オオボウシバナ由来のフラボノイドを含有するヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤
【課題】真皮を構成している線維芽細胞を活性化させ、細胞によるヒアルロン酸の合成を促進させることで、老化に伴うシワ、しみ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下などを予防、改善できるヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤を提供する。
【解決手段】オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含むヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤。
【解決手段】オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含むヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ツユクサ科（Commelinaceae）の植物であるオオボウシバナ（C. communis var. hortensis）由来のフラボノイドを有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚を構成する真皮は、主に線維芽細胞およびマトリックス成分からなっている。線維芽細胞は、コラーゲンなどのタンパク質およびヒアルロン酸などのグリコサミノグリカンを産生して、結合組織を形成し、皮膚において重要な役割を果たしている。そのため、コラーゲンやヒアルロン酸などが減少すると、結合組織が崩壊することにより皮膚が老化し、シワ、しみ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下などが起こることになる。
【０００３】
このようなコラーゲンやヒアルロン酸の機能に着目して、従来より、ニワトリのトサカなどに含まれるヒアルロン酸が化粧料に配合されている。しかし、ヒアルロン酸は高分子であるため、それを配合した化粧料を皮膚に直接塗布しても吸収されにくいという問題があった。そこで、これまで、線維芽細胞を活性化することで、細胞自らのコラーゲンやヒアルロン酸の合成を促進させることができる皮膚外用剤が模索されてきた。
【０００４】
一方、これまでに多くの植物抽出物が種々の生理作用を有することが知られている。たとえば、オオボウシバナの場合、その抽出物が血糖上昇抑制作用や抗酸化作用を有することが知られている（特許文献１および２参照）。
【０００５】
しかし、オオボウシバナ抽出物を皮膚に塗布することで線維芽細胞が活性化され、細胞によるコラーゲンやヒアルロン酸の合成が促進されることについては知られていなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３１６９３５号公報
【特許文献２】特開２００６−１４３６５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、真皮を構成している線維芽細胞を活性化させ、細胞によるヒアルロン酸の合成を促進させることで、老化に伴うシワ、しみ、くすみ、きめの消失、弾力の低下などを予防、改善できるヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、オオボウシバナ抽出物を皮膚に塗布することで線維芽細胞を活性化させることができ、その結果、細胞によるヒアルロン酸の合成を促進させることができることを見出し、オオボウシバナの抽出物の細胞賦活効果、コラーゲン合成促進効果およびヒアルロン酸合成促進効果について特許出願を行っている。
【０００９】
さらに本発明者らはオオボウシバナ抽出物から、その活性成分の分析を進めていく過程において、強いヒアルロン酸合成促進効果を有するフラボノイドを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とするヒアルロン酸合成促進剤に関する。
【００１１】
本発明のヒアルロン酸合成促進剤において、フラボノイドが、ルテオリン−７−グルコシド、クリソエリオール−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドおよびイソラムネチン−３−Ｏ−ルチノシドからなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００１２】
本発明はまた、オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有する抗老化剤に関する。
【００１３】
本発明はさらに、オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有する皮膚外用剤に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、オオボウシバナ由来のフラボノイドを用いることにより、真皮を構成している線維芽細胞を活性化させ、細胞によるヒアルロン酸の合成を促進させることで、老化に伴うシワ、しみ、くすみ、きめの消失および弾力の低下などを予防、改善できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤に関する。
【００１６】
オオボウシバナは、従来染物や食用にも用いられている安全性の高いツユクサ科の植物である。本発明においては、植物体の全草（茎、葉、根、花などの各種部位）または一部をそのままか、その乾燥物からオオボウシバナの抽出物またはオオボウシバナの抽出物に含まれるフラボノイドを得ることができる。
【００１７】
本発明のオオボウシバナ由来のフラボノイドとしては、オオボウシバナ抽出物から単離して使用することもできるが、抽出物をそのまま使用することもできる。
【００１８】
本発明の有効成分としてオオボウシバナから得られるフラボノイドとしては、ルテオリン−７−グルコシド、クリソエリオール−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドおよびイソラムネチン−３−Ｏ−ルチノシドなどが挙げられる。以下にこれらのフラボノイドの化学構造式を示す。
【００１９】
【化１】
【００２０】
【化２】
【００２１】
これら３つのフラボノイドは、当然合成により製造することもできるが、オオボウシバナ抽出物から単離して使用することができ、あるいは、これらのフラボノイドを含有するオオボウシバナ抽出物をそのまま使用しても本発明の効果を得ることができる。安全性の面からオオボウシバナ抽出物から単離するか、オオボウシバナ抽出物をそのまま使用することが好ましい。
【００２２】
