抗癌化合物
【課題】抗癌化合物の提供。
【解決手段】本発明は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ種、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａ種、およびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ種の植物に由来する有効成分に存在する化合物または化合物の群に関し、またこれらの化合物を含有する薬学的組成物に関する。これらの植物からの抽出物は、いくつかの異なる癌細胞株に対して選択的細胞傷害性を示すことが見い出されている。これらの化合物は、癌、特に、悪性黒色腫および扁平上皮癌（ＳＣＣ）の有効処置において有用である。本発明の好ましい実施態様においては、この化合物は、ジャトロファン類、ペプルアン類、パラリアン類およびインゲナン類、ならびにこれらの薬学的に受容可能な塩またはエステルからなる群から選択され、より詳細には、立体配座ＩＩのジャトロファンである。
【解決手段】本発明は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ種、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａ種、およびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ種の植物に由来する有効成分に存在する化合物または化合物の群に関し、またこれらの化合物を含有する薬学的組成物に関する。これらの植物からの抽出物は、いくつかの異なる癌細胞株に対して選択的細胞傷害性を示すことが見い出されている。これらの化合物は、癌、特に、悪性黒色腫および扁平上皮癌（ＳＣＣ）の有効処置において有用である。本発明の好ましい実施態様においては、この化合物は、ジャトロファン類、ペプルアン類、パラリアン類およびインゲナン類、ならびにこれらの薬学的に受容可能な塩またはエステルからなる群から選択され、より詳細には、立体配座ＩＩのジャトロファンである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅファミリーに由来する有効成分に存在し、そして特にＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａ、およびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ種の植物中に存在する化合物または化合物の群に関する。これらの植物に由来する抽出物は、いくつかの異なる癌細胞株に対する選択的な細胞障害性を示すことが見いだされている。Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ種の樹液に存在する化合物は、癌、特に悪性黒色腫および扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）の効果的な処置において有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
日光の紫外線成分への皮膚の曝露と皮膚癌（例えば、悪性黒色腫および非黒色腫皮膚癌（おもに、基底細胞癌（ＢＣＣ）および扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）））の発症との間には強力な関連がある。これらの癌の発症率は、世界的に迅速に増大してきた。英国では、１９９４年に、４０００の新たに診断された悪性黒色腫の症例が存在し、これは過去１０年間で８０％の増加であった（Ｗｅｓｓｅｘ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｕｓｔ，１９９６）。米国では、約３４，１００の新たな症例が予想され、これは１年あたり４％の増大であった。オーストラリアのクイーンズランドは、世界で最も高い黒色腫の発症率を有するが、初期の検出および広範な公衆衛生キャンペーンならびに日焼け止めの使用および紫外線への曝露を減少することの奨励により、死者の数を減少させることに役立ってきた。ＢＣＣは、現在のところ、英国の人口の１，０００人に１人が罹患し、そして過去２０年でその発症率は２倍以上になっている（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ、英国、１９９７）。１９９０年の６００，０００および１９８０年の４００，０００に比較して、１９９７年には米国において、ＢＣＣおよびＳＣＣの１００万の新たな症例が診断されると予想されている（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｃｅａｎｉｃ ａｎｄ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９７）。オーストラリアでは、太陽の放射およびＵＶ放射の危険性（クイーンズランドの集団が最も大きな危険性にある）の広範な宣伝にもかかわらず、同様に増大する症例が同様に当てはまらないと予想する理由はない。
【０００３】
全ての皮膚癌の９０％を超えるものが、日光または他の紫外線の照射に規則的に曝されている皮膚の領域に生じ、ここで、Ｕ．Ｖ．Ｂ．は、皮膚の日焼けの原因であり、そして悪性の黒色腫に関連し、そしてＵ．Ｖ．Ａ．は、未成熟の皮膚の老化ならびにＢＣＣおよびＳＣＣの発症に関連する（Ｗｅｓｓｅｘ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｕｓｔ，１９９６）。幼少時の日光への曝露は、若年成人における悪性黒色腫の発症に関連付けられてきた。他の危険因子には、遺伝的素因（色白、多数の皮膚のほくろ）、化学的汚染、Ｘ線への過剰な曝露、ならびに何らかの薬物および殺虫剤に対する曝露が含まれる。成層圏のオゾン層の減少は、皮膚癌の長期的増加に貢献すると考えられている。
【０００４】
外科的切除が悪性黒色腫（ＢＣＣおよびＳＣＣ）に対するずばぬけて最も一般的な処置である。これは、電気乾燥療法および掻爬術、凍結外科、単純な広範な切除、顕微鏡的手術、またはレーザー治療の形態をとり得る。癌が発症の後期に検出された場合に使用される他の処置は、外因的放射線治療、化学療法、またはより低い程度に生体免疫治療または光力学的治療である。処置の選択は、疾患の型および段階に依存し、そして患者の年齢および健康に依存する（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９７）。
【０００５】
現在の処置の全てが重大な制限に悩んでいる。主要な懸念は、切除部位での癌細胞の認識が貧弱であること、および再発の可能性が高いことであり、そのため追尾手術および処置が必要になり、さらなる美観の損失および傷跡の危険性を伴う。１つの刊行物において、不完全に切り出されたＢＣＣの報告された割合は、３０〜６７％であった（ＳｕｓｓｍａｎおよびＬｉｇｇｉｎｓ、１９９６）。手術に伴う免疫抑制は、任意の残余の細胞の増殖を引き起こし得、そして転移の危険性を増大させ得る。黒色腫患者においては、最初の手術の時点で癌がすでに転移しているという高い危険性が存在し、そして死を導くその後の再発は一般的である。現在手術に替わるもの、例えば、放射線治療および化学療法はまた、免疫抑制および特異性の悪さの危険性を有する。免疫治療および遺伝子治療は、最も大きな期待を有しているが、これらの合理的な適用は、未だ何十年先であるようである。
【０００６】
腫瘍が手術の影響を受けやすい段階を過ぎた場合、全ての型の黒色腫または転移皮膚癌のための最も一般的な処置は、化学療法であり、これは大部分は成功を収めていない（ＢｅｌｊａｎｓｋｉおよびＣｒｏｃｈｅｔ、１９９６）。
【０００７】
理論的には、理想的な薬物は、曝露された黒色腫、ＢＣＣまたはＳＣＣに局所的に適用された場合に、周囲の健康な皮膚細胞に損傷を引き起こさずに選択的にその腫瘍細胞を壊死させるか、またはそれらがアポトーシスを経ることを誘導する薬物である。実際には、これはまだ達成されていない。現在利用可能な薬物は、選択的でも浸透性でもない。
【０００８】
専門家ではない大衆はまた、局所化学治療の概念に魅了される。皮膚癌のための多くの報告された「民間療法」が存在し、これらは悲惨な結果（例えば、靴磨きの使用）を有してきた（Ａｄｅｌｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐｅｒｓ． Ｃｏｍｍ．）。主要な危険性は瘢痕組織の生成であり、その下に腫瘍細胞が継続して増殖する。Ｓｏｌａｎｕｍ属の植物（カンガルーリンゴまたは悪魔のリンゴ）に由来し、そしてソラソジン（ｓｏｌａｓｏｄｉｎｅ）グリコシドを含有すると噂される抽出物は、サンスポット（ｓｕｎｓｐｏｔ）および日光性角化症の非処方調製物処置として「Ｃｕｒａｄｅｒｍ」の名の下にオーストラリアで入手可能である。しかし、その調製物は、小さな臨床的試行においてＢＣＣに対して効果的でないことが示され、２０人の患者のうちの１４人が処置された部位由来の組織の組織学的検査において持続的腫瘍を示した。いくつかの症例において、処置の部位の組織学的検査は、瘢痕組織に包埋された悪性組織を明らかにした。執筆者らは、自己診断および処置（特に刺激物質での）に対して警告した（Ｆｒａｎｃｉｓら、１９８９）。
【０００９】
しかし、秘話的報告は、植物樹液抽出物が、サンスポットまたは日光性角化症の処置に一般公衆によって未だに使用され、いくつかの成功例が主張されていることを示唆する。
【００１０】
Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅファミリーの植物、特にＥｕｐｈｏｒｂｉａ属の樹液は、多くの国々の民間療法において使用されてきた。この属は、その意図された医学的特性を考慮して昔のギリシャ人の内科医にちなんで名付けられた（Ｐｅａｒｎ，１９８７）。ほんの最近になって、これらの主張のいくつかが科学的に調査されるようになった。この属は、非常に広範であり、小さな丈の低い草木性の植物から低木および木までの範囲にわたる。これらの植物およびその抽出物の活性のほとんど全ての報告が、逸話的であるか、または伝統的な医学に由来し、そして使用されるその調製物の性質は、未知であるかまたは非常に貧弱に記載されているかのいずれかである場合が頻繁である。いぼ、「病的増殖物」、胼胝、「ケロイド腫瘍」、魚の目、ひょう疽（ｗｈｉｔｌｏｗもしくはｆｅｌｏｎ）、「余分な肉（ｓｕｐｅｒｆｌｕｏｕｓ ｆｌｅｓｈ）」などから、種々の癌までにわたる非常に種々の状態に対して活性が主張されている（例えば、Ｈａｒｔｗｅｌｌ：Ｌｌｏｙｄｉａ １９６９ ３２ １５３を参照のこと）。
【００１１】
米国国立ガン研究所によって行われた３５，０００の陸生植物種からの１１４，０００の抽出物について行われた抗癌活性についてのスクリーニングプログラムの一部として、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａの多数の種が試験された。水性の懸濁液、オリーブ油懸濁液、アルコール抽出物、および酸抽出物が移植可能な癌細胞株肉腫３７に対する活性についてスクリーニングされた。４つの種が試験された。これらのうち、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓは、その抽出物のいずれにおいても活性を示さなかった；Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ、およびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａは、酸抽出物、アルコール抽出物、およびオリーブ油懸濁液のそれぞれの弱い活性を示した（ＢｅｌｋｉｎおよびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ，１９５３）。過去５年間の科学的および医学的文献の総説は、広範な強力な有効成分（例えば、この属におけるジ、およびテトラテルペン、フラボノイド、ステロール、およびタンパク質）を明らかにし、そして多くの生物活性効果が、記録された陽性および悪性効果の両方について報告されている。これらの報告は表１に要約される。特に、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ属は、ホルボールエステルのような腫瘍プロモーターを生成することが周知である（Ｈｅｃｋｅｒ，Ｅ．：「Ｃｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ ｆｒｏｍ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ ａｎｄ Ｔｈｙｍｅｌｅａｃｅａｅ」 「Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｇｎｏｓｙ ａｎｄ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｗａｇｎｅｒら、編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
Ｖｅｒｌａｇ １９７０ １４７−１６５）。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【００１４】
【００１５】
この群のなかで最も重点的に研究されている種は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ Ｌ（同義語Ｅ．ｈｉｒｔａ Ｌ．；Ｅ．ｃａｐｉｔａｔａ Ｌａｍ．）であり、その一般的な名称は、ピル保有（ｐｉｌｌ−ｂｅａｒｉｎｇ）トウダイグサ、ヘビグサ（ｓｎａｋｅ−ｗｅｅｄ）、ネコの毛、クイーンズランド喘息草（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ ａｓｔｈｍａ ｗｅｅｄ）、および花様頭（ｆｌｏｗｅｒｙ−ｈｅａｄｅｄ）トウダイグサを含む。その植物は、インドを含む熱帯諸国およびクイーンズランドを含む北オーストラリアに広く分布している。「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｏｍｍｏｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｆｏｏｄ， Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ」（ＬｅｕｎｇおよびＦｏｓｔｅｒ、１９９６）によれば、その顕花植物または子実植物（ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｐｌａｎｔ）の全体が、薬草療法（基本的には咳用調製物のため）に、および呼吸器の状態（例えば、喘息、気管支炎、咳、および枯草熱）の処置のための伝統的な薬物において使用される。この参考文献は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａの活性成分が、コリンおよびシキミ酸であり、そして存在する他の化合物には、トリテルペン、ステロール、フラボノイド、ｎ−アルカン、フェノール酸、Ｌ−イノシトール、糖および樹脂が含まれることを報告する。これらの成分のうち、シキミ酸は、芳香族アミノ酸の合成における重要な中間体であり、そしてマウスにおいて発ガン活性を有することが報告されている（ＥｖａｎｓおよびＯｓｍａｎ、１９７４；ＳｔａｖｒｉｃおよびＳｔｏｌｔｚ、１９７６）。ジャトロファン（ｊａｔｒｏｐｈａｎｅ）、インゲナン（ｉｎｇｅｎａｎｅ）、およびペプルアンと名付けられた四環系ジテルペンは、Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら（１９９８ａ）によってＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓの樹液の中に同定された。ジャトロファンは、以前に公知であったジャトロファンのコンホメーションとは異なるコンホメーションを有すると記載された。ジャトロファンはまた、非刺激性のジテルペンの群に属すると記載され、このことはそれらが以前の研究において過誤されたことを説明しうるかもしれない。ジャトロファンまたは新たなペプルアン化合物のいかなる生物学的活性の開示も示唆も少しもない；またこれらの化合物のいずれかが任意の薬学的目的のために有用であり得ることを示唆もされていない。
【００１６】
最近の報告は、北ナイジェリアに見つけられる高度に毒性である植物であるＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｏｉｓｏｎｉｉの乳液由来の多数のチグリアン（ｔｉｇｌｉａｎｅ）ジテルペンエステルの選択的な細胞傷害性を記載し、これは園芸用殺虫剤として使用され、そして殺人に使用されると一般に考えられている。これらの化合物の１つは、アドリアマイシンの細胞傷害性よりも１０，０００倍を超えるヒトの腎臓癌細胞株Ａ−４９８に対する選択的な細胞傷害性を有する（Ｆａｔｏｐｅら、１９９６）。
【００１７】
一連の特許出願において、Ｔａｍａｓは、癌治療（ＥＰ３３００９４）、ＡＩＤＳ関連複合体およびＡＩＤＳ（ＨＵ−２０８７９０）、ならびに免疫を増強することおよび開放創の処置のための抗菌剤として（ＤＥ−４１０２０５４）、を含む種々の目的のためのＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａ植物およびその抽出物の使用を主張している。
【００１８】
従って、種々のＥｕｐｈｏｒｂｉａ調製物の抗癌活性の単離された報告が存在する一方（Ｆａｔｏｐｅら、１９９６；Ｏｋｓｕｚら、１９９６を参照のこと）、少なくとも１つのＥｕｐｈｏｒｂｉａ種に存在する化合物が発ガン性であると報告されたのみでなく（ＥｖａｎｓおよびＯｓｍａｎ、１９７４；ＳｔａｖｒｉｃおよびＳｔｏｌｚ、１９７６；Ｈｅｃｋｅｒ、１９７０；１９７７）、少なくとも１つの種が皮膚刺激性および腫瘍促進効果を有し（Ｇｕｎｄｉｄｚａら、１９９３）、そして別の種がバーキットリンパ腫においてＥＢＶ−特異的細胞免疫を減少させる（Ｉｍａｉ、１９９４）。
【００１９】
本発明らの知る限りでは、悪性黒色腫またはＳＣＣの処置のためのＥｕｐｈｏｒｂｉａ種からの任意の抽出物の使用の信頼性のあるかまたは再現性のある報告はこれまで存在しなかった。ＢＣＣのＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ（微量のトウダイグサ（ｐｅｔｔｙ ｓｐｕｒｇｅ）またはミルク草（ｍｉｌｋ ｗｅｅｄ））の乳液での在宅治療の逸話的な報告は、「Ｈｏｍｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」（１９７６）と題されたＷｅｅｄｏｎ，Ｄ．およびＣｈｉｃｋ，Ｊ．の刊行物であった。執筆者らは、医学的な特性がＧａｌｅｎの時点からこの植物の乳状の汁について主張されており、そして魚の目、いぼ、および喘息のための民間療法として広く使用されたことを記載した。その世紀の半ばにおいて、それは蚕食性潰瘍の処置のためにシドニーの何人かの内科医によって使用された。執筆者らの患者は、複数のＢＣＣについて何年もにわたって彼自身を処置してきたと主張した。
【００２０】
「その患者（５４歳の男性）は、１９７１年以来、時々Ｒｏｙａｌ Ｂｒｉｓｂａｎｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌに来診していた。ある来診の時に、彼は、彼の胸の前部に臨床的な基底細胞癌（これは、その端から採取した小さな標本の生検によって確認された）を有することが認められた。数日後、その生検部位が治癒した時、その患者はＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓの樹液を５日間毎日塗布した。その領域は、紅斑性になり、次いで膿疱性になり、その後その病変は脱落した。処置の６週間後に彼が戻ったとき、その患者は、残っている傷跡の小領域を外科的に切り出すことに同意した。複数の切片が数個の慢性炎症性細胞を含んだ皮膚瘢痕組織を示したが、残余の腫瘍の証拠は示さなかった。」
その執筆者らは、「この通信はその治療の形態を推奨するものとして受け取られるべきものでは決してない」と記載した。樹液の腐食性の性質、およびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓを使用するいぼの在宅治療から生じるわずかな目の損傷に対して警告するいくつかの報告が存在する（Ｅｋｅ，Ｔ．、１９９４）。ＷｅｅｄｏｎおよびＣｈｉｃｋによって報告された効果は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ
ｐｅｐｌｕｓ樹液の刺激活性から生じ、そしてＦｒａｎｃｉｓら（１９８９）によって報告されたＳｏｌａｎｕｍ抽出物「Ｃｕｒａｄｅｒｍ」の場合と同様に、このような処置から生じる瘢痕組織の中にまたはその下に生存する残余の癌組織の高い危険性が存在する。
【００２１】
本発明者は現在、驚くべきことに、３つの異なるＥｕｐｈｏｒｂｉａ種である、Ｅｕｐｈｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａ、およびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉに由来する植物の樹液が、悪性黒色腫を含む３つの異なるヒト癌細胞株の増殖を特異的に阻害することを見いだした。さらに、非常に低い濃度で、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓおよびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａに由来する樹液が、悪性黒色腫細胞が正常なメラニン細胞の形態学的外観に適合するように、それらの分化を誘導した。類似のまたはさらに低い濃度で、抽出物は、メタロチオネイン遺伝子プロモーターの活性化およびＭＭ９６Ｌ悪性黒色腫細胞におけるレポーター遺伝子の発現を刺激した。その結果は、特に顕著であった。なぜなら、使用された黒色腫細胞株は、それに対して試験された従来の化学療法剤の全てによる阻害に対して抵抗性であるからである（ＭａｙｎａｒｄおよびＰａｒｓｏｎｓ、１９８６）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
第一の局面において、本発明は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ属の植物、特にＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａ、および／またはＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉの樹液に存在する化合物を提供する。その化合物は：（ａ）癌細胞を殺傷またはその増殖を阻害し得るが、正常な新生仔の線維芽細胞または自発的に形質転換したケラチノサイトに有意に影響を与えず；（ｂ）９５℃で１５分間加熱することによって破壊されない活性を有し；（ｃ）アセトンによる処理によって破壊されない活性を有し；（ｄ）９５％エタノールで抽出し得る活性を有し；そして（ｅ）メタロチオネイン遺伝子活性化を刺激する。
【００２３】
好ましくは、その化合物（単数または複数）は、本明細書中で規定されるＭＭ９６Ｌ、ＭＭ２２９、ＭＭ２２０、ＭＭ２３７、ＭＭ２０５８、Ｂ１６、ＬＩＭ１２１５，ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＭＣＣ１６、およびＣｏｌｏ１６からなる群から選択された少なくとも１つの細胞株の増殖を阻害し得る。より好ましくは、その化合物（単数または複数）は、ＭＭ９６Ｌ細胞における増殖を阻害し得るか、または分化を誘導し得る。
【００２４】
