ウレアーゼ阻害活性物質の生成方法およびウレアーゼ阻害活性物質
【課題】蒟蒻芋の産業廃棄物となる飛粉からウレアーゼ阻害活性物質を生成する。
【解決手段】蒟蒻芋の製粉時に発生して廃棄物とされる蒟蒻飛粉を、メタノール溶液に浸漬し、減圧濾過してメタノール抽出液を取得し、ついで、前記メタノール抽出液を減圧濃縮した後に加水し、このメタノール溶液を酢酸エチルで抽出して酢酸エチル抽出物を取得し、ついで、前記酢酸エチル抽出物をカラムクロマトグラフィーで分画して、ウレアーゼ阻害活性物質を取得する。
【解決手段】蒟蒻芋の製粉時に発生して廃棄物とされる蒟蒻飛粉を、メタノール溶液に浸漬し、減圧濾過してメタノール抽出液を取得し、ついで、前記メタノール抽出液を減圧濃縮した後に加水し、このメタノール溶液を酢酸エチルで抽出して酢酸エチル抽出物を取得し、ついで、前記酢酸エチル抽出物をカラムクロマトグラフィーで分画して、ウレアーゼ阻害活性物質を取得する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウレアーゼ阻害活性物質の生成方法および該方法で生成されたウレアーゼ阻害活性物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウレアーゼは尿素をアンモニアと二酸化炭素に分解する酵素であり、様々な細菌、菌類、および植物中など自然界の生物に広く分布している。本酵素は１９２６年にSumnerによりナタマメから初めて結晶化された酵素であり、その後、１９７５年には活性部位にニッケルを含んだ構造をしていることも明らかにされた。しかし、このような歴史のある酵素であり多くの研究がなされてきたにも関わらず、ウレアーゼの触媒様式はまだ分かっていない部分も多く、更なる研究が期待される酵素でもある。
植物はウレアーゼにより尿素を利用して成長のために必要な窒素源であるアンモニアを生育環境から得ると共に、植物体内においても窒素形態の変換の際に関わっていると推察されている。
【０００３】
その一方で、ウレアーゼによって発生したアンモニアによって問題が起こる場合もある。ピロリ菌 (Helicobacter pylori) や腸内細菌科に属するProteus mirabilisのウレアーゼは人間の疾病にも関わっている。
前者のピロリ菌は慢性胃炎、消化性潰瘍と密接な関係があり、通常の細菌が生育できない胃内の強酸性の環境 (ｐＨ１〜２) で生育することができることが特徴である。これは菌体表面に存在するウレアーゼにより胃内の尿素をアンモニアに変換し、菌体付近の胃酸を中和し生育に適したｐＨ環境にすることができるためである。
後者のProteus mirabilisは特に尿路感染症患者において認められる細菌である。本細菌の所有するウレアーゼは治療の際に使用される尿道カテーテルを覆う付着物の形成に関わっている。その形成プロセスはピロリ菌と同じくウレアーゼによって生成されるアンモニアが原因のｐＨ変化によって起こる。尿路感染症患者の体内においてProteus mirabilisは治療のために留置されたカテーテルに付着し、バイオフィルムを形成している。菌由来のウレアーゼの作用により体内の尿素からアンモニアが発生し、尿およびバイオフィルムの急激なｐＨ上昇が起こることによってバイオフィルム内のカルシウムおよびマグネシウムのリン酸塩の結晶の析出が起こる。カテーテル内の結晶の析出は、管の閉塞につながったり、腎孟腎炎といったさらなる疾病の原因となる可能性がある。
【０００４】
また、農業において、窒素肥料を植物が利用できる窒素源であるアンモニアに変えるウレアーゼは重要であるが、あまりにも迅速に加水分解が起こり、過剰なアンモニアが発生してしまうと、土壌のアルカリ化を引き起こしたり、アンモニアによって植物に損害をあたえたりするといった問題が起こる。
既にウレアーゼ阻害物質として知られているものには、フルオロファミド、ヒドロキシウレア、ヒドロキサム酸、アセトヒドロキサム酸といった化合物が存在する。しかし、中には生体毒性や不安定性を示すものがあり、例えばアセトヒドロキサム酸はラットに対し、催奇性を示すことから実用化には至っていない。
【０００５】
以上のことから、ウレアーゼ阻害活性物質は酵素への知見を深めるためにも重要であるだけでなく、医薬品としての利用あるいは農業のための利用といった幅広い応用を見込むことができる。
本発明者は以前から香辛料、糸状菌、食用植物のメタノール抽出物を対象としてナタマメ由来のウレアーゼを用いた酵素阻害試験によりウレアーゼ阻害活性物質を探索してきた。今まで単離されてきた化合物としてはsulfoquinovosyl diacylglycerol、5-geranyloxy-7-methoxycoumarin、5-geranyloxypsolarenなどがある。
【０００６】
一方、特開２００５−２０６４９３号公報（特許文献１）において、「芋類から有機溶媒及び／又は超臨界二酸化炭素により抽出される抽出物を有効成分とする抗ヘリコバクター・ピロリ剤、ヘリコバクター・ピロリ菌を原因とする胃又は十二指腸潰瘍に対する予防剤及び治療剤、ならびに予防用飲食品」が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２０６４９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記特許文献１では、好ましい芋類の例として、蒟蒻芋が挙げられ、抽出溶媒として使用する有機溶媒として酢酸エチルが記載されているが、抽出物中の活性物質の単離および精製の具体的な方法等は開示されていない。
【０００９】
本発明は、蒟蒻芋からウレアーゼ阻害活性物質を単離・精製する精製方法等を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、第１の発明として、蒟蒻芋の製粉時に発生して廃棄物とされる蒟蒻飛粉を、メタノール溶液に浸漬し、減圧濾過してメタノール抽出液を取得し、
前記メタノール抽出液を減圧濃縮した後に加水し、このメタノール溶液を酢酸エチルで抽出して酢酸エチル抽出物を取得し、
前記酢酸エチル抽出物をカラムクロマトグラフィーで分画して、ウレアーゼ阻害活性物質を取得することを特徴とするウレアーゼ阻害活性物質の生成方法を提供している。
【００１１】
前記蒟蒻飛粉は蒟蒻芋から蒟蒻が製造される際の副産物である。蒟蒻飛粉は蒟蒻芋の約40%を占めるが、特有のエグ味や臭いを有するため食用には適さず、産業廃棄物として処理されているのが現状である。
本発明では、スクリーニングの結果、活性が認められた蒟蒻飛粉を有効利用し、蒟蒻飛粉のメタノール抽出物からのウレアーゼ阻害活性物質の単離・精製およびＮＭＲによる構造決定を行っている。
【００１２】
前記酢酸エチル抽出物の取得工程では、前記メタノール溶液を分液漏斗を用いて等量の酢酸エチルで複数回抽出することが好ましい。
【００１３】
前記カラムクロマトグラフィーでの分画工程では、酢酸エチル抽出物の半分量をワコーゲル Ｃ−２００に吸着させた後、n-ヘキサンで懸濁させて充填しておいたカラムの上端に載せ、n-ヘキサン-酢酸エチル-メタノール混合溶媒によるステップワイズ法で溶出し、２０〜３０％の酢酸エチル溶出画分として取得し、
ついで、カラムクロマトグラフィーでの分画工程は、酢酸エチル抽出物の半分量をワコーゲル（Ｗａｋｏｇｅｌ） Ｃ−２００に吸着させた後、n-ヘキサンで懸濁させて充填しておいたカラムの上端に載せ、n-ヘキサン-アセトン混合溶媒によるステップワイズ法で溶出し、溶出した６〜１５％アセトン溶出画分を前記ウレアーゼ阻害活性物質として取得している。