オオボウシバナの抽出に用いる溶媒としては、とくに限定されないが、たとえば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクチルアルコールなどのアルコール類；グリセリン、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコールなどの多価アルコール；酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、ギ酸メチルなどのエステル類；アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；エチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類；ヘキサン、トルエン、クロロホルム、塩化メチレンなどの炭化水素系溶媒などがあげられる。これらは単独または２種以上を組み合わせて用いることができる。これらのなかでも、安全性、皮膚外用剤としての利便性という点から水およびアルコール類が好ましく、水およびエタノールがより好ましい。
【００２３】
たとえば、溶媒として水とエタノールを併用する場合、両者の割合は任意であっても良好にオオボウシバナ抽出物やオオボウシバナ抽出物に含まれるフラボノイドを得ることができるが、なかでも抽出溶媒はエタノール濃度２０〜１００容量％であることが好ましく、５０〜７５容量％であることがより好ましい。
【００２４】
抽出方法としては、とくに限定されないが、浸漬または加熱還流などの方法があげられる。溶媒の量は、粉砕したオオボウシバナ１００重量部に対して、１００〜１０００００重量部であることが好ましく、５００〜１００００重量部であることがより好ましい。溶媒が１００重量部未満であると、抽出効率が悪くなる傾向があり、また１０００００重量部をこえて添加してもさらなる抽出効率の向上が望めないうえに、濃縮・精製工程に時間がかかり製造効率が劣る傾向がある。また、浸漬抽出時の温度は６０〜８０℃に、抽出時の浸漬時間は６０〜１２０分間に設定できるがこれに限定されるものではない。これらの抽出操作は単回、または２回〜数回繰り返すこともできる。
【００２５】
得られた抽出物は、そのまま使用してもよいが、不純物の除去や脱臭、脱色、濃縮などの精製を、ろ過、ゲルろ過、遠心分離、クロマトグラフィー、蒸留、分配法などにより行ってもよい。また、スプレードライ法や凍結乾燥法などにより溶媒を除去して乾固物の形態とすることもでき、さらに精製水などの溶媒に可溶化した形態や乳剤の形態とすることもできる。
【００２６】
本発明のヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤は前記オオボウシバナ抽出物やオオボウシバナ抽出物に含まれるフラボノイドを有効成分として配合することで製造される。オオボウシバナ抽出物およびオオボウシバナ抽出物に含まれるフラボノイドは、それ自体で細胞賦活、ヒアルロン酸合成促進などの作用を有するので、抽出物を単独で使用することもできるが、たとえば、外用剤基剤に通常用いられる油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、低級アルコール類、高級アルコール類、多価アルコール類、エステル類、水溶性高分子、界面活性剤、保湿剤、抗炎症剤、紫外線吸収剤、防腐剤、防カビ剤、香料、顔料、賦形剤、酸化防止剤、美容成分、化粧料安定化剤などを含有させてもよい。また、本発明のヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤には、前記オオボウシバナ抽出物に含まれるフラボノイド以外にも、さらにその他の細胞賦活剤、抗老化防止剤、コラーゲン合成促進剤、ヒアルロン酸合成促進剤などをさらに配合することができる。
【００２７】
本発明の皮膚外用剤としては、たとえば、シワ予防改善用外用剤、皮膚老化防止用化粧料、日焼け止め化粧料、皮膚保護用化粧料、美白化粧料、ファンデーションやその他の医薬部外品などがあげられる。
【００２８】
本発明のヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤における前記オオボウシバナ抽出物の配合量は、とくに限定されないが、好ましくは０．００００１〜１０重量％であり、より好ましくは０．０００１〜１重量％である。配合量が０．００００１重量％未満であると、ヒアルロン酸合成促進効果、抗老化効果および細胞賦活効果を充分に発現させることができない傾向があり、また、１０重量％をこえても、それに応じた効果の発現が望めない傾向がある。
【００２９】
本発明のヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤は、ローション剤、乳剤、ゲル剤、ゾル剤、クリーム、軟膏、パウダー、スプレーなどの種々の形態とすることができる。また、皮膚外用剤として、とくに化粧料の形態で用いる場合は、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック剤、洗顔料などの皮膚用化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、ファンデーション、リキッドファンデーション、口紅などのメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション、ボディソープ、石鹸などの身体用化粧料、シャンプー、リンス、養毛剤などの頭髪用化粧料とすることができる。
【実施例】
【００３０】
つぎに、実施例にもとづいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００３１】
製造例１（オオボウシバナ抽出物の製造）
乾燥させたオオボウシバナ２ｋｇを７０％エタノール水溶液２０Ｌで還流抽出した。抽出液を１／１０に濃縮し、凍結乾燥させた。乾燥粉末として約１６０ｇのオオボウシバナ抽出物を得た。
【００３２】
製造例２（各フラボノイドの単離）
製造例１で得られた抽出物を、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー（約３００ｍｌ）に通導し、Ｈ2Ｏで洗浄後、メタノール溶出画分を得た。さらにメタノール溶出画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５００ｇ、５．３ｃｍ（内径）×５６ｃｍ、ジクロロメタン−メタノール系、）に付し、さらにＨＰＬＣ（カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＰＡＱ、Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ−５ＰＥまたはＮｕｃｌｅｏｓｉｌ ５Ｃ１８ＡＢ）分離を行い、ルテオリン−７−グルコシド（フラボノイドＡ）、クリソエリオール−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（フラボノイドＢ）、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノシド（フラボノイドＣ）を単離した。
