抗酸化及び老化抑制活性を有するハナズオウ抽出物及びそれを含む抗酸化、皮膚老化抑制及びシワ改善用化粧料組成物
本発明は、化学式１乃至化学式２０で表される化合物を含む抗酸化活性及び抗老化活性を有するハナズオウ抽出物、ならびに、その抽出物を有効成分として含む、抗酸化用、皮膚老化保護用及びシワ改善用の化粧料組成物に関するものである。本発明の抽出物は、酸化的損傷及び皮膚損傷に対する保護効果、ならびに老化依存性のテロメア短縮に対する抑制効果を有するため、皮膚老化保護用化粧料として有用に使用できる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、皮膚老化抑制活性を有する植物抽出物及びそれを有効成分として含む老化抑制用化粧料組成物に関するもので、詳細には酸化的ストレスに対する抑制活性及び皮膚細胞寿命延長効果が優秀なハナズオウ抽出物を含む皮膚老化抑制用化粧料組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
老化は、時間の経過と共に起きる身体のすべての生理的変化を総称するもので、個体により数多くの要因によりとても多様に起きる生命現象である。老化は、個体毎にその様相と速度が異なり、一個体内においても各組織毎にその様相が異なるため、老化を個体水準で研究するには多くの難しさがある。一方、老化現象を具体的に詳しく見てみると、各構成器官及び組織の機能変化が起きるもので、これは構成単位である細胞の機能変化に起因する。即ち、脳の神経細胞消失により認知機能が低下したり、皮下脂肪細胞の消失により皮膚の弾力が減少したり、毛根メラニン細胞がメラニン色素生成能力を失うことにより髪の毛が白くなる等、個体の老化は結局その個体を構成する細胞の老化に起因する。ゆえに、最近では老化の研究も細胞水準で多く行われている。この数十年間数多くの科学者らが細胞の老化に関して研究してきたが、老化の多様な現象と複合的な特徴のため、いまだ正確なメカニズムを糾明できずにいる。しかし、多数の現象学的研究を通じて老化に関する様々な仮説が提起され、その中で正常的な代謝過程で発生する活性酸素による酸化的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）が蓄積され老化の原因になるという老化の活性酸素説と染色体末端部分にあるテロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）が細胞分裂を繰り返すにしたがって漸次消失して細胞分裂が停止し、結局死滅に至るという老化のテロメア説が関心を集めている。その他にも様々な仮説があるがこのような仮説は、お互いに相反するものではなくお互いに補完的に老化を説明している。老化の活性酸素説というのは、正常的な代謝過程で付随的に生成される活性酸素は、反応性が強くて細胞構成成分の脂質、タンパク質、糖、またはＤＮＡ等を非選択的、非可逆的に破壊して細胞や組織の酸化的ストレスを誘発させることにより、癌を始めとする脳卒中及び粥状動脈硬化のような心血関係疾患、リューマチのような慢性炎症疾患、呼吸器疾患または自己免疫疾患等の各種疾病を誘発するだけではなく（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂ ａｎｄ Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｍ．Ｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８４年，第２１９巻，１−１４頁；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ Ｇｒａｐｏ，Ｊ．Ｄ．，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，１９８２年，第４７巻，４１２−４２６頁；Ａｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３年，第２２１巻，１２５６−１２６４頁；Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｉ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９８６年，第２４７巻，１−１１頁；Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈ，Ｍ．Ｓ．，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，１９９５年，第１０巻，１９−２５頁）、このような酸化的損傷が長い時間蓄積されて老化と死に至るというものである。このような老化の活性酸素説は、１９５６年にハルマン（Ｈａｒｍａｎ）によって始めて提案され（Ｈａｒｍａｎ，Ｄ．，Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６年，３−４９頁）、以後、色々な実験結果が前記仮説を裏付けいている。実験条件を変えて食餌を制限したり運動量を減少させる等、基礎代謝率、即ち、酸素消費量を減少させることにより寿命が延長されることが観察された（Ｍｅｄｖｅｄｅｖ，Ｚ．Ａ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９０年，第６５巻，３７５−３９８頁；Ｌｏｅ，Ｊ．，Ｎｏｒｔｈｒｏｐ，Ｊ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７１年，第３２巻，１０３−１２１頁；Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．，Ｉｎｓｅｃｔ ａｇｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９８６年，２３−４４頁；Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．，Ａｇｉｎｇ，１９８２年，第５巻，２１−２４頁）。
【０００３】
一方、生体内には酸化的損傷から防御するための抗酸化物質等とスーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，以下「ＳＯＤ」と略称する）、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）またはペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）のような抗酸化酵素が存在する。年を取って老いるにつれて活性酸素に対する防御能力が減少するという事実が報告された（Ｏｒｒ，Ｗ．Ｃ．ａｎｄ Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４年，第２６３巻，１１２８−１１３０頁；Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５年，第２７０巻，１５６７１−１５６７４頁）。即ち、年老いたネズミの肝から分離されたＳＯＤは、若いネズミのＳＯＤより活性が低く、特にショウジョウバエに抗酸化酵素のＳＯＤとカタラーゼの活性を高めると寿命が３０％以上増加し、活性酸素と老化が密接な関連があることが分かる。したがって、活性酸素を消去できる物質や脂質過酸化抑制物質のような抗酸化剤は、活性酸素によって誘発される各種疾患治療剤及び老化予防のための抑制剤として期待を集めている。
【０００４】
また、大気汚染、紫外線露出、ストレスまたは疾病等の有害環境から酸化的ストレスに継続的に露出すると、体内にラジカルが増加して真皮の結合組織であるコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等を破壊して皮膚の一定部位沈下現象（シワ）を作り得る。また、細胞膜の脂質部分を酸化させ細胞の破壊現象を起こして皮膚炎、ニキビまたは皮膚癌等の疾病を誘発し得る。その他にもラジカルは、メラニン形成過程に関与してシミ、そばかす及びシワ生成の原因になったりする。以前からアスコルビン酸、α−トコフェロールまたはＳＯＤ等が自由ラジカル消去機能物質として化粧料や医薬品に配合され、シワ及びその他皮膚疾患を防止するために使用されてきたが、これらの価格が高価なだけではなく配合時の化学的安定性が良くないため実質的な効果を期待することが難しい問題点があった。そのような理由から安全でありながら自由ラジカル消去効果が高い物質を開発することが医薬品や食品分野だけだはなく化粧品産業分野にも重要な課題として台頭し多くの研究が進められている。
