【課題】哺乳類の自己免疫疾患を治療する方法、および移植レシピエントの移植拒絶を予防または治療する方法を提供する。
【解決手段】特定のメチマゾール誘導体および互変異性環状チオン化合物並びにこれらの化合物を含有する医薬組成物を利用する。これらの化合物および組成物は、医薬活性に関してはメチマゾールと少なくとも同じように有効であるが、一方、甲状腺機能に対する副作用が少ない。それらはまた通常の医薬賦形剤における溶解性がメチマゾールよりも高い。自己免疫疾患に対して有用な化合物の活性（ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子の発現を抑制する能力）をスクリーニングするアッセイもまた教示される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類の自己免疫疾患および移植拒絶に関する。より具体的には、本発明は、本発明に記述された目的のための、綿密に規定した１群のメチマゾール誘導体および互変異性環状チオンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
哺乳類における免疫反応の主要な機能は、非自己抗原から自己を識別し、さらに非自己抗原を排除することである。免疫反応は細胞対細胞の複雑な相互作用を含み、主として３つの主要な免疫細胞タイプに依存する。これらは、胸腺由来（Ｔ）リンパ球、骨髄由来（Ｂ）リンパ球、およびマクロファージである。免疫反応は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によってコードされる分子によって仲介される。ＭＨＣ分子の２つの主要な型（クラスＩおよびクラスＩＩ）は、各々一組の細胞表面糖タンパク質を含む（以下を参照されたい：．D.P. Stites & A.I. Terr, eds., “Basic and Clinical Immunology”, Appelton & Lange, Norwalk, Connecticut/San Mateo, California, 1991）。ＭＨＣクラスＩ分子は実質的に全てのタイプの体細胞で見出されるが、ただしそのレベルはそれぞれの細胞タイプで異なる。対照的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子は、通常はいくつかの細胞タイプ（例えばリンパ球、マクロファージおよび樹状細胞）でのみ発現される。
【０００３】
抗原は、クラスＩまたはクラスＩＩ細胞表面分子を有する抗原提示細胞によって免疫系に提示される。例えば、ＣＤ４⁺ヘルパーＴリンパ球はＭＨＣクラスＩＩ分子に会合した抗原を認識し、ＣＤ８＋細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）はクラスＩ遺伝子生成物に会合した抗原を認識する。現在のところ、ＭＨＣクラスＩ分子は主として細胞性免疫反応の標的として機能し、一方、クラスＩＩ分子は液性および細胞性免疫反応の両方を調節すると考えられている（J. Klein & E. Gutze, “Major Histocompatibility Complex”, Springer Verlag, New York, 1977; E.R. Unanue, Ann. Rev. Immunology, 2:295-428(1984)）。クラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子は、免疫反応の仲介物質または開始物質としてのその役割のゆえに自己免疫疾患の研究においてこれまで多くの実験で関心を集めてきた。ＭＨＣクラスＩＩ抗原は自己免疫疾患の病因についての研究の主要な対象であったが、一方、ＭＨＣクラスＩ抗原は移植拒絶の研究で関心を集めた。
【０００４】
ヒトの疾患についての多くの実験動物モデルは、クラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ抗原の異常な(aberrant)発現および／または機能が、自己免疫疾患の進行、例えばインスリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）（Trisch & McDevitt, Cell 85:291-297(1996)）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）（Kotzin, Cell 85:303-306(1996)）およびブドウ膜網膜炎（Prendergast et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 39:754-762(1998)）と連携することを示した。
【０００５】
ＭＨＣクラスＩおよび／またはＩＩの発現と疾患との間の病理学的連関は、これまで多くのこのようなモデル系で生化学的および遺伝学的アプローチを用いて調べられてきた。しかしながら、異常なＭＨＣ機能が自己免疫を仲介することに関するもっとも確かな証拠は、ＭＨＣ遺伝子が不活化されている遺伝子導入動物モデルから得られた。ＭＨＣクラスＩ欠損動物を用いて、自己免疫疾患の進行に対する抵抗性、したがってＭＨＣ遺伝子発現に対する自己免疫の依存性が、ＩＤＤＭ（Serreze et al., Diabetes 43:505-509(1994)）およびＳＬＥ（Mozes et al., Science 261:91-93(1993)）の動物モデルで直接的に示された。
【０００６】
さらにまた、ＴＧＦ−ベータル欠損遺伝子導入マウス（Shull et al., Nature 359:693-699(1992); Kulkarini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:770-774(1993); Boivin et al., Am. J. Pathol. 146:276-288(1995)）で明瞭な進行性多病巣炎症性自己免疫疾患表現型のＭＨＣクラスＩＩ発現に対する依存性は、ＭＨＣクラスＩＩ欠損動物を用いて最近明らかにされた。特に、ＭＨＣクラスＩＩ発現を欠くＴＧＦ−ベータル欠損動物では炎症性浸潤物、循環性抗体または糸球体を侵す免疫複合体の沈積は明らかではない（Letterio et al., J. Clin. Invest. 98:2109-2119(1996)）。
ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが動物モデルの場合自己免疫疾患の発生の要件であることを支持する知見の他に、自己免疫疾患の進行とＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原のヒトにおける発現との連携を示す同様に強力な証拠が存在する。
【０００７】
グレーヴズ病は比較的一般的な甲状腺の自己免疫疾患である。グレーヴズ病では、甲状腺抗原（特にタイロトロピンレセプター（ＴＳＨＲ））に対する自己抗体が甲状腺機能に変化を与え、甲状腺機能亢進症をもたらす（D.P. Stites & A.I. Terr, eds., “Basic and Clinical Immunology”, Appleton and Lang, Norwalk, Connecticut/San Manteo, California, 1991, pp.469-470））。グレーヴズ病の患者の甲状腺細胞は、異所性ＭＨＣクラスＩＩの発現および高レベルのＭＨＣクラスＩの発現を示す（Hanafusa et al., Lancet 2:1111-1115(1983); Bottazzo et al., Lancet 2:1115-1119(1983); Kohn et al., in “International Reviews of Immunology”, Vol.912, pp.135-165(1992)）。線維芽細胞でのＭＨＣクラスＩＩおよびＴＳＨＲの異所性発現（ただし単独発現ではない）が、マウスでグレーヴズ病を誘発すること、すなわち標的組織でのクラスＩＩの異所性発現は正常な免疫系を有する動物で自己免疫疾患を発症させることが示された。
【０００８】
チオナミド療法はグレーヴズ病の治療に歴史的に用いられてきた。もっとも一般的に用いられるチオナミドはメチマゾール、カルビマゾールおよびプロピルチオウラシルである。これらのチオナミドは、チオウレア基を含み、これはもっとも強力なチオウレイレンである（W.L. Green, in Werner & Ingbar’s “The Thyroid”: A Fundamental Clinical Text, 6^th Edition, L. Braveman & R. Utiger(eds), J.B. Lippincott Co., 1991, p.324）。チオナミド療法の根拠は、しかしながら免疫抑制を目指してはいない。むしろ、その基礎は甲状腺ホルモン生成の抑制であった。免疫細胞に対する影響（抗原提示の抑制または抗体産生の抑制）を示唆する実験は、高いＭＭＩ濃度による非生理学的なin vitroの人工産物としてほとんど無視された。このような環境下でのＭＭＩ活性は、遊離ラジカルのスカベンジャー活性によるものといわれている（例えば以下を参照されたい：D.S. Cooper, in Werner & Ingbar’s “The Thyroid”, 上掲書, pp.712-734））。
【０００９】
全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）は慢性の自己免疫疾患で、グレーヴズ病と同様に比較的発症率が高い。ＳＬＥにはもっぱら女性が罹患し、２０歳から６０歳の女性７００人に１人が発症する（A.K. Abbus, A.H. Lichtman, J.S. Pober, eds., “Cellular and Molecular Immunology”, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1991, pp. 360-370））。ＳＬＥは、多様な自己抗体の産生および多臓器の関与を特徴とする（Sites & Terr, 上掲書pp.438-443））。現時点でのＳＬＥの治療法は、コルチコステロイドおよび細胞毒性薬（例えばシクロホスファミド）の使用を必要とする。免疫抑制剤（例えばシクロスポリン、ＦＫ５０６、またはラパマイシン）は、Ｔ細胞の数および機能を低下させることによって免疫系を抑制する（P.J. Morris, Curr. Opin. In Immun., 3:748-751(1991)。これらの免疫抑制療法はＳＬＥおよび他の自己免疫疾患の症状を軽減するが、一方、重篤な副作用をもたらす。実際、これらの薬剤を用いる長期の治療は、対象となっている疾患よりももっと重大な病的状態を引き起こす可能性がある。動物モデルにおけるＭＨＣクラスＩ発現とＳＬＥとの連関が明確になった。すなわち、クラスＩ欠損マウスは、１６／６ＩＤモデルでＳＬＥを発症しない（Mozes et al., Science 261:91-93(1993)）。
【００１０】
ＳＬＥ患者で乳癌を有する者は特に困難に直面する。これらの患者は、ＳＬＥのためのコルチコステロイドおよび細胞毒性薬剤治療の結果として免疫が抑制されており、癌治療のための放射線療法（現在のところ選択される治療法）は、免疫抑制状態をさらに強めるであろう。さらにまた、放射線療法は症状の発現をさらに悪化させるか、または重篤な放射線合併症を誘発するであろう。このような患者の場合、ＳＬＥと癌の同時治療を可能にするまた別の治療選択肢が極めて必要であろう。
【００１１】
真性糖尿病は、相対的または絶対的インスリン不足および相対的または絶対的グルカゴン過剰を特徴とする疾患である（D.W. Foster, Diabetes Mellitus. In J.B. Stanbury et al., The Metabolic Basis of Inherited Disease. Ch.4, pp.99-117(1960)）。Ｉ型糖尿病は発症しやすい遺伝背景と環境因子を必要とするようである。島細胞抗体は最初の数ヶ月の間この疾患では一般的である。それらは、おそらく部分的には細胞抗原を漏出させるβ細胞の損傷から生じるのであろうが、また初期の自己免疫疾患を表している。Ｉ型糖尿病の顕著な代謝異常は高血糖および糖尿である。糖尿病の後期の合併症は多く、これらには発作および心臓の合併症を伴うアテローム性硬化症、腎臓病および腎不全、完全な衰弱をもたらす神経障害が含まれる。ＨＬＡ抗原との連関は１９７０年から知られている。あるＨＬＡ対立遺伝子座が発症頻度の増加に密接に関係し、他の抗原は頻度の低下と関連する。小島細胞におけるＭＨＣクラスＩの増加とＭＨＣクラスＩＩの異所性発現が報告された（Bottazzo et al., NEJM 313:353-360(1985); Foulis & Farquharson, Diabetes 35:1215-1224(1986)）。ＭＨＣクラスＩとの絶対的な連関は、この疾患の遺伝的動物モデルで得られた。すなわち、ＭＨＣクラスＩ欠損はＮＯＤマウスで糖尿病発生に対する抵抗性をもたらす（Sereze et al., Diabetes 43:505-509(1994); Wicker et al., Diabetes 43:500-504(1994)）。
【００１２】
豊富な遺伝的、生化学的および動物モデルデータは、自己免疫進行における炎症性サイトカイン（例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１８および特にＩＦＮ−ガンマ）の貢献的役割を支持している（Sarvetnick, J. Clin. Invest. 99:371-372(1997)）。非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウス（ヒトのＩ型ＩＤＤＭを髣髴させる自己免疫性糖尿病を偶発的に発症する）を用いた実験は、どのようにＩＦＮ−ガンマ刺激過程が自己免疫の発生に重要な役割を果たすか、さらにどのように他の前炎症性サイトカインの作用（それらは、とりわけＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現強化である）がＩＦＮ−ガンマ刺激過程で伝えられていくかを実証的に示している。
【００１３】
ＩＬ−１２およびＩＬ−１８（ＩＦＮ−ガンマ誘発因子）は、Ｔ細胞でのＩＦＮ−ガンマ産生の刺激で協調的に作用することが知られている（Micallef et al., Eur. J. Immunol. 26:1647-1651(1996)）。糖尿病ＮＯＤマウスでは、ＩＬ−１８の全身性発現（Rothe et al., J. Autoimmun. 10:251-256(1997)）およびＩＬ−１２の小島での発現が増加する（Rabinovitch et al., J. Autoimmun. 9:645-651(1996)）。さらにまた、別のＩＬ−１２がＮＯＤマウスで自己免疫糖尿病を促進する（Trembleau et al., J. Exp. Med. 181:817-821(1995)）。遺伝的分析によって、ＩＬ−１８遺伝子の位置は、自己免疫糖尿病の遺伝的感受性に付随する染色体領域（Ｉｄｄ２）にマッピングされた（Kothe et al., J. Clin. Invest. 99:469-474(1997)）。これらの報告は、自己免疫進行におけるＩＦＮ−ガンマの重要な役割を特定するために役立つ。
【００１４】
自己免疫進行におけるＩＦＮ−ガンマの役割は、ＩＦＮ−ガンマのシグナリング能力が何らかの態様で失われるという研究によってさらに立証された。例えば、ＩＦＮ−ガンマに対する細胞レセプターに欠損を有する遺伝子導入ＮＯＤマウス（Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:13844-13849(1997)）は、自己免疫糖尿病を発症しない。ＩＦＮ−ガンマに対する中和抗体で処置したＮＯＤマウスもまた自己免疫糖尿病を発症しない。糖尿病の開始がＩＦＮ−ガンマ欠損遺伝子導入ＮＯＤマウスで遅れるだけであることは幾分驚くべきことであるが、この発見は、ＮＯＤマウスで自己免疫を効果的に予防するためにはＩＦＮ−ガンマシグナルの封鎖が重要であることを明瞭に示した（さらに重要なことにはＩＦＮ−ガンマは下流の事象を刺激した）。
【００１５】
同様なことがＳＬＥの動物モデルで観察された。可溶性ＩＦＮ−ガンマレセプターは以下の疾患を阻害する：ＮＺＢ／ＮＺＷＦ１偶発的自己免疫疾患ＳＬＥモデルでの疾患（Ozmen et al., Eur. J. Immunol. 25:6-12(1995)）；ブドウ膜炎、この場合ＩＦＮ−ガンマの誘導発現は眼の炎症を高める（Geiger et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 35:2667-2681(1994)）；自己免疫性胃炎、この場合ＩＦＮ−ガンマ中和抗体は疾患を阻害する（Barret et al., Eur. J. Immunol. 26:1652-1655(1996)）。さらにまた、ヒトの場合、ＩＦＮ−ガンマによる処置はＳＬＥ様疾患の発生を伴うことが報告された（Graninger et al., J. Rheumatol. 18:1621-1622(1991)）。
【００１６】
γ−ＩＦＮは多くの組織でＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ発現を増加させ、したがって補助調節分子、クラスＩＩトランスアクチベーターの作用と連関していることはよく理解されている（Mach et al., Ann. Rev. Immunol. 14:301-331(1996); Chang et al., Immunity 4:167-178(1996); Steimle et al., Science 265:106-109(1994); Chang et al., J. Exp. Med. 180:1367-1374(1994); Chin et al., Immunity 1:687-697(1994); V. Montani et al., Endocrinology 139:280-289(1998)）。さらにまた、ＭＭＩは、ＩＦＮによって増加したクラスＩおよびクラスＩＩの甲状腺での発現を抑制することが知られている（Saji et al., J. Clin. Endocrinology. Metab. 75:871-878(1992); Montani et al., Endocrinology. 139:290-302(1998)）。最後に、ＭＭＩは、ＣＩＩＴＡによって増加したクラスＩＩの発現を低下させることが示され、これは、Ｙボックスタンパク質の遺伝子発現を強化させるというＭＭＩの作用と関連しているようである（Ｙボックスタンパク質はクラスＩＩの遺伝子発現を抑制する）（Montani et al., Endocrinology 139:280-289(1998)）。
【００１７】
自己免疫疾患の場合と同様に、移植拒絶の治療または予防のために新規なまたは別の方法が強く望まれる。移植拒絶は、ホストとドナーとの間の組織適合性の結果として生じ、組織の移植の成功を妨げる主要な障害である。移植拒絶に対する現在の治療は、自己免疫疾患の場合のように、種々の免疫抑制剤の使用およびコルチコステロイド治療を必要とする。
【００１８】
一連の互変異性環状チオン（すなわちオキサゾリン−、チアゾリン−、およびイミダゾリン−２−(３)−チオン）でその４位および５位にメチルおよびフェニル基を有するものが文献に開示されている（Kjellin & Sandstrom, Acta Chemica Scandinavica, 23:2879-2887および2888-2899(1969)）。これらの化合物は、チオン−チオール平衡の研究に用いられた。これらの化合物について医薬的またはその他の用途は報告されておらず、また推察もされていない。
【００１９】
米国特許3,641,049号(Sandstrom et al., 1972年２月８日）は、Ｎ，Ｎ’−ジアルキル−４−フェニルイミダゾリン−２−チオン、特に１，３−ジメチル−４−フェニルイミダゾリン−２−チオンの抗うつ剤としての使用を開示している。ジメチル化合物はまた、ヘルペスシンプレックスおよびワクシニアウイルスに対して抗ウイルス作用を示すと報告されている。
米国再発行特許24,505号(Rimington et al., 1958年7月22日）は、抗甲状腺化合物として一群のイミダゾール化合物を開示している。
【００２０】
米国特許3,505,350号(Doebel et al., 1970年4月7日）では一群の置換２−メルカプトイミダゾール誘導体が開示され、これらは抗炎症剤として有効であるという。例示された化合物には、１−（４−フルオロフェニル）−５−メチル−２−メルカプトイミダゾールおよび１−メチル−５−フェニル−２−メルカプトイミダゾールが含まれる。
米国特許3,390,150号(Henry et al., 1968年６月25日）は、抗住血吸虫活性および抗トリコモナス活性を有するニトロイミダゾール誘導体を開示する一群の特許の代表である。
【００２１】
米国特許5,051,441号(Matsumoto et al., 1991年9月24日）では、免疫調節剤として作用するというジフェニルイミダゾリン誘導体が開示され、慢性関節リューマチ、多発性硬化症、全身性狼そう、およびリューマチ熱の治療に有効であることが示された。
米国特許4,073,905号(Kummer et al., 1978年2月14日）では、高血圧の治療に有用であるという２−アミノ−４−フェニル−イミダゾリンが開示されている。
米国特許5,202,312号(Matsumoto et al., 1993年4月13日）では、免疫調節活性を有するというイミダゾリン含有ペプチドが開示されている。
【００２２】
ＰＣＴ出願ＷＯ92/04033（Faustman et al.）では、移植される組織の表面に存在する抗原を改変するか、排除するかまたは覆い隠すことによって、レシピエントの動物で移植組織の拒絶を抑制する方法が特定されている。特に、この出願は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）のクラスＩ抗原を改変、隠蔽または排除することを提唱している。好ましい隠蔽または改変薬剤は、ＨＬＡ−クラスＩ抗原に対して誘導した抗体のＦ（ａｂ）’フラグメントである。しかしながら、そのような治療の有効性は、隠蔽または改変薬剤として作用する抗体に対するホストの免疫反応のために制限を受ける。さらに、器官移植では、この治療は、隠蔽抗体の還流が限定されるために全ての細胞に影響を及ぼすことができるというわけではない。出願人らは、ホストに移植を実施する前にＨＬＡ−クラスＩ発現を抑制するためにドナーにフラグメントまたは完全なウイルスをトランスフェクトしようとする。しかしながら、完全なウイルスまたはそのフラグメントを使用することは、あるウイルス（特にＳＶ４０）はクラスＩの発現を高めるので（Singer & Maguire, Crit. Rev. Immunol. 10:235-237(1991)、特に表２を参照されたい）、そのような移植組織のレシピエントが合併症を発症する可能性がある。
【００２３】
英国特許592,453号(Durant et al.）は、宿主対移植片病（ＨＶＧ）における自己免疫疾患の治療で有用なイソチオウレア組成物およびこれらの化合物の免疫抑制能力を評価するアッセイを開示している。しかしながら、この特許はメチマゾールまたは自己免疫疾患の治療におけるＭＨＣクラスＩの抑制については記載していない。
いくつかの自己免疫疾患はメチマゾールで治療され成功したと思われる。ある研究では、ＭＭＩは若年性糖尿病の治療でシクロスポリンと同様に有効であると思われた（W. Waldhausl et al., Akt. Endocrin. Stoffw. 8:119(1987)）。さらに、乾癬もまたＭＭＩで治療された。
【００２４】
米国特許5,556,754号(Singer et al. 1996年9月17日）（これはＰＣＴ出願WO94/28897と同じである）は、メチマゾール、メチマゾール誘導体およびメチマゾール類似体を用いて自己免疫疾患を治療する方法を記載している。“メチマゾール誘導体”および“メチマゾール類似体”という用語は、この特許のいずれの箇所でも特定または例示されていない。
米国特許5,310,742号(Elias, 1994年5月10日）は、乾癬および自己免疫疾患を治療するためにチオウレイレン化合物の使用を述べている。プロピルチオウラシル、メチマゾールおよびチアベンダゾールのみがこの特許で開示された具体的な化合物である。ヒトの乾癬治療のためにメチマゾールの使用が、さらに慢性関節リューマチ、狼瘡および移植拒絶の治療にチオウレイレンの使用が例として示されている。メチマゾール類似体または誘導体は開示も考察もされていない。互変異性環状チオンは開示も考察もされていない。
【００２５】
米国特許4,148,885号(Renoux et al. 1979年4月10日）は、イオウを含む特定の低分子量化合物を免疫刺激剤として使用することを開示している。とりわけ、メチマゾール、チオグアニン、およびチオウラシルが特定された化合物である。メチマゾール類似体または誘導体は開示も考察もされていない。互変異性環状チオンは開示も考察もされていない。
米国特許5,010,092号(Elfarra, 1991年4月23日）は、メチマゾールまたはカルビマゾール（これはメチマゾールのプロドラッグであると教示されている）を腎毒性薬剤とともに同時投与することによりある種の薬剤の腎毒性を低下させる方法を記載している。メチマゾール類似体または誘導体はこの特許では開示も考察もされていない。互変異性環状チオンは開示も考察もされていない。
【００２６】
米国特許5,578,645号(Askanazi et al. 1996年11月26日）は、伝統的な鎮痛剤に付随する副作用を最小限にする方法を記載している。これは、特定の分枝アミノ酸を鎮痛化合物と一緒に投与することによって達成される。メチマゾールが、この特許の従来技術の項でこの発明にいう副作用のいくつかをもたらす可能性がある非ステロイド系抗炎症剤として開示されている。互変異性環状チオンは開示も考察もされていない。
米国特許5,587,369号(Daynes et al. 1996年12月24日）は、損傷後の虚血の予防または抑制方法を記載している。これは、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、ＤＨＥＡ誘導体、またはＤＨＥＡ同族体を損傷後可能なかぎり速やかに患者に投与することによって達成される。この特許の従来技術の項では、メチマゾールはトロンボキサン抑制物質であることが教示されている（トロンボキサン抑制物質は火傷で血管の変化を防止することが示された）。
米国局方（US Pharmacopeia, Rockville, Maryland, 1996）にはメチマゾールが含まれ（CAS-60-56-0）、甲状腺抑制物質であると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２７】
【特許文献１】米国特許3,641,049号
【特許文献２】米国再発行特許24,505号
【特許文献３】米国特許3,505,350号
【特許文献４】米国特許3,390,150号
【特許文献５】米国特許5,051,441号
【特許文献６】米国特許4,073,905号
【特許文献７】米国特許5,202,312号
【特許文献８】ＷＯ92/04033
【特許文献９】英国特許592,453号
【特許文献１０】米国特許5,556,754号
【特許文献１１】米国特許5,310,742号
【特許文献１２】米国特許4,148,885号
【特許文献１３】米国特許5,010,092号
【特許文献１４】米国特許5,578,645号
【特許文献１５】米国特許5,587,369号
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】D.P. Stites & A.I. Terr, eds., “Basic and Clinical Immunology”, Appelton & Lange, Norwalk, Connecticut/San Mateo, California, 1991
【非特許文献２】J. Klein & E. Gutze, “Major Histocompatibility Complex”, Springer Verlag, New York, 1977
【非特許文献３】E.R. Unanue, Ann. Rev. Immunology, 2:295-428(1984)
【非特許文献４】Trisch & McDevitt, Cell 85:291-297(1996)
【非特許文献５】Kotzin, Cell 85:303-306(1996)
【非特許文献６】Prendergast et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 39:754-762(1998)
【非特許文献７】Serreze et al., Diabetes 43:505-509(1994)
【非特許文献８】Mozes et al., Science 261:91-93(1993)
【非特許文献９】Shull et al., Nature 359:693-699(1992)
【非特許文献１０】Kulkarini et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:770-774(1993)
【非特許文献１１】Boivin et al., Am. J. Pathol. 146:276-288(1995)
【非特許文献１２】Letterio et al., J. Clin. Invest. 98:2109-2119(1996)
【非特許文献１３】D.P. Stites & A.I. Terr, eds., “Basic and Clinical Immunology”, Appleton and Lang, Norwalk, Connecticut/San Manteo, California, 1991, pp.469-470
【非特許文献１４】Hanafusa et al., Lancet 2:1111-1115(1983)
【非特許文献１５】Bottazzo et al., Lancet 2:1115-1119(1983)
【非特許文献１６】Kohn et al., in “International Reviews of Immunology”, Vol.912, pp.135-165(1992)
【非特許文献１７】W.L. Green, in Werner & Ingbar’s “The Thyroid”: A Fundamental Clinical Text, 6th Edition, L. Braveman & R. Utiger(eds), J.B. Lippincott Co., 1991, p.324
【非特許文献１８】D.S. Cooper, in Werner & Ingbar’s “The Thyroid”, 上掲書, pp.712-734
【非特許文献１９】A.K. Abbus, A.H. Lichtman, J.S. Pober, eds., “Cellular and Molecular Immunology”, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1991, pp. 360-370
【非特許文献２０】Sites & Terr, 上掲書pp.438-443
【非特許文献２１】P.J. Morris, Curr. Opin. In Immun., 3:748-751(1991)
【非特許文献２２】Mozes et al., Science 261:91-93(1993)
【非特許文献２３】D.W. Foster, Diabetes Mellitus. In J.B. Stanbury et al., The Metabolic Basis of Inherited Disease. Ch.4, pp.99-117(1960)
【非特許文献２４】Bottazzo et al., NEJM 313:353-360(1985)
【非特許文献２５】Foulis & Farquharson, Diabetes 35:1215-1224(1986)
【非特許文献２６】Sereze et al., Diabetes 43:505-509(1994)
【非特許文献２７】Wicker et al., Diabetes 43:500-504(1994)
【非特許文献２８】Sarvetnick, J. Clin. Invest. 99:371-372(1997)
【非特許文献２９】Micallef et al., Eur. J. Immunol. 26:1647-1651(1996)
【非特許文献３０】Rothe et al., J. Autoimmun. 10:251-256(1997)
【非特許文献３１】Rabinovitch et al., J. Autoimmun. 9:645-651(1996)
【非特許文献３２】Trembleau et al., J. Exp. Med. 181:817-821(1995)
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【非特許文献３４】Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:13844-13849(1997)
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【非特許文献４１】Steimle et al., Science 265:106-109(1994)
【非特許文献４２】Chang et al., J. Exp. Med. 180:1367-1374(1994)
【非特許文献４３】Chin et al., Immunity 1:687-697(1994)
【非特許文献４４】V. Montani et al., Endocrinology 139:280-289(1998)
【非特許文献４５】Saji et al., J. Clin. Endocrinology. Metab. 75:871-878(1992)
【非特許文献４６】Montani et al., Endocrinology. 139:290-302(1998)
【非特許文献４７】Montani et al., Endocrinology 139:280-289(1998)
【非特許文献４８】Kjellin & Sandstrom, Acta Chemica Scandinavica, 23:2879-2887および2888-2899(1969)
【非特許文献４９】Singer & Maguire, Crit. Rev. Immunol. 10:235-237(1991)
【非特許文献５０】W. Waldhausl et al., Akt. Endocrin. Stoffw. 8:119(1987)
【発明の概要】
【００２９】
したがって、メチマゾールについては当技術分野では多様な医薬的用途が知られている。すなわち、乾癬の治療のため（Elias）、免疫刺激剤として（Renoux et al.）、ある種の薬剤の腎毒性の減少のために（Elfarra）、ある種の鎮痛剤で見出される副作用を最小限にするために（Oskinasi et al.）、甲状腺抑制物質として（米国局方）、およびトロンボキサン抑制物質として（Daynes et al.）。さらにまた、前記特許（Singer et al.）では、自己免疫疾患（例えば慢性関節リューマチおよび全身性狼そう）の治療に有用であると教示されている。この特許は、メチマゾール類似体および誘導体をこれらの治療目的に使用することについて一般的に言及しているが、これらの化合物の定義は提供されておらず、具体的な化合物も特定されていない。互変異性環状チオンの薬理学的特性は考察されておらず、メチマゾール誘導体との関連も示されていない。
【００３０】
特定の種類のメチマゾール誘導体および互変異性環状チオンは自己免疫疾患の治療および移植器官の拒絶の抑制に有効であること、さらにこれらの化合物は、本来のメチマゾールの使用を凌ぐ明瞭で予期しない利点をもつことが見出された。特にこれらの化合物は以下の利点を有する：（ａ）基礎的およびＩＦＮ誘発クラスＩのＲＮＡ発現の抑制およびＩＦＮ誘発クラスＩＩのＲＮＡ発現の抑制でメチマゾールよりも有効である；（ｂ）ＣＩＩＴＡ／Ｙボックス調節系に作用することによってＩＦＮの作用を抑制する；（ｃ）メチマゾールよりもはるかに可溶性で、製剤化について顕著な自由度および利点をもたらす；（ｄ）甲状腺機能に対してメチマゾールよりも副作用が少ない；（ｅ）ＭＭＩの影響を受けた標的と結合する能力が強化されている；さらに（ｆ）in vivoで治療活性を示す。これらの特性は、これまでに知られているメチマゾール、および特に互変異性環状チオンの特性からは予期できないことである。
【００３１】
最後に、本発明は、これらの薬剤がインターフェロン−ガンマ作用を抑制する方法、特にＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ発現並びに前炎症過程、より具体的には自己免疫疾患誘発および／または移植拒絶の誘発に関連する過程を抑制する方法に関する。
【００３２】
［発明の概要］
本発明は、医薬的に許容できる担体とともに以下から選ばれる活性化合物の安全で有効な量を含む医薬組成物に関する：
【００３３】
【化１】