さらにより好ましくは、その化合物はまた、正常なメラニン細胞の増殖を誘導し得る。
【００２５】
好ましくは、その化合物はＥ．ｐｅｐｌｕｓまたはＥ．ｈｉｒｔａの樹液中に存在する。
【００２６】
本発明が樹液または樹液抽出物において検出される化合物を参照して詳細に記載されるが、これらの化合物は、植物全体またはその一部に存在するかまたはそれらから抽出された場合、なお本発明の範囲内にあることが明確に理解される。
【００２７】
第二の局面において、本発明は、上記のような活性化合物を薬学的に適切なキャリアまたは希釈剤とともに含む組成物を提供する。
【００２８】
より好ましくは、その化合物は、ジャトロファン、ペプルアン、パラリアン、およびインゲナンからなる群から選択される。
【００２９】
その化合物がジャトロファンである場合、それは好ましくはＪａｋｕｐｏｖｉｃら（１９９８ａ）によって定義される立体配座ＩＩである。天然に生じるジャトロファン、ペプルアン、およびパラリアン骨格において観察される置換体は、本発明の範囲内であることが明確に理解される。これらは、以下の置換体およびアナログを含む。
【００３０】
この型の化合物は、Ｅｕｐｈｏｂｉａ属の種々の植物において見いだされている（Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら、１９９８ａ、ｂ、ｃ；Ｍａｒｃｏら、１９９８）。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【００３３】
さらにより好ましくは、この化合物は、以下から成る群およびそれらの薬学的に受容可能な塩またはエステルから選択される：
５，８，９，１０，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシペプルアン（ペプルアン（ｐｅｐｕｌｕａｎｅ））；
１５−ペンタアセトキシ−９−ニコチノイルオキシ−１４−オキソヤトロファ−６（１），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン（ｊａｔｒｏｐｈａｎｅ）１）；
２，５，７，９，１４−ヘキサアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシ−ヤトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン２）；
２，５，１４−トリアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシ−９−ニコチノイルオキシヤトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン３）；
２，５，９，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシヤトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン４）；
２，５，７，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−９−ニコチノイルオキシヤトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン５）；
２，５，７，９，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシヤトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン６）；２０−アセチル−インゲノール（ｉｎｇｅｎｏｌ）−３−アンゲレート（ａｎｇｅｌａｔｅ）。
【００３４】
本発明の１つの好ましい実施態様において、この組成物は、β−アラニンベタイン塩酸塩またはｔ−４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロリンをさらに包含する。
【００３５】
第３の局面において、本発明はガンの処置方法を提供し、この方法は、抗ガン有効量の本発明の化合物を、このような処置を必要とする哺乳動物へと投与する工程を包含する。
【００３６】
好ましくは、このガンは固形ガンである。より好ましくは、このガンは以下から成る群から選択される：悪性黒色腫、メルケル（Ｍｅｒｋｅｌ）細胞ガンと扁平上皮細胞ガンと基底細胞ガンとを含む他の皮膚ガン、肺ガン、結腸ガン、前立腺ガン、頸部ガンおよび乳ガン。
【００３７】
第４の局面において、本発明は新形成性細胞の増殖活性を阻害する方法を提供し、この方法は、この細胞を、抗増殖量の本発明の化合物へと曝す工程を包含する。これらの細胞はエキソビボまたはインビボのいずれかで処置され得る。
【００３８】
第５の局面において、本発明は、紫外線の照射、電離放射線、マイクロ波照射、オゾンへの曝露などによって生じる、皮膚に対する損傷を予防または軽減する方法を提供し、この方法は有効量の本発明の化合物をこのような処置を必要とする被験体に局所的に投与する工程を包含する。本発明はこの局面において、日光性角化症、放射線治療の間に生じる皮膚損傷などの処置に使用され得る。
【００３９】
第６の局面において、本発明は非新形成性細胞の増殖を刺激する方法を提供し、この方法は、この細胞を、増殖を誘導する量の本発明の化合物または組成物へと曝す工程を包含する。これは組織の再生を誘導するに有用であり、そして、Ｔ−リンパ球が本発明の組成物に応答して増殖するので、疾患状態に対する免疫応答を促進するに有用である。
【００４０】
哺乳動物はヒトであり得るか、または家畜もしくはペット（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ａｎｉｍａｌ）であり得る。本発明の化合物はヒトの医療的処置での使用について適切であることが特に意図されるが、イヌおよびネコのようなペット、およびウマ、ウシおよびヒツジのような家畜、またはネコ科動物、イヌ科動物、ウシ科動物および有蹄動物のような動物園の動物の処置を含む、獣医学的処置にもまた適応可能である。
【００４１】
本発明の化合物および組成物は任意の適切な経路によって投与され得、そして当業者は処置される症状に対して最も適切な経路および用量を容易に決定し得る。用量は臨床の医師または獣医師の裁量により、そして処置される症状の性質および状態、処置される被験体の年齢および全体的な健康状態、投与経路ならびに施されたかもしれない以前の処置に依存する。
【００４２】
キャリアまたは希釈剤、および他の賦形剤は投与経路に依存し、そして当業者はやはり各々の特定の症例について最も適切な処方を容易に決定し得る。本発明の化合物は、経口的、局所的および／または非経口的注入（静脈内注射を含む）によって投与され得ることが意図される。
【００４３】
薬学的組成物の調製のための方法および薬学的キャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡのような教科書に記載のように、当該分野において周知である。
【００４４】
本明細書の目的のために、用語「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは「含むが、限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ
ｔｏ）」を意味し、そして用語「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」が対応する意味を有することは、明らかに理解される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１） Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ属の植物、特に、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａおよび／またはＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉの樹液に存在する化合物であって、
（ａ）癌細胞を死滅または癌細胞の増殖を阻害し得るが、正常新生仔線維芽細胞または自発的に形質転換したケラチノサイトに有意に影響を与えない；
（ｂ）９５℃１５分間の加熱によって破壊されない活性を有する；
（ｃ）アセトンでの処理によって破壊されない活性を有する；
（ｄ）９５％エタノールを用いて抽出され得る活性を有する；かつ
（ｅ）メタロチオネイン遺伝子活性化を刺激する、
化合物。
（項目２） 本明細書中で定義される、ＭＭ９６Ｌ、ＭＭ２２９、ＭＭ２２０、ＭＭ５３７、ＭＭ２０５８、ＨｅＬａ、Ｂ１６、ＬＩＭ１２１５、Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＭＣＣ１６およびＣｏｌｏ１６からなる群から選択される少なくとも１つの細胞株の増殖を阻害し得る、項目１に記載の化合物。
（項目３） ＭＭ９６Ｌ細胞の増殖を阻害またはＭＭ９６Ｌ細胞の分化を誘導し得る、項目２に記載の化合物。
（項目４） 正常メラニン細胞および／またはＴ細胞の増殖もまた誘導し得る、項目１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
（項目５） 薬学的に受容可能なキャリアまたは化粧品的に受容可能なキャリアとともに、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物を含有する組成物。
（項目６） 前記化合物が、ジャトロファン類、ペプルアン類、パラリアン類およびアンゲロイル置換インゲナン類、またはこれらのアセチル化誘導体、ならびにこれらの薬学的に受容可能な塩またはエステルからなる群から選択される、項目５に記載の組成物。
（項目７） 前記化合物が立体配座ＩＩのジャトロファンである、項目６に記載の組成物。
（項目８） 前記化合物が表２で定義されるように置換されている、項目６または項目７に記載の組成物。
（項目９） 前記化合物が以下からなる群から選択される、項目５〜８のいずれか１項に記載の組成物：
５，８，９，１０，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシペプルアン（ペプルアン）；
１５−ペンタアセトキシ−９−ニコチノイルオキシ−１４−オキソジャトロファ−６（１），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン １）；
２，５，７，９，１４−ヘキサアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシ−ジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン ２）；２，５，１４−トリアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシ−９−ニコチノイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン ３）；
２，５，９，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン ４）；
２，５，７，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−９−ニコチノイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン ５）；
２，５，７，９，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン ６）；
２０−アセチル−インゲノール−３−アンゲレート；
およびこれらの薬学的に受容可能な塩またはエステル。
（項目１０） 前記キャリアが、β−アラニンベタインヒドロクロリドまたはｔ−４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロリンを含有する、項目５〜９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１１） 癌を処置する方法であって、抗癌に有効な量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物を、このような処置が必要な哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目１２） 前記癌が固形腫瘍である、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 前記癌が、悪性黒色腫、メルケル細胞癌、扁平上皮癌および基底細胞癌を含む他の皮膚癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、頸癌、および乳癌からなる群から選択される、項目１１または項目１２に記載の方法。
（項目１４） 放射線治療するためまたはＤＮＡ損傷物質を用いて治療するためのアジュバントとして使用される、項目１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５） 腫瘍形成細胞の増殖活性を阻害する方法であって、該細胞を、抗増殖量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１６） 非腫瘍形成細胞の増殖を刺激する方法であって、該細胞を、増殖誘導量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１７） Ｔ細胞の活性および／またはＴ細胞の増殖の誘導を刺激する方法であって、該細胞を、有効量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１８） 項目１６に記載の方法に従って免疫系の細胞を刺激することによって疾患状態を軽減する方法。
（項目１９） 腫瘍形成細胞の分化を誘導する方法であって、該細胞を、有効量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物に曝露する工程を包含する、方法
（項目２０） 前記細胞がインビボで処置される、項目１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１） 前記細胞がエキソビボで処置される、項目１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２） 紫外線照射、電離放射線、マイクロ波照射、またはオゾンへの曝露によって引き起こされる皮膚への損傷を予防または緩和する方法であって、このような処置を必要とする被験体に、有効量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物を局所投与する工程を包含する、方法。
（項目２３） 前記損傷が日光性角化症である、項目２２に記載の方法。
（項目２４） 前記損傷が放射線治療の間に起こる、項目２２に記載の方法。
（項目２５） 前記哺乳動物がヒトである、項目１１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６） 癌の処置における、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（項目２７） 紫外線照射、電離放射線、マイクロ波照射、またはオゾンへの曝露によって引き起こされる皮膚への損傷を予防または軽減するための、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（項目２８） 癌の処置における、項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目２９） 紫外線照射、電離放射線、マイクロ波照射、またはオゾンへの曝露によって引き起こされる皮膚への損傷を予防または軽減するための、項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目３０） 癌の処置のための医薬の製造における、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目３１） 紫外線照射、電離放射線、マイクロ波照射、またはオゾンへの曝露によって引き起こされる皮膚への損傷を予防または軽減するための医薬の製造における、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目３２） 非腫瘍形成細胞の増殖を誘導するための医薬の製造における、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの樹液のメタロチオネイン遺伝子の活性化に対する効果を示し、これは発色性基質を使用してβ−ガラクトシダーゼの活性を検出することによって測定された。
【図２】図２は、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの樹液の存在下で７日間マイクロタイタ−ウエル中で増殖したＭＣＦ７乳ガン細胞の増殖度を示す（コントロール値に対するパーセントとして表す）。
【図３】図３は、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの樹液のエタノール可溶性抽出物のＲＰ−ＨＰＬＣ細分画の後の、１９５ｎｍでの吸光度プロフィールを示す。
【図４】図４は、図３由来のフラクション１４を繰り返しＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにかけた結果を示す。
【図５】図５は、図４由来のピークの定常ダイオードアレイ（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ）スペクトルを示す。
【図６】図６は、ＭＭ９６Ｌ黒色腫細胞の、実施例７由来のフラクション１５での処置の結果を示す。細胞は抗体ＴＲＰ−１で染色し、この抗体は細胞骨格に対して指向される。Ａ、Ｂ（４日目）、Ｃ、Ｄ（２１日目）。
【図７】図７は、展開溶媒としてクロロホルム：酢酸エチル（８２：１８）を用いる、実施例６由来のエーテル可溶性画分の薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【図８】図８は、一次元ではヘキサン：酢酸エチル（１：１）、および二次元ではトルエン：アセトン（９：１）を用いる、シリカゲルでの二次元ＴＬＣによってのさらなる精製の結果を示す。 Ａ：スポット３４〜４５は、ＵＶ光ボックスで可視化された。活性は、５００分の１の希釈で、ＭＭ９６Ｌに対してスコアした（＋＋＋＝効果無し、−＝完全な細胞の死滅、ｄ＝細胞の樹状外観への１００％の復帰。 Ｂ：スポット１４〜２０は、ＵＶ光ボックスで可視化された。活性は、５００分の１の希釈で、ＭＭ９６Ｌに対してスコアした（＋＋＋＝効果無し、−＝完全な細胞の死滅、ｄ＝細胞の樹状外観への１００％の復帰。 Ｃ：スポット２１〜２７は、ＵＶ光ボックスで可視化された。活性は、５００分の１の希釈で、ＭＭ９６Ｌに対してスコアした（＋＋＋＝効果無し、−＝完全な細胞の死滅、ｄ＝細胞の樹状外観への１００％の復帰。
【図９】図９は、トルエン：アセトン（９：１）溶媒系を用いるＨＰＴＬＣでの、粗樹液の上昇クロマトグラフィーの結果を示す。不透明バンド１〜７は、ＵＶ光ボックスで可視化された。
【図１０】図１０は、ヘキサン：酢酸エチル（４：１）溶媒系を用いるＨＰＴＬＣでの、図９由来のフラクション１の上昇クロマトグラフィーの結果を示す。バンドＡ〜Ｇは、ＵＶ光ボックスで可視化された。（クロロホルム中０．１％ヨウ素で染色した側面のストリップによりフラクションＧが明らかにされた−ＭＭ９６Ｌに対して不活性）。
【図１１】図１１は、ヘキサン：酢酸エチル（４：１）溶媒系を用いるＨＰＴＬＣでの、図９由来のフラクション１の上昇クロマトグラフィーの結果を示す。バンドＨは、ＵＶ光ボックスで可視化された。
【図１２】図１２は、ヘキサン：酢酸エチル（４：１）溶媒系を用いる分取薄層クロマトグラフィー（ＰＬＣ，Ｍｅｒｃｋ）での、粗樹液から調製したジエチルエーテル可溶性画分の上昇クロマトグラフィーの結果を示す。領域ＨおよびＡ〜Ｆは、ＵＶ光ボックスで可視化され、抽出され、そしてインビボ実験に使用された。
【図１３】図１３は、ヌードマウスにおける皮下のヒト黒色腫ＭＭ９６Ｌ異種移植片の、実施例１１に記載のように調製された部分的に精製された画分での処置の結果を示す。矢印は腫瘍（右手側）および正常皮膚（背中上部）についての局所処置の位置を示す。処置レジメ開始後３２日目、および最初の局所適用の２０日目に、残留する腫瘍の増殖または正常皮膚に対する存続する損傷の証拠は存在しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、以下の非限定的な実施例および図面のみを参照として、詳細に記載される。
【００４７】
（実施例１）
（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ樹液の腫瘍細胞株に対する阻害活性）
３つのＥｕｐｈｏｒｂｉａ種（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａおよびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ）の樹液の、３つの異なる腫瘍細胞株の増殖を阻害する能力を試験した。正常皮膚線維芽細胞に対する活性をコントロールとして試験した。
【００４８】
これらの細胞株を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ培地中で維持し、そしてアッセイを同じ培地中で行った。
【００４９】
樹液を、Ｓｏｕｔｈ−Ｅａｓｔ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｃｏａｓｔ ｈｉｎｔｅｒｌａｎｄ、Ｐａｌｍｗｏｏｄｓにある農地の耕土で無作為に成長させた植物から回収した。この植物の幹表面を、７０％エタノールで簡単に洗浄し、そしてエタノールで洗浄したはさみを使用して幹を切り、そして乳白色乳濁樹液を流出させた。この樹液を１０ｍｌの滅菌プラスチック遠心分離チューブに回収し、４℃でＢｒｉｓｂａｎｅに輸送し、そして−２０℃で凍結保存した。使用前に、この樹液を、滅菌１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水を使用して、３１２５分の１まで順次５倍づつ希釈した。各希釈の１０μＬアリコートを、１００μｌの細胞株を含むマイクロタイタープレートウエルのそれぞれ２つに添加した。アッセイは２連で行った。
【００５０】
５日後、細胞をコントロール未処理細胞サンプルと比較しての増殖の阻害について、盲検で（ｂｌｉｎｄ）試験した。この結果を表３〜６に要約する。ここで試験した細胞株は、
ＮＦＦ 正常皮膚線維芽細胞
ＭＭ９６Ｌ 悪性黒色腫、脳転移
ＨｅＬａ 頸部ガン
ＨＡＣａｔ 自発性形質転換ヒトケラチノサイト
であり、そして、尺度は、０＝効果無し〜５＝完全な細胞の死滅、である。
【００５１】
表見出しでの希釈は、培養物への添加前のサンプルの希釈を指す。それゆえ、最終培養物中での希釈は、さらに約１０倍高い。
【００５２】
【表３】
【００５３】
【表４】
【００５４】
【表５】
【００５５】
【表６】
【００５６】
これらの結果から、以下のことが見出され得る：
ａ）Ｅ．ｐｅｐｌｕｓは、ＨｅＬａ細胞に対して活性であり、そしてＭＭ９６Ｌ細胞に対してはより少ない程度で活性であった。
ｂ）Ｅ．ｈｉｒｔａは、ＭＭ９６Ｌ細胞に対して活性であり、そしてＨｅＬａ細胞に対して非常に強力に活性であった。
ｃ）Ｅ．ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉは、ＭＭ９６Ｌに対して他の２つのサンプルよりも低い効果を有し、そして試験した最も高い濃度でのみＨｅＬａ細胞を阻害した。