【０００５】
老化現象を理解するためのまた一つの理論として、老化のテロメア仮説がある。ヒトの正常細胞は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で決められた回数だけ細胞分裂をしてそれ以上分裂しない。これを複製老化というが、このような現象がなぜ起きるのかを説明するのがテロメア仮説である（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．，等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２年，第２１巻，５０３−５１１頁；Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．，等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０年，第３４５巻，４５８−４６０頁；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ｂｉｏｌ．１９７３年，第４１巻，１８１−１９０頁；Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．１９９２年，第２７巻，３７５−３８２頁；Ａｌｌｓｏｐｐ，Ｒ．Ｃ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２年，第２１巻，３２７０−３２７３頁）。テロメアは、真核細胞線形染色体の末端部分にＴＴＡＧＧＧ塩基配列が反復する特異な構造からなっている。特に、グアニン（Ｇ）は、水素結合により非常に安定なＧ−四分体（ｑｕａｒｔｅｔ）構造を形成することにより染色体を安定化させ染色体を保護するのに重要な役割を果たす（Ｍｏｙｚｉｓ，Ｒ．Ｋ．，等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８８年，第８５巻，６６２２−６６２６頁）。しかし、ヒトの体細胞は、細胞分裂をする度にテロメアの長さが段々減少することが明らかにされた（Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．，Ｆｕｔｃｈｅｒ，Ａ．Ｂ．，Ｇｒｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０年，第３４５巻，４５８−４６０頁；Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．等，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．１９９２年，第２７巻，３７５−３８２頁；Ａｌｌｓｏｐｐ，Ｒ．Ｃ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２年，第２１巻，３２７０−３２７３頁）。このような現象は、ＤＮＡが複製される時、３’−末端のプライマー部分が複製されない、いわゆる「末端複製問題（Ｅｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｌｅｍ）」のために起きる（Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ｂｉｏｌ．１９７３年，第４１巻，１８１−１９０頁）。ゆえに、細胞は一度分裂する度にプライマー部分だけ短いＤＮＡが複製され、分裂を重ねるにつれて染色体のテロメアの長さが短くなり臨界長さ以下になるとＤＮＡの単一鎖と二重鎖が切れて、結局、サイクリン依存キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ）の抑制剤等を誘導させ細胞分裂がＧ１期に停滞する（Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．等，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．１９９２年，第２７巻，３７５−３８２頁）。最近の研究によると、テロメアの長さは、酸化的ストレスの影響を受けるものと明らかにされた。即ち、酸化的ストレスはテロメア短縮速度を増加させる。これは酸化的損傷が染色体の他の部分に比べてテロメリックＤＮＡ部分が不十分に復旧されるためであると考えられている（Ｓａｒｅｔｚｋｉ，Ｇ．，ｖｏｎ Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ，Ｔ．，Ａｎｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００２年，第９５９巻、２４−２９頁；ｖｏｎ Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ，Ｔ．，Ａｎｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００年，第９０８巻，９９−１１０頁；ｖｏｎ Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ，Ｔ．，ＴＲＥＮＤＳ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２００２年，第２７巻，３３９−３４４頁；Ｌｏｒｅｎｚ，Ｍ．，等，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２００１年，第３１巻、８２４−８３１頁）。
【０００６】
このような老化の理論に基づき植物から皮膚老化を抑制させられる物質を探した。植物は、光合成過程で副産物としてスーパーオキサイドラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ）を始め色々な活性酸素が生成されるため、このような酸化的ストレスから自らを保護できる防御体系が良く発達しているものと考えられる。ゆえに、植物はそれ自体が抗酸化物質を含有している重要な資源になり得る。それで、３５０余種の植物を対象にラジカル消去活性及び脂質過酸化抑制活性を調査して、抗酸化活性がある数種の候補植物を選定した。文献考察及び資源確保の容易性等を考慮して、比較的成分及び活性に関する報告がなく資源確保が容易なハナズオウ（Ｃｅｒｃｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）を最終候補植物に選定した。
【０００７】
ハナズオウ（Ｃｅｒｃｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）は、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）に属する落葉潅木であり中国原産である。高さは、３乃至５ｍで小さい枝には毛がなく、数個の皮目がある。葉は、互生して単葉で、形は丸い心臓型で、直径は６乃至１１ｃｍで毛はなく縁が単調である。葉の表は濃い緑色で、潤気が出て、裏面は薄緑である。托葉は四角形で、早く散る。花は長さが１乃至２ｃｍで、葉のわきが数房付き、花がなく花梗だけがある。萼は鐘模様で、外側の縁に５個の鈍いノコギリ葉がある。花冠は蝶模様で紫紅色で、花びらは５枚で大きさが一定ではない。雄しべは１０個で、分離している。基部は萼内に付いている。花糸は細長い。雌しべは１つで、子房は光沢があり、毛はなく、袋がある。花柱上部分は曲がっていて、柱頭は短くて小さく、押されて扁平になった模様である。開花期は、４月頃で葉より先に咲く。実は莢果で扁平な帯模様で、端は少し収縮して短いくちばし模様である。さやは長さ７乃至１２ｃｍで８〜９月に熟し、種子は丸く扁平で黒色に近い（李永魯、原色韓国植物図鑑、教学社、ソウル、１９９６年、３６２−３６３頁）。漢方薬では、ハナズオウの樹皮、根皮、木質部、実、花等を各々紫荊皮、紫荊根皮、紫荊木、紫荊果、紫荊花といい、風寒湿痺、通経、生理痛、喉痺、淋疾、血液循環促進等に使用している（Ｂａｅ, Ｋ．Ｈ．，Ｔｈｅ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｋｏｒｅａ，Ｋｙｏ−Ｈａｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ，２０００）。
