ＨＣＶＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼの阻害
【課題】Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）非遺伝子型１ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼ活性の活性阻害方法の提供。
【解決手段】該プロテアーゼを該プロテアーゼの活性を阻害するのに有効な量のＶＸ−９５０（競合的可逆的ペプチドミミックＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤）またはその製薬上許容される塩、および免疫調節剤、シトクロムｐ４５阻害剤、抗ウイルス剤、ＨＣＶプロテアーゼの第２の阻害剤、ＨＣＶの生活環中の他の標的の阻害剤、またはそれらの組合せから選択される追加の薬剤を患者に投与する方法。
【解決手段】該プロテアーゼを該プロテアーゼの活性を阻害するのに有効な量のＶＸ−９５０（競合的可逆的ペプチドミミックＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤）またはその製薬上許容される塩、および免疫調節剤、シトクロムｐ４５阻害剤、抗ウイルス剤、ＨＣＶプロテアーゼの第２の阻害剤、ＨＣＶの生活環中の他の標的の阻害剤、またはそれらの組合せから選択される追加の薬剤を患者に投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、セリンプロテアーゼの活性、とくに、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼの活性を阻害する化合物に関する。したがって、該化合物は、Ｃ型肝炎ウイルスの生活環を阻害することにより作用し、抗ウイルス剤としても有用である。本発明はさらに、ｅｘ ｖｉｖｏで使用するためのまたはＨＣＶ感染症に罹患している患者に投与するための組成物に関する。本発明はまた、本発明に係る組成物を投与することにより患者においてＨＣＶ感染症を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）の感染は、切実なヒト医学上の問題である。ＨＣＶは、非Ａ型非Ｂ型肝炎のほとんどの症例の原因因子として認識され、全世界で３％の推定ヒト血清有病率を有する［A. Alberti et al., ”Natural History of Hepatitis C,” J. Hepatology, 31., (Suppl. 1), pp. 17-24 (1999)］。米国だけでも、およそ４００万人が感染している可能性がある［M.J. Alter et al., ”The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States, Gastroenterol. Clin. North Am., 23, pp. 437-455 (1994); M. J. Alter ”Hepatitis C Virus Infection in the United States,” J. Hepatology, 31., (Suppl. 1), pp. 88-91 (1999)］。
【０００３】
ＨＣＶに初めて暴露されたとき、感染者のわずか約２０％が急性臨床的肝炎を発症するにすぎず、他の者は、感染を自発的に消散させるように思われる。しかしながら、症例のほぼ７０％において、このウイルスは、何十年にもわたり持続する慢性感染症を定着させる［S. Iwarson, ”The Natural Course of Chronic Hepatitis,” FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 201-204 (1994); D. Lavanchy, ”Global Surveillance and Control of Hepatitis C,” J. Viral Hepatitis, 6, pp. 35-47 (1999)］。この結果、通常、肝炎の再発および進行性悪化が起こり、それにより、多くの場合、肝硬変や肝細胞癌のようなより重篤な疾患状態を生じる［M.C. Kew, ”Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma”, FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 211-220 (1994); I. Saito et al., ”Hepatitis C Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carcinoma,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 6547-6549 (1990)］。残念ながら、慢性ＨＣＶ症の衰弱性進行に対する広く有効な治療法は存在しない。
【０００４】
ＨＣＶゲノムは、３０１０〜３０３３個のアミノ酸よりなるポリタンパク質をコードする［Q.L. Choo, et al., ”Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis C Virus.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 2451-2455 (1991); N. Kato et al., ”Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patients with Non-A, Non-B Hepatitis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 9524-9528 (1990); A. Takamizawa et al., "Structure and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human Carriers," J. Virol., 65, pp. 1105-1113 (1991)］。ＨＣＶの非構造（ＮＳ）タンパク質は、ウイルスの複製に不可欠な触媒機構を提供するものと推定される。ＮＳタンパク質は、ポリタンパク質のタンパク質分解切断により誘導される［R. Bartenschlager et al., ”Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions,” J. Virol., 67, pp. 3835-3844 (1993); A. Grakoui et al., "Characterization of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites," J. Virol., 67, pp. 2832-2843 (1993); A. Grakoui et
al., "Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products," J. Virol., 67, pp. 1385-1395 (1993); L. Tomei et al., "NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein", J. Virol., 67, pp. 4017-4026 (1993)］。
【０００５】
ＨＣＶのＮＳタンパク質３（ＮＳ３）は、ウイルス酵素の大多数のプロセシングを助けるセリンプロテアーゼ活性を含有するので、ウイルスの複製および感染力に不可欠であると考えられる。チンパンジーにおいて触媒性トライアドの置換が感染力の消失を引き起こしたので、ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼは、ウイルスの複製に不可欠である［A.A. Kolykhalov et al., ”Hepatitis C virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3’ nontranslated region are essential for virus replication in vivo”, J. Virol., 74: 2046-2051］。ＮＳ３の最初の１８１個のアミノ酸（ウイルスポリタンパク質の残基１０２７〜１２０７）は、ＨＣＶポリタンパク質の４つの下流部位すべてのプロセシングを行うＮＳ３のセリンプロテアーゼドメインを含有することが明らかにされている［C. Lin et al., ”Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics”, J. Virol., 68, pp. 8147-8157 (1994)］。
【０００６】
ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼおよびその関連補因子ＮＳ４Ａは、ウイルスの非構造タンパク質領域から個々の非構造タンパク質（ウイルスの酵素すべてを包含する）へのプロセシングを助ける。このプロセシングは、ヒト免疫不全ウイルスのアスパルチルプロテアーゼ（ウイルスタンパク質のプロセシングにも関与する）により行われるものと類似しているように思われる。ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤（ウイルスタンパク質のプロセシングを阻害する）が、ヒトにおいて強力な抗ウイルス剤であることから、ウイルスの生活環のこの段階を中断すれば、治療上有効な薬剤が得られることが示唆される。したがって、それは、薬剤探索の魅力的な標的である。
【０００７】
ＨＣＶ プロテアーゼの阻害剤として可能性のあるものが先行技術でいくつか報告されている［PCT publication Nos. WO 02/18369, WO 02/08244, WO 00/09558, WO 00/09543, WO 99/64442, WO 99/07733, WO 99/07734, WO 99/50230, WO 98/46630, WO 98/17679 and WO 97/43310, United States Patent 5,990,276, M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, pp. 1713-18 (1998); W. Han et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 711-13 (2000); R. Dunsdon et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 1571-79 (2000); M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2267-70 (2000); and S. LaPlante et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2271-74 (2000)］。しかしながら、これらの化合物が許容しうる薬剤として適切なプロファイルを有しているかどうかは、わかっていない。さらに、これらの阻害剤は、全部ではないにしてもほとんどが、標的として遺伝子型１（１ａまたは１ｂ）のＮＳ３−４Ａセリンプロテアーゼを用いて見いだされたものであった。しかしながら、ＨＣＶにはさまざまな遺伝子型が存在し、各遺伝子型内にさまざまなサブタイプが存在する。たとえば、現在、ＨＣＶには１１種（１〜１１の番号が付けられている）の主要な遺伝子型が存在することが知られているが、遺伝子型を６種の主要な遺伝子型として分類する人たちもいる。これらの各遺伝子型はさらに、サブタイプ（１ａ〜１ｃ、２ａ〜２ｃ、３ａ〜３ｂ、４ａ〜４ｅ、５ａ、６ａ、７ａ〜７ｂ、８ａ〜８ｂ、９ａ、１０ａ、および１１ａ）に細分される。
【０００８】
サブタイプの存在割合は、以下のように全世界的に異なっている。
【表１】
【０００９】
現在の科学的考えは、ＨＣＶの遺伝子型またはサブタイプが治療に対する患者の応答性を決定しうるということである。ＨＣＶのゲノムの複雑度とインターフェロン療法に対する患者の応答との間に相関があることが知られているが、この相関の理由は、明らかでない。遺伝子型２のＨＣＶウイルスおよび遺伝子型３のＨＣＶウイルスに感染した患者は、遺伝子型１のＨＣＶに感染した患者とは異なる度合いで従来療法に応答することが一般に認められる。このため、遺伝子型１ ＨＣＶプロテアーゼに対していくつかのＨＣＶプロテアーゼ阻害剤が設計／探索されてきたが、これらの阻害剤が遺伝子型２ ＨＣＶや遺伝子型３ ＨＣＶなどのような他の遺伝子型のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａセリンプロテアーゼを効果的に阻害するかどうかは、明らかでない。
【００１０】
したがって、ＨＣＶに関する現在の理解は、なんら満足すべき抗ＨＣＶ剤や抗ＨＣＶ治療をもたらすに至っていない。ＨＣＶ疾患に対する唯一の確立された療法は、ペグ化インターフェロンとリバビリンとの組合せ治療である。しかしながら、インターフェロンは、有意な副作用を有し［M. A. Wlaker et al., "Hepatitis C Virus: An Overview of Current Approaches and Progress," DDT, 4, pp. 518-29 (1999); D. Moradpour et al., "Current and Evolving Therapies for Hepatitis C," Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11, pp. 1199-1202 (1999); H. L. A. Janssen et al. "Suicide Associated with Alfa-Interferon Therapy for Chronic Viral Hepatitis," J. Hepatol., 21, pp. 241-243 (1994); P.F. Renault et al., "Side Effects of Alpha Interferon," Seminars in Liver Disease, 9, pp. 273-277. (1989)］、症例のごく一部だけ（約２５％）で長期寛解をもたらすにすぎない［O. Weiland, ”Interferon Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection” , FEMS Microbiol. Rev., 14, pp. 279-288 (1994)］。それに加えて、この組合せ治療は、遺伝子型２または３のＨＣＶに感染した患者では約８０％の持続性ウイルス応答（ＳＶＲ）を有し、遺伝子型１のＨＣＶに感染した患者では４０〜５０％のＳＶＲを有する［J.G. McHutchison, et al., N. Engl. J. Med., 339: 1485-1492 (1998); G.L. Davis et al., N. Engl. J. Med., 339: 1493-1499 (1998)］。さらに、有効な抗ＨＣＶワクチンの見通しは、不明確なままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、より有効な抗ＨＣＶ療法、とくに、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを阻害する化合物に対する必要性が存在する。そのような化合物は、抗ウイルス剤とくに抗ＨＣＶ剤として有用でありうる。種々の遺伝子型のＨＣＶセリンプロテアーゼを阻害する化合物に対する必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、ＶＸ−９５０を用いて遺伝子型２および遺伝子型３のＨＣＶを阻害する方法を提供することにより、これらの必要性に対処する。遺伝子型２および遺伝子型３のＨＣＶを特異的に阻害する点でＶＸ−９５０は他のプロテアーゼ阻害剤よりも優れていることが本発明に例示されているが、他の非遺伝子型１のＨＣＶ遺伝子型であってもＶＸ−９５０により効果的に阻害されうると考えられる。
【００１３】
本発明はまた、ＶＸ−９５０を含む組成物およびその使用に関する。そのような組成物は、患者に挿入される侵襲的デバイスを前処理したり、血液のような生物学的サンプルを患者への投与前に処理したり、患者に直接投与したりするために使用することが可能である。いずれの場合も、組成物は、ＨＣＶの複製を阻害したりＨＣＶ感染症にかかる危険性やＨＣＶ感染症の重症度を低減したりするために使用されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】１１種の遺伝子型２ ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのアミノ酸配列のアライメント
【図２】遺伝子型２ａのＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのコンセンサスアミノ酸配列およびコンセンサスヌクレオチド配列
【図３】６種の遺伝子型３ ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのアミノ酸配列のアライメント。
【図４】遺伝子型３ａのＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのコンセンサスアミノ酸配列およびコンセンサスヌクレオチド配列。
【図５】それぞれの遺伝子型または遺伝子サブタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、および３ｂのコンセンサスアミノ酸配列のアライメント。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、遺伝子型２または遺伝子型３のプロテアーゼをＶＸ−９５０に接触させることにより遺伝子型２および遺伝子型３のプロテアーゼを単独にまたは同時に阻害する方法を提供する。
【００１６】
ＶＸ−９５０は、３ｎＭの定常状態結合定数（ｋｉ＊）（および８ｎＭのＫｉ）を有する競合的可逆的ペプチドミミックＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤である［WO 02/018369］。ＶＸ−９５０は、一般的には、当業者に公知の方法により調製可能である（たとえば、WO 02/18369を参照されたい）。
【化１】
【００１７】
本発明に係る化合物は、１個以上の不斉炭素原子を含有しうるので、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、ジアステレオマー混合物および個別のジアステレオマーとして存在しうる。当該化合物のそのような異性形はすべて、本発明に明示的に包含される。各ステレオジェン炭素は、Ｒ配置またはＳ配置をとりうる。
【００１８】
たとえば、特定の実施形態では、使用される化合物は、以下の構造：
【化２】
【００１９】
に示されるようにＮ−プロピル側鎖におけるＤ異性体とＬ異性体との混合物でありうる。出発化合物としてたとえばＶＸ−９５０または構造Ａで示される化合物を用いてラショナルドラッグデザインを介して創出される他の薬剤をプロテアーゼ阻害剤としての活性に関して試験することも可能である。
【００２０】
好ましくは、本発明に係る化合物は、ＶＸ−９５０に包含される化合物に示される構造および立体化学を有する。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、ＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩を含む組成物を提供する。好ましい実施形態によれば、ＶＸ−９５０は、サンプルにおいてまたは患者においてウイルス負荷（ただし、該ウイルスは、ウイルスの生活環に必要なセリンプロテアーゼをコードする）を減少させるのに有効な量でかつ製薬上許容される担体中に存在する。
【００２２】
本発明に係る化合物の製薬上許容される塩を当該組成物で利用する場合、該塩は、好ましくは、無機または有機の酸および塩基から誘導される。そのような酸塩に包含されるのは、次の化合物、すなわち、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、１／２硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニル−プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、およびウンデカン酸塩である。塩基塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（たとえば、ナトリウム塩およびカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（たとえば、カルシウム塩およびマグネシウム塩）、有機塩基との塩（たとえば、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩）、およびアミノ酸（たとえば、アルギニン、リシンなど）との塩が包含される。
【００２３】
また、塩基性窒素含有基は、低級アルキルハリド（たとえば、メチル、エチル、プロピル、およびブチルのクロリド、ブロミド、およびヨージド）、ジアルキルスルファート（たとえば、ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミルのスルファート）、長鎖ハリド（たとえば、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリルのクロリド、ブロミド、およびヨージド）、アラルキルハリド（たとえば、ベンジルおよびフェネチルのブロミド）などのような作用剤で四級化可能である。それにより水または油に溶解可能または分散可能な生成物が得られる。
【００２４】
本発明に係る組成物および方法で利用される化合物はまた、選択的生物学的性質を向上させるために、適切な官能基を付加することにより修飾可能である。そのような修飾は、当技術分野で公知であり、所与の生体系（たとえば、血液、リンパ系、中枢神経系）中への生物学的浸透を増大させたり、経口利用可能性を増大させたり、注射による投与が可能になるように溶解度を増大させたり、代謝を改変したり、排泄速度を改変したりする修飾を包含する。
【００２５】
当該組成物で使用しうる製薬上許容される担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（たとえば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（たとえば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトへの医薬投与のために製剤化される。
【００２７】
本発明に係るそのような医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸内に、鼻内に、口腔内に、膣内に、または移植レザバーを介して投与可能である。本明細書中で使用される「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、脊髄内、肝臓内、病変内、および頭蓋内への注射または注入の技術を包含する。好ましくは、組成物は、経口的にまたは静脈内に投与される。
【００２８】
本発明に係る滅菌注射剤形態の組成物は、水性懸濁剤または油性懸濁剤でありうる。これらの懸濁剤は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて当技術分野で公知の技術に従って製剤化可能である。滅菌注射調剤はまた、非毒性の非経口的に許容しうる希釈剤中または溶媒中（たとえば、１，３−ブタンジオール溶液として）の滅菌注射溶液剤または滅菌注射懸濁剤でありうる。利用可能な許容しうる媒体および溶媒には、水、リンゲル溶液、および等張塩化ナトリウム溶液が包含される。そのほかに、滅菌固定油が、溶媒または懸濁媒体として従来から利用されている。この目的のために、合成のモノ−またはジ−グリセリドをはじめとする任意の無刺激性固定油を利用することが可能である。オレイン酸のような脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、オリーブ油やヒマシ油（とくに、それらのポリオキシエチル化体）のような天然の製薬上許容される油の場合と同じように注射剤の調製に有用である。これらの油溶液剤または油懸濁剤は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤（たとえば、カルボキシメチルセルロースもしくはエマルジョン剤や懸濁剤をはじめとする製薬上許容される製剤の製剤化に一般に使用される類似の分散剤）をも含有しうる。他の一般に使用される界面活性剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および他の乳化剤）または製薬上許容される固形製剤、液状製剤、もしくは他の製剤の製造に一般に使用される生物学的利用能向上剤もまた、製剤化の目的に使用しうる。
【００２９】
１日あたり約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．５〜約７５ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与レベルの本明細書に記載のプロテアーゼ阻害化合物が、ウイルス疾患に対する、とくにＨＣＶ媒介疾患に対する予防および治療のための単独療法に有用である。典型的には、本発明に係る医薬組成物は、１日あたり約１〜約５回または他の選択肢として連続注入として投与されるであろう。そのような投与は、長期療法または短期療法として使用可能である。単一製剤を作製するために担体材料と組み合わせうる活性成分の量は、治療対象の宿主および特定の投与形態によって異なるであろう。典型的な調剤は、約５％〜約９５％の活性化合物（ｗ／ｗ）を含有するであろう。好ましくは、そのような調剤は、約２０％〜約８０％の活性化合物を含有する。熟練診療医であればわかることであるが、インターフェロンの用量は、典型的には、ＩＵ単位で測定される（たとえば、約４００万ＩＵ〜約１２００万ＩＵ）。
【００３０】
本発明に係る組成物がＶＸ−９５０と１種以上の追加の治療剤または予防剤との組合せを含む場合、これらの化合物および追加の薬剤はいずれも、単独療法レジメンで通常投与される用量の約１０〜１００％、より好ましくは約１０〜８０％の投与レベルで存在することが望ましい。
【００３１】
本発明に係る医薬組成物は、任意の経口的に許容しうる製剤、たとえば、限定されるものではないが、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、または水溶液剤として経口投与可能である。経口用途の錠剤の場合、一般に使用される担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。典型的には、マグネシウムステアレートのような滑沢剤もまた添加される。カプセル剤形態で経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁剤が経口用途に必要とされる場合、活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と組み合わされる。所望により、特定の甘味剤、風味剤、または着色剤もまた添加可能である。