【００３３】
各フラボノイドの構造は、５００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトルや質量分析等を用いて文献記載のデータと比較することにより、上記フラボノイドであることを同定した。
【００３４】
試験例１（細胞賦活作用試験）
正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ：倉敷紡績（株）製）を１０％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地で前培養した（細胞培養条件：ＣＯ2インキュベーター ５％ＣＯ2、９５％空気（以下、細胞培養条件はすべて同じ））。培養後、細胞を回収し、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地で細胞数を２．５×１０5個／ｍｌに調整し、３５ｍｍシャーレに２ｍｌずつ播種した。２４時間後、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（２ｍｌ）（対照）、または表１に示した濃度の製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物もしくは製造例２で得られた各フラボノイドを含む、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（２ｍｌ）に交換して、４８時間培養した。培養終了後、２−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−３，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で含む１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（２ｍｌ）に交換して、２時間培養した。２時間後、テトラゾリウム環の開環によるフォルマザンを２−プロパノール（２ｍｌ）で抽出した。抽出液の吸光度（５５０−６５０ｎｍ）を測定し、細胞活性量とした。対照培地で培養したときの抽出液の細胞活性量を基準（１００）として、製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物または製造例２で得られた各フラボノイドを用いて得られた値を指数表示した。結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
表１に示す結果より、製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物または製造例２で得られた各フラボノイドが細胞賦活作用を有することが確認できた。
【００３７】
試験例２（ヒアルロン酸合成促進作用試験）
正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ：倉敷紡績（株）製）を１０％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地で前培養した。培養後、細胞を回収し、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地で細胞数を２．５×１０5個／ｍｌに調整し、３５ｍｍシャーレに２ｍｌずつ播種した。２４時間後、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（２ｍｌ）（対照）、または表２に示した濃度の製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物または製造例２で得られた各フラボノイドを含む、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（２ｍｌ）に交換して、７２時間培養した。培養終了後、培養上清中のヒアルロン酸量をヒアルロン酸測定キット（生化学工業（株）製）を用いてＥＬＩＳＡ法にて測定した。対照培地で培養したときの培養上清中のヒアルロン酸量を基準（１００）として、製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物または製造例２で得られた各フラボノイドを用いて得られた値を指数表示した。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
表２に示す結果より、製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物または製造例２で得られた各フラボノイドは高いヒアルロン酸合成促進作用を有することが確認できた。
【００４０】
実施例１（クリーム）
表３に示す成分（Ａ）および（Ｂ）をそれぞれ８５℃に加温溶解し、成分（Ａ）および（Ｂ）を混合、分散させた。そこに、成分（Ｃ）を加えて、撹拌しながら３０℃まで徐冷し、均一なクリームを得た。
【００４１】
【表３】
【００４２】
実施例２（リキッドファンデーション）
表４に示す成分（Ａ）および（Ｂ）をそれぞれ８５℃に加温溶解し、成分（Ａ）および（Ｂ）を混合、分散させた。そこに、成分（Ｃ）を加えて、撹拌しながら３０℃まで徐冷し、均一なリキッドファンデーションを得た。
【００４３】
【表４】
【００４４】
比較例１（クリーム）
製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物の代わりに精製水を用いた以外は、実施例１と同様にクリームを得た。
【００４５】
比較例２（リキッドファンデーション）
製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物の代わりに精製水を用いた以外は、実施例１と同様にリキッドファンデーションを得た。
【００４６】
試験例３（皮膚化粧料のモニター試験）
無作為に抽出した２０歳代、３０歳代および４０歳代の健常な成人それぞれ２０名（合計６０名）を被験者とし、実施例１および２ならびに比較例１および２の皮膚化粧料を通常の方法で連日１ヵ月使用してもらった。
【００４７】
１ヵ月経過した後、皮膚の状態としてシワに対する改善効果と、はりおよびたるみに対する改善効果を以下の基準で評価した。結果を表５に示す。
【００４８】
なお、このモニター試験で皮膚に異常が生じた被験者は１名もいなかった。また、１ヵ月にわたってそれぞれの皮膚化粧料はその状態に変化が生じることなく安定していた。
【００４９】