【００３４】
式中、ＹはＨ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキル、−ＮＯ₂または下記のフェニル成分で、
【００３５】
【化２】

【００３６】
式中、前記活性化合物中のＹ基の２つ以上はフェニル成分ではなく；Ｒ¹は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄エステル、またはＣ₁−Ｃ₄置換エステルから選ばれ；Ｒ²は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、またはＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから選ばれ；Ｒ³は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキル、または−ＣＨ₂Ｐｈ（式中Ｐｈはフェニル）から選ばれ；Ｒ⁴は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、またはＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから選ばれ；Ｘは、ＳまたはＯから選ばれ；Ｚは、−ＳＲ³、−ＯＲ³、Ｓ（Ｏ）Ｒ³またはＣ₁−Ｃ₄アルキルから選ばれ；さらに、式中Ｙがフェニル成分でない場合は前記化合物のＲ²およびＲ³基の少なくとも２つがＣ₁−Ｃ₄アルキルで、Zがアルキルである場合は、少なくとも１つのＹは−ＮＯ₂である。
【００３７】
これらの医薬組成物で使用される好ましい化合物は以下の式を有する：
【００３８】
【化３】

【００３９】
式中、ＹはＨおよびＣ₁−Ｃ₄アルキルまたはＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから選ばれ；Ｒ¹は、Ｈ、−OH、ハロゲン（F、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、またはＣ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄エステルまたはＣ₁−Ｃ₄置換エステルから選ばれ；Ｒ²は、ＨまたはＣ₁−Ｃ₄アルキルまたはＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから選ばれ；Ｒ³は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキル、または−ＣＨ₂Ｐｈから選ばれ；Ｒ⁴は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルまたはＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから選ばれ；Ｘは、ＳまたはＯから選ばれ；Ｚは、−ＳＲ³または−ＯＲ³から選ばれる。
【００４０】
特に好ましい化合物は以下の式を有するものである：
【００４１】
【化４】

【００４２】
好ましい化合物はまた以下の式のものを含む：
【００４３】
【化５】

【００４４】
式中、Ｒ⁹は−ＯＨ、−ＭおよびＭＣＨ₂ＣＯＯ−から選ばれ；さらにＭはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選ばれる。
本発明はまた、自己免疫疾患または移植拒絶の治療を必要とする患者に、安全で有効な量の上記の活性化合物および医薬組成物を投与することによって、自己免疫疾患または移植拒絶を治療する方法に関する。
本発明はまた、クラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現に対する化合物の作用を極めて効率的にスクリーニングすることができるin vivoアッセイ方法に関する。
最後に、本発明は、本明細書で特定した化合物が、クラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩの発現を高めるガンマインターフェロンの作用を抑制する方法に関する。ガンマインターフェロンは免疫疾患の発現に連関している。
本明細書で用いられるように、全ての比率、割合、および百分率は、特に別に規定しないかぎり“重量”による。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＭＨＣクラスＩ ＰＤ１遺伝子の上流サイレンサー／エンハンサー領域（パネルＡ）、クラスＩ ＰＤ１遺伝子の下流サイレンサー／エンハンサー領域（パネルＢ）、およびＨＬＡ−ＤＲαＭＨＣクラスＩＩプロモーターの調節領域（パネルＣ）の模式図である。
【図２】図２は、ＭＨＣ（クラスＩ）５'−フランキング領域のフラグメント１４０（−７７０から−６３６ｂｐ）とのタンパク質／ＤＮＡサイレンサー複合体の形成に対する、メチマゾールおよび本明細書で用いたいくつかの活性化合物の影響を示す。前記フラグメント１４０は、種々の組織で構成的ＭＨＣクラスＩ発現を制御する上流サイレンサー／エンハンサーをその中に含んでいる。
【図３】図３は、−２５０ｂｐと翻訳開始との間のＭＨＣクラスＩ遺伝子の配列を示す。
【図４】図４は、時間の関数として、ＭＨＣ５'−フランキング領域（−１２７から＋１ｂｐ）の放射能標識フラグメント１２７（図１参照）とのタンパク質／ＤＮＡ複合体形成に対する、ＭＭＩまたは本明細書の代表的化合物（化合物８）によるＦＲＴＬ−５細胞の処理の影響を示す。
【図５】図５は、本明細書の実験で使用した−１７６ｂｐＨＬＡ−ＤＲα−ＣＡＴ構築物の１７６ｂｐ５'−フランキング領域のヌクレオチド配列を示す。
【図６】図６は、ＴＳＨ存在下または非存在下で維持し、γ−ＩＦＮで処理または未処理のＦＲＴＬ−５細胞から得られた抽出物とタンパク質／ＤＮＡ複合体を形成する、³²Ｐ−放射能標識ＤＲα−５’−フランキング領域プローブの能力の電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）を示す。
【図７】図７は、³²Ｐ−放射能標識ＤＲα−５'−フランキング領域プローブとのタンパク質／ＤＮＡ複合体形成を増加させるγ−ＩＦＮの能力に対するＭＭＩの影響を示す。
【図８】図８は、³²Ｐ−放射能標識ＤＲα−５'−フランキング領域プローブとのタンパク質／ＤＮＡ複合体形成を増加させるγ−ＩＦＮの能力に対する１ｍＭのＭＭＩまたは１ｍＭの本明細書で調べた代表的化合物の影響を示す。
【図９】図９は、ＦＲＴＬ−５細胞における外因性クラスＩプロモーター活性に対するＭＭＩおよび／またはＴＳＨの影響を示す。
【図１０】図１０は、ＦＲＴＬ−５細胞におけるブタクラスＩプロモーターの５'−欠損変異体のＣＡＴキメラのプロモーター活性に対するＭＭＩおよびＴＳＨの影響を示す。
【図１１】図１１は、−１７６ｂｐＨＬＡ−ＤＲα−ＣＡＴ構築物およびその５'−欠損（Ａ）またはＳ、Ｘ₁、Ｘ₂およびＹボックスに変異を有する−１７６ｂｐＤＲα−ＣＡＴ構築物（Ｂ）を用いて測定したＦＲＴＬ−５甲状腺細胞におけるクラスＩＩ発現に対するγ−インターフェロン（ＩＦＮ）の影響を示す。
【図１２】図１２は、ＦＲＴＬ−５細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ抗原発現に対するγ−ＩＦＮの影響を示す。
【図１３】図１３は、γ−ＩＦＮの濃度の関数として（Ａ）およびＭＭＩの存在下で（Ｂ）、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞でＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現させることに対するγ−ＩＦＮの影響を示す。
【図１４】図１４は、ＭＭＩ濃度の関数として、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞におけるγ−ＩＦＮ増加クラスＩＩ発現に対するγ−ＩＦＮの影響を示す。
【図１５】図１５は、（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ₁マウスの腎の免疫複合体に対するＭＭＩ、化合物１０（５−フェニルメチマゾール）および化合物３（２−メルカプトイミダゾール）の影響を示す。
【図１６】図１６は、ＹボックスＲＮＡレベルを減少させるγ−ＩＦＮの能力を逆転させる、ＭＭＩ、化合物１０（５−フェニルメチマゾール）、化合物７（５−メチルメチマゾール）、化合物８（Ｎ−メチルメチマゾール）、または化合物１１（１−メチル−２−チオメチル−５（４）ニトロイミダゾール）の能力を示す。
【図１７】図１７は、自己免疫疾患の発生モデルおよびＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンの前記発生過程に対する作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
［発明の詳細な説明］
本発明は、自己免疫疾患の治療および移植組織の拒絶抑制のために用いることができる医薬組成物に関する。これら医薬組成物を用いる自己免疫疾患の治療および移植組織の拒絶抑制の方法もまた、これら薬剤の製造に使用することができる特定のメチマゾール誘導体および互変異性環状チオンと同様に本発明に含まれる。本明細書で用いられるように、以下の用語は下記に示すように定義される。
【００４７】
“安全で有効な量”という語句は、医療措置のいずれにも付随する合理的な利益／リスク比で、自己免疫疾患の治療または移植組織の拒絶の抑制に所望の影響を与えるために十分な医薬的に活性な化合物の量を意味する。医薬的に活性な薬剤、または前記活性な薬剤を含む医薬組成物の必要な投与量は、適切な医学的判断の範囲内で、治療されるべき症状の重篤度、治療期間、付属治療の性質、患者の年齢および健康状態、使用される個々の活性化合物および下記でより詳細に考察する事柄などによって変動するであろう。これに関して高投与量でのＭＭＩの使用は、ある種の患者では、副作用（例えば再生不良性貧血、顆粒球減少症、肝不全および皮膚炎）を誘発することは留意されるべきである。特定の化合物について“安全で有効な量”に到達するために、本明細書で開示する化合物は通常のメチマゾール化合物より低い投与レベルで医薬活性を提供するという事実と合わせてこのようなリスクは考慮されねばならない。
【００４８】
“医薬的に許容できる”ということは、本明細書で特定された医薬組成物または方法で用いられる医薬的に活性な化合物または他の成分が、ヒトおよびより下等な動物の組織と接触して用いた場合、過度の毒性、炎症、アレルギー反応などを示さず適切で、合理的な利益／リスク比でつりあうことを意味する。
本明細書で特定される医薬的に活性な化合物および医薬組成物の“投与”という用語は、注射（特に非経口的）、静脈内輸液、座薬および経口投与のような全身的使用とともに前記化合物および組成物の局所塗布を含む。本発明では経口投与が特に好ましい。
【００４９】
本明細書で用いられるように、“含む”という用語は、規定の医薬的に活性な化合物および担体が開示の態様で用いられるかぎり、多様な適合する他の薬剤および医薬が不活性成分とともに本発明の医薬組成物または方法に組合わされて用いられ得ることを意味する。したがって、“含む”という用語は、より限定的な用語“から成る”および“本質的に〜から成る”を包含する。
本明細書で用いられる“患者”という用語は一切の哺乳類、動物またはヒト（本発明の化合物、組成物または方法を用いる治療が有益なもの）を包含しようとするものである。
本明細書の“適合する”とは、本発明を構成する組成物の成分が、医薬的に活性な化合物の有効性を通常の使用条件下で実質的に低下させるような態様で相互作用することなく一緒に混ぜ合わせることができることを意味する。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容できる担体と一緒に、特別に定義されたメチマゾール誘導体および互変異性環状チオンを安全で有効な量で含む。
本発明の組成物で用いられるメチマゾール誘導体は以下の構造式を有するものである：
【００５１】
【化６】

【００５２】
これらの式で、ＹはＨ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキル、−ＮＯ₂、および下記のフェニル成分から選ばれる：
【００５３】
【化７】

【００５４】
Ｙは好ましくはＨ、フェニル成分または−ＮＯ₂で、もっとも好ましくは、Ｈまたは下記フェニル成分である。
【００５５】
【化８】

【００５６】
本規定の化合物ではＹ基の２つ以上はフェニル成分ではない。Ｒ¹は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ）、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄エステルおよびＣ₁−Ｃ₄置換エステルから選ばれ；好ましくは、Ｒ¹は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、−ＯＯＣＣＨ₂Ｍ（式中、ＭはＨまたはハロゲン）で；もっとも好ましくはＨである。Ｒ²は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルおよびＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから選ばれ；好ましくは、Ｒ²基の一方または両方がメチルである。本明細書で用いられるように、“置換アルキル”または“置換エステル”は、アルキル、アリールまたはエステル基を含み、これらは１つまたは２つ以上の場所でヒドロキシルまたはアルコキシル基、カルボキシル基、ハロゲン、ニトロ基、アミノまたはアシルアミノ基、およびこれら成分の混合物で置換される。好ましい“置換アルキル”基はＣ₁−Ｃ₄ヒドロキシルまたはアルコキシル基の他にハロゲンで置換された基である。上記の式のＲ³基は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキルおよび−ＣＨ₂Ｐｈ（式中、Ｐｈはフェニルである）から選ばれ；好ましい化合物では、Ｒ³は、ＨまたはＣ₁−Ｃ₄アルキルで；もっとも好ましくは、Ｒ³はＣ₁−Ｃ₄アルキル、特にメチルである。Ｒ⁴は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルおよびＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから選ばれ、好ましくはＨである。ＸはＳまたはＯで、好ましくはＳである。最後に、Ｚは、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、−ＳＲ³、−Ｓ（Ｏ）Ｒ³および−ＯＲ³から選ばれ、好ましくは−ＳＲ³、−ＯＲ³およびＳ（Ｏ）Ｒ³で、もっとも好ましくは−ＳＲ³および−ＯＲ³で、特に−ＳＲ³である。上記の式で、Ｙがフェニル成分でない場合は、化合物のＲ²およびＲ³基の少なくとも２つはＣ₁−Ｃ₄アルキルでなければならない。さらに、ZがＣ₁−Ｃ₄アルキルである場合は、少なくとも１つのＹ基は−ＮＯ₂でなければならない。
【００５７】
本発明で有用な化合物には、以下の式を有する互変異性環状チオンが含まれる（前記物質は以下の文献によって開示された：Kjellin & Sandstrom, Acta Chemica Scandanavica 23:2879-2887(1969)(この文献は参照により本明細書に含まれる)）：
【００５８】
【化９】

【００５９】
式中、Ｒ⁵、Ｒ⁶＝ＣＨ₃、ＣＨ₃；Ｐｈ、Ｈ；Ｈ、Ｐｈであり、Ｒ⁷＝Ｈ、ＣＨ₃であり、Ｒ⁸＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＣＨ₃である。
本発明の化合物で使用される好ましい化合物には以下の式を有するものが含まれる：
【００６０】
【化１０】

【００６１】
好ましい別の群の化合物には以下の式のものが含まれる：
【００６２】
【化１１】

【００６３】
式中、Ｒ¹⁰は、Ｈ、ＮＯ₂、Ｐｈ、４−ＨＯＰｈおよび４−ｍ−Ｐｈから選ばれる（式中、ｍはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである）。
本明細書で特定される特に好ましいサブセットは、Ｙ基の１つが上記で定義したフェニル基であるものである。これらの化合物は以下の式を有する：
【００６４】
【化１２】

【００６５】
これらの化合物では、Ｙは、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルおよびＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから選ばれ、好ましくはＨである。Ｒ¹は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩ）、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄エステルおよびＣ₁−Ｃ₄置換エステルから選ばれ；好ましくは、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、−ＯＯＣＣＨ₂Ｍ（式中、ＭはＨまたはハロゲン）で；もっとも好ましくはＨである。Ｒ²は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルおよびＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから選ばれ；好ましくは、Ｒ²基の少なくとも一方がメチルである。Ｒ³は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキルおよび−ＣＨ₂Ｐｈから選ばれ；好ましいＲ³成分は、Ｈおよびメチルである。Ｒ⁴は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルおよびＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから選ばれ、好ましくはＨである。ＸはＳおよびＯで、好ましくはＳである。最後に、Ｚ成分は、−ＳＲ³および−ＯＲ³から選ばれ、好ましくは−ＳＲ³である。特に好ましい化合物は以下の構造式を有するものである：
【００６６】
【化１３】

