２‘水酸基を修飾された新規人工ＲＮＡ
本発明の目的は、穏やかな条件で効率的にシアノエチルエーテルを構築する系、及び機能性官能基としての可能性を開拓し新規機能性核酸の創製に寄与することである。
本発明は、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシドもしくはそのヌクレオチド：
【化１】
（式Ｉ中、Ｘ及びＹは同一または異なって、水素、置換基を有していてもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は一般式（ＩＩ）：
【化２】
（式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ２は同一または異なって、炭素数１から７のアルキル基を表すか、又は、Ｒ1およびＲ２が互いに結合して環構造を形成し、Ｒ３はリン酸の保護基を表す）を表し、Ｂ１は置換基を有していてもよいピリミジン塩基又はプリン塩基を表す。）に関する。
本発明は、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシドもしくはそのヌクレオチド：
【化１】
（式Ｉ中、Ｘ及びＹは同一または異なって、水素、置換基を有していてもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は一般式（ＩＩ）：
【化２】
（式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ２は同一または異なって、炭素数１から７のアルキル基を表すか、又は、Ｒ1およびＲ２が互いに結合して環構造を形成し、Ｒ３はリン酸の保護基を表す）を表し、Ｂ１は置換基を有していてもよいピリミジン塩基又はプリン塩基を表す。）に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２‘水酸基をシアノエチルエーテル化したヌクレオシド、ヌクレオチド及びそれらのホスホロアミダイト化合物に関する。これらの化合物は、核酸合成試薬としてまた修飾ＲＮＡとして各々用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
化学的に合成されたオリゴリボヌクレオチド（オリゴＲＮＡ）は、遺伝子解析用のＲＮＡプローブ、ＲＮＡ医薬品素材（アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡを利用した遺伝子発現制御）、人工酵素、アプタマーとして利用することが可能である。
【０００３】
２‘水酸基をメチルエーテル誘導体は市販されていることもあり、エーテル修飾体として汎用されている。しかしながらこの修飾ＲＮＡでは、遺伝子制御物質として用いる場合細胞内における酵素耐性の点で問題がある。一方、同様のエーテル型修飾としてメトキシエチルエーテル誘導体も汎用されている。こちらの化合物は、メチル修飾体と比較して酵素耐性の点で優れていると報告されている（非特許文献１）。しかし、それらの調製には、導入法や導入試薬に制限がつくためピリミジンヌクレオシド、プリンヌクレオシドに共通な合成法がないのが現状である。また、エーテル鎖中に存在する酸素原子の影響によりエーテル鎖の構造が制限されているためオリゴＲＮＡ合成の際、縮合効率の点で問題が生じる可能性が十分考えられる。
【０００４】
これらの問題点を解決するには、炭素数が３炭素程度でエーテル鎖中に酸素原子を含まず末端に電子吸引性でかつ親水性置換を有するエーテル修飾体の開発を行うことが有用である。
【０００５】
【非特許文献１】VonPierre Martin, ヘルベチカ チミカ アクタ, 1995, 78, 486-504
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のような条件を満たすエーテル修飾体としてシアノエチルエーテルが考えられる。このエーテルはアクリロニトリルを導入試薬とすることで安価に修飾体が得られるという利点がある。しかし、導入には強塩基例えば水酸化ナトリウムなどを用いて加熱という過酷な条件を要する問題点があった。また、機能性官能基としての可能性は核酸化学において開拓されていない。
【０００７】
本発明は、穏やかな条件で効率的にシアノエチルエーテルを構築する系、及び機能性官能基としての可能性を開拓し新規機能性核酸の創製に寄与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者は、アクリトニトリルを２−シアノエチル化の合成原料に用いるとともに、水酸基を活性化する塩基として最適なものを探索した結果、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシド又はそのヌクレオチド（式Ｉ中、Ｘ及びＹは同一または異なって、水素、置換基を有していてもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は一般式（ＩＩ）（式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ２は同一または異なって、例えば、ジイソプロピルのような炭素数１から７のアルキル基を表すか、又は、Ｒ1およびＲ２が互いに結合して環構造を形成し、Ｒ３は、例えば、２−シアノエチルのようなリン酸の保護基を表す）を表し、Ｂ１は置換基を有していてもよいピリミジン塩基又はプリン塩基を表す。）に係る。
【００１０】
更に、本発明は、上記一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシドの合成方法であって、炭酸セシウム、ＤＢＵ，及びＴｒｉｔｏｎＢから成る群から選択される少なくとも一種の化合物とアクリロニトリルとヌクレオシド誘導体を合成原料として用い、ｔ−ブチルアルコールの存在下又は非存在下で、２‘水酸基をシアノエチルエーテル化することを特徴とする、前記合成方法に係る。
【００１１】
本発明は又、これら合成方法で得られたヌクレオシドのホスホロアミダイト化合物にも係る。尚、本発明のホスホロアミダイト化合物は、当業者に公知のホスホロアミダイト法を用いて、当業者であれば容易に調製することが出来る。更に、本発明は上記ヌクレオシド（一般式（Ｉ）におけるＸ及びＹを除いた部分）を含むＲＮＡオリゴマーにも係る。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のシアノエチル化反応により種々の水酸基のシアノエチル化を効率よく実施することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明で得られたRNAオリゴマーの陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによる分析プロファイルを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明化合物において、ピリミジン塩基又はプリン塩基であるＢ１の置換基の具体例としては、当業者に公知の任意の基、例えば、Ｎ−ジメチルアミノメチレン、Ｎ−アセチル、及びトリイソプロピルベンゼンスルホニル基等の本明細書の実施例中に記載されたものを挙げることができる。
また、ホスホロアミダイト基（ＩＩ）中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、イソプロピル基等の炭素数１から７のアルキル基を表すか、又は、Ｒ1およびＲ２が互いに環構造を形成する。又、リン酸の保護基であるＲ３は、例えば、２−シアノエチル基、４−ニトロフェニルエチル基、Ｎ−（トリフロオロアセチル）アミノブチル基、又は、４−［Ｎ−メチル−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］ブチル基を挙げることが出来、２−シアノエチル基が好適である。
【００１５】
本発明の合成方法において、炭酸セシウム、ＤＢＵ，及びＴｒｉｔｏｎＢから成る群から選択される少なくとも一種の化合物、特に、好適には炭酸セシウムの存在下で、合成原料としてアクリロニトリル及びヌクレオシド誘導体を用いる合成方法であり、これら化合物はヌクレオシド誘導体に対して０．１〜３０ｅｑｕｉｖの範囲で反応系に存在させ、更に、アクリロニトリルに対して０．０５〜３０ｅｑｕｉｖの範囲のｔ−ブチルアルコールの存在下に反応を行うことが好適である。通常、２０℃〜３０℃の温度範囲で反応させることが好ましく、又、反応時間は２時間〜３時間の範囲であることが好ましい。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【００１７】
実施例１：２’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ３‐ベンゾイル‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐ウリジン（化合物１）
【００１８】
【化１】
【００１９】
Ｎ３‐ベンゾイル‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐ウリジン化合物 (５９１ｍｇ,１ｍｍｏｌ)をｔ−ブチルアルコール（５ｍｌ）に溶解させた。そこにアクリロニトリル（１．３ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）、引き続き炭酸セシウム（３５３ｍｇ， １ｍｍｏｌ）を加え２時間激しく撹拌した。その後、セライトろ過により炭酸セシウムを取り除き、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）により精製し白色結晶として標題化合物（５９３ｍｇ，０．９２１ｍｍｏｌ）を収率９２％で得た。分析用サンプルにはクロロホルム−ジイソプロピルエーテルから結晶化したものを用いた。ｍ．ｐ．１５９℃。
【００２０】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)0.94‐1.12(28H, m), 2.61‐2.63(2H, m), 3.91‐4.05(4H, m), 4.18‐4.29(3H, m), 5.70(1H,s), 5.79(1H, d, J=8.30), 7.49-7.94(5H, m), 8.00(1H, d, J=8.30)
【００２１】
実施例２ ２’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ３‐ベンゾイルウリジン（化合物２）
【００２２】
【化２】
【００２３】
得られた化合物１（３２２ｍｇ，０．５４５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３ｍｌ）に溶解させ、あらかじめ調製したテトラブチルアンモニウムフルオリド（３２７ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ）と酢酸（７２μｌ，１．２５ｍｍｏｌ）のテトラヒドフラン溶液（２ｍｌ）をゆっくりと滴下した。１時間撹拌させた後、反応液をクロロホルムで希釈し飽和食塩水で３回洗浄した。有機層を分離後、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：アセトン＝１０：１）により精製し白色泡状物質として標題化合物（１４７ｍｇ，０．３６６ｍｍｏｌ）を収率６７％で得た。
【００２４】
1H-NMR(CDCl3, 500 MHz)2.63‐2.66(2H, m), 3.83‐3.90(2H, m), 4.04‐4.09(4H, m), 4.31(1H, dd, J=5.37, 7.32), 5.81(1H, d, J=1.71), 5.83(1H, d, J=8.30), 7.50‐7.94(5H, m), 8.10(1H, d, J=8.30)
【００２５】
実施例３ ２’−Ｏ−（２−シアノエチル）ウリジン（化合物３）
【００２６】
【化３】
【００２７】
得られた化合物２（８０ｍｇ，０．２０２ｍｍｏｌ）をエタノール：アンモニア水（２ｍｌ，３：１，ｖ／ｖ）に溶解させ３時間撹拌した。その後、減圧濃縮して得られた残渣を１ｍｌのメタノールに溶かし１０ｍｌのエーテルで希釈して３ｍｌの蒸留水で３回抽出した。水層を減圧濃縮し、得られた残渣を球状シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５：１）で精製し白色泡状物質として標題化合物（５７ｍｇ， ０．１９１ｍｍｏｌ）を収率９５％で得た。
【００２８】
1H-NMR(D2O, 500 MHz)2.70‐2.72(2H, m), 3.69(1H, dd, J=4.15, 12.9 Hz), 3.82‐3.85(3H, m), 4.02‐4.04(1H, m), 4.08(1H, dd, J=3.66, 5.23), 4.19(1H, t, J=5.62, 6.10), 5.77(1H, d, J=8.06), 5.87(1H, d, J=3.66), 7.80(1H, d, J=8.06)
