メラニン形成を阻害するためのＫｉｆ１３Ａ阻害剤およびＡＰ−１阻害剤の使用
本発明は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの少なくとも１つの阻害剤、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａの少なくとも１つの阻害剤、またはＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットと前記キネシンとの間の相互作用の少なくとも１つの阻害剤、並びに、色素性疾患の処置のための薬物を製造するためのおよび色素脱失剤としてのその使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン細胞におけるメラニン色素の合成を減少させる組成物およびその使用に関する。
【０００２】
発明の技術的背景
ヒトにおいて、色素沈着は、最も顕著には皮膚、毛髪および虹彩色素上皮におけるメラニン色素の合成および分布から生じる。従って、皮膚、毛髪および眼の色は、主に存在する色素のタイプおよびその濃度に依存する。この色素沈着は、多くの内因性または外因性因子、例えば紫外線照射への曝露によって調節される。
【０００３】
メラニンは、チロシン（ユーメラニン）から形成されるモノマーまたはチロシンおよびシステイン（フェオメラニン）の付加もしくは縮合によってメラニン細胞によって産生される巨大分子である。メラニンが合成される機序、すなわちメラニン形成は、特に複雑であり、そして様々な酵素、主にチロシナーゼおよびチロシン関連タンパク質（チロシナーゼ関連タンパク質−１またはＴｙｒｐ−１）が関与している。メラニン形成中、これらの酵素は、特にチロシンからＤＯＰＡ（ジヒドロキシフェニルアラニン）への変換、そしてその後、ドーパキノンへの変換を触媒する。この分子から、２つの代謝経路により、ユーメラニンまたはフェオメラニンの合成が可能となる。
【０００４】
メラニン形成は、メラニン細胞に含まれる特殊な細胞内小器官であるメラノソームで行なわれる。メラノソームは形態学的に記載された最初の細胞小器官であるが（Seiji et al., 1963)、そのタンパク質組成およびその生合成は依然として比較的あまり知られていない。
【０００５】
メラノソームの成熟は、形態学的基準に基づいて４つの段階に分解できる。段階Ｉは、様々な量の管腔内膜を有する膜によって区切られた区画に相当する。段階ＩＩは、特徴的なタンパク質様の条線を有する楕円体の構造である。これらの条線は、メラニン濃縮、毒性合成中間体の排除、およびケラチノサイトへのメラニンの移動を促進する際に重要な役割を果たす(Seiji et al., 1963)。メラニンは、条線に沿った高電子密度の沈着物によって段階ＩＩＩから検出される。段階ＩＶは、内部条線がもはや見えない高電子密度の構造である。この段階は、ケラチノサイトへと移動する準備のできた成熟メラノソームに相当する(Van Den Bossche et al., 2006)。
【０００６】
生合成のプロセスの間に、「色素化された」成熟メラノソーム（段階ＩＩＩおよびＩＶ）は、メラニン合成に重要な酵素、および周辺へのその輸送に必要とされるエフェクターの添加によって得られる(Raposo et al., 2001)。メラニン形成に関与する酵素はこのようにゴルジ装置で合成され、その後、プレメラノソーム中に移動する。この移動に関与する機序は依然として比較的あまり知られていない。このタイプの移動は、輸送小胞において酵素を補充する役割を有するヘテロテトラマーであるアダプタータンパク質（ＡＰ）複合体の関与を特に必要とする。これらの複合体には４つあり、ＡＰ−１からＡＰ−４と命名されている。本発明者らは、以前に、ＡＰ−３複合体が、メラノソームへのチロシナーゼの移動に関与していたことを示した。しかしながら、ＡＰ−３の欠失は色素沈着を消失させず、Ｔｙｒｐ−１の輸送に影響を及ぼさない。彼らはまた、ＡＰ−１アダプター複合体が、チロシナーゼおよびＴｙｒｐ−１の細胞質ドメインのアミノ酸配列と相互作用できることを観察したが、メラニン形成におけるこの複合体の正確な機能を解明することはできなかった(Theos et al., 2005)。それと平行して、Ｋｉｆ１３Ａと称されたキネシンが、ＡＰ−１のサブユニットと相互作用できることも示された(Nakagawa et al., 2000)。この相互作用は、メラノソームを欠失した細胞株において観察された。従って、メラニン細胞の細胞株におけるこのような相互作用の存在、並びにメラニン形成におけるその役割は確立されていない。
【０００７】
メラニン細胞機能不全は色素沈着異常をもたらし得る。色素沈着低下が、色素脱失症、特に白皮症および白斑症から生じ得る。逆に、局所的な色素沈着過剰は、特発性肝斑または良性メラニン細胞活動亢進および増殖から生じ得、これらは例えば老人性色素斑（老人性黒子）を引き起こす。色素沈着過剰はまた、災難に因り、例えば光感作または病変後瘢痕によって引き起こされ得る。
【０００８】
これらの色素沈着過剰は、局所経路によって投与される色素脱失物質によって処置することができる。色素脱失分子は皮膚メラニン細胞に作用し、そしてメラニン形成の１つ以上の段階に干渉する。公知の色素脱失物質は、特に、ヒドロキノンおよびその誘導体、アスコルビン酸およびその誘導体、胎盤抽出物、コウジ酸、アルブチン、イミノフェノール(WO 99/22707)、カルニチンとキノンの組合せ(DE 19806947)、アミノ−フェノールアミド誘導体(FR 2772607)、およびベンゾチアゾール誘導体(WO 99/24035)である。
【０００９】
これらの物質は、特にその不安定性、高濃度でそれらを使用する必要性、その非特異的作用またはその毒性、刺激性もしくはアレルギー特性に因り、様々な欠点を提示し得る。従って、局所経路によって色素沈着過剰を処置または予防するための効果的で無害な色素脱失物質が、化粧品学および皮膚科学の分野において非常に求められている。
【００１０】
ここ数年間において、メラニン細胞の機能不全によって引き起こされる疾病を処置するための新規なアプローチが出現している。特にアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が考えられた。実際に、文書WO 99/25819は、白斑症および他の色素脱失症を処置するためにテネイシンの発現を調節することによって、色素沈着を増加させるために使用したオリゴヌクレオチドを記載し、文書FR 2804960は、色素沈着過剰を処置するためにチロシナーゼまたはＴｙｒｐ−１の発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載した。
【００１１】
発明の要約
本発明の目的は、メラニン形成に対して特異的な作用を有し、局所経路による投与に適した製剤において安定である、無毒性で非刺激性で非アレルギー性である、新規な色素脱失剤を提供することである。
【００１２】
本発明は、第一に、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン阻害剤、特にＫｉｆ１３Ａの少なくとも１つの阻害剤、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤、またはＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用の阻害剤を含む、薬学的または化粧品組成物に関する。本発明の第一の好ましい態様において、前記阻害剤は、キネシンＫｉｆ１３Ａの阻害剤である。本発明の第二の好ましい態様において、前記阻害剤は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤である。本発明の第三の好ましい態様において、前記阻害剤は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシン、特にキネシンＫｉｆ１３Ａとの間の相互作用の阻害剤である。特定の態様において、前記阻害剤は、小分子、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドである。好ましくは、前記阻害剤は、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチド（dominant negative peptide）である。
【００１３】
好ましい態様において、本発明は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含むまたはからなる少なくとも１つの核酸を含む薬学的または化粧品組成物に関する。本発明の第一の好ましい態様において、前記の少なくとも１つの核酸は、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含むまたはからなる。本発明の第二の好ましい態様において、前記の少なくとも１つの核酸は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションできる配列、および、このタンパク質の発現を減少または抑制することを含むまたはからなる。好ましくは、前記核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｉＲＮＡ、好ましくはｓｉＲＮＡである。前記核酸は、１５〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドを有し得る。好ましい態様において、前記核酸は、配列番号１〜６および１１〜２４の配列間で選択される配列を含む。
【００１４】
前記組成物は、エラク酸；アルブチン；レゾルシノール；ビタミンＣ；パントテネート；コウジ酸；胎盤抽出物；メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、そのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）と直接的にまたは間接的に干渉する分子；ポリオール、例えばグリセリン、グリコールまたはプロピレングリコール；ビタミン；角質溶解剤および／または剥離剤、例えばサリチル酸；α−ヒドロキシ酸、例えば乳酸またはリンゴ酸；アスコルビン酸；レチノイン酸；レチンアルデヒド；レチノール；パルミテート、プロピオネートまたはアセテート；抗糖化剤および／または抗酸化剤、例えばトコフェロール、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミンピロホスフェート、ピリドキサミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシン、アデノシントリホスフェート；抗炎症剤；鎮静剤およびその混合物；化学的または物理的な太陽フィルターおよびデオキシリボ核酸またはリボ核酸、およびその誘導体からなる群より好ましくは選択される、１つ以上の他の活性物質をさらに含み得る。好ましい態様において、この組成物は、局所使用に適応される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、色素性疾患を処置または予防するための薬物の調製のための本発明による薬学的または化粧品組成物の使用に関する。好ましい態様において、色素性疾患は色素沈着過剰である。
【００１６】
別の局面において、本発明は、化粧品薬剤としての本発明による薬学的または化粧品組成物の使用に関する。好ましくは、化粧品薬剤は色素脱失剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、ｓｉＲＮＡ−対照、ｓｉＲＮＡ−ＡＰ−１（μ１Ａ）、ｓｉＲＮＡ−ＡＰ−３（β３Ａ）またはｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞の細胞溶解液のウェスタンブロット実験によって得られた結果を示す。使用した一次抗体は抗Ｋｉｆ１３Ａである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、メラニン細胞の細胞溶解液から作られた抗Ｋｉｆ１３Ａ抗体または抗γ−アダプチン抗体（ＡＰ−１）を用いた免疫沈降の結果を示す。ウェスタンブロットを可視化するために使用した一次抗体は抗Ｋｉｆ１３Ａである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ｓｉＲＮＡ−対照またはｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞のタンパク質抽出物のウェスタンブロット実験によって得られた結果を示す。キネシンＫｉｆ１３ＡおよびＡＰ−１複合体サブユニットμ１Ａの発現レベルは、基準としてβ−チューブリンの発現を使用することによってここで定量的に評価される。
【図２】図２は、ｓｉＲＮＡ−対照またはｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞におけるメラニンの比率を提示する図を示す。ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞におけるメラニンの量を、１００％に等しいと捉える。メラニンの量は、４９２nmの波長における細胞溶解液の吸光度を測定することによって決定された。
【図３】図３は、ｓｉＲＮＡ−対照またはｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞の切片の電子顕微鏡写真を示す。
【図４】図４は、ｓｉＲＮＡ−対照またはｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞のタンパク質抽出物のウェスタンブロット実験によって得られた結果を示す。ＡＰ−１複合体のμ１およびγ−アダプチンサブユニットの発現は、基準としてβ−チューブリン発現レベルを使用することによってここで定量的に評価される。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、ｓｉＲＮＡ−対照、ｓｉＲＮＡ−μ１ＡまたはｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンで（図５Ａ）、あるいはｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンおよびｓｉＲＮＡ−μ１Ａの組合せ（図５Ｂ）でトランスフェクトされたメラニン細胞の中で、白い細胞、すなわち、成熟した色素化されたメラノソームを含まないメラニン細胞の比率を提示する図を示す。これらの測定は、光学顕微鏡（位相差）を使用して直接計測することによって行なわれた。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ｓｉＲＮＡ−対照、ｓｉＲＮＡ−μ１ＡまたはｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンで（図５Ａ）、あるいはｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンおよびｓｉＲＮＡ−μ１Ａの組合せ（図５Ｂ）でトランスフェクトされたメラニン細胞の中で、白い細胞、すなわち、成熟した色素化されたメラノソームを含まないメラニン細胞の比率を提示する図を示す。これらの測定は、光学顕微鏡（位相差）を使用して直接計測することによって行なわれた。
【図６】図６は、ｓｉＲＮＡ−対照、ｓｉＲＮＡ−μ１Ａ、またはｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンとｓｉＲＮＡ−μ１Ａの組合せでトランスフェクトされたメラニン細胞におけるメラニンの比率を提示する図を示す。ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞におけるメラニンの量を、１００％に等しいと捉える。メラニンの量は、４９２nmの波長における細胞溶解液の吸光度を測定することによって決定された。
【図７】図７は、ｓｉＲＮＡ−対照およびｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞の切片の電子顕微鏡写真を示す。写真上のローマ数字は、細胞中に存在するメラノソーム成熟段階に相当する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、驚くべき方法で、メラニン色素の合成を、メラニン細胞において、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤またはＡＰ−１と相互作用するキネシンの阻害剤を用いて、特にＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの発現またはＡＰ−１と相互作用するキネシンの発現を遮断する核酸を用いて減少させることができることを示した。彼らは実際に、このような核酸が、プレメラノソームへ向けたゴルジ装置のメラニン形成酵素の輸送を破壊し、従ってこれらの細胞小器官の成熟を遮断できるだけでなく、メラニン形成酵素の発現も減少させることができることを観察した。従って、本発明者らは、このタイプの核酸が、メラニン形成の様々な段階に対して作用することによってメラニン細胞におけるメラニンの合成を減少または阻害でき、従って、新規で特に効果的な色素脱失剤を構成することを明らかにした。
【００１９】
本発明は、第一に、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａの少なくとも１つの阻害剤、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤、または、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用の阻害剤に関する。
【００２０】
本文書で使用した用語「ＡＰ−１」は、トランスゴルジネットワークにおいて作用するＡＰ−１アダプター複合体をいう。junおよびfosファミリーのメンバーである遺伝子によってコードされるタンパク質からなる同じ名称の転写因子と混同すべきではない。ＡＰ−１アダプター複合体は、４つのサブユニット、すなわちγ、β１、σ１およびμ１からなり、これらのサブユニットのいずれか１つの不活性化は、複合体を不安定化し、それを不機能にするに十分である(Braun, 2007)。
【００２１】
本発明の第一の好ましい態様において、前記阻害剤は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にキネシンＫｉｆ１３Ａの阻害剤である。
【００２２】
本発明は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａの任意のタイプの阻害剤に関する。前記阻害剤は、キネシンの活性または発現を減少させることができる任意の分子であり得る。前記阻害剤は、小分子、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドであり得るが、これらに限定されるわけではない。
【００２３】
用語「小分子」は、１，０００ダルトン未満の分子、特に有機または無機化合物をいう。小さなキネシン阻害性分子は、アセプロマジン、クロルフェネタジン、クロルプロマジン、Ｎ−メチルクロルプロマジン、シアメマジン、フルフェナジン、メパジン、メトトリメプラジン、メトキシプロマジン、ノルクロルプロマジン、ペラジン、ペルフェナジン、フェノチアジン、プロクロルペラジン、プロメタジン、プロピオマジン、プタペラジン（putaperazine）、チエチルペラジン、チオプロパゼート、チオリダジン、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン並びに、特許出願および特許WO 01/98278、WO 02/057244、WO 02/079169、WO 02/057244、WO 02/056880、WO 03/050122、WO 03/050064、WO 03/049679、WO 03/049678、WO 03/049527、WO 03/079973、US 6,890,933、WO 2008/070739、WO 2006/060737、WO 2006/119146およびUS 6,777,200に記載された阻害性分子を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２４】
１つの態様において、前記阻害剤は、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドである。ここで使用したような用語「ドミナントネガティブペプチド」は、ＡＰ−１と相互作用し、その活性を抑制もしくは減少することのできるキネシンの少なくとも一部分を含むペプチドをいう。好ましくは、ドミナントネガティブペプチドは、ＡＰ−１と相互作用するキネシンの一部、すなわちキネシンの尾部に相当する部分のみから構成される。従って、このペプチドは、ＡＰ−１複合体と相互作用できるが、キネシンの頭部に相当するセグメントがなければ、微小管に沿って移動することができず、よってその機能を満たすことができない。
【００２５】
キネシンＫｉｆ１３Ａのためのいくつかのネガティブドミナントペプチドがすでに記載されている。特に、Ｋｉｆ１３Ａのドミナントネガティブペプチドは、キネシンの尾部に相当するＫｉｆ１３Ａタンパク質の部分のみを発現させることによって得られた。
【００２６】
本発明の好ましい態様において、キネシン阻害剤は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含むまたはからなる核酸である。このような核酸は、より十分に以下に記載されている。
【００２７】
本発明の第二の好ましい態様において、前記阻害剤は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤である。本発明は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの１つの任意のタイプの阻害剤である。ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの１つの阻害剤によって、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの１つの活性または発現を減少することのできる任意の分子を意味する。前記阻害剤は、小分子、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドであり得るが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、前記阻害剤はアプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドである。特に、γおよびμ１サブユニットの阻害剤が好ましい。
【００２８】
用語「小分子」は、１，０００ダルトン未満の分子、特に有機または無機化合物をいう。
【００２９】
ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットのためのいくつかのネガティブドミナントペプチドがすでに記載されている。特に、μ１サブユニットのネガティブドミナント突然変異体は、チロシンと結合するポケットに突然変異を導入することによって得られ、そしてWonderlich et al. (2008, J. Biol. Chem., vol. 283, 3011-3022)に記載されている。
