Ｌ−ドーパ誘発性運動障害、運動異常、薬物嗜癖、疼痛および白内障の処置用薬剤の調製のためのキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤の使用
Ｌ−ドーパ誘発性運動障害、運動異常、薬物嗜癖、疼痛および白内障の処置用薬剤の調製のためのキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−ドーパ誘発性運動障害、運動異常、薬物嗜癖、疼痛および白内障の処置用薬剤の調製のためのキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤の使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
キヌレニン経路は、Ｌ−トリプトファン代謝の主要ルートである。この経路は、神経毒性酸化活性を有する化合物およびグルタミン酸受容体での活性を調節できる化合物を生成する。この経路は末梢および脳の両方に存在する。この経路の主生成物はキノリン酸（ＱＵＩＮ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、およびフリーラジカルを生成する３−ヒドロキシキヌレニン（３ＯＨ−Ｋｙｎ）である。ＱＵＩＮは、ＮＭＤＡレセプターを活性化し、発作を誘発し、かつ興奮毒性病変を作ることが示されている。ＫＹＮＡは、高濃度（μＭ域）でＮＭＤＡレセプター複合体のグリシン部位と拮抗し、ｍＭ濃度でＡＭＰＡおよびカイニン酸レセプターを拮抗し、かつ神経保護作用を有する（Schwarcz and Pellicciari, 2002, JPET 303:1-10）。
【０００３】
例えば、Gomez-Mancilla B.ら: Clinical Pharmacol. 16(5), 1999-10, 1999は、ＮＭＤＡアンタゴニスト（ＭＫ−８０１）がＭＴＰＰで処置されたサルにおいて、Ｌ−ドーパ誘発性運動異常を軽減したことを開示している。しかし、ＫＹＮＡが、高用量（μＭおよびｍＭ範囲）でのみＮＭＤＡおよびＡＭＰＡレセプターの拮抗剤として作用することに注目すべきである。他方、さらに低濃度（３０〜１００ｎＭ）のＫＹＮＡは、Carpenedoら（Eur. J. Neurosci. 2001）によって示されたようにイオンチャネル型または代謝型のどちらのＧＬＵレセプターの機能も調節せずにグルタミン酸の放出を強く阻害する。したがって、Ｋｙｎ−３−ＯＨアーゼ阻害剤の治療作用の原因を、異なる新規な抗グルタミン酸作動メカニズムとすることができる。ＫＹＮＡがＮＭＤＡ拮抗剤として作用するだけでなく、新規で予想外のメカニズムが関与している薬物嗜癖についても同じことがあてはまる。Rasmussen K他、Psychopharmacology他、105 (4), 1991, 508-512およびTruyllo K.A., ibidem, 2000, 51(2-3), 121-141は、モルヒネ離脱または疼痛の処置におけるＫＹＮＡの使用を単に示唆しているが、Ｋｙｎ−３−ＯＨアーゼの可能性のある処置的使用を支持する説得力のある実験データはこの論文のどこにも示されていない。
【０００４】
キヌレニン３−ヒドロキシラーゼ（Ｋｙｎ−３−ＯＨアーゼ）はキヌレニン経路の主要酵素であり、その阻害はＱＵＩＮおよび３ＯＨ−Ｋｙｎレベルの減少ならびにＫＹＮＡレベルの増加を引き起こす。
【０００５】
キヌレニン３−ヒドロキシラーゼ阻害剤は、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）によって起こる痴呆、梗塞性痴呆、脳虚血、脳低酸素症、パーキンソン病、てんかん、頭および脊髄の傷害、筋萎縮性側索硬化症、緑内障網膜症、脳の感染症または脳の炎症のような神経変性疾患の処置のための処置剤として提案されてきた。
【０００６】
キヌレン酸の可能性のある役割は、Kekesi G.ら、Eur. J. Pharmacol., 2002, 445 (1-2) ９３−９６およびHeyliger S.O.ら、Pharmacol. Res. 1998, 38(4) 243-250によっても示唆されたが、これら２つの論文のいずれもＫｙｎ−３−ＯＨアーゼ阻害剤が動物モデルにおいて有効であるという実際の根拠を提供していない。
【０００７】
ＲＯ−６１８０４８化合物は、Ｋｙｎ−３ＯＨアーゼの阻害剤である（Roverら、1997, J. Med. Chem 40:4378-4385）。他のキヌレニン３−ヒドロキシラーゼ阻害剤がとりわけＵＳ６３２３２４０、ＷＯ９８／４０３４４、ＷＯ９８／０９９３８、ＥＰ８１９６８１、ＷＯ９９／６３７５、ＷＯ９９／２８３０９、ＷＯ９９／２８３１６、ＷＯ９９／６３７５、ＷＯ９８／３４６９、ＷＯ９５／３２７１に開示されている。
【０００８】
［発明の説明］
キヌレニン３−ヒドロキシラーゼ阻害剤が、長期Ｌ−ドーパ処置、薬物嗜癖、疼痛に関連する運動不全および白内障の処置のための処置剤として有用であることが発見された。
【０００９】
キヌレニン３−ヒドロキシラーゼ阻害剤の活性は、以下に報告するように適切な動物モデルおよび実験証拠によって示された。
【００１０】
長期Ｌ−ドーパ処置に関連する運動障害
ＰＤにおける運動障害の最も広く使用されている処置は、ドーパミン前駆体であるレボドーパ（Ｌ−ドーパ）を用いた代替療法である。しかし、Ｌ−ドーパを用いた長期処置は、Ｌ−ドーパの作用の脱感作（ウェアリングオフ現象（wearing-off phenomenon））ならびに運動応答合併症（遅発性運動合併症ＬＭＣ）および運動異常の発生を伴う。
【００１１】
一般に使用されるＰＤのモデルである６−ＯＨＤＡ病変ラットにおいて、Ｌ−ドーパに対する運動応答は、長期処置後に減少する。この作用は、Ｌ−ドーパで長期処置中のパーキンソン病患者において観察される「ウェアリングオフ」現象を模倣している（Boldryら、Brain Res 1995 Sep 18; 692: 259-64）。
【００１２】
このラットモデルにおいて、本発明者らは、Ｒｏ−６１８０４８（４０mg/kg、ｉｐ）および２−（３，４−ジクロロベンゾイル）シクロプロパンカルボン酸（ＵＰＦ−６４８、５０mg/kg、ｉｐ）が長期Ｌ−ドーパ（２８日間の処置、２５mg/kg/日、ｉｐ）に対する回転応答に及ぼす作用をＭＫ−８０１（０．１mg/kg、ｉｐ）と比較して評価した。
【００１３】
方法
６−ヒドロキシドーパミンにより誘発される病変
左内側前脳束（ＭＦＢ）に６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ−ＨＢｒ）を注射することによって黒質線条体経路の片側病変を作製した。ペントバルビタールナトリウム（４５mg/kg ｉｐ）麻酔下の雄性ウィスターラット（２５０〜２７５ｇ）を定位フレーム（David Kopf inst.）に配置した。頭蓋に穴を空け、以下の座標で注射用カニューレを留置できるようにした：ラムダの４．０mm前方、正中線の１．３mm左、および頭蓋表面から８．４mm下側。６−ＯＨＤＡ−ＨＢｒを０．０２％アスコルビン酸生理食塩水（８ｇ/４ｌ）に溶かし、ハミルトンシリンジで０．５μl／分の流速で８分間（総体積４．０μl）注入した。この処置の後に動物をホームケージに３週間戻し、その後行動試験を行った。
【００１４】
回転行動の測定
回転行動を測定するために、ラットを円筒型ケージに入れ、自動回転数計につないだ。それぞれ５分間に全回転した回数をコンピュータで記録した。６−ＯＨＤＡの注射の３週間後にアポモルヒネ（０．０５mg/kg sc）に対する動物の応答を測定することによって回転行動についてスクリーニングした。１００回以上の回転応答を示した動物のみを使用した。
