抗アルキル化物質の探索方法、抗アルキル化剤
【課題】 アルキル化の中でもＯ６メチルグアニンを引き起こすアルキル化を抑制・修復する抗アルキル化物質を探索する方法及び該探索方法によって探索された抗アルキル化剤を得ることを目的とする。
【解決手段】 本発明の抗アルキル化物質の探索方法は、Ｏ６メチルグアニンを認識するアルキル化修復遺伝子を有する融合遺伝子の発現量を測定し、アルキル化剤添加により引き起こされた宿主細胞のＤＮＡのアルキル化に被検物質を添加し、アルキル化量を抑制する抗アルキル化物質を探索することができる。
【選択図面】 図１
【解決手段】 本発明の抗アルキル化物質の探索方法は、Ｏ６メチルグアニンを認識するアルキル化修復遺伝子を有する融合遺伝子の発現量を測定し、アルキル化剤添加により引き起こされた宿主細胞のＤＮＡのアルキル化に被検物質を添加し、アルキル化量を抑制する抗アルキル化物質を探索することができる。
【選択図面】 図１
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗アルキル化物質の探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本人の最も多い死亡原因として悪性新生物（以下、がんという）が挙げられる。がんの原因は未だ完全に解明されていないが、そのがん化の一因としてＤＮＡの損傷が挙げられる。ＤＮＡの損傷とは、環境からの要因によりＤＮＡに生じた物理的又は化学的変化のことをさし、中でも化学的変化の１つであるＤＮＡのアルキル化が最近注目を集めている。
【０００３】
ＤＮＡのアルキル化とは、通常、ＤＮＡ上の塩基がアルキル化されることをいうが、特にグアニン塩基の６位の酸素原子がアルキル化されたＯ６メチルグアニンががん化に関与するといわれている。
【０００４】
例えば、大腸菌ＤＮＡ上にＯ６メチルグアニンが生じると、ａｄａ遺伝子の転写が起き、Ａｄａタンパク質が産生される。このＡｄａタンパク質は、ＤＮＡのＯ６メチルグアニンを修復するタンパク質であり、細胞内に生じたＤＮＡ上のＯ６メチルグアニン量と相関関係を有する。
【０００５】
Ｏ６メチルグアニンの生成量を測定することにより、ＤＮＡのがん化に関わるアルキル化を確認することが可能となる。ここで測定方法としては、Ａｄａタンパク質とβ−ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードした形質転換体を用いて測定する方法がある（非特許文献１）。
【０００６】
この測定方法によれば、ＨＰＬＣ、ＧＣＭＳ又はＬＣＭＳ等の高価な機器及び技術による大掛かりな測定方法を用いることなく、ＤＮＡのアルキル化の中でも特にＯ６メチルグアニンに特化した測定をすることが可能である。
【０００７】
このようにして、ＤＮＡのアルキル化メカニズムに関しては近年様々な方法で研究されてきている。
【０００８】
そして、上記アルキル化のメカニズムが解明されていくにつれて、このアルキル化を抑制する物質、すなわち「抗アルキル化物質」の存在に関する研究も始まりつつある。
【０００９】
しかしながら、例えば前述の測定方法では、Ｏ６メチルグアニン量を測定し、Ｏ６メチルグアニンに係るアルキル化物質を探索することが可能であるが、抗アルキル化物質を探索することは不可能であり、逆にがん化を抑制する抗アルキル化物質の探索する方法については未だ確立されていない。
【００１０】
また、抗アルキル化物質を探索するために、様々な被検物質を１度に大量かつ安定に、精度良く測定する必要があるが、前述した測定方法では、Ｏ６メチルグアニンの量を測定することができても、大量のサンプルを１度に安定かつ精度良く測定することは困難である。
【非特許文献】 （Ｙ． Ｎａｋａｂｅｐｐｕ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４６（１９８５） １５５−１６７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、アルキル化の中でもＯ６メチルグアニンを引き起こすアルキル化を抑制・修復する抗アルキル化物質を探索する方法及び該探索方法によって探索された抗アルキル化剤を得ることを目的とする。
【発明を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
【００１３】
（１）宿主細胞にアルキル化剤を添加する工程と、前記宿主細胞に被検物質を添加する工程とを具備することを特徴とする抗アルキル化物質の探索方法、
（２）前記宿主細胞が、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有することを特徴とする（１）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、
（３）前記宿主細胞が大腸菌由来であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（４）前記アルキル化修復遺伝子が、大腸菌ａｄａ遺伝子であることを特徴とする（１）乃至（３）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（５）前記指標となる遺伝子が、大腸菌ｌａｃＺであることを特徴とする（１）乃至（４）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（６）前記アルキル化剤を添加する工程で、前記宿主細胞のＤＮＡがアルキル化されることを特徴とする（１）乃至（５）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（７）前記アルキル化剤を添加する工程で、前記ＤＮＡ上のグアニン塩基の６位の酸素原子がアルキル化されることを特徴とする（１）乃至（６）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（８）前記アルキル化剤が、ＭＮＮＧ（１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン；１−Ｍｅｔｈｙｌ−３−ｎｉｔｒｏ−１−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ＭＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア；Ｎ−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｕｒｅａ）、ＤＥＮ（Ｎ−ニトロソジエチルアミン）又はＥＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−エチルウレア）であることを特徴とする（１）乃至（７）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（９）前記アルキル化剤を添加する前に前記被検物質を添加する場合において、前記ＤＮＡのアルキル化が抑制されることを特徴とする（１）乃至（８）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１０）前記アルキル化剤を添加する後に前記被検物質を添加する場合において、前記ＤＮＡのアルキル化が抑制されることを特徴とする（１）乃至（８）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１１）自然発生的にアルキル化されている宿主細胞に被検物質を添加する工程を具備し、前記宿主細胞は、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有することを特徴とする抗アルキル化物質の探索方法、（１２）前記宿主細胞は、大腸菌由来であることを特徴とする（１１）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１３）前記アルキル化修復遺伝子が、大腸菌ａｄａ遺伝子であることを特徴とする（１１）又は（１２）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１４）前記指標となる遺伝子が、大腸菌ｌａｃＺであることを特徴とする（１１）乃至（１３）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１５）前記ＤＮＡ上のグアニン塩基の６位の酸素原子が自然発生的にアルキル化されることを特徴とする（１１）乃至（１４）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１６）宿主細胞にアルキル化剤を添加する工程と、前記宿主細胞に被検物質を添加する工程とを具備する抗アルキル化物質の探索方法、又は、自然発生的にアルキル化されている宿主細胞に被検物質を添加する工程を具備する抗アルキル化物質の探索方法であって、前記宿主細胞は、大腸菌由来であり、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有する抗アルキル化物質の探索方法によって、探索されたことを特徴とする抗アルキル化剤、（１７）カプトプリン、キトサン、クロロフィリン、Ｌ−シトルリン、クルクミン、フィセチン、Ｌ−グルタチオン、フェネチルイソチオシアネート、ケルセチン、アスコルビン酸、ルチン、シスチアミン、エピカテキン、β−カロチン、キトサン及び／又はフォロログルシノールを含有することを特徴とする抗アルキル化剤。
【００１４】
従来は、がん化の一因となるＤＮＡのアルキル化を引き起こすいくつかのアルキル化剤によりａｄａ遺伝子の発現が上昇することがわかっていた。しかしながら、抗アルキル化物質を探索する試みがなされていなかった。
【００１５】
そこで、本発明者らはアルキル化物質を探索するだけではなく、例えば、アルキル化物質が体内に取り込まれた際にそのＤＮＡのアルキル化反応を抑制する、又は、体内に自然発生的に起こりうるアルキル化を抑制・修復する等の被検物質として抗アルキル化物質を探索する方法を確立するに至った。更に、効率良く、信頼度の高い結果を得るために、大量のサンプルを一度に測定できるハイスループットな系を確立するに至った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１７】
（第１の実施形態）
【００１８】
宿主細胞にアルキル化剤を添加する場合における抗アルキル化物質の探索方法について説明する。
【００１９】
本発明の抗アルキル化物質の探索方法（以下、「本発明の探索方法」という）は、宿主細胞にアルキル化剤を添加する工程と、宿主細胞に被検物質を添加する工程とを具備することを特徴とする。
【００２０】
すなわち、本発明の探索方法では、宿主細胞にアルキル化剤を添加し宿主細胞のＤＮＡをアルキル化させると同時に、この宿主細胞に被検物質を添加することにより、ＤＮＡ上のアルキル化された塩基の量（以下、アルキル化量とする）を抑制する物質、つまり抗アルキル化物質を探索する。
【００２１】
宿主細胞とは目的の遺伝子等を取り込ませ増殖する細胞のことをいい、ここでは、例えば大腸菌を使用する。他の宿主細胞としては、枯草菌、酵母、線虫、ハエ・マウス・ヒトの細胞株等を使用してもよい。
【００２２】
ここでＤＮＡのアルキル化とは、ＤＮＡ上のグアニン塩基の６位の酸素原子がアルキル化される、つまり、Ｏ６メチルグアニンが形成されることをいう。
【００２３】
また、本発明で用いる宿主細胞、例えば大腸菌には、目的の遺伝子としてアルキル化修復遺伝子と、指標となる遺伝子とからなる融合遺伝子を組み込むことを特徴とする。
【００２４】
この場合のアルキル化修復遺伝子とは、ＤＮＡのアルキル化を認識し、これを修復するタンパク質をコードする遺伝子であり、ＤＮＡのアルキル化量に伴って発現する遺伝子である。
【００２５】
大腸菌のＤＮＡのアルキル化量が多い時には該アルキル化修復遺伝子は多く発現し、逆に宿主細胞のＤＮＡのアルキル化量が少ない時には該アルキル化修復遺伝子は少なく発現する。
【００２６】
そこで、大腸菌のＤＮＡのアルキル化量を測定するには、該アルキル化修復遺伝子の発現量を測定すればよい。
【００２７】
しかしながら、アルキル化修復遺伝子単独での発現量を測定することが困難であるために指標となる遺伝子と融合させた融合タンパク質を作製し、指標となる遺伝子量を測定することにより、アルキル化修復遺伝子の発現量を測定することができる。すなわち測定されたアルキル化修復遺伝子の発現量が、ＤＮＡのアルキル化量となる。
【００２８】
ここで、アルキル化修復遺伝子とは、ａｄａ遺伝子（Ｏ６メチルグアニンＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子）であることが好ましい。