【００３０】
前記阻害剤は、ＡＰ−１のサブユニットの１つの特異的抗体であり得る。これらの抗体のいくつか、例えばγサブユニットまたはβ１サブユニットの特異的抗体(Sigma-Aldrich)は市販されている。
【００３１】
本出願において、阻害剤はまた、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットが、複合体の他のサブユニットに結合するのを減少または防ぐことのできる任意の分子、すなわち、ＡＰ−１複合体の形成を減少または防ぐことのできる任意の分子も意味する。例えば、阻害性分子は、ＡＰ−１のサブユニットの１つに結合されて、前記のサブユニットが、ＡＰ１の他のサブユニットの１つ以上に結合するのを防ぐコンフォメーション変化を引き起こすことができ、これによりＡＰ−１複合体の形成を遮断することができる。それはまた、サブユニット間の相互作用のドメインを遮蔽することもできる。
【００３２】
本発明の好ましい態様において、ＡＰ−１アダプター複合体の阻害剤は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、このタンパク質の発現を減少または抑制できる配列を含むまたはからなる核酸である。このような核酸は、より十分に以下に詳述されている。
【００３３】
本発明の第三の好ましい態様において、前記阻害剤は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシン、特にキネシンＫｉｆ１３Ａとの間の相互作用の阻害剤である。本発明は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用の任意のタイプの阻害剤に関する。好ましくは、キネシンはＫｉｆ１３Ａである。好ましくは、ＡＰ−１のサブユニットはβ１サブユニットである。キネシンＫｉｆ１３Ａの尾部は、ＡＰ−１複合体のβ１サブユニットと相互作用する(Nakagawa et al., 2000)。前記阻害剤は、キネシンとＡＰ−１複合体との間の相互作用を減少または抑制することができる任意の分子であり得る。前記阻害剤は、小分子、アプタマーまたは抗体であり得るが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、前記阻害剤は、Ｋｉｆ１３Ａと相互作用するβ１サブユニットのドメインに対して、またはβ１サブユニットと相互作用するキネシンＫｉｆ１３Ａの尾部のドメインに対する抗体である。前記抗体は分子のどれか一方に結合し、これにより、Ｋｉｆ１３ＡとＡＰ−１複合体の間の相互作用を遮断する。さらに、前記阻害剤はまた、Ｋｉｆ１３Ａと相互作用するβ１サブユニットのドメインまたはβ１サブユニットと相互作用するキネシンＫｉｆ１３Ａの尾部のドメインを再現するデコイであり得、このデコイが、これらの２つの要素の間の相互作用においてＫｉｆ１３ＡまたはＡＰ−１と競合する。
【００３４】
本発明に使用したような用語「抗体」は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体およびその断片を含む。抗体断片は、例えば、Ｆ(ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓＦｖ断片を意味する。特定の態様において、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭであり得る。抗体を産生するための方法は、当業者に周知である。
【００３５】
ここで使用したような用語「アプタマー」は、ＡＰ−１複合体のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａに特異的に結合することのできる核酸またはペプチドの分子を意味する。好ましい態様において、アプタマーは、５〜１２０ヌクレオチドを一般的に含む、核酸、好ましくはＲＮＡである(Osborne et al., 1997)。それらは、インビトロで、ＳＥＬＥＸ(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)として知られるプロセスに従って選択されることができる。
【００３６】
本明細書において、用語「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は、同義語として使用され、そしてデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドの配列をいう。
【００３７】
本文書で使用した用語「ｉＲＮＡ」または「干渉ＲＮＡ」は、特定のメッセンジャーＲＮＡと干渉し、これによりその分解またはタンパク質へのその翻訳の減少をもたらす、一本鎖または二本鎖の任意のＲＮＡをいう。この用語は、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ)、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡに指向するｉＲＮＡ（ｄｄｉＲＮＡ）およびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。
【００３８】
本文書において、用語「ハイブリダイズ」は、ワトソン・クリック水素結合が相補的な塩基の間で２本の核酸鎖に対して確立されて二本鎖を形成できることを意味する。本文書において、用語「特異的にハイブリダイゼーションできる」は、本発明に従って使用される核酸が、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする遺伝子または転写物と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションできることを意味する。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、文献に、例えばSambrook et al., (1989)、Maniatis et al., (1982またはその近年の刊行物の１つ)およびAusubel et al., (1995)に広く記載されており、これらの条件は、適切な公知の技術に従って、ヌクレオチド断片のサイズに従って当業者により適合されることができる。純粋に説明するために、高度にストリンジェントな条件は有利には以下の通りである。２本の鎖（特にＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ）の間のハイブリダイゼーションは、２段階で行なわれる：（ａ）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムに相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート液、５％硫酸デキストランおよび１％サケ精子ＤＮＡを含むリン酸緩衝液（２０mm、ｐＨ７．５）中で４２℃で３時間プレハイブリダイゼーション；（ｂ）プローブのサイズに依存した温度で（例えば、１００ヌクレオチドを超えるサイズのプローブでは４２℃）２０時間ハイブリダイゼーションし、その後、２×ＳＳＣ／２％ＳＤＳ溶液を用いて２０℃で２０分間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液を用いて２０℃で２０分間の洗浄を１回。最後の洗浄は、１００ヌクレオチドより長いプローブでは０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液を用いて６０℃で３０分間行なわれる。
【００３９】
本発明の脈絡の中で、用語「ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする遺伝子」は、ＡＰ−１のγ、β１、σ１およびμ１サブユニットの１つ、またはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａをコードするゲノム配列を示すために使用される。この用語は、遺伝子の５’非コード領域（この領域は開始コドンを含む）、コード領域、および３’非コード領域を含む。用語「ＡＰ−１のサブユニットをコードする遺伝子」は、ＡＰ−１のγ、β１、σ１およびμ１サブユニットの１つをコードするゲノム配列を示すために使用される。この用語は、遺伝子の５’非コード領域（この領域は開始コドンを含む）、コード領域、および３’非コード領域を含む。用語「ＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする遺伝子」は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａをコードするゲノム配列を示すために使用される。この用語は、遺伝子の５’非コード領域（この領域は開始コドンを含む）、コード領域、および３’非コード領域を含む。
【００４０】
本発明の範囲内で、用語「ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ１と相互作用するキネシンをコードするｍＲＮＡ」は、対応するタンパク質をコードする遺伝子の転写から生じたリボヌクレオチド配列を示すために使用される。この用語は、３’および５’非翻訳領域（３’−ＵＴＲおよび５’−ＵＴＲ）、エキソン、および場合により、スプライシングされていないイントロンを含む。用語「ＡＰ−１のサブユニットをコードするｍＲＮＡ」は、対応するタンパク質をコードする遺伝子の転写から生じたリボヌクレオチド配列を示すために使用される。用語「ＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードするｍＲＮＡ」は、対応するタンパク質をコードする遺伝子の転写から生じたリボヌクレオチド配列を示すために使用される。より特定すると、用語「キネシンＫｉｆ１３ＡをコードするｍＲＮＡ」は、キネシンＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子の転写から生じたリボヌクレオチド配列を示すために使用される。
【００４１】
ゲノム配列およびタンパク質は、GeneIDデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)におけるその番号によって同定することができる。従って、ＡＰ−１のγ、β１、σ１およびμ１サブユニットのGeneIDアクセッション番号は、それぞれ、GeneID164、GeneID162、GeneID1174、GeneID8907であり、ヒトキネシンＫｉｆ１３ＡのGeneIDアクセッション番号はGeneID63971である。
【００４２】
用語「メラニン（melanin）」、「メラニン（melanins）」および「メラニン色素」は、本明細書において同義語として使用される。それらはメラノソームで合成されるようである様々な色素を含み、これにはユーメラニンおよびフェオメラニンが含まれる。
【００４３】
本文書において、用語「薬学的組成物」は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む本発明による組成物をいう。
【００４４】
本文書において、用語「化粧品組成物」は、化粧品的に許容される担体および／または賦形剤を含む本発明による組成物をいう。
【００４５】
用語「色素脱失剤」は、本明細書において、メラニン細胞においてメラニンの合成を阻害または減少でき、従って皮膚を明るくすることのできる活性薬剤をいう。
【００４６】
本発明による阻害剤は、メラニン細胞に導入されると、ＡＰ−１の１つ以上のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａの発現または活性の減少または抑制を誘導できるか、あるいは、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシン、特にキネシンＫｉｆ１３Ａとの相互作用の減少または抑制を誘導でき、その結果は、メラニン色素の合成の有意な減少である。
【００４７】
好ましい態様において、本発明に従って使用される核酸は、メラニン細胞に導入されると、ＡＰ−１の１つ以上のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａの発現の減少または抑制を誘導でき、その結果は、メラニン色素の合成の有意な下降である。特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、メラニン細胞に導入されると、ＡＰ−１の１つ以上のサブユニットの発現の減少または抑制を誘導でき、その結果は、メラニン色素の合成の有意な下降である。別の特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、メラニン細胞に導入されると、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａの発現の減少または抑制を誘導でき、その結果は、メラニン色素の合成の有意な下降である。これらの核酸は、転写または翻訳レベルで作用し得る。
【００４８】
発現の「減少」によって、例えば、遺伝子発現産物の３０％、５０％、７０％、８０％、９０％または９５％の減少を意味する。
【００４９】
本発明に従って使用される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであり得る。それらは一本鎖または二本鎖の形態またはその両方の混合物であり得る。それらは、場合により、少なくとも１つの修飾されたまたは非天然のヌクレオチド、例えば、修飾された塩基を含むヌクレオチド、例えばイノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジンまたはハイブリダイゼーションを可能とする任意の他の修飾された塩基を含み得る。本発明に従って使用される核酸はまた、ヌクレオチド間結合のレベルで、例えばホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネートまたはアルキル−ホスホネート、あるいは骨格のレベルで、例えばαオリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルリボースまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）(M. Egholm et al., 1992)、修飾され得る。これらの核酸は、当業者に公知の全ての方法、例えば化学合成、ライブラリースクリーニング、インビボ転写、またはＤＮＡ組換えもしくは増幅技術によって調製することができる。
【００５０】
本発明の特定の態様において、核酸は、細胞に導入されると、細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する干渉ＲＮＡ（ｄｄｉＲＮＡ）の産生を誘導するＤＮＡであり得る。この技術は、ＤＮＡ指向性干渉ＲＮＡとして当業者には公知である。
【００５１】
別の好ましい態様において、核酸は、ＲＮＡ、好ましくは干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）である。これらのＲＮＡは、天然、合成、または組換え技術によって産生され得る。それらはまた、例えば、ヌクレアーゼに対するその抵抗性を増加させ、よって細胞中でのその寿命を増加させることのできる修飾されたヌクレオチドまたは化学修飾を含み得る。ＲＮＡ干渉は、転写後レベルで標的遺伝子の発現を特異的に阻害することを可能とする当業者に周知の現象である。多くの特許および特許出願が、遺伝子発現を阻害するためのｉＲＮＡ分子の使用を記載し；例は、文書WO 99/32619、US 20040053876、US 20040102408およびWO 2004/007718を含む。好ましくはｉＲＮＡ分子は、約１５〜５０ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド長の二本鎖のｓｉＲＮＡ分子である。
【００５２】
本発明の代替的な態様において、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａの発現を減少または抑制するのに使用される核酸は、アンチセンス核酸である。特定の方法において、ＡＰ−１のサブユニットの発現を減少または抑制するのに使用される核酸は、アンチセンス核酸である。別の特定の方法において、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａの発現を減少または抑制するために使用される核酸は、アンチセンス核酸である。このアンチセンス核酸は、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードするセンス核酸の全てまたは一部に相補的であり得る。特定の方法において、アンチセンス核酸は、ＡＰ−１のサブユニットをコードするセンス核酸の全てまたは一部に相補的であり得る。別の特定の方法において、アンチセンス核酸は、ＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードするセンス核酸の全てまたは一部と相補的であり得る。それは、例えば、ｍＲＮＡに相補的であり得る。アンチセンス核酸は、一般に、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンの転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、古典的なワトソン・クリック相互作用によってこれらの転写物に選択的にハイブリダイゼーションする。特定の方法において、アンチセンス核酸は、一般に、ＡＰ−１のサブユニットの転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の特定の方法において、アンチセンス核酸は、一般に、ＡＰ−１と相互作用するキネシンの転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス阻害性核酸は、ＡＰ−１のγ、β１、σ１およびμ１サブユニットをコードするまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする転写物に結合し、そして例えば、ｍＲＮＡの場合には対象の転写物の５’末端において細胞翻訳機序へのアクセスを遮断し、タンパク質へのその翻訳を妨害し、インビボにおいて対象の転写物の発現の抑制を可能とすることができる(Kumar et al., 1993)。特定の方法において、アンチセンス阻害性核酸は、ＡＰ−１のγ、β１、σ１およびμ１サブユニットをコードする遺伝子の転写物に結合することができる。別の特定の方法において、アンチセンス阻害性核酸は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子の転写物に結合することができる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、特許EP 0092574に記載されている。好ましくは、アンチセンス核酸は、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３ＡをコードするｍＲＮＡに相補的である。特定の方法において、アンチセンス核酸は、ＡＰ−１のサブユニットをコードするｍＲＮＡと相補的である。別の特定の方法において、アンチセンス核酸は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３ＡをコードするｍＲＮＡと相補的である。阻害性核酸がアンチセンス型である場合、対象の転写物をコードする配列の全てまたは一部、あるいは３’または５’非コード配列の全てまたは一部を網羅することができる。好ましくは、アンチセンス阻害性核酸は、リボソーム結合配列および翻訳開始配列と相補的である。阻害性核酸は、一般に、少なくとも１０リボヌクレオチド、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０リボヌクレオチド長、好ましくは１５〜３０リボヌクレオチド長の長さを有する。
【００５３】
本発明に従って使用されるアンチセンス核酸は、化学合成法によって、または当業者に公知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡは、特に、化学的に合成できるか、鎖状の鋳型（例えばＰＣＲによって）または環状の鋳型（例えばウイルスまたは非ウイルスベクター由来）のインビトロでの転写によって産生されるか、またはウイルス性もしくは非ウイルス性ベクターからインビボでの転写によって産生することができる。アンチセンス核酸を、その安定性、ヌクレアーゼに対するその抵抗性、その特異性またはその薬理学的特性を高めるために修飾することができる。例えば、アンチセンス核酸は、センス核酸とアンチセンス核酸の間に形成された二本鎖の安定性を高めるために使用される修飾されたヌクレオチドを含むことができる。
【００５４】
別の態様において、阻害性核酸はリボザイムである。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有し、従って、それらが相補的であるｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断できる触媒ＲＮＡ分子である。ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする転写物の特定のリボザイムを、当業者に周知の方法に従って設計、合成および産生することができる(例えば、Fanning and Symonds, 2006を参照)。リボザイムは一般的に２つの異なる領域を有する。対象の転写物、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする遺伝子の転写物に対してある特異性を有する第一領域（従って、後者ＡＰ−１に結合できる）、一方で、第二領域は、リボザイム上に、対象の転写物の切断、ライゲーションおよびスプライシングのその触媒活性を付与する。特定の方法において、第一領域は、対象の転写物、ＡＰ−１のサブユニットをコードする遺伝子の転写物にある特異性を有する。別の特定の方法において、第一領域は、対象の転写物、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子の転写物にある特異性を有する。様々なタイプのリボザイム、例えばハンマーヘッドリボザイムまたは環状リボザイム、ヘアピンリボザイムまたはラッソ（lasso）リボザイムなどを使用することができる。
【００５５】
本発明に従って使用する干渉ＲＮＡまたはアンチセンス核酸を、それらをコードする前駆体またはＤＮＡ分子の形態で投与することができる。
【００５６】
本発明に従って使用される核酸は、一般に、１５〜５０ヌクレオチドの長さ、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド長を有する。
【００５７】