【００１５】
処理
Ｌ−ドーパメチルエステル（５０mg/kg）および末梢デカルボキシラーゼ阻害剤であるベンセラジド（１２．５mg/kg）の組み合わせまたは生理食塩水のいずれかを１日２回、８：００および１６：００に、２８日間連続してラットに腹腔内注射した。処理の開始時（Ｌ−ドーパ第１日）および処理の終了時（Ｌ−ドーパ第２８日）、ならびにラットに薬物（Ｒｏ−６１８０４８、ＭＫ８０１）も投与した翌日に回転をスクリーニングした。各群８匹のラットを使用した。回転速度がその最終的な平均値の半分に達した最初の５分間の区間と、速度が減少し再びその平均値の半分に達した最初の区間との間の時間まで応答の持続時間を測定した。
【００１６】
統計解析
分散分析の後に事後比較についてのダンカンの新しい多重検定を行ってデータを解析した。
【００１７】
結果
４週間の処理の過程でＬ−ドーパに対する回転応答は徐々に短くなり、１日目に測定した回転に比べてＬ−ドーパ処理の２８日目には２０％（ｐ＜０．０５）減少した。
【００１８】
Ｌ−ドーパに対するこの応答の減少は、Ｒｏ−６１８０４８の急性同時投与（４０mg/kg ｉｐ）によって２９日目に逆転した。この作用は図１に示すように、ＭＫ８０１（０．１mg/kg ｉｐ）で得られた作用と類似している。図１で棒線は平均値±ＳＥＭ、ｎ＝ラットの数。＊および＄はそれぞれ１日目および２８日目でのＬ−ドーパ処理に比べてＰ＜０．０５で有意であることを示す。化合物ＵＰＦ−６４８（５０mg/kg ｉｐ）を用いて同様の結果を得た。
【００１９】
これらの結果は、キヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤ＲＯ−６１８０４８およびＵＰＦ−６４８が、長期Ｌ−ドーパに対する応答の減少を逆転できることを示している。これらのデータは、キヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を、ＰＤ患者および運動異常における長期Ｌ−ドーパに関連する運動障害の処置に使用しうることを示している。
【００２０】
パーキンソン病サルにおいてＬ−ドーパ誘発性運動異常モデルに及ぼすＫｙｎ−３ＯＨアーゼ阻害剤の作用
実験プロトコール
動物
ＭＰＴＰで処理され、安定したパーキンソン症候群およびＬ−ドーパに対する再現性運動異常を有する雌性カニクイザル（macaca fascicularis）（体重２．９〜５．０kg）５〜６匹を用いて実験を行った。国立衛生研究所による実験動物のケアおよび使用に関する指針（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）に従って動物を取り扱い、すべての処置は、ラバル大学の研究所内動物実験委員会で承認されたものであった。動物を観察ケージに別々に入れ、２３±１℃に温度調節した室内で１２時間の明暗サイクル（午前６時〜午後６時に点灯）に曝した。１日１回午後、動物にペレットおよび果物を給餌し、水を自由に飲ませた。
【００２１】
実験処理
ＲＯ−６１８０４８を単独およびＬ−ドーパと同時に投与した。
特に、
Ａ）３日間連続して、増加する用量１０、３０、１００mg/kgでＲＯ−６１８０４８単独を投与し、処理前後に投与された賦形剤と比較した。
Ｂ）３日間連続して、増加する用量１０、３０、１００mg/kgでＲＯ−６１８０４８をＬ−ドーパ／ベンセラジドと同時に与え、同じく３日間連続して与えられたＬ−ドーパと比較した。処理の合間に準備刺激を維持するために動物にＬ−ドーパ／ベンセラジド（１００／２５mg、Prolopa）の経口処理を受けさせた。
【００２２】
化合物
増加する用量１０、３０、１００mg/kgのＲＯ−６１８０４８を０．１％（v/v）トウィーン８０／滅菌水に懸濁し、ガラス製ホモジナイザで均質化し、均質懸濁液として投与されるまで一晩混合した。増加する各用量で経口強制投与（p.o）によって投与される薬物懸濁液の最大体積はそれぞれ１０、２０および４０mlであった。対照として、０．１％（v/v）トウィーン８０／滅菌水懸濁液をp.o.（２ml/kg）投与した。Ｌ−ドーパメチルエステル（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）を常にベンセラジド５０mg（ホフマンラロシュ、モントリオール、ケベック州）と共に（各動物についての閾値濃度に基づいて）２５から３０mg/kgの範囲の用量で０．９％滅菌生理食塩水１mlに溶かし、単独またはＲＯ−６１８０４８と組み合わせてs.c.投与した。
【００２３】
運動異常のレーティング
いくつかの発表済みの研究で我々が使用した尺度によって、振幅、正常な運動活動の妨害および異常運動の頻度の評価に基いて、顔面、頚部、体幹、腕および脚について運動異常の重症度を以下のようにレーティングした：異常なし＝Ｏ、軽度＝１、中度＝２、重度＝３。得られた運動異常スコアは、身体部分のすべてについてのスコアの合計であり、最大スコアは２１点であった。３時間または薬物作用の総持続時間に得られたすべてのスコアの平均として各動物についての平均運動異常スコアを計算した。
【００２４】
統計解析
３時間または所与の薬物の作用の総持続時間に各サルについて得られた平均パーキンソンスコアおよび平均運動異常スコアをノンパラメトリックのフリードマン検定後にフリードマン順位和（Friedman rank sum）に基づく多重比較を用いて解析した。すべてのサルについてのこれらのデータを、繰り返し測定のある分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後にフィッシャーの最小有意差確率（ＰＬＳＤ）を用いて比較した。
【００２５】
結果
結果を図２に示す。
Ａ）増加する用量１０、３０、１００mg/kgでＲＯ−６１８０４８を単独投与しても賦形剤投与に比べてパーキンソンスコアおよび歩行活動は全く作用を受けなかった（ＲＯ−６１８０４８で処理前後）。
Ｂ）増加する用量のＲＯ−６１８０４８をＬ−ドーパ／ベンセラジド（２５〜３０mg/kg）と共に３日間連続して同時投与すると、Ｌ−ドーパに対する運動異常応答が３０および１００mg/kgのＲＯ−６１８０４８について約２０％有意に減少した（図２）。
【００２６】
結論
Ｌ−ドーパによって誘発される運動異常に及ぼすＲＯ−６１８０４８の即時作用に関する本研究の結果は、Ｌ−ドーパによって誘発されるパーキンソン症候群の改善に何らマイナス作用を有さずに運動異常が低減することを表している。
【００２７】
薬物嗜癖
薬物嗜癖は、強迫的な薬物探求と摂取を特徴とする病的行動である（Koobら、1998, Neuron 21, 467-476）。連続する薬物使用は、動機づけに関与する神経回路に遅延性の機能変化を引き起こし、それによって依存、薬物切望、および再発に至りうると考えられている（Koobら、1998, Neuron 21, 467-476）。これらの行動変化の一動物モデルは、げっ歯動物における精神刺激薬の繰り返し投与によって誘発される歩行活動の長期持続性の増加であり、これは薬物誘発性行動感作として知られている（Robinson and Berridge, 1993, Brain Res Rev 18, 247〜91 1993）。
【００２８】
本発明者らは、ラットにおけるコカイン誘発性行動感作のモデルを使ってＲｏ−６１８０４８（４０mg/kg、ｉｐ）および２−（３，４−ジクロロベンゾイル）−シクロプロパンカルボン酸（ＵＰＦ−６４８、５０mg/kg、ｉｐ）の作用を評価した。結果から、Ｒｏ−６１８０４８およびＵＰＦ−６４８が、コカインに対する行動感作の誘発を防止することが実証された。
【００２９】
方法
歩行活動用装置
