エナンチオピュアな中間体の酵素合成
本発明は、価値のある薬学的に活性な化合物、たとえばＭＡＯＢインヒビターの合成に有用なエナンチオピュアな中間体の製造方法、ならびに式（Ｉ）および（II）の新規な中間体（式中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24は、明細書および請求項に定義の通りである）に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、価値のある薬学的に活性な化合物の合成に有用なエナンチオピュアな中間体の製造方法、および新規な中間体に関するものである。
【０００２】
さらに詳しくは、本発明は式Ｉ：
【０００３】
【化６】
【０００４】
（式中、Ｒ21、Ｒ22およびＲ23は、互いに独立に、水素またはハロゲンであり、
Ｒ24は、水素、メチル、またはハロゲンである）の化合物および／または式II：
【０００５】
【化７】
【０００６】
［式中、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、Ｃ2〜Ｃ4アルケニル、または式Ａ：
【０００７】
【化８】
【０００８】
（式中、Ｒ3は、水素またはＣ1〜Ｃ4アルキルであり、ｎは、１、２、または３である）の基であり、
Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24は、前記定義の意味を有する］の化合物の製造方法であって、
式III：
【０００９】
【化９】
【００１０】
（式中、Ｒ1、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24は、前記定義の意味を有する）の化合物を、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程を含む製造方法を提供する。
【００１１】
本明細書で示す構造式中、くさび形の結合：
【００１２】
【化１０】
【００１３】
は、置換基が紙の面より上であることを意味する。
【００１４】
本明細書で示す構造式中、点線の結合：
【００１５】
【化１１】
【００１６】
は、置換基が紙の面より下であることを意味する。
【００１７】
本明細書で用いる用語「アルキル」は、１〜８個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の炭化水素残基、たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルを意味し、これらの種々の異性体を含む。好ましくは、用語「アルキル」は、非置換であっても、１個以上の置換基で置換されていてもよい１〜５個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状炭化水素残基を意味する。置換基の例は、ヒドロキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキル、アリール、およびハロゲン原子を含む。置換アルキルの例は、３−ヒドロキシブチル、４−メトキシブチル、３−エトキシプロピル、３−シクロヘキシルプロピル、ベンジル、２−フェニルエチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、２，２−ジクロロエチル、３−ブロモプロピル、または２，２，２−トリフルオロエチルなどを含む。アルケニルの例は、ビニル、アリル、イソプロペニル、ブテニル、およびブテニルの異性体、たとえば１−または２−ブテニルを含む。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルを含む。
【００１８】
ハロゲンの例は、フッ素、塩素および臭素を含む。
【００１９】
コレステラーゼ（EC 3.1.1.13）は、幅の広い特異性の酵素のグループであり、コレステロールエステラーゼ；コレステリルエステルシンターゼ；トリテルペノールエステラーゼ；コレステリルエステラーゼ；コレステリルエステルヒドロラーゼ；ステロールエステルヒドロラーゼ、またはコレステロールエステルヒドロラーゼとも呼ばれる。これは、エステラーゼ、プロテアーゼ、およびリパーゼも含むヒドロラーゼのグループに属する。
【００２０】
酵母に由来するコレステラーゼの例は、カンジダ（Candida）属から、たとえばカンジダシリンドラシア（Candida cylindracea）に由来するコレステラーゼを含む。たとえば、コレステラーゼは、カンジダシリンドラシアから得られる市販Lipase MY（Meito Sangyo, Japan）から精製することにより得ることができる。精製は不完全でよい。酵母に由来する市販コレステラーゼの例は、Roche Applied Science, Industrial Products, Enzyme Projects, Sandhofer Str. 116, D-68305 Mannheim, Germany, オーダー番号、たとえば10129046103（固体剤）、0393916、または039800（液体剤）により販売されているカンジダシリンドラシアからのコレステラーゼである。
【００２１】
したがって１態様では、本発明は、酵母に由来するコレステラーゼが、カンジダシリンドラシアのコレステラーゼである方法を提供する。
【００２２】
酵母に由来するコレステラーゼは、可溶性の形態または固定化した形態で用いることができる。酵素を固定する方法の種々の選択は、当業者に公知である。
【００２３】
酵素反応は、水中または水−有機系中で行うことができる。
【００２４】
基質、すなわち式IIIの化合物は、たとえば懸濁液として適用することができる。濃度は、０．５〜２０％の総濃度（w／w）の範囲、または２〜１０％の範囲とすることができる。式IIIの化合物は、イタコン酸と、場合により置換されたアミノフェノールとから公知方法により製造することができる。
【００２５】
１態様では、本発明は、式III中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24が、互いに独立に、水素またはフッ素である方法を提供する。別の態様では、本発明は式III中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24が、水素である方法を提供する。別の態様では、本発明は、式III中、Ｒ1がメチルまたはエチルである方法を提供する。
【００２６】
１態様では、本発明は、（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシルフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルを、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程を含む、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸および（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルの製造方法を提供する。
【００２７】
生化学的転化のために用いる公知の一般的な緩衝剤溶液、たとえばリン酸緩衝液または酢酸緩衝液などを用いることができる。緩衝剤濃度は、１Mまでの範囲、または約３〜２５０mMの範囲とすることができる。
【００２８】
酵素反応は、有機補助溶剤の存在下で行うことができる。有機補助溶剤は、水混和性または水不混和性の補助溶剤とすることができる。水混和性の有機補助溶剤が存在する場合、その総濃度は３０％までまたは２５％までとすることができる。水不混和性の有機補助溶剤は、任意の比の総濃度で用いることができる。
【００２９】
有機補助溶剤の例は、技術的に一般的な溶剤、たとえばエーテル（たとえばテトラヒドロフラン、ジオキサン、またはｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ））、低級アルコール（たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール）、エステル（たとえば酢酸エチル）、極性非プロトン性溶剤（たとえばジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、またはアセトン）、およびアルカン（たとえばヘプタン）、またはシクロアルカン（たとえばシクロヘキサンまたはメチルシクロヘキサン）を含む。
【００３０】
したがって、１態様では、本発明は、水不混和性補助溶剤、たとえば、ＴＢＭＥ、ヘプタン、シクロヘキサンおよびメチルシクロヘキサンから選択される有機補助溶剤の存在下で酵素反応を行う方法を提供する。別の態様では、本発明は、シクロヘキサンまたはメチルシクロヘキサンの存在下で酵素反応を行う方法を提供する。
【００３１】
酵素反応は水溶性の添加剤の存在下、たとえば塩、ポリオール、ポリエチレングリコール、またはこれらの誘導体の存在下で行うことができる。これらの添加剤は、酵素に活性化、選択性誘発、または安定化の効果を及ぼすことができる。
【００３２】
塩の例は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含むが、他の添加剤、たとえばＬｉＳＣＮ、Ｎａ2ＳＯ4、およびＭｇ2ＳＯ4も含む。特に水性緩衝液は、公知の酵素活性化剤であるマグネシウムイオンを含有することができる。塩は、１Mまでの範囲、または０．５Mまでの範囲の濃度で存在することができる。
【００３３】
したがって、１態様では、本発明は、マグネシウム塩の存在下で酵素反応を行う方法を提供する。
【００３４】
ポリオールの例は、グリセロールおよび糖を含む。ポリオールは、水相の４０％（w／w）までの濃度で存在することができる。
【００３５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、場合によりモノ−またはジメチルエーテルとして、５０％（w/v）までの範囲、あるいは５％〜２５％の範囲の濃度で用いることができる。たとえば、４〜６kDの範囲のＰＥＧを、場合によりモノ−またはジメチルエーテルとして、用いることができる。
【００３６】
酵素の添加後、反応混合物のｐＨを、選択したｐＨ値、たとえば酵素反応が起こりうるｐＨ３．５〜１０．０の範囲のｐＨに、またはｐＨ４．０〜８．０の範囲のｐＨに、またはｐＨ５．５〜７．０の範囲のｐＨに維持することができる。一定のｐＨ値は、当業者に公知の方法により、たとえば塩基、たとえば水酸化ナトリウムもしくはカリウムまたは重炭酸ナトリウムもしくはカリウムの水溶液の制御された添加、あるいは十分な緩衝能を有する緩衝液の選択により維持される。
【００３７】
酵素反応は、４〜４５℃の範囲の温度で、または１５〜３５℃の範囲の温度で、または２６〜３２℃の範囲の温度で行うことができる。
【００３８】
反応の停止後、式Ｉの化合物および式IIの化合物を、抽出により分離することができる。
【００３９】
たとえば、式IIの化合物は、反応混合物を適切な有機溶剤、たとえばジクロロメタンで抽出することにより、従来どおりに精製することができる。この溶液を濃縮すると、式IIの化合物を結晶させることができ、これによりその光学純度を容易に高くすることができる。
【００４０】
水相中に残存する式Ｉの対掌化合物は、次に水相を低いｐＨ値で抽出することにより単離することができる。これは通常、保持された水相を酸性化し形成された沈殿をろ別するか、または適切な有機溶剤、たとえば酢酸エチルで抽出することにより達成することができる。この溶液を濃縮すると、式Ｉの化合物を結晶させることができ、これによりその光学純度を高くすることができる。
【００４１】
したがって、１態様では、本発明は、
（ａ）式IIIの化合物を、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程、および
（ｂ）得られた式Ｉの化合物および得られた式IIの化合物を、別々のｐＨで抽出することにより分離する工程
を含む、式Ｉの化合物および／または式IIの化合物の製造方法を提供する。
【００４２】
水溶性の添加剤が式Ｉの化合物または式IIとともに同時抽出される場合、それぞれの反応生成物を添加剤から分離するために、さらなる抽出工程が必要であるかもしれない。あるいはまた、吸着樹脂またはイオン交換樹脂を使用することもできる。適用する特定の抽出方式の選択は、当業者の技術の内であり、そして添加剤（たとえばＰＥＧ添加剤）の特定の性質に依存する。たとえば、ポリエチレンは、たとえばジクロロメタンで抽出することにより式Ｉの化合物から分離することができ（保持された式IIの化合物との同時抽出により）、続いて式IIの化合物の保持された画分から、酢酸エチルによって溶剤変更するかまたは粉砕／温浸することにより分離することができる（ポリエチレンは、これらの条件下で不溶性である）。
【００４３】