【００１４】
また、第２の発明として、第１の発明の生成方法で取得するウレアーゼ阻害活性物質の炭素鎖長さを測定し、該炭素鎖長さが長くなるに従って強くなるウレアーゼ阻害活性度を測定しているウレアーゼ阻害活性測定方法を提供している。
【００１５】
さらに、第３の発明として、第１の発明の生成方法で取得したウレアーゼ阻害活性物質を提供している。
【００１６】
前記ウレアーゼ阻害活性物質は、炭素数１８〜２２の飽和または不飽和脂肪酸を含むものである。また、前記不飽和脂肪酸がドコセン酸であることが好ましい。
【００１７】
さらに、本発明は、前記ウレアーゼ阻害活性物質を含む肥料、土壌改良剤を提供している。例えば、土壌改良剤はウレアーゼ阻害活性物質５〜１５重量％、窒素０．５〜２％を含有するものとしている。
【００１８】
さらに、本発明は前記ウレアーゼ阻害活性物質を含む尿道カテーテルを提供している。
例えば、ウレアーゼ阻害活性物質を脂肪酸のヘキサン溶液に加え、該溶液をカテーテルの表面に塗布し、または、風船カテーテルの形成素材と樹脂に練り込んでいる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明では、蒟蒻芋を製粉して蒟蒻製品を加工する際に発生する産業廃棄物となる蒟蒻飛粉を利用して、ウレアーゼ阻害活性物質を単離・精製することができ、該ウレアーゼ阻害活性物質は、肥料、土地改良剤、尿道カテーテル等と幅広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明のウレアーゼ阻害活性物質の生成方法を示す工程図である。
【図２】（Ａ）（Ｂ）はウレアーゼ阻害活性物質のＮＭＲスペクトルを示すグラフである。
【図３】（Ａ）〜（Ｄ）はウレアーゼ阻害活性物質のガスクロマトグラフィー分析を示すグラフである。
【図４】リノール酸の阻害率を示すグラフである。
【図５】（Ａ）〜（Ｆ）は脂肪酸類の濃度と阻害率との関係より阻害活性を示すグラフである。
【図６】ラインウイバー−バーク プロットのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
〔ウレアーゼ阻害活性物質の単離・精製〕
図１に示す工程で、こんにゃく芋の飛粉からウレアーゼ阻害活性物質を精製している。
具体的には、蒟蒻飛粉１０ｋｇをメタノールに浸漬し、濃縮後、酢酸エチルで分液し、得られた酢酸エチル抽出物を各種混合溶媒系でワコーゲル Ｃ−２００カラムクロマトグラフィーで精製を進め、ウレアーゼ阻害活性物質を１８０ｍｇ取得している。
以下に、各工程を詳述する。
【００２２】
（第一工程＃１のメタノール抽出工程）
蒟蒻芋の製粉時に発生して廃棄物とされる蒟蒻飛粉（１０ｋｇ）を、メタノール溶液（１５Ｌ）に７日間浸漬し、減圧濾過してメタノール抽出液（１０Ｌ）を取得した。
【００２３】
（第二工程＃２の分配抽出工程 ）
得られたメタノール抽出液約１０Ｌを約１００ｍｌに減圧濃縮した後、水９００ｍｌを加え、これを分液漏斗を用いて等量の酢酸エチルで３回抽出した。
酢酸エチル相の阻害率は１０００ｐｐｍ（ｆｉｎａｌ）において３２％であった。
【００２４】
〔酢酸エチル抽出物に含まれる阻害活性物質の分離工程〕
（第三工程＃３の濃縮工程）
抽出した酢酸エチルを減圧下濃縮し、酢酸エチル抽出物（１５．６ｇ）を取得した。
【００２５】
（第四工程＃４でワコーゲルＣ−２００カラムクロマト工程）
第三工程で得られた酢酸エチル抽出物１５．６ｇの半分量の７．８ｇをワコーゲル Ｃ−２００（１５．６ｇ）に吸着させた後、あらかじめn-ヘキサンで懸濁させ充填しておいたカラム （７８ｇ）の上端にのせ、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル−メタノール混合溶媒系（１００％ ｎ−ヘキサン、２０％、３０％、４０％、０％、１００％ 酢酸エチル，９０％、８０％、５０％メタノール） によるステップワイズ法で溶出した。
ウレアーゼ阻害活性試験を行い、活性物質を含む画分の確認を行った。その結果、20%〜30% 酢酸エチル溶出画分に活性が認められた。
【００２６】
（第五工程＃５でのワコーゲル Ｃ−２００カラムクロマト工程）
前記第四工程で得られた２０％〜３０％ 酢酸エチル溶出画分４ｇを前段階と同様にワコーゲル Ｃ−２００ (６g) に吸着させた後、あらかじめn-ヘキサンで懸濁させ充填しておいたカラム (４０g) の上端にのせ、n-ヘキサン-アセトン混合溶媒系による３％ステップワイズ法で溶出した。ウレアーゼ阻害活性試験を行い、活性物質を含む画分の確認を行ったところ、６〜１５％アセトン溶出画分に強い阻害が認められた。
【００２７】
（第六工程＃６でのワコーゲル Ｃ−２００カラムクロマト）
第五工程で得られた画分のうち最も量の多かった６％アセトン溶出画分について、前段階と同様にワコーゲルＣ−２００（４．５ｇ） に吸着させた後、あらかじめn-ヘキサンで懸濁させ充填しておいたカラム (３０g) の上端にのせ、n-ヘキサン-アセトン混合溶媒系による１％ ステップワイズ法で溶出した。ウレアーゼ阻害活性試験を行い、活性物質を含む画分の確認を行った。その結果7% アセトン溶出画分にて活性物質が１８０ｍｇ得られた。
【００２８】
前記のように、蒟蒻飛粉１０ｋｇから得られたメタノール抽出物を溶媒分画したところ、酢酸エチル相に活性が認められた。酢酸エチル相を減圧濃縮後、ワコーゲルＣ−２００カラムクロマトグラフィーで精製を進めた。その結果、ウレアーゼ阻害活性物質を１８０mg得た。精製には、ナタマメ由来のウレアーゼを用いた酵素阻害試験、ＴＬＣにおける紫外線吸収、および硫酸試薬による呈色を指標とした。
【００２９】
〔ウレアーゼ阻害活性物質について構造解析および化合物の同定〕
前記工程で蒟蒻飛粉から取得したウレアーゼ阻害活性物質の構造解析および構造決定について以下に説明する。
【００３０】
構造解析および構造決定を行う実験方法として、下記のＮＭＲスペクトル解析とガスクロマトグラフィー分析方法とを採用した。
【００３１】
（ＮＭＲスペクトル解析）
ウレアーゼ阻害活性物質を真空ポンプにて減圧乾燥させ溶媒を除去し、ＮＭＲ測定用溶媒のＣＤＣｌ３に溶解させた。これを日本電子製ＪＮＭ−ＡＬ４００を用いて１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。ケミカルシフト値はＮＭＲ測定溶媒のシグナルを内部標準とし、δで示した。
【００３２】
（ガスクロマトグラフィー分析）
ＮＭＲスペクトルの結果から活性物質がリノール酸と強く示唆された。
そこで、ガスクロマトグラフィー分析を行い、脂肪酸の標品と比較することで活性物質の同定を行った。
活性物質約１０ｍｇをＭｅＯＨ２ｍｌに溶かし、メチル化剤Trimethyl silyl diazo methane 2.0 M Solution in hexaneを０．５ｍｌ加えた。
５分間スターラーバーで攪拌しながら反応させた後、１Ｈ−ＮＭＲで反応が進んでいることを確認した。
活性物質の脂肪酸メチルエステルを６ｍｇ得た。この得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー［カラム：ＴＣ−ＦＦＡＰ（φ０．２５×６０ ｍｍ），キャリヤーガスＮ２流量：１．１８ｍｌ／ｍｉｎ，カラム温度：昇温１２０→２４０℃（１０℃／ｍｉｎ），検出器：ＦＩＤ］で分析を行った。