ａｄａ遺伝子は、Ｏ６メチルグアニンを認識しこれを修復する遺伝子で、ＤＮＡのアルキル化量に比例して発現が上昇するため、本発明に係るＤＮＡのアルキル化された塩基の生成量を測定する際に好適である。なお、Ｏ６メチルグアニンを認識し、これに比例して発現が上昇するタンパク質をコードする遺伝子であれば、ａｄａ遺伝子以外の遺伝子を用いてもよい。
【００２９】
また、指標となる遺伝子とは、好ましくはレポーター遺伝子のことをいう。更に好ましくはレポーター遺伝子の中でもｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子）がよい。
【００３０】
レポーター遺伝子とは、組換えＤＮＡ技術により作製された組換え遺伝子がどの時点でどの程度発現されたかを容易に確認することができる遺伝子のことである。また、ｌａｃＺとは、発現量を測定する目的遺伝子と融合して指標となる遺伝子、すなわちレポーター遺伝子として、融合後もその酵素活性を保つことやその酵素反応等がよく知られており、いくつかの基質の分解により発色することが示されているため、好適である。なお、レポーター遺伝子であれば、ｌａｃＺ以外の遺伝子、例えばルシフェラーゼ等でもよい。
【００３１】
ここで、アルキル化剤の例としては例えばＭＮＮＧ（１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン）が挙げられる。ＭＮＮＧは、アルキル化剤中でもＯ６メチルグアニンを多く生成することから、ａｄａ遺伝子の発現が強く誘導されるため、抗アルキル化剤を添加する際にＤＮＡのアルキル化が抑制されるか否かの判別を行うことが容易である。つまり、ＭＮＮＧによるアルキル化は、アルキル化されたＤＮＡ上の塩基の中でのＯ６メチルグアニンの生成される割合が多いためである。
なお、他のアルキル化剤として、Ｏ６メチルグアニンの生成される割合が多いＭＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア）、ＤＥＮ（Ｎ−ニトロソジエチルアミン）、ＥＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−エチルウレア）等でもよい。
【００３２】
また、抗アルキル化物質を宿主細胞に添加する時期は、アルキル化物質の添加前でも添加後でもよい。このように抗アルキル化物質を宿主細胞にアルキル化剤を添加する前やアルキル化物質を添加した後に経過時間毎にＤＮＡのアルキル化量を測定することにより、例えば、アルキル化物質の添加前に抗アルキル化物質を添加しアルキル化を抑制することであれば、抗アルキル化物質がＤＮＡのアルキル化を抑制していることを推測できる。これにより、将来該探索方法で探索された抗アルキル化物質を例えば食品、薬剤等に応用させる場合に、摂取時期を最適化することができる。
【００３３】
以上の構成から、本発明の抗アルキル化物質の探索方法は、宿主細胞におけるアルキル化修復遺伝子を有する融合遺伝子の量を測定し、更に被検物質を添加することにより、アルキル化剤添加により引き起こされた宿主細胞のＤＮＡのアルキル化量を抑制する抗アルキル化物質を探索することができる。
【００３４】
（第２の実施形態）
【００３５】
次に、自然発生的に起こる宿主細胞のＤＮＡのアルキル化を抑制する抗アルキル化物質の探索方法について説明する。
【００３６】
本発明の探索方法は、宿主細胞に被検物質を添加する工程を具備し、前記宿主細胞は、大腸菌由来であり、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有することを特徴とする。
【００３７】
すなわち、本発明の探索方法では、宿主細胞にアルキル化剤を添加しないという点で第１の実施形態と異なり、自然発生的な宿主細胞のＤＮＡのアルキル化を抑制する物質、つまり、抗アルキル化物質を検索する。
【００３８】
ここで、自然発生的なアルキル化とは、宿主細胞にアルキル化剤等のアルキル化の一因となる物質を添加しない状態であっても、自然に起こりうるＤＮＡのアルキル化のことをいう。例えば、自然発生的に起こるアルキル化としては、物質代謝の過程等で生じるものが挙げられる。
【００３９】
自然発生的なＤＮＡのアルキル化によるアルキル化量を測定するには、経時的にアルキル化量を測定することが好ましい。
【００４０】
すなわち、経時的にアルキル化量を測定していれば、確実にアルキル化が生じたことを確認することができるからである。
【００４１】
本発明の方法では、この自然発生なアルキル化が起きた宿主細胞に対して、被検物質を添加してアルキル化を抑制する抗アルキル化物質を探索することができる。
【００４２】
つまり、このように自然発生的に起こったアルキル化に対して、抗アルキル化物質を経時的に添加することにより、自然発生的に起こったアルキル化に対して、どの時点で効果的に抑制することができるかを確認することができる。そのため、本発明の探索方法により探索された抗アルキル化物質は、がんに対する予防・治療分野に利用することができる。
【００４３】
以上の構成から、本発明の抗アルキル化物質の探索方法は、自然発生的なＤＮＡのアルキル化に対する抗アルキル化物質を探索することができる。
【００４４】
以上のようにして得られた本発明の抗アルキル化物質を、例えば食品、医薬等として利用することができる。食品として利用する場合、本発明の抗アルキル化物質単体のみならず、既存食品に添加してもよい。また、医薬として利用する場合は通常用いられる担体を用いて製剤化し、注射、経口、経皮等の剤型に調整することができる。例えば、人に用いる場合、抗アルキル化物質を１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を１日１回〜数回から適宜選択すればよい。
【００４５】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００４６】
＜抗アルキル化活性の検出＞
【００４７】
以下に、被検物質とアルキル化剤をほぼ同時に若しくは被検物質を添加した後に添加した場合における抗アルキル化活性を測定した。なお、本実施例の被検物質としては、抗変異原性物質を用い、抗アルキル化活性を測定した。
菌株 大腸菌；ＹＮ１１３ Ｗ３１１０ ｔｒｐＲ ｌａｃＺ ＶａｌＲ ａｚｉ ＴｒｐＥ９２９（ａｍ） ｔｒｐＡ９７６１（ａｍ）：：ｐＭＹ３
ＬＢ培地（５００ｍｌ）：トリプトン（ｔｒｐｔｏｎｅ）（ＤＩＦＣＯ）５ｇ
イーストエクストラクト（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）（ ＤＩＦＣＯ）２．５ｇ
ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ）５ｇ
Ｚバッファー（５００ｍｌ）：０．２ＭＮａ２ＨＰＯ４（Ｗａｋｏ）１５０ｍｌ
０．２ＭＮａＨ２ＰＯ４（Ｗａｋｏ）１００ｍｌ
ＫＣｌ（Ｗａｋｏ）０．３７５ｇ
ＭｇＳＯ４・２Ｈ２Ｏ（Ｗａｋｏ）０．１２３ｇ
β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔ ａｎｏｌ（ｓｉｇｍａ）０．３５ｍｌ
【００４８】
（１） 前培養１：大試験管を利用し、ＬＢ培地２．５ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ））中、３７℃で１４時間培養した。
【００４９】
（２） 前培養２：２００ｍｌの三角フラスコを利用して前培養１をＬＢ培地３０ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００に希釈し、３７℃、１時間５０分で培養した。
【００５０】
（３） （２）にアルキル化剤ＭＮＮＧ最終濃度０．００５μｇ／ｍｌを添加した。
【００５１】
（４） 被験物質として、抗変異原性物質として知られるＰＥＩＴＣ（フェネチルイソチオシアネート：Ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（Ｓｉｇｍａ））の最終濃度が０．５、１、２、５、１０、２５μｇ／ｍｌとなるように希釈してサンプルを使った。
【００５２】
（５） サンプルの分注。（４）の小試験官に（３）を１ｍｌ又は１．５ｍｌずつ分注し、攪拌した。２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ各チューブのサンプルを分注し、（各小試験管（濃度）あたり４穴又は５穴分注する）培養した。
【００５３】
（６） サンプリング及びサンプル調整。アルキル化剤を添加した後、培養開始１時間目に、プレートの各穴よりサンプルを回収した。
０．５ｍｌの９６穴プレートを用意し、あらかじめ１５０μｌのＺバッファーを入れた。さらに培養サンプルを３０μｌずつ加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に、９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【００５４】
（７） アッセイ。全てのサンプリング終了後、軽く遠心し、蓋を開ける。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させる。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（Ｚバッファー（Ｓｉｇｍａ）中のＯＮＰＧの最終濃度 １μｇ／ｍｌ）を９６穴アッセイプレートに分注する。これに３０μｌのサンプルを加え、２８℃で１０分間放置する。４０μｌの１ＭＮａ２ＣＯ３を加え反応を止める。プレートリーダーで、波長４１４ｎｍ及び波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５５】
（８） 下記の計算により活性をもとめた。
（抗アルキル化活性）Ｕ（ユニット）＝１０００×（Ａ４１４−１．７５×Ａ５５０）／（ｔ×０．００７５×Ａ６００）
ｔ；２８℃でのインキュベートの時間（分）
Ａ４１４；波長４１４ｎｍの吸光度
Ａ５５０；波長５５０ｎｍの吸光度
Ａ６００；波長６００ｎｍの吸光度
【００５６】
（９） データ処理。ユニット数の比較の他にコントロールを１とした場合の各サンプルにおける被検物質の影響を検出した。
【００５７】
＜結果＞
濃度依存的にアルキル化剤ＭＮＮＧによるａｄａ遺伝子の発現が抑制されることが示された。アルキル化剤ＭＮＮＧの添加により、強い発現が誘導される１時間目及び２時間目において、被検物質ＰＥＩＴＣの濃度依存的な抗アルキル化活性の検出を行った。図１には、アルキル化剤ＭＮＮＧ及び被検物質ＰＥＩＴＣの１時間目の抗アルキル化活性を示した。縦軸は被検物質を添加していないコントロール１とした場合に、被検物質を添加して抑制された割合を示している。横軸は被検物質の濃度である。
【００５８】
なお、被検物質として、ＰＥＩＴＣの他にＣａｐｔｏｐｒｉｌ（カプトプリル（Ｗａｋｏ））、Ｃｈｉｔｏｓａｎ（キトサン（Ｓｉｇｍａ））、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｎ（クロロフィリン（Ｓｉｇｍａ））、Ｌ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（Ｌ−シトルリン（Ｓｉｇｍａ））、ｃｕｒｃｕｍｉｎ（クルクミン（Ｗａｋｏ））、Ｆｉｓｅｔｉｎ（フィセチン（Ｓｉｇｍａ））、Ｌ−Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（Ｌ−グルタチオン）、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ（ケルセチン（Ｓｉｇｍａ））においても、抗アルキル化活性が確認された。
【実施例２】
【００５９】
＜抗アルキル化活性の検出＞
以下に、被検物質をアルキル化剤添加する前に添加した場合の抗アルキル化活性について測定した。
菌株 大腸菌；ＹＮ１１３ Ｗ３１１０ ｔｒｐＲ ｌａｃＺ ＶａｌＲ ａｚｉ ＴｒｐＥ９２９（ａｍ） ｔｒｐＡ９７６１（ａｍ）：：ｐＭＹ３
【００６０】
（１） 前培養１ 大試験管を利用して、ＬＢ培地２．５ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）中、３７℃で１４時間培養した。
【００６１】
（２） 前培養２ （１）をＬＢ培地３０ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００に希釈した。
【００６２】
（３） 被験物質として、β−ｃａｒｏｔｅｎｅ（β−カロチン（Ｓｉｇｍａ））の最終濃度が１、５、１０、２５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、大試験管に入れた。
【００６３】
（４） （２）を（３）に１．５ｍｌづつ添加し、３７℃で１時間５０分振とう培養した。
【００６４】
（５） （４）の小試験官にアルキル化剤ＭＮＮＧ（最終濃度０．００５μｇ／ｍｌ）を添加し攪拌した。
【００６５】