本発明の方法から得られた化合物、すなわち式Ｉの化合物および式IIの化合物を、当業者に公知の、カルボン酸またはエステル官能性での誘導反応に供し、たとえばカルボキサミド、Ｎ−置換カルボキサミド、Ｎ，Ｎ−二置換カルボキサミド、カルボキサミジン、Ｎ−ヒドロキシ−カルボキサミジン、カルボン酸ヒドロキサミド、カルボン酸ヒドラジド、カルボニトリル、カルバルデヒド、ケトン、イソシアネート、イソチオシアネート、カルバメート、尿素、Ｎ−置換尿素、Ｎ，Ｎ−二置換尿素、第一級、第二級および第三級アミン、Ｎ−アミド、グアニジン、アミノメチル−、ヒドロキシメチル誘導体、ならびにエステル誘導体のような化合物をもたらすことができる。
【００４４】
このような化合物の例は、式IVａまたは式IVｂ：
【００４５】
【化１２】
【００４６】
（式中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24は、式Ｉ、IIおよびIIIに対する定義の意味を有し、
Ｒは、ＣＮ、ＣＨＯ、ＣＨ2Ｒ4、Ｃ（Ｏ）Ｒ5、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ6、Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、ＮＨＲ7、またはＣ（Ｏ）ＯＲ8であり；
Ｒ4は、ＯＨまたはＮＨ2であり；
Ｒ5は、Ｃ1〜Ｃ6アルキルであり；
Ｒ6は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、またはＣ1〜Ｃ6アルキルであり；
Ｒ7は、ＨまたはＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
Ｒ8は、Ｃ1〜Ｃ6アルキルである）の化合物を含む。
【００４７】
式IVａおよび式IVｂの化合物は新規であり、そして本発明の態様にもなる。
【００４８】
２種の鏡像異性体の一方のリサイクル化を目的として、式IIの化合物およびエステル化後の式Iの化合物のラセミ化を、塩基、たとえばアルコラートまたは１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）を使用して行うことができる。
【００４９】
本発明の方法から得られた化合物、すなわち式Ｉの化合物および式IIの化合物、ならびに式IVａおよび式IVｂの化合物は、有用な構成単位であり、化学、農業、および製薬産業において価値のある製品の合成、たとえば薬学的に活性な化合物、たとえば、パーキンソン病、アルツハイマー病、または他の中枢神経系の疾患のような疾患の処置に有用であるモノアミンオキシダーゼ（monoaminooxidase）インヒビターの合成に用いることができる。
【００５０】
たとえば、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸は、アルコール、好ましくはメタノールまたはエタノールと、酸触媒作用のもとに反応して、対応する（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルを得ることができる。このエステルを、ベンジル位のハロゲン化物、トシラート、メタンスルホン酸エステル（メシラート）、またはトリフルオロメタンスルホン酸エステル（トリフラート）から選択される非置換または置換ベンジル誘導体を使用するウィリアムソン（Williamson）のエーテル合成によりアルキル化することができる。使用する塩基は、炭酸塩、たとえば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、または炭酸セシウムの炭酸塩であることができる。溶剤の例は、低級ケトン、たとえばアセトンまたは２−ブタノンである。反応は２０℃〜還流温度の範囲の温度で行うことができる。別のアルキル化の方法は、光延（Mitsunobu）カップリングである：場合により置換されたベンジル位のアルコールとフェノールとを、不活性な溶剤、たとえば、ジエチルエーテルまたはテトラヒドロフラン中で、アゾ−ジカルボン酸ジアルキルを使用して、ホスフィン、たとえば、トリブチル−またはトリフェニル−ホスフィンの存在下で反応させる。エステル官能基の加水分解は、それ自身公知の方法、たとえば、酸性の条件下での（たとえば、塩酸による）、あるいは塩基性条件下での（たとえば溶剤としてアルコールおよび水の混合物中で、水酸化リチウム、ナトリウムまたはカリウムによる）加水分解により行うことができる。得られた酸は、次に、たとえばホフマン（Hofmann）またはクルチウス（Curtius）転位により、対応するイソシアネートの形成を介して、炭素から窒素原子への求核性移動に付すことができる。続いてイソシアネートを酸水溶液により処理すると、すぐに対応するアミンを得る。中間体イソシアネートを適切なアルコールで処理すると、カルバメートの形で保護されたアミノ誘導体を得る。イソシアネートの処理のために、アミン保護基として使用する代表的なカルバメート、たとえばｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、またはフルオレニル−メトキシカルボニルを得るアルコールが選択される。アミンに開裂するための方法は文献から周知である。Ｎ−アミドへのさらなる転位は、標準的な手順、たとえば活性化アシル誘導体、たとえばハロゲン化アシルまたは無水物との反応により、あるいは、たとえば縮合試薬としてカルボジイミドを用いる酸の縮合反応によりにより行うことができ、このようにして化合物、たとえば（Ｓ）−Ｎ−｛１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−イル｝−アセトアミド（実施例１０）を得る。
【００５１】
（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルは、上述したウィリアムソンのエーテル合成または光延カップリングにより、非置換または置換ベンジル誘導体で、アルキル化することができる。エステル官能基の加水分解は、それ自身公知の方法、たとえば酸性の条件下での（たとえば、塩酸による）、あるいは塩基性条件下での（たとえば溶剤としてアルコールおよび水の混合物中で、水酸化リチウム、ナトリウムまたはカリウムによる）加水分解により行うことができる。次に、得られた酸を、標準的な手順により対応するアミドに変換することができる。第一級または第二級アミンとの反応のために、縮合試薬、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミドのようなカルボジイミド、、またはｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）のようなベンゾトリアゾール誘導体を適用して、（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルアミド（実施例９）のような化合物を得ることができる。
【００５２】
実施例において、次の略語を使用する：ＩＳＮ−ＭＳ：イオンスプレー負イオン質量分析法；ＥＩ−ＭＳ：電子衝撃質量分析法；ＮＭＲ：核磁気共鳴分光法；ＩＲ：赤外分光法；ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー；min：分；ＲＴ：室温；ＨＢＴＵ：ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート；ＴＢＭＥ：ｔ−ブチルメチルエーテル；ＨＶ：高真空
【００５３】
実施例１：（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルの製造
ａ）４−アミノフェノール２．３５５molおよびイタコン酸２．３２molの混合物を徐々に加熱した：６０℃で、粉末は粘稠になり始め、１１０〜１２０℃で液体になり、色が暗褐色に変化する一方、固体材料の残りも溶解した。沸騰下で発熱反応が始まり、温度が１５０℃まで上昇した。砂状の生成物を、１〜２時間内でＲＴに放冷した。得られた粗（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸を、さらなる精製や特性決定をせずに次の工程で用いた。
【００５４】
ｂ）粗（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸を、メタノール５０００mL、濃硫酸２４mL、および２，２−ジメトキシプロパン４００mLの混合物に溶解し、還流させながら２時間攪拌した。反応溶液を蒸留によりその容量の半分まで減らし、次に２０L容器に移した。４０℃で攪拌しながら、水／氷混合物（１：１）２５００mLを加えた。すぐに結晶化が始まり、そこで微細な白色結晶をろ過ロート上に集めた。それらをろ液が中性になるまで合計２０００mLの冷水で洗浄した。生成物を減圧下乾燥して、（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル９８０g（理論の８４％、２工程）を白色固体として得た；
ＭＳ：ｍ／ｅ＝２３４（Ｍ＋Ｈ）+。
【００５５】
実施例１ｂ）で述べた方法と類似の方法で、粗（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸とエタノールとを反応させることにより、（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルを白色固体として得た；ＭＳ：ｍ／ｅ＝２４８（Ｍ＋Ｈ）+。
【００５６】
実施例２：（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルおよび（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸の製造
ａ）（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（９８％ＨＰＬＣ）２１３．５mmolを、シクロヘキサン５００mLに穏やかに攪拌しながら懸濁させた。塩化ナトリウム０．１Mおよび硫酸マグネシウム５０mMを含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２．０Lを加え、得られたエマルション／懸濁液を、ｐＨ６．０に再調節し、温度を３０℃に設定した。カンジダ・シリンドラシア（Candida cylindracea）からのコレステラーゼ（Roche Applied Science, Industrial Products, Enzyme Projects, Sandhofer Str. 116, D-68305 Mannheim, Germany, オーダー番号10129046103、以下：酵素）２０１mgの添加により加水分解を開始し、穏やかに攪拌しながら０．１N ＮａＯＨ溶液（ｐＨ−ｓｔａｔ）の制御された添加によりｐＨを６．０に一定に保った。滴定剤を合計１０１６mL消費した後（一晩；転化率４８．６％）、反応混合物をジクロロメタン３．５Lおよび２×２．５Lで（最初は濁った相）、続いて酢酸エチル３．５Lで抽出した（有機相を排出）。合わせたジクロロメタン相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、ＨＶ下乾燥して、（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル２２．５g（９５．６mmol；４４．８％）を白色結晶として得た。分析：ＨＰＬＣ：＞９９％。エナンチオマー過剰率：９６．３％（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ、２５０×４．６mm；ヘキサン７０％＋ヘキサン中ＴＦＡ（０．１％）１０％＋エタノール２０％；１mL／min；ＤＡＤ：ｓｉｇ＝２１０．８nm、ｒｅｆ＝３６０．１nm；サンプル使用：２mg／mLＥｔＯＨ中ＴＦＡ（１％）を０．５μL）。［δ］D＝−２７．７°（ｃ＝１．０２；ＥｔＯＨ）。ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝２３５．１（Ｍ；６７）、１２２．０（１００）。
【００５７】
【表１】
【００５８】
ｂ）ジクロロメタンおよび酢酸エチルで抽出した後に残された水層を３２％塩酸でｐＨ２．２に設定し、酢酸エチル３×３．５Lで抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、ＨＶ下で乾燥して、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸２１．９g（９９．０mmol；４６．４％）を白色固体として得た。分析：ＨＰＬＣ：＞９９％。エナンチオマー過剰率：９９．１％（上記方法を参照）。［δ］D＝２５．４°（ｃ＝１．０５；ＥｔＯＨ）。ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝２２１．１（Ｍ；５７）、１２２．０（１００）。
