ヘルペスを処置するための医薬組成物
【課題】ヘルペスを、ウイルスの潜在さらに伝染および二次的細菌感染を無くし、処置するための医薬組成物を提供することが本発明の課題である。
【解決手段】第一構成成分として第四級アンモニウム化合物および／または第二構成成分として抗ウイルス剤および／または第三構成成分として植物抽出物を薬学的に許容される基剤に含み、該３構成成分は相互に和合している、ヘルペス単純ウイルス感染の処置のための医薬組成物により解決される。
【解決手段】第一構成成分として第四級アンモニウム化合物および／または第二構成成分として抗ウイルス剤および／または第三構成成分として植物抽出物を薬学的に許容される基剤に含み、該３構成成分は相互に和合している、ヘルペス単純ウイルス感染の処置のための医薬組成物により解決される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘルペスを処置するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚のヘルペス単純感染は表面に痛みのある箇所および疱疹を生じ、これらは後に開口し、病巣となる。ヘルペスは、主にヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）１型により生じるが、性器ヘルペスを常に起こすＨＳＶ２型により生じることもある。逆に、性器ヘルペスの３０％がＨＳＶ１型による。
【０００３】
口部の感染は、口唇ヘルペスと名付けられ、またコールド・ソア（単純疱疹）とも呼ばれる。眼や鼻などの顔の他の箇所も感染を起こす。これは顔面単純ヘルペスと言われる。感染は体の他の部分にも現れることがある。
【０００４】
人口の約７０−９０％はＨＳＶに原発的に感染している。これらの者はウイルス保持者である。ＨＳＶに一度感染すると、その後ウイルスが体内に潜在している。潜在状態において、ウイルスは神経節の神経細胞体に存在している。一定の刺激、例えばインフルエンザ感染や他の呼吸器障害、消化器感染、ストレス、疲労、月経、妊娠、アレルギー、太陽光線および熱などにより、潜在ウイルスが活性化される。ウイルスは神経節からよく知られた神経経路を通り皮膚表面に達し、そこで増殖して、症状を起こす。この再発型ヘルペスは感染者の約４０％で生じる。
【０００５】
それ自体は無害のヘルペス単純感染が角膜炎および脳炎などの重篤な感染をもたらすことがある。従って、ウイルス巣を感染部位において効率よく破壊してしまうことが肝要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在のところ、最もよく用いられている治療法はアシクロビルであり、これは商標名ゾビラックスで市販されている。アシクロビルはグアニン同族体で、ウイルスのＤＮＡポリメラーゼに干渉して、ウイルスのＤＮＡ複製を阻害する。ウイルスの増殖は阻止されるが、ウイルスそのものは殺されない。こうして、ウイルスは、神経節に引っ込み、再び潜在状態になる。
【０００７】
ＨＳＶ−１の伝染は、唾液や皮膚の感染箇所への直接接触により起きる。この伝染もアシクロビルで防止されない。
【０００８】
他の問題は、ブドウ球菌および／または連鎖球菌による二次的細菌感染、たとえば膿痂疹が起きることである。
【０００９】
ヘルペス感染のこれらの問題からして、それが付随しようが、しなかろうが、ウイルスの潜在さらに伝染および二次的細菌感染を無くし、あるいは防止し得る医薬品についての明白な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明により、第一構成成分として第四級アンモニウム化合物および／または第二構成成分として抗ウイルス剤および／または第三構成成分として植物抽出物からなる医薬組成物（３構成成分は薬学的に許容される基剤中で相互に和合している）が上記の問題を解決し得ることが分かった。
【００１１】
ウイルスの潜在、再発、新たな潜在という悪循環を打破するために、ウイルス自体を殺すことが必要である。死んだウイルスは神経節に引っ込むということがないので、原発および再発感染において、潜在することが減少するし又は全くなくなる。従って、本発明の本組成物において最も重要な構成成分は、ウイルスを殺してしまう殺ウイルス物質である。
【００１２】
抗ウイルス剤は、いくつかのカテゴリーに分けることができ（Ｃolgate, Ｓ.Ｍ. ＆ Ｍolyneux,Ｒ.Ｊ.,Ｂio-active natural products,410,ＣＲＣ Ｐress, Ｉnc.(1993)）、グループＩａからグループＶｂまでに分類される。本発明により、ＨＳＶ感染に可能な限り完璧に対処するため、望ましくは、グループＩＶｂからの１以上の物質をグループＶａからの１以上の物質と組合わすべきであることが見いだされた。グループＩＶｂからの物質は殺ウイルス作用を示し、グループＶａからの物質は静ウイルスおよび抗ウイルス作用を発揮する。両タイプの物質を組み合わせることにより、ウイルスの複製が阻害され、そして更に既存在のウイルスが殺される。
【００１３】
ＨＳＶ感染病巣の細菌などの他の微生物による二次感染を防止するのを確実にするために、第一構成成分および／または第二構成成分が殺菌性を有していることが推奨される。
【００１４】
疼痛および炎症の関連症状を緩和するために、植物抽出物も使用するのが望ましい。この抽出物は、望ましくは、炎症抑制作用に加えてなめらかにする効果も有している。
【００１５】
殺菌活性も有し、そして本発明の医薬組成物に用いられるグループＩＶｂの物質は、当業者に知られている方法で選択されうる。Ｃolgate & Ｍolyneux(supra.p.413)記載の終点滴定法（ＥＰＴＴ）を用いて、物質の殺ウイルス活性が調べられる。活性はウイルス力価の低下として表され、これは、試験する物質の希釈液と共にヘルペスウイルス懸濁液を３７℃で５分間インキュベートしてインビトロで測定する。優れた物質は１０３の最小力価低下を与える。
【００１６】
ヘルペス単純１型およびヘルペス単純２型（臨床分離株）に対する殺ウイルス作用について既知の殺菌剤を一般的なスクリーニングをしたところ、いくつかの物質が非常に高い活性を２５℃においてすら発揮することが、本発明により明らかになった。このことは、皮膚の温度が一般に３７℃以下、また３４℃以下ですらあることから、大変有利な点である。第四級アンモニウム化合物、セトリミドおよび塩化ベンザルコニウムがそれぞれ濃度５０−２００μg/mlおよび１００−２００μg/mlで５分間２５℃の試験期間、少なくとも１０３の力価低下を示すことが本発明により分かった。他の既知の殺菌剤、例えばアルコール類、フェノール類、過酸化物類、ビグアナイド類、アルデヒド類、塩素化合物などは、最小５倍以下の活性を示した。水銀化合物および一定の重金属化合物のみがより優れた活性を有する。しかし、これらの化合物は、毒性が高いので意図する使用には適していない。
【００１７】
すべての第四級アンモニウム化合物は、原則的に下記の一般式を有するものが使用される。
【００１８】
【化１】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同じまたは異なっていてよく、脂肪族または芳香族基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとも一つは８以上の脂肪族鎖であり、Ｘは低分子量の無機アニオンまたは高分子量の有機アニオンである。適当な第四級アンモニウム化合物についての概説は、例えばＡ.Ｄauphin & Ｊ.Ｃ.Ｄarbord in “Ｈygieane hospitaliere pratique”,Ｅditions medicales internationales,Ｐaris(1988)に記載されている。セトリミドが強く推奨される。
【００１９】
第四級アンモニウム化合物は、水およびアルコールによく溶けるが、必ずしも他の物質と組み合わせし得ない。従って、第二構成成分の重要な要件は第一構成成分と和合することである。アニオン性物質、石鹸類、硝酸塩、重金属、酸化物質、ゴム、タンパク質などは、第四級アンモニウム化合物と和合性でない。従って、これらの物質は、本発明の組成物に用いるのに適していない。第二構成成分は望ましくは、催奇性がなく、毒性なしに大量に与えうることである。更に望ましくは、第二構成成分は皮膚への浸透性がよいことである。
【００２０】
第二構成成分として、既知の抗ウイルス剤、例えばアシクロビル、ＢＶＤＵ、３ＦＴ、イドクスウリジンなどが、第一構成成分と和合する限り、使用できる。また、抗ウイルス活性を有する非毒性の天然物質も使用できる。
【００２１】
