蛋白質活性の検出および定量のための蛍光シグナル発光型生細胞バイオセンサー分子ならびに色素
本発明は、色素、バイオセンサー、ならびに、選択したターゲット分子を検出するために色素およびバイオセンサーを使用する方法、を提供する。バイオセンサーは、結合ドメイン、ならびに、色素もしくは所望のターゲットに直接結合した色素、を有する。本発明で考慮される結合ドメインは、所望のターゲット分子と相互作用し、且つ分子の所定の構造状態もしくは共有結合修飾(例えば、リン酸化)に対して特異的でありえるような、生分子もしくは生分子のフラグメントを含む。或る実施形態においては、バイオセンサーの結合ドメインは、一本鎖可変領域フラグメント(scFv)と、CDR3領域に結合した本発明に係る色素との組み合わせである。また、本発明は、選択したターゲットの結合の変化、構造的変化、もしくは翻訳後修飾を検出するために有用な、環境感受性色素も提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
(a) ターゲット分子への特異的な親和性を有する結合ドメインと、
(b) 前記結合ドメインが前記ターゲット分子に結合したときに、特に、疎水性、水素結合、極性、極性化、活性化、もしくは構造的な環境に曝される位置において、前記結合ドメインに結合した環境感受性色素と
を含み、
前記結合ドメインが前記ターゲット分子と結合している間もしくは結合した後の、前記疎水性、水素結合、極性、極性化、活性化、もしくは構造的な環境が変化した際に、前記色素からの蛍光シグナルが変化する
ことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項2】
前記ターゲット分子が、特定の構造をとるか、もしくは特定のリガンドに結合しているか、もしくは翻訳後修飾をされているときに、前記結合ドメインが前記ターゲット分子と結合することを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項3】
前記ターゲット分子が、リン酸化によって翻訳後修飾されていることを特徴とする、請求項2記載のバイオセンサー。
【請求項4】
前記結合ドメインが、前記ターゲット分子上のリン酸化部位の近傍に結合することを特徴とする、請求項3記載のバイオセンサー。
【請求項5】
前記ターゲット分子が、核酸もしくは蛋白質を含むことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項6】
前記結合ドメインが、核酸もしくはポリペプチドであることを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項7】
前記結合ドメインが、アプタマー、相補性決定領域(CDR)、 VH 領域、 VL 領域、Fvフラグメント、 F(ab) フラグメント、F(ab')2 フラグメント、抗体、抗体フラグメント、ロイシンジッパー、ヒストン、エンハンサー、一本鎖可変領域フラグメント(scFv)、リガンド、受容体、蛋白質複合体中のうちのひとつの蛋白質、アプタマー、もしくはレクチン、を含むことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項8】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、4、5、9、10、11、12、16、17、18、19、20、21、22、27に記載のうちのいずれかひとつの配列を含むことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項9】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号23もしくは24に記載の核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項10】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号5もしくは12に記載の配列を含み、ここで下記に示す配列表の配列番号5もしくは12の中の下線を引いたアミノ酸のうちの少なくともひとつが、システイン(cystene)であることを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【化1】
【請求項11】
前記色素が芳香環を含み、ここで、前記芳香環は、前記芳香環の成す平面から突出しているようなひとつもしくは複数の非平面状アルキル基もしくはヘテロ原子置換基を有していることを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項12】
前記環境感受性色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化2】
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I 、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2
、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、 HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリル( tolyl-acetonitrile )
であることを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項13】
前記蛍光シグナルが、約 400nm 以上の波長の光を含むことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項14】
前記蛍光シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)に依存したものでは無いことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項15】