【００３２】
他の選択肢として、本発明に係る医薬組成物は、直腸内投与に供すべく坐剤の形態で投与可能である。これらは、薬剤を室温では固体であるが直腸温では液体である好適な非刺激性賦形剤と混合することにより調製可能であり、したがって、直腸内で融解して薬剤を放出するであろう。そのような材料としては、ココアバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００３３】
本発明に係る医薬組成物はまた、とくに、治療の標的が局所適用で容易に到達可能な領域または器官を含む場合（たとえば、眼、皮膚、または下部腸管の疾患）、局所投与することも可能である。これらの領域または器官のそれぞれに好適な局所製剤は、容易に調製される。
【００３４】
下部腸管に対する局所適用は、直腸坐薬製剤（上記参照）または好適な浣腸製剤で行うことが可能である。局所的経皮貼付剤を使用することも可能である。
【００３５】
局所適用の場合、医薬組成物は、１種以上の担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適な軟膏剤として製剤化可能である。本発明に係る化合物の局所投与に供される担体としては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の選択肢として、医薬組成物は、１種以上の製薬上許容される担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適なローション剤またはクリーム剤として製剤化可能である。好適な担体としては、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
眼科用途の場合、医薬組成物はまた、ベンジルアルコニウムクロリドのような保存剤を併用してまたは併用せずに、等張性のｐＨ調整された滅菌生理食塩水中のマイクロ粒子化懸濁剤としてまたは好ましくは等張性のｐＨ調整された滅菌生理食塩水中の溶液剤として製剤化可能である。他の選択肢として、眼科用途の場合、医薬組成物は、ワセリン剤のような軟膏剤として製剤化可能である。
【００３７】
本発明に係る医薬組成物は、鼻内エアロゾルまたは吸入により投与することも可能である。そのような組成物は、医薬製剤分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールもしくは他の好適な保存剤、生物学的利用能を向上させる吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を利用して生理食塩水溶液として調製可能である。
【００３８】
最も好ましいのは、経口投与に供すべく製剤化される医薬組成物である。
【００３９】
他の実施形態では、本発明に係る組成物は、他の抗ウイルス剤、好ましくは抗ＨＣＶ剤を追加的に含む。そのような抗ウイルス剤としては、免疫調節剤、たとえば、α−、β−、およびγ−インターフェロン、ペグ化誘導体化インターフェロン−α化合物、ならびにチモシン；他の抗ウイルス剤、たとえば、リバビリン、アマンタジン、およびテルビブジン；Ｃ型肝炎プロテアーゼの他の阻害剤（ＮＳ２−ＮＳ３阻害剤およびＮＳ３−ＮＳ４Ａ阻害剤）；ＨＣＶの生活環中の他の標的の阻害剤、たとえば、ヘリカーゼ阻害剤およびポリメラーゼ阻害剤；リボソーム内部進入の阻害剤；広域ウイルス阻害剤、たとえば、ＩＭＰＤＨ阻害剤（たとえば、United States Patent 5,807,876、6,498,178、6,344,465、6,054,472、WO 97/40028、WO 98/40381、WO 00/56331に記載の化合物、ならびにミコフェノール酸およびその誘導体、さらにはたとえば、限定されるものではないが、ＶＸ−４９７、ＶＸ−１４８、および／またはＶＸ−９４４）；または以上のいずれかの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、W. Markland et al., Antimicrobial & Antiviral Chemotherapy, 44, p. 859 (2000) および U.S. Patent 6,541,496をも参照されたい。
【化３】
【００４０】
本明細書中では、以下の定義を使用する（商標は、本出願の出願日現在で入手可能な製品を示す）。
【００４１】
「Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ」は、Schering Corporation, Kenilworth, NJから入手可能なペグインターフェロンα−２ｂであるＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）を意味する。
【００４２】
「Ｉｎｔｒｏｎ」は、Schering Corporation, Kenilworth, NJから入手可能なインターフェロンα−２ｂであるＩｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）を意味する。
【００４３】
「リバビリン」は、リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）を意味し、ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CAから入手可能であり；Merck Index, entry 8365, Twelfth Editionに記載されており；さらには、Schering Corporation, Kenilworth, NJからＲｅｂｅｔｏｌ（登録商標）としてまたはHoffmann-La Roche, Nutley, NJからＣｏｐｅｇｕｓ（登録商標）として入手可能である。
【００４４】
「Ｐａｇａｓｙｓ」は、Hoffmann-La Roche, Nutley, NJから入手可能なペグインターフェロンα−２ａであるＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）を意味する。
【００４５】
「Ｒｏｆｅｒｏｎ」は、Hoffmann-La Roche, Nutley, NJから入手可能な組換えインターフェロンα−２ａであるＲｏｆｅｒｏｎ（登録商標）を意味する。
【００４６】
「Ｂｅｒｅｆｏｒ」は、Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, CTから入手可能なインターフェロンα２であるＢｅｒｅｆｏｒ（登録商標）を意味する。
【００４７】
Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ（登録商標）は、Sumitomo, Japanから入手可能なＳｕｍｉｆｅｒｏｎのような天然のαインターフェロンの精製ブレンドである。
【００４８】
Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ（登録商標）は、Glaxo_Wellcome LTd., Great Britainから入手可能なインターフェロンαｎ１である。
【００４９】
Ａｌｆｅｒｏｎ（登録商標）は、Interferon Sciencesにより製造されてPurdue Frederick Co., CTから入手可能な天然のαインターフェロンの混合物である。
【００５０】
本明細書中で使用される「インターフェロン」という用語は、ウイルスの複製および細胞の増殖を阻害しかつ免疫応答をモジュレートする高度の相同性を有する種特異的タンパク質ファミリーのメンバー、たとえば、インターフェロンα、インターフェロンβ、またはインターフェロンγを意味する。Merck Index, entry 5015, Twelfth Edition。
【００５１】
本発明の一実施形態によれば、インターフェロンは、α−インターフェロンである。他の実施形態によれば、本発明に係る治療剤の組合せでは、天然のαインターフェロン２ａが利用される。または、本発明に係る治療剤の組合せでは、天然のαインターフェロン２ｂが利用される。他の実施形態では、本発明に係る治療剤の組合せでは、組換えαインターフェロン２ａまたは２ｂが利用される。さらに他の実施形態では、インターフェロンは、ペグ化αインターフェロン２ａまたは２ｂである。本発明に好適なインターフェロンとしては、以下のものが挙げられる：
（ａ） Ｉｎｔｒｏｎ（インターフェロン−α２Ｂ、Schering Plough）、
（ｂ） Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ、
（ｃ） Ｐｅｇａｓｙｓ、
（ｄ） Ｒｏｆｅｒｏｎ、
（ｅ） Ｂｅｒｏｆｏｒ、
（ｆ） Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ、
（ｇ） Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ、
（ｈ） Amgen, Inc., Newbury Park, CAから入手可能なコンセンサスαインターフェロン、
（ｉ） Ａｌｆｅｒｏｎ、
（ｊ） Ｖｉｒａｆｅｒｏｎ（登録商標）、
（ｋ） Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）。
【００５２】
熟練診療医であればわかることであるが、プロテアーゼ阻害剤は、好ましくは、経口投与されるであろう。インターフェロンは、典型的には、経口投与されない。それにもかかわらず、本発明に係る方法や組合せは、本明細書の記載内容によりなんら特定の製剤やレジームに限定されるものではない。したがって、本発明に係る組合せの各成分は、別々に、一緒に、またはそれらの任意の組合せで投与可能である。
【００５３】
一実施形態では、プロテアーゼ阻害剤およびインターフェロンは、個別製剤として投与される。一実施形態では、任意の追加の薬剤は、プロテアーゼ阻害剤を含む単一製剤の一部分としてまたは個別製剤として投与される。本発明が化合物の組合せを含む場合、各化合物の特定量は、組合せ中の他のそれぞれの化合物の特定量に依存する可能性がある。熟練診療医であればわかることであるが、インターフェロンの用量は、典型的には、ＩＵ単位で測定される（たとえば、約４００万ＩＵ〜約１２００万ＩＵ）。
【００５４】
したがって、本発明に係る化合物と組み合わせて使用しうる薬剤（免疫調節剤として作用するか否かを問わず）としては、インターフェロン−α２Ｂ（Intron A, Schering Plough）、Ｒｅｂａｔｒｏｎ（Schering Plough、インターフェロン−α２Ｂ＋リバビリン）、ペグ化インターフェロンα（Reddy, K.R. et al. "Efficacy and Safety of Pegylated (40-kd) interferon alpha-2a compared with interferon alpha-2a in noncirrhotic patients with chronic hepatitis C" (Hepatology, 33, pp. 433-438 (2001)）、コンセンサスインターフェロン（Kao, J.H., et al., "Efficacy of Consensus Interferon in the Treatement of Chronic Hepatitis" J. Gastroenterol. Hepatol. 15, pp. 1418-1423 (2000)）、インターフェロン−α２Ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ；Roche）、リンパ芽球様細胞インターフェロンすなわち「天然型」インターフェロン、インターフェロンτ（Clayette, P. et al., "IFN-tau, A New Interferon Type I with Antiretroviral activity" Pathol. Biol. (Paris) 47, pp. 553-559 (1999)）、インターロイキン２（Davis, G.L. et al., "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease, 19, pp. 103-112 (1999)）、インターロイキン６（Davis et al. "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease 19, pp. 103-112 (1999)）、インターロイキン１２（Davis, G.L. et al., "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease, 19, pp. 103-112 (1999)）、リバビリン、および１型ヘルパーＴ細胞応答の発生を促進する化合物（Davis et al., "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease, 19, pp. 103-112 (1999)）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。インターフェロンは、直接的な抗ウイルス作用を発揮することによりおよび／または感染に対する免疫応答を改変することによりウイルス感染症を改善しうる。インターフェロンの抗ウイルス作用は、多くの場合、ウイルスの侵入もしくは脱殻、ウイルスＲＮＡの合成、ウイルスタンパク質の翻訳、ならびに／またはウイルスの集合および放出の阻害を介して媒介される。
【００５５】
細胞内におけるインターフェロンの合成を刺激する化合物（Tazulakhova, E.B. et al., "Russian Experience in Screening, analysis, and Clinical Application of Novel Interferon Inducers" J. Interferon Cytokine Res., 21 pp. 65-73）としては、二本鎖ＲＮＡ単独またはトブラマイシンおよびイミキモド（3M Pharmaceuticals; Sauder, D.N. "Immunomodulatory and Pharmacologic Properties of Imiquimod" J. Am. Acad. Dermatol., 43 pp. S6-11 (2000)）との組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
他の非免疫調節性または免疫調節性の化合物、たとえば、限定されるものではないが、WO 02/18369（参照により本明細書に組み入れられるものとする）（たとえば、第２７３頁第９〜２２行および第２７４頁第４行〜第２７６頁第１１行（参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）を参照されたい）に指定されているものを本発明に係る化合物と組み合わせて使用することが可能である。
【００５７】
細胞内におけるインターフェロンの合成を刺激する化合物（Tazulakhova et al., J. Interferon Cytokine Res. 21, 65-73)）としては、二本鎖ＲＮＡ単独またはトブラマイシンおよびイミキモド（3M Pharmaceuticals）（Sauder, J. Am. Arad. Dermatol. 43, S6-11 (2000)）との組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。非免疫調節機序に基づくＨＣＶ抗ウイルス活性を有することが公知であるかまたはそれを有する可能性のある他の化合物としては、リバビリン（ICN Pharmaceuticals）、イノシン５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤（本明細書中に提供されるＶＸ−４９７の式）、アマンタジンおよびリマンタジン（Younossi et al., In Seminars in Liver Disease 19, 95-102 (1999)）、ＬＹ２１７８９６（U.S. Patent 4,835,168）（Colacino, et al., Antimicrobial Agents & Chemotherapy 34, 2156-2163 (1990)）、さらには９−ヒドロキシイミノ−６−メトキシ−１，４ａ−ジメチル−１，２，３，４，４ａ，９，１０，１０ａ−オクタヒドロ−フェナントレン−１−カルボン酸メチルエステル、６−メトキシ−１，４ａ−ジメチル−９−（４−メチル−ピペラジン−１−イルイミノ）−１，２，３，４，４ａ，９，１０，１０ａ−オクタヒドロ−フェナントレン−１−カルボン酸メチルエステル−塩酸塩、１−（２−クロロ−フェニル）−３−（２，２−ビフェニルエチル）−ウレア（U.S. Patent 6,127,422）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。以上の分子の製剤、用量、および投与経路は、以下で引用される参考文献中に教示されているか、またはたとえば、F.G. Hayden, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., Eds., McGraw-Hill, New York (1996), Chapter 50, pp. 1191-1223 およびそこに引用されている参考文献に開示されているように当技術分野で周知である。他の選択肢として、ＨＣＶ抗ウイルス活性を呈する化合物を同定した後、当業者に周知の技術を用いてその化合物の製薬的有効量を決定することが可能である。たとえば、Benet et al., in Goodman & Gilman's The Phannaeological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., Eds., McGraw-Hill, New York (1996), Chapter 1, pp. 3-27 およびそこに引用されている参考文献に注目されたい。したがって、そのような化合物の適切な製剤、用量、範囲、および投与レジメンは、常法で容易に決定可能である。本発明に係る薬剤の組合せは、同時にもしくは逐次的に投与される個別の製薬上許容される製剤として、２種以上の治療剤を含有する製剤として、または単剤製剤および多剤製剤の組合せにより、１種もしくは複数種の細胞にまたはヒト患者に提供することが可能である。投与経路に関係なく、これらの薬剤の組合せは、抗ＨＣＶ有効量の成分で構成される。
【００５８】
本発明に係る方法で使用しうる多数の他の免疫調節剤および免疫刺激剤が、現在、入手可能であり、その例としては、次のものが挙げられる：ＡＡ−２Ｇ；アダマンチルアミドジペプチド；アデノシンデアミナーゼ、Ｅｎｚｏｎ；アジュバント、Alliance；アジュバント、Ribi；アジュバント、Vaxcel；Ａｄｊｕｖａｘ；アゲラスフィン−１１；ＡＩＤＳ療法剤、Chiron；藻類グルカン、SRI；Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ、Anutech；Ａｎｇｉｎｌｙｃ；抗細胞因子、Yeda；Ａｎｔｉｃｏｒｔ；抗ガストリン−１７免疫原、Ａｐ；抗原送達システム、Vac；抗原製剤、ＩＤＢＣ；抗ＧｎＲＨ免疫原、Aphton；Ａｎｔｉｈｅｒｐｉｎ；Ａｒｂｉｄｏｌ；アザロール；Ｂａｙ−ｑ−８９３９；Ｂａｙ−ｒ−１００５；ＢＣＨ−１３９３；Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ；Ｂｉｏｓｔｉｍ；ＢＬ−００１；ＢＬ−００９；Ｂｒｏｎｃｏｓｔａｔ；Ｃａｎｔａｓｔｉｍ；ＣＤＲＩ−８４−２４６；セフォジジム；ケモカイン阻害剤、ＩＣＯＳ；ＣＭＶペプチド、City of Hope；ＣＮ−５８８８；サイトカイン放出剤、Ｓｔ；ＤＨＥＡ、Paradigm；ＤＩＳＣ ＴＡ−ＨＳＶ；Ｊ０７Ｂ；Ｉ０１Ａ；Ｉ０１Ｚ；ジチオカルブナトリウム；ＥＣＡ−１０−１４２；ＥＬ−１；エンドトキシン、Novartis；ＦＣＥ−２０６９６；ＦＣＥ−２４０８９；ＦＣＥ−２４５７８；ＦＬＴ−３リガンド、Ｉｍｍｕｎｅｘ；ＦＲ−９００４８３；ＦＲ−９００４９４；ＦＲ−９０１２３５；ＦＴＳ−Ｚｎ；Ｇタンパク質、Cadus；グルダプシン；グルタウリン；グリコホスホペプチカル；ＧＭ−２；ＧＭ−５３；ＧＭＤＰ；増殖因子ワクチン、ＥｎｔｒｅＭ；Ｈ−ＢＩＧ、NABI；Ｈ−ＣＩＧ、NABI；ＨＡＢ−４３９；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）ワクチン；ヘルペス特異的免疫因子；ＨＩＶ療法剤、United Biomed；ＨｙｐｅｒＧＡＭ＋ＣＦ；ＩｍｍｕＭａｘ；Ｉｍｍｕｎ ＢＣＧ；免疫療法剤、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ；免疫調節剤、Evans；免疫調節剤、Novacell；ｉｍｒｅｇ−１；ｉｍｒｅｇ−２；Ｉｎｄｏｍｕｎｅ；イノシンプラノベクス；インターフェロン、Dong-A（α２）；インターフェロン、Genentech（γ）；インターフェロン、Novartis（α）；インターロイキン−１２、Genetics Ins；インターロイキン−１５、Immunex；インターロイキン−１６、Research Cor；ＩＳＣＡＲ−１；Ｊ００５Ｘ；Ｌ−６４４２５７；リコマラスミン酸；ＬｉｐｏＴｈｅｒ；ＬＫ−４０９、ＬＫ−４１０；ＬＰ−２３０７；ＬＴ（Ｒ１９２６）；ＬＷ−５００２０；ＭＡＦ、Shionogi；ＭＤＰ誘導体、Merck；メトエンケファリン、TNI；メチルフリルブチロラクトン類；ＭＩＭＰ；ミリモスチム；混合細菌ワクチン、Tem；ＭＭ−１；Ｍｏｎｉｌｉａｓｔａｔ；ＭＰＬＡ、Ribi；ＭＳ−７０５；ムラブチド；ａｒａｂｕｔｉｄｅ、Vacsyn；ムラミルジペプチド誘導体；ムラミルペプチド誘導体；ミエロピド；Ｎ−５６３；ＮＡＣＯＳ−６；ＮＨ−７６５；ＮＩＳＶ、Proteus；ＮＰＴ−１６４１６；ＮＴ−００２；ＰＡ−４８５；ＰＥＦＡ−８１４；ペプチド、Ｓｃｉｏｓ；ペプチドグリカン、Pliva；Ｐｅｒｔｈｏｎ，Advanced Plant；ＰＧＭ誘導体、Ｐｌｉｖａ；Pharmaprojects Ｎｏ．１０９９；Ｎｏ．１４２６；Ｎｏ．１５４９；Ｎｏ．１５８５；Ｎｏ．１６０７；Ｎｏ．１７１０；Ｎｏ．１７７９；Ｎｏ．２００２；Ｎｏ．２０６０；Ｎｏ．２７９５；Ｎｏ．３０８８；Ｎｏ．３１１１；Ｎｏ．３３４５；Ｎｏ．３４６７；Ｎｏ．３６６８；Ｎｏ．３９９８；Ｎｏ．３９９９；Ｎｏ．４０８９；Ｎｏ．４１８８；Ｎｏ．４４５１；Ｎｏ．４５００；Ｎｏ．４６８９；Ｎｏ．４８３３；Ｎｏ．４９４；Ｎｏ．５２１７；Ｎｏ．５３０；ピドチモド；ピメラウチド；ピナフィド；ＰＭＤ−５８９；ポドフィロトキシン、Conpharm；ＰＯＬ−５０９；ポリ−ＩＣＬＣ；ポリ−ＩＣＬＣ，Yamasa Shoyu；ポリＡ−ポリＵ；ポリサッカリドＡ；プロテインＡ、Berlux Bioscience；ＰＳ３４Ｗ０；シュードモナス（Pseudomonas）ＭＡｂ、Teijin；Ｐｓｏｍａｇｌｏｂｉｎ；ＰＴＬ−７８４１９；Ｐｙｒｅｘｏｌ；ピリフェロン；Ｒｅｔｒｏｇｅｎ；Ｒｅｔｒｏｐｅｐ；ＲＧ−００３；Ｒｈｉｎｏｓｔａｔ；リファマキシル；ＲＭ−０６；Ｒｏｌｌｉｎ；ロムルチド；ＲＵ−４０５５５；ＲＵ−４１８２１；風疹抗体、ResCo；Ｓ−２７６４９；ＳＢ−７３；ＳＤＺ−２８０−６３６；ＳＤＺ−ＭＲＬ９５３；ＳＫ＆Ｆ−１０７６４７；ＳＬ０４；ＳＬ０５；ＳＭ−４３３３；Ｓｏｌｕｔｅｉｎ；ＳＲＩ−６２−８３４；ＳＲＬ−１７２；ＳＴ−５７０；ＳＴ−７８９；スタファージ溶解物；Ｓｔｉｍｕｌｏｎ；サプレッシン；Ｔ−１５０Ｒ１；Ｔ−ＬＣＥＦ；タビラウチド；テムルチド；Ｔｈｅｒａｄｉｇｍ−ＨＢＶ；Ｔｈｅｒａｄｉｇｍ−ＨＢＶ；Ｔｈｅｒａｄｉｇｍ−ＨＳＶ；ＴＨＦ，Pharm & Upjohn；ＴＨＦ、Yeda；チマルファシン；胸腺ホルモンフラクション；チモカルチン；チモリンホトロピン；チモペンチン；チモペンチン類似体；チモペンチン、Peptech；チモシンフラクション５、α；チモスチムリン；チモトリナン；ＴＭＤ−２３２；ＴＯ−１１５；伝達因子、Viragen；タフトシン、Selavo；ウベニメクス；Ｕｌｓａｓｔａｔ；ＡＮＧＧ−；ＣＤ−４＋；Ｃｏｌｌａｇ＋；ＣＯＬＳＦ＋；ＣＯＭ＋；ＤＡ−Ａ＋；ＧＡＳＴ−；ＧＦ−ＴＨ＋；ＧＰ−１２０−；ＩＦ＋；ＩＦ−Ａ＋；ＩＦＡ−２＋；ＩＦ−Ｂ＋；ＩＦ−Ｇ＋；ＩＦ−Ｇ−１Ｂ＋；ＩＬ−２＋；ＩＬ−１２＋；ＩＬ−１５＋；ＩＭ＋；ＬＨＲＨ−；ＬＩＰＣＯＲ＋Ｌ；ＬＹＭ−Ｂ＋；ＬＹＭ−ＮＫ＋；ＬＹＭ−Ｔ＋；ＯＰＩ＋；ＰＥＰ＋；ＰＨＧ−ＭＡ＋；ＲＮＡ−ＳＹＮ−；ＳＹ−ＣＷ−；ＴＨ−Ａ−Ｉ＋；ＴＨ−５＋；ＴＮＦ＋；ＵＮ。
【００５９】
本発明に有用な代表的なヌクレオシド化合物およびヌクレオチド化合物としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：（＋）−ｃｉｓ−５−フルオロ−１−［２−（ヒドロキシ−メチル）−［１，３−オキサチオラン−５−イル］シトシン；（−）−２’−デオキシ−３’−チオシチジン−５’−三リン酸（３ＴＣ）；（−）−ｃｉｓ−５−フルオロ−１−［２−（ヒドロキシ−メチル）−［１，３−オキサチオラン−５−イル］シトシン（ＦＴＣ）；（−）−２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン［（−）−ＳｄｄＣ］；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードシトシン（ＦＩＡＣ）；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードシトシン三リン酸（ＦＩＡＣＴＰ）；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル（ＦＭＡＵ）；１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド；２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−５−メチル−デオキシシチジン（ＦｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−クロロ−５−メチル−デオキシシチジン（ＣｌｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−５−メチル−デオキシシチジン（ＡｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−５−メチルシチジン（ＦｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−クロロ−５−メチル−シチジン（ＣｌｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−５−メチルシチジン（ＡｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロチミジン（ＦｄｄＴｈｄ）；２’，３’−ジデオキシ−β−Ｌ−５−フルオロシチジン（β−Ｌ−ＦｄｄＣ）；２’，３’−ジデオキシ−β−Ｌ−５−チアシチジン；２’，３’−ジデオキシ−β−Ｌ−５−シチジン（βＬ−ｄｄＣ）；９−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシメチル）グアニン；２’−デオキシ−３’−チア−５−フルオロシトシン；３’−アミノ−５−メチル−デオキシシチジン（ＡｄｄＭｅＣｙｔ）；２−アミノ−１，９−［（２−ヒドロキシメチル−１−（ヒドロキシメチル）エトキシ）メチル］−６Ｈ−プリン−６−オン（ガンシクロビル）；２−［２−（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル−１，３−プロパンジオールジアセテート（ファムシクロビル）；２−アミノ−１，９−ジヒドロ−９−［（２−ヒドロキシ−エトキシ）メチル］６Ｈ−プリン−６−オン（アシクロビル）；９−（４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチルブト−１−イル）グアニン（ペンシクロビル）；９−（４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチルブト−１−イル）−６−デオキシ−グアニンジアセテート（ファムシクロビル）；３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）；３’−クロロ−５−メチル−デオキシシチジン（ＣｌｄｄＭｅＣｙｔ）；９−（２−ホスホニル−メトキシエチル）−２’，６’−ジアミノプリン−２’，３’−ジデオキシリボシド；９−（２−ホスホニルメトキシエチル）アデニン（ＰＭＥＡ）；アシクロビル三リン酸（ＡＣＶＴＰ）；Ｄ−カルボサイクリック−２’−デオキシグアノシン（ＣｄＧ）；ジデオキシ−シチジン；ジデオキシ−シトシン（ｄｄＣ）；ジデオキシ−グアニン（ｄｄＧ）；ジデオキシ−イノシン（ｄｄｌ）；Ｅ−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン三リン酸；フルオロ−アラビノフラノシル−ヨードウラシル；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）；スタブジン；９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−９Ｈ−プリン−６−アミン一水和物（Ａｒａ−Ａ）；９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−９Ｈ−プリン−６−アミン−５’−一リン酸一水和物（Ａｒａ−ＡＭＰ）；２−デオキシ−３’−チア−５−フルオロシチジン；２’，３’−ジデオキシ−グアニン；および２’，３’−ジデオキシ−グアノシン。