到着時に体重２００〜２５０ｇの雄性ウィスターラット（Charles River, Kingston, NY）を使用した。それぞれ寸法３６cm（Ｌ）×２５cm（Ｗ）×２０cm（Ｈ）の同型の金属線製つり下げ型ケージ１６個で歩行活動を測定した。格子状の床の上部１cmに長軸に沿って位置し、ケージの前部および後部から８ｃｍ離れて位置する２セットの赤外投光受光光電池を各ケージは有していた。バックグラウンド雑音を白色雑音発生器によって供給した。ケージ内の運動によって光電池への割り込みが生じ、これをＩＢＭ互換性コンピュータで自動記録した。
【００３０】
感作法および処理
実験前に２〜３日間連続して歩行活動用チャンバーに動物を慣れさせた。コカイン（１５mg/kg）または生理食塩水と、Ｋｙｎ−３ＯＨアーゼ阻害剤であるＲｏ−６１８０４８（４０mg/kg ｉｐ）またはその賦形剤のいずれかとのＩＰ注射をラットに５日間行い、歩行活動を３時間記録した。コカインまたは生理食塩水を最後に注射した１０日後（１５日目）に、Ｒｏ−６１８０４８が存在しない状態でコカイン１５mg/kgで動物を攻撃誘発し、歩行活動をもう一度３時間監視した。
【００３１】
統計解析
４つの実験群（すなわち生理食塩水／賦形剤、生理食塩水／Ｒｏ−６１８０４８、コカイン／賦形剤およびコカイン／Ｒｏ−６１８０４８）および２つの時点（１日目および５日目）を含む一因子について反復測定のある二元配置ＡＮＯＶＡを用い、その後に単純効果分析を用いてデータ（３時間に生じた光の遮断の総数）を分析した。１日目および攻撃誘発日を比較するために一因子について繰り返し測定のある２番目の二元配置ＡＮＯＶＡを使用し、その後にニューマン・クールスのポストホック検定を行った。
【００３２】
結果
コカインでの５日目の処理までに、賦形剤をＩＰ前処理された動物は、歩行反応の増加を示した（１日目に比べ２０％の増加、ｐ＜０．０５）、逆にＲｏ−６１８０４８（４０mg/kg ＩＰ）で前処理されたラットは有意な増加を全く示さなかった。コカインまたは生理食塩水の最終注射の１０日後に、Ｒｏ−６１８０４８が存在しない状態で１５mg/kgのコカインで動物を攻撃誘発し、歩行活動をもう一度３時間監視した。予想どおり、コカインで予め処理され、Ｒｏ−６１８０４８を投与されていなかったラットは、コカインに応答して歩行活動の増加を示した（１日目に比べ３０％の増加、ｐ＜０．０５）が、５日間のコカイン処理の間にＲｏ−６１８０４８で前処理されたラットは増加を示さなかった。ＵＰＦ−６４８（５０mg/kg ｉｐ）でも同様の結果を得た。
【００３３】
これらのデータは、Ｒｏ−６１８０４８およびＵＰＦ−６４８がコカインに対する歩行感作の進展を防止することを示している。したがって、キヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤は、薬物乱用による嗜癖および依存の処置に使用されうる。
【００３４】
疼痛
急性および慢性疼痛は、有害刺激による侵害受容経路の活性化と共に始まり、その活性化を開始する。両方のタイプの疼痛は、傷害を受けた組織を行動および反射の面から防御するように誘導することによって生存機能の役目を果たす。しかし、慢性疼痛は傷害を受けた組織から自立し身体を無能にする場合がある。実際に、末梢または中枢神経系（ＣＮＳ）に対する長期組織損傷または傷害に関連する慢性の神経障害性疼痛は、侵害受容経路で様々なレベルで起こる多数の複雑な変化の結果である。特に、傷害を受けた組織の炎症または神経傷害後に、Ｃ侵害受容線維からの持続性入力が中枢侵害受容経路に過興奮状態を作り出し、結果として痛覚過敏、異痛、および自発痛をもたらす（Price, 1996 Pain; 68: 1-3）。
【００３５】
トリプトファンおよびその代謝物のいくつかが動物モデルにおいて鎮痛性を有することが示された（Heyligerら、1998 Pharmacol Res 38: 243-50）。
【００３６】
本発明者らは、炎症および神経障害痛の動物モデル（マウスにおけるホルマリン試験）ならびに急性疼痛試験（ラットにおけるテールフリック法）を用いてＲｏ−６１８０４８（４０mg/kg、ｉｐ）および２−（３，４−ジクロロベンゾイル）シクロプロパンカルボン酸（ＵＰＦ−６４８、５０mg/kg、ｉｐ）の鎮痛活性を評価した。
【００３７】
方法
動物
試験時に体重１７５〜２００ｇの成雄性ウィスターラットおよび体重２２〜２５ｇのＣｒ１：ＣＤ−１マウスを使用した（Harlan-Nossan, Italy）。
【００３８】
マウスホルマリン試験
マウスを用いたホルマリン試験は、ヒトにおける神経原性炎症および持続痛（Shibataら、1989, Pain 38: 347-352）ならびに傷害後の疼痛のいくつかの特徴（Dallelら、1995, Pain. 61:11-16）をモデル化するために使用されている方法である。
【００３９】
Roslandら（1990, Pain 42: 235-242）の修正プロトコールによれば、マウス左後足底表面から２．７％ホルマリン溶液２０μlを皮下（s.c.）注射し、すぐに透明なＰＶＣ観察チャンバー（２３×１２×１３cm）に入れた。注射を受けた足の累積リッキング時間（秒）を測定することによって疼痛行動を定量した。ホルマリン注射後の初期（０〜５分）および後期（３０〜４０分）に測定を行った（Tjolsenら、1992, Pain 51: 5-17）。ホルマリン注射の１５分前に、各用量あたりマウス１０匹の群に２ml/kg体重の体積で４０mg/kgのＲｏ−６１８０４８をｉｐ投与した。対照群を賦形剤で処置した。
【００４０】
テールフリック試験
テールフリック試験は、熱に対する尾の反応を誘発するのに必要な潜時として定義される熱侵害受容の閾値を測定するものである。この試験は、D'AmourおよびSmith（1941, J. Pharmacol. Exp. Ther. 72:74-79）によって記載された方法にしたがって鎮痛効果測定装置（U. Basile, Italy）を用いて実施した。薬物（Ｒｏ−６１８０４８ ４０mg/kg）または賦形剤でラットをｉｐ処理し、その９０分後に各動物を台に乗せ、尾の先端から約３ｃｍの場所にビームの焦点を合わせて放射熱に曝した。対照ラットに３〜５秒の反応潜時をもたらすようにビーム光強度を調整した。熱侵害受容の閾値を尾の反応を誘発するのに必要な潜時として定義した。２０秒のカットオフを採用して組織の損傷を防止した。
【００４１】
データ解析と統計
マウスホルマリン試験。各用量群あたり８〜１０匹の動物の平均±ＳＥＭとしてデータを表す。分散分析後にダンネットのｔ検定を行ってデータを評価した。
【００４２】
ホルマリン注射後の初期（０〜５分）および後期（３０〜４０分）に注射を受けた足の累積リッキング時間（秒）を記録した。
【００４３】
テールフリック試験。熱刺激の開始と尾のフリックとの間の時間（秒）として潜時を定義した。分散分析後にダンネットのｔ検定を行ってデータを評価した。
【００４４】
結果
マウスホルマリン試験における作用：Ｒｏ−６１８０４８は、用量４０mg/kgで初期の累積リッキング時間を有意に低減した。累積リッキング時間は１０６±４．３９秒（対照群）から７５±５．５秒（ｐ＜０．０５）に減少した。
【００４５】
後期において、Ｒｏ−６１８０４８は累積リッキング時間の用量依存的な有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．０５）。累積リッキング時間は、対照群の１２３±１２．８秒から６８±１４．３秒に減少した。ＵＰＦ−６４８（５０mg/kg ｉｐ）でも同様の結果を得た。
【００４６】