前記結合ドメインが、リンカーによってターゲット分子と結合することを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項16】
前記リンカーが、ヒドロキシスクシンイミド基類、マレイミド基類、ハロアセチル基類、ピリジルジスルフィド基類、ヒドラジン類、エチルジエチルアミノ-プロピルカルボジイミド基、およびヨードアセトアミド基、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項15記載のバイオセンサー。
【請求項17】
二つ以上の色素分子が、前記結合ドメインに結合することを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項18】
前記色素分子のうちのひとつから発せられるシグナルが、前記結合ドメインのターゲット分子との結合に依って変化し、また、前記シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)によって生成されたものでは無いことを特徴とする、請求項17記載のバイオセンサー。
【請求項19】
前記色素分子が、前記結合ドメインと、システイン、リシン、アルギニン、天然アミノ酸側鎖、誘導体化アミノ酸側鎖、非天然アミノ酸の箇所で結合することを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項20】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含んだ一本鎖可変領域フラグメントを含み、ここで、
配列表の配列番号1は、
LTQSPGTLSLSAGERATLSC(X)nWYQQ
KPGQAPRLLIY(X)nGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDLAVYYC(X)n
であり、
配列表の配列番号2は、
QVQLVQSGAEVKKPGSSVQVSCKASGGTF(X)n
WVRQAPGHGLEWMG(X)nRVTFTADQATSTAYMELTNLRSDDT
AVYYCAR(X)nWGQGTLVTVSSPRGPAGQ
であり、
配列表の配列番号4は、
TQSPGTLSLSAGERATLSC(X)nWYQQKPGQA
PRLLIY(X)nGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDLAVYYC(X)nG
GGGSGGGGSGGGGSRSSQVQLVQSGAEVKKPGSSVQVSC
KASGGTF(X)nWVRQAPGHGLEWMG(X)nRVTFTADQATSTAY
MELTNLRSDDTAVYYCAR(X)nWGQGTLVTVSSPRGPAGQ
であって、
それぞれの X は、独立に、可変であるアミノ酸であり、 n は、約3〜約25の整数であって、また、ひとつもしくは複数のアミノ酸 X を、前記色素が結合する部位となるシステインとすることができる
ことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項21】
HIV を検出するためのバイオセンサーにおいて、 HIV と結合することが可能である結合ドメインと、色素とを含み、前記結合ドメインが、配列RASQSVSSGCLA(配列表の配列番号9)、GASCRAT (配列表の配列番号10)、 QQYGTSPCTFGQGTKVDIKR (配列表の配列番号11)、SMYGCN (配列表の配列番号16)、GIIPCFGTSNYAQKFRG(配列表の配列番号17)、 GIIPIFGTSNYAQKFCG (配列表の配列番号18)、DCGPDWEDGDSYDGSGRGFFDF(配列表の配列番号19)、DFGPDWEDCDSYDGSGRGFFDF (配列表の配列番号20)、DFGPDWEDGDCYDGSGRGFFDF (配列表の配列番号21)、もしくはDFGPDWEDGDSYDCSGRGFFDF (配列表の配列番号22)を有するペプチドから本質的に成るCDRフラグメントを含むことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項22】
前記色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化3】
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I 、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2 、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、 HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリルである
ことを特徴とする、請求項21記載のバイオセンサー。
【請求項23】
環境感受性蛍光色素において、
ひとつもしくは複数のインドール芳香環もしくはベンゾチオフェン芳香環と、
前記芳香環の成す平面から突出した、ひとつもしくは複数の非平面的脂肪族置換基またはヘテロ原子置換基と
を含み、前記色素が、疎水性、水素結合、極性、もしくは構造変化を含む環境の変化に曝されたときに、前記色素から発せられる蛍光シグナルが変化することを特徴とする、色素。
【請求項24】
前記色素が、約400nm以上の波長の励起もしくは光の放射を含むことを特徴とする、請求項23記載の色素。
【請求項25】
前記色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化4】
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I 、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2 、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、 HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリルである
ことを特徴とする、請求項23記載のバイオセンサー。
【請求項26】
前記色素が、ひとつもしくは複数のリンカーをさらに含むことを特徴とする、請求項23記載のバイオセンサー。
【請求項27】
前記色素が、バイオセンサー、結合ドメイン、生分子の結合部位、もしくはターゲット分子に結合することを特徴とする、請求項23記載のバイオセンサー。
【請求項28】
バイオセンサーと、
選択したターゲット分子を検出、監視、もしくは観察するために、前記バイオセンサーを使用する手引きと
を含み、また、
前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび色素を含み、
前記結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント(scFv)であって、前記抗体は、前記 scFv 内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、キット。
【請求項29】
色素と、
前記色素を使用する手引きと
を含み、前記色素が請求項25記載の色素であることを特徴とする、キット。
【請求項30】
前記キットの手引きが、前記色素を、選択した結合ドメインに結合させるための手引きを含むことを特徴とする、請求項29記載のキット。
【請求項31】
選択したターゲット分子を検出するための方法において、
前記選択したターゲットを含む可能性がある供試体を、バイオセンサーと接触させるステップと、
シグナルが、前記バイオセンサーから発せられたものであるかどうかを観察するステップと
を含み、前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび環境感受性色素を含み、また、前記結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント(scFv)であって、前記抗体が、前記scFvのCDR3領域の内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、方法。
【請求項32】
前記色素が結合する前記部位が、システインであることを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項33】
前記バイオセンサー結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項34】
前記色素が、請求項25記載の色素であることを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項35】
前記選択したターゲット分子が、蛋白質、受容体、リガンド、もしくは酵素、であることを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項36】
前記供試体が、生細胞、細胞リシス生成物、細胞ライブラリ、もしくは細胞培地、を含むことを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項37】
選択したターゲット分子の、細胞内部での活性もしくは位置を検出するための方法において、
前記細胞を、バイオセンサーと接触させるステップと、
前記バイオセンサーによって発せられたシグナルの変化、もしくは、前記シグナルの位置の変化、を観察するステップと
を含み、前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび色素を含み、また、前記結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント(scFv)であって、前記抗体が、前記scFvのCDR3領域の内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、方法。
【請求項38】
前記バイオセンサー結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項37記載の方法。
【請求項39】
前記色素が、請求項25記載の色素であることを特徴とする、請求項37記載の方法。
【請求項40】
前記選択されたターゲット分子が、蛋白質、受容体、リガンド、もしくは酵素、であることを特徴とする、請求項37記載の方法。
【請求項41】
前記選択されたターゲット分子の活性が、前記選択されたターゲット分子のリン酸化状態、細胞レベル以下の位置、細胞レベル以下の構造との相互作用、もしくは、細胞の蛋白質との相互作用、を含むことを特徴とする、請求項37記載の方法。
【請求項42】
選択した内因性ターゲット生分子と、細胞因子との相互作用を検出するための方法において、
a. 選択した内因性ターゲット生分子を含む細胞を同定するステップと、
b. 前記ターゲット生分子上の結合部位への特異的結合親和性を有する結合ドメインと、環境感受性色素とを含んだプローブ生分子を投与するステップと、
c. 前記プローブ生分子を、前記細胞と共にインキュベートするステップと、
d. 前記環境感受性色素から発せられるバックグラウンドシグナルを観察するステップと、
e. 前記環境感受性色素から発せられるシグナルの変化を検出することによって、前記ターゲット生分子と細胞因子との間の相互作用を検出するステップと
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項43】
前記細胞因子が、細胞の核酸、蛋白質、ペプチド、酵素、受容体、サイトカイン、細胞骨格、およびシグナル伝達蛋白質、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項44】
プローブ生分子の前記結合ドメインが、前記ターゲット生分子と、リン酸化部位において結合することができるものであることを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項45】