【００２９】
実施例４ ５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ３‐ベンゾイルウリジン（化合物４）
【００３０】
【化４】
【００３１】
化合物１（２．７０ｇ，４．１９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍｌ）に溶解させ、あらかじめ調製したテトラブチルアンモニウムフルオリド（２．７５ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）と酢酸（０．６ｍｌ，１０．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドフラン溶液（２０ｍｌ）をゆっくりと滴下した。７時間撹拌させた後、反応液をクロロホルムで希釈し飽和食塩水で３回洗浄した。水層をクロロホルムで抽出し、有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：アセトン＝１０：１）により精製し化合物２を得た。引き続き、乾燥ピリジンにて３回共沸脱水を行い、乾燥ピリジン（４０ｍｌ）に溶解させた。塩化ジメトキシトリチル（１．７１ｇ， ５．０４ｍｍｏｌ）を加えて７時間撹拌させた後、反応系に水を加えて反応を停止した。減圧濃縮して得られた残渣をクロロホルムで希釈し、飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し白色泡状物質として標題化合物（２．０７ｇ， ２．８４ｍｍｏｌ）を収率７０％で得た。
【００３２】
1H-NMR(CDCl3, 500 MHz)2.55‐2.62(3H, m), 3.57‐3.64(2H, m), 3.79‐3.86(7H, m), 4.00(1H, d, J=5.13), 4.04‐4.07(1H, m), 4.12‐4.15(1H, m), 4.53(1H, ddd, J=5.13, 9.40, 9.52), 5.37(1H, d, J=8.30), 5.86(1H, s), 6.86(4H, dd, J=1.22, 8.79), 7.24-7.34(7H, m), 7.42(2H, br), 7.49(2H, br), 7.64(2H, br), 7.93(2H, br), 8.22(1H, J=8.30)
【００３３】
実施例５ ５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ３‐ベンゾイルウリジン （２‐シアノエチル Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物５）
【００３４】
【化５】
【００３５】
アルゴン雰囲気下、五酸化ニリンを乾燥剤としてデシケータにて減圧乾燥させた上記化合物４（１．０６ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）とテトラゾールジイソプロピルアンモニウム塩（１９３ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル（７ｍｌ）に溶解させた。２‐シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ‐テトライソプロピルホスホロジアミダイト（６７８ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル（３ｍｌ）の溶液として反応系に滴下した。５時間撹拌した後、反応液をクロロホルムで希釈し飽和食塩水で２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した。水層をクロロホルムで抽出し、得られた有機層を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を球状シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１ ０．５％トリエチルアミン）で精製し白色泡状物質として標題化合物（１．２７ｇ，１．４０ｍｍｏｌ）を収率９３％で得た。
【００３６】
1H‐NMR(CDCl3, 500 MHz)1.08‐1.30(12H, m), 2.47‐2.68(4H, m), 3.49‐4.30(16H, m), 4.59‐4.80(1H, br), 5.28‐5.37(1H, m), 5.85(1H, m), 6.83‐6.91(4H, m), 7.24‐7.66(13H, m), 8.00‐8.03( 2H, m), 8.24‐8.30(1H, m)
【００３７】
実施例６ ５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）ウリジン（化合物６）
【００３８】
【化６】
【００３９】
２‘‐Ｏ‐シアノエチルウリジン（化合物３）（１．９７ｇ，６．６３ｍｍｏｌ）をピリジン（７０ｍｌ）に溶解させ、ジメトキシトリチルクロリド（２．４７ｇ，７．２９ｍｍｏｌ）を加え４時間撹拌する。その後、反応液を減圧濃縮してクロロホルムで希釈し飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０から２０：１、含０．５％トリエチルアミン）で精製し標題化合物（３．９１ｇ，９９％）を得た。
【００４０】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)2.68‐2,71(2H, m), 3.53‐3.58(2H, m), 3.78‐3.79(6H, m), 3.90‐3.98(2H, m), 4.03‐4.06(1H, m), 4.17‐4.22(1H, m), 4.49(1H, dd), 5.31(1H, d), 5.89(1H, s), 6.84(4H, d), 7.22-7.40(9H, m),8.06(1H, d)
【００４１】
実施例７ ５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）ウリジン ３’−（２−シアノエチル Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物７）
【００４２】
【化７】
【００４３】
上記化合物６（１．２０ｇ，２．００ｍｍｏｌ）を脱水トルエンにて５回共沸脱水した後アルゴン置換した。乾燥ジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍｌ，２．８７ｍｍｏｌ）、２‐シアノエチルＮ，Ｎ‐ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（５２１ｍｇ，２．２０ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（２ｍｌ）の溶液として反応系に滴下した。室温で２時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣をＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０→５０：１）で精製し標題化合物（１．３３ｇ，８３％）を得た。
【００４４】
1H‐NMR(CDCl3, 500 MHz)1.08‐1.21(12H, m), 2.60‐2.77(4H, m), 3.43‐3.76(4H, m), 3.79‐3.80(6H, m), 3.87-4.84(6H, m), 5.18-5.29(1H, m), 5.88-5.90(1H, m), 6.81-6.87(4H, m), 7.23-7.39( 9H, m), .05-8.13(1H, m)
【００４５】
実施例８ Ｎ４‐ジメチルアミノメチレン‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐２‘‐Ｏ‐（２−シアノエチル）シチジン（化合物８）
【００４６】
【化８】
【００４７】
Ｎ４‐ジメチルアミノメチレン‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐シチジン(５４１ｍｇ, 1ｍｍｏｌ)をｔ−ブチルアルコール（５ｍｌ）に溶解させた。そこにアクリロニトリル（１．３ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）、引き続き炭酸セシウム（３５３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加え３時間激しく撹拌した。その後、セライトろ過により炭酸セシウムを取り除き、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（４０：１）で精製し標題化合物（５２８ｍｇ、８９％）を得た。
【００４８】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)0.85‐1.06(28H, m), 2.69‐2.73(2H, m), 3.10(3H, s), 3.12(3H, s), 3.86‐4.24(7H,m), 5.74(1H, s), 6.01(1H, dd), 8.01(1H, d), 8.76(1H, s)
【００４９】
実施例９ Ｎ４‐ジメチルアミノメチレン‐２‘‐Ｏ‐（２−シアノエチル）シチジン（化合物９）
【００５０】
【化９】
【００５１】
得られた化合物８(３４７ｍｇ, ０．５８４ｍｍｏｌ)をテトラヒドロフラン６ｍｌ）に溶解させた。そこにトリエチルアミン3フッ化水素（３３２μｌ，２．０４ｍｍｏｌ）、引き続きトリエチルアミン（１４７μｌ，１．０５ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０から５０：１）で標題化合物（１８４ｍｇ、９０％）を得た。
【００５２】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)0.85‐1.06(28H, m), 2.69‐2.73(2H, m), 3.10(3H, s), 3.12(3H, s), 3.86‐4.24(7H,m), 5.74(1H, vs), 6.01(1H, dd), 8.01(1H, d), 8.76(1H, s)
【００５３】
実施例１０ Ｎ４‐ジメチルアミノメチレン‐５‘‐Ｏ‐ジメトキシトリチル‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルシチジン（化合物１０）
【００５４】
【化１０】
【００５５】
化合物９(１９２ｍｇ, ０．５４６ｍｍｏｌ)をピリジン（５ｍｌ）に溶解させた。そこにジメトキシトリチルクロリド（２０４ｍｇ，０．６０２ｍｍｏｌ）を加え２時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、クロロホルムで希釈し飽和食塩水並びに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。さらに水層をクロロホルムで３回逆抽出し有機層とあわせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、減圧濃縮し得られた残渣を得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０から２５：１）で精製し標題化合物（１５７ｍｇ，４５％）を得た。
【００５６】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)2.69‐2,73(2H, br), 3.10(3H, s), 3.12(3H, s), 3.49(1H, dd), 3.57‐3.59(1H, m), 3.77(6H, s), 3.94‐4.07(3H, m), 4.31‐4.41(2H, m), 5.76(1H, d), 5.93(1H, s), 6.82-6.85(4H, m), 7.20‐7.43(9H, m), 8.16(1H, dd), 8.76(1H, s)
【００５７】
実施例１１ ２‘‐Ｏ‐（２−シアノエチル）シチジン（化合物１１）
【００５８】
【化１１】
【００５９】
化合物１０(３５１ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ)を濃アンモニア水−エタノール（３：１,ｖ/ｖ、４ｍｌ）に溶解し、１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（７：１）で精製し標題化合物（１０９ｍｇ，９２％）を得た。
【００６０】
1H-NMR(D2O, 500 MHz)2.83‐2.86(2H, m),3.84(1H,dd, J = 13 Hz, 4.4 Hz), 3.95-4.03(3H, m), 4.14-4.18(2H, m), 4.27(1H, dd,J=13 Hz, 1.7 Hz), 5.97(1H, d, J = 3.2 Hz), 6.1(1H, d,J=7.6 Hz), 7.89 (1H, d, J=7.6Hz).