ｄ）ＮＦＦ正常線維芽細胞は１／５の希釈で激しく影響をうけたが、しかし他の希釈度では温和に影響をうけたのみであった。例えば、１／２５の希釈では、ＮＦＦ細胞の阻害は温和（評点２）だったが、ＭＭ９６Ｌ細胞の阻害は激しかった（評点４）。１／１２５の希釈では、ＮＦＦ細胞に対する効果は観察されなかった（評点０）が、ＭＭ９６Ｌ細胞の激しい阻害（評点４）が１サンプルについて観察され、そして２連の他のサンプルではより温和な阻害（評点１）が観察された。ＨＡＣａｔ細胞（これは正常ケラチノサイトの代表としてみなされ得る）は、最も高い濃度でのみ阻害された。
【００５７】
高い濃度のＥ．ｐｅｐｌｕｓ樹液では、ＭＭ９６細胞が直接的に殺傷されることは明らかであった。しかし、（１／６２５の希釈までの）低い濃度では、増殖阻害は観察されなかったが、生存する細胞は樹状であり、そして正常メラニン細胞の外観を呈していた。提案されるいずれのメカニズムにも制限されることは望まないが、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの樹液は、ＤＮＡを損傷する直接的に細胞傷害性の因子よりむしろ、分化を促進する少なくとも１つの因子を含み得ると見られる。
【００５８】
（実施例２）
（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ樹液の活性に対する熱処理またはアセトン処理の影響）
実施例１に記載される実験を、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓおよびＥ．ｈｉｒｔａについて、異なる細胞株調製物、異なる植物サンプルおよび異なる評点スケールを使用して、異なる人物により反復した。
【００５９】
これらのサンプルは、実施例１に記載のように調製したか、または熱もしくはアセトンでの処理に供したかのいずれかである。植物樹液の希釈していない抽出物を９５℃で１５分間、加熱した。アセトン処理については、４０μｌの抽出物を４００μｌのアセトン中に懸濁し、そしてチューブをボルテックスミキサーで振盪した。内容物を１０，０００ｇで３分間遠心分離し、そして上清（アセトン可溶性画分）を別のチューブに取り出した。ペレットおよび上清の両方を、開口したチューブ中で室温で排気ファンを作動させたヒュームフード中に一晩放置して残留アセトンをエバポレートした。
【００６０】
これらの結果を表７〜９に示す。ここで、＋＋＋は効果無しを示し、そして−は１００％の細胞の死滅を示す。「Ｃ」は、培養物が汚染されたことを示す。この評価スケールを使用すると、これらの結果は実施例１におけるよりもさらに著しく、１：３１２５の希釈まで強力な阻害活性が観察された。しかし、ＮＦＦ細胞のいくらかの増殖阻害がこの実験において見出された。
【００６１】
熱またはアセトンのいずれも抗腫瘍活性に有意に影響を与えなかった。アセトン処理を行った場合、いくらかの活性は可溶性画分中にも見出されたが、ほとんどの活性はペレット中に見出された（特にＥ．ｈｉｒｔａの場合）。このことは、原因である化合物はその性質においてタンパク質ではなく、そして少なくとも１つの成分が脂質であり得ることを示唆する。
【００６２】
【表７】
【００６３】
【表８】
【００６４】
【表９】
【００６５】
（実施例３）
（Ｅ．ｐｅｐｌｕｓを使用するさらなる試験）
Ｅ．ｐｅｐｌｕｓはこれらの実験で試験した３つの植物の最も豊富なものであるので、さらなる実験にはこの種からの抽出物を使用した。このことは、活性が他の２つの種に存在しないことを意味すると考慮されるべきではない。
【００６６】
ＮＦＦおよびＭＭ９６Ｌ細胞に加えて、ＭＭ２２９およびＭＭ２２０ヒト悪性黒色腫細胞ならびにＢ１６マウス悪性黒色腫細胞株を使用して、実施例２を繰り返した。コントロールとして等量の水、ならびにアセトン処理後のペレットおよび上清画分の１／２０〜１／１２５００の希釈物の添加を使用して、アッセイを２連で行った。この結果を表１０に要約する。
【００６７】
【表１０】
【００６８】
これらの結果により、実施例２で得られた結果が確認される。１／１００〜１／５０の希釈では、ＮＦＦ細胞に対する効果はないが、ＭＭ９６Ｌ細胞の有意な阻害が観察された。これらの希釈で生存する黒色腫細胞は、正常なメラニン細胞の外観を呈した。他の２種のヒト黒色腫細胞株およびマウス黒色腫細胞株の阻害もまた、観察された。
【００６９】
同様の結果が、メルケル細胞ガン（ＭＣＣ１６）または扁平上皮細胞ガン（Ｃｏｌｏ６）細胞を使用して得られた。これらの結果を表１１に示す。
【００７０】
扁平上皮細胞ガンによって、５００，０００分の１の希釈でさえ、樹状細胞形態が示された。この粗抽出物の非常に強い力価はまた、メルケル細胞阻害に対しても明らかであり、これは、５００，０００分の１の希釈でもまた、なお明らかであった。
【００７１】
【表１１】
【００７２】
（実施例４）
（Ｅ．ｐｅｐｌｕｓのエタノール抽出物）
Ｅ．ｐｅｐｌｕｓからの樹液の新鮮な調製物を、９５％水性エタノールでの抽出に供した。減圧遠心分離によって抽出後の可溶性画分からエタノールを取り除き、そしてこの画分を、５％ウシ胎仔血清および抗生物質を含む組織培養培地（ＲＰＭＩ１６４０）中に、その最初の容量まで再構成した。エタノール抽出後に残存するペレットを減圧遠心分離により乾燥させ、そして上記のように組織培養培地中に、その最初の容量まで再構成した。粗樹液（Ｃ）、可溶性画分（Ｓ）およびペレット（Ｐ）を上記のようにＮＦＦ細胞、黒色腫細胞株ＭＭ９６Ｌ、ＭＭ５３７、ＭＭ２２９およびＭＭ２０５８ならびにまた、結腸ガン細胞株ＬＩＭ１２１５および肺ガン細胞株Ａ５４９に対して試験した。アッセイを３連で行い、そしてサンプル添加後に４日間培養した後に評価した。この結果を表１２に示す。ここで、＋は細胞の正常な外観を示し、＋＋は細胞数における可能な増加を示し、そして−は細胞の死滅を示す。
【００７３】
【表１２】
【００７４】
得られた結果は、以前の実験の結果と整合した。やはり低用量でも、ＭＭ９６Ｌ細胞は樹状の外観を呈した。全ての腫瘍細胞株および正常線維芽細胞株ＮＦＦは、粗樹液およびエタノール抽出により得られた可溶性画分（１／２０の希釈）により死滅した。活性の大部分はエタノール可溶性画分に分配されたと見られた。肺ガン細胞株Ａ４５９は、１／２５００までの希釈で、粗樹液および可溶性画分の両方により影響され、特に感受性であると見られた。
【００７５】
（実施例５）
（トランスフェクトＭＭ９６Ｌ悪性黒色腫細胞株における遺伝子発現についてのレポーターアッセイ）
リン酸緩衝化生理食塩水中のＥ．ｐｅｐｌｕｓ樹液希釈物を、構築物でトランスフェクトされたＭＭ９６Ｌ細胞または乳ガン細胞株ＭＣＦ７を含むウエルに添加した。この構築物は、メタロチオネイン遺伝子の代わりに置換されたβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の上流にあるヒツジメタロチオネインプロモーターから構成される。それゆえ、このアッセイは遺伝子発現、特にメタロチオネイン遺伝子の可能性のある転写、翻訳および発現の尺度となる。細胞を４つの抽出物でマイクロタイタープレート中で２０時間の間処理し、１００μＭ ＺｕＳＯ4を添加して、そしてプレートをさらに５時間インキュベートし、そして培地を取り除いた。次いで、β−ガラクトシトシダーゼ活性を、１〜２時間の間の３７℃での細胞の発色性基質とのインキュベーションにより測定した。このアッセイは、遺伝子の転写活性についての高感度の試験として使用される。
【００７６】
結果を図１に示す。
【００７７】
これは、増加したβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子発現によって測定される、メタロチオネイン遺伝子活性化の顕著な刺激があったことを示す。驚くべきことに、このことはサンプルをさらに希釈した場合により明らかとなった。Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ樹液がこの効果を媒介するメカニズムは分かっていない。ヒストンデアセチラーゼ活性の阻害に特異的な公知の薬物が、より高い濃度の薬物でレポーター遺伝子の発現の増加を示すのに対して、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓは逆の用量応答を示す。しかし、この結果は、このアッセイを用いて、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ樹液または植物自体の中の活性な因子の精製をモニターし得ることを示す。
【００７８】
メタロチオネインタンパク質は抗酸化活性を有し、そして重金属誘導性のガンに対する防御的役割に関連する。メタロチオネインプロモーターの活性化は、非常に感受性の乳ガン細胞株ＭＣＦ７を除いて、直接的な細胞殺傷をもたらし得ないほど低い濃度のＥ．ｐｅｐｌｕｓ樹液で生じた（図２）。これらの希釈でのＭＭ９６Ｌ黒色腫細胞の正常なメラニン細胞の樹状形態への外観における変化は、これらの効果におけるメタロチオネイン遺伝子の関連を意味し得る。
【００７９】
（実施例６）エタノール可溶性抽出物の細分画
実施例４の通りに実施した、９５％エタノールを用いた抽出によって得られた可溶性画分を、無勾配（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に供した。
【００８０】
１００μｌの粗抽出物を１ｍｌの９５％エタノールに溶解し、４℃で一晩、定期的に振盪した。この抽出物を１０，０００×ｇにて４分間遠心分離し、そしてこの上清を取り出しそして真空遠心分離によって乾燥した。固体を、かるく遠心分離した１００μｌのランニング緩衝液中で再構成し、そして可溶性物質を、、３０×４ｍｍのＲＰ−３００ガードカラムを備えた２２０×４ｍｍのＢｒｏｗｎｌｅｅ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００（Ｃ８）にかけた。
【００８１】
このランニング緩衝液はアセトニトリル：水が５０：５０（Ｖ／Ｖ）であり、そして流速は０．７５ｍｌ／分であった。画分を、０．５分の間隔で回収し、そして１９５ｎｍにおける吸光度プロフィールをモニターした。この吸光度プロフィールを図３に示す。
【００８２】
画分を、上記のように、真空遠心分離によって乾燥し、５００μｌＰＢＳ中で再構成し、そしてＭＭ９６Ｌ細胞に対してそしてメタロチオネインレポーターアッセイ中でアッセイした。画分１３〜２８全てがＭＭ９６Ｌ細胞の樹状の外観への完全な転換を誘導したが、細胞死は観察されなかった。この効果は、レポーターアッセイにおいて非常に顕著であり、ここでこの活性は、１／１０，０００の希釈において（すなわち、１／１００，０００の培養物中での最終濃度において）でもなお観察された。
【００８３】
上記の結果に加えて、本発明者は、超遠心分離の後に、ＭＭ９６Ｌ細胞に対する活性が上清中およびペレット中の両方において見いだされること、および活性は、分子量カットオフ膜を介してサンプルを通過させることによって除去され得ないことを見い出した。上記で試験した細胞株に加えて、ＭＣＦ７乳ガン、細胞株の細胞の増殖は１／１００，０００までの最終希釈のＥ．ｐｅｐｌｕｓ樹液によって阻害された。細胞数は、バイシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ
ａｃｉｄ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して評価した。結果を図２に示す。
【００８４】
（実施例７）溶媒分画
Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの粗乳液のさらなる溶媒分画は、極性が増大する一連の溶媒によってもたらされた。１ｍｌ粗乳液には、遠心チューブ内で２０ｍｌジエチルエーテルを添加した。このチューブを振盪し、そして５０００ｇにて５分間遠心分離し、層を分配した。このジエチルエーテル上層を取り出し、そしてこの手順を２回繰り返した。このエーテル画分を合わせ、ロータリーエバポレーター上で乾燥するまで濃縮し、そしてバイオアッセイのために１ｍｌ ＤＭＥ中で再構成した。同様の様式で、この残渣を酢酸エチルで抽出し、続いて塩化メチレンで抽出した。ＭＣＦ７乳ガン細胞の細胞数の減少および樹状の外観への転換によって測定される場合、この最初のエーテル抽出物はこの活性の大部分を得た。しかし、活性はまた、酢酸エチル層および塩化メチレン層に由来する画分から証明された。最終の水可溶性（水性）画分において活性は見られなかった。この結果を、表１３にまとめる。
【００８５】
【表１３】
【００８６】
ＣＭＶプロモーター活性を、複製欠損アデノウィルス構築物によって感染されたＨｅＬａ細胞内にてアッセイした。この構築物において、Ｅ１ａ遺伝子は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるβ−ガラクトシダーゼに置換されていた。この結果は、表１４に示されるように、感染された未処理の細胞のコントロール値の百分率として表記される
【００８７】
【表１４】
【００８８】
得られた結果は、他の分化誘導因子（例えば、ヒストンデアセチラーゼインヒビターまたはブチレート）を用いた場合にみられる結果と定性的に同様であるが、これらの因子を用いた場合に見られる活性に比べてより強力な活性を有する。より高濃度にて粗抽出物およびジエチルエーテル抽出物を用いた場合に観察されるより低いプロモーター活性は、おそらくこれらの濃度において見られるＨｅＬａ細胞に対する細胞殺傷効果を反映する。
【００８９】
さらなる溶媒分画実験において、粗液をメタノール：水（１７：３）とｎ−ヘキサンとの間で分配し、トリテルペン（ヘプタン相）からジテルペン（極性相）を分離するための以前の報告（ＥｖａｎｓおよびＫｉｎｇｈｏｒｎ １９７７）に基づいて溶媒分配が期待された。しかし、予想外に、両方の相において活性が検出された。このことは、この系において有効成分（ａｃｔｉｖｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）が異常に挙動することを示唆する。
【００９０】
別の溶媒分画アプローチでは、ＨＰＬＣ分析の前にサンプルを明澄化する必要が示唆された。この粗乳液を、７０−９５％までのエタノールと混合し、４℃で一晩振盪した。この混合物を１，０００ｇにて１０分間遠心分離し、そして上清を取り出し、そして粗液の元の体積の約３分の１まで濃縮した。この濃縮物に１００％アセトニトリルを３０−６０％添加した。この得られた白色沈殿物を１２，０００ｇにて１０分間の遠心分離によって除去した。ＴＬＣおよび質量分析法によって決定されるように、上清は、大環状ジテルペン（ジャトロファン類およびペプルアン）に富んでいた。この観察結果は、活性素の富化のための適切な大規模プロセスへの方法を示す。
【００９１】
（実施例８）エタノール可溶性抽出物のさらなる活性誘導細分画
実施例７および図３に記載したＨＰＬＣ細分画からの画分１４および１５を、クロマトグラフィーを繰り返すことによって、一定のダイオードアレイスペクトルを有する主要な対称ピークを選択することにより、さらに精製した（例えば、画分１４および１５；画分１４についての結果を図４および５に示す）。ＭＭ９６Ｌの樹状外観への転換を生じる際の精製した画分の活性を、細胞アッセイによって確認した。
【００９２】
画分１５の添加後のＭＭ９６Ｌ細胞への変化の特徴を、図６に示す。細胞を、抗体カップリング手順を使用して、顕微鏡写真として可視化した。この第一抗体、すなわちチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）に指向されたマウスモノクローナルを、ブロモ−クロロ−インドリルリン酸およびニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を発色基質として使用して、第二抗体、すなわちヒツジ抗マウスアルカリホスファターゼ結合体を用いて検出した。４日間のインキュベーションの後（図６Ａおよび６Ｂ）、黒色腫細胞数の著しい減少およびそれらの形態の明白な変化があった。この細胞は、正常な成熟メラニン形成細胞の特徴である長く、紡錘形の（樹状の）外観に戻った。この視野における全ての細胞は、この変化した形態を採るようであった。これは、ＭＭ９６Ｌ細胞集団の不均質な性質を考えると驚くべきことである。２１日間のインキュベーション後、この処理した細胞は、図６Ｃおよび６Ｄに示されるように、クラスター内で互いに幾分平行に整列することが見られ、これは正常な成熟したメラニン形成細胞の特徴である。粗液を含むＥ．ｐｅｐｌｕｓ由来の全ての樹状細胞誘導画分についても、同様の特徴が、観察された。
【００９３】
画分１４および１５についてのエレクトロスプレイ質量分析は、７８０（計算値７７９．３１５）のｍ／ｚを有する２，５，７，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−９−ニコチノイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン５、Ｊａｋｕｐｏｖｉｃ
ら、１９９８ａ）の存在を示した。１Ｄ ＮＭＲを使用した場合の、画分１４の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析は、７ｐｐｍと９．４ｐｐｍとの間にダウンフィールドシグナルを与えた。これらは、環の９位におけるニコチノエート基内に存在するような、ピリジン様部分に一致する。また、トランス二重結合は、５−６ｐｐｍにおける大きなカップリング定数によって証明された。これはジャトロファン環式構造内の１１、１２内部二重結合に一致する。また、画分１４において、負イオンモードでのエレクトロスプレイによって、ｍ／ｚ７１６（計算値７１６．３０４）、６７３（Ｍ−ケテン）、６５６（Ｍ−ＡｃＯＨ）を有する、２，５，７，９，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−ジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン６、Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら、１９９８ａ）であると同定した。
【００９４】
画分１５は、ｍ／ｚ５９７（Ｍ−ケテン−ＡｃＯＨ）を有する２，３，５，７，１５−ペンタアセトキシ−９−ニコチノイルオキシ−１４−オキソジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン１、Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら、１９９８ａ）を含んでいた。従って、分光学的分析によって、ＨＰＬＣ上での、細胞殺傷活性および樹状活性を有する７−７．５分における初期溶出画分は、ジャトロファン５、６、および１の混合物を含んでいた。展開溶媒としてトルエン：アセトンを９：１で使用してＨＰＴＬＣ上でクロマトグラフにかけた場合、この結果は、ＨＰＬＣ画分１４および１５の挙動と一致する。ＵＶ陽性スポットは、終期溶出画分（例えば、画分２０−２２、Ｒｆが０．３−０．５）と対照的に、原点、すなわちＲｆが０．０（約）から移動しなかった。これは、展開溶媒としてトルエン：アセトンを９：１でまたはヘキサン：酢酸エチルを４：１でのいずれかを使用する、ＨＰＴＬＣ上でのクロマトグラフィーによって証明されるように、ジャトロファン３、２および４と比較して、ジャトロファン５、６、および１の相対的に極性の挙動を示す。これらの結果は、Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら、１９９８ａによって、展開溶媒として石油：メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１：１）を使用して得られる結果（例えば：ジャトロファン５：Ｒf０．０４、ジャトロファン６：Ｒf０．１０（３Ｘ）、およびジャトロファン１：Ｒf０．１１）と同様である。初期ＨＰＬＣ画分からの質量分析データにおいて、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ粗抽出物中にインゲナン誘導体（後述を参照）、または文献で報告され、そして表１に表された他の成分が存在するという証拠はない。
【００９５】
（実施例９）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）上での粗抽出物およびエーテル可溶性抽出物の生物学的活性誘導精製
（ａ）実施例７で調製されたエーテル可溶性画分を、エチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）中で再構成し、そして展開溶媒としてクロロホルム：酢酸エチル（８２：１８）を使用して、２０×２０ｃｍシリカゲルプレート上でクロマトグラフした（図７）。このプレートをＵＶ光箱上で観察し、そしてＵＶ陽性バンドを同定し、ゲルから切り出し、ＤＭＥで溶出し、そしてＭＭ９６Ｌ黒色腫細胞株に対する阻害活性および形態転換について試験した。全体のゲルをＵＶ吸収画分および非ＵＶ吸収画分にスライスすることによって、予備実験において、活性がＵＶ吸収バンドと関連することが示された。ゲルの側片をクロロホルム中での０．１％ヨウ素で染色することにより、他の、ヨウ素に対して強い陽性のバンドを明らかにした。しかし、これらは、無視できる活性を有することが見いだされた。Ｒｆ０．０（Ａ）、Ｒｆ０．１６−０．１８（Ｂ１）、Ｒｆ０．２２−０．２４（Ｂ２）、Ｒｆ０．７３−０．８０（Ｃ）、Ｒｆ０．８０−０．９６（Ｄ）におけるＵＶ吸収バンドは、生物学的に活性であり、１／５，０００希釈において、細胞数の減少および樹状細胞の外観への完全な転換が観察され得る。
【００９６】
ゾーンＢ１、ＣおよびＤを、第一次元にヘキサン：酢酸エチル（１：１）を、そして第二次元にトルエン：アセトン（９：１）を用いる二次元溶媒システムを使用して、シリカゲル６０プレート上のクロマトグラフィーによってさらに精製した（それぞれ、図８Ａ〜８Ｃ）。１／５００希釈にて、細胞数の３０％より大きなＭＭ９６Ｌに対する阻害活性および樹状細胞の外観への完全な転換を有するＵＶ吸収スポットを、その図に示す。
【００９７】
Ｄゾーン由来の強くＵＶを吸収するスポット２２および２３（図８Ｃを参照のこと）を、ゲルから切り出し、ＤＭＥで溶出し、そして真空遠心分離によって乾燥した。画分２２および２３の質量分析は、５，８，９，１０，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシペプルアン、ｍ／ｚ６３９．５［Ｍ−ＡｃＯＨ］+、すなわちペプルアンの存在を明らかにした。
【００９８】
（ｂ）図９に示されるように、展開溶媒としてトルエン：アセトン（９：１）を使用して、濃縮ゾーンを有する１０×１０ｃｍのＨＰＴＬＣシリカゲル６０プレート（Ｍｅｒｃｋ カタログ番号０１３７４８．１０００）上で、全ての粗液をクロマトグラフにかけた。ＵＶ陽性ゾーン（１，Ｒf０．１４；２，Ｒf０．２３；３，Ｒf０．４９；４，Ｒf０．５４；５，Ｒf０．５７；６，Ｒf０．６３；および７，Ｒf０．７３）をゲルから切り出し、そしてＤＭＥ／ジエチルエーテルを用いて溶出した。上記のように、この画分をＭＭ９６Ｌに対して試験し、そして画分１、３、４、５および６は、細胞阻害活性および細胞転換活性を有することが証明された。これらの画分は、展開溶媒として、ヘキサン：酢酸エチル（４：１）を使用して、ＨＰＴＬＣプレート上で別々にクロマトグラフにかけ、ＵＶ陽性バンドＡ，Ｒf０．１７；Ｂ，Ｒf０．２４；Ｃ，Ｒf０．４２；Ｄ，Ｒf０．４８；Ｅ，Ｒf０．５２；Ｆ，Ｒf０．５８；Ｇ，Ｒf０．６２（図１０）およびＨ，Ｒf０．０２（図１１）を得た。Ｇ（ヨウ素陽性、図１０を参照）を除いた全画分は、１／５０００希釈にて、細胞増殖阻害および完全な樹状形態への転換に関して、ＭＭ９６Ｌ細胞に対して活性であった。
【００９９】