第二構成成分の適合性は、それ自体既知のＥＰＴＴ法（Ｃolgate & Ｍolyneux,supra,p.414）に準じて調べることができる。ここではＶＥＲＯ細胞を用いる。本発明により、ガレート類がインビトロで優れた抗ウイルス活性を有することが分かった。プロピル・ガレートは濃度１００μg/mlで力価低下因数が１０４である。濃度２５μg/mlでＶＥＲＯ細胞中の低下因数は１０３である。エチル・ガレートは、濃度１００μg/mlで１０４、および２５μg/mlで１０２である。従って、エチル・ガレートはやや活性が弱い。
【００２２】
第一構成成分と第二構成成分との和合性は、ＨＳＶ−１に対する両構成成分の混合物を試験することにより決定される。プロピル・ガレートとセトリミド（２：１）の混合物は、濃度プロピル・ガレート２５０μｇ対セトリミド１２５μｇで５分間２５℃の試験期間後にも１０３の殺ウイルス作用を有することが分かった。エチル・ガレートおよびセトリミドについても同様に行われる。セトリミドとＢＶＤＵまたはアシクロビルとの混合物は、５μg/mlＢＶＤＵまたはアシクロビルおよび０.１μg/mlセトリミドにまで希釈してもインビトロで抗ウイルス活性を発揮し続ける。
【００２３】
医薬組成物は望ましくは植物抽出物を含み、それにより疼痛および炎症反応を寛解する。抽出物が第一および第二の構成成分の活性に干渉しないことも重要である。
【００２４】
この目的のため、種々の植物抽出物をセトリミドとプロピル・ガレートまたは塩化ベンザルコニウムとプロピル・ガレートと共に、殺ウイルス活性が保持されるか、各構成成分が和合し得るかどうかを知るべく、検査した。カミツレおよびキンセンカの抽出物がインビトロで利用し得ることが分かった。アロエ、エキナセア根、三色スミレ、センナ、メリサおよび／またはサンザシの抽出物も、殺ウイルス活性が保持されたままで、炎症反応または疼痛を寛解し得る。
【００２５】
しかし、ある種の植物抽出物は、いくつかの第四級アンモニウム化合物の殺ウイルス活性を顕著に減少せしめる。例えば、１０％ハマメリスは塩化ベンザルコニウム（０.５％）の殺ウイルスおよび抗菌活性を完全になくしてしまうことが判明した。ヘルペスおよび細菌に対する０.１％塩化ベンザルコニウムの活性は、サルビアおよびゴボウ類（great burdock）の抽出物により４−８倍減少する。しかし、セトリミドと第二構成成分およびカミツレ、キンセンカ、サルビア、ゴボウ類およびセンナの植物抽出物の組み合わせは、ヘルペス単純ウイルスおよび細菌に対する活性を保持することがインビトロで分かった。
【００２６】
使用しようとする植物抽出物の和合性は前以て測定されるべきである。かかる測定は、平均的当業者のできる範囲内にある。
【００２７】
適当な植物抽出物は、例えば Aesculus hippocastanum L; Aloe vera L; Anagallis arvensis L; Anthemis nobilis L; Arctium lappa L; Aristolochia clematitis L; Arnica montana L; Betonica officinalis L; Calendula officinalis L; Capsicum annuum (tetraqonum); Carica papaya L; Carlina acaulis L; Caryophyllus aromaticus L; Cynoglossum officinale L; Echinacea angustifolia; Echinacea purpurea L; Eupatorium cannabinum L; Geranium robertianum; Geum urbanum L; Glechoma hederacea L; Hamamelis virginiana L; Hypericum perforatum L; Inula helenium L; Juglans regia L; Juniperus oxycedrus L; Lavandula officinalis; Lawsonia alba L; Lysimachia nummeralia L; Lythrum salicaria L; Malva sylvestris; Marrubium vulgare L; Matricaria chamomilla L; Mentha piperita L; Myroxylon balsamum L; Myrtus communis L; Olea europaea L; Prunus amygdalus; Pyrus cydonia L; Quercus robur L; Quillaja saponaria; Rubus idaeus L; Salvia officinalis L; Saponaria officinalis L; Smilax officinalis; Solanum dulcamara L; Solidago virga aurea L; Styrax tonkinensis; Styrax benzoides; Styrax benzoin; Symphytum officinale L; Trigonella foenum-graecum L; Tropaeolum majus L; Urtica urens L; Urtica dioica L; Viola tricolor L.からつくられる。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、殺ウイルスおよび抗菌活性を有する１以上の第四級アンモニウム化合物および／または第四級アンモニウム化合物に和合し、ウイルス複製を阻止する抗ウイルス剤および／または上記両物質に同様に和合し、ヘルペス感染の関連症状、例えば、疼痛、かゆみ、腫れ、打診痛などを軽減する植物抽出物の組み合わせからなり、ヘルペス感染の全般的処置法を提供する。組成物の殺ウイルス活性によりウイルスは殺され、潜伏状態がほとんど、またはまったく無くなる。抗ウイルス活性は、ウイルスの複製およびそれによるウイルスの増殖を阻害する。抗菌活性は二次的細菌感染を防止する。最後に、炎症阻止活性は炎症を防止し、疼痛およびかゆみを和らげる。
【００２９】
本発明の組成物の構成成分は、薬学的に許容される基剤に含有されるのが望ましい。３構成成分の活性に影響を与えない基剤が用いられる。適当な基剤であるかどうかを調べるために、第一構成成分の殺ウイルス活性および殺菌活性が測定される。殺菌活性は、例えば当業者に知られているような方法で、５分間２５℃でグラム陰性菌、例えばＰseudomonas aeruginosaまたはＥscherichia coliについて調べられる。
【００３０】
適当な基剤の例としては、種々の分子量のポリエチレングリコールまたはその混合物、脂肪酸エステルまたはその混合物があり、乳化剤および／または皮膚手入剤と混合し、またはしない。また、適当な基剤にポリエチレングリコールおよび／または脂肪酸エステルの混合物もあり、乳化剤および／または皮膚手入剤と混合し、またはしない。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、粉末、懸濁液、溶液、噴霧剤、乳濁液、軟膏またはクリームの形態をとることができ、局所適用され得る。該組成物は、遊離酸または塩の形態の活性構成成分を活性のない薬学的に許容される賦形剤（水性または非水性溶媒、安定剤、乳化剤、浄化剤、添加剤など）および更に必要に応じて色素、芳香物質および／または香味剤を組み合わせる（すなわち、混合する、溶解する、など）ことにより、調製される。活性構成成分の濃度は、処置の性質および使用方法に応じて、０．００１％−１００％の間にある。軟膏が推奨される。
【００３２】
本発明の組成物は、例えば、非水性基剤を１０−９０％、アルコールを１−２０％、１以上の第四級アンモニウム化合物を０．１−５％および／または１以上の抗ウイルス剤を０．０１−２％および／または１以上の植物抽出物を０．５−１０％含む。用いられる植物抽出物の量は、その活性および抽出物中の活性構成成分の濃度に密接に関連している。
【００３３】
望ましい本発明の組成物は、ＰＥＧ４００を２０−６０％、望ましくは５２％、ＰＥＧ４０００を１０−４０％、望ましくは２６％、グリセロールを２−２０％、望ましくは９％、セトリミドを０．５−１．８％、望ましくは１％、セチルアルコールを０．２−３％，望ましくは１％、カミツレ抽出物を５−１５％、望ましくは８％およびプロピル・ガレートを０．２−１％、望ましくは０．２５％含有する。
【００３４】
本発明は、添付の実施例により更に明らかになるであろう。しかし実施例は、いかなる場合でも発明を限定する意図を有しない。