［シワに対する改善効果］
目じりの状態を目視で観察して、以下の評価基準にもとづいて評価した。
Ａ：非常に改善された。
Ｂ：改善された。
Ｃ：やや改善された。
Ｄ：改善効果がなかった。
Ｅ：悪化した。
【００５０】
［はりおよびたるみに対する改善効果］
顔全体の皮膚の状態を目視にて観察して、以下の評価基準にもとづいて評価した。
Ａ：非常に改善された。
Ｂ：改善された。
Ｃ：やや改善された。
Ｄ：改善効果がなかった。
Ｅ：悪化した。
【００５１】
【表５】
【００５２】
表５に示す結果より、実施例１および２の皮膚化粧料を用いた場合には、比較例１および２の皮膚化粧料を用いた場合と比較して、目じりのシワ、ならびにはりおよびたるみが改善されたことがわかる。すなわち、本発明により、オオボウシバナ抽出物を含む皮膚化粧料が、シワならびにはりおよびたるみを予防、改善し、総じて老化防止作用を発現することがわかる。
【００５３】
以下、本発明の皮膚外用剤の処方例を示す。なお、含有量は重量％である。
【００５４】
＜処方例１：クリーム＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０２
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
グリセリルモノステアレート ３．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ３．０
セタノール ２．０
スクワラン ３．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル １０．０
グリセリン ７．０
エチルパラベン ０．１
精製水 残部
合計 １００
【００５５】
＜処方例２：クリーム＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０１
ステアリン酸 １０．０
セタノール ２．０
ラノリン １．０
ミリスチン酸イソプロピル ３．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール １．５
トリエタノールアミン ０．８
ソルビトール（７０％） ４．０
メチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【００５６】
＜処方例３：リキッドファンデーション＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０１
ヒアルロン酸 ０．０１
グリセリルモノステアレート ２．０
ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム ０．５
ステアリン酸 ５．０
ベヘニルアルコール １．０
ラノリン ２．０
スクワラン ５．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル ４．０
顔料 １０．０
プロピレングリコール ７．０
トリエタノールアミン １．０
エチルパラベン ０．１
精製水 残部
合計 １００
【００５７】
＜処方例４：リキッドファンデーション＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０５
ラノリン ２．０
流動パラフィン ５．０
ステアリン酸 ２．０
セタノール １．０
グリセリン ２．０
スクワラン ５．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル ４．０
顔料 １０．０
プロピレングリコール ７．０
トリエタノールアミン １．０
エチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【００５８】
＜処方例５：乳液＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０２
ヒアルロン酸 ０．０１
ステアリン酸 ２．０
エタノール ０．５
流動パラフィン １０．０
ラノリン脂肪酸イソプロピル ３．０
ラノリン ４．０
スクワラン ５．０
セスキイソステアリン酸ソルビタン １．０
プロピレングリコール ５．０
トリエタノールアミン ０．６
エチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【００５９】
＜処方例６：乳液＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０１
ステアリン酸 ３．５
エタノール ０．５
流動パラフィン ３．０
ラノリン ０．５
スクワラン ２．０
プロピレングリコール ３．０
トリエタノールアミン ０．８
エチルパラベン ０．１
カルボキシビニルポリマー１％液（アルカリ中和） ８．０
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【００６０】
＜処方例７：化粧水＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０２
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン １．０
１，３−ブチレングリコール ３．０
ソルビトール（７０％） ２．０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液 ３．０
エタノール １５．０
アスコルビン酸 ０．１
メチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【００６１】
＜処方例８：化粧水＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０５
モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン １．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ソルビトール（７０％） ２．０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液 ３．０
エタノール １５．０
アスコルビン酸 ０．１
メチルパラベン ０．１
色素 ０．０１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ツユクサ科（Commelinaceae）の植物であるオオボウシバナ（C. communis var. hortensis）由来のフラボノイドを有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚を構成する真皮は、主に線維芽細胞およびマトリックス成分からなっている。線維芽細胞は、コラーゲンなどのタンパク質およびヒアルロン酸などのグリコサミノグリカンを産生して、結合組織を形成し、皮膚において重要な役割を果たしている。そのため、コラーゲンやヒアルロン酸などが減少すると、結合組織が崩壊することにより皮膚が老化し、シワ、しみ、くすみ、きめの消失、弾力性の低下などが起こることになる。
