］
で示される、ラクトン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩を含む腎線維症の治療剤又は予防剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、腎臓のＶＫＯＲを選択的に阻害することで、出血などのリスクを伴うことなく、腎臓の線維化を予防、改善又は治療することが可能となる。このため、本発明の新規なラクトン誘導体又はその薬理学的に許容される塩は、より効果的で、かつ安全性の高い腎線維症の治療剤又は予防剤として極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための好ましい実施形態について説明する。
【００１３】
本発明の腎線維症の治療剤又は予防剤は、
一般式（Ｉ）
【化３】
又は、一般式（ＩＩ）
【化４】
［一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、
Ｒ1は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−（ＣＨ2）q−Ｘ、−ＣＨ2−Ｏ−（ＣＨ2）r−Ｙ又は−ＣＨ＝ＣＨ−Ｚ、
Ｒ2は、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜１０のアシル基又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）であり、
Ｘは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基（該アルキル基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフロオロメチル基、メチルチオ基、フェニルチオ基又は炭素数１〜６のアルキルアミノ基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基又は炭素数１〜９のアルキル基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、炭素数２〜６のリン酸エステル基、リン酸基、炭素数１〜７のアルキルスルフォニル基、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ基、メチルスルオキシド基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｙは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基及びシアノ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｚは、それぞれ独立して、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、メチルチオ基及びフェニルチオ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）
ｑは、０〜１０の整数、ｒは、０又は１である。］
で示される、ラクトン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩を含むことを特徴としている。
【００１４】
本明細書で使用する次の用語は、特に断りがない限り、下記の定義の通りである。
【００１５】
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。
【００１６】
「炭素数１〜１２のアルキル基」とは、炭素数１〜１２の直鎖状、分岐状もしくは環状の飽和又は不飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アセチレニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、フェニル基などが挙げられる。
【００１７】
「炭素数１〜９の複素環基」としては、例えば、チエニル基、フラニル基、ピロリル基、テトラヒドロフラニル基、Ｎ−メチルピロリル基、インドイル基、イミダゾイル基、ピロリジニル基、ピリジニル基、ベンゾチオフェニル基、ベンゾフラニル基、キノリニル基、イソキノリニル基、フタルイミド基、フタリド基などが挙げられる。
【００１８】
上記のチオエーテル基としては、例えば、チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオフェニル基、チオブチル基などが挙げられる。
【００１９】
上記のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロピオキシ基、フェノキシ基などが挙げられる。
【００２０】
上記のカルボン酸エステル基としては、例えば、カルボメトキシ基、カルボエトキシ基、カルボプロポキシ基、カルボブトキシ基、カルボフェノキシ基などが挙げられる。
【００２１】
上記の１級アミドとしては、例えば、Ｎ−メチルアミド基、Ｎ−エチルアミド基、Ｎ−プロピルアミド基などが挙げられる。
【００２２】
上記の２級アミドとしては、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミド基、Ｎ、Ｎ−ジエチルアミド基、Ｎ、Ｎ−メチルエチルアミド基、Ｎ、Ｎ−ジプロピルアミド基などが挙げられる。炭素数１〜６のアルコキシ基とは例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロピオキシ基、フェノキシ基などが例示される。
【００２３】
「炭素数６〜１２のアリール基」としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基などが挙げられる。
【００２４】
Ｒ１としては、−（ＣＨ2）q−Ｘ（ｑは０〜１０の整数を表し、Ｘは水素原子、炭素数１〜６のアルキル基）又は炭素数１〜９の複素環基が好ましく、−（ＣＨ2）q−Ｘ（ｑは０〜１０の整数を示し、Ｘは水素原子、炭素数１〜６のアルキル基）がより好ましく、メチル基がさらに好ましい。
【００２５】
Ｒ２としては、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜９の複素環基が好ましく、炭素数１〜６のアルキル基がより好ましく、メチル基がさらに好ましい。
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表されるラクトン誘導体の薬理学的に許容しうる塩としては、例えば、塩酸、硫酸などの無機酸塩や、マレイン酸、フマール酸、酢酸、マロン酸、クエン酸などの有機酸塩などが挙げられる。また、これら塩化体は国際公開第９７／３５５６５号パンフレットに記載された方法により製造することができる。
【００２６】
一般式（Ｉ）で示されるラクトン誘導体の好適な具体例を、以下に示す。
【化５】
【００２７】