【００６０】
本発明に有用であるヌクレオシドおよびヌクレオチドを調製するための合成方法は、Acta Biochim Pol., 43, 25-36 (1996); Swed. Nucleosides Nucleotides 15, 361-378 (1996); Synthesis 12,1465-1479 (1995); Carbohyd. Chem. 27, 242-276 (1995); Chena Nucleosides Nucleotides 3, 421-535 (1994); Ann. Reports in Med. Chena, Academic Press; and Exp. Opin. Invest. Drugs 4, 95-115 (1995)に開示されているように当技術分野で周知である。
【００６１】
以上で引用した参考文献に記載の化学反応は、一般的には、本発明に係る化合物の調製に最も広く適用される形で開示されている。ときとして、それらの反応は、本明細書に開示されている化合物の範囲内に包含されるそれぞれの化合物に、記載されるとおりには適用できない可能性がある。これに該当する化合物は、当業者であれば容易にわかるであろう。そのような場合にはいずれにおいても、当業者に公知の従来型の変更を加えることにより、たとえば、妨害基の適切な保護を行ったり、他の選択肢の従来型の試薬に変更したり、反応条件に慣用的な変更を加えたりすることにより、うまく反応を行うことが可能であるか、または本明細書に開示されている他の反応もしくはそれ以外の従来型の反応を本発明に係る対応する化合物の調製に適用することが可能であろう。いずれの調製方法においても、出発原料はすべて、公知であるかまたは公知の出発原料から容易に調製可能である。一般的にはヌクレオシド類似体がそのままの状態で抗ウイルス剤として利用されるが、細胞膜を横切る輸送を促進するために、ヌクレオチド（ヌクレオシドリン酸）をヌクレオシドに変換しなければならないこともある。細胞に進入しうる化学修飾されたヌクレオチドの例は、Ｓ−１−３−ヒドロキシ−２−ホスホニルメトキシプロピルシトシン（ＨＰＭＰＣ、Gilead Sciences）である。本発明で使用されるヌクレオシド化合物およびヌクレオチド化合物が酸である場合、塩を形成することが可能である。例としては、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属（たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、もしくはマグネシウム）との塩または有機塩基との塩あるいは塩基性第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００６２】
本発明はまた、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ阻害剤を投与することを包含しうる。ＣＹＰ阻害剤は、ＣＹＰにより阻害される化合物の肝臓内濃度の増大および／または血中レベルの増大に有用でありうる。
【００６３】
本発明に係る実施形態がＣＹＰ阻害剤を含む場合、関連するＮＳ３／４Ａプロテアーゼの薬動学的挙動を改善する任意のＣＹＰ阻害剤を本発明に係る方法で使用することが可能である。これらのＣＹＰ阻害剤としては、リトナビル（WO 94/14436）、ケトコナゾール、トロレアンドマイシン、４−メチルピラゾール、シクロスポリン、クロメチアゾール、シメチジン、イトラコナゾール、フルコナゾール、ミコナゾール、フルボキサミン、フルオキセチン、ネファゾドン、セルトラリン、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、フォサムプレナビル、サキナビル、ロピナビル、デラビルジン、エリスロマイシン、ＶＸ−９４４、およびＶＸ−４９７が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましいＣＹＰ阻害剤としては、リトナビル、ケトコナゾール、トロレアンドマイシン、４−メチルピラゾール、シクロスポリン、およびクロメチアゾールが挙げられる。リトナビルの好ましい製剤については、United States Patent 6,037,157 およびそこに引用されている文献、すなわち、United States Patent 5,484,801、United States Application 08/402,690、ならびにInternational Applications WO 95/07696 および WO 95/09614)を参照されたい。
【００６４】
シトクロムＰ５０モノオキシゲナーゼ活性を阻害する化合物の能力を測定する方法は公知である（US 6,037,157 および Yun, et al. Drug Metabolism & Disposition, vol. 21, pp. 403-407 (1993)を参照されたい）。
【００６５】
種々の公開された米国特許出願には、肝炎を治療するためにＶＸ−９５０と組み合わせて使用しうる化合物および方法についてさらなる教示が提供されている。そのような方法および組成物はいずれも、本発明に係る方法および組成物と組み合わせて使用しうると考えられる。簡潔にするために、それらの公報の開示内容の開示は、公開番号を参照することにより参照されるが、なかでもとくに、化合物の開示は、参照により本明細書にとくに組み入れられることに留意すべきである。代表的なそのような公報としては、U.S. Patent Publication No. 20040058982; U.S. Patent Publication No. 20050192212; U.S. Patent Publication No. 20050080005; U.S. Patent Publication No. 20050062522; U.S. Patent Publication No. 20050020503; U.S. Patent Publication No. 20040229818; U.S. Patent Publication No. 20040229817; U.S. Patent Publication No. 20040224900; U.S. Patent Publication No. 20040186125; U.S. Patent Publication No. 20040171626; U.S. Patent Publication No. 20040110747; U.S. Patent Publication No. 20040072788; U.S. Patent Publication No. 20040067901; U.S. Patent Publication No. 20030191067; U.S. Patent Publication No. 20030187018; U.S. Patent Publication No. 20030186895; U.S. Patent Publication No. 20030181363; U.S. Patent Publication No. 20020147160; U.S. Patent Publication No. 20040082574; U.S. Patent Publication No. 20050192212; U.S. Patent Publication No. 20050187192; U.S. Patent Publication No. 20050187165; U.S. Patent Publication No. 20050049220が挙げられる。
【００６６】
本発明に係る組合せ治療方法に有用な免疫調節剤、免疫刺激剤、および他の薬剤は、当技術分野で慣用される量よりも少ない量で投与可能である。たとえば、インターフェロンαは、ＨＣＶ感染症を治療するために、典型的には、毎週３回で約１×１０６単位／人〜毎週３回で約１０×１０６単位／人の量でヒトに投与される（Simon et al., Hepatology 25: 445-448 (1997)）。本発明に係る方法および組成物では、この用量は、毎週３回で約０．１×１０６単位／人〜毎週３回で約７．５×１０６単位／人；より好ましくは毎週３回で約０．５×１０６単位／人〜毎週３回で約５×１０６単位／人；最も好ましくは毎週３回で約１×１０６単位／人〜毎週３回で約３×１０６単位／人の範囲内でありうる。本発明に係るＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤の存在下でＣ型肝炎ウイルスに対する免疫調節剤、免疫刺激剤、または他の抗ＨＣＶ剤の抗ウイルス効率が増大されるので、これらの免疫調節剤／免疫刺激剤は、低減された量で本発明に係る治療方法および組成物に利用可能である。同様に、免疫調節剤および免疫刺激剤の存在下でＣ型肝炎ウイルスに対する本発明に係るＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤の抗ウイルス効率が増大されるので、当該ＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤は、低減された量で本発明に係る方法および組成物に利用可能である。そのような低減された量は、治療を受けている感染患者においてＣ型肝炎ウイルスの力価を慣例に従ってモニタリングすることにより決定可能である。これは、たとえば、スロットブロット技術、ドットブロット技術、もしくはＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて患者の血清中のＨＣＶ ＲＮＡをモニタリングすることにより、またはＨＣＶの表面抗原もしくは他の抗原を測定することにより、実施可能である。本明細書に開示されているＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤と、抗ＨＣＶ活性を有する他の化合物、たとえば、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの抗ウイルス剤と、を利用する組合せ療法時、組み合わせて使用するときのそれぞれの最小有効用量を決定するために、患者に対して同様にモニタリングを行うことが可能である。
【００６７】
本明細書に開示されている組合せ治療方法では、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドの抗ウイルス化合物またはそれらの混合物は、約０．１ｍｇ／人／日〜約５００ｍｇ／人／日の範囲内、好ましくは約１０ｍｇ／人／日〜約３００ｍｇ／人／日、より好ましくは約２５ｍｇ／人／日〜約２００ｍｇ／人／日、さらにより好ましくは約５０ｍｇ／人／日〜約１５０ｍｇ／人／日、最も好ましくは約１ｍｇ／人／日〜約５０ｍｇ／人／日の範囲内の量でヒトに投与することが可能である。
【００６８】
種々の用量の化合物を一回用量でまたは適切に配分された用量で患者に投与することが可能である。後者の場合、投与ユニット組成物は、一日用量を構成するような量またはそのサブ用量を含有しうる。薬剤処方者が望むのであれば、１日に複数回投与することにより、合計一日用量を増大させることも可能である。
【００６９】
ＨＣＶ感染症に罹患している患者を本発明に係る化合物および／または組成物で治療するためのレジメンは、患者の年齢、体重、性別、食事、および病状、感染症の重症度、投与の経路、薬理学的な要件（たとえば、利用される特定の化合物の活性、効力、薬動学的および毒性学的なプロファイル）、ならびに薬剤送達システムを利用するかどうかをはじめとするさまざまな因子に基づいて選択される。本明細書に開示されている薬剤の組合せの投与は、一般的には、ウイルス力価が許容レベルに達して感染症が抑制または根絶されたことが示唆されるまで、数週間〜数ヶ月間または数年間にわたり継続しなければならない。療法の有効性を決定するために、スロットブロット技術、ドットブロット技術、もしくはＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて患者の血清中の肝炎ウイルスＲＮＡを測定することにより、または血清中のＣ型肝炎ウイルス抗原（たとえば、表面抗原）を測定することにより、本明細書に開示されている薬剤の組合せによる治療を受けている患者に対して慣例に従ってモニタリングを行うことが可能である。組合せの各成分が最適量で投与されるように、しかも治療の継続期間を決定することもできるように、これらの方法により得られたデータを継続して解析すれば、治療時、治療レジメンに変更を加えることが可能である。
【００７０】
本発明は、患者においてＨＣＶ感染症を治療または予防するために、抗ＨＣＶ活性を有する以上のタイプかつ類似のタイプの化合物とさまざまに組み合わせて、本明細書に開示されているＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤を使用することを包含する。たとえば、抗ＨＣＶ活性を有する１種以上のインターフェロンもしくはインターフェロン誘導体、抗ＨＣＶ活性を有する１種以上の非インターフェロン化合物、または抗ＨＣＶ活性を有する１種以上のインターフェロンもしくはインターフェロン誘導体および抗ＨＣＶ活性を有する１種以上の非インターフェロン化合物と組み合わせて、１種以上のＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤を使用することが可能である。ヒト患者においてＨＣＶ感染症を治療または予防するために組み合わせて使用する場合、このたび開示されたＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤および抗ＨＣＶ活性を有する以上の化合物はいずれも、製薬的有効量または抗ＨＣＶ有効量で存在しうる。以上に記載した組合せで使用した場合、相加効果または相乗効果に基づいて、準臨床的な製薬的有効量または抗ＨＣＶ有効量でそれぞれを存在させることも可能である。すなわち、単独で使用した場合、製薬的有効量で使用したときのそのようなＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤および抗ＨＣＶ活性を有する化合物と比較して、ＨＣＶビリオンの蓄積の完全阻害もしくは減少および／または患者におけるＨＣＶの感染もしくは病理発生に関連する病状もしくは症状の軽減もしくは改善に関して、低減された製薬的有効性を提供する量で、それぞれを存在させることも可能である。それに加えて、本発明は、ＨＣＶ感染症を治療または予防するために、以上に記載したように、ＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤と抗ＨＣＶ活性を有する化合物とを組み合わせて使用することを包含する。この場合、これらの阻害剤または化合物の１種以上は、製薬的有効量で存在し、他のものは、相加効果または相乗効果に基づいて準臨床的な製薬的有効量または抗ＨＣＶ有効量で存在する。本明細書中で使用する場合、「相加効果」という用語は、各薬剤を単独で与えたときの効果の合計に等しい２種（もしくはそれ以上）の医薬活性剤の組合せ効果を記述する。相乗効果とは、２種（もしくはそれ以上）の医薬活性剤の組合せ効果が各薬剤を単独で与えたときの効果の合計よりも大きい効果のことである。
【００７１】
患者の病状が改善された後、必要であれば、本発明に係る化合物、組成物、または組合せを維持用量で投与することが可能である。その結果、治療を中止すべき所望のレベルにまで症状が軽減されたときに、症状に応じて、投与用量もしくは投与頻度またはその両方を改善された病状が維持されるレベルにまで低減させることが可能である。しかしながら、患者は、疾患症状が再発した際に長期間にわたる間欠的治療を必要とすることもある。
【００７２】
また、当然のことながら、特定の患者に対する特定の用量および治療レジメンは、利用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与時期、排泄速度、薬剤の組合せ、および治療医の判断、さらには治療される特定の疾患の重症度をはじめとするさまざまな因子に依存するであろう。活性成分の量もまた、特定の記載化合物ならびに組成物中の追加の抗ウイルス剤の存在または不在および性質に依存するであろう。
【００７３】
他の実施形態によれば、本発明は、本発明に係る製薬上許容される組成物を患者に投与することにより、ウイルスの生活環に必要であるウイルスにコードされたセリンプロテアーゼにより特徴付けられるウイルスに感染した患者を治療する方法を提供する。好ましくは、本発明に係る方法は、ＨＣＶ感染症に罹患している患者を治療するために使用される。そのような治療は、ウイルス感染症を完全に根絶しうるか、またはその重症度を低減させうる。より好ましくは、患者はヒトである。
【００７４】
代替実施形態では、本発明に係る方法は、抗ウイルス剤、好ましくは抗ＨＣＶ剤を前記患者に投与する工程を追加的に含む。そのような抗ウイルス剤としては、免疫調節剤、たとえば、α−、β−、およびγ−インターフェロン、ペグ化誘導体化インターフェロン−α化合物、ならびにチモシン；他の抗ウイルス剤、たとえば、リバビリンおよびアマンタジン；Ｃ型肝炎プロテアーゼの他の阻害剤（ＮＳ２−ＮＳ３阻害剤およびＮＳ３−ＮＳ４Ａ阻害剤）；ＨＣＶの生活環中の他の標的の阻害剤、たとえば、ヘリカーゼ阻害剤およびポリメラーゼ阻害剤；リボソーム内部進入の阻害剤；広域ウイルス阻害剤、たとえば、ＩＭＰＤＨ阻害剤（United States Patent 5,807,876に開示されているＩＭＰＤＨ阻害剤、ミコフェノール酸およびその誘導体）；または以上のいずれかの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
そのような追加の薬剤は、本発明に係る化合物および追加の抗ウイルス剤の両方を含む単一製剤の一部分として前記患者に投与可能である。他の選択肢として、追加の薬剤は、本発明に係る化合物とは別に複数製剤の一部分として投与可能である。この場合、該追加の薬剤は、本発明に係る化合物を含む組成物の前に、それと一緒に、またはその後で、投与可能である。
【００７６】
さらに他の実施形態では、本発明は、患者への投与を目的とした生体物質を前処理する方法を提供する。この方法は、該生体物質を、本発明に係る化合物を含む製薬上許容される組成物に、接触させる工程を含む。そのような生体物質としては、血液およびその成分、たとえば、血漿、血小板、血球の亜集団など；臓器、たとえば、腎臓、肝臓、心臓、肺など；精子および卵子；骨髄およびその成分；ならびに患者に注入される他の流体、たとえば、生理食塩水、デキストロースなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
他の実施形態によれば、本発明は、生活環に必要であるウイルスにコードされたセリンプロテアーゼにより特徴付けられるウイルスに接触する可能性のある材料を処理する方法を提供する。この方法は、該材料を本発明に係る化合物に接触させる工程を含む。そのような材料としては、外科用の器具および衣類（たとえば、衣服、手袋、エプロン、ガウン、マスク、眼鏡、履物など）；実験用の器具および衣類（たとえば、衣服、手袋、エプロン、ガウン、マスク、眼鏡、履物など）；血液採取用の器具および材料；ならびに侵襲的デバイス、たとえば、シャント、ステントなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
他の実施形態では、本発明に係る化合物は、ウイルスにコードされたセリンプロテアーゼの単離を助ける実験ツールとして使用可能である。この方法は、固体担体に結合された本発明に係る化合物を提供する工程と、該固体担体へのプロテアーゼの結合を引き起こす条件下で、該固体担体を、ウイルスのセリンプロテアーゼを含有するサンプルに、接触させる工程と、該固体担体から該セリンプロテアーゼを溶出させる工程と、を含む。好ましくは、この方法により単離されるウイルスのセリンプロテアーゼは、ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼである。
【００７９】
本発明がより十分に理解されるように、以下の調製例および試験例について説明する。これらの実施例は、例示を目的としたものにすぎず、なんら本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、好ましい実施形態および技術を提示したものであり、限定しようとするものではない。当業者であれば、本開示に照らして、開示されている特定の材料および方法に多くの変更を加えうることかつそれにより本発明の精神および範囲から逸脱することなく同一もしくは類似の結果が得られることはわかるであろう。
【００８１】
実施例１
ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのＨＰＬＣペプチド切断アッセイ
このアッセイは、Landro et al. [Landro J.A. et al., Biochemistry, 36, pp. 9340-9348 (1997)]に報告されたアッセイに変更を加えたものである。遺伝子型１ａ ＨＣＶのＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づく単一のペプチド基質（ＮＳ５ＡＢ）をすべてのプロテアーゼについて使用した。０．２Ｍ ＤＴＴを含有するＤＭＳＯを用いて基質ストック溶液（２５ｍＭ）を調製し、−２０℃で貯蔵した。各遺伝子型に適合した合成ペプチド補因子（ＫＫ４Ａ）をＮＳ４Ａの中心コア領域の代わりに使用した。ペプチド配列は、以下に示される。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ、および２５μＭ ＫＫ４Ａを含有する緩衝液中の２５ｎＭ〜５０ｎＭ ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート方式で加水分解反応を行った。最終ＤＭＳＯ濃度は、２％ ｖ／ｖ以下であった。２．５％の最終ＴＦＡ濃度になるように１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加することにより、反応を停止させた。自動注入ならびに２１０ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるダイオードアレイ検出の機能を備えたＡｇｉｌｅｎｔシリーズ１１００装置を使用し、サーモスタット付きカラムチャンバーを用いて４０℃に加熱された逆相マイクロボアＨＰＬＣカラム（Phenomenex Jupiter 5μ C18 300A column, 150×2.0 mm）で基質と産物とを分離することにより、酵素活性を評価した。Ｈ２Ｏ／０．１％ ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＣＨ３ＣＮ／０．１％ ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を使用し、流量は、０．２ｍＬ／ｍｉｎであった。リニアグラジエントを使用した。１２分間で溶媒Ｂを５％から６０％に、次に、１分間で溶媒Ｂを６０％から１００％に変化させ、３分間の定組成条件の後、１分間で溶媒Ｂを５％に変化させ、そして定組成条件で５％溶媒Ｂを用いて１０分間のポストタイムで最終処理を行った。２１０ｎｍで収集されたデータを用いてＳＭＳＹ産物ピーク（典型的には１０分間の保持時間を有する）を分析した。
【表２】
【００８２】
速度論的パラメーターＫｍおよびＶｍａｘを決定するために、ＮＳ５ＡＢ基質を３μＭ〜２００μＭの間で変化させた。産物ピーク面積と反応時間との比から、酵素触媒加水分解の速度を得た。これらの速度ｖｓ基質濃度データ点を非線形回帰によりＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式にあてはめた。装置校正標準として公称プロテアーゼ濃度および完全切断基質ペプチドを用いてＶｍａｘからｋｃａｔの値を決定した。
【表３】
【００８３】
実施例２
ＨＰＬＣペプチド切断アッセイによる効力の決定
見掛けのＫｉ値を評価するために、試験化合物および基質を除くすべての成分を室温で５分間プレインキュベートした。次に、ＤＭＳＯに溶解された試験化合物を混合物に添加し、室温で１５分間インキュベートした。Ｋｍに見合う濃度（７０μＭ〜１１μＭ）でＮＳ５ＡＢペプチドを添加することにより切断反応を開始し、３０℃で１５分間インキュベートした。阻害を調べるために、７〜８つの化合物濃度を用いて酵素活性の力価を測定した。活性ｖｓ阻害剤濃度のデータ点を非線形回帰により競合的強結合酵素阻害を記述するＭｏｒｒｉｓｏｎ式にあてはめた［Sculley, M.J. and Morrison, J.F., Biochim. Biophys. Acta. 874, pp. 44-53 (1986)］。
【表４】
【００８４】
実施例３
ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの蛍光ペプチドアッセイ