【０００８】
本発明者らは、ハナズオウから分離した抽出物が合成抗酸化剤とは異り人体に無害で、他の天然抗酸化剤に比べて酸化的ストレスに対する細胞保護活性が優秀であるだけではなく、テロメアの長さの短縮速度を遅くすることにより細胞寿命を延長させられるため老化防止、皮膚弾力保護またはシワ改善のための化粧料組成物として有用に使用できることを確認することにより本発明を完成した。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明の目的は、水またはアルコール水溶液を抽出溶媒に使用して抽出した抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用ハナズオウ抽出物を提供することである。
【００１０】
また、本発明の別の目的は、前記抽出物またはそれから分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物からなる群から選択された化合物を有効成分として含む抗酸化用、皮膚弾力保護用またはシワ改善用化粧料組成物を提供することである。
【００１１】
また、本発明の別の目的は、前記抽出物を有効成分として含む薬学的組成物を提供することである。
【００１２】
また、本発明の目的は、本発明の前記抽出物を製造する方法を提供することである。
【００１３】
発明の詳細な説明
前記目的を達成するために、本発明は、水またはアルコール水溶液を抽出溶媒に使用して抽出した抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用ハナズオウ抽出物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記抽出物またはそれから分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物からなる群から選択された化合物を有効成分として含む抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ改善用化粧料組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記抽出物を有効成分として含む薬学的組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記抽出物を製造する方法を提供する。
【００１７】
本発明を、以下で詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、水またはアルコール水溶液を抽出溶媒に使用して抽出した抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用ハナズオウ抽出物を提供する。
【００１９】
本発明者らは、老化の活性酸素説に基づき１４０余種の生薬と全国で採集した２１０余種の植物を対象に抗酸化活性を検索して、数種の候補植物を選定し、その中で資源確保が容易で抗酸化活性に関する報告がなかったハナズオウの抽出物から抗酸化活性を確認した。本発明に使用したハナズオウは、２００１年９月中旬、大徳研究団地及び忠南大学校で採集したものを植物図鑑と比較して確証した。確証標本（HK1122）は、（株）韓国新薬慈光研究所に保管されている。
【００２０】
本発明のハナズオウ抽出物を製造するのに使用した溶媒は、アルコール水溶液である。前記アルコール水溶液は、メタノール水溶液、エタノール水溶液、プロパノール水溶液及びブタノール水溶液からなる群から選択することが好ましい。また、前記アルコール水溶液は、エタノール水溶液であることが好ましく、エタノール水溶液は５０乃至８０％エタノール水溶液であることが好ましく、６０％エタノール水溶液であることがさらに好ましい。
【００２１】
本発明において、ハナズオウ抽出物は、前記したハナズオウのアルコール粗抽出物、好ましくはエタノール（ＥｔＯＨ）粗抽出物をヘキサン、エチルアセテート（ＥｔＯＡｃ）及びブタノール（ＢｕＯＨ）で抽出して各々の分画を収得した後、抗酸化活性を示すエチルアセテート画分及びブタノール画分からクロマトグラフィー過程を経て製造され、エチルアセテート画分及びブタノール画分から下記化学式１乃至化学式２０で表される化合物を含む抽出物が収得される（図４及び図５参照）。また、構造分析の結果、本発明で収得した化学式１５で表される化合物（シリンゲチン−３−Ｏ−（２”−Ｏ−ガロイル）−ルチノシド）は、現在まで報告されていない新規な化合物であることを確認した。
<化学式１>
<化学式２>
<化学式３>
<化学式４>
<化学式５>
<化学式６>
<化学式７>
<化学式８>
<化学式９>
<化学式１０>
<化学式１１>
<化学式１２>
<化学式１３>
<化学式１４>
<化学式１５>
<化学式１６>
<化学式１７>
<化学式１８>
<化学式１９>
<化学式２０>
【００２２】
前記化学式１乃至化学式２０で表される本発明の化合物の場合、ハナズオウ抽出物総重量に対して化学式６で表される化合物は、０．０１乃至１．００重量％、化学式１２で表される化合物は、０．０１乃至１．００重量％、化学式５で表される化合物は、０．０１乃至０．５重量％で含むことが好ましい。
【００２３】
前記化学式１乃至化学式２０で表される本発明の化合物は、ラジカル消去活性（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−Ｐｙｃｒｙｌ−Ｈｙｄｒａｚｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（表３参照）、脂質過酸化抑制活性（Ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（表４参照）、ヒドロキシルラジカル消去活性（Ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）とニトリックオキシド消去活性（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（表６参照）及びスーパーオキシドラジカル消去活性（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（表５参照）等の抗酸化活性を有する。
【００２４】
好気性生物体は、酸素を使用してエネルギー代謝を行っているが、生体内酸素が各種物理的、化学的及び生物学的なストレスを受けるとスーパーオキシド陰イオンラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）、過酸化水素及びヒドロキシラジカル（ｈｙｄｒｏｘｙ ｒａｄｉｃａｌ）等の有害な活性酸素種（ａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）に変化して人体に致命的な生理的障害を引き起こす。前記のような活性酸素種は、細胞生体膜の構成成分である不飽和脂肪酸を攻撃して過酸化反応を起こし、それにより生体内に蓄積された過酸化脂質は老化と各種疾病の原因になり得る。本発明では、前記の活性酸素種の消去機能及び脂質過酸化抑制能力を調査することにより、ハナズオウ抽出物の抗酸化活性を測定した。その結果、前記ハナズオウ抽出物は、既存の抗酸化物質として知られているビタミンＥ及び合成抗酸化剤の ＢＨＡ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ）と活性が同等またはより高く現れ、前記結果からハナズオウ抽出物は、抗酸化活性が優秀な抽出物であることを確認できた。
【００２５】
また、化学式１乃至化学式２０で表される本発明の化合物は、ｔ−ブチル過酸化物（ｔ−ＢｕＯＯＨ）で誘導される酸化的損傷に対する細胞保護活性（表７参照）、ＵＶ照射に対する細胞保護効果（図６ａ及び図６ｂ参照）、無毛マウスでのＵＶ照射に対する保護効果（図７参照）、ＵＶ照射による脂質過酸化の生成抑制活性（表８参照）、細胞寿命延長効果（図８参照）、テロメアの長さ延長効果（図９及び図１０参照）を示す。即ち、本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した活性成分は、抗酸化活性を示すだけではなく細胞老化抑制効果も優れていることがわかる。
【００２６】