腎線維症の治療効果は、血小板、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−ＧＴ、ＡＬＰ、ヒアルロン酸、ヒドロキシプロリン、IV型コラーゲン、グルタミルリジン、尿中タンパク質、クレアチニン、腎臓組織重量などの生理マーカーを用いて確認することができる。
【００２８】
上記の腎線維症の治療剤又は予防剤の投与用法は、患者の年齢、体重、性別、人種、内科的症状、腎疾患の進行度若しくは重症度、又は併用薬の種類若しくは量など、様々な要因に従って選択される。投与経路としては、例えば、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与などが挙げられるが、患者の負担を考慮すると、経口投与が最も好ましい。投与量としては、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲が好ましいが、ワルファリンと同様に、プロトロンビン時間の測定やトロンボテストを用い、出血をコントロールしながら投与量を暫増していくことが好ましい。ワルファリンに対する感受性は個体差が大きく、さらに同一個体でも治療中にその感受性が変化することが知られているため、上記の腎線維症の治療剤又は予防剤においても、投与初期には、プロトロンビン時間測定、トロンボテストなどを頻回行い、治療域を逸脱しないように留意することが好ましい。投与期間は、尿検査（尿蛋白、血尿、クレアチニンなど）、血液検査（クレアチニン、ＢＵＮなど）、組織検査（生検）などの、腎疾患を対象とした様々な検査の結果から設定することができる。
【００２９】
上記の腎線維症の治療剤又は予防剤には、賦形剤が適宜混合されていてもよく、投与形態としては、例えば、錠剤、糖衣錠、丸剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤、液剤、坐剤、注射剤などが挙げられる。
【００３０】
上記の賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、ソルビトール、マンニトール、馬鈴薯でんぷん、アミロペクチン、その他各種でんぷん、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース、ハイドロキシエチルセルロースなど）、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールワックス、アラビアゴム、タルク、二酸化チタン、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油などの植物油、パラフィン油、中性脂肪基剤、エタノール、プロピレングリコール、生理食塩水、滅菌水、グリセリン、着色剤、調味剤、濃厚剤、安定剤、等張剤、緩衝剤などが挙げられる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を挙げて本発明について具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ 肝臓及び腎臓のＶＫＯＲ阻害試験
（１）肝臓及び腎臓のＶＫＯＲ分画の調製
ＴＲＩＺＭＡ ＢＡＳＥ ７．２６ｇ、塩化カリウム３３．５６ｇおよびＳｕｃｒｏｓｅ２５６．８ｇを３Ｌの超純水にて溶解した後、濃塩酸を滴下してｐＨを７．４に調整したものを緩衝液Ａとした。また、塩化ナトリウム２９．２ｇを５００ｍＬの緩衝液Ａで溶解したものを、緩衝液Ｂとした。エーテル麻酔下のラットの門脈へ、ペリスタポンプを用いて緩衝液Ａを灌流し（１０〜２０ｍＬ／分、２〜３分）、灌流後直ちに腹大静脈より放血させ、そのまま屠殺した。
【００３３】
屠殺したラットの肝臓および腎臓を摘出した後、緩衝液Ａで両組織をよく洗浄した。電子天秤を用いて摘出した各組織の湿重量を測定した後、各組織をハサミでよく細断し（数ｍｍ画程度）、湿重量の３倍容の緩衝液Ａを加えて、氷冷下でポッター型ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。低速遠心機にて、４℃、７００×ｇ、１０分間遠心分離後、上清を採取した。超遠心機にて、４℃、９，０００×ｇ、２０分間遠心分離後、上清を採取した。超遠心機にて、４℃、１０５，０００×ｇ、６０分間遠心分離後、上清を除去し、沈殿を採取した。
【００３４】
採取した沈殿を緩衝液Ａに再懸濁し、超遠心機にて、４℃、１０５，０００×ｇ、６０分間遠心分離後、上清を除去し、沈殿を採取した。採取した沈殿を緩衝液Ｂに再懸濁し、超遠心機にて、４℃、１０５，０００×ｇ、６０分間遠心分離後、上清を除去し、ＶＫＯＲ分画として得た。各組織のＶＫＯＲ分画のタンパク質濃度を測定し（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＰＩＥＲＣＥ）、タンパク質濃度が約１５ｍｇ／ｍＬになるように緩衝液Ｂを加えた後、再懸濁した。調製したミクロソーム分画懸濁液は使用時まで約−８０℃で保存した。
【００３５】
（２）試験手順および試験結果の解析方法
ＰＰ製９６ウェルチューブプレート（ＴＰ−９６Ｖ、ビーエム機器）の全てのウェルに、０．２μｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの各化合物溶液を５μＬ、肝臓又は腎臓のＶＫＯＲ分画懸濁液を１０μＬ、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を７４．５μＬ、１０００μｍｏｌ／ＬのビタミンＫエポキシド溶液を０．５μＬ入れ、３７℃で５分間プレインキュベートした。Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ用ウェル（反応時間０分）を除く全てのウェルに０．０２ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ溶液を１０μＬ添加した後、直ちに、ダイレクトミキサーで２〜３秒撹拌し、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００３６】
３０分後、各ウェルに氷冷した２−プロパノールを３００μＬ加え、反応停止した。Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ用ウェルに０．０２ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ溶液１０μＬを添加した後、ダイレクトミキサーで約１分撹拌した。反応停止後のプレートを４℃で３０分間冷却した後、反応液をガラスフィルタープレート（７７００−３３１０、Ｗｈａｔｍａｎ）を用い遠心濾過した（４℃、６８０×ｇ、１０分間）。ろ液を分析用試料とした。分析にはＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム（日本ウォーターズ）を用い、ビタミンＫエポキシドの還元により生成されるビタミンＫのピーク面積を測定した。分析条件は以下の通りである。
【００３７】
・カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ−Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ（日本ウォーターズ）
・カラム温度：４０℃
・移動相Ａ：アセトニトリル／２−プロパノール／ＤＷ＝１００／８／１００
・移動相Ｂ：アセトニトリル／２−プロパノール／ＤＷ＝１００／８／２
・流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、グラジエントタイムプログラム（Ｂ％）：１（初期）→1（１ｍｉｎ）→９９（１．５ｍｉｎ）→９９（３ｍｉｎ）→１（３．０１ｍｉｎ）→１（３．５ｍｉｎ）
・検出：ＵＶ（２５０ｎｍ）
・注入量：３５μＬ
【００３８】
阻害活性については、ＩＣ５０（５０％阻害活性を示す化合物濃度）を指標にした。ＩＣ５０の算出にはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００３を用いた。各化合物について、化合物を含まない場合の生成したビタミンＫのピーク面積を１００％として、各化合物濃度におけるビタミンＫ生成量を百分率で表示した。化合物濃度の対数をＸ軸、ビタミンＫ生成量の百分率をＹ軸として、化合物ごと、散布図を作成した。ビタミンＫ生成量５０％を挟む直近の２濃度を結ぶ直線式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ）から、ＩＣ５０を算出した。
（３）結果
結果を表１〜４に示した。腎臓のＶＫＯＲに対する阻害活性が最も高かった化合物はＤ３８１であり、その阻害活性はワルファリン以上であることから、D３８１を含む腎線維症の治療剤又は予防剤が腎線維症に対して顕著な効果を示すことは明らかである。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】
（実施例２）ラットＴｈｙ１腎炎モデルを用いた腎炎治療効果の確認
（１）Ｔｈｙ１腎炎ラットの作製
Ｙａｎａｇｉｔａらの方法に従って作製した（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｔｈｏｌ．，１５８（４）、１４２３−１４３２、２００１）。Ａｎｔｉ−ｒａｔ Ｔｈｙ１．１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｓｃｔｉｔｅｓ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．）の凍結乾燥品をリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で溶解し、濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるよう調製した。６週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット［Ｃｒｊ：Ｗｉｓｔａｒ］に０．１ｍｇ／ｍＬのＡｎｔｉ−ｒａｔ Ｔｈｙ１．１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｓｃｔｉｔｅｓ溶液を、化合物初回投与日を１日目として６日目に１回、１ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇの用量で単回静脈内投与した。
【００４４】
（２）試験手順および試験結果の解析方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 腎ＶＫＯＲ阻害試験で活性の確認されたＡＭＴについて、ラットＴｈｙ１腎炎モデルにおける効果を検証した。Ｔｈｙ１腎炎ラットに、ＡＭＴを３０ｍｇ／５ｍＬ／ｋｇの用量で１２日間反復静脈内投与した（１回／日）。コントロール群は生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）を５ｍＬ／ｋｇの用量で同様に１２日間反復静脈内投与した（１回／日）。ＡＭＴの初回投与日を１日目として、１２日目の投与後に動物を代謝ケージに収容し、約１７時間採尿した。
【００４５】
メスシリンダーを用いて尿量測定を行った後、４℃、１，５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し上清尿を得た。上清尿は測定まで−８０℃で冷凍保存した。これを用いて７０７０型自動分析装置にて総タンパク、電解質（Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ）およびクレアチニンを、ＥＬＩＳＡ法によりアルブミンを測定した。総タンパク、電解質（Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ）、クレアチニンおよびアルブミンについては、測定値に尿量を乗じ、１日排泄量を算出した。
【００４６】
（３）結果
結果を図１に示す。生理食塩水を投与したコントロール群に比べ、ＡＭＴ３０ｍｇ／ｋｇ投与群において有意な尿中アルブミンの低下が確認された。また、両投与群において、血液凝固反応を含めた出血傾向に差は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
以上の結果より、本発明の化合物は腎臓のＶＫＯＲ阻害活性を有し、腎線維症を治療、予防又は改善することから、腎線維症治療薬として、医薬分野で好ましく用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】Ｔｈｙ１腎炎ラットにＡＭＴを１２日間反復静脈内投与時の尿中アルブミン／クレアチニン比を表した図である。図中、＊はＰ＜０．０５（ｔ検定）を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎線維症の治療剤又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活を中心とした生活習慣の大きな変化により、高血圧や糖尿病などの生活習慣病罹患率が増加し、それに伴って腎疾患、延いては腎不全のリスクが増大しつつある。
従来の腎疾患の治療は、高血圧や糖尿病を対象とした間接的又は予防的なものが主であったため、直接的な病態の改善又は治癒はほとんど期待できなかった。特に、病態の進行した末期腎不全（ＥＳＲＤ）には有効な治療法がなく、病態の進行に直接作用する新たな腎疾患治療薬が望まれていた。
【０００３】
腎疾患はその症状などにより、糸球体腎炎、慢性又は急性の腎不全、ネフローゼ症候群に大別されるが、全ての腎疾患が腎臓の線維化を伴い、最終的に末期腎不全に至る。特に、慢性的な腎機能の低下は腎臓の線維化の進行と深く関わっているため、線維化の進行阻害は、慢性腎不全の進行抑制につながると考えられている（非特許文献１及び２）。
【０００４】
一般的に、腎線維症は、内皮細胞の障害を起因する炎症反応を伴い、最終的に過剰の細胞外マトリックスが線維化して起こるものである。例えば、糸球体硬化症においては、糸球体内皮細胞の障害が起因となり、サイトカイン（ケモカイン、増殖因子など）が分泌され、単細胞やマクロファージが遊走することで炎症反応が進行する。次いで、メサンギウム細胞の活性化、増殖、形質転換が起こり、メサンギウム細胞から過剰量の細胞外マトリックスが産生され、それらが線維化することで、糸球体硬化症に至る。