【０００３】
このようなコラーゲンやヒアルロン酸の機能に着目して、従来より、ニワトリのトサカなどに含まれるヒアルロン酸が化粧料に配合されている。しかし、ヒアルロン酸は高分子であるため、それを配合した化粧料を皮膚に直接塗布しても吸収されにくいという問題があった。そこで、これまで、線維芽細胞を活性化することで、細胞自らのコラーゲンやヒアルロン酸の合成を促進させることができる皮膚外用剤が模索されてきた。
【０００４】
一方、これまでに多くの植物抽出物が種々の生理作用を有することが知られている。たとえば、オオボウシバナの場合、その抽出物が血糖上昇抑制作用や抗酸化作用を有することが知られている（特許文献１および２参照）。
【０００５】
しかし、オオボウシバナ抽出物を皮膚に塗布することで線維芽細胞が活性化され、細胞によるコラーゲンやヒアルロン酸の合成が促進されることについては知られていなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−３１６９３５号公報
【特許文献２】特開２００６−１４３６５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、真皮を構成している線維芽細胞を活性化させ、細胞によるヒアルロン酸の合成を促進させることで、老化に伴うシワ、しみ、くすみ、きめの消失、弾力の低下などを予防、改善できるヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、オオボウシバナ抽出物を皮膚に塗布することで線維芽細胞を活性化させることができ、その結果、細胞によるヒアルロン酸の合成を促進させることができることを見出し、オオボウシバナの抽出物の細胞賦活効果、コラーゲン合成促進効果およびヒアルロン酸合成促進効果について特許出願を行っている。
【０００９】
さらに本発明者らはオオボウシバナ抽出物から、その活性成分の分析を進めていく過程において、強いヒアルロン酸合成促進効果を有するフラボノイドを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とするヒアルロン酸合成促進剤に関する。
【００１１】
本発明のヒアルロン酸合成促進剤において、フラボノイドが、ルテオリン−７−グルコシド、クリソエリオール−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドおよびイソラムネチン−３−Ｏ−ルチノシドからなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００１２】
本発明はまた、オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有する抗老化剤に関する。
【００１３】
本発明はさらに、オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有する皮膚外用剤に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、オオボウシバナ由来のフラボノイドを用いることにより、真皮を構成している線維芽細胞を活性化させ、細胞によるヒアルロン酸の合成を促進させることで、老化に伴うシワ、しみ、くすみ、きめの消失および弾力の低下などを予防、改善できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有するヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤に関する。
【００１６】
オオボウシバナは、従来染物や食用にも用いられている安全性の高いツユクサ科の植物である。本発明においては、植物体の全草（茎、葉、根、花などの各種部位）または一部をそのままか、その乾燥物からオオボウシバナの抽出物またはオオボウシバナの抽出物に含まれるフラボノイドを得ることができる。
【００１７】
本発明のオオボウシバナ由来のフラボノイドとしては、オオボウシバナ抽出物から単離して使用することもできるが、抽出物をそのまま使用することもできる。
【００１８】
本発明の有効成分としてオオボウシバナから得られるフラボノイドとしては、ルテオリン−７−グルコシド、クリソエリオール−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドおよびイソラムネチン−３−Ｏ−ルチノシドなどが挙げられる。以下にこれらのフラボノイドの化学構造式を示す。
【００１９】
【化１】
【００２０】
【化２】
【００２１】
これら３つのフラボノイドは、当然合成により製造することもできるが、オオボウシバナ抽出物から単離して使用することができ、あるいは、これらのフラボノイドを含有するオオボウシバナ抽出物をそのまま使用しても本発明の効果を得ることができる。安全性の面からオオボウシバナ抽出物から単離するか、オオボウシバナ抽出物をそのまま使用することが好ましい。
【００２２】
オオボウシバナの抽出に用いる溶媒としては、とくに限定されないが、たとえば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロパノール、イソブタノール、ｎ−ヘキサノール、メチルアミルアルコール、２−エチルブタノール、ｎ−オクチルアルコールなどのアルコール類；グリセリン、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコール、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、トリエチレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ヘキシレングリコールなどの多価アルコール；酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル、ギ酸メチルなどのエステル類；アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；エチルエーテル、イソプロピルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類；ヘキサン、トルエン、クロロホルム、塩化メチレンなどの炭化水素系溶媒などがあげられる。これらは単独または２種以上を組み合わせて用いることができる。これらのなかでも、安全性、皮膚外用剤としての利便性という点から水およびアルコール類が好ましく、水およびエタノールがより好ましい。
