イムノフィリンおよびカルシウムチャネル活性を調整するためのイムノフィリンリガンドおよび方法
カルシウムチャネル活性のモジュレーターとしてのイムノフィリンリガンドおよびその使用を開示する。カルシウムチャネル機能障害に関連する状態（例えば、神経変性障害および心血管障害）のスクリーニング方法、治療方法、および予防方法も開示する。１つの実施形態では、ラパマイシンのｍＴＯＲ結合領域を改変したイムノフィリンリガンドは、ＦＫＢＰ５２および電位開口型Ｌ型カルシウムチャネル、特に、Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットの活性を減少させることが示されている。かかる活性の減少は、神経突起伸長およびニューロンの生存の同時増加に関連することが示されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノフィリンリガンドと、（ｉ）イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／または（ｉｉ）カルシウムチャネルサブユニットもしくはその機能的フラグメントの一方あるいは両方とを含む精製複合体。
【請求項２】
前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項１に記載の精製複合体。
【請求項３】
前記イムノフィリンリガンドが、式Ｉ：
【化１２】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は異なる独立した基であり、ＯＲ３およびＮ（Ｒ３’）（Ｒ３’’）からなる群より選択されるか、
Ｒ１およびＲ２は異なり、単結合を介して連結し、ＯおよびＮＲ３からなる群より選択され、
Ｒ３、Ｒ３’、およびＲ３’’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
Ｒ４およびＲ４’は、
（ａ）Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（アシル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、または、
（ｂ）共にＯと二重結合を形成し、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、およびＯＣＨ３からなる群より独立して選択され、
Ｒ８およびＲ９は、（ｉ）単結合を介して連結し、且つＣＨ２であるか、（ｉｉ）二重結合を介して連結し、且つＣＨであり、
Ｒ１５は、Ｃ＝Ｏ、ＣＨＯＨ、およびＣＨ２からなる群より選択され、ｎは１または２である）を有するラパマイシンアナログまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１に記載の精製複合体。
【請求項４】
前記ラパマイシンアナログのＲ１がＯであり、Ｒ２がＮＲ３である、請求項３に記載の精製複合体。
【請求項５】
前記ラパマイシンアナログのＲ１がＯＲ３であり、Ｒ２がＮ（Ｒ３’）（ＮＲ３’’）である、請求項３に記載の精製複合体。
【請求項６】
前記ラパマイシンアナログのＲ３、Ｒ３’、またはＲ３’’が、アリールまたは置換アリールである、請求項３に記載の精製複合体。
【請求項７】
前記ラパマイシンアナログのアリールまたは置換アリールが、構造：
【化１３】
（式中、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ハロゲン、アシル、ＯＨ、Ｏ（アルキル）、Ｏ（置換アルキル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、Ｏ（アシル）、ＮＨ２、ＮＨ（アルキル）、ＮＨ（置換アルキル）、ＮＨ（アリール）、ＮＨ（置換アリール）、およびＮＨ（アシル）からなる群より独立して選択される）である、請求項６に記載の精製複合体。
【請求項８】
前記イムノフィリンリガンドが、
【化１４】
からなる群より選択されるラパマイシンアナログである、請求項１に記載の精製複合体。
【請求項９】
前記イムノフィリンが、図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１４）と少なくとも９５％同一であるか、または同一である配列を有するＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントである、請求項１に記載の精製複合体。
【請求項１０】
前記カルシウムチャネルサブユニットが、図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）と少なくとも９５％同一であるか、または同一である配列を有する電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントである、請求項１に記載の精製複合体。
【請求項１１】
図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１４）を有するＦＫＢＰ５２をコードするヌクレオチド配列を含む第１の組換え核酸および／または図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）を有する電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組換え核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載の精製複合体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
試験化合物と（ｉ）イムノフィリンおよび／または（ｉｉ）電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットの一方または両方とを含む複合体の形成を増加させる試験化合物の同定方法であって、
該複合体の形成が可能な条件下でイムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／またはβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントを試験化合物と接触させる工程、
該試験化合物の存在下で基準と比較して該複合体の存在を検出する工程
を含み、
該基準中の該複合体のレベルと比較した、該試験化合物の存在下での該複合体のレベルの増加が、該試験化合物が複合体形成を増加させることを示す、方法。
【請求項１４】