【０００５】
最近、ビタミンＫ依存性タンパク質であるＧａｓ６が、上記のメサンギウム細胞の働きに重要な役割を果たしていることが明らかとなった。生体内の酸化型ビタミンＫ（ビタミンＫエポキシド）は、ビタミンＫエポキシド還元酵素（以下、ＶＫＯＲ）により活性化されてビタミンＫとなるが、このＶＫＯＲはＧａｓ６を活性化する。このため、腎臓のＶＫＯＲを阻害すれば、Ｇａｓ６の活性化に基づく腎線維化は抑制され、結果として腎疾患の進展も抑制可能である（非特許文献３）。
【０００６】
実際、ＶＫＯＲ阻害活性を有する医薬品であるワルファリンは、臨床において糸球体腎炎治療薬として使用されている。しかし、ＶＫＯＲは肝臓や腎臓などの主要臓器に広く分布しているため、ワルファリンは腎臓のみならず、血液凝固因子産生の場である肝臓にも作用して肝臓の血液凝固因子産生を阻害する。このため、ワルファリンの使用は出血などを伴うリスクが高く、特に、臨床での使用に際しては投与量の厳密なコントロールが必要である。したがって、腎臓のＶＫＯＲを選択的に阻害し、かつ、安全性の高い、新たな腎線維症の治療剤及び予防剤が求められていた。
【０００７】
【非特許文献１】相川ら、「腎臓疾患の病理と臨床」、１９８０年、南山堂
【非特許文献２】Ｗａｒｄｅｎｅｒ、「腎臓」、１９７０年、医歯薬出版
【非特許文献３】Ｙａｎａｇｉｔａら、「Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ」、２００４年、８巻、ｐ．３０４−３０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、腎臓のＶＫＯＲを阻害することで、腎線維症を予防し、かつ、治療することができる、安全性の高い医薬品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記の組織線維化を伴う腎疾患について鋭意研究を重ねた結果、５又は６員環ラクトン誘導体が腎臓のＶＫＯＲ阻害活性を発揮し、腎線維化を治療、予防又は改善する効果を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、一般式（Ｉ）
【化１】
又は、一般式（ＩＩ）
【化２】
［一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、
Ｒ1は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−（ＣＨ2）q−Ｘ、−ＣＨ2−Ｏ−（ＣＨ2）r−Ｙ又は−ＣＨ＝ＣＨ−Ｚ、
Ｒ2は、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜１０のアシル基又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）であり、
Ｘは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基（該アルキル基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフロオロメチル基、メチルチオ基、フェニルチオ基又は炭素数１〜６のアルキルアミノ基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基又は炭素数１〜９のアルキル基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、炭素数２〜６のリン酸エステル基、リン酸基、炭素数１〜７のアルキルスルフォニル基、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ基、メチルスルオキシド基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｙは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基及びシアノ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｚは、それぞれ独立して、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、メチルチオ基及びフェニルチオ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）
ｑは、０〜１０の整数、ｒは、０又は１である。］
で示される、ラクトン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩を含む腎線維症の治療剤又は予防剤を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、腎臓のＶＫＯＲを選択的に阻害することで、出血などのリスクを伴うことなく、腎臓の線維化を予防、改善又は治療することが可能となる。このため、本発明の新規なラクトン誘導体又はその薬理学的に許容される塩は、より効果的で、かつ安全性の高い腎線維症の治療剤又は予防剤として極めて有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための好ましい実施形態について説明する。
【００１３】
本発明の腎線維症の治療剤又は予防剤は、
一般式（Ｉ）
【化３】
又は、一般式（ＩＩ）
【化４】
［一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、
Ｒ1は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−（ＣＨ2）q−Ｘ、−ＣＨ2−Ｏ−（ＣＨ2）r−Ｙ又は−ＣＨ＝ＣＨ−Ｚ、
Ｒ2は、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜１０のアシル基又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）であり、
Ｘは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基（該アルキル基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフロオロメチル基、メチルチオ基、フェニルチオ基又は炭素数１〜６のアルキルアミノ基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基又は炭素数１〜９のアルキル基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、炭素数２〜６のリン酸エステル基、リン酸基、炭素数１〜７のアルキルスルフォニル基、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ基、メチルスルオキシド基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｙは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基及びシアノ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｚは、それぞれ独立して、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、メチルチオ基及びフェニルチオ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）