画分Ａ−Ｆ（Ｂは失われた）およびＨの質量分析を、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの公表された成分の公知の分子質量イオンからの化合物の仮の割り当てと共に、表１５に示す。
【０１００】
【表１５】
【０１０１】
ペプルアン＝５，８，９，１０，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシペプルアン
ジャトロファン２＝２，５，７，９，１４−ヘキサアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシ−ジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン
ジャトロファン３＝２，５，１４−トリアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシ−９−ニコチノイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン
ジャトロファン４＝２，５，９，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン）
従って、質量分析は、２０−アセチル−インゲノール−３−アンゲレート（画分Ａ）、ペプルアン（画分Ａ，ＣおよびＤ）、ならびにジャトロファン２（画分Ｄ）３（画分ＣおよびＨ）、および４（画分ＥおよびＦ）の混合物を明らかにした。画分Ｈについての1Ｈ化学シフトデータを表１６に示す。
【０１０２】
【表１６】
【０１０３】
これらの帰属は、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹおよびＴＯＣＳＹ二次元スペクトルから決定されるように、ジャトロファン環状構造の存在を示した。画分Ｈのスペクトルは、２つのジアステレオマー配座（最も有望であると考えられる）をとるジャトロファン３、２つ以上の同様に置換したジャトロファンの混合物、または２つのニコチネート、１つのベンゾエート、およびイソ−ブチレート部分を有する新規のジャトロファンの存在と一致した。Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら（１９９８ａ）によるように、約６ＨｚのＪ４，５、ならびに５と８との間、および４と７との間に強いＮＯＥを有し；ＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいて交差したピークの全体としての欠如によって証明されるように、Ｊ７，８およびＪ８，９が実質的にゼロであり、有望な環状配座はＩＩであった。任意のインゲノール構造の存在に一致するシグナルは存在しなかった。このサンプルを磁石から回収し、そしてそのアリコートは、ＭＭ９６Ｌに対する強力な活性を証明し、これは、２０μｇ／ｍｌにおける完全な細胞死、および２０ｐｇ／ｍｌ未満における樹状外観への完全な転換によって証明された。
【０１０４】
（実施例１０）ＮＭＲ分析
画分Ａを、展開溶媒として、ヘキサン：酢酸エチル（４：１）を使用して、ＨＰＴＬＣ上のクロマトグラフィーによってさらに精製した。ＵＶ光箱上での吸収に対する添加剤として、側片を、メタノール中の７０％リン酸をゲルに噴霧することによって染色し、そしてヘアードライアーを用いたゲルの加熱による発色は、ＵＶ光下にて濃い青色バンドを示し、これは主なＵＶ吸収バンドから分離され得た。このバンドと等価の非染色領域を、切り出し、エーテルを用いて溶出し、そして真空遠心分離によって乾燥した。約１ｍｇのこの物質を４ｍｌ乳液から蓄積した。この物質を、ＮＭＲ分析に供し、続いてバイオアッセイし、そして１ｎｇ／ｍｌ最終濃度を表す１／５×１０6希釈において完全な樹状形態への転換に関して活性であることを証明した。この物質は、ＮＭＲによって、表１７に示されるようにＣ27Ｈ36Ｏ7、つまり２０−アセチル−インゲノール−３−アンゲレートとして同定された。この知見は、表１５に表される質量分析の証拠に一致する。
【０１０５】
【表１７】
【０１０６】
しかし、ＨＰＬＣによる活性誘導精製の質量スペクトルから、および画分Ａから離れた他のＴＬＣ画分における、２０−アセチル−インゲノール−３−アンゲレートの非存在は、これが唯一の活性画分ではないことを示す。むしろ、ジャトロファン１−６およびペプルアンはまた、ＮＭＲおよび質量分析データからの推察によって、関係づけられる。これは、ＴＬＣによって調製されるような画分Ｈ（ジャトロファン３Ｎａ+ｍ／ｚ ８３０；表１６の１Ｄ ＮＭＲの結果も参照）について、およびＨＰＬＣによって調製されるような画分１３および１４（ジャトロファン５、ｍ／ｚ ７７９および１Ｄ ＮＭＲ；ジャトロファン６、ｍ／ｚ ７１６；ジャトロファン１またはジャトロファン６誘導体、ｍ／Ｚ ５９７）について特に本当である。
【０１０７】
Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら（１９９８ａ）は、パラリアン（ｐａｒａｌｉａｎｅ）クラスの化合物がジャトロファンとペプルアンとの間の経路における中間体であることを提唱した。ジャトロファンおよびペプルアンの両方による抗癌細胞活性および樹状細胞転換が本発明において証明されているため、このパラリアンもまたこれらの特性を示すと結論づけることが合理的であるようである。
【０１０８】
（実施例１１）調製薄層クロマトグラフィーによるマウス実験のための物質の調製
実施例６に記載されるように、７０％エタノール中の１５ｍｌ粗液をジエチルエーテルで抽出した。この抽出物を真空遠心分離によって濃縮し、そして約５ｍｌ ＤＭＥ中で再懸濁した。このＤＭＥ抽出物を、展開溶媒としてヘキサン：酢酸エチル（４：１）を使用して、調製ＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ ＰＬＣ、シリカゲル６０、カタログ番号００５７４５．１０００）上でクロマトグラフにかけた。図１２に示されるように、領域「Ｈ」および「Ａ−Ｆ」に対応するゾーンを切り出し、そして合わせ、エーテル／ＤＭＥで溶出し、そして真空遠心分離によって乾燥した。抽出物は、ジャトロファン２、３および４、ペプルアン、ならびに酢酸インゲナンに富んでいた。ペレットを、９５％エタノール中で懸濁し、そして１０，０００ｇにて１０分間遠心分離した。上清（６．０ｍｌ，１０ｍｇ／ｍｌ）を０．２ｍｌアリコート内に分散し、そして−２０℃にて保存した。この抽出物を、ＭＭ９６Ｌ黒色腫細胞株に対してアッセイし、そして高い能力を示し、１／５×１０6希釈においてもなお樹状細胞形態が明白であった；これは粗液の能力を複製した。このように調製した抽出物は、ジャトロファン２、３および４、ペプルアンならびに酢酸インゲナンに富んでいた。注入の直前に、２０μｌを、０．１−０．２ｍｌの注入のために、５％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０組織培養培地を有する１ｍｌに希釈した。エタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）をコットンバッド（０．２−０．４ｍｌ）に吸収させ、マウスの局所塗布のために使用した。
【０１０９】
（実施例１２）腫瘍細胞の皮下インプラントの増殖の阻害
（ａ）５匹の４週齢のヌードマウスに、２×１０6個のＭＭ９６Ｌヒト黒色腫細胞を含む、０．１ｍｌの組織培養培地を４つの異なる部位にｓ．ｃ．注射した。３匹の処置したマウスに、５％ウシ胎仔血清および２０μｇのエタノール抽出物を含む０．１ｍｌ ＲＰＭＩ培地を１、２、３、５、６、７、および８日目に注射した。さらに、その処置したマウスに、約５〜１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ エタノール抽出物または粗製の希釈していない樹液を４回まで局所適用した。処置したそれぞれのマウス上の異なる２つの部位に、エタノール抽出物または粗製の樹液で局所的処置を行った。１匹のマウスに１２、１３、および１４日目に局所的処置を行い、そして他の２匹の処置したマウスは、１５、１９、２０、および２２日目に局所的処置を行った。腫瘍容積を３２日目に測定した。
【０１１０】
局所的適用の前では、抽出物の注入は、腫瘍容積に明らかな効果を有さなかった。エタノール抽出物の局所的適用後に、一晩で腫瘍の外見に変化があった。腫瘍は、灰色がかった黒色になり、次いで固く、黒色のごつごつした外見になり、次いで痂皮形成が見られた。粗製の樹液で処置した腫瘍は、１日後に類似の変化を示した。時間がたつにつれて、エタノール抽出物および粗製の樹液の全体的効果は類似したため、局所的に処置した病変についての測定を組み合わせた。注射および局所的処置を与えたマウスにおいて、腫瘍容積は７６％減少した（ｐ＜０．２）。エタノール抽出物で処置した１つの腫瘍は、図１３に示すように、完全に消失し、他の８つは、平らな黒色の痂皮に縮小した。他の３つの処置した腫瘍は、最初に類似の色の変化と腫瘍後退が示されたが、測定を行う１０日前の局所的適用の中止後に再増殖した。
【０１１１】
（ｂ）６匹の４週齢のＣ５７Ｂｌａｃｋ（Ｃ５７Ｂｌ）マウスに、１０5個のＢ１６黒色腫癌細胞を含む、０．１ｍｌの組織培養培地を下腹部の２箇所に注射した。腫瘍を４日間発達させ、次いで、３つの注射レジメ（５％ウシ胎仔血清を含む、０．１ｍｌのＲＰＭＩ培地中の２０μｇエタノール抽出物（１、２、および４日目）および１回の局所的処置（４日目における５〜１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ エタノール抽出物）に供した。最初の注射の８日後、腫瘍領域を定規を使用して測定した。処置によって、３匹の処置したマウスにおけるＢ１６黒色腫腫瘍サイズは、３匹のコントロールマウスの腫瘍サイズと比較して、６４％（ｐ＜０．０５）減少した。
【０１１２】
結果を表１８に要約する。
【０１１３】
【表１８】
【０１１４】
（実施例１３ 精製した抽出物によってヒト黒色腫細胞株（ＭＭ９６Ｌ）に誘導された遺伝子発現の変化）
１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中、１５０ｃｍ2プレートにおいて培養されたヒト黒色腫細胞株のＭＭ９６Ｌ細胞株を、精製抽出物とともに５％ＣＯ2／空気中、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中に掻き取り、ペレット化し、１ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁した。細胞をペレット化して３００μｌ ＮＰ−４０溶解緩衝液中に入れ、氷上に１５分間放置した。細胞をペレット化し、上清をプロテイナーゼＫおよびＳＤＳとともに３７℃で１５分間処理し、フェノールクロロホルムで抽出して、そして全ＲＮＡを酢酸アンモニウム／エタノールによって−２０℃で一晩沈澱させた。Ｐｒｏｍｅｇａ ｍＲＮＡ単離キットを用いて、ｍＲＮＡを単離し、次いで、33Ｐ標識されたｄＣＴＰの存在下で逆転写し、ｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡをＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ａｒｒａｙ １．２（ＧＤＡ）において、製造業者の説明書に従ってハイブリダイズさせた。このアレイをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒで定量し、そしてＩｍａｇｅＱａｎｔおよびＥｘｃｅｌソフトウェアで分析した。
【０１１５】
処理および未処理細胞に由来する２連のスポット容積の割合を算出し、そして遺伝子活性化（割合＞１）または阻害（＜１）のレベルを規定するために使用した。バックグラウンドは、代表的には５００〜１０００カウントであるが差し引きされず；従って述べられた割合は、実際の変化より小さく見積もられている傾向がある。
【０１１６】
このアレイは、１８，０００を超える特有の配列、いわゆる発現された配列タグ（ＥＳＴ）からのｃＤＮＡスポットを含んでいた。ＥＳＴのうち約３０００が同定可能な、ヒト細胞の発現された遺伝子に由来した。試験されたヒト黒色腫細胞における多くのＥＳＴ配列は、抽出物での処置によってアップレギュレートされたか、またはダウンレギュレートされたかのいずれかであった。割合の＜３０％の標準偏差を有した２連に基づいた変化のみが、この段階において生物学的に有意であると考慮された。４時間という比較的短い処置時間が、薬剤について最も早くかつ最も重要な標的を同定するために使用されたことにもまた注意すべきである。遺伝子発現におけるさらなる主要な変化は、１次応答に依存して、この時間の後に生じるようである。
【０１１７】
いくつかの関連する公知の遺伝子（これは、癌細胞の制御に関して直接的または間接的にのいずれかで有利であると思われる）の転写物レベルにおける変化からの結果は、表１９に要約される。
【０１１８】
この実施例において見られた細胞形態における変化は、主要な細胞骨格タンパク質であるアクチンと結合する多くのタンパク質の主要なダウンレギュレーションから生じることが予測され得る。レチノール結合タンパク質の増加はまた、ここで関与し得、そしてレチノイドの細胞内レベルの増加を介して分化された表現型の誘導にもまた関与し得る。
【０１１９】
太陽のＵＶ照射によって誘導される現在または将来のＤＮＡ損傷の修復は、ＸＰ修復タンパク質の観察された誘導によって増強され得る。さらに、ＧＡＤＤ４５の減少およびイオン化照射耐性タンパク質（ＤＡＰ３）は、放射線治療に対する腫瘍組織の感作において有用であり得る。後者の変化はまた注目すべきである。なぜなら、これは、ＭＭ９６Ｌ細胞において、皮膚癌および黒色腫の原因であるＵＶＢによって強力にアップレギュレートされるからである。
【０１２０】
免疫応答を増強することに関連性のある多くの分子、特にＧ−ＣＳＦが誘導される。これらのうちのいくつか（例えば、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のタンパク質）は、免疫治療のため有用な属性であると考えられ、キラーＴ細胞活性を増強させる。
【０１２１】
細胞増殖の制御に最も重要な変化は、Ｇタンパク質およびＰＫＣ経路、ならびにプロテオソーム活性の増強の検出された変化に関する。経路の正常な平衡および経路相互作用（例えば、Ｒａｓシグナル伝達によって媒介される）における増殖および変化を含む、多くの細胞プロセスに関して重要である細胞内シグナル伝達は、細胞について有害な結果を有するようである。プロテオソーム成分ＬＡＭＰ７−Ｅ１の誘導レベルは、実験におけるいずれの遺伝子について見出されたものの中で最も高く、そしてユビキチン経路を介して多くのタンパク質のプロセシングを大きく変化させると予測される。
【０１２２】
遺伝子発現アレイデータに基づくと、本発明の化合物は、以下の活性を有すると予測される：
１．インビボで抗癌活性を導く様式で、Ｇタンパク質、ＰＫＣおよびＲａｓシグナル伝達経路における遺伝子発現を調節することにおける活性
２．標的またはエフェクタ細胞のいずれかにおいて、ＤＮＡ修復および免疫応答を増強させることによって、太陽のＵＶおよび類似の因子からの損傷を寛解させることにおける活性
３．防御タンパク質（ＧＡＤＤ４５およびＤＡＰ３）のダウンレギュレーションに基づく、放射線治療に対するアジュバントまたは他のＤＮＡ損傷因子での治療に対するアジュバントとしての活性。
【０１２３】
【表１９】
【０１２４】
【０１２５】
（実施例１４ ヒトボランティアにおける日光性角化症の処置）
倫理委員会の承認を、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから、ヒト被験体における顔面日光性角化症の処置のための、臨床医の監督下でのＥ．ｐｅｐｌｕｓの粗製の樹液の使用の治験について得た。
【０１２６】
オーストラリアで生長した植物から得て、５０％グリセロール中で−２０℃で２週間保存した粗製抽出物を、綿棒塗布具を用いて、臨床的に診断された（直径約５ｍｍの）日光性角化症の表面（男性ヒトボランティアの顔面の左こめかみ）に適用した。約５０μｌを表面に送達した。１日後、２回目の適用を同じ部位に行った。１回目の適用の後、４〜５時間にわたって何の反応も見られなかったが、その後、この部位で炎症反応が生じて、直径８０〜１００ｍｍの領域に広がった。１日後、適用部位および適用領域に対して遠位の局在性の部分において、新たな前悪性の部位がまた標的化されたかのように、局在性の腫脹および水疱形成が見られた。１回目の処置の４日後に、腫脹は鎮静化し、そして痂皮形成が罹患部位で明らかであった。１４日後、痂皮は脱落し、その下部に新たな皮膚が出てきた。６週間後、処置した領域は、まだピンクがかっていたが、元々の日光性角化症の兆候はなかった。コントロールとして、同じボランティアの前腕部の正常皮膚の１ｃｍ2の部分もまた同様に処置した。局在性の軽度の炎症が見られ、これは、処置後７〜１０日で消失した。
【０１２７】
日光性角化症の処置に関連した強い炎症反応は、実施例１３における遺伝子アレイスクリーニングから得られた免疫応答についての結果、および以下の実施例１５におけるＥ．ｐｅｐｌｕｓの粗製樹液によってＴ細胞のインビトロの増殖の観察によって示唆されるように、キラーＴ細胞の漸増および増殖を反映し得る。キラーＴ細胞活性の増強は、免疫系による癌細胞の破壊において重要な過程であると考えられ、そして元来の処置部位に対して遠位の前悪性病変の認識および攻撃を説明することを補助し得る。
【０１２８】
（実施例１５ 正常メラニン細胞の細胞数に対する粗製樹液およびＴＬＣからの精製画分「Ａ」および「Ｈ」の効果）
１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）は、インビトロでの正常メラニン細胞の培養のために必須である。なぜなら、これらの細胞は、ＴＰＡなしでは非常に不充分にしか増殖しないからである。予備実験において、実験の開始からＴＰＡを添加することなく、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ画分を培地に添加した。Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ画分を新鮮な培地に添加し、そしてスコアされた細胞数を、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ画分またはＴＰＡなしの新鮮な培地と比較した。このレジメの下で、ＴＰＡ欠損培地において増殖させた「コントロール」細胞で得られた細胞数より、より多くのメラニン細胞数が得られた。興味深いことに、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ画分含有培地における細胞は、ＴＰＡを含有する、いわゆる「標準」培地において増殖させた細胞より健常に見えた。従って、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ由来の化合物は、細胞培養におけるツールとしてのＴＰＡの使用より優れた代替物を提供し得る。
【０１２９】
第２の実験において、正常のメラニン細胞を、１０％ウシ胎仔血清、コレラ毒素、抗生物質およびＴＰＡを含むＲＰＭＩ １６４０培地中、１ウェルあたり５０００細胞でプレートした。２４時間後、培地を吸引によって細胞から除去し、そしてＴＰＡを添加することなく（しかし、特定された添加物を含む）、新たな培地で置換した。細胞をさらに１０日間インキュベートした後にスコア付けした。結果を表２０に示す。先の実験において示された癌細胞株に対するこれらの濃度で観察された細胞阻害効果と対照的に、１／５，０００，０００希釈においてすら、細胞増殖効果が粗製および精製画分で注目されたことが明らかである。別個の試験において、インビトロでのＴ細胞増殖はまた、粗製のＥ．ｐｅｐｌｕｓ樹液を用いたＴ細胞の処置後に得られた。
【０１３０】
【表２０】
【０１３１】
正常メラニン細胞およびＴ細胞の両方がＥ．ｐｅｐｌｕｓ 樹液からの画分によって増殖が誘導されたので、この因子は、正常細胞の再生が有利である任意の医学的状態において、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、正常細胞についての細胞増殖因子として広範な適用を有し得る。その医学的状態としては、以下が含まれるが、これらに限定されない：
ａ）外傷の症例において、および外科的手術後、および熱傷からの回復における迅速な創傷治癒のための皮膚細胞（ケラチノサイト）の増殖。
ｂ）移植のための膵臓島細胞の増殖。
ｃ）免疫系のＴ細胞および他の細胞の増殖。日光性角化症の処置に対するヒトボランティア治験における適用時点後の作用の拡大が、適用領域に対するナチュラルキラーＴ細胞の漸増によって説明され得ることに注目することは興味深い。
ｄ）肝臓、腎臓、結腸、肺、および眼に由来する老化および壊死組織の再生。
ｅ）器官移植に対する代替物としての宿主組織の増殖。
【０１３２】
（実施例１６ 悪性黒色腫ＭＭ９６Ｌ細胞数に対するベタインの効果）
異なるタイプのベタインを、最終濃度１ｍｇ／ｍｌまで滅菌ＭｉｌｌｉＱTM水中に溶解し、そして５０００個のＭＭ９６Ｌ細胞を含む０．１ｍｌの組織培養培地中に、先に記載したように希釈した。細胞を４日のインキュベートの後にスコア付けした。結果を表２１に示す。
【０１３３】
試験したほとんどのベタインが細胞数に対する影響を有さなかったのに対して、βアラニンベタインヒドロクロリド（ホモベタイン）は、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞数を減少させ、そして細胞は、樹状の様相を呈した。ｔ−４ヒドロキシＮ，Ｎ−ジメチルプロリンもまた、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞数を阻害した；しかし、細胞形態は、多樹状（ｐｏｌｙｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）形態の細胞形態に変化し、このことの意義は未知である。
【０１３４】
βアラニンベタインヒドロクロリド（ホモベタイン）は、別個にまたは組み合わせてのいずれかで、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ粗製樹液またはその精製有効成分についての適切な処方物薬剤であり得る（インゲノール、ペプルアン、およびジャトロファン１−６を含む）。これは、低希釈のＥ．ｐｅｐｌｕｓ成分で前悪性皮膚病変に対して局所的適用のために使用され得るか、または高濃度のＥ．ｐｅｐｌｕｓ成分を有する抗癌剤として処方され得る。ベタイン自体は、抗癌剤として有用であることが示唆されている；例えば、Ｗｉｅｒｓｅｍａらの米国特許第５，５４５，６６７号を参照のこと。
【０１３５】
それらの界面活性剤特性のために、ベタインは、化粧品における処方物成分として広範に使用される。それらの両性イオン特性に起因して、ベタインはまた、皮膚のより深層に他の成分の輸送を助け得る。Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ 樹液またはそれらから得られた精製画分の非常に希釈された抽出物とともに、皮膚用化粧品調製物において使用されるベタイン（例えば、ジャトロファン類、ペプルアン、パラリアン、またはインゲナンを含む）は、別個にまたは組み合わせて、望ましくは、補完的な特性を有するべきである。グリシンベタインを含む、試験された全てのベタインのうち、β−アラニンベタインヒドロクロリド（ホモベタイン）のみが、たとえ中程度であっても、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ 樹液およびその画分と比較して、表現型逆転（ｒｅｖｅｒｓａｌ）効果を有した。
【０１３６】
【表２１】
【０１３７】