【００６７】
他の好ましい化合物には以下が含まれる：
【００６８】
【化１４】

【００６９】
式中、Ｒ⁹は、−OH、−Ｍおよび−ＯＯＣＣＨ₂Ｍから選ばれ、Ｍは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選ばれる。
【００７０】
もっとも好ましいものは下記に示す構造を有する化合物である。この化合物は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩタンパク質の発現の抑制について予期せぬ高活性を示した。さらにこの化合物は、甲状腺遺伝子発現、すなわちサイログロビンに対してＭＭＩと比較した場合異なる作用を示した。これは、この化合物を自己免疫疾患、さらにグレーヴズ病の治療にも、甲状腺ホルモンの補充を必要とすることなく用いることが可能なことを示している。
【００７１】
【化１５】

【００７２】
本明細書で特定される医薬的に活性な化合物の混合物もまた用いることができる。
上記で述べたメチマゾール誘導体および互変異性環状チオンは、当業者に周知の技術を用いて合成できる。例えば、いくつかの互変異性環状チオンの合成は文献に記載されている（Kjellin & Sandstrom, Acta Chemica Scandanavica 23:2879-2887(1969)(この文献は参照により本明細書に含まれる)）。
【００７３】
代表的なメチマゾール誘導体は以下の方法を用いて合成できる。適切に置換されたアセトアルデヒドの類似体を臭素およびＵＶ光で処理して２位に臭素を付加し、続いて無水エタノールを用いて対応するジエチルアセタールを生成する。続いて封入試験管内で無水メチルアミンまたは他の適切なアミンで約１６時間まで約1２０度で処理して臭素をこの化合物から取り除く。得られたアミノアセタールをスチームバスの温度で一晩チオシアン酸カリウムと反応させてメチマゾール誘導体を得る。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、安全で有効な量の１つまたは２つ以上のメチマゾール誘導体または互変異性環状チオン化合物（すなわち活性化合物）を含む。好ましい組成物は約０．０１％から約２５％の活性化合物を含み、もっとも好ましい組成物は約０．１％から約1０％の活性化合物を含む。本発明の医薬組成物は、通常知られている任意の態様で、例えば腹腔内、静脈内、筋肉内、または局所的に投与できるが、ただし経口投与が好ましい。好ましい組成物は単位剤形、すなわち１回の投与のために予め計量された製剤として利用可能で、使用者が個々の投与について計量する必要がないもので、例えばピル、錠剤またはアンプルである。
【００７５】
本発明の医薬組成物はさらに、上記のメチマゾール誘導体または互変異性環状チオンと適合する医薬的に許容できる担体を含む。前記医薬的に許容できる担体の他に、本医薬組成物は、それらの許容できるレベルでまた別の成分、例えば、また別の医薬的に活性な物質、賦形剤、製剤補助剤（例えば錠剤化補助剤）、着色剤、香料、保存料、および当業者の周知の他の物質を含むことができる。
【００７６】
本明細書で用いられるように、“医薬担体”という用語は、固体または液体充填剤、希釈剤または被包化物質を指す。これらの物質は当医薬分野では周知である。医薬担体として役立つ物質のいくつかの例は、糖類（例えばラクトース、グルコースおよびシュクロース）；澱粉（例えば、トウモロコシ澱粉およびジャガイモ澱粉）；セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）；トラガカント末；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；植物油（例えば、ピーナツ油、綿実油；ごま油；オリーブ油；トウモロコシ油；カカオ脂）；ポリオール（例えば、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール）；寒天；アルギン酸；発熱因子非含有水；等張食塩水；および燐酸緩衝溶液、並びに医薬製剤で用いられる適合する他の非毒性物質である。湿潤剤および潤滑剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）、並びに着色剤、香料、錠剤化剤および保存料もまた含有することができる。成分を医薬組成物として製剤化するためには通常の技術を用いることができる。
【００７７】
本発明の医薬組成物とともに用いることができる医薬担体は、実際的なサイズ／用量関係を提供するために十分な濃度で用いられる。好ましくは、医薬担体は、全医薬組成物重量で約７５％から約９９．９９％、好ましくは約９０％から約９９．９％で含まれる。本出願で特定されるメチマゾール誘導体または互変異性環状チオンは、驚くべきことには、通常の担体物質中でのメチマゾールと比較してより可溶性である。このことは、これらのメチマゾール誘導体を含有する医薬組成物の製剤化においてより大きな融通性を可能にし顕著な利点を提供し、さらに極めて低用量の活性化合物の使用を可能にするであろう。
【００７８】
本発明はまた、自己免疫疾患の治療方法および移植片のレシピエントにおける組織拒絶の予防または治療方法を提供する。より具体的には、本発明は、そのような治療を必要としている哺乳類に、クラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を抑制することができる本明細書で特定した薬剤を投与する方法に関する。
【００７９】
本方法を用いて治療することができる自己免疫疾患の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：慢性関節リューマチ、乾癬、若年性またはＩ型糖尿病、原発性特発性粘液水腫、全身性紅斑性狼瘡、ド＝ケルヴァン甲状腺炎、甲状腺炎、自己免疫性喘息、重症筋無力症、皮膚硬化症、慢性肝炎、アジソン病、性機能低下、悪性貧血、白斑、円形脱毛症、セリアック病、自己免疫性腸症、特発性血小板性紫斑病、後天性脾臓萎縮、特発性尿崩症、抗精子抗体に起因する不妊症、突然の聴力喪失、感覚神経性聴力喪失、ショーグレン症候群、多発性筋炎、自己免疫性脱髄症（例えば、多発性硬化症）、横断脊髄炎、運動失調性硬化症、天疱瘡、進行性全身性硬化症、皮膚筋炎、結節性多発性動脈炎、溶血性貧血、糸球体腎炎および特発性顔面麻痺。そのもっとも広い例では、本発明のメチマゾール誘導体は、１日当たり約０．００１から約１００ミリグラム、好ましくは約０．０５から約５０ミリグラムの投与範囲で投与される。本発明の医薬組成物は、医薬活性物の適切なレベルが血中で達成されるように投与される。ある症例で要求される正確な投与レベルは、例えば使用される個々のメチマゾール誘導体、処置される疾患の性質、患者のサイズ、体重、年齢、健康状態に左右されるであろう。
【００８０】
好ましい実施態様では、本発明の活性化合物（例えば５−フェニルメチマゾール）は、自己免疫疾患に罹患した哺乳類（好ましくはヒト）に投与される。メチマゾール誘導体の適切な治療量は、１日当たり約０．０５から２０ミリグラムの範囲である。好ましい投与量は、１日当たり約０．０５から約1０ミリグラムである。投薬は、８時間間隔または朝食、昼食もしくは夕食でほぼ均等に分割して毎日実施できる。治療は、例えば１年またはそれ以上の期間連続することができる。また別には、治療は次第に減少させることができる。例えば高投与量で開始し、４から1０週内でより低い投与量に減少させることができる。そのような治療を受ける個体の甲状腺ホルモン（サイロキシンＴ₄またはトリヨードサイロニンＴ₃）または甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）レベルは、いくつかの化合物については治療効果のインデックスとなろう。自己免疫疾患に罹患している哺乳類に投与される用量は、当該哺乳類の年齢、疾患の重篤度、治療経過に対する反応に応じて変動することは当業者には理解されよう。当分野で習熟する者は、罹患者に対する適切な投与量を決定するための臨床的査定パラメーターについて知識を有するであろう。
【００８１】
別の好ましい実施態様では、本明細書に記載された活性化合物は、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）に罹患した哺乳類、好ましくはヒトに投与される。好ましい治療のための量は、１日当たり約０．０５から約２０ミリグラムで２から1２ヶ月にわたって投与されるが、しかし５年間または必要な期間にわたって同様な長さの不連続な治療期間で投与することができる。また別には、本発明の組成物は、ＳＬＥを抑制するために、現存のＳＬＥ治療、ヒドロコーチゾンおよび細胞毒性薬剤と併用して投与することができる。乳癌のＳＬＥ患者は放射線で容易に治療することができない。なせならば、彼らは既にＳＬＥのための現存の一般的治療によって免疫が抑制されているからである。さらに、ＳＬＥは放射線照射の合併症に異常な感受性を有する可能性があり、したがって放射線療法はこの疾患を悪化させる。したがって、乳癌を有するＳＬＥ患者を治療するために、本発明のメチマゾール誘導体および互変異性環状チオンを使用することは、放射線照射合併症を引き起こすことなくまたは症状を悪化させることなく、そのような患者に放射線療法を行うことを可能にするであろう。
【００８２】
別の実施態様では、本発明のメチマゾール誘導体、環状互変異性チオンおよび医薬組成物は、Ｉ型または若年性糖尿病に罹患している哺乳類、好ましくはヒトに投与される。
別の実施態様では、本発明のメチマゾール誘導体、互変異性環状チオンおよび医薬組成物は、甲状腺自己抗体の血中出現に付随する自己免疫疾患に罹患している哺乳類、好ましくはヒトに投与される。
【００８３】
さらに別の実施態様では、本発明のメチマゾール誘導体、互変異性環状チオンおよび医薬組成物は、レセプター自己抗体の出現を特徴とする自己免疫疾患に罹患している哺乳類、好ましくはヒトに投与される。例えば、自己免疫性喘息は、β−アドレナリン作動性レセプター自己抗体に付随する。本発明の組成物による治療はこの疾患を軽減させる。そのような自己免疫疾患の別の例は重症筋無力症である。重症筋無力症は、アセチルコリンレセプター自己抗体に付随する。重症筋無力症に罹患している患者は、より高い頻度で甲状腺自己免疫を有する。ＴＳＨとアセチルコリンレセプターとの構造的および機能的関係のために、重症筋無力症に罹患している動物、好ましくはヒトをＭＨＣタイプＩおよびタイプＩＩの両方を抑制することができる薬剤、例えば本発明のメチマゾール誘導体または互変異性環状チオンで処置することによってこの疾患は抑制されるであろう。
【００８４】
本発明の方法はまた、移植された組織の拒絶をレシピエントの哺乳類、好ましくはヒトで予防または治療するために適している。移植される組織の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：心臓、肺臓、腎臓、骨髄、皮膚、すい臓小島細胞、甲状腺、肝臓および全ての内分泌組織、神経組織、筋肉、線維芽細胞、および脂肪細胞。
【００８５】
移植組織の拒絶の予防例として、膵臓の小島細胞をドナーから単離し、糖尿病を罹患している患者に移植する前に本発明のメチマゾール誘導体または互変異性環状チオンで処理する。糖尿病は、自己免疫疾患の結果として小島細胞の喪失によってもたらされる。小島細胞の移植はそのような欠乏を修正するであろう。小島細胞は、１日あたり約０．０５から約２０ミリグラムの活性化合物で、例えば水溶液として約２４時間から約７２時間または小島細胞のＭＨＣクラスＩ分子の発現の抑制に必要な場合はそれ以上の時間処理することができる。移植後、レシピエントはさらに、ヒドロコーチゾンおよび／または他の免疫抑制剤とともにメチマゾール誘導体または互変異性環状チオンで処理される。
【００８６】
本発明はまた、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの発現を抑制する薬剤の能力を評価するin vitroアッセイに関する。本アッセイは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩプロモーター並びにその調節配列の下流に操作可能に連結したレポーター遺伝子の活性を測定する。ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩプロモーター並びにその調節配列に操作可能に連結したレポーター遺伝子は哺乳類細胞に導入され、この哺乳類細胞は候補薬剤で処理され、処理哺乳類細胞および未処理哺乳類細胞から得た溶解物中のレポーター遺伝子の活性が測定される。未処理細胞に対する処理細胞の細胞溶解物中のレポーター遺伝子活性の減少は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ発現の抑制を示唆し、順次、自己免疫疾患の抑制または移植拒絶の予防について候補薬剤の有用性を予見する。
【００８７】
レポーター遺伝子に操作可能に連結することができる好ましい調節配列は、以下の調節領域に対応する配列である：クラスＩ遺伝子の調節領域、−１Ｋｂから＋１ｂｐ；ＭＨＣクラスＩ、ＰＤ１遺伝子の上流のサイレンス／エンハンサー領域、−７６９から−６７３ｂｐ（図１Ａ）；ＰＤ１遺伝子の下流調節領域、−２０３または−１２７から−１ｂｐ；ＰＤ１遺伝子の下流サイレンス領域、−１２７から−８０ｂｐ（図１Ｂ）；およびＳ、Ｙ、Ｘ₁およびＸ₂ボックスを含むＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の調節領域、−１３７から−５０ｂｐ（図１Ｃ）。これらの配列は、その同系のプロモーターとともに図１に示されている。他のクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子の調節およびプロモータードメインに見出される配列的および機能的に相同な領域もまた用いることができることは当業者には理解されよう。レポーター遺伝子の例には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vol.2, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Press, NY(1989); F. Ausubel et al., in “Current Protocols in Molecular Biology” Supplement 14, section9.6(1987); John Wiley and Sons, New York(1990)）。本in vitroアッセイで用いることができる哺乳類細胞の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：哺乳類甲状腺細胞、肝細胞、神経組織、筋肉、線維芽細胞、脂肪細胞およびＨＥＬＡ細胞。前記レポーター遺伝子に操作可能に連結された調節配列を細胞に導入する手段は上記で述べたものと同じである。好ましい実施態様では、ルシフェラーゼ遺伝子は上記のＰＤ１配列の１つに操作可能に連結され、ＦＲＴＬ−５細胞に導入される。
【００８８】
ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を抑制する候補薬剤の能力はまた、候補薬剤で処理された哺乳類細胞と候補薬剤で処理されていない細胞における細胞ｍＲＮＡレベルを比較することによって評価することができる。細胞のｍＲＮＡレベルを測定する方法の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ノザンブロッティング（J.C. Alwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5350-5354(1977)）, ドット／スロットハイブリダイゼーション（F.C. Kafatos et al., Nucleic Acids Res., 7:1541-1522(1979)）、フィルターハイブリダイゼーション（M.C. Hollander et al., Biotecniques; 9:174-179(1990)）、ＲＮＡ分解酵素保護（J. Sambrook et al., in “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY(1989)）、ポリメラーゼ連鎖反応（J.D.Watson et al., in “Recombinat DNA” 2^nd ed., W.H. Freeman & Company, New York(1992)）および核ランオフアッセイ（F. Ausubel et al., in “Current Protocols in Molecular Biology”, Supplement 9(1990), John Wiley and Sons, New York(1990)）。
以下の実施例は、本発明の医薬的に活性な化合物、医薬組成物および治療方法を詳述しようとするもので、それらを限定しようとするものではない。
【実施例】
【００８９】
［実施例］
実施例１
５−フェニルメチマゾールの調製
好ましい化合物５−フェニルメチマゾールは以下のように合成される：
工程１：２−ブロモフェニルアセトアルデヒドジエチルアセタールの合成
フェニルアセトアルデヒドの臭素付加は下記の文献の方法によって実施できる：P. Duhamel, L. Duhamel & J-Y Valnot, Bull. Soc. Chim. Fr. １４６５（1973）。
１２０ｇ（１mol、１１７mL）のフェニルアセトアルデヒドを３つの首が付いたフラスコでドライアイス／ＣＣｌ₄を用いて２０℃に冷却する。１６０ｇ（１mol）の臭素を激しく攪拌しながら１滴ずつ加え、冷却する。添加の後、反応溶液を２リットルの丸底フラスコに移し、約１．５リットルの絶対エタノールを添加する。この溶液を室温で一晩攪拌する。溶液を真空中で蒸発させ、Ｎａ₂ＣＯ₃の飽和溶液で抽出する。粗生成物をＫ₂ＣＯ₃の上で乾燥させ、ろ過して１４５．３４ｇを得た。最終生成物を５０μの圧力下で９４℃で蒸留し、８６．９３ｇ（４６％）の純粋な物質を得る。
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：δ１．０５（３Ｈｔ），１．３０（３Ｈｔ），３．３−３．９（５Ｈｍ），４．９１（２Ｈｄｄ），７．３２−７．４８（５Ｈｍ）
【００９０】
工程２：２−メチルアミノフェニルアセトアルデヒドジエチルアセタールの合成
この物質は下記の方法を用いて合成できる：Jones et al., J. Am. Chem. Soc. 71:4000(1949)。
２００mLの壁の厚いガラスの反応容器をドライアイス／アセトン中で冷却し、約２５mLの無水メチルアミンを満たす。これに約２５mL（３２ｇ）の２−ブロモフェニルアセトアルデヒドジエチルアセタールを添加する。この混合物を液体窒素中で固め、真空ポンプで反応容器内を吸引する。この反応容器を油浴中で１１０℃で一晩加熱する。反応容器をドライアイス／アセトンで、続いて液体窒素で冷却し、メチルアミンを水溶液に逃がす。粗反応生成物をメタノールに採取し、１ＮのＫＯＨ水溶液で抽出し、固形ＫＯＨ上で乾燥させる。この溶液を真空中で乾燥させ、粗生成物を蒸留によって精製する。この生成物を２５５μの圧力下で１００℃で蒸留する。物質の収量は８９．７％である。
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：δ０．９５（３Ｈｔ），１．２４（３Ｈｔ），２．２３（３Ｈｓ），３．４９−３．５４（ｍ），３．６０（ｄ），３．７−３．９（ｍ），４．４１（ｄ），７．２６−７．４０（５Ｈｍ）
【００９１】
工程３：５−フェニルメチマゾール
この物質は下記の文献の方法を用いて合成できる：R.G. Jones, J. Am. Chem. Soc. 71:383-386(1949)。
５０ｇ（２２４mmol）の２−メチルアミノフェニルアセトアルデヒドジエチルアセタールを１００mLの５０％エタノール／水の溶液に溶解する。これに２６．１２３ｇ（２６８．８mmol）のチオシアン酸カリウムおよび２２．３９mL（２６８．８mmol）の濃塩酸を攪拌しながら添加する。解放状態のビーカー内で混合物をスチームバス上で４日間過熱する。粗反応混合物を酢酸エチル（２００mL）中にとり、水（３ｘ５０ｍＬ）、飽和炭酸ナトリウム（３ｘ５０ｍＬ）および飽和食塩水（３ｘ５０ｍＬ）で抽出する。この溶液を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空中で乾燥させて４７．６５ｇの橙赤色の油を得る。この物質をベンゼンにとり、４５０ｇのシリカゲル上でクロマトグラフィーを実施する。カラムを最初ベンゼンで、続いて生成物の出現時に１０％酢酸エチル：ベンゼンで溶出させる。生成物を含む分画を３つの分画にまとめる。分画ＡおよびＣを一緒にし、１３．９３ｇを得、さらにエタノールから再結晶化させて２．３ｇを得る。群Bは再結晶により３．９ｇを得る。再結晶収量は１４．５％である。融点は１６８−１７３℃。
¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：δ３．５９（３Ｈｓ），６．７６（１Ｈｓ），７．４２（５Ｈｍ）
【００９２】
１−メチル−５−フェニルイミダゾール−２（３）−チオン
下記文献を参照されたい：Kjellin & Sandstrom, Acta Chemica Scandinavica 23:2879-2887(1969)
【００９３】
【化１６】

【００９４】
機械的攪拌装置、添加ロート、コンデンサーおよびＮ₂注入口を備えた１リットルの丸底フラスコに、５０ｇのα−アミノアセトフェノンヒドロクロリド、２２．５ｍＬのメチルイソチオシアネートおよび６００ｍＬの絶対エタノールを添加する。この混合物に４２ｍＬのトリエチルアミンを添加する。反応溶液を１時間還流で加熱する。
【００９５】
反応混合物をほぼ乾燥するまで絞り、残留物に１５０ｍＬの水を加える。生じた懸濁液を吸引ろ過し、８０ｇの黄色固体を採集する。このろ過固形物を５００ｍＬの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でスラリーにする。不要物をろ過して除く。ロ液に約１００ｍＬの３７％塩酸を加える。得られた懸濁物を吸引ろ過し、固形物を５ｍＬの２５％エタノール水溶液で再結晶化させる。
２５．７ｇの青桃色の固形物を採集する（融点１７８−１７９℃）。ＨＰＬＣで純度９９．８％であることが示される。
元素分析は以下のとおりである：
実験値：Ｃ，６２．８２；Ｈ，５．２１；Ｎ，１４．７４；Ｓ，１６．６３
理論値：Ｃ，６３．１３；Ｈ，５．３０；Ｎ，１４．７３；Ｓ，１６．８６
ＩＲ、炭素ＮＭＲおよびプロトンＮＭＲは全て所望の構造を支持した。
【００９６】
１−メチル−２−メチルチオ−５−フェニル−イミダゾールの調製
【００９７】
【化１７】

【００９８】
機械的攪拌装置、コンデンサー、温度計および添加ロートを備えた１リットルの丸底フラスコに、１９．１ｇの１−メチル−５−フェニル−イミダゾリン−２（３）−チオン（化合物１０）および３３５ｍＬの９５％エタノールを添加する。これに４ｇ水酸化ナトリウムを添加し、混合物を溶液が得られるまで攪拌する。
【００９９】
これに９５％エタノール１４５ｍＬ中の１５．６ｇのヨウ化メチルを周囲温度（２８−３０℃）で３５分かけて添加する。得られた混合物をロータリーエバポレーターで乾燥させる。ほぼ４１ｇの橙色の固形物を採集する。これを約６００ｍＬの塩化メチレンに溶解させ、これに約６００ｍＬの水を加える。有機層を分離する。水層を２回塩化メチレンで抽出し、橙色の層を一緒にし、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、ろ過してロータリーエバポレーターで乾燥させ、２６．７ｇの油状の固形物を得る。これを吸引ろ過し、風乾して１６．５ｇの青桃色の固形物を得る（融点８５−８７℃）。これを（２つの小規模調製物から得た０．８ｇおよび２．５ｇと合わせて）総量２．５Ｌのヘプタンで再結晶化する。１０．７ｇのオフホワイトの固形物が得られる；融点８７℃。ＨＰＬＣで純度９９．８％であることが示される。
元素分析は以下のとおりである：
実験値：Ｃ，６４．７０；Ｈ，５．８５；Ｎ，１３．７０；Ｓ，１５．５５
理論値：Ｃ，６４．６６；Ｈ，５．９３；Ｎ，１３．７０；Ｓ，１５．７２
ＩＲ、炭素ＮＭＲおよびプロトンＮＭＲは全て所望の生成物の証拠を示した。
【０１００】
１，３−ジメチル−４（５）−フェニル−イミダゾリン−２（３）−チオンの調製
【０１０１】
【化１８】