また、本発明は、前記ハナズオウ抽出物またはそれから分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物から選択された化合物を有効成分として含む、抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用化粧料組成物を提供する。
【００２７】
本発明の化粧料組成物に含まれるハナズオウ抽出物から分離した活性成分は、化学式１（イソリキリチゲニン：イソリキリチゲニン）、化学式２（２’，４’−ジヒドロキシ−４−メトキシカルコン）、化学式３（リキリチゲニン）、化学式４（リスベラトロール）、化学式５（ピセアタンノール）、化学式６（没食子酸）、化学式７（没食子酸メチル）、化学式８（没食子酸エチル）、化学式９（ミリセチン）、化学式１０（アフゼリン（afzelin））、化学式１１（ケルシトリン）、化学式１２（ミリシトリン）、化学式１３（ミリセチン−３−Ｏ−（２”−Ｏ−ガロイル）−α−Ｌ−ラムノピラノシド）、化学式１４（シリンゲチン−３−Ｏ−ルチノシド）、化学式１５（シリンゲチン−３−Ｏ−２”−Ｏ−ガロイル）−ルチノシド）、化学式１６（（＋）−カテキン）、化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１９（（−）−リオニレシノール３ａ−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシド）及び化学式２０（（＋）−リオニレシノール３ａ−Ｏ−β−Ｄ−グリコピラノシド）で表される化合物からなる群から選択された化合物であることが好ましい。
【００２８】
本発明の化粧料組成物において、ハナズオウ抽出物またはそれから分離した活性成分は、過酸化沮害活性及びラジカル除去活性が優秀で高い抗酸化活性を有し、細胞保護効果、細胞寿命延長効果等が優れ、皮膚老化抑制、皮膚弾力保護またはシワ改善のための化粧品試料として使用できる。
【００２９】
本発明の化粧料組成物は、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、エッセンス、パックまたは風呂用パウダーの基礎化粧品試料または皮膚外用剤の形で使用できる。
【００３０】
化粧料組成物の製造時に油状成分の含量は油化能力補強及び経済性等を考慮して選択され、油状成分として主に使用されるオイルには、植物性オイル、鉱物性オイル、シリコン油及び合成油の中から選択された一つ以上を使用できる。それ以外に油化能力を補強するためには界面活性剤、高級アルコール等を０．１乃至５重量％添加できる。このような界面活性剤には、非イオン界面活性剤のような通常的な界面活性剤を使用でき、高級アルコールとしては炭素数が１２乃至２０のアルコールを単独または２種以上を混合して使用できる。
【００３１】
また、化粧料組成物の製造時に水状成分は、粘度または硬度を調節するためにカーボマー、キサンタンガム、ベントナイト等の１種以上の増粘剤を０．００１乃至５重量％さらに添加できる。
【００３２】
また、本発明の化粧料組成物には必要に応じて、高級脂肪酸、ビタミン等の薬効成分と紫外線遮断剤、酸化防止剤、防腐剤、香料、着色剤、ｐＨ調節剤等の通常的な化粧品に使用される成分をさらに添加できる。
【００３３】
本発明の好ましい態様では、本発明のハナズオウ抽出物を使用して柔軟化粧水、粘組成液、乳液、ローション及びクリームを製造した（表９乃至表１１参照）。
【００３４】
本発明のハナズオウ抽出物を含む化粧料組成物において、通常的に含有される化粧料組成物に本発明のハナズオウ抽出物が１乃至１５重量％、好ましくは２乃至１０重量％の量で添加する。
【００３５】
また、本発明は、前記ハナズオウ抽出物を有効成分として含む、抗酸化用及び老化抑制用薬学的組成物を提供する。
【００３６】
本発明のハナズオウ抽出物を有効成分として含む、抗酸化用及び老化抑制用薬学的組成物は、活性酸素による細胞構成成分の酸化により誘発される疾患の治療または予防に有用に使用できる。このような疾患としては例えば、癌、老化、冠状心臓疾患、高脂肪血症、動脈硬化、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、脳卒中、アルツハイマー病及び腸炎等があり、必ずしもこれに限定されない。
【００３７】
ハナズオウ抽出物を有効成分として含む薬学的組成物は、通常的に使用される賦形剤、崩解剤、甘味剤、滑沢剤、香味剤等をさらに含むことができ、通常的な方法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、その他液剤に剤形化できる。
【００３８】
詳細には、本発明のハナズオウ抽出物を有効成分として含む薬学的組成物は、経口投与用剤形、例えば錠剤、トローチ、ロゲンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、水溶性または油性懸濁液、調剤粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）に製剤化される。錠剤及びカプセル等の剤形に製剤するためにはラクトース、スクロース、サッカロース、ソルビトール、マニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンのような結合剤、ジカルシウムホスファートのような賦形剤、トウモロコシ澱粉またはサツマイモ澱粉のような崩解剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマール酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスのような潤滑油が含有される。カプセル剤形の場合は、前記で言及した物質以外にも脂肪油のような液体担体を含有する。
【００３９】
また、本発明のハナズオウ抽出物を有効成分として含む薬学的組成物は、非経口で投与でき、非経口投与は、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式による。非経口投与用剤形としては、製剤化するためには本発明のハナズオウ抽出物を安定剤または緩衝剤と共に水に混合して溶液または懸濁液に製造してそれをアンプルまたはバイアルの単位投与形に製剤する。
【００４０】
本発明の有効成分の投与量は、体内で活性成分の吸収度、不活性化率及び排泄速度、患者の年齢、性別及び状態、治療する疾病の重症程度により適切に選択され、経口投与剤の場合一般的に成人に１日に体重１ｋｇ当り本発明のハナズオウ抽出物を２〜２００ｍｇの量で１回乃至数回に分けて投与でき、１０〜１００ｍｇの量で投与することが好ましい。
【００４１】
また、本発明は、前記ハナズオウ抽出物の製造方法を提供する。
【００４２】
本発明のハナズオウ抽出物の調製方法は、
１）ハナズオウの微粉砕粉末をアルコールで粗抽出する工程；
２）前記工程１のアルコール粗抽出物をヘキサン、エチルアセテート、ブタノールの順に抽出する工程；
３）前記工程２のエチルアセテート画分またはブタノール画分を収得してメタノール：水の濃度勾配カラムクロマトグラフィーを実施する工程；及び
４）前記工程３の抗酸化活性画分を収得してカラムクロマトグラフィー、ＴＬＣまたはＨＰＬＣを実施して最終抗酸化抽出物を得る工程からなる。
【００４３】
工程１において、アルコールはメタノール、エタノール、プロパノールまたはブタノールであることが好ましく、その中でもエタノールが好ましい。前記でエタノールは６０％エタノールが最も好ましい。本発明の好ましい実施例では、０％乃至１００％の濃度のハナズオウエタノール粗抽出物を使用してＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した結果、６０％エタノール粗抽出物の活性が最も高かった（図２参照）。
【００４４】
実施例
本発明の実践的かつ現在好ましい態様を、以下の実施例により詳細に説明する。
【００４５】
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例の内容によって限定されるものではない。
【００４６】
実施例１：ハナズオウからの有効成分抽出
＜１−１＞第１次抗酸化活性画分分離