テールフリック試験における作用：２つの群のラットに賦形剤またはＲｏ−６１８０４８（４０mg/kg）をｉｐ投与した。対照群では熱侵害刺激に対するテールフリック応答の潜時は３．９±０．４秒であった。処置群では潜時は投与後９０分で有意に異なった（６．１±０．４秒）。ＵＰＦ−６４８（５０mg/kg ｉｐ）でも同様の結果を得た。
【００４７】
本発明者らの結果は、使用したモデルにおいて、Ｒｏ−６１８０４８およびＵＰＦ−６４８が、抗侵害受容作用を有することを示している。これらのデータは、Ｋｙｎ ３ＯＨアーゼ阻害剤の使用が、ヒトにおける急性痛、炎症痛、神経障害痛および慢性痛の処置に有益でありうることを示している。
【００４８】
白内障
哺乳動物のレンズは、「キヌレニン代謝経路」に沿って形成されるトリプトファン（ＴＲＰ）代謝物の１つである高濃度の３−ヒドロキシキヌレニン（３ＯＨ−Ｋｙｎ）を含む。ＴＲＰから３ＯＨ−Ｋｙｎへの合成には２つの酵素が必要である。第１の酵素は、ＴＲＰをキヌレニンに代謝できるインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）である。第２の酵素は、キヌレニンを３ＯＨ−Ｋｙｎに代謝するキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ（Ｋｙｎ−３−ＯＨアーゼ）である。これらの両方が虹彩／毛様体に高度に発現し、虹彩／毛様体では有意な量の３ＯＨ−Ｋｙｎが合成されている（Chiarugiら、1999）。しかし、この論文は、白内障発生性ではない眼から抽出された酵素を用いて実施された試験が開示され、治療的処理の実際の活性を予測すると現実にみなすことができる唯一のモデルである白内障発生レンズではインビボ実験もインビトロ実験のどちらも全く実施されていないと記載している。
【００４９】
新たに形成した３ＯＨ−Ｋｙｎが、次に房水に連続的に放出されレンズに能動的に取り込まれ、そのレンズでＵＶフィルター化合物の合成に使用されうると提案されている。３ＯＨ−Ｋｙｎ自体、そのグリコシド誘導体、および３ＯＨ−Ｋｙｎ代謝物の１つである４−（２−アミノ−３−ヒドロキシフェニル）−４−オキソブタン酸のグリコシド誘導体は有効な太陽光フィルターであり、昼行動物のレンズにそれらが存在すると太陽光に存在するＵＶ線から虹彩を保護するのに有用でありうることが今や広く受け入れられている（Truscottら、1994; Taylorら 2001）。
【００５０】
ＵＶ光から虹彩を保護する他にも、レンズに３ＯＨ−Ｋｙｎおよびその代謝物のいくつかが蓄積するとレンズの混濁および老人性白内障の形成に至る過程が促進される。実際に、３ＯＨ−Ｋｙｎは、レンズのタンパク質と反応し白内障物質にみられるものに類似した褐色生成物を形成する。さらに、３ＯＨ−Ｋｙｎおよび関連化合物のｏ−アミノフェノール部分は、結晶と反応できてタンパク質四次構造を修飾することでレンズタンパク質の酸化的損傷および老人性白内障の形成に寄与するラジカル種の形成を担う複雑な自己酸化過程をたどる（Goldsteinら、2000）。Ｋｙｎ−３ＯＨアーゼの阻害剤は、虹彩−毛様体およびレンズにおける３ＯＨ−Ｋｙｎ合成を低減し、レンズタンパク質に及ぼす３ＨＫの作用を減少させ、老人性白内障の発生を防止しうる。
【００５１】
本発明者らは、白内障のインビボモデル（長期ナフタレン処置）およびインビトロモデル（種々の傷害の原因にさらされた培養レンズ）においてＫｙｎ−３ＯＨアーゼ阻害剤（Ｒｏ−６１８０４８）および２−（３，４−ジクロロベンゾイル）シクロプロパンカルボン酸（ＵＰＦ−６４８、５０mg/kg、ｉｐ）による処置の作用を評価した。得られた結果は、Ｋｙｎ−３ＯＨアーゼ阻害剤による処置が、これらのモデルにおいてレンズの混濁度を低減することを示している。
【００５２】
想定される治療的使用のために、キヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤は薬学的組成物に適切に製剤されて経口、非経口または局所経路によって投与されるであろう。投薬方式は、選択された化合物の薬物動態的および毒性学的性質、患者の状態、および処置されるべき病状の種類に基づいて当業者によって調整されうる。それでも用量範囲はすでに開示された、例えば上に引用した先行技術の特許文献における用量範囲と実質的に異ならないであろう。それらの特許文献は、神経変性疾患の処置における公知の使用について参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、Ｒｏ−６１８０４８およびＵＰＦ−６４８が長期Ｌ−ドーパに対する回転応答に及ぼす作用をＭＫ−８０１と比較して評価した結果を示す。
【図２】図２は、Ｌ−ドーパによって誘発される運動異常に及ぼすＲＯ−６１８０４８の即時作用に関する研究の結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−ドーパ誘発性運動障害、運動異常、薬物嗜癖、疼痛および白内障の処置用薬剤の調製のためのキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤の使用に関する。
【０００２】
［発明の背景］
キヌレニン経路は、Ｌ−トリプトファン代謝の主要ルートである。この経路は、神経毒性酸化活性を有する化合物およびグルタミン酸受容体での活性を調節できる化合物を生成する。この経路は末梢および脳の両方に存在する。この経路の主生成物はキノリン酸（ＱＵＩＮ）、キヌレン酸（ＫＹＮＡ）、およびフリーラジカルを生成する３−ヒドロキシキヌレニン（３ＯＨ−Ｋｙｎ）である。ＱＵＩＮは、ＮＭＤＡレセプターを活性化し、発作を誘発し、かつ興奮毒性病変を作ることが示されている。ＫＹＮＡは、高濃度（μＭ域）でＮＭＤＡレセプター複合体のグリシン部位と拮抗し、ｍＭ濃度でＡＭＰＡおよびカイニン酸レセプターを拮抗し、かつ神経保護作用を有する（Schwarcz and Pellicciari, 2002, JPET 303:1-10）。
【０００３】
例えば、Gomez-Mancilla B.ら: Clinical Pharmacol. 16(5), 1999-10, 1999は、ＮＭＤＡアンタゴニスト（ＭＫ−８０１）がＭＴＰＰで処置されたサルにおいて、Ｌ−ドーパ誘発性運動異常を軽減したことを開示している。しかし、ＫＹＮＡが、高用量（μＭおよびｍＭ範囲）でのみＮＭＤＡおよびＡＭＰＡレセプターの拮抗剤として作用することに注目すべきである。他方、さらに低濃度（３０〜１００ｎＭ）のＫＹＮＡは、Carpenedoら（Eur. J. Neurosci. 2001）によって示されたようにイオンチャネル型または代謝型のどちらのＧＬＵレセプターの機能も調節せずにグルタミン酸の放出を強く阻害する。したがって、Ｋｙｎ−３−ＯＨアーゼ阻害剤の治療作用の原因を、異なる新規な抗グルタミン酸作動メカニズムとすることができる。ＫＹＮＡがＮＭＤＡ拮抗剤として作用するだけでなく、新規で予想外のメカニズムが関与している薬物嗜癖についても同じことがあてはまる。Rasmussen K他、Psychopharmacology他、105 (4), 1991, 508-512およびTruyllo K.A., ibidem, 2000, 51(2-3), 121-141は、モルヒネ離脱または疼痛の処置におけるＫＹＮＡの使用を単に示唆しているが、Ｋｙｎ−３−ＯＨアーゼの可能性のある処置的使用を支持する説得力のある実験データはこの論文のどこにも示されていない。
【０００４】
キヌレニン３−ヒドロキシラーゼ（Ｋｙｎ−３−ＯＨアーゼ）はキヌレニン経路の主要酵素であり、その阻害はＱＵＩＮおよび３ＯＨ−Ｋｙｎレベルの減少ならびにＫＹＮＡレベルの増加を引き起こす。