【実施例】
【００３５】
実施例１
Ｉ．以下の成分を用いた抗ヘルペス製剤の調製
【表１】
【００３６】
Ａ成分を７５℃で溶融し、次いでＢ成分を溶解して、軟膏を調製した。混合後に得たＡ成分の混合物を緩やかに冷やしながら、均質に混合し、Ａの混合物が固まる前にＢの混合物を加えた。次いで、全混合物が完全に冷えるまで、混合を続けた。混合物を９３Ｊ１２と名づけた。
【００３７】
ポリエチレングリコール４００および４０００は、商標名マクロゴール４００−Ｐurnaおよびマクロゴール４０００として市販されているものを購入した。グリセロールは１年ごとの品質で、Merck社から入手し、セトリミドＡ１１９３６はPharmachemicNVから、塩化コリンはSigma社から供給された。セチルアルコールは、Ｌanette１６なる商標名でHenkel KGaAから市販されている。液体カミツレ抽出物はConforma社およびプロピル・ガレートＰ３１３０はＳigma社から入手した。
【００３８】
ＩＩ．以下の成分を用いたＭ−ＶＤＢ培地の組成物およびその調製
【表２】
【００３９】
すべてを蒸留水９６０mlに溶解し、ＮａＯＨ（１０Ｎ）でｐＨを７．４に調整し、０.２μ膜フィルターで無菌濾過して細胞培養物のための保持培地を調製した。２％新生子牛血清（ＶＥＲＯ細胞のために）または胎児牛血清（他の細胞のために）を加えた。
【００４０】
実施例２ 抗ウイルス活性
１．構成成分の抗ウイルス活性
この実施例ではAmerican Type Culture Collection（受付番号ＣＣＬ２６）からのＶＥＲＯ細胞を用いた。ＶＥＲＯ細胞は、Ｅａｒｌｅ’ｓ塩および５％子牛血清と共に培地１９９（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ウイルス源としてヘルペス単純ウイルス１（ＨＳＶ−１、臨床分離株）を用い、１００μg/mlペニシリン、１００μg/mlストレプトマイシンおよび２％子牛血清と共に培養した。
【００４１】
マイクロタイター・プレート（９６ウエル、平板）中に培養したＶＥＲＯ細胞の単層上にＭ−ＶＤＢ中のＨＳＶ−１の１０−１−１０−６の希釈液１００μｌを入れた。ウイルスは６０−９０分間で細胞に吸収された。Ｍ−ＶＤＢ中の試験物質の希釈液を感染細胞に加えた。物質の細胞毒性を調べるために、同様に物質の希釈液を非感染細胞に加えた。５日間、湿室で３７℃でインキュベートした後、細胞病理学的効果を顕微鏡で調べた。
【００４２】
抗ウイルス活性は、サンプルの最も高い非毒性濃度の低下因数（ＲＦ）として表す。低下因数（ＲＦ）は、物質希釈液における生きているウイルス濃度に比した対照中のウイルス濃度の比である。≧１０２のＲＦは有意とみる。プロピル・ガレートでの結果を表１に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
上表からＨＳＶ−１に対する抗ウイルス活性は濃度２５μg/mlまで有意であることが分かる。
【００４５】
殺ウイルス活性は、１０６ｃｆｕＨＳＶ−１含有のウイルス懸濁液を同量の種々の濃度の試験物質溶液と混合することにより測定した。この混合物を、定めた時間、管理した温度でインキュベートした。各混合物の１０−１−１０−６の段階希釈液をＶＥＲＯ細胞の単層上に入れた。３７℃で５日間インキュベートした後、ＣＰＥを測定した。結果はＲＦで表す。再度、≧１０２の力価低下を有意とする。
【００４６】
１５分間３４℃でのＨＳＶについての殺ウイルス活性の結果を表２に示す。
【表４】
【００４７】
上表からプロピル・ガレートが殺ウイルス活性を発揮しないことおよびセトリミドが濃度１００μg/mlまでで殺ウイルス活性を有することが分かる。プロピル・ガレートおよびセトリミドの混合物はプロピル・ガレートの過剰（２／１）でもその殺ウイルス活性を保持する。
【００４８】
２．試験混合物の抗ウイルス性
同様に、実施例１で調製した試験混合物の抗ウイルス活性を測定した。１５分間２５℃における軟膏の殺ウイルス活性の結果を表３に示す。
表３から、軟膏は２５℃で希釈１／１００までＨＳＶについての殺ウイルス活性を発揮することが分かる。セトリミドも２５℃ですら完全な活性を保持する。
【００４９】
【表５】
【００５０】
実施例３
抗菌活性
個々の構成成分および最終産物の抗菌活性を試験微生物Ｃandida albicans（ＡＴＴＣ １０２３１）、Ｅscherichia coli（ＡＴＴＣ ８７３９），Ｐseudomonas aeruginosa（ＡＴＴＣ １５４４２）およびＳtaphylococcus aureus（ＡＴＴＣ ６５３８）で測定した。用いた培地はトリプチカーゼ醤油肉汁（ＴＳＢ）、トリプチカーゼ醤油寒天（ＴＳＡ）および無菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）である。
【００５１】
Ｉ．構成成分および混合物の抗菌活性
最小阻止濃度（ＭＩＣ）を測定するために、一夜培養物を３７℃でＴＳＢ中各微生物について調製した。使用する試験物質のＴＳＢにおいて１／２希釈系を同様につくった。各希釈１００μlをミクロタイター・プレートに入れた。一夜培養物をＴＳＢ中１／１０００に希釈した。同様に細菌懸濁液１００μlを物質に加えた。無菌性の対照として、細菌を加えない物質希釈液および物質希釈液を加えない細菌希釈液を用いた。ミクロタイター・プレートを湿室内で２４時間３７℃でインキュベートした。細菌生育を懸濁液の混濁性をもとに調べた。ＭＩＣ価は、微生物の正常な生育を阻止し得る、すなわちいかなる懸濁をももたらさない最小の物質濃度である。
【００５２】
結果を表４に示す。
【表６】
【００５３】
上表により、カミツレ抽出物が、ある種の微生物について、そして高濃度でのみ非常に限定された抗菌活性を有することが分かる。他方、プロピル・ガレートおよびセトリミドは顕著な抗菌活性を有す。混合物において、セトリミドはその抗菌活性を保持することが分かる。
【００５４】
II．試験軟膏の抗菌活性
実施例１に記載したように、別々の３軟膏を調製した。そのロット番号は９４Ａ１２、９４Ｄ２１および９４Ｅ０５である。プラセボとしてセトリミドを除外した同じ組成物を調製した。このプラセボは９４Ｄ２７と呼ぶ。対照として無菌蒸留水中の１％セトリミドを用いた。すべての試験サンプルは室温で保存した。
【００５５】
IIａ．最小阻止濃度（ＭＩＣ）の測定
最小阻止濃度は、細菌がもはや生育しない試験物質の濃度である。用いた最も高い濃度（１／１０希釈）は、無菌蒸留水９ml中に軟膏１ｇを懸濁することにより調製した。希釈液を細菌に加え、２４時間培養した。用いた微生物は、容量１０５Ｃandida albicans（Ｃa）、１０６Ｅscherichia coli（Ｅc）、１０５Ｐseudomonas aeruginosa（Ｐa）および１０６Ｓtaphylococcus aureus（Ｓa）であった。
表５は、細菌の生育が阻止される希釈度を示す。
【００５６】
【表７】
【００５７】
表によると、すべての試験軟膏が抗菌活性を保持している。これらの軟膏のＭＩＣは、１％セトリミド水のＭＩＣ価に匹敵する。試験濃度においてプラセボは抗菌活性がない。
【００５８】
IIｂ．抗菌および抗真菌活性の測定
抗菌活性をＣandida albicans（１０５）、Ｅscherichia coli（１０６）、Ｐseudomonas aeruginosa（１０５）およびＳtaphylococcus aureus（１０６）で調べる。抗菌活性は、ヨーロッパ薬局方の記載に従って測定する。試験する物質を微生物と混じ、ある時間インキュベートし、この混合物を希釈し、どの希釈度でなお微生物の生育が起きるかを測定する。
【００５９】
希釈は、最終濃度１０６−１０７ｃｆｕまで各微生物について調製した。軟膏は、希釈なし、無菌蒸留水での１／２および１／１０希釈として調べた。軟膏またはその希釈液１ｇに対し、希釈接種物１００μｌを加えて、混合した。２５℃１５分間のインキュベーション後、１／１０希釈系をこの混合物１００mgからＴＳＢ（トリプチカーゼ醤油肉汁）中で調製した。各希釈液をＴＳＡ（トリプチカーゼ醤油寒天）上に接種した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。対照として、微生物の非処置培養物および蒸留水中の１％セトリミドを用いた。インキュベーション後、すべてのプレートを生長について検査した。低下因数（Ｒｆ）中に表される試験は３回実施された。その結果を表６に示す。
【００６０】
【表８】
【００６１】
上表から、すべての試験軟膏が希釈においてその抗菌活性を保持することが分かる。すべての細菌が殺された。プラセボは非常に限定された抗菌活性を有する。