前記結合ドメインが、前記ターゲット生分子の、特定の構造、リガンド相互作用、もしくは翻訳後修飾に対する、特異的親和性を有することを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項46】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、4、5、9、10、11、16、17、18、19、20、21、22、もしくは27に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項47】
前記色素が、約600nm以上の波長の励起もしくは光の放射を含むことを特徴とする、
請求項42記載の方法。
【請求項48】
前記環境感受性色素が、請求項25記載の色素であることを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項49】
前記環境感受性色素が、前記結合ドメインと、前記プローブ生分子と前記ターゲット生分子との間の結合に対して影響を実質的に及ぼさない部位で結合することを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項50】
前記部位が、前記結合部位もしくは前記ターゲット生分子の結晶構造の検査によって選択されるものであることを特徴とする、請求項49記載の方法。
【請求項51】
前記プローブ生分子が、TATペプチドと縮合していることを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項52】
前記プローブ生分子を、電気穿孔法、形質導入、微量穿孔法、微量注入、界面活性剤、もしくは噴出物を使用することによって、前記細胞内へと導入するステップ、をさらに含むことを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項53】
前記シグナルの変化が、蛍光が少なくとも50%増加するものであることを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項54】
シグナルの変化を検出する前記ステップが、蛍光定量法、分光法、基質の酵素の変化、検鏡法、もしくは質量分光法、を含むことを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項55】
シグナルの変化を検出する前記ステップが、
蛋白質の量を定量するステップ、蛋白質の位置決定をするステップ、前記ターゲットの構造変化を検出するステップ、前記ターゲットの活性化を検出するステップ、もしくは、前記ターゲットのリン酸化を検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項56】
対象とするターゲット分子の変化を検出するための方法において、
(a) ターゲット分子に、前記ターゲット分子上の部位に結合した環境感受性色素を加えるステップと、
(b) 前記色素から発せられるシグナルの、前記ターゲット分子を新たな環境に曝したことに因る変化を検出するステップと
を含み、
前記ターゲット分子上の前記部位の、疎水性、水素結合、極性、極性化、リン酸化、ポリペプチドの折り返し、水和、リガンド結合、もしくは、サブユニット相互作用が、前記ターゲット分子を前記新たな環境に曝すことによって変化するものである
ことを特徴とする、方法。
【請求項57】
前記色素が、請求項25記載の色素であることを特徴とする、請求項56記載の方法。
【請求項58】
GTP加水分解酵素(GTPアーゼ)の活性化を検出するためのバイオセンサーにおいて、
GTP加水分解酵素配列、第一蛍光蛋白質、第二蛍光蛋白質、および、前記GTP加水分解酵素の活性化形態と結合するドメイン、の順番で含んでいるポリペプチド鎖を含む
ことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項59】
前記GTP加水分解酵素が、Rho であることを特徴とする、請求項58記載のバイオセンサー。
【請求項60】
前記第一蛍光蛋白質および前記第二蛍光蛋白質が、シアン蛍光蛋白質(CFP)、もしくは黄色蛍光蛋白質(YFP)を含むことを特徴とする、請求項58記載のバイオセンサー。
【請求項61】
前記ドメインが、活性化されていない前記GPT加水分解酵素の配列に対するものよりも大きい親和性を以って、活性化されたGTP加水分解酵素配列と結合することを特徴とする、請求項58記載のバイオセンサー。
【請求項62】
前記ドメインが、前記GTP加水分解酵素配列に結合することによって、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)が発生することを特徴とする、請求項58記載のバイオセンサー。
【請求項63】
前記ペプチド鎖をコードしている核酸配列を含んだ発現ベクターをさらに含むことを特徴とする、請求項58記載のバイオセンサー。
【請求項64】
Cdc42 の活性化を検出するためのバイオセンサーにおいて、
WASP ポリペプチド鎖と、
請求項25記載の色素と
を含むことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項65】
前記WASPポリペプチド鎖が、配列表の配列番号27に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項64記載のバイオセンサー。
【請求項66】
前記色素が、前記WASPポリペプチド鎖と、配列表の配列番号28に記載の配列の位置271に対応した位置において結合することを特徴とする、請求項64記載のバイオセンサー。
【請求項1】
(a) ターゲット分子への特異的な親和性を有する結合ドメインと、
(b) 前記結合ドメインが前記ターゲット分子に結合したときに、特に、疎水性、水素結合、極性、極性化、活性化、もしくは構造的な環境に曝される位置において、前記結合ドメインに結合した環境感受性色素と