【０００５】
キヌレニン３−ヒドロキシラーゼ阻害剤は、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）によって起こる痴呆、梗塞性痴呆、脳虚血、脳低酸素症、パーキンソン病、てんかん、頭および脊髄の傷害、筋萎縮性側索硬化症、緑内障網膜症、脳の感染症または脳の炎症のような神経変性疾患の処置のための処置剤として提案されてきた。
【０００６】
キヌレン酸の可能性のある役割は、Kekesi G.ら、Eur. J. Pharmacol., 2002, 445 (1-2) ９３−９６およびHeyliger S.O.ら、Pharmacol. Res. 1998, 38(4) 243-250によっても示唆されたが、これら２つの論文のいずれもＫｙｎ−３−ＯＨアーゼ阻害剤が動物モデルにおいて有効であるという実際の根拠を提供していない。
【０００７】
ＲＯ−６１８０４８化合物は、Ｋｙｎ−３ＯＨアーゼの阻害剤である（Roverら、1997, J. Med. Chem 40:4378-4385）。他のキヌレニン３−ヒドロキシラーゼ阻害剤がとりわけＵＳ６３２３２４０、ＷＯ９８／４０３４４、ＷＯ９８／０９９３８、ＥＰ８１９６８１、ＷＯ９９／６３７５、ＷＯ９９／２８３０９、ＷＯ９９／２８３１６、ＷＯ９９／６３７５、ＷＯ９８／３４６９、ＷＯ９５／３２７１に開示されている。
【０００８】
［発明の説明］
キヌレニン３−ヒドロキシラーゼ阻害剤が、長期Ｌ−ドーパ処置、薬物嗜癖、疼痛に関連する運動不全および白内障の処置のための処置剤として有用であることが発見された。
【０００９】
キヌレニン３−ヒドロキシラーゼ阻害剤の活性は、以下に報告するように適切な動物モデルおよび実験証拠によって示された。
【００１０】
長期Ｌ−ドーパ処置に関連する運動障害
ＰＤにおける運動障害の最も広く使用されている処置は、ドーパミン前駆体であるレボドーパ（Ｌ−ドーパ）を用いた代替療法である。しかし、Ｌ−ドーパを用いた長期処置は、Ｌ−ドーパの作用の脱感作（ウェアリングオフ現象（wearing-off phenomenon））ならびに運動応答合併症（遅発性運動合併症ＬＭＣ）および運動異常の発生を伴う。
【００１１】
一般に使用されるＰＤのモデルである６−ＯＨＤＡ病変ラットにおいて、Ｌ−ドーパに対する運動応答は、長期処置後に減少する。この作用は、Ｌ−ドーパで長期処置中のパーキンソン病患者において観察される「ウェアリングオフ」現象を模倣している（Boldryら、Brain Res 1995 Sep 18; 692: 259-64）。
【００１２】
このラットモデルにおいて、本発明者らは、Ｒｏ−６１８０４８（４０mg/kg、ｉｐ）および２−（３，４−ジクロロベンゾイル）シクロプロパンカルボン酸（ＵＰＦ−６４８、５０mg/kg、ｉｐ）が長期Ｌ−ドーパ（２８日間の処置、２５mg/kg/日、ｉｐ）に対する回転応答に及ぼす作用をＭＫ−８０１（０．１mg/kg、ｉｐ）と比較して評価した。
【００１３】
方法
６−ヒドロキシドーパミンにより誘発される病変
左内側前脳束（ＭＦＢ）に６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ−ＨＢｒ）を注射することによって黒質線条体経路の片側病変を作製した。ペントバルビタールナトリウム（４５mg/kg ｉｐ）麻酔下の雄性ウィスターラット（２５０〜２７５ｇ）を定位フレーム（David Kopf inst.）に配置した。頭蓋に穴を空け、以下の座標で注射用カニューレを留置できるようにした：ラムダの４．０mm前方、正中線の１．３mm左、および頭蓋表面から８．４mm下側。６−ＯＨＤＡ−ＨＢｒを０．０２％アスコルビン酸生理食塩水（８ｇ/４ｌ）に溶かし、ハミルトンシリンジで０．５μl／分の流速で８分間（総体積４．０μl）注入した。この処置の後に動物をホームケージに３週間戻し、その後行動試験を行った。
【００１４】
回転行動の測定
回転行動を測定するために、ラットを円筒型ケージに入れ、自動回転数計につないだ。それぞれ５分間に全回転した回数をコンピュータで記録した。６−ＯＨＤＡの注射の３週間後にアポモルヒネ（０．０５mg/kg sc）に対する動物の応答を測定することによって回転行動についてスクリーニングした。１００回以上の回転応答を示した動物のみを使用した。
【００１５】
処理
Ｌ−ドーパメチルエステル（５０mg/kg）および末梢デカルボキシラーゼ阻害剤であるベンセラジド（１２．５mg/kg）の組み合わせまたは生理食塩水のいずれかを１日２回、８：００および１６：００に、２８日間連続してラットに腹腔内注射した。処理の開始時（Ｌ−ドーパ第１日）および処理の終了時（Ｌ−ドーパ第２８日）、ならびにラットに薬物（Ｒｏ−６１８０４８、ＭＫ８０１）も投与した翌日に回転をスクリーニングした。各群８匹のラットを使用した。回転速度がその最終的な平均値の半分に達した最初の５分間の区間と、速度が減少し再びその平均値の半分に達した最初の区間との間の時間まで応答の持続時間を測定した。
【００１６】
統計解析
分散分析の後に事後比較についてのダンカンの新しい多重検定を行ってデータを解析した。
【００１７】
結果
４週間の処理の過程でＬ−ドーパに対する回転応答は徐々に短くなり、１日目に測定した回転に比べてＬ−ドーパ処理の２８日目には２０％（ｐ＜０．０５）減少した。
【００１８】
Ｌ−ドーパに対するこの応答の減少は、Ｒｏ−６１８０４８の急性同時投与（４０mg/kg ｉｐ）によって２９日目に逆転した。この作用は図１に示すように、ＭＫ８０１（０．１mg/kg ｉｐ）で得られた作用と類似している。図１で棒線は平均値±ＳＥＭ、ｎ＝ラットの数。＊および＄はそれぞれ１日目および２８日目でのＬ−ドーパ処理に比べてＰ＜０．０５で有意であることを示す。化合物ＵＰＦ−６４８（５０mg/kg ｉｐ）を用いて同様の結果を得た。
【００１９】
これらの結果は、キヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤ＲＯ−６１８０４８およびＵＰＦ−６４８が、長期Ｌ−ドーパに対する応答の減少を逆転できることを示している。これらのデータは、キヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を、ＰＤ患者および運動異常における長期Ｌ−ドーパに関連する運動障害の処置に使用しうることを示している。
【００２０】
パーキンソン病サルにおいてＬ−ドーパ誘発性運動異常モデルに及ぼすＫｙｎ−３ＯＨアーゼ阻害剤の作用
実験プロトコール
動物
ＭＰＴＰで処理され、安定したパーキンソン症候群およびＬ−ドーパに対する再現性運動異常を有する雌性カニクイザル（macaca fascicularis）（体重２．９〜５．０kg）５〜６匹を用いて実験を行った。国立衛生研究所による実験動物のケアおよび使用に関する指針（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）に従って動物を取り扱い、すべての処置は、ラバル大学の研究所内動物実験委員会で承認されたものであった。動物を観察ケージに別々に入れ、２３±１℃に温度調節した室内で１２時間の明暗サイクル（午前６時〜午後６時に点灯）に曝した。１日１回午後、動物にペレットおよび果物を給餌し、水を自由に飲ませた。
【００２１】
実験処理
ＲＯ−６１８０４８を単独およびＬ−ドーパと同時に投与した。
特に、
Ａ）３日間連続して、増加する用量１０、３０、１００mg/kgでＲＯ−６１８０４８単独を投与し、処理前後に投与された賦形剤と比較した。