【０１０２】
ディーン−スタークのトラップ、コンデンサー、Ｎ₂注入口および磁気攪拌装置を備えた１００ｍＬの丸底フラスコに、１３ｇのα−ヒドロキシアセトフェノン、１０ｇのＮ，Ｎ−ジメチルチオウレアおよび５０ｍＬの１−ヘキサノールを加える。これを約３．５時間還流して過熱する。約３ｍＬの水を採集する。
反応混合物を冷凍庫に１時間静置した後で沈殿が生じる。得られた混合物を吸引ろ過する。１３．２ｇの固形物を採集する（融点１０５℃）。これを（別の調製物から得た１０．４ｇの生成物と合わせて）約１５０ｍＬの絶対アルコールで再結晶化する。１２．５ｇのオフホワイトの固形物が得られる；融点１２６−１２７℃。ＨＰＬＣで純度９９．８％であることが示される。
元素分析は以下のとおりである：
実験値：Ｃ，６４．４４；Ｈ，５．８１；Ｎ，１３．７０；Ｓ，１５．５５
理論値：Ｃ，６４．６６；Ｈ，５．９３；Ｎ，１３．７１；Ｓ，１５．７１
ＩＲ、炭素ＮＭＲおよびプロトンＮＭＲは全て所望の構造を支持した。
【０１０３】
４−ニトロ−１，３−ジメチルイミダゾール−２−チオンの調製
文献にはこの化合物６の調製についての報告はないが、既知の反応条件を用いることによって合理的な収量で所望の生成物が得られる。この硝化のための出発物質、化合物５は、既知の反応経路および条件を用い市販の材料から２工程で容易に調製できる。
【０１０４】
【化１９】

【０１０５】
実施例２
ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ発現に対するＭＭＩ誘導体の作用のゲルシフトアッセイによる評価
材料：
精製ウシＴＳＨはＮＩＨプログラム（ＮＩＤＤＫ−ｂＴＳＨ−Ｉ−１、３０Ｕ／ｍｇ）から得るか、または以前に記載（L.D. Kohn & R.J. Winand, J. Biol. Chem. 250:6503-6508(1975)）されたように調製した。インスリン、ヒドロコーチゾン、ヒトトランスフェリン、ソマトスタチン、およびグリシル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−リジンアセテートはシグマ＝ケミカル社（Sigma Chemical Co. St. Louis, MO.）から得た。
【０１０６】
細胞培養：
ＦＲＴＬ−５ラット甲状腺細胞（L.D. Kohn et al., 米国特許4608341号（1986）；Ambesi-Impiombato ES., 米国特許4608341号（1986））を下記のように増殖させる。これらの細胞はＴＳＨの非存在下では分裂せず、にもかかわらずＴＳＨの非存在下で長期間生存する。それらのダブリングタイムは約３６±６時間で、さらに、５．０％血清を含みＴＳＨを含まない培養液（５Ｈ）で６日培養後、１ｘ１０^-10mol／ＬのＴＳＨは、ヨウ化物の取り込みを８−１０倍に、チミジンの取り込みを１０倍増大させた。細胞は、ほとんどの実験で５代から２５代の継代の間はニ倍体で、クーン（Coon）の改良Ｆ１２培養液で日常的に増殖させた。前記改良培養液には以下が補充されている：５％仔牛血清、１mmol／Ｌの非必須アミノ酸（GIBCO）および６種のホルモンの混合物（６Ｈ培養液）：ＴＳＨ（１ｘ１０^-10Ｍ）、インスリン（１０μｇ）、ヒドロコーチゾン０．４ｎｇ／ｍｌ、ヒトトランスフェリン（５μｇ／ｍｌ）、ソマトスタチン（１０ｎｇ／ｍｌ）およびグリシル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−リジンアセテート（１０ｎｇ／ｍｌ）（L.D. Kohn et al., 米国特許4609622号（1986）；E.S. Ambesi-Impiombato, 米国特許4608341号（1986））。それらを７−１０日毎に継代し、２または３日毎に新鮮な培養液を与えた。個々の実験では、細胞を６Ｈ培養液で細胞同士がほぼ接触する細胞密度まで増殖させ、続いていくつかの実験では５％または０．２％の血清を含むがＴＳＨを含まない培養液（５Ｈ）、ＴＳＨおよびインスリンを含まない培養液（４Ｈ）、ＴＳＨもインスリンもヒドロコーチゾンも含まない培養液（３Ｈ）に使用の４−７日前に移した。
【０１０７】
細胞抽出物：
細胞は５％仔牛血清を含む６Ｈ培養液で７０−８０％の細胞密度で６−７日間増殖させ、続いて、５％仔牛血清を含む５Ｈ培養液に移した。ＴＳＨ（１ｘ１０^-10Ｍ）、ガンマ−インターフェロン（１００Ｕ／ｍｌ）、ＭＭＩ（５ｍＭ）、および種々の濃度のＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオン（０．０００１から１０ｍＭ）を２４−４８時間の間に適切なときに添加した。続いて細胞を採集し、文献（J. Dignam et al., Methods in Enzymology 101:582-598(1983)）の方法を改変して抽出物を作製した。簡単に記せば、冷燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、細胞をかきとって採集し、続いて遠心沈殿し、冷ＰＢＳで洗浄し再度遠心沈殿した。この沈殿物をディグナム（Dignam）緩衝液Ｃ（２０ｍMヘペス緩衝液（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．４２ＭＮａＣｌ、２５％グリセロール、０．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１μｇ／Ｌロイペプチン、１μｇ／Ｌペプスタチン）に再懸濁させた。最終ＮａＣｌ濃度を、細胞沈殿物の容積を基準にして０．４２Ｍに調節し、細胞を凍結融解を繰り返して溶解させた。続いて抽出物を１００００ｘｇで４℃で２０分遠心した。上清を回収して部分標本をとり、−７０℃で保存した。
【０１０８】
ゲル移動度シフトアッセイ：
結合反応は２０μｌの容積で室温で実施した。典型的な反応混合物は、１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．９）、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および５％グリセロール中の１．５fmolの³²ＰＤＮＡ、３μｇの細胞抽出物、１から３μgのポリ（ｄＩ−ｄＣ）を含んでいた。保温後、反応混合物を４％アクリルアミドゲルで９０−１２０分、１６０Ｖで０．５ｘＴＢＥ中で電気泳動に付し（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed. Cold Spring Harbor Press, NY, 2:11.23-11.44(1989)）、続いて乾燥させオートラジオグラフを実施した。プローブは、製造元の指示にしたがい［α³²Ｐ］デオキシＣＰＴでクレノウ酵素（インビトロ標識キット、Amersham）によって標識するか、またはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用い［γ³²Ｐ］ＡＴＰによって標識した。続いて、Ｇ−５０カラム（５プライム−＞３プライム）または８％ポリアクリルアミドゲルのどちらかで標識プローブを精製した。
【０１０９】
ＩＩ型のゲルシフト実験を実施するための細胞抽出物は、γ−インターフェロン処理（通常は１００Ｕ／ｍｌのインターフェロンで２４から４８時間）細胞から抽出物を得る点を除いて、正確にＩ型実験の場合にしたがって調製した（Dignam et al., 上掲書、582-598(1983); C. Giuliani et al., J. Biol. Chem. 270:11453-11462(1995); M. Saji et al., J. Biol. Chem. 272:20096-20107(1997); V. Montani et al., Endocrinology 139:280-289(1998a); V. Montani et al., Endocrinology 139:290-302(1998b)）。同様に、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は同じように実施した。ＥＭＳＡに用いるオリゴヌクレオチドは合成するか（Operon Technologies, Inc）、またはキメラＨＬＡ−ＤＲα−ＣＡＴ構築物（Montani et al., 1998a, b）の制限酵素による処理に続いてＱＩＡＥＸ（Qiagen, Chatsworth, CA）もしくはジェットソーブ（Jet Sorb, Genomed）を用いて２％アガロースゲルで精製した。このオリゴヌクレオチドを仔牛の腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ−³²Ｐ］ｄＣＴＰまたは［γ−³²Ｐ］ＡＴＰで標識し、続いて８％の非変性ポリアクリルアミドゲルで精製した（C. Giuliani et al., 上掲書、11453-11462(1995); M. Saji et al., 上掲書、20096-20107(1997); J. Sambrook et al., 上掲書、2:11.23-11.44(1989); V. Montani et al., 上掲書、280-289(1998a), 290-302(1998b)）。
【０１１０】
ＩＩ型のＥＭＳＡの場合の結合反応は同様に同じ条件を用いた。反応は２０μlの容積で３０分室温で実施した。反応混合物は、１０ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．９）、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡおよび５％グリセロール中の１．５fmolの［³²Ｐ］ＤＮＡ、３μｇの細胞抽出物、１．５から３μgのポリ（ｄＩ−ｄＣ）を含んでいた。表示がある場合は、非標識の二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドを競合物として結合反応物に添加し、標識ＤＮＡを添加する前に抽出物とともに室温で２０分保温した。同様に、抗血清を用いる実験では、上記の工程の前に、抗血清または正常ウサギ血清を含む同じ緩衝液中で室温で２０分抽出物を保温した。保温の後で、反応混合物を０．５ｘのＴＢＥ中で１．５から２時間、室温で１６０Ｖで３．５または５％の非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を実施した。別に記載がなければゲルを乾燥させ、−８０℃でオートラジオグラフを実施した。
【０１１１】
他の方法：
タンパク質濃度はブラッドフォード法（Bio-Rad）で測定し、標準物質は再結晶ウシ血清アルブミンであった。ＤＮＡを調製し、ＣｓＣｌ濃度勾配遠心沈殿によって精製した（L.G. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, NY, pp93-98(1986)）。全ての構築物の配列は標準的な方法（F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467(1977)）で確認した。数値は、記載の実験の平均値±ＳＥである。実験値間の有意差は平方偏差のニ方向分析によって決定し、全実験データを考察するとき、Ｐ値が＜０．０５である場合は有意である。
【０１１２】
ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ遺伝子のＭＭＩ感受性エレメント
ＭＨＣクラスＩ：
ＭＭＩに応答する調節配列がブタＭＨＣクラスＩ遺伝子、ＰＤＩのプロモーターで特定された。２つの調節ドメインがＰＤ１遺伝子の５’フランキング領域で特定された。下流の調節ドメインは、転写開始部位から約−２０３から−１ｂｐの間に存在する（図１Ｂ）。この領域は、インターフェロン応答エレメントおよび主要エンハンサー（エンハンサーＡ）の他に環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）を含む。ゲル移動度シフトアッセイを用いた実験では、ＭＭＩ−誘発またはＭＭＩ−改変タンパク質はこの領域と相互作用し、転写開始、特にＹボックスタンパク質を調節することができることが示された（Saji et al., 上掲書、20096-20107(1997); Singer et al.，米国特許5556754号（1996年9月17日））。別の複合調節領域（サイレンサーおよびエンハンサー活性のオーバーラップを示す）は、プロモーターの上流−７６９から−６７３の間にマッピングされた（J.D. Weissman & D.S. Singer, Mol. Cell. Biol. 11:4217-4227(1991)）。この上流調節ドメインのエンハンサーおよびサイレンサー配列は、クラスＩ遺伝子の組織特異的発現および組織特異的レベルと連関し（J.D. Weissman & D.S. Singer, 上掲書、4217-4227(1991)）、Ｓｏｘ−４を必要とする（D.S. Singer et al., 米国特許5556754号(1996)）。
【０１１３】
Sajiら（J. Clin. Endocrinol. Metab. 75:871-878(1992b)）は、ＭＭＩで処理したラットのＦＲＴＬ−５細胞でのＭＨＣクラスＩ遺伝子の発現低下を示した。この実験はまた、ＭＨＣクラスＩの発現におけるＭＭＩの作用は転写レベルに存在することを示した。ＭＭＩは下流の調節ドメインとの正常な複合体の出現を増加させ、上流の調節ドメインのサイレンサー複合体の出現を減少させる。これらの変化は構成的制御（上流調節ドメイン）の低下、および液性制御（下流調節ドメイン）の優勢をもたらす。ＭＭＩ作用は、下流調節ドメインに作用するＴＳＨに対して累積的である（Saji et al., 上掲書、20096-20107(1997); Singer et al.，米国特許5556754号（1996））。
【０１１４】
ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞系は、したがってＭＭＩ作用に必要な調節ＤＮＡ配列エレメントおよびトランス作動性因子を特定するために優れた系である。ＰＤ１ゲル移動度シフトアッセイは、ＰＤ１遺伝子の５’フランキング領域および、γ−インターフェロン処理もしくは未処理ＦＲＴＬ−５細胞、並びに、ＭＭＩおよびＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオン処理ＦＲＴＬ−５細胞の細胞抽出物を用いて実施した（表１）。
【０１１５】
図１Ａは、ＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンゲルシフト活性のための領域をマッピングするために用いた１４０領域オリゴヌクレオチドのサイレンサーおよびエンハンサー領域を示している。対応するサイレンサーおよびエンハンサー領域は矢印で記されている。この１４０フラグメントは、ＰＤ１ＭＨＣクラスＩ遺伝子のＰＤ１プロモーターに由来する（D.S. Singer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1403-1407(1982)）。図２は、図１に記した放射能標識１４０フラグメントを用いたゲルシフトを示す。この図はＭＭＩによって調節されるサイレンサー複合体を示している。
【０１１６】
【表１】

【０１１７】
【表２】

【０１１８】
レーン２は、サイレンサー領域と細胞抽出物との間で形成された複合体を示す：前記細胞抽出物は、５Ｈ培養液（ＴＳＨを含まない）プラス５％血清の存在下で維持したＦＲＬＴ−５ラット甲状腺細胞から抽出された。５Ｈ培養液で維持した細胞から抽出物を調製する前に５ｍＭのＭＭＩを４８時間細胞に添加することによって生じる影響は、図２のレーン１に示されている。１ｍＭ濃度の代表的なＭＭＩ誘導体を５Ｈ培養液で維持した細胞に抽出前に添加することによって生じる影響は、図２のレーン３から８に示されている。番号を付したこれら代表的な化合物の構造および名称は表１に示されている。ＭＭＩまたはその誘導体はサイレンサー複合体を減少させる。このような減少は、オートラジオグラフィーのデンシトメーターによる検査およびバス（Bas）画像化装置１５００（例）によるホスホイメージングによって定量できる。定量は、コントロールに対する減少を基準にし、変化のないより速く移動する複合体によって標準化する。
以下の表２は表１に記載した化合物を用いた実験結果の要約を示しているが、ＥＭＳＡでの種々の濃度の活性化合物を加えて改変されている。化合物１０が最も効果的である。
【０１１９】
【表３】

【０１２０】
図３は、ＰＤ１プロモーターの下流領域の配列を示す。エンハンサーＡ（−１８０から−１７０ｂｐ）、インターフェロン応答エレメント（ＩＲＥ；−１６１から−１５０ｂｐ）およびｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ；−１０７から−１００ｂｐ）の位置が示されている。下流サイレンサーは、−１２７から−８０ｂｐの間に存在する（Saji et al., 上掲書、20096-20107(1997)）。１２７ｂｐプローブ（−１２５から＋１ｂｐ）を用いたとき、ＭＭＩ（レーン４）またはＴＳＨ（レーン１０）は迅速に移動するタンパク質／ＤＮＡ複合体の形成を誘発する（図４）。この複合体は、５Ｈ細胞の処理後２４から４８時間で極めて明瞭である。ＭＭＩ誘導体はまた、図４で化合物８（レーン１から３）について示すようにこの複合体を増加させることができる。もっとも測定に適した時間は２４から４８時間で（図４）、複合体は、上記に記載したようにデンシトメーターまたはホスホイメージャーを用いてコントロール（レーン７から９）と比較することによって定量することができる。この場合には、コントロール（１に設定）に対する増加が、５ｍＭのＭＭＩによって誘発される最大増加（任意に１０と設定）に対して任意の単位で測定される。表１の全ての化合物を用いた結果（抽出物調製の４８時間前に各々が細胞に種々の濃度で添加される）は表３に要約されている。ここでもまた、異なる細胞バッチに由来する抽出物を用いたいくつかの実験例を評価したとき、化合物１０は明らかにもっとも有効である。
【０１２１】
【表４】