を含み、
前記結合ドメインが前記ターゲット分子と結合している間もしくは結合した後の、前記疎水性、水素結合、極性、極性化、活性化、もしくは構造的な環境が変化した際に、前記色素からの蛍光シグナルが変化する
ことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項2】
前記ターゲット分子が、特定の構造をとるか、もしくは特定のリガンドに結合しているか、もしくは翻訳後修飾をされているときに、前記結合ドメインが前記ターゲット分子と結合することを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項3】
前記ターゲット分子が、リン酸化によって翻訳後修飾されていることを特徴とする、請求項2記載のバイオセンサー。
【請求項4】
前記結合ドメインが、前記ターゲット分子上のリン酸化部位の近傍に結合することを特徴とする、請求項3記載のバイオセンサー。
【請求項5】
前記ターゲット分子が、核酸もしくは蛋白質を含むことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項6】
前記結合ドメインが、核酸もしくはポリペプチドであることを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項7】
前記結合ドメインが、アプタマー、相補性決定領域(CDR)、 VH 領域、 VL 領域、Fvフラグメント、 F(ab) フラグメント、F(ab')2 フラグメント、抗体、抗体フラグメント、ロイシンジッパー、ヒストン、エンハンサー、一本鎖可変領域フラグメント(scFv)、リガンド、受容体、蛋白質複合体中のうちのひとつの蛋白質、アプタマー、もしくはレクチン、を含むことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項8】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、4、5、9、10、11、12、16、17、18、19、20、21、22、27に記載のうちのいずれかひとつの配列を含むことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項9】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号23もしくは24に記載の核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項10】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号5もしくは12に記載の配列を含み、ここで下記に示す配列表の配列番号5もしくは12の中の下線を引いたアミノ酸のうちの少なくともひとつが、システイン(cystene)であることを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【化1】
【請求項11】
前記色素が芳香環を含み、ここで、前記芳香環は、前記芳香環の成す平面から突出しているようなひとつもしくは複数の非平面状アルキル基もしくはヘテロ原子置換基を有していることを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項12】
前記環境感受性色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化2】
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I 、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2
、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、 HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリル( tolyl-acetonitrile )
であることを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項13】
前記蛍光シグナルが、約 400nm 以上の波長の光を含むことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項14】
前記蛍光シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)に依存したものでは無いことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項15】
前記結合ドメインが、リンカーによってターゲット分子と結合することを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項16】
前記リンカーが、ヒドロキシスクシンイミド基類、マレイミド基類、ハロアセチル基類、ピリジルジスルフィド基類、ヒドラジン類、エチルジエチルアミノ-プロピルカルボジイミド基、およびヨードアセトアミド基、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項15記載のバイオセンサー。
【請求項17】
二つ以上の色素分子が、前記結合ドメインに結合することを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項18】
前記色素分子のうちのひとつから発せられるシグナルが、前記結合ドメインのターゲット分子との結合に依って変化し、また、前記シグナルが、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)によって生成されたものでは無いことを特徴とする、請求項17記載のバイオセンサー。
【請求項19】