【００５９】
【表２】
【００６０】
実施例３：種々の有機補助溶剤の存在下でのエナンチオ選択加水分解
ａ）ＴＢＭＥ５mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（９８％）２．１３mmolの懸濁液に、５０mM硫酸マグネシウム２mLと、０．１M塩化ナトリウムおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２０mLとを、攪拌しながら加えた。酵素１０mgの添加により反応を開始し、０．１N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。１０．４mL消費（転化率４９．９％；４５h）後、反応混合物を３×５０mLのジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相を蒸発させ、ｅｅ決定に付した。水相をｐＨ２まで酸性にし、酢酸エチル３×５０mLで抽出し、合わせた有機相を蒸発させ、ｅｅ決定に付した。
【００６１】
ｂ）有機溶剤（表を参照）１０mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（それぞれのラセミ酸約２％を含有する）４．２５mmolの懸濁液に、塩化マグネシウム５０mMおよび塩化ナトリウム０．１Mを含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３９mLを、穏やかに攪拌しながら加え、温度を２８℃に設定した。脱イオン水１．０mLに溶解した酵素６．５mgの添加により反応を開始し、０．１N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。約５０％転化後、反応混合物を実施例３aと同様に後処理した。
【００６２】
【表３】
【００６３】
実施例４：種々の添加剤の存在下でのエナンチオ選択加水分解
シクロヘキサン１０mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル４．２５mmol（それぞれのラセミ酸約２％を含有する）の懸濁液に、塩化マグネシウム５０mMおよび塩化ナトリウム０．１Mを含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中の添加剤（表を参照）の溶液（量は表に示す）を穏やかに攪拌しながら加え、温度を２８℃に設定した。脱イオン水１．０mLに溶解した酵素６．５mgの添加により反応を開始し、０．１N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。約５０％転化後、反応混合物を実施例３ａ）と同様に後処理した。
【００６４】
【表４】
【００６５】
実施例５：種々の塩添加剤の存在下でのエナンチオ選択加水分解
シクロヘキサン１０mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（それぞれのラセミ酸約２％を含有する）４．２５mmolの各懸濁液に、１種または２種の中性塩（表を参照）を含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３９mLを、穏やかに攪拌しながら加え、温度を２８℃に設定した。脱イオン水１．０mLに溶解した酵素６．５mgの添加により反応を開始し、０．１N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。約５０％転化後、反応混合物を実施例３ａ）と同様に後処理した。
【００６６】
【表５】
【００６７】
実施例６：種々の条件でのエナンチオ選択加水分解
有機溶剤（表を参照）中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（量は表を参照；それぞれのラセミ酸約２％を含有する）の懸濁液に、添加剤（表を参照）とともに水性の緩衝溶液を穏やかに攪拌しながら加え、温度を２８℃に設定した。脱イオン水１．０mLに溶解した酵素（量は表を参照）の添加により反応を開始し、１．０N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。約５０％転化後、反応混合物を実施例３a）と同様に後処理した。
【００６８】
【表６】
【００６９】
実施例７：別のエステルを用いるエナンチオ選択加水分解
シクロヘキサン１０mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステル４．０１mmolの懸濁液に、塩化マグネシウム５０mMを含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３９mLを、穏やかに攪拌しながら加え、温度を２８℃に設定した。脱イオン水１．０mLに溶解した酵素６．５mgの添加により反応を開始し、０．１N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。反応完了後、反応混合物を実施例３ａ）と同様に後処理した。
【００７０】
【表７】
【００７１】
実施例８：（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルおよび（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸の製造
ａ）（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルの製造：（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（９８．２％ＨＰＬＣ； ラセミ酸０．２％を含有）１０６．３mmolを、メチルシクロヘキサン１００mLに、穏やかに攪拌しながら懸濁させた。ポリエチレングリコールモノメチルエーテル５０００ ２０．００gを、０．１M酢酸マグネシウム（ｐＨ６．０）３８０mLに溶解し（０．５h攪拌； 容量約３９８mL）、この溶液を上記懸濁液に注いだ。得られたエマルション／懸濁液をｐＨ６．０に再調節し、温度を２８℃に設定した。酵素８３mgの添加により加水分解を開始し、穏やかに攪拌しながら１．０NのＮａＯＨ溶液（ｐＨ−ｓｔａｔ）の制御された添加によりｐＨを６．０に一定に保った。１７．２h後、および滴定剤を合計で４９．６４mL（転化率４７．５％）消費の後、ジクロロメタン５００mLを添加することにより反応を止めた。反応混合物を、ジクロロメタン４×５００mLで（最初は濁った相）、続いて酢酸エチル５００mLで（有機相を排出）抽出した。合わせたジクロロメタン相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。不溶性ＰＥＧを除去するために、残留物を酢酸エチル４００mL中で一晩すり砕いた。懸濁液をろ過し、ろ液を蒸発させ、残留物をジクロロメタンから再結晶して、（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル１１．２７g（４７．９mmol； ４５．１％）を白色結晶として得た。分析：ＨＰＬＣ：９９．４％（Ａ226nm）。エナンチオマー過剰率：９７．８％（方法は実施例２を参照）。
【００７２】
【表８】
【００７３】
ｂ）（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸の製造：水相を２５％硫酸でｐＨ２．０に設定し、酢酸エチル４×５００mLで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、残留物をＴＢＭＥから再結晶して、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸１０．４９g（４７．４mmol； ４４．６％）を白色固体として得た。分析：ＨＰＬＣ：９９．９％（Ａ226nm）。エナンチオマー過剰率：９８．２％（上記方法を参照； 保持時間：（Ｒ）−酸：１２．４４min、（Ｓ）−酸：１６．２５min）。
【００７４】
【表９】
【００７５】
ＮＭＲによれば、生成物はＰＥＧ約２％を含有する。
【００７６】
実施例９：（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルアミドの製造
ａ）テトラヒドロフラン７mL中の４−フルオロ−ベンジルアルコール４．３mmolおよびトリフェニルホスフィン４．７mmolの溶液を、テトラヒドロフラン１１mL中の（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル［実施例２ａ）または８ａ）］４．７mmolおよびアゾジカルボン酸ジイソプロピル４．７mmolの溶液に０℃で滴下した。混合物をＲＴまで暖まるままにし、攪拌を１８時間続けた。シリカゲル２gを添加した後、反応混合物を減圧下蒸発させた。得られた物質を、溶離剤として最初にヘプタンおよび酢酸エチルの２：１混合物、次に１：１混合物を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルを白色固体として得た； ＭＳ：ｍ／ｅ＝３４４（Ｍ＋Ｈ）+。
【００７７】
ｂ）ジオキサン７７mL中の（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル３．７mmolの溶液を、塩酸（３７％）８．６４mLで処理した。密閉したフラスコ中で、混合物を５２℃で１８h加熱した。溶液を減圧下蒸発させて、粗酸を黄色がかった固体として得た。粗酸を、酢酸エチル１０mL中、−５℃ですり砕いた。固体をろ過ロート上に集め、次に高真空下で乾燥して、（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸を白色固体としてを得た； ＭＳ：ｍ／ｅ＝３３０（Ｍ＋Ｈ）+。
【００７８】
ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３７mL中の（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸１．８２mmolの溶液を０℃に冷却し、トリエチルアミン２．０mmol、ＨＢＴＵ１．８２mmol、メチルアミン塩酸塩２．２mmol、およびトリエチルアミン２．０mmolで連続的に処理した。氷浴を外しＲＴで攪拌を続けた。３０min後反応を止め、橙色溶液を減圧下で蒸発させた。得られた残留物を酢酸エチル１mL中ですり砕き、白色固体生成物をろ過し、その後ジクロロメタンに溶解し、この溶液を水で３回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、次に減圧下で蒸発させて（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルアミド４０９mg（理論の６６％）を白色固体として得た。ＭＳ：ｍ／ｅ＝３４３（Ｍ＋Ｈ）+； エナンチオマー過剰率＞９９．５％。
【００７９】
実施例１０：（Ｓ）−Ｎ−｛１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−イル｝−アセトアミドの製造
ａ）テトラヒドロフラン１５０mL中の３−フルオロ−ベンジルアルコール１１０．６mmolおよびトリフェニルホスフィン１０８．８mmolの溶液を、テトラヒドロフラン２００mL中の（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル１００．５mmolおよびアゾジカルボン酸ジイソプロピル１００．５mmolの溶液に、窒素雰囲気下、０℃で、５０min内に滴下した。混合物をＲＴまで暖まるままにし、攪拌を１８時間続けた。混合物を減圧下蒸発させた。固体の残留物をエーテル４００mL中ですり砕いて主に生成物およびトリフェニルホスフィンオキシドからなる白色固体を残した。ろ過後、固体物質を冷メタノール１００mL中ですり砕いて、（Ｓ）−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルを白色固体として［ＭＳ：ｍ／ｅ＝３４４（Ｍ＋Ｈ）+］、微量のトリフェニルホスフィンおよびヒドラゾジカルボン酸ジイソプロピルとともに得た。
【００８０】
ｂ）ジオキサン６５０mL中の（Ｓ）−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル７４．６mmolの溶液を、塩酸（３７％）１７５mLで処理した。密閉したフラスコ中で、混合物を５０℃で１８h加熱した。溶液を減圧下で蒸発させて、黄色固体として粗酸を得た。粗酸を酢酸エチル５０mL中、０℃ですり砕いた。固体をろ過ロート上に集め、次に高真空下乾燥して、（Ｓ）−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸を黄色がかった固体として得た； ＭＳ：ｍ／ｅ＝３０（Ｍ＋Ｈ）+。