【００２３】
たとえば、溶媒として水とエタノールを併用する場合、両者の割合は任意であっても良好にオオボウシバナ抽出物やオオボウシバナ抽出物に含まれるフラボノイドを得ることができるが、なかでも抽出溶媒はエタノール濃度２０〜１００容量％であることが好ましく、５０〜７５容量％であることがより好ましい。
【００２４】
抽出方法としては、とくに限定されないが、浸漬または加熱還流などの方法があげられる。溶媒の量は、粉砕したオオボウシバナ１００重量部に対して、１００〜１０００００重量部であることが好ましく、５００〜１００００重量部であることがより好ましい。溶媒が１００重量部未満であると、抽出効率が悪くなる傾向があり、また１０００００重量部をこえて添加してもさらなる抽出効率の向上が望めないうえに、濃縮・精製工程に時間がかかり製造効率が劣る傾向がある。また、浸漬抽出時の温度は６０〜８０℃に、抽出時の浸漬時間は６０〜１２０分間に設定できるがこれに限定されるものではない。これらの抽出操作は単回、または２回〜数回繰り返すこともできる。
【００２５】
得られた抽出物は、そのまま使用してもよいが、不純物の除去や脱臭、脱色、濃縮などの精製を、ろ過、ゲルろ過、遠心分離、クロマトグラフィー、蒸留、分配法などにより行ってもよい。また、スプレードライ法や凍結乾燥法などにより溶媒を除去して乾固物の形態とすることもでき、さらに精製水などの溶媒に可溶化した形態や乳剤の形態とすることもできる。
【００２６】
本発明のヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤は前記オオボウシバナ抽出物やオオボウシバナ抽出物に含まれるフラボノイドを有効成分として配合することで製造される。オオボウシバナ抽出物およびオオボウシバナ抽出物に含まれるフラボノイドは、それ自体で細胞賦活、ヒアルロン酸合成促進などの作用を有するので、抽出物を単独で使用することもできるが、たとえば、外用剤基剤に通常用いられる油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、低級アルコール類、高級アルコール類、多価アルコール類、エステル類、水溶性高分子、界面活性剤、保湿剤、抗炎症剤、紫外線吸収剤、防腐剤、防カビ剤、香料、顔料、賦形剤、酸化防止剤、美容成分、化粧料安定化剤などを含有させてもよい。また、本発明のヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤には、前記オオボウシバナ抽出物に含まれるフラボノイド以外にも、さらにその他の細胞賦活剤、抗老化防止剤、コラーゲン合成促進剤、ヒアルロン酸合成促進剤などをさらに配合することができる。
【００２７】
本発明の皮膚外用剤としては、たとえば、シワ予防改善用外用剤、皮膚老化防止用化粧料、日焼け止め化粧料、皮膚保護用化粧料、美白化粧料、ファンデーションやその他の医薬部外品などがあげられる。
【００２８】
本発明のヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤における前記オオボウシバナ抽出物の配合量は、とくに限定されないが、好ましくは０．００００１〜１０重量％であり、より好ましくは０．０００１〜１重量％である。配合量が０．００００１重量％未満であると、ヒアルロン酸合成促進効果、抗老化効果および細胞賦活効果を充分に発現させることができない傾向があり、また、１０重量％をこえても、それに応じた効果の発現が望めない傾向がある。
【００２９】
本発明のヒアルロン酸合成促進剤、抗老化剤および皮膚外用剤は、ローション剤、乳剤、ゲル剤、ゾル剤、クリーム、軟膏、パウダー、スプレーなどの種々の形態とすることができる。また、皮膚外用剤として、とくに化粧料の形態で用いる場合は、化粧水、乳液、クリーム、美容液、パック剤、洗顔料などの皮膚用化粧料、メイクアップベースローション、メイクアップベースクリーム、ファンデーション、リキッドファンデーション、口紅などのメイクアップ化粧料、ハンドクリーム、レッグクリーム、ボディローション、ボディソープ、石鹸などの身体用化粧料、シャンプー、リンス、養毛剤などの頭髪用化粧料とすることができる。
【実施例】
【００３０】
つぎに、実施例にもとづいて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００３１】
製造例１（オオボウシバナ抽出物の製造）
乾燥させたオオボウシバナ２ｋｇを７０％エタノール水溶液２０Ｌで還流抽出した。抽出液を１／１０に濃縮し、凍結乾燥させた。乾燥粉末として約１６０ｇのオオボウシバナ抽出物を得た。
【００３２】
製造例２（各フラボノイドの単離）
製造例１で得られた抽出物を、ダイヤイオンＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー（約３００ｍｌ）に通導し、Ｈ2Ｏで洗浄後、メタノール溶出画分を得た。さらにメタノール溶出画分を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５００ｇ、５．３ｃｍ（内径）×５６ｃｍ、ジクロロメタン−メタノール系、）に付し、さらにＨＰＬＣ（カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＰＡＱ、Ｄｅｖｅｒｏｓｉｌ−５ＰＥまたはＮｕｃｌｅｏｓｉｌ ５Ｃ１８ＡＢ）分離を行い、ルテオリン−７−グルコシド（フラボノイドＡ）、クリソエリオール−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（フラボノイドＢ）、イソラムネチン−３−Ｏ−ルチノシド（フラボノイドＣ）を単離した。
【００３３】
各フラボノイドの構造は、５００ＭＨｚ核磁気共鳴スペクトルや質量分析等を用いて文献記載のデータと比較することにより、上記フラボノイドであることを同定した。
【００３４】
試験例１（細胞賦活作用試験）