【００６２】
IIｃ．抗真菌活性
抗真菌活性を測定するために、試験微生物Ｅpidermophyton floccosum（ＲＶ ６９６３５）およびＴrichophyton rubrum（ＲＶ５８１２４）を用いた。抗真菌活性は抗菌活性と同じ方法で測定した。
【００６３】
この目的のために、希釈液は、最終濃度１０４−１０５ｃｆｕまで各微生物につき調製した。軟膏は、希釈なし、無菌蒸留水での１／２および１／１０希釈として調べた。軟膏またはその希釈液１ｇに対し、希釈接種物１００μｌを加えて、混合した。２５℃１５分間のインキュベーション後、１／１０希釈系をこの混合物１００mgからＳＡＢ（サブロー肉汁（Ｇｉｂｃｏ））中で調製した。各希釈液をＳＡＢＡ（サブロー寒天（Ｇｉｂｃｏ））上に接種した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。対照として、微生物の非処置培養物および蒸留水中の１％セトリミドを用いた。インキュベーション後、すべてのプレートを生長について検査した。低下因数（Ｒｆ）中に表される試験は３回実施された。その結果を表７に示す。
【００６４】
【表９】
【００６５】
上表から、すべての試験軟膏が希釈においてその抗真菌活性を保持し、これは蒸留水中１％セトリミドに匹敵することが分かる。プラセボは非常に限定された抗真菌活性を有する。
【００６６】
IIｄ．殺ウイルス活性
殺ウイルス活性をＤ.Ｖanden Ｂerghe et al.in “Ｍethods in Ｐlant Ｂiochemistry”,Ｖol.6“Ａssays for Ｂioactivity”,p.49-67,Ａcademic Ｐress Ｌimited 1991記載のミクロ方法に従って測定した。物質希釈液３００μlに非希釈ウイルス懸濁液３００μlを加えた。混合物を３４℃で１５秒間インキュベートした。希釈チューブにウイルス用の冷却培養培地０.９mlを加え、氷浴に入れた。インキュベート混合物１００μlを希釈チューブに入れた。それから１／１０希釈系を調製した。これらの希釈液２００μlをＶＥＲＯ細胞上に入れた。対照は非処置ウイルス（ウイルス対照）および非処置細胞（細胞対照）である。プレートを３７℃で湿培養器中５−７日間インキュベートした。細胞毒性および細胞病理学的効果について顕微鏡で細胞を調べた。結果は低下因数（Ｒｆ）で表す。低下因数は、最初のウイルス濃度に対する残留ウイルス濃度の比である。この試験は３回実施された。Ｒｆで表された結果を表８に示す。
【００６７】
【表１０】
【００６８】
上表から試験軟膏が１／５０希釈まで殺ウイルス活性を有することが分かる。殺ウイルス活性は１％セトリミドの活性に匹敵する。プラセボは殺ウイルス活性がない。
【００６９】
実施例４
インビボ活性試験
試験群は、口唇にコールド・ソアがある１５人の患者からなる。彼等は以下の組成を有する軟膏で処置された。
【００７０】
【表１１】
試験結果を次の表９に示す。
【００７１】
【表１２】
２人の男性による第２試験において軟膏の予防的作用を調べた。その終了時まで軟膏を、１日１回６カ月間、通常病変が生じたとされる部位に適用した。この処置の結果、かぜの場合でも症状の繰り返しは起きなかった。この処置の前は、２人の患者の１人は少なくとも月に１回コールド・ソアが起きており、両者ともかぜに症状が伴っていた。
【００７２】
本発明は、ヘルペス感染、特にＨＳＶ−１または−２による顔面または口唇ヘルペスの処置のための新しい医薬組成物を提供する。他の療法との大きい相違は、治療的または予防的にこの薬剤を使用する患者では、同じ部位に症状の繰り返しが起きないことである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘルペスを処置するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚のヘルペス単純感染は表面に痛みのある箇所および疱疹を生じ、これらは後に開口し、病巣となる。ヘルペスは、主にヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）１型により生じるが、性器ヘルペスを常に起こすＨＳＶ２型により生じることもある。逆に、性器ヘルペスの３０％がＨＳＶ１型による。
【０００３】
口部の感染は、口唇ヘルペスと名付けられ、またコールド・ソア（単純疱疹）とも呼ばれる。眼や鼻などの顔の他の箇所も感染を起こす。これは顔面単純ヘルペスと言われる。感染は体の他の部分にも現れることがある。
【０００４】
人口の約７０−９０％はＨＳＶに原発的に感染している。これらの者はウイルス保持者である。ＨＳＶに一度感染すると、その後ウイルスが体内に潜在している。潜在状態において、ウイルスは神経節の神経細胞体に存在している。一定の刺激、例えばインフルエンザ感染や他の呼吸器障害、消化器感染、ストレス、疲労、月経、妊娠、アレルギー、太陽光線および熱などにより、潜在ウイルスが活性化される。ウイルスは神経節からよく知られた神経経路を通り皮膚表面に達し、そこで増殖して、症状を起こす。この再発型ヘルペスは感染者の約４０％で生じる。
【０００５】
それ自体は無害のヘルペス単純感染が角膜炎および脳炎などの重篤な感染をもたらすことがある。従って、ウイルス巣を感染部位において効率よく破壊してしまうことが肝要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在のところ、最もよく用いられている治療法はアシクロビルであり、これは商標名ゾビラックスで市販されている。アシクロビルはグアニン同族体で、ウイルスのＤＮＡポリメラーゼに干渉して、ウイルスのＤＮＡ複製を阻害する。ウイルスの増殖は阻止されるが、ウイルスそのものは殺されない。こうして、ウイルスは、神経節に引っ込み、再び潜在状態になる。
【０００７】
ＨＳＶ−１の伝染は、唾液や皮膚の感染箇所への直接接触により起きる。この伝染もアシクロビルで防止されない。
【０００８】
他の問題は、ブドウ球菌および／または連鎖球菌による二次的細菌感染、たとえば膿痂疹が起きることである。
【０００９】
ヘルペス感染のこれらの問題からして、それが付随しようが、しなかろうが、ウイルスの潜在さらに伝染および二次的細菌感染を無くし、あるいは防止し得る医薬品についての明白な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明により、第一構成成分として第四級アンモニウム化合物および／または第二構成成分として抗ウイルス剤および／または第三構成成分として植物抽出物からなる医薬組成物（３構成成分は薬学的に許容される基剤中で相互に和合している）が上記の問題を解決し得ることが分かった。
【００１１】
ウイルスの潜在、再発、新たな潜在という悪循環を打破するために、ウイルス自体を殺すことが必要である。死んだウイルスは神経節に引っ込むということがないので、原発および再発感染において、潜在することが減少するし又は全くなくなる。従って、本発明の本組成物において最も重要な構成成分は、ウイルスを殺してしまう殺ウイルス物質である。
【００１２】
抗ウイルス剤は、いくつかのカテゴリーに分けることができ（Ｃolgate, Ｓ.Ｍ. ＆ Ｍolyneux,Ｒ.Ｊ.,Ｂio-active natural products,410,ＣＲＣ Ｐress, Ｉnc.(1993)）、グループＩａからグループＶｂまでに分類される。本発明により、ＨＳＶ感染に可能な限り完璧に対処するため、望ましくは、グループＩＶｂからの１以上の物質をグループＶａからの１以上の物質と組合わすべきであることが見いだされた。グループＩＶｂからの物質は殺ウイルス作用を示し、グループＶａからの物質は静ウイルスおよび抗ウイルス作用を発揮する。両タイプの物質を組み合わせることにより、ウイルスの複製が阻害され、そして更に既存在のウイルスが殺される。
【００１３】
ＨＳＶ感染病巣の細菌などの他の微生物による二次感染を防止するのを確実にするために、第一構成成分および／または第二構成成分が殺菌性を有していることが推奨される。
【００１４】
疼痛および炎症の関連症状を緩和するために、植物抽出物も使用するのが望ましい。この抽出物は、望ましくは、炎症抑制作用に加えてなめらかにする効果も有している。
【００１５】
殺菌活性も有し、そして本発明の医薬組成物に用いられるグループＩＶｂの物質は、当業者に知られている方法で選択されうる。Ｃolgate & Ｍolyneux(supra.p.413)記載の終点滴定法（ＥＰＴＴ）を用いて、物質の殺ウイルス活性が調べられる。活性はウイルス力価の低下として表され、これは、試験する物質の希釈液と共にヘルペスウイルス懸濁液を３７℃で５分間インキュベートしてインビトロで測定する。優れた物質は１０３の最小力価低下を与える。