Taliani et al. [Taliani M. et al., Anal. Biochem., 240, pp. 60-67 (1997)]に報告されたアッセイに変更を加えて、酵素活性を決定した。基質としてＲＥＴ−Ｓ１蛍光ペプチド（AnaSpec, San Jose, CA）を用いて、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ、および２５μＭ ＫＫ４Ａを含有する緩衝液（緩衝液Ａ）中で、すべての反応を行った。最終ＤＭＳＯ濃度を１〜２％（ｖ／ｖ）に保持した。とくに記載がないかぎり、それぞれ３５５ｎｍおよび４９５ｎｍの励起フィルターおよび発光フィルターを用いて、サーモスタットで３０℃に制御された蛍光マイクロタイタープレートリーダーにより、反応を連続的にモニタリングした。
【００８５】
速度論的パラメーターＫｍおよびＶｍａｘを決定するために、ＲＥＴ−Ｓ１基質を緩衝液Ａ中で６μＭ〜２００μＭの間で変化させ、５ｎＭ〜１０ｎＭ ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼと５〜１０分間反応させた。２５μＬの１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加することにより、反応を停止させた。自動注入ならびに３５０ｎｍ励起および４９０ｎｍ検出による蛍光検出の機能を備えたＡｇｉｌｅｎｔシリーズ１１００装置を使用し、サーモスタット付きカラムチャンバーを用いて４０℃に加熱された逆相マイクロボアＨＰＬＣカラム（Phenomenex Jupiter 5μ C18 300A column, 150×2.0 mm）で基質と産物とを分離することにより、酵素活性を評価した。Ｈ２Ｏ／０．１％ ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＣＨ３ＣＮ／０．１％ ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を使用し、流量は、０．２ｍＬ／ｍｉｎであった。リニアグラジエントを使用した。３０分間で溶媒Ｂを５％から１００％に、次に、２分間で溶媒Ｂを１００％から５％に変化させ、そして定組成条件で５％溶媒Ｂを用いて１０分間のポストタイムで最終処理を行った。活性ｖｓ基質濃度データ点を非線形回帰によりＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式にあてはめた。装置校正標準として公称プロテアーゼ濃度および完全切断基質ペプチドを用いてＶｍａｘからｋｃａｔの値を決定した。
【表５】
【００８６】
実施例４
長時間インキュベーションによる効力の決定
ＶＸ−９５０と共に長時間プレインキュベーションを行った後の残存酵素活性をアッセイすることにより、ＶＸ−９５０およびＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼに対する阻害定数を決定した。緩衝液Ａ中のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのストック溶液を室温で１０分間プレインキュベートし、次に、３０℃に変化させた。１００％ ＤＭＳＯに溶解されたＶＸ−９５０のアリコートを予備加熱された酵素ストック液に時間ゼロで添加した。４μＭ ＲＥＴ−Ｓ１および５ｎＭ〜２０ｎＭ ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの最終濃度になるように緩衝液Ａ中のＲＥＴ−Ｓ１の５μＬアリコートを酵素−阻害剤混合物の９５μＬアリコートに添加することにより、５〜３６０分の範囲内の時間点で反応を開始した。蛍光の変化を１５０秒のウィンドウでモニタリングし、蛍光ｖｓ時間のデータ点の線形回帰に基づいて反応速度を決定した。ニートなＤＭＳＯを含有する反応から対照速度を決定した。阻害を調べるために、７〜８つの化合物濃度を用いて酵素活性の力価を測定した。標準的なロジスティック２パラメーターあてはめを用いて、活性ｖｓ阻害剤濃度のデータからＩＣ５０値を計算した。これらのアッセイ条件下では、長時間インキュベーション後におけるＶＸ−９５０によるＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの阻害に対するＩＣ５０は、強結合酵素／阻害剤複合体に対する阻害定数と等価である。
【表６】
【００８７】
実施例５
プログレス曲線解析に基づく阻害の特徴付け
Narjes et al. [Narjes F. et al., Biochemistry 39, pp. 1849-1861 (2000)]に報告されたプログレス曲線の測定方法に変更を加えて、緩徐な結合阻害の初速度を決定した。緩衝液Ａ中のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのストック溶液を室温で１０分間プレインキュベートし、次に、１０分間で３０℃に変化させた。１００％ ＤＭＳＯに溶解された対象化合物を緩衝液Ａ中のＲＥＴ−Ｓ１の溶液に添加した。次に、化合物および基質を３０℃で１０分間インキュベートした。６〜１２μＭ ＲＥＴ−Ｓ１および０．５ｎＭ〜４ｎＭ ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの最終濃度になるように予備加熱された酵素ストック液のアリコートを化合物−基質混合物に添加することにより、反応を開始した。蛍光の変化を４時間までモニタリングし、蛍光ｖｓ時間のデータ点を非線形回帰により式１にあてはめた［Morrison, J.F. and Walsh, C.T., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 61, pp. 201-301 (1988)］。ニートなＤＭＳＯを含有する反応から対照速度を決定した。
式１： Ｆ（ｔ）＝Ｖｓ×ｔ＋（Ｖｉ−Ｖｓ）×（１−ｅｘｐ（−ｋｏｂｓ×ｔ））／ｋｏｂｓ＋Ｃ
【００８８】
ｋｏｂｓ値ｖｓＶＸ−９５０濃度の再プロットを行って、式２へのあてはめにより強結合酵素／阻害剤複合体の形成の二次速度定数（ｋｏｎ）および強結合酵素／阻害剤複合体の解離の一次速度定数（ｋｏｆｆ）の両方の決定を可能にした。この種に対する阻害定数をｋｏｆｆ／ｋｏｎの比から求めた［Morrison, J.F. and Walsh, C.T., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 61, pp. 201-301 (1988)］。
式２： ｋｏｂｓ＝ｋｏｆｆ＋（ｋｏｎ×［Ｉ］）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）
【００８９】
【表７】
【００９０】
以上で得られたプログレス曲線を用いて長い反応時間で残存酵素活性を分析することにより、ＶＸ−９５０によるＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの阻害に対する阻害定数を決定した。反応の定常状態時における蛍光ｖｓ時間のデータ点の線形回帰に基づいて反応速度を決定した。活性ｖｓ阻害剤濃度のデータ点を非線形回帰により競合的強結合酵素阻害を記述するＭｏｒｒｉｓｏｎ式にあてはめた［Sculley, M.J. and Morrison, J.F., Biochim. Biophys. Acta. 874, pp. 44-53 (1986)］。
【表８】
【００９１】
実施例６
酵素−阻害剤複合体からの解離速度の測定
緩衝液Ａ中のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのストック溶液を室温で１０分間プレインキュベートし、次に、１０分間で３０℃に変化させた。３３０ｎＭ〜１６００ｎＭ酵素および１．０μＭ〜６．４μＭ阻害剤を生成するように、１００％ ＤＭＳＯに溶解された対象化合物を予備加熱された酵素ストック液に添加した。酵素−阻害剤複合体が平衡に達するように、この溶液を３０℃で長時間インキュベートした。３０℃で酵素−阻害剤混合物を緩衝液Ａ中のＲＥＴ−Ｓ１の溶液中に希釈することにより、反応を開始した。最終濃度は、０．５ｎＭ〜８ｎＭ ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ、１２μＭ ＲＥＴ−Ｓ１、および２ｎＭ〜３２ｎＭ阻害剤であった。蛍光の変化を４時間までモニタリングし、蛍光ｖｓ時間のデータ点を非線形回帰により式２にあてはめた。ニートなＤＭＳＯを含有する反応から対照速度を決定した。式３を用いて強結合ＶＸ−９５０／ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ複合体の半減期を決定した［Segel, I.H. Biochemical Calculations, 2nd ed., Wiley & Sons: New York, p. 228 (1976)］。
式３： ｔ１／２＝０．６９３／ｋｏｆｆ
【００９２】
【表９】
【００９３】
実施例７
ＨＣＶレプリコン細胞アッセイのプロトコル
Lohmannn et al., Science, 285, pp. 110-113 (1999)の方法に従って細胞を取得した。適切な補助剤と共に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ（培地Ａ）中に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レプリコンを含有する細胞を保持した。
【００９４】
１日目、レプリコン細胞単層をトリプシン：ＥＤＴＡ混合物で処理し、取り出し、次に、１００，０００細胞／ｍｌの最終濃度になるように培地Ａをその中に希釈導入した。１００μｌ中の１０，０００個の細胞を９６ウェル組織培養プレートの各ウェル中にプレーティングし、３７℃の組織培養インキュベーター中で一晩培養した。
【００９５】
２日目、適切な補助剤と共に２％ ＦＢＳ、０．５％ ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ（培地Ｂ）中に化合物（１００％ ＤＭＳＯ中）を逐次希釈導入した。希釈シリーズ全体にわたりＤＭＳＯの最終濃度を０．５％に保持した。
【００９６】
レプリコン細胞単層上の培地を除去し、次に、種々の濃度の化合物を含有する培地Ｂを添加した。化合物をまったく含まない培地Ｂを化合物なしの対照として他のウェルに添加した。
【００９７】
３７℃の組織培養インキュベーター中で培地Ｂ中の化合物または０．５％ ＤＭＳＯと共に細胞を４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーションの終了時、培地を除去し、レプリコン細胞単層をＰＢＳで１回洗浄し、そしてＲＮＡ抽出前、−８０℃で貯蔵した。
【００９８】
処理されたレプリコン細胞単層を有する培養プレートを解凍し、一定量の他のＲＮＡウイルス（たとえば、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ））を各ウェル中の細胞に添加した。ＲＮＡの分解を回避するために、ただちにＲＮＡ抽出試薬（たとえば、ＲＮｅａｓｙキットの試薬）を細胞に添加した。抽出効率および粘稠度を改良するように変更を加え、製造業者の使用説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。最後に、ＨＣＶレプリコンＲＮＡを含む全細胞ＲＮＡを溶出させ、さらなる処理まで−８０℃で貯蔵した。
【００９９】
２セットの特異的なプライマーおよびプローブを用いてＴａｑｍａｎリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量アッセイを構成した。一方はＨＣＶ用であり、他方はＢＶＤＶ用であった。同一のＰＣＲウェル中のＨＣＶ ＲＮＡおよびＢＶＤＶ ＲＮＡの両方を定量するために、処理されたＨＣＶレプリコン細胞からの全ＲＮＡ抽出物をＰＣＲ反応系に添加した。各ウェル中のＢＶＤＶ ＲＮＡのレベルに基づいて実験の失敗をマークして排除した。同一のＰＣＲプレート中で実験した標準曲線に基づいて、各ウェル中のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを計算した。０％の阻害としてＤＭＳＯ対照すなわち化合物なしの対照を用いて、化合物処理に基づく阻害のパーセントすなわちＨＣＶ ＲＮＡレベルの減少のパーセントを計算した。任意の所与の化合物の力価測定曲線からＩＣ５０（ＨＣＶ ＲＮＡレベルの５０％阻害が観測される濃度）を計算した。
【０１００】
このレプリコンアッセイでＶＸ−９５０が３５４ｎＭのＩＣ５０を有することが判明した。
【０１０１】
実施例８
遺伝子型２ａ、２ｂ、３ａ、または３ｂに対するＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインおよびＮＳ４Ａ補因子ペプチドのコンセンサス配列
多くのＨＣＶ単離株のＮＳ３セリンプロテアーゼドメインおよびＮＳ４Ａ補因子ペプチドをカバーするｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋから入手し、ＤＮＡｓｔａｒソフトウェアを用いてアライメントした。これらの遺伝子型２単離株には、遺伝子型２ａに属する８種（ＧｅｎＢａｎｋ寄託コードＰ２６６６０、ＡＦ１７７０３６、ＡＢ０３１６６３、Ｄ５０４０９、ＡＦ１６９００２、ＡＦ１６９００３、ＡＦ２３８４８１、ＡＦ２３８４８２）および遺伝子型２ｂに属する３種（ＧｅｎＢａｎｋ寄託コードＰ２６６６１、ＡＦ２３８４８６、ＡＢ０３０９０７）が包含される。これらの１１種の遺伝子型２ ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのアミノ酸配列のアライメントを図１に示す。遺伝子型２ａ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのコンセンサスアミノ酸配列およびコンセンサスヌクレオチド配列を図２に示す。これらの遺伝子型３単離株には、遺伝子型３ａに属する４種（ＧｅｎＢａｎｋ寄託コードＡＦ０４６８６６、Ｄ１７７６３、Ｄ２８９１７、Ｘ７６９１８）および遺伝子型３ｂに属する２種（ＧｅｎＢａｎｋ寄託コードＤ４９３７４およびＤ６３８２１）が包含される。これらの６種の遺伝子型３ ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのアミノ酸配列のアライメントを図３に示す。遺伝子型３ａ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのコンセンサスアミノ酸配列およびコンセンサスヌクレオチド配列を図４に示す。最後に、それぞれの遺伝子型または遺伝子サブタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、および３ｂのコンセンサスアミノ酸配列のアライメントを図５に示す。
【０１０２】
プラスミドの構築。遺伝子型２ａまたは２ｂのいくつかの単離株の残基Ａｌａ１〜Ｓｅｒ１８１をコードするＤＮＡ断片のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋから入手し、遺伝子型２ａまたは２ｂ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインに対するコンセンサス配列を同定するためにアラインメントした。遺伝子型３ａまたは３ｂ ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのコンセンサス配列を同定するために、同じことを遺伝子型３ａまたは３ｂに適用した。E. coli最適コドン使用頻度を用いてオリゴヌクレオチド合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によりこれらのコンセンサス配列のｃＤＮＡ断片を形成し、次に、ＰＣＲにより増幅し、そしてＣ末端ヘキサヒスチジンタグを有するＨＣＶタンパク質をE. coliにより発現させるためにｐＢＥＶ１１中にサブクローニングした。可溶性変異体を得るために、ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼのアミノ酸番号１３のＬｅｕをＬｙｓで置き換えた。すべての構築物を配列決定により確認した。
【０１０３】
ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインの発現および精製。遺伝子型２ａまたは３ａのＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインに対する各発現構築物をＢＬ２１／ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ E. coli細胞（Stratagene）中にトランスフォームした。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが追加されたＢＨＩ培地（Difco Laboratories）中、３７℃において、トランスフォームされたばかりの細胞を６００ｎｍで０．７５の光学濃度になるまで増殖させた。２４℃で４時間にわたり１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導を行った。細胞ペーストを遠心分離により採取し、タンパク質精製前、−８０℃でフラッシュ凍結した。すべての精製工程を４℃で行った。ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのそれぞれについて、１００ｇの細胞ペーストを１．５Ｌの緩衝液Ａ［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール］に溶解させて３０分間攪拌した。Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Microfluidics, Newton, MA）を用いて溶解物をホモジナイズし、続いて、５４，０００×ｇで超遠心分離を４５分間行った。５ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａであらかじめ平衡化された２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂と共にイミダゾールを５ｍＭの最終濃度になるように上清に添加した。混合物を３時間揺動させ、２０カラム体積の緩衝液Ａ＋５ｍＭのイミダゾールで洗浄した。３００ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａ中にＨＣＶ ＮＳ３タンパク質を溶出させた。溶出液を濃縮し、緩衝液Ａであらかじめ平衡化されたＨｉ−Ｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム上に充填した。精製ＨＣＶタンパク質の適切な画分をプールし、−８０℃で貯蔵した。
【０１０４】
実施例９
ＨＣＶ遺伝子型のコンセンサスドメインを決定した後、ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインタンパク質をE. coliにより発現させ、そして所定の均一度になるように精製した。ＫＫ−４Ａペプチド（Landro et al., 1997 Biochemistry）およびＦＲＥＴ基質（Taliani et al., 1997 Anal. Biochem.）を用いてＶＸ−９５０に対する酵素アッセイを行った。定常状態法を用いてＶＸ−９５０のＫｉ＊を決定し、２つの他の方法（長時間インキュベーション法およびプログレス曲線法）により確認した。
【０１０５】
コンセンサスドメインが単離されたので、ＨＣＶ−２と比較してＨＣＶ−１のドメインへのＶＸ−９５０の結合特性を決定することが可能になった。本発明者らは、ＶＸ−９５０が当業者により報告された他の阻害剤よりも数倍良好な活性を有することを明らかにした。本発明者らにより得られたデータから、ＮＳ３−４ＡセリンプロテアーゼへのＶＸ−９５０の結合は、可逆的、共有結合的、競合的、強固、かつ緩徐な結合であることが明らかである。したがって、この薬剤は、現在開発段階にある他の薬剤とは異なる阻害作用機序を有する。たとえば、他の薬剤は、プロテアーゼに結合することが観測されてはいるが、その結合は、可逆的、非共有結合的、競合的、かつ強固なものであった。より重要な点として、遺伝子型１の結合部位には残基７８〜８０にＶａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎおよびアミノ酸５６が存在し、一方、遺伝子型２ではＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙが存在することが確認された。それらの残基のアミノ酸にこうした差異があることは、ＨＣＶ遺伝子型２のセリンプロテアーゼ中に存在するループの配座安定性がＨＣＶ遺伝子型１のループの安定性と比較して低いことを意味する。配座安定性が低下するといくつかの阻害剤の結合は減少するが、こうして配座安定性が低下してもＶＸ−９５０の結合はほとんど影響を受けないと予想されるので、この阻害剤は、遺伝子型２ ＨＣＶのセリンプロテアーゼに対するより強力な阻害剤になる。遺伝子型１ ＨＣＶ中に存在するＡｓｐ１６８がＧｌｎで置き換えられた遺伝子型３ ＨＣＶをに関しても、類似の結果が観測された。
【０１０６】
本発明のいくつかの実施形態について説明してきたが、本発明に係る化合物および方法を利用する他の実施形態を行うようにこれらの基本的実施例に変更を加えることが可能である。したがって、本発明の範囲は、以上に例として示された特定の実施形態により規定されるのではなく、添付の特許請求の範囲により規定されなければならないことはわかるであろう。引用文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、セリンプロテアーゼの活性、とくに、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼの活性を阻害する化合物に関する。したがって、該化合物は、Ｃ型肝炎ウイルスの生活環を阻害することにより作用し、抗ウイルス剤としても有用である。本発明はさらに、ｅｘ ｖｉｖｏで使用するためのまたはＨＣＶ感染症に罹患している患者に投与するための組成物に関する。本発明はまた、本発明に係る組成物を投与することにより患者においてＨＣＶ感染症を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）の感染は、切実なヒト医学上の問題である。ＨＣＶは、非Ａ型非Ｂ型肝炎のほとんどの症例の原因因子として認識され、全世界で３％の推定ヒト血清有病率を有する［A. Alberti et al., ”Natural History of Hepatitis C,” J. Hepatology, 31., (Suppl. 1), pp. 17-24 (1999)］。米国だけでも、およそ４００万人が感染している可能性がある［M.J. Alter et al., ”The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States, Gastroenterol. Clin. North Am., 23, pp. 437-455 (1994); M. J. Alter ”Hepatitis C Virus Infection in the United States,” J. Hepatology, 31., (Suppl. 1), pp. 88-91 (1999)］。
【０００３】
ＨＣＶに初めて暴露されたとき、感染者のわずか約２０％が急性臨床的肝炎を発症するにすぎず、他の者は、感染を自発的に消散させるように思われる。しかしながら、症例のほぼ７０％において、このウイルスは、何十年にもわたり持続する慢性感染症を定着させる［S. Iwarson, ”The Natural Course of Chronic Hepatitis,” FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 201-204 (1994); D. Lavanchy, ”Global Surveillance and Control of Hepatitis C,” J. Viral Hepatitis, 6, pp. 35-47 (1999)］。この結果、通常、肝炎の再発および進行性悪化が起こり、それにより、多くの場合、肝硬変や肝細胞癌のようなより重篤な疾患状態を生じる［M.C. Kew, ”Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma”, FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 211-220 (1994); I. Saito et al., ”Hepatitis C Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carcinoma,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 6547-6549 (1990)］。残念ながら、慢性ＨＣＶ症の衰弱性進行に対する広く有効な治療法は存在しない。
【０００４】
ＨＣＶゲノムは、３０１０〜３０３３個のアミノ酸よりなるポリタンパク質をコードする［Q.L. Choo, et al., ”Genetic Organization and Diversity of the Hepatitis C Virus.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 2451-2455 (1991); N. Kato et al., ”Molecular Cloning of the Human Hepatitis C Virus Genome From Japanese Patients with Non-A, Non-B Hepatitis," Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 9524-9528 (1990); A. Takamizawa et al., "Structure and Organization of the Hepatitis C Virus Genome Isolated From Human Carriers," J. Virol., 65, pp. 1105-1113 (1991)］。ＨＣＶの非構造（ＮＳ）タンパク質は、ウイルスの複製に不可欠な触媒機構を提供するものと推定される。ＮＳタンパク質は、ポリタンパク質のタンパク質分解切断により誘導される［R. Bartenschlager et al., ”Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions,” J. Virol., 67, pp. 3835-3844 (1993); A. Grakoui et al., "Characterization of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase: Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites," J. Virol., 67, pp. 2832-2843 (1993); A. Grakoui et
al., "Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products," J. Virol., 67, pp. 1385-1395 (1993); L. Tomei et al., "NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein", J. Virol., 67, pp. 4017-4026 (1993)］。