ハナズオウから抗酸化活性を示す有効成分を抽出するために図１の模式図に示した順序で実験を進行した。詳細には、陰乾したハナズオウの葉と茎１ｋｇを磨砕器でおろして粉末にし、エタノールで室温で２週間ずつ２回抽出した。ここで、エタノールの濃度を０％から順次的に１０％ずつ増やして最終１００％エタノールを調製した後、それを使用して抽出した。エタノールの濃度による抽出物の抗酸化活性を確認するためにＤＰＰＨ（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−Ｐｙｃｒｙｌ−Ｈｙｄｒａｚｙｌ）方法を遂行して抗酸化活性を測定した（Ｔａｃｏ，Ｔ．等，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９４年，第５８巻，１７８０−１７８３頁；Ｎａ，Ｍ．Ｋ．等，Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｓｃｉ．，２００２年，第８巻，２６−２９頁）。ＤＰＰＨは、比較的安定な自由ラジカルで、ラジカル状態で存在時に５１７ｎｍで最大吸光度を示し、消去されると吸光性を失うためこのような原理を使用して抗酸化活性を測定する方法である。詳細には、ハナズオウの濃度別エタノール抽出物を取って、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を使用して３．１２５、６．２５、１２．２５、２５及び５０μｇ／ｍｌに希釈した後、９６ウェルプレートに前記溶液１０μｌずつを各々入れ２×１０−４Ｍ／ｍｌエタノール濃度のＤＰＰＨ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）溶液１９０μｌを入れ室温で３０分間放置した後、５１７ｎｍでＯＤ５１７を測定した。対照群には、試料の代わりにＤＭＳＯを加え試料の吸光度減少程度を調査した。ＤＰＰＨラジカル消去活性を下記の数式１により計算して、ＤＰＰＨラジカルを５０％消去させる試料の濃度をＩＣ５０と定めた。
【００４７】
＜数式１＞
ＤＰＰＨラジカル消去活性（％）＝（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｓａｍｐｌｅ）／Ａｃｏｎｔｒｏｌ×１００
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：試料を添加していない対照群の吸光度
Ａｓａｍｐｌｅ：試料を添加した反応群の吸光度
【００４８】
その結果、抽出時に使用したエタノールの濃度が増加するにつれＤＰＰＨラジカル消去活性は増加した。０％、１０％、２０％及び９０％エタノール抽出物は、ラジカル消去活性が低い反面、程度の差があるが３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％及び１００％エタノール抽出物の場合、大体的にラジカル消去活性が高かった。特に、６０％エタノール抽出物の場合、抽出物の濃度増加によるラジカル消去活性が最も高く、ＩＣ５０値が２６．６で最も低く、エタノール抽出物中で最も高い抗酸化活性を示す抽出物であることが分かった（表１及び図２）。
【００４９】
（表１）
【００５０】
前記で６０％エタノール抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性が最も高いことを確認した後、それから溶媒別抽出物を収得した。詳細には、６０％エタノール抽出物を蒸溜水で懸濁させた後、ヘキサンで３回抽出して減圧濃縮してヘキサン分画（Ｆｒａｃｔｉｏｎ，以下「Ｆｒ」と略称する）１１ｇを得た。残った懸濁液をエチルアセテートで３回抽出して減圧濃縮してエチルアセテート画分（以下「ＥｔＯＡｃ Ｆｒ」と略称する）２５ｇを得た。残った懸濁液を再び水泡化させたブタノール（ｂｕｔａｎｏｌ，ＢｕＯＨ）で３回抽出して減圧濃縮してブタノール画分（以下「ＢｕＯＨ Ｆｒ」と略称する）１９ｇを得た。そして、残った分画２０ｇは、水分画と見なした（図１）。
【００５１】
前記で溶媒抽出したヘキサンＦｒ、ＥｔＯＡｃ Ｆｒ及びＢｕＯＨ Ｆｒから抗酸化活性がある分画をさがすために、前記と同様な方法で各分画別抽出物を使用してＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。ここで、ＤＰＰＨラジカル消去活性が高いと知られているビタミンＥを比較群に使用した。
【００５２】
その結果、ＥｔＯＡｃ ＦｒとＢｕＯＨ Ｆｒの場合、ＩＣ５０値が各々２４．０と２７．０μｇ／ｍｌと現れ比較群に使用したビタミンＥ（ＩＣ５０ ２４．９μｇ／ｍｌ）と類似な程度の強い活性を示したが、他の分画物は活性が微弱だった（図３）。
【００５３】
＜１−２＞第２次抗酸化活性画分の分離
前記実施例＜１−１＞の結果にしたがい活性が強いＥｔＯＡｃ Ｆｒ及びＢｕＯＨ Ｆｒに対して下記のカラムクロマトグラフィーを実施して、その結果収得された各々の分画に対して再び抗酸化活性実験を行なって高い活性を示す分画だけを選択した。
【００５４】
まず、ＥｔＯＡｃ Ｆｒ（２５ｇ）に対してメタノール：水（１：４→１：０）を移動相にＹＭＣカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：５×３０ｃｍ）を実施して１１個の小分画（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．１１）を得た。前記１１個の小分画中のＦｒ．１（３．６ ｇ）を再びＹＭＣカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：３×３０ｃｍ）を行なって５個の小分画（Ｆｒ．１−１〜Ｆｒ．１−５）を得た。その中のＦｒ．１−１（４５０ｍｇ）にＨＰＬＣ［カラム：μＢｏｎｄａｐａｋＴＭＣ１８（３．９×３００ｍｍ，水）、移動相：ＡＣＮ：０．１％ＴＣＡ（１６：１８）、流速：１ｍｌ／分、ＵＶ：２８０ｎｍ］を実施して滞留時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，以下「ｔＲ」と略称する）が各々１１．１分と６．２分の化合物１８ｍｇ及び２１ｍｇの化合物を得て、各々を「ＣＣＥＡ１１１」及び「ＣＣＥＡ１１２」と命名した。
【００５５】
次に、Ｆｒ．１−２（５００ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａカラム（２０×２５０ｍｍ）、移動相：メタノール：水（３：７）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施してｔＲが１６分の化合物７７ｍｇ及びｔＲが２４分の化合物１９ｍｇを得て、各々を「ＣＣＥＡ１２１１」及び「ＣＣＥＡ１２１２」と命名した。
【００５６】
次に、Ｆｒ．３（４．８ｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａカラム（２０×２５０ｍｍ）、移動相：ＡＣＮ：０．１％ＴＣＡ（２５：７５）、流速：６ｍｌ／分、ｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＵＶ（２８０ｎｍ）］を実施してｔＲが２４．５分の化合物１９ｍｇを得て、「ＣＣＥＡ３３」と命名した。
【００５７】
次に、Ｆｒ．４（４．０ｇ）は、移動相クロロホルム：メタノール（８５：１５）でシリカゲルカラムクロマトグラフィー（４×２５ｃｍ、２３０−４００メッシュ）を実施して、再び６個の小分画（Ｆｒ．４−１〜Ｆｒ．４−６）に分けた。その中のＦｒ．４−１（３２０ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（３５：６５）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが２５分の化合物３０ｍｇを得て、それを「ＣＣＥＡ４１３」と命名して、Ｆｒ．４−４（１ｇ）もまた分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（１：１）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが１５分の化合物５７ｍｇを得て、「ＣＣＥＡ４４２」と命名した。
【００５８】