Ｂ）３日間連続して、増加する用量１０、３０、１００mg/kgでＲＯ−６１８０４８をＬ−ドーパ／ベンセラジドと同時に与え、同じく３日間連続して与えられたＬ−ドーパと比較した。処理の合間に準備刺激を維持するために動物にＬ−ドーパ／ベンセラジド（１００／２５mg、Prolopa）の経口処理を受けさせた。
【００２２】
化合物
増加する用量１０、３０、１００mg/kgのＲＯ−６１８０４８を０．１％（v/v）トウィーン８０／滅菌水に懸濁し、ガラス製ホモジナイザで均質化し、均質懸濁液として投与されるまで一晩混合した。増加する各用量で経口強制投与（p.o）によって投与される薬物懸濁液の最大体積はそれぞれ１０、２０および４０mlであった。対照として、０．１％（v/v）トウィーン８０／滅菌水懸濁液をp.o.（２ml/kg）投与した。Ｌ−ドーパメチルエステル（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）を常にベンセラジド５０mg（ホフマンラロシュ、モントリオール、ケベック州）と共に（各動物についての閾値濃度に基づいて）２５から３０mg/kgの範囲の用量で０．９％滅菌生理食塩水１mlに溶かし、単独またはＲＯ−６１８０４８と組み合わせてs.c.投与した。
【００２３】
運動異常のレーティング
いくつかの発表済みの研究で我々が使用した尺度によって、振幅、正常な運動活動の妨害および異常運動の頻度の評価に基いて、顔面、頚部、体幹、腕および脚について運動異常の重症度を以下のようにレーティングした：異常なし＝Ｏ、軽度＝１、中度＝２、重度＝３。得られた運動異常スコアは、身体部分のすべてについてのスコアの合計であり、最大スコアは２１点であった。３時間または薬物作用の総持続時間に得られたすべてのスコアの平均として各動物についての平均運動異常スコアを計算した。
【００２４】
統計解析
３時間または所与の薬物の作用の総持続時間に各サルについて得られた平均パーキンソンスコアおよび平均運動異常スコアをノンパラメトリックのフリードマン検定後にフリードマン順位和（Friedman rank sum）に基づく多重比較を用いて解析した。すべてのサルについてのこれらのデータを、繰り返し測定のある分散分析（ＡＮＯＶＡ）の後にフィッシャーの最小有意差確率（ＰＬＳＤ）を用いて比較した。
【００２５】
結果
結果を図２に示す。
Ａ）増加する用量１０、３０、１００mg/kgでＲＯ−６１８０４８を単独投与しても賦形剤投与に比べてパーキンソンスコアおよび歩行活動は全く作用を受けなかった（ＲＯ−６１８０４８で処理前後）。
Ｂ）増加する用量のＲＯ−６１８０４８をＬ−ドーパ／ベンセラジド（２５〜３０mg/kg）と共に３日間連続して同時投与すると、Ｌ−ドーパに対する運動異常応答が３０および１００mg/kgのＲＯ−６１８０４８について約２０％有意に減少した（図２）。
【００２６】
結論
Ｌ−ドーパによって誘発される運動異常に及ぼすＲＯ−６１８０４８の即時作用に関する本研究の結果は、Ｌ−ドーパによって誘発されるパーキンソン症候群の改善に何らマイナス作用を有さずに運動異常が低減することを表している。
【００２７】
薬物嗜癖
薬物嗜癖は、強迫的な薬物探求と摂取を特徴とする病的行動である（Koobら、1998, Neuron 21, 467-476）。連続する薬物使用は、動機づけに関与する神経回路に遅延性の機能変化を引き起こし、それによって依存、薬物切望、および再発に至りうると考えられている（Koobら、1998, Neuron 21, 467-476）。これらの行動変化の一動物モデルは、げっ歯動物における精神刺激薬の繰り返し投与によって誘発される歩行活動の長期持続性の増加であり、これは薬物誘発性行動感作として知られている（Robinson and Berridge, 1993, Brain Res Rev 18, 247〜91 1993）。
【００２８】
本発明者らは、ラットにおけるコカイン誘発性行動感作のモデルを使ってＲｏ−６１８０４８（４０mg/kg、ｉｐ）および２−（３，４−ジクロロベンゾイル）−シクロプロパンカルボン酸（ＵＰＦ−６４８、５０mg/kg、ｉｐ）の作用を評価した。結果から、Ｒｏ−６１８０４８およびＵＰＦ−６４８が、コカインに対する行動感作の誘発を防止することが実証された。
【００２９】
方法
歩行活動用装置
到着時に体重２００〜２５０ｇの雄性ウィスターラット（Charles River, Kingston, NY）を使用した。それぞれ寸法３６cm（Ｌ）×２５cm（Ｗ）×２０cm（Ｈ）の同型の金属線製つり下げ型ケージ１６個で歩行活動を測定した。格子状の床の上部１cmに長軸に沿って位置し、ケージの前部および後部から８ｃｍ離れて位置する２セットの赤外投光受光光電池を各ケージは有していた。バックグラウンド雑音を白色雑音発生器によって供給した。ケージ内の運動によって光電池への割り込みが生じ、これをＩＢＭ互換性コンピュータで自動記録した。
【００３０】
感作法および処理
実験前に２〜３日間連続して歩行活動用チャンバーに動物を慣れさせた。コカイン（１５mg/kg）または生理食塩水と、Ｋｙｎ−３ＯＨアーゼ阻害剤であるＲｏ−６１８０４８（４０mg/kg ｉｐ）またはその賦形剤のいずれかとのＩＰ注射をラットに５日間行い、歩行活動を３時間記録した。コカインまたは生理食塩水を最後に注射した１０日後（１５日目）に、Ｒｏ−６１８０４８が存在しない状態でコカイン１５mg/kgで動物を攻撃誘発し、歩行活動をもう一度３時間監視した。
【００３１】
統計解析
４つの実験群（すなわち生理食塩水／賦形剤、生理食塩水／Ｒｏ−６１８０４８、コカイン／賦形剤およびコカイン／Ｒｏ−６１８０４８）および２つの時点（１日目および５日目）を含む一因子について反復測定のある二元配置ＡＮＯＶＡを用い、その後に単純効果分析を用いてデータ（３時間に生じた光の遮断の総数）を分析した。１日目および攻撃誘発日を比較するために一因子について繰り返し測定のある２番目の二元配置ＡＮＯＶＡを使用し、その後にニューマン・クールスのポストホック検定を行った。
【００３２】
結果
コカインでの５日目の処理までに、賦形剤をＩＰ前処理された動物は、歩行反応の増加を示した（１日目に比べ２０％の増加、ｐ＜０．０５）、逆にＲｏ−６１８０４８（４０mg/kg ＩＰ）で前処理されたラットは有意な増加を全く示さなかった。コカインまたは生理食塩水の最終注射の１０日後に、Ｒｏ−６１８０４８が存在しない状態で１５mg/kgのコカインで動物を攻撃誘発し、歩行活動をもう一度３時間監視した。予想どおり、コカインで予め処理され、Ｒｏ−６１８０４８を投与されていなかったラットは、コカインに応答して歩行活動の増加を示した（１日目に比べ３０％の増加、ｐ＜０．０５）が、５日間のコカイン処理の間にＲｏ−６１８０４８で前処理されたラットは増加を示さなかった。ＵＰＦ−６４８（５０mg/kg ｉｐ）でも同様の結果を得た。
【００３３】
これらのデータは、Ｒｏ−６１８０４８およびＵＰＦ−６４８がコカインに対する歩行感作の進展を防止することを示している。したがって、キヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤は、薬物乱用による嗜癖および依存の処置に使用されうる。
【００３４】
疼痛
急性および慢性疼痛は、有害刺激による侵害受容経路の活性化と共に始まり、その活性化を開始する。両方のタイプの疼痛は、傷害を受けた組織を行動および反射の面から防御するように誘導することによって生存機能の役目を果たす。しかし、慢性疼痛は傷害を受けた組織から自立し身体を無能にする場合がある。実際に、末梢または中枢神経系（ＣＮＳ）に対する長期組織損傷または傷害に関連する慢性の神経障害性疼痛は、侵害受容経路で様々なレベルで起こる多数の複雑な変化の結果である。特に、傷害を受けた組織の炎症または神経傷害後に、Ｃ侵害受容線維からの持続性入力が中枢侵害受容経路に過興奮状態を作り出し、結果として痛覚過敏、異痛、および自発痛をもたらす（Price, 1996 Pain; 68: 1-3）。