【００８１】
ｃ）ジオキサン３００mL中の（Ｓ）−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸６１mmolの溶液を、Ｎ−メチルモルホリン６１mmolで処理した。その後、反応混合物を−８℃に冷却し、クロロギ酸イソブチル６１mmolを添加した。５min攪拌後、温度が０℃まで上昇する間に、水４０mL中のアジ化ナトリウム１２１mmolの溶液を加えた。０℃で７０min攪拌後、懸濁液をDicalite（登録商標）でろ過した。ろ液をトルエン７００mLで希釈し、分液ロートに移した。有機層を分離し、次に炭酸水素ナトリウム飽和溶液２５０mLで２回、塩化ナトリウム飽和溶液２００mLで２回洗浄した。その後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、トルエン４００mLを添加した後、溶剤および残留イソブチルアルコールを蒸発させて容量約３５０mLで終了した。溶液を徐々に８０℃に加熱し、この温度に７０min保った。冷却後、中間体イソシアネートの溶液を約３００mLに濃縮し、この溶液をジオキサン１００mL中の塩酸（３７％）２５．４mLの溶液に４５℃に加熱しながら滴下した。最後に、添加が完了した後、温度を１時間で６０℃まで上げ、塩酸塩はすでに沈殿し始めた。混合物を０℃に冷却し、形成した固体物質をろ過ロート上に集めた。ｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄した後、生成物を高真空下で乾燥した。（Ｓ）−４−アミノ−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−ピロリジン−２−オン塩酸塩を白色固体として得た。ＭＳ：ｍ／ｅ＝３０１（Ｍ＋Ｈ）+。
【００８２】
ｄ）ジクロロメタン８６mL中の（Ｓ）−４−アミノ−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）フェニル］−ピロリジン−２−オン塩酸塩１１．３mmolの懸濁液を、トリエチルアミン２３．８mmolで処理し、０℃に冷却した。この溶液に、塩化アセチル１２．５mmolを加え、０℃で１５min攪拌を続けた。後処理のために、反応混合物を水１００mLで２回抽出した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させた。粗生成物をトルエン１００mL中ですり砕き、次に固体をろ過ロート上に集めた。第２工程では、生成物をｔ−ブチルメチルエーテル２００mL中、ＲＴですり砕いた。再び、固体の生成物をろ過ロート上に集め、高真空下で乾燥した。（Ｓ）−Ｎ−｛１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−イル｝−アセトアミドを白色固体として得た。ＭＳ：ｍ／ｅ＝３４３（Ｍ＋Ｈ）+； エナンチオマー過剰率：＞９９．５％。
【００８３】
実施例１１：（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸の製造
ポリエチレングリコール６０００ ８．００g、を１００mM酢酸マグネシウム緩衝液（ｐＨ６．０）１５０mLに攪拌しながら溶解し、この溶液を、メチルシクロヘキサン４０mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（９９．７％）１０．００g（４２．５１mmol）の攪拌した懸濁液に添加した。混合物を２８℃に加熱し、２MのＮａＯＨでｐＨを６．０に再調節した。カンジダ・シリンドラシア（Candida cylindracea）コレステラーゼ３３．２mg（１６．８８kU/g）の添加により反応を開始し、攪拌下での１．０M ＮａＯＨ溶液の制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。１．０M水酸化ナトリウム溶液を合計２０．３５mL（２０．３５mmol）消費した後（１７．１h後； 転化率４７．９％）、反応混合物を焼結ガラスフィルターに通した。ろ液は自然に水相および有機相に分離した。水相を酢酸エチル２×２００mLで洗浄して、未開裂エステルを除去した。水相を２５％硫酸でｐＨ４．０に設定し、真空中で容量約８０mLまで濃縮した（浴６０℃）。溶液を１℃に冷却し（白色沈殿／結晶の形成）、２５％硫酸でｐＨを１．５に設定した。沈殿／結晶を１℃で一晩攪拌し、焼結ガラスフィルターでろ別し（最小限の量の水で洗浄した）、高真空（ＲＴ、６×１０-2mbar）で一晩乾燥して、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸４．３２g（１９．５３mmol； ４５．９％）を得た。分析：ＨＰＬＣ（面積Ａ226nm）：９９．３％、エステル０．７％。９８．９％ｅｅ。生成物は、水５．３％（カールフィッシャー測定による）およびＰＥＧ２．１％（w／w）（ＮＭＲによる）を含有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、価値のある薬学的に活性な化合物の合成に有用なエナンチオピュアな中間体の製造方法、および新規な中間体に関するものである。
【０００２】
さらに詳しくは、本発明は式Ｉ：
【０００３】
【化６】
【０００４】
（式中、Ｒ21、Ｒ22およびＲ23は、互いに独立に、水素またはハロゲンであり、
Ｒ24は、水素、メチル、またはハロゲンである）の化合物および／または式II：
【０００５】
【化７】
【０００６】
［式中、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、Ｃ2〜Ｃ4アルケニル、または式Ａ：
【０００７】
【化８】
【０００８】
（式中、Ｒ3は、水素またはＣ1〜Ｃ4アルキルであり、ｎは、１、２、または３である）の基であり、
Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24は、前記定義の意味を有する］の化合物の製造方法であって、
式III：
【０００９】
【化９】
【００１０】
（式中、Ｒ1、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24は、前記定義の意味を有する）の化合物を、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程を含む製造方法を提供する。
【００１１】
本明細書で示す構造式中、くさび形の結合：
【００１２】
【化１０】
【００１３】
は、置換基が紙の面より上であることを意味する。
【００１４】
本明細書で示す構造式中、点線の結合：
【００１５】
【化１１】
【００１６】
は、置換基が紙の面より下であることを意味する。
【００１７】
本明細書で用いる用語「アルキル」は、１〜８個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の炭化水素残基、たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルを意味し、これらの種々の異性体を含む。好ましくは、用語「アルキル」は、非置換であっても、１個以上の置換基で置換されていてもよい１〜５個の炭素原子を含有する直鎖状または分岐状炭化水素残基を意味する。置換基の例は、ヒドロキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、Ｃ3〜Ｃ6シクロアルキル、アリール、およびハロゲン原子を含む。置換アルキルの例は、３−ヒドロキシブチル、４−メトキシブチル、３−エトキシプロピル、３−シクロヘキシルプロピル、ベンジル、２−フェニルエチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、２，２−ジクロロエチル、３−ブロモプロピル、または２，２，２−トリフルオロエチルなどを含む。アルケニルの例は、ビニル、アリル、イソプロペニル、ブテニル、およびブテニルの異性体、たとえば１−または２−ブテニルを含む。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルを含む。
【００１８】
ハロゲンの例は、フッ素、塩素および臭素を含む。
【００１９】
コレステラーゼ（EC 3.1.1.13）は、幅の広い特異性の酵素のグループであり、コレステロールエステラーゼ；コレステリルエステルシンターゼ；トリテルペノールエステラーゼ；コレステリルエステラーゼ；コレステリルエステルヒドロラーゼ；ステロールエステルヒドロラーゼ、またはコレステロールエステルヒドロラーゼとも呼ばれる。これは、エステラーゼ、プロテアーゼ、およびリパーゼも含むヒドロラーゼのグループに属する。
【００２０】
酵母に由来するコレステラーゼの例は、カンジダ（Candida）属から、たとえばカンジダシリンドラシア（Candida cylindracea）に由来するコレステラーゼを含む。たとえば、コレステラーゼは、カンジダシリンドラシアから得られる市販Lipase MY（Meito Sangyo, Japan）から精製することにより得ることができる。精製は不完全でよい。酵母に由来する市販コレステラーゼの例は、Roche Applied Science, Industrial Products, Enzyme Projects, Sandhofer Str. 116, D-68305 Mannheim, Germany, オーダー番号、たとえば10129046103（固体剤）、0393916、または039800（液体剤）により販売されているカンジダシリンドラシアからのコレステラーゼである。
【００２１】
したがって１態様では、本発明は、酵母に由来するコレステラーゼが、カンジダシリンドラシアのコレステラーゼである方法を提供する。
【００２２】
酵母に由来するコレステラーゼは、可溶性の形態または固定化した形態で用いることができる。酵素を固定する方法の種々の選択は、当業者に公知である。
【００２３】
酵素反応は、水中または水−有機系中で行うことができる。
【００２４】
基質、すなわち式IIIの化合物は、たとえば懸濁液として適用することができる。濃度は、０．５〜２０％の総濃度（w／w）の範囲、または２〜１０％の範囲とすることができる。式IIIの化合物は、イタコン酸と、場合により置換されたアミノフェノールとから公知方法により製造することができる。
【００２５】
１態様では、本発明は、式III中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24が、互いに独立に、水素またはフッ素である方法を提供する。別の態様では、本発明は式III中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24が、水素である方法を提供する。別の態様では、本発明は、式III中、Ｒ1がメチルまたはエチルである方法を提供する。
【００２６】
１態様では、本発明は、（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシルフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルを、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程を含む、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸および（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルの製造方法を提供する。
【００２７】
生化学的転化のために用いる公知の一般的な緩衝剤溶液、たとえばリン酸緩衝液または酢酸緩衝液などを用いることができる。緩衝剤濃度は、１Mまでの範囲、または約３〜２５０mMの範囲とすることができる。
【００２８】
酵素反応は、有機補助溶剤の存在下で行うことができる。有機補助溶剤は、水混和性または水不混和性の補助溶剤とすることができる。水混和性の有機補助溶剤が存在する場合、その総濃度は３０％までまたは２５％までとすることができる。水不混和性の有機補助溶剤は、任意の比の総濃度で用いることができる。
【００２９】
有機補助溶剤の例は、技術的に一般的な溶剤、たとえばエーテル（たとえばテトラヒドロフラン、ジオキサン、またはｔ−ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ））、低級アルコール（たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール）、エステル（たとえば酢酸エチル）、極性非プロトン性溶剤（たとえばジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、またはアセトン）、およびアルカン（たとえばヘプタン）、またはシクロアルカン（たとえばシクロヘキサンまたはメチルシクロヘキサン）を含む。