【０００５】
ＨＣＶのＮＳタンパク質３（ＮＳ３）は、ウイルス酵素の大多数のプロセシングを助けるセリンプロテアーゼ活性を含有するので、ウイルスの複製および感染力に不可欠であると考えられる。チンパンジーにおいて触媒性トライアドの置換が感染力の消失を引き起こしたので、ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼは、ウイルスの複製に不可欠である［A.A. Kolykhalov et al., ”Hepatitis C virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3’ nontranslated region are essential for virus replication in vivo”, J. Virol., 74: 2046-2051］。ＮＳ３の最初の１８１個のアミノ酸（ウイルスポリタンパク質の残基１０２７〜１２０７）は、ＨＣＶポリタンパク質の４つの下流部位すべてのプロセシングを行うＮＳ３のセリンプロテアーゼドメインを含有することが明らかにされている［C. Lin et al., ”Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase: Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics”, J. Virol., 68, pp. 8147-8157 (1994)］。
【０００６】
ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼおよびその関連補因子ＮＳ４Ａは、ウイルスの非構造タンパク質領域から個々の非構造タンパク質（ウイルスの酵素すべてを包含する）へのプロセシングを助ける。このプロセシングは、ヒト免疫不全ウイルスのアスパルチルプロテアーゼ（ウイルスタンパク質のプロセシングにも関与する）により行われるものと類似しているように思われる。ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤（ウイルスタンパク質のプロセシングを阻害する）が、ヒトにおいて強力な抗ウイルス剤であることから、ウイルスの生活環のこの段階を中断すれば、治療上有効な薬剤が得られることが示唆される。したがって、それは、薬剤探索の魅力的な標的である。
【０００７】
ＨＣＶ プロテアーゼの阻害剤として可能性のあるものが先行技術でいくつか報告されている［PCT publication Nos. WO 02/18369, WO 02/08244, WO 00/09558, WO 00/09543, WO 99/64442, WO 99/07733, WO 99/07734, WO 99/50230, WO 98/46630, WO 98/17679 and WO 97/43310, United States Patent 5,990,276, M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8, pp. 1713-18 (1998); W. Han et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, 711-13 (2000); R. Dunsdon et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 1571-79 (2000); M. Llinas-Brunet et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2267-70 (2000); and S. LaPlante et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 10, pp. 2271-74 (2000)］。しかしながら、これらの化合物が許容しうる薬剤として適切なプロファイルを有しているかどうかは、わかっていない。さらに、これらの阻害剤は、全部ではないにしてもほとんどが、標的として遺伝子型１（１ａまたは１ｂ）のＮＳ３−４Ａセリンプロテアーゼを用いて見いだされたものであった。しかしながら、ＨＣＶにはさまざまな遺伝子型が存在し、各遺伝子型内にさまざまなサブタイプが存在する。たとえば、現在、ＨＣＶには１１種（１〜１１の番号が付けられている）の主要な遺伝子型が存在することが知られているが、遺伝子型を６種の主要な遺伝子型として分類する人たちもいる。これらの各遺伝子型はさらに、サブタイプ（１ａ〜１ｃ、２ａ〜２ｃ、３ａ〜３ｂ、４ａ〜４ｅ、５ａ、６ａ、７ａ〜７ｂ、８ａ〜８ｂ、９ａ、１０ａ、および１１ａ）に細分される。
【０００８】
サブタイプの存在割合は、以下のように全世界的に異なっている。
【表１】
【０００９】
現在の科学的考えは、ＨＣＶの遺伝子型またはサブタイプが治療に対する患者の応答性を決定しうるということである。ＨＣＶのゲノムの複雑度とインターフェロン療法に対する患者の応答との間に相関があることが知られているが、この相関の理由は、明らかでない。遺伝子型２のＨＣＶウイルスおよび遺伝子型３のＨＣＶウイルスに感染した患者は、遺伝子型１のＨＣＶに感染した患者とは異なる度合いで従来療法に応答することが一般に認められる。このため、遺伝子型１ ＨＣＶプロテアーゼに対していくつかのＨＣＶプロテアーゼ阻害剤が設計／探索されてきたが、これらの阻害剤が遺伝子型２ ＨＣＶや遺伝子型３ ＨＣＶなどのような他の遺伝子型のＨＣＶ ＮＳ３−４Ａセリンプロテアーゼを効果的に阻害するかどうかは、明らかでない。
【００１０】
したがって、ＨＣＶに関する現在の理解は、なんら満足すべき抗ＨＣＶ剤や抗ＨＣＶ治療をもたらすに至っていない。ＨＣＶ疾患に対する唯一の確立された療法は、ペグ化インターフェロンとリバビリンとの組合せ治療である。しかしながら、インターフェロンは、有意な副作用を有し［M. A. Wlaker et al., "Hepatitis C Virus: An Overview of Current Approaches and Progress," DDT, 4, pp. 518-29 (1999); D. Moradpour et al., "Current and Evolving Therapies for Hepatitis C," Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 11, pp. 1199-1202 (1999); H. L. A. Janssen et al. "Suicide Associated with Alfa-Interferon Therapy for Chronic Viral Hepatitis," J. Hepatol., 21, pp. 241-243 (1994); P.F. Renault et al., "Side Effects of Alpha Interferon," Seminars in Liver Disease, 9, pp. 273-277. (1989)］、症例のごく一部だけ（約２５％）で長期寛解をもたらすにすぎない［O. Weiland, ”Interferon Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection” , FEMS Microbiol. Rev., 14, pp. 279-288 (1994)］。それに加えて、この組合せ治療は、遺伝子型２または３のＨＣＶに感染した患者では約８０％の持続性ウイルス応答（ＳＶＲ）を有し、遺伝子型１のＨＣＶに感染した患者では４０〜５０％のＳＶＲを有する［J.G. McHutchison, et al., N. Engl. J. Med., 339: 1485-1492 (1998); G.L. Davis et al., N. Engl. J. Med., 339: 1493-1499 (1998)］。さらに、有効な抗ＨＣＶワクチンの見通しは、不明確なままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、より有効な抗ＨＣＶ療法、とくに、ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを阻害する化合物に対する必要性が存在する。そのような化合物は、抗ウイルス剤とくに抗ＨＣＶ剤として有用でありうる。種々の遺伝子型のＨＣＶセリンプロテアーゼを阻害する化合物に対する必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、ＶＸ−９５０を用いて遺伝子型２および遺伝子型３のＨＣＶを阻害する方法を提供することにより、これらの必要性に対処する。遺伝子型２および遺伝子型３のＨＣＶを特異的に阻害する点でＶＸ−９５０は他のプロテアーゼ阻害剤よりも優れていることが本発明に例示されているが、他の非遺伝子型１のＨＣＶ遺伝子型であってもＶＸ−９５０により効果的に阻害されうると考えられる。
【００１３】
本発明はまた、ＶＸ−９５０を含む組成物およびその使用に関する。そのような組成物は、患者に挿入される侵襲的デバイスを前処理したり、血液のような生物学的サンプルを患者への投与前に処理したり、患者に直接投与したりするために使用することが可能である。いずれの場合も、組成物は、ＨＣＶの複製を阻害したりＨＣＶ感染症にかかる危険性やＨＣＶ感染症の重症度を低減したりするために使用されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】１１種の遺伝子型２ ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのアミノ酸配列のアライメント
【図２】遺伝子型２ａのＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのコンセンサスアミノ酸配列およびコンセンサスヌクレオチド配列
【図３】６種の遺伝子型３ ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのアミノ酸配列のアライメント。
【図４】遺伝子型３ａのＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのコンセンサスアミノ酸配列およびコンセンサスヌクレオチド配列。
【図５】それぞれの遺伝子型または遺伝子サブタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、および３ｂのコンセンサスアミノ酸配列のアライメント。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、遺伝子型２または遺伝子型３のプロテアーゼをＶＸ−９５０に接触させることにより遺伝子型２および遺伝子型３のプロテアーゼを単独にまたは同時に阻害する方法を提供する。
【００１６】
ＶＸ−９５０は、３ｎＭの定常状態結合定数（ｋｉ＊）（および８ｎＭのＫｉ）を有する競合的可逆的ペプチドミミックＮＳ３／４Ａプロテアーゼ阻害剤である［WO 02/018369］。ＶＸ−９５０は、一般的には、当業者に公知の方法により調製可能である（たとえば、WO 02/18369を参照されたい）。
【化１】
【００１７】
本発明に係る化合物は、１個以上の不斉炭素原子を含有しうるので、ラセミ体およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、ジアステレオマー混合物および個別のジアステレオマーとして存在しうる。当該化合物のそのような異性形はすべて、本発明に明示的に包含される。各ステレオジェン炭素は、Ｒ配置またはＳ配置をとりうる。
【００１８】
たとえば、特定の実施形態では、使用される化合物は、以下の構造：
【化２】
【００１９】
に示されるようにＮ−プロピル側鎖におけるＤ異性体とＬ異性体との混合物でありうる。出発化合物としてたとえばＶＸ−９５０または構造Ａで示される化合物を用いてラショナルドラッグデザインを介して創出される他の薬剤をプロテアーゼ阻害剤としての活性に関して試験することも可能である。
【００２０】
好ましくは、本発明に係る化合物は、ＶＸ−９５０に包含される化合物に示される構造および立体化学を有する。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、ＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩を含む組成物を提供する。好ましい実施形態によれば、ＶＸ−９５０は、サンプルにおいてまたは患者においてウイルス負荷（ただし、該ウイルスは、ウイルスの生活環に必要なセリンプロテアーゼをコードする）を減少させるのに有効な量でかつ製薬上許容される担体中に存在する。
【００２２】
本発明に係る化合物の製薬上許容される塩を当該組成物で利用する場合、該塩は、好ましくは、無機または有機の酸および塩基から誘導される。そのような酸塩に包含されるのは、次の化合物、すなわち、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、１／２硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニル−プロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、およびウンデカン酸塩である。塩基塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（たとえば、ナトリウム塩およびカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（たとえば、カルシウム塩およびマグネシウム塩）、有機塩基との塩（たとえば、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン塩）、およびアミノ酸（たとえば、アルギニン、リシンなど）との塩が包含される。
【００２３】
また、塩基性窒素含有基は、低級アルキルハリド（たとえば、メチル、エチル、プロピル、およびブチルのクロリド、ブロミド、およびヨージド）、ジアルキルスルファート（たとえば、ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミルのスルファート）、長鎖ハリド（たとえば、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリルのクロリド、ブロミド、およびヨージド）、アラルキルハリド（たとえば、ベンジルおよびフェネチルのブロミド）などのような作用剤で四級化可能である。それにより水または油に溶解可能または分散可能な生成物が得られる。
【００２４】
本発明に係る組成物および方法で利用される化合物はまた、選択的生物学的性質を向上させるために、適切な官能基を付加することにより修飾可能である。そのような修飾は、当技術分野で公知であり、所与の生体系（たとえば、血液、リンパ系、中枢神経系）中への生物学的浸透を増大させたり、経口利用可能性を増大させたり、注射による投与が可能になるように溶解度を増大させたり、代謝を改変したり、排泄速度を改変したりする修飾を包含する。
【００２５】
当該組成物で使用しうる製薬上許容される担体としては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン）、緩衝物質（たとえば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルベート、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（たとえば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る組成物は、哺乳動物、好ましくはヒトへの医薬投与のために製剤化される。
【００２７】
本発明に係るそのような医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸内に、鼻内に、口腔内に、膣内に、または移植レザバーを介して投与可能である。本明細書中で使用される「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、脊髄内、肝臓内、病変内、および頭蓋内への注射または注入の技術を包含する。好ましくは、組成物は、経口的にまたは静脈内に投与される。
【００２８】
本発明に係る滅菌注射剤形態の組成物は、水性懸濁剤または油性懸濁剤でありうる。これらの懸濁剤は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて当技術分野で公知の技術に従って製剤化可能である。滅菌注射調剤はまた、非毒性の非経口的に許容しうる希釈剤中または溶媒中（たとえば、１，３−ブタンジオール溶液として）の滅菌注射溶液剤または滅菌注射懸濁剤でありうる。利用可能な許容しうる媒体および溶媒には、水、リンゲル溶液、および等張塩化ナトリウム溶液が包含される。そのほかに、滅菌固定油が、溶媒または懸濁媒体として従来から利用されている。この目的のために、合成のモノ−またはジ−グリセリドをはじめとする任意の無刺激性固定油を利用することが可能である。オレイン酸のような脂肪酸およびそのグリセリド誘導体は、オリーブ油やヒマシ油（とくに、それらのポリオキシエチル化体）のような天然の製薬上許容される油の場合と同じように注射剤の調製に有用である。これらの油溶液剤または油懸濁剤は、長鎖アルコール希釈剤または分散剤（たとえば、カルボキシメチルセルロースもしくはエマルジョン剤や懸濁剤をはじめとする製薬上許容される製剤の製剤化に一般に使用される類似の分散剤）をも含有しうる。他の一般に使用される界面活性剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および他の乳化剤）または製薬上許容される固形製剤、液状製剤、もしくは他の製剤の製造に一般に使用される生物学的利用能向上剤もまた、製剤化の目的に使用しうる。
【００２９】
１日あたり約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１日あたり約０．５〜約７５ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与レベルの本明細書に記載のプロテアーゼ阻害化合物が、ウイルス疾患に対する、とくにＨＣＶ媒介疾患に対する予防および治療のための単独療法に有用である。典型的には、本発明に係る医薬組成物は、１日あたり約１〜約５回または他の選択肢として連続注入として投与されるであろう。そのような投与は、長期療法または短期療法として使用可能である。単一製剤を作製するために担体材料と組み合わせうる活性成分の量は、治療対象の宿主および特定の投与形態によって異なるであろう。典型的な調剤は、約５％〜約９５％の活性化合物（ｗ／ｗ）を含有するであろう。好ましくは、そのような調剤は、約２０％〜約８０％の活性化合物を含有する。熟練診療医であればわかることであるが、インターフェロンの用量は、典型的には、ＩＵ単位で測定される（たとえば、約４００万ＩＵ〜約１２００万ＩＵ）。
【００３０】
本発明に係る組成物がＶＸ−９５０と１種以上の追加の治療剤または予防剤との組合せを含む場合、これらの化合物および追加の薬剤はいずれも、単独療法レジメンで通常投与される用量の約１０〜１００％、より好ましくは約１０〜８０％の投与レベルで存在することが望ましい。
【００３１】
本発明に係る医薬組成物は、任意の経口的に許容しうる製剤、たとえば、限定されるものではないが、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、または水溶液剤として経口投与可能である。経口用途の錠剤の場合、一般に使用される担体としては、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが挙げられる。典型的には、マグネシウムステアレートのような滑沢剤もまた添加される。カプセル剤形態で経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。水性懸濁剤が経口用途に必要とされる場合、活性成分は、乳化剤および懸濁化剤と組み合わされる。所望により、特定の甘味剤、風味剤、または着色剤もまた添加可能である。
【００３２】
他の選択肢として、本発明に係る医薬組成物は、直腸内投与に供すべく坐剤の形態で投与可能である。これらは、薬剤を室温では固体であるが直腸温では液体である好適な非刺激性賦形剤と混合することにより調製可能であり、したがって、直腸内で融解して薬剤を放出するであろう。そのような材料としては、ココアバター、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００３３】
本発明に係る医薬組成物はまた、とくに、治療の標的が局所適用で容易に到達可能な領域または器官を含む場合（たとえば、眼、皮膚、または下部腸管の疾患）、局所投与することも可能である。これらの領域または器官のそれぞれに好適な局所製剤は、容易に調製される。
【００３４】
下部腸管に対する局所適用は、直腸坐薬製剤（上記参照）または好適な浣腸製剤で行うことが可能である。局所的経皮貼付剤を使用することも可能である。
【００３５】
局所適用の場合、医薬組成物は、１種以上の担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適な軟膏剤として製剤化可能である。本発明に係る化合物の局所投与に供される担体としては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の選択肢として、医薬組成物は、１種以上の製薬上許容される担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適なローション剤またはクリーム剤として製剤化可能である。好適な担体としては、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
眼科用途の場合、医薬組成物はまた、ベンジルアルコニウムクロリドのような保存剤を併用してまたは併用せずに、等張性のｐＨ調整された滅菌生理食塩水中のマイクロ粒子化懸濁剤としてまたは好ましくは等張性のｐＨ調整された滅菌生理食塩水中の溶液剤として製剤化可能である。他の選択肢として、眼科用途の場合、医薬組成物は、ワセリン剤のような軟膏剤として製剤化可能である。
【００３７】
本発明に係る医薬組成物は、鼻内エアロゾルまたは吸入により投与することも可能である。そのような組成物は、医薬製剤分野で周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールもしくは他の好適な保存剤、生物学的利用能を向上させる吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を利用して生理食塩水溶液として調製可能である。
【００３８】
最も好ましいのは、経口投与に供すべく製剤化される医薬組成物である。
【００３９】
他の実施形態では、本発明に係る組成物は、他の抗ウイルス剤、好ましくは抗ＨＣＶ剤を追加的に含む。そのような抗ウイルス剤としては、免疫調節剤、たとえば、α−、β−、およびγ−インターフェロン、ペグ化誘導体化インターフェロン−α化合物、ならびにチモシン；他の抗ウイルス剤、たとえば、リバビリン、アマンタジン、およびテルビブジン；Ｃ型肝炎プロテアーゼの他の阻害剤（ＮＳ２−ＮＳ３阻害剤およびＮＳ３−ＮＳ４Ａ阻害剤）；ＨＣＶの生活環中の他の標的の阻害剤、たとえば、ヘリカーゼ阻害剤およびポリメラーゼ阻害剤；リボソーム内部進入の阻害剤；広域ウイルス阻害剤、たとえば、ＩＭＰＤＨ阻害剤（たとえば、United States Patent 5,807,876、6,498,178、6,344,465、6,054,472、WO 97/40028、WO 98/40381、WO 00/56331に記載の化合物、ならびにミコフェノール酸およびその誘導体、さらにはたとえば、限定されるものではないが、ＶＸ−４９７、ＶＸ−１４８、および／またはＶＸ−９４４）；または以上のいずれかの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、W. Markland et al., Antimicrobial & Antiviral Chemotherapy, 44, p. 859 (2000) および U.S. Patent 6,541,496をも参照されたい。
【化３】
【００４０】
本明細書中では、以下の定義を使用する（商標は、本出願の出願日現在で入手可能な製品を示す）。
【００４１】
「Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ」は、Schering Corporation, Kenilworth, NJから入手可能なペグインターフェロンα−２ｂであるＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）を意味する。
【００４２】
「Ｉｎｔｒｏｎ」は、Schering Corporation, Kenilworth, NJから入手可能なインターフェロンα−２ｂであるＩｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）を意味する。
【００４３】
「リバビリン」は、リバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）を意味し、ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CAから入手可能であり；Merck Index, entry 8365, Twelfth Editionに記載されており；さらには、Schering Corporation, Kenilworth, NJからＲｅｂｅｔｏｌ（登録商標）としてまたはHoffmann-La Roche, Nutley, NJからＣｏｐｅｇｕｓ（登録商標）として入手可能である。
【００４４】
「Ｐａｇａｓｙｓ」は、Hoffmann-La Roche, Nutley, NJから入手可能なペグインターフェロンα−２ａであるＰｅｇａｓｙｓ（登録商標）を意味する。
【００４５】
「Ｒｏｆｅｒｏｎ」は、Hoffmann-La Roche, Nutley, NJから入手可能な組換えインターフェロンα−２ａであるＲｏｆｅｒｏｎ（登録商標）を意味する。
【００４６】
「Ｂｅｒｅｆｏｒ」は、Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, CTから入手可能なインターフェロンα２であるＢｅｒｅｆｏｒ（登録商標）を意味する。
【００４７】
Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ（登録商標）は、Sumitomo, Japanから入手可能なＳｕｍｉｆｅｒｏｎのような天然のαインターフェロンの精製ブレンドである。
【００４８】
Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ（登録商標）は、Glaxo_Wellcome LTd., Great Britainから入手可能なインターフェロンαｎ１である。
【００４９】