（６） ２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ各チューブのサンプルを分注した（各小試験管（濃度）あたり４穴分注する）。
【００６６】
（７） サンプリングおよびサンプル調整。アルキル化剤ＭＮＮＧの添加後、１時間目又は２時間目に、プレートの各穴よりサンプルを回収した。０．５ｍｌの９６穴プレートを用意し、あらかじめ１５０μｌのＺバッファーを入れた。更に、培養サンプルを３０μｌずつ加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に、９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【００６７】
（８） アッセイ。全てのサンプリングが終了した後、軽く遠心し、蓋を開けた。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させた。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（Ｚバッファー中のＯＮＰＧの最終濃度 １μｇ／ｍｌ）を９６穴アッセイプレートに分注した。これに３０μｌのサンプルを加え、２８℃で１０から９０分間放置した。４０μｌの１ＭＮａ２ＣＯ３を加え反応を止めた。プレートリーダーで、波長４１４ｎｍ及び波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６８】
（９） 下記の計算により活性をもとめた。
（抗アルキル化活性）Ｕ（ユニット）＝１０００×（Ａ４１４−１．７５×Ａ５５０）／（ｔ×０．００７５×Ａ６００）
ｔ；２８℃でのインキュベートの時間（分）
【００６９】
（１０） データ処理。ユニット数の比較の他、コントロールを１とした場合の被検物質の影響を検出した。
【００７０】
＜結果＞
予め細胞内に被検物質が過剰に存在する条件下で培養するような場合、言い換えると、アルキル化剤を添加する前に被検物質を細胞と培養したような場合に、実施例１で抗アルキル化の活性がはっきりとは確認されなかった物質の中で、ａｄａ遺伝子の発現抑制が確認されたものがある。被検物質としては、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ（カプトプリル（Ｗａｋｏ））、Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ（アスコルビン酸（ビタミンＣ）（Ｓｉｇｍａ））、Ｒｕｔｉｎ（ルチン（ビタミンＰ）（Ｓｉｇｍａ））、β−ｃａｒｏｔｅｎｅ（β−カロチン（Ｓｉｇｍａ））において、アルキル化剤ＭＮＮＧのアルキル化を抑制することが確認された。図２には、被検物質β−カロチンの被検物質添加前にアルキル化剤ＭＮＮＧを添加したｐｒｅと、被検物質添加後にアルキル化剤ＭＮＮＧを添加したｐｏｓｔとの抗アルキル化活性を示した。縦軸は被検物質を添加していないコントロールを１とした場合に、被検物質を添加して抑制された割合を示している。横軸は被検物質の濃度である。
【実施例３】
【００７１】
＜自然発生的なアルキル化の抑制物質の探索＞
以下に、アルキル化剤を添加しない場合である自然発生的なアルキル化を抑制する抗アルキル化活性について測定した。
【００７２】
（１） 前培養１ 大試験管を利用して、ＬＢ培地２．５ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）中、３７℃で１４時間培養した。
【００７３】
（２） 前培養２ ２００ｍｌの三角フラスコを利用して、上記をＬＢ培地３０ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００希釈し、３７℃で１時間５０分培養した。
【００７４】
（３） サンプルの分注および本培養。大試験官に（２）を１ｍｌずつ分注し、攪拌した。そのまま３７℃で培養を続けた。
【００７５】
（４） 被験物質として、抗変異物質として知られるＰＥＩＴＣの最終濃度が１、５、１０、２５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、本培養３時間後に（２）のそれぞれの大試験官に被検物質を添加した。攪拌後、２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ各チューブのサンプルを分注した（５穴に各試験管の同じサンプルを分注した）。
【００７６】
（５） サンプリングおよびサンプル調整。本培養後、１、２、４時間目に、大試験官よりサンプルを回収した。また、６、７、８時間目に、それぞれの穴よりサンプルを回収した。あらかじめ０．５ｍｌの９６穴プレートの各穴に１５０μｌのＺバッファーを入れておき、それぞれ３０μｌの培養サンプルを加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【００７７】
（６） アッセイ。全てのサンプリング終了後、軽く遠心し、蓋を開ける。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させた。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（Ｚバッファー中のＯＮＰＧの最終濃度 １μｇ／ｍｌ）を９６穴アッセイプレートに分注した。これに３０μｌのサンプルを加え、２８℃で４５分間放置した。４０μｌの１ＭＮａ２ＣＯ３を加え反応を止めた。プレートリーダーで、波長４１４ｎｍ及び波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００７８】
（７） 下記の計算により活性をもとめた。
（抗アルキル化活性）Ｕ（ユニット）＝１０００×（Ａ４１４−１．７５×Ａ５５０）／（ｔ×０．００７５×Ａ６００）
ｔ；２８℃でのインキュベートの時間（分）
【００７９】
（８） データ処理。ユニット数の比較の他、コントロールを１とした場合の各サンプルにおける被検物質の影響を検出した。
【００８０】
＜結果＞
アルキル化剤を添加しない場合における自然発生的なアルキル化を抑える物質として、β−カロチン、Ｃｈｉｔｏｓａｎ（キトサン（Ｓｉｇｍａ））、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｎ（クロロフィリン（Ｓｉｇｍａ））、ＰＥＩＴＣが確認された。なお、図３には、自然に発生するアルキル化に対する被検物質ＰＥＩＴＣの各濃度における経時的な抗アルキル化活性について示した。縦軸は被検物質を添加していないコントロールを１とした場合に、被検物質を添加して抑制された割合を示している。横軸は被検物質の濃度である。
【実施例４】
【００８１】
＜ＭＮＮＧ、ＭＮＵ、ＥＮＵ及びＤＥＮのアルキル化剤を用いた場合の抗アルキル化活性の検出＞
【００８２】
以下に、アルキル化剤ＭＮＮＧの他にアルキル化剤ＭＮＵ、ＥＮＵ及びＤＥＮを添加した場合についての抗アルキル化活性を測定した。
【００８３】
実施例１と同様にアルキル化物質としてＭＮＮＧ（０．０５μｇ／ｍｌ）、ＭＮＵ（５０μｇ／ｍｌ）、ＥＮＵ（１μｇ／ｍｌ）、ＤＥＮ（１００μｇ／ｍｌ）を用い、被検物質としてＰＥＩＴＣ２μｇ／ｍｌを用いて、抗アルキル化活性を測定した。
【００８４】
図４には、各アルキル化剤を用いて被検物質ＰＥＩＴＣとの抗アルキル化活性の比較を示した。各アルキル化剤におけるＰＥＩＴＣの無添加時の値を１としたときのＰＥＩＴＣ添加時の相対値を示した。
【００８５】
＜結果＞
アルキル化剤ＭＮＮＧだけではなく、その他のアルキル化剤としてＭＮＵ、ＥＮＵ及びＤＥＮでも抗アルキル化活性を測定することが可能であった。
【実施例５】
【００８６】
＜基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌ（Ｗａｋｏ）に変更し、抗アルキル活性を可視化する検出＞
【００８７】
菌株 大腸菌；ＹＮ１１３ Ｗ３１１０ ｔｒｐＲ ｌａｃＺ ＶａｌＲ ａｚｉ ＴｒｐＥ９２９（ａｍ） ｔｒｐＡ９７６１ （ａｍ）：：ｐＭＹ３
【００８８】
（１） 前培養１ 大試験管を利用して、ＬＢ培地２．５ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）中、３７℃で１４時間培養した。
【００８９】
（２） 前培養２ ２００ｍｌ三角フラスコを利用して、上記をＬＢ培地３０ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００希釈し、３７℃で１時間５０分培養した。
【００９０】
（３） （２）にアルキル化剤ＭＮＮＧ（最終濃度０．００５μｇ／ｍｌ）を添加した。
【００９１】
（４） 被験物質として、ＰＥＩＴＣの濃度が０．５、１、２、５、１０μｇ／ｍｌとなるように希釈してサンプルを作製した。
【００９２】
（５） サンプルの分注。（４）の小試験官に（３）を１ｍｌずつ分注し、攪拌した。２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ各チューブのサンプルを分注した（各小試験管（濃度）あたり４又は５穴分注した）。
【００９３】
（６） サンプリングおよびサンプル調整。アルキル化剤添加後、０．５、１、２、４時間目にプレートの各穴よりサンプルを回収した。０．５ｍｌの９６穴プレートを用意し、あらかじめ１５０μｌのＺバッファーを入れた。さらに培養サンプルを３０μｌずつ加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に、９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【００９４】
（７） アッセイ。全てのサンプリング終了後、軽く遠心し、蓋を開けた。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させた。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（最終濃度４０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ ｉｎ ＰＢＳ）を９６穴アッセイプレートに分注した。これに５０μｌのサンプルを加え、室温で９０分間放置した。図５の上図は、本実施例の基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌに変更した場合の本培養開始１時間後の各濃度における抗アルキル化活性について示し、下図は、基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌに変更した際の被検プレートの写真について示した。
【００９５】
＜結果＞
基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌに変更した場合にも、同様に抗アルキル化活性の検出が可能であった。ＯＮＰＧの方が感度がよいが、基質Ｘ−ｇａｌを使用した本実施例は、基質がβガラクトシダーゼにより分解されると青色に呈するため、可視で活性を確認することが容易となる。例えば、プレートリーダーがない場合に、裸眼で抗アルキル化活性を検出することができるため、非常に有用である。
【実施例６】
【００９６】
＜代謝活性化した被検物質によるアルキル化への影響＞
Ｓ９Ｍｉｘサンプル作製（代謝活性化用）／ｍｌ
Ｇ−６−Ｐ（オリエンタル酵母）１．７ｍｇ
ＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母）３．６２ｍｇ
ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母）３．０５ｍｇ
０．２ＭＰＯ４ｂｕｆｆｅｒ ２．５ｍｌ
１ＭＫＣｌ ３３μｌ
１ＭＭｇＣｌ２ ８μｌ
上記物質に対して、全量が０．９ｍｌとなるように水を添加し、更に１００μｌのＳ−９（ラット肝Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）（キッコーマン）を添加したものである。
【００９７】
（１） 前培養１ 大試験管を利用して、ＬＢ培地２．５ｍｌ（５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）中、３７℃で１４時間培養した。
【００９８】
（２） 前培養２ ２００ｍｌの三角フラスコを利用して、上記をＬＢ培地３０ｍｌ（５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００希釈し、３７℃で１時間５０分培養した。
【００９９】
（３） 代謝活性化サンプルの作製。（２）の細胞にＳ９Ｍｉｘ（最終濃度１０％）加え、さらにアルキル化剤ＭＮＮＧ（最終濃度０．００５μｇ／ｍｌ）を添加した（コントロールにＳ９を添加しないサンプルを作製した）。
【０１００】