【００１６】
ヘルペス単純１型およびヘルペス単純２型（臨床分離株）に対する殺ウイルス作用について既知の殺菌剤を一般的なスクリーニングをしたところ、いくつかの物質が非常に高い活性を２５℃においてすら発揮することが、本発明により明らかになった。このことは、皮膚の温度が一般に３７℃以下、また３４℃以下ですらあることから、大変有利な点である。第四級アンモニウム化合物、セトリミドおよび塩化ベンザルコニウムがそれぞれ濃度５０−２００μg/mlおよび１００−２００μg/mlで５分間２５℃の試験期間、少なくとも１０３の力価低下を示すことが本発明により分かった。他の既知の殺菌剤、例えばアルコール類、フェノール類、過酸化物類、ビグアナイド類、アルデヒド類、塩素化合物などは、最小５倍以下の活性を示した。水銀化合物および一定の重金属化合物のみがより優れた活性を有する。しかし、これらの化合物は、毒性が高いので意図する使用には適していない。
【００１７】
すべての第四級アンモニウム化合物は、原則的に下記の一般式を有するものが使用される。
【００１８】
【化１】
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同じまたは異なっていてよく、脂肪族または芳香族基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３またはＲ４の少なくとも一つは８以上の脂肪族鎖であり、Ｘは低分子量の無機アニオンまたは高分子量の有機アニオンである。適当な第四級アンモニウム化合物についての概説は、例えばＡ.Ｄauphin & Ｊ.Ｃ.Ｄarbord in “Ｈygieane hospitaliere pratique”,Ｅditions medicales internationales,Ｐaris(1988)に記載されている。セトリミドが強く推奨される。
【００１９】
第四級アンモニウム化合物は、水およびアルコールによく溶けるが、必ずしも他の物質と組み合わせし得ない。従って、第二構成成分の重要な要件は第一構成成分と和合することである。アニオン性物質、石鹸類、硝酸塩、重金属、酸化物質、ゴム、タンパク質などは、第四級アンモニウム化合物と和合性でない。従って、これらの物質は、本発明の組成物に用いるのに適していない。第二構成成分は望ましくは、催奇性がなく、毒性なしに大量に与えうることである。更に望ましくは、第二構成成分は皮膚への浸透性がよいことである。
【００２０】
第二構成成分として、既知の抗ウイルス剤、例えばアシクロビル、ＢＶＤＵ、３ＦＴ、イドクスウリジンなどが、第一構成成分と和合する限り、使用できる。また、抗ウイルス活性を有する非毒性の天然物質も使用できる。
【００２１】
第二構成成分の適合性は、それ自体既知のＥＰＴＴ法（Ｃolgate & Ｍolyneux,supra,p.414）に準じて調べることができる。ここではＶＥＲＯ細胞を用いる。本発明により、ガレート類がインビトロで優れた抗ウイルス活性を有することが分かった。プロピル・ガレートは濃度１００μg/mlで力価低下因数が１０４である。濃度２５μg/mlでＶＥＲＯ細胞中の低下因数は１０３である。エチル・ガレートは、濃度１００μg/mlで１０４、および２５μg/mlで１０２である。従って、エチル・ガレートはやや活性が弱い。
【００２２】
第一構成成分と第二構成成分との和合性は、ＨＳＶ−１に対する両構成成分の混合物を試験することにより決定される。プロピル・ガレートとセトリミド（２：１）の混合物は、濃度プロピル・ガレート２５０μｇ対セトリミド１２５μｇで５分間２５℃の試験期間後にも１０３の殺ウイルス作用を有することが分かった。エチル・ガレートおよびセトリミドについても同様に行われる。セトリミドとＢＶＤＵまたはアシクロビルとの混合物は、５μg/mlＢＶＤＵまたはアシクロビルおよび０.１μg/mlセトリミドにまで希釈してもインビトロで抗ウイルス活性を発揮し続ける。
【００２３】
医薬組成物は望ましくは植物抽出物を含み、それにより疼痛および炎症反応を寛解する。抽出物が第一および第二の構成成分の活性に干渉しないことも重要である。
【００２４】
この目的のため、種々の植物抽出物をセトリミドとプロピル・ガレートまたは塩化ベンザルコニウムとプロピル・ガレートと共に、殺ウイルス活性が保持されるか、各構成成分が和合し得るかどうかを知るべく、検査した。カミツレおよびキンセンカの抽出物がインビトロで利用し得ることが分かった。アロエ、エキナセア根、三色スミレ、センナ、メリサおよび／またはサンザシの抽出物も、殺ウイルス活性が保持されたままで、炎症反応または疼痛を寛解し得る。
【００２５】
しかし、ある種の植物抽出物は、いくつかの第四級アンモニウム化合物の殺ウイルス活性を顕著に減少せしめる。例えば、１０％ハマメリスは塩化ベンザルコニウム（０.５％）の殺ウイルスおよび抗菌活性を完全になくしてしまうことが判明した。ヘルペスおよび細菌に対する０.１％塩化ベンザルコニウムの活性は、サルビアおよびゴボウ類（great burdock）の抽出物により４−８倍減少する。しかし、セトリミドと第二構成成分およびカミツレ、キンセンカ、サルビア、ゴボウ類およびセンナの植物抽出物の組み合わせは、ヘルペス単純ウイルスおよび細菌に対する活性を保持することがインビトロで分かった。
【００２６】
使用しようとする植物抽出物の和合性は前以て測定されるべきである。かかる測定は、平均的当業者のできる範囲内にある。
【００２７】
適当な植物抽出物は、例えば Aesculus hippocastanum L; Aloe vera L; Anagallis arvensis L; Anthemis nobilis L; Arctium lappa L; Aristolochia clematitis L; Arnica montana L; Betonica officinalis L; Calendula officinalis L; Capsicum annuum (tetraqonum); Carica papaya L; Carlina acaulis L; Caryophyllus aromaticus L; Cynoglossum officinale L; Echinacea angustifolia; Echinacea purpurea L; Eupatorium cannabinum L; Geranium robertianum; Geum urbanum L; Glechoma hederacea L; Hamamelis virginiana L; Hypericum perforatum L; Inula helenium L; Juglans regia L; Juniperus oxycedrus L; Lavandula officinalis; Lawsonia alba L; Lysimachia nummeralia L; Lythrum salicaria L; Malva sylvestris; Marrubium vulgare L; Matricaria chamomilla L; Mentha piperita L; Myroxylon balsamum L; Myrtus communis L; Olea europaea L; Prunus amygdalus; Pyrus cydonia L; Quercus robur L; Quillaja saponaria; Rubus idaeus L; Salvia officinalis L; Saponaria officinalis L; Smilax officinalis; Solanum dulcamara L; Solidago virga aurea L; Styrax tonkinensis; Styrax benzoides; Styrax benzoin; Symphytum officinale L; Trigonella foenum-graecum L; Tropaeolum majus L; Urtica urens L; Urtica dioica L; Viola tricolor L.からつくられる。
【００２８】
本発明の医薬組成物は、殺ウイルスおよび抗菌活性を有する１以上の第四級アンモニウム化合物および／または第四級アンモニウム化合物に和合し、ウイルス複製を阻止する抗ウイルス剤および／または上記両物質に同様に和合し、ヘルペス感染の関連症状、例えば、疼痛、かゆみ、腫れ、打診痛などを軽減する植物抽出物の組み合わせからなり、ヘルペス感染の全般的処置法を提供する。組成物の殺ウイルス活性によりウイルスは殺され、潜伏状態がほとんど、またはまったく無くなる。抗ウイルス活性は、ウイルスの複製およびそれによるウイルスの増殖を阻害する。抗菌活性は二次的細菌感染を防止する。最後に、炎症阻止活性は炎症を防止し、疼痛およびかゆみを和らげる。