ｑは、０〜１０の整数、ｒは、０又は１である。］
で示される、ラクトン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩を含むことを特徴としている。
【００１４】
本明細書で使用する次の用語は、特に断りがない限り、下記の定義の通りである。
【００１５】
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味する。
【００１６】
「炭素数１〜１２のアルキル基」とは、炭素数１〜１２の直鎖状、分岐状もしくは環状の飽和又は不飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、アセチレニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、フェニル基などが挙げられる。
【００１７】
「炭素数１〜９の複素環基」としては、例えば、チエニル基、フラニル基、ピロリル基、テトラヒドロフラニル基、Ｎ−メチルピロリル基、インドイル基、イミダゾイル基、ピロリジニル基、ピリジニル基、ベンゾチオフェニル基、ベンゾフラニル基、キノリニル基、イソキノリニル基、フタルイミド基、フタリド基などが挙げられる。
【００１８】
上記のチオエーテル基としては、例えば、チオメチル基、チオエチル基、チオプロピル基、チオフェニル基、チオブチル基などが挙げられる。
【００１９】
上記のアルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロピオキシ基、フェノキシ基などが挙げられる。
【００２０】
上記のカルボン酸エステル基としては、例えば、カルボメトキシ基、カルボエトキシ基、カルボプロポキシ基、カルボブトキシ基、カルボフェノキシ基などが挙げられる。
【００２１】
上記の１級アミドとしては、例えば、Ｎ−メチルアミド基、Ｎ−エチルアミド基、Ｎ−プロピルアミド基などが挙げられる。
【００２２】
上記の２級アミドとしては、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミド基、Ｎ、Ｎ−ジエチルアミド基、Ｎ、Ｎ−メチルエチルアミド基、Ｎ、Ｎ−ジプロピルアミド基などが挙げられる。炭素数１〜６のアルコキシ基とは例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロピオキシ基、フェノキシ基などが例示される。
【００２３】
「炭素数６〜１２のアリール基」としては、例えば、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基などが挙げられる。
【００２４】
Ｒ１としては、−（ＣＨ2）q−Ｘ（ｑは０〜１０の整数を表し、Ｘは水素原子、炭素数１〜６のアルキル基）又は炭素数１〜９の複素環基が好ましく、−（ＣＨ2）q−Ｘ（ｑは０〜１０の整数を示し、Ｘは水素原子、炭素数１〜６のアルキル基）がより好ましく、メチル基がさらに好ましい。
【００２５】
Ｒ２としては、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜９の複素環基が好ましく、炭素数１〜６のアルキル基がより好ましく、メチル基がさらに好ましい。
一般式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表されるラクトン誘導体の薬理学的に許容しうる塩としては、例えば、塩酸、硫酸などの無機酸塩や、マレイン酸、フマール酸、酢酸、マロン酸、クエン酸などの有機酸塩などが挙げられる。また、これら塩化体は国際公開第９７／３５５６５号パンフレットに記載された方法により製造することができる。
【００２６】
一般式（Ｉ）で示されるラクトン誘導体の好適な具体例を、以下に示す。
【化５】
【００２７】
腎線維症の治療効果は、血小板、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−ＧＴ、ＡＬＰ、ヒアルロン酸、ヒドロキシプロリン、IV型コラーゲン、グルタミルリジン、尿中タンパク質、クレアチニン、腎臓組織重量などの生理マーカーを用いて確認することができる。
【００２８】
上記の腎線維症の治療剤又は予防剤の投与用法は、患者の年齢、体重、性別、人種、内科的症状、腎疾患の進行度若しくは重症度、又は併用薬の種類若しくは量など、様々な要因に従って選択される。投与経路としては、例えば、経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与などが挙げられるが、患者の負担を考慮すると、経口投与が最も好ましい。投与量としては、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲が好ましいが、ワルファリンと同様に、プロトロンビン時間の測定やトロンボテストを用い、出血をコントロールしながら投与量を暫増していくことが好ましい。ワルファリンに対する感受性は個体差が大きく、さらに同一個体でも治療中にその感受性が変化することが知られているため、上記の腎線維症の治療剤又は予防剤においても、投与初期には、プロトロンビン時間測定、トロンボテストなどを頻回行い、治療域を逸脱しないように留意することが好ましい。投与期間は、尿検査（尿蛋白、血尿、クレアチニンなど）、血液検査（クレアチニン、ＢＵＮなど）、組織検査（生検）などの、腎疾患を対象とした様々な検査の結果から設定することができる。
【００２９】
上記の腎線維症の治療剤又は予防剤には、賦形剤が適宜混合されていてもよく、投与形態としては、例えば、錠剤、糖衣錠、丸剤、カプセル剤、散剤、トローチ剤、液剤、坐剤、注射剤などが挙げられる。
【００３０】
上記の賦形剤としては、例えば、乳糖、ショ糖、ブドウ糖、ソルビトール、マンニトール、馬鈴薯でんぷん、アミロペクチン、その他各種でんぷん、セルロース誘導体（カルボキシメチルセルロース、ハイドロキシエチルセルロースなど）、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールワックス、アラビアゴム、タルク、二酸化チタン、オリーブ油、ピーナッツ油、ゴマ油などの植物油、パラフィン油、中性脂肪基剤、エタノール、プロピレングリコール、生理食塩水、滅菌水、グリセリン、着色剤、調味剤、濃厚剤、安定剤、等張剤、緩衝剤などが挙げられる。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を挙げて本発明について具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ 肝臓及び腎臓のＶＫＯＲ阻害試験