【００６１】
実施例１２ Ｎ４‐アセチル‐２‘‐Ｏ‐（２−シアノエチル）シチジン（化合物１２）
【００６２】
【化１２】
【００６３】
化合物１１（１０００ｍｇ，３．３８ｍｍｏｌ）をエタノール（７０ｍｌ）に溶解させ、無水酢酸（１．６ｍｌ，１６．９６ｍｍｏｌ）を加えて１２時間撹拌する。系内で析出した結晶をろ別し、ジエチルエーテルにて洗浄し標題化合物（１０５５ｍｇ，３．１２ｍｍｏｌ）を９２％の収率で得る。
【００６４】
1H-NMR (DMSO, 500 MHz) 2.10 (3H, s), 2.81-2.86 (2H, m), 3.60-3.63(1H, m), 3.78-3.94 (5H, m), 4.03-4.05 (1H, m), 5.13 (1H, d, J=4.88), 5.20 (1H, t, J=4.88), 5.78 (1H, d, J=1.71) , 7.18(d, J=7.57), 8.47(1H, J=7.57), 10.92(1H, s)
【００６５】
実施例１３ Ｎ４−アセチル−５‘−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）シチジン （化合物１３）
【００６６】
【化１３】
【００６７】
化合物１２(１０５５ｍｇ,３．１２ｍｍｏｌ)を乾燥ピリジンにて４回共沸脱水させた後、乾燥ピリジン（３０ｍｌ）に溶解させた。そこにジメトキシトリチルクロリド（１１６２ｍｇ，３．４３ｍｍｏｌ）を加え３時間撹拌させ、水を加えて反応を停止する。反応液を減圧濃縮し、クロロホルムで希釈し飽和食塩水並びに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、減圧濃縮し得られた残渣を得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（９８：２ ０．５％トリエチルアミン）で精製し標題化合物（１８４８ｍｇ，２．８８ｍｍｏｌ，９２％）を白色泡状物質として得る。
【００６８】
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 2.20 (3 H, s), 2.60-2.68 (2 H, m), 2.97-2.98 (1 H, br), 3.54-3.62 (2 H, m), 3.79 (6 H, m), 3.92-3.97 (1 H, m), 4.01(1H, d, J=5.13), 4.11-4.13(1H, m), 4.24-4.18(1H, m), 5.89 (1 H, s), 6.85-6.87 (4 H, m), 7.15-7.43 (10 H, m), 8.53 (1H, d, J=7.57), 10.00 (1H, br)
【００６９】
実施例１４ Ｎ４−アセチル−５‘−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）シチジン ３’−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物１４）
【００７０】
【化１４】
【００７１】
上記化合物１３(668 mg, 1.04 mmol) を乾燥トルエンにて５回共沸脱水を行った後、アルゴン置換した。乾燥ジクロロメタン(8 ml)に溶解させジイソプロピルエチルアミン(271μl , 1.56 mmol)を加え, ジイソプロピルアミノ-(2−シアノエチル)-クロロホスフィン(271 mg, 1.15 mmol) を乾燥ジクロロメタン (2 ml)の溶液として加えた。3時間撹拌した後, 酢酸エチルで希釈し, 飽和食塩水、飽和重曹水で有機層を洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して乾燥剤をろ別した。溶媒を減圧流去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール (９８：２〜９７：３ ０．５％トリエチルアミン)で精製し標題化合物 (790 mg, 0.94 mmol, 90%) を白色泡状物質として得る。
【００７２】
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 1.01‐1.18 (12 H, m), 2.23‐2.24(3 H, m), 2.40-2.75(4 H, m), 3.45-3.74(5 H, m), 3.81-3.82(6 H, m), 3.84-4.59(6 H, m),5.91-5.93(1 H, m), 6.83-6.87(4 H, m), 6.96-7.05(1 H, m), 7.26-7.44(9H,m),8.53-8.60(1H,m),10.10(1H,s)
【００７３】
実施例１５ Ｎ６‐ジメチルアミノメチレン‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン（化合物１５）
【００７４】
【化１５】
【００７５】
Ｎ６‐ジメチルアミノメチレン‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐アデノシン化合物 (５６５ｍｇ,１ｍｍｏｌ)をｔ−ブチルアルコール（５ｍｌ）に溶解させた。そこにアクリロニトリル（１．３ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）、引き続き炭酸セシウム（３５３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加え３時間激しく撹拌した。その後、セライトろ過により炭酸セシウムを取り除き、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（５０：１）で精製し標題化合物（５５９ｍｇ、９０％）を得た。
【００７６】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)0.96‐1.12(28H, m), 2.71‐2.73(2H, m), 3.19(3H, s), 3.25(3H, s), 3.94-4.27(6H,m), 4.77(1H, dd), 6.01(1H, s), 8.14(1H, s), 8.48(1H, s), 8.93(1H, s)
【００７７】
実施例１６ Ｎ６‐ジメチルアミノメチレン‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン（化合物１６）
【００７８】
【化１６】
【００７９】
得られた化合物１５(１．４５ｇ, ２．３５ｍｍｏｌ)をテトラヒドロフラン２４ｍｌ）に溶解させた。そこにトリエチルアミン3フッ化水素（１．３ｍｌ，７．９８ｍｍｏｌ）、引き続きトリエチルアミン（５８９μｌ，４．２３ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（５０：１から２５：１）で精製し標題化合物（８７８ｍｇ、ｑｕａｎｔ）を得た。
【００８０】
1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)2.62‐2.65(2H, m), 3.16(3H, s), 3.18(3H, s), 3.65‐3.72(4H, m), 3.80‐3.86(4H, m), 4.09‐4.11(1H, m), 4.43(1H, t), 4.53 (1H, t), 6.08 (1H, d), 8.34 (1H, s), 8.40 (1H, s), 8.83 (1H, s)
【００８１】
実施例１７ Ｎ６‐ジメチルアミノメチレン‐５‘‐Ｏ‐ジメトキシトリチル‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン（化合物１７）
【００８２】
【化１７】
【００８３】
化合物１６(７１６ｍｇ, １．９１ｍｍｏｌ)をピリジン（１９ｍｌ）に溶解させた。そこにジメトキシトリチルクロリド（７１２ｍｇ，２．１０ｍｍｏｌ）を加え３時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、クロロホルムで希釈し飽和食塩水並びに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。さらに水層をクロロホルムで３回逆抽出し有機層とあわせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、減圧濃縮し得られた残渣を得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０から５０：１含０．５％トリエチルアミン）で精製し標題化合物（１１３２ｍｇ，８７％）を得た。
【００８４】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)2.52‐2,2.59(2H, m), 3.13(3H, s), 3.18(3H, s), 3.25‐3.57(2H, m), 3.72(6H, s), 3.82‐3.92(2H, m), 4.20‐4.24(3H, m), 4.50(1H, t), 4.60(1H, dd),6.14(1H, d),6.75(4H, d), 7.13‐7.47(9H, m), 8.09(1H, s), 8.43(1H, s), 8.94(1H, s)
【００８５】
実施例１８ Ｎ６‐ジメチルアミノメチレン‐５‘‐Ｏ‐ジメトキシトリチル‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン ３’−（２−シアノエチル Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物１８）
【００８６】
【化１８】
【００８７】
上記化合物１７（１．０６ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を脱水トルエンにて５回共沸脱水した後アルゴン置換した。乾燥ジクロロメタン（１２ｍｌ）に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．３ｍｌ，１．７２ｍｍｏｌ）、２‐シアノエチルＮ，Ｎ‐ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（３２８ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（２ｍｌ）の溶液として反応系に滴下した。室温で２時間撹拌した後、反応液をクロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣をＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０→１００：１）で精製し標題化合物（８９６ｍｇ，８２％）を得た。
【００８８】
1H‐NMR(CDCl3, 500MHz)1.06‐1.18(12H, m), 2.58‐2.66(4H, m), 3.21(3H, s), 3.26(3H, s), 3.32‐3.35(1H, m), 3.51‐4.01(14H, m), 4.34‐4.39(1H, m), 4.55‐4.67(1H, m), 4.80‐4.85( 1H, m), 6.10-6.14(1H, m), 6.76‐6.83(4H, t), 7.18‐7.36(9H, m), 8.09‐8.12(1H, m), 8.45‐8.46(1H, m), 8.95‐8.96(1H, m)
【００８９】
実施例１９ N2−ジメチルアミノメチレン−Ｏ−６‐トリイソプロピルベンゼンスルホニル‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルグアノシン (化合物１９）
【００９０】
【化１９】
【００９１】
N2−ジメチルアミノメチレン−０６‐トリイソプロピルベンゼンスルホニル‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐グアノシン (６．６０ｇ,７．８０ｍｍｏｌ)をｔ−ブチルアルコール（３９ｍｌ）に溶解させた。そこにアクリロニトリル（２０ｍｌ，１５６ｍｍｏｌ）、引き続き炭酸セシウム（２．７５ｇ，７．８０ｍｍｏｌ）を加え２時間激しく撹拌した。その後、セライトろ過により炭酸セシウムを取り除き、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：１）で精製し標題化合物（５．８２ｍｇ、８３％）を得た。
【００９２】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)0.99‐1.34(46H, m), 2.77‐2.632.79(2H, t), 2.95‐2.97(1H, m), 3.11(3H, s), 3.16(3H,s), 3.99‐4.33(9H, m), 4.57(1H, dd), 6.18(1H, s), 7.23(2H, s), 8.04(1H,s), 8.23(1H, s)
【００９３】
実施例２０ Ｎ２‐ジメチルアミノメチレン‐６‐Ｏ‐トリイソプロピルベンゼンスルホニル‐２’‐Ｏ‐シアノエチルグアノノシン（化合物２０）
【００９４】
【化２０】
【００９５】
化合物１９(１１３ｍｇ,０．１２６ｍｍｏｌ)をテトラヒドロフラン（１ｍｌ）に溶解させた。そこにトリエチルアミン3フッ化水素（７２μｌ，０．４４２ｍｍｏｌ）、引き続きトリエチルアミン（３１μｌ，０．２２６ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０から５０：１から１０：１）で精製し標題化合物（６７ｍｇ，８１％）を得た。
【００９６】
1H-NMR(CDCl3, 500 MHz)1.22‐1.31(18H, m), 2.57-2.60(2H, t), 2.81-2.96(1H, m), 3.05(3H, s), 3.12(3H, s), 3.62-3.79(3H, m), 3.93(1H, d), 4.24(2H, dt), 4.31(1H, br), 4.62(1H, m), 4.84(1H, dd), 5.98‐6.15(2H, m), 7.23(2H, s), 8.12(1H, s), 8.20(1H, s)
【００９７】
実施例２１ Ｎ２‐ジメチルアミノメチレン‐２’‐Ｏ‐シアノエチルグアノノシン（化合物２１）
【００９８】
【化２１】
【００９９】