【０１２２】
ＭＨＣクラスＩＩ
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子は異種ニ量体膜貫通糖タンパク質で、これらは、６番目染色体のＨＬＡ−Ｄ領域によってコードされ、免疫機能で中心的役割を果たす（R.M. German et al., Ann. Rev. Immunol. 4:281-315(1986); R.S. Schwartz & S.K. Datta, Autoimmunity and Autoimmune Dieases, in W.E. Paul (ed), Fundamental Immunology, Raven Press, NY, pp819-866(1989); C. Benoist et al., Ann. Rev. Immunol. 8:681-715(1990); L.H. Glimcher et al., Ann. Rev. Immunol. 10:13-49(1992); JP-Y Ting et al., Curr. Opin. Immunol. 5:8-16(1993)）。クラスＩＩ抗原は、通常は抗原提示細胞（例えばＢ細胞、マクロファージまたは樹状細胞）上で発現される。クラスII分子は、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球に抗原性ペプチドを提示し、Ｔ細胞活性化を惹起する（R.M. German, 上掲書、(1986); R.S. Schwartz et al., 上掲書(1989); C. Benoist et al., 上掲書(1990); L.H. Glimcher et al., 上掲書(1992); JP-Y Ting et al., 上掲書(1993)）。クラスＩＩの発現は通常は上皮細胞（例えば甲状腺細胞、滑膜細胞または小島細胞）では明瞭ではないが、甲状腺細胞、滑膜細胞または小島細胞上でのクラスＩＩの異所性発現は、それぞれ甲状腺疾患、慢性関節炎、および糖尿病にそれぞれ付随している（G.F. Bottazzo et al., Lancet 2:1115-1119(1983); G.F. Bottazzo et al., N. Engl. J. Med. 313:353-360(1985); I. Todd et al., Ann. NY Acad. Sci. 475:241-249(1986); R.M. German et al., 上掲書(1986); G.R. Burmester et al., J. Clin. Invest. 80:594-605(1987); L.A. Piccinini et al., Clin. Endocrinol. (Oxf)26:253-272(1987); R.S. Schwartz et al., 上掲書(1989); C. Benoist et al., 上掲書(1990); L.H. Glimcher et al., 上掲書(1992); JP-Y. Ting et al., 上掲書(1993)）。クラスＩＩの異所性発現は、細胞を抗原提示細胞にしてＴ細胞と相互作用させ、免疫反応を開始させるのではないかという仮説が浮上した（R.S. Schwartz et al., 上掲書(1989); A.P. Weetman et al., Endocr. Rev. 15:788-830(1994)）。にもかかわらず、これは、組織に浸潤したリンパ球によって産生された例えばγ−ＩＦＮのようなサイトカインに対する二次反応であったかもしれないし、またその組織自体のより初期の傷害の結果であった可能性がある。より重要なことには、クラスＩＩが自己免疫性甲状腺疾患の開始に重要であるという直接的な証拠はほとんど存在しなかった（A.P. Weetman et al., 上掲書(1994)）。しかしながら、最近の研究によってこの仮説はいっそう有力になった（N. Shimojo er al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11074-11079(1996)）。
【０１２３】
自己免疫性甲状腺疾患（ＡＴＤ）の１形態はグレーブズ病で、この疾患では、自己抗体はＴＳＨＲに対して発生し、ＴＳＨの作用に類似することにより甲状腺機能亢進を誘発する。ＴＳＨＲの細胞外ドメインで動物を免疫することによってグレーブズ病モデルを作製しようとする多くの試みが失敗に終ったが（例えば以下を参照されたい：G.S. Seetharamaiah et al., Autoimmunity 14:315-320(1993); Costagliola et al., J. Mol. Endocrinol. 13:11-21(1994); Costagliola et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 199:1027-1034(1994); Costagliola et al., Endocrinology 135:2150-2159(1994); A. Marion et al., Cell Immunol. 158:329-341(1994); N.M. Wagle et al., Autoimmunity 18:103-108(1994)）、一方、ヒトのＴＳＨＲおよびＭＨＣクラスＩＩ分子（どちらか一方ではなく）をトランスフェクトした線維芽細胞でマウスを免疫することによって、以下のようなグレーブズ病の主要な液性および組織学的特性を有するＡＴＤが誘発された（N. Schimojo et al., 上掲書11074-11079(1996)：すなわち、刺激性ＴＳＨＲ抗体（ＴＳＨＲＡｂ）、刺激性ＴＳＨＲＡｂとは異なるサイロトロピン結合抑制免疫グロブリン（ＴＢＩＩ）、甲状腺ホルモンレベルの増加、甲状腺拡張、甲状腺細胞の過剰充実性である。これらの結果は、甲状腺細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の異所性発現は、甲状腺を刺激する機能的なＴＳＨＲＡｂの誘発をもたらすことを示している。
【０１２４】
それらは、異所性クラスＩＩ発現の結果として、甲状腺細胞は抗原提示能力を獲得し、動物に通常存在するＴおよびＢ細胞を活性化し、それによって、正常な免疫寛容を破壊することを示唆している。同様なことが、類リューマチ疾患、糖尿病、並びに自己免疫および異所性ＭＨＣクラスＩＩ発現に付随する多数の他の自己免疫疾患の発達に関係している。甲状腺細胞における異所性クラスＩＩ発現の基礎を理解することは、したがって、自己免疫性甲状腺疾患だけでなく他の多くの自己免疫疾患の病理学の理解にも潜在的に重要である。異所性ＭＨＣクラスＩＩ発現を抑制する、したがって自己免疫状態を抑制する薬剤の開発は重要である。このような薬剤はさらにＭＨＣクラスＩも抑制するかもしれない。
【０１２５】
ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞でクラスＩＩ抗原の発現を誘発し、さらにＡＴＤで見られるヒトの甲状腺細胞での変化を模倣するγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の能力は十分に記載されている（I. Todd et al., 上掲書(1985); M. Platzer et al., Endocrinology 121:2087-2092(1987); T. Misaki et al., Endocrinology 123:2849-2855(1988); M. Zakarija et al., Mol. Cell. Endocrinol. 58:329-336(1988)）。ラットのＦＲＴＬ−５甲状腺細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ遺伝子の発現が、γ−ＩＦＮ誘発異常発現のために重要なエレメントおよび因子を特定するためにＦＲＴＬ−５甲状腺細胞モデルで研究され（V. Montani et al., 上掲書(1998a, b)）、したがって、これは、ＡＴＤおよび他の免疫疾患で重要なエレメントおよび因子を特定するために合理的なモデルである。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子に結合させた、−１７６から＋４５ｂｐのＨＬＡ−ＤＲ５’フランキング領域構築物を用いて、リンパ球とは異なり甲状腺細胞にはクラスＩＩ遺伝子の基礎発現は存在しないが、いくつかの免疫細胞と同様にγ−ＩＦＮによって発現が誘発されることが示された（V. Montani et al., 上掲書(1998a,b)）。
【０１２６】
ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞における異所性ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子発現を誘発するγ−ＩＦＮの能力は、ＭＨＣクラスＩＩを通常発現する免疫系の抗原提示細胞のように、その５’フランキング領域（−１３７から−６５ｂｐ）上に高度に保存されたＳ、Ｘ₁、Ｘ₂、およびＹボックスを必要とする（C. Benoist et al., 上掲書(1990); L.H. Glimcher et al., 上掲書(1992); JP-Y. Ting et al., 上掲書(1993); W. Reitg et al., Immunology 193:248-253(1995); V. Montani et al., 上掲書(1998a,b)）。標識プローブとして−１７６または−１３７から＋４５ｂｐのＨＬＡ−ＤＲ５’フランキング領域を用いゲルシフトアッセイによって、γ−ＩＦＮ未処理ＦＲＴＬ−５細胞抽出物との主要なタンパク質／ＤＮＡ複合体およびマイナーなより速く移動する複合体の形成が観察された（V. Montani et al., 上掲書(1998a,b)）。γ−ＩＦＮによって誘発される異所性発現は、ＣＢＰ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質のコアクティベーター）を含む特異的で新規なタンパク質／ＤＮＡ複合体の形成の増加に付随する（V. Montani et al., 上掲書(1998a,b)）。
【０１２７】
免疫細胞におけるクラスＩＩ遺伝子の発現を調節することが知られている２つの因子は、クラスＩＩトランスアクティベーター（ＣＩＩＴＡ）およびＹボックス結合タンパク質である（JP-Y. Ting et al., 上掲書(1993); W. Reith et al., 上掲書(1995)）。ＣＩＩＴＡは非ＤＮＡ結合性タンパク質トランスアクティベーターで、免疫細胞において構成的および誘発性ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子発現を制御する分子スイッチとして機能する。ＣＩＩＴＡ発現はγ−ＩＦＮによって誘発され、その活性に必要であると考えられている（V. Steimle et al., Science 265:106-109(1994); W. Reith et al., 上掲書(1995); C.H. Chang et al., J. Exp. Med. 180:1367-1374(1996); B. Mach et al., Ann. Rev. Immunol. 14:301-331(1996)）。ヒトのＹボックスタンパク質、ＹＢ−１は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子のＹボックス（逆向きにされたＣＣＡＡＴボックス）に結合するというその能力によってクローニングされ（D.K. Didier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7322-7326(1988)）、ヒトの神経膠芽腫細胞でのＨＬＡ−ＤＲ遺伝子の発現を抑制することが示された（JP-Y Ting et al., J. Exp. Med. 179:1605-1611(1944); G.H. MacDonald et al., J. Biol. Chem. 270:3527-3533(1995)）。ＣＩＩＴＡはγ−ＩＦＮによって誘発される複合体の形成を誘発することができ、さらに、ＦＲＴＬ−５細胞における異所性クラスＩＩ遺伝子発現に付随し（V. Montani et al., 上掲書(1978b)）、ＦＲＴＬ−５細胞におけるＹボックスタンパク質の過剰発現はこの複合体の形成を抑制する（V. Montani et al., 上掲書(1978b)）。したがって、この複合体は、ＡＴＤに付随する異所性クラスＩＩ発現に必要で、さらに他の自己免疫疾患における異所性クラスＩＩ発現と関係があると考えることは合理的であろう。さらにまた、これらのデータは、クラスＩ遺伝子と同様にクラスＩＩの負の調節は一般的な転写因子、Ｙボックスタンパク質を必要とするという結論を支持し、クラスＩ遺伝子と同様に一般的な転写因子によるクラスＩＩの協調的な負の制御は、甲状腺細胞の増殖および機能のホルモン誘発増加時の自己寛容を維持するという以前の仮説（L.D. Kohn et al., 上掲書(1997); M. Saji et al., 上掲書(1998)）と一致する。
【０１２８】
メチマゾール（ＭＭＩ）はグレーブズ病の治療に有効な薬剤で、ラットまたはマウスの実験的甲状腺炎を予防する（D.S. Cooper, N. Engl. J. Med. 311:1353-1362(1984); T.F. Davies et al., J. Clin. Invest. 73:397-404(1984); W. Reinhardt et al., Endocrinol. Invest. 12:559-563(1989)）。甲状腺細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ遺伝子発現に対するメチマゾールの作用は、しかしながら、矛盾に満ちている。したがって、グレーブズ病の患者でＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現を抑制する抗甲状腺薬の能力に関しては相違する報告が存在し（J.C. Carel et al., in The Thyroid and Autoimmunity, Drexhage and Weirsinga (eds), Excerpta Medica, Amsterdam, pp.145-147(1986); J. Aguayo et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 66:903-908(1988); T.F. Davies et al., Clin. Endocrinol. (Oxf)31:125-135(1989)）、外科手術前にＭＭＩで処置された難治性グレーブズ病患者では免疫学的パラメーターに関しては用量依存性が認められないことが懸念された（R. Paschke et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 80:2470-2474(1995)）。にもかかわらず、γ−ＩＦＮまたはＣＩＩＴＡ誘発複合体形成は、ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子発現の増加と同様に時間と濃度の関数としてＦＲＴＬ−５甲状腺細胞でメチマゾールによって抑制される（V. Montani et al., 上掲書(1998a)）。したがって、ＦＲＴＬ−５細胞におけるこの複合体のＭＭＩによる抑制は、異所性ＭＨＣクラスＩＩ発現および自己免疫疾患を抑制するＭＭＩの能力のマーカーと考えることができる。自己免疫疾患におけるクラスＩＩの異所性発現およびクラスＩの異常発現の臨床的な関係性は、ヨウ化物がクラスＩＩおよびクラスＩ（これらはグレーブズ病の甲状腺で増加する）の両方の発現を抑制するという観察によって明瞭に示された（F. Schuppert et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:3622-3628(1996)）。ヨウ化物は、ＭＭＩと同様に、グレーブズ病の患者を治療するために用いることができ、グレーブズ病患者の甲状腺摘出の準備として広範囲に用いられてきた（S. Nagataki et al., Autoregulation: effects of iodide. In: L.E. Braveman, R.D. Utiger,(eds), Werner & Ingbar’s The Thyroid: a fundamental and clinical text. Lippencott-Raven, Philadelphia, 241-247(1996)）。
【０１２９】
図５は、ＨＬＡ−ＤＲの−１７６ｂｐから５'−フランキング領域のヌクレオチド配列を示している。Ｓ、Ｘ₁、Ｘ₂およびＹボックス（またはエレメント）（これらは、今日までに性状を調べられた全てのＭＨＣクラスＩＩプロモーターで保存されている）、ＨＬＡ、−ＤＲ、−ＤＱおよび−ＤＰには太線を付し、ＤＲの５'および３'末端には数値を記した。いくつかの報告（JP-Y Ting et al., 上掲書(1993); C. Benoist et al., 上掲書(1990)）にあるより限定的なＳボックスは、より広いＳボックスの上に太い点線で示した（広いＳボックスは本明細書および他の報告（A.M. Reimold et al., J. Immunol. 151:4173-4182(1993)）で用いられている）。
【０１３０】
図６は、³²Ｐ標識ＤＲα−５'フランキング領域プローブが、ＴＳＨの存在下および非存在下で維持され、さらにγ−ＩＦＮで処理または処理されていないＦＲＴＬ−５細胞の抽出物とタンパク質／ＤＮＡ複合体を形成する能力について電気泳動移動度シフト分析で調べたものを示している。プローブは、−１３７から＋４５ｂｐのＤＲ−ＣＡＴキメラ（A.M. Reimold et al., 上掲書(1993); V. Montai et al., 上掲書(1998a,b)）の制限酵素処理によって切り出し、図の下方に模式的に示した。抽出物は、細胞同士がほぼ集密状態(confluency)までＴＳＨ中で増殖させるか、または５Ｈ培養液で６日間維持したＦＲＴＬ−５ラット甲状腺細胞から得た。各々２組の培養を、実験の終了前の最後の４８時間１００Ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮで処理した。各組の細胞から調製した細胞抽出物を、ＤＲα ５'−フランキング領域の−１３７ｂｐを含む³²Ｐ標識プローブと保温し、上記のとおりにＥＭＳＡを実施した。この実験では、オートラジオグラムは−７０℃で一晩露光させた。
【０１３１】
図７は、³²Ｐ標識ＤＲα５'−フランキング領域プローブとのタンパク質／ＤＮＡ複合体形成を増加させるγ−ＩＦＮの能力に対するＭＭＩの影響を示している。放射能標識プローブは図６で使用し模式的に示したものと同じである。前記プローブは、ＤＲα−ＣＡＴキメラの−１３７ｂｐから＋４５ｂｐの５'−フランキング領域を含んでいる。抽出物は、ＴＳＨ中でコンフルエンシーまで増殖させ、５Ｈ培養液で６日間維持し、続いて１００Ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮ、５ｍＭＭＭＩまたはその両方で実験の終了前の最後の４８時間したＦＲＴＬ−５ラット甲状腺細胞から得た。上記の記載のとおり図６のように細胞抽出物を保温し、ＥＭＳＡを実施した。矢印は、図６に認められる上方および下方複合体を示している。この実験では、オートラジオグラムは−７０℃で７２時間露光させた。レーン５は、コントロール細胞の抽出物を含んでいる。ＩＦＮまたはＭＭＩで処理した細胞抽出物はパネルの上に記載されている。細胞抽出物がＴＳＨ中で集密状態まで増殖させ、続いて１００Ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮで実験の終了前の最後の４８時間処理したＦＲＴＬ−５ラット甲状腺細胞から調製された場合は、同じ結果が得られた。
【０１３２】
ＭＭＩの場合（図７）と同じプロトコルを用いたとき（ただしオートラジオグラムの露光時間は異なる）、種々の活性化合物（ＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオン）は、図８で示すように、細胞上でのクラスＩＩのインターフェロン誘発（異所性）発現または構成的発現に連関してクラスＩＩ複合体を減少させることが示された。化合物２、７、８はＭＭＩよりも極めて有効なサプレッサーである（それぞれ図８Ａのレーン４および図８Ｂのレーンレーン２および４に対して図８Ａのレーン２および図８Ｂのレーン３）。各々の化合物についてのＩＦＮ誘発複合体における平均的減少の定量化は表４に示す。
総合すれば、種々の誘導体の異所性クラスＩＩ発現に対する影響（γ−ＩＦＮによって増加する複合体形成の減少により測定される）は、化合物によって異なり、定量が可能である。化合物１０は、上記に記載したクラスＩのシフトの場合と同じようにもっとも有効である。
【０１３３】
【表５】

【０１３４】
実施例３
一過性トランスフェクション分析およびＣＡＴアッセイによる、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩのプロモーター活性に対するＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンの影響の評価
プラスミドの構築：
ｐＳＶ３ＣＡＴのマルチクローニング部位に挿入される完全長のＰＤ１プロモーター、ＰＤ１ＣＡＴ構築物ｐＨ（−３８）は以前に記載された（R. Erhlich et al., Immunogenetics 30:18-26(1989)）。ｐＳＶ３ＣＡＴのマルチクローニング部位に挿入される完全長のＰＤ１プロモーターの連続的欠損変異体もまた以前に報告された（D.S. Singer et al., 上掲書(1991); Saji et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1944-1948(1992a); Saji et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75:871-878(1992b)）。簡単に記せば、ＰＤ１遺伝子の上流レギュレーター領域について入れ子式５'欠損シリーズをＢａｌ３消化によって作製した。このシリーズの５'末端は−１０１２塩基対から−６８塩基対の範囲であるが、全ては共通の３'境界部分を＋１５塩基対に含んでいた。この欠損シリーズをまたｐＳＶ３ＣＡＴレポーター構築物でクローニングし、プロモーターの活性を評価した（J.D. Weisman et al., 上掲書(1991); J. Maguire et al., Mol. Cell. Biol. 12:3078-3086(1992)）。クラスＩプロモーター活性に対するＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンの作用をスクリーニングするために、３つのクローン、ｐ（−１１００）ＣＡＴ、ｐ（−２０３）ＣＡＴおよびｐ（−１２７）ＣＡＴを一般的に用いたが、ｐ（−２０３）ＣＡＴが好ましい。数字は、ＰＤ１プロモーターの５´フランキング領域中のもっとも５´側の残基を示す。
【０１３５】
ＨＬＡ−ＤＲプロモーター構築物の構築もそれらの性状と同様に報告された（A.M. Reimold et al., 上掲書(1993)）。さらに別のＣＡＴ構築物を、鋳型として５'フランキング領域の−１７６から＋４５を含むＨＬＡ−ＤＲα−ＣＡＴキメラおよび種々のプライマーを用いてＰＣＲによって構築した（V. Montani et al., 上掲書(1998a,b)）。例えば、ＨＬＡ−ＤＲαの５'−フランキング領域の−３８から＋４５ｂｐを含むプラスミドを以下のプライマーを用いて構築した：５'SphＩ制限部位を有する５'プライマー、５'−ＡＣＡＴＧＣＡＴＧＣＧＧＴＣＡＧＡＣＴＣＴＡＴＴＡＣＡＣＣＣＣＡＣ−３'およびXbaＩ制限部位を有する３'プライマー、５'−ＣＴＡＧＴＣＴＡＧＴＴＴＧＧＧＡＧＴＣＡＧＴＡＧＡＧＣＴＣＧ−３'（V. Montani et al., 上掲書(1998a,b)）。ＰＣＲ生成物は、フェノール−クロロホルム抽出で精製し、XbaＩおよびSphＩで消化し、２％アガロースゲルでジェットソーブ（Jet Sorb, Genomed, Frederick, MD）を用いて精製し、仔牛腸アルカリホスファターゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）で脱燐酸し、ＣＡＴ−ベーシックベクター（Promega, Madison, WI）のSphＩおよびXbaＩ部位にＤＮＡ連結キット（Takara Biochemical, Inc., Berkley, CA）を用いて記載にしたがい再連結した（A.M. Reimold et al., 上掲書(1993); V. Montani et al., 上掲書(1998a,b)）。
【０１３６】
サイログロブリン（ＴＧ）−ＣＡＴ構築物、ｐＴＧ−６８８−ＣＡＴは、先に述べたｐＴＧ−ＣＡＴキメラ（H. Shimura et al., Mol. Endocrinol. 8:1049-1069(1994)）から得たＴＧプロモーター挿入物を、クラスＩＩプロモーター挿入物を切り出したＨＬＡ−ＤＲα−ＣＡＴキメラに代入することによって得られた。ＣＡＴレポーター遺伝子を含むが挿入物を含まないベクターはコントロールである。
【０１３７】
細胞培養：
ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞（Interthyr Research Foundation, Baltimore, MD;ATCC CRL8305）は、先に述べたゲルシフト実験で用いたものと同じサブクローン（Ｆ１）であった。それらを以下の培養液で増殖させた：クーンの改変Ｆ１２培溶液で以下を含む：５％の熱処理したマイコプラズマの存在しない仔牛血清、１ｍＭの非必須アミノ酸、および以下を含有する６ホルモン混合物（６Ｈ）（１ｘ１０^-10ＭのＴＳＨ、１０μｇ／ｍｌのインスリン、０．４ｎｇ／ｍｌのコーチゾル、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、１０ｎｇ／ｍｌのグリシル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−リジンアセテート、および１０ｎｇ／ｍｌのソマトスタチン）。細胞はニ倍体で５代から２５代継代のものであった。新しい培養液を２から３日毎に加え、細胞は７−１０日毎に継代した。いくつかの実験では、細胞同士がほぼ接触するまで６Ｈ培養液中で増殖させ、続いて実験開始前の５−８日間ＴＳＨを含まない５Ｈ培養液で維持した。
【０１３８】
トランスフェクションとＣＡＴ分析：
ＣＡＴ活性によって示されるＭＨＣクラスＩプロモーター構築物のプロモーター活性を測定するために、２つの方法を用いた。１つの方法では、ラットのＦＲＴＬ−５甲状腺細胞に以前に報告された電気穿孔によってトランスフェクションを施した（M. Saji et al., 上掲書(1992b); C. Giuliani et al., 上掲書(1995); M, Saji et al., 上掲書(1997)）。簡単に記せば、ＦＲＴＬ−５細胞を８０％の細胞密度に増殖させ、５％仔牛血清を含む新しい６Ｈ培養液に１２時間静置し、採集して洗浄し、０．８ｍＬの電気穿孔緩衝液（２７２ｍＭのシュクロース、７ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．４）および１ｍＭのＭｇＣｌ₂）に１．５ｘ１０⁷細胞／ｍＬで懸濁させた。２０μｇの完全長ＣＡＴ構築物を５μｇのｐＳＶＧＨとともに添加した。続いて細胞に電気パルスを与え（３３０ボルト、静電容量２５μファラッド）、平板培養し（約６ｘ１０⁶細胞／平板）、５％仔牛血清含有６Ｈ培養液で１２時間培養した。この時点で細胞を以下の培養液に静置した：５％仔牛血清添加５Ｈ培養液（コントロール）、５％仔牛血清および５ｍＭＭＭＩまたは異なる濃度の活性化合物（ＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオン）添加５Ｈ培養液、または５％仔牛血清および５ｍＭＭＭＩまたは異なる濃度の活性化合物添加６Ｈ培養液。４８時間後それらを採集した。細胞生存度はほぼ８０％であった。培養液をｈＧＨ放射能免疫アッセイのために採取し、トランスフェクション効率をモニターし（Nichols Institute, San Juan Capistrano, CA）、細胞はＣＡＴアッセイのために採集した。前記アッセイでは２０−５０μｇの細胞溶解物を最終容積１３０μｌで用いた。保温は３７℃で２から４時間実施した。アセチル化クロラムフェニコールは薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で分離し、ＴＬＣプレートの陽性スポットを切り出し、シンチレーション測定装置で定量した。ＣＡＴ活性は、データーを比較する前に、ＧＨ活性および／または細胞タンパク質について標準化した。
【０１３９】
また別に、一過性トランスフェクションでは同じクラスＩ−ＣＡＴキメラおよびＤＥＡＥデキストラン法を用いた（M.A. Lopata et al., Nucleic Acids Res. 12:5707-5717(1984); C. Giuliani et al., 上掲書(1995)）。集密状態まで（細胞密度８０％）細胞を６Ｈ培養液で増殖させ、１日間５Ｈ培養液にシフトさせ、ダルベッコの改変燐酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、プラスミドＤＮＡおよび２５０μｇのＤＥＡＥデキストラン（5Prime-3Prime, Inc.）を含む、５ｍＬの血清非含有５Ｈ培養液とともに１時間保温した。続いて細胞をＤＰＢＳ中の１０％ジメチルスルホキシドに３分間暴露し、ＤＰＢＳで２回洗浄し、５Ｈ培養液で２４時間培養し、続いて表示のようにＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンの存在下または非存在下でさらにもう４８時間、同じ場所で維持した。トランスフェクション効率は、上記のように、または５μｇのｐＲＳＶＬｕｃ（J.R. De Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725-737(1987)）を同時トランスフェクションすることによって決定した。
【０１４０】
ＭＨＣクラスＩＩプロモーター構築物のプロモーター活性を測定するために、ＦＲＴＬ−５細胞の一過性トランスフェクションを以下の方法の１つを用いて実施した（V. Montani et al., 上掲書(1998a, b)）。１つの方法では、ＦＲＴＬ−５細胞をほぼ８０％の細胞密度に６Ｈ培養液で培養し、採集して洗浄し、０．８５ｍＬの電気穿孔緩衝液（２７２ｍＭのシュクロース、７ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ７．４）および１ｍＭのＭｇＣｌ₂）に１．５ｘ１０⁷細胞／ｍＬで再懸濁させた。プラスミドＤＮＡ、ＣＡＴキメラ２０μｇを２μｇのｐＲＳＶ−ルシフェラーゼとともに添加した（後者はトランスフェクション効率の測定のために用いた）。細胞にパルス刺激を与え（３３０ボルト、静電容量２５μファラッド）、平板培養し（６ｘ１０⁶細胞／平板）、γ−ＩＦＮを補充または補充していない５％仔牛血清添加６Ｈ培養液で培養した。表示の時点でＣＡＴおよびルシフェラーゼアッセイのために細胞を採集した。第二の方法は以下のとおり相違する。ＦＲＴＬ−５細胞は６Ｈ培養液で８０％の細胞密度に増殖させ、続いて５％仔牛血清添加５Ｈ培養液で６日間維持した。細胞を６Ｈ培養液に１２時間戻し、上記のようにトランスフェクトし、５％仔牛血清添加６Ｈ培養液で１２時間維持した。培養液を続いて、γ−ＩＦＮ補充または非補充５％仔牛血清添加の新しい５Ｈ培養液に交換した。ＣＡＴ活性を上記のように測定し、数値は、プロメガ（Promega, Madison, WI）アッセイ系を用いて測定したルシフェラーゼ活性について標準化した。
【０１４１】
ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞におけるγ−ＩＦＮ誘発クラスＩＩ発現に対するＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体、または互変異性環状チオンの影響を調べるために、以下の方法を用いた。−１３７ｂｐまたは−１７６ｂｐＤＲα−ＣＡＴキメラの一過性トランスフェクションを記載のように実施し、トランスフェクション後１２時間から表示の時間１００Ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮで処理した。各々２組の細胞に、５ｍＭのＭＭＩ、または表示の濃度のＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンをγ−ＩＦＮと同時に添加し、４８時間後にＣＡＴ活性を測定した。細胞の生存度は全てのサンプルで約８５±５％であった。結果は、ＣＡＴ活性をルシフェラーゼ活性と細胞タンパク質の両方について修正した後、γ−ＩＦＮまたはＭＭＩが存在しないベクターコントロールとの比較で表した。全ての事例でこれらの修正は、５％未満の活性の変化を生じた。同じ結果が、ＴＳＨを含まない培養液で維持した細胞を用いるまた別のトランスフェクションプロトコルによって得られた。
【０１４２】
基礎クラスＩプロモーター活性に対するＭＭＩの影響およびＴＳＨとのその付加作用を示す代表的な例は下記に提示されている。図９では、５％仔牛血清添加５Ｈ培養液で維持したＦＲＴＬ−５細胞に、ブタのクラスＩプロモーターの５'−フランキング領域の１１００ｂｐを含むＣＡＴキメラが記載のようにトランスフェクトされた。１２時間後、培養液を新しい５Ｈ培養液に交換した。この培養液は１ｘ１０^-10ＭのＴＳＨ、５ｍＭのＭＭＩまたは両者を含むものと含まないものである。細胞は３６時間後にアッセイした。培養液中にＴＳＨまたはＭＭＩを含まないトランスフェクタントから得られた数値をコントロールとし、１００％に設定した。数値は３つの実験の平均で、Ｐ＜０．０５（＊）またはＰ＜０．０１（＊＊）の有意の増加又は減少を示している。ＭＭＩはクラスＩの基礎プロモーター活性を減少させることができ、その作用はＴＳＨ存在下でも非存在下でも細胞で測定可能であることが明らかである。
【０１４３】
第二の実験（図１０、パネルＡ）では、ブタクラスＩプロモーターの５'−欠損変異体のＣＡＴキメラのプロモーター活性に対するＭＭＩおよびＴＳＨの影響をＦＲＴＬ−５細胞で調べた。６Ｈ培養液（＋ＴＳＨ）で増殖させたＦＲＴＬ−５細胞にＰＤ１の５'−フランキング領域を含む種々の構築物を電気穿孔でトランスフェクトした。１２時間後、培養液を以下の新鮮な培養液に交換した：６Ｈ培養液（＋ＴＳＨ）、５ｍＭのＭＭＩ添加６Ｈ培養液（＋ＴＳＨ／＋ＭＭＩ）またはＴＳＨもＭＭＩも含まない５Ｈ培養液。ＣＡＴ活性は３６時間後に測定した。変換率は、ルシフェラーゼレベルおよびタンパク質について標準化した。６Ｈ培養液で維持した細胞での−１１００ｂｐ構築物の活性（第一の棒線）にコントロール値１００％を割り振った。数値は、各々２組で実施した３つの異なる実験の平均±ＳＥである。それぞれの構築物についての基礎発現レベルの相違は、それぞれの調節エレメント（それらのいくつかはパネルＢに示されている）の活性を反映している。表示の調節エレメントには以下が含まれる：（ａ）異なる組織で構成的クラスＩレベルを調節する場合に重要な上流サイレンサー／エンハンサー領域；（ｂ）血清応答エレメント；（ｃ）エンハンサーＡ；（ｄ）インターフェロン応答エレメント；（ｅ）構成的サイレンサーエレメント内にＣＲＥ類似配列を含む３８ｂｐの構成的サイレンサー（C. Giulian et al., 上掲書(1995); M. Saji et al., 上掲書(1997)）。さらに記載されるものは、（ｆ）ＣＣＡＡＴおよび（ｇ）ＴＡＴＡボックスで、これらは転写開始に重要である。これらの結果は、いずれの構築物もＭＭＩ誘導体のスクリーニングに用いることができるが、ｐ（−２０３）ＣＡＴが最良であるかもしれない。なぜならば、そのＣＡＴ活性はより容易に測定でき、さらにそのＭＭＩ抑制作用は最良であるからである。
【０１４４】
ＭＭＩの作用はまた、γ−インターフェロンで処理した細胞で容易に測定できる。別の場所で述べたように、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞でクラスＩを増加させさらにクラスＩＩ抗原の発現を誘発し、さらにＡＴＤで見られるヒト甲状腺細胞の変化を模倣することができるγ−ＩＦＮの能力は、文献によく記載されている（I. Todd et al., 上掲書(1985); M. Platzer et al., 上掲書(1987); T. Misaki et al., 上掲書(1988); M. Zakarja et al., 上掲書(1988)）。γ−ＩＦＮによって増加するクラスＩ発現またはγ−ＩＦＮ誘発クラスＩＩ異所性発現に対するＭＭＩまたはＭＭＩ誘導体の影響に関する研究は、したがってＡＴＤおよび他の免疫疾患において重要な活性を示すための合理的なモデルである。例としてｐ（−１１００）ＣＡＴ、ｐ（−２０３）ＣＡＴ、およびｐ（−１２７）ＣＡＴクラスＩキメラを用いて、クラスＩプロモーター発現を増加させるγ−ＩＦＮの能力を容易に測定でき、さらにこの作用を低下させるＭＭＩの能力も容易に測定できる（表５）。
【０１４５】
この実験では、ＦＲＴＬ−５細胞を６Ｈ培養液（ＴＳＨ添加）で集密状態まで増殖させ、続いてγ−ＩＦＮまたはＩＦＮ＋ＭＭＩで４０時間処理する前に、５Ｈ培養液（ＴＳＨ非添加）で７日間維持した。コントロール細胞は、５Ｈ培養液で同じく４０時間維持したものである。ＣＡＴ活性は上記のように測定した。γ−ＩＦＮ処理は、ＣＡＴプラスミド（ｐＳＶ０コントロールは除く）をトランスフェクトした細胞は全て有意に（Ｐ＜０．０５または０．０１）ＣＡＴ活性を増加させた。重要なことには、ＭＭＩは、全ＣＡＴプラスミド（ｐＳＶ０は除く）トランスフェクト細胞でＣＡＴ活性を増加させる（Ｐ＜０．０１）γ−ＩＦＮ処理の能力を顕著に低下させた。
【０１４６】
【表６】