本発明において、核酸は、ＡＰ−１複合体のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子または転写物に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。１つの態様において、核酸は、ＡＰ−１複合体のサブユニットをコードする遺伝子または転写物に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。別の態様において、核酸は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子または転写物に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。それにも関わらず、本発明による核酸は、特異的にハイブリダイゼーションするために標的配列と１００％の相補性を有する必要はない。特に、少なくとも約９０％に等しい相補度を有する核酸が、特異的にハイブリダイゼーションすることができる。好ましくは、本発明の核酸と標的配列の間の相補度は、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％に等しい。
【００５８】
好ましい態様において、本発明に従って使用される核酸は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはキネシンＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションできる１つ以上の配列を含むまたはからなる。好ましくは、核酸は、配列番号１〜６および１１〜２４の配列間で選択された１つ以上の配列を含むまたはからなる。特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションできる１つ以上の配列を含むまたはからなる。好ましくは、核酸は、配列番号５、６および１１〜２４の配列間で選択された１つ以上の配列を含むまたはからなる。より好ましくは、核酸は、ＡＰ−１のμ１Ａまたはγ−アダプチンサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションできる１つ以上の配列を含むまたはからなる。別の特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、キネシンＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションできる１つ以上の配列を含むまたはからなる。好ましくは、核酸は、配列番号１〜４の配列間で選択された１つ以上の配列を含むまたはからなる。
【００５９】
特に好ましい態様において、本発明に従って使用される核酸は、以下の対の１つによって形成された二本鎖干渉ＲＮＡの分子を含むまたはからなる：配列番号１および２、配列番号３および４、配列番号５および６、配列番号１１および１２、配列番号１３および１４、配列番号１５および１６、配列番号１７および１８、配列番号１９および２０、配列番号２１および２２、並びに配列番号２３および２４。特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、以下の対の１つによって形成された二本鎖干渉ＲＮＡの分子を含むまたはからなる：配列番号１および２、並びに配列番号３および４。別の特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、以下の対の１つによって形成された二本鎖干渉ＲＮＡの分子を含むまたはからなる：配列番号５および６、配列番号１１および１２、配列番号１３および１４、配列番号１５および１６、配列番号１７および１８、配列番号１９および２０、配列番号２１および２２、並びに配列番号２３および２４。
【００６０】
本発明は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの少なくとも１つの阻害剤、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａの阻害剤、またはＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンの間の相互作用の阻害剤、特に本出願で定義したような任意の阻害剤を含む、薬学的または化粧品組成物に関する。
【００６１】
好ましい態様において、本発明は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニット、またはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のようにこのタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含むまたはからなる少なくとも１つの核酸を特に含む、薬学的または化粧品組成物に関する。特定の態様において、薬学的または化粧品組成物は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のようにこのタンパク質の発現を減少または抑制することのできる配列を含むまたはからなる少なくとも１つの核酸を含む。別の特定の態様において、薬学的または化粧品組成物は、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシンをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のように、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含むまたはからなる少なくとも１つの核酸を含む。好ましくは、キネシンはキネシンＫｉｆ１３Ａである。
【００６２】
好ましい態様において、前記組成物は、その製剤が局所投与に適合された薬学的または化粧品組成物である。組成物中に使用される阻害剤は、有効量で存在する。使用する阻害剤のタイプにより、有効量は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａの発現または活性を減少または抑制するか、あるいは、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用を減少または抑制する量である。
【００６３】
好ましい態様によると、阻害剤が核酸である場合、組成物中に使用される核酸は、有効量で、例えば、組成物の全重量の０．００００１％〜１０％、好ましくは０．０００３％〜３％（ｗ/ｗ）の範囲で存在する。
【００６４】
本出願で使用したような用語「有効量」は、メラニン合成の有意な減少を可能とする、本発明に従って使用される阻害剤の量である。好ましい態様において、本出願で使用される用語「有効量」は、メラニン合成の有意な減少を可能とする本発明に従って使用される核酸の量である。この減少は、特に、皮膚の色の可視的変化を引き起こし得る。この減少は、例えば、非処理細胞に存在するメラニンの量の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％であり得る。それは、実施例に記載または当業者に公知の方法の１つによって測定することができる。
【００６５】
本発明による組成物は、同一または異なるタイプおよび同一または異なる標的を有するいくつかの阻害剤を含み得る。それは、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤、またはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａの阻害剤、またはＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用の阻害剤を含み得る。それは、類似した性質（例えば核酸のみ）または異なる性質（例えばアプタマー、抗体および／または核酸）の阻害剤を含み得る。好ましい態様において、この組成物は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニット、またはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のように、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含む、いくつかの核酸を含み得る。それはまた、ＡＰ−１の同じサブユニット、またはＡＰ−１の異なるサブユニット、またはＡＰ−１と相互作用する同じキネシン、またはＡＰ−１と相互作用する異なるキネシンを標的化する、いくつかの阻害性核酸の組合せを含み得る。特定の態様において、前記組成物は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のように、このタンパク質の発現を減少または抑制できる、配列を含む、いくつかの核酸を含み得る。それはまた、ＡＰ−１の同じサブユニット、またはＡＰ−１の異なるサブユニットを標的化するいくつかの阻害性核酸の組合せも含み得る。別の特定の態様において、前記組成物は、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のように、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる、配列を含む、いくつかの核酸を含み得る。それはまた、ＡＰ−１と相互作用する同じキネシン、またはＡＰ−１と相互作用する異なるキネシンを標的化する、いくつかの阻害性核酸の組合せも含み得る。
【００６６】
本発明による組成物は、さらに、所望の効果を強化することを目的とした追加の活性物質、例えば、エラク酸；アルブチン；レゾルシノール；ビタミンＣ；パントテネート；コウジ酸；胎盤抽出物；メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、そのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）と直接的にまたは間接的に干渉する分子；ポリオール、例えばグリセリン、グリコールまたはプロピレングリコール；ビタミン；角質溶解剤および／または剥離剤、例えばサリチル酸；α−ヒドロキシ酸、例えば乳酸またはリンゴ酸；アスコルビン酸；レチノイン酸；レチンアルデヒド；レチノール；パルミテート、プロピオネートまたはアセテート；抗糖化剤および／または抗酸化剤、例えばトコフェロール、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミンピロホスフェート、ピリドキサミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシン、アデノシントリホスフェート；抗炎症剤；鎮静剤およびその混合物；化学的または物理的な太陽フィルターおよびデオキシリボ核酸またはリボ核酸、およびその誘導体を含み得る。
【００６７】
本発明による組成物は、局所適用に通常使用される任意の生薬形態、特に含水アルコール水溶液または油溶液、水中油滴型または油中水滴型または複合エマルション、水性または油性ゲル、液体、ペースト状または固体状の無水生成物、ナノスフィアおよびナノカプセルなどのポリマー相中の油分散液、またはフランス特許FR 2534487に記載のような良好なイオン性および／または非イオン性脂質小胞の形態で生じ得る。
【００６８】
特に、本発明による組成物は、リポソームに封入された、特許出願に記載された、少なくとも１つの阻害剤、好ましくは阻害性核酸を含むことができる。
【００６９】
本発明によると、「リポソーム」は、人工的に製造され、リン脂質層からなり、互いに水性区画によって分離された小胞を意味する。それらは細胞膜の構造と非常に近い構造を有し、これにより、それらが含む活性成分を放出しながらそれらと合体することができる。本発明により使用されるリポソームは、多重膜リポソームまたはＭＬＶ（多重膜小胞）、小さな一枚膜リポソームまたはＳＵＶ（小さな一枚膜小胞）、あるいは大きな一枚膜リポソームまたはＬＵＶ（大きな一枚膜小胞）であり得る。リポソームはまた、壁がリン脂質からなっているのではなく、むしろ非イオン性脂質からなっている非イオン性リポソームでもあり得る。
【００７０】
本発明による組成物は、ほぼ液体であり得、白色または着色したクリーム、ポマード、ミルク、ローション、セラム、ペーストまたは発泡体の外見を有する。場合により、エアゾールの形態で皮膚に適用することができる。それはまた、固体形態、粉状、または粉状ではない、例えば棒形態でも提供され得る。それはさらに、顔または手の円形の小さな領域上に局所適用するための、パッチ、ペンシル、ブラシ、およびアプリケーターとして提供され得る。それは、皮膚ケア製品および／またはメーキャップ製品として使用することができる。
【００７１】
期待されるように、本発明による組成物はまた、皮膚科学および化粧品の分野における通常の補助剤、例えば、親水性または親油性ゲル化剤、親水性または親油性活性成分、保存剤、抗酸化剤、溶媒、香料、添加物、フィルター、色素、消臭剤および着色剤も含むことができる。これらの様々な補助剤の量は、関連分野で古典的に使用されている量である。これらの補助剤は、その性質に従って、油相、水相、脂質小胞および／またはナノ粒子に導入することができる。
【００７２】
本発明の化粧品または皮膚科学的組成物がエマルションである場合、油相の比率は、組成物の全重量に比較して、５重量％〜８０重量％、好ましくは５重量％〜５０重量％の範囲であり得る。組成物中にエマルションの形態で使用される油、乳化剤および共乳化剤は、関連分野で古典的に使用されるものから選択される。乳化剤および共乳化剤は、組成物の全重量に比較して、０．３重量％〜３０重量％、好ましくは０．５重量％〜２０重量％の範囲の比率で組成物中に存在する。
【００７３】
本発明による阻害剤と、特に本発明による核酸と組み合わせて使用できる油の例は、鉱物油、例えば石油ゼリー；植物起源の油、例えばアボカド油または大豆油；動物起源の油、例えばラノリン；合成油、例えばペルヒドロスクアラン；シリコーン油、例えばシクロメチコンおよびフッ素化油、例えばパーフルオロポリエーテルを含む。脂肪物質として有用なのはまた、脂肪アルコール、例えばセチルアルコール、脂肪酸またはワックス、例えばカルナバワックスまたはオゾケライトである。
【００７４】
本発明による核酸と組み合わせて使用できる乳化剤および共乳化剤の例は、脂肪酸とポリエチレングリコールのエステル、例えばＰＥＧ−２０ステアレート、および脂肪酸とグリセリンのエステル、例えばグリセリルステアレートを含む。
【００７５】
本発明による阻害剤、特に核酸と組み合わせて使用できる親水性ゲル化剤の例は、カルボキシビニルポリマー（カルボマー）、アクリルコポリマー、例えばアクリレート／アルキルアクリレートコポリマー、ポリアクリルアミド、ポリサッカリド、天然ゴムおよびクレーを含む。親油性ゲル化剤として、例えば、修飾されたクレー、例えばベントン、脂肪酸の金属塩、疎水性シリカまたはポリエチレンを使用することができる。
【００７６】
本発明はさらに、化粧品剤としての本発明による組成物の使用に関する。好ましい態様において、化粧品剤は色素脱失剤である。
【００７７】
本発明は、色素性疾患の処置に使用するための、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの少なくとも１つの阻害剤、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシンの阻害剤、特にＫｉｆ１１３Ａの阻害剤、またはＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用の阻害剤を含む、薬学的または化粧品組成物に関する。特定の態様によると、前記阻害剤は、小分子、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドであり得るが、これらに限定されるわけではない。
【００７８】
好ましい態様において、本発明は、色素性疾患の処置のための、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードまたはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａ、をコードする遺伝子またはｍＲＮＡに特異的にハイブリダイゼーションでき、そしてこのタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含む少なくとも１つの核酸を含む薬学的組成物に関する。特定の方法において、本発明は、色素性疾患の処置のための、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、そしてこのタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含む少なくとも１つの核酸を含む薬学的組成物に関する。別の特定の方法において、本発明は、色素性疾患の処置のための、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、そしてこのタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含む少なくとも１つの核酸を含む薬学的組成物に関する。
【００７９】
本発明はまた、色素性疾患を処置または予防するための薬物の調製のための、本発明による薬学的組成物の使用に関する。
【００８０】
本発明はまた、本発明による化粧品または薬学的組成物を、色素脱失しようとする皮膚に適用することからなる、ヒト皮膚を色素脱失および／または漂白する化粧品的または薬学的方法、あるいは、色素性疾患の処置または予防を主題として有する。
【００８１】
処置しようとする色素性疾患は、色素沈着過剰または色素沈着低下症であり得る。局所的な色素沈着過剰は、あるメラニン細胞の障害から生じ得、そしてメラニンの蓄積によって特徴づけられる。処置しようとする色素性疾患は、色素沈着過剰、例えば特発性肝斑（妊娠または経口避妊薬の摂取に関連していない）、肝斑（また褐色斑または妊娠性肝斑とも呼ばれる）、光線性黒子（老人性黒子、老人性斑点、日光性斑点、加齢性斑点または黒子とも呼ばれる）、ざ瘡による色素性後遺症、擦過傷、火傷、瘢痕、皮膚症および／または接触性アレルギーに起因する炎症性色素沈着、イナゴツナギ皮膚炎、ツタウルシに起因する色素沈着、そばかす、母斑、例えば先天性巨大母斑、ベッカー母斑またはスピッツ母斑であり得る。色素沈着過剰は、遺伝的に決定できるか、または代謝起源または薬物関連起源のものであり得る。それらは、偶然に、例えば光増感または病変後の瘢痕によって引き起こされ得る。色素性疾患はまた、色素沈着低下症、例えば白斑としても表現され得る。好ましい態様において、処置しようとする色素性疾患は色素沈着過剰である。好ましくは、色素沈着過剰は、肝斑、特発性肝斑または老人性黒子である。
【００８２】
色素沈着過剰の場合、処置の目的は、色素沈着過剰領域を色素脱失し、従って、これらの特異的な色素性疾患に関連した可視的な症状を減少または抑制することである。
【００８３】
色素沈着低下症の場合、処置の目的は、残りの色素性領域を色素脱失することによって皮膚の色を標準化することであり得る。
【００８４】
予防の目的は、色素沈着過剰の場合、色素沈着過剰領域の出現を回避し、色素沈着低下症の場合、皮膚の色の不均衡の出現を回避することである。
【００８５】
以下の実施例は、説明として提示され、限定するものではない。
【００８６】
実施例
材料および方法
細胞、抗体および試薬
ヒトメラニン細胞の細胞株ＭＮＴ−１を、以前に記載されているように(Raposo et al., 2001)培養液中に維持する。
【００８７】
この実施例で使用した抗体を以下に列挙する：
− 抗β−チューブリンウサギポリクローナル抗体(ab6046, Abcam（登録商標））
− ウサギ抗μ１Ａ（ＡＰ−１のサブユニット）ポリクローナル抗体(Dr. Linton Traub, University of Pittsburg)；
− マウス抗γ−アダプチンモノクローナル抗体（クローン100/3；SIGMA（登録商標））；
− 培養液ＴＡ９９（Ｍｅｌ−５）(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Manassas、VA、USA)の上清から得られたマウス抗Ｔｙｒｐ１モノクローナル抗体（チロシナーゼ関連タンパク質−１）；
− 抗チロシナーゼポリクローナル抗体(ab15175, Abcam（登録商標））；
− 抗Ｐｍｅｌ１７モノクローナル抗体(HMB50, Labvision（登録商標）)；
− ウサギ抗Ｋｉｆ１３Ａポリクローナル抗体(Bethyl Laboratories, Montgomery, USA)；
− ウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体(Jackson Immunoresearch（登録商標）)；および
− テキサスレッドと結合させたウサギ抗マウス抗体(Invitrogen（登録商標）)。
【００８８】
この実施例で使用した抗体以外の試薬を以下に列挙する：
− コロイド状金粒子に結合したプロテインＡ（ユトレヒト大学細胞顕微鏡センター、オランダ）；
− プロテインＧアガロース（Invitrogen（登録商標）、カタログ参照15920-010)；
− NuPAGE Bis-Tris 4-12%ゲル、NuPAGE 3-8% トリス−アセテートゲル、MES-SDS移動および転写緩衝液を含む、ウェスタンブロット用のキット(Invitrogen（登録商標）)；
− ＰＶＤＦメンブラン(Millipore（登録商標）)上でＨＲＰ活性を可視化するための、ＥＣＬキット「ウェスタンブロッティング検出試薬」(Amersham（登録商標）)；
− パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(Sigma（登録商標）)；
− サポニン（(Carlo Erba Reagents（登録商標）)；および
− 蛍光顕微鏡カバーガラスをのせるためのＤＡＰＩを含む「ProLong（登録商標） Gold Antifade Reagent」媒体。
【００８９】
干渉ＲＮＡ配列
【表１】
【００９０】
ＲＮＡ干渉
１×１０６個の細胞を、２日間、１０cmの培養皿に接種し、その後、予め加熱したＰＢＳで２回洗浄し、その後、インキュベーター中の４mlのOptiMem培地(Invitrogen（登録商標）)で４０分間培養した。
【００９１】
１０μｌの２０μM ｓｉＲＮＡを８４０μlのOptiMem培地と混合し、この混合物を２０分間室温でインキュベートすることによって溶液Ａを得た。５０μlのオリゴフェクタミン（登録商標）(Invitrogen（登録商標）)を１５０μlのOptiMem培地と混合し、この混合物を２０分間室温でインキュベートすることによって溶液Ｂを得た。
【００９２】
その後、溶液ＡおよびＢを混合し、２０分間室温で放置した。その後、この混合物を、インキュベーター中で４時間保持していた細胞上にのせた。その後、４０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を有する５mlの完全培地を細胞に加えた。２４時間後、細胞を回収し、１．５×１０５細胞/ウェルの濃度で６ウェルプレートに接種した。この同じプロトコルを、容量を適合させることによって次の日も繰り返した。
【００９３】
ウェスタンブロット