次に、Ｆｒ．６（２．２ｇ）は、移動相クロロホルム：メタノール（１０：１）でシリカゲルクロマトグラフィー（３×３０ｃｍ、２３０−４００メッシュ）を実施して、３個の小分画（Ｆｒ．６−１〜Ｆｒ．６−３）に分けた。その中のＦｒ．６−２（２００ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（１：１）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施してｔＲが２０分の化合物２５ｍｇを得て、それを「ＣＣＥＡ６２２」と命名した。
【００５９】
次に、Ｆｒ．８（２．１ｇ）に対して移動相溶媒にクロロホルム：メタノール（１０：１）を使用したシリカゲルクロマトグラフィーを実施して化合物２０ｍｇを得て、それを「ＣＣＥＡ８２」と命名した。前記ＣＣＥＡ８２を分離して残った分画物をメタノールに溶解して再結晶させて収得した化合物１０ｍｇを「ＣＣＥＡ８３」と命名した。
【００６０】
次に、Ｆｒ．９（２．８ｇ）に対して移動相クロロホルム：メタノール（１５：１）でシリカゲルクロマトグラフィーを実施して２個の小分画（Ｆｒ．９−１〜Ｆｒ．９−２）に分けた。その中のＦｒ．９−１（２２０ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（４：１）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが２５分の化合物３２ｍｇを得てそれを「ＣＣＥＡ９１３」と命名した（図４）。
【００６１】
ＢｕＯＨ Ｆｒ（１９ｇ）に対しても、メタノール：水（０：１→１：０）を移動相にしてＹＭＣゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：５×３０ｃｍ）を実施して８個の小分画（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．８）を得た。
【００６２】
Ｆｒ．２（３．８ｇ）を移動相クロロホルム：メタノール：水（７０：３０：５）でシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３×３０ｃｍ、２３０−４００メッシュ）を実施して再び５個の小分画（Ｆｒ．２−１〜Ｆｒ．２−５）に分けた。その中のＦｒ．２−３（４２０ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：アセトニトリル：水（１８：８２）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施してＦｒ．２−３−１及び２−３−２を得た。その中のＦｒ．２−３−１に対して再び分取用ＨＰＬＣ［移動相：アセトニトリル：水（１０：９０）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが１５分の化合物３２ｍｇを得てそれを「ＣＣＢｔ２３１」と命名した。
【００６３】
次に、Ｆｒ．５（３ｇ）を移動相クロロホルム：メタノール：水（７０：３０：５）でシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３×３０ｃｍ、２３０−４００メッシュ）を実施して、再び４個の小分画（Ｆｒ．５−１〜Ｆｒ．５−４）に分けた。その中のＦｒ．５−２（３００ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（３５：６５）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが２５分の化合物２０ｍｇ及びｔＲが３０分の化合物１３ｍｇを得て、それを各々「ＣＣＢｔ５２１」及び「ＣＣＢｔ５２２」と命名した。また、Ｆｒ．５−３（６００ｍｇ）に対して３０％メタノールを移動相に使用してＹＭＣゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：３×３０ｃｍ）を実施して、再び４個の小分画（Ｆｒ．５−３−１〜Ｆｒ．５−３−４）に分離した。その中のＦｒ．５−３−３から沈澱して生じた物質を精製して化合物２９ｍｇを得、それを「ＣＣＢｔ５３３」と命名した。
【００６４】
次に、Ｆｒ．６（３．２ｇ）を再びＹＭＣカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：３×３０ｃｍ）を実施して４個の小分画（Ｆｒ．６−１〜Ｆｒ．６−４）を得た。その中のＦｒ．６−２（３７０ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（３：７）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが２６分の化合物９ｍｇ及びｔＲが２８分の化合物１６ｍｇを得て、それを各々「ＣＣＢｔ６２２」及び「ＣＣＢｔ６２３」と命名した。また、Ｆｒ．６−４（２００ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ（移動相：メタノール：水（４：６）、流速：６ｍｌ／分）を実施して、ｔＲが１８分の化合物５ｍｇを得てそれを「ＣＣＢｔ６４１」と命名した。
【００６５】
次に、Ｆｒ．７（１．９ｇ）を移動相クロロホルム：メタノールでシリカゲルクロマトグラフィー（カラムサイズ：３×３０ｃｍ）を実施して４個の小分画（Ｆｒ．７−１〜Ｆｒ．７−４）を得た。Ｆｒ．７−２（５０ｍｇ）を再び移動相８０％メタノールでセパデクスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：３×３０ｃｍ）を実施して５個の小分画（Ｆｒ．７−２−１〜Ｆｒ．７−２−５）に分けた。その中のＦｒ．７−２−２をメタノールで再結晶させて化合物９ｍｇを得て、それを「ＣＣＢｔ７２２」と命名した。また、沈澱で析出したＦｒ．７−２−４を精製して化合物１０ｍｇを得て、それを「ＣＣＢｔ７２４」と命名した（図５）。
【００６６】
＜１−３＞分離した化合物の構造分析
前記実施例＜１−２＞で分離した２１種の分画物の構造を分析した。詳細には、分離した化合物の融点は、電気的温度融点分析機（ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ ａｐｐａｒａｔｕｓ）（Ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ Ｅｎｇ．Ｌｔｄ．，ＡＺ ９００３）を使用して、旋光度は、ＤＩＰ−３７０デジタル旋光計（ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ）（ＪＡＳＣＯ）を使用して、ＩＲスペクトルは、ＩＲレポート１００分光光度計（ＪＡＳＣＯ）を使用して、質量分析は、タンデム質量分析計（Ｊｅｏｌ，ＪＭＳ ＨＸ−１１０／１１０Ａ）を使用し、ＮＭＲ分析は、ＮＭＲ分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ，ＮＭＲ ＡＭＸ−６００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して、ガスクロマトグラフィーは、ＳＴＡＲ ３４００ＣＸ ＧＣ（Ｖａｒｉａｎ）を使用して製造社の指針にしたがって分析した。分析した融点、旋光度、ＩＲスペクトル、質量、ＮＭＲ分析結果を使用して各化合物の構造を決定した。
【００６７】
その結果、構造分析した化合物は、下記の表２に示したようにカルコン系、スチルベン系、フェノール系、フラボノール系、フラバノール系及びリグナン系で表される群れで特定づけられた。各々は、化学式１乃至化学式２０で表される化合物であることが分かった。また、分析した化合物中に化学式１５で表される化合物（シリンゲチン−３−Ｏ−（２”−Ｏ−ガロイル）−ルチノシド）は、下記のような特性を有しその内容から前記化合物は新規な化合物であることが分かった。
【００６８】
＜化学式１５の特性＞
薄い黄色パウダー、
ＦｅＣｌ３、Ｍｇ−ＨＣｌ、Ｚｎ−ＨＣｌテスト：陽性
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ８２３［Ｍ＋Ｈ］＋
［α］Ｄ−８０（ｃ ０．１，ＭｅＯＨ）
ＩＲ νｍａｘ ｃｍ−１：３４００（−ＯＨ）、１６５０（Ｃ＝Ｏ）、１６１０，１５００，１４５５（ａｒｏｍａｔｉｃ Ｃ＝Ｃ）、１２００，１０２０（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ Ｃ−Ｏ）
ＵＶ λｍａｘ ｎｍ（ｌｏｇ ε）：２５７（３．６０），３６０（３．８２）