【０１４７】
表６は、基礎クラスＩ活性に対するＭＭＩ、多数のＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンの影響を示している。表７は、ＩＦＮで増加したクラスＩプロモーター活性に対するＭＭＩ、多数のＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンの影響を示している。化合物１０の影響は両事例で明らかに最良で、化合物１１，７および８がそれに続く。
【０１４８】
ＣＡＴに結合させたＨＬＡ−ＤＲα−１７６ｂｐまたは−１３７ｂｐ最小プロモータークラスＩＩキメラを用いて、ＦＲＴｌ−５甲状腺細胞でのＨＬＡ−クラスＩＩ遺伝子の発現を評価した。ベクターコントロールと比較したとき、細胞がラットのリコンビナントγ−ＩＦＮで処理されなければ、ＨＬＡ−ＤＲαは一過性にトランスフェクトしたＦＲＴＬ−５甲状腺細胞で発現されない（図１１、各パネルの第一と第二の白棒および斑入り棒のセット）。ラットγ−ＩＦＮの作用は、ヒトγ−ＩＦＮでは再現されず、内因性クラスＩＩ発現の増加に付随していた（この増加は蛍光による全パートナー分析を用いたフローサイトメトリーで測定した（図１２））。したがって、γ−ＩＦＮ作用は特異的で、内因性クラスＩＩ抗原に対する影響を反映しているようである。−１７６ｂｐＤＲα−ＣＡＴキメラの−１３７−１２２−１１−９７−３８ｂｐへの漸進的５'欠損は、免疫細胞と同様にＳボックス（−１３７から−１２３ｂｐ）がいったん除去されると、γ−ＩＦＮ誘発は失われることを示した（図１１、パネルＡ）。さらにまた、免疫細胞と同様に、γ−ＩＦＮ−誘発は、Ｓボックスだけでなく活性のためにはＸ₁、Ｘ₂およびＹボックスもまた必要とする。したがって、各々のエレメントの変異は、各々γ−ＩＦＮ反応の喪失（図１１、パネルＢ、ＭＵＴＳ、ＭＵＴＸ₁、およびＭＵＴＹ）または顕著な低下を生じる。
【０１４９】
【表７】

【０１５０】
【表８】

【０１５１】
この実験では一過性トランスフェクションは、ＴＳＨを含む培養液（６Ｈ培養液）中でほぼコンフルエンシーまで増殖させたＦＲＴＬ−５細胞で実施し、トランスフェクション後に１００Ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮで２４時間処理した。結果は、ＣＡＴ活性をルシフェラーゼ活性および細胞タンパク質について修正した後、γ−ＩＦＮの非存在下でのベクターコントロール（各パネルの最初の白棒）との比較で表されている。全ての事例でこれらの修正は、５％未満の活性の変化をもたらした。結果は、３つの異なる細胞バッチで実施した３つの別々の実験の平均±ＳＤである。１つの星印（＊）は、γ−ＩＦＮで誘発されたＤＲαプロモーター活性における統計的に有意な増加（Ｐ＜０．０１）を示し、２つの星印（＊＊）は、−１７６ｂｐＤＲα最小プロモーターがＳ、Ｘ₁、Ｘ₂およびＹボックスに変異を含むときγ−ＩＦＮで誘発されたＤＲαプロモーター活性における統計的に有意な減少（Ｐ＜０．０１）が存在することを示している。同じ結果が、ＴＳＨを含まない培養液で維持された細胞を用いるまた別のプロトコルによっても得られた。図１１（上段左）は、枠で示したＳ、Ｘ１、Ｘ２およびＹボックスの位置および欠損部分を表示した５'−末端の位置と合わせて−１７６ｂｐＤＲα−ＣＡＴを模式的に示している。図の上段右には、Ｓ、Ｘ１、Ｘ２およびＹボックス内の変異が示されている。
【０１５２】
総合すれば、他の抗原提示細胞または免疫疾患に付随する異所性クラスII発現を示す細胞の場合のように、γ−ＩＦＮはＦＲＴＬ−５細胞におけるＨＬＡ−ＤＲαプロモーター発現を増加させることができ、インターフェロンの作用は、この作用のために全てのクラスII遺伝子に存在する高度に保存された同じ５'−フランキング領域エレメント、Ｓ、Ｘ１、Ｘ２およびＹを必要とする（G.F. Bottazzo et al., 上掲書(1983); I. Todd et al., 上掲書(1985); G.F. Bottazo et al., 上掲書(1986); G.R. Burmester et al., 上掲書(1987): R.S. Schwartz et al., 上掲書(1989); C. Benoist et al., 上掲書(1990); L.H. Glimcher et al., 上掲書(1992); JP-Y. Ting et al., 上掲書(1993)）。
【０１５３】
クラスＩＩ遺伝子発現を増加させるγ−ＩＦＮの能力は、−１７６ｂｐ（データーは示されていない）または−１３７ｂｐＤＲα−ＣＡＴキメラのどちらが一過性トランスフェクションに用いられたかにかかわらずその濃度に依存する。最大の効果が、各事例で１００Ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮで明瞭であった（図１３、パネルＡ）。ＭＭＩは、最大有効濃度のγ−ＩＦＮが時間の関数として−１３７ｂｐＤＲα−ＣＡＴキメラの活性を増加させる能力を阻害する。したがって、１００ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮによって誘発されるＣＡＴ活性は、ＭＭＩ添加後２４および４８時間で進行的に減少した（図１３、パネルＢ）。図１３パネルＢのＭＭＩの濃度は５ｍＭであるが、その作用はより低いＭＭＩ濃度で明瞭であり、ＭＭＩ濃度に依存していた（図１４）。
【０１５４】
これらの実験では、一過性トランスフェクションは−１３７ｂｐＤＲα−ＣＡＴキメラを用いて実施された。ＦＲＴＬ−５細胞は６Ｈ培養液でほぼコンフルエンシーに増殖させ、トランスフェクションから１２時間して開始し表示の時間１００Ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮで処理した。ＭＭＩは、γ−ＩＦＮと同時またはγ−ＩＦＮ添加後２４時間して２組の細胞に添加した。ＣＡＴ活性は、γ−ＩＦＮ添加後４８時間で測定し、結果は、ＣＡＴ活性をルシフェラーゼ活性と細胞タンパク質について修正した後、γ−ＩＦＮの非存在下でのベクターコントロールとの比較で示されている。全ての事例でこれらの修正は、５％未満の活性の変化をもたらした。結果は、３つの異なる細胞バッチで実施した３つの別々の実験の平均±ＳＤである。図１３、パネルＡでは、１つの星印（＊）は、γ−ＩＦＮで誘発されたＤＲプロモーター活性における統計的に有意な増加を示す。図１３、パネルＢでは、２つの星印（＊＊）は、メチマゾールの２４または４８時間暴露によるγ−ＩＦＮ誘発ＤＲαプロモーター活性の統計的に有意な減少を示している。図１４では、２つの星印（＊＊）は、ＭＭＩによるγ−ＩＦＮ誘発ＤＲαプロモーター活性の統計的に有意な減少を示している。同じ結果が、ＴＳＨを含まない培養液で維持された細胞を用いるまた別のプロトコルによっても得られた。
【０１５５】
【表９】

【０１５６】
γ−ＩＦＮおよびＭＭＩの両者の作用は特異的であった。したがって、どちらもコントロールベクターには影響を与えず、各々はＴＧ−ＣＡＴキメラに対しては反対の効果を示した（表８）（すなわち、γ−ＩＦＮはＴＧ−ＣＡＴ活性を低下させ、ＭＭＩはＴＧ−ＣＡＴ活性におけるγ−ＩＦＮ誘発低下を逆転させた）。さらにまた、ＭＭＩ単独ではＴＧ−ＣＡＴ活性は増加するが、ＨＬＡ−ＤＲαＣＡＴ活性は増加しなかった（表８）。この実験では、先の実験のように、６Ｈ培養液で８０％の細胞密度に増殖させ、５Ｈ培養液で６日間維持し、トランスフェクションの１２時間前に６Ｈ培養液に戻したＦＲＴＬ−５細胞で記載のように一過性トランスフェクションを実施した。１２時間後、１００Ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮおよび／または５ｍＭのＭＭＩを補充しまたは補充していない新しい５Ｈ培養液に交換した。ＣＡＴ活性は４８時間後に測定した。全ての実験で細胞の生存度は８５％であった。結果は、活性をルシフェラーゼ活性および細胞質タンパク質の両者について修正した後、未処置コントロールとの比較で示されている。全ての事例でこれらの修正は、５％未満の活性の変化をもたらした。結果は、３つの別々の実験の平均±ＳＤである。
【０１５７】
ＣＡＴアッセイでのγ−ＩＦＮ誘発外因性クラスＩＩ遺伝子発現に対するその作用と一致しかつ同時に、ＭＭＩは、フローサイトメトリーで測定されたように、細胞表面の内因性クラスＩＩ抗原発現を減少させた(図１２)。この実験では、ＦＲＴＬ−５細胞をＴＳＨ中でほぼコンフルエンシーに増殖させ、５Ｈ培養液で８日間維持し、続いて、図１３および１４で述べたように、１００Ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮ、５ｍＭのＭＭＩまたは両者で最後の４８時間処理した。細胞をＲＴ１．Ｂに対するフルオレセインイソチオシアネート共役クラスＩＩ特異的モノクローナル抗体（クローンＯＸ−６、Sera Labs, UK）で、４℃で６０分染色し、ダルベッコーの燐酸緩衝食塩水で２回洗浄し、レーザーフローサイトメトリーに付した。
【０１５８】
表９は、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞におけるγ−ＩＦＮ誘発クラスＩＩ活性にＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンの影響を査定した実験の結果の要約である。抑制の有効性はクラスＩのそれと同様で、化合物１０＞化合物１１＞化合物７および８＞化合物２＞ＭＭＩである。
【０１５９】
したがって、クラスＩまたはクラスＩＩプロモーターのキメラＣＡＴ構築物のＣＡＴ活性を測定することは、クラスＩまたはクラスＩＩ活性に対するＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンの影響をアッセイするためのもう１つの方法である。これらのアッセイは、自己免疫疾患の治療または移植治療に関連して採用される治療でＭＭＩに類似する能力をもつ薬剤を評価するために用いることができる。
【０１６０】
【表１０】

【０１６１】
実施例４
ＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンの評価に使用する高処理アッセイの作製とこれらアッセイでの前記物質の活性
クラスＩＲＮＡレベル、クラスＩおよびクラスＩＩゲルシフト、並びにクラスＩおよびクラスＩＩプロモーター構築物を用いた一過性トランスフェクションに対するＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンの作用についてのこれまでの結果は、全てのアッセイで全ての化合物について類似の結果が得られることを示した。したがって、有効性の順序、すなわち化合物１０＞１１＞７または８＞２＞ＭＭＩは、全てのアッセイで同じであった。このことによって、ただ１組のアッセイが種々の誘導体の高処理スクリーニングで有用である可能性が示唆された。スピードと定量の観点から、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞でクラスIおよびクラスIIプロモーター構築物の安定なトランスファクタントを作製することは有用なアプローチとなろう。以下の実験はこのことが正しいことを示している。
【０１６２】
ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩプロモーター−ルシフェラーゼキメラプラスミド：
ブタのＰＤ１ ５'−フランキング配列−ＣＡＴキメラ(−１１００、−２０３、および−１２７)、および−１０７から−１００ｂｐの欠損を含むＣＲＥ部位を有する２つの変異体（−２０３ΔＣＲＥおよび−１２７ΔＣＲＥ）を用いて、ルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物を作製した。挿入物は制限酵素消化によって遊離させ、ＱＵＩＡＥＸ（QIAGEN, Chatsworth, CA）を用いてアガロースゲルで精製し、さらにＤＮＡ連結キット（TAKARA biomedicals, TAKARA SHUZO Co.）を用いてＰＧＬ−２ベーシックベクター（Promega, Madison, WI）のNheＩ−HindIII部位に連結した。ＪＭ１０９細菌のコンピテント細胞（Promega, Madison, WI）を前記連結反応物で形質転換し、寒天平板で３７℃で１２時間平板培養した。コロニーをとり、ＱＩＡｐｒｅｐスピンプラスミドキット（QIAGEN, Chatsworth, CA）および制限酵素消化を用いてミニプレップでスクリーニングした。続いて、プラスミドをＣｓＣｌ勾配遠心沈殿で精製した。
【０１６３】
同様に、ｐＣＡＴ−ベーシックベクターに挿入されたＨＬＡＤＲαプロモーター、ｐ（−１７６）ＣＡＴおよびｐ（−１３７）ＣＡＴを制限酵素消化によって遊離させ、ＱＩＡＥＸ（QUIAGEN, Chatsworth, CA）を用いてアガロースゲルで精製し、５'−フランキングMluＩ部位を有する挿入物のＰＣＲによる構築のための鋳型として用いた。ＰＣＲ生成物をフェノール−クロロホルム抽出によって精製し、MluＩおよびXbaＩで消化し、ＱＩＡＥＸ（QUIAGEN, Chatsworth, CA）を用いてアガロースゲルで精製し、ＤＮＡ連結キット（TAKARA biomedicals, TAKARA SHUZO Co.）を用いてＰＧＬ−２ベーシックベクター（Promega, Madison, WI）のMluＩ−NheＩ部位に連結した。ＪＭ１０９細菌のコンピテント細胞（Promega, Madison, WI）を前記連結反応物で形質転換し、寒天平板で３７℃で１２時間平板培養した。コロニーをとり、ＱＩＡｐｒｅｐスピンプラスミドキット（QIAGEN, Chatsworth, CA）および制限酵素消化を用いてミニプレップでスクリーニングした。続いて、プラスミドをＣｓＣｌ勾配遠心沈殿で精製した。
【０１６４】
ＦＲＴＬ−５細胞の安定なトランスフェクタント：
リポフェクタミン法（GIBCO, Life Technologies, Inc.）法を用いて、ＰＤ１−ＰＧＬ−２ベーシック構築物およびクラスＩＩ−ＰＧＬ−２ベーシック構築物でＦＲＴＬ−５細胞を安定にトランスフェクトした。６Ｈ中でほぼコンフルエンシーに達した細胞を、２０μｇのプラスミドＤＮＡおよび２μｇのｐｃＤＮＡ３ｎｅｏまたはｐＰＵＲ選別ベクター(CONTECH, Palo Alto, CA)で同時にトランスフェクトした。２４−４８時間後に、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（GIBCO, Life Technologies, Inc）または１０μＭのピューロマイシン（Sigma）を培養液に添加した。３週間後に、抗生物質耐性コロニーを制限希釈によってクローニングし、それらのインターフェロン感受性についてスクリーニングした。各構築物の少なくとも５細胞株を単離し、細胞の培養液に１００Ｕ／ｍｌγ−インターフェロンを添加して各々の活性を増加させた。以下のデータ(表１０−１３)は、クラスＩまたはクラスＩＩ−ルシフェラーゼキメラの各々のクローンの１つを用いて得られたが、それらは、それぞれの少なくとも３つの他のクローンを代表するものであった。
【０１６５】
ルシフェラーゼアッセイ：
ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイ系（Promega, Madison, WI）を用いて測定した。簡単に記せば、１００ｍｍの培養皿から得た処理または未処理細胞をＰＢＳで洗浄し、かきとって微量遠心管に採集した。ペレットを１倍のレポーター溶解緩衝液１００μｌに溶解し、室温で１５分保温した。細胞をドライアイス＋エタノール中で凍結し、さらに室温の水で融解させた。ボルテックスミキサーで１０秒攪拌し、管を１２０００ｘｇで５分遠心した。１２μｌの上清を１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬と混合し、直ちにルミノメーターに静置した。２秒置いた後１０秒間光を測定した。
【０１６６】
安定なトランスフェクタントに対するＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンの影響：
ＴＳＨの存在下または非存在下で１００Ｕ／ｍｌのインターフェロンとともに維持した処理細胞は、クラスＩおよびクラスＩＩプロモーター活性を増加させた(表１０)。この実験では、ＦＲＴＬ−５細胞をＴＳＨを含む６Ｈ培養液で８０％の細胞密度に増殖させ、続いて１００Ｕ／ｍｌのγ−インターフェロン、５ｍＭのＭＭＩまたはその両方で処理した。ルシフェラーゼ活性は記載のように４０時間後に測定した。いくつかの点が顕著である。第一に、インターフェロンは安定なトランスフェクタントでクラスＩおよびクラスＩＩプロモーター活性の両方を増加させる。第二に、ＭＭＩは、インターフェロンによって増加したクラスＩプロモーター活性およびインターフェロンによって増加したクラスＩＩプロモーター活性の両方を抑制する。第三に、一過性トランスフェクトアッセイと異なり、ＭＭＩは基礎クラスＩ活性は顕著には減少させない。最後に、インターフェロンによって誘発されるクラスＩ活性はＣＲＥの存在を必要とする：これは、インターフェロン誘発ＣＩＩＴＡはクラスＩおよびクラスＩＩ活性における増加の仲介因子であり、その活性にＣＲＥを必要とするということを示唆する最近の結果と一致する（Saji et al., 上掲書(1997); V. Montani et al., 上掲書(1998a, 1998b); Balducci-Silano et al., Endocrinology 139:2300-2313(1998)）。
【０１６７】
ｐ（−２０３）クラスＩルシフェラーゼキメラのインターフェロンによって増加するクラスＩ活性に対する種々のＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンの活性は表１１に示されている。一過性トランスフェクション実験で明らかな同じパターンが認められる。すなわち、化合物１０の活性＞１１＞７または８＞２＞ＭＭＩである。したがって、このアッセイは、ＲＮＡ、ゲルシフトおよびプロモーターの一過性トランスフェクションに対する影響を測定した他の実験のデータと一致する。しかしながら、このアッセイはいくつかの主要な利点を有する。細胞は５Ｈ状態へ変化させることを必要とせず、したがって細胞調製時間が少なくなる。労力集約的な一過性トランスフェクションは不要である。このアッセイは迅速で、放射性物質による第二の長時間にわたる保温を必要としない。最後に、このアッセイは各化合物による生細胞の処理を必要とするので、細胞毒性および生存度は容易に観察でき定量することができ、そのために酵素活性の測定よりもin vivoでの使用についてより優れた予想を提供できる。
【０１６８】
ｐ（−２０３）クラスIルシフェラーゼキメラの基礎クラスＩ活性に対する種々のＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンの活性は表１２に示されている。興味深いことには、１または５ｍＭのＭＭＩは基礎活性に対して顕著な影響を与えないという事実にもかかわらず、より活性の高い誘導体はこのスクリーニングアッセイでは有効であるようにみえる。繰り返せば、これらの活性は迅速に、４０時間の処理時間を含めて細胞の分割の７日以内に測定される。
【０１６９】
ｐ（−１３７）クラスＩIルシフェラーゼキメラのインターフェロンによって増加したクラスＩＩ活性に対する種々のＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンの活性は表１３に示されている。一過性トランスフェクション実験で明らかな同じパターンが認められる。すなわち、化合物１０の活性＞１１＞７または８＞２＞ＭＭＩである。したがって、このアッセイは、クラスIＲＮＡ、クラスIおよびＩＩゲルシフト並びにクラスIおよびクラスIIの両プロモーターの一過性トランスフェクションに対する影響を測定した他の実験のデータと一致する。
【０１７０】
【表１１】