ＲＮＡ干渉後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後、氷上で１ウェルあたり２００μlの溶解緩衝液（５０mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、１％トリトン、１％プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ８）と共に１５分間インキュベートした。その後、細胞を剥がし、遠心分離にかけ（１５，０００rpm、４℃）、そして上清を回収した。全タンパク質の量を、ＢＣＡプロテインアッセイキット(Pierce（登録商標）)によって測定した。１０mgの各上清をゲル上にのせ、２００Ｖで３５分間泳動を行なった。その後、ゲルを、３０Ｖで１時間かけてＰＶＤＦメンブラン(Millipore（登録商標）)に転写した。その後、メンブランを、ＰＢＳ/０．１％Tween/５％ＢＳＡ緩衝液を用いて１時間室温で飽和させ、ＷＢ緩衝液（ＰＢＳ/０．１％Tween）中で希釈した一次抗体と共に４５分間インキュベートし、ＷＢ緩衝液で１０分間３回濯ぎ、ＷＢ緩衝液中で希釈したＨＲＰと結合させた対応する二次抗体と共に４５分間インキュベートし、ＷＢ緩衝液中で１０分間３回濯いだ。その後、ＨＲＰ活性を、ＥＣＬキット（ウェスタンブロット検出試薬）(Amersham（登録商標）)を使用して明らかにした。
【００９４】
蛍光顕微鏡
カバーガラス上に予め接種した細胞（０．５×１０５個の細胞/カバーガラス）を、予め加熱したＰＢＳで２回洗浄し、その後、ＰＢＳ/４％ＰＦＡ溶液で１０分間かけて固定した。ＰＢＳを用いて室温で２回洗浄した後、反応しなかった過剰ＰＦＡを、５０mMグリシン/ＰＢＳを用いて１０分間処理することによって中和した。その後、非特異的結合部位を、２mg/mlＢＳＡを補充したＰＢＳで３分間の洗浄を２回することによって飽和させ、細胞を、透過緩衝液（ＰＢＳ/２％ＢＳＡ/０．０５％サポニン）を用いて透過化した。その後、カバーガラスを、透過緩衝液で希釈した２５μlの一次抗体と４５分間室温で接触させておき、そして過剰の抗体を、透過緩衝液を用いて３分間の洗浄を２回することによって排除した。その後、カバーガラスを、透過緩衝液で希釈した２５μlの二次抗体と共に４５分間室温でインキュベートした。
【００９５】
透過緩衝液で３分間の洗浄を２回行ない、続いてＰＢＳで１回洗浄した後、カバーガラスを、１５μlの封入培地(ProLong（登録商標） Gold Antifade Reagent with DAPI、Invitrogen（登録商標）)と共に顕微鏡スライドにのせ、観察時における蛍光の消失を減弱させた。
【００９６】
免疫沈降
メラニン細胞を、コンフルエントになるまで７５cm２のフラスコ中で培養し、その後、溶解緩衝液（５０mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、１％トリトン、１％プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．３）を用いて２０分間４℃で溶解した。その後、細胞を剥がし、そして遠心分離（１５，０００rpm、４℃）にかけ、そして上清を収集した。プロテインＧアガロースと結合させたビーズを溶解緩衝液中で洗浄し、これらのビーズの２０mlを、回転下で１時間かけて４℃で溶解液と共にインキュベートした。その後、溶解液を４，０００rpmで遠心分離にかけ、そして上清を収集し、その後、１μgウサギ抗体（Ｋｉｆ１３Ａ対照）またはマウス抗ＣＤ９抗体（ＡＰ−１γ−アダプチン対照）と共に１時間かけて予めインキュベートしておいた洗浄したビーズと共にインキュベートした。その後、溶解液を４，０００rpmで遠心分離にかけ、そして、上清を、１μgのウサギ抗体（Ｋｉｆ１３ａ対照）、抗Ｋｉｆ１３ａ抗体（Ｋｉｆ１３ａ）、マウス抗ＣＤ９抗体（ＡＰ−１γ−アダプチン対照）またはマウス抗γ−アダプチン抗体（ＡＰ−１ γ−アダプチン）と共に２時間かけて４℃で回転下で予めインキュベートしておいた洗浄したビーズ２０μlと接触させておくことによって免疫沈降を行なう。その後、溶解液を４，０００rpmで遠心分離にかけ、上清を収集し、そしてウェスタンブロット解析のためにゲル上にのせた。
【００９７】
電子顕微鏡
６ウェルプレートに予め接種し、「対照」ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３ＡまたはｓｉＲＮＡ−μ１Ａで処理したメラニン細胞を、０．２Ｍ ｐＨ７．４リン酸緩衝液中で４時間かけて室温で、２％ＰＦＡの混合物および２％グルタルアルデヒドの混合物（従来型顕微鏡）または２％ＰＦＡと０．５％グルタルアルデヒドの混合物（免疫染色）のいずれかを用いて固定した。
【００９８】
従来型顕微鏡：０．２Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中で数回洗浄した後、細胞を、２％オスミウム酸（ＯｓＯ４）溶液を用いて４５分間かけて固定した。蒸留水で濯いだ後、細胞を、漸増濃度のエタノールを用いて脱水し、その後、Epon 812樹脂で覆った。４８時間かけて６０℃で重合した後、超微細片を採取し、５分間かけて４％酢酸ウラニルを用いて対比し、その後、電子顕微鏡(Philips CM120, FEI Company（登録商標）)下で観察した。KeenViewカメラ(SIS（登録商標）、ドイツ)を用いて画像を撮影した。
【００９９】
免疫染色：０．１Ｍグリシンを含む０．２Ｍリン酸緩衝液中で数回洗浄した後、細胞を、Raposo et al. (1997)による文書で以前に記載のように凍結超薄切片法用に調製した。
【０１００】
簡潔には、細胞ペレットを最初に１０％ゼラチンで覆った。４℃で凝固させた後、１mm３の塊を切り、２時間かけて２．３Ｍスクロース中に注入した。細胞の塊をその支持体上で凍結させ、超微細凍結切片を、凍結超薄切片作成装置(Leica（登録商標）、オーストリア)を用いて作成した。電子顕微鏡グリッド上に回収した切片を、抗Ｔｙｒｐ１および抗Ｐｍｅｌ１７抗体を用いて免疫染色した。これらの抗体を、コロイド状金粒子に結合させたプロテインＡを用いて可視化した。切片を対比させ、酢酸ウラニルとメチルセルロースの混合物中で覆い、その後、電子顕微鏡(Philips CM120, FEI Company（登録商標）)下で観察した。KeenViewカメラ(SIS（登録商標）、ドイツ)で画像を撮影した。
【０１０１】
メラニンの定量
ＲＮＡ干渉後、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、１５０μlのメラニン緩衝液（５０mMトリス、２mM ＥＤＴＡ、１５０mM ＮａＣｌ、１％プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．４）と共にインキュベートした。その後、それらを剥がし、１つの画分に収集し、その後、２０秒間最大強度で超音波をあてた。その後、１０μlを採取し、タンパク質を定量し（BCAプロテインアッセイキットを用いて、Pierce)、そして２００μgのタンパク質を採取し、１５，０００rpmで１５分間かけて４℃で遠心分離にかけた。上清を排除し、ペレットを５００μlのエタノール／エーテル（１：１）溶液で洗浄した。最後に、ペレットを、２３０μlの２Ｍ ＮａＯｈ/２０％ＤＭＳＯ溶液を用いて５５℃で可溶化した。一旦可溶化すると、２００μlを採取して、４９２nmにおける吸光度を測定した。
【０１０２】
白い細胞の定量
定量は、免疫蛍光のために調製した細胞上で落射蛍光顕微鏡を使用して行なった。細胞を位相差で観察し、そして色素化された成熟メラノソームの存在（黒）または非存在（白）を定量した。
【０１０３】
実施例１
ｓｉＲＮＡ−ＡＰ−１（μ１Ａ）、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３ＡおよびｓｉＲＮＡ−ＡＰ−３（β３Ａ）でトランスフェクトされたメラニン細胞の細胞溶解液のウェスタンブロット実験により、Ｋｉｆ１３Ａの発現は、ＡＰ−１またはＡＰ−３の不活性化によって破壊されないことを示すことができた（図１Ａ）。他方で、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞においては、Ｋｉｆ１３Ａの発現が完全に抑制され（図１Ａおよび１Ｃ）、一方で、ＡＰ−１のμ１Ａサブユニットの発現は破壊されなかった。従って、これらの結果は、メラニン細胞においてこのタンパク質を不活性化するｓｉＲＮＡの効力および特異性を示す。
【０１０４】
さらに、メラニン細胞において行なわれた免疫沈降実験は、Ｋｉｆ１３Ａタンパク質が、γ−アダプチンＡＰ−１サブユニットと共沈降すること、そして、従って非メラニン細胞株で以前に観察されたＫｉｆ１３ＡとＡＰ−１の間の相互作用(Nakagawa et al., 2000)がメラニン細胞の細胞株においても存在する（図１Ｂ）ことを示すことができた。
【０１０５】
ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞中に存在する量と比較した、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞中のメラニンの相対量を、４９２nmの波長における細胞溶解液の吸光度の測定によって決定した（図２）。図２に提示される結果は、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａの使用が、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞と比較して、合成されたメラニンの量の約４０％の減少をもたらすことを可能とすることを示す。
【０１０６】
電子顕微鏡下での観察を、従来型の電子顕微鏡（図３）または抗Ｔｙｒｐ１抗体を用いた免疫染色（データは示さず）のいずれかで、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３ＡまたはｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞上で行なった。
【０１０７】
従来型電子顕微鏡の実験は、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞が、大量のメラニン（図３において黒で）を有する多くのメラノソームを含むことを示すことを可能とした。他方で、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞は全くまたは殆ど色素を含んでいなかった。
【０１０８】
ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞では、免疫染色により、Ｔｙｒｐ１タンパク質の濃縮された多くの成熟段階ＩＩＩまたはＩＶメラノソームが判明した。他方で、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされた細胞では、成熟メラノソームは見られず、Ｔｙｒｐ１酵素が、エンドソーム特徴を有する小胞構造中に分散されていた。
【０１０９】
従って、キネシンＫｉｆ１３Ａの不活性化は、プレメラノソームにおいてメラニン形成酵素の移動を妨害し、従って、これらの細胞小器官の成熟を遮断し、これにより結果としてメラニンの合成ができなくなる。
【０１１０】
結論
これらの実験によって得られた結果は最初に、特異的ｓｉＲＮＡの使用は、メラニン細胞におけるキネシンＫｉｆ１３Ａを不活性化することを観察することを可能とした。
【０１１１】
得られた結果はまた、キネシンＫｉｆ１３Ａの特異的ｓｉＲＮＡの使用が、
− メラニン細胞において産生されるメラニンの量、
− 色素化された成熟メラノソームを含むメラニン細胞の量、および
− メラニン細胞における成熟メラノソーム（段階ＩＩＩまたはＩＶ）の比率
を有意に減少させることを可能とすることを示す。
【０１１２】
これらの実験によって、本発明者らは、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にキネシンＫｉｆ１３Ａの特異的ｓｉＲＮＡが、メラニン色素の産生に対して有意な作用を及ぼし、従って、色素脱失剤として効果的に使用することができることを示した。
【０１１３】
実施例２
トランスフェクトされたメラニン細胞のウェスタンブロット実験（図４）は、ＡＰ−１のμ１Ａサブユニットの発現が、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞と比較して、ｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞において強く減少していることを示すことを可能とした。この発現の下降はまた、ＡＰ−１アダプター複合体の不安定化の結果、ＡＰ−１の別のサブユニットであるγ−アダプチンの発現の減少も伴った。従って、これらの結果は、ＡＰ−１の唯１つのサブユニットの不活性化がこの複合体を完全に不安定化するに十分であることを確認する。さらに、驚くべき様式で、ｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされ従ってＡＰ−１に欠陥を有する細胞において、Ｔｙｒｐ−１酵素の発現はより低い強度で減少していたが、メラニン形成の鍵となる酵素であるチロシナーゼの発現は強く減少していることが観察された。
【０１１４】
従って、これらの結果は、ＡＰ−１の唯１つのサブユニットの不活性化はアダプター複合体の不安定化および不活性化に十分であるが、メラニン形成の基本的な酵素の発現も妨害することを示す。
【０１１５】
トランスフェクトされたメラニン細胞の中の白い細胞、すなわち色素化された成熟メラノソームを含まない細胞の定量は、光学顕微鏡（位相差）下で直接計測することによって行なわれ（図５Ａおよび５Ｂ）、ｓｉ−ＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞に存在する量と比較したこれらの細胞中のメラニンの比率を、４９２nmの波長における細胞溶解液の吸光度を測定することによって決定した（図６）。図５Ａ、５Ｂおよび６は、ｓｉＲＮＡ−対照、ｓｉＲＮＡ−１μＡ、ｓｉＲＮＡ−γ−アダプチン、またはｓｉＲＮＡ−１μＡとｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンの組合せでトランスフェクトされたメラニン細胞で得られた結果を示す。図５Ａおよび５Ｂで提示された結果は、ｓｉＲＮＡ−１μＡ、ｓｉＲＮＡ−γ−アダプチン（図５Ａ）または両方同時(図５Ｂ）の使用は、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞との比較によって、トランスフェクトされたメラニン細胞間での白い細胞の比率を有意に増加させることを可能としたことを示す。ｓｉＲＮＡ−１μＡのみでトランスフェクトされた細胞ではこの増加は２４％に達した。これらの結果は図６に提示される結果により確認され、ここでは、ｓｉＲＮＡ−１μＡ、ｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンまたは両方同時のトランスフェクションは、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞との比較によって、細胞中で合成されたメラニンの量を顕著に減少させることを可能としたように思われる。この減少は、ｓｉＲＮＡ−１μＡでトランスフェクトされた細胞において４０％超に達し得る。
【０１１６】
従って、これらの結果は、１つ以上のｓｉＲＮＡによるＡＰ−１複合体の１つ以上のサブユニットの不活性化は、メラニン細胞におけるメラニンの合成を有意に減少させることを可能とすることを示す。
【０１１７】
電子顕微鏡下での観察を、従来型顕微鏡（図７）または抗Ｔｙｒｐ１抗体を用いた免疫染色を用いて（データは示さず）のいずれかで、ｓｉＲＮＡ−μ１ＡまたはｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞で行なった。
【０１１８】
従来型電子顕微鏡を用いた実験は、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞が、大量のメラニン（図７で黒で）を含む多くのメラノソームを含んでいたことを示すことを可能とした。他方で、ｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞は、全くまたは殆ど色素を含んでいなかった。
【０１１９】
ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞における免疫染色により、Ｔｙｒｐ１タンパク質の濃縮された多くの成熟段階ＩＩＩまたはＩＶメラノソームが判明した。他方で、ｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされた細胞（従って、ＡＰ−１アダプター複合体は不活性化されていた）は、未成熟の段階ＩまたはＩＩメラノソームしか含まなかった。これらの細胞中には成熟メラノソームは見られなかった。Ｔｙｒｐ１酵素は常に抗体によって検出されたが、エンドソーム特徴を有し色素を欠失していた小胞構造中にしか存在しなかった。
【０１２０】
従って、これらの観察は、ＡＰ−１複合体の不活性化は、プレメラノソームにおいてメラニン形成の酵素の移動を妨害し、従って、これらの細胞小器官の成熟を遮断し、これにより結果としてメラニンの合成ができなくなることを示す。
【０１２１】
結論
これらの実験によって得られた結果は、まず第一に、特異的ｓｉＲＮＡの使用がメラニン細胞におけるＡＰ−１複合体を不活性化することを観察することを可能とした。さらに、ＡＰ−１アダプター複合体の唯１つのサブユニットの不活性化が、前記複合体を不安定化し従って不活性化するのに十分であることが示された。
【０１２２】
得られた結果はまた、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの特異的ｓｉＲＮＡの使用が、
− メラニン細胞において産生されるメラニンの量、
− 色素化された成熟メラノソームを含むメラニン細胞の量、および
− メラニン細胞における成熟（段階ＩＩＩまたはＩＶ）メラノソームの比率
を有意に減少させることを可能とすることを示す。
【０１２３】
これらの実験によって、本発明者らは、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの特異的ｓｉＲＮＡが、メラニン色素の産生に対して有意な効果を及ぼし、従って、色素脱失剤として効果的に使用されることができることを示した。
【０１２４】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニン細胞におけるメラニン色素の合成を減少させる組成物およびその使用に関する。
【０００２】
発明の技術的背景
ヒトにおいて、色素沈着は、最も顕著には皮膚、毛髪および虹彩色素上皮におけるメラニン色素の合成および分布から生じる。従って、皮膚、毛髪および眼の色は、主に存在する色素のタイプおよびその濃度に依存する。この色素沈着は、多くの内因性または外因性因子、例えば紫外線照射への曝露によって調節される。
【０００３】
メラニンは、チロシン（ユーメラニン）から形成されるモノマーまたはチロシンおよびシステイン（フェオメラニン）の付加もしくは縮合によってメラニン細胞によって産生される巨大分子である。メラニンが合成される機序、すなわちメラニン形成は、特に複雑であり、そして様々な酵素、主にチロシナーゼおよびチロシン関連タンパク質（チロシナーゼ関連タンパク質−１またはＴｙｒｐ−１）が関与している。メラニン形成中、これらの酵素は、特にチロシンからＤＯＰＡ（ジヒドロキシフェニルアラニン）への変換、そしてその後、ドーパキノンへの変換を触媒する。この分子から、２つの代謝経路により、ユーメラニンまたはフェオメラニンの合成が可能となる。
【０００４】
メラニン形成は、メラニン細胞に含まれる特殊な細胞内小器官であるメラノソームで行なわれる。メラノソームは形態学的に記載された最初の細胞小器官であるが（Seiji et al., 1963)、そのタンパク質組成およびその生合成は依然として比較的あまり知られていない。
【０００５】
メラノソームの成熟は、形態学的基準に基づいて４つの段階に分解できる。段階Ｉは、様々な量の管腔内膜を有する膜によって区切られた区画に相当する。段階ＩＩは、特徴的なタンパク質様の条線を有する楕円体の構造である。これらの条線は、メラニン濃縮、毒性合成中間体の排除、およびケラチノサイトへのメラニンの移動を促進する際に重要な役割を果たす(Seiji et al., 1963)。メラニンは、条線に沿った高電子密度の沈着物によって段階ＩＩＩから検出される。段階ＩＶは、内部条線がもはや見えない高電子密度の構造である。この段階は、ケラチノサイトへと移動する準備のできた成熟メラノソームに相当する(Van Den Bossche et al., 2006)。
【０００６】
生合成のプロセスの間に、「色素化された」成熟メラノソーム（段階ＩＩＩおよびＩＶ）は、メラニン合成に重要な酵素、および周辺へのその輸送に必要とされるエフェクターの添加によって得られる(Raposo et al., 2001)。メラニン形成に関与する酵素はこのようにゴルジ装置で合成され、その後、プレメラノソーム中に移動する。この移動に関与する機序は依然として比較的あまり知られていない。このタイプの移動は、輸送小胞において酵素を補充する役割を有するヘテロテトラマーであるアダプタータンパク質（ＡＰ）複合体の関与を特に必要とする。これらの複合体には４つあり、ＡＰ−１からＡＰ−４と命名されている。本発明者らは、以前に、ＡＰ−３複合体が、メラノソームへのチロシナーゼの移動に関与していたことを示した。しかしながら、ＡＰ−３の欠失は色素沈着を消失させず、Ｔｙｒｐ−１の輸送に影響を及ぼさない。彼らはまた、ＡＰ−１アダプター複合体が、チロシナーゼおよびＴｙｒｐ−１の細胞質ドメインのアミノ酸配列と相互作用できることを観察したが、メラニン形成におけるこの複合体の正確な機能を解明することはできなかった(Theos et al., 2005)。それと平行して、Ｋｉｆ１３Ａと称されたキネシンが、ＡＰ−１のサブユニットと相互作用できることも示された(Nakagawa et al., 2000)。この相互作用は、メラノソームを欠失した細胞株において観察された。従って、メラニン細胞の細胞株におけるこのような相互作用の存在、並びにメラニン形成におけるその役割は確立されていない。
【０００７】
メラニン細胞機能不全は色素沈着異常をもたらし得る。色素沈着低下が、色素脱失症、特に白皮症および白斑症から生じ得る。逆に、局所的な色素沈着過剰は、特発性肝斑または良性メラニン細胞活動亢進および増殖から生じ得、これらは例えば老人性色素斑（老人性黒子）を引き起こす。色素沈着過剰はまた、災難に因り、例えば光感作または病変後瘢痕によって引き起こされ得る。
【０００８】
これらの色素沈着過剰は、局所経路によって投与される色素脱失物質によって処置することができる。色素脱失分子は皮膚メラニン細胞に作用し、そしてメラニン形成の１つ以上の段階に干渉する。公知の色素脱失物質は、特に、ヒドロキノンおよびその誘導体、アスコルビン酸およびその誘導体、胎盤抽出物、コウジ酸、アルブチン、イミノフェノール(WO 99/22707)、カルニチンとキノンの組合せ(DE 19806947)、アミノ−フェノールアミド誘導体(FR 2772607)、およびベンゾチアゾール誘導体(WO 99/24035)である。
【０００９】
これらの物質は、特にその不安定性、高濃度でそれらを使用する必要性、その非特異的作用またはその毒性、刺激性もしくはアレルギー特性に因り、様々な欠点を提示し得る。従って、局所経路によって色素沈着過剰を処置または予防するための効果的で無害な色素脱失物質が、化粧品学および皮膚科学の分野において非常に求められている。