【００２９】
本発明の組成物の構成成分は、薬学的に許容される基剤に含有されるのが望ましい。３構成成分の活性に影響を与えない基剤が用いられる。適当な基剤であるかどうかを調べるために、第一構成成分の殺ウイルス活性および殺菌活性が測定される。殺菌活性は、例えば当業者に知られているような方法で、５分間２５℃でグラム陰性菌、例えばＰseudomonas aeruginosaまたはＥscherichia coliについて調べられる。
【００３０】
適当な基剤の例としては、種々の分子量のポリエチレングリコールまたはその混合物、脂肪酸エステルまたはその混合物があり、乳化剤および／または皮膚手入剤と混合し、またはしない。また、適当な基剤にポリエチレングリコールおよび／または脂肪酸エステルの混合物もあり、乳化剤および／または皮膚手入剤と混合し、またはしない。
【００３１】
本発明の医薬組成物は、粉末、懸濁液、溶液、噴霧剤、乳濁液、軟膏またはクリームの形態をとることができ、局所適用され得る。該組成物は、遊離酸または塩の形態の活性構成成分を活性のない薬学的に許容される賦形剤（水性または非水性溶媒、安定剤、乳化剤、浄化剤、添加剤など）および更に必要に応じて色素、芳香物質および／または香味剤を組み合わせる（すなわち、混合する、溶解する、など）ことにより、調製される。活性構成成分の濃度は、処置の性質および使用方法に応じて、０．００１％−１００％の間にある。軟膏が推奨される。
【００３２】
本発明の組成物は、例えば、非水性基剤を１０−９０％、アルコールを１−２０％、１以上の第四級アンモニウム化合物を０．１−５％および／または１以上の抗ウイルス剤を０．０１−２％および／または１以上の植物抽出物を０．５−１０％含む。用いられる植物抽出物の量は、その活性および抽出物中の活性構成成分の濃度に密接に関連している。
【００３３】
望ましい本発明の組成物は、ＰＥＧ４００を２０−６０％、望ましくは５２％、ＰＥＧ４０００を１０−４０％、望ましくは２６％、グリセロールを２−２０％、望ましくは９％、セトリミドを０．５−１．８％、望ましくは１％、セチルアルコールを０．２−３％，望ましくは１％、カミツレ抽出物を５−１５％、望ましくは８％およびプロピル・ガレートを０．２−１％、望ましくは０．２５％含有する。
【００３４】
本発明は、添付の実施例により更に明らかになるであろう。しかし実施例は、いかなる場合でも発明を限定する意図を有しない。
【実施例】
【００３５】
実施例１
Ｉ．以下の成分を用いた抗ヘルペス製剤の調製
【表１】
【００３６】
Ａ成分を７５℃で溶融し、次いでＢ成分を溶解して、軟膏を調製した。混合後に得たＡ成分の混合物を緩やかに冷やしながら、均質に混合し、Ａの混合物が固まる前にＢの混合物を加えた。次いで、全混合物が完全に冷えるまで、混合を続けた。混合物を９３Ｊ１２と名づけた。
【００３７】
ポリエチレングリコール４００および４０００は、商標名マクロゴール４００−Ｐurnaおよびマクロゴール４０００として市販されているものを購入した。グリセロールは１年ごとの品質で、Merck社から入手し、セトリミドＡ１１９３６はPharmachemicNVから、塩化コリンはSigma社から供給された。セチルアルコールは、Ｌanette１６なる商標名でHenkel KGaAから市販されている。液体カミツレ抽出物はConforma社およびプロピル・ガレートＰ３１３０はＳigma社から入手した。
【００３８】
ＩＩ．以下の成分を用いたＭ−ＶＤＢ培地の組成物およびその調製
【表２】
【００３９】
すべてを蒸留水９６０mlに溶解し、ＮａＯＨ（１０Ｎ）でｐＨを７．４に調整し、０.２μ膜フィルターで無菌濾過して細胞培養物のための保持培地を調製した。２％新生子牛血清（ＶＥＲＯ細胞のために）または胎児牛血清（他の細胞のために）を加えた。
【００４０】
実施例２ 抗ウイルス活性
１．構成成分の抗ウイルス活性
この実施例ではAmerican Type Culture Collection（受付番号ＣＣＬ２６）からのＶＥＲＯ細胞を用いた。ＶＥＲＯ細胞は、Ｅａｒｌｅ’ｓ塩および５％子牛血清と共に培地１９９（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ウイルス源としてヘルペス単純ウイルス１（ＨＳＶ−１、臨床分離株）を用い、１００μg/mlペニシリン、１００μg/mlストレプトマイシンおよび２％子牛血清と共に培養した。
【００４１】
マイクロタイター・プレート（９６ウエル、平板）中に培養したＶＥＲＯ細胞の単層上にＭ−ＶＤＢ中のＨＳＶ−１の１０−１−１０−６の希釈液１００μｌを入れた。ウイルスは６０−９０分間で細胞に吸収された。Ｍ−ＶＤＢ中の試験物質の希釈液を感染細胞に加えた。物質の細胞毒性を調べるために、同様に物質の希釈液を非感染細胞に加えた。５日間、湿室で３７℃でインキュベートした後、細胞病理学的効果を顕微鏡で調べた。
【００４２】
抗ウイルス活性は、サンプルの最も高い非毒性濃度の低下因数（ＲＦ）として表す。低下因数（ＲＦ）は、物質希釈液における生きているウイルス濃度に比した対照中のウイルス濃度の比である。≧１０２のＲＦは有意とみる。プロピル・ガレートでの結果を表１に示す。
【００４３】
【表３】
【００４４】
上表からＨＳＶ−１に対する抗ウイルス活性は濃度２５μg/mlまで有意であることが分かる。
【００４５】
殺ウイルス活性は、１０６ｃｆｕＨＳＶ−１含有のウイルス懸濁液を同量の種々の濃度の試験物質溶液と混合することにより測定した。この混合物を、定めた時間、管理した温度でインキュベートした。各混合物の１０−１−１０−６の段階希釈液をＶＥＲＯ細胞の単層上に入れた。３７℃で５日間インキュベートした後、ＣＰＥを測定した。結果はＲＦで表す。再度、≧１０２の力価低下を有意とする。
【００４６】
１５分間３４℃でのＨＳＶについての殺ウイルス活性の結果を表２に示す。
【表４】
【００４７】
上表からプロピル・ガレートが殺ウイルス活性を発揮しないことおよびセトリミドが濃度１００μg/mlまでで殺ウイルス活性を有することが分かる。プロピル・ガレートおよびセトリミドの混合物はプロピル・ガレートの過剰（２／１）でもその殺ウイルス活性を保持する。
【００４８】
２．試験混合物の抗ウイルス性
同様に、実施例１で調製した試験混合物の抗ウイルス活性を測定した。１５分間２５℃における軟膏の殺ウイルス活性の結果を表３に示す。
表３から、軟膏は２５℃で希釈１／１００までＨＳＶについての殺ウイルス活性を発揮することが分かる。セトリミドも２５℃ですら完全な活性を保持する。
【００４９】
【表５】
【００５０】
実施例３
抗菌活性
個々の構成成分および最終産物の抗菌活性を試験微生物Ｃandida albicans（ＡＴＴＣ １０２３１）、Ｅscherichia coli（ＡＴＴＣ ８７３９），Ｐseudomonas aeruginosa（ＡＴＴＣ １５４４２）およびＳtaphylococcus aureus（ＡＴＴＣ ６５３８）で測定した。用いた培地はトリプチカーゼ醤油肉汁（ＴＳＢ）、トリプチカーゼ醤油寒天（ＴＳＡ）および無菌リン酸緩衝液（ＰＢＳ）である。
【００５１】
Ｉ．構成成分および混合物の抗菌活性
最小阻止濃度（ＭＩＣ）を測定するために、一夜培養物を３７℃でＴＳＢ中各微生物について調製した。使用する試験物質のＴＳＢにおいて１／２希釈系を同様につくった。各希釈１００μlをミクロタイター・プレートに入れた。一夜培養物をＴＳＢ中１／１０００に希釈した。同様に細菌懸濁液１００μlを物質に加えた。無菌性の対照として、細菌を加えない物質希釈液および物質希釈液を加えない細菌希釈液を用いた。ミクロタイター・プレートを湿室内で２４時間３７℃でインキュベートした。細菌生育を懸濁液の混濁性をもとに調べた。ＭＩＣ価は、微生物の正常な生育を阻止し得る、すなわちいかなる懸濁をももたらさない最小の物質濃度である。
【００５２】
結果を表４に示す。
【表６】
【００５３】
上表により、カミツレ抽出物が、ある種の微生物について、そして高濃度でのみ非常に限定された抗菌活性を有することが分かる。他方、プロピル・ガレートおよびセトリミドは顕著な抗菌活性を有す。混合物において、セトリミドはその抗菌活性を保持することが分かる。
【００５４】
II．試験軟膏の抗菌活性