Ａｌｆｅｒｏｎ（登録商標）は、Interferon Sciencesにより製造されてPurdue Frederick Co., CTから入手可能な天然のαインターフェロンの混合物である。
【００５０】
本明細書中で使用される「インターフェロン」という用語は、ウイルスの複製および細胞の増殖を阻害しかつ免疫応答をモジュレートする高度の相同性を有する種特異的タンパク質ファミリーのメンバー、たとえば、インターフェロンα、インターフェロンβ、またはインターフェロンγを意味する。Merck Index, entry 5015, Twelfth Edition。
【００５１】
本発明の一実施形態によれば、インターフェロンは、α−インターフェロンである。他の実施形態によれば、本発明に係る治療剤の組合せでは、天然のαインターフェロン２ａが利用される。または、本発明に係る治療剤の組合せでは、天然のαインターフェロン２ｂが利用される。他の実施形態では、本発明に係る治療剤の組合せでは、組換えαインターフェロン２ａまたは２ｂが利用される。さらに他の実施形態では、インターフェロンは、ペグ化αインターフェロン２ａまたは２ｂである。本発明に好適なインターフェロンとしては、以下のものが挙げられる：
（ａ） Ｉｎｔｒｏｎ（インターフェロン−α２Ｂ、Schering Plough）、
（ｂ） Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ、
（ｃ） Ｐｅｇａｓｙｓ、
（ｄ） Ｒｏｆｅｒｏｎ、
（ｅ） Ｂｅｒｏｆｏｒ、
（ｆ） Ｓｕｍｉｆｅｒｏｎ、
（ｇ） Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ、
（ｈ） Amgen, Inc., Newbury Park, CAから入手可能なコンセンサスαインターフェロン、
（ｉ） Ａｌｆｅｒｏｎ、
（ｊ） Ｖｉｒａｆｅｒｏｎ（登録商標）、
（ｋ） Ｉｎｆｅｒｇｅｎ（登録商標）。
【００５２】
熟練診療医であればわかることであるが、プロテアーゼ阻害剤は、好ましくは、経口投与されるであろう。インターフェロンは、典型的には、経口投与されない。それにもかかわらず、本発明に係る方法や組合せは、本明細書の記載内容によりなんら特定の製剤やレジームに限定されるものではない。したがって、本発明に係る組合せの各成分は、別々に、一緒に、またはそれらの任意の組合せで投与可能である。
【００５３】
一実施形態では、プロテアーゼ阻害剤およびインターフェロンは、個別製剤として投与される。一実施形態では、任意の追加の薬剤は、プロテアーゼ阻害剤を含む単一製剤の一部分としてまたは個別製剤として投与される。本発明が化合物の組合せを含む場合、各化合物の特定量は、組合せ中の他のそれぞれの化合物の特定量に依存する可能性がある。熟練診療医であればわかることであるが、インターフェロンの用量は、典型的には、ＩＵ単位で測定される（たとえば、約４００万ＩＵ〜約１２００万ＩＵ）。
【００５４】
したがって、本発明に係る化合物と組み合わせて使用しうる薬剤（免疫調節剤として作用するか否かを問わず）としては、インターフェロン−α２Ｂ（Intron A, Schering Plough）、Ｒｅｂａｔｒｏｎ（Schering Plough、インターフェロン−α２Ｂ＋リバビリン）、ペグ化インターフェロンα（Reddy, K.R. et al. "Efficacy and Safety of Pegylated (40-kd) interferon alpha-2a compared with interferon alpha-2a in noncirrhotic patients with chronic hepatitis C" (Hepatology, 33, pp. 433-438 (2001)）、コンセンサスインターフェロン（Kao, J.H., et al., "Efficacy of Consensus Interferon in the Treatement of Chronic Hepatitis" J. Gastroenterol. Hepatol. 15, pp. 1418-1423 (2000)）、インターフェロン−α２Ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ；Roche）、リンパ芽球様細胞インターフェロンすなわち「天然型」インターフェロン、インターフェロンτ（Clayette, P. et al., "IFN-tau, A New Interferon Type I with Antiretroviral activity" Pathol. Biol. (Paris) 47, pp. 553-559 (1999)）、インターロイキン２（Davis, G.L. et al., "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease, 19, pp. 103-112 (1999)）、インターロイキン６（Davis et al. "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease 19, pp. 103-112 (1999)）、インターロイキン１２（Davis, G.L. et al., "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease, 19, pp. 103-112 (1999)）、リバビリン、および１型ヘルパーＴ細胞応答の発生を促進する化合物（Davis et al., "Future Options for the Management of Hepatitis C." Seminars in Liver Disease, 19, pp. 103-112 (1999)）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。インターフェロンは、直接的な抗ウイルス作用を発揮することによりおよび／または感染に対する免疫応答を改変することによりウイルス感染症を改善しうる。インターフェロンの抗ウイルス作用は、多くの場合、ウイルスの侵入もしくは脱殻、ウイルスＲＮＡの合成、ウイルスタンパク質の翻訳、ならびに／またはウイルスの集合および放出の阻害を介して媒介される。
【００５５】
細胞内におけるインターフェロンの合成を刺激する化合物（Tazulakhova, E.B. et al., "Russian Experience in Screening, analysis, and Clinical Application of Novel Interferon Inducers" J. Interferon Cytokine Res., 21 pp. 65-73）としては、二本鎖ＲＮＡ単独またはトブラマイシンおよびイミキモド（3M Pharmaceuticals; Sauder, D.N. "Immunomodulatory and Pharmacologic Properties of Imiquimod" J. Am. Acad. Dermatol., 43 pp. S6-11 (2000)）との組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５６】
他の非免疫調節性または免疫調節性の化合物、たとえば、限定されるものではないが、WO 02/18369（参照により本明細書に組み入れられるものとする）（たとえば、第２７３頁第９〜２２行および第２７４頁第４行〜第２７６頁第１１行（参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする）を参照されたい）に指定されているものを本発明に係る化合物と組み合わせて使用することが可能である。
【００５７】
細胞内におけるインターフェロンの合成を刺激する化合物（Tazulakhova et al., J. Interferon Cytokine Res. 21, 65-73)）としては、二本鎖ＲＮＡ単独またはトブラマイシンおよびイミキモド（3M Pharmaceuticals）（Sauder, J. Am. Arad. Dermatol. 43, S6-11 (2000)）との組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。非免疫調節機序に基づくＨＣＶ抗ウイルス活性を有することが公知であるかまたはそれを有する可能性のある他の化合物としては、リバビリン（ICN Pharmaceuticals）、イノシン５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ阻害剤（本明細書中に提供されるＶＸ−４９７の式）、アマンタジンおよびリマンタジン（Younossi et al., In Seminars in Liver Disease 19, 95-102 (1999)）、ＬＹ２１７８９６（U.S. Patent 4,835,168）（Colacino, et al., Antimicrobial Agents & Chemotherapy 34, 2156-2163 (1990)）、さらには９−ヒドロキシイミノ−６−メトキシ−１，４ａ−ジメチル−１，２，３，４，４ａ，９，１０，１０ａ−オクタヒドロ−フェナントレン−１−カルボン酸メチルエステル、６−メトキシ−１，４ａ−ジメチル−９−（４−メチル−ピペラジン−１−イルイミノ）−１，２，３，４，４ａ，９，１０，１０ａ−オクタヒドロ−フェナントレン−１−カルボン酸メチルエステル−塩酸塩、１−（２−クロロ−フェニル）−３−（２，２−ビフェニルエチル）−ウレア（U.S. Patent 6,127,422）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。以上の分子の製剤、用量、および投与経路は、以下で引用される参考文献中に教示されているか、またはたとえば、F.G. Hayden, in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., Eds., McGraw-Hill, New York (1996), Chapter 50, pp. 1191-1223 およびそこに引用されている参考文献に開示されているように当技術分野で周知である。他の選択肢として、ＨＣＶ抗ウイルス活性を呈する化合物を同定した後、当業者に周知の技術を用いてその化合物の製薬的有効量を決定することが可能である。たとえば、Benet et al., in Goodman & Gilman's The Phannaeological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., Eds., McGraw-Hill, New York (1996), Chapter 1, pp. 3-27 およびそこに引用されている参考文献に注目されたい。したがって、そのような化合物の適切な製剤、用量、範囲、および投与レジメンは、常法で容易に決定可能である。本発明に係る薬剤の組合せは、同時にもしくは逐次的に投与される個別の製薬上許容される製剤として、２種以上の治療剤を含有する製剤として、または単剤製剤および多剤製剤の組合せにより、１種もしくは複数種の細胞にまたはヒト患者に提供することが可能である。投与経路に関係なく、これらの薬剤の組合せは、抗ＨＣＶ有効量の成分で構成される。
【００５８】
本発明に係る方法で使用しうる多数の他の免疫調節剤および免疫刺激剤が、現在、入手可能であり、その例としては、次のものが挙げられる：ＡＡ−２Ｇ；アダマンチルアミドジペプチド；アデノシンデアミナーゼ、Ｅｎｚｏｎ；アジュバント、Alliance；アジュバント、Ribi；アジュバント、Vaxcel；Ａｄｊｕｖａｘ；アゲラスフィン−１１；ＡＩＤＳ療法剤、Chiron；藻類グルカン、SRI；Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ、Anutech；Ａｎｇｉｎｌｙｃ；抗細胞因子、Yeda；Ａｎｔｉｃｏｒｔ；抗ガストリン−１７免疫原、Ａｐ；抗原送達システム、Vac；抗原製剤、ＩＤＢＣ；抗ＧｎＲＨ免疫原、Aphton；Ａｎｔｉｈｅｒｐｉｎ；Ａｒｂｉｄｏｌ；アザロール；Ｂａｙ−ｑ−８９３９；Ｂａｙ−ｒ−１００５；ＢＣＨ−１３９３；Ｂｅｔａｆｅｃｔｉｎ；Ｂｉｏｓｔｉｍ；ＢＬ−００１；ＢＬ−００９；Ｂｒｏｎｃｏｓｔａｔ；Ｃａｎｔａｓｔｉｍ；ＣＤＲＩ−８４−２４６；セフォジジム；ケモカイン阻害剤、ＩＣＯＳ；ＣＭＶペプチド、City of Hope；ＣＮ−５８８８；サイトカイン放出剤、Ｓｔ；ＤＨＥＡ、Paradigm；ＤＩＳＣ ＴＡ−ＨＳＶ；Ｊ０７Ｂ；Ｉ０１Ａ；Ｉ０１Ｚ；ジチオカルブナトリウム；ＥＣＡ−１０−１４２；ＥＬ−１；エンドトキシン、Novartis；ＦＣＥ−２０６９６；ＦＣＥ−２４０８９；ＦＣＥ−２４５７８；ＦＬＴ−３リガンド、Ｉｍｍｕｎｅｘ；ＦＲ−９００４８３；ＦＲ−９００４９４；ＦＲ−９０１２３５；ＦＴＳ−Ｚｎ；Ｇタンパク質、Cadus；グルダプシン；グルタウリン；グリコホスホペプチカル；ＧＭ−２；ＧＭ−５３；ＧＭＤＰ；増殖因子ワクチン、ＥｎｔｒｅＭ；Ｈ−ＢＩＧ、NABI；Ｈ−ＣＩＧ、NABI；ＨＡＢ−４３９；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）ワクチン；ヘルペス特異的免疫因子；ＨＩＶ療法剤、United Biomed；ＨｙｐｅｒＧＡＭ＋ＣＦ；ＩｍｍｕＭａｘ；Ｉｍｍｕｎ ＢＣＧ；免疫療法剤、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ；免疫調節剤、Evans；免疫調節剤、Novacell；ｉｍｒｅｇ−１；ｉｍｒｅｇ−２；Ｉｎｄｏｍｕｎｅ；イノシンプラノベクス；インターフェロン、Dong-A（α２）；インターフェロン、Genentech（γ）；インターフェロン、Novartis（α）；インターロイキン−１２、Genetics Ins；インターロイキン−１５、Immunex；インターロイキン−１６、Research Cor；ＩＳＣＡＲ−１；Ｊ００５Ｘ；Ｌ−６４４２５７；リコマラスミン酸；ＬｉｐｏＴｈｅｒ；ＬＫ−４０９、ＬＫ−４１０；ＬＰ−２３０７；ＬＴ（Ｒ１９２６）；ＬＷ−５００２０；ＭＡＦ、Shionogi；ＭＤＰ誘導体、Merck；メトエンケファリン、TNI；メチルフリルブチロラクトン類；ＭＩＭＰ；ミリモスチム；混合細菌ワクチン、Tem；ＭＭ−１；Ｍｏｎｉｌｉａｓｔａｔ；ＭＰＬＡ、Ribi；ＭＳ−７０５；ムラブチド；ａｒａｂｕｔｉｄｅ、Vacsyn；ムラミルジペプチド誘導体；ムラミルペプチド誘導体；ミエロピド；Ｎ−５６３；ＮＡＣＯＳ−６；ＮＨ−７６５；ＮＩＳＶ、Proteus；ＮＰＴ−１６４１６；ＮＴ−００２；ＰＡ−４８５；ＰＥＦＡ−８１４；ペプチド、Ｓｃｉｏｓ；ペプチドグリカン、Pliva；Ｐｅｒｔｈｏｎ，Advanced Plant；ＰＧＭ誘導体、Ｐｌｉｖａ；Pharmaprojects Ｎｏ．１０９９；Ｎｏ．１４２６；Ｎｏ．１５４９；Ｎｏ．１５８５；Ｎｏ．１６０７；Ｎｏ．１７１０；Ｎｏ．１７７９；Ｎｏ．２００２；Ｎｏ．２０６０；Ｎｏ．２７９５；Ｎｏ．３０８８；Ｎｏ．３１１１；Ｎｏ．３３４５；Ｎｏ．３４６７；Ｎｏ．３６６８；Ｎｏ．３９９８；Ｎｏ．３９９９；Ｎｏ．４０８９；Ｎｏ．４１８８；Ｎｏ．４４５１；Ｎｏ．４５００；Ｎｏ．４６８９；Ｎｏ．４８３３；Ｎｏ．４９４；Ｎｏ．５２１７；Ｎｏ．５３０；ピドチモド；ピメラウチド；ピナフィド；ＰＭＤ−５８９；ポドフィロトキシン、Conpharm；ＰＯＬ−５０９；ポリ−ＩＣＬＣ；ポリ−ＩＣＬＣ，Yamasa Shoyu；ポリＡ−ポリＵ；ポリサッカリドＡ；プロテインＡ、Berlux Bioscience；ＰＳ３４Ｗ０；シュードモナス（Pseudomonas）ＭＡｂ、Teijin；Ｐｓｏｍａｇｌｏｂｉｎ；ＰＴＬ−７８４１９；Ｐｙｒｅｘｏｌ；ピリフェロン；Ｒｅｔｒｏｇｅｎ；Ｒｅｔｒｏｐｅｐ；ＲＧ−００３；Ｒｈｉｎｏｓｔａｔ；リファマキシル；ＲＭ−０６；Ｒｏｌｌｉｎ；ロムルチド；ＲＵ−４０５５５；ＲＵ−４１８２１；風疹抗体、ResCo；Ｓ−２７６４９；ＳＢ−７３；ＳＤＺ−２８０−６３６；ＳＤＺ−ＭＲＬ９５３；ＳＫ＆Ｆ−１０７６４７；ＳＬ０４；ＳＬ０５；ＳＭ−４３３３；Ｓｏｌｕｔｅｉｎ；ＳＲＩ−６２−８３４；ＳＲＬ−１７２；ＳＴ−５７０；ＳＴ−７８９；スタファージ溶解物；Ｓｔｉｍｕｌｏｎ；サプレッシン；Ｔ−１５０Ｒ１；Ｔ−ＬＣＥＦ；タビラウチド；テムルチド；Ｔｈｅｒａｄｉｇｍ−ＨＢＶ；Ｔｈｅｒａｄｉｇｍ−ＨＢＶ；Ｔｈｅｒａｄｉｇｍ−ＨＳＶ；ＴＨＦ，Pharm & Upjohn；ＴＨＦ、Yeda；チマルファシン；胸腺ホルモンフラクション；チモカルチン；チモリンホトロピン；チモペンチン；チモペンチン類似体；チモペンチン、Peptech；チモシンフラクション５、α；チモスチムリン；チモトリナン；ＴＭＤ−２３２；ＴＯ−１１５；伝達因子、Viragen；タフトシン、Selavo；ウベニメクス；Ｕｌｓａｓｔａｔ；ＡＮＧＧ−；ＣＤ−４＋；Ｃｏｌｌａｇ＋；ＣＯＬＳＦ＋；ＣＯＭ＋；ＤＡ−Ａ＋；ＧＡＳＴ−；ＧＦ−ＴＨ＋；ＧＰ−１２０−；ＩＦ＋；ＩＦ−Ａ＋；ＩＦＡ−２＋；ＩＦ−Ｂ＋；ＩＦ−Ｇ＋；ＩＦ−Ｇ−１Ｂ＋；ＩＬ−２＋；ＩＬ−１２＋；ＩＬ−１５＋；ＩＭ＋；ＬＨＲＨ−；ＬＩＰＣＯＲ＋Ｌ；ＬＹＭ−Ｂ＋；ＬＹＭ−ＮＫ＋；ＬＹＭ−Ｔ＋；ＯＰＩ＋；ＰＥＰ＋；ＰＨＧ−ＭＡ＋；ＲＮＡ−ＳＹＮ−；ＳＹ−ＣＷ−；ＴＨ−Ａ−Ｉ＋；ＴＨ−５＋；ＴＮＦ＋；ＵＮ。
【００５９】
本発明に有用な代表的なヌクレオシド化合物およびヌクレオチド化合物としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：（＋）−ｃｉｓ−５−フルオロ−１−［２−（ヒドロキシ−メチル）−［１，３−オキサチオラン−５−イル］シトシン；（−）−２’−デオキシ−３’−チオシチジン−５’−三リン酸（３ＴＣ）；（−）−ｃｉｓ−５−フルオロ−１−［２−（ヒドロキシ−メチル）−［１，３−オキサチオラン−５−イル］シトシン（ＦＴＣ）；（−）−２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン［（−）−ＳｄｄＣ］；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードシトシン（ＦＩＡＣ）；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードシトシン三リン酸（ＦＩＡＣＴＰ）；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウラシル（ＦＭＡＵ）；１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド；２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−５−メチル−デオキシシチジン（ＦｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−クロロ−５−メチル−デオキシシチジン（ＣｌｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−５−メチル−デオキシシチジン（ＡｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロ−５−メチルシチジン（ＦｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−クロロ−５−メチル−シチジン（ＣｌｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−アミノ−５−メチルシチジン（ＡｄｄＭｅＣｙｔ）；２’，３’−ジデオキシ−３’−フルオロチミジン（ＦｄｄＴｈｄ）；２’，３’−ジデオキシ−β−Ｌ−５−フルオロシチジン（β−Ｌ−ＦｄｄＣ）；２’，３’−ジデオキシ−β−Ｌ−５−チアシチジン；２’，３’−ジデオキシ−β−Ｌ−５−シチジン（βＬ−ｄｄＣ）；９−（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシメチル）グアニン；２’−デオキシ−３’−チア−５−フルオロシトシン；３’−アミノ−５−メチル−デオキシシチジン（ＡｄｄＭｅＣｙｔ）；２−アミノ−１，９−［（２−ヒドロキシメチル−１−（ヒドロキシメチル）エトキシ）メチル］−６Ｈ−プリン−６−オン（ガンシクロビル）；２−［２−（２−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）エチル−１，３−プロパンジオールジアセテート（ファムシクロビル）；２−アミノ−１，９−ジヒドロ−９−［（２−ヒドロキシ−エトキシ）メチル］６Ｈ−プリン−６−オン（アシクロビル）；９−（４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチルブト−１−イル）グアニン（ペンシクロビル）；９−（４−ヒドロキシ−３−ヒドロキシメチルブト−１−イル）−６−デオキシ−グアニンジアセテート（ファムシクロビル）；３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）；３’−クロロ−５−メチル−デオキシシチジン（ＣｌｄｄＭｅＣｙｔ）；９−（２−ホスホニル−メトキシエチル）−２’，６’−ジアミノプリン−２’，３’−ジデオキシリボシド；９−（２−ホスホニルメトキシエチル）アデニン（ＰＭＥＡ）；アシクロビル三リン酸（ＡＣＶＴＰ）；Ｄ−カルボサイクリック−２’−デオキシグアノシン（ＣｄＧ）；ジデオキシ−シチジン；ジデオキシ−シトシン（ｄｄＣ）；ジデオキシ−グアニン（ｄｄＧ）；ジデオキシ−イノシン（ｄｄｌ）；Ｅ−５−（２−ブロモビニル）−２’−デオキシウリジン三リン酸；フルオロ−アラビノフラノシル−ヨードウラシル；１−（２’−デオキシ−２’−フルオロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル（ＦＩＡＵ）；スタブジン；９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−９Ｈ−プリン−６−アミン一水和物（Ａｒａ−Ａ）；９−β−Ｄ−アラビノフラノシル−９Ｈ−プリン−６−アミン−５’−一リン酸一水和物（Ａｒａ−ＡＭＰ）；２−デオキシ−３’−チア−５−フルオロシチジン；２’，３’−ジデオキシ−グアニン；および２’，３’−ジデオキシ−グアノシン。
【００６０】
本発明に有用であるヌクレオシドおよびヌクレオチドを調製するための合成方法は、Acta Biochim Pol., 43, 25-36 (1996); Swed. Nucleosides Nucleotides 15, 361-378 (1996); Synthesis 12,1465-1479 (1995); Carbohyd. Chem. 27, 242-276 (1995); Chena Nucleosides Nucleotides 3, 421-535 (1994); Ann. Reports in Med. Chena, Academic Press; and Exp. Opin. Invest. Drugs 4, 95-115 (1995)に開示されているように当技術分野で周知である。
【００６１】
以上で引用した参考文献に記載の化学反応は、一般的には、本発明に係る化合物の調製に最も広く適用される形で開示されている。ときとして、それらの反応は、本明細書に開示されている化合物の範囲内に包含されるそれぞれの化合物に、記載されるとおりには適用できない可能性がある。これに該当する化合物は、当業者であれば容易にわかるであろう。そのような場合にはいずれにおいても、当業者に公知の従来型の変更を加えることにより、たとえば、妨害基の適切な保護を行ったり、他の選択肢の従来型の試薬に変更したり、反応条件に慣用的な変更を加えたりすることにより、うまく反応を行うことが可能であるか、または本明細書に開示されている他の反応もしくはそれ以外の従来型の反応を本発明に係る対応する化合物の調製に適用することが可能であろう。いずれの調製方法においても、出発原料はすべて、公知であるかまたは公知の出発原料から容易に調製可能である。一般的にはヌクレオシド類似体がそのままの状態で抗ウイルス剤として利用されるが、細胞膜を横切る輸送を促進するために、ヌクレオチド（ヌクレオシドリン酸）をヌクレオシドに変換しなければならないこともある。細胞に進入しうる化学修飾されたヌクレオチドの例は、Ｓ−１−３−ヒドロキシ−２−ホスホニルメトキシプロピルシトシン（ＨＰＭＰＣ、Gilead Sciences）である。本発明で使用されるヌクレオシド化合物およびヌクレオチド化合物が酸である場合、塩を形成することが可能である。例としては、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属（たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、もしくはマグネシウム）との塩または有機塩基との塩あるいは塩基性第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００６２】
本発明はまた、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ阻害剤を投与することを包含しうる。ＣＹＰ阻害剤は、ＣＹＰにより阻害される化合物の肝臓内濃度の増大および／または血中レベルの増大に有用でありうる。
【００６３】
本発明に係る実施形態がＣＹＰ阻害剤を含む場合、関連するＮＳ３／４Ａプロテアーゼの薬動学的挙動を改善する任意のＣＹＰ阻害剤を本発明に係る方法で使用することが可能である。これらのＣＹＰ阻害剤としては、リトナビル（WO 94/14436）、ケトコナゾール、トロレアンドマイシン、４−メチルピラゾール、シクロスポリン、クロメチアゾール、シメチジン、イトラコナゾール、フルコナゾール、ミコナゾール、フルボキサミン、フルオキセチン、ネファゾドン、セルトラリン、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、フォサムプレナビル、サキナビル、ロピナビル、デラビルジン、エリスロマイシン、ＶＸ−９４４、およびＶＸ−４９７が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましいＣＹＰ阻害剤としては、リトナビル、ケトコナゾール、トロレアンドマイシン、４−メチルピラゾール、シクロスポリン、およびクロメチアゾールが挙げられる。リトナビルの好ましい製剤については、United States Patent 6,037,157 およびそこに引用されている文献、すなわち、United States Patent 5,484,801、United States Application 08/402,690、ならびにInternational Applications WO 95/07696 および WO 95/09614)を参照されたい。
【００６４】
シトクロムＰ５０モノオキシゲナーゼ活性を阻害する化合物の能力を測定する方法は公知である（US 6,037,157 および Yun, et al. Drug Metabolism & Disposition, vol. 21, pp. 403-407 (1993)を参照されたい）。
【００６５】