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：７．４６（２Ｈ，ｓ，Ｈ−２，６），６．９１（２Ｈ，ｓ，ガロイル−２，６），６．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−８），６．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−６），５．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ｇｌｃ−１），４．４９（１Ｈ，ｓ，ｒｈａｍ−１），３．８４（６Ｈ，ｓ，ＯＭｅ−３，５），３．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，ｇｌｃ−６），３．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，ｇｌｃ−６），１．００（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，ｒｈａｍ−６）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１５６．３（Ｃ−２），１３３．１ （Ｃ−３），１７７．３（Ｃ−４），１６１．１（Ｃ−５），９８．６（Ｃ−６），１６４．０（Ｃ−７），９３．９（Ｃ−８），１５６．４（Ｃ−９），１０４．０（Ｃ−１０），１１９．７（Ｃ−１），１０６．９（Ｃ−２，６），１４７．４（Ｃ−３，５），１３８．６（Ｃ−４），１００．８（ｇｌｃ−１），７６．４（ｇｌｃ−２），７４．９ （ｇｌｃ−３），７０．１（ｇｌｃ−４），７４．３（ｇｌｃ−５），６６．７（ｇｌｃ−６），１０１．０（ｒｈａ−１），７０．２（ｒｈａ−２），７０．５（ｒｈａ−３），７１．７（ｒｈａ−４），６８．３（ｒｈａ−５），１７．６（ｒｈａ−６），１６５．３（Ｃ＝Ｏ），１２０．４（ガロイル−１），１０８．７（ガロイル−２，６），１４５．３（ガロイル−３，５），１３７．９（ガロイル−４）。
【００６９】
（表２）
【００７０】
実施例２：ＤＰＰＨラジカル消去活性（ＤＰＰＨ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の測定
本発明者らは、前記実施例１で分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物を含む抽出物の抗酸化活性を測定するために前記実施例１と同一な方法でＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。ここで、合成抗酸化剤のＢＨＡ（タート−ブチル−４−ヒドロキシアニソール）及びα−トコフェロールを陽性対照群に使用した。
【００７１】
その結果、フェノール酸及びフラボノイド化合物等が濃度依存的に強いラジカル消去活性を示した。スチルベン化合物も比較的強いラジカル消去活性を示した。特に、没食子酸を始めとするガロイルエステルが強い活性を示した。詳細には化学式６（没食子酸）、化学式７（没食子酸メチル）、化学式８（没食子酸エチル）、化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）及び化学式１３（ミリセチン−３−Ｏ−（２−Ｏ−ガロイル）−ａ−Ｌ−ラムノピラノシド）のＩＣ５０値は、各々５．１±０．４、５．３±０．３、７．０±１．１、６．８±０．５、６．７±０．４及び８．６±０．７ｇ／ｍｌで前記化合物間に顕著な活性の差は無かったが、これらの化合物すべてが陽性対照群に使用したα−トコフェロール（ＩＣ５０ ２５．４±０．９ｇ／ｍｌ）及びＢＨＡ（ＩＣ５０ １５．３±０．６ｇ／ｍｌ）より顕著に強いラジカル消去活性を示した（表３）。
【００７２】
ベンゼン環のｏｒｔｈｏ−位置に電子供与グループ（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）が置換されているとフェノキシラジカルを容易に安定化させられるため、ラジカル消去活性が増加するものと知られている（Ｃｕｖｅｌｉｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈ．，Ｂｅｒｓｅｔ，Ｃ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２年，第５６巻，３２４−３２５頁；Ｋｉｋｕｚａｋｉ，Ｈ．，等，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２００２年，第５０巻，２１６１−２１６８頁）。ガロイルグループの場合３個のヒドロキシルグループが鄰接した位置に置換されていて効果的にフェノキシラジカルを安定化させられるため強力なラジカル消去活性を示すものと思料される。表３に示したようにガロイルエステル以外にも化学式１６（（＋）−カテキン）、化学式９（ミリセチン）、化学式１０（アフゼリン）、化学式１１（ケルシトリン）、化学式１２（ミリシトリン）等のフラボノイド系化合物も強いラジカル消去活性を示した。これは、フラボノイド構造中に生成されたフェノキシラジカルを効果的に安定化させられるフェノリック置換基が存在するためと考えられる。即ち、電子供与能力が大きい置換基を有する化合物であるほどラジカル消去活性が増加する結果を示す。これは、ペッカリネン（Ｐｅｋｋａｒｉｎｅｎ）等の報告と一致した（Ｐｅｋｋａｒｉｎｅｎ，Ｓ．Ｓ．，等，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９９９年，第４７巻，３０３６−３０４３頁）。
【００７３】
（表３）
【００７４】
実施例３：脂質過酸化抑制活性（Ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ）測定
本発明者らは、前記実施例１で分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物の抗酸化活性を測定するために脂質過酸化抑制活性を測定した。脂質の酸化は、脂質過酸化物（ｌｉｐｉｄ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ）、コンジュゲートされた脂肪酸（ＨＯＤＥｓ）、エポキシ脂肪酸、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、４−ヒドロキシノネナル（４−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ，４−ＨＮＥ）等の酸化物を生成させ細胞を構成する生体膜を直接損傷させたり他の細胞構成成分と２次的な反応を起こしたりして、様々な退行性疾患及び老化過程の重要な原因として知られている（Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｈ．等，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９１年，第１１巻、８１−１２８頁；Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｈ．，Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９０年，第１８６巻，４０７−４２１頁；Ｊｉｒａ，Ｗ．，等，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，１９９６年，第８４巻，１６５−１７３頁；Ｊｉｒａ，Ｗ．等，Ｂｉｏｓｃｉ，１９９８年，第５３巻，１０６１−１０７１頁）。一般的に、ミトコンドリアやミクロゾーム等の細胞内電子伝達系で生成されたスーパーオキシドラジカルは、体内酵素反応を通じてＨ２Ｏ２に転換され、それが再びカタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼのような酵素により毒性がない物に変換される。