前記サンプルが細胞溶解物、再構成された系であり、培養物または動物対象中の細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複合体形成の増加を、該複合体の物理的形成の増加、シグナル伝達の変化、カルシウムチャネル活性の減少、またはニューロン活性の変化の１つ以上の検出によって決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ニューロン活性の変化を、生存、分化、または神経突起伸長の１つ以上の増加として検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験化合物が天然に存在するかまたは改変したＳ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓから得たポリケチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載の方法によって同定された化合物。
【請求項１９】
イムノフィリンリガンドと、（ｉ）イムノフィリンまたはその機能的バリアントおよび／または（ｉｉ）カルシウムチャネルサブユニットまたはその機能的バリアントの一方または両方とを含む複合体の形成を増加させる方法であって、該複合体の形成を増加させる条件下で、イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／または電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントをイムノフィリンリガンドと接触させる工程を含む、方法。
【請求項２０】
前記接触工程が細胞溶解物、再構成した系、または培養物もしくは動物対象中の細胞において起こる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞中の電位開口型カルシウムチャネル活性および／またはＦＫＢＰ５２活性を減少させる方法であって、イムノフィリンリガンドとＦＫＢＰ５２またはそのフラグメントおよび／またはそのサブユニットまたはそのフラグメントの一方または両方との間で結合を可能にする条件下で、ＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントおよび／または電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントの一方または両方を発現する細胞をイムノフィリンリガンドと接触させ、それにより、該カルシウムチャネル活性を阻害する工程を含む、方法。
【請求項２２】
前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンドを培養物中の哺乳動物の神経細胞または心血管細胞に添加する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンドと前記ＦＫＢＰ５２またはそのフラグメントおよび／またはそのサブユニットまたはそのフラグメントの一方または両方との間に複合体を形成するのに十分な量で該イムノフィリンリガンドを対象に投与することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する１つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象が、神経変性障害または心血管障害を罹患した哺乳動物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記イムノフィリンリガンドを、Ｌ型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ラパマイシンアナログが、式Ｉ：
【化１５】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は異なる独立した基であり、ＯＲ３およびＮ（Ｒ３’）（Ｒ３’’）からなる群より選択されるか、
Ｒ１およびＲ２は異なり、単結合を介して連結し、ＯおよびＮＲ３からなる群より選択され、
Ｒ３、Ｒ３’、およびＲ３’’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
Ｒ４およびＲ４’は、
（ａ）Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（アシル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、
（ｂ）共にＯと二重結合を形成し、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、およびＯＣＨ３からなる群より独立して選択され、
Ｒ８およびＲ９は、（ｉ）単結合を介して連結し、且つＣＨ２であるか、（ｉｉ）二重結合を介して連結し、且つＣＨであり、
Ｒ１５は、Ｃ＝Ｏ、ＣＨＯＨ、およびＣＨ２からなる群より選択され、ｎは１または２である）またはその薬学的に許容可能な塩を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ラパマイシンアナログが、
【化１６】
からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントが、図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１２）と少なくとも９５％同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントが、図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
神経突起伸長および／または神経細胞の生存を刺激する方法であって、該神経細胞をイムノフィリンリガンドと接触させる工程を含み、該イムノフィリンリガンドが、１つ以上の以下：（ｉ）カルシウムシグナル伝達経路の少なくとも１つの成分の発現または活性の下方制御、（ｉｉ）ＦＫＢＰ５２活性または発現の減少、（ｉｉｉ）Ｌ型カルシウムチャネルの活性または発現の減少または阻害、（ｉｖ）糖質コルチコイド受容体シグナル伝達の活性化、（ｖ）イムノフィリンリガンド、ＦＫＢＰ５２および／またはβ１サブユニットを含む複合体の形成の誘導、および／または（ｖｉ）カルシウム誘導性細胞死からのニューロンの保護、を誘発する濃度で存在する、方法。
【請求項３４】
前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンド、およびＦＫＢＰ５２および／またはβ１サブユニットの一方または両方を含む複合体を形成するのに十分な量での前記イムノフィリンリガンドの対象への投与を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する１つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する障害を治療する方法であって、イムノフィリンリガンドと、イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットもしくはその機能的フラグメントの一方または両方とを含む複合体を形成するのに十分な量で該イムノフィリンリガンドを対象に投与し、それにより、該障害を治療する工程を含む、方法。
【請求項３８】