種々の公開された米国特許出願には、肝炎を治療するためにＶＸ−９５０と組み合わせて使用しうる化合物および方法についてさらなる教示が提供されている。そのような方法および組成物はいずれも、本発明に係る方法および組成物と組み合わせて使用しうると考えられる。簡潔にするために、それらの公報の開示内容の開示は、公開番号を参照することにより参照されるが、なかでもとくに、化合物の開示は、参照により本明細書にとくに組み入れられることに留意すべきである。代表的なそのような公報としては、U.S. Patent Publication No. 20040058982; U.S. Patent Publication No. 20050192212; U.S. Patent Publication No. 20050080005; U.S. Patent Publication No. 20050062522; U.S. Patent Publication No. 20050020503; U.S. Patent Publication No. 20040229818; U.S. Patent Publication No. 20040229817; U.S. Patent Publication No. 20040224900; U.S. Patent Publication No. 20040186125; U.S. Patent Publication No. 20040171626; U.S. Patent Publication No. 20040110747; U.S. Patent Publication No. 20040072788; U.S. Patent Publication No. 20040067901; U.S. Patent Publication No. 20030191067; U.S. Patent Publication No. 20030187018; U.S. Patent Publication No. 20030186895; U.S. Patent Publication No. 20030181363; U.S. Patent Publication No. 20020147160; U.S. Patent Publication No. 20040082574; U.S. Patent Publication No. 20050192212; U.S. Patent Publication No. 20050187192; U.S. Patent Publication No. 20050187165; U.S. Patent Publication No. 20050049220が挙げられる。
【００６６】
本発明に係る組合せ治療方法に有用な免疫調節剤、免疫刺激剤、および他の薬剤は、当技術分野で慣用される量よりも少ない量で投与可能である。たとえば、インターフェロンαは、ＨＣＶ感染症を治療するために、典型的には、毎週３回で約１×１０６単位／人〜毎週３回で約１０×１０６単位／人の量でヒトに投与される（Simon et al., Hepatology 25: 445-448 (1997)）。本発明に係る方法および組成物では、この用量は、毎週３回で約０．１×１０６単位／人〜毎週３回で約７．５×１０６単位／人；より好ましくは毎週３回で約０．５×１０６単位／人〜毎週３回で約５×１０６単位／人；最も好ましくは毎週３回で約１×１０６単位／人〜毎週３回で約３×１０６単位／人の範囲内でありうる。本発明に係るＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤の存在下でＣ型肝炎ウイルスに対する免疫調節剤、免疫刺激剤、または他の抗ＨＣＶ剤の抗ウイルス効率が増大されるので、これらの免疫調節剤／免疫刺激剤は、低減された量で本発明に係る治療方法および組成物に利用可能である。同様に、免疫調節剤および免疫刺激剤の存在下でＣ型肝炎ウイルスに対する本発明に係るＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤の抗ウイルス効率が増大されるので、当該ＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤は、低減された量で本発明に係る方法および組成物に利用可能である。そのような低減された量は、治療を受けている感染患者においてＣ型肝炎ウイルスの力価を慣例に従ってモニタリングすることにより決定可能である。これは、たとえば、スロットブロット技術、ドットブロット技術、もしくはＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて患者の血清中のＨＣＶ ＲＮＡをモニタリングすることにより、またはＨＣＶの表面抗原もしくは他の抗原を測定することにより、実施可能である。本明細書に開示されているＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤と、抗ＨＣＶ活性を有する他の化合物、たとえば、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチドの抗ウイルス剤と、を利用する組合せ療法時、組み合わせて使用するときのそれぞれの最小有効用量を決定するために、患者に対して同様にモニタリングを行うことが可能である。
【００６７】
本明細書に開示されている組合せ治療方法では、ヌクレオシドもしくはヌクレオチドの抗ウイルス化合物またはそれらの混合物は、約０．１ｍｇ／人／日〜約５００ｍｇ／人／日の範囲内、好ましくは約１０ｍｇ／人／日〜約３００ｍｇ／人／日、より好ましくは約２５ｍｇ／人／日〜約２００ｍｇ／人／日、さらにより好ましくは約５０ｍｇ／人／日〜約１５０ｍｇ／人／日、最も好ましくは約１ｍｇ／人／日〜約５０ｍｇ／人／日の範囲内の量でヒトに投与することが可能である。
【００６８】
種々の用量の化合物を一回用量でまたは適切に配分された用量で患者に投与することが可能である。後者の場合、投与ユニット組成物は、一日用量を構成するような量またはそのサブ用量を含有しうる。薬剤処方者が望むのであれば、１日に複数回投与することにより、合計一日用量を増大させることも可能である。
【００６９】
ＨＣＶ感染症に罹患している患者を本発明に係る化合物および／または組成物で治療するためのレジメンは、患者の年齢、体重、性別、食事、および病状、感染症の重症度、投与の経路、薬理学的な要件（たとえば、利用される特定の化合物の活性、効力、薬動学的および毒性学的なプロファイル）、ならびに薬剤送達システムを利用するかどうかをはじめとするさまざまな因子に基づいて選択される。本明細書に開示されている薬剤の組合せの投与は、一般的には、ウイルス力価が許容レベルに達して感染症が抑制または根絶されたことが示唆されるまで、数週間〜数ヶ月間または数年間にわたり継続しなければならない。療法の有効性を決定するために、スロットブロット技術、ドットブロット技術、もしくはＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて患者の血清中の肝炎ウイルスＲＮＡを測定することにより、または血清中のＣ型肝炎ウイルス抗原（たとえば、表面抗原）を測定することにより、本明細書に開示されている薬剤の組合せによる治療を受けている患者に対して慣例に従ってモニタリングを行うことが可能である。組合せの各成分が最適量で投与されるように、しかも治療の継続期間を決定することもできるように、これらの方法により得られたデータを継続して解析すれば、治療時、治療レジメンに変更を加えることが可能である。
【００７０】
本発明は、患者においてＨＣＶ感染症を治療または予防するために、抗ＨＣＶ活性を有する以上のタイプかつ類似のタイプの化合物とさまざまに組み合わせて、本明細書に開示されているＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤を使用することを包含する。たとえば、抗ＨＣＶ活性を有する１種以上のインターフェロンもしくはインターフェロン誘導体、抗ＨＣＶ活性を有する１種以上の非インターフェロン化合物、または抗ＨＣＶ活性を有する１種以上のインターフェロンもしくはインターフェロン誘導体および抗ＨＣＶ活性を有する１種以上の非インターフェロン化合物と組み合わせて、１種以上のＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤を使用することが可能である。ヒト患者においてＨＣＶ感染症を治療または予防するために組み合わせて使用する場合、このたび開示されたＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤および抗ＨＣＶ活性を有する以上の化合物はいずれも、製薬的有効量または抗ＨＣＶ有効量で存在しうる。以上に記載した組合せで使用した場合、相加効果または相乗効果に基づいて、準臨床的な製薬的有効量または抗ＨＣＶ有効量でそれぞれを存在させることも可能である。すなわち、単独で使用した場合、製薬的有効量で使用したときのそのようなＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤および抗ＨＣＶ活性を有する化合物と比較して、ＨＣＶビリオンの蓄積の完全阻害もしくは減少および／または患者におけるＨＣＶの感染もしくは病理発生に関連する病状もしくは症状の軽減もしくは改善に関して、低減された製薬的有効性を提供する量で、それぞれを存在させることも可能である。それに加えて、本発明は、ＨＣＶ感染症を治療または予防するために、以上に記載したように、ＨＣＶセリンプロテアーゼ阻害剤と抗ＨＣＶ活性を有する化合物とを組み合わせて使用することを包含する。この場合、これらの阻害剤または化合物の１種以上は、製薬的有効量で存在し、他のものは、相加効果または相乗効果に基づいて準臨床的な製薬的有効量または抗ＨＣＶ有効量で存在する。本明細書中で使用する場合、「相加効果」という用語は、各薬剤を単独で与えたときの効果の合計に等しい２種（もしくはそれ以上）の医薬活性剤の組合せ効果を記述する。相乗効果とは、２種（もしくはそれ以上）の医薬活性剤の組合せ効果が各薬剤を単独で与えたときの効果の合計よりも大きい効果のことである。
【００７１】
患者の病状が改善された後、必要であれば、本発明に係る化合物、組成物、または組合せを維持用量で投与することが可能である。その結果、治療を中止すべき所望のレベルにまで症状が軽減されたときに、症状に応じて、投与用量もしくは投与頻度またはその両方を改善された病状が維持されるレベルにまで低減させることが可能である。しかしながら、患者は、疾患症状が再発した際に長期間にわたる間欠的治療を必要とすることもある。
【００７２】
また、当然のことながら、特定の患者に対する特定の用量および治療レジメンは、利用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与時期、排泄速度、薬剤の組合せ、および治療医の判断、さらには治療される特定の疾患の重症度をはじめとするさまざまな因子に依存するであろう。活性成分の量もまた、特定の記載化合物ならびに組成物中の追加の抗ウイルス剤の存在または不在および性質に依存するであろう。
【００７３】
他の実施形態によれば、本発明は、本発明に係る製薬上許容される組成物を患者に投与することにより、ウイルスの生活環に必要であるウイルスにコードされたセリンプロテアーゼにより特徴付けられるウイルスに感染した患者を治療する方法を提供する。好ましくは、本発明に係る方法は、ＨＣＶ感染症に罹患している患者を治療するために使用される。そのような治療は、ウイルス感染症を完全に根絶しうるか、またはその重症度を低減させうる。より好ましくは、患者はヒトである。
【００７４】
代替実施形態では、本発明に係る方法は、抗ウイルス剤、好ましくは抗ＨＣＶ剤を前記患者に投与する工程を追加的に含む。そのような抗ウイルス剤としては、免疫調節剤、たとえば、α−、β−、およびγ−インターフェロン、ペグ化誘導体化インターフェロン−α化合物、ならびにチモシン；他の抗ウイルス剤、たとえば、リバビリンおよびアマンタジン；Ｃ型肝炎プロテアーゼの他の阻害剤（ＮＳ２−ＮＳ３阻害剤およびＮＳ３−ＮＳ４Ａ阻害剤）；ＨＣＶの生活環中の他の標的の阻害剤、たとえば、ヘリカーゼ阻害剤およびポリメラーゼ阻害剤；リボソーム内部進入の阻害剤；広域ウイルス阻害剤、たとえば、ＩＭＰＤＨ阻害剤（United States Patent 5,807,876に開示されているＩＭＰＤＨ阻害剤、ミコフェノール酸およびその誘導体）；または以上のいずれかの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７５】
そのような追加の薬剤は、本発明に係る化合物および追加の抗ウイルス剤の両方を含む単一製剤の一部分として前記患者に投与可能である。他の選択肢として、追加の薬剤は、本発明に係る化合物とは別に複数製剤の一部分として投与可能である。この場合、該追加の薬剤は、本発明に係る化合物を含む組成物の前に、それと一緒に、またはその後で、投与可能である。
【００７６】
さらに他の実施形態では、本発明は、患者への投与を目的とした生体物質を前処理する方法を提供する。この方法は、該生体物質を、本発明に係る化合物を含む製薬上許容される組成物に、接触させる工程を含む。そのような生体物質としては、血液およびその成分、たとえば、血漿、血小板、血球の亜集団など；臓器、たとえば、腎臓、肝臓、心臓、肺など；精子および卵子；骨髄およびその成分；ならびに患者に注入される他の流体、たとえば、生理食塩水、デキストロースなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
他の実施形態によれば、本発明は、生活環に必要であるウイルスにコードされたセリンプロテアーゼにより特徴付けられるウイルスに接触する可能性のある材料を処理する方法を提供する。この方法は、該材料を本発明に係る化合物に接触させる工程を含む。そのような材料としては、外科用の器具および衣類（たとえば、衣服、手袋、エプロン、ガウン、マスク、眼鏡、履物など）；実験用の器具および衣類（たとえば、衣服、手袋、エプロン、ガウン、マスク、眼鏡、履物など）；血液採取用の器具および材料；ならびに侵襲的デバイス、たとえば、シャント、ステントなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
他の実施形態では、本発明に係る化合物は、ウイルスにコードされたセリンプロテアーゼの単離を助ける実験ツールとして使用可能である。この方法は、固体担体に結合された本発明に係る化合物を提供する工程と、該固体担体へのプロテアーゼの結合を引き起こす条件下で、該固体担体を、ウイルスのセリンプロテアーゼを含有するサンプルに、接触させる工程と、該固体担体から該セリンプロテアーゼを溶出させる工程と、を含む。好ましくは、この方法により単離されるウイルスのセリンプロテアーゼは、ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼである。
【００７９】
本発明がより十分に理解されるように、以下の調製例および試験例について説明する。これらの実施例は、例示を目的としたものにすぎず、なんら本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例】
【００８０】
以下の実施例は、好ましい実施形態および技術を提示したものであり、限定しようとするものではない。当業者であれば、本開示に照らして、開示されている特定の材料および方法に多くの変更を加えうることかつそれにより本発明の精神および範囲から逸脱することなく同一もしくは類似の結果が得られることはわかるであろう。
【００８１】
実施例１
ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのＨＰＬＣペプチド切断アッセイ
このアッセイは、Landro et al. [Landro J.A. et al., Biochemistry, 36, pp. 9340-9348 (1997)]に報告されたアッセイに変更を加えたものである。遺伝子型１ａ ＨＣＶのＮＳ５Ａ／ＮＳ５Ｂ切断部位に基づく単一のペプチド基質（ＮＳ５ＡＢ）をすべてのプロテアーゼについて使用した。０．２Ｍ ＤＴＴを含有するＤＭＳＯを用いて基質ストック溶液（２５ｍＭ）を調製し、−２０℃で貯蔵した。各遺伝子型に適合した合成ペプチド補因子（ＫＫ４Ａ）をＮＳ４Ａの中心コア領域の代わりに使用した。ペプチド配列は、以下に示される。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ、および２５μＭ ＫＫ４Ａを含有する緩衝液中の２５ｎＭ〜５０ｎＭ ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを用いて、９６ウェルマイクロタイタープレート方式で加水分解反応を行った。最終ＤＭＳＯ濃度は、２％ ｖ／ｖ以下であった。２．５％の最終ＴＦＡ濃度になるように１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加することにより、反応を停止させた。自動注入ならびに２１０ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるダイオードアレイ検出の機能を備えたＡｇｉｌｅｎｔシリーズ１１００装置を使用し、サーモスタット付きカラムチャンバーを用いて４０℃に加熱された逆相マイクロボアＨＰＬＣカラム（Phenomenex Jupiter 5μ C18 300A column, 150×2.0 mm）で基質と産物とを分離することにより、酵素活性を評価した。Ｈ２Ｏ／０．１％ ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＣＨ３ＣＮ／０．１％ ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を使用し、流量は、０．２ｍＬ／ｍｉｎであった。リニアグラジエントを使用した。１２分間で溶媒Ｂを５％から６０％に、次に、１分間で溶媒Ｂを６０％から１００％に変化させ、３分間の定組成条件の後、１分間で溶媒Ｂを５％に変化させ、そして定組成条件で５％溶媒Ｂを用いて１０分間のポストタイムで最終処理を行った。２１０ｎｍで収集されたデータを用いてＳＭＳＹ産物ピーク（典型的には１０分間の保持時間を有する）を分析した。
【表２】
【００８２】
速度論的パラメーターＫｍおよびＶｍａｘを決定するために、ＮＳ５ＡＢ基質を３μＭ〜２００μＭの間で変化させた。産物ピーク面積と反応時間との比から、酵素触媒加水分解の速度を得た。これらの速度ｖｓ基質濃度データ点を非線形回帰によりＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式にあてはめた。装置校正標準として公称プロテアーゼ濃度および完全切断基質ペプチドを用いてＶｍａｘからｋｃａｔの値を決定した。
【表３】
【００８３】
実施例２
ＨＰＬＣペプチド切断アッセイによる効力の決定
見掛けのＫｉ値を評価するために、試験化合物および基質を除くすべての成分を室温で５分間プレインキュベートした。次に、ＤＭＳＯに溶解された試験化合物を混合物に添加し、室温で１５分間インキュベートした。Ｋｍに見合う濃度（７０μＭ〜１１μＭ）でＮＳ５ＡＢペプチドを添加することにより切断反応を開始し、３０℃で１５分間インキュベートした。阻害を調べるために、７〜８つの化合物濃度を用いて酵素活性の力価を測定した。活性ｖｓ阻害剤濃度のデータ点を非線形回帰により競合的強結合酵素阻害を記述するＭｏｒｒｉｓｏｎ式にあてはめた［Sculley, M.J. and Morrison, J.F., Biochim. Biophys. Acta. 874, pp. 44-53 (1986)］。
【表４】
【００８４】
実施例３
ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの蛍光ペプチドアッセイ
Taliani et al. [Taliani M. et al., Anal. Biochem., 240, pp. 60-67 (1997)]に報告されたアッセイに変更を加えて、酵素活性を決定した。基質としてＲＥＴ−Ｓ１蛍光ペプチド（AnaSpec, San Jose, CA）を用いて、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、５ｍＭ ＤＴＴ、および２５μＭ ＫＫ４Ａを含有する緩衝液（緩衝液Ａ）中で、すべての反応を行った。最終ＤＭＳＯ濃度を１〜２％（ｖ／ｖ）に保持した。とくに記載がないかぎり、それぞれ３５５ｎｍおよび４９５ｎｍの励起フィルターおよび発光フィルターを用いて、サーモスタットで３０℃に制御された蛍光マイクロタイタープレートリーダーにより、反応を連続的にモニタリングした。
【００８５】
速度論的パラメーターＫｍおよびＶｍａｘを決定するために、ＲＥＴ−Ｓ１基質を緩衝液Ａ中で６μＭ〜２００μＭの間で変化させ、５ｎＭ〜１０ｎＭ ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼと５〜１０分間反応させた。２５μＬの１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加することにより、反応を停止させた。自動注入ならびに３５０ｎｍ励起および４９０ｎｍ検出による蛍光検出の機能を備えたＡｇｉｌｅｎｔシリーズ１１００装置を使用し、サーモスタット付きカラムチャンバーを用いて４０℃に加熱された逆相マイクロボアＨＰＬＣカラム（Phenomenex Jupiter 5μ C18 300A column, 150×2.0 mm）で基質と産物とを分離することにより、酵素活性を評価した。Ｈ２Ｏ／０．１％ ＴＦＡ（溶媒Ａ）およびＣＨ３ＣＮ／０．１％ ＴＦＡ（溶媒Ｂ）を使用し、流量は、０．２ｍＬ／ｍｉｎであった。リニアグラジエントを使用した。３０分間で溶媒Ｂを５％から１００％に、次に、２分間で溶媒Ｂを１００％から５％に変化させ、そして定組成条件で５％溶媒Ｂを用いて１０分間のポストタイムで最終処理を行った。活性ｖｓ基質濃度データ点を非線形回帰によりＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ式にあてはめた。装置校正標準として公称プロテアーゼ濃度および完全切断基質ペプチドを用いてＶｍａｘからｋｃａｔの値を決定した。
【表５】
【００８６】
実施例４
長時間インキュベーションによる効力の決定
ＶＸ−９５０と共に長時間プレインキュベーションを行った後の残存酵素活性をアッセイすることにより、ＶＸ−９５０およびＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼに対する阻害定数を決定した。緩衝液Ａ中のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのストック溶液を室温で１０分間プレインキュベートし、次に、３０℃に変化させた。１００％ ＤＭＳＯに溶解されたＶＸ−９５０のアリコートを予備加熱された酵素ストック液に時間ゼロで添加した。４μＭ ＲＥＴ−Ｓ１および５ｎＭ〜２０ｎＭ ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの最終濃度になるように緩衝液Ａ中のＲＥＴ−Ｓ１の５μＬアリコートを酵素−阻害剤混合物の９５μＬアリコートに添加することにより、５〜３６０分の範囲内の時間点で反応を開始した。蛍光の変化を１５０秒のウィンドウでモニタリングし、蛍光ｖｓ時間のデータ点の線形回帰に基づいて反応速度を決定した。ニートなＤＭＳＯを含有する反応から対照速度を決定した。阻害を調べるために、７〜８つの化合物濃度を用いて酵素活性の力価を測定した。標準的なロジスティック２パラメーターあてはめを用いて、活性ｖｓ阻害剤濃度のデータからＩＣ５０値を計算した。これらのアッセイ条件下では、長時間インキュベーション後におけるＶＸ−９５０によるＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの阻害に対するＩＣ５０は、強結合酵素／阻害剤複合体に対する阻害定数と等価である。
【表６】
【００８７】
実施例５
プログレス曲線解析に基づく阻害の特徴付け
Narjes et al. [Narjes F. et al., Biochemistry 39, pp. 1849-1861 (2000)]に報告されたプログレス曲線の測定方法に変更を加えて、緩徐な結合阻害の初速度を決定した。緩衝液Ａ中のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのストック溶液を室温で１０分間プレインキュベートし、次に、１０分間で３０℃に変化させた。１００％ ＤＭＳＯに溶解された対象化合物を緩衝液Ａ中のＲＥＴ−Ｓ１の溶液に添加した。次に、化合物および基質を３０℃で１０分間インキュベートした。６〜１２μＭ ＲＥＴ−Ｓ１および０．５ｎＭ〜４ｎＭ ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの最終濃度になるように予備加熱された酵素ストック液のアリコートを化合物−基質混合物に添加することにより、反応を開始した。蛍光の変化を４時間までモニタリングし、蛍光ｖｓ時間のデータ点を非線形回帰により式１にあてはめた［Morrison, J.F. and Walsh, C.T., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 61, pp. 201-301 (1988)］。ニートなＤＭＳＯを含有する反応から対照速度を決定した。
式１： Ｆ（ｔ）＝Ｖｓ×ｔ＋（Ｖｉ−Ｖｓ）×（１−ｅｘｐ（−ｋｏｂｓ×ｔ））／ｋｏｂｓ＋Ｃ
【００８８】
ｋｏｂｓ値ｖｓＶＸ−９５０濃度の再プロットを行って、式２へのあてはめにより強結合酵素／阻害剤複合体の形成の二次速度定数（ｋｏｎ）および強結合酵素／阻害剤複合体の解離の一次速度定数（ｋｏｆｆ）の両方の決定を可能にした。この種に対する阻害定数をｋｏｆｆ／ｋｏｎの比から求めた［Morrison, J.F. and Walsh, C.T., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 61, pp. 201-301 (1988)］。
式２： ｋｏｂｓ＝ｋｏｆｆ＋（ｋｏｎ×［Ｉ］）／（１＋［Ｓ］／Ｋｍ）
【００８９】
【表７】
【００９０】
以上で得られたプログレス曲線を用いて長い反応時間で残存酵素活性を分析することにより、ＶＸ−９５０によるＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの阻害に対する阻害定数を決定した。反応の定常状態時における蛍光ｖｓ時間のデータ点の線形回帰に基づいて反応速度を決定した。活性ｖｓ阻害剤濃度のデータ点を非線形回帰により競合的強結合酵素阻害を記述するＭｏｒｒｉｓｏｎ式にあてはめた［Sculley, M.J. and Morrison, J.F., Biochim. Biophys. Acta. 874, pp. 44-53 (1986)］。
【表８】
【００９１】
実施例６
酵素−阻害剤複合体からの解離速度の測定
緩衝液Ａ中のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのストック溶液を室温で１０分間プレインキュベートし、次に、１０分間で３０℃に変化させた。３３０ｎＭ〜１６００ｎＭ酵素および１．０μＭ〜６．４μＭ阻害剤を生成するように、１００％ ＤＭＳＯに溶解された対象化合物を予備加熱された酵素ストック液に添加した。酵素−阻害剤複合体が平衡に達するように、この溶液を３０℃で長時間インキュベートした。３０℃で酵素−阻害剤混合物を緩衝液Ａ中のＲＥＴ−Ｓ１の溶液中に希釈することにより、反応を開始した。最終濃度は、０．５ｎＭ〜８ｎＭ ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ、１２μＭ ＲＥＴ−Ｓ１、および２ｎＭ〜３２ｎＭ阻害剤であった。蛍光の変化を４時間までモニタリングし、蛍光ｖｓ時間のデータ点を非線形回帰により式２にあてはめた。ニートなＤＭＳＯを含有する反応から対照速度を決定した。式３を用いて強結合ＶＸ−９５０／ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼ複合体の半減期を決定した［Segel, I.H. Biochemical Calculations, 2nd ed., Wiley & Sons: New York, p. 228 (1976)］。