【００３０】
したがって、１態様では、本発明は、水不混和性補助溶剤、たとえば、ＴＢＭＥ、ヘプタン、シクロヘキサンおよびメチルシクロヘキサンから選択される有機補助溶剤の存在下で酵素反応を行う方法を提供する。別の態様では、本発明は、シクロヘキサンまたはメチルシクロヘキサンの存在下で酵素反応を行う方法を提供する。
【００３１】
酵素反応は水溶性の添加剤の存在下、たとえば塩、ポリオール、ポリエチレングリコール、またはこれらの誘導体の存在下で行うことができる。これらの添加剤は、酵素に活性化、選択性誘発、または安定化の効果を及ぼすことができる。
【００３２】
塩の例は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムを含むが、他の添加剤、たとえばＬｉＳＣＮ、Ｎａ2ＳＯ4、およびＭｇ2ＳＯ4も含む。特に水性緩衝液は、公知の酵素活性化剤であるマグネシウムイオンを含有することができる。塩は、１Mまでの範囲、または０．５Mまでの範囲の濃度で存在することができる。
【００３３】
したがって、１態様では、本発明は、マグネシウム塩の存在下で酵素反応を行う方法を提供する。
【００３４】
ポリオールの例は、グリセロールおよび糖を含む。ポリオールは、水相の４０％（w／w）までの濃度で存在することができる。
【００３５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、場合によりモノ−またはジメチルエーテルとして、５０％（w/v）までの範囲、あるいは５％〜２５％の範囲の濃度で用いることができる。たとえば、４〜６kDの範囲のＰＥＧを、場合によりモノ−またはジメチルエーテルとして、用いることができる。
【００３６】
酵素の添加後、反応混合物のｐＨを、選択したｐＨ値、たとえば酵素反応が起こりうるｐＨ３．５〜１０．０の範囲のｐＨに、またはｐＨ４．０〜８．０の範囲のｐＨに、またはｐＨ５．５〜７．０の範囲のｐＨに維持することができる。一定のｐＨ値は、当業者に公知の方法により、たとえば塩基、たとえば水酸化ナトリウムもしくはカリウムまたは重炭酸ナトリウムもしくはカリウムの水溶液の制御された添加、あるいは十分な緩衝能を有する緩衝液の選択により維持される。
【００３７】
酵素反応は、４〜４５℃の範囲の温度で、または１５〜３５℃の範囲の温度で、または２６〜３２℃の範囲の温度で行うことができる。
【００３８】
反応の停止後、式Ｉの化合物および式IIの化合物を、抽出により分離することができる。
【００３９】
たとえば、式IIの化合物は、反応混合物を適切な有機溶剤、たとえばジクロロメタンで抽出することにより、従来どおりに精製することができる。この溶液を濃縮すると、式IIの化合物を結晶させることができ、これによりその光学純度を容易に高くすることができる。
【００４０】
水相中に残存する式Ｉの対掌化合物は、次に水相を低いｐＨ値で抽出することにより単離することができる。これは通常、保持された水相を酸性化し形成された沈殿をろ別するか、または適切な有機溶剤、たとえば酢酸エチルで抽出することにより達成することができる。この溶液を濃縮すると、式Ｉの化合物を結晶させることができ、これによりその光学純度を高くすることができる。
【００４１】
したがって、１態様では、本発明は、
（ａ）式IIIの化合物を、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程、および
（ｂ）得られた式Ｉの化合物および得られた式IIの化合物を、別々のｐＨで抽出することにより分離する工程
を含む、式Ｉの化合物および／または式IIの化合物の製造方法を提供する。
【００４２】
水溶性の添加剤が式Ｉの化合物または式IIとともに同時抽出される場合、それぞれの反応生成物を添加剤から分離するために、さらなる抽出工程が必要であるかもしれない。あるいはまた、吸着樹脂またはイオン交換樹脂を使用することもできる。適用する特定の抽出方式の選択は、当業者の技術の内であり、そして添加剤（たとえばＰＥＧ添加剤）の特定の性質に依存する。たとえば、ポリエチレンは、たとえばジクロロメタンで抽出することにより式Ｉの化合物から分離することができ（保持された式IIの化合物との同時抽出により）、続いて式IIの化合物の保持された画分から、酢酸エチルによって溶剤変更するかまたは粉砕／温浸することにより分離することができる（ポリエチレンは、これらの条件下で不溶性である）。
【００４３】
本発明の方法から得られた化合物、すなわち式Ｉの化合物および式IIの化合物を、当業者に公知の、カルボン酸またはエステル官能性での誘導反応に供し、たとえばカルボキサミド、Ｎ−置換カルボキサミド、Ｎ，Ｎ−二置換カルボキサミド、カルボキサミジン、Ｎ−ヒドロキシ−カルボキサミジン、カルボン酸ヒドロキサミド、カルボン酸ヒドラジド、カルボニトリル、カルバルデヒド、ケトン、イソシアネート、イソチオシアネート、カルバメート、尿素、Ｎ−置換尿素、Ｎ，Ｎ−二置換尿素、第一級、第二級および第三級アミン、Ｎ−アミド、グアニジン、アミノメチル−、ヒドロキシメチル誘導体、ならびにエステル誘導体のような化合物をもたらすことができる。
【００４４】
このような化合物の例は、式IVａまたは式IVｂ：
【００４５】
【化１２】
【００４６】
（式中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24は、式Ｉ、IIおよびIIIに対する定義の意味を有し、
Ｒは、ＣＮ、ＣＨＯ、ＣＨ2Ｒ4、Ｃ（Ｏ）Ｒ5、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ6、Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、ＮＨＲ7、またはＣ（Ｏ）ＯＲ8であり；
Ｒ4は、ＯＨまたはＮＨ2であり；
Ｒ5は、Ｃ1〜Ｃ6アルキルであり；
Ｒ6は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、またはＣ1〜Ｃ6アルキルであり；
Ｒ7は、ＨまたはＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
Ｒ8は、Ｃ1〜Ｃ6アルキルである）の化合物を含む。
【００４７】
式IVａおよび式IVｂの化合物は新規であり、そして本発明の態様にもなる。
【００４８】
２種の鏡像異性体の一方のリサイクル化を目的として、式IIの化合物およびエステル化後の式Iの化合物のラセミ化を、塩基、たとえばアルコラートまたは１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）を使用して行うことができる。
【００４９】
本発明の方法から得られた化合物、すなわち式Ｉの化合物および式IIの化合物、ならびに式IVａおよび式IVｂの化合物は、有用な構成単位であり、化学、農業、および製薬産業において価値のある製品の合成、たとえば薬学的に活性な化合物、たとえば、パーキンソン病、アルツハイマー病、または他の中枢神経系の疾患のような疾患の処置に有用であるモノアミンオキシダーゼ（monoaminooxidase）インヒビターの合成に用いることができる。
【００５０】
たとえば、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸は、アルコール、好ましくはメタノールまたはエタノールと、酸触媒作用のもとに反応して、対応する（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルを得ることができる。このエステルを、ベンジル位のハロゲン化物、トシラート、メタンスルホン酸エステル（メシラート）、またはトリフルオロメタンスルホン酸エステル（トリフラート）から選択される非置換または置換ベンジル誘導体を使用するウィリアムソン（Williamson）のエーテル合成によりアルキル化することができる。使用する塩基は、炭酸塩、たとえば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、または炭酸セシウムの炭酸塩であることができる。溶剤の例は、低級ケトン、たとえばアセトンまたは２−ブタノンである。反応は２０℃〜還流温度の範囲の温度で行うことができる。別のアルキル化の方法は、光延（Mitsunobu）カップリングである：場合により置換されたベンジル位のアルコールとフェノールとを、不活性な溶剤、たとえば、ジエチルエーテルまたはテトラヒドロフラン中で、アゾ−ジカルボン酸ジアルキルを使用して、ホスフィン、たとえば、トリブチル−またはトリフェニル−ホスフィンの存在下で反応させる。エステル官能基の加水分解は、それ自身公知の方法、たとえば、酸性の条件下での（たとえば、塩酸による）、あるいは塩基性条件下での（たとえば溶剤としてアルコールおよび水の混合物中で、水酸化リチウム、ナトリウムまたはカリウムによる）加水分解により行うことができる。得られた酸は、次に、たとえばホフマン（Hofmann）またはクルチウス（Curtius）転位により、対応するイソシアネートの形成を介して、炭素から窒素原子への求核性移動に付すことができる。続いてイソシアネートを酸水溶液により処理すると、すぐに対応するアミンを得る。中間体イソシアネートを適切なアルコールで処理すると、カルバメートの形で保護されたアミノ誘導体を得る。イソシアネートの処理のために、アミン保護基として使用する代表的なカルバメート、たとえばｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、またはフルオレニル−メトキシカルボニルを得るアルコールが選択される。アミンに開裂するための方法は文献から周知である。Ｎ−アミドへのさらなる転位は、標準的な手順、たとえば活性化アシル誘導体、たとえばハロゲン化アシルまたは無水物との反応により、あるいは、たとえば縮合試薬としてカルボジイミドを用いる酸の縮合反応によりにより行うことができ、このようにして化合物、たとえば（Ｓ）−Ｎ−｛１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−イル｝−アセトアミド（実施例１０）を得る。
【００５１】
（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルは、上述したウィリアムソンのエーテル合成または光延カップリングにより、非置換または置換ベンジル誘導体で、アルキル化することができる。エステル官能基の加水分解は、それ自身公知の方法、たとえば酸性の条件下での（たとえば、塩酸による）、あるいは塩基性条件下での（たとえば溶剤としてアルコールおよび水の混合物中で、水酸化リチウム、ナトリウムまたはカリウムによる）加水分解により行うことができる。次に、得られた酸を、標準的な手順により対応するアミドに変換することができる。第一級または第二級アミンとの反応のために、縮合試薬、たとえばジシクロヘキシルカルボジイミドのようなカルボジイミド、、またはｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）のようなベンゾトリアゾール誘導体を適用して、（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルアミド（実施例９）のような化合物を得ることができる。
【００５２】
実施例において、次の略語を使用する：ＩＳＮ−ＭＳ：イオンスプレー負イオン質量分析法；ＥＩ−ＭＳ：電子衝撃質量分析法；ＮＭＲ：核磁気共鳴分光法；ＩＲ：赤外分光法；ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー；min：分；ＲＴ：室温；ＨＢＴＵ：ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート；ＴＢＭＥ：ｔ−ブチルメチルエーテル；ＨＶ：高真空
【００５３】
実施例１：（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルの製造
ａ）４−アミノフェノール２．３５５molおよびイタコン酸２．３２molの混合物を徐々に加熱した：６０℃で、粉末は粘稠になり始め、１１０〜１２０℃で液体になり、色が暗褐色に変化する一方、固体材料の残りも溶解した。沸騰下で発熱反応が始まり、温度が１５０℃まで上昇した。砂状の生成物を、１〜２時間内でＲＴに放冷した。得られた粗（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸を、さらなる精製や特性決定をせずに次の工程で用いた。
【００５４】