（４） 被験物質として、ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ（シスチアミン（Ｗａｋｏ））の濃度が１、２、５、１０、２５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、サンプルを作製した。
【０１０１】
（５） サンプルの分注。（４）の小試験官に（３）を１又は１．５ｍｌずつ分注し、攪拌した。２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ各チューブのサンプルを分注した（各小試験管（濃度）あたり４穴又は５穴分注した）。
【０１０２】
（６） サンプリングおよびサンプル調整。アルキル化剤添加後、２時間目に、にプレートの各穴よりサンプルを回収した。０．５ｍｌの９６穴プレートを用意し、あらかじめ１５０μｌのＺバッファーを入れた。更に、培養サンプルを３０μｌずつ加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に、９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【０１０３】
（７） アッセイ。全てのサンプリング終了後、軽く遠心し、蓋を開けた。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させた。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（Ｚバッファー中のＯＮＰＧの最終濃度 １μｇ／ｍｌ）を９６穴アッセイプレートに分注した。これに３０μｌのサンプルを加え、２８℃で１０分間放置した。４０μｌの１ＭＮａ２ＣＯ３を加え反応を止めた。プレートリーダーで、波長４１４ｎｍ及び波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０４】
（８） 下記の計算により活性をもとめた。
（抗アルキル化活性）Ｕ（ユニット）＝１０００×（Ａ４１４−１．７５×Ａ５５０）／（ｔ×０．００７５×Ａ６００）
ｔ；２８℃でのインキュベートの時間（分）
【０１０５】
（９） データ処理。ユニット数の比較のほか、コントロールを１とした場合の各サンプルにおける被検物質の影響を検出した。図６には、代謝活性化酵素Ｓ９の効果を調べるために、Ｓ９の添加及び無添加の状態で、アルキル化剤ＭＮＮＧ及び被検物質シスチアミンを添加し、シスチアミンの抗アルキル化活性について示した。
【０１０６】
＜結果＞
【０１０７】
Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ（シスチアミン（Ｗａｋｏ））、Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ（エピカテキン（Ｓｉｇｍａ））、Ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌ（フォロログルシノール（Ｓｉｇｍａ））等が代謝活性Ｓ９を添加したことにより、抗アルキル化活性を示した。
【実施例７】
【０１０８】
＜大量のサンプルの検出＞
【０１０９】
以下に、各種被検物質と該被検物質の各濃度を１度に抗アルキル化測定した。
【０１１０】
（１） 前培養１ 大試験管を利用して、ＬＢ培地２．５ｍｌ（５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）中、３７℃で１４時間培養した。
【０１１１】
（２） 前培養２ ２００ｍｌの三角フラスコを利用して、上記をＬＢ培地３０ｍｌ（５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００希釈し、３７℃で１時間５０分培養した。
【０１１２】
（３） 被験物質の希釈。１５種の被検物質を調整した。１穴あたりの被検物質の最終濃度を１、２、５、１０、２５μｇ／ｍｌとなるように調整した（この際、横に濃度を振ると測定が容易である）。
【０１１３】
（４） （２）の細胞に更にアルキル化剤ＭＮＮＧ（最終濃度０．００５μｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１１４】
（５） サンプルの分注した。（４）の被検物質を添加したプレートに、（４）を２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ分注した（小試験管で被検物質と混合した後に、２５０μｌ分注してもよい）。
【０１１５】
（６） サンプリングおよびサンプル調整。アルキル化剤添加後、２時間目に、プレートの各穴よりサンプルを回収した。０．５ｍｌの９６穴プレートを用意し、あらかじめ１５０μｌのＺバッファーを入れる。さらに培養サンプルを３０μｌずつ加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に、９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【０１１６】
（７） アッセイ。全てのサンプリング終了後、軽く遠心し、蓋を開けた。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させた。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（Ｚバッファー中のＯＮＰＧの最終濃度 １μｇ／ｍｌ）を９６穴アッセイプレートに分注した。これに３０μｌのサンプルを加え、２８℃で１０分間放置した。４０μｌの１ＭＮａ２ＣＯ３を加え反応を止めた。プレートリーダーで、波長４１４ｎｍ及び波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１７】
（８） 下記の計算により活性をもとめる
（抗アルキル化活性）Ｕ（ユニット）＝１０００×（Ａ４１４−１．７５×Ａ５５０）／（ｔ×０．００７５×Ａ６００）
ｔ；２８℃でのインキュベートの時間（分）
【０１１８】
（９） コントロールの被検物質を入れないサンプルの活性を１としたときの、それぞれの活性を計算した。
【０１１９】
＜結果＞
【０１２０】
１５種類の被検物質を用い、各種濃度の抗アルキル化活性を測定することができた。このような構成により、本発明の検出方法はハイスループット化を図ることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、アルキル化剤ＭＮＮＧ及び被検物質ＰＥＩＴＣの１時間目の抗アルキル化活性を示した図である。
【図２】 図２は、被検物質β−カロチンの被検物質添加前にアルキル化剤ＭＮＮＧを添加したｐｒｅと、被検物質添加後にアルキル化剤ＭＮＮＧを添加したｐｏｓｔとの抗アルキル化活性を示した図である。
【図３】 図３は、自然に発生するアルキル化に対する被検物質ＰＥＩＴＣの各濃度における経時的な抗アルキル化活性について示した図である
【図４】 図４は、各アルキル化剤を用いて被検物質ＰＥＩＴＣとの抗アルキル化活性の比較を示した図である。
【図５】 図５の上図は、本実施例の基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌに変更した場合の本培養開始１時間後の各濃度における抗アルキル化活性について示し、下図は、基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌに変更した際の被検プレートの写真について示した図である。
【図６】 図６は、代謝活性化酵素Ｓ９の効果を調べるために、Ｓ９の添加及び無添加の状態で、アルキル化剤ＭＮＮＧ及び被検物質シスチアミンを添加し、シスチアミンの抗アルキル化活性について示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗アルキル化物質の探索方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、日本人の最も多い死亡原因として悪性新生物（以下、がんという）が挙げられる。がんの原因は未だ完全に解明されていないが、そのがん化の一因としてＤＮＡの損傷が挙げられる。ＤＮＡの損傷とは、環境からの要因によりＤＮＡに生じた物理的又は化学的変化のことをさし、中でも化学的変化の１つであるＤＮＡのアルキル化が最近注目を集めている。
【０００３】
ＤＮＡのアルキル化とは、通常、ＤＮＡ上の塩基がアルキル化されることをいうが、特にグアニン塩基の６位の酸素原子がアルキル化されたＯ６メチルグアニンががん化に関与するといわれている。
【０００４】
例えば、大腸菌ＤＮＡ上にＯ６メチルグアニンが生じると、ａｄａ遺伝子の転写が起き、Ａｄａタンパク質が産生される。このＡｄａタンパク質は、ＤＮＡのＯ６メチルグアニンを修復するタンパク質であり、細胞内に生じたＤＮＡ上のＯ６メチルグアニン量と相関関係を有する。
【０００５】
Ｏ６メチルグアニンの生成量を測定することにより、ＤＮＡのがん化に関わるアルキル化を確認することが可能となる。ここで測定方法としては、Ａｄａタンパク質とβ−ガラクトシダーゼの融合タンパク質をコードした形質転換体を用いて測定する方法がある（非特許文献１）。
【０００６】
この測定方法によれば、ＨＰＬＣ、ＧＣＭＳ又はＬＣＭＳ等の高価な機器及び技術による大掛かりな測定方法を用いることなく、ＤＮＡのアルキル化の中でも特にＯ６メチルグアニンに特化した測定をすることが可能である。
【０００７】
このようにして、ＤＮＡのアルキル化メカニズムに関しては近年様々な方法で研究されてきている。
【０００８】
そして、上記アルキル化のメカニズムが解明されていくにつれて、このアルキル化を抑制する物質、すなわち「抗アルキル化物質」の存在に関する研究も始まりつつある。
【０００９】
しかしながら、例えば前述の測定方法では、Ｏ６メチルグアニン量を測定し、Ｏ６メチルグアニンに係るアルキル化物質を探索することが可能であるが、抗アルキル化物質を探索することは不可能であり、逆にがん化を抑制する抗アルキル化物質の探索する方法については未だ確立されていない。
【００１０】
また、抗アルキル化物質を探索するために、様々な被検物質を１度に大量かつ安定に、精度良く測定する必要があるが、前述した測定方法では、Ｏ６メチルグアニンの量を測定することができても、大量のサンプルを１度に安定かつ精度良く測定することは困難である。
【非特許文献】 （Ｙ． Ｎａｋａｂｅｐｐｕ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４６（１９８５） １５５−１６７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、アルキル化の中でもＯ６メチルグアニンを引き起こすアルキル化を抑制・修復する抗アルキル化物質を探索する方法及び該探索方法によって探索された抗アルキル化剤を得ることを目的とする。
【発明を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
【００１３】
（１）宿主細胞にアルキル化剤を添加する工程と、前記宿主細胞に被検物質を添加する工程とを具備することを特徴とする抗アルキル化物質の探索方法、
（２）前記宿主細胞が、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有することを特徴とする（１）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、