【０１７１】
【表１２】

【０１７２】
【表１３】

【０１７３】
【表１４】

【０１７４】
ＭＭＩおよび互変異性環状チオン誘導体の評価で使用する一般的高処理アッセイおよびそれらアッセイでの誘導体の活性：
ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩプロモーター構築物を安定的にトランスフェクトされたＦＲＴＬ−５甲状腺細胞に対するＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンの作用を示した以前の結果は、これらのアッセイが他の全てのアッセイと類似の結果を生じることを示した。したがって、有効性の順序、すなわち化合物１０＞１１＞７または８＞２＞ＭＭＩは同じである。さらにまた、これらのデータは種々の誘導体の高処理スクリーニングのための好ましい方法を確立させた。この方法は以下のとおりである。
【０１７５】
１．ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩプロモーター構築物、好ましくはそれぞれｐ（−２０３）ＭＨＣ−クラスＩ−ＬＵＣまたはｐ（−１３７）ＭＨＣ−クラスＩＩ−ＬＵＣで安定的にトランスフェクトしたＦＲＴＬ−５細胞を、５％仔牛血清添加の完全な６Ｈ培養液、および４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（GIBCO, Life Technologies, Inc.）または１０μＭのピューロマイシン（Sigma）中で、必要なアッセイ数に応じて６、１２、２４または９６穴(ウェル)プレートで増殖させる。
【０１７６】
２．細胞が６０−７０％の細胞密度の時に、これら細胞をＭＭＩ誘導体、互変異性環状チオンまたは他の化合物（５ｍＭまたはそれより低い濃度で）の存在下または非存在下で新しい培養液とともに１００Ｕ／ｍｌのγ−インターフェロンで処理する。好ましくは５ｍＭから５ｎＭの濃度範囲で、２組ずつで検査する。
【０１７７】
３．３６から４８時間後、好ましくは４０時間後に、６、１２、または２４穴プレートの細胞を１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、かきとって微量遠心管に採集し、遠心して細胞をペレットにする。
４．ペレットを１倍のレポーター溶解緩衝液２０、５０または１００μｌに、繰り返しマイクロピペットで出し入れするか、またはボルテックスミキサーで攪拌することによってそれぞれ溶解し、室温で１５分保温する。
【０１７８】
５．細胞をドライアイスとエタノール中で凍結し、室温の水で溶解する。ボルテックスミキサーで１０秒間攪拌した後、試験管を１２０００ｘｇで５分遠心する。
６．９６穴プレートの細胞を１倍のレポーター溶解緩衝液１００μｌを添加し、繰り返しマイクロピペットで出し入れすることによって溶解し、さらに室温で１５分保温する。
７．用いたプレートに応じて５から１００μｌの上清を１００から３００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬と混合し、直ちにルミノメーターに静置する。
８．光を２秒間の猶予の後１０秒間測定する。
【０１７９】
通常はウェル間でタンパク質濃度に顕著な相違は存在しないが、ルシフェラーゼの生データは、上清溶液中のタンパク質濃度を測定することによって標準化できる。アッセイ感度を高めるために、または実験室でのタイムスケジュール調節のために、６０％の細胞密度に達した後、細胞を５Ｈ培養液（ＴＳＨなし）に２から７日間移し、処理が開始する１２時間前に６Ｈ培養液に戻すことができる。
【０１８０】
インターフェロンはクラスＩおよびクラスＩＩプロモーター活性の両方を安定なトランスフェクタントで増加させ、インターフェロンで誘発される活性の抑制は、自己免疫疾患の患者でそれら化合物の作用の一番代表的なものであるので、この方法は最適である。しかしながら、クラスＩトランスフェクタントについては、インターフェロンの非存在下でのテストが、基礎プロモーター活性に対する影響を評価するために実施できる。このアッセイがインターフェロン作用について特異的あることを担保するために、テストは、ｐ（−２０３ΔＣＲＥ）ＭＨＣ−クラスＩ−ＬＵＣトランスフェクト細胞（これはインターフェロンに反応しない）で実施できる。
【０１８１】
このアッセイは、ＲＮＡ、抗原発現、およびプロモーターの一過性トランスフェクションに対する影響を測定する他の実験のデータと一致する。しかしながら、このアッセイはいくつかの主要な利点を有する。細胞は５Ｈ状態へ変化させることを必要とせず、したがって細胞調製時間が少なくなる。労力集約的な一過性トランスフェクションは不要である。
【０１８２】
実施例５
ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩのｍＲＮＡレベルに対するＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンの影響の評価：
一過性または安定にトランスフェクトされたＦＲＴＬ−５細胞での外因性ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩプロモーター活性にを低下させるＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンの能力は、前記細胞でＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩＲＮＡレベルを同様に低下させる前記誘導体の能力と平行していた。したがって、プロモーター活性の測定は、他の種(例えばヒトまたはブタ)のプロモーターもしくはプローブ、および異なるアッセイ技術（外因性対内因性遺伝子発現の変化を測定する）を使用したとしても、細胞内の現象を再現することができる。これらのデータはまた、遺伝子発現を調節するタンパク質生成物を測定するゲルシフトの変化およびＭＨＣ表面発現(図１２)とも一致する。
【０１８３】
細胞および処理：
ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞は、以前にゲルシフトおよびトランスフェクション実験で用いたものと同じ新しいサブクローン（Ｆ₁）で、そこで詳細に述べた全ての特性を保有していた。ＴＳＨの存在下での前記細胞のダブリングタイムは３６±６時間で、その非存在下では前記細胞は分裂しない。ＴＳＨを含まない５Ｈ培養液で６日経過後、１ｘ１０^-10ＭのＭＳＨによって、ｃＡＭＰレベル、ヨウ化物の取り込み、およびＤＮＡへのチミジンの取り込みは１０倍を越えた。細胞は２倍体で、5代から２５代継代で以下を補充した５％仔牛血清添加クーンの改変Ｆ１２培溶液で増殖させた：１mmol／Ｌの非必須アミノ酸（GIBCO, Grand Island, NY）および以下の６ホルモンの混合物（ＴＳＨ（１ｘ１０^-10Ｍ）、インスリン(１０μｇ／ｍｌ)、ヒドロコーチゾン（０．４ｎｇ／ｍｌ）、ヒトトランスフェリン(５μｇ／ｍｌ)、ソマトスタチン(１０μｇ／ｍｌ)およびグリシル−Ｌ−ヒスリジル−Ｌ−リジンアセテート（１０ ｎｇ／ｍｌ））（F.S. Ambesi-Impiombato, 米国特許4,608,341号(1986); L.D. Kohn et al., 米国特許4,609,622号（1986））。継代は７−１０日毎に実施し、新しい培養液を２または３日毎に加えた。細胞は使用前４−６日にＴＳＨを含まない培養液（５Ｈ）に移した。実験は、新しい培養液中の１ｘ１０^-10ＭのＴＳＨ、１００Ｕ／ｍｌのγ−インターフェロン、表示の濃度のＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオン、またはこれらの混合物を添加することによって開始した。新しい培養液のみのものはコントロールとした。ＲＮＡは４０時間後に単離した。
【０１８４】
ＲＮＡ単離とノザン分析：
全細胞ＲＮＡを単離し、ノザン分析を実施し、フィルターを以下のｃＤＮＡプローブ（０．５−１．０ｘ１０⁶ｃｐｍ／ｍｌ）を用い文献にしたがって連続的にハイブリダイズさせた（O. Isozaki et al., Mol. Endocrinol. 3:1681-1692(1989); M. Saji et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1944-1948(1992); M. Saji et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 75:871-878(1992)）。プローブのうち３つは以前に記載されたものであった：全ｃＤＮＡ挿入物に広がるブタＭＨＣクラスＩｐＨ７クローンの１．０ｋｂのＨｐａＩＩフラグメント（M. Saji et al., 上掲書(1992)）;陽性コントロールとして使用されるラットサイログロブリン(P. Santisteban et al., J. Biol. Chem. 262:4048-4052(1987); O. Isozaki et al., 上掲書(1989))；陰性コントロールとして用いられるβ−アクチン。ＭＨＣクラスＩＩＤＮＡプローブはＰＣＲ増幅５４６ｂｐ生成物（クラスＩＩ配列の７４から６１９ｂｐの間）で、これは、インターフェロン処理ラットＦＲＴＬ−５細胞ＲＮＡに由来し、以下のプライマーをＰＣＲで使用した：センスプライマーのヌクレオチド配列は、５'−ＡＧＣＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡＧＧ−３'で、アンチセンスプライマーのヌクレオチド配列は５'−ＧＡＴＴＣＧＡＣＴＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣ−３'で、２つの領域は、クラスＩＩヌクレオチド配列およびタンパク質配列において高度に保存されている。ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅後、生成物をアガロースゲルで精製し、続いて[³²Ｐ]ｄＣＴＰおよびクレノウ酵素を用いてランダムプライム放射能標識を実施した。
【０１８５】
全ての実験は異なる細胞バッチで少なくとも３回繰り返し、生物学的変動性を査定した。数値は、別に記載がなければこれらの実験の平均±ＳＤである。実験数値間の有意性はスチューデントｔ検定または平方偏差の２方向分析を用いて決定した。数値は、全実験のデータを考慮したときＰが０．０５未満の場合有意である。
【０１８６】
結果：
検査したＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンは、基礎クラスＩ並びにインターフェロン誘発クラスＩおよびクラスＩＩＲＮＡレベルの両方を減少させた。ＴＳＨ非存在下で維持した細胞の基礎クラスＩＲＮＡレベルに対するＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンの影響は表１４に提示されている。ＴＳＨ存在下で維持した細胞のγ−インターフェロン誘発クラスＩＲＮＡレベルに対する影響は表１５に、ＴＳＨ存在下で維持した細胞のγ−インターフェロン誘発クラスＩＩＲＮＡレベルに対する影響は表１６に提示されている。全ての実験で、ＲＮＡレベルは、オートラジオグラムのレーザーデンシトメトリーによって、またはβ−アクチンに対するＢＡＳホスホイメージングによって定量される。コントロール細胞におけるβ−アクチンレベルに対するクラスＩまたはクラスＩＩ比を１００％レベルとする。百分率で示した抑制は、この比を減少させるＭＭＩ誘導体または互変異性環状チオンの影響を示す。
【０１８７】
一般に、前記誘導体の作用は全てのＲＮＡアッセイで同様で、化合物１０＞１１＞７または８＞２＞ＭＭＩであった。より重要なことには、この順序は、プロモーター活性に対する影響をテストするトランスフェクション実験で測定されたクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子発現の両者に対する誘導体の能力と一致する。
サイログロブリンＲＮＡに関する実験は前記誘導体の特異性を強調し、予期せぬ結果を提供している。ＭＭＩは、クラスＩおよびクラスＩＩの事例(表１４−１６)のようにＲＮＡレベルを低下させるよりはむしろ、ＴＧＲＮＡレベルをほぼ２倍に増加させる。予期に反することには、これは、比較可能な増加が明瞭ではないほとんどのＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオン、特にクラスＩおよびクラスＩＩＲＮＡレベルの減少にもっとも有効な化合物（１０、１１、７および８）には当てはまらない。このことは、これらの誘導体／チオンは自己免疫疾患の治療に有効で甲状腺機能に対する副作用がメチマゾールよりも少ないかもしれない。
【０１８８】
【表１５】

【０１８９】
【表１６】

【０１９０】
【表１７】

【０１９１】
【表１８】

【０１９２】
図１２で指摘したように、タンパク質／ＤＮＡ複合体およびプロモーター活性を低下させるＭＭＩの能力は、フローサイトメトリーによって測定されるように抗原発現を減少させるＭＭＩの能力に付随する。ＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンはまた、γ−インターフェロンによって誘発されるＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ抗原発現をフローサイトメトリーで測定されたように減少させた。
【０１９３】
この実験では、文献にしたがって（V. Montani et al., 上掲書(1998b); M. Saji et al 上掲書(1992a); P. L. Balducci-Silano et al., Endocrinology 139:2309-2313(1998)）、１０⁶細胞をＭＨＣクラスＩＩまたはクラスＩ特異的抗体と保温した。氷上で３０分後、細胞を燐酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄し、フルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役抗体と３０分保温し、続いてセルケスト（CellQuest）ソフトウェア（Becton Dickinson）を用いて、ファックスキャンサイトメーター（FACScan Cytometer）でフローサイトメトリーによって分析した。
インターフェロン誘発クラスＩおよびクラスＩＩ表面発現の抑制を達成するために必要な濃度は、異なる濃度の化合物をテストすることによって決定した(表１８)。他の全てのアッセイと同様に、有効性の順序は以下のとおりであった：化合物１０＞１１＞７または８＞２＞ＭＭＩ＞３。
【０１９４】
【表１９】

【０１９５】
実施例６
（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ₁マウスの蛋白尿またはＮＯＤマウスの糖尿病を予防する、ＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体（２−メルカプトイミダゾール）または互変異性環状チオン(化合物１０)の能力：
本実験の目的は、ＮＺＢマウスでの狼瘡またはＮＯＤマウスでの糖尿病の発症に対するＭＭＩおよび互変異性環状チオン(化合物１０)の影響を、メチマゾール誘導体（２−メルカプトイミダゾール）と比較することによって決定することであった。化合物１０は、多数のin vitroアッセイでクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子発現を抑制するためにもっとも効果的であるとされた化合物で、対照的に、２−メルカプトイミダゾールはＭＭＩより効果が弱く、クラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子発現を抑制する能力は無視しえるものであった。これらは、in vivo相関物に関する特定方法の有効性を立証するアッセイである。
【０１９６】
雌の（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ₁マウスは、加齢とともに偶発的にヒトの全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）に類似する自己免疫疾患を発症する（Mozes et al., Clinical Immunology 18:106-113(1998)）。同様に、雌のＮＯＤマウスは加齢とともにＩ型糖尿病に類似する疾患を発症する（Makino et al., Exp. Anim. 29:1-13(1980); L.S. Wicker et al., Diabetes 35:855-860(1986)）。前者の事例では、蛋白尿が疾患の開始の基準で、後者の事例では、糖尿が疾患の開始の基準である。
【０１９７】
方法：
雌の（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ₁マウスはジャクソンラブ（Jackson Labs）から入手した。蛋白尿を半定量的に測定するために動物をＡＭＥＳ２８５５ウリスティックス（Uristix）(Miles)で見守った。蛋白尿はＳＬＥの発症基準として、さらに腎臓における腎複合体の抑制として蛋白尿のＭＭＩ抑制の基準として採用した（Mozes et al., J. Clin Immunology 18:106-113(1998)）。７−８ヶ月で、マウスは腎疾患を示す蛋白尿を生じる。治療は２ヶ月齢から６ヶ月齢で、経口的であった。各群は８匹の動物で開始した。
雌のＮＯＤマウスはまたジャクソンラブから，コントロールマウスと一緒に入手した。このコントロールマウスから前記の系統が得られた（Makino et al., Exp. Anim. 29:1-13(1980); L.S. Wicker et al., Diabetes 35:855-860(1986)）。１＋より高いＴｅｓ−Ｔａｐｅ陽性度を示す動物は陽性と考え、糖尿病であるとした（L.S. Wicker et al., 上掲書(1986)）。８−１６週では、１０−４０％のＮＯＤマウスが糖尿を生じ、文献のとおり糖尿病を発症した（L.S. Wicker et al., 上掲書(1986)）。
【０１９８】
結果：
雌の（ＮＺＢｘＮＺＷ）Ｆ₁マウスを用いた実験(表１９)では、全ての生存コントロール動物および全ての２−メルカプトイミダゾール処理動物は顕著な蛋白尿を７．５ヶ月で発症した。対照的に、ＭＭＩおよび化合物１０（５−フェニルメチマゾール）（これはＭＭＩ濃度の１／５）は顕著に蛋白尿を予防した。各群の動物を殺処分し、免疫複合体について腎臓を調べた。データによればコントロール動物は著名な数の免疫複合体を腎臓に有し、一方、ＭＭＩまたは化合物１０で処理した動物ではそのようではなかった（図１５）。この実験では、５μｍの厚い凍結腎切片で盲検態様で免疫組織学検査を実施した。この切片は固定し、ＦＩＴＣに結合させた免疫グロブリンＧ（γ鎖特異的）に対するヤギ抗体で文献（Mozes et al., Sciece 261:91-93(1993); E. Mozes et al., 上掲書(1998)）にしたがって染色した。化合物１０（互変異性環状チオン）およびＭＭＩはこの実験モデルでは、ＳＬＥの予防に有効である。
【０１９９】
この実験では数匹の動物が、技術的理由（すなわち過去２ヶ月間のケージの水あふれ、取り扱いなど）のために死亡した。しかしながら、コントロール群の損失は実験群と同様であった。ＭＭＩ、２−メルカプトイミダゾールおよび化合物１０の処置は２から６．２５ヶ月齢に実施された。
表２０は、ＭＭＩおよびＭＭＩの１／５濃度の化合物１０（５−フェニルメチマゾール）で処理したとき糖尿および糖尿病を発症する雌のＮＯＤマウス（各群５匹）の能力を、２−メルカプトイミダゾールで処理したものまたは未処理のものと比較することによって示している。この実験ではマウスはジャクソンラブから入手した。１＋より高い尿Ｔｅｓ−Ｔａｐｅ陽性を示す動物を陽性で糖尿病であると考えた。
【０２００】
この実験では、全ての生存コントロール動物および全ての２−メルカプトイミダゾール処理動物は１２週までに糖尿病を発症した。対照的に、ＭＭＩおよび５−フェニルメチマゾール（ＭＭＩ濃度の１／５）は両者とも糖尿を予防した。化合物１０およびＭＭＩはしたがって糖尿病のＮＯＤマウスの例で糖尿病の予防に有効である。技術的理由（すなわち過去２ヶ月間のケージの水あふれ、取り扱いなど）のための動物の死亡はコントロール群および実験群で同様で、結果に影響を及ぼさなかった。
これら２つの実験の結果は、in vitroアッセイは、in vivoで自己免疫疾患を治療するために有効な薬剤をそれらのクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子発現をラットＦＲＴＬ−５細胞でin vitroで抑制する能力を基に検出することができるという結論を支持する。さらにまた、ＭＭＩ濃度の１／５でそのような作用を示し、さらに毒性のない化合物１０の能力は、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞培養でこのアッセイプロトコルを使用することによってin vivoの有効性を合理的に予想することができるという仮説を実証しているように思われる。
【０２０１】
【表２０】