（１）肝臓及び腎臓のＶＫＯＲ分画の調製
ＴＲＩＺＭＡ ＢＡＳＥ ７．２６ｇ、塩化カリウム３３．５６ｇおよびＳｕｃｒｏｓｅ２５６．８ｇを３Ｌの超純水にて溶解した後、濃塩酸を滴下してｐＨを７．４に調整したものを緩衝液Ａとした。また、塩化ナトリウム２９．２ｇを５００ｍＬの緩衝液Ａで溶解したものを、緩衝液Ｂとした。エーテル麻酔下のラットの門脈へ、ペリスタポンプを用いて緩衝液Ａを灌流し（１０〜２０ｍＬ／分、２〜３分）、灌流後直ちに腹大静脈より放血させ、そのまま屠殺した。
【００３３】
屠殺したラットの肝臓および腎臓を摘出した後、緩衝液Ａで両組織をよく洗浄した。電子天秤を用いて摘出した各組織の湿重量を測定した後、各組織をハサミでよく細断し（数ｍｍ画程度）、湿重量の３倍容の緩衝液Ａを加えて、氷冷下でポッター型ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。低速遠心機にて、４℃、７００×ｇ、１０分間遠心分離後、上清を採取した。超遠心機にて、４℃、９，０００×ｇ、２０分間遠心分離後、上清を採取した。超遠心機にて、４℃、１０５，０００×ｇ、６０分間遠心分離後、上清を除去し、沈殿を採取した。
【００３４】
採取した沈殿を緩衝液Ａに再懸濁し、超遠心機にて、４℃、１０５，０００×ｇ、６０分間遠心分離後、上清を除去し、沈殿を採取した。採取した沈殿を緩衝液Ｂに再懸濁し、超遠心機にて、４℃、１０５，０００×ｇ、６０分間遠心分離後、上清を除去し、ＶＫＯＲ分画として得た。各組織のＶＫＯＲ分画のタンパク質濃度を測定し（ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＰＩＥＲＣＥ）、タンパク質濃度が約１５ｍｇ／ｍＬになるように緩衝液Ｂを加えた後、再懸濁した。調製したミクロソーム分画懸濁液は使用時まで約−８０℃で保存した。
【００３５】
（２）試験手順および試験結果の解析方法
ＰＰ製９６ウェルチューブプレート（ＴＰ−９６Ｖ、ビーエム機器）の全てのウェルに、０．２μｍｏｌ／Ｌ〜２００ｍｍｏｌ／Ｌの各化合物溶液を５μＬ、肝臓又は腎臓のＶＫＯＲ分画懸濁液を１０μＬ、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）を７４．５μＬ、１０００μｍｏｌ／ＬのビタミンＫエポキシド溶液を０．５μＬ入れ、３７℃で５分間プレインキュベートした。Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ用ウェル（反応時間０分）を除く全てのウェルに０．０２ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ溶液を１０μＬ添加した後、直ちに、ダイレクトミキサーで２〜３秒撹拌し、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００３６】
３０分後、各ウェルに氷冷した２−プロパノールを３００μＬ加え、反応停止した。Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ用ウェルに０．０２ｍｍｏｌ／ＬのＤＴＴ溶液１０μＬを添加した後、ダイレクトミキサーで約１分撹拌した。反応停止後のプレートを４℃で３０分間冷却した後、反応液をガラスフィルタープレート（７７００−３３１０、Ｗｈａｔｍａｎ）を用い遠心濾過した（４℃、６８０×ｇ、１０分間）。ろ液を分析用試料とした。分析にはＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム（日本ウォーターズ）を用い、ビタミンＫエポキシドの還元により生成されるビタミンＫのピーク面積を測定した。分析条件は以下の通りである。
【００３７】
・カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ−Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ（日本ウォーターズ）
・カラム温度：４０℃
・移動相Ａ：アセトニトリル／２−プロパノール／ＤＷ＝１００／８／１００
・移動相Ｂ：アセトニトリル／２−プロパノール／ＤＷ＝１００／８／２
・流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、グラジエントタイムプログラム（Ｂ％）：１（初期）→1（１ｍｉｎ）→９９（１．５ｍｉｎ）→９９（３ｍｉｎ）→１（３．０１ｍｉｎ）→１（３．５ｍｉｎ）
・検出：ＵＶ（２５０ｎｍ）
・注入量：３５μＬ
【００３８】
阻害活性については、ＩＣ５０（５０％阻害活性を示す化合物濃度）を指標にした。ＩＣ５０の算出にはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２００３を用いた。各化合物について、化合物を含まない場合の生成したビタミンＫのピーク面積を１００％として、各化合物濃度におけるビタミンＫ生成量を百分率で表示した。化合物濃度の対数をＸ軸、ビタミンＫ生成量の百分率をＹ軸として、化合物ごと、散布図を作成した。ビタミンＫ生成量５０％を挟む直近の２濃度を結ぶ直線式（Ｙ＝ａＸ＋ｂ）から、ＩＣ５０を算出した。
（３）結果
結果を表１〜４に示した。腎臓のＶＫＯＲに対する阻害活性が最も高かった化合物はＤ３８１であり、その阻害活性はワルファリン以上であることから、D３８１を含む腎線維症の治療剤又は予防剤が腎線維症に対して顕著な効果を示すことは明らかである。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】
（実施例２）ラットＴｈｙ１腎炎モデルを用いた腎炎治療効果の確認
（１）Ｔｈｙ１腎炎ラットの作製
Ｙａｎａｇｉｔａらの方法に従って作製した（Ａｍ．Ｊ．Ｐｈａｔｈｏｌ．，１５８（４）、１４２３−１４３２、２００１）。Ａｎｔｉ−ｒａｔ Ｔｈｙ１．１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｓｃｔｉｔｅｓ（ＣＥＤＡＲＬＡＮＥ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．）の凍結乾燥品をリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））で溶解し、濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるよう調製した。６週齢Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット［Ｃｒｊ：Ｗｉｓｔａｒ］に０．１ｍｇ／ｍＬのＡｎｔｉ−ｒａｔ Ｔｈｙ１．１ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｓｃｔｉｔｅｓ溶液を、化合物初回投与日を１日目として６日目に１回、１ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇの用量で単回静脈内投与した。