（３）前記宿主細胞が大腸菌由来であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（４）前記アルキル化修復遺伝子が、大腸菌ａｄａ遺伝子であることを特徴とする（１）乃至（３）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（５）前記指標となる遺伝子が、大腸菌ｌａｃＺであることを特徴とする（１）乃至（４）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（６）前記アルキル化剤を添加する工程で、前記宿主細胞のＤＮＡがアルキル化されることを特徴とする（１）乃至（５）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（７）前記アルキル化剤を添加する工程で、前記ＤＮＡ上のグアニン塩基の６位の酸素原子がアルキル化されることを特徴とする（１）乃至（６）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（８）前記アルキル化剤が、ＭＮＮＧ（１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン；１−Ｍｅｔｈｙｌ−３−ｎｉｔｒｏ−１−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ＭＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア；Ｎ−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｕｒｅａ）、ＤＥＮ（Ｎ−ニトロソジエチルアミン）又はＥＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−エチルウレア）であることを特徴とする（１）乃至（７）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（９）前記アルキル化剤を添加する前に前記被検物質を添加する場合において、前記ＤＮＡのアルキル化が抑制されることを特徴とする（１）乃至（８）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１０）前記アルキル化剤を添加する後に前記被検物質を添加する場合において、前記ＤＮＡのアルキル化が抑制されることを特徴とする（１）乃至（８）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１１）自然発生的にアルキル化されている宿主細胞に被検物質を添加する工程を具備し、前記宿主細胞は、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有することを特徴とする抗アルキル化物質の探索方法、（１２）前記宿主細胞は、大腸菌由来であることを特徴とする（１１）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１３）前記アルキル化修復遺伝子が、大腸菌ａｄａ遺伝子であることを特徴とする（１１）又は（１２）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１４）前記指標となる遺伝子が、大腸菌ｌａｃＺであることを特徴とする（１１）乃至（１３）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１５）前記ＤＮＡ上のグアニン塩基の６位の酸素原子が自然発生的にアルキル化されることを特徴とする（１１）乃至（１４）に記載の抗アルキル化物質の探索方法、（１６）宿主細胞にアルキル化剤を添加する工程と、前記宿主細胞に被検物質を添加する工程とを具備する抗アルキル化物質の探索方法、又は、自然発生的にアルキル化されている宿主細胞に被検物質を添加する工程を具備する抗アルキル化物質の探索方法であって、前記宿主細胞は、大腸菌由来であり、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有する抗アルキル化物質の探索方法によって、探索されたことを特徴とする抗アルキル化剤、（１７）カプトプリン、キトサン、クロロフィリン、Ｌ−シトルリン、クルクミン、フィセチン、Ｌ−グルタチオン、フェネチルイソチオシアネート、ケルセチン、アスコルビン酸、ルチン、シスチアミン、エピカテキン、β−カロチン、キトサン及び／又はフォロログルシノールを含有することを特徴とする抗アルキル化剤。
【００１４】
従来は、がん化の一因となるＤＮＡのアルキル化を引き起こすいくつかのアルキル化剤によりａｄａ遺伝子の発現が上昇することがわかっていた。しかしながら、抗アルキル化物質を探索する試みがなされていなかった。
【００１５】
そこで、本発明者らはアルキル化物質を探索するだけではなく、例えば、アルキル化物質が体内に取り込まれた際にそのＤＮＡのアルキル化反応を抑制する、又は、体内に自然発生的に起こりうるアルキル化を抑制・修復する等の被検物質として抗アルキル化物質を探索する方法を確立するに至った。更に、効率良く、信頼度の高い結果を得るために、大量のサンプルを一度に測定できるハイスループットな系を確立するに至った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について説明する。
【００１７】
（第１の実施形態）
【００１８】
宿主細胞にアルキル化剤を添加する場合における抗アルキル化物質の探索方法について説明する。
【００１９】
本発明の抗アルキル化物質の探索方法（以下、「本発明の探索方法」という）は、宿主細胞にアルキル化剤を添加する工程と、宿主細胞に被検物質を添加する工程とを具備することを特徴とする。
【００２０】
すなわち、本発明の探索方法では、宿主細胞にアルキル化剤を添加し宿主細胞のＤＮＡをアルキル化させると同時に、この宿主細胞に被検物質を添加することにより、ＤＮＡ上のアルキル化された塩基の量（以下、アルキル化量とする）を抑制する物質、つまり抗アルキル化物質を探索する。
【００２１】
宿主細胞とは目的の遺伝子等を取り込ませ増殖する細胞のことをいい、ここでは、例えば大腸菌を使用する。他の宿主細胞としては、枯草菌、酵母、線虫、ハエ・マウス・ヒトの細胞株等を使用してもよい。
【００２２】
ここでＤＮＡのアルキル化とは、ＤＮＡ上のグアニン塩基の６位の酸素原子がアルキル化される、つまり、Ｏ６メチルグアニンが形成されることをいう。
【００２３】
また、本発明で用いる宿主細胞、例えば大腸菌には、目的の遺伝子としてアルキル化修復遺伝子と、指標となる遺伝子とからなる融合遺伝子を組み込むことを特徴とする。
【００２４】
この場合のアルキル化修復遺伝子とは、ＤＮＡのアルキル化を認識し、これを修復するタンパク質をコードする遺伝子であり、ＤＮＡのアルキル化量に伴って発現する遺伝子である。
【００２５】
大腸菌のＤＮＡのアルキル化量が多い時には該アルキル化修復遺伝子は多く発現し、逆に宿主細胞のＤＮＡのアルキル化量が少ない時には該アルキル化修復遺伝子は少なく発現する。
【００２６】
そこで、大腸菌のＤＮＡのアルキル化量を測定するには、該アルキル化修復遺伝子の発現量を測定すればよい。
【００２７】
しかしながら、アルキル化修復遺伝子単独での発現量を測定することが困難であるために指標となる遺伝子と融合させた融合タンパク質を作製し、指標となる遺伝子量を測定することにより、アルキル化修復遺伝子の発現量を測定することができる。すなわち測定されたアルキル化修復遺伝子の発現量が、ＤＮＡのアルキル化量となる。
【００２８】
ここで、アルキル化修復遺伝子とは、ａｄａ遺伝子（Ｏ６メチルグアニンＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子）であることが好ましい。
ａｄａ遺伝子は、Ｏ６メチルグアニンを認識しこれを修復する遺伝子で、ＤＮＡのアルキル化量に比例して発現が上昇するため、本発明に係るＤＮＡのアルキル化された塩基の生成量を測定する際に好適である。なお、Ｏ６メチルグアニンを認識し、これに比例して発現が上昇するタンパク質をコードする遺伝子であれば、ａｄａ遺伝子以外の遺伝子を用いてもよい。
【００２９】
また、指標となる遺伝子とは、好ましくはレポーター遺伝子のことをいう。更に好ましくはレポーター遺伝子の中でもｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子）がよい。
【００３０】
レポーター遺伝子とは、組換えＤＮＡ技術により作製された組換え遺伝子がどの時点でどの程度発現されたかを容易に確認することができる遺伝子のことである。また、ｌａｃＺとは、発現量を測定する目的遺伝子と融合して指標となる遺伝子、すなわちレポーター遺伝子として、融合後もその酵素活性を保つことやその酵素反応等がよく知られており、いくつかの基質の分解により発色することが示されているため、好適である。なお、レポーター遺伝子であれば、ｌａｃＺ以外の遺伝子、例えばルシフェラーゼ等でもよい。
【００３１】
ここで、アルキル化剤の例としては例えばＭＮＮＧ（１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン）が挙げられる。ＭＮＮＧは、アルキル化剤中でもＯ６メチルグアニンを多く生成することから、ａｄａ遺伝子の発現が強く誘導されるため、抗アルキル化剤を添加する際にＤＮＡのアルキル化が抑制されるか否かの判別を行うことが容易である。つまり、ＭＮＮＧによるアルキル化は、アルキル化されたＤＮＡ上の塩基の中でのＯ６メチルグアニンの生成される割合が多いためである。
なお、他のアルキル化剤として、Ｏ６メチルグアニンの生成される割合が多いＭＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア）、ＤＥＮ（Ｎ−ニトロソジエチルアミン）、ＥＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−エチルウレア）等でもよい。
【００３２】
また、抗アルキル化物質を宿主細胞に添加する時期は、アルキル化物質の添加前でも添加後でもよい。このように抗アルキル化物質を宿主細胞にアルキル化剤を添加する前やアルキル化物質を添加した後に経過時間毎にＤＮＡのアルキル化量を測定することにより、例えば、アルキル化物質の添加前に抗アルキル化物質を添加しアルキル化を抑制することであれば、抗アルキル化物質がＤＮＡのアルキル化を抑制していることを推測できる。これにより、将来該探索方法で探索された抗アルキル化物質を例えば食品、薬剤等に応用させる場合に、摂取時期を最適化することができる。
【００３３】
以上の構成から、本発明の抗アルキル化物質の探索方法は、宿主細胞におけるアルキル化修復遺伝子を有する融合遺伝子の量を測定し、更に被検物質を添加することにより、アルキル化剤添加により引き起こされた宿主細胞のＤＮＡのアルキル化量を抑制する抗アルキル化物質を探索することができる。
【００３４】
（第２の実施形態）
【００３５】
次に、自然発生的に起こる宿主細胞のＤＮＡのアルキル化を抑制する抗アルキル化物質の探索方法について説明する。
【００３６】
本発明の探索方法は、宿主細胞に被検物質を添加する工程を具備し、前記宿主細胞は、大腸菌由来であり、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有することを特徴とする。
【００３７】
すなわち、本発明の探索方法では、宿主細胞にアルキル化剤を添加しないという点で第１の実施形態と異なり、自然発生的な宿主細胞のＤＮＡのアルキル化を抑制する物質、つまり、抗アルキル化物質を検索する。
【００３８】
ここで、自然発生的なアルキル化とは、宿主細胞にアルキル化剤等のアルキル化の一因となる物質を添加しない状態であっても、自然に起こりうるＤＮＡのアルキル化のことをいう。例えば、自然発生的に起こるアルキル化としては、物質代謝の過程等で生じるものが挙げられる。
【００３９】
自然発生的なＤＮＡのアルキル化によるアルキル化量を測定するには、経時的にアルキル化量を測定することが好ましい。
【００４０】
すなわち、経時的にアルキル化量を測定していれば、確実にアルキル化が生じたことを確認することができるからである。
【００４１】
本発明の方法では、この自然発生なアルキル化が起きた宿主細胞に対して、被検物質を添加してアルキル化を抑制する抗アルキル化物質を探索することができる。
【００４２】
つまり、このように自然発生的に起こったアルキル化に対して、抗アルキル化物質を経時的に添加することにより、自然発生的に起こったアルキル化に対して、どの時点で効果的に抑制することができるかを確認することができる。そのため、本発明の探索方法により探索された抗アルキル化物質は、がんに対する予防・治療分野に利用することができる。
【００４３】
以上の構成から、本発明の抗アルキル化物質の探索方法は、自然発生的なＤＮＡのアルキル化に対する抗アルキル化物質を探索することができる。
【００４４】
以上のようにして得られた本発明の抗アルキル化物質を、例えば食品、医薬等として利用することができる。食品として利用する場合、本発明の抗アルキル化物質単体のみならず、既存食品に添加してもよい。また、医薬として利用する場合は通常用いられる担体を用いて製剤化し、注射、経口、経皮等の剤型に調整することができる。例えば、人に用いる場合、抗アルキル化物質を１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を１日１回〜数回から適宜選択すればよい。
【００４５】
以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。ただし、本発明がこれに限定されるものでないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００４６】
＜抗アルキル化活性の検出＞
【００４７】
以下に、被検物質とアルキル化剤をほぼ同時に若しくは被検物質を添加した後に添加した場合における抗アルキル化活性を測定した。なお、本実施例の被検物質としては、抗変異原性物質を用い、抗アルキル化活性を測定した。