前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する１つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象が、神経変性障害または心血管障害を罹患した哺乳動物である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象が、卒中、パーキンソン病、癲癇、アンギナ、心不整脈および虚血からなる群より選択される障害を罹患した哺乳動物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象が、片頭痛、神経因性疼痛、急性疼痛、気分障害、統合失調症、鬱病、不安、小脳性運動失調症、遅発性ジスキネジー、高血圧症、および尿失禁からなる群より選択される障害を罹患した哺乳動物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記イムノフィリンリガンドを、Ｌ型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記イムノフィリンリガンドが、式Ｉ：
【化１７】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は異なる独立した基であり、ＯＲ３およびＮ（Ｒ３’）（Ｒ３’’）からなる群より選択されるか、
Ｒ１およびＲ２は異なり、単結合を介して連結し、ＯおよびＮＲ３からなる群より選択され、
Ｒ３、Ｒ３’、およびＲ３’’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
Ｒ４およびＲ４’は、
（ａ）Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（アシル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、
（ｂ）共にＯと二重結合を形成し、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、およびＯＣＨ３からなる群より独立して選択され、
Ｒ８およびＲ９は、（ｉ）単結合を介して連結し、且つＣＨ２であるか、（ｉｉ）二重結合を介して連結し、且つＣＨであり、
Ｒ１５は、Ｃ＝Ｏ、ＣＨＯＨ、およびＣＨ２からなる群より選択され、ｎは１または２である）を有するラパマイシンアナログまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項３３または請求項３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記ラパマイシンアナログが、
【化１８】
からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記イムノフィリンが、図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１４）と少なくとも９５％同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を有するＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記カルシウムチャネルサブユニットが、図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）と少なくとも９５％同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を有する電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
神経細胞の神経突起伸長を刺激する方法であって、該神経細胞を、電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットのアンタゴニストおよび／またはＦＫＢＰ５２のアンタゴニストの一方または両方と、該β１サブユニットまたはＦＫＢＰ５２の活性または発現を減少させる条件下で接触させる工程を含む、方法。
【請求項４９】
前記神経細胞が、ドーパミン作動性細胞、コリン作動性細胞、皮質細胞、および脊髄細胞からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記アンタゴニストが、β１サブユニットおよび／またはＦＫＢＰ５２と複合体を形成するイムノフィリンリガンドである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記アンタゴニストが、カルシウムチャネルβサブユニットまたはＦＫＢＰ５２の転写のインヒビターである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記アンタゴニストが抗体である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のための薬物の製造におけるイムノフィリンリガンドの使用。
【請求項５４】
前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のためのＬ型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせたイムノフィリンリガンドの使用。
【請求項５６】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のための薬物の製造における請求項１３〜請求項１７のいずれか１項に記載のように同定した化合物の使用。
【請求項５７】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いるイムノフィリンリガンド。
【請求項５８】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いるイムノフィリンリガンドおよびＬ型カルシウムチャネルアンタゴニストを含む組成物。
【請求項５９】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いる請求項１３〜請求項１７のいずれか１項に記載のように同定した化合物。
【請求項１】
イムノフィリンリガンドと、（ｉ）イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／または（ｉｉ）カルシウムチャネルサブユニットもしくはその機能的フラグメントの一方あるいは両方とを含む精製複合体。
【請求項２】
前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項１に記載の精製複合体。
【請求項３】
前記イムノフィリンリガンドが、式Ｉ：
【化１２】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は異なる独立した基であり、ＯＲ３およびＮ（Ｒ３’）（Ｒ３’’）からなる群より選択されるか、