【０２０２】
実施例７
インターフェロンによって誘発されるＹボックスタンパク質レベルの低下に対するメチマゾールおよび互変異性環状チオンの影響：
ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子発現を抑制することが判明している因子の１つはＹボックス結合タンパク質である（M. Saji et al., 上掲書(1997); J.P-Y. Ting et al., J. Exp. Med. 179:1605-1611(1994)）。ヒトＹボックスタンパク質、ＹＢ−１は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子のＹボックス（逆方向ＣＣＡＡＴボックス）に結合する能力によってクローニングされた（D.K. Didier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7322-7326(1988)）。ＹＢ−１のトランスフェクションによって、ヒトの神経膠芽腫細胞およびＦＲＴＬ−５甲状腺細胞でのＨＬＡ−ＤＲα遺伝子の発現が抑制されることが示された（J. P-Y. Ting et al., 上掲書(1994); G.H. MacDonald et al., J. Biol. Chem. 270:3527-3533(1995); V. Montani et al., 上掲書(1998a)）。ＦＲＴＬ−５細胞のＹボックスは、サイロトロピンレセプター（ＴＳＨＲ）遺伝子発現を抑制する能力によってクローニングされ（H. Shimura et al., J. Biol. Chem. 268:24125-24137(1993); M. Ohmori et al., Mol. Endocrinol. 10:76-89(1996)）、したがってＴＳＨＲサプレッサーエレメント結合タンパク質−１（ＴＳＥＰ−１）と名づけられた。ＴＳＥＰ−１は甲状腺自己調節系の成分で、この系では、ＦＲＴＬ−５甲状腺細胞が、ＴＳＨチャレンジ後に機能的局面および増殖局面を経過するとき、ＴＳＨ／ｃＡＭＰはＴＳＨＲおよびＭＨＣを減少させる（H. Shimura et al., 上掲書(1993); M. Ohmori et al., 上掲書(1996); L.D. Kohn etal., 上掲書(1995)）。ＴＳＨ／ｃＡＭＰはＹボックス遺伝子発現を増加させ、ＹボックスはＴＳＨＲおよびクラスＩ遺伝子発現のサプレッサーで、結果としてＴＳＨＲおよびクラスＩ遺伝子発現は低下する。
【０２０３】
γ−ＩＦＮは、ＦＲＴＬ−５細胞のＹボックスタンパク質ＲＮＡレベルを減少させ、一方、ＭＭＩはこの作用を逆転させる(図１６)。この実験では、ＦＲＴＬ−５細胞は完全な６Ｈ培養液プラス５％仔牛血清で維持され、１００Ｕ／ｍｌのγ−ＩＦＮ、以下から選ばれる活性化合物（５ｍＭのメチマゾール、０．１ｍＭの化合物１０、０．２５ｍＭの化合物１１、０．５ｍＭまたは０．２５ｍＭの化合物７、８および９、または０．５ｍＭの化合物３）、またはＩＦＮおよび異なる活性化合物の両方で４０時間処理してから、全細胞ＲＮＡを単離し、文献（O. Ozaki et al., 上掲書(1989); M. Saji et al., Endocrinology 130;520-533(1992); M. Ohmori et al., 上掲書(1996)）にしたがってノザン分析を実施した。ラットのＴＳＥＰ−１プローブは、クローン３１挿入物（報告されたラットＴＳＥＰ−１ヌクレオチド配列の残基５から１３９５）（M. Ohmori et al., 上掲書(1996)）であった。ラットのβ−アクチンはDr. B. Paterson（NCI, Bethesda）から提供された。全てのプローブの放射能標識、ハイブリダイゼーション（０．５−１．０ｘ１０⁶ｃｐｍ／ｍｌ）および洗浄は文献（O. Isozaki et al., 上掲書(1989); M. Saji et al., 上掲書(1992); M. Ohmori et al., 上掲書(1996)）にしたがった。
γ−ＩＦＮによって減少するＴＳＥＰ−１レベルに対するＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンの影響は表２１に示されている。ＴＳＥＰ−１ＲＮＡレベルにおけるγ−ＩＦＮ誘発低下を逆転させる化合物の能力は、繰り返せば１０＞１１＞７または８＞２＞ＭＭＩ＞３である。これは他の全てのアッセイのデータと類似する。
【０２０４】
ＹＢ−１はＹボックス結合タンパク質のプロトタイプである。これをクラスＩＩプロモーターの放射能標識Ｙボックスエレメントを用いてクローニングし、λｇｔ11発現ＤＮＡライブラリー（D.K. Didier et al., 上掲書(1998)）をスクリーニングした。γ−ＩＦＮ誘発クラスII遺伝子発現を抑制するＴＢ−１の能力の直接的な証拠は神経膠芽腫細胞およびＦＲＴＬ−５細胞で提供された（J. P-Y. Ting et al., 上掲書(1998a)）。別個の実験でも、それがＭＨＣクラスI遺伝子発現を抑制することが示された（M. Saji et al., 上掲書(1997)）。これらのデータはγ−ＩＦＮはＹボックスＲＮＡレベルを低下させることを示している。Ｙボックスタンパク質が減少するとしたら、クラスIおよびクラスＩＩのＹボックスによる抑制の低下がまたもたらされると推定することは合理的であろう（なぜならば、ＹボックスはクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子発現を抑制する）。簡潔にいえば、γ−ＩＦＮがMHC発現を増加させる手段は両遺伝子のＹボックスによる抑制を低下させることができるという仮説は合理的である。これらのデータはさらに以下のことを示している：ＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンはＹボックスＲＮＡレベルのγ−ＩＦＮ誘発低下を逆転させ、この作用は、ＭＨＣ遺伝子発現のγ−ＩＦＮ誘発増加を減少させるそれら化合物の作用（ゲルシフト、ＲＮＡレベルまたはプロモーター活性で判断された）と同時に発生する。総合すれば、我々は以下のように考える：γ−ＩＦＮは、ＴＳＥＰ−１ＲＮＡレベルを減少させることによってクラスＩＩの抑制性作用を低下させ、ＣＩＩＴＡＲＮＡレベルを増加させることによって同時にクラスＩＩ発現を増加させる。正味の結果は、ＭＨＣクラスＩＩの“異所性”発現および異常なクラスＩ発現である。メチマゾールは、ＴＳＥＰ−１（Ｙボックス）ＲＮＡレベルに対するγ−ＩＦＮの影響を逆転させ、ＨＬＡ−ＤＲα５'−フランキング領域とγ−ＩＦＮとの複合体を排除する（V. Montani, 上掲書(1998a)）ことによってこれを逆転させる。ＩＦＮによって増加したクラスＩおよびクラスＩＩ遺伝子発現の抑制でより高い活性を有する本明細書で開示した誘導体は、Ｙボックス遺伝子発現に対するＩＦＮの作用を逆転させるためにＭＭＩより強力な能力を有する。これらの薬剤の効果の１つは、したがって、ＭＨＣ遺伝子発現を変化させ、自己免疫反応を悪化させるインターフェロンの作用を予防または逆転させることである(図１７)。これらの薬剤はまた同様に、自己免疫過程を開始させる最初のまたは初期の標的組織における損傷を、基礎クラスＩ遺伝子発現の減少によって立証されたように減少させることができる(図１７)。
興味深いことには、ＭＭＩ、ＭＭＩ誘導体および互変異性環状チオンは基礎ＹボックスＲＮＡレベルに対してごくわずかの作用を有する。このことは、前記化合物の作用は、ＹボックスＲＮＡレベルにおけるγ−ＩＦＮ誘発変化に対する作用で選択的である可能性を補強し、Ｙボックスによって制御される正常な生理的過程を害しないことを強調する。
【０２０５】
【表２１】

【０２０６】
実施例８
本発明の医薬組成物の製造
組成物の投与：
本発明の活性化合物を投与する手段には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない：経口、舌下、筋肉内、腹腔内、経皮、鼻腔内、髄内、皮下または腸内である。患部への限局投与は当技術分野で既知の手段で達成できるが、これには以下が含まれる(ただしこれらに限定されない)：局所塗布、注射、輸液および多孔性装置の埋め込み（その中に本発明の化合物が含有されている）。したがって、本発明の活性化合物は、医薬的に許容できる賦形剤および他の製剤補助剤とともに本発明の１つまたは２つ以上の活性化合物を組み合わせて含有する医薬組成物として一般的に投与されるであろう。
【０２０７】
製剤補助剤：
そのような組成物は、水溶液、乳液、クリーム、軟膏、懸濁液、ゲル、リポソーム懸濁液などでもよい。適切な賦形剤には水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および、エタノール、グルコース、シュクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、リン酸塩、アセテート、ゼラチン、コラーゲン、カルボポル(登録商標)、植物油などの溶液が含まれる。さらにまた、適切な保存料、安定剤、抗酸化剤、抗菌剤、および緩衝剤、例えばＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなどを含むことができる。製剤で有用なクリームまたは軟膏基剤には、ラノリン、シルバデン(登録商標)（Marion）、アクアホア（登録商標）（Duke Laboratories）などが含まれる。また別には、本発明の活性化合物を適切なポリマーマトリックスまたは膜に包含するか被包化し、したがって局所的に処置されるべき部位の近くに埋め込むために適した徐放性装置を提供してもよい。他の装置には、体内カテーテルおよびアルゼット(登録商標)ミニポンプのような装置を含む。市販の賦形剤、例えばソルビ−ケア（登録商標）(Allergan)、ネオデクドロン（登録商標）（Merck, Sharp & Dohme）、ラクリルーブ（登録商標）などを用いて眼科用調製物を製剤化してもよい。さらに、膨張剤、例えばヒト血清アルブミン、シュクロース、マンニトロールに含ませて本発明の活性化合物を提供してもよい。医薬的に許容できる賦形剤の完全な考察は以下の成書から得ることができる：Remington’s Pharmaceutical Sciences I(Mack Pub. Co.)（この文献は参照により本明細書に含まれる）。
【０２０８】
経口／非経口投与：
本発明の活性化合物は、自己免疫疾患の治療および器官および／または組織の移植の実施のための一般的な方法に従って経口的にも非経口的にも投与できる。任意の具体的な自己免疫および／または移植疾患の治療に必要とされる活性化合物の量はもちろん、疾患の性質および重篤度、対象者の年齢および状態、並びに当業者によって容易に決定できる他の因子に応じて変動しうる。活性化合物は単位剤形（好ましくは分割された単位剤形）で投与される。前記単位剤形は、活性化合物を適切な生理学的に許容される担体または賦形剤とともに含み、後者の多くは当業者には周知で上記に記載されている。単位剤形は、液体調製物（例えば溶液、懸濁液、分散剤、または乳液でもよく、それらはまた固体製剤（例えばピル、錠剤、カプセルなど）でもよい。単位剤形の医薬組成物、すなわち個々の投薬を使用者が計量することを要しない１回投与に適した予め計量された形態として利用可能な医薬組成物、例えばピル、錠剤、カプセル、またはアンプルが、本発明の活性化合物の特に好ましい投与方法である。
【０２０９】
具体的／好ましい指示：
自己免疫疾患および移植疾患の治療のために、単位剤形中の医薬組成物は、１日当たり約０．０５から約６０ミリグラム、好ましくは約０．０５から約２０ミリグラムの活性化合物を提供する組成物量を含む。経口投与用製剤を製造するためには、本発明の活性化合物またはその塩を、例えば固形粉末担体（例えばラクトース、シュクロース、マンニトール；澱粉、例えばジャガイモ澱粉、トウモロコシ澱粉またはアミロペクチンの他にラミナリア粉末およびかんきつ類パルプ粉末；セルロース誘導体、ゼラチン）と混合し、また潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、適切な分子量のポリエチレングリコール（カルボワックス）を添加して圧縮錠剤または糖衣用錠剤を生成してもよい。後者は、例えば濃縮糖溶液（アラビアゴム、タルクおよび／または二酸化チチニウムを含むことができる）で被覆するか、または容易に揮発する有機溶媒または有機溶媒混合物に溶解した膠で被覆する。染料をこれら被覆物に、例えば活性物質の含有量の相違を区別するために添加してもよい。本明細書で有用なカプセルには、例えば軟ゼラチンカプセル（真珠形閉鎖カプセル）、ジェルタブ、他のカプセルが含まれる。後者は、例えばゼラチンおよびグリセリンの混合物から成り、活性物質または適切なその塩を以下のものとともに含有する：固形粉末担体、例えばラクトース、シュクロース、ソルビタール、マンニトール；澱粉、例えばジャガイモ澱粉、トウモロコシ澱粉またはアミロペクチン、セルロース誘導体、またはゼラチンの他にステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸。座薬は、直腸適用のための剤形として用いられる。これらは、活性物質または適切なその塩と中性脂肪性基剤との混合物から成る。また、ゼラチン直腸カプセルを用いてもよい。これは、活性物質またはその塩と適切な分子量のポリエチレングリコール（カーボワックス）との混合物から成る。
【０２１０】
非経口用、特に筋肉内投与用アンプルは、好ましくは、活性化合物または水溶性のその塩および適切な安定剤、さらに必要な場合には緩衝物質の水溶液を含む。抗酸化剤、例えば重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸またはロンガリット（ホルムアルデヒド−重亜硫酸ナトリウム化合物）などが、単独または併用される安定剤として適切で、総濃度は組成物の０．０１から約０．０５％である。キレートを形成するその能力のために、アスコルビン酸はさらに別の安定剤効果を有し、この機能の場合にはアスコルビン酸は他のキレート形成物質と置き換えることができる。活性成分のもっとも高い安定性は、例えば亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、および／またはアスコルビン酸を適切な割合で混合するか、または他の緩衝物質（例えばクエン酸および／またはその塩）を添加することによって達成できる。さらに、アンプルは微量の保存料を含むことができる。
【０２１１】
本発明の活性化合物を投与するための有用な医薬製剤は下記に例示される。それらは通常の技術によって製造される。
カプセル：
活性成分 ０．０５から２０ｍｇ
ラクトース ２０−１００ｍｇ
トウモロコシ澱粉Ｕ．Ｓ．Ｐ ２０−１００ｍｇ
エアロゾル化シリカゲル ２−４ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １−２ｍｇ
【０２１２】
錠剤：
活性成分 ０．０５から２０ｍｇ
微小質セルロース ５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉Ｕ．Ｓ．Ｐ ８０ｍｇ
ラクトースＵ．Ｓ．Ｐ ５０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム １−２ｍｇ
この錠剤は通常の技術にしたがって糖で被覆できる。被覆物質に着色料を添加してもよい。
【０２１３】
咀嚼可能錠剤：
活性成分 ０．０５から２０ｍｇ
マンニトール、Ｎ．Ｆ １００ｍｇ
香料 １ｍｇ
ステアリン酸マグネシウムＵ．Ｓ．Ｐ． ２ｍｇ
【０２１４】
座薬：
活性成分 ０．０５から２０ｍｇ
座薬基剤 １９００ｍｇ
【０２１５】
リキッド：
活性成分 ２．０％
ポリエチレングリコール３００、Ｎ．Ｆ． １０．０％
グリセリン ５．０％
重亜硫酸ナトリウム ０．０２％
ソルビトール溶液７０％、Ｕ．Ｓ．Ｐ． ５０％
メチルパラバン、Ｕ．Ｓ．Ｐ． ０．１％
プロピルパラバン、Ｕ．Ｓ．Ｐ． ０．２％
蒸留水（Ｕ．Ｓ．Ｐ）で総量を１００．０ｃｃとする
【０２１６】
注射用：
活性成分 ０．０５から６０ｍｇ
ポリエチレングリコール６００ １．０ｃｃ
重亜硫酸ナトリウムＵ．Ｓ．Ｐ． ０．４ｍｇ
注射用の水（Ｕ．Ｓ．Ｐ）で総量を２．０ｃｃとする
【０２１７】
実施例９
ＳＬＥ、自己免疫疾患に罹患しているヒトの治療
ＳＬＥに罹患しているヒトを治療するために、本発明の活性化合物を、好ましくは経口的に最初は１日当たり１００ｍｇまでの投与量で投与する。しかし投与は非経口的でもよい。最初の投与の後、５０ｍｇ２０日間、４０ｍｇ３０日間まで、３５ｍｇ３０から６０日間まで、４０ｍｇ２０日間まで、３５ｍｇ３０から６０日間までの段階的減少プログラムに従い、１日当たり５ｍｇ−３０ｍｇに徐々に減少させる。１日当たり５ｍｇ−１０ｍｇで１年またはそれ以上の維持投与量もまた用いることができる。投与量は、好ましい化合物について５０から１００倍減少させることができる。
【０２１８】
活動中の疾患の臨床的徴候または症状の軽減について患者をモニターすることができる。特異的にモニターできるパラメーターには、自己抗体（特にＤＮＡ抗体）；ＰＢＬ細胞表面マーカー、白血球減少症；蛋白尿、高免疫グロブリン血症；およびパンチ生検による腎の免疫複合体レベルが含まれる。
さらに、ＳＬＥ患者で疾患のコントロールに必要な本発明の活性化合物の治療レベルを知るために、ＴＳＨまたはＴ₃／Ｔ₄レベルをモニターすることができる。ＴＳＨレベルが正常範囲を越えて顕著に増加するとき（活性化合物の有効な作用を示している）、投与量を次の投与レベルに減少させることができる。甲状腺ホルモンレベルが正常範囲から顕著に減少するとき、これもまた投与量を減少させる指示として用いることができる。患者が甲状腺ホルモンの低下またはＴＳＨの増加を示す場合、患者を甲状腺ホルモン（Ｔ₃またはＴ₄）プラス活性化合物で処置し、甲状腺機能の正常状態を維持することができる。ＴＳＨレベルはより良好なインデックスである。同じパラメーターで小児を評価することができる。
【０２１９】
実施例１０
ＩＤＤＭ（自己免疫疾患）に罹患または前記疾患の発症のリスクが高い患者の治療
若年性糖尿病、Ｉ型糖尿病に罹患していると判明した患者または、ＩＤＤＭ発症のリスクが高いと当業者が決定した者を、本発明の活性化合物を、好ましくは経口的に、最初は１日当たり１００ｍｇまでの投与量で投与することによって治療することができる（ただしそれらはまた非経口的に投与することもできる）。最初の投薬の後、５０ｍｇ２０日間、４０ｍｇ２０日間まで、３５ｍｇ３０から６０日間まで段階的減少プログラムにしたがい１日当たり５ｍｇ−３０ｍｇへ徐々に減少させる。１年またはそれ以上の期間、５ｍｇ−１０ｍｇの維持投与量もまた用いることができる。投薬はしかしながら、好ましい活性化合物について少なくとも５０から１００倍まで減少させることができる。
【０２２０】
活動中の疾患の臨床的徴候または症状の軽減について患者をモニターすることができる。特異的にモニターできるパラメーターには、糖尿、血糖、自己抗体、特に疾患の進行と正の相関を有することが当業者に知られている抗体および／または各個体の素因に関して予想に役立つ、したがってＩＤＤＭのリスクが高いことが当業者に知られている抗体、；ＰＢＬ細胞表面マーカー、白血球減少症；および糖尿が含まれる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、基底のＭＨＣクラスＩ活性を抑制する薬剤の能力を査定する方法：
（ａ）ＭＨＣクラスＩ調節核酸配列に操作可能に連結された１つまたは２つ以上のレポーター遺伝子で構成されたレポーター遺伝子構築物を哺乳類細胞集団に導入し；
（ｂ）前記ＭＨＣクラスＩ抑制薬剤で前記細胞を処理し；
（ｃ）前記ＭＨＣクラスＩ調節配列と結合した１つまたは２つ以上のレポーター遺伝子の活性を測定すること。
【請求項２】
以下の工程を含む、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子の発現に対するγ−インターフェロンの作用を抑制する薬剤の能力を査定する方法：
（ａ）ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ調節核酸配列に操作可能に連結された１つまたは２つ以上のレポーター遺伝子で構成されたレポーター遺伝子構築物を哺乳類細胞集団に導入し；
（ｂ）γ−インターフェロンおよび前記ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ抑制薬剤で前記細胞を処理し；
（ｃ）前記ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ調節配列と結合した１つまたは２つ以上のレポーター遺伝子の活性を測定する。
【請求項３】
前記レポーター遺伝子構築物が、電気穿孔、形質導入、トランスフェクションおよびリポフェクションから成る群から選ばれる手段によって前記哺乳類細胞に導入される請求項２の方法。
【請求項４】
前記哺乳類細胞が、甲状腺細胞、肝細胞、神経組織、筋肉、線維芽細胞、脂肪細胞およびＨＥＬＡ細胞から成る群から選ばれる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）から成る群から選ばれる請求項４の方法。
【請求項６】
前記レポーター遺伝子構築物が前記哺乳類細胞にトランスフェクトされる請求項５の方法。
【請求項７】
前記哺乳類細胞がＦＲＴＬ−５甲状腺細胞である請求項６の方法。
【請求項８】
前記レポーター遺伝子が、ｐ（−２０３）ＭＨＣ−クラスＩ−ＬＵＣおよびｐ（−１３７）ＭＨＣ−クラスＩＩ−ＬＵＣから選ばれる請求項７の方法。
【請求項９】
ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ調節核酸配列と操作可能に連結された１つまたは２つ以上のレポーター遺伝子で構成されたレポーター遺伝子構築物を導入された哺乳類細胞。
【請求項１０】
前記レポーター遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）から成る群から選ばれる請求項９の哺乳類細胞。
【請求項１１】
甲状腺細胞、肝細胞、神経組織、筋肉、線維芽細胞、脂肪細胞およびＨＥＬＡ細胞から成る群から選ばれる請求項１０の哺乳類細胞。
【請求項１２】
前記レポーター遺伝子構築物が、電気穿孔、形質導入、トランスフェクションおよびリポフェクションから成る群から選ばれる手段によって導入される請求項１１の哺乳類細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、前記レポーター遺伝子構築物をトランスフェクトされたＦＲＴＬ−５甲状腺細胞である請求項１２の哺乳類細胞。
【請求項１４】
前記レポーター遺伝子が、ｐ（−２０３）ＭＨＣ−クラスＩ−ＬＵＣおよびｐ（−１３７）ＭＨＣ−クラスＩＩ−ＬＵＣから選ばれる請求項１３の哺乳類細胞。
【請求項１５】
下記式から選ばれる化合物の安全で有効な量と医薬的に許容できる担体とを含む医薬化合物：
【化１】

式中、Ｒ⁵およびＲ⁶は以下の成分対ＣＨ₃、ＣＨ₃；Ｐｈ、ＨおよびＨ、Ｐｈから選ばれ；Ｒ⁷はＨおよびＣＨ₃から選ばれ；さらにＲ⁸はＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮＣＨ₃から選ばれる。
【請求項１６】
以下の式を有する化合物：
【化２】

式中、Ｒ²は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルおよびＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから成る群から選ばれる。
【請求項１７】
Ｒ²が、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルおよびＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから成る群から選ばれる請求項１６の化合物。
【請求項１８】
Ｒ²がメチルである請求項１７の化合物。
【請求項１９】
下記式から選ばれる化合物の安全で有効な量と医薬的に許容できる担体とを含む医薬組成物：
【化３】

式中、ＹはＨ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキル、−ＮＯ₂および下記のフェニル成分から成る群から選ばれ、
【化４】

式中、前記活性化合物中のＹ基の２つ以上はフェニル成分ではなく；Ｒ¹は、Ｈ、−ＯＨ、ハロゲン、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄エステル、Ｃ₁−Ｃ₄置換エステルから成る群から選ばれ；Ｒ²は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルおよびＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから成る群から選ばれ；Ｒ³は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキル、Ｃ₁−Ｃ₄置換アルキルおよび−ＣＨ₂Ｐｈから成る群から選ばれ；Ｒ⁴は、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₄アルキルおよびＣ₁−Ｃ₄置換アルキルから成る群から選ばれ；ＸはＳおよびＯから選ばれ；Ｚは、−ＳＲ³、−ＯＲ³、−Ｓ(Ｏ)Ｒ³およびＣ₁−Ｃ₄アルキルから選ばれ；さらに、式中Ｙがフェニル成分でない場合は前記化合物のＲ²およびＲ³基の少なくとも２つはＣ₁−Ｃ₄アルキルで、Ｚがアルキルである場合は、少なくとも１つのＹは−ＮＯ₂である。
【請求項２０】
前記活性化合物が以下から成る群から選ばれる請求項１９に記載の医薬組成物：
【化５】

式中、Ｒ⁹は−ＯＨ、−Ｍおよび−ＯＯＣＣＨ₂Ｍから成る群から選ばれ；式中、ＭはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選ばれる。
【請求項２１】
前記活性化合物が以下から成る群から選ばれる請求項１９に記載の医薬組成物：
【化６】

式中、Ｒ¹⁰は、Ｈ、−ＮＯ₂、Ｐｈ、４−ＨＯＰｈおよび４−ＭＰｈから成る群から選ばれ、式中、ＭはＦ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩから選ばれる。
【請求項２２】
自己免疫疾患の治療用の請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
自己免疫疾患の治療用の請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
自己免疫疾患の治療用の請求項２１に記載の医薬組成物。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【公開番号】特開２０１０−２６８８０５（Ｐ２０１０−２６８８０５Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−１５３６７９（Ｐ２０１０−１５３６７９）
【出願日】平成２２年７月６日（２０１０．７．６）
【分割の表示】特願２０００−５６７２７９（Ｐ２０００−５６７２７９）の分割
【原出願日】平成１１年８月２７日（１９９９．８．２７）
【出願人】（５０１０８４１４５）セントロン・メディカル・インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＳＥＮＴＲＯＮ　ＭＥＤＩＣＡＬ，　ＩＮＣ．
【出願人】（３０３０４３６９０）アメリカ合衆国 (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ　ＧＯＶＥＲＮＭＥＮＴ　ＯＦ　ＴＨＥ　ＵＮＩＴＥＤ　ＳＴＡＴＥＳ　ＯＦ　ＡＭＥＲＩＣＡ　ａｓ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｂｙ　ＴＨＥ　ＳＥＣＲＥＴＡＲＹ，ＤＥＰＡＲＴＭＥＮＴ　ＯＦ　ＨＥＡＬＴＨ　ＡＮＤ　ＨＵＭＡＮ　ＳＥＲＶＩＣＥＳ
【Ｆターム（参考）】