正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ：倉敷紡績（株）製）を１０％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地で前培養した（細胞培養条件：ＣＯ2インキュベーター ５％ＣＯ2、９５％空気（以下、細胞培養条件はすべて同じ））。培養後、細胞を回収し、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地で細胞数を２．５×１０5個／ｍｌに調整し、３５ｍｍシャーレに２ｍｌずつ播種した。２４時間後、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（２ｍｌ）（対照）、または表１に示した濃度の製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物もしくは製造例２で得られた各フラボノイドを含む、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（２ｍｌ）に交換して、４８時間培養した。培養終了後、２−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−３，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で含む１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（２ｍｌ）に交換して、２時間培養した。２時間後、テトラゾリウム環の開環によるフォルマザンを２−プロパノール（２ｍｌ）で抽出した。抽出液の吸光度（５５０−６５０ｎｍ）を測定し、細胞活性量とした。対照培地で培養したときの抽出液の細胞活性量を基準（１００）として、製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物または製造例２で得られた各フラボノイドを用いて得られた値を指数表示した。結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
表１に示す結果より、製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物または製造例２で得られた各フラボノイドが細胞賦活作用を有することが確認できた。
【００３７】
試験例２（ヒアルロン酸合成促進作用試験）
正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ：倉敷紡績（株）製）を１０％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地で前培養した。培養後、細胞を回収し、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地で細胞数を２．５×１０5個／ｍｌに調整し、３５ｍｍシャーレに２ｍｌずつ播種した。２４時間後、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（２ｍｌ）（対照）、または表２に示した濃度の製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物または製造例２で得られた各フラボノイドを含む、１％ＦＢＳを含むダルベッコ変法イーグル培地（２ｍｌ）に交換して、７２時間培養した。培養終了後、培養上清中のヒアルロン酸量をヒアルロン酸測定キット（生化学工業（株）製）を用いてＥＬＩＳＡ法にて測定した。対照培地で培養したときの培養上清中のヒアルロン酸量を基準（１００）として、製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物または製造例２で得られた各フラボノイドを用いて得られた値を指数表示した。結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】
表２に示す結果より、製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物または製造例２で得られた各フラボノイドは高いヒアルロン酸合成促進作用を有することが確認できた。
【００４０】
実施例１（クリーム）
表３に示す成分（Ａ）および（Ｂ）をそれぞれ８５℃に加温溶解し、成分（Ａ）および（Ｂ）を混合、分散させた。そこに、成分（Ｃ）を加えて、撹拌しながら３０℃まで徐冷し、均一なクリームを得た。
【００４１】
【表３】
【００４２】
実施例２（リキッドファンデーション）
表４に示す成分（Ａ）および（Ｂ）をそれぞれ８５℃に加温溶解し、成分（Ａ）および（Ｂ）を混合、分散させた。そこに、成分（Ｃ）を加えて、撹拌しながら３０℃まで徐冷し、均一なリキッドファンデーションを得た。
【００４３】
【表４】
【００４４】
比較例１（クリーム）
製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物の代わりに精製水を用いた以外は、実施例１と同様にクリームを得た。
【００４５】
比較例２（リキッドファンデーション）
製造例１で得られたオオボウシバナ抽出物の代わりに精製水を用いた以外は、実施例１と同様にリキッドファンデーションを得た。
【００４６】
試験例３（皮膚化粧料のモニター試験）
無作為に抽出した２０歳代、３０歳代および４０歳代の健常な成人それぞれ２０名（合計６０名）を被験者とし、実施例１および２ならびに比較例１および２の皮膚化粧料を通常の方法で連日１ヵ月使用してもらった。
【００４７】
１ヵ月経過した後、皮膚の状態としてシワに対する改善効果と、はりおよびたるみに対する改善効果を以下の基準で評価した。結果を表５に示す。
【００４８】
なお、このモニター試験で皮膚に異常が生じた被験者は１名もいなかった。また、１ヵ月にわたってそれぞれの皮膚化粧料はその状態に変化が生じることなく安定していた。
【００４９】
［シワに対する改善効果］
目じりの状態を目視で観察して、以下の評価基準にもとづいて評価した。
Ａ：非常に改善された。
Ｂ：改善された。
Ｃ：やや改善された。
Ｄ：改善効果がなかった。
Ｅ：悪化した。
【００５０】
［はりおよびたるみに対する改善効果］
顔全体の皮膚の状態を目視にて観察して、以下の評価基準にもとづいて評価した。
Ａ：非常に改善された。
Ｂ：改善された。
Ｃ：やや改善された。
Ｄ：改善効果がなかった。
Ｅ：悪化した。
【００５１】
【表５】
【００５２】
表５に示す結果より、実施例１および２の皮膚化粧料を用いた場合には、比較例１および２の皮膚化粧料を用いた場合と比較して、目じりのシワ、ならびにはりおよびたるみが改善されたことがわかる。すなわち、本発明により、オオボウシバナ抽出物を含む皮膚化粧料が、シワならびにはりおよびたるみを予防、改善し、総じて老化防止作用を発現することがわかる。
【００５３】
以下、本発明の皮膚外用剤の処方例を示す。なお、含有量は重量％である。
【００５４】
＜処方例１：クリーム＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０２
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
グリセリルモノステアレート ３．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート ３．０
セタノール ２．０
スクワラン ３．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル １０．０
グリセリン ７．０
エチルパラベン ０．１
精製水 残部
合計 １００
【００５５】