Ｒ１およびＲ２は異なり、単結合を介して連結し、ＯおよびＮＲ３からなる群より選択され、
Ｒ３、Ｒ３’、およびＲ３’’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
Ｒ４およびＲ４’は、
（ａ）Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（アシル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、または、
（ｂ）共にＯと二重結合を形成し、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、およびＯＣＨ３からなる群より独立して選択され、
Ｒ８およびＲ９は、（ｉ）単結合を介して連結し、且つＣＨ２であるか、（ｉｉ）二重結合を介して連結し、且つＣＨであり、
Ｒ１５は、Ｃ＝Ｏ、ＣＨＯＨ、およびＣＨ２からなる群より選択され、ｎは１または２である）を有するラパマイシンアナログまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項１に記載の精製複合体。
【請求項４】
前記ラパマイシンアナログのＲ１がＯであり、Ｒ２がＮＲ３である、請求項３に記載の精製複合体。
【請求項５】
前記ラパマイシンアナログのＲ１がＯＲ３であり、Ｒ２がＮ（Ｒ３’）（ＮＲ３’’）である、請求項３に記載の精製複合体。
【請求項６】
前記ラパマイシンアナログのＲ３、Ｒ３’、またはＲ３’’が、アリールまたは置換アリールである、請求項３に記載の精製複合体。
【請求項７】
前記ラパマイシンアナログのアリールまたは置換アリールが、構造：
【化１３】
（式中、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、およびＲ１４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ハロゲン、アシル、ＯＨ、Ｏ（アルキル）、Ｏ（置換アルキル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、Ｏ（アシル）、ＮＨ２、ＮＨ（アルキル）、ＮＨ（置換アルキル）、ＮＨ（アリール）、ＮＨ（置換アリール）、およびＮＨ（アシル）からなる群より独立して選択される）である、請求項６に記載の精製複合体。
【請求項８】
前記イムノフィリンリガンドが、
【化１４】
からなる群より選択されるラパマイシンアナログである、請求項１に記載の精製複合体。
【請求項９】
前記イムノフィリンが、図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１４）と少なくとも９５％同一であるか、または同一である配列を有するＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントである、請求項１に記載の精製複合体。
【請求項１０】
前記カルシウムチャネルサブユニットが、図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）と少なくとも９５％同一であるか、または同一である配列を有する電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントである、請求項１に記載の精製複合体。
【請求項１１】
図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１４）を有するＦＫＢＰ５２をコードするヌクレオチド配列を含む第１の組換え核酸および／または図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）を有する電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む第２の組換え核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１に記載の精製複合体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
試験化合物と（ｉ）イムノフィリンおよび／または（ｉｉ）電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットの一方または両方とを含む複合体の形成を増加させる試験化合物の同定方法であって、
該複合体の形成が可能な条件下でイムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／またはβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントを試験化合物と接触させる工程、
該試験化合物の存在下で基準と比較して該複合体の存在を検出する工程
を含み、
該基準中の該複合体のレベルと比較した、該試験化合物の存在下での該複合体のレベルの増加が、該試験化合物が複合体形成を増加させることを示す、方法。
【請求項１４】
前記サンプルが細胞溶解物、再構成された系であり、培養物または動物対象中の細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複合体形成の増加を、該複合体の物理的形成の増加、シグナル伝達の変化、カルシウムチャネル活性の減少、またはニューロン活性の変化の１つ以上の検出によって決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ニューロン活性の変化を、生存、分化、または神経突起伸長の１つ以上の増加として検出する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試験化合物が天然に存在するかまたは改変したＳ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓから得たポリケチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載の方法によって同定された化合物。
【請求項１９】
イムノフィリンリガンドと、（ｉ）イムノフィリンまたはその機能的バリアントおよび／または（ｉｉ）カルシウムチャネルサブユニットまたはその機能的バリアントの一方または両方とを含む複合体の形成を増加させる方法であって、該複合体の形成を増加させる条件下で、イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／または電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントをイムノフィリンリガンドと接触させる工程を含む、方法。
【請求項２０】