ｂ）粗（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸を、メタノール５０００mL、濃硫酸２４mL、および２，２−ジメトキシプロパン４００mLの混合物に溶解し、還流させながら２時間攪拌した。反応溶液を蒸留によりその容量の半分まで減らし、次に２０L容器に移した。４０℃で攪拌しながら、水／氷混合物（１：１）２５００mLを加えた。すぐに結晶化が始まり、そこで微細な白色結晶をろ過ロート上に集めた。それらをろ液が中性になるまで合計２０００mLの冷水で洗浄した。生成物を減圧下乾燥して、（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル９８０g（理論の８４％、２工程）を白色固体として得た；
ＭＳ：ｍ／ｅ＝２３４（Ｍ＋Ｈ）+。
【００５５】
実施例１ｂ）で述べた方法と類似の方法で、粗（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸とエタノールとを反応させることにより、（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルを白色固体として得た；ＭＳ：ｍ／ｅ＝２４８（Ｍ＋Ｈ）+。
【００５６】
実施例２：（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルおよび（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸の製造
ａ）（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（９８％ＨＰＬＣ）２１３．５mmolを、シクロヘキサン５００mLに穏やかに攪拌しながら懸濁させた。塩化ナトリウム０．１Mおよび硫酸マグネシウム５０mMを含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２．０Lを加え、得られたエマルション／懸濁液を、ｐＨ６．０に再調節し、温度を３０℃に設定した。カンジダ・シリンドラシア（Candida cylindracea）からのコレステラーゼ（Roche Applied Science, Industrial Products, Enzyme Projects, Sandhofer Str. 116, D-68305 Mannheim, Germany, オーダー番号10129046103、以下：酵素）２０１mgの添加により加水分解を開始し、穏やかに攪拌しながら０．１N ＮａＯＨ溶液（ｐＨ−ｓｔａｔ）の制御された添加によりｐＨを６．０に一定に保った。滴定剤を合計１０１６mL消費した後（一晩；転化率４８．６％）、反応混合物をジクロロメタン３．５Lおよび２×２．５Lで（最初は濁った相）、続いて酢酸エチル３．５Lで抽出した（有機相を排出）。合わせたジクロロメタン相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、ＨＶ下乾燥して、（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル２２．５g（９５．６mmol；４４．８％）を白色結晶として得た。分析：ＨＰＬＣ：＞９９％。エナンチオマー過剰率：９６．３％（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ ＡＤ、２５０×４．６mm；ヘキサン７０％＋ヘキサン中ＴＦＡ（０．１％）１０％＋エタノール２０％；１mL／min；ＤＡＤ：ｓｉｇ＝２１０．８nm、ｒｅｆ＝３６０．１nm；サンプル使用：２mg／mLＥｔＯＨ中ＴＦＡ（１％）を０．５μL）。［δ］D＝−２７．７°（ｃ＝１．０２；ＥｔＯＨ）。ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝２３５．１（Ｍ；６７）、１２２．０（１００）。
【００５７】
【表１】
【００５８】
ｂ）ジクロロメタンおよび酢酸エチルで抽出した後に残された水層を３２％塩酸でｐＨ２．２に設定し、酢酸エチル３×３．５Lで抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、ＨＶ下で乾燥して、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸２１．９g（９９．０mmol；４６．４％）を白色固体として得た。分析：ＨＰＬＣ：＞９９％。エナンチオマー過剰率：９９．１％（上記方法を参照）。［δ］D＝２５．４°（ｃ＝１．０５；ＥｔＯＨ）。ＥＩ−ＭＳ：ｍ／ｅ＝２２１．１（Ｍ；５７）、１２２．０（１００）。
【００５９】
【表２】
【００６０】
実施例３：種々の有機補助溶剤の存在下でのエナンチオ選択加水分解
ａ）ＴＢＭＥ５mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（９８％）２．１３mmolの懸濁液に、５０mM硫酸マグネシウム２mLと、０．１M塩化ナトリウムおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）２０mLとを、攪拌しながら加えた。酵素１０mgの添加により反応を開始し、０．１N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。１０．４mL消費（転化率４９．９％；４５h）後、反応混合物を３×５０mLのジクロロメタンで抽出し、合わせた有機相を蒸発させ、ｅｅ決定に付した。水相をｐＨ２まで酸性にし、酢酸エチル３×５０mLで抽出し、合わせた有機相を蒸発させ、ｅｅ決定に付した。
【００６１】
ｂ）有機溶剤（表を参照）１０mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（それぞれのラセミ酸約２％を含有する）４．２５mmolの懸濁液に、塩化マグネシウム５０mMおよび塩化ナトリウム０．１Mを含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３９mLを、穏やかに攪拌しながら加え、温度を２８℃に設定した。脱イオン水１．０mLに溶解した酵素６．５mgの添加により反応を開始し、０．１N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。約５０％転化後、反応混合物を実施例３aと同様に後処理した。
【００６２】
【表３】
【００６３】
実施例４：種々の添加剤の存在下でのエナンチオ選択加水分解
シクロヘキサン１０mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル４．２５mmol（それぞれのラセミ酸約２％を含有する）の懸濁液に、塩化マグネシウム５０mMおよび塩化ナトリウム０．１Mを含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中の添加剤（表を参照）の溶液（量は表に示す）を穏やかに攪拌しながら加え、温度を２８℃に設定した。脱イオン水１．０mLに溶解した酵素６．５mgの添加により反応を開始し、０．１N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。約５０％転化後、反応混合物を実施例３ａ）と同様に後処理した。
【００６４】
【表４】
【００６５】
実施例５：種々の塩添加剤の存在下でのエナンチオ選択加水分解
シクロヘキサン１０mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（それぞれのラセミ酸約２％を含有する）４．２５mmolの各懸濁液に、１種または２種の中性塩（表を参照）を含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３９mLを、穏やかに攪拌しながら加え、温度を２８℃に設定した。脱イオン水１．０mLに溶解した酵素６．５mgの添加により反応を開始し、０．１N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。約５０％転化後、反応混合物を実施例３ａ）と同様に後処理した。
【００６６】
【表５】
【００６７】
実施例６：種々の条件でのエナンチオ選択加水分解
有機溶剤（表を参照）中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（量は表を参照；それぞれのラセミ酸約２％を含有する）の懸濁液に、添加剤（表を参照）とともに水性の緩衝溶液を穏やかに攪拌しながら加え、温度を２８℃に設定した。脱イオン水１．０mLに溶解した酵素（量は表を参照）の添加により反応を開始し、１．０N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。約５０％転化後、反応混合物を実施例３a）と同様に後処理した。
【００６８】
【表６】
【００６９】
実施例７：別のエステルを用いるエナンチオ選択加水分解
シクロヘキサン１０mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステル４．０１mmolの懸濁液に、塩化マグネシウム５０mMを含有する３mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）３９mLを、穏やかに攪拌しながら加え、温度を２８℃に設定した。脱イオン水１．０mLに溶解した酵素６．５mgの添加により反応を開始し、０．１N ＮａＯＨの制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。反応完了後、反応混合物を実施例３ａ）と同様に後処理した。
【００７０】
【表７】
【００７１】
実施例８：（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルおよび（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸の製造
ａ）（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルの製造：（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（９８．２％ＨＰＬＣ； ラセミ酸０．２％を含有）１０６．３mmolを、メチルシクロヘキサン１００mLに、穏やかに攪拌しながら懸濁させた。ポリエチレングリコールモノメチルエーテル５０００ ２０．００gを、０．１M酢酸マグネシウム（ｐＨ６．０）３８０mLに溶解し（０．５h攪拌； 容量約３９８mL）、この溶液を上記懸濁液に注いだ。得られたエマルション／懸濁液をｐＨ６．０に再調節し、温度を２８℃に設定した。酵素８３mgの添加により加水分解を開始し、穏やかに攪拌しながら１．０NのＮａＯＨ溶液（ｐＨ−ｓｔａｔ）の制御された添加によりｐＨを６．０に一定に保った。１７．２h後、および滴定剤を合計で４９．６４mL（転化率４７．５％）消費の後、ジクロロメタン５００mLを添加することにより反応を止めた。反応混合物を、ジクロロメタン４×５００mLで（最初は濁った相）、続いて酢酸エチル５００mLで（有機相を排出）抽出した。合わせたジクロロメタン相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させた。不溶性ＰＥＧを除去するために、残留物を酢酸エチル４００mL中で一晩すり砕いた。懸濁液をろ過し、ろ液を蒸発させ、残留物をジクロロメタンから再結晶して、（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル１１．２７g（４７．９mmol； ４５．１％）を白色結晶として得た。分析：ＨＰＬＣ：９９．４％（Ａ226nm）。エナンチオマー過剰率：９７．８％（方法は実施例２を参照）。
【００７２】
【表８】
【００７３】
ｂ）（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸の製造：水相を２５％硫酸でｐＨ２．０に設定し、酢酸エチル４×５００mLで抽出した。合わせた有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させ、残留物をＴＢＭＥから再結晶して、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸１０．４９g（４７．４mmol； ４４．６％）を白色固体として得た。分析：ＨＰＬＣ：９９．９％（Ａ226nm）。エナンチオマー過剰率：９８．２％（上記方法を参照； 保持時間：（Ｒ）−酸：１２．４４min、（Ｓ）−酸：１６．２５min）。
【００７４】
【表９】
【００７５】
ＮＭＲによれば、生成物はＰＥＧ約２％を含有する。
【００７６】
実施例９：（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルアミドの製造