＜処方例２：クリーム＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０１
ステアリン酸 １０．０
セタノール ２．０
ラノリン １．０
ミリスチン酸イソプロピル ３．０
モノステアリン酸ポリエチレングリコール １．５
トリエタノールアミン ０．８
ソルビトール（７０％） ４．０
メチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【００５６】
＜処方例３：リキッドファンデーション＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０１
ヒアルロン酸 ０．０１
グリセリルモノステアレート ２．０
ポリオキシエチレン（４）ラウリルエーテルリン酸ナトリウム ０．５
ステアリン酸 ５．０
ベヘニルアルコール １．０
ラノリン ２．０
スクワラン ５．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル ４．０
顔料 １０．０
プロピレングリコール ７．０
トリエタノールアミン １．０
エチルパラベン ０．１
精製水 残部
合計 １００
【００５７】
＜処方例４：リキッドファンデーション＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０５
ラノリン ２．０
流動パラフィン ５．０
ステアリン酸 ２．０
セタノール １．０
グリセリン ２．０
スクワラン ５．０
２−エチルヘキサン酸グリセリル ４．０
顔料 １０．０
プロピレングリコール ７．０
トリエタノールアミン １．０
エチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【００５８】
＜処方例５：乳液＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０２
ヒアルロン酸 ０．０１
ステアリン酸 ２．０
エタノール ０．５
流動パラフィン １０．０
ラノリン脂肪酸イソプロピル ３．０
ラノリン ４．０
スクワラン ５．０
セスキイソステアリン酸ソルビタン １．０
プロピレングリコール ５．０
トリエタノールアミン ０．６
エチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【００５９】
＜処方例６：乳液＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０１
ステアリン酸 ３．５
エタノール ０．５
流動パラフィン ３．０
ラノリン ０．５
スクワラン ２．０
プロピレングリコール ３．０
トリエタノールアミン ０．８
エチルパラベン ０．１
カルボキシビニルポリマー１％液（アルカリ中和） ８．０
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【００６０】
＜処方例７：化粧水＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０２
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０１
モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン １．０
１，３−ブチレングリコール ３．０
ソルビトール（７０％） ２．０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液 ３．０
エタノール １５．０
アスコルビン酸 ０．１
メチルパラベン ０．１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【００６１】
＜処方例８：化粧水＞
オオボウシバナ抽出物 ０．０５
モノラウリン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン １．０
１，３−ブチレングリコール ５．０
ソルビトール（７０％） ２．０
ピロリドンカルボン酸ナトリウム液 ３．０
エタノール １５．０
アスコルビン酸 ０．１
メチルパラベン ０．１
色素 ０．０１
香料 ０．０１
精製水 残部
合計 １００
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とするヒアルロン酸合成促進剤。
【請求項２】
前記フラボノイドが、ルテオリン−７−グルコシド、クリソエリオール−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドおよびイソラムネチン−３−Ｏ−ルチノシドからなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸合成促進剤。
【請求項３】
オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項４】
オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項１】
オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とするヒアルロン酸合成促進剤。
【請求項２】
前記フラボノイドが、ルテオリン−７−グルコシド、クリソエリオール−７−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドおよびイソラムネチン−３−Ｏ−ルチノシドからなる群より選択される少なくとも１つであることを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸合成促進剤。
【請求項３】
オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とする抗老化剤。
【請求項４】
オオボウシバナ由来のフラボノイドを有効成分として含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【公開番号】特開２００８−９４７９２（Ｐ２００８−９４７９２Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２８０７４１（Ｐ２００６−２８０７４１）
【出願日】平成１８年１０月１３日（２００６．１０．１３）
【出願人】（３００００６０８７）オッペン化粧品株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１３日（２００６．１０．１３）
【出願人】（３００００６０８７）オッペン化粧品株式会社 (7)
【Ｆターム（参考）】
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