菌株 大腸菌；ＹＮ１１３ Ｗ３１１０ ｔｒｐＲ ｌａｃＺ ＶａｌＲ ａｚｉ ＴｒｐＥ９２９（ａｍ） ｔｒｐＡ９７６１（ａｍ）：：ｐＭＹ３
ＬＢ培地（５００ｍｌ）：トリプトン（ｔｒｐｔｏｎｅ）（ＤＩＦＣＯ）５ｇ
イーストエクストラクト（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ）（ ＤＩＦＣＯ）２．５ｇ
ＮａＣｌ（Ｗａｋｏ）５ｇ
Ｚバッファー（５００ｍｌ）：０．２ＭＮａ２ＨＰＯ４（Ｗａｋｏ）１５０ｍｌ
０．２ＭＮａＨ２ＰＯ４（Ｗａｋｏ）１００ｍｌ
ＫＣｌ（Ｗａｋｏ）０．３７５ｇ
ＭｇＳＯ４・２Ｈ２Ｏ（Ｗａｋｏ）０．１２３ｇ
β−メルカプトエタノール（β−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔ ａｎｏｌ（ｓｉｇｍａ）０．３５ｍｌ
【００４８】
（１） 前培養１：大試験管を利用し、ＬＢ培地２．５ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩（Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ Ｓｏｄｉｕｍ））中、３７℃で１４時間培養した。
【００４９】
（２） 前培養２：２００ｍｌの三角フラスコを利用して前培養１をＬＢ培地３０ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００に希釈し、３７℃、１時間５０分で培養した。
【００５０】
（３） （２）にアルキル化剤ＭＮＮＧ最終濃度０．００５μｇ／ｍｌを添加した。
【００５１】
（４） 被験物質として、抗変異原性物質として知られるＰＥＩＴＣ（フェネチルイソチオシアネート：Ｐｈｅｎｅｔｈｙｌ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（Ｓｉｇｍａ））の最終濃度が０．５、１、２、５、１０、２５μｇ／ｍｌとなるように希釈してサンプルを使った。
【００５２】
（５） サンプルの分注。（４）の小試験官に（３）を１ｍｌ又は１．５ｍｌずつ分注し、攪拌した。２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ各チューブのサンプルを分注し、（各小試験管（濃度）あたり４穴又は５穴分注する）培養した。
【００５３】
（６） サンプリング及びサンプル調整。アルキル化剤を添加した後、培養開始１時間目に、プレートの各穴よりサンプルを回収した。
０．５ｍｌの９６穴プレートを用意し、あらかじめ１５０μｌのＺバッファーを入れた。さらに培養サンプルを３０μｌずつ加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に、９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【００５４】
（７） アッセイ。全てのサンプリング終了後、軽く遠心し、蓋を開ける。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させる。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（Ｚバッファー（Ｓｉｇｍａ）中のＯＮＰＧの最終濃度 １μｇ／ｍｌ）を９６穴アッセイプレートに分注する。これに３０μｌのサンプルを加え、２８℃で１０分間放置する。４０μｌの１ＭＮａ２ＣＯ３を加え反応を止める。プレートリーダーで、波長４１４ｎｍ及び波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５５】
（８） 下記の計算により活性をもとめた。
（抗アルキル化活性）Ｕ（ユニット）＝１０００×（Ａ４１４−１．７５×Ａ５５０）／（ｔ×０．００７５×Ａ６００）
ｔ；２８℃でのインキュベートの時間（分）
Ａ４１４；波長４１４ｎｍの吸光度
Ａ５５０；波長５５０ｎｍの吸光度
Ａ６００；波長６００ｎｍの吸光度
【００５６】
（９） データ処理。ユニット数の比較の他にコントロールを１とした場合の各サンプルにおける被検物質の影響を検出した。
【００５７】
＜結果＞
濃度依存的にアルキル化剤ＭＮＮＧによるａｄａ遺伝子の発現が抑制されることが示された。アルキル化剤ＭＮＮＧの添加により、強い発現が誘導される１時間目及び２時間目において、被検物質ＰＥＩＴＣの濃度依存的な抗アルキル化活性の検出を行った。図１には、アルキル化剤ＭＮＮＧ及び被検物質ＰＥＩＴＣの１時間目の抗アルキル化活性を示した。縦軸は被検物質を添加していないコントロール１とした場合に、被検物質を添加して抑制された割合を示している。横軸は被検物質の濃度である。
【００５８】
なお、被検物質として、ＰＥＩＴＣの他にＣａｐｔｏｐｒｉｌ（カプトプリル（Ｗａｋｏ））、Ｃｈｉｔｏｓａｎ（キトサン（Ｓｉｇｍａ））、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｎ（クロロフィリン（Ｓｉｇｍａ））、Ｌ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ（Ｌ−シトルリン（Ｓｉｇｍａ））、ｃｕｒｃｕｍｉｎ（クルクミン（Ｗａｋｏ））、Ｆｉｓｅｔｉｎ（フィセチン（Ｓｉｇｍａ））、Ｌ−Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（Ｌ−グルタチオン）、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ（ケルセチン（Ｓｉｇｍａ））においても、抗アルキル化活性が確認された。
【実施例２】
【００５９】
＜抗アルキル化活性の検出＞
以下に、被検物質をアルキル化剤添加する前に添加した場合の抗アルキル化活性について測定した。
菌株 大腸菌；ＹＮ１１３ Ｗ３１１０ ｔｒｐＲ ｌａｃＺ ＶａｌＲ ａｚｉ ＴｒｐＥ９２９（ａｍ） ｔｒｐＡ９７６１（ａｍ）：：ｐＭＹ３
【００６０】
（１） 前培養１ 大試験管を利用して、ＬＢ培地２．５ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）中、３７℃で１４時間培養した。
【００６１】
（２） 前培養２ （１）をＬＢ培地３０ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００に希釈した。
【００６２】
（３） 被験物質として、β−ｃａｒｏｔｅｎｅ（β−カロチン（Ｓｉｇｍａ））の最終濃度が１、５、１０、２５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、大試験管に入れた。
【００６３】
（４） （２）を（３）に１．５ｍｌづつ添加し、３７℃で１時間５０分振とう培養した。
【００６４】
（５） （４）の小試験官にアルキル化剤ＭＮＮＧ（最終濃度０．００５μｇ／ｍｌ）を添加し攪拌した。
【００６５】
（６） ２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ各チューブのサンプルを分注した（各小試験管（濃度）あたり４穴分注する）。
【００６６】
（７） サンプリングおよびサンプル調整。アルキル化剤ＭＮＮＧの添加後、１時間目又は２時間目に、プレートの各穴よりサンプルを回収した。０．５ｍｌの９６穴プレートを用意し、あらかじめ１５０μｌのＺバッファーを入れた。更に、培養サンプルを３０μｌずつ加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に、９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【００６７】
（８） アッセイ。全てのサンプリングが終了した後、軽く遠心し、蓋を開けた。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させた。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（Ｚバッファー中のＯＮＰＧの最終濃度 １μｇ／ｍｌ）を９６穴アッセイプレートに分注した。これに３０μｌのサンプルを加え、２８℃で１０から９０分間放置した。４０μｌの１ＭＮａ２ＣＯ３を加え反応を止めた。プレートリーダーで、波長４１４ｎｍ及び波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００６８】
（９） 下記の計算により活性をもとめた。
（抗アルキル化活性）Ｕ（ユニット）＝１０００×（Ａ４１４−１．７５×Ａ５５０）／（ｔ×０．００７５×Ａ６００）
ｔ；２８℃でのインキュベートの時間（分）
【００６９】
（１０） データ処理。ユニット数の比較の他、コントロールを１とした場合の被検物質の影響を検出した。
【００７０】
＜結果＞
予め細胞内に被検物質が過剰に存在する条件下で培養するような場合、言い換えると、アルキル化剤を添加する前に被検物質を細胞と培養したような場合に、実施例１で抗アルキル化の活性がはっきりとは確認されなかった物質の中で、ａｄａ遺伝子の発現抑制が確認されたものがある。被検物質としては、Ｃａｐｔｏｐｒｉｌ（カプトプリル（Ｗａｋｏ））、Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ（アスコルビン酸（ビタミンＣ）（Ｓｉｇｍａ））、Ｒｕｔｉｎ（ルチン（ビタミンＰ）（Ｓｉｇｍａ））、β−ｃａｒｏｔｅｎｅ（β−カロチン（Ｓｉｇｍａ））において、アルキル化剤ＭＮＮＧのアルキル化を抑制することが確認された。図２には、被検物質β−カロチンの被検物質添加前にアルキル化剤ＭＮＮＧを添加したｐｒｅと、被検物質添加後にアルキル化剤ＭＮＮＧを添加したｐｏｓｔとの抗アルキル化活性を示した。縦軸は被検物質を添加していないコントロールを１とした場合に、被検物質を添加して抑制された割合を示している。横軸は被検物質の濃度である。
【実施例３】
【００７１】
＜自然発生的なアルキル化の抑制物質の探索＞
以下に、アルキル化剤を添加しない場合である自然発生的なアルキル化を抑制する抗アルキル化活性について測定した。
【００７２】
（１） 前培養１ 大試験管を利用して、ＬＢ培地２．５ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）中、３７℃で１４時間培養した。
【００７３】
（２） 前培養２ ２００ｍｌの三角フラスコを利用して、上記をＬＢ培地３０ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００希釈し、３７℃で１時間５０分培養した。
【００７４】
（３） サンプルの分注および本培養。大試験官に（２）を１ｍｌずつ分注し、攪拌した。そのまま３７℃で培養を続けた。
【００７５】
（４） 被験物質として、抗変異物質として知られるＰＥＩＴＣの最終濃度が１、５、１０、２５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、本培養３時間後に（２）のそれぞれの大試験官に被検物質を添加した。攪拌後、２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ各チューブのサンプルを分注した（５穴に各試験管の同じサンプルを分注した）。
【００７６】
（５） サンプリングおよびサンプル調整。本培養後、１、２、４時間目に、大試験官よりサンプルを回収した。また、６、７、８時間目に、それぞれの穴よりサンプルを回収した。あらかじめ０．５ｍｌの９６穴プレートの各穴に１５０μｌのＺバッファーを入れておき、それぞれ３０μｌの培養サンプルを加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【００７７】
（６） アッセイ。全てのサンプリング終了後、軽く遠心し、蓋を開ける。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させた。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（Ｚバッファー中のＯＮＰＧの最終濃度 １μｇ／ｍｌ）を９６穴アッセイプレートに分注した。これに３０μｌのサンプルを加え、２８℃で４５分間放置した。４０μｌの１ＭＮａ２ＣＯ３を加え反応を止めた。プレートリーダーで、波長４１４ｎｍ及び波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００７８】
（７） 下記の計算により活性をもとめた。
（抗アルキル化活性）Ｕ（ユニット）＝１０００×（Ａ４１４−１．７５×Ａ５５０）／（ｔ×０．００７５×Ａ６００）
ｔ；２８℃でのインキュベートの時間（分）
【００７９】
（８） データ処理。ユニット数の比較の他、コントロールを１とした場合の各サンプルにおける被検物質の影響を検出した。
【００８０】
＜結果＞