【００３５】
トリプトファンおよびその代謝物のいくつかが動物モデルにおいて鎮痛性を有することが示された（Heyligerら、1998 Pharmacol Res 38: 243-50）。
【００３６】
本発明者らは、炎症および神経障害痛の動物モデル（マウスにおけるホルマリン試験）ならびに急性疼痛試験（ラットにおけるテールフリック法）を用いてＲｏ−６１８０４８（４０mg/kg、ｉｐ）および２−（３，４−ジクロロベンゾイル）シクロプロパンカルボン酸（ＵＰＦ−６４８、５０mg/kg、ｉｐ）の鎮痛活性を評価した。
【００３７】
方法
動物
試験時に体重１７５〜２００ｇの成雄性ウィスターラットおよび体重２２〜２５ｇのＣｒ１：ＣＤ−１マウスを使用した（Harlan-Nossan, Italy）。
【００３８】
マウスホルマリン試験
マウスを用いたホルマリン試験は、ヒトにおける神経原性炎症および持続痛（Shibataら、1989, Pain 38: 347-352）ならびに傷害後の疼痛のいくつかの特徴（Dallelら、1995, Pain. 61:11-16）をモデル化するために使用されている方法である。
【００３９】
Roslandら（1990, Pain 42: 235-242）の修正プロトコールによれば、マウス左後足底表面から２．７％ホルマリン溶液２０μlを皮下（s.c.）注射し、すぐに透明なＰＶＣ観察チャンバー（２３×１２×１３cm）に入れた。注射を受けた足の累積リッキング時間（秒）を測定することによって疼痛行動を定量した。ホルマリン注射後の初期（０〜５分）および後期（３０〜４０分）に測定を行った（Tjolsenら、1992, Pain 51: 5-17）。ホルマリン注射の１５分前に、各用量あたりマウス１０匹の群に２ml/kg体重の体積で４０mg/kgのＲｏ−６１８０４８をｉｐ投与した。対照群を賦形剤で処置した。
【００４０】
テールフリック試験
テールフリック試験は、熱に対する尾の反応を誘発するのに必要な潜時として定義される熱侵害受容の閾値を測定するものである。この試験は、D'AmourおよびSmith（1941, J. Pharmacol. Exp. Ther. 72:74-79）によって記載された方法にしたがって鎮痛効果測定装置（U. Basile, Italy）を用いて実施した。薬物（Ｒｏ−６１８０４８ ４０mg/kg）または賦形剤でラットをｉｐ処理し、その９０分後に各動物を台に乗せ、尾の先端から約３ｃｍの場所にビームの焦点を合わせて放射熱に曝した。対照ラットに３〜５秒の反応潜時をもたらすようにビーム光強度を調整した。熱侵害受容の閾値を尾の反応を誘発するのに必要な潜時として定義した。２０秒のカットオフを採用して組織の損傷を防止した。
【００４１】
データ解析と統計
マウスホルマリン試験。各用量群あたり８〜１０匹の動物の平均±ＳＥＭとしてデータを表す。分散分析後にダンネットのｔ検定を行ってデータを評価した。
【００４２】
ホルマリン注射後の初期（０〜５分）および後期（３０〜４０分）に注射を受けた足の累積リッキング時間（秒）を記録した。
【００４３】
テールフリック試験。熱刺激の開始と尾のフリックとの間の時間（秒）として潜時を定義した。分散分析後にダンネットのｔ検定を行ってデータを評価した。
【００４４】
結果
マウスホルマリン試験における作用：Ｒｏ−６１８０４８は、用量４０mg/kgで初期の累積リッキング時間を有意に低減した。累積リッキング時間は１０６±４．３９秒（対照群）から７５±５．５秒（ｐ＜０．０５）に減少した。
【００４５】
後期において、Ｒｏ−６１８０４８は累積リッキング時間の用量依存的な有意な減少を引き起こした（ｐ＜０．０５）。累積リッキング時間は、対照群の１２３±１２．８秒から６８±１４．３秒に減少した。ＵＰＦ−６４８（５０mg/kg ｉｐ）でも同様の結果を得た。
【００４６】
テールフリック試験における作用：２つの群のラットに賦形剤またはＲｏ−６１８０４８（４０mg/kg）をｉｐ投与した。対照群では熱侵害刺激に対するテールフリック応答の潜時は３．９±０．４秒であった。処置群では潜時は投与後９０分で有意に異なった（６．１±０．４秒）。ＵＰＦ−６４８（５０mg/kg ｉｐ）でも同様の結果を得た。
【００４７】
本発明者らの結果は、使用したモデルにおいて、Ｒｏ−６１８０４８およびＵＰＦ−６４８が、抗侵害受容作用を有することを示している。これらのデータは、Ｋｙｎ ３ＯＨアーゼ阻害剤の使用が、ヒトにおける急性痛、炎症痛、神経障害痛および慢性痛の処置に有益でありうることを示している。
【００４８】
白内障
哺乳動物のレンズは、「キヌレニン代謝経路」に沿って形成されるトリプトファン（ＴＲＰ）代謝物の１つである高濃度の３−ヒドロキシキヌレニン（３ＯＨ−Ｋｙｎ）を含む。ＴＲＰから３ＯＨ−Ｋｙｎへの合成には２つの酵素が必要である。第１の酵素は、ＴＲＰをキヌレニンに代謝できるインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）である。第２の酵素は、キヌレニンを３ＯＨ−Ｋｙｎに代謝するキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ（Ｋｙｎ−３−ＯＨアーゼ）である。これらの両方が虹彩／毛様体に高度に発現し、虹彩／毛様体では有意な量の３ＯＨ−Ｋｙｎが合成されている（Chiarugiら、1999）。しかし、この論文は、白内障発生性ではない眼から抽出された酵素を用いて実施された試験が開示され、治療的処理の実際の活性を予測すると現実にみなすことができる唯一のモデルである白内障発生レンズではインビボ実験もインビトロ実験のどちらも全く実施されていないと記載している。
【００４９】
新たに形成した３ＯＨ−Ｋｙｎが、次に房水に連続的に放出されレンズに能動的に取り込まれ、そのレンズでＵＶフィルター化合物の合成に使用されうると提案されている。３ＯＨ−Ｋｙｎ自体、そのグリコシド誘導体、および３ＯＨ−Ｋｙｎ代謝物の１つである４−（２−アミノ−３−ヒドロキシフェニル）−４−オキソブタン酸のグリコシド誘導体は有効な太陽光フィルターであり、昼行動物のレンズにそれらが存在すると太陽光に存在するＵＶ線から虹彩を保護するのに有用でありうることが今や広く受け入れられている（Truscottら、1994; Taylorら 2001）。
【００５０】
ＵＶ光から虹彩を保護する他にも、レンズに３ＯＨ−Ｋｙｎおよびその代謝物のいくつかが蓄積するとレンズの混濁および老人性白内障の形成に至る過程が促進される。実際に、３ＯＨ−Ｋｙｎは、レンズのタンパク質と反応し白内障物質にみられるものに類似した褐色生成物を形成する。さらに、３ＯＨ−Ｋｙｎおよび関連化合物のｏ−アミノフェノール部分は、結晶と反応できてタンパク質四次構造を修飾することでレンズタンパク質の酸化的損傷および老人性白内障の形成に寄与するラジカル種の形成を担う複雑な自己酸化過程をたどる（Goldsteinら、2000）。Ｋｙｎ−３ＯＨアーゼの阻害剤は、虹彩−毛様体およびレンズにおける３ＯＨ−Ｋｙｎ合成を低減し、レンズタンパク質に及ぼす３ＨＫの作用を減少させ、老人性白内障の発生を防止しうる。
【００５１】
本発明者らは、白内障のインビボモデル（長期ナフタレン処置）およびインビトロモデル（種々の傷害の原因にさらされた培養レンズ）においてＫｙｎ−３ＯＨアーゼ阻害剤（Ｒｏ−６１８０４８）および２−（３，４−ジクロロベンゾイル）シクロプロパンカルボン酸（ＵＰＦ−６４８、５０mg/kg、ｉｐ）による処置の作用を評価した。得られた結果は、Ｋｙｎ−３ＯＨアーゼ阻害剤による処置が、これらのモデルにおいてレンズの混濁度を低減することを示している。