実施例１に記載したように、別々の３軟膏を調製した。そのロット番号は９４Ａ１２、９４Ｄ２１および９４Ｅ０５である。プラセボとしてセトリミドを除外した同じ組成物を調製した。このプラセボは９４Ｄ２７と呼ぶ。対照として無菌蒸留水中の１％セトリミドを用いた。すべての試験サンプルは室温で保存した。
【００５５】
IIａ．最小阻止濃度（ＭＩＣ）の測定
最小阻止濃度は、細菌がもはや生育しない試験物質の濃度である。用いた最も高い濃度（１／１０希釈）は、無菌蒸留水９ml中に軟膏１ｇを懸濁することにより調製した。希釈液を細菌に加え、２４時間培養した。用いた微生物は、容量１０５Ｃandida albicans（Ｃa）、１０６Ｅscherichia coli（Ｅc）、１０５Ｐseudomonas aeruginosa（Ｐa）および１０６Ｓtaphylococcus aureus（Ｓa）であった。
表５は、細菌の生育が阻止される希釈度を示す。
【００５６】
【表７】
【００５７】
表によると、すべての試験軟膏が抗菌活性を保持している。これらの軟膏のＭＩＣは、１％セトリミド水のＭＩＣ価に匹敵する。試験濃度においてプラセボは抗菌活性がない。
【００５８】
IIｂ．抗菌および抗真菌活性の測定
抗菌活性をＣandida albicans（１０５）、Ｅscherichia coli（１０６）、Ｐseudomonas aeruginosa（１０５）およびＳtaphylococcus aureus（１０６）で調べる。抗菌活性は、ヨーロッパ薬局方の記載に従って測定する。試験する物質を微生物と混じ、ある時間インキュベートし、この混合物を希釈し、どの希釈度でなお微生物の生育が起きるかを測定する。
【００５９】
希釈は、最終濃度１０６−１０７ｃｆｕまで各微生物について調製した。軟膏は、希釈なし、無菌蒸留水での１／２および１／１０希釈として調べた。軟膏またはその希釈液１ｇに対し、希釈接種物１００μｌを加えて、混合した。２５℃１５分間のインキュベーション後、１／１０希釈系をこの混合物１００mgからＴＳＢ（トリプチカーゼ醤油肉汁）中で調製した。各希釈液をＴＳＡ（トリプチカーゼ醤油寒天）上に接種した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。対照として、微生物の非処置培養物および蒸留水中の１％セトリミドを用いた。インキュベーション後、すべてのプレートを生長について検査した。低下因数（Ｒｆ）中に表される試験は３回実施された。その結果を表６に示す。
【００６０】
【表８】
【００６１】
上表から、すべての試験軟膏が希釈においてその抗菌活性を保持することが分かる。すべての細菌が殺された。プラセボは非常に限定された抗菌活性を有する。
【００６２】
IIｃ．抗真菌活性
抗真菌活性を測定するために、試験微生物Ｅpidermophyton floccosum（ＲＶ ６９６３５）およびＴrichophyton rubrum（ＲＶ５８１２４）を用いた。抗真菌活性は抗菌活性と同じ方法で測定した。
【００６３】
この目的のために、希釈液は、最終濃度１０４−１０５ｃｆｕまで各微生物につき調製した。軟膏は、希釈なし、無菌蒸留水での１／２および１／１０希釈として調べた。軟膏またはその希釈液１ｇに対し、希釈接種物１００μｌを加えて、混合した。２５℃１５分間のインキュベーション後、１／１０希釈系をこの混合物１００mgからＳＡＢ（サブロー肉汁（Ｇｉｂｃｏ））中で調製した。各希釈液をＳＡＢＡ（サブロー寒天（Ｇｉｂｃｏ））上に接種した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。対照として、微生物の非処置培養物および蒸留水中の１％セトリミドを用いた。インキュベーション後、すべてのプレートを生長について検査した。低下因数（Ｒｆ）中に表される試験は３回実施された。その結果を表７に示す。
【００６４】
【表９】
【００６５】
上表から、すべての試験軟膏が希釈においてその抗真菌活性を保持し、これは蒸留水中１％セトリミドに匹敵することが分かる。プラセボは非常に限定された抗真菌活性を有する。
【００６６】
IIｄ．殺ウイルス活性
殺ウイルス活性をＤ.Ｖanden Ｂerghe et al.in “Ｍethods in Ｐlant Ｂiochemistry”,Ｖol.6“Ａssays for Ｂioactivity”,p.49-67,Ａcademic Ｐress Ｌimited 1991記載のミクロ方法に従って測定した。物質希釈液３００μlに非希釈ウイルス懸濁液３００μlを加えた。混合物を３４℃で１５秒間インキュベートした。希釈チューブにウイルス用の冷却培養培地０.９mlを加え、氷浴に入れた。インキュベート混合物１００μlを希釈チューブに入れた。それから１／１０希釈系を調製した。これらの希釈液２００μlをＶＥＲＯ細胞上に入れた。対照は非処置ウイルス（ウイルス対照）および非処置細胞（細胞対照）である。プレートを３７℃で湿培養器中５−７日間インキュベートした。細胞毒性および細胞病理学的効果について顕微鏡で細胞を調べた。結果は低下因数（Ｒｆ）で表す。低下因数は、最初のウイルス濃度に対する残留ウイルス濃度の比である。この試験は３回実施された。Ｒｆで表された結果を表８に示す。
【００６７】
【表１０】
【００６８】
上表から試験軟膏が１／５０希釈まで殺ウイルス活性を有することが分かる。殺ウイルス活性は１％セトリミドの活性に匹敵する。プラセボは殺ウイルス活性がない。
【００６９】
実施例４
インビボ活性試験
試験群は、口唇にコールド・ソアがある１５人の患者からなる。彼等は以下の組成を有する軟膏で処置された。
【００７０】
【表１１】
試験結果を次の表９に示す。
【００７１】
【表１２】
２人の男性による第２試験において軟膏の予防的作用を調べた。その終了時まで軟膏を、１日１回６カ月間、通常病変が生じたとされる部位に適用した。この処置の結果、かぜの場合でも症状の繰り返しは起きなかった。この処置の前は、２人の患者の１人は少なくとも月に１回コールド・ソアが起きており、両者ともかぜに症状が伴っていた。
【００７２】
本発明は、ヘルペス感染、特にＨＳＶ−１または−２による顔面または口唇ヘルペスの処置のための新しい医薬組成物を提供する。他の療法との大きい相違は、治療的または予防的にこの薬剤を使用する患者では、同じ部位に症状の繰り返しが起きないことである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一構成成分として第四級アンモニウム化合物および／または第二構成成分として抗ウイルス剤および／または第三構成成分として植物抽出物を薬学的に許容される基剤に含み、該３構成成分は相互に和合している、ヘルペス単純ウイルス感染の処置のための医薬組成物。
【請求項２】
第一構成成分がセトリミド、塩化ベンザルコニウムからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
第二構成成分がアシクロビル、ブロモビニルデソクスウリジン(ＢＶＤＵ)、３−フルオロチミジン（３ＦＴ）、イドクスウリジン、プロピル・ガレート、エチル・ガレート、プロアントシアニド、グルコサミンからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１または２の医薬組成物。
【請求項４】
第三構成成分が Aesculus hippocastanum L; Aloe vera L; Anagallis arvensis L; Anthemis nobilis L; Arctium lappa L; Aristolochia clematitis L; Arnica montana L; Betonica officinalis L; Calendula officinalis L; Capsicum annuum (tetraqonum); Carica papaya L; Carlina acaulis L; Caryophyllus aromaticus L; Cynoglossum officinale L; Echinacea angustifolia; Echinacea purpurea L; Eupatorium cannabinum L; Geranium robertianum; Geum urbanum L; Glechoma hederacea L; Hamamelis virginiana L; Hypericum perforatum L; Inula helenium L; Juglans regia L; Juniperus oxycedrus L; Lavandula officinalis; Lawsonia alba L; Lysimachia nummeralia L; Lythrum salicaria L; Malva sylvestris; Marrubium vulgare L; Matricaria chamomilla L; Mentha piperita L; Myroxylon balsamum L; Myrtus communis L; Olea europaea L; Prunus amygdalus; Pyrus cydonia L; Quercus robur L; Quillaja saponaria; Rubus idaeus L; Salvia officinalis L; Saponaria officinalis L; Smilax officinalis; Solanum dulcamara L; Solidago virga aurea L; Styrax tonkinensis; Styrax benzoides; Styrax benzoin; Symphytum officinale L; Trigonella foenum-graecum L; Tropaeolum majus L; Urtica urens L; Urtica dioica L; Viola tricolor L.