【００４４】
（２）試験手順および試験結果の解析方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 腎ＶＫＯＲ阻害試験で活性の確認されたＡＭＴについて、ラットＴｈｙ１腎炎モデルにおける効果を検証した。Ｔｈｙ１腎炎ラットに、ＡＭＴを３０ｍｇ／５ｍＬ／ｋｇの用量で１２日間反復静脈内投与した（１回／日）。コントロール群は生理食塩水（株式会社大塚製薬工場）を５ｍＬ／ｋｇの用量で同様に１２日間反復静脈内投与した（１回／日）。ＡＭＴの初回投与日を１日目として、１２日目の投与後に動物を代謝ケージに収容し、約１７時間採尿した。
【００４５】
メスシリンダーを用いて尿量測定を行った後、４℃、１，５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し上清尿を得た。上清尿は測定まで−８０℃で冷凍保存した。これを用いて７０７０型自動分析装置にて総タンパク、電解質（Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ）およびクレアチニンを、ＥＬＩＳＡ法によりアルブミンを測定した。総タンパク、電解質（Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ）、クレアチニンおよびアルブミンについては、測定値に尿量を乗じ、１日排泄量を算出した。
【００４６】
（３）結果
結果を図１に示す。生理食塩水を投与したコントロール群に比べ、ＡＭＴ３０ｍｇ／ｋｇ投与群において有意な尿中アルブミンの低下が確認された。また、両投与群において、血液凝固反応を含めた出血傾向に差は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
以上の結果より、本発明の化合物は腎臓のＶＫＯＲ阻害活性を有し、腎線維症を治療、予防又は改善することから、腎線維症治療薬として、医薬分野で好ましく用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】Ｔｈｙ１腎炎ラットにＡＭＴを１２日間反復静脈内投与時の尿中アルブミン／クレアチニン比を表した図である。図中、＊はＰ＜０．０５（ｔ検定）を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
又は、一般式（ＩＩ）
【化２】
［一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、
Ｒ1は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−（ＣＨ2）q−Ｘ、−ＣＨ2−Ｏ−（ＣＨ2）r−Ｙ又は−ＣＨ＝ＣＨ−Ｚ、
Ｒ2は、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜１０のアシル基又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）であり、
Ｘは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基（該アルキル基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフロオロメチル基、メチルチオ基、フェニルチオ基又は炭素数１〜６のアルキルアミノ基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基又は炭素数１〜９のアルキル基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、炭素数２〜６のリン酸エステル基、リン酸基、炭素数１〜７のアルキルスルフォニル基、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ基、メチルスルオキシド基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｙは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基及びシアノ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｚは、それぞれ独立して、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、メチルチオ基及びフェニルチオ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）
ｑは、０〜１０の整数、ｒは、０又は１である。］
で示される、ラクトン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩を含む腎線維症の治療剤又は予防剤。
【請求項２】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、
Ｒ1は、それぞれ独立して、メチル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基、デカニル基、フェニル基、フラン−２−イル基、フラン−３−イル基、チオフェン−２−イル基、チオフェン−３−イル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシ−２−エニル基、シクロヘキシ−３−エニル基、ベンジル基、シクロヘキシルメチル基、シクロペンチルメチル基、フラン−２−イルメチル基、フラン−３−イルメチル基、チオフェン−２−イルメチル基、チオフェン−３−イルメチル基、フェノキシメチル基、４−メチルベンジル基、４−フルオロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−メチルチオベンジル基、４−（トリフルオロメチル）ベンジル基、４−（ジメチルアミノ）ベンジル基、（フェニルアミノ）メチル基、フェニルチオメチル基、１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イル基、４−イソプロピルフェネチル基、３−（チオフェン−２イル）プロピル基、トシルメチル基、ベンゾフェン−２−イルメチル基、（５−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）メチル基、（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル基、２−オキソ−（チオフェン）メチル基、（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）メチル基、（３−オキソ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−イル）メチル基、（３−メチルベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）メチル基又はベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルメチル基、