【００３３】
前記ＮＭＲスペクトル解析から、図２（Ａ）に示す、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのδｃ１８０．４のシグナルからカルボキシル基、δｃ１２８．７〜１３０．２のシグナルから二重結合が二つ存在することがわかった。
また、図２（Ｂ）に示す、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのδＨ０．８７のシグナルからアルキル鎖末端メチルプロトンが３Ｈ分、δＨ１．３０付近の重なったシグナルからメチレンプロトンが１４Ｈ分、δＨ １．６０のシグナルからカルボキシル基β位のメチレンプロトンが２Ｈ分、δＨ ２．０３のシグナルからアリル位のメチレンプロトンが４Ｈ分、δＨ ２．３３のシグナルからカルボキシル基のα位のメチレンプロトンが２Ｈ分、δＨ ２．７５のシグナルから二重結合にはさまれたメチレンプロトンが２Ｈ分、そしてδＨ ５．３４のシグナルからオレフィンプロトンの存在することがわかった。
以上のスペクトルより、活性物質がリノール酸であることが示唆された。標品リノール酸のＮＭＲの比較でもその可能性は強く示唆された。
【００３４】
単離されたウレアーゼ阻害活性物質をメチル化した後、図３（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、ガスクロマトグラフィー分析に供し、脂肪酸標品の保持時間を比較した。
リノール酸標品の保持時間１２．８７ｍｉｎと活性物質の主成分の保持時間１２．９０ｍｉｎが一致したので、この活性物質をリノール酸であると同定した。
その他の混合物に関して、保持時間１２．３５ｍｉｎのピークはオレイン酸、保持時間１３．５６ｍｉｎのピークはリノレイン酸であると同定された。保持時間１０．２７ｍｉｎのピークを示す物質は同定できなかった。しかし、リノール酸と活性物質の活性が同程度であったため、活性の中心がリノール酸であることは確認された。
【００３５】
単離されたウレアーゼ阻害活性物質のＮＭＲスペクトルを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８７（３Ｈ，ｔ），１．３０（１４Ｈ，ｍ），１．６１（２Ｈ，ｑｕｉｎｔ），２．０３（４Ｈ，ｑ），２．３３（２Ｈ，ｔ），２．７５（２Ｈ，ｍ），５．３４（４Ｈ，ｍ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．０，２２．６，２４．６，２５．６，２７．２，２７．２，２９．０，２９．０，２９．１，２９．３，２９．６，３１．５，３４．０，１２７．８，１２８．０，１３０．０，１３０．２，１８０．０。
標品リノール酸のＮＭＲスペクトルを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８７（３Ｈ，ｔ），１．３０（１４Ｈ，ｍ），１．６０（２Ｈ，ｑｕｉｎｔ），２．０３（４Ｈ，ｑ），２．３３（２Ｈ，ｔ），２．７５（２Ｈ，ｔ），５．３４（４Ｈ，ｍ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．１，２２．６，２４．６，２５．６，２７．２，２７．２，２９．０，２９．１，２９．１，２９．３，２９．６，３１．５，３４．１，１２７．９，１２８．１，１３０．０，１３０．２，１８０．４。
【００３６】
〔活性物質のウレアーゼ阻害活性測定法〕
次に、前記蒟蒻飛粉から単離、精製した活性物質のウレアーゼ阻害活性測定方法について説明する。具体的には、前記単離されたリノール酸の活性の強度を測定している。
【００３７】
以下の試薬を調製する。
（緩衝液の調製）
ＭＥＳ ５．３３１ｇをミリＱ水２５０ｍｌに溶かし、０．１ Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨ６．０に調整した。
（酵素の調製）
Ｊａｃｋ ｂｅａｎ由来のｕｒｅａｓｅ（東洋紡製）を用いた。２０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4０．１３６ｇをミリＱ水５０ｍｌに溶かしたものに、０．０２Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨ７．０に調整した。
以下の操作は氷冷しながら行った。それに０．５ Ｍ ＥＤＴＡ １ｍｌを加え、ミリＱ水で１００ｍｌにｆｉｌｌ ｕｐした（Ａ）。
５％ＢＳＡ ４０μｌに（Ａ）を９６０μｌ加える（Ｂ）。
（Ａ）４９．５ｍｌに（Ｂ）を５００μｌ加えたものにｕｒｅａｓｅ７．５ｍｇを溶かしたものをエッペンチューブに７００μｌずつ分注したものを冷蔵庫に保存しておき、使用する直前にこれを１０倍希釈したものを酵素溶液とした。
（発色試薬の調製）
フェノール５ｇとニトロプルシドナトリウム２５ｍｇをミリＱ水に溶解し、５００ｍｌにしたものを発色液Ａとした。ＮａＯＨ５ｇをミリＱ水５００ｍｌに溶解し、使用する直前に、この溶液１９．７ｍｌに次亜塩素酸ナトリウム溶液０．３ｍｌを加えたものを発色液Ｂとした。
（ｕｒｅａの調整）
ｕｒｅａ １２．０ｍｇをミリＱ水１００ｍｌに溶かしたのち、１０倍希釈して０．２ｍＭの溶液とした。
【００３８】
（実験方法）
酵素反応には以下に示す試薬を用いた。
緩衝溶液に３０ｍＭ（ｆｉｎａｌ） ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を用いた。
基質に０．２０ｍＭ ｕｒｅａを用いた。緩衝溶液１．２ｍｌにメタノール（コントロール）あるいはサンプル０．１ｍｌを加えたものに酵素０．２ｍｌを加え、３７℃で５分間プレインキュベートした。
次いで、基質０．５ｍｌを加えて反応を開始し、３７℃で２０分間インキュベートした後、反応溶液に発色液Ａ，Ｂをそれぞれ１ｍｌずつ加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。
そして、発生したアンモニアの量を６４０ｎｍにおける吸光度により測定した。
即ち、この系に阻害剤を加えて、未添加のコントロールとの比較から阻害活性を求めた。阻害率の算出は下記の式を用いた。
なお、吸光度の測定には島津製作所のuv mini-1240 uv-vis spectrophotometerを用いた。
阻害率 (%) = { (Abs.640 control - Abs.640 sample)/ Abs.640 control }×100
【００３９】
単離されたリノール酸についてウレアーゼ阻害活性試験を行った。
その結果を図４に示す。リノール酸のＩＣ50は８５．０μＭであった。これに対し、ウレアーゼ阻害物質として知られているアセトヒドロキサム酸のＩＣ50は２０．０ μＭであった。よって、今回単離されたリノール酸の活性は強いとは言えないものであった。
【００４０】
〔ウレアーゼ阻害活性に対する脂肪酸の構造活性相関〕
前記単離された活性物質がリノール酸であったことから、脂肪酸の構造活性相関を調べた。
具体的には、異なる構造の脂肪酸について炭素鎖長さを測定し、該炭素鎖長さが長くなるに従って強くなるウレアーゼ阻害活性度を測定している。
【００４１】
（実験方法）