前記接触工程が細胞溶解物、再構成した系、または培養物もしくは動物対象中の細胞において起こる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞中の電位開口型カルシウムチャネル活性および／またはＦＫＢＰ５２活性を減少させる方法であって、イムノフィリンリガンドとＦＫＢＰ５２またはそのフラグメントおよび／またはそのサブユニットまたはそのフラグメントの一方または両方との間で結合を可能にする条件下で、ＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントおよび／または電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントの一方または両方を発現する細胞をイムノフィリンリガンドと接触させ、それにより、該カルシウムチャネル活性を阻害する工程を含む、方法。
【請求項２２】
前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンドを培養物中の哺乳動物の神経細胞または心血管細胞に添加する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンドと前記ＦＫＢＰ５２またはそのフラグメントおよび／またはそのサブユニットまたはそのフラグメントの一方または両方との間に複合体を形成するのに十分な量で該イムノフィリンリガンドを対象に投与することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する１つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象が、神経変性障害または心血管障害を罹患した哺乳動物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記イムノフィリンリガンドを、Ｌ型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ラパマイシンアナログが、式Ｉ：
【化１５】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は異なる独立した基であり、ＯＲ３およびＮ（Ｒ３’）（Ｒ３’’）からなる群より選択されるか、
Ｒ１およびＲ２は異なり、単結合を介して連結し、ＯおよびＮＲ３からなる群より選択され、
Ｒ３、Ｒ３’、およびＲ３’’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
Ｒ４およびＲ４’は、
（ａ）Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（アシル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、
（ｂ）共にＯと二重結合を形成し、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、およびＯＣＨ３からなる群より独立して選択され、
Ｒ８およびＲ９は、（ｉ）単結合を介して連結し、且つＣＨ２であるか、（ｉｉ）二重結合を介して連結し、且つＣＨであり、
Ｒ１５は、Ｃ＝Ｏ、ＣＨＯＨ、およびＣＨ２からなる群より選択され、ｎは１または２である）またはその薬学的に許容可能な塩を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ラパマイシンアナログが、
【化１６】
からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントが、図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１２）と少なくとも９５％同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントが、図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
神経突起伸長および／または神経細胞の生存を刺激する方法であって、該神経細胞をイムノフィリンリガンドと接触させる工程を含み、該イムノフィリンリガンドが、１つ以上の以下：（ｉ）カルシウムシグナル伝達経路の少なくとも１つの成分の発現または活性の下方制御、（ｉｉ）ＦＫＢＰ５２活性または発現の減少、（ｉｉｉ）Ｌ型カルシウムチャネルの活性または発現の減少または阻害、（ｉｖ）糖質コルチコイド受容体シグナル伝達の活性化、（ｖ）イムノフィリンリガンド、ＦＫＢＰ５２および／またはβ１サブユニットを含む複合体の形成の誘導、および／または（ｖｉ）カルシウム誘導性細胞死からのニューロンの保護、を誘発する濃度で存在する、方法。
【請求項３４】
前記接触工程が、前記イムノフィリンリガンド、およびＦＫＢＰ５２および／またはβ１サブユニットの一方または両方を含む複合体を形成するのに十分な量での前記イムノフィリンリガンドの対象への投与を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する１つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する障害を治療する方法であって、イムノフィリンリガンドと、イムノフィリンもしくはその機能的フラグメントおよび／またはカルシウムチャネルサブユニットもしくはその機能的フラグメントの一方または両方とを含む複合体を形成するのに十分な量で該イムノフィリンリガンドを対象に投与し、それにより、該障害を治療する工程を含む、方法。
【請求項３８】
前記対象に投与された前記イムノフィリンの量を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複合体形成を誘導するのに必要なイムノフィリンリガンドの量を試験することによって決定する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関与する障害に関連する１つ以上の症状を有するリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定する工程をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象が、神経変性障害または心血管障害を罹患した哺乳動物である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象が、卒中、パーキンソン病、癲癇、アンギナ、心不整脈および虚血からなる群より選択される障害を罹患した哺乳動物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象が、片頭痛、神経因性疼痛、急性疼痛、気分障害、統合失調症、鬱病、不安、小脳性運動失調症、遅発性ジスキネジー、高血圧症、および尿失禁からなる群より選択される障害を罹患した哺乳動物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記イムノフィリンリガンドを、Ｌ型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせて投与する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記イムノフィリンリガンドが、式Ｉ：