本発明は、明瞭化および理解の目的でいくらか詳細に記載されているが、本明細書中に記載の実施態様および方法に対して種々の改変および変更が、本明細書に開示された本発明の概念の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に明らかである。
【０１３８】
本明細書中に引用された参考文献は、以下の頁に列挙され、本明細書に参考として援用される。
【０１３９】
【表２２】
【０１４０】
【０１４１】
【０１４２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅファミリーに由来する有効成分に存在し、そして特にＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａ、およびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ種の植物中に存在する化合物または化合物の群に関する。これらの植物に由来する抽出物は、いくつかの異なる癌細胞株に対する選択的な細胞障害性を示すことが見いだされている。Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ種の樹液に存在する化合物は、癌、特に悪性黒色腫および扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）の効果的な処置において有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
日光の紫外線成分への皮膚の曝露と皮膚癌（例えば、悪性黒色腫および非黒色腫皮膚癌（おもに、基底細胞癌（ＢＣＣ）および扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）））の発症との間には強力な関連がある。これらの癌の発症率は、世界的に迅速に増大してきた。英国では、１９９４年に、４０００の新たに診断された悪性黒色腫の症例が存在し、これは過去１０年間で８０％の増加であった（Ｗｅｓｓｅｘ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｕｓｔ，１９９６）。米国では、約３４，１００の新たな症例が予想され、これは１年あたり４％の増大であった。オーストラリアのクイーンズランドは、世界で最も高い黒色腫の発症率を有するが、初期の検出および広範な公衆衛生キャンペーンならびに日焼け止めの使用および紫外線への曝露を減少することの奨励により、死者の数を減少させることに役立ってきた。ＢＣＣは、現在のところ、英国の人口の１，０００人に１人が罹患し、そして過去２０年でその発症率は２倍以上になっている（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ、英国、１９９７）。１９９０年の６００，０００および１９８０年の４００，０００に比較して、１９９７年には米国において、ＢＣＣおよびＳＣＣの１００万の新たな症例が診断されると予想されている（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｏｃｅａｎｉｃ ａｎｄ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９７）。オーストラリアでは、太陽の放射およびＵＶ放射の危険性（クイーンズランドの集団が最も大きな危険性にある）の広範な宣伝にもかかわらず、同様に増大する症例が同様に当てはまらないと予想する理由はない。
【０００３】
全ての皮膚癌の９０％を超えるものが、日光または他の紫外線の照射に規則的に曝されている皮膚の領域に生じ、ここで、Ｕ．Ｖ．Ｂ．は、皮膚の日焼けの原因であり、そして悪性の黒色腫に関連し、そしてＵ．Ｖ．Ａ．は、未成熟の皮膚の老化ならびにＢＣＣおよびＳＣＣの発症に関連する（Ｗｅｓｓｅｘ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｕｓｔ，１９９６）。幼少時の日光への曝露は、若年成人における悪性黒色腫の発症に関連付けられてきた。他の危険因子には、遺伝的素因（色白、多数の皮膚のほくろ）、化学的汚染、Ｘ線への過剰な曝露、ならびに何らかの薬物および殺虫剤に対する曝露が含まれる。成層圏のオゾン層の減少は、皮膚癌の長期的増加に貢献すると考えられている。
【０００４】
外科的切除が悪性黒色腫（ＢＣＣおよびＳＣＣ）に対するずばぬけて最も一般的な処置である。これは、電気乾燥療法および掻爬術、凍結外科、単純な広範な切除、顕微鏡的手術、またはレーザー治療の形態をとり得る。癌が発症の後期に検出された場合に使用される他の処置は、外因的放射線治療、化学療法、またはより低い程度に生体免疫治療または光力学的治療である。処置の選択は、疾患の型および段階に依存し、そして患者の年齢および健康に依存する（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９７）。
【０００５】
現在の処置の全てが重大な制限に悩んでいる。主要な懸念は、切除部位での癌細胞の認識が貧弱であること、および再発の可能性が高いことであり、そのため追尾手術および処置が必要になり、さらなる美観の損失および傷跡の危険性を伴う。１つの刊行物において、不完全に切り出されたＢＣＣの報告された割合は、３０〜６７％であった（ＳｕｓｓｍａｎおよびＬｉｇｇｉｎｓ、１９９６）。手術に伴う免疫抑制は、任意の残余の細胞の増殖を引き起こし得、そして転移の危険性を増大させ得る。黒色腫患者においては、最初の手術の時点で癌がすでに転移しているという高い危険性が存在し、そして死を導くその後の再発は一般的である。現在手術に替わるもの、例えば、放射線治療および化学療法はまた、免疫抑制および特異性の悪さの危険性を有する。免疫治療および遺伝子治療は、最も大きな期待を有しているが、これらの合理的な適用は、未だ何十年先であるようである。
【０００６】
腫瘍が手術の影響を受けやすい段階を過ぎた場合、全ての型の黒色腫または転移皮膚癌のための最も一般的な処置は、化学療法であり、これは大部分は成功を収めていない（ＢｅｌｊａｎｓｋｉおよびＣｒｏｃｈｅｔ、１９９６）。
【０００７】
理論的には、理想的な薬物は、曝露された黒色腫、ＢＣＣまたはＳＣＣに局所的に適用された場合に、周囲の健康な皮膚細胞に損傷を引き起こさずに選択的にその腫瘍細胞を壊死させるか、またはそれらがアポトーシスを経ることを誘導する薬物である。実際には、これはまだ達成されていない。現在利用可能な薬物は、選択的でも浸透性でもない。
【０００８】
専門家ではない大衆はまた、局所化学治療の概念に魅了される。皮膚癌のための多くの報告された「民間療法」が存在し、これらは悲惨な結果（例えば、靴磨きの使用）を有してきた（Ａｄｅｌｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｐｅｒｓ． Ｃｏｍｍ．）。主要な危険性は瘢痕組織の生成であり、その下に腫瘍細胞が継続して増殖する。Ｓｏｌａｎｕｍ属の植物（カンガルーリンゴまたは悪魔のリンゴ）に由来し、そしてソラソジン（ｓｏｌａｓｏｄｉｎｅ）グリコシドを含有すると噂される抽出物は、サンスポット（ｓｕｎｓｐｏｔ）および日光性角化症の非処方調製物処置として「Ｃｕｒａｄｅｒｍ」の名の下にオーストラリアで入手可能である。しかし、その調製物は、小さな臨床的試行においてＢＣＣに対して効果的でないことが示され、２０人の患者のうちの１４人が処置された部位由来の組織の組織学的検査において持続的腫瘍を示した。いくつかの症例において、処置の部位の組織学的検査は、瘢痕組織に包埋された悪性組織を明らかにした。執筆者らは、自己診断および処置（特に刺激物質での）に対して警告した（Ｆｒａｎｃｉｓら、１９８９）。
【０００９】
しかし、秘話的報告は、植物樹液抽出物が、サンスポットまたは日光性角化症の処置に一般公衆によって未だに使用され、いくつかの成功例が主張されていることを示唆する。
【００１０】
Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅファミリーの植物、特にＥｕｐｈｏｒｂｉａ属の樹液は、多くの国々の民間療法において使用されてきた。この属は、その意図された医学的特性を考慮して昔のギリシャ人の内科医にちなんで名付けられた（Ｐｅａｒｎ，１９８７）。ほんの最近になって、これらの主張のいくつかが科学的に調査されるようになった。この属は、非常に広範であり、小さな丈の低い草木性の植物から低木および木までの範囲にわたる。これらの植物およびその抽出物の活性のほとんど全ての報告が、逸話的であるか、または伝統的な医学に由来し、そして使用されるその調製物の性質は、未知であるかまたは非常に貧弱に記載されているかのいずれかである場合が頻繁である。いぼ、「病的増殖物」、胼胝、「ケロイド腫瘍」、魚の目、ひょう疽（ｗｈｉｔｌｏｗもしくはｆｅｌｏｎ）、「余分な肉（ｓｕｐｅｒｆｌｕｏｕｓ ｆｌｅｓｈ）」などから、種々の癌までにわたる非常に種々の状態に対して活性が主張されている（例えば、Ｈａｒｔｗｅｌｌ：Ｌｌｏｙｄｉａ １９６９ ３２ １５３を参照のこと）。
【００１１】
米国国立ガン研究所によって行われた３５，０００の陸生植物種からの１１４，０００の抽出物について行われた抗癌活性についてのスクリーニングプログラムの一部として、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａの多数の種が試験された。水性の懸濁液、オリーブ油懸濁液、アルコール抽出物、および酸抽出物が移植可能な癌細胞株肉腫３７に対する活性についてスクリーニングされた。４つの種が試験された。これらのうち、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓは、その抽出物のいずれにおいても活性を示さなかった；Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ、およびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａは、酸抽出物、アルコール抽出物、およびオリーブ油懸濁液のそれぞれの弱い活性を示した（ＢｅｌｋｉｎおよびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ，１９５３）。過去５年間の科学的および医学的文献の総説は、広範な強力な有効成分（例えば、この属におけるジ、およびテトラテルペン、フラボノイド、ステロール、およびタンパク質）を明らかにし、そして多くの生物活性効果が、記録された陽性および悪性効果の両方について報告されている。これらの報告は表１に要約される。特に、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ属は、ホルボールエステルのような腫瘍プロモーターを生成することが周知である（Ｈｅｃｋｅｒ，Ｅ．：「Ｃｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ ｆｒｏｍ Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ ａｎｄ Ｔｈｙｍｅｌｅａｃｅａｅ」 「Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｇｎｏｓｙ ａｎｄ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｗａｇｎｅｒら、編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
Ｖｅｒｌａｇ １９７０ １４７−１６５）。
【００１２】
【表１】
【００１３】
【００１４】
【００１５】
この群のなかで最も重点的に研究されている種は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａ Ｌ（同義語Ｅ．ｈｉｒｔａ Ｌ．；Ｅ．ｃａｐｉｔａｔａ Ｌａｍ．）であり、その一般的な名称は、ピル保有（ｐｉｌｌ−ｂｅａｒｉｎｇ）トウダイグサ、ヘビグサ（ｓｎａｋｅ−ｗｅｅｄ）、ネコの毛、クイーンズランド喘息草（Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ ａｓｔｈｍａ ｗｅｅｄ）、および花様頭（ｆｌｏｗｅｒｙ−ｈｅａｄｅｄ）トウダイグサを含む。その植物は、インドを含む熱帯諸国およびクイーンズランドを含む北オーストラリアに広く分布している。「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｏｍｍｏｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｆｏｏｄ， Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ」（ＬｅｕｎｇおよびＦｏｓｔｅｒ、１９９６）によれば、その顕花植物または子実植物（ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｐｌａｎｔ）の全体が、薬草療法（基本的には咳用調製物のため）に、および呼吸器の状態（例えば、喘息、気管支炎、咳、および枯草熱）の処置のための伝統的な薬物において使用される。この参考文献は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｉｌｕｌｉｆｅｒａの活性成分が、コリンおよびシキミ酸であり、そして存在する他の化合物には、トリテルペン、ステロール、フラボノイド、ｎ−アルカン、フェノール酸、Ｌ−イノシトール、糖および樹脂が含まれることを報告する。これらの成分のうち、シキミ酸は、芳香族アミノ酸の合成における重要な中間体であり、そしてマウスにおいて発ガン活性を有することが報告されている（ＥｖａｎｓおよびＯｓｍａｎ、１９７４；ＳｔａｖｒｉｃおよびＳｔｏｌｔｚ、１９７６）。ジャトロファン（ｊａｔｒｏｐｈａｎｅ）、インゲナン（ｉｎｇｅｎａｎｅ）、およびペプルアンと名付けられた四環系ジテルペンは、Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら（１９９８ａ）によってＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓの樹液の中に同定された。ジャトロファンは、以前に公知であったジャトロファンのコンホメーションとは異なるコンホメーションを有すると記載された。ジャトロファンはまた、非刺激性のジテルペンの群に属すると記載され、このことはそれらが以前の研究において過誤されたことを説明しうるかもしれない。ジャトロファンまたは新たなペプルアン化合物のいかなる生物学的活性の開示も示唆も少しもない；またこれらの化合物のいずれかが任意の薬学的目的のために有用であり得ることを示唆もされていない。
【００１６】
最近の報告は、北ナイジェリアに見つけられる高度に毒性である植物であるＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｏｉｓｏｎｉｉの乳液由来の多数のチグリアン（ｔｉｇｌｉａｎｅ）ジテルペンエステルの選択的な細胞傷害性を記載し、これは園芸用殺虫剤として使用され、そして殺人に使用されると一般に考えられている。これらの化合物の１つは、アドリアマイシンの細胞傷害性よりも１０，０００倍を超えるヒトの腎臓癌細胞株Ａ−４９８に対する選択的な細胞傷害性を有する（Ｆａｔｏｐｅら、１９９６）。
【００１７】
一連の特許出願において、Ｔａｍａｓは、癌治療（ＥＰ３３００９４）、ＡＩＤＳ関連複合体およびＡＩＤＳ（ＨＵ−２０８７９０）、ならびに免疫を増強することおよび開放創の処置のための抗菌剤として（ＤＥ−４１０２０５４）、を含む種々の目的のためのＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａ植物およびその抽出物の使用を主張している。
【００１８】
従って、種々のＥｕｐｈｏｒｂｉａ調製物の抗癌活性の単離された報告が存在する一方（Ｆａｔｏｐｅら、１９９６；Ｏｋｓｕｚら、１９９６を参照のこと）、少なくとも１つのＥｕｐｈｏｒｂｉａ種に存在する化合物が発ガン性であると報告されたのみでなく（ＥｖａｎｓおよびＯｓｍａｎ、１９７４；ＳｔａｖｒｉｃおよびＳｔｏｌｚ、１９７６；Ｈｅｃｋｅｒ、１９７０；１９７７）、少なくとも１つの種が皮膚刺激性および腫瘍促進効果を有し（Ｇｕｎｄｉｄｚａら、１９９３）、そして別の種がバーキットリンパ腫においてＥＢＶ−特異的細胞免疫を減少させる（Ｉｍａｉ、１９９４）。
【００１９】
本発明らの知る限りでは、悪性黒色腫またはＳＣＣの処置のためのＥｕｐｈｏｒｂｉａ種からの任意の抽出物の使用の信頼性のあるかまたは再現性のある報告はこれまで存在しなかった。ＢＣＣのＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ（微量のトウダイグサ（ｐｅｔｔｙ ｓｐｕｒｇｅ）またはミルク草（ｍｉｌｋ ｗｅｅｄ））の乳液での在宅治療の逸話的な報告は、「Ｈｏｍｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」（１９７６）と題されたＷｅｅｄｏｎ，Ｄ．およびＣｈｉｃｋ，Ｊ．の刊行物であった。執筆者らは、医学的な特性がＧａｌｅｎの時点からこの植物の乳状の汁について主張されており、そして魚の目、いぼ、および喘息のための民間療法として広く使用されたことを記載した。その世紀の半ばにおいて、それは蚕食性潰瘍の処置のためにシドニーの何人かの内科医によって使用された。執筆者らの患者は、複数のＢＣＣについて何年もにわたって彼自身を処置してきたと主張した。
【００２０】
「その患者（５４歳の男性）は、１９７１年以来、時々Ｒｏｙａｌ Ｂｒｉｓｂａｎｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌに来診していた。ある来診の時に、彼は、彼の胸の前部に臨床的な基底細胞癌（これは、その端から採取した小さな標本の生検によって確認された）を有することが認められた。数日後、その生検部位が治癒した時、その患者はＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓの樹液を５日間毎日塗布した。その領域は、紅斑性になり、次いで膿疱性になり、その後その病変は脱落した。処置の６週間後に彼が戻ったとき、その患者は、残っている傷跡の小領域を外科的に切り出すことに同意した。複数の切片が数個の慢性炎症性細胞を含んだ皮膚瘢痕組織を示したが、残余の腫瘍の証拠は示さなかった。」
その執筆者らは、「この通信はその治療の形態を推奨するものとして受け取られるべきものでは決してない」と記載した。樹液の腐食性の性質、およびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓを使用するいぼの在宅治療から生じるわずかな目の損傷に対して警告するいくつかの報告が存在する（Ｅｋｅ，Ｔ．、１９９４）。ＷｅｅｄｏｎおよびＣｈｉｃｋによって報告された効果は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ
ｐｅｐｌｕｓ樹液の刺激活性から生じ、そしてＦｒａｎｃｉｓら（１９８９）によって報告されたＳｏｌａｎｕｍ抽出物「Ｃｕｒａｄｅｒｍ」の場合と同様に、このような処置から生じる瘢痕組織の中にまたはその下に生存する残余の癌組織の高い危険性が存在する。
【００２１】
本発明者は現在、驚くべきことに、３つの異なるＥｕｐｈｏｒｂｉａ種である、Ｅｕｐｈｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａ、およびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉに由来する植物の樹液が、悪性黒色腫を含む３つの異なるヒト癌細胞株の増殖を特異的に阻害することを見いだした。さらに、非常に低い濃度で、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓおよびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａに由来する樹液が、悪性黒色腫細胞が正常なメラニン細胞の形態学的外観に適合するように、それらの分化を誘導した。類似のまたはさらに低い濃度で、抽出物は、メタロチオネイン遺伝子プロモーターの活性化およびＭＭ９６Ｌ悪性黒色腫細胞におけるレポーター遺伝子の発現を刺激した。その結果は、特に顕著であった。なぜなら、使用された黒色腫細胞株は、それに対して試験された従来の化学療法剤の全てによる阻害に対して抵抗性であるからである（ＭａｙｎａｒｄおよびＰａｒｓｏｎｓ、１９８６）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
（発明の要旨）
第一の局面において、本発明は、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ属の植物、特にＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａ、および／またはＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉの樹液に存在する化合物を提供する。その化合物は：（ａ）癌細胞を殺傷またはその増殖を阻害し得るが、正常な新生仔の線維芽細胞または自発的に形質転換したケラチノサイトに有意に影響を与えず；（ｂ）９５℃で１５分間加熱することによって破壊されない活性を有し；（ｃ）アセトンによる処理によって破壊されない活性を有し；（ｄ）９５％エタノールで抽出し得る活性を有し；そして（ｅ）メタロチオネイン遺伝子活性化を刺激する。
【００２３】
好ましくは、その化合物（単数または複数）は、本明細書中で規定されるＭＭ９６Ｌ、ＭＭ２２９、ＭＭ２２０、ＭＭ２３７、ＭＭ２０５８、Ｂ１６、ＬＩＭ１２１５，ＨｅＬａ、Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＭＣＣ１６、およびＣｏｌｏ１６からなる群から選択された少なくとも１つの細胞株の増殖を阻害し得る。より好ましくは、その化合物（単数または複数）は、ＭＭ９６Ｌ細胞における増殖を阻害し得るか、または分化を誘導し得る。
【００２４】
さらにより好ましくは、その化合物はまた、正常なメラニン細胞の増殖を誘導し得る。
【００２５】
好ましくは、その化合物はＥ．ｐｅｐｌｕｓまたはＥ．ｈｉｒｔａの樹液中に存在する。
【００２６】
本発明が樹液または樹液抽出物において検出される化合物を参照して詳細に記載されるが、これらの化合物は、植物全体またはその一部に存在するかまたはそれらから抽出された場合、なお本発明の範囲内にあることが明確に理解される。
【００２７】
第二の局面において、本発明は、上記のような活性化合物を薬学的に適切なキャリアまたは希釈剤とともに含む組成物を提供する。
【００２８】
より好ましくは、その化合物は、ジャトロファン、ペプルアン、パラリアン、およびインゲナンからなる群から選択される。
【００２９】
その化合物がジャトロファンである場合、それは好ましくはＪａｋｕｐｏｖｉｃら（１９９８ａ）によって定義される立体配座ＩＩである。天然に生じるジャトロファン、ペプルアン、およびパラリアン骨格において観察される置換体は、本発明の範囲内であることが明確に理解される。これらは、以下の置換体およびアナログを含む。
【００３０】
この型の化合物は、Ｅｕｐｈｏｂｉａ属の種々の植物において見いだされている（Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら、１９９８ａ、ｂ、ｃ；Ｍａｒｃｏら、１９９８）。
【００３１】
【表２】
【００３２】
【００３３】
さらにより好ましくは、この化合物は、以下から成る群およびそれらの薬学的に受容可能な塩またはエステルから選択される：