【００１０】
ここ数年間において、メラニン細胞の機能不全によって引き起こされる疾病を処置するための新規なアプローチが出現している。特にアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が考えられた。実際に、文書WO 99/25819は、白斑症および他の色素脱失症を処置するためにテネイシンの発現を調節することによって、色素沈着を増加させるために使用したオリゴヌクレオチドを記載し、文書FR 2804960は、色素沈着過剰を処置するためにチロシナーゼまたはＴｙｒｐ−１の発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを記載した。
【００１１】
発明の要約
本発明の目的は、メラニン形成に対して特異的な作用を有し、局所経路による投与に適した製剤において安定である、無毒性で非刺激性で非アレルギー性である、新規な色素脱失剤を提供することである。
【００１２】
本発明は、第一に、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン阻害剤、特にＫｉｆ１３Ａの少なくとも１つの阻害剤、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤、またはＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用の阻害剤を含む、薬学的または化粧品組成物に関する。本発明の第一の好ましい態様において、前記阻害剤は、キネシンＫｉｆ１３Ａの阻害剤である。本発明の第二の好ましい態様において、前記阻害剤は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤である。本発明の第三の好ましい態様において、前記阻害剤は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシン、特にキネシンＫｉｆ１３Ａとの間の相互作用の阻害剤である。特定の態様において、前記阻害剤は、小分子、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドである。好ましくは、前記阻害剤は、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチド（dominant negative peptide）である。
【００１３】
好ましい態様において、本発明は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含むまたはからなる少なくとも１つの核酸を含む薬学的または化粧品組成物に関する。本発明の第一の好ましい態様において、前記の少なくとも１つの核酸は、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含むまたはからなる。本発明の第二の好ましい態様において、前記の少なくとも１つの核酸は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションできる配列、および、このタンパク質の発現を減少または抑制することを含むまたはからなる。好ましくは、前記核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｉＲＮＡ、好ましくはｓｉＲＮＡである。前記核酸は、１５〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドを有し得る。好ましい態様において、前記核酸は、配列番号１〜６および１１〜２４の配列間で選択される配列を含む。
【００１４】
前記組成物は、エラク酸；アルブチン；レゾルシノール；ビタミンＣ；パントテネート；コウジ酸；胎盤抽出物；メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、そのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）と直接的にまたは間接的に干渉する分子；ポリオール、例えばグリセリン、グリコールまたはプロピレングリコール；ビタミン；角質溶解剤および／または剥離剤、例えばサリチル酸；α−ヒドロキシ酸、例えば乳酸またはリンゴ酸；アスコルビン酸；レチノイン酸；レチンアルデヒド；レチノール；パルミテート、プロピオネートまたはアセテート；抗糖化剤および／または抗酸化剤、例えばトコフェロール、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミンピロホスフェート、ピリドキサミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシン、アデノシントリホスフェート；抗炎症剤；鎮静剤およびその混合物；化学的または物理的な太陽フィルターおよびデオキシリボ核酸またはリボ核酸、およびその誘導体からなる群より好ましくは選択される、１つ以上の他の活性物質をさらに含み得る。好ましい態様において、この組成物は、局所使用に適応される。
【００１５】
別の局面において、本発明は、色素性疾患を処置または予防するための薬物の調製のための本発明による薬学的または化粧品組成物の使用に関する。好ましい態様において、色素性疾患は色素沈着過剰である。
【００１６】
別の局面において、本発明は、化粧品薬剤としての本発明による薬学的または化粧品組成物の使用に関する。好ましくは、化粧品薬剤は色素脱失剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、ｓｉＲＮＡ−対照、ｓｉＲＮＡ−ＡＰ−１（μ１Ａ）、ｓｉＲＮＡ−ＡＰ−３（β３Ａ）またはｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞の細胞溶解液のウェスタンブロット実験によって得られた結果を示す。使用した一次抗体は抗Ｋｉｆ１３Ａである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、メラニン細胞の細胞溶解液から作られた抗Ｋｉｆ１３Ａ抗体または抗γ−アダプチン抗体（ＡＰ−１）を用いた免疫沈降の結果を示す。ウェスタンブロットを可視化するために使用した一次抗体は抗Ｋｉｆ１３Ａである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ｓｉＲＮＡ−対照またはｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞のタンパク質抽出物のウェスタンブロット実験によって得られた結果を示す。キネシンＫｉｆ１３ＡおよびＡＰ−１複合体サブユニットμ１Ａの発現レベルは、基準としてβ−チューブリンの発現を使用することによってここで定量的に評価される。
【図２】図２は、ｓｉＲＮＡ−対照またはｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞におけるメラニンの比率を提示する図を示す。ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞におけるメラニンの量を、１００％に等しいと捉える。メラニンの量は、４９２nmの波長における細胞溶解液の吸光度を測定することによって決定された。
【図３】図３は、ｓｉＲＮＡ−対照またはｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞の切片の電子顕微鏡写真を示す。
【図４】図４は、ｓｉＲＮＡ−対照またはｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞のタンパク質抽出物のウェスタンブロット実験によって得られた結果を示す。ＡＰ−１複合体のμ１およびγ−アダプチンサブユニットの発現は、基準としてβ−チューブリン発現レベルを使用することによってここで定量的に評価される。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、ｓｉＲＮＡ−対照、ｓｉＲＮＡ−μ１ＡまたはｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンで（図５Ａ）、あるいはｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンおよびｓｉＲＮＡ−μ１Ａの組合せ（図５Ｂ）でトランスフェクトされたメラニン細胞の中で、白い細胞、すなわち、成熟した色素化されたメラノソームを含まないメラニン細胞の比率を提示する図を示す。これらの測定は、光学顕微鏡（位相差）を使用して直接計測することによって行なわれた。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、ｓｉＲＮＡ−対照、ｓｉＲＮＡ−μ１ＡまたはｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンで（図５Ａ）、あるいはｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンおよびｓｉＲＮＡ−μ１Ａの組合せ（図５Ｂ）でトランスフェクトされたメラニン細胞の中で、白い細胞、すなわち、成熟した色素化されたメラノソームを含まないメラニン細胞の比率を提示する図を示す。これらの測定は、光学顕微鏡（位相差）を使用して直接計測することによって行なわれた。
【図６】図６は、ｓｉＲＮＡ−対照、ｓｉＲＮＡ−μ１Ａ、またはｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンとｓｉＲＮＡ−μ１Ａの組合せでトランスフェクトされたメラニン細胞におけるメラニンの比率を提示する図を示す。ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞におけるメラニンの量を、１００％に等しいと捉える。メラニンの量は、４９２nmの波長における細胞溶解液の吸光度を測定することによって決定された。
【図７】図７は、ｓｉＲＮＡ−対照およびｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞の切片の電子顕微鏡写真を示す。写真上のローマ数字は、細胞中に存在するメラノソーム成熟段階に相当する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明者らは、驚くべき方法で、メラニン色素の合成を、メラニン細胞において、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤またはＡＰ−１と相互作用するキネシンの阻害剤を用いて、特にＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの発現またはＡＰ−１と相互作用するキネシンの発現を遮断する核酸を用いて減少させることができることを示した。彼らは実際に、このような核酸が、プレメラノソームへ向けたゴルジ装置のメラニン形成酵素の輸送を破壊し、従ってこれらの細胞小器官の成熟を遮断できるだけでなく、メラニン形成酵素の発現も減少させることができることを観察した。従って、本発明者らは、このタイプの核酸が、メラニン形成の様々な段階に対して作用することによってメラニン細胞におけるメラニンの合成を減少または阻害でき、従って、新規で特に効果的な色素脱失剤を構成することを明らかにした。
【００１９】
本発明は、第一に、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａの少なくとも１つの阻害剤、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤、または、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用の阻害剤に関する。
【００２０】
本文書で使用した用語「ＡＰ−１」は、トランスゴルジネットワークにおいて作用するＡＰ−１アダプター複合体をいう。junおよびfosファミリーのメンバーである遺伝子によってコードされるタンパク質からなる同じ名称の転写因子と混同すべきではない。ＡＰ−１アダプター複合体は、４つのサブユニット、すなわちγ、β１、σ１およびμ１からなり、これらのサブユニットのいずれか１つの不活性化は、複合体を不安定化し、それを不機能にするに十分である(Braun, 2007)。
【００２１】
本発明の第一の好ましい態様において、前記阻害剤は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にキネシンＫｉｆ１３Ａの阻害剤である。
【００２２】
本発明は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａの任意のタイプの阻害剤に関する。前記阻害剤は、キネシンの活性または発現を減少させることができる任意の分子であり得る。前記阻害剤は、小分子、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドであり得るが、これらに限定されるわけではない。
【００２３】
用語「小分子」は、１，０００ダルトン未満の分子、特に有機または無機化合物をいう。小さなキネシン阻害性分子は、アセプロマジン、クロルフェネタジン、クロルプロマジン、Ｎ−メチルクロルプロマジン、シアメマジン、フルフェナジン、メパジン、メトトリメプラジン、メトキシプロマジン、ノルクロルプロマジン、ペラジン、ペルフェナジン、フェノチアジン、プロクロルペラジン、プロメタジン、プロピオマジン、プタペラジン（putaperazine）、チエチルペラジン、チオプロパゼート、チオリダジン、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン並びに、特許出願および特許WO 01/98278、WO 02/057244、WO 02/079169、WO 02/057244、WO 02/056880、WO 03/050122、WO 03/050064、WO 03/049679、WO 03/049678、WO 03/049527、WO 03/079973、US 6,890,933、WO 2008/070739、WO 2006/060737、WO 2006/119146およびUS 6,777,200に記載された阻害性分子を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２４】
１つの態様において、前記阻害剤は、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドである。ここで使用したような用語「ドミナントネガティブペプチド」は、ＡＰ−１と相互作用し、その活性を抑制もしくは減少することのできるキネシンの少なくとも一部分を含むペプチドをいう。好ましくは、ドミナントネガティブペプチドは、ＡＰ−１と相互作用するキネシンの一部、すなわちキネシンの尾部に相当する部分のみから構成される。従って、このペプチドは、ＡＰ−１複合体と相互作用できるが、キネシンの頭部に相当するセグメントがなければ、微小管に沿って移動することができず、よってその機能を満たすことができない。
【００２５】
キネシンＫｉｆ１３Ａのためのいくつかのネガティブドミナントペプチドがすでに記載されている。特に、Ｋｉｆ１３Ａのドミナントネガティブペプチドは、キネシンの尾部に相当するＫｉｆ１３Ａタンパク質の部分のみを発現させることによって得られた。
【００２６】
本発明の好ましい態様において、キネシン阻害剤は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含むまたはからなる核酸である。このような核酸は、より十分に以下に記載されている。
【００２７】
本発明の第二の好ましい態様において、前記阻害剤は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤である。本発明は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの１つの任意のタイプの阻害剤である。ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの１つの阻害剤によって、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの１つの活性または発現を減少することのできる任意の分子を意味する。前記阻害剤は、小分子、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドであり得るが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、前記阻害剤はアプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドである。特に、γおよびμ１サブユニットの阻害剤が好ましい。
【００２８】
用語「小分子」は、１，０００ダルトン未満の分子、特に有機または無機化合物をいう。
【００２９】
ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットのためのいくつかのネガティブドミナントペプチドがすでに記載されている。特に、μ１サブユニットのネガティブドミナント突然変異体は、チロシンと結合するポケットに突然変異を導入することによって得られ、そしてWonderlich et al. (2008, J. Biol. Chem., vol. 283, 3011-3022)に記載されている。
【００３０】
前記阻害剤は、ＡＰ−１のサブユニットの１つの特異的抗体であり得る。これらの抗体のいくつか、例えばγサブユニットまたはβ１サブユニットの特異的抗体(Sigma-Aldrich)は市販されている。
【００３１】
本出願において、阻害剤はまた、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットが、複合体の他のサブユニットに結合するのを減少または防ぐことのできる任意の分子、すなわち、ＡＰ−１複合体の形成を減少または防ぐことのできる任意の分子も意味する。例えば、阻害性分子は、ＡＰ−１のサブユニットの１つに結合されて、前記のサブユニットが、ＡＰ１の他のサブユニットの１つ以上に結合するのを防ぐコンフォメーション変化を引き起こすことができ、これによりＡＰ−１複合体の形成を遮断することができる。それはまた、サブユニット間の相互作用のドメインを遮蔽することもできる。
【００３２】
本発明の好ましい態様において、ＡＰ−１アダプター複合体の阻害剤は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、このタンパク質の発現を減少または抑制できる配列を含むまたはからなる核酸である。このような核酸は、より十分に以下に詳述されている。
【００３３】
本発明の第三の好ましい態様において、前記阻害剤は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシン、特にキネシンＫｉｆ１３Ａとの間の相互作用の阻害剤である。本発明は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用の任意のタイプの阻害剤に関する。好ましくは、キネシンはＫｉｆ１３Ａである。好ましくは、ＡＰ−１のサブユニットはβ１サブユニットである。キネシンＫｉｆ１３Ａの尾部は、ＡＰ−１複合体のβ１サブユニットと相互作用する(Nakagawa et al., 2000)。前記阻害剤は、キネシンとＡＰ−１複合体との間の相互作用を減少または抑制することができる任意の分子であり得る。前記阻害剤は、小分子、アプタマーまたは抗体であり得るが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、前記阻害剤は、Ｋｉｆ１３Ａと相互作用するβ１サブユニットのドメインに対して、またはβ１サブユニットと相互作用するキネシンＫｉｆ１３Ａの尾部のドメインに対する抗体である。前記抗体は分子のどれか一方に結合し、これにより、Ｋｉｆ１３ＡとＡＰ−１複合体の間の相互作用を遮断する。さらに、前記阻害剤はまた、Ｋｉｆ１３Ａと相互作用するβ１サブユニットのドメインまたはβ１サブユニットと相互作用するキネシンＫｉｆ１３Ａの尾部のドメインを再現するデコイであり得、このデコイが、これらの２つの要素の間の相互作用においてＫｉｆ１３ＡまたはＡＰ−１と競合する。
【００３４】
本発明に使用したような用語「抗体」は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組換え抗体およびその断片を含む。抗体断片は、例えば、Ｆ(ａｂ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはｓＦｖ断片を意味する。特定の態様において、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＭであり得る。抗体を産生するための方法は、当業者に周知である。
【００３５】
ここで使用したような用語「アプタマー」は、ＡＰ−１複合体のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａに特異的に結合することのできる核酸またはペプチドの分子を意味する。好ましい態様において、アプタマーは、５〜１２０ヌクレオチドを一般的に含む、核酸、好ましくはＲＮＡである(Osborne et al., 1997)。それらは、インビトロで、ＳＥＬＥＸ(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)として知られるプロセスに従って選択されることができる。
【００３６】
本明細書において、用語「核酸」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は、同義語として使用され、そしてデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドの配列をいう。
【００３７】
本文書で使用した用語「ｉＲＮＡ」または「干渉ＲＮＡ」は、特定のメッセンジャーＲＮＡと干渉し、これによりその分解またはタンパク質へのその翻訳の減少をもたらす、一本鎖または二本鎖の任意のＲＮＡをいう。この用語は、小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ)、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡに指向するｉＲＮＡ（ｄｄｉＲＮＡ）およびミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。
【００３８】