【００５２】
想定される治療的使用のために、キヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤は薬学的組成物に適切に製剤されて経口、非経口または局所経路によって投与されるであろう。投薬方式は、選択された化合物の薬物動態的および毒性学的性質、患者の状態、および処置されるべき病状の種類に基づいて当業者によって調整されうる。それでも用量範囲はすでに開示された、例えば上に引用した先行技術の特許文献における用量範囲と実質的に異ならないであろう。それらの特許文献は、神経変性疾患の処置における公知の使用について参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、Ｒｏ−６１８０４８およびＵＰＦ−６４８が長期Ｌ−ドーパに対する回転応答に及ぼす作用をＭＫ−８０１と比較して評価した結果を示す。
【図２】図２は、Ｌ−ドーパによって誘発される運動異常に及ぼすＲＯ−６１８０４８の即時作用に関する研究の結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−ドーパ誘発性運動障害、運動異常、薬物嗜癖、疼痛および白内障の処置用薬剤の調製のためのキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤の使用。
【請求項２】
Ｌ−ドーパ誘発性運動障害の処置用薬剤の調製のための、請求項１記載の使用。
【請求項３】
運動異常の処置用薬剤の調製のための、請求項１記載の使用。
【請求項４】
薬物嗜癖の処置用薬剤の調製のための、請求項１記載の使用。
【請求項５】
疼痛の処置用薬剤の調製のための、請求項１記載の使用。
【請求項６】
白内障の処置用薬剤の調製のための、請求項１記載の使用。
【請求項７】
キヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤が、ＲＯ−６１８０４８またはＵＰＦ−６４８である、請求項１〜６に記載の使用。
【請求項８】
Ｌ−ドーパ誘発性運動障害に冒された患者の処置法であって、該患者に有効量のキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を投与することを含む処置法。
【請求項９】
運動異常に冒された患者の処置法であって、該患者に有効量のキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を投与することを含む処置法。
【請求項１０】
薬物嗜癖に冒された患者の処置法であって、該患者に有効量のキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を投与することを含む処置法。
【請求項１１】
疼痛に冒された患者の処置法であって、該患者に有効量のキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を投与することを含む処置法。
【請求項１２】
白内障に冒された患者の処置法であって、該患者に有効量のキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を投与することを含む処置法。
【請求項１】
Ｌ−ドーパ誘発性運動障害、運動異常、薬物嗜癖、疼痛および白内障の処置用薬剤の調製のためのキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤の使用。
【請求項２】
Ｌ−ドーパ誘発性運動障害の処置用薬剤の調製のための、請求項１記載の使用。
【請求項３】
運動異常の処置用薬剤の調製のための、請求項１記載の使用。
【請求項４】
薬物嗜癖の処置用薬剤の調製のための、請求項１記載の使用。
【請求項５】
疼痛の処置用薬剤の調製のための、請求項１記載の使用。
【請求項６】
白内障の処置用薬剤の調製のための、請求項１記載の使用。
【請求項７】
キヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤が、ＲＯ−６１８０４８またはＵＰＦ−６４８である、請求項１〜６に記載の使用。
【請求項８】
Ｌ−ドーパ誘発性運動障害に冒された患者の処置法であって、該患者に有効量のキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を投与することを含む処置法。
【請求項９】
運動異常に冒された患者の処置法であって、該患者に有効量のキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を投与することを含む処置法。
【請求項１０】
薬物嗜癖に冒された患者の処置法であって、該患者に有効量のキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を投与することを含む処置法。
【請求項１１】
疼痛に冒された患者の処置法であって、該患者に有効量のキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を投与することを含む処置法。
【請求項１２】
白内障に冒された患者の処置法であって、該患者に有効量のキヌレニン−３−ヒドロキシラーゼ阻害剤を投与することを含む処置法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２００６−５２５２７５（Ｐ２００６−５２５２７５Ａ）
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０５３６７（Ｐ２００６−５０５３６７）
【出願日】平成１６年５月４日（２００４．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４７１９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９８５８５
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０５１９６８１９）ニューロン・ファーマシューティカルズ・ソチエタ・ペル・アチオニ (12)
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＷＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ Ｓ．Ｐ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月４日（２００４．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００４７１９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９８５８５
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０５１９６８１９）ニューロン・ファーマシューティカルズ・ソチエタ・ペル・アチオニ (12)
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＷＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ Ｓ．Ｐ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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