化合物１３(630 mg, 0.7 mmol) を無水アセトニトリル（７ｍｌ）に溶解させオルトニトロベンズアルドキシム(349 mg, 2.10 mmol),テトラメチルグアニジン(263 μl, 2.10 mmol). を加える。１時間撹拌後、反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水、飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過して有機溶媒を減圧留去する。得られた残渣を無水THF（７ｍｌ）に溶解させ、トリエチルアミン（１７２μl，１．２６mmol）,トリエチルアミン３フッ化水素（３９９ｍｌ，２．４５mmol）を加えて、１時間撹拌する。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（９０：１０→８５：１５，ｖ／ｖ）で精製し標題化合物（２１８ｍｇ，０．５５７mmol，８０％）を白色固体として得る。
【０１００】
1H-NMR (DMSO, 500 MHz) 2.73-2.76 (2H, m), 3.03 (3H, s), 3.15 (3H, s), 3.54-3.58 (1H, m), 3.63-3.69(1H, m), 3.78-3.82 (1H, m), 3.91 (1H, q, J=3.91), 4.29 (1H, q, J=4.39, 5.13), 4.40 (1H, t, J=5.13), 5.01 (1H, t, J=5.61), 5.30 (1H, d, J=5.37), 5.91(1H, d, J=5.13), 8.08 (1H, s), 8.55 (1H, s), 11.4 (1H, br)
【０１０１】
実施例２２ ２‘‐Ｏ‐シアノエチルシチジン（化合物２２）
【０１０２】
【化２２】
【０１０３】
化合物１２ (１４１ｍｇ,０．４０１ｍｍｏｌ)をアンモニア水：エタノール（４ｍｌ，ｖ／ｖ＝３／１）に溶解させ１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（７：１）で精製し標題化合物（１０９ｍｇ、９２％）を得た。
【０１０４】
1H-NMR(D2O, 500 MHz)2.83‐2.86(2H, m), 3.83(1H, dd), 3.95‐4.03(3H, m), 4.14‐4.18(2H, m), 4.28(1H,dd), 5.97(1H, d), 6.05(1H, dd), 7.88(1H, d)
【０１０５】
実施例２３ ２‘‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン（化合物２３）
【０１０６】
【化２３】
【０１０７】
化合物１６ (４７５ｍｇ,１．２７ｍｍｏｌ)をアセトニトリルに溶解させヒドラジン（２１８μｌ，７ｍｍｏｌ）を加えて３時間撹拌する。反応系に析出してきた粉体をイソプロピルアルコールで洗浄した。さらに炉液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０→５０：１→１０：１）で精製し先ほどの粉体とあわせて標題化合物（３３２ｍｇ、８２％）を得た。
【０１０８】
1H-NMR(D2O, 500 MHz)2.83‐2.86(2H, m), 3.83(1H, dd), 3.95‐4.03(3H, m), 4.14‐4.18(2H, m), 4.28(1H,dd), 5.97(1H, d), 6.05(1H, dd), 7.88(1H, d)
【０１０９】
実施例２４ ２‘‐Ｏ‐シアノエチルグアノシン(化合物２４）
【０１１０】
【化２４】
【０１１１】
化合物２１ (４４７ｍｇ，０．６８０ｍｍｏｌ)をアセトニトリル７ｍｌに溶解させオルトニトロベンズアルドオキシム（３３９ｍｇ，７ｍｍｏｌ）、テトラメチルグアニジン（８５μｌ，０．６７７ｍｍｏｌ）を加えて１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０→５０：１→２０：１→１０：１）で精製する。得られた化合物をアンモニア水：エタノール（５ｍｌ，ｖ／ｖ＝３：１）を加えて６時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し５０％エタノール溶液から結晶化し標題化合物（１２１ｍｇ，５３％）を得る。
【０１１２】
1H-NMR(D2O, 500 MHz)2.73(2H, t), 3.76‐3.95(4H, m), 4.23(1H, q), 4.50(1H, dd), 4.52(1H,t), 5.98(1H, d), 8.04(1H, s)
【０１１３】
実施例２５ ２Ｎ-ジメチルアミノメチレン‐5‘-Ｏ‐ジメトキシトリチル‐２’‐Ｏ‐（２‐シアノエチル）グアノシン（化合物２５）
【０１１４】
【化２５】
【０１１５】
化合物２１ (392 mg, 1.00 mmol) 無水ピリジンにて４回共沸脱水を行い、無水ピリジン１０ｍｌに溶解させた。ジメトキシトリチルクロリド (373 mg, 1.10 mmol)を加えて室温で3時間撹拌する。水を加えて反応を停止し溶媒を減圧留去した。得られた残渣をクロロホルムで希釈し飽和食塩水ならびに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール (９８：２, ０．５％トリエチルアミン)にて精製し、標題化合物 (635 mg, 0.92 mmol, 92 %) を白色泡状物として得る。
【０１１６】
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 2.57-2.59 (2 H, m), 2.98(3 H, s), 3.04(3 H, s), 3.38(1 H, dd, J=4.64. 10.50), 3.45-3.47(1 H, dd, J=2.44, 10.50), 3.74(6 H, s), 3.78-3.96(3 H, m,), 4.21-4.23(1 H, m), 4.29(1 H, dd, J=3.42, 8.55), 4.59-4.60(1H, m), 6.09(1H, dd, J=3.42), 6.10-6.78(4H, m), 7.13-7.41(9H, m), 7.74(1H, s), 8.54(1H, s), 10.01(1H, br)
【０１１７】
実施例２６ ２Ｎ-ジメチルアミノメチレン‐5‘-Ｏ‐ジメトキシトリチル‐２’‐Ｏ‐（２‐シアノエチル）グアノシン ３’−（２−シアノエチル Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物２６）
【０１１８】
【化２６】
【０１１９】
化合物２５ (1.95 g, 2.81 mmol) を無水トルエンにて3回共沸脱水を行い系内をアルゴン置換した。無水ジクロロメタン（２６ｍｌ）に溶解させた後、ジイソプロピルエチルアミン(736μl , 1.56 mmol)を加え, ジイソプロピルアミノ-(2−シアノエチル)-クロロホスフィン (732 mg, 3.09 mmol) を無水ジクロロメタン(2 ml)の溶液として加えた。３時間撹拌した後,クロロホルムで希釈し, 飽和食塩水並びに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄する。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ別する。有機溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール (９８：２, ０．５％トリエチルアミン)にて精製し標題化合物 (2.11 g, 2.36 mmol, 84%)を白色泡状物質として得る。
【０１２０】
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 1.01 -1.24(12 H, m),2.33-2.66(5 H, m), 3.07-3.10(6 H,m), 3.30-4.02(14 H, m), 4.29-4.35(2 H, m), 4.48-4.55(1 H, m), 6.09-6.12(1 H,m), 6.79-6.82(4H, m), 7.17-7.44(10 H, m),7.78-7.82(1H,m),8.57-8.60(1H, m), 9.73-9.77(1H,m)
【０１２１】
実施例２７ ２‘−シアノエチルウリジル酸１２量体の合成
常法により調整された、２‘−Ｏ−シアノエチルウリジンがサクシニルリンカーを介して導入されているロングアミノアルキルチェーンＣＰＧ（１６μｍｏｌ／ｇ）を1μmol固相合成用ソケットに充填されたものを用い、２‘−Ｏ-シアノエチルウリジンホスホロアミダイトユニット（化合物７）を０．１Ｍの無水アセトニトリルの溶液としてＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ）に縮合時間１０分間の縮合時間であるＲＮＡ合成用プログラムを適用する。
合成終了後、アンモニア水１ｍｌにて２０分間処理して固相担体からオリゴヌクレオチドを切り出しを行う。その後、酢酸アンモニウムバッファーで適当量希釈し、逆相カラムカートリッジ並びに陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて精製する。逆相カラムカートリッジにて脱塩操作を行い得られたオリゴヌクレオチドを凍結乾燥して標題化合物を得る。（収率２１％）。陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによる分析プロファイルを図１Ａに示す。
【０１２２】
ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＡＳＳ （ｎｅｇａｔｉｖｅ）Ｃａｌｃｄ．４２４５．６６ Ｆｏｕｎｄ ４２４４．３３
【０１２３】
実施例２８ ＧＡＣＵの混合配列を有する２‘−Ｏ−シアノエチルＲＮＡ４量体の合成
常法により調整された２‘−Ｏ−シアノエチルウリジンがサクシニルリンカーを介して導入されているロングアミノアルキルチェーンＣＰＧ（１６μｍｏｌ／ｇ）を1μmol固相合成用ソケットに充填されたものを用い、各4種類の２‘−Ｏ-シアノエチルヌクレオシドホスホロアミダイトユニット（化合物７、１４、１８、２６） を０．１Ｍの無水アセトニトリルの溶液としてＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ）に縮合時間１０分間の縮合時間であるＲＮＡ合成用プログラムを適用する。
合成終了後、アンモニア水-酢酸アンモニウム（１０％ｗｔ／ｗｔ）１ｍｌにて９０分間処理して固相担体からのオリゴヌクレオチドの切り出し並びに核酸塩基部の保護基の脱保護を行う。その後、酢酸アンモニウムバッファーで適当量希釈し、逆相カラムカートリッジ並びに陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて精製する。逆相カラムカートリッジを用いて脱塩操作を行い得られたオリゴヌクレオチドを凍結乾燥して標題化合物を得る（収率 ５８％）。陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによる分析プロファイルを図１Ｂに示す。
【０１２４】
ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＡＳＳ （ｎｅｇａｔｉｖｅ）Ｃａｌｃｄ．１４３４．３１ Ｆｏｕｎｄ １４３４．１２
【０１２５】
実施例２９ ＧＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＵの混合配列を有する２‘−Ｏ−シアノエチルＲＮＡ１２量体の合成
常法により調整された２‘−Ｏ−シアノエチルウリジンがサクシニルリンカーを介して導入されているロングアミノアルキルチェーンＣＰＧ（１６μｍｏｌ／ｇ）を1μmol固相合成用ソケットに充填されたものを用い、各4種類の２‘−Ｏ-シアノエチルヌクレオシドホスホロアミダイトユニット（化合物７、１４、１８、２６）を０．１Ｍの無水アセトニトリルの溶液としてＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ）に縮合時間１０分間の縮合時間であるＲＮＡ合成用プログラムを適用する。
合成終了後、アンモニア水-酢酸アンモニウム（１０％ｗｔ／ｗｔ）１ｍｌにて９０分間処理して固相担体からのオリゴヌクレオチドの切り出し並びに核酸塩基部の保護基の脱保護を行う。その後、酢酸アンモニウムバッファーで適当量希釈し、逆相カラムカートリッジ並びに陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて精製する。逆相カラムカートリッジを用いて脱塩操作を行い得られたオリゴヌクレオチドを凍結乾燥して標題化合物を得る（収率 ６％）。陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによる分析プロファイルを図１Ｃに示す。
【０１２６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）Ｃａｌｃｄ．４４２８．８６ Ｆｏｕｎｄ ４４２８．５５
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明の合成方法で得られる、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシドもしくはそのヌクレオチド：
【０１２８】
【化２７】
【０１２９】
（式Ｉ中、Ｘ及びＹは同一または異なって、水素、置換基を有していてもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は一般式（ＩＩ）：
【０１３０】
【化２８】
【０１３１】
（式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ２は同一または異なって、炭素数１から７のアルキル基を表すか、又は、Ｒ1およびＲ２が互いに結合して環構造を形成し、Ｒ３はリン酸の保護基を表す）を表し、Ｂ１は置換基を有していてもよいピリミジン塩基又はプリン塩基を表す。）である修飾RNAは遺伝子制御のための人工RNA分子等として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２‘水酸基をシアノエチルエーテル化したヌクレオシド、ヌクレオチド及びそれらのホスホロアミダイト化合物に関する。これらの化合物は、核酸合成試薬としてまた修飾ＲＮＡとして各々用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
化学的に合成されたオリゴリボヌクレオチド（オリゴＲＮＡ）は、遺伝子解析用のＲＮＡプローブ、ＲＮＡ医薬品素材（アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡを利用した遺伝子発現制御）、人工酵素、アプタマーとして利用することが可能である。
【０００３】