５，８，９，１０，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシペプルアン（ペプルアン（ｐｅｐｕｌｕａｎｅ））；
１５−ペンタアセトキシ−９−ニコチノイルオキシ−１４−オキソヤトロファ−６（１），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン（ｊａｔｒｏｐｈａｎｅ）１）；
２，５，７，９，１４−ヘキサアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシ−ヤトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン２）；
２，５，１４−トリアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシ−９−ニコチノイルオキシヤトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン３）；
２，５，９，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシヤトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン４）；
２，５，７，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−９−ニコチノイルオキシヤトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン５）；
２，５，７，９，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシヤトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン６）；２０−アセチル−インゲノール（ｉｎｇｅｎｏｌ）−３−アンゲレート（ａｎｇｅｌａｔｅ）。
【００３４】
本発明の１つの好ましい実施態様において、この組成物は、β−アラニンベタイン塩酸塩またはｔ−４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロリンをさらに包含する。
【００３５】
第３の局面において、本発明はガンの処置方法を提供し、この方法は、抗ガン有効量の本発明の化合物を、このような処置を必要とする哺乳動物へと投与する工程を包含する。
【００３６】
好ましくは、このガンは固形ガンである。より好ましくは、このガンは以下から成る群から選択される：悪性黒色腫、メルケル（Ｍｅｒｋｅｌ）細胞ガンと扁平上皮細胞ガンと基底細胞ガンとを含む他の皮膚ガン、肺ガン、結腸ガン、前立腺ガン、頸部ガンおよび乳ガン。
【００３７】
第４の局面において、本発明は新形成性細胞の増殖活性を阻害する方法を提供し、この方法は、この細胞を、抗増殖量の本発明の化合物へと曝す工程を包含する。これらの細胞はエキソビボまたはインビボのいずれかで処置され得る。
【００３８】
第５の局面において、本発明は、紫外線の照射、電離放射線、マイクロ波照射、オゾンへの曝露などによって生じる、皮膚に対する損傷を予防または軽減する方法を提供し、この方法は有効量の本発明の化合物をこのような処置を必要とする被験体に局所的に投与する工程を包含する。本発明はこの局面において、日光性角化症、放射線治療の間に生じる皮膚損傷などの処置に使用され得る。
【００３９】
第６の局面において、本発明は非新形成性細胞の増殖を刺激する方法を提供し、この方法は、この細胞を、増殖を誘導する量の本発明の化合物または組成物へと曝す工程を包含する。これは組織の再生を誘導するに有用であり、そして、Ｔ−リンパ球が本発明の組成物に応答して増殖するので、疾患状態に対する免疫応答を促進するに有用である。
【００４０】
哺乳動物はヒトであり得るか、または家畜もしくはペット（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ａｎｉｍａｌ）であり得る。本発明の化合物はヒトの医療的処置での使用について適切であることが特に意図されるが、イヌおよびネコのようなペット、およびウマ、ウシおよびヒツジのような家畜、またはネコ科動物、イヌ科動物、ウシ科動物および有蹄動物のような動物園の動物の処置を含む、獣医学的処置にもまた適応可能である。
【００４１】
本発明の化合物および組成物は任意の適切な経路によって投与され得、そして当業者は処置される症状に対して最も適切な経路および用量を容易に決定し得る。用量は臨床の医師または獣医師の裁量により、そして処置される症状の性質および状態、処置される被験体の年齢および全体的な健康状態、投与経路ならびに施されたかもしれない以前の処置に依存する。
【００４２】
キャリアまたは希釈剤、および他の賦形剤は投与経路に依存し、そして当業者はやはり各々の特定の症例について最も適切な処方を容易に決定し得る。本発明の化合物は、経口的、局所的および／または非経口的注入（静脈内注射を含む）によって投与され得ることが意図される。
【００４３】
薬学的組成物の調製のための方法および薬学的キャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳＡのような教科書に記載のように、当該分野において周知である。
【００４４】
本明細書の目的のために、用語「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは「含むが、限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ
ｔｏ）」を意味し、そして用語「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」が対応する意味を有することは、明らかに理解される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１） Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ属の植物、特に、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａおよび／またはＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉの樹液に存在する化合物であって、
（ａ）癌細胞を死滅または癌細胞の増殖を阻害し得るが、正常新生仔線維芽細胞または自発的に形質転換したケラチノサイトに有意に影響を与えない；
（ｂ）９５℃１５分間の加熱によって破壊されない活性を有する；
（ｃ）アセトンでの処理によって破壊されない活性を有する；
（ｄ）９５％エタノールを用いて抽出され得る活性を有する；かつ
（ｅ）メタロチオネイン遺伝子活性化を刺激する、
化合物。
（項目２） 本明細書中で定義される、ＭＭ９６Ｌ、ＭＭ２２９、ＭＭ２２０、ＭＭ５３７、ＭＭ２０５８、ＨｅＬａ、Ｂ１６、ＬＩＭ１２１５、Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＭＣＣ１６およびＣｏｌｏ１６からなる群から選択される少なくとも１つの細胞株の増殖を阻害し得る、項目１に記載の化合物。
（項目３） ＭＭ９６Ｌ細胞の増殖を阻害またはＭＭ９６Ｌ細胞の分化を誘導し得る、項目２に記載の化合物。
（項目４） 正常メラニン細胞および／またはＴ細胞の増殖もまた誘導し得る、項目１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
（項目５） 薬学的に受容可能なキャリアまたは化粧品的に受容可能なキャリアとともに、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物を含有する組成物。
（項目６） 前記化合物が、ジャトロファン類、ペプルアン類、パラリアン類およびアンゲロイル置換インゲナン類、またはこれらのアセチル化誘導体、ならびにこれらの薬学的に受容可能な塩またはエステルからなる群から選択される、項目５に記載の組成物。
（項目７） 前記化合物が立体配座ＩＩのジャトロファンである、項目６に記載の組成物。
（項目８） 前記化合物が表２で定義されるように置換されている、項目６または項目７に記載の組成物。
（項目９） 前記化合物が以下からなる群から選択される、項目５〜８のいずれか１項に記載の組成物：
５，８，９，１０，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシペプルアン（ペプルアン）；
１５−ペンタアセトキシ−９−ニコチノイルオキシ−１４−オキソジャトロファ−６（１），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン １）；
２，５，７，９，１４−ヘキサアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシ−ジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン ２）；２，５，１４−トリアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシ−９−ニコチノイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン ３）；
２，５，９，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン ４）；
２，５，７，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−９−ニコチノイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン ５）；
２，５，７，９，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン ６）；
２０−アセチル−インゲノール−３−アンゲレート；
およびこれらの薬学的に受容可能な塩またはエステル。
（項目１０） 前記キャリアが、β−アラニンベタインヒドロクロリドまたはｔ−４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロリンを含有する、項目５〜９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目１１） 癌を処置する方法であって、抗癌に有効な量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物を、このような処置が必要な哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
（項目１２） 前記癌が固形腫瘍である、項目１１に記載の方法。
（項目１３） 前記癌が、悪性黒色腫、メルケル細胞癌、扁平上皮癌および基底細胞癌を含む他の皮膚癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、頸癌、および乳癌からなる群から選択される、項目１１または項目１２に記載の方法。
（項目１４） 放射線治療するためまたはＤＮＡ損傷物質を用いて治療するためのアジュバントとして使用される、項目１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５） 腫瘍形成細胞の増殖活性を阻害する方法であって、該細胞を、抗増殖量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１６） 非腫瘍形成細胞の増殖を刺激する方法であって、該細胞を、増殖誘導量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１７） Ｔ細胞の活性および／またはＴ細胞の増殖の誘導を刺激する方法であって、該細胞を、有効量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物に曝露する工程を包含する、方法。
（項目１８） 項目１６に記載の方法に従って免疫系の細胞を刺激することによって疾患状態を軽減する方法。
（項目１９） 腫瘍形成細胞の分化を誘導する方法であって、該細胞を、有効量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物に曝露する工程を包含する、方法
（項目２０） 前記細胞がインビボで処置される、項目１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１） 前記細胞がエキソビボで処置される、項目１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２） 紫外線照射、電離放射線、マイクロ波照射、またはオゾンへの曝露によって引き起こされる皮膚への損傷を予防または緩和する方法であって、このような処置を必要とする被験体に、有効量の、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物を局所投与する工程を包含する、方法。
（項目２３） 前記損傷が日光性角化症である、項目２２に記載の方法。
（項目２４） 前記損傷が放射線治療の間に起こる、項目２２に記載の方法。
（項目２５） 前記哺乳動物がヒトである、項目１１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６） 癌の処置における、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（項目２７） 紫外線照射、電離放射線、マイクロ波照射、またはオゾンへの曝露によって引き起こされる皮膚への損傷を予防または軽減するための、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物の使用。
（項目２８） 癌の処置における、項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目２９） 紫外線照射、電離放射線、マイクロ波照射、またはオゾンへの曝露によって引き起こされる皮膚への損傷を予防または軽減するための、項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目３０） 癌の処置のための医薬の製造における、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目３１） 紫外線照射、電離放射線、マイクロ波照射、またはオゾンへの曝露によって引き起こされる皮膚への損傷を予防または軽減するための医薬の製造における、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
（項目３２） 非腫瘍形成細胞の増殖を誘導するための医薬の製造における、項目１〜４のいずれか１項に記載の化合物または項目５〜１０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの樹液のメタロチオネイン遺伝子の活性化に対する効果を示し、これは発色性基質を使用してβ−ガラクトシダーゼの活性を検出することによって測定された。
【図２】図２は、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの樹液の存在下で７日間マイクロタイタ−ウエル中で増殖したＭＣＦ７乳ガン細胞の増殖度を示す（コントロール値に対するパーセントとして表す）。
【図３】図３は、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの樹液のエタノール可溶性抽出物のＲＰ−ＨＰＬＣ細分画の後の、１９５ｎｍでの吸光度プロフィールを示す。
【図４】図４は、図３由来のフラクション１４を繰り返しＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにかけた結果を示す。
【図５】図５は、図４由来のピークの定常ダイオードアレイ（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ）スペクトルを示す。
【図６】図６は、ＭＭ９６Ｌ黒色腫細胞の、実施例７由来のフラクション１５での処置の結果を示す。細胞は抗体ＴＲＰ−１で染色し、この抗体は細胞骨格に対して指向される。Ａ、Ｂ（４日目）、Ｃ、Ｄ（２１日目）。
【図７】図７は、展開溶媒としてクロロホルム：酢酸エチル（８２：１８）を用いる、実施例６由来のエーテル可溶性画分の薄層クロマトグラフィーの結果を示す。
【図８】図８は、一次元ではヘキサン：酢酸エチル（１：１）、および二次元ではトルエン：アセトン（９：１）を用いる、シリカゲルでの二次元ＴＬＣによってのさらなる精製の結果を示す。 Ａ：スポット３４〜４５は、ＵＶ光ボックスで可視化された。活性は、５００分の１の希釈で、ＭＭ９６Ｌに対してスコアした（＋＋＋＝効果無し、−＝完全な細胞の死滅、ｄ＝細胞の樹状外観への１００％の復帰。 Ｂ：スポット１４〜２０は、ＵＶ光ボックスで可視化された。活性は、５００分の１の希釈で、ＭＭ９６Ｌに対してスコアした（＋＋＋＝効果無し、−＝完全な細胞の死滅、ｄ＝細胞の樹状外観への１００％の復帰。 Ｃ：スポット２１〜２７は、ＵＶ光ボックスで可視化された。活性は、５００分の１の希釈で、ＭＭ９６Ｌに対してスコアした（＋＋＋＝効果無し、−＝完全な細胞の死滅、ｄ＝細胞の樹状外観への１００％の復帰。
【図９】図９は、トルエン：アセトン（９：１）溶媒系を用いるＨＰＴＬＣでの、粗樹液の上昇クロマトグラフィーの結果を示す。不透明バンド１〜７は、ＵＶ光ボックスで可視化された。
【図１０】図１０は、ヘキサン：酢酸エチル（４：１）溶媒系を用いるＨＰＴＬＣでの、図９由来のフラクション１の上昇クロマトグラフィーの結果を示す。バンドＡ〜Ｇは、ＵＶ光ボックスで可視化された。（クロロホルム中０．１％ヨウ素で染色した側面のストリップによりフラクションＧが明らかにされた−ＭＭ９６Ｌに対して不活性）。
【図１１】図１１は、ヘキサン：酢酸エチル（４：１）溶媒系を用いるＨＰＴＬＣでの、図９由来のフラクション１の上昇クロマトグラフィーの結果を示す。バンドＨは、ＵＶ光ボックスで可視化された。
【図１２】図１２は、ヘキサン：酢酸エチル（４：１）溶媒系を用いる分取薄層クロマトグラフィー（ＰＬＣ，Ｍｅｒｃｋ）での、粗樹液から調製したジエチルエーテル可溶性画分の上昇クロマトグラフィーの結果を示す。領域ＨおよびＡ〜Ｆは、ＵＶ光ボックスで可視化され、抽出され、そしてインビボ実験に使用された。
【図１３】図１３は、ヌードマウスにおける皮下のヒト黒色腫ＭＭ９６Ｌ異種移植片の、実施例１１に記載のように調製された部分的に精製された画分での処置の結果を示す。矢印は腫瘍（右手側）および正常皮膚（背中上部）についての局所処置の位置を示す。処置レジメ開始後３２日目、および最初の局所適用の２０日目に、残留する腫瘍の増殖または正常皮膚に対する存続する損傷の証拠は存在しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、以下の非限定的な実施例および図面のみを参照として、詳細に記載される。
【００４７】
（実施例１）
（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ樹液の腫瘍細胞株に対する阻害活性）
３つのＥｕｐｈｏｒｂｉａ種（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｅｐｌｕｓ、Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｈｉｒｔａおよびＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉ）の樹液の、３つの異なる腫瘍細胞株の増殖を阻害する能力を試験した。正常皮膚線維芽細胞に対する活性をコントロールとして試験した。
【００４８】
これらの細胞株を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ培地中で維持し、そしてアッセイを同じ培地中で行った。
【００４９】
樹液を、Ｓｏｕｔｈ−Ｅａｓｔ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ、Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｃｏａｓｔ ｈｉｎｔｅｒｌａｎｄ、Ｐａｌｍｗｏｏｄｓにある農地の耕土で無作為に成長させた植物から回収した。この植物の幹表面を、７０％エタノールで簡単に洗浄し、そしてエタノールで洗浄したはさみを使用して幹を切り、そして乳白色乳濁樹液を流出させた。この樹液を１０ｍｌの滅菌プラスチック遠心分離チューブに回収し、４℃でＢｒｉｓｂａｎｅに輸送し、そして−２０℃で凍結保存した。使用前に、この樹液を、滅菌１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で、滅菌ＭｉｌｌｉＱ水を使用して、３１２５分の１まで順次５倍づつ希釈した。各希釈の１０μＬアリコートを、１００μｌの細胞株を含むマイクロタイタープレートウエルのそれぞれ２つに添加した。アッセイは２連で行った。
【００５０】
５日後、細胞をコントロール未処理細胞サンプルと比較しての増殖の阻害について、盲検で（ｂｌｉｎｄ）試験した。この結果を表３〜６に要約する。ここで試験した細胞株は、
ＮＦＦ 正常皮膚線維芽細胞
ＭＭ９６Ｌ 悪性黒色腫、脳転移
ＨｅＬａ 頸部ガン
ＨＡＣａｔ 自発性形質転換ヒトケラチノサイト
であり、そして、尺度は、０＝効果無し〜５＝完全な細胞の死滅、である。
【００５１】
表見出しでの希釈は、培養物への添加前のサンプルの希釈を指す。それゆえ、最終培養物中での希釈は、さらに約１０倍高い。
【００５２】
【表３】
【００５３】
【表４】
【００５４】
【表５】
【００５５】
【表６】
【００５６】
これらの結果から、以下のことが見出され得る：
ａ）Ｅ．ｐｅｐｌｕｓは、ＨｅＬａ細胞に対して活性であり、そしてＭＭ９６Ｌ細胞に対してはより少ない程度で活性であった。
ｂ）Ｅ．ｈｉｒｔａは、ＭＭ９６Ｌ細胞に対して活性であり、そしてＨｅＬａ細胞に対して非常に強力に活性であった。
ｃ）Ｅ．ｄｒｕｍｍｏｎｄｉｉは、ＭＭ９６Ｌに対して他の２つのサンプルよりも低い効果を有し、そして試験した最も高い濃度でのみＨｅＬａ細胞を阻害した。
ｄ）ＮＦＦ正常線維芽細胞は１／５の希釈で激しく影響をうけたが、しかし他の希釈度では温和に影響をうけたのみであった。例えば、１／２５の希釈では、ＮＦＦ細胞の阻害は温和（評点２）だったが、ＭＭ９６Ｌ細胞の阻害は激しかった（評点４）。１／１２５の希釈では、ＮＦＦ細胞に対する効果は観察されなかった（評点０）が、ＭＭ９６Ｌ細胞の激しい阻害（評点４）が１サンプルについて観察され、そして２連の他のサンプルではより温和な阻害（評点１）が観察された。ＨＡＣａｔ細胞（これは正常ケラチノサイトの代表としてみなされ得る）は、最も高い濃度でのみ阻害された。
【００５７】
高い濃度のＥ．ｐｅｐｌｕｓ樹液では、ＭＭ９６細胞が直接的に殺傷されることは明らかであった。しかし、（１／６２５の希釈までの）低い濃度では、増殖阻害は観察されなかったが、生存する細胞は樹状であり、そして正常メラニン細胞の外観を呈していた。提案されるいずれのメカニズムにも制限されることは望まないが、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの樹液は、ＤＮＡを損傷する直接的に細胞傷害性の因子よりむしろ、分化を促進する少なくとも１つの因子を含み得ると見られる。
【００５８】
（実施例２）
（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ樹液の活性に対する熱処理またはアセトン処理の影響）