前記色素分子が、前記結合ドメインと、システイン、リシン、アルギニン、天然アミノ酸側鎖、誘導体化アミノ酸側鎖、非天然アミノ酸の箇所で結合することを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項20】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含んだ一本鎖可変領域フラグメントを含み、ここで、
配列表の配列番号1は、
LTQSPGTLSLSAGERATLSC(X)nWYQQ
KPGQAPRLLIY(X)nGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDLAVYYC(X)n
であり、
配列表の配列番号2は、
QVQLVQSGAEVKKPGSSVQVSCKASGGTF(X)n
WVRQAPGHGLEWMG(X)nRVTFTADQATSTAYMELTNLRSDDT
AVYYCAR(X)nWGQGTLVTVSSPRGPAGQ
であり、
配列表の配列番号4は、
TQSPGTLSLSAGERATLSC(X)nWYQQKPGQA
PRLLIY(X)nGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDLAVYYC(X)nG
GGGSGGGGSGGGGSRSSQVQLVQSGAEVKKPGSSVQVSC
KASGGTF(X)nWVRQAPGHGLEWMG(X)nRVTFTADQATSTAY
MELTNLRSDDTAVYYCAR(X)nWGQGTLVTVSSPRGPAGQ
であって、
それぞれの X は、独立に、可変であるアミノ酸であり、 n は、約3〜約25の整数であって、また、ひとつもしくは複数のアミノ酸 X を、前記色素が結合する部位となるシステインとすることができる
ことを特徴とする、請求項1記載のバイオセンサー。
【請求項21】
HIV を検出するためのバイオセンサーにおいて、 HIV と結合することが可能である結合ドメインと、色素とを含み、前記結合ドメインが、配列RASQSVSSGCLA(配列表の配列番号9)、GASCRAT (配列表の配列番号10)、 QQYGTSPCTFGQGTKVDIKR (配列表の配列番号11)、SMYGCN (配列表の配列番号16)、GIIPCFGTSNYAQKFRG(配列表の配列番号17)、 GIIPIFGTSNYAQKFCG (配列表の配列番号18)、DCGPDWEDGDSYDGSGRGFFDF(配列表の配列番号19)、DFGPDWEDCDSYDGSGRGFFDF (配列表の配列番号20)、DFGPDWEDGDCYDGSGRGFFDF (配列表の配列番号21)、もしくはDFGPDWEDGDSYDCSGRGFFDF (配列表の配列番号22)を有するペプチドから本質的に成るCDRフラグメントを含むことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項22】
前記色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化3】
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I 、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2 、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、 HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリルである
ことを特徴とする、請求項21記載のバイオセンサー。
【請求項23】
環境感受性蛍光色素において、
ひとつもしくは複数のインドール芳香環もしくはベンゾチオフェン芳香環と、
前記芳香環の成す平面から突出した、ひとつもしくは複数の非平面的脂肪族置換基またはヘテロ原子置換基と
を含み、前記色素が、疎水性、水素結合、極性、もしくは構造変化を含む環境の変化に曝されたときに、前記色素から発せられる蛍光シグナルが変化することを特徴とする、色素。
【請求項24】
前記色素が、約400nm以上の波長の励起もしくは光の放射を含むことを特徴とする、請求項23記載の色素。
【請求項25】
前記色素が、下記の構造式の化合物のうちのひとつであって、
【化4】
ここで、
R1 は、低級アルキル基、 -(CH2)3-SO3-、-(CH2)3-NH-CO-CH2-I 、もしくは -(CH2)3-N+(CH3)2-(CH2)2-NCSであり、
R2 は、 H 、 -NH2 、 -SO3- 、 CH3CONH-、ICH2CONH- 、 HO(CH2)2-S-CH2CONH- 、SuOCOCH2OCH2CON(CH3)-、もしくは保護基であり、
R3 は、低級アルキル基、もしくはトリル-アセトニトリルである
ことを特徴とする、請求項23記載のバイオセンサー。
【請求項26】
前記色素が、ひとつもしくは複数のリンカーをさらに含むことを特徴とする、請求項23記載のバイオセンサー。
【請求項27】
前記色素が、バイオセンサー、結合ドメイン、生分子の結合部位、もしくはターゲット分子に結合することを特徴とする、請求項23記載のバイオセンサー。
【請求項28】
バイオセンサーと、
選択したターゲット分子を検出、監視、もしくは観察するために、前記バイオセンサーを使用する手引きと
を含み、また、
前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび色素を含み、
前記結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント(scFv)であって、前記抗体は、前記 scFv 内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、キット。
【請求項29】
色素と、
前記色素を使用する手引きと
を含み、前記色素が請求項25記載の色素であることを特徴とする、キット。
【請求項30】
前記キットの手引きが、前記色素を、選択した結合ドメインに結合させるための手引きを含むことを特徴とする、請求項29記載のキット。