２‘水酸基をメチルエーテル誘導体は市販されていることもあり、エーテル修飾体として汎用されている。しかしながらこの修飾ＲＮＡでは、遺伝子制御物質として用いる場合細胞内における酵素耐性の点で問題がある。一方、同様のエーテル型修飾としてメトキシエチルエーテル誘導体も汎用されている。こちらの化合物は、メチル修飾体と比較して酵素耐性の点で優れていると報告されている（非特許文献１）。しかし、それらの調製には、導入法や導入試薬に制限がつくためピリミジンヌクレオシド、プリンヌクレオシドに共通な合成法がないのが現状である。また、エーテル鎖中に存在する酸素原子の影響によりエーテル鎖の構造が制限されているためオリゴＲＮＡ合成の際、縮合効率の点で問題が生じる可能性が十分考えられる。
【０００４】
これらの問題点を解決するには、炭素数が３炭素程度でエーテル鎖中に酸素原子を含まず末端に電子吸引性でかつ親水性置換を有するエーテル修飾体の開発を行うことが有用である。
【０００５】
【非特許文献１】VonPierre Martin, ヘルベチカ チミカ アクタ, 1995, 78, 486-504
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のような条件を満たすエーテル修飾体としてシアノエチルエーテルが考えられる。このエーテルはアクリロニトリルを導入試薬とすることで安価に修飾体が得られるという利点がある。しかし、導入には強塩基例えば水酸化ナトリウムなどを用いて加熱という過酷な条件を要する問題点があった。また、機能性官能基としての可能性は核酸化学において開拓されていない。
【０００７】
本発明は、穏やかな条件で効率的にシアノエチルエーテルを構築する系、及び機能性官能基としての可能性を開拓し新規機能性核酸の創製に寄与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者は、アクリトニトリルを２−シアノエチル化の合成原料に用いるとともに、水酸基を活性化する塩基として最適なものを探索した結果、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシド又はそのヌクレオチド（式Ｉ中、Ｘ及びＹは同一または異なって、水素、置換基を有していてもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は一般式（ＩＩ）（式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ２は同一または異なって、例えば、ジイソプロピルのような炭素数１から７のアルキル基を表すか、又は、Ｒ1およびＲ２が互いに結合して環構造を形成し、Ｒ３は、例えば、２−シアノエチルのようなリン酸の保護基を表す）を表し、Ｂ１は置換基を有していてもよいピリミジン塩基又はプリン塩基を表す。）に係る。
【００１０】
更に、本発明は、上記一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシドの合成方法であって、炭酸セシウム、ＤＢＵ，及びＴｒｉｔｏｎＢから成る群から選択される少なくとも一種の化合物とアクリロニトリルとヌクレオシド誘導体を合成原料として用い、ｔ−ブチルアルコールの存在下又は非存在下で、２‘水酸基をシアノエチルエーテル化することを特徴とする、前記合成方法に係る。
【００１１】
本発明は又、これら合成方法で得られたヌクレオシドのホスホロアミダイト化合物にも係る。尚、本発明のホスホロアミダイト化合物は、当業者に公知のホスホロアミダイト法を用いて、当業者であれば容易に調製することが出来る。更に、本発明は上記ヌクレオシド（一般式（Ｉ）におけるＸ及びＹを除いた部分）を含むＲＮＡオリゴマーにも係る。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のシアノエチル化反応により種々の水酸基のシアノエチル化を効率よく実施することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明で得られたRNAオリゴマーの陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによる分析プロファイルを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明化合物において、ピリミジン塩基又はプリン塩基であるＢ１の置換基の具体例としては、当業者に公知の任意の基、例えば、Ｎ−ジメチルアミノメチレン、Ｎ−アセチル、及びトリイソプロピルベンゼンスルホニル基等の本明細書の実施例中に記載されたものを挙げることができる。
また、ホスホロアミダイト基（ＩＩ）中、Ｒ１およびＲ２は同一または異なって、イソプロピル基等の炭素数１から７のアルキル基を表すか、又は、Ｒ1およびＲ２が互いに環構造を形成する。又、リン酸の保護基であるＲ３は、例えば、２−シアノエチル基、４−ニトロフェニルエチル基、Ｎ−（トリフロオロアセチル）アミノブチル基、又は、４−［Ｎ−メチル−Ｎ−（２，２，２−トリフルオロアセチル）アミノ］ブチル基を挙げることが出来、２−シアノエチル基が好適である。
【００１５】
本発明の合成方法において、炭酸セシウム、ＤＢＵ，及びＴｒｉｔｏｎＢから成る群から選択される少なくとも一種の化合物、特に、好適には炭酸セシウムの存在下で、合成原料としてアクリロニトリル及びヌクレオシド誘導体を用いる合成方法であり、これら化合物はヌクレオシド誘導体に対して０．１〜３０ｅｑｕｉｖの範囲で反応系に存在させ、更に、アクリロニトリルに対して０．０５〜３０ｅｑｕｉｖの範囲のｔ−ブチルアルコールの存在下に反応を行うことが好適である。通常、２０℃〜３０℃の温度範囲で反応させることが好ましく、又、反応時間は２時間〜３時間の範囲であることが好ましい。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【００１７】
実施例１：２’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ３‐ベンゾイル‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐ウリジン（化合物１）
【００１８】
【化１】
【００１９】
Ｎ３‐ベンゾイル‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐ウリジン化合物 (５９１ｍｇ,１ｍｍｏｌ)をｔ−ブチルアルコール（５ｍｌ）に溶解させた。そこにアクリロニトリル（１．３ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）、引き続き炭酸セシウム（３５３ｍｇ， １ｍｍｏｌ）を加え２時間激しく撹拌した。その後、セライトろ過により炭酸セシウムを取り除き、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：１）により精製し白色結晶として標題化合物（５９３ｍｇ，０．９２１ｍｍｏｌ）を収率９２％で得た。分析用サンプルにはクロロホルム−ジイソプロピルエーテルから結晶化したものを用いた。ｍ．ｐ．１５９℃。
【００２０】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)0.94‐1.12(28H, m), 2.61‐2.63(2H, m), 3.91‐4.05(4H, m), 4.18‐4.29(3H, m), 5.70(1H,s), 5.79(1H, d, J=8.30), 7.49-7.94(5H, m), 8.00(1H, d, J=8.30)
【００２１】
実施例２ ２’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ３‐ベンゾイルウリジン（化合物２）
【００２２】
【化２】
【００２３】
得られた化合物１（３２２ｍｇ，０．５４５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（３ｍｌ）に溶解させ、あらかじめ調製したテトラブチルアンモニウムフルオリド（３２７ｍｇ，１．２５ｍｍｏｌ）と酢酸（７２μｌ，１．２５ｍｍｏｌ）のテトラヒドフラン溶液（２ｍｌ）をゆっくりと滴下した。１時間撹拌させた後、反応液をクロロホルムで希釈し飽和食塩水で３回洗浄した。有機層を分離後、水層をクロロホルムで抽出した。有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：アセトン＝１０：１）により精製し白色泡状物質として標題化合物（１４７ｍｇ，０．３６６ｍｍｏｌ）を収率６７％で得た。
【００２４】
1H-NMR(CDCl3, 500 MHz)2.63‐2.66(2H, m), 3.83‐3.90(2H, m), 4.04‐4.09(4H, m), 4.31(1H, dd, J=5.37, 7.32), 5.81(1H, d, J=1.71), 5.83(1H, d, J=8.30), 7.50‐7.94(5H, m), 8.10(1H, d, J=8.30)
【００２５】
実施例３ ２’−Ｏ−（２−シアノエチル）ウリジン（化合物３）
【００２６】
【化３】
【００２７】
得られた化合物２（８０ｍｇ，０．２０２ｍｍｏｌ）をエタノール：アンモニア水（２ｍｌ，３：１，ｖ／ｖ）に溶解させ３時間撹拌した。その後、減圧濃縮して得られた残渣を１ｍｌのメタノールに溶かし１０ｍｌのエーテルで希釈して３ｍｌの蒸留水で３回抽出した。水層を減圧濃縮し、得られた残渣を球状シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５：１）で精製し白色泡状物質として標題化合物（５７ｍｇ， ０．１９１ｍｍｏｌ）を収率９５％で得た。
【００２８】
1H-NMR(D2O, 500 MHz)2.70‐2.72(2H, m), 3.69(1H, dd, J=4.15, 12.9 Hz), 3.82‐3.85(3H, m), 4.02‐4.04(1H, m), 4.08(1H, dd, J=3.66, 5.23), 4.19(1H, t, J=5.62, 6.10), 5.77(1H, d, J=8.06), 5.87(1H, d, J=3.66), 7.80(1H, d, J=8.06)
【００２９】
実施例４ ５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ３‐ベンゾイルウリジン（化合物４）
【００３０】
【化４】
【００３１】
化合物１（２．７０ｇ，４．１９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（２０ｍｌ）に溶解させ、あらかじめ調製したテトラブチルアンモニウムフルオリド（２．７５ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）と酢酸（０．６ｍｌ，１０．５ｍｍｏｌ）のテトラヒドフラン溶液（２０ｍｌ）をゆっくりと滴下した。７時間撹拌させた後、反応液をクロロホルムで希釈し飽和食塩水で３回洗浄した。水層をクロロホルムで抽出し、有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムで乾燥した。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：アセトン＝１０：１）により精製し化合物２を得た。引き続き、乾燥ピリジンにて３回共沸脱水を行い、乾燥ピリジン（４０ｍｌ）に溶解させた。塩化ジメトキシトリチル（１．７１ｇ， ５．０４ｍｍｏｌ）を加えて７時間撹拌させた後、反応系に水を加えて反応を停止した。減圧濃縮して得られた残渣をクロロホルムで希釈し、飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）で精製し白色泡状物質として標題化合物（２．０７ｇ， ２．８４ｍｍｏｌ）を収率７０％で得た。
【００３２】
1H-NMR(CDCl3, 500 MHz)2.55‐2.62(3H, m), 3.57‐3.64(2H, m), 3.79‐3.86(7H, m), 4.00(1H, d, J=5.13), 4.04‐4.07(1H, m), 4.12‐4.15(1H, m), 4.53(1H, ddd, J=5.13, 9.40, 9.52), 5.37(1H, d, J=8.30), 5.86(1H, s), 6.86(4H, dd, J=1.22, 8.79), 7.24-7.34(7H, m), 7.42(2H, br), 7.49(2H, br), 7.64(2H, br), 7.93(2H, br), 8.22(1H, J=8.30)
【００３３】
実施例５ ５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ３‐ベンゾイルウリジン （２‐シアノエチル Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物５）
【００３４】
【化５】
【００３５】
アルゴン雰囲気下、五酸化ニリンを乾燥剤としてデシケータにて減圧乾燥させた上記化合物４（１．０６ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）とテトラゾールジイソプロピルアンモニウム塩（１９３ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル（７ｍｌ）に溶解させた。２‐シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ‐テトライソプロピルホスホロジアミダイト（６７８ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル（３ｍｌ）の溶液として反応系に滴下した。５時間撹拌した後、反応液をクロロホルムで希釈し飽和食塩水で２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した。水層をクロロホルムで抽出し、得られた有機層を合わせて無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を球状シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１ ０．５％トリエチルアミン）で精製し白色泡状物質として標題化合物（１．２７ｇ，１．４０ｍｍｏｌ）を収率９３％で得た。
【００３６】
1H‐NMR(CDCl3, 500 MHz)1.08‐1.30(12H, m), 2.47‐2.68(4H, m), 3.49‐4.30(16H, m), 4.59‐4.80(1H, br), 5.28‐5.37(1H, m), 5.85(1H, m), 6.83‐6.91(4H, m), 7.24‐7.66(13H, m), 8.00‐8.03( 2H, m), 8.24‐8.30(1H, m)
【００３７】