実施例１に記載される実験を、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓおよびＥ．ｈｉｒｔａについて、異なる細胞株調製物、異なる植物サンプルおよび異なる評点スケールを使用して、異なる人物により反復した。
【００５９】
これらのサンプルは、実施例１に記載のように調製したか、または熱もしくはアセトンでの処理に供したかのいずれかである。植物樹液の希釈していない抽出物を９５℃で１５分間、加熱した。アセトン処理については、４０μｌの抽出物を４００μｌのアセトン中に懸濁し、そしてチューブをボルテックスミキサーで振盪した。内容物を１０，０００ｇで３分間遠心分離し、そして上清（アセトン可溶性画分）を別のチューブに取り出した。ペレットおよび上清の両方を、開口したチューブ中で室温で排気ファンを作動させたヒュームフード中に一晩放置して残留アセトンをエバポレートした。
【００６０】
これらの結果を表７〜９に示す。ここで、＋＋＋は効果無しを示し、そして−は１００％の細胞の死滅を示す。「Ｃ」は、培養物が汚染されたことを示す。この評価スケールを使用すると、これらの結果は実施例１におけるよりもさらに著しく、１：３１２５の希釈まで強力な阻害活性が観察された。しかし、ＮＦＦ細胞のいくらかの増殖阻害がこの実験において見出された。
【００６１】
熱またはアセトンのいずれも抗腫瘍活性に有意に影響を与えなかった。アセトン処理を行った場合、いくらかの活性は可溶性画分中にも見出されたが、ほとんどの活性はペレット中に見出された（特にＥ．ｈｉｒｔａの場合）。このことは、原因である化合物はその性質においてタンパク質ではなく、そして少なくとも１つの成分が脂質であり得ることを示唆する。
【００６２】
【表７】
【００６３】
【表８】
【００６４】
【表９】
【００６５】
（実施例３）
（Ｅ．ｐｅｐｌｕｓを使用するさらなる試験）
Ｅ．ｐｅｐｌｕｓはこれらの実験で試験した３つの植物の最も豊富なものであるので、さらなる実験にはこの種からの抽出物を使用した。このことは、活性が他の２つの種に存在しないことを意味すると考慮されるべきではない。
【００６６】
ＮＦＦおよびＭＭ９６Ｌ細胞に加えて、ＭＭ２２９およびＭＭ２２０ヒト悪性黒色腫細胞ならびにＢ１６マウス悪性黒色腫細胞株を使用して、実施例２を繰り返した。コントロールとして等量の水、ならびにアセトン処理後のペレットおよび上清画分の１／２０〜１／１２５００の希釈物の添加を使用して、アッセイを２連で行った。この結果を表１０に要約する。
【００６７】
【表１０】
【００６８】
これらの結果により、実施例２で得られた結果が確認される。１／１００〜１／５０の希釈では、ＮＦＦ細胞に対する効果はないが、ＭＭ９６Ｌ細胞の有意な阻害が観察された。これらの希釈で生存する黒色腫細胞は、正常なメラニン細胞の外観を呈した。他の２種のヒト黒色腫細胞株およびマウス黒色腫細胞株の阻害もまた、観察された。
【００６９】
同様の結果が、メルケル細胞ガン（ＭＣＣ１６）または扁平上皮細胞ガン（Ｃｏｌｏ６）細胞を使用して得られた。これらの結果を表１１に示す。
【００７０】
扁平上皮細胞ガンによって、５００，０００分の１の希釈でさえ、樹状細胞形態が示された。この粗抽出物の非常に強い力価はまた、メルケル細胞阻害に対しても明らかであり、これは、５００，０００分の１の希釈でもまた、なお明らかであった。
【００７１】
【表１１】
【００７２】
（実施例４）
（Ｅ．ｐｅｐｌｕｓのエタノール抽出物）
Ｅ．ｐｅｐｌｕｓからの樹液の新鮮な調製物を、９５％水性エタノールでの抽出に供した。減圧遠心分離によって抽出後の可溶性画分からエタノールを取り除き、そしてこの画分を、５％ウシ胎仔血清および抗生物質を含む組織培養培地（ＲＰＭＩ１６４０）中に、その最初の容量まで再構成した。エタノール抽出後に残存するペレットを減圧遠心分離により乾燥させ、そして上記のように組織培養培地中に、その最初の容量まで再構成した。粗樹液（Ｃ）、可溶性画分（Ｓ）およびペレット（Ｐ）を上記のようにＮＦＦ細胞、黒色腫細胞株ＭＭ９６Ｌ、ＭＭ５３７、ＭＭ２２９およびＭＭ２０５８ならびにまた、結腸ガン細胞株ＬＩＭ１２１５および肺ガン細胞株Ａ５４９に対して試験した。アッセイを３連で行い、そしてサンプル添加後に４日間培養した後に評価した。この結果を表１２に示す。ここで、＋は細胞の正常な外観を示し、＋＋は細胞数における可能な増加を示し、そして−は細胞の死滅を示す。
【００７３】
【表１２】
【００７４】
得られた結果は、以前の実験の結果と整合した。やはり低用量でも、ＭＭ９６Ｌ細胞は樹状の外観を呈した。全ての腫瘍細胞株および正常線維芽細胞株ＮＦＦは、粗樹液およびエタノール抽出により得られた可溶性画分（１／２０の希釈）により死滅した。活性の大部分はエタノール可溶性画分に分配されたと見られた。肺ガン細胞株Ａ４５９は、１／２５００までの希釈で、粗樹液および可溶性画分の両方により影響され、特に感受性であると見られた。
【００７５】
（実施例５）
（トランスフェクトＭＭ９６Ｌ悪性黒色腫細胞株における遺伝子発現についてのレポーターアッセイ）
リン酸緩衝化生理食塩水中のＥ．ｐｅｐｌｕｓ樹液希釈物を、構築物でトランスフェクトされたＭＭ９６Ｌ細胞または乳ガン細胞株ＭＣＦ７を含むウエルに添加した。この構築物は、メタロチオネイン遺伝子の代わりに置換されたβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の上流にあるヒツジメタロチオネインプロモーターから構成される。それゆえ、このアッセイは遺伝子発現、特にメタロチオネイン遺伝子の可能性のある転写、翻訳および発現の尺度となる。細胞を４つの抽出物でマイクロタイタープレート中で２０時間の間処理し、１００μＭ ＺｕＳＯ4を添加して、そしてプレートをさらに５時間インキュベートし、そして培地を取り除いた。次いで、β−ガラクトシトシダーゼ活性を、１〜２時間の間の３７℃での細胞の発色性基質とのインキュベーションにより測定した。このアッセイは、遺伝子の転写活性についての高感度の試験として使用される。
【００７６】
結果を図１に示す。
【００７７】
これは、増加したβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子発現によって測定される、メタロチオネイン遺伝子活性化の顕著な刺激があったことを示す。驚くべきことに、このことはサンプルをさらに希釈した場合により明らかとなった。Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ樹液がこの効果を媒介するメカニズムは分かっていない。ヒストンデアセチラーゼ活性の阻害に特異的な公知の薬物が、より高い濃度の薬物でレポーター遺伝子の発現の増加を示すのに対して、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓは逆の用量応答を示す。しかし、この結果は、このアッセイを用いて、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ樹液または植物自体の中の活性な因子の精製をモニターし得ることを示す。
【００７８】
メタロチオネインタンパク質は抗酸化活性を有し、そして重金属誘導性のガンに対する防御的役割に関連する。メタロチオネインプロモーターの活性化は、非常に感受性の乳ガン細胞株ＭＣＦ７を除いて、直接的な細胞殺傷をもたらし得ないほど低い濃度のＥ．ｐｅｐｌｕｓ樹液で生じた（図２）。これらの希釈でのＭＭ９６Ｌ黒色腫細胞の正常なメラニン細胞の樹状形態への外観における変化は、これらの効果におけるメタロチオネイン遺伝子の関連を意味し得る。
【００７９】
（実施例６）エタノール可溶性抽出物の細分画
実施例４の通りに実施した、９５％エタノールを用いた抽出によって得られた可溶性画分を、無勾配（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）に供した。
【００８０】
１００μｌの粗抽出物を１ｍｌの９５％エタノールに溶解し、４℃で一晩、定期的に振盪した。この抽出物を１０，０００×ｇにて４分間遠心分離し、そしてこの上清を取り出しそして真空遠心分離によって乾燥した。固体を、かるく遠心分離した１００μｌのランニング緩衝液中で再構成し、そして可溶性物質を、、３０×４ｍｍのＲＰ−３００ガードカラムを備えた２２０×４ｍｍのＢｒｏｗｎｌｅｅ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ−３００（Ｃ８）にかけた。
【００８１】
このランニング緩衝液はアセトニトリル：水が５０：５０（Ｖ／Ｖ）であり、そして流速は０．７５ｍｌ／分であった。画分を、０．５分の間隔で回収し、そして１９５ｎｍにおける吸光度プロフィールをモニターした。この吸光度プロフィールを図３に示す。
【００８２】
画分を、上記のように、真空遠心分離によって乾燥し、５００μｌＰＢＳ中で再構成し、そしてＭＭ９６Ｌ細胞に対してそしてメタロチオネインレポーターアッセイ中でアッセイした。画分１３〜２８全てがＭＭ９６Ｌ細胞の樹状の外観への完全な転換を誘導したが、細胞死は観察されなかった。この効果は、レポーターアッセイにおいて非常に顕著であり、ここでこの活性は、１／１０，０００の希釈において（すなわち、１／１００，０００の培養物中での最終濃度において）でもなお観察された。
【００８３】
上記の結果に加えて、本発明者は、超遠心分離の後に、ＭＭ９６Ｌ細胞に対する活性が上清中およびペレット中の両方において見いだされること、および活性は、分子量カットオフ膜を介してサンプルを通過させることによって除去され得ないことを見い出した。上記で試験した細胞株に加えて、ＭＣＦ７乳ガン、細胞株の細胞の増殖は１／１００，０００までの最終希釈のＥ．ｐｅｐｌｕｓ樹液によって阻害された。細胞数は、バイシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ
ａｃｉｄ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して評価した。結果を図２に示す。
【００８４】
（実施例７）溶媒分画
Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの粗乳液のさらなる溶媒分画は、極性が増大する一連の溶媒によってもたらされた。１ｍｌ粗乳液には、遠心チューブ内で２０ｍｌジエチルエーテルを添加した。このチューブを振盪し、そして５０００ｇにて５分間遠心分離し、層を分配した。このジエチルエーテル上層を取り出し、そしてこの手順を２回繰り返した。このエーテル画分を合わせ、ロータリーエバポレーター上で乾燥するまで濃縮し、そしてバイオアッセイのために１ｍｌ ＤＭＥ中で再構成した。同様の様式で、この残渣を酢酸エチルで抽出し、続いて塩化メチレンで抽出した。ＭＣＦ７乳ガン細胞の細胞数の減少および樹状の外観への転換によって測定される場合、この最初のエーテル抽出物はこの活性の大部分を得た。しかし、活性はまた、酢酸エチル層および塩化メチレン層に由来する画分から証明された。最終の水可溶性（水性）画分において活性は見られなかった。この結果を、表１３にまとめる。
【００８５】
【表１３】
【００８６】
ＣＭＶプロモーター活性を、複製欠損アデノウィルス構築物によって感染されたＨｅＬａ細胞内にてアッセイした。この構築物において、Ｅ１ａ遺伝子は、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるβ−ガラクトシダーゼに置換されていた。この結果は、表１４に示されるように、感染された未処理の細胞のコントロール値の百分率として表記される
【００８７】
【表１４】
【００８８】
得られた結果は、他の分化誘導因子（例えば、ヒストンデアセチラーゼインヒビターまたはブチレート）を用いた場合にみられる結果と定性的に同様であるが、これらの因子を用いた場合に見られる活性に比べてより強力な活性を有する。より高濃度にて粗抽出物およびジエチルエーテル抽出物を用いた場合に観察されるより低いプロモーター活性は、おそらくこれらの濃度において見られるＨｅＬａ細胞に対する細胞殺傷効果を反映する。
【００８９】
さらなる溶媒分画実験において、粗液をメタノール：水（１７：３）とｎ−ヘキサンとの間で分配し、トリテルペン（ヘプタン相）からジテルペン（極性相）を分離するための以前の報告（ＥｖａｎｓおよびＫｉｎｇｈｏｒｎ １９７７）に基づいて溶媒分配が期待された。しかし、予想外に、両方の相において活性が検出された。このことは、この系において有効成分（ａｃｔｉｖｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）が異常に挙動することを示唆する。
【００９０】
別の溶媒分画アプローチでは、ＨＰＬＣ分析の前にサンプルを明澄化する必要が示唆された。この粗乳液を、７０−９５％までのエタノールと混合し、４℃で一晩振盪した。この混合物を１，０００ｇにて１０分間遠心分離し、そして上清を取り出し、そして粗液の元の体積の約３分の１まで濃縮した。この濃縮物に１００％アセトニトリルを３０−６０％添加した。この得られた白色沈殿物を１２，０００ｇにて１０分間の遠心分離によって除去した。ＴＬＣおよび質量分析法によって決定されるように、上清は、大環状ジテルペン（ジャトロファン類およびペプルアン）に富んでいた。この観察結果は、活性素の富化のための適切な大規模プロセスへの方法を示す。
【００９１】
（実施例８）エタノール可溶性抽出物のさらなる活性誘導細分画
実施例７および図３に記載したＨＰＬＣ細分画からの画分１４および１５を、クロマトグラフィーを繰り返すことによって、一定のダイオードアレイスペクトルを有する主要な対称ピークを選択することにより、さらに精製した（例えば、画分１４および１５；画分１４についての結果を図４および５に示す）。ＭＭ９６Ｌの樹状外観への転換を生じる際の精製した画分の活性を、細胞アッセイによって確認した。
【００９２】
画分１５の添加後のＭＭ９６Ｌ細胞への変化の特徴を、図６に示す。細胞を、抗体カップリング手順を使用して、顕微鏡写真として可視化した。この第一抗体、すなわちチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）に指向されたマウスモノクローナルを、ブロモ−クロロ−インドリルリン酸およびニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を発色基質として使用して、第二抗体、すなわちヒツジ抗マウスアルカリホスファターゼ結合体を用いて検出した。４日間のインキュベーションの後（図６Ａおよび６Ｂ）、黒色腫細胞数の著しい減少およびそれらの形態の明白な変化があった。この細胞は、正常な成熟メラニン形成細胞の特徴である長く、紡錘形の（樹状の）外観に戻った。この視野における全ての細胞は、この変化した形態を採るようであった。これは、ＭＭ９６Ｌ細胞集団の不均質な性質を考えると驚くべきことである。２１日間のインキュベーション後、この処理した細胞は、図６Ｃおよび６Ｄに示されるように、クラスター内で互いに幾分平行に整列することが見られ、これは正常な成熟したメラニン形成細胞の特徴である。粗液を含むＥ．ｐｅｐｌｕｓ由来の全ての樹状細胞誘導画分についても、同様の特徴が、観察された。
【００９３】
画分１４および１５についてのエレクトロスプレイ質量分析は、７８０（計算値７７９．３１５）のｍ／ｚを有する２，５，７，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−９−ニコチノイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン５、Ｊａｋｕｐｏｖｉｃ
ら、１９９８ａ）の存在を示した。１Ｄ ＮＭＲを使用した場合の、画分１４の核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析は、７ｐｐｍと９．４ｐｐｍとの間にダウンフィールドシグナルを与えた。これらは、環の９位におけるニコチノエート基内に存在するような、ピリジン様部分に一致する。また、トランス二重結合は、５−６ｐｐｍにおける大きなカップリング定数によって証明された。これはジャトロファン環式構造内の１１、１２内部二重結合に一致する。また、画分１４において、負イオンモードでのエレクトロスプレイによって、ｍ／ｚ７１６（計算値７１６．３０４）、６７３（Ｍ−ケテン）、６５６（Ｍ−ＡｃＯＨ）を有する、２，５，７，９，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−ジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン６、Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら、１９９８ａ）であると同定した。
【００９４】
画分１５は、ｍ／ｚ５９７（Ｍ−ケテン−ＡｃＯＨ）を有する２，３，５，７，１５−ペンタアセトキシ−９−ニコチノイルオキシ−１４−オキソジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン（ジャトロファン１、Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら、１９９８ａ）を含んでいた。従って、分光学的分析によって、ＨＰＬＣ上での、細胞殺傷活性および樹状活性を有する７−７．５分における初期溶出画分は、ジャトロファン５、６、および１の混合物を含んでいた。展開溶媒としてトルエン：アセトンを９：１で使用してＨＰＴＬＣ上でクロマトグラフにかけた場合、この結果は、ＨＰＬＣ画分１４および１５の挙動と一致する。ＵＶ陽性スポットは、終期溶出画分（例えば、画分２０−２２、Ｒｆが０．３−０．５）と対照的に、原点、すなわちＲｆが０．０（約）から移動しなかった。これは、展開溶媒としてトルエン：アセトンを９：１でまたはヘキサン：酢酸エチルを４：１でのいずれかを使用する、ＨＰＴＬＣ上でのクロマトグラフィーによって証明されるように、ジャトロファン３、２および４と比較して、ジャトロファン５、６、および１の相対的に極性の挙動を示す。これらの結果は、Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら、１９９８ａによって、展開溶媒として石油：メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１：１）を使用して得られる結果（例えば：ジャトロファン５：Ｒf０．０４、ジャトロファン６：Ｒf０．１０（３Ｘ）、およびジャトロファン１：Ｒf０．１１）と同様である。初期ＨＰＬＣ画分からの質量分析データにおいて、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ粗抽出物中にインゲナン誘導体（後述を参照）、または文献で報告され、そして表１に表された他の成分が存在するという証拠はない。
【００９５】
（実施例９）薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰＴＬＣ）上での粗抽出物およびエーテル可溶性抽出物の生物学的活性誘導精製
（ａ）実施例７で調製されたエーテル可溶性画分を、エチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）中で再構成し、そして展開溶媒としてクロロホルム：酢酸エチル（８２：１８）を使用して、２０×２０ｃｍシリカゲルプレート上でクロマトグラフした（図７）。このプレートをＵＶ光箱上で観察し、そしてＵＶ陽性バンドを同定し、ゲルから切り出し、ＤＭＥで溶出し、そしてＭＭ９６Ｌ黒色腫細胞株に対する阻害活性および形態転換について試験した。全体のゲルをＵＶ吸収画分および非ＵＶ吸収画分にスライスすることによって、予備実験において、活性がＵＶ吸収バンドと関連することが示された。ゲルの側片をクロロホルム中での０．１％ヨウ素で染色することにより、他の、ヨウ素に対して強い陽性のバンドを明らかにした。しかし、これらは、無視できる活性を有することが見いだされた。Ｒｆ０．０（Ａ）、Ｒｆ０．１６−０．１８（Ｂ１）、Ｒｆ０．２２−０．２４（Ｂ２）、Ｒｆ０．７３−０．８０（Ｃ）、Ｒｆ０．８０−０．９６（Ｄ）におけるＵＶ吸収バンドは、生物学的に活性であり、１／５，０００希釈において、細胞数の減少および樹状細胞の外観への完全な転換が観察され得る。
【００９６】
ゾーンＢ１、ＣおよびＤを、第一次元にヘキサン：酢酸エチル（１：１）を、そして第二次元にトルエン：アセトン（９：１）を用いる二次元溶媒システムを使用して、シリカゲル６０プレート上のクロマトグラフィーによってさらに精製した（それぞれ、図８Ａ〜８Ｃ）。１／５００希釈にて、細胞数の３０％より大きなＭＭ９６Ｌに対する阻害活性および樹状細胞の外観への完全な転換を有するＵＶ吸収スポットを、その図に示す。
【００９７】
Ｄゾーン由来の強くＵＶを吸収するスポット２２および２３（図８Ｃを参照のこと）を、ゲルから切り出し、ＤＭＥで溶出し、そして真空遠心分離によって乾燥した。画分２２および２３の質量分析は、５，８，９，１０，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシペプルアン、ｍ／ｚ６３９．５［Ｍ−ＡｃＯＨ］+、すなわちペプルアンの存在を明らかにした。
【００９８】
（ｂ）図９に示されるように、展開溶媒としてトルエン：アセトン（９：１）を使用して、濃縮ゾーンを有する１０×１０ｃｍのＨＰＴＬＣシリカゲル６０プレート（Ｍｅｒｃｋ カタログ番号０１３７４８．１０００）上で、全ての粗液をクロマトグラフにかけた。ＵＶ陽性ゾーン（１，Ｒf０．１４；２，Ｒf０．２３；３，Ｒf０．４９；４，Ｒf０．５４；５，Ｒf０．５７；６，Ｒf０．６３；および７，Ｒf０．７３）をゲルから切り出し、そしてＤＭＥ／ジエチルエーテルを用いて溶出した。上記のように、この画分をＭＭ９６Ｌに対して試験し、そして画分１、３、４、５および６は、細胞阻害活性および細胞転換活性を有することが証明された。これらの画分は、展開溶媒として、ヘキサン：酢酸エチル（４：１）を使用して、ＨＰＴＬＣプレート上で別々にクロマトグラフにかけ、ＵＶ陽性バンドＡ，Ｒf０．１７；Ｂ，Ｒf０．２４；Ｃ，Ｒf０．４２；Ｄ，Ｒf０．４８；Ｅ，Ｒf０．５２；Ｆ，Ｒf０．５８；Ｇ，Ｒf０．６２（図１０）およびＨ，Ｒf０．０２（図１１）を得た。Ｇ（ヨウ素陽性、図１０を参照）を除いた全画分は、１／５０００希釈にて、細胞増殖阻害および完全な樹状形態への転換に関して、ＭＭ９６Ｌ細胞に対して活性であった。
【００９９】
画分Ａ−Ｆ（Ｂは失われた）およびＨの質量分析を、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓの公表された成分の公知の分子質量イオンからの化合物の仮の割り当てと共に、表１５に示す。
【０１００】
【表１５】
【０１０１】
ペプルアン＝５，８，９，１０，１４−ペンタアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシペプルアン
ジャトロファン２＝２，５，７，９，１４−ヘキサアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−１５−ヒドロキシ−ジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン
ジャトロファン３＝２，５，１４−トリアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシ−９−ニコチノイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン
ジャトロファン４＝２，５，９，１４−テトラアセトキシ−３−ベンゾイルオキシ−８，１５−ジヒドロキシ−７−イソブチロイルオキシジャトロファ−６（１７），１１Ｅ−ジエン）
従って、質量分析は、２０−アセチル−インゲノール−３−アンゲレート（画分Ａ）、ペプルアン（画分Ａ，ＣおよびＤ）、ならびにジャトロファン２（画分Ｄ）３（画分ＣおよびＨ）、および４（画分ＥおよびＦ）の混合物を明らかにした。画分Ｈについての1Ｈ化学シフトデータを表１６に示す。