【請求項31】
選択したターゲット分子を検出するための方法において、
前記選択したターゲットを含む可能性がある供試体を、バイオセンサーと接触させるステップと、
シグナルが、前記バイオセンサーから発せられたものであるかどうかを観察するステップと
を含み、前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび環境感受性色素を含み、また、前記結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント(scFv)であって、前記抗体が、前記scFvのCDR3領域の内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、方法。
【請求項32】
前記色素が結合する前記部位が、システインであることを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項33】
前記バイオセンサー結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項34】
前記色素が、請求項25記載の色素であることを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項35】
前記選択したターゲット分子が、蛋白質、受容体、リガンド、もしくは酵素、であることを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項36】
前記供試体が、生細胞、細胞リシス生成物、細胞ライブラリ、もしくは細胞培地、を含むことを特徴とする、請求項31記載の方法。
【請求項37】
選択したターゲット分子の、細胞内部での活性もしくは位置を検出するための方法において、
前記細胞を、バイオセンサーと接触させるステップと、
前記バイオセンサーによって発せられたシグナルの変化、もしくは、前記シグナルの位置の変化、を観察するステップと
を含み、前記バイオセンサーが、結合ドメインおよび色素を含み、また、前記結合ドメインが、抗体の一本鎖可変領域フラグメント(scFv)であって、前記抗体が、前記scFvのCDR3領域の内部に、色素が結合する部位を有している
ことを特徴とする、方法。
【請求項38】
前記バイオセンサー結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、もしくは4に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項37記載の方法。
【請求項39】
前記色素が、請求項25記載の色素であることを特徴とする、請求項37記載の方法。
【請求項40】
前記選択されたターゲット分子が、蛋白質、受容体、リガンド、もしくは酵素、であることを特徴とする、請求項37記載の方法。
【請求項41】
前記選択されたターゲット分子の活性が、前記選択されたターゲット分子のリン酸化状態、細胞レベル以下の位置、細胞レベル以下の構造との相互作用、もしくは、細胞の蛋白質との相互作用、を含むことを特徴とする、請求項37記載の方法。
【請求項42】
選択した内因性ターゲット生分子と、細胞因子との相互作用を検出するための方法において、
a. 選択した内因性ターゲット生分子を含む細胞を同定するステップと、
b. 前記ターゲット生分子上の結合部位への特異的結合親和性を有する結合ドメインと、環境感受性色素とを含んだプローブ生分子を投与するステップと、
c. 前記プローブ生分子を、前記細胞と共にインキュベートするステップと、
d. 前記環境感受性色素から発せられるバックグラウンドシグナルを観察するステップと、
e. 前記環境感受性色素から発せられるシグナルの変化を検出することによって、前記ターゲット生分子と細胞因子との間の相互作用を検出するステップと
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項43】
前記細胞因子が、細胞の核酸、蛋白質、ペプチド、酵素、受容体、サイトカイン、細胞骨格、およびシグナル伝達蛋白質、から成る群から選択されることを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項44】
プローブ生分子の前記結合ドメインが、前記ターゲット生分子と、リン酸化部位において結合することができるものであることを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項45】
前記結合ドメインが、前記ターゲット生分子の、特定の構造、リガンド相互作用、もしくは翻訳後修飾に対する、特異的親和性を有することを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項46】
前記結合ドメインが、配列表の配列番号1、2、4、5、9、10、11、16、17、18、19、20、21、22、もしくは27に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項47】
前記色素が、約600nm以上の波長の励起もしくは光の放射を含むことを特徴とする、
請求項42記載の方法。
【請求項48】
前記環境感受性色素が、請求項25記載の色素であることを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項49】
前記環境感受性色素が、前記結合ドメインと、前記プローブ生分子と前記ターゲット生分子との間の結合に対して影響を実質的に及ぼさない部位で結合することを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項50】
前記部位が、前記結合部位もしくは前記ターゲット生分子の結晶構造の検査によって選択されるものであることを特徴とする、請求項49記載の方法。
【請求項51】