実施例６ ５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）ウリジン（化合物６）
【００３８】
【化６】
【００３９】
２‘‐Ｏ‐シアノエチルウリジン（化合物３）（１．９７ｇ，６．６３ｍｍｏｌ）をピリジン（７０ｍｌ）に溶解させ、ジメトキシトリチルクロリド（２．４７ｇ，７．２９ｍｍｏｌ）を加え４時間撹拌する。その後、反応液を減圧濃縮してクロロホルムで希釈し飽和食塩水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させる。減圧濃縮して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０から２０：１、含０．５％トリエチルアミン）で精製し標題化合物（３．９１ｇ，９９％）を得た。
【００４０】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)2.68‐2,71(2H, m), 3.53‐3.58(2H, m), 3.78‐3.79(6H, m), 3.90‐3.98(2H, m), 4.03‐4.06(1H, m), 4.17‐4.22(1H, m), 4.49(1H, dd), 5.31(1H, d), 5.89(1H, s), 6.84(4H, d), 7.22-7.40(9H, m),8.06(1H, d)
【００４１】
実施例７ ５’−Ｏ−（４,４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）ウリジン ３’−（２−シアノエチル Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物７）
【００４２】
【化７】
【００４３】
上記化合物６（１．２０ｇ，２．００ｍｍｏｌ）を脱水トルエンにて５回共沸脱水した後アルゴン置換した。乾燥ジクロロメタン（１０ｍｌ）に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．５ｍｌ，２．８７ｍｍｏｌ）、２‐シアノエチルＮ，Ｎ‐ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（５２１ｍｇ，２．２０ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（２ｍｌ）の溶液として反応系に滴下した。室温で２時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回、飽和食塩水で２回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣をＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０→５０：１）で精製し標題化合物（１．３３ｇ，８３％）を得た。
【００４４】
1H‐NMR(CDCl3, 500 MHz)1.08‐1.21(12H, m), 2.60‐2.77(4H, m), 3.43‐3.76(4H, m), 3.79‐3.80(6H, m), 3.87-4.84(6H, m), 5.18-5.29(1H, m), 5.88-5.90(1H, m), 6.81-6.87(4H, m), 7.23-7.39( 9H, m), .05-8.13(1H, m)
【００４５】
実施例８ Ｎ４‐ジメチルアミノメチレン‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐２‘‐Ｏ‐（２−シアノエチル）シチジン（化合物８）
【００４６】
【化８】
【００４７】
Ｎ４‐ジメチルアミノメチレン‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐シチジン(５４１ｍｇ, 1ｍｍｏｌ)をｔ−ブチルアルコール（５ｍｌ）に溶解させた。そこにアクリロニトリル（１．３ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）、引き続き炭酸セシウム（３５３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加え３時間激しく撹拌した。その後、セライトろ過により炭酸セシウムを取り除き、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（４０：１）で精製し標題化合物（５２８ｍｇ、８９％）を得た。
【００４８】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)0.85‐1.06(28H, m), 2.69‐2.73(2H, m), 3.10(3H, s), 3.12(3H, s), 3.86‐4.24(7H,m), 5.74(1H, s), 6.01(1H, dd), 8.01(1H, d), 8.76(1H, s)
【００４９】
実施例９ Ｎ４‐ジメチルアミノメチレン‐２‘‐Ｏ‐（２−シアノエチル）シチジン（化合物９）
【００５０】
【化９】
【００５１】
得られた化合物８(３４７ｍｇ, ０．５８４ｍｍｏｌ)をテトラヒドロフラン６ｍｌ）に溶解させた。そこにトリエチルアミン3フッ化水素（３３２μｌ，２．０４ｍｍｏｌ）、引き続きトリエチルアミン（１４７μｌ，１．０５ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０から５０：１）で標題化合物（１８４ｍｇ、９０％）を得た。
【００５２】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)0.85‐1.06(28H, m), 2.69‐2.73(2H, m), 3.10(3H, s), 3.12(3H, s), 3.86‐4.24(7H,m), 5.74(1H, vs), 6.01(1H, dd), 8.01(1H, d), 8.76(1H, s)
【００５３】
実施例１０ Ｎ４‐ジメチルアミノメチレン‐５‘‐Ｏ‐ジメトキシトリチル‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルシチジン（化合物１０）
【００５４】
【化１０】
【００５５】
化合物９(１９２ｍｇ, ０．５４６ｍｍｏｌ)をピリジン（５ｍｌ）に溶解させた。そこにジメトキシトリチルクロリド（２０４ｍｇ，０．６０２ｍｍｏｌ）を加え２時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、クロロホルムで希釈し飽和食塩水並びに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。さらに水層をクロロホルムで３回逆抽出し有機層とあわせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、減圧濃縮し得られた残渣を得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０から２５：１）で精製し標題化合物（１５７ｍｇ，４５％）を得た。
【００５６】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)2.69‐2,73(2H, br), 3.10(3H, s), 3.12(3H, s), 3.49(1H, dd), 3.57‐3.59(1H, m), 3.77(6H, s), 3.94‐4.07(3H, m), 4.31‐4.41(2H, m), 5.76(1H, d), 5.93(1H, s), 6.82-6.85(4H, m), 7.20‐7.43(9H, m), 8.16(1H, dd), 8.76(1H, s)
【００５７】
実施例１１ ２‘‐Ｏ‐（２−シアノエチル）シチジン（化合物１１）
【００５８】
【化１１】
【００５９】
化合物１０(３５１ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ)を濃アンモニア水−エタノール（３：１,ｖ/ｖ、４ｍｌ）に溶解し、１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（７：１）で精製し標題化合物（１０９ｍｇ，９２％）を得た。
【００６０】
1H-NMR(D2O, 500 MHz)2.83‐2.86(2H, m),3.84(1H,dd, J = 13 Hz, 4.4 Hz), 3.95-4.03(3H, m), 4.14-4.18(2H, m), 4.27(1H, dd,J=13 Hz, 1.7 Hz), 5.97(1H, d, J = 3.2 Hz), 6.1(1H, d,J=7.6 Hz), 7.89 (1H, d, J=7.6Hz).
【００６１】
実施例１２ Ｎ４‐アセチル‐２‘‐Ｏ‐（２−シアノエチル）シチジン（化合物１２）
【００６２】
【化１２】
【００６３】
化合物１１（１０００ｍｇ，３．３８ｍｍｏｌ）をエタノール（７０ｍｌ）に溶解させ、無水酢酸（１．６ｍｌ，１６．９６ｍｍｏｌ）を加えて１２時間撹拌する。系内で析出した結晶をろ別し、ジエチルエーテルにて洗浄し標題化合物（１０５５ｍｇ，３．１２ｍｍｏｌ）を９２％の収率で得る。
【００６４】
1H-NMR (DMSO, 500 MHz) 2.10 (3H, s), 2.81-2.86 (2H, m), 3.60-3.63(1H, m), 3.78-3.94 (5H, m), 4.03-4.05 (1H, m), 5.13 (1H, d, J=4.88), 5.20 (1H, t, J=4.88), 5.78 (1H, d, J=1.71) , 7.18(d, J=7.57), 8.47(1H, J=7.57), 10.92(1H, s)
【００６５】
実施例１３ Ｎ４−アセチル−５‘−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）シチジン （化合物１３）
【００６６】
【化１３】
【００６７】
化合物１２(１０５５ｍｇ,３．１２ｍｍｏｌ)を乾燥ピリジンにて４回共沸脱水させた後、乾燥ピリジン（３０ｍｌ）に溶解させた。そこにジメトキシトリチルクロリド（１１６２ｍｇ，３．４３ｍｍｏｌ）を加え３時間撹拌させ、水を加えて反応を停止する。反応液を減圧濃縮し、クロロホルムで希釈し飽和食塩水並びに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、減圧濃縮し得られた残渣を得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（９８：２ ０．５％トリエチルアミン）で精製し標題化合物（１８４８ｍｇ，２．８８ｍｍｏｌ，９２％）を白色泡状物質として得る。
【００６８】
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 2.20 (3 H, s), 2.60-2.68 (2 H, m), 2.97-2.98 (1 H, br), 3.54-3.62 (2 H, m), 3.79 (6 H, m), 3.92-3.97 (1 H, m), 4.01(1H, d, J=5.13), 4.11-4.13(1H, m), 4.24-4.18(1H, m), 5.89 (1 H, s), 6.85-6.87 (4 H, m), 7.15-7.43 (10 H, m), 8.53 (1H, d, J=7.57), 10.00 (1H, br)
【００６９】
実施例１４ Ｎ４−アセチル−５‘−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−シアノエチル）シチジン ３’−（２−シアノエチル Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物１４）
【００７０】
【化１４】
【００７１】
上記化合物１３(668 mg, 1.04 mmol) を乾燥トルエンにて５回共沸脱水を行った後、アルゴン置換した。乾燥ジクロロメタン(8 ml)に溶解させジイソプロピルエチルアミン(271μl , 1.56 mmol)を加え, ジイソプロピルアミノ-(2−シアノエチル)-クロロホスフィン(271 mg, 1.15 mmol) を乾燥ジクロロメタン (2 ml)の溶液として加えた。3時間撹拌した後, 酢酸エチルで希釈し, 飽和食塩水、飽和重曹水で有機層を洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥して乾燥剤をろ別した。溶媒を減圧流去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール (９８：２〜９７：３ ０．５％トリエチルアミン)で精製し標題化合物 (790 mg, 0.94 mmol, 90%) を白色泡状物質として得る。
【００７２】
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 1.01‐1.18 (12 H, m), 2.23‐2.24(3 H, m), 2.40-2.75(4 H, m), 3.45-3.74(5 H, m), 3.81-3.82(6 H, m), 3.84-4.59(6 H, m),5.91-5.93(1 H, m), 6.83-6.87(4 H, m), 6.96-7.05(1 H, m), 7.26-7.44(9H,m),8.53-8.60(1H,m),10.10(1H,s)
【００７３】
実施例１５ Ｎ６‐ジメチルアミノメチレン‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン（化合物１５）
【００７４】
【化１５】
【００７５】
Ｎ６‐ジメチルアミノメチレン‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐アデノシン化合物 (５６５ｍｇ,１ｍｍｏｌ)をｔ−ブチルアルコール（５ｍｌ）に溶解させた。そこにアクリロニトリル（１．３ｍｌ，２０ｍｍｏｌ）、引き続き炭酸セシウム（３５３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加え３時間激しく撹拌した。その後、セライトろ過により炭酸セシウムを取り除き、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（５０：１）で精製し標題化合物（５５９ｍｇ、９０％）を得た。
【００７６】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)0.96‐1.12(28H, m), 2.71‐2.73(2H, m), 3.19(3H, s), 3.25(3H, s), 3.94-4.27(6H,m), 4.77(1H, dd), 6.01(1H, s), 8.14(1H, s), 8.48(1H, s), 8.93(1H, s)