本文書において、用語「ハイブリダイズ」は、ワトソン・クリック水素結合が相補的な塩基の間で２本の核酸鎖に対して確立されて二本鎖を形成できることを意味する。本文書において、用語「特異的にハイブリダイゼーションできる」は、本発明に従って使用される核酸が、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする遺伝子または転写物と高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションできることを意味する。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、文献に、例えばSambrook et al., (1989)、Maniatis et al., (1982またはその近年の刊行物の１つ)およびAusubel et al., (1995)に広く記載されており、これらの条件は、適切な公知の技術に従って、ヌクレオチド断片のサイズに従って当業者により適合されることができる。純粋に説明するために、高度にストリンジェントな条件は有利には以下の通りである。２本の鎖（特にＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ）の間のハイブリダイゼーションは、２段階で行なわれる：（ａ）５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムに相当する）、５０％ホルムアミド、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート液、５％硫酸デキストランおよび１％サケ精子ＤＮＡを含むリン酸緩衝液（２０mm、ｐＨ７．５）中で４２℃で３時間プレハイブリダイゼーション；（ｂ）プローブのサイズに依存した温度で（例えば、１００ヌクレオチドを超えるサイズのプローブでは４２℃）２０時間ハイブリダイゼーションし、その後、２×ＳＳＣ／２％ＳＤＳ溶液を用いて２０℃で２０分間の洗浄を２回、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液を用いて２０℃で２０分間の洗浄を１回。最後の洗浄は、１００ヌクレオチドより長いプローブでは０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ溶液を用いて６０℃で３０分間行なわれる。
【００３９】
本発明の脈絡の中で、用語「ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする遺伝子」は、ＡＰ−１のγ、β１、σ１およびμ１サブユニットの１つ、またはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａをコードするゲノム配列を示すために使用される。この用語は、遺伝子の５’非コード領域（この領域は開始コドンを含む）、コード領域、および３’非コード領域を含む。用語「ＡＰ−１のサブユニットをコードする遺伝子」は、ＡＰ−１のγ、β１、σ１およびμ１サブユニットの１つをコードするゲノム配列を示すために使用される。この用語は、遺伝子の５’非コード領域（この領域は開始コドンを含む）、コード領域、および３’非コード領域を含む。用語「ＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする遺伝子」は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａをコードするゲノム配列を示すために使用される。この用語は、遺伝子の５’非コード領域（この領域は開始コドンを含む）、コード領域、および３’非コード領域を含む。
【００４０】
本発明の範囲内で、用語「ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ１と相互作用するキネシンをコードするｍＲＮＡ」は、対応するタンパク質をコードする遺伝子の転写から生じたリボヌクレオチド配列を示すために使用される。この用語は、３’および５’非翻訳領域（３’−ＵＴＲおよび５’−ＵＴＲ）、エキソン、および場合により、スプライシングされていないイントロンを含む。用語「ＡＰ−１のサブユニットをコードするｍＲＮＡ」は、対応するタンパク質をコードする遺伝子の転写から生じたリボヌクレオチド配列を示すために使用される。用語「ＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードするｍＲＮＡ」は、対応するタンパク質をコードする遺伝子の転写から生じたリボヌクレオチド配列を示すために使用される。より特定すると、用語「キネシンＫｉｆ１３ＡをコードするｍＲＮＡ」は、キネシンＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子の転写から生じたリボヌクレオチド配列を示すために使用される。
【００４１】
ゲノム配列およびタンパク質は、GeneIDデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)におけるその番号によって同定することができる。従って、ＡＰ−１のγ、β１、σ１およびμ１サブユニットのGeneIDアクセッション番号は、それぞれ、GeneID164、GeneID162、GeneID1174、GeneID8907であり、ヒトキネシンＫｉｆ１３ＡのGeneIDアクセッション番号はGeneID63971である。
【００４２】
用語「メラニン（melanin）」、「メラニン（melanins）」および「メラニン色素」は、本明細書において同義語として使用される。それらはメラノソームで合成されるようである様々な色素を含み、これにはユーメラニンおよびフェオメラニンが含まれる。
【００４３】
本文書において、用語「薬学的組成物」は、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む本発明による組成物をいう。
【００４４】
本文書において、用語「化粧品組成物」は、化粧品的に許容される担体および／または賦形剤を含む本発明による組成物をいう。
【００４５】
用語「色素脱失剤」は、本明細書において、メラニン細胞においてメラニンの合成を阻害または減少でき、従って皮膚を明るくすることのできる活性薬剤をいう。
【００４６】
本発明による阻害剤は、メラニン細胞に導入されると、ＡＰ−１の１つ以上のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａの発現または活性の減少または抑制を誘導できるか、あるいは、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシン、特にキネシンＫｉｆ１３Ａとの相互作用の減少または抑制を誘導でき、その結果は、メラニン色素の合成の有意な減少である。
【００４７】
好ましい態様において、本発明に従って使用される核酸は、メラニン細胞に導入されると、ＡＰ−１の１つ以上のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａの発現の減少または抑制を誘導でき、その結果は、メラニン色素の合成の有意な下降である。特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、メラニン細胞に導入されると、ＡＰ−１の１つ以上のサブユニットの発現の減少または抑制を誘導でき、その結果は、メラニン色素の合成の有意な下降である。別の特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、メラニン細胞に導入されると、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１３Ａの発現の減少または抑制を誘導でき、その結果は、メラニン色素の合成の有意な下降である。これらの核酸は、転写または翻訳レベルで作用し得る。
【００４８】
発現の「減少」によって、例えば、遺伝子発現産物の３０％、５０％、７０％、８０％、９０％または９５％の減少を意味する。
【００４９】
本発明に従って使用される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであり得る。それらは一本鎖または二本鎖の形態またはその両方の混合物であり得る。それらは、場合により、少なくとも１つの修飾されたまたは非天然のヌクレオチド、例えば、修飾された塩基を含むヌクレオチド、例えばイノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジンまたはハイブリダイゼーションを可能とする任意の他の修飾された塩基を含み得る。本発明に従って使用される核酸はまた、ヌクレオチド間結合のレベルで、例えばホスホロチオエート、Ｈ−ホスホネートまたはアルキル−ホスホネート、あるいは骨格のレベルで、例えばαオリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−アルキルリボースまたはＰＮＡ（ペプチド核酸）(M. Egholm et al., 1992)、修飾され得る。これらの核酸は、当業者に公知の全ての方法、例えば化学合成、ライブラリースクリーニング、インビボ転写、またはＤＮＡ組換えもしくは増幅技術によって調製することができる。
【００５０】
本発明の特定の態様において、核酸は、細胞に導入されると、細胞内の標的遺伝子の発現を阻害する干渉ＲＮＡ（ｄｄｉＲＮＡ）の産生を誘導するＤＮＡであり得る。この技術は、ＤＮＡ指向性干渉ＲＮＡとして当業者には公知である。
【００５１】
別の好ましい態様において、核酸は、ＲＮＡ、好ましくは干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）である。これらのＲＮＡは、天然、合成、または組換え技術によって産生され得る。それらはまた、例えば、ヌクレアーゼに対するその抵抗性を増加させ、よって細胞中でのその寿命を増加させることのできる修飾されたヌクレオチドまたは化学修飾を含み得る。ＲＮＡ干渉は、転写後レベルで標的遺伝子の発現を特異的に阻害することを可能とする当業者に周知の現象である。多くの特許および特許出願が、遺伝子発現を阻害するためのｉＲＮＡ分子の使用を記載し；例は、文書WO 99/32619、US 20040053876、US 20040102408およびWO 2004/007718を含む。好ましくはｉＲＮＡ分子は、約１５〜５０ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜３０ヌクレオチド長の二本鎖のｓｉＲＮＡ分子である。
【００５２】
本発明の代替的な態様において、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａの発現を減少または抑制するのに使用される核酸は、アンチセンス核酸である。特定の方法において、ＡＰ−１のサブユニットの発現を減少または抑制するのに使用される核酸は、アンチセンス核酸である。別の特定の方法において、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａの発現を減少または抑制するために使用される核酸は、アンチセンス核酸である。このアンチセンス核酸は、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードするセンス核酸の全てまたは一部に相補的であり得る。特定の方法において、アンチセンス核酸は、ＡＰ−１のサブユニットをコードするセンス核酸の全てまたは一部に相補的であり得る。別の特定の方法において、アンチセンス核酸は、ＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードするセンス核酸の全てまたは一部と相補的であり得る。それは、例えば、ｍＲＮＡに相補的であり得る。アンチセンス核酸は、一般に、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンの転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、古典的なワトソン・クリック相互作用によってこれらの転写物に選択的にハイブリダイゼーションする。特定の方法において、アンチセンス核酸は、一般に、ＡＰ−１のサブユニットの転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の特定の方法において、アンチセンス核酸は、一般に、ＡＰ−１と相互作用するキネシンの転写物の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス阻害性核酸は、ＡＰ−１のγ、β１、σ１およびμ１サブユニットをコードするまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする転写物に結合し、そして例えば、ｍＲＮＡの場合には対象の転写物の５’末端において細胞翻訳機序へのアクセスを遮断し、タンパク質へのその翻訳を妨害し、インビボにおいて対象の転写物の発現の抑制を可能とすることができる(Kumar et al., 1993)。特定の方法において、アンチセンス阻害性核酸は、ＡＰ−１のγ、β１、σ１およびμ１サブユニットをコードする遺伝子の転写物に結合することができる。別の特定の方法において、アンチセンス阻害性核酸は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子の転写物に結合することができる。このようなポリヌクレオチドは、例えば、特許EP 0092574に記載されている。好ましくは、アンチセンス核酸は、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３ＡをコードするｍＲＮＡに相補的である。特定の方法において、アンチセンス核酸は、ＡＰ−１のサブユニットをコードするｍＲＮＡと相補的である。別の特定の方法において、アンチセンス核酸は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３ＡをコードするｍＲＮＡと相補的である。阻害性核酸がアンチセンス型である場合、対象の転写物をコードする配列の全てまたは一部、あるいは３’または５’非コード配列の全てまたは一部を網羅することができる。好ましくは、アンチセンス阻害性核酸は、リボソーム結合配列および翻訳開始配列と相補的である。阻害性核酸は、一般に、少なくとも１０リボヌクレオチド、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０リボヌクレオチド長、好ましくは１５〜３０リボヌクレオチド長の長さを有する。
【００５３】
本発明に従って使用されるアンチセンス核酸は、化学合成法によって、または当業者に公知の組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡは、特に、化学的に合成できるか、鎖状の鋳型（例えばＰＣＲによって）または環状の鋳型（例えばウイルスまたは非ウイルスベクター由来）のインビトロでの転写によって産生されるか、またはウイルス性もしくは非ウイルス性ベクターからインビボでの転写によって産生することができる。アンチセンス核酸を、その安定性、ヌクレアーゼに対するその抵抗性、その特異性またはその薬理学的特性を高めるために修飾することができる。例えば、アンチセンス核酸は、センス核酸とアンチセンス核酸の間に形成された二本鎖の安定性を高めるために使用される修飾されたヌクレオチドを含むことができる。
【００５４】
別の態様において、阻害性核酸はリボザイムである。リボザイムは、リボヌクレアーゼ活性を有し、従って、それらが相補的であるｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断できる触媒ＲＮＡ分子である。ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする転写物の特定のリボザイムを、当業者に周知の方法に従って設計、合成および産生することができる(例えば、Fanning and Symonds, 2006を参照)。リボザイムは一般的に２つの異なる領域を有する。対象の転写物、ＡＰ−１のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシンをコードする遺伝子の転写物に対してある特異性を有する第一領域（従って、後者ＡＰ−１に結合できる）、一方で、第二領域は、リボザイム上に、対象の転写物の切断、ライゲーションおよびスプライシングのその触媒活性を付与する。特定の方法において、第一領域は、対象の転写物、ＡＰ−１のサブユニットをコードする遺伝子の転写物にある特異性を有する。別の特定の方法において、第一領域は、対象の転写物、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子の転写物にある特異性を有する。様々なタイプのリボザイム、例えばハンマーヘッドリボザイムまたは環状リボザイム、ヘアピンリボザイムまたはラッソ（lasso）リボザイムなどを使用することができる。
【００５５】
本発明に従って使用する干渉ＲＮＡまたはアンチセンス核酸を、それらをコードする前駆体またはＤＮＡ分子の形態で投与することができる。
【００５６】
本発明に従って使用される核酸は、一般に、１５〜５０ヌクレオチドの長さ、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド長を有する。
【００５７】
本発明において、核酸は、ＡＰ−１複合体のサブユニットまたはＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子または転写物に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。１つの態様において、核酸は、ＡＰ−１複合体のサブユニットをコードする遺伝子または転写物に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。別の態様において、核酸は、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子または転写物に特異的にハイブリダイゼーションすることができる。それにも関わらず、本発明による核酸は、特異的にハイブリダイゼーションするために標的配列と１００％の相補性を有する必要はない。特に、少なくとも約９０％に等しい相補度を有する核酸が、特異的にハイブリダイゼーションすることができる。好ましくは、本発明の核酸と標的配列の間の相補度は、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％に等しい。
【００５８】
好ましい態様において、本発明に従って使用される核酸は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはキネシンＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションできる１つ以上の配列を含むまたはからなる。好ましくは、核酸は、配列番号１〜６および１１〜２４の配列間で選択された１つ以上の配列を含むまたはからなる。特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションできる１つ以上の配列を含むまたはからなる。好ましくは、核酸は、配列番号５、６および１１〜２４の配列間で選択された１つ以上の配列を含むまたはからなる。より好ましくは、核酸は、ＡＰ−１のμ１Ａまたはγ−アダプチンサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションできる１つ以上の配列を含むまたはからなる。別の特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、キネシンＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションできる１つ以上の配列を含むまたはからなる。好ましくは、核酸は、配列番号１〜４の配列間で選択された１つ以上の配列を含むまたはからなる。
【００５９】
特に好ましい態様において、本発明に従って使用される核酸は、以下の対の１つによって形成された二本鎖干渉ＲＮＡの分子を含むまたはからなる：配列番号１および２、配列番号３および４、配列番号５および６、配列番号１１および１２、配列番号１３および１４、配列番号１５および１６、配列番号１７および１８、配列番号１９および２０、配列番号２１および２２、並びに配列番号２３および２４。特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、以下の対の１つによって形成された二本鎖干渉ＲＮＡの分子を含むまたはからなる：配列番号１および２、並びに配列番号３および４。別の特定の態様において、本発明に従って使用される核酸は、以下の対の１つによって形成された二本鎖干渉ＲＮＡの分子を含むまたはからなる：配列番号５および６、配列番号１１および１２、配列番号１３および１４、配列番号１５および１６、配列番号１７および１８、配列番号１９および２０、配列番号２１および２２、並びに配列番号２３および２４。
【００６０】
本発明は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの少なくとも１つの阻害剤、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａの阻害剤、またはＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンの間の相互作用の阻害剤、特に本出願で定義したような任意の阻害剤を含む、薬学的または化粧品組成物に関する。
【００６１】
好ましい態様において、本発明は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニット、またはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のようにこのタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含むまたはからなる少なくとも１つの核酸を特に含む、薬学的または化粧品組成物に関する。特定の態様において、薬学的または化粧品組成物は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のようにこのタンパク質の発現を減少または抑制することのできる配列を含むまたはからなる少なくとも１つの核酸を含む。別の特定の態様において、薬学的または化粧品組成物は、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシンをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のように、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含むまたはからなる少なくとも１つの核酸を含む。好ましくは、キネシンはキネシンＫｉｆ１３Ａである。
【００６２】
好ましい態様において、前記組成物は、その製剤が局所投与に適合された薬学的または化粧品組成物である。組成物中に使用される阻害剤は、有効量で存在する。使用する阻害剤のタイプにより、有効量は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａの発現または活性を減少または抑制するか、あるいは、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用を減少または抑制する量である。
【００６３】
好ましい態様によると、阻害剤が核酸である場合、組成物中に使用される核酸は、有効量で、例えば、組成物の全重量の０．００００１％〜１０％、好ましくは０．０００３％〜３％（ｗ/ｗ）の範囲で存在する。
【００６４】