ａ）テトラヒドロフラン７mL中の４−フルオロ−ベンジルアルコール４．３mmolおよびトリフェニルホスフィン４．７mmolの溶液を、テトラヒドロフラン１１mL中の（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル［実施例２ａ）または８ａ）］４．７mmolおよびアゾジカルボン酸ジイソプロピル４．７mmolの溶液に０℃で滴下した。混合物をＲＴまで暖まるままにし、攪拌を１８時間続けた。シリカゲル２gを添加した後、反応混合物を減圧下蒸発させた。得られた物質を、溶離剤として最初にヘプタンおよび酢酸エチルの２：１混合物、次に１：１混合物を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルを白色固体として得た； ＭＳ：ｍ／ｅ＝３４４（Ｍ＋Ｈ）+。
【００７７】
ｂ）ジオキサン７７mL中の（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル３．７mmolの溶液を、塩酸（３７％）８．６４mLで処理した。密閉したフラスコ中で、混合物を５２℃で１８h加熱した。溶液を減圧下蒸発させて、粗酸を黄色がかった固体として得た。粗酸を、酢酸エチル１０mL中、−５℃ですり砕いた。固体をろ過ロート上に集め、次に高真空下で乾燥して、（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸を白色固体としてを得た； ＭＳ：ｍ／ｅ＝３３０（Ｍ＋Ｈ）+。
【００７８】
ｃ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３７mL中の（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸１．８２mmolの溶液を０℃に冷却し、トリエチルアミン２．０mmol、ＨＢＴＵ１．８２mmol、メチルアミン塩酸塩２．２mmol、およびトリエチルアミン２．０mmolで連続的に処理した。氷浴を外しＲＴで攪拌を続けた。３０min後反応を止め、橙色溶液を減圧下で蒸発させた。得られた残留物を酢酸エチル１mL中ですり砕き、白色固体生成物をろ過し、その後ジクロロメタンに溶解し、この溶液を水で３回洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、次に減圧下で蒸発させて（Ｒ）−１−［４−（４−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルアミド４０９mg（理論の６６％）を白色固体として得た。ＭＳ：ｍ／ｅ＝３４３（Ｍ＋Ｈ）+； エナンチオマー過剰率＞９９．５％。
【００７９】
実施例１０：（Ｓ）−Ｎ−｛１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−イル｝−アセトアミドの製造
ａ）テトラヒドロフラン１５０mL中の３−フルオロ−ベンジルアルコール１１０．６mmolおよびトリフェニルホスフィン１０８．８mmolの溶液を、テトラヒドロフラン２００mL中の（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシ−フェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル１００．５mmolおよびアゾジカルボン酸ジイソプロピル１００．５mmolの溶液に、窒素雰囲気下、０℃で、５０min内に滴下した。混合物をＲＴまで暖まるままにし、攪拌を１８時間続けた。混合物を減圧下蒸発させた。固体の残留物をエーテル４００mL中ですり砕いて主に生成物およびトリフェニルホスフィンオキシドからなる白色固体を残した。ろ過後、固体物質を冷メタノール１００mL中ですり砕いて、（Ｓ）−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステルを白色固体として［ＭＳ：ｍ／ｅ＝３４４（Ｍ＋Ｈ）+］、微量のトリフェニルホスフィンおよびヒドラゾジカルボン酸ジイソプロピルとともに得た。
【００８０】
ｂ）ジオキサン６５０mL中の（Ｓ）−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル７４．６mmolの溶液を、塩酸（３７％）１７５mLで処理した。密閉したフラスコ中で、混合物を５０℃で１８h加熱した。溶液を減圧下で蒸発させて、黄色固体として粗酸を得た。粗酸を酢酸エチル５０mL中、０℃ですり砕いた。固体をろ過ロート上に集め、次に高真空下乾燥して、（Ｓ）−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸を黄色がかった固体として得た； ＭＳ：ｍ／ｅ＝３０（Ｍ＋Ｈ）+。
【００８１】
ｃ）ジオキサン３００mL中の（Ｓ）−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸６１mmolの溶液を、Ｎ−メチルモルホリン６１mmolで処理した。その後、反応混合物を−８℃に冷却し、クロロギ酸イソブチル６１mmolを添加した。５min攪拌後、温度が０℃まで上昇する間に、水４０mL中のアジ化ナトリウム１２１mmolの溶液を加えた。０℃で７０min攪拌後、懸濁液をDicalite（登録商標）でろ過した。ろ液をトルエン７００mLで希釈し、分液ロートに移した。有機層を分離し、次に炭酸水素ナトリウム飽和溶液２５０mLで２回、塩化ナトリウム飽和溶液２００mLで２回洗浄した。その後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、トルエン４００mLを添加した後、溶剤および残留イソブチルアルコールを蒸発させて容量約３５０mLで終了した。溶液を徐々に８０℃に加熱し、この温度に７０min保った。冷却後、中間体イソシアネートの溶液を約３００mLに濃縮し、この溶液をジオキサン１００mL中の塩酸（３７％）２５．４mLの溶液に４５℃に加熱しながら滴下した。最後に、添加が完了した後、温度を１時間で６０℃まで上げ、塩酸塩はすでに沈殿し始めた。混合物を０℃に冷却し、形成した固体物質をろ過ロート上に集めた。ｔ−ブチルメチルエーテルで洗浄した後、生成物を高真空下で乾燥した。（Ｓ）−４−アミノ−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−ピロリジン−２−オン塩酸塩を白色固体として得た。ＭＳ：ｍ／ｅ＝３０１（Ｍ＋Ｈ）+。
【００８２】
ｄ）ジクロロメタン８６mL中の（Ｓ）−４−アミノ−１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）フェニル］−ピロリジン−２−オン塩酸塩１１．３mmolの懸濁液を、トリエチルアミン２３．８mmolで処理し、０℃に冷却した。この溶液に、塩化アセチル１２．５mmolを加え、０℃で１５min攪拌を続けた。後処理のために、反応混合物を水１００mLで２回抽出した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させた。粗生成物をトルエン１００mL中ですり砕き、次に固体をろ過ロート上に集めた。第２工程では、生成物をｔ−ブチルメチルエーテル２００mL中、ＲＴですり砕いた。再び、固体の生成物をろ過ロート上に集め、高真空下で乾燥した。（Ｓ）−Ｎ−｛１−［４−（３−フルオロ−ベンジルオキシ）−フェニル］−５−オキソ−ピロリジン−３−イル｝−アセトアミドを白色固体として得た。ＭＳ：ｍ／ｅ＝３４３（Ｍ＋Ｈ）+； エナンチオマー過剰率：＞９９．５％。
【００８３】
実施例１１：（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸の製造
ポリエチレングリコール６０００ ８．００g、を１００mM酢酸マグネシウム緩衝液（ｐＨ６．０）１５０mLに攪拌しながら溶解し、この溶液を、メチルシクロヘキサン４０mL中の（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸メチルエステル（９９．７％）１０．００g（４２．５１mmol）の攪拌した懸濁液に添加した。混合物を２８℃に加熱し、２MのＮａＯＨでｐＨを６．０に再調節した。カンジダ・シリンドラシア（Candida cylindracea）コレステラーゼ３３．２mg（１６．８８kU/g）の添加により反応を開始し、攪拌下での１．０M ＮａＯＨ溶液の制御された添加によりｐＨを６．０に維持した。１．０M水酸化ナトリウム溶液を合計２０．３５mL（２０．３５mmol）消費した後（１７．１h後； 転化率４７．９％）、反応混合物を焼結ガラスフィルターに通した。ろ液は自然に水相および有機相に分離した。水相を酢酸エチル２×２００mLで洗浄して、未開裂エステルを除去した。水相を２５％硫酸でｐＨ４．０に設定し、真空中で容量約８０mLまで濃縮した（浴６０℃）。溶液を１℃に冷却し（白色沈殿／結晶の形成）、２５％硫酸でｐＨを１．５に設定した。沈殿／結晶を１℃で一晩攪拌し、焼結ガラスフィルターでろ別し（最小限の量の水で洗浄した）、高真空（ＲＴ、６×１０-2mbar）で一晩乾燥して、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸４．３２g（１９．５３mmol； ４５．９％）を得た。分析：ＨＰＬＣ（面積Ａ226nm）：９９．３％、エステル０．７％。９８．９％ｅｅ。生成物は、水５．３％（カールフィッシャー測定による）およびＰＥＧ２．１％（w／w）（ＮＭＲによる）を含有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ21、Ｒ22およびＲ23は、互いに独立に、水素またはハロゲンであり、
Ｒ24は、水素、メチル、またはハロゲンである）の化合物および／または式II：
【化２】
［式中、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、Ｃ2〜Ｃ4アルケニル、または式Ａ：
【化３】
（式中、Ｒ3は、水素またはＣ1〜Ｃ4アルキルであり、ｎは、１、２、または３である）の基であり、
Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24は、前記定義の意味を有する］の化合物の製造方法であって、
式III：
【化４】
（式中、Ｒ1、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、およびＲ24は、前記定義の意味を有する）の化合物を、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程を含む製造方法。
【請求項２】
酵母に由来するコレステラーゼが、カンジダ・シリンドラシア（Candida cylindracea）に由来するコレステラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
酵母に由来するコレステラーゼが、ロシュ・アプライド・サイエンス、インダストリアル・プロダクト、エンザイム・プロジェクト、サンドホファ・ストリート１１６、Ｄ−６８３０５ マンハイム、ドイツ（Roche Applied Science, Industrial Products, Enzyme Projects, Sandhofer Str. 116, D-68305 Mannheim, Germany）、オーダー番号10129046103、0393916または039800により販売されている市販コレステラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
式IIIの化合物を、０．５〜２０％の総濃度（w／w）の範囲の濃度で適用する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
式III中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24が、互いに独立に、水素またはフッ素である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
式III中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24が、水素である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
式III中、Ｒ1が、メチルまたはエチルである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルを、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程を含む、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸および（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルの製造方法。
【請求項９】