【００７７】
実施例１６ Ｎ６‐ジメチルアミノメチレン‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン（化合物１６）
【００７８】
【化１６】
【００７９】
得られた化合物１５(１．４５ｇ, ２．３５ｍｍｏｌ)をテトラヒドロフラン２４ｍｌ）に溶解させた。そこにトリエチルアミン3フッ化水素（１．３ｍｌ，７．９８ｍｍｏｌ）、引き続きトリエチルアミン（５８９μｌ，４．２３ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（５０：１から２５：１）で精製し標題化合物（８７８ｍｇ、ｑｕａｎｔ）を得た。
【００８０】
1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)2.62‐2.65(2H, m), 3.16(3H, s), 3.18(3H, s), 3.65‐3.72(4H, m), 3.80‐3.86(4H, m), 4.09‐4.11(1H, m), 4.43(1H, t), 4.53 (1H, t), 6.08 (1H, d), 8.34 (1H, s), 8.40 (1H, s), 8.83 (1H, s)
【００８１】
実施例１７ Ｎ６‐ジメチルアミノメチレン‐５‘‐Ｏ‐ジメトキシトリチル‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン（化合物１７）
【００８２】
【化１７】
【００８３】
化合物１６(７１６ｍｇ, １．９１ｍｍｏｌ)をピリジン（１９ｍｌ）に溶解させた。そこにジメトキシトリチルクロリド（７１２ｍｇ，２．１０ｍｍｏｌ）を加え３時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、クロロホルムで希釈し飽和食塩水並びに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。さらに水層をクロロホルムで３回逆抽出し有機層とあわせて無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。乾燥剤をろ別した後、減圧濃縮し得られた残渣を得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０から５０：１含０．５％トリエチルアミン）で精製し標題化合物（１１３２ｍｇ，８７％）を得た。
【００８４】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)2.52‐2,2.59(2H, m), 3.13(3H, s), 3.18(3H, s), 3.25‐3.57(2H, m), 3.72(6H, s), 3.82‐3.92(2H, m), 4.20‐4.24(3H, m), 4.50(1H, t), 4.60(1H, dd),6.14(1H, d),6.75(4H, d), 7.13‐7.47(9H, m), 8.09(1H, s), 8.43(1H, s), 8.94(1H, s)
【００８５】
実施例１８ Ｎ６‐ジメチルアミノメチレン‐５‘‐Ｏ‐ジメトキシトリチル‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン ３’−（２−シアノエチル Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物１８）
【００８６】
【化１８】
【００８７】
上記化合物１７（１．０６ｇ，１．５１ｍｍｏｌ）を脱水トルエンにて５回共沸脱水した後アルゴン置換した。乾燥ジクロロメタン（１２ｍｌ）に溶解させ、ジイソプロピルエチルアミン（０．３ｍｌ，１．７２ｍｍｏｌ）、２‐シアノエチルＮ，Ｎ‐ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（３２８ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（２ｍｌ）の溶液として反応系に滴下した。室温で２時間撹拌した後、反応液をクロロホルムで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で３回、飽和食塩水で１回洗浄した。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。乾燥剤をろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣をＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０→１００：１）で精製し標題化合物（８９６ｍｇ，８２％）を得た。
【００８８】
1H‐NMR(CDCl3, 500MHz)1.06‐1.18(12H, m), 2.58‐2.66(4H, m), 3.21(3H, s), 3.26(3H, s), 3.32‐3.35(1H, m), 3.51‐4.01(14H, m), 4.34‐4.39(1H, m), 4.55‐4.67(1H, m), 4.80‐4.85( 1H, m), 6.10-6.14(1H, m), 6.76‐6.83(4H, t), 7.18‐7.36(9H, m), 8.09‐8.12(1H, m), 8.45‐8.46(1H, m), 8.95‐8.96(1H, m)
【００８９】
実施例１９ N2−ジメチルアミノメチレン−Ｏ−６‐トリイソプロピルベンゼンスルホニル‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐２‘‐Ｏ‐シアノエチルグアノシン (化合物１９）
【００９０】
【化１９】
【００９１】
N2−ジメチルアミノメチレン−０６‐トリイソプロピルベンゼンスルホニル‐３’，５’‐Ｏ‐テトライソプロピルジシロキサニリデン‐グアノシン (６．６０ｇ,７．８０ｍｍｏｌ)をｔ−ブチルアルコール（３９ｍｌ）に溶解させた。そこにアクリロニトリル（２０ｍｌ，１５６ｍｍｏｌ）、引き続き炭酸セシウム（２．７５ｇ，７．８０ｍｍｏｌ）を加え２時間激しく撹拌した。その後、セライトろ過により炭酸セシウムを取り除き、減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：１）で精製し標題化合物（５．８２ｍｇ、８３％）を得た。
【００９２】
1H-NMR(CDCL3, 500 MHz)0.99‐1.34(46H, m), 2.77‐2.632.79(2H, t), 2.95‐2.97(1H, m), 3.11(3H, s), 3.16(3H,s), 3.99‐4.33(9H, m), 4.57(1H, dd), 6.18(1H, s), 7.23(2H, s), 8.04(1H,s), 8.23(1H, s)
【００９３】
実施例２０ Ｎ２‐ジメチルアミノメチレン‐６‐Ｏ‐トリイソプロピルベンゼンスルホニル‐２’‐Ｏ‐シアノエチルグアノノシン（化合物２０）
【００９４】
【化２０】
【００９５】
化合物１９(１１３ｍｇ,０．１２６ｍｍｏｌ)をテトラヒドロフラン（１ｍｌ）に溶解させた。そこにトリエチルアミン3フッ化水素（７２μｌ，０．４４２ｍｍｏｌ）、引き続きトリエチルアミン（３１μｌ，０．２２６ｍｍｏｌ）を加え１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０から５０：１から１０：１）で精製し標題化合物（６７ｍｇ，８１％）を得た。
【００９６】
1H-NMR(CDCl3, 500 MHz)1.22‐1.31(18H, m), 2.57-2.60(2H, t), 2.81-2.96(1H, m), 3.05(3H, s), 3.12(3H, s), 3.62-3.79(3H, m), 3.93(1H, d), 4.24(2H, dt), 4.31(1H, br), 4.62(1H, m), 4.84(1H, dd), 5.98‐6.15(2H, m), 7.23(2H, s), 8.12(1H, s), 8.20(1H, s)
【００９７】
実施例２１ Ｎ２‐ジメチルアミノメチレン‐２’‐Ｏ‐シアノエチルグアノノシン（化合物２１）
【００９８】
【化２１】
【００９９】
化合物１３(630 mg, 0.7 mmol) を無水アセトニトリル（７ｍｌ）に溶解させオルトニトロベンズアルドキシム(349 mg, 2.10 mmol),テトラメチルグアニジン(263 μl, 2.10 mmol). を加える。１時間撹拌後、反応液を酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水、飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄する。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ過して有機溶媒を減圧留去する。得られた残渣を無水THF（７ｍｌ）に溶解させ、トリエチルアミン（１７２μl，１．２６mmol）,トリエチルアミン３フッ化水素（３９９ｍｌ，２．４５mmol）を加えて、１時間撹拌する。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（９０：１０→８５：１５，ｖ／ｖ）で精製し標題化合物（２１８ｍｇ，０．５５７mmol，８０％）を白色固体として得る。
【０１００】
1H-NMR (DMSO, 500 MHz) 2.73-2.76 (2H, m), 3.03 (3H, s), 3.15 (3H, s), 3.54-3.58 (1H, m), 3.63-3.69(1H, m), 3.78-3.82 (1H, m), 3.91 (1H, q, J=3.91), 4.29 (1H, q, J=4.39, 5.13), 4.40 (1H, t, J=5.13), 5.01 (1H, t, J=5.61), 5.30 (1H, d, J=5.37), 5.91(1H, d, J=5.13), 8.08 (1H, s), 8.55 (1H, s), 11.4 (1H, br)
【０１０１】
実施例２２ ２‘‐Ｏ‐シアノエチルシチジン（化合物２２）
【０１０２】
【化２２】
【０１０３】
化合物１２ (１４１ｍｇ,０．４０１ｍｍｏｌ)をアンモニア水：エタノール（４ｍｌ，ｖ／ｖ＝３／１）に溶解させ１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（７：１）で精製し標題化合物（１０９ｍｇ、９２％）を得た。
【０１０４】
1H-NMR(D2O, 500 MHz)2.83‐2.86(2H, m), 3.83(1H, dd), 3.95‐4.03(3H, m), 4.14‐4.18(2H, m), 4.28(1H,dd), 5.97(1H, d), 6.05(1H, dd), 7.88(1H, d)
【０１０５】
実施例２３ ２‘‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン（化合物２３）
【０１０６】
【化２３】
【０１０７】
化合物１６ (４７５ｍｇ,１．２７ｍｍｏｌ)をアセトニトリルに溶解させヒドラジン（２１８μｌ，７ｍｍｏｌ）を加えて３時間撹拌する。反応系に析出してきた粉体をイソプロピルアルコールで洗浄した。さらに炉液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０→５０：１→１０：１）で精製し先ほどの粉体とあわせて標題化合物（３３２ｍｇ、８２％）を得た。
【０１０８】
1H-NMR(D2O, 500 MHz)2.83‐2.86(2H, m), 3.83(1H, dd), 3.95‐4.03(3H, m), 4.14‐4.18(2H, m), 4.28(1H,dd), 5.97(1H, d), 6.05(1H, dd), 7.88(1H, d)
【０１０９】
実施例２４ ２‘‐Ｏ‐シアノエチルグアノシン(化合物２４）
【０１１０】
【化２４】
【０１１１】
化合物２１ (４４７ｍｇ，０．６８０ｍｍｏｌ)をアセトニトリル７ｍｌに溶解させオルトニトロベンズアルドオキシム（３３９ｍｇ，７ｍｍｏｌ）、テトラメチルグアニジン（８５μｌ，０．６７７ｍｍｏｌ）を加えて１時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール（１００：０→５０：１→２０：１→１０：１）で精製する。得られた化合物をアンモニア水：エタノール（５ｍｌ，ｖ／ｖ＝３：１）を加えて６時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し５０％エタノール溶液から結晶化し標題化合物（１２１ｍｇ，５３％）を得る。
【０１１２】
1H-NMR(D2O, 500 MHz)2.73(2H, t), 3.76‐3.95(4H, m), 4.23(1H, q), 4.50(1H, dd), 4.52(1H,t), 5.98(1H, d), 8.04(1H, s)
【０１１３】
実施例２５ ２Ｎ-ジメチルアミノメチレン‐5‘-Ｏ‐ジメトキシトリチル‐２’‐Ｏ‐（２‐シアノエチル）グアノシン（化合物２５）
【０１１４】
【化２５】
【０１１５】
化合物２１ (392 mg, 1.00 mmol) 無水ピリジンにて４回共沸脱水を行い、無水ピリジン１０ｍｌに溶解させた。ジメトキシトリチルクロリド (373 mg, 1.10 mmol)を加えて室温で3時間撹拌する。水を加えて反応を停止し溶媒を減圧留去した。得られた残渣をクロロホルムで希釈し飽和食塩水ならびに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール (９８：２, ０．５％トリエチルアミン)にて精製し、標題化合物 (635 mg, 0.92 mmol, 92 %) を白色泡状物として得る。
【０１１６】
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 2.57-2.59 (2 H, m), 2.98(3 H, s), 3.04(3 H, s), 3.38(1 H, dd, J=4.64. 10.50), 3.45-3.47(1 H, dd, J=2.44, 10.50), 3.74(6 H, s), 3.78-3.96(3 H, m,), 4.21-4.23(1 H, m), 4.29(1 H, dd, J=3.42, 8.55), 4.59-4.60(1H, m), 6.09(1H, dd, J=3.42), 6.10-6.78(4H, m), 7.13-7.41(9H, m), 7.74(1H, s), 8.54(1H, s), 10.01(1H, br)