の抽出物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１、２または３の医薬組成物。
【請求項５】
第一構成成分がセトリミドの場合に第三構成成分がカミツレ、キンセンカ、サルビア、ゴボウ類およびセンナの植物抽出物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１、２または３の医薬組成物。
【請求項６】
第一構成成分が塩化ベンザルコニウムの場合に第三構成成分がカミツレ、キレセンカ、センナの抽出物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１、２または３の医薬組成物。
【請求項７】
第四級アンモニウム塩０.１−５％、抗ウイルス剤０.０１−３％および植物抽出物１−２０％を薬学的に許容される担体中に含む、請求項１−６のいずれかの医薬組成物。
【請求項８】
【表１】
を含む、請求項７の医薬組成物。
【請求項９】
ＨＳＶ−１感染の処置のための請求項１−８のいずれかの医薬組成物の使用。
【請求項１０】
ＨＳＶ−２感染の処置のための請求項１−８のいずれかの医薬組成物の使用。
【請求項１】
第一構成成分として第四級アンモニウム化合物および／または第二構成成分として抗ウイルス剤および／または第三構成成分として植物抽出物を薬学的に許容される基剤に含み、該３構成成分は相互に和合している、ヘルペス単純ウイルス感染の処置のための医薬組成物。
【請求項２】
第一構成成分がセトリミド、塩化ベンザルコニウムからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１の医薬組成物。
【請求項３】
第二構成成分がアシクロビル、ブロモビニルデソクスウリジン(ＢＶＤＵ)、３−フルオロチミジン（３ＦＴ）、イドクスウリジン、プロピル・ガレート、エチル・ガレート、プロアントシアニド、グルコサミンからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１または２の医薬組成物。
【請求項４】
第三構成成分が Aesculus hippocastanum L; Aloe vera L; Anagallis arvensis L; Anthemis nobilis L; Arctium lappa L; Aristolochia clematitis L; Arnica montana L; Betonica officinalis L; Calendula officinalis L; Capsicum annuum (tetraqonum); Carica papaya L; Carlina acaulis L; Caryophyllus aromaticus L; Cynoglossum officinale L; Echinacea angustifolia; Echinacea purpurea L; Eupatorium cannabinum L; Geranium robertianum; Geum urbanum L; Glechoma hederacea L; Hamamelis virginiana L; Hypericum perforatum L; Inula helenium L; Juglans regia L; Juniperus oxycedrus L; Lavandula officinalis; Lawsonia alba L; Lysimachia nummeralia L; Lythrum salicaria L; Malva sylvestris; Marrubium vulgare L; Matricaria chamomilla L; Mentha piperita L; Myroxylon balsamum L; Myrtus communis L; Olea europaea L; Prunus amygdalus; Pyrus cydonia L; Quercus robur L; Quillaja saponaria; Rubus idaeus L; Salvia officinalis L; Saponaria officinalis L; Smilax officinalis; Solanum dulcamara L; Solidago virga aurea L; Styrax tonkinensis; Styrax benzoides; Styrax benzoin; Symphytum officinale L; Trigonella foenum-graecum L; Tropaeolum majus L; Urtica urens L; Urtica dioica L; Viola tricolor L.の抽出物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１、２または３の医薬組成物。
【請求項５】
第一構成成分がセトリミドの場合に第三構成成分がカミツレ、キンセンカ、サルビア、ゴボウ類およびセンナの植物抽出物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１、２または３の医薬組成物。
【請求項６】
第一構成成分が塩化ベンザルコニウムの場合に第三構成成分がカミツレ、キレセンカ、センナの抽出物からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１、２または３の医薬組成物。
【請求項７】
第四級アンモニウム塩０.１−５％、抗ウイルス剤０.０１−３％および植物抽出物１−２０％を薬学的に許容される担体中に含む、請求項１−６のいずれかの医薬組成物。
【請求項８】
【表１】
を含む、請求項７の医薬組成物。
【請求項９】
ＨＳＶ−１感染の処置のための請求項１−８のいずれかの医薬組成物の使用。
【請求項１０】
ＨＳＶ−２感染の処置のための請求項１−８のいずれかの医薬組成物の使用。
【公開番号】特開２００８−７４８７２（Ｐ２００８−７４８７２Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３１９８３６（Ｐ２００７−３１９８３６）
【出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【分割の表示】特願平８−５２４１５９の分割
【原出願日】平成８年１月２３日（１９９６．１．２３）
【出願人】（５０７３７４４８０）バイオ・ファルマ・サイエンシーズ・ベスローテン・フエンノートシャップ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂ．Ｖ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月１１日（２００７．１２．１１）
【分割の表示】特願平８−５２４１５９の分割
【原出願日】平成８年１月２３日（１９９６．１．２３）
【出願人】（５０７３７４４８０）バイオ・ファルマ・サイエンシーズ・ベスローテン・フエンノートシャップ (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｂｉｏ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂ．Ｖ．
【Ｆターム（参考）】
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