緩衝剤、たとえばリン酸カリウム緩衝剤またはマグネシウムジアセテートを、約３mM〜約１Mの範囲で使用する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
有機補助溶剤が存在する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
補助溶剤がｔ−ブチルメチルエーテル、シクロヘキサンまたはメチルシクロヘキサンである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
マグネシウム塩、ポリオール、ならびにポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールの誘導体から選択される添加剤の存在下で行う、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
塩が、１Mまでの範囲の濃度で存在する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ポリオールが、水相の４０％（w/v）までの濃度で存在する、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、分子量４〜６kDの範囲のＰＥＧから、場合によりモノ−またはジメチルエーテルとして選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
ポリエチレングリコールの濃度が５０％（v/v）までの範囲である、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
反応をｐＨ３．５〜１０の範囲のｐＨで行う、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
反応を４〜４５℃の範囲の温度で行う、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）請求項１記載の式IIIの化合物を、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程、および
（ｂ）得られた式Ｉの化合物および式IIの化合物を別々のｐＨで抽出することにより分離する工程
を含む、請求項１記載の式Ｉの化合物および／または請求項１記載の式IIの化合物の製造方法。
【請求項２０】
請求項１記載の式Ｉの化合物。
【請求項２１】
請求項１記載の式IIの化合物。
【請求項２２】
カルボキサミド、Ｎ−置換カルボキサミド、Ｎ，Ｎ−二置換カルボキサミド、カルボキサミジン、Ｎ−ヒドロキシ−カルボキサミジン、カルボン酸ヒドロキサミド、カルボン酸ヒドラジド、カルボニトリル、カルバルデヒド、ケトン、イソシアネート、イソチオシアネート、カルバメート、尿素、Ｎ−置換尿素、Ｎ，Ｎ−二置換尿素、第一級、第二級および第三級アミン、Ｎ−アミド、グアニジン、アミノメチル−、ヒドロキシメチル誘導体、ならびにエステル誘導体から選択される、請求項１記載の式Ｉの化合物または式IIの化合物の誘導体。
【請求項２３】
式IVａまたは式IVｂ：
【化５】
（式中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24は、請求項１記載の式Ｉ、IIおよびIIIに対する定義の意味を有し、
Ｒは、ＣＮ、ＣＨＯ、ＣＨ2Ｒ4、Ｃ（Ｏ）Ｒ5、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ6、Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、ＮＨＲ7、またはＣ（Ｏ）ＯＲ8であり；
Ｒ4は、ＯＨまたはＮＨ2であり；
Ｒ5は、Ｃ1〜Ｃ6アルキルであり；
Ｒ6は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、またはＣ1〜Ｃ6アルキルであり；
Ｒ7は、ＨまたはＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
Ｒ8は、Ｃ1〜Ｃ6アルキルである）の化合物。
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ21、Ｒ22およびＲ23は、互いに独立に、水素またはハロゲンであり、
Ｒ24は、水素、メチル、またはハロゲンである）の化合物および／または式II：
【化２】
［式中、Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ8アルキル、Ｃ2〜Ｃ4アルケニル、または式Ａ：
【化３】
（式中、Ｒ3は、水素またはＣ1〜Ｃ4アルキルであり、ｎは、１、２、または３である）の基であり、
Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24は、前記定義の意味を有する］の化合物の製造方法であって、
式III：
【化４】
（式中、Ｒ1、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、およびＲ24は、前記定義の意味を有する）の化合物を、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程を含む製造方法。
【請求項２】
酵母に由来するコレステラーゼが、カンジダ・シリンドラシア（Candida cylindracea）に由来するコレステラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
酵母に由来するコレステラーゼが、ロシュ・アプライド・サイエンス、インダストリアル・プロダクト、エンザイム・プロジェクト、サンドホファ・ストリート１１６、Ｄ−６８３０５ マンハイム、ドイツ（Roche Applied Science, Industrial Products, Enzyme Projects, Sandhofer Str. 116, D-68305 Mannheim, Germany）、オーダー番号10129046103、0393916または039800により販売されている市販コレステラーゼである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
式IIIの化合物を、０．５〜２０％の総濃度（w／w）の範囲の濃度で適用する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
式III中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24が、互いに独立に、水素またはフッ素である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
式III中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24が、水素である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
式III中、Ｒ1が、メチルまたはエチルである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
（ＲＳ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルを、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程を含む、（Ｓ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸および（Ｒ）−１−（４−ヒドロキシフェニル）−５−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エステルの製造方法。
【請求項９】
緩衝剤、たとえばリン酸カリウム緩衝剤またはマグネシウムジアセテートを、約３mM〜約１Mの範囲で使用する、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
有機補助溶剤が存在する、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
補助溶剤がｔ−ブチルメチルエーテル、シクロヘキサンまたはメチルシクロヘキサンである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
マグネシウム塩、ポリオール、ならびにポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールの誘導体から選択される添加剤の存在下で行う、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
塩が、１Mまでの範囲の濃度で存在する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ポリオールが、水相の４０％（w/v）までの濃度で存在する、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が、分子量４〜６kDの範囲のＰＥＧから、場合によりモノ−またはジメチルエーテルとして選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
ポリエチレングリコールの濃度が５０％（v/v）までの範囲である、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
反応をｐＨ３．５〜１０の範囲のｐＨで行う、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
反応を４〜４５℃の範囲の温度で行う、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）請求項１記載の式IIIの化合物を、酵母に由来するコレステラーゼと接触させる工程、および
（ｂ）得られた式Ｉの化合物および式IIの化合物を別々のｐＨで抽出することにより分離する工程
を含む、請求項１記載の式Ｉの化合物および／または請求項１記載の式IIの化合物の製造方法。
【請求項２０】
請求項１記載の式Ｉの化合物。
【請求項２１】
請求項１記載の式IIの化合物。
【請求項２２】
カルボキサミド、Ｎ−置換カルボキサミド、Ｎ，Ｎ−二置換カルボキサミド、カルボキサミジン、Ｎ−ヒドロキシ−カルボキサミジン、カルボン酸ヒドロキサミド、カルボン酸ヒドラジド、カルボニトリル、カルバルデヒド、ケトン、イソシアネート、イソチオシアネート、カルバメート、尿素、Ｎ−置換尿素、Ｎ，Ｎ−二置換尿素、第一級、第二級および第三級アミン、Ｎ−アミド、グアニジン、アミノメチル−、ヒドロキシメチル誘導体、ならびにエステル誘導体から選択される、請求項１記載の式Ｉの化合物または式IIの化合物の誘導体。
【請求項２３】
式IVａまたは式IVｂ：
【化５】
（式中、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23およびＲ24は、請求項１記載の式Ｉ、IIおよびIIIに対する定義の意味を有し、
Ｒは、ＣＮ、ＣＨＯ、ＣＨ2Ｒ4、Ｃ（Ｏ）Ｒ5、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ6、Ｃ（ＮＨ）ＮＨ2、ＮＨＲ7、またはＣ（Ｏ）ＯＲ8であり；
Ｒ4は、ＯＨまたはＮＨ2であり；
Ｒ5は、Ｃ1〜Ｃ6アルキルであり；
Ｒ6は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、またはＣ1〜Ｃ6アルキルであり；
Ｒ7は、ＨまたはＣ（ＮＨ）ＮＨ2であり；
Ｒ8は、Ｃ1〜Ｃ6アルキルである）の化合物。
【公表番号】特表２００７−５０５８５５（Ｐ２００７−５０５８５５Ａ）
【公表日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２６５８０（Ｐ２００６−５２６５８０）
【出願日】平成１６年９月１５日（２００４．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１０２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２６３７３
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１５日（２００４．９．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１０２９０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２６３７３
【国際公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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