【０１１７】
実施例２６ ２Ｎ-ジメチルアミノメチレン‐5‘-Ｏ‐ジメトキシトリチル‐２’‐Ｏ‐（２‐シアノエチル）グアノシン ３’−（２−シアノエチル Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物２６）
【０１１８】
【化２６】
【０１１９】
化合物２５ (1.95 g, 2.81 mmol) を無水トルエンにて3回共沸脱水を行い系内をアルゴン置換した。無水ジクロロメタン（２６ｍｌ）に溶解させた後、ジイソプロピルエチルアミン(736μl , 1.56 mmol)を加え, ジイソプロピルアミノ-(2−シアノエチル)-クロロホスフィン (732 mg, 3.09 mmol) を無水ジクロロメタン(2 ml)の溶液として加えた。３時間撹拌した後,クロロホルムで希釈し, 飽和食塩水並びに飽和炭酸水素ナトリウム水溶液にて洗浄する。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムにて乾燥し、ろ別する。有機溶媒を減圧留去して得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに吸着させクロロホルム：メタノール (９８：２, ０．５％トリエチルアミン)にて精製し標題化合物 (2.11 g, 2.36 mmol, 84%)を白色泡状物質として得る。
【０１２０】
1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) 1.01 -1.24(12 H, m),2.33-2.66(5 H, m), 3.07-3.10(6 H,m), 3.30-4.02(14 H, m), 4.29-4.35(2 H, m), 4.48-4.55(1 H, m), 6.09-6.12(1 H,m), 6.79-6.82(4H, m), 7.17-7.44(10 H, m),7.78-7.82(1H,m),8.57-8.60(1H, m), 9.73-9.77(1H,m)
【０１２１】
実施例２７ ２‘−シアノエチルウリジル酸１２量体の合成
常法により調整された、２‘−Ｏ−シアノエチルウリジンがサクシニルリンカーを介して導入されているロングアミノアルキルチェーンＣＰＧ（１６μｍｏｌ／ｇ）を1μmol固相合成用ソケットに充填されたものを用い、２‘−Ｏ-シアノエチルウリジンホスホロアミダイトユニット（化合物７）を０．１Ｍの無水アセトニトリルの溶液としてＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ）に縮合時間１０分間の縮合時間であるＲＮＡ合成用プログラムを適用する。
合成終了後、アンモニア水１ｍｌにて２０分間処理して固相担体からオリゴヌクレオチドを切り出しを行う。その後、酢酸アンモニウムバッファーで適当量希釈し、逆相カラムカートリッジ並びに陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて精製する。逆相カラムカートリッジにて脱塩操作を行い得られたオリゴヌクレオチドを凍結乾燥して標題化合物を得る。（収率２１％）。陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによる分析プロファイルを図１Ａに示す。
【０１２２】
ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＡＳＳ （ｎｅｇａｔｉｖｅ）Ｃａｌｃｄ．４２４５．６６ Ｆｏｕｎｄ ４２４４．３３
【０１２３】
実施例２８ ＧＡＣＵの混合配列を有する２‘−Ｏ−シアノエチルＲＮＡ４量体の合成
常法により調整された２‘−Ｏ−シアノエチルウリジンがサクシニルリンカーを介して導入されているロングアミノアルキルチェーンＣＰＧ（１６μｍｏｌ／ｇ）を1μmol固相合成用ソケットに充填されたものを用い、各4種類の２‘−Ｏ-シアノエチルヌクレオシドホスホロアミダイトユニット（化合物７、１４、１８、２６） を０．１Ｍの無水アセトニトリルの溶液としてＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ）に縮合時間１０分間の縮合時間であるＲＮＡ合成用プログラムを適用する。
合成終了後、アンモニア水-酢酸アンモニウム（１０％ｗｔ／ｗｔ）１ｍｌにて９０分間処理して固相担体からのオリゴヌクレオチドの切り出し並びに核酸塩基部の保護基の脱保護を行う。その後、酢酸アンモニウムバッファーで適当量希釈し、逆相カラムカートリッジ並びに陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて精製する。逆相カラムカートリッジを用いて脱塩操作を行い得られたオリゴヌクレオチドを凍結乾燥して標題化合物を得る（収率 ５８％）。陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによる分析プロファイルを図１Ｂに示す。
【０１２４】
ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＡＳＳ （ｎｅｇａｔｉｖｅ）Ｃａｌｃｄ．１４３４．３１ Ｆｏｕｎｄ １４３４．１２
【０１２５】
実施例２９ ＧＡＣＵＧＡＣＵＧＡＣＵの混合配列を有する２‘−Ｏ−シアノエチルＲＮＡ１２量体の合成
常法により調整された２‘−Ｏ−シアノエチルウリジンがサクシニルリンカーを介して導入されているロングアミノアルキルチェーンＣＰＧ（１６μｍｏｌ／ｇ）を1μmol固相合成用ソケットに充填されたものを用い、各4種類の２‘−Ｏ-シアノエチルヌクレオシドホスホロアミダイトユニット（化合物７、１４、１８、２６）を０．１Ｍの無水アセトニトリルの溶液としてＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍ）に縮合時間１０分間の縮合時間であるＲＮＡ合成用プログラムを適用する。
合成終了後、アンモニア水-酢酸アンモニウム（１０％ｗｔ／ｗｔ）１ｍｌにて９０分間処理して固相担体からのオリゴヌクレオチドの切り出し並びに核酸塩基部の保護基の脱保護を行う。その後、酢酸アンモニウムバッファーで適当量希釈し、逆相カラムカートリッジ並びに陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて精製する。逆相カラムカートリッジを用いて脱塩操作を行い得られたオリゴヌクレオチドを凍結乾燥して標題化合物を得る（収率 ６％）。陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによる分析プロファイルを図１Ｃに示す。
【０１２６】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）Ｃａｌｃｄ．４４２８．８６ Ｆｏｕｎｄ ４４２８．５５
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明の合成方法で得られる、一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシドもしくはそのヌクレオチド：
【０１２８】
【化２７】
【０１２９】
（式Ｉ中、Ｘ及びＹは同一または異なって、水素、置換基を有していてもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は一般式（ＩＩ）：
【０１３０】
【化２８】
【０１３１】
（式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ２は同一または異なって、炭素数１から７のアルキル基を表すか、又は、Ｒ1およびＲ２が互いに結合して環構造を形成し、Ｒ３はリン酸の保護基を表す）を表し、Ｂ１は置換基を有していてもよいピリミジン塩基又はプリン塩基を表す。）である修飾RNAは遺伝子制御のための人工RNA分子等として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシド又はそのヌクレオチド：
【化１】
（式Ｉ中、Ｘ及びＹは同一または異なって、水素、置換基を有していてもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は一般式（ＩＩ）：
【化２】
（式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ２は同一または異なって、炭素数１から７のアルキル基を表すか、又は、Ｒ1およびＲ２が互いに結合して環構造を形成し、Ｒ３はリン酸の保護基を表す）を表し、Ｂ１は置換基を有していてもよいピリミジン塩基又はプリン塩基を表す。）。
【請求項２】
２’‐Ｏ‐シアノエチルウリジン。
【請求項３】
２’‐Ｏ‐シアノエチルシチジン。
【請求項４】
２’‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン。
【請求項５】
２’‐Ｏ‐シアノエチルグアノノシン。
【請求項６】
Ｎ−４−ジメチルアミノメチレン−２’‐Ｏ‐シアノエチルシチジン。
【請求項７】
Ｎ６−ジメチルアミノメチレン−２’‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン。
【請求項８】
Ｎ２‐ジメチルアミノメチレン‐６‐Ｏ‐トリイソプロピルベンゼンスルホニル‐２’‐Ｏ‐シアノエチルグアノノシン。
【請求項９】
Ｎ４‐アセチル‐２‘‐Ｏ‐（２−シアノエチル）シチジン。
【請求項１０】
Ｎ２‐ジメチルアミノメチレン‐２’‐Ｏ‐シアノエチルグアノノシン。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか一項に記載のヌクレオシドの合成方法であって、炭酸セシウム、ＤＢＵ，及びＴｒｉｔｏｎＢから成る群から選択される少なくとも一種の化合物とアクリロニトリルとヌクレオシド誘導体を合成原料として用い、ｔ−ブチルアルコールの存在下又は非存在下で、２‘水酸基をシアノエチルエーテル化することを特徴とする、前記合成方法。
【請求項１２】
炭酸セシウム、ＤＢＵ，及びＴｒｉｔｏｎＢから成る群から選択される少なくとも一種の化合物をヌクレオシド誘導体に対して０．１〜３０ｅｑｕｉｖの範囲で反応系に存在させ、アクリロニトリルに対して、０．０５〜３０ｅｑｕｉｖの範囲のｔ−ブチルアルコールの存在下に反応を行う、請求項１１記載の合成方法。
【請求項１３】
炭酸セシウムを用いる、請求項１１又は１２に記載の合成方法。
【請求項１４】
２０℃〜３０℃の温度範囲で反応させる、請求項１１〜１３の何れか一項に記載の合成方法。
【請求項１５】
反応時間が２時間〜３時間の範囲である、請求項１１〜１４の何れか一項に記載の合成方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１０のいずれか一項に記載のヌクレオシドを含むＲＮＡオリゴマー。
【請求項１】
一般式（Ｉ）で表されるヌクレオシド又はそのヌクレオチド：
【化１】
（式Ｉ中、Ｘ及びＹは同一または異なって、水素、置換基を有していてもよいシリル基、４−メトキシトリチル基、４，４’−ジメトキシトリチル基、又は一般式（ＩＩ）：
【化２】
（式（ＩＩ）中、Ｒ1およびＲ２は同一または異なって、炭素数１から７のアルキル基を表すか、又は、Ｒ1およびＲ２が互いに結合して環構造を形成し、Ｒ３はリン酸の保護基を表す）を表し、Ｂ１は置換基を有していてもよいピリミジン塩基又はプリン塩基を表す。）。
【請求項２】
２’‐Ｏ‐シアノエチルウリジン。
【請求項３】
２’‐Ｏ‐シアノエチルシチジン。
【請求項４】
２’‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン。
【請求項５】
２’‐Ｏ‐シアノエチルグアノノシン。
【請求項６】
Ｎ−４−ジメチルアミノメチレン−２’‐Ｏ‐シアノエチルシチジン。
【請求項７】
Ｎ６−ジメチルアミノメチレン−２’‐Ｏ‐シアノエチルアデノシン。
【請求項８】
Ｎ２‐ジメチルアミノメチレン‐６‐Ｏ‐トリイソプロピルベンゼンスルホニル‐２’‐Ｏ‐シアノエチルグアノノシン。
【請求項９】
Ｎ４‐アセチル‐２‘‐Ｏ‐（２−シアノエチル）シチジン。
【請求項１０】
Ｎ２‐ジメチルアミノメチレン‐２’‐Ｏ‐シアノエチルグアノノシン。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか一項に記載のヌクレオシドの合成方法であって、炭酸セシウム、ＤＢＵ，及びＴｒｉｔｏｎＢから成る群から選択される少なくとも一種の化合物とアクリロニトリルとヌクレオシド誘導体を合成原料として用い、ｔ−ブチルアルコールの存在下又は非存在下で、２‘水酸基をシアノエチルエーテル化することを特徴とする、前記合成方法。
【請求項１２】
炭酸セシウム、ＤＢＵ，及びＴｒｉｔｏｎＢから成る群から選択される少なくとも一種の化合物をヌクレオシド誘導体に対して０．１〜３０ｅｑｕｉｖの範囲で反応系に存在させ、アクリロニトリルに対して、０．０５〜３０ｅｑｕｉｖの範囲のｔ−ブチルアルコールの存在下に反応を行う、請求項１１記載の合成方法。
【請求項１３】
炭酸セシウムを用いる、請求項１１又は１２に記載の合成方法。
【請求項１４】
２０℃〜３０℃の温度範囲で反応させる、請求項１１〜１３の何れか一項に記載の合成方法。
【請求項１５】
反応時間が２時間〜３時間の範囲である、請求項１１〜１４の何れか一項に記載の合成方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１０のいずれか一項に記載のヌクレオシドを含むＲＮＡオリゴマー。
【図１】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８５２７１
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【発行日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１０６８０（Ｐ２００６−５１０６８０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３４５９
【国際出願日】平成１７年３月２日（２００５．３．２）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年９月１５日（２００５．９．１５）
【発行日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／００３４５９
【国際出願日】平成１７年３月２日（２００５．３．２）
【出願人】（５０３３６０１１５）独立行政法人科学技術振興機構 (1,734)
【Ｆターム（参考）】
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