Ｒ2は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、フラン−２−イル基、フラン−３−イル基、チオフェン−２−イル基、チオフェン−３−イル基、フェニル基又はシクロペンタ−１,３−ジエニル基である、請求項１記載の治療剤又は予防剤。
【請求項３】
腎臓のビタミンＫエポキシド還元酵素を阻害又は抑制する、請求項１又は２記載の腎線維症の治療剤又は予防剤。
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
又は、一般式（ＩＩ）
【化２】
［一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、
Ｒ1は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、−（ＣＨ2）q−Ｘ、−ＣＨ2−Ｏ−（ＣＨ2）r−Ｙ又は−ＣＨ＝ＣＨ−Ｚ、
Ｒ2は、それぞれ独立して、水素、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜１０のアシル基又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）であり、
Ｘは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基（該アルキル基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフロオロメチル基、メチルチオ基、フェニルチオ基又は炭素数１〜６のアルキルアミノ基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基又は炭素数１〜９のアルキル基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、炭素数２〜６のリン酸エステル基、リン酸基、炭素数１〜７のアルキルスルフォニル基、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ基、メチルスルオキシド基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｙは、それぞれ独立して、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基及びシアノ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）、炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）、ヒドロキシ基、チオール基、炭素数１〜６のチオエーテル基、炭素数１〜６のアルコキシ基、アセチル基、アミノ基、アセトアミド基、シアノ基、炭素数１〜７のカルボン酸エステル基、カルボキシル基、１級アミド基又は２級アミド基、
Ｚは、それぞれ独立して、炭素数６〜１２のアリール基（該アリール基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基、エトキシ基、カルボキシル基、カルボエトキシ基、カルボメトキシ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、メチルチオ基及びフェニルチオ基なる群から選ばれる１以上の置換基で置換されていてもよい。）又は炭素数１〜９の複素環基（該複素環基は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ニトロ基、メトキシ基又はエトキシ基で置換されていてもよい。）
ｑは、０〜１０の整数、ｒは、０又は１である。］
で示される、ラクトン誘導体又はその薬理学的に許容しうる塩を含む腎線維症の治療剤又は予防剤。
【請求項２】
一般式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、
Ｒ1は、それぞれ独立して、メチル基、ブチル基、ヘキシル基、オクチル基、デカニル基、フェニル基、フラン−２−イル基、フラン−３−イル基、チオフェン−２−イル基、チオフェン−３−イル基、シクロヘキシル基、シクロヘキシ−２−エニル基、シクロヘキシ−３−エニル基、ベンジル基、シクロヘキシルメチル基、シクロペンチルメチル基、フラン−２−イルメチル基、フラン−３−イルメチル基、チオフェン−２−イルメチル基、チオフェン−３−イルメチル基、フェノキシメチル基、４−メチルベンジル基、４−フルオロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−メチルチオベンジル基、４−（トリフルオロメチル）ベンジル基、４−（ジメチルアミノ）ベンジル基、（フェニルアミノ）メチル基、フェニルチオメチル基、１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イル基、４−イソプロピルフェネチル基、３−（チオフェン−２イル）プロピル基、トシルメチル基、ベンゾフェン−２−イルメチル基、（５−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）メチル基、（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル基、２−オキソ−（チオフェン）メチル基、（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）メチル基、（３−オキソ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−１−イル）メチル基、（３−メチルベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イル）メチル基又はベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルメチル基、
Ｒ2は、それぞれ独立して、メチル基、エチル基、フラン−２−イル基、フラン−３−イル基、チオフェン−２−イル基、チオフェン−３−イル基、フェニル基又はシクロペンタ−１,３−ジエニル基である、請求項１記載の治療剤又は予防剤。
【請求項３】
腎臓のビタミンＫエポキシド還元酵素を阻害又は抑制する、請求項１又は２記載の腎線維症の治療剤又は予防剤。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−７７１０１（Ｐ２０１０−７７１０１Ａ）
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２５０７０９（Ｐ２００８−２５０７０９）
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]