炭素鎖の長さによる相関を調べるためにヘキサデセン酸 (16：1）オレイン酸 (18：1)、エイコセン酸 (20：1）、ドコセン酸 (22：1)のＩＣ50を求めた。
二重結合の数による相関を調べるためにオレイン 酸 (18：1）、リノール酸 (18：2）、リノレイン酸 (18：3)のＩＣ50を求めた。また、脂肪酸メチルエステルにも活性があるか調べるためにリノール酸メチルエステルのＩＣ50を求めた。
【００４２】
前記実験の結果を図５（Ａ）〜（Ｆ）に示す。
比較すると、炭素鎖が長くなるにつれて活性が強くなっていることがわかる。一方で、二重結合の数の違いによる大きな活性の違いは見られなかった。
また、リノール酸メチルエステルにもリノール酸と同程度の活性が見られた。これらの結果から、脂肪酸のウレアーゼ阻害活性は炭素鎖の長さに影響を受けていることが示唆された。
脂肪酸は炭素鎖が長いほど活性が強く、特に図５（Ｄ）に示すドコセン酸はＩＣ50が１４μMであり、アセトヒドロキサム酸よりも活性が強い。炭素鎖が長くなるにつれて活性が強くなる原因として、脂肪酸のウレアーゼ阻害が疎水性相互作用によって影響を受けていることが考えられる。
前記結果より、ウレアーゼ阻害活性物質は、炭素数１８〜２２の飽和または不飽和脂肪酸を含むものであり、前記不飽和脂肪酸がドコセン酸であることが好ましいことが示唆された。
【００４３】
〔リノール酸のウレアーゼに対する阻害様式の解析〕
（実験方法）
前記活性物質のウレアーゼ阻害活性測定法で用いた試薬を調製した。
酵素反応には以下に示す試薬を用いた。
緩衝溶液に３０ｍＭ（ｆｉｎａｌ） ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を用いた。基質に０．２０ｍＭ ｕｒｅａを用いた。緩衝溶液１．２ｍｌにメタノール（コントロール）を０．１ｍｌ加えたものに酵素０．２ｍｌを加え、３７℃で５分間プレインキュベートした。
次いで、基質０．５ｍｌを加えて反応を開始し、３７℃で０、５、１５、２０分間インキュベートした後、反応溶液に発色液Ａ，Ｂをそれぞれ１ｍｌずつ加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。
そして、発生したアンモニアの量を６４０ｎｍにおける吸光度により測定した。
アンモニア量の測定はあらかじめアンモニア量と吸光度Ａｂｓ６４０ｎｍの検量線を作成しておき、吸光度からアンモニア発生量を求めた。酵素反応時間とアンモニア発生量から初速度を求めた。
同様にして、基質であるｕｒｅａの濃度を０．１、０．１２５、０．１４３、０．２５、０．５ｍＭとした場合の初速度を求めた。そして、横軸に基質の濃度分の１、縦軸に初速度分の１をプロットすることでラインウイバー−バーク プロットを作成した。
次に、この系にメタノールのかわりに終濃度７０、１４０μＭのリノール酸を加え同様にラインウイバー−バーク プロットを作成した。
【００４４】
実験結果により作成したラインウイバー−バーク プロットを図６に示す。
図６に示すように、Kmは変化せず、Vmaxは減少していることがわかり、リノール酸のウレアーゼに対する阻害が非競合阻害であることが示された。
非競合阻害剤は酵素にも酵素基質複合体にも結合する。この型の阻害剤は基質アナログではなく、基質と同じ部位には結合しない。
このような非競合阻害はアロステリック酵素のなかに例が知られている。このような非競合阻害剤は酵素のコンホメーションを変化させ、基質は結合できるが、反応を触媒できない形に変えているのだと考えられている。
リノール酸を始め前記ウレアーゼ阻害活性がある脂肪酸は、基質である尿素とは構造は似ていない。このことからも脂肪酸がウレアーゼに対し、競合的ではなく非競合的に阻害を示していることを予想することができる。
【００４５】
前記した本発明の前記蒟蒻飛粉から生成するウレアーゼ阻害活性物質は、肥料、土壌改良剤として好適に用いられる。例えば、土壌改良剤はウレアーゼ阻害活性物質５〜１５重量％、窒素０．５〜２％を含有するものとしている。
【００４６】
さらに、ヒトに対し尿路感染症を引き起こすProteus mirabilisはウレアーゼによって発生させたアンモニアによってｐＨを上昇させ、尿路感染症治療に用いられるカテーテルに付着物がついたり、チューブの塞栓が起こったりといった問題が引き起こされる。これはカテーテル付近に感染したProteus mirabilisによってｐＨが上昇すると、周辺に存在するカルシウムおよびマグネシウム酸塩の結晶化が起こるためである。
よって、蒟蒻飛粉から取得したウレアーゼ阻害活性物質を、脂肪酸のヘキサン溶液に加え、該溶液をカテーテルの表面に塗布し、または、風船カテーテルの形成素材と樹脂に練り込んで、カテーテルの構成要素として好適に用いることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明はウレアーゼ阻害活性物質の生成方法および該方法で生成されたウレアーゼ阻害活性物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウレアーゼは尿素をアンモニアと二酸化炭素に分解する酵素であり、様々な細菌、菌類、および植物中など自然界の生物に広く分布している。本酵素は１９２６年にSumnerによりナタマメから初めて結晶化された酵素であり、その後、１９７５年には活性部位にニッケルを含んだ構造をしていることも明らかにされた。しかし、このような歴史のある酵素であり多くの研究がなされてきたにも関わらず、ウレアーゼの触媒様式はまだ分かっていない部分も多く、更なる研究が期待される酵素でもある。
植物はウレアーゼにより尿素を利用して成長のために必要な窒素源であるアンモニアを生育環境から得ると共に、植物体内においても窒素形態の変換の際に関わっていると推察されている。
【０００３】
その一方で、ウレアーゼによって発生したアンモニアによって問題が起こる場合もある。ピロリ菌 (Helicobacter pylori) や腸内細菌科に属するProteus mirabilisのウレアーゼは人間の疾病にも関わっている。
前者のピロリ菌は慢性胃炎、消化性潰瘍と密接な関係があり、通常の細菌が生育できない胃内の強酸性の環境 (ｐＨ１〜２) で生育することができることが特徴である。これは菌体表面に存在するウレアーゼにより胃内の尿素をアンモニアに変換し、菌体付近の胃酸を中和し生育に適したｐＨ環境にすることができるためである。
後者のProteus mirabilisは特に尿路感染症患者において認められる細菌である。本細菌の所有するウレアーゼは治療の際に使用される尿道カテーテルを覆う付着物の形成に関わっている。その形成プロセスはピロリ菌と同じくウレアーゼによって生成されるアンモニアが原因のｐＨ変化によって起こる。尿路感染症患者の体内においてProteus mirabilisは治療のために留置されたカテーテルに付着し、バイオフィルムを形成している。菌由来のウレアーゼの作用により体内の尿素からアンモニアが発生し、尿およびバイオフィルムの急激なｐＨ上昇が起こることによってバイオフィルム内のカルシウムおよびマグネシウムのリン酸塩の結晶の析出が起こる。カテーテル内の結晶の析出は、管の閉塞につながったり、腎孟腎炎といったさらなる疾病の原因となる可能性がある。
【０００４】