【０１０２】
【表１６】
【０１０３】
これらの帰属は、ＤＱＦ−ＣＯＳＹ、ＮＯＥＳＹおよびＴＯＣＳＹ二次元スペクトルから決定されるように、ジャトロファン環状構造の存在を示した。画分Ｈのスペクトルは、２つのジアステレオマー配座（最も有望であると考えられる）をとるジャトロファン３、２つ以上の同様に置換したジャトロファンの混合物、または２つのニコチネート、１つのベンゾエート、およびイソ−ブチレート部分を有する新規のジャトロファンの存在と一致した。Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら（１９９８ａ）によるように、約６ＨｚのＪ４，５、ならびに５と８との間、および４と７との間に強いＮＯＥを有し；ＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトルにおいて交差したピークの全体としての欠如によって証明されるように、Ｊ７，８およびＪ８，９が実質的にゼロであり、有望な環状配座はＩＩであった。任意のインゲノール構造の存在に一致するシグナルは存在しなかった。このサンプルを磁石から回収し、そしてそのアリコートは、ＭＭ９６Ｌに対する強力な活性を証明し、これは、２０μｇ／ｍｌにおける完全な細胞死、および２０ｐｇ／ｍｌ未満における樹状外観への完全な転換によって証明された。
【０１０４】
（実施例１０）ＮＭＲ分析
画分Ａを、展開溶媒として、ヘキサン：酢酸エチル（４：１）を使用して、ＨＰＴＬＣ上のクロマトグラフィーによってさらに精製した。ＵＶ光箱上での吸収に対する添加剤として、側片を、メタノール中の７０％リン酸をゲルに噴霧することによって染色し、そしてヘアードライアーを用いたゲルの加熱による発色は、ＵＶ光下にて濃い青色バンドを示し、これは主なＵＶ吸収バンドから分離され得た。このバンドと等価の非染色領域を、切り出し、エーテルを用いて溶出し、そして真空遠心分離によって乾燥した。約１ｍｇのこの物質を４ｍｌ乳液から蓄積した。この物質を、ＮＭＲ分析に供し、続いてバイオアッセイし、そして１ｎｇ／ｍｌ最終濃度を表す１／５×１０6希釈において完全な樹状形態への転換に関して活性であることを証明した。この物質は、ＮＭＲによって、表１７に示されるようにＣ27Ｈ36Ｏ7、つまり２０−アセチル−インゲノール−３−アンゲレートとして同定された。この知見は、表１５に表される質量分析の証拠に一致する。
【０１０５】
【表１７】
【０１０６】
しかし、ＨＰＬＣによる活性誘導精製の質量スペクトルから、および画分Ａから離れた他のＴＬＣ画分における、２０−アセチル−インゲノール−３−アンゲレートの非存在は、これが唯一の活性画分ではないことを示す。むしろ、ジャトロファン１−６およびペプルアンはまた、ＮＭＲおよび質量分析データからの推察によって、関係づけられる。これは、ＴＬＣによって調製されるような画分Ｈ（ジャトロファン３Ｎａ+ｍ／ｚ ８３０；表１６の１Ｄ ＮＭＲの結果も参照）について、およびＨＰＬＣによって調製されるような画分１３および１４（ジャトロファン５、ｍ／ｚ ７７９および１Ｄ ＮＭＲ；ジャトロファン６、ｍ／ｚ ７１６；ジャトロファン１またはジャトロファン６誘導体、ｍ／Ｚ ５９７）について特に本当である。
【０１０７】
Ｊａｋｕｐｏｖｉｃら（１９９８ａ）は、パラリアン（ｐａｒａｌｉａｎｅ）クラスの化合物がジャトロファンとペプルアンとの間の経路における中間体であることを提唱した。ジャトロファンおよびペプルアンの両方による抗癌細胞活性および樹状細胞転換が本発明において証明されているため、このパラリアンもまたこれらの特性を示すと結論づけることが合理的であるようである。
【０１０８】
（実施例１１）調製薄層クロマトグラフィーによるマウス実験のための物質の調製
実施例６に記載されるように、７０％エタノール中の１５ｍｌ粗液をジエチルエーテルで抽出した。この抽出物を真空遠心分離によって濃縮し、そして約５ｍｌ ＤＭＥ中で再懸濁した。このＤＭＥ抽出物を、展開溶媒としてヘキサン：酢酸エチル（４：１）を使用して、調製ＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ ＰＬＣ、シリカゲル６０、カタログ番号００５７４５．１０００）上でクロマトグラフにかけた。図１２に示されるように、領域「Ｈ」および「Ａ−Ｆ」に対応するゾーンを切り出し、そして合わせ、エーテル／ＤＭＥで溶出し、そして真空遠心分離によって乾燥した。抽出物は、ジャトロファン２、３および４、ペプルアン、ならびに酢酸インゲナンに富んでいた。ペレットを、９５％エタノール中で懸濁し、そして１０，０００ｇにて１０分間遠心分離した。上清（６．０ｍｌ，１０ｍｇ／ｍｌ）を０．２ｍｌアリコート内に分散し、そして−２０℃にて保存した。この抽出物を、ＭＭ９６Ｌ黒色腫細胞株に対してアッセイし、そして高い能力を示し、１／５×１０6希釈においてもなお樹状細胞形態が明白であった；これは粗液の能力を複製した。このように調製した抽出物は、ジャトロファン２、３および４、ペプルアンならびに酢酸インゲナンに富んでいた。注入の直前に、２０μｌを、０．１−０．２ｍｌの注入のために、５％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０組織培養培地を有する１ｍｌに希釈した。エタノール溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）をコットンバッド（０．２−０．４ｍｌ）に吸収させ、マウスの局所塗布のために使用した。
【０１０９】
（実施例１２）腫瘍細胞の皮下インプラントの増殖の阻害
（ａ）５匹の４週齢のヌードマウスに、２×１０6個のＭＭ９６Ｌヒト黒色腫細胞を含む、０．１ｍｌの組織培養培地を４つの異なる部位にｓ．ｃ．注射した。３匹の処置したマウスに、５％ウシ胎仔血清および２０μｇのエタノール抽出物を含む０．１ｍｌ ＲＰＭＩ培地を１、２、３、５、６、７、および８日目に注射した。さらに、その処置したマウスに、約５〜１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ エタノール抽出物または粗製の希釈していない樹液を４回まで局所適用した。処置したそれぞれのマウス上の異なる２つの部位に、エタノール抽出物または粗製の樹液で局所的処置を行った。１匹のマウスに１２、１３、および１４日目に局所的処置を行い、そして他の２匹の処置したマウスは、１５、１９、２０、および２２日目に局所的処置を行った。腫瘍容積を３２日目に測定した。
【０１１０】
局所的適用の前では、抽出物の注入は、腫瘍容積に明らかな効果を有さなかった。エタノール抽出物の局所的適用後に、一晩で腫瘍の外見に変化があった。腫瘍は、灰色がかった黒色になり、次いで固く、黒色のごつごつした外見になり、次いで痂皮形成が見られた。粗製の樹液で処置した腫瘍は、１日後に類似の変化を示した。時間がたつにつれて、エタノール抽出物および粗製の樹液の全体的効果は類似したため、局所的に処置した病変についての測定を組み合わせた。注射および局所的処置を与えたマウスにおいて、腫瘍容積は７６％減少した（ｐ＜０．２）。エタノール抽出物で処置した１つの腫瘍は、図１３に示すように、完全に消失し、他の８つは、平らな黒色の痂皮に縮小した。他の３つの処置した腫瘍は、最初に類似の色の変化と腫瘍後退が示されたが、測定を行う１０日前の局所的適用の中止後に再増殖した。
【０１１１】
（ｂ）６匹の４週齢のＣ５７Ｂｌａｃｋ（Ｃ５７Ｂｌ）マウスに、１０5個のＢ１６黒色腫癌細胞を含む、０．１ｍｌの組織培養培地を下腹部の２箇所に注射した。腫瘍を４日間発達させ、次いで、３つの注射レジメ（５％ウシ胎仔血清を含む、０．１ｍｌのＲＰＭＩ培地中の２０μｇエタノール抽出物（１、２、および４日目）および１回の局所的処置（４日目における５〜１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ エタノール抽出物）に供した。最初の注射の８日後、腫瘍領域を定規を使用して測定した。処置によって、３匹の処置したマウスにおけるＢ１６黒色腫腫瘍サイズは、３匹のコントロールマウスの腫瘍サイズと比較して、６４％（ｐ＜０．０５）減少した。
【０１１２】
結果を表１８に要約する。
【０１１３】
【表１８】
【０１１４】
（実施例１３ 精製した抽出物によってヒト黒色腫細胞株（ＭＭ９６Ｌ）に誘導された遺伝子発現の変化）
１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中、１５０ｃｍ2プレートにおいて培養されたヒト黒色腫細胞株のＭＭ９６Ｌ細胞株を、精製抽出物とともに５％ＣＯ2／空気中、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中に掻き取り、ペレット化し、１ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁した。細胞をペレット化して３００μｌ ＮＰ−４０溶解緩衝液中に入れ、氷上に１５分間放置した。細胞をペレット化し、上清をプロテイナーゼＫおよびＳＤＳとともに３７℃で１５分間処理し、フェノールクロロホルムで抽出して、そして全ＲＮＡを酢酸アンモニウム／エタノールによって−２０℃で一晩沈澱させた。Ｐｒｏｍｅｇａ ｍＲＮＡ単離キットを用いて、ｍＲＮＡを単離し、次いで、33Ｐ標識されたｄＣＴＰの存在下で逆転写し、ｃＤＮＡを生成した。ｃＤＮＡをＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ａｒｒａｙ １．２（ＧＤＡ）において、製造業者の説明書に従ってハイブリダイズさせた。このアレイをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒで定量し、そしてＩｍａｇｅＱａｎｔおよびＥｘｃｅｌソフトウェアで分析した。
【０１１５】
処理および未処理細胞に由来する２連のスポット容積の割合を算出し、そして遺伝子活性化（割合＞１）または阻害（＜１）のレベルを規定するために使用した。バックグラウンドは、代表的には５００〜１０００カウントであるが差し引きされず；従って述べられた割合は、実際の変化より小さく見積もられている傾向がある。
【０１１６】
このアレイは、１８，０００を超える特有の配列、いわゆる発現された配列タグ（ＥＳＴ）からのｃＤＮＡスポットを含んでいた。ＥＳＴのうち約３０００が同定可能な、ヒト細胞の発現された遺伝子に由来した。試験されたヒト黒色腫細胞における多くのＥＳＴ配列は、抽出物での処置によってアップレギュレートされたか、またはダウンレギュレートされたかのいずれかであった。割合の＜３０％の標準偏差を有した２連に基づいた変化のみが、この段階において生物学的に有意であると考慮された。４時間という比較的短い処置時間が、薬剤について最も早くかつ最も重要な標的を同定するために使用されたことにもまた注意すべきである。遺伝子発現におけるさらなる主要な変化は、１次応答に依存して、この時間の後に生じるようである。
【０１１７】
いくつかの関連する公知の遺伝子（これは、癌細胞の制御に関して直接的または間接的にのいずれかで有利であると思われる）の転写物レベルにおける変化からの結果は、表１９に要約される。
【０１１８】
この実施例において見られた細胞形態における変化は、主要な細胞骨格タンパク質であるアクチンと結合する多くのタンパク質の主要なダウンレギュレーションから生じることが予測され得る。レチノール結合タンパク質の増加はまた、ここで関与し得、そしてレチノイドの細胞内レベルの増加を介して分化された表現型の誘導にもまた関与し得る。
【０１１９】
太陽のＵＶ照射によって誘導される現在または将来のＤＮＡ損傷の修復は、ＸＰ修復タンパク質の観察された誘導によって増強され得る。さらに、ＧＡＤＤ４５の減少およびイオン化照射耐性タンパク質（ＤＡＰ３）は、放射線治療に対する腫瘍組織の感作において有用であり得る。後者の変化はまた注目すべきである。なぜなら、これは、ＭＭ９６Ｌ細胞において、皮膚癌および黒色腫の原因であるＵＶＢによって強力にアップレギュレートされるからである。
【０１２０】
免疫応答を増強することに関連性のある多くの分子、特にＧ−ＣＳＦが誘導される。これらのうちのいくつか（例えば、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のタンパク質）は、免疫治療のため有用な属性であると考えられ、キラーＴ細胞活性を増強させる。
【０１２１】
細胞増殖の制御に最も重要な変化は、Ｇタンパク質およびＰＫＣ経路、ならびにプロテオソーム活性の増強の検出された変化に関する。経路の正常な平衡および経路相互作用（例えば、Ｒａｓシグナル伝達によって媒介される）における増殖および変化を含む、多くの細胞プロセスに関して重要である細胞内シグナル伝達は、細胞について有害な結果を有するようである。プロテオソーム成分ＬＡＭＰ７−Ｅ１の誘導レベルは、実験におけるいずれの遺伝子について見出されたものの中で最も高く、そしてユビキチン経路を介して多くのタンパク質のプロセシングを大きく変化させると予測される。
【０１２２】
遺伝子発現アレイデータに基づくと、本発明の化合物は、以下の活性を有すると予測される：
１．インビボで抗癌活性を導く様式で、Ｇタンパク質、ＰＫＣおよびＲａｓシグナル伝達経路における遺伝子発現を調節することにおける活性
２．標的またはエフェクタ細胞のいずれかにおいて、ＤＮＡ修復および免疫応答を増強させることによって、太陽のＵＶおよび類似の因子からの損傷を寛解させることにおける活性
３．防御タンパク質（ＧＡＤＤ４５およびＤＡＰ３）のダウンレギュレーションに基づく、放射線治療に対するアジュバントまたは他のＤＮＡ損傷因子での治療に対するアジュバントとしての活性。
【０１２３】
【表１９】
【０１２４】
【０１２５】
（実施例１４ ヒトボランティアにおける日光性角化症の処置）
倫理委員会の承認を、Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈから、ヒト被験体における顔面日光性角化症の処置のための、臨床医の監督下でのＥ．ｐｅｐｌｕｓの粗製の樹液の使用の治験について得た。
【０１２６】
オーストラリアで生長した植物から得て、５０％グリセロール中で−２０℃で２週間保存した粗製抽出物を、綿棒塗布具を用いて、臨床的に診断された（直径約５ｍｍの）日光性角化症の表面（男性ヒトボランティアの顔面の左こめかみ）に適用した。約５０μｌを表面に送達した。１日後、２回目の適用を同じ部位に行った。１回目の適用の後、４〜５時間にわたって何の反応も見られなかったが、その後、この部位で炎症反応が生じて、直径８０〜１００ｍｍの領域に広がった。１日後、適用部位および適用領域に対して遠位の局在性の部分において、新たな前悪性の部位がまた標的化されたかのように、局在性の腫脹および水疱形成が見られた。１回目の処置の４日後に、腫脹は鎮静化し、そして痂皮形成が罹患部位で明らかであった。１４日後、痂皮は脱落し、その下部に新たな皮膚が出てきた。６週間後、処置した領域は、まだピンクがかっていたが、元々の日光性角化症の兆候はなかった。コントロールとして、同じボランティアの前腕部の正常皮膚の１ｃｍ2の部分もまた同様に処置した。局在性の軽度の炎症が見られ、これは、処置後７〜１０日で消失した。
【０１２７】
日光性角化症の処置に関連した強い炎症反応は、実施例１３における遺伝子アレイスクリーニングから得られた免疫応答についての結果、および以下の実施例１５におけるＥ．ｐｅｐｌｕｓの粗製樹液によってＴ細胞のインビトロの増殖の観察によって示唆されるように、キラーＴ細胞の漸増および増殖を反映し得る。キラーＴ細胞活性の増強は、免疫系による癌細胞の破壊において重要な過程であると考えられ、そして元来の処置部位に対して遠位の前悪性病変の認識および攻撃を説明することを補助し得る。
【０１２８】
（実施例１５ 正常メラニン細胞の細胞数に対する粗製樹液およびＴＬＣからの精製画分「Ａ」および「Ｈ」の効果）
１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）は、インビトロでの正常メラニン細胞の培養のために必須である。なぜなら、これらの細胞は、ＴＰＡなしでは非常に不充分にしか増殖しないからである。予備実験において、実験の開始からＴＰＡを添加することなく、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ画分を培地に添加した。Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ画分を新鮮な培地に添加し、そしてスコアされた細胞数を、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ画分またはＴＰＡなしの新鮮な培地と比較した。このレジメの下で、ＴＰＡ欠損培地において増殖させた「コントロール」細胞で得られた細胞数より、より多くのメラニン細胞数が得られた。興味深いことに、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ画分含有培地における細胞は、ＴＰＡを含有する、いわゆる「標準」培地において増殖させた細胞より健常に見えた。従って、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ由来の化合物は、細胞培養におけるツールとしてのＴＰＡの使用より優れた代替物を提供し得る。
【０１２９】
第２の実験において、正常のメラニン細胞を、１０％ウシ胎仔血清、コレラ毒素、抗生物質およびＴＰＡを含むＲＰＭＩ １６４０培地中、１ウェルあたり５０００細胞でプレートした。２４時間後、培地を吸引によって細胞から除去し、そしてＴＰＡを添加することなく（しかし、特定された添加物を含む）、新たな培地で置換した。細胞をさらに１０日間インキュベートした後にスコア付けした。結果を表２０に示す。先の実験において示された癌細胞株に対するこれらの濃度で観察された細胞阻害効果と対照的に、１／５，０００，０００希釈においてすら、細胞増殖効果が粗製および精製画分で注目されたことが明らかである。別個の試験において、インビトロでのＴ細胞増殖はまた、粗製のＥ．ｐｅｐｌｕｓ樹液を用いたＴ細胞の処置後に得られた。
【０１３０】
【表２０】
【０１３１】
正常メラニン細胞およびＴ細胞の両方がＥ．ｐｅｐｌｕｓ 樹液からの画分によって増殖が誘導されたので、この因子は、正常細胞の再生が有利である任意の医学的状態において、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて、正常細胞についての細胞増殖因子として広範な適用を有し得る。その医学的状態としては、以下が含まれるが、これらに限定されない：
ａ）外傷の症例において、および外科的手術後、および熱傷からの回復における迅速な創傷治癒のための皮膚細胞（ケラチノサイト）の増殖。
ｂ）移植のための膵臓島細胞の増殖。
ｃ）免疫系のＴ細胞および他の細胞の増殖。日光性角化症の処置に対するヒトボランティア治験における適用時点後の作用の拡大が、適用領域に対するナチュラルキラーＴ細胞の漸増によって説明され得ることに注目することは興味深い。
ｄ）肝臓、腎臓、結腸、肺、および眼に由来する老化および壊死組織の再生。
ｅ）器官移植に対する代替物としての宿主組織の増殖。
【０１３２】
（実施例１６ 悪性黒色腫ＭＭ９６Ｌ細胞数に対するベタインの効果）
異なるタイプのベタインを、最終濃度１ｍｇ／ｍｌまで滅菌ＭｉｌｌｉＱTM水中に溶解し、そして５０００個のＭＭ９６Ｌ細胞を含む０．１ｍｌの組織培養培地中に、先に記載したように希釈した。細胞を４日のインキュベートの後にスコア付けした。結果を表２１に示す。
【０１３３】
試験したほとんどのベタインが細胞数に対する影響を有さなかったのに対して、βアラニンベタインヒドロクロリド（ホモベタイン）は、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞数を減少させ、そして細胞は、樹状の様相を呈した。ｔ−４ヒドロキシＮ，Ｎ−ジメチルプロリンもまた、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で細胞数を阻害した；しかし、細胞形態は、多樹状（ｐｏｌｙｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）形態の細胞形態に変化し、このことの意義は未知である。
【０１３４】
βアラニンベタインヒドロクロリド（ホモベタイン）は、別個にまたは組み合わせてのいずれかで、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ粗製樹液またはその精製有効成分についての適切な処方物薬剤であり得る（インゲノール、ペプルアン、およびジャトロファン１−６を含む）。これは、低希釈のＥ．ｐｅｐｌｕｓ成分で前悪性皮膚病変に対して局所的適用のために使用され得るか、または高濃度のＥ．ｐｅｐｌｕｓ成分を有する抗癌剤として処方され得る。ベタイン自体は、抗癌剤として有用であることが示唆されている；例えば、Ｗｉｅｒｓｅｍａらの米国特許第５，５４５，６６７号を参照のこと。
【０１３５】
それらの界面活性剤特性のために、ベタインは、化粧品における処方物成分として広範に使用される。それらの両性イオン特性に起因して、ベタインはまた、皮膚のより深層に他の成分の輸送を助け得る。Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ 樹液またはそれらから得られた精製画分の非常に希釈された抽出物とともに、皮膚用化粧品調製物において使用されるベタイン（例えば、ジャトロファン類、ペプルアン、パラリアン、またはインゲナンを含む）は、別個にまたは組み合わせて、望ましくは、補完的な特性を有するべきである。グリシンベタインを含む、試験された全てのベタインのうち、β−アラニンベタインヒドロクロリド（ホモベタイン）のみが、たとえ中程度であっても、Ｅ．ｐｅｐｌｕｓ 樹液およびその画分と比較して、表現型逆転（ｒｅｖｅｒｓａｌ）効果を有した。
【０１３６】
【表２１】
【０１３７】
本発明は、明瞭化および理解の目的でいくらか詳細に記載されているが、本明細書中に記載の実施態様および方法に対して種々の改変および変更が、本明細書に開示された本発明の概念の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、当業者に明らかである。
【０１３８】
本明細書中に引用された参考文献は、以下の頁に列挙され、本明細書に参考として援用される。
【０１３９】
【表２２】
【０１４０】
【０１４１】
【０１４２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図６】
【公開番号】特開２０１２−３１２１２（Ｐ２０１２−３１２１２Ａ）
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１１−２４９０９１（Ｐ２０１１−２４９０９１）
【出願日】平成２３年１１月１４日（２０１１．１１．１４）
【分割の表示】特願２０００−５０９６８１（Ｐ２０００−５０９６８１）の分割
【原出願日】平成１０年８月１９日（１９９８．８．１９）
【出願人】（５０００７５５０８）ペプリン リサーチ プロプライエタリー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２４９０９１（Ｐ２０１１−２４９０９１）
【出願日】平成２３年１１月１４日（２０１１．１１．１４）
【分割の表示】特願２０００−５０９６８１（Ｐ２０００−５０９６８１）の分割
【原出願日】平成１０年８月１９日（１９９８．８．１９）
【出願人】（５０００７５５０８）ペプリン リサーチ プロプライエタリー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]