アルキル化剤を添加しない場合における自然発生的なアルキル化を抑える物質として、β−カロチン、Ｃｈｉｔｏｓａｎ（キトサン（Ｓｉｇｍａ））、Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｎ（クロロフィリン（Ｓｉｇｍａ））、ＰＥＩＴＣが確認された。なお、図３には、自然に発生するアルキル化に対する被検物質ＰＥＩＴＣの各濃度における経時的な抗アルキル化活性について示した。縦軸は被検物質を添加していないコントロールを１とした場合に、被検物質を添加して抑制された割合を示している。横軸は被検物質の濃度である。
【実施例４】
【００８１】
＜ＭＮＮＧ、ＭＮＵ、ＥＮＵ及びＤＥＮのアルキル化剤を用いた場合の抗アルキル化活性の検出＞
【００８２】
以下に、アルキル化剤ＭＮＮＧの他にアルキル化剤ＭＮＵ、ＥＮＵ及びＤＥＮを添加した場合についての抗アルキル化活性を測定した。
【００８３】
実施例１と同様にアルキル化物質としてＭＮＮＧ（０．０５μｇ／ｍｌ）、ＭＮＵ（５０μｇ／ｍｌ）、ＥＮＵ（１μｇ／ｍｌ）、ＤＥＮ（１００μｇ／ｍｌ）を用い、被検物質としてＰＥＩＴＣ２μｇ／ｍｌを用いて、抗アルキル化活性を測定した。
【００８４】
図４には、各アルキル化剤を用いて被検物質ＰＥＩＴＣとの抗アルキル化活性の比較を示した。各アルキル化剤におけるＰＥＩＴＣの無添加時の値を１としたときのＰＥＩＴＣ添加時の相対値を示した。
【００８５】
＜結果＞
アルキル化剤ＭＮＮＧだけではなく、その他のアルキル化剤としてＭＮＵ、ＥＮＵ及びＤＥＮでも抗アルキル化活性を測定することが可能であった。
【実施例５】
【００８６】
＜基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌ（Ｗａｋｏ）に変更し、抗アルキル活性を可視化する検出＞
【００８７】
菌株 大腸菌；ＹＮ１１３ Ｗ３１１０ ｔｒｐＲ ｌａｃＺ ＶａｌＲ ａｚｉ ＴｒｐＥ９２９（ａｍ） ｔｒｐＡ９７６１ （ａｍ）：：ｐＭＹ３
【００８８】
（１） 前培養１ 大試験管を利用して、ＬＢ培地２．５ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）中、３７℃で１４時間培養した。
【００８９】
（２） 前培養２ ２００ｍｌ三角フラスコを利用して、上記をＬＢ培地３０ｍｌ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００希釈し、３７℃で１時間５０分培養した。
【００９０】
（３） （２）にアルキル化剤ＭＮＮＧ（最終濃度０．００５μｇ／ｍｌ）を添加した。
【００９１】
（４） 被験物質として、ＰＥＩＴＣの濃度が０．５、１、２、５、１０μｇ／ｍｌとなるように希釈してサンプルを作製した。
【００９２】
（５） サンプルの分注。（４）の小試験官に（３）を１ｍｌずつ分注し、攪拌した。２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ各チューブのサンプルを分注した（各小試験管（濃度）あたり４又は５穴分注した）。
【００９３】
（６） サンプリングおよびサンプル調整。アルキル化剤添加後、０．５、１、２、４時間目にプレートの各穴よりサンプルを回収した。０．５ｍｌの９６穴プレートを用意し、あらかじめ１５０μｌのＺバッファーを入れた。さらに培養サンプルを３０μｌずつ加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に、９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【００９４】
（７） アッセイ。全てのサンプリング終了後、軽く遠心し、蓋を開けた。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させた。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（最終濃度４０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ ｉｎ ＰＢＳ）を９６穴アッセイプレートに分注した。これに５０μｌのサンプルを加え、室温で９０分間放置した。図５の上図は、本実施例の基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌに変更した場合の本培養開始１時間後の各濃度における抗アルキル化活性について示し、下図は、基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌに変更した際の被検プレートの写真について示した。
【００９５】
＜結果＞
基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌに変更した場合にも、同様に抗アルキル化活性の検出が可能であった。ＯＮＰＧの方が感度がよいが、基質Ｘ−ｇａｌを使用した本実施例は、基質がβガラクトシダーゼにより分解されると青色に呈するため、可視で活性を確認することが容易となる。例えば、プレートリーダーがない場合に、裸眼で抗アルキル化活性を検出することができるため、非常に有用である。
【実施例６】
【００９６】
＜代謝活性化した被検物質によるアルキル化への影響＞
Ｓ９Ｍｉｘサンプル作製（代謝活性化用）／ｍｌ
Ｇ−６−Ｐ（オリエンタル酵母）１．７ｍｇ
ＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母）３．６２ｍｇ
ＮＡＤＨ（オリエンタル酵母）３．０５ｍｇ
０．２ＭＰＯ４ｂｕｆｆｅｒ ２．５ｍｌ
１ＭＫＣｌ ３３μｌ
１ＭＭｇＣｌ２ ８μｌ
上記物質に対して、全量が０．９ｍｌとなるように水を添加し、更に１００μｌのＳ−９（ラット肝Ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）（キッコーマン）を添加したものである。
【００９７】
（１） 前培養１ 大試験管を利用して、ＬＢ培地２．５ｍｌ（５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）中、３７℃で１４時間培養した。
【００９８】
（２） 前培養２ ２００ｍｌの三角フラスコを利用して、上記をＬＢ培地３０ｍｌ（５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００希釈し、３７℃で１時間５０分培養した。
【００９９】
（３） 代謝活性化サンプルの作製。（２）の細胞にＳ９Ｍｉｘ（最終濃度１０％）加え、さらにアルキル化剤ＭＮＮＧ（最終濃度０．００５μｇ／ｍｌ）を添加した（コントロールにＳ９を添加しないサンプルを作製した）。
【０１００】
（４） 被験物質として、ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ（シスチアミン（Ｗａｋｏ））の濃度が１、２、５、１０、２５μｇ／ｍｌとなるように希釈し、サンプルを作製した。
【０１０１】
（５） サンプルの分注。（４）の小試験官に（３）を１又は１．５ｍｌずつ分注し、攪拌した。２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ各チューブのサンプルを分注した（各小試験管（濃度）あたり４穴又は５穴分注した）。
【０１０２】
（６） サンプリングおよびサンプル調整。アルキル化剤添加後、２時間目に、にプレートの各穴よりサンプルを回収した。０．５ｍｌの９６穴プレートを用意し、あらかじめ１５０μｌのＺバッファーを入れた。更に、培養サンプルを３０μｌずつ加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に、９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【０１０３】
（７） アッセイ。全てのサンプリング終了後、軽く遠心し、蓋を開けた。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させた。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（Ｚバッファー中のＯＮＰＧの最終濃度 １μｇ／ｍｌ）を９６穴アッセイプレートに分注した。これに３０μｌのサンプルを加え、２８℃で１０分間放置した。４０μｌの１ＭＮａ２ＣＯ３を加え反応を止めた。プレートリーダーで、波長４１４ｎｍ及び波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１０４】
（８） 下記の計算により活性をもとめた。
（抗アルキル化活性）Ｕ（ユニット）＝１０００×（Ａ４１４−１．７５×Ａ５５０）／（ｔ×０．００７５×Ａ６００）
ｔ；２８℃でのインキュベートの時間（分）
【０１０５】
（９） データ処理。ユニット数の比較のほか、コントロールを１とした場合の各サンプルにおける被検物質の影響を検出した。図６には、代謝活性化酵素Ｓ９の効果を調べるために、Ｓ９の添加及び無添加の状態で、アルキル化剤ＭＮＮＧ及び被検物質シスチアミンを添加し、シスチアミンの抗アルキル化活性について示した。
【０１０６】
＜結果＞
【０１０７】
Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ（シスチアミン（Ｗａｋｏ））、Ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ（エピカテキン（Ｓｉｇｍａ））、Ｐｈｌｏｒｏｇｌｕｃｉｎｏｌ（フォロログルシノール（Ｓｉｇｍａ））等が代謝活性Ｓ９を添加したことにより、抗アルキル化活性を示した。
【実施例７】
【０１０８】
＜大量のサンプルの検出＞
【０１０９】
以下に、各種被検物質と該被検物質の各濃度を１度に抗アルキル化測定した。
【０１１０】
（１） 前培養１ 大試験管を利用して、ＬＢ培地２．５ｍｌ（５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）中、３７℃で１４時間培養した。
【０１１１】
（２） 前培養２ ２００ｍｌの三角フラスコを利用して、上記をＬＢ培地３０ｍｌ（５０μｇ／ｍｌ アンピシリン・ナトリウム塩）で１／１００希釈し、３７℃で１時間５０分培養した。
【０１１２】
（３） 被験物質の希釈。１５種の被検物質を調整した。１穴あたりの被検物質の最終濃度を１、２、５、１０、２５μｇ／ｍｌとなるように調整した（この際、横に濃度を振ると測定が容易である）。
【０１１３】
（４） （２）の細胞に更にアルキル化剤ＭＮＮＧ（最終濃度０．００５μｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１１４】
（５） サンプルの分注した。（４）の被検物質を添加したプレートに、（４）を２ｍｌの９６穴プレートに１穴２５０μｌづつ分注した（小試験管で被検物質と混合した後に、２５０μｌ分注してもよい）。
【０１１５】
（６） サンプリングおよびサンプル調整。アルキル化剤添加後、２時間目に、プレートの各穴よりサンプルを回収した。０．５ｍｌの９６穴プレートを用意し、あらかじめ１５０μｌのＺバッファーを入れる。さらに培養サンプルを３０μｌずつ加え、トルエンを１滴添加した後に、蓋をしてボルテックスした。同時に、９６穴アッセイプレートに１００μｌのサンプルを回収し、プレートリーダーにより波長６００ｎｍの吸光度を測定してサンプルの濁度を計った。
【０１１６】
（７） アッセイ。全てのサンプリング終了後、軽く遠心し、蓋を開けた。３７℃で３０分インキュベートし、トルエンを揮発させた。１サンプルあたり、５０μｌのアッセイバッファー（Ｚバッファー中のＯＮＰＧの最終濃度 １μｇ／ｍｌ）を９６穴アッセイプレートに分注した。これに３０μｌのサンプルを加え、２８℃で１０分間放置した。４０μｌの１ＭＮａ２ＣＯ３を加え反応を止めた。プレートリーダーで、波長４１４ｎｍ及び波長５５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１１７】
（８） 下記の計算により活性をもとめる
（抗アルキル化活性）Ｕ（ユニット）＝１０００×（Ａ４１４−１．７５×Ａ５５０）／（ｔ×０．００７５×Ａ６００）
ｔ；２８℃でのインキュベートの時間（分）
【０１１８】
（９） コントロールの被検物質を入れないサンプルの活性を１としたときの、それぞれの活性を計算した。
【０１１９】
＜結果＞
【０１２０】
１５種類の被検物質を用い、各種濃度の抗アルキル化活性を測定することができた。このような構成により、本発明の検出方法はハイスループット化を図ることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、アルキル化剤ＭＮＮＧ及び被検物質ＰＥＩＴＣの１時間目の抗アルキル化活性を示した図である。