また、農業において、窒素肥料を植物が利用できる窒素源であるアンモニアに変えるウレアーゼは重要であるが、あまりにも迅速に加水分解が起こり、過剰なアンモニアが発生してしまうと、土壌のアルカリ化を引き起こしたり、アンモニアによって植物に損害をあたえたりするといった問題が起こる。
既にウレアーゼ阻害物質として知られているものには、フルオロファミド、ヒドロキシウレア、ヒドロキサム酸、アセトヒドロキサム酸といった化合物が存在する。しかし、中には生体毒性や不安定性を示すものがあり、例えばアセトヒドロキサム酸はラットに対し、催奇性を示すことから実用化には至っていない。
【０００５】
以上のことから、ウレアーゼ阻害活性物質は酵素への知見を深めるためにも重要であるだけでなく、医薬品としての利用あるいは農業のための利用といった幅広い応用を見込むことができる。
本発明者は以前から香辛料、糸状菌、食用植物のメタノール抽出物を対象としてナタマメ由来のウレアーゼを用いた酵素阻害試験によりウレアーゼ阻害活性物質を探索してきた。今まで単離されてきた化合物としてはsulfoquinovosyl diacylglycerol、5-geranyloxy-7-methoxycoumarin、5-geranyloxypsolarenなどがある。
【０００６】
一方、特開２００５−２０６４９３号公報（特許文献１）において、「芋類から有機溶媒及び／又は超臨界二酸化炭素により抽出される抽出物を有効成分とする抗ヘリコバクター・ピロリ剤、ヘリコバクター・ピロリ菌を原因とする胃又は十二指腸潰瘍に対する予防剤及び治療剤、ならびに予防用飲食品」が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２０６４９３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記特許文献１では、好ましい芋類の例として、蒟蒻芋が挙げられ、抽出溶媒として使用する有機溶媒として酢酸エチルが記載されているが、抽出物中の活性物質の単離および精製の具体的な方法等は開示されていない。
【０００９】
本発明は、蒟蒻芋からウレアーゼ阻害活性物質を単離・精製する精製方法等を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、第１の発明として、蒟蒻芋の製粉時に発生して廃棄物とされる蒟蒻飛粉を、メタノール溶液に浸漬し、減圧濾過してメタノール抽出液を取得し、
前記メタノール抽出液を減圧濃縮した後に加水し、このメタノール溶液を酢酸エチルで抽出して酢酸エチル抽出物を取得し、
前記酢酸エチル抽出物をカラムクロマトグラフィーで分画して、ウレアーゼ阻害活性物質を取得することを特徴とするウレアーゼ阻害活性物質の生成方法を提供している。
【００１１】
前記蒟蒻飛粉は蒟蒻芋から蒟蒻が製造される際の副産物である。蒟蒻飛粉は蒟蒻芋の約40%を占めるが、特有のエグ味や臭いを有するため食用には適さず、産業廃棄物として処理されているのが現状である。
本発明では、スクリーニングの結果、活性が認められた蒟蒻飛粉を有効利用し、蒟蒻飛粉のメタノール抽出物からのウレアーゼ阻害活性物質の単離・精製およびＮＭＲによる構造決定を行っている。
【００１２】
前記酢酸エチル抽出物の取得工程では、前記メタノール溶液を分液漏斗を用いて等量の酢酸エチルで複数回抽出することが好ましい。
【００１３】
前記カラムクロマトグラフィーでの分画工程では、酢酸エチル抽出物の半分量をワコーゲル Ｃ−２００に吸着させた後、n-ヘキサンで懸濁させて充填しておいたカラムの上端に載せ、n-ヘキサン-酢酸エチル-メタノール混合溶媒によるステップワイズ法で溶出し、２０〜３０％の酢酸エチル溶出画分として取得し、
ついで、カラムクロマトグラフィーでの分画工程は、酢酸エチル抽出物の半分量をワコーゲル（Ｗａｋｏｇｅｌ） Ｃ−２００に吸着させた後、n-ヘキサンで懸濁させて充填しておいたカラムの上端に載せ、n-ヘキサン-アセトン混合溶媒によるステップワイズ法で溶出し、溶出した６〜１５％アセトン溶出画分を前記ウレアーゼ阻害活性物質として取得している。
【００１４】
また、第２の発明として、第１の発明の生成方法で取得するウレアーゼ阻害活性物質の炭素鎖長さを測定し、該炭素鎖長さが長くなるに従って強くなるウレアーゼ阻害活性度を測定しているウレアーゼ阻害活性測定方法を提供している。
【００１５】
さらに、第３の発明として、第１の発明の生成方法で取得したウレアーゼ阻害活性物質を提供している。
【００１６】
前記ウレアーゼ阻害活性物質は、炭素数１８〜２２の飽和または不飽和脂肪酸を含むものである。また、前記不飽和脂肪酸がドコセン酸であることが好ましい。
【００１７】
さらに、本発明は、前記ウレアーゼ阻害活性物質を含む肥料、土壌改良剤を提供している。例えば、土壌改良剤はウレアーゼ阻害活性物質５〜１５重量％、窒素０．５〜２％を含有するものとしている。
【００１８】
さらに、本発明は前記ウレアーゼ阻害活性物質を含む尿道カテーテルを提供している。
例えば、ウレアーゼ阻害活性物質を脂肪酸のヘキサン溶液に加え、該溶液をカテーテルの表面に塗布し、または、風船カテーテルの形成素材と樹脂に練り込んでいる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明では、蒟蒻芋を製粉して蒟蒻製品を加工する際に発生する産業廃棄物となる蒟蒻飛粉を利用して、ウレアーゼ阻害活性物質を単離・精製することができ、該ウレアーゼ阻害活性物質は、肥料、土地改良剤、尿道カテーテル等と幅広く用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明のウレアーゼ阻害活性物質の生成方法を示す工程図である。
【図２】（Ａ）（Ｂ）はウレアーゼ阻害活性物質のＮＭＲスペクトルを示すグラフである。
【図３】（Ａ）〜（Ｄ）はウレアーゼ阻害活性物質のガスクロマトグラフィー分析を示すグラフである。
【図４】リノール酸の阻害率を示すグラフである。
【図５】（Ａ）〜（Ｆ）は脂肪酸類の濃度と阻害率との関係より阻害活性を示すグラフである。
【図６】ラインウイバー−バーク プロットのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
〔ウレアーゼ阻害活性物質の単離・精製〕
図１に示す工程で、こんにゃく芋の飛粉からウレアーゼ阻害活性物質を精製している。
具体的には、蒟蒻飛粉１０ｋｇをメタノールに浸漬し、濃縮後、酢酸エチルで分液し、得られた酢酸エチル抽出物を各種混合溶媒系でワコーゲル Ｃ−２００カラムクロマトグラフィーで精製を進め、ウレアーゼ阻害活性物質を１８０ｍｇ取得している。
以下に、各工程を詳述する。
【００２２】
（第一工程＃１のメタノール抽出工程）
蒟蒻芋の製粉時に発生して廃棄物とされる蒟蒻飛粉（１０ｋｇ）を、メタノール溶液（１５Ｌ）に７日間浸漬し、減圧濾過してメタノール抽出液（１０Ｌ）を取得した。
【００２３】
（第二工程＃２の分配抽出工程 ）
得られたメタノール抽出液約１０Ｌを約１００ｍｌに減圧濃縮した後、水９００ｍｌを加え、これを分液漏斗を用いて等量の酢酸エチルで３回抽出した。
酢酸エチル相の阻害率は１０００ｐｐｍ（ｆｉｎａｌ）において３２％であった。
【００２４】
〔酢酸エチル抽出物に含まれる阻害活性物質の分離工程〕
（第三工程＃３の濃縮工程）
抽出した酢酸エチルを減圧下濃縮し、酢酸エチル抽出物（１５．６ｇ）を取得した。
【００２５】
（第四工程＃４でワコーゲルＣ−２００カラムクロマト工程）