前記プローブ生分子が、TATペプチドと縮合していることを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項52】
前記プローブ生分子を、電気穿孔法、形質導入、微量穿孔法、微量注入、界面活性剤、もしくは噴出物を使用することによって、前記細胞内へと導入するステップ、をさらに含むことを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項53】
前記シグナルの変化が、蛍光が少なくとも50%増加するものであることを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項54】
シグナルの変化を検出する前記ステップが、蛍光定量法、分光法、基質の酵素の変化、検鏡法、もしくは質量分光法、を含むことを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項55】
シグナルの変化を検出する前記ステップが、
蛋白質の量を定量するステップ、蛋白質の位置決定をするステップ、前記ターゲットの構造変化を検出するステップ、前記ターゲットの活性化を検出するステップ、もしくは、前記ターゲットのリン酸化を検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項42記載の方法。
【請求項56】
対象とするターゲット分子の変化を検出するための方法において、
(a) ターゲット分子に、前記ターゲット分子上の部位に結合した環境感受性色素を加えるステップと、
(b) 前記色素から発せられるシグナルの、前記ターゲット分子を新たな環境に曝したことに因る変化を検出するステップと
を含み、
前記ターゲット分子上の前記部位の、疎水性、水素結合、極性、極性化、リン酸化、ポリペプチドの折り返し、水和、リガンド結合、もしくは、サブユニット相互作用が、前記ターゲット分子を前記新たな環境に曝すことによって変化するものである
ことを特徴とする、方法。
【請求項57】
前記色素が、請求項25記載の色素であることを特徴とする、請求項56記載の方法。
【請求項58】
GTP加水分解酵素(GTPアーゼ)の活性化を検出するためのバイオセンサーにおいて、
GTP加水分解酵素配列、第一蛍光蛋白質、第二蛍光蛋白質、および、前記GTP加水分解酵素の活性化形態と結合するドメイン、の順番で含んでいるポリペプチド鎖を含む
ことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項59】
前記GTP加水分解酵素が、Rho であることを特徴とする、請求項58記載のバイオセンサー。
【請求項60】
前記第一蛍光蛋白質および前記第二蛍光蛋白質が、シアン蛍光蛋白質(CFP)、もしくは黄色蛍光蛋白質(YFP)を含むことを特徴とする、請求項58記載のバイオセンサー。
【請求項61】
前記ドメインが、活性化されていない前記GPT加水分解酵素の配列に対するものよりも大きい親和性を以って、活性化されたGTP加水分解酵素配列と結合することを特徴とする、請求項58記載のバイオセンサー。
【請求項62】
前記ドメインが、前記GTP加水分解酵素配列に結合することによって、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)が発生することを特徴とする、請求項58記載のバイオセンサー。
【請求項63】
前記ペプチド鎖をコードしている核酸配列を含んだ発現ベクターをさらに含むことを特徴とする、請求項58記載のバイオセンサー。
【請求項64】
Cdc42 の活性化を検出するためのバイオセンサーにおいて、
WASP ポリペプチド鎖と、
請求項25記載の色素と
を含むことを特徴とする、バイオセンサー。
【請求項65】
前記WASPポリペプチド鎖が、配列表の配列番号27に記載の配列を含むことを特徴とする、請求項64記載のバイオセンサー。
【請求項66】
前記色素が、前記WASPポリペプチド鎖と、配列表の配列番号28に記載の配列の位置271に対応した位置において結合することを特徴とする、請求項64記載のバイオセンサー。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D1】
【図14D2】
【図15A】
【図15B1】
【図15B2】
【図15C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D1】
【図14D2】
【図15A】
【図15B1】
【図15B2】
【図15C】
【公表番号】特表2007−529718(P2007−529718A)
【公表日】平成19年10月25日(2007.10.25)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−503107(P2007−503107)
【出願日】平成17年3月14日(2005.3.14)
【国際出願番号】PCT/US2005/008426
【国際公開番号】WO2005/088308
【国際公開日】平成17年9月22日(2005.9.22)
【出願人】(504440959)ザ スクリップス リサーチ インスティチュート (1)
【氏名又は名称原語表記】THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE
【Fターム(参考)】
【公表日】平成19年10月25日(2007.10.25)
【国際特許分類】
【出願日】平成17年3月14日(2005.3.14)
【国際出願番号】PCT/US2005/008426
【国際公開番号】WO2005/088308
【国際公開日】平成17年9月22日(2005.9.22)
【出願人】(504440959)ザ スクリップス リサーチ インスティチュート (1)
【氏名又は名称原語表記】THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE
【Fターム(参考)】
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