【図２】 図２は、被検物質β−カロチンの被検物質添加前にアルキル化剤ＭＮＮＧを添加したｐｒｅと、被検物質添加後にアルキル化剤ＭＮＮＧを添加したｐｏｓｔとの抗アルキル化活性を示した図である。
【図３】 図３は、自然に発生するアルキル化に対する被検物質ＰＥＩＴＣの各濃度における経時的な抗アルキル化活性について示した図である
【図４】 図４は、各アルキル化剤を用いて被検物質ＰＥＩＴＣとの抗アルキル化活性の比較を示した図である。
【図５】 図５の上図は、本実施例の基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌに変更した場合の本培養開始１時間後の各濃度における抗アルキル化活性について示し、下図は、基質をＯＮＰＧからＸ−ｇａｌに変更した際の被検プレートの写真について示した図である。
【図６】 図６は、代謝活性化酵素Ｓ９の効果を調べるために、Ｓ９の添加及び無添加の状態で、アルキル化剤ＭＮＮＧ及び被検物質シスチアミンを添加し、シスチアミンの抗アルキル化活性について示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞にアルキル化剤を添加する工程と、
前記宿主細胞に被検物質を添加する工程と
を具備することを特徴とする抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項２】
前記宿主細胞が、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有することを特徴とする請求項１に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が大腸菌由来であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項４】
前記アルキル化修復遺伝子が、大腸菌ａｄａ遺伝子であることを特徴とする請求項１乃至請求項３に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項５】
前記指標となる遺伝子が、大腸菌ｌａｃＺであることを特徴とする請求項１乃至請求項４に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項６】
前記アルキル化剤を添加する工程で、前記宿主細胞のＤＮＡがアルキル化されることを特徴とする請求項１乃至請求項５に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項７】
前記アルキル化剤を添加する工程で、前記ＤＮＡ上のグアニン塩基の６位の酸素原子がアルキル化されることを特徴とする請求項１乃至請求項６に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項８】
前記アルキル化剤が、ＭＮＮＧ（１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン；１−Ｍｅｔｈｙｌ−３−ｎｉｔｒｏ−１−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ＭＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア；Ｎ−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｕｒｅａ）、ＤＥＮ（Ｎ−ニトロソジエチルアミン；Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）又はＥＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−エチルウレア；Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｅｔｈｙｌｕｒｅａ）であることを特徴とする請求項１乃至請求項７に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項９】
前記アルキル化剤を添加する前に前記被検物質を添加する場合において、
前記ＤＮＡのアルキル化が抑制されることを特徴とする請求項１乃至請求項８に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１０】
前記アルキル化剤を添加する後に前記被検物質を添加する場合において、
前記ＤＮＡのアルキル化が抑制されることを特徴とする請求項１乃至請求項８に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１１】
自然発生的にアルキル化されている宿主細胞に被検物質を添加する工程を具備し、前記宿主細胞は、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有することを特徴とする抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞は、大腸菌由来であることを特徴とする請求項１１に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１３】
前記アルキル化修復遺伝子が、大腸菌ａｄａ遺伝子であることを特徴とする請求項１１又は請求項１２に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１４】
前記指標となる遺伝子が、大腸菌ｌａｃＺであることを特徴とする請求項１１乃至請求項１３に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ上のグアニン塩基の６位の酸素原子が自然発生的にアルキル化されることを特徴とする請求項１１乃至請求項１４に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１６】
宿主細胞にアルキル化剤を添加する工程と、前記宿主細胞に被検物質を添加する工程とを具備する抗アルキル化物質の探索方法、又は、自然発生的にアルキル化されている宿主細胞に被検物質を添加する工程を具備する抗アルキル化物質の探索方法であって、前記宿主細胞は、大腸菌由来であり、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有する抗アルキル化物質の探索方法によって、探索されたことを特徴とする抗アルキル化剤。
【請求項１７】
カプトプリン、キトサン、クロロフィリン、Ｌ−シトルリン、クルクミン、フィセチン、Ｌ−グルタチオン、フェネチルイソチオシアネート、ケルセチン、アスコルビン酸、ルチン、シスチアミン、エピカテキン、β−カロチン、キトサン及び／又はフォロログルシノールを含有することを特徴とする抗アルキル化剤。
【請求項１】
宿主細胞にアルキル化剤を添加する工程と、
前記宿主細胞に被検物質を添加する工程と
を具備することを特徴とする抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項２】
前記宿主細胞が、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有することを特徴とする請求項１に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項３】
前記宿主細胞が大腸菌由来であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項４】
前記アルキル化修復遺伝子が、大腸菌ａｄａ遺伝子であることを特徴とする請求項１乃至請求項３に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項５】
前記指標となる遺伝子が、大腸菌ｌａｃＺであることを特徴とする請求項１乃至請求項４に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項６】
前記アルキル化剤を添加する工程で、前記宿主細胞のＤＮＡがアルキル化されることを特徴とする請求項１乃至請求項５に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項７】
前記アルキル化剤を添加する工程で、前記ＤＮＡ上のグアニン塩基の６位の酸素原子がアルキル化されることを特徴とする請求項１乃至請求項６に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項８】
前記アルキル化剤が、ＭＮＮＧ（１−メチル−３−ニトロ−１−ニトロソグアニジン；１−Ｍｅｔｈｙｌ−３−ｎｉｔｒｏ−１−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、ＭＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア；Ｎ−Ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｕｒｅａ）、ＤＥＮ（Ｎ−ニトロソジエチルアミン；Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）又はＥＮＵ（Ｎ−ニトロソ−Ｎ−エチルウレア；Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｅｔｈｙｌｕｒｅａ）であることを特徴とする請求項１乃至請求項７に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項９】
前記アルキル化剤を添加する前に前記被検物質を添加する場合において、
前記ＤＮＡのアルキル化が抑制されることを特徴とする請求項１乃至請求項８に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１０】
前記アルキル化剤を添加する後に前記被検物質を添加する場合において、
前記ＤＮＡのアルキル化が抑制されることを特徴とする請求項１乃至請求項８に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１１】
自然発生的にアルキル化されている宿主細胞に被検物質を添加する工程を具備し、前記宿主細胞は、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有することを特徴とする抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞は、大腸菌由来であることを特徴とする請求項１１に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１３】
前記アルキル化修復遺伝子が、大腸菌ａｄａ遺伝子であることを特徴とする請求項１１又は請求項１２に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１４】
前記指標となる遺伝子が、大腸菌ｌａｃＺであることを特徴とする請求項１１乃至請求項１３に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ上のグアニン塩基の６位の酸素原子が自然発生的にアルキル化されることを特徴とする請求項１１乃至請求項１４に記載の抗アルキル化物質の探索方法。
【請求項１６】
宿主細胞にアルキル化剤を添加する工程と、前記宿主細胞に被検物質を添加する工程とを具備する抗アルキル化物質の探索方法、又は、自然発生的にアルキル化されている宿主細胞に被検物質を添加する工程を具備する抗アルキル化物質の探索方法であって、前記宿主細胞は、大腸菌由来であり、アルキル化修復遺伝子と指標となる遺伝子との融合遺伝子を有する抗アルキル化物質の探索方法によって、探索されたことを特徴とする抗アルキル化剤。
【請求項１７】
カプトプリン、キトサン、クロロフィリン、Ｌ−シトルリン、クルクミン、フィセチン、Ｌ−グルタチオン、フェネチルイソチオシアネート、ケルセチン、アスコルビン酸、ルチン、シスチアミン、エピカテキン、β−カロチン、キトサン及び／又はフォロログルシノールを含有することを特徴とする抗アルキル化剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−１４７１６（Ｐ２００６−１４７１６Ａ）
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２２２６３５（Ｐ２００４−２２２６３５）
【出願日】平成１６年７月１日（２００４．７．１）
【出願人】（５９８０８６８４４）株式会社メディネット (10)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月１日（２００４．７．１）
【出願人】（５９８０８６８４４）株式会社メディネット (10)
【Ｆターム（参考）】
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