本出願で使用したような用語「有効量」は、メラニン合成の有意な減少を可能とする、本発明に従って使用される阻害剤の量である。好ましい態様において、本出願で使用される用語「有効量」は、メラニン合成の有意な減少を可能とする本発明に従って使用される核酸の量である。この減少は、特に、皮膚の色の可視的変化を引き起こし得る。この減少は、例えば、非処理細胞に存在するメラニンの量の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％であり得る。それは、実施例に記載または当業者に公知の方法の１つによって測定することができる。
【００６５】
本発明による組成物は、同一または異なるタイプおよび同一または異なる標的を有するいくつかの阻害剤を含み得る。それは、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤、またはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａの阻害剤、またはＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用の阻害剤を含み得る。それは、類似した性質（例えば核酸のみ）または異なる性質（例えばアプタマー、抗体および／または核酸）の阻害剤を含み得る。好ましい態様において、この組成物は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニット、またはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のように、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含む、いくつかの核酸を含み得る。それはまた、ＡＰ−１の同じサブユニット、またはＡＰ−１の異なるサブユニット、またはＡＰ−１と相互作用する同じキネシン、またはＡＰ−１と相互作用する異なるキネシンを標的化する、いくつかの阻害性核酸の組合せを含み得る。特定の態様において、前記組成物は、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のように、このタンパク質の発現を減少または抑制できる、配列を含む、いくつかの核酸を含み得る。それはまた、ＡＰ−１の同じサブユニット、またはＡＰ−１の異なるサブユニットを標的化するいくつかの阻害性核酸の組合せも含み得る。別の特定の態様において、前記組成物は、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、本出願に記載のように、このタンパク質の発現を減少または抑制することができる、配列を含む、いくつかの核酸を含み得る。それはまた、ＡＰ−１と相互作用する同じキネシン、またはＡＰ−１と相互作用する異なるキネシンを標的化する、いくつかの阻害性核酸の組合せも含み得る。
【００６６】
本発明による組成物は、さらに、所望の効果を強化することを目的とした追加の活性物質、例えば、エラク酸；アルブチン；レゾルシノール；ビタミンＣ；パントテネート；コウジ酸；胎盤抽出物；メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、そのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）と直接的にまたは間接的に干渉する分子；ポリオール、例えばグリセリン、グリコールまたはプロピレングリコール；ビタミン；角質溶解剤および／または剥離剤、例えばサリチル酸；α−ヒドロキシ酸、例えば乳酸またはリンゴ酸；アスコルビン酸；レチノイン酸；レチンアルデヒド；レチノール；パルミテート、プロピオネートまたはアセテート；抗糖化剤および／または抗酸化剤、例えばトコフェロール、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミンピロホスフェート、ピリドキサミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシン、アデノシントリホスフェート；抗炎症剤；鎮静剤およびその混合物；化学的または物理的な太陽フィルターおよびデオキシリボ核酸またはリボ核酸、およびその誘導体を含み得る。
【００６７】
本発明による組成物は、局所適用に通常使用される任意の生薬形態、特に含水アルコール水溶液または油溶液、水中油滴型または油中水滴型または複合エマルション、水性または油性ゲル、液体、ペースト状または固体状の無水生成物、ナノスフィアおよびナノカプセルなどのポリマー相中の油分散液、またはフランス特許FR 2534487に記載のような良好なイオン性および／または非イオン性脂質小胞の形態で生じ得る。
【００６８】
特に、本発明による組成物は、リポソームに封入された、特許出願に記載された、少なくとも１つの阻害剤、好ましくは阻害性核酸を含むことができる。
【００６９】
本発明によると、「リポソーム」は、人工的に製造され、リン脂質層からなり、互いに水性区画によって分離された小胞を意味する。それらは細胞膜の構造と非常に近い構造を有し、これにより、それらが含む活性成分を放出しながらそれらと合体することができる。本発明により使用されるリポソームは、多重膜リポソームまたはＭＬＶ（多重膜小胞）、小さな一枚膜リポソームまたはＳＵＶ（小さな一枚膜小胞）、あるいは大きな一枚膜リポソームまたはＬＵＶ（大きな一枚膜小胞）であり得る。リポソームはまた、壁がリン脂質からなっているのではなく、むしろ非イオン性脂質からなっている非イオン性リポソームでもあり得る。
【００７０】
本発明による組成物は、ほぼ液体であり得、白色または着色したクリーム、ポマード、ミルク、ローション、セラム、ペーストまたは発泡体の外見を有する。場合により、エアゾールの形態で皮膚に適用することができる。それはまた、固体形態、粉状、または粉状ではない、例えば棒形態でも提供され得る。それはさらに、顔または手の円形の小さな領域上に局所適用するための、パッチ、ペンシル、ブラシ、およびアプリケーターとして提供され得る。それは、皮膚ケア製品および／またはメーキャップ製品として使用することができる。
【００７１】
期待されるように、本発明による組成物はまた、皮膚科学および化粧品の分野における通常の補助剤、例えば、親水性または親油性ゲル化剤、親水性または親油性活性成分、保存剤、抗酸化剤、溶媒、香料、添加物、フィルター、色素、消臭剤および着色剤も含むことができる。これらの様々な補助剤の量は、関連分野で古典的に使用されている量である。これらの補助剤は、その性質に従って、油相、水相、脂質小胞および／またはナノ粒子に導入することができる。
【００７２】
本発明の化粧品または皮膚科学的組成物がエマルションである場合、油相の比率は、組成物の全重量に比較して、５重量％〜８０重量％、好ましくは５重量％〜５０重量％の範囲であり得る。組成物中にエマルションの形態で使用される油、乳化剤および共乳化剤は、関連分野で古典的に使用されるものから選択される。乳化剤および共乳化剤は、組成物の全重量に比較して、０．３重量％〜３０重量％、好ましくは０．５重量％〜２０重量％の範囲の比率で組成物中に存在する。
【００７３】
本発明による阻害剤と、特に本発明による核酸と組み合わせて使用できる油の例は、鉱物油、例えば石油ゼリー；植物起源の油、例えばアボカド油または大豆油；動物起源の油、例えばラノリン；合成油、例えばペルヒドロスクアラン；シリコーン油、例えばシクロメチコンおよびフッ素化油、例えばパーフルオロポリエーテルを含む。脂肪物質として有用なのはまた、脂肪アルコール、例えばセチルアルコール、脂肪酸またはワックス、例えばカルナバワックスまたはオゾケライトである。
【００７４】
本発明による核酸と組み合わせて使用できる乳化剤および共乳化剤の例は、脂肪酸とポリエチレングリコールのエステル、例えばＰＥＧ−２０ステアレート、および脂肪酸とグリセリンのエステル、例えばグリセリルステアレートを含む。
【００７５】
本発明による阻害剤、特に核酸と組み合わせて使用できる親水性ゲル化剤の例は、カルボキシビニルポリマー（カルボマー）、アクリルコポリマー、例えばアクリレート／アルキルアクリレートコポリマー、ポリアクリルアミド、ポリサッカリド、天然ゴムおよびクレーを含む。親油性ゲル化剤として、例えば、修飾されたクレー、例えばベントン、脂肪酸の金属塩、疎水性シリカまたはポリエチレンを使用することができる。
【００７６】
本発明はさらに、化粧品剤としての本発明による組成物の使用に関する。好ましい態様において、化粧品剤は色素脱失剤である。
【００７７】
本発明は、色素性疾患の処置に使用するための、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの少なくとも１つの阻害剤、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシンの阻害剤、特にＫｉｆ１１３Ａの阻害剤、またはＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体と、ＡＰ−１複合体と相互作用するキネシンとの間の相互作用の阻害剤を含む、薬学的または化粧品組成物に関する。特定の態様によると、前記阻害剤は、小分子、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドであり得るが、これらに限定されるわけではない。
【００７８】
好ましい態様において、本発明は、色素性疾患の処置のための、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードまたはＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａ、をコードする遺伝子またはｍＲＮＡに特異的にハイブリダイゼーションでき、そしてこのタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含む少なくとも１つの核酸を含む薬学的組成物に関する。特定の方法において、本発明は、色素性疾患の処置のための、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、そしてこのタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含む少なくとも１つの核酸を含む薬学的組成物に関する。別の特定の方法において、本発明は、色素性疾患の処置のための、ＡＰ−１アダプター複合体と相互作用するキネシン、特にＫｉｆ１１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、そしてこのタンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含む少なくとも１つの核酸を含む薬学的組成物に関する。
【００７９】
本発明はまた、色素性疾患を処置または予防するための薬物の調製のための、本発明による薬学的組成物の使用に関する。
【００８０】
本発明はまた、本発明による化粧品または薬学的組成物を、色素脱失しようとする皮膚に適用することからなる、ヒト皮膚を色素脱失および／または漂白する化粧品的または薬学的方法、あるいは、色素性疾患の処置または予防を主題として有する。
【００８１】
処置しようとする色素性疾患は、色素沈着過剰または色素沈着低下症であり得る。局所的な色素沈着過剰は、あるメラニン細胞の障害から生じ得、そしてメラニンの蓄積によって特徴づけられる。処置しようとする色素性疾患は、色素沈着過剰、例えば特発性肝斑（妊娠または経口避妊薬の摂取に関連していない）、肝斑（また褐色斑または妊娠性肝斑とも呼ばれる）、光線性黒子（老人性黒子、老人性斑点、日光性斑点、加齢性斑点または黒子とも呼ばれる）、ざ瘡による色素性後遺症、擦過傷、火傷、瘢痕、皮膚症および／または接触性アレルギーに起因する炎症性色素沈着、イナゴツナギ皮膚炎、ツタウルシに起因する色素沈着、そばかす、母斑、例えば先天性巨大母斑、ベッカー母斑またはスピッツ母斑であり得る。色素沈着過剰は、遺伝的に決定できるか、または代謝起源または薬物関連起源のものであり得る。それらは、偶然に、例えば光増感または病変後の瘢痕によって引き起こされ得る。色素性疾患はまた、色素沈着低下症、例えば白斑としても表現され得る。好ましい態様において、処置しようとする色素性疾患は色素沈着過剰である。好ましくは、色素沈着過剰は、肝斑、特発性肝斑または老人性黒子である。
【００８２】
色素沈着過剰の場合、処置の目的は、色素沈着過剰領域を色素脱失し、従って、これらの特異的な色素性疾患に関連した可視的な症状を減少または抑制することである。
【００８３】
色素沈着低下症の場合、処置の目的は、残りの色素性領域を色素脱失することによって皮膚の色を標準化することであり得る。
【００８４】
予防の目的は、色素沈着過剰の場合、色素沈着過剰領域の出現を回避し、色素沈着低下症の場合、皮膚の色の不均衡の出現を回避することである。
【００８５】
以下の実施例は、説明として提示され、限定するものではない。
【００８６】
実施例
材料および方法
細胞、抗体および試薬
ヒトメラニン細胞の細胞株ＭＮＴ−１を、以前に記載されているように(Raposo et al., 2001)培養液中に維持する。
【００８７】
この実施例で使用した抗体を以下に列挙する：
− 抗β−チューブリンウサギポリクローナル抗体(ab6046, Abcam（登録商標））
− ウサギ抗μ１Ａ（ＡＰ−１のサブユニット）ポリクローナル抗体(Dr. Linton Traub, University of Pittsburg)；
− マウス抗γ−アダプチンモノクローナル抗体（クローン100/3；SIGMA（登録商標））；
− 培養液ＴＡ９９（Ｍｅｌ−５）(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Manassas、VA、USA)の上清から得られたマウス抗Ｔｙｒｐ１モノクローナル抗体（チロシナーゼ関連タンパク質−１）；
− 抗チロシナーゼポリクローナル抗体(ab15175, Abcam（登録商標））；
− 抗Ｐｍｅｌ１７モノクローナル抗体(HMB50, Labvision（登録商標）)；
− ウサギ抗Ｋｉｆ１３Ａポリクローナル抗体(Bethyl Laboratories, Montgomery, USA)；
− ウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体(Jackson Immunoresearch（登録商標）)；および
− テキサスレッドと結合させたウサギ抗マウス抗体(Invitrogen（登録商標）)。
【００８８】
この実施例で使用した抗体以外の試薬を以下に列挙する：
− コロイド状金粒子に結合したプロテインＡ（ユトレヒト大学細胞顕微鏡センター、オランダ）；
− プロテインＧアガロース（Invitrogen（登録商標）、カタログ参照15920-010)；
− NuPAGE Bis-Tris 4-12%ゲル、NuPAGE 3-8% トリス−アセテートゲル、MES-SDS移動および転写緩衝液を含む、ウェスタンブロット用のキット(Invitrogen（登録商標）)；
− ＰＶＤＦメンブラン(Millipore（登録商標）)上でＨＲＰ活性を可視化するための、ＥＣＬキット「ウェスタンブロッティング検出試薬」(Amersham（登録商標）)；
− パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）(Sigma（登録商標）)；
− サポニン（(Carlo Erba Reagents（登録商標）)；および
− 蛍光顕微鏡カバーガラスをのせるためのＤＡＰＩを含む「ProLong（登録商標） Gold Antifade Reagent」媒体。
【００８９】
干渉ＲＮＡ配列
【表１】
【００９０】
ＲＮＡ干渉
１×１０６個の細胞を、２日間、１０cmの培養皿に接種し、その後、予め加熱したＰＢＳで２回洗浄し、その後、インキュベーター中の４mlのOptiMem培地(Invitrogen（登録商標）)で４０分間培養した。
【００９１】
１０μｌの２０μM ｓｉＲＮＡを８４０μlのOptiMem培地と混合し、この混合物を２０分間室温でインキュベートすることによって溶液Ａを得た。５０μlのオリゴフェクタミン（登録商標）(Invitrogen（登録商標）)を１５０μlのOptiMem培地と混合し、この混合物を２０分間室温でインキュベートすることによって溶液Ｂを得た。
【００９２】
その後、溶液ＡおよびＢを混合し、２０分間室温で放置した。その後、この混合物を、インキュベーター中で４時間保持していた細胞上にのせた。その後、４０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を有する５mlの完全培地を細胞に加えた。２４時間後、細胞を回収し、１．５×１０５細胞/ウェルの濃度で６ウェルプレートに接種した。この同じプロトコルを、容量を適合させることによって次の日も繰り返した。
【００９３】
ウェスタンブロット
ＲＮＡ干渉後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後、氷上で１ウェルあたり２００μlの溶解緩衝液（５０mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、１％トリトン、１％プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ８）と共に１５分間インキュベートした。その後、細胞を剥がし、遠心分離にかけ（１５，０００rpm、４℃）、そして上清を回収した。全タンパク質の量を、ＢＣＡプロテインアッセイキット(Pierce（登録商標）)によって測定した。１０mgの各上清をゲル上にのせ、２００Ｖで３５分間泳動を行なった。その後、ゲルを、３０Ｖで１時間かけてＰＶＤＦメンブラン(Millipore（登録商標）)に転写した。その後、メンブランを、ＰＢＳ/０．１％Tween/５％ＢＳＡ緩衝液を用いて１時間室温で飽和させ、ＷＢ緩衝液（ＰＢＳ/０．１％Tween）中で希釈した一次抗体と共に４５分間インキュベートし、ＷＢ緩衝液で１０分間３回濯ぎ、ＷＢ緩衝液中で希釈したＨＲＰと結合させた対応する二次抗体と共に４５分間インキュベートし、ＷＢ緩衝液中で１０分間３回濯いだ。その後、ＨＲＰ活性を、ＥＣＬキット（ウェスタンブロット検出試薬）(Amersham（登録商標）)を使用して明らかにした。
【００９４】
蛍光顕微鏡
カバーガラス上に予め接種した細胞（０．５×１０５個の細胞/カバーガラス）を、予め加熱したＰＢＳで２回洗浄し、その後、ＰＢＳ/４％ＰＦＡ溶液で１０分間かけて固定した。ＰＢＳを用いて室温で２回洗浄した後、反応しなかった過剰ＰＦＡを、５０mMグリシン/ＰＢＳを用いて１０分間処理することによって中和した。その後、非特異的結合部位を、２mg/mlＢＳＡを補充したＰＢＳで３分間の洗浄を２回することによって飽和させ、細胞を、透過緩衝液（ＰＢＳ/２％ＢＳＡ/０．０５％サポニン）を用いて透過化した。その後、カバーガラスを、透過緩衝液で希釈した２５μlの一次抗体と４５分間室温で接触させておき、そして過剰の抗体を、透過緩衝液を用いて３分間の洗浄を２回することによって排除した。その後、カバーガラスを、透過緩衝液で希釈した２５μlの二次抗体と共に４５分間室温でインキュベートした。
【００９５】
透過緩衝液で３分間の洗浄を２回行ない、続いてＰＢＳで１回洗浄した後、カバーガラスを、１５μlの封入培地(ProLong（登録商標） Gold Antifade Reagent with DAPI、Invitrogen（登録商標）)と共に顕微鏡スライドにのせ、観察時における蛍光の消失を減弱させた。
【００９６】
免疫沈降
メラニン細胞を、コンフルエントになるまで７５cm２のフラスコ中で培養し、その後、溶解緩衝液（５０mMトリス、１５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＥＤＴＡ、１％トリトン、１％プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．３）を用いて２０分間４℃で溶解した。その後、細胞を剥がし、そして遠心分離（１５，０００rpm、４℃）にかけ、そして上清を収集した。プロテインＧアガロースと結合させたビーズを溶解緩衝液中で洗浄し、これらのビーズの２０mlを、回転下で１時間かけて４℃で溶解液と共にインキュベートした。その後、溶解液を４，０００rpmで遠心分離にかけ、そして上清を収集し、その後、１μgウサギ抗体（Ｋｉｆ１３Ａ対照）またはマウス抗ＣＤ９抗体（ＡＰ−１γ−アダプチン対照）と共に１時間かけて予めインキュベートしておいた洗浄したビーズと共にインキュベートした。その後、溶解液を４，０００rpmで遠心分離にかけ、そして、上清を、１μgのウサギ抗体（Ｋｉｆ１３ａ対照）、抗Ｋｉｆ１３ａ抗体（Ｋｉｆ１３ａ）、マウス抗ＣＤ９抗体（ＡＰ−１γ−アダプチン対照）またはマウス抗γ−アダプチン抗体（ＡＰ−１ γ−アダプチン）と共に２時間かけて４℃で回転下で予めインキュベートしておいた洗浄したビーズ２０μlと接触させておくことによって免疫沈降を行なう。その後、溶解液を４，０００rpmで遠心分離にかけ、上清を収集し、そしてウェスタンブロット解析のためにゲル上にのせた。
【００９７】
電子顕微鏡
６ウェルプレートに予め接種し、「対照」ｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３ＡまたはｓｉＲＮＡ−μ１Ａで処理したメラニン細胞を、０．２Ｍ ｐＨ７．４リン酸緩衝液中で４時間かけて室温で、２％ＰＦＡの混合物および２％グルタルアルデヒドの混合物（従来型顕微鏡）または２％ＰＦＡと０．５％グルタルアルデヒドの混合物（免疫染色）のいずれかを用いて固定した。
【００９８】
従来型顕微鏡：０．２Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中で数回洗浄した後、細胞を、２％オスミウム酸（ＯｓＯ４）溶液を用いて４５分間かけて固定した。蒸留水で濯いだ後、細胞を、漸増濃度のエタノールを用いて脱水し、その後、Epon 812樹脂で覆った。４８時間かけて６０℃で重合した後、超微細片を採取し、５分間かけて４％酢酸ウラニルを用いて対比し、その後、電子顕微鏡(Philips CM120, FEI Company（登録商標）)下で観察した。KeenViewカメラ(SIS（登録商標）、ドイツ)を用いて画像を撮影した。
【００９９】
免疫染色：０．１Ｍグリシンを含む０．２Ｍリン酸緩衝液中で数回洗浄した後、細胞を、Raposo et al. (1997)による文書で以前に記載のように凍結超薄切片法用に調製した。
【０１００】
簡潔には、細胞ペレットを最初に１０％ゼラチンで覆った。４℃で凝固させた後、１mm３の塊を切り、２時間かけて２．３Ｍスクロース中に注入した。細胞の塊をその支持体上で凍結させ、超微細凍結切片を、凍結超薄切片作成装置(Leica（登録商標）、オーストリア)を用いて作成した。電子顕微鏡グリッド上に回収した切片を、抗Ｔｙｒｐ１および抗Ｐｍｅｌ１７抗体を用いて免疫染色した。これらの抗体を、コロイド状金粒子に結合させたプロテインＡを用いて可視化した。切片を対比させ、酢酸ウラニルとメチルセルロースの混合物中で覆い、その後、電子顕微鏡(Philips CM120, FEI Company（登録商標）)下で観察した。KeenViewカメラ(SIS（登録商標）、ドイツ)で画像を撮影した。
【０１０１】
メラニンの定量