第三工程で得られた酢酸エチル抽出物１５．６ｇの半分量の７．８ｇをワコーゲル Ｃ−２００（１５．６ｇ）に吸着させた後、あらかじめn-ヘキサンで懸濁させ充填しておいたカラム （７８ｇ）の上端にのせ、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル−メタノール混合溶媒系（１００％ ｎ−ヘキサン、２０％、３０％、４０％、０％、１００％ 酢酸エチル，９０％、８０％、５０％メタノール） によるステップワイズ法で溶出した。
ウレアーゼ阻害活性試験を行い、活性物質を含む画分の確認を行った。その結果、20%〜30% 酢酸エチル溶出画分に活性が認められた。
【００２６】
（第五工程＃５でのワコーゲル Ｃ−２００カラムクロマト工程）
前記第四工程で得られた２０％〜３０％ 酢酸エチル溶出画分４ｇを前段階と同様にワコーゲル Ｃ−２００ (６g) に吸着させた後、あらかじめn-ヘキサンで懸濁させ充填しておいたカラム (４０g) の上端にのせ、n-ヘキサン-アセトン混合溶媒系による３％ステップワイズ法で溶出した。ウレアーゼ阻害活性試験を行い、活性物質を含む画分の確認を行ったところ、６〜１５％アセトン溶出画分に強い阻害が認められた。
【００２７】
（第六工程＃６でのワコーゲル Ｃ−２００カラムクロマト）
第五工程で得られた画分のうち最も量の多かった６％アセトン溶出画分について、前段階と同様にワコーゲルＣ−２００（４．５ｇ） に吸着させた後、あらかじめn-ヘキサンで懸濁させ充填しておいたカラム (３０g) の上端にのせ、n-ヘキサン-アセトン混合溶媒系による１％ ステップワイズ法で溶出した。ウレアーゼ阻害活性試験を行い、活性物質を含む画分の確認を行った。その結果7% アセトン溶出画分にて活性物質が１８０ｍｇ得られた。
【００２８】
前記のように、蒟蒻飛粉１０ｋｇから得られたメタノール抽出物を溶媒分画したところ、酢酸エチル相に活性が認められた。酢酸エチル相を減圧濃縮後、ワコーゲルＣ−２００カラムクロマトグラフィーで精製を進めた。その結果、ウレアーゼ阻害活性物質を１８０mg得た。精製には、ナタマメ由来のウレアーゼを用いた酵素阻害試験、ＴＬＣにおける紫外線吸収、および硫酸試薬による呈色を指標とした。
【００２９】
〔ウレアーゼ阻害活性物質について構造解析および化合物の同定〕
前記工程で蒟蒻飛粉から取得したウレアーゼ阻害活性物質の構造解析および構造決定について以下に説明する。
【００３０】
構造解析および構造決定を行う実験方法として、下記のＮＭＲスペクトル解析とガスクロマトグラフィー分析方法とを採用した。
【００３１】
（ＮＭＲスペクトル解析）
ウレアーゼ阻害活性物質を真空ポンプにて減圧乾燥させ溶媒を除去し、ＮＭＲ測定用溶媒のＣＤＣｌ３に溶解させた。これを日本電子製ＪＮＭ−ＡＬ４００を用いて１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを測定した。ケミカルシフト値はＮＭＲ測定溶媒のシグナルを内部標準とし、δで示した。
【００３２】
（ガスクロマトグラフィー分析）
ＮＭＲスペクトルの結果から活性物質がリノール酸と強く示唆された。
そこで、ガスクロマトグラフィー分析を行い、脂肪酸の標品と比較することで活性物質の同定を行った。
活性物質約１０ｍｇをＭｅＯＨ２ｍｌに溶かし、メチル化剤Trimethyl silyl diazo methane 2.0 M Solution in hexaneを０．５ｍｌ加えた。
５分間スターラーバーで攪拌しながら反応させた後、１Ｈ−ＮＭＲで反応が進んでいることを確認した。
活性物質の脂肪酸メチルエステルを６ｍｇ得た。この得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー［カラム：ＴＣ−ＦＦＡＰ（φ０．２５×６０ ｍｍ），キャリヤーガスＮ２流量：１．１８ｍｌ／ｍｉｎ，カラム温度：昇温１２０→２４０℃（１０℃／ｍｉｎ），検出器：ＦＩＤ］で分析を行った。
【００３３】
前記ＮＭＲスペクトル解析から、図２（Ａ）に示す、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルのδｃ１８０．４のシグナルからカルボキシル基、δｃ１２８．７〜１３０．２のシグナルから二重結合が二つ存在することがわかった。
また、図２（Ｂ）に示す、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルのδＨ０．８７のシグナルからアルキル鎖末端メチルプロトンが３Ｈ分、δＨ１．３０付近の重なったシグナルからメチレンプロトンが１４Ｈ分、δＨ １．６０のシグナルからカルボキシル基β位のメチレンプロトンが２Ｈ分、δＨ ２．０３のシグナルからアリル位のメチレンプロトンが４Ｈ分、δＨ ２．３３のシグナルからカルボキシル基のα位のメチレンプロトンが２Ｈ分、δＨ ２．７５のシグナルから二重結合にはさまれたメチレンプロトンが２Ｈ分、そしてδＨ ５．３４のシグナルからオレフィンプロトンの存在することがわかった。
以上のスペクトルより、活性物質がリノール酸であることが示唆された。標品リノール酸のＮＭＲの比較でもその可能性は強く示唆された。
【００３４】
単離されたウレアーゼ阻害活性物質をメチル化した後、図３（Ａ）〜（Ｄ）に示すように、ガスクロマトグラフィー分析に供し、脂肪酸標品の保持時間を比較した。
リノール酸標品の保持時間１２．８７ｍｉｎと活性物質の主成分の保持時間１２．９０ｍｉｎが一致したので、この活性物質をリノール酸であると同定した。
その他の混合物に関して、保持時間１２．３５ｍｉｎのピークはオレイン酸、保持時間１３．５６ｍｉｎのピークはリノレイン酸であると同定された。保持時間１０．２７ｍｉｎのピークを示す物質は同定できなかった。しかし、リノール酸と活性物質の活性が同程度であったため、活性の中心がリノール酸であることは確認された。
【００３５】
単離されたウレアーゼ阻害活性物質のＮＭＲスペクトルを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８７（３Ｈ，ｔ），１．３０（１４Ｈ，ｍ），１．６１（２Ｈ，ｑｕｉｎｔ），２．０３（４Ｈ，ｑ），２．３３（２Ｈ，ｔ），２．７５（２Ｈ，ｍ），５．３４（４Ｈ，ｍ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．０，２２．６，２４．６，２５．６，２７．２，２７．２，２９．０，２９．０，２９．１，２９．３，２９．６，３１．５，３４．０，１２７．８，１２８．０，１３０．０，１３０．２，１８０．０。
標品リノール酸のＮＭＲスペクトルを以下に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ０．８７（３Ｈ，ｔ），１．３０（１４Ｈ，ｍ），１．６０（２Ｈ，ｑｕｉｎｔ），２．０３（４Ｈ，ｑ），２．３３（２Ｈ，ｔ），２．７５（２Ｈ，ｔ），５．３４（４Ｈ，ｍ）。
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１４．１，２２．６，２４．６，２５．６，２７．２，２７．２，２９．０，２９．１，２９．１，２９．３，２９．６，３１．５，３４．１，１２７．９，１２８．１，１３０．０，１３０．２，１８０．４。
【００３６】
〔活性物質のウレアーゼ阻害活性測定法〕