式３： ｔ１／２＝０．６９３／ｋｏｆｆ
【００９２】
【表９】
【００９３】
実施例７
ＨＣＶレプリコン細胞アッセイのプロトコル
Lohmannn et al., Science, 285, pp. 110-113 (1999)の方法に従って細胞を取得した。適切な補助剤と共に１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．２５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＤＭＥＭ（培地Ａ）中に、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）レプリコンを含有する細胞を保持した。
【００９４】
１日目、レプリコン細胞単層をトリプシン：ＥＤＴＡ混合物で処理し、取り出し、次に、１００，０００細胞／ｍｌの最終濃度になるように培地Ａをその中に希釈導入した。１００μｌ中の１０，０００個の細胞を９６ウェル組織培養プレートの各ウェル中にプレーティングし、３７℃の組織培養インキュベーター中で一晩培養した。
【００９５】
２日目、適切な補助剤と共に２％ ＦＢＳ、０．５％ ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ（培地Ｂ）中に化合物（１００％ ＤＭＳＯ中）を逐次希釈導入した。希釈シリーズ全体にわたりＤＭＳＯの最終濃度を０．５％に保持した。
【００９６】
レプリコン細胞単層上の培地を除去し、次に、種々の濃度の化合物を含有する培地Ｂを添加した。化合物をまったく含まない培地Ｂを化合物なしの対照として他のウェルに添加した。
【００９７】
３７℃の組織培養インキュベーター中で培地Ｂ中の化合物または０．５％ ＤＭＳＯと共に細胞を４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーションの終了時、培地を除去し、レプリコン細胞単層をＰＢＳで１回洗浄し、そしてＲＮＡ抽出前、−８０℃で貯蔵した。
【００９８】
処理されたレプリコン細胞単層を有する培養プレートを解凍し、一定量の他のＲＮＡウイルス（たとえば、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ））を各ウェル中の細胞に添加した。ＲＮＡの分解を回避するために、ただちにＲＮＡ抽出試薬（たとえば、ＲＮｅａｓｙキットの試薬）を細胞に添加した。抽出効率および粘稠度を改良するように変更を加え、製造業者の使用説明書に従って全ＲＮＡを抽出した。最後に、ＨＣＶレプリコンＲＮＡを含む全細胞ＲＮＡを溶出させ、さらなる処理まで−８０℃で貯蔵した。
【００９９】
２セットの特異的なプライマーおよびプローブを用いてＴａｑｍａｎリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量アッセイを構成した。一方はＨＣＶ用であり、他方はＢＶＤＶ用であった。同一のＰＣＲウェル中のＨＣＶ ＲＮＡおよびＢＶＤＶ ＲＮＡの両方を定量するために、処理されたＨＣＶレプリコン細胞からの全ＲＮＡ抽出物をＰＣＲ反応系に添加した。各ウェル中のＢＶＤＶ ＲＮＡのレベルに基づいて実験の失敗をマークして排除した。同一のＰＣＲプレート中で実験した標準曲線に基づいて、各ウェル中のＨＣＶ ＲＮＡのレベルを計算した。０％の阻害としてＤＭＳＯ対照すなわち化合物なしの対照を用いて、化合物処理に基づく阻害のパーセントすなわちＨＣＶ ＲＮＡレベルの減少のパーセントを計算した。任意の所与の化合物の力価測定曲線からＩＣ５０（ＨＣＶ ＲＮＡレベルの５０％阻害が観測される濃度）を計算した。
【０１００】
このレプリコンアッセイでＶＸ−９５０が３５４ｎＭのＩＣ５０を有することが判明した。
【０１０１】
実施例８
遺伝子型２ａ、２ｂ、３ａ、または３ｂに対するＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインおよびＮＳ４Ａ補因子ペプチドのコンセンサス配列
多くのＨＣＶ単離株のＮＳ３セリンプロテアーゼドメインおよびＮＳ４Ａ補因子ペプチドをカバーするｃＤＮＡ断片のヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋから入手し、ＤＮＡｓｔａｒソフトウェアを用いてアライメントした。これらの遺伝子型２単離株には、遺伝子型２ａに属する８種（ＧｅｎＢａｎｋ寄託コードＰ２６６６０、ＡＦ１７７０３６、ＡＢ０３１６６３、Ｄ５０４０９、ＡＦ１６９００２、ＡＦ１６９００３、ＡＦ２３８４８１、ＡＦ２３８４８２）および遺伝子型２ｂに属する３種（ＧｅｎＢａｎｋ寄託コードＰ２６６６１、ＡＦ２３８４８６、ＡＢ０３０９０７）が包含される。これらの１１種の遺伝子型２ ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのアミノ酸配列のアライメントを図１に示す。遺伝子型２ａ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのコンセンサスアミノ酸配列およびコンセンサスヌクレオチド配列を図２に示す。これらの遺伝子型３単離株には、遺伝子型３ａに属する４種（ＧｅｎＢａｎｋ寄託コードＡＦ０４６８６６、Ｄ１７７６３、Ｄ２８９１７、Ｘ７６９１８）および遺伝子型３ｂに属する２種（ＧｅｎＢａｎｋ寄託コードＤ４９３７４およびＤ６３８２１）が包含される。これらの６種の遺伝子型３ ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのアミノ酸配列のアライメントを図３に示す。遺伝子型３ａ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのコンセンサスアミノ酸配列およびコンセンサスヌクレオチド配列を図４に示す。最後に、それぞれの遺伝子型または遺伝子サブタイプ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、および３ｂのコンセンサスアミノ酸配列のアライメントを図５に示す。
【０１０２】
プラスミドの構築。遺伝子型２ａまたは２ｂのいくつかの単離株の残基Ａｌａ１〜Ｓｅｒ１８１をコードするＤＮＡ断片のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋから入手し、遺伝子型２ａまたは２ｂ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインに対するコンセンサス配列を同定するためにアラインメントした。遺伝子型３ａまたは３ｂ ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインのコンセンサス配列を同定するために、同じことを遺伝子型３ａまたは３ｂに適用した。E. coli最適コドン使用頻度を用いてオリゴヌクレオチド合成（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によりこれらのコンセンサス配列のｃＤＮＡ断片を形成し、次に、ＰＣＲにより増幅し、そしてＣ末端ヘキサヒスチジンタグを有するＨＣＶタンパク質をE. coliにより発現させるためにｐＢＥＶ１１中にサブクローニングした。可溶性変異体を得るために、ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼのアミノ酸番号１３のＬｅｕをＬｙｓで置き換えた。すべての構築物を配列決定により確認した。
【０１０３】
ＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインの発現および精製。遺伝子型２ａまたは３ａのＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインに対する各発現構築物をＢＬ２１／ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ E. coli細胞（Stratagene）中にトランスフォームした。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが追加されたＢＨＩ培地（Difco Laboratories）中、３７℃において、トランスフォームされたばかりの細胞を６００ｎｍで０．７５の光学濃度になるまで増殖させた。２４℃で４時間にわたり１ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導を行った。細胞ペーストを遠心分離により採取し、タンパク質精製前、−８０℃でフラッシュ凍結した。すべての精製工程を４℃で行った。ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼのそれぞれについて、１００ｇの細胞ペーストを１．５Ｌの緩衝液Ａ［５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール］に溶解させて３０分間攪拌した。Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Microfluidics, Newton, MA）を用いて溶解物をホモジナイズし、続いて、５４，０００×ｇで超遠心分離を４５分間行った。５ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａであらかじめ平衡化された２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ樹脂と共にイミダゾールを５ｍＭの最終濃度になるように上清に添加した。混合物を３時間揺動させ、２０カラム体積の緩衝液Ａ＋５ｍＭのイミダゾールで洗浄した。３００ｍＭのイミダゾールを含有する緩衝液Ａ中にＨＣＶ ＮＳ３タンパク質を溶出させた。溶出液を濃縮し、緩衝液Ａであらかじめ平衡化されたＨｉ−Ｌｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム上に充填した。精製ＨＣＶタンパク質の適切な画分をプールし、−８０℃で貯蔵した。
【０１０４】
実施例９
ＨＣＶ遺伝子型のコンセンサスドメインを決定した後、ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインタンパク質をE. coliにより発現させ、そして所定の均一度になるように精製した。ＫＫ−４Ａペプチド（Landro et al., 1997 Biochemistry）およびＦＲＥＴ基質（Taliani et al., 1997 Anal. Biochem.）を用いてＶＸ−９５０に対する酵素アッセイを行った。定常状態法を用いてＶＸ−９５０のＫｉ＊を決定し、２つの他の方法（長時間インキュベーション法およびプログレス曲線法）により確認した。
【０１０５】
コンセンサスドメインが単離されたので、ＨＣＶ−２と比較してＨＣＶ−１のドメインへのＶＸ−９５０の結合特性を決定することが可能になった。本発明者らは、ＶＸ−９５０が当業者により報告された他の阻害剤よりも数倍良好な活性を有することを明らかにした。本発明者らにより得られたデータから、ＮＳ３−４ＡセリンプロテアーゼへのＶＸ−９５０の結合は、可逆的、共有結合的、競合的、強固、かつ緩徐な結合であることが明らかである。したがって、この薬剤は、現在開発段階にある他の薬剤とは異なる阻害作用機序を有する。たとえば、他の薬剤は、プロテアーゼに結合することが観測されてはいるが、その結合は、可逆的、非共有結合的、競合的、かつ強固なものであった。より重要な点として、遺伝子型１の結合部位には残基７８〜８０にＶａｌ−Ａｓｐ−Ｇｌｎおよびアミノ酸５６が存在し、一方、遺伝子型２ではＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙが存在することが確認された。それらの残基のアミノ酸にこうした差異があることは、ＨＣＶ遺伝子型２のセリンプロテアーゼ中に存在するループの配座安定性がＨＣＶ遺伝子型１のループの安定性と比較して低いことを意味する。配座安定性が低下するといくつかの阻害剤の結合は減少するが、こうして配座安定性が低下してもＶＸ−９５０の結合はほとんど影響を受けないと予想されるので、この阻害剤は、遺伝子型２ ＨＣＶのセリンプロテアーゼに対するより強力な阻害剤になる。遺伝子型１ ＨＣＶ中に存在するＡｓｐ１６８がＧｌｎで置き換えられた遺伝子型３ ＨＣＶをに関しても、類似の結果が観測された。
【０１０６】
本発明のいくつかの実施形態について説明してきたが、本発明に係る化合物および方法を利用する他の実施形態を行うようにこれらの基本的実施例に変更を加えることが可能である。したがって、本発明の範囲は、以上に例として示された特定の実施形態により規定されるのではなく、添付の特許請求の範囲により規定されなければならないことはわかるであろう。引用文献はすべて、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子型２ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害する方法であって、該プロテアーゼを該プロテアーゼの活性を阻害するのに有効な量のＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩に接触させることを含む、上記方法。
【請求項２】
ＨＣＶ遺伝子型３ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害する方法であって、該プロテアーゼを該プロテアーゼの活性を阻害するのに有効な量のＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩に接触させることを含む、上記方法。
【請求項３】
患者においてＨＣＶ遺伝子型２感染症を治療する方法であって、該患者にＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、上記方法。
【請求項４】
患者においてＨＣＶ遺伝子型３感染症を治療する方法であって、該患者にＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、上記方法。
【請求項５】
免疫調節剤；シトクロムｐ４５阻害剤、抗ウイルス剤；ＨＣＶプロテアーゼの第２の阻害剤；ＨＣＶの生活環中の他の標的の阻害剤；またはそれらの組合せ；から選択される追加の薬剤を前記患者に投与する追加の工程を含み、該追加の薬剤が、ＶＸ−９５０と同一の製剤の一部分としてまたは個別の製剤として前記患者に投与される、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫調節剤が、α−、β−、もしくはγ−インターフェロン、またはチモシンであるか；前記抗ウイルス剤が、リババリン、アマンタジン、またはテルビブジンであるか；あるいはＨＣＶの生活環中の他の標的の前記阻害剤が、ＨＣＶヘリカーゼ、ＨＣＶポリメラーゼ、またはＨＣＶメタロプロテアーゼの阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記シトクロムＰ−４５０阻害剤がリトナビルである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記追加の薬剤がＶＸ−４９７である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記追加の薬剤がインターフェロンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的サンプルまたは医療機器もしくは実験機器のＨＣＶ遺伝子型２汚染またはＨＣＶ遺伝子型３汚染を排除または低減する方法であって、該生物学的サンプルまたは該医療機器もしくは該実験機器をＶＸ−９５０に接触させる工程を含む、上記方法。
【請求項１１】
前記サンプルまたは前記機器が、体液、生物学的組織、外科用器具、外科用衣類、実験用器具、実験用衣類、血液もしくは他の体液の採取装置；血液もしくは他の体液の貯蔵材料；から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記体液が血液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＣＶ遺伝子型２ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害する組成物であって、ｉ）ＨＣＶ遺伝子型２ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害するのに有効な量のＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩と；ｉｉ）許容しうる担体、アジュバント、または媒体と；を含む、上記組成物。
【請求項１４】
ＨＣＶ遺伝子型３ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害する組成物であって、ｉ）ＨＣＶ遺伝子型３ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害するのに有効な量のＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩と；ｉｉ）担体、アジュバント、または媒体と；を含む、上記組成物。
【請求項１５】
前記組成物が患者への投与に供すべく製剤化されている、請求項１３または請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記担体、前記アジュバント、または前記媒体が、製薬上許容される担体、アジュバント、または媒体である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、免疫調節剤；シトクロムｐ４５０阻害剤、抗ウイルス剤；ＨＣＶプロテアーゼの第２の阻害剤；ＨＣＶの生活環中の他の標的の阻害剤；シトクロムＰ−４５０阻害剤；またはそれらの組合せ；から選択される追加の薬剤を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫調節剤が、α−、β−、もしくはγ−インターフェロン、またはチモシンであるか；前記抗ウイルス剤が、リバビリン、アマンタジン、またはテルビブジンであるか；あるいはＨＣＶの生活環中の他の標的の前記阻害剤が、ＨＣＶヘリカーゼ、ＨＣＶポリメラーゼ、またはＨＣＶメタロプロテアーゼの阻害剤である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記シトクロムＰ−４５０阻害剤がリトナビルである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記追加の薬剤がＶＸ−４９７である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記追加の薬剤がインターフェロンである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）遺伝子型２ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害する方法であって、該プロテアーゼを該プロテアーゼの活性を阻害するのに有効な量のＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩に接触させることを含む、上記方法。
【請求項２】
ＨＣＶ遺伝子型３ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害する方法であって、該プロテアーゼを該プロテアーゼの活性を阻害するのに有効な量のＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩に接触させることを含む、上記方法。
【請求項３】
患者においてＨＣＶ遺伝子型２感染症を治療する方法であって、該患者にＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、上記方法。
【請求項４】
患者においてＨＣＶ遺伝子型３感染症を治療する方法であって、該患者にＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩を投与することを含む、上記方法。
【請求項５】
免疫調節剤；シトクロムｐ４５阻害剤、抗ウイルス剤；ＨＣＶプロテアーゼの第２の阻害剤；ＨＣＶの生活環中の他の標的の阻害剤；またはそれらの組合せ；から選択される追加の薬剤を前記患者に投与する追加の工程を含み、該追加の薬剤が、ＶＸ−９５０と同一の製剤の一部分としてまたは個別の製剤として前記患者に投与される、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫調節剤が、α−、β−、もしくはγ−インターフェロン、またはチモシンであるか；前記抗ウイルス剤が、リババリン、アマンタジン、またはテルビブジンであるか；あるいはＨＣＶの生活環中の他の標的の前記阻害剤が、ＨＣＶヘリカーゼ、ＨＣＶポリメラーゼ、またはＨＣＶメタロプロテアーゼの阻害剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記シトクロムＰ−４５０阻害剤がリトナビルである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記追加の薬剤がＶＸ−４９７である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記追加の薬剤がインターフェロンである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的サンプルまたは医療機器もしくは実験機器のＨＣＶ遺伝子型２汚染またはＨＣＶ遺伝子型３汚染を排除または低減する方法であって、該生物学的サンプルまたは該医療機器もしくは該実験機器をＶＸ−９５０に接触させる工程を含む、上記方法。
【請求項１１】
前記サンプルまたは前記機器が、体液、生物学的組織、外科用器具、外科用衣類、実験用器具、実験用衣類、血液もしくは他の体液の採取装置；血液もしくは他の体液の貯蔵材料；から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記体液が血液である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＨＣＶ遺伝子型２ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害する組成物であって、ｉ）ＨＣＶ遺伝子型２ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害するのに有効な量のＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩と；ｉｉ）許容しうる担体、アジュバント、または媒体と；を含む、上記組成物。
【請求項１４】
ＨＣＶ遺伝子型３ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害する組成物であって、ｉ）ＨＣＶ遺伝子型３ ＮＳ３−ＮＳ４Ａプロテアーゼを阻害するのに有効な量のＶＸ−９５０またはその製薬上許容される塩と；ｉｉ）担体、アジュバント、または媒体と；を含む、上記組成物。
【請求項１５】
前記組成物が患者への投与に供すべく製剤化されている、請求項１３または請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記担体、前記アジュバント、または前記媒体が、製薬上許容される担体、アジュバント、または媒体である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、免疫調節剤；シトクロムｐ４５０阻害剤、抗ウイルス剤；ＨＣＶプロテアーゼの第２の阻害剤；ＨＣＶの生活環中の他の標的の阻害剤；シトクロムＰ−４５０阻害剤；またはそれらの組合せ；から選択される追加の薬剤を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫調節剤が、α−、β−、もしくはγ−インターフェロン、またはチモシンであるか；前記抗ウイルス剤が、リバビリン、アマンタジン、またはテルビブジンであるか；あるいはＨＣＶの生活環中の他の標的の前記阻害剤が、ＨＣＶヘリカーゼ、ＨＣＶポリメラーゼ、またはＨＣＶメタロプロテアーゼの阻害剤である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記シトクロムＰ−４５０阻害剤がリトナビルである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記追加の薬剤がＶＸ−４９７である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記追加の薬剤がインターフェロンである、請求項１７に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−１０２０９８（Ｐ２０１２−１０２０９８Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４６０３４（Ｐ２０１１−２４６０３４）
【出願日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【分割の表示】特願２００７−５３４７９８（Ｐ２００７−５３４７９８）の分割
【原出願日】平成１７年９月３０日（２００５．９．３０）
【出願人】（５９８０３２１０６）バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (414)
【氏名又は名称原語表記】ＶＥＲＴＥＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】１３０ Ｗａｖｅｒｌｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３９−４２４２， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１１月１０日（２０１１．１１．１０）
【分割の表示】特願２００７−５３４７９８（Ｐ２００７−５３４７９８）の分割
【原出願日】平成１７年９月３０日（２００５．９．３０）
【出願人】（５９８０３２１０６）バーテックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (414)
【氏名又は名称原語表記】ＶＥＲＴＥＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】１３０ Ｗａｖｅｒｌｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３９−４２４２， Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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