【化１７】
（式中、
Ｒ１およびＲ２は異なる独立した基であり、ＯＲ３およびＮ（Ｒ３’）（Ｒ３’’）からなる群より選択されるか、
Ｒ１およびＲ２は異なり、単結合を介して連結し、ＯおよびＮＲ３からなる群より選択され、
Ｒ３、Ｒ３’、およびＲ３’’は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換アルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、および置換ヘテロアリールからなる群より独立して選択され、
Ｒ４およびＲ４’は、
（ａ）Ｈ、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、Ｏ（アシル）、Ｏ（アリール）、Ｏ（置換アリール）、およびハロゲンからなる群より独立して選択されるか、
（ｂ）共にＯと二重結合を形成し、
Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、Ｈ、ＯＨ、およびＯＣＨ３からなる群より独立して選択され、
Ｒ８およびＲ９は、（ｉ）単結合を介して連結し、且つＣＨ２であるか、（ｉｉ）二重結合を介して連結し、且つＣＨであり、
Ｒ１５は、Ｃ＝Ｏ、ＣＨＯＨ、およびＣＨ２からなる群より選択され、ｎは１または２である）を有するラパマイシンアナログまたはその薬学的に許容可能な塩である、請求項３３または請求項３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記ラパマイシンアナログが、
【化１８】
からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記イムノフィリンが、図１２Ａ〜１２Ｄに示すアミノ酸配列（配列番号１１〜１４）と少なくとも９５％同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を有するＦＫＢＰ５２またはその機能的フラグメントである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記カルシウムチャネルサブユニットが、図１１Ａ〜１１Ｊに示すアミノ酸配列（配列番号１〜１０）と少なくとも９５％同一であるか、または同一であるアミノ酸配列を有する電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットまたはその機能的フラグメントである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
神経細胞の神経突起伸長を刺激する方法であって、該神経細胞を、電位開口型Ｌ型カルシウムチャネルのβ１サブユニットのアンタゴニストおよび／またはＦＫＢＰ５２のアンタゴニストの一方または両方と、該β１サブユニットまたはＦＫＢＰ５２の活性または発現を減少させる条件下で接触させる工程を含む、方法。
【請求項４９】
前記神経細胞が、ドーパミン作動性細胞、コリン作動性細胞、皮質細胞、および脊髄細胞からなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記アンタゴニストが、β１サブユニットおよび／またはＦＫＢＰ５２と複合体を形成するイムノフィリンリガンドである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記アンタゴニストが、カルシウムチャネルβサブユニットまたはＦＫＢＰ５２の転写のインヒビターである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記アンタゴニストが抗体である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のための薬物の製造におけるイムノフィリンリガンドの使用。
【請求項５４】
前記イムノフィリンリガンドが、ラパマイシン骨格の１位および４位にヘテロ原子置換基を有するラパマイシンアナログである、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のためのＬ型カルシウムチャネルアンタゴニストと組み合わせたイムノフィリンリガンドの使用。
【請求項５６】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療のための薬物の製造における請求項１３〜請求項１７のいずれか１項に記載のように同定した化合物の使用。
【請求項５７】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いるイムノフィリンリガンド。
【請求項５８】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いるイムノフィリンリガンドおよびＬ型カルシウムチャネルアンタゴニストを含む組成物。
【請求項５９】
Ｌ型カルシウムチャネル機能障害に関連する状態の予防または治療で用いる請求項１３〜請求項１７のいずれか１項に記載のように同定した化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１１Ｉ】
【図１１Ｊ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１Ａ】
【図１１Ｂ】
【図１１Ｃ】
【図１１Ｄ】
【図１１Ｅ】
【図１１Ｆ】
【図１１Ｇ】
【図１１Ｈ】
【図１１Ｉ】
【図１１Ｊ】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【公表番号】特表２０１０−５２１４１９（Ｐ２０１０−５２１４１９Ａ）
【公表日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４７２１１（Ｐ２００９−５４７２１１）
【出願日】平成１９年１月２９日（２００７．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００２６５６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９４１４７
【国際公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２９日（２００７．１．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／００２６５６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９４１４７
【国際公開日】平成２０年８月７日（２００８．８．７）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス エルエルシー (573)
【Ｆターム（参考）】
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