次に、前記蒟蒻飛粉から単離、精製した活性物質のウレアーゼ阻害活性測定方法について説明する。具体的には、前記単離されたリノール酸の活性の強度を測定している。
【００３７】
以下の試薬を調製する。
（緩衝液の調製）
ＭＥＳ ５．３３１ｇをミリＱ水２５０ｍｌに溶かし、０．１ Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨ６．０に調整した。
（酵素の調製）
Ｊａｃｋ ｂｅａｎ由来のｕｒｅａｓｅ（東洋紡製）を用いた。２０ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4０．１３６ｇをミリＱ水５０ｍｌに溶かしたものに、０．０２Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨ７．０に調整した。
以下の操作は氷冷しながら行った。それに０．５ Ｍ ＥＤＴＡ １ｍｌを加え、ミリＱ水で１００ｍｌにｆｉｌｌ ｕｐした（Ａ）。
５％ＢＳＡ ４０μｌに（Ａ）を９６０μｌ加える（Ｂ）。
（Ａ）４９．５ｍｌに（Ｂ）を５００μｌ加えたものにｕｒｅａｓｅ７．５ｍｇを溶かしたものをエッペンチューブに７００μｌずつ分注したものを冷蔵庫に保存しておき、使用する直前にこれを１０倍希釈したものを酵素溶液とした。
（発色試薬の調製）
フェノール５ｇとニトロプルシドナトリウム２５ｍｇをミリＱ水に溶解し、５００ｍｌにしたものを発色液Ａとした。ＮａＯＨ５ｇをミリＱ水５００ｍｌに溶解し、使用する直前に、この溶液１９．７ｍｌに次亜塩素酸ナトリウム溶液０．３ｍｌを加えたものを発色液Ｂとした。
（ｕｒｅａの調整）
ｕｒｅａ １２．０ｍｇをミリＱ水１００ｍｌに溶かしたのち、１０倍希釈して０．２ｍＭの溶液とした。
【００３８】
（実験方法）
酵素反応には以下に示す試薬を用いた。
緩衝溶液に３０ｍＭ（ｆｉｎａｌ） ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を用いた。
基質に０．２０ｍＭ ｕｒｅａを用いた。緩衝溶液１．２ｍｌにメタノール（コントロール）あるいはサンプル０．１ｍｌを加えたものに酵素０．２ｍｌを加え、３７℃で５分間プレインキュベートした。
次いで、基質０．５ｍｌを加えて反応を開始し、３７℃で２０分間インキュベートした後、反応溶液に発色液Ａ，Ｂをそれぞれ１ｍｌずつ加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。
そして、発生したアンモニアの量を６４０ｎｍにおける吸光度により測定した。
即ち、この系に阻害剤を加えて、未添加のコントロールとの比較から阻害活性を求めた。阻害率の算出は下記の式を用いた。
なお、吸光度の測定には島津製作所のuv mini-1240 uv-vis spectrophotometerを用いた。
阻害率 (%) = { (Abs.640 control - Abs.640 sample)/ Abs.640 control }×100
【００３９】
単離されたリノール酸についてウレアーゼ阻害活性試験を行った。
その結果を図４に示す。リノール酸のＩＣ50は８５．０μＭであった。これに対し、ウレアーゼ阻害物質として知られているアセトヒドロキサム酸のＩＣ50は２０．０ μＭであった。よって、今回単離されたリノール酸の活性は強いとは言えないものであった。
【００４０】
〔ウレアーゼ阻害活性に対する脂肪酸の構造活性相関〕
前記単離された活性物質がリノール酸であったことから、脂肪酸の構造活性相関を調べた。
具体的には、異なる構造の脂肪酸について炭素鎖長さを測定し、該炭素鎖長さが長くなるに従って強くなるウレアーゼ阻害活性度を測定している。
【００４１】
（実験方法）
炭素鎖の長さによる相関を調べるためにヘキサデセン酸 (16：1）オレイン酸 (18：1)、エイコセン酸 (20：1）、ドコセン酸 (22：1)のＩＣ50を求めた。
二重結合の数による相関を調べるためにオレイン 酸 (18：1）、リノール酸 (18：2）、リノレイン酸 (18：3)のＩＣ50を求めた。また、脂肪酸メチルエステルにも活性があるか調べるためにリノール酸メチルエステルのＩＣ50を求めた。
【００４２】
前記実験の結果を図５（Ａ）〜（Ｆ）に示す。
比較すると、炭素鎖が長くなるにつれて活性が強くなっていることがわかる。一方で、二重結合の数の違いによる大きな活性の違いは見られなかった。
また、リノール酸メチルエステルにもリノール酸と同程度の活性が見られた。これらの結果から、脂肪酸のウレアーゼ阻害活性は炭素鎖の長さに影響を受けていることが示唆された。
脂肪酸は炭素鎖が長いほど活性が強く、特に図５（Ｄ）に示すドコセン酸はＩＣ50が１４μMであり、アセトヒドロキサム酸よりも活性が強い。炭素鎖が長くなるにつれて活性が強くなる原因として、脂肪酸のウレアーゼ阻害が疎水性相互作用によって影響を受けていることが考えられる。
前記結果より、ウレアーゼ阻害活性物質は、炭素数１８〜２２の飽和または不飽和脂肪酸を含むものであり、前記不飽和脂肪酸がドコセン酸であることが好ましいことが示唆された。
【００４３】
〔リノール酸のウレアーゼに対する阻害様式の解析〕
（実験方法）
前記活性物質のウレアーゼ阻害活性測定法で用いた試薬を調製した。
酵素反応には以下に示す試薬を用いた。
緩衝溶液に３０ｍＭ（ｆｉｎａｌ） ＭＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）を用いた。基質に０．２０ｍＭ ｕｒｅａを用いた。緩衝溶液１．２ｍｌにメタノール（コントロール）を０．１ｍｌ加えたものに酵素０．２ｍｌを加え、３７℃で５分間プレインキュベートした。
次いで、基質０．５ｍｌを加えて反応を開始し、３７℃で０、５、１５、２０分間インキュベートした後、反応溶液に発色液Ａ，Ｂをそれぞれ１ｍｌずつ加え、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。
そして、発生したアンモニアの量を６４０ｎｍにおける吸光度により測定した。
アンモニア量の測定はあらかじめアンモニア量と吸光度Ａｂｓ６４０ｎｍの検量線を作成しておき、吸光度からアンモニア発生量を求めた。酵素反応時間とアンモニア発生量から初速度を求めた。
同様にして、基質であるｕｒｅａの濃度を０．１、０．１２５、０．１４３、０．２５、０．５ｍＭとした場合の初速度を求めた。そして、横軸に基質の濃度分の１、縦軸に初速度分の１をプロットすることでラインウイバー−バーク プロットを作成した。
次に、この系にメタノールのかわりに終濃度７０、１４０μＭのリノール酸を加え同様にラインウイバー−バーク プロットを作成した。
【００４４】
実験結果により作成したラインウイバー−バーク プロットを図６に示す。
図６に示すように、Kmは変化せず、Vmaxは減少していることがわかり、リノール酸のウレアーゼに対する阻害が非競合阻害であることが示された。
非競合阻害剤は酵素にも酵素基質複合体にも結合する。この型の阻害剤は基質アナログではなく、基質と同じ部位には結合しない。
このような非競合阻害はアロステリック酵素のなかに例が知られている。このような非競合阻害剤は酵素のコンホメーションを変化させ、基質は結合できるが、反応を触媒できない形に変えているのだと考えられている。
リノール酸を始め前記ウレアーゼ阻害活性がある脂肪酸は、基質である尿素とは構造は似ていない。このことからも脂肪酸がウレアーゼに対し、競合的ではなく非競合的に阻害を示していることを予想することができる。