ＲＮＡ干渉後、細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、１５０μlのメラニン緩衝液（５０mMトリス、２mM ＥＤＴＡ、１５０mM ＮａＣｌ、１％プロテアーゼ阻害剤、ｐＨ７．４）と共にインキュベートした。その後、それらを剥がし、１つの画分に収集し、その後、２０秒間最大強度で超音波をあてた。その後、１０μlを採取し、タンパク質を定量し（BCAプロテインアッセイキットを用いて、Pierce)、そして２００μgのタンパク質を採取し、１５，０００rpmで１５分間かけて４℃で遠心分離にかけた。上清を排除し、ペレットを５００μlのエタノール／エーテル（１：１）溶液で洗浄した。最後に、ペレットを、２３０μlの２Ｍ ＮａＯｈ/２０％ＤＭＳＯ溶液を用いて５５℃で可溶化した。一旦可溶化すると、２００μlを採取して、４９２nmにおける吸光度を測定した。
【０１０２】
白い細胞の定量
定量は、免疫蛍光のために調製した細胞上で落射蛍光顕微鏡を使用して行なった。細胞を位相差で観察し、そして色素化された成熟メラノソームの存在（黒）または非存在（白）を定量した。
【０１０３】
実施例１
ｓｉＲＮＡ−ＡＰ−１（μ１Ａ）、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３ＡおよびｓｉＲＮＡ−ＡＰ−３（β３Ａ）でトランスフェクトされたメラニン細胞の細胞溶解液のウェスタンブロット実験により、Ｋｉｆ１３Ａの発現は、ＡＰ−１またはＡＰ−３の不活性化によって破壊されないことを示すことができた（図１Ａ）。他方で、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞においては、Ｋｉｆ１３Ａの発現が完全に抑制され（図１Ａおよび１Ｃ）、一方で、ＡＰ−１のμ１Ａサブユニットの発現は破壊されなかった。従って、これらの結果は、メラニン細胞においてこのタンパク質を不活性化するｓｉＲＮＡの効力および特異性を示す。
【０１０４】
さらに、メラニン細胞において行なわれた免疫沈降実験は、Ｋｉｆ１３Ａタンパク質が、γ−アダプチンＡＰ−１サブユニットと共沈降すること、そして、従って非メラニン細胞株で以前に観察されたＫｉｆ１３ＡとＡＰ−１の間の相互作用(Nakagawa et al., 2000)がメラニン細胞の細胞株においても存在する（図１Ｂ）ことを示すことができた。
【０１０５】
ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞中に存在する量と比較した、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞中のメラニンの相対量を、４９２nmの波長における細胞溶解液の吸光度の測定によって決定した（図２）。図２に提示される結果は、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａの使用が、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞と比較して、合成されたメラニンの量の約４０％の減少をもたらすことを可能とすることを示す。
【０１０６】
電子顕微鏡下での観察を、従来型の電子顕微鏡（図３）または抗Ｔｙｒｐ１抗体を用いた免疫染色（データは示さず）のいずれかで、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３ＡまたはｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞上で行なった。
【０１０７】
従来型電子顕微鏡の実験は、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞が、大量のメラニン（図３において黒で）を有する多くのメラノソームを含むことを示すことを可能とした。他方で、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞は全くまたは殆ど色素を含んでいなかった。
【０１０８】
ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞では、免疫染色により、Ｔｙｒｐ１タンパク質の濃縮された多くの成熟段階ＩＩＩまたはＩＶメラノソームが判明した。他方で、ｓｉＲＮＡ−Ｋｉｆ１３Ａでトランスフェクトされた細胞では、成熟メラノソームは見られず、Ｔｙｒｐ１酵素が、エンドソーム特徴を有する小胞構造中に分散されていた。
【０１０９】
従って、キネシンＫｉｆ１３Ａの不活性化は、プレメラノソームにおいてメラニン形成酵素の移動を妨害し、従って、これらの細胞小器官の成熟を遮断し、これにより結果としてメラニンの合成ができなくなる。
【０１１０】
結論
これらの実験によって得られた結果は最初に、特異的ｓｉＲＮＡの使用は、メラニン細胞におけるキネシンＫｉｆ１３Ａを不活性化することを観察することを可能とした。
【０１１１】
得られた結果はまた、キネシンＫｉｆ１３Ａの特異的ｓｉＲＮＡの使用が、
− メラニン細胞において産生されるメラニンの量、
− 色素化された成熟メラノソームを含むメラニン細胞の量、および
− メラニン細胞における成熟メラノソーム（段階ＩＩＩまたはＩＶ）の比率
を有意に減少させることを可能とすることを示す。
【０１１２】
これらの実験によって、本発明者らは、ＡＰ−１と相互作用するキネシン、特にキネシンＫｉｆ１３Ａの特異的ｓｉＲＮＡが、メラニン色素の産生に対して有意な作用を及ぼし、従って、色素脱失剤として効果的に使用することができることを示した。
【０１１３】
実施例２
トランスフェクトされたメラニン細胞のウェスタンブロット実験（図４）は、ＡＰ−１のμ１Ａサブユニットの発現が、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞と比較して、ｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞において強く減少していることを示すことを可能とした。この発現の下降はまた、ＡＰ−１アダプター複合体の不安定化の結果、ＡＰ−１の別のサブユニットであるγ−アダプチンの発現の減少も伴った。従って、これらの結果は、ＡＰ−１の唯１つのサブユニットの不活性化がこの複合体を完全に不安定化するに十分であることを確認する。さらに、驚くべき様式で、ｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされ従ってＡＰ−１に欠陥を有する細胞において、Ｔｙｒｐ−１酵素の発現はより低い強度で減少していたが、メラニン形成の鍵となる酵素であるチロシナーゼの発現は強く減少していることが観察された。
【０１１４】
従って、これらの結果は、ＡＰ−１の唯１つのサブユニットの不活性化はアダプター複合体の不安定化および不活性化に十分であるが、メラニン形成の基本的な酵素の発現も妨害することを示す。
【０１１５】
トランスフェクトされたメラニン細胞の中の白い細胞、すなわち色素化された成熟メラノソームを含まない細胞の定量は、光学顕微鏡（位相差）下で直接計測することによって行なわれ（図５Ａおよび５Ｂ）、ｓｉ−ＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞に存在する量と比較したこれらの細胞中のメラニンの比率を、４９２nmの波長における細胞溶解液の吸光度を測定することによって決定した（図６）。図５Ａ、５Ｂおよび６は、ｓｉＲＮＡ−対照、ｓｉＲＮＡ−１μＡ、ｓｉＲＮＡ−γ−アダプチン、またはｓｉＲＮＡ−１μＡとｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンの組合せでトランスフェクトされたメラニン細胞で得られた結果を示す。図５Ａおよび５Ｂで提示された結果は、ｓｉＲＮＡ−１μＡ、ｓｉＲＮＡ−γ−アダプチン（図５Ａ）または両方同時(図５Ｂ）の使用は、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞との比較によって、トランスフェクトされたメラニン細胞間での白い細胞の比率を有意に増加させることを可能としたことを示す。ｓｉＲＮＡ−１μＡのみでトランスフェクトされた細胞ではこの増加は２４％に達した。これらの結果は図６に提示される結果により確認され、ここでは、ｓｉＲＮＡ−１μＡ、ｓｉＲＮＡ−γ−アダプチンまたは両方同時のトランスフェクションは、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞との比較によって、細胞中で合成されたメラニンの量を顕著に減少させることを可能としたように思われる。この減少は、ｓｉＲＮＡ−１μＡでトランスフェクトされた細胞において４０％超に達し得る。
【０１１６】
従って、これらの結果は、１つ以上のｓｉＲＮＡによるＡＰ−１複合体の１つ以上のサブユニットの不活性化は、メラニン細胞におけるメラニンの合成を有意に減少させることを可能とすることを示す。
【０１１７】
電子顕微鏡下での観察を、従来型顕微鏡（図７）または抗Ｔｙｒｐ１抗体を用いた免疫染色を用いて（データは示さず）のいずれかで、ｓｉＲＮＡ−μ１ＡまたはｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞で行なった。
【０１１８】
従来型電子顕微鏡を用いた実験は、ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされたメラニン細胞が、大量のメラニン（図７で黒で）を含む多くのメラノソームを含んでいたことを示すことを可能とした。他方で、ｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされたメラニン細胞は、全くまたは殆ど色素を含んでいなかった。
【０１１９】
ｓｉＲＮＡ−対照でトランスフェクトされた細胞における免疫染色により、Ｔｙｒｐ１タンパク質の濃縮された多くの成熟段階ＩＩＩまたはＩＶメラノソームが判明した。他方で、ｓｉＲＮＡ−μ１Ａでトランスフェクトされた細胞（従って、ＡＰ−１アダプター複合体は不活性化されていた）は、未成熟の段階ＩまたはＩＩメラノソームしか含まなかった。これらの細胞中には成熟メラノソームは見られなかった。Ｔｙｒｐ１酵素は常に抗体によって検出されたが、エンドソーム特徴を有し色素を欠失していた小胞構造中にしか存在しなかった。
【０１２０】
従って、これらの観察は、ＡＰ−１複合体の不活性化は、プレメラノソームにおいてメラニン形成の酵素の移動を妨害し、従って、これらの細胞小器官の成熟を遮断し、これにより結果としてメラニンの合成ができなくなることを示す。
【０１２１】
結論
これらの実験によって得られた結果は、まず第一に、特異的ｓｉＲＮＡの使用がメラニン細胞におけるＡＰ−１複合体を不活性化することを観察することを可能とした。さらに、ＡＰ−１アダプター複合体の唯１つのサブユニットの不活性化が、前記複合体を不安定化し従って不活性化するのに十分であることが示された。
【０１２２】
得られた結果はまた、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの特異的ｓｉＲＮＡの使用が、
− メラニン細胞において産生されるメラニンの量、
− 色素化された成熟メラノソームを含むメラニン細胞の量、および
− メラニン細胞における成熟（段階ＩＩＩまたはＩＶ）メラノソームの比率
を有意に減少させることを可能とすることを示す。
【０１２３】
これらの実験によって、本発明者らは、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの特異的ｓｉＲＮＡが、メラニン色素の産生に対して有意な効果を及ぼし、従って、色素脱失剤として効果的に使用されることができることを示した。
【０１２４】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのキネシンＫｉｆ１３Ａ阻害剤、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤、および／またはＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体とキネシンＫｉｆ１３Ａとの間の相互作用の阻害剤を含む、薬学的または化粧品組成物。
【請求項２】
前記阻害剤が、キネシンＫｉｆ１３Ａ阻害剤であることを特徴とする、請求項１の組成物。
【請求項３】
前記阻害剤が、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤であることを特徴とする、請求項１の組成物。
【請求項４】
前記阻害剤が、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体とキネシンＫｉｆ１３Ａとの間の相互作用の阻害剤であることを特徴とする、請求項１の組成物。
【請求項５】
前記阻害剤が、小分子、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項の組成物。
【請求項６】
前記阻害剤が、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項の組成物。
【請求項７】
前記阻害剤が、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはキネシンＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、そして前記タンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含む核酸であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項の組成物。
【請求項８】
前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｉＲＮＡ、好ましくはｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項７の組成物。
【請求項９】
前記核酸が、１５〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドの配列を有する、請求項５〜８の組成物。
【請求項１０】
前記核酸が、配列番号１〜６および１１〜２４の配列からなる群より選択される配列を含むことを特徴とする、請求項５〜９のいずれか１項の組成物。
【請求項１１】
エラク酸；アルブチン；レゾルシノール；ビタミンＣ；パントテネート；コウジ酸；胎盤抽出物；メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、そのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）と直接的にまたは間接的に干渉する分子；ポリオール、例えばグリセリン、グリコールまたはプロピレングリコール；ビタミン；角質溶解剤および／または剥離剤、例えばサリチル酸；α−ヒドロキシ酸、例えば乳酸またはリンゴ酸；アスコルビン酸；レチノイン酸；レチンアルデヒド；レチノール；パルミテート、プロピオネートまたはアセテート；抗糖化剤および／または抗酸化剤、例えばトコフェロール、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミンピロホスフェート、ピリドキサミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシン、アデノシントリホスフェート；抗炎症剤；鎮静剤およびその混合物；化学的または物理的な太陽フィルターおよびデオキシリボ核酸またはリボ核酸、およびその誘導体からなる群より好ましくは選択される、１つ以上の他の活性物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項の組成物。
【請求項１２】
局所経路による投与に適合されていることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項の組成物。
【請求項１３】
色素性疾患を処置または予防するための薬物の調製のための、請求項１〜１２のいずれか１項の薬学的組成物の使用。
【請求項１４】
前記色素性疾患が色素沈着過剰であることを特徴とする、請求項１３の使用。
【請求項１５】
化粧品薬剤としての、請求項１〜１２のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項１６】
前記化粧品薬剤が、色素脱失剤であることを特徴とする、請求項１５の使用。
【請求項１】
少なくとも１つのキネシンＫｉｆ１３Ａ阻害剤、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤、および／またはＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体とキネシンＫｉｆ１３Ａとの間の相互作用の阻害剤を含む、薬学的または化粧品組成物。
【請求項２】
前記阻害剤が、キネシンＫｉｆ１３Ａ阻害剤であることを特徴とする、請求項１の組成物。
【請求項３】
前記阻害剤が、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットの阻害剤であることを特徴とする、請求項１の組成物。
【請求項４】
前記阻害剤が、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットもしくはＡＰ−１複合体とキネシンＫｉｆ１３Ａとの間の相互作用の阻害剤であることを特徴とする、請求項１の組成物。
【請求項５】
前記阻害剤が、小分子、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項の組成物。
【請求項６】
前記阻害剤が、アプタマー、抗体、核酸またはドミナントネガティブペプチドであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項の組成物。
【請求項７】
前記阻害剤が、ＡＰ−１アダプター複合体のサブユニットまたはキネシンＫｉｆ１３Ａをコードする遺伝子またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイゼーションでき、そして前記タンパク質の発現を減少または抑制することができる配列を含む核酸であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項の組成物。
【請求項８】
前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｉＲＮＡ、好ましくはｓｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項７の組成物。
【請求項９】
前記核酸が、１５〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドの配列を有する、請求項５〜８の組成物。
【請求項１０】
前記核酸が、配列番号１〜６および１１〜２４の配列からなる群より選択される配列を含むことを特徴とする、請求項５〜９のいずれか１項の組成物。
【請求項１１】
エラク酸；アルブチン；レゾルシノール；ビタミンＣ；パントテネート；コウジ酸；胎盤抽出物；メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、そのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）と直接的にまたは間接的に干渉する分子；ポリオール、例えばグリセリン、グリコールまたはプロピレングリコール；ビタミン；角質溶解剤および／または剥離剤、例えばサリチル酸；α−ヒドロキシ酸、例えば乳酸またはリンゴ酸；アスコルビン酸；レチノイン酸；レチンアルデヒド；レチノール；パルミテート、プロピオネートまたはアセテート；抗糖化剤および／または抗酸化剤、例えばトコフェロール、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミンピロホスフェート、ピリドキサミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシン、アデノシントリホスフェート；抗炎症剤；鎮静剤およびその混合物；化学的または物理的な太陽フィルターおよびデオキシリボ核酸またはリボ核酸、およびその誘導体からなる群より好ましくは選択される、１つ以上の他の活性物質をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項の組成物。
【請求項１２】
局所経路による投与に適合されていることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項の組成物。
【請求項１３】
色素性疾患を処置または予防するための薬物の調製のための、請求項１〜１２のいずれか１項の薬学的組成物の使用。
【請求項１４】
前記色素性疾患が色素沈着過剰であることを特徴とする、請求項１３の使用。
【請求項１５】
化粧品薬剤としての、請求項１〜１２のいずれか１項の組成物の使用。
【請求項１６】
前記化粧品薬剤が、色素脱失剤であることを特徴とする、請求項１５の使用。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５１８２１４（Ｐ２０１１−５１８２１４Ａ）
【公表日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０５５７３（Ｐ２０１１−５０５５７３）
【出願日】平成２１年４月２１日（２００９．４．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５０７３７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４１５４１
【国際公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５０００２６５３３）アンスティテュ・キュリ (20)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＣＵＲＩＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年６月２３日（２０１１．６．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月２１日（２００９．４．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０５０７３７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４１５４１
【国際公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【出願人】（５９５０４０７４４）サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク (88)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ
【出願人】（５０００２６５３３）アンスティテュ・キュリ (20)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＣＵＲＩＥ
【Ｆターム（参考）】
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