【００４５】
前記した本発明の前記蒟蒻飛粉から生成するウレアーゼ阻害活性物質は、肥料、土壌改良剤として好適に用いられる。例えば、土壌改良剤はウレアーゼ阻害活性物質５〜１５重量％、窒素０．５〜２％を含有するものとしている。
【００４６】
さらに、ヒトに対し尿路感染症を引き起こすProteus mirabilisはウレアーゼによって発生させたアンモニアによってｐＨを上昇させ、尿路感染症治療に用いられるカテーテルに付着物がついたり、チューブの塞栓が起こったりといった問題が引き起こされる。これはカテーテル付近に感染したProteus mirabilisによってｐＨが上昇すると、周辺に存在するカルシウムおよびマグネシウム酸塩の結晶化が起こるためである。
よって、蒟蒻飛粉から取得したウレアーゼ阻害活性物質を、脂肪酸のヘキサン溶液に加え、該溶液をカテーテルの表面に塗布し、または、風船カテーテルの形成素材と樹脂に練り込んで、カテーテルの構成要素として好適に用いることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蒟蒻芋の製粉時に発生して廃棄物とされる蒟蒻飛粉を、メタノール溶液に浸漬し、減圧濾過してメタノール抽出液を取得し、
前記メタノール抽出液を減圧濃縮した後に加水し、このメタノール溶液を酢酸エチルで抽出して酢酸エチル抽出物を取得し、
前記酢酸エチル抽出物をカラムクロマトグラフィーで分画して、ウレアーゼ阻害活性物質を取得することを特徴とするウレアーゼ阻害活性物質の生成方法。
【請求項２】
前記酢酸エチル抽出物の取得工程では、前記メタノール溶液を分液漏斗を用いて等量の酢酸エチルで複数回抽出している請求項１に記載のウレアーゼ阻害活性物質の生成方法。
【請求項３】
前記カラムクロマトグラフィーでの分画工程では、酢酸エチル抽出物の半分量をワコーゲル Ｃ−２００に吸着させた後、n-ヘキサンで懸濁させて充填しておいたカラムの上端に載せ、n-ヘキサン-酢酸エチル-メタノール混合溶媒によるステップワイズ法で溶出し、２０〜３０％の酢酸エチル溶出画分として取得し、
ついで、カラムクロマトグラフィーでの分画工程は、酢酸エチル抽出物の半分量をワコーゲル Ｃ−２００に吸着させた後、n-ヘキサンで懸濁させて充填しておいたカラムの上端に載せ、n-ヘキサン-アセトン混合溶媒によるステップワイズ法で溶出し、溶出した６％〜１５％アセトン溶出画分を前記ウレアーゼ阻害活性物質として取得している請求項１または請求項２に記載のウレアーゼ阻害活性物質の生成方法。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の生成方法で取得するウレアーゼ阻害活性物質の炭素鎖長さを測定し、該炭素鎖長さが長くなるに従って強くなるウレアーゼ阻害活性度を測定しているウレアーゼ阻害活性測定方法。
【請求項５】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の生成方法で取得したウレアーゼ阻害活性物質。
【請求項６】
炭素数１８〜２２の飽和または不飽和脂肪酸を含む請求項５に記載のウレアーゼ阻害活性物質。
【請求項７】
前記脂肪酸がドコセン酸である請求項６に記載のウレアーゼ阻害活性物質。
【請求項８】
請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載のウレアーゼ阻害活性物質を含む肥料。
【請求項９】
請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載のウレアーゼ阻害活性物質を含む土壌改良剤。
【請求項１０】
請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載のウレアーゼ阻害活性物質を含む尿道カテーテル。
【請求項１】
蒟蒻芋の製粉時に発生して廃棄物とされる蒟蒻飛粉を、メタノール溶液に浸漬し、減圧濾過してメタノール抽出液を取得し、
前記メタノール抽出液を減圧濃縮した後に加水し、このメタノール溶液を酢酸エチルで抽出して酢酸エチル抽出物を取得し、
前記酢酸エチル抽出物をカラムクロマトグラフィーで分画して、ウレアーゼ阻害活性物質を取得することを特徴とするウレアーゼ阻害活性物質の生成方法。
【請求項２】
前記酢酸エチル抽出物の取得工程では、前記メタノール溶液を分液漏斗を用いて等量の酢酸エチルで複数回抽出している請求項１に記載のウレアーゼ阻害活性物質の生成方法。
【請求項３】
前記カラムクロマトグラフィーでの分画工程では、酢酸エチル抽出物の半分量をワコーゲル Ｃ−２００に吸着させた後、n-ヘキサンで懸濁させて充填しておいたカラムの上端に載せ、n-ヘキサン-酢酸エチル-メタノール混合溶媒によるステップワイズ法で溶出し、２０〜３０％の酢酸エチル溶出画分として取得し、
ついで、カラムクロマトグラフィーでの分画工程は、酢酸エチル抽出物の半分量をワコーゲル Ｃ−２００に吸着させた後、n-ヘキサンで懸濁させて充填しておいたカラムの上端に載せ、n-ヘキサン-アセトン混合溶媒によるステップワイズ法で溶出し、溶出した６％〜１５％アセトン溶出画分を前記ウレアーゼ阻害活性物質として取得している請求項１または請求項２に記載のウレアーゼ阻害活性物質の生成方法。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の生成方法で取得するウレアーゼ阻害活性物質の炭素鎖長さを測定し、該炭素鎖長さが長くなるに従って強くなるウレアーゼ阻害活性度を測定しているウレアーゼ阻害活性測定方法。
【請求項５】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の生成方法で取得したウレアーゼ阻害活性物質。
【請求項６】
炭素数１８〜２２の飽和または不飽和脂肪酸を含む請求項５に記載のウレアーゼ阻害活性物質。
【請求項７】
前記脂肪酸がドコセン酸である請求項６に記載のウレアーゼ阻害活性物質。
【請求項８】
請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載のウレアーゼ阻害活性物質を含む肥料。
【請求項９】
請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載のウレアーゼ阻害活性物質を含む土壌改良剤。
【請求項１０】
請求項５乃至請求項７のいずれか１項に記載のウレアーゼ阻害活性物質を含む尿道カテーテル。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１１−６３５７１（Ｐ２０１１−６３５７１Ａ）
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１８１３１（Ｐ２００９−２１８１３１）
【出願日】平成２１年９月１８日（２００９．９．１８）
【出願人】（５９７０３０４０８）
【出願人】（５９３１８８４３１）株式会社オーカワ (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１８日（２００９．９．１８）
【出願人】（５９７０３０４０８）
【出願人】（５９３１８８４３１）株式会社オーカワ (5)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]