しかし、色々な要因により体内活性酸素が多く生成されるとＨ２Ｏ２はフェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）反応（Ｆｅ２＋＋Ｈ２Ｏ２→Ｆｅ３＋＋ＨＯ・＋ＨＯ−）やメタルカタライズされたハーバーウエイス反応（ｍｅｔａｌ−ｃａｔａｌｙｓｅｄ Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｏ２−＋Ｈ２Ｏ２→Ｏ２＋ＨＯ・＋ＨＯ−）を通じて反応性が大きいヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）を発生させ脂質過酸化物を生成させ、これが再び体内 金属イオンと反応して脂質ラジカル（Ｌ・）や脂質ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）を誘導して脂質過酸化連鎖反応を起こすものと良く知られている（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂ．，Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｍ．Ｃ．，Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９９年；Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂ．，Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｍ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９９年，第２１９巻，１−１４頁；Ｈａｒｍａｎ，Ｄ．，Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ．Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６年，３−４９頁；Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｒ．Ｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００年，第８９９巻，１９１−２０８頁）。それで、電子供与能力を有する化合物は、結果的に脂質の過酸化を抑制できるものと受け入れられている。
【００７５】
脂質過酸化抑制活性を測定することは、Ｆｅ２＋／アスコルビン酸反応系により最終生成されたヒドロキシルラジカル（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ）が脂質を酸化させて生成するマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）をチオバルビツール酸（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ，以下「ＴＢＡ」と略称する）と反応させ分光学的方法で定量することである。詳細には、化学式１乃至化学式２０で表される化合物試料各々１０μｌと１０ｍｇタンパク質／ｍｌ濃度のネズミの脳均質化物（Ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）５０μｌ及び５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４）７４０μｌを混合した後、０．１ｍＭ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２と１ｍＭアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）混合液２００μｌを入れて３７℃で３０分間反応させた。前記反応液に２０％トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，以下「ＴＣＡ」と略称する）（Ｓｉｇｍａ）２５０μｌを加えて反応を停止させた後、１％ＴＢＡ（Ｓｉｇｍａ）２５０μｌを加えて１００℃で１０分間反応させた。前記反応液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、５３２ｎｍで吸光度を測定した。各試料の脂質過酸化抑制活性は、下記の数式２により算出した。脂質過酸化反応を５０％抑制する濃度をＩＣ５０とした。比較群には、α−トコフェロール及びＢＨＡを使用し、対照群には試料及び溶液を何も添加していないものを使用した。
【００７６】
＜数式２＞
脂質過酸化抑制活性（％）＝（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｓａｍｐｌｅ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）×１００
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：試料を添加していない対照群の吸光度
Ａｓａｍｐｌｅ：試料を添加した反応群の吸光度
Ａｂｌａｎｋ：試料、ＴＣＡ及びＴＢＡ溶液を添加していない吸光度
【００７７】
その結果、フラボノイド系、スチルベン系及びフェノール酸系化合物が濃度依存的に強い脂質過酸化抑制活性を示した。特に、スチルベン系の化学式５（ピセアタンノール）は、ＩＣ５０値が０．０９±０．０１ｇ／ｍｌで強力な脂質過酸化抑制剤として知られているＢＨＡ（ＩＣ５０ ０．１１±０．０２ｇ／ｍｌ）と同じ程度の強い活性を示した。また、活性を検索した大部分のフラボノイド系化合物が強い脂質過酸化抑制活性を示した。詳細には、化学式９（ミリセチン）、化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１１（ケルシトリン）、化学式１２（ミリシトリン）及び化学式１３（ミリセチン−３−Ｏ−（２−Ｏ−ガロイル）−ａ−Ｌ−ラムノピラノシド）のＩＣ５０値が各々０．９５±０．０６、２．９±０．０６、１．０±０．０８、６．２１±０．４０、５．２７±０．３２及び４．７３±０．４１ｇ／ｍｌと現れ、陽性対照群に使用したα−トコフェロールより顕著に強い脂質過酸化抑制活性を示した（表４）。脂質過酸化抑制活性の場合も前記実施例２で実施したＤＰＰＨラジカル消去活性結果と同じく、ベンゼン環に電子供与グループが多く置換されているほどフェノキシラジカルを容易に安定化させるので活性が増加すると思料された。特に、フラボノイド系化合物の構造は、効果的にフェノキシラジカルを安定化させるだけではなく金属イオンをキレート化させられるため強力な脂質過酸化抑制活性を示すものと思料される。
【００７８】
（表４）
【００７９】
実施例４：ヒドロキシルラジカル消去活性（Ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）及びニトリックオキシド（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）消去活性測定
ヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）は、体内金属イオンまたはスーパーオキシドラジカルと反応して生成される。反応性がとても高く直接的に体内タンパク質、脂質及びＤＮＡの酸化的損傷を起こすものと知られている。ニトリックオキシド（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ，ＮＯ・）もまたスーパーオキシドラジカルと反応して反応性が強いフェノキシニトラート（ＯＮＯＯ−）を生成することによりヒドロキシルラジカルと似た作用を示すものと知られている（Ｙａｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２０００，２９：１１４３−１１５０）。それで、本発明者らは、前記実施例１で分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物の抗酸化活性を測定するためにハリウェルの方法（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂ．等，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７，１６５，２１５−２１９）にしたがってヒドロキシルラジカル除去活性を測定した。詳細には、化合物をＤＭＳＯに溶解した試料１０μｌ、リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）、デオキシリボース（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）５．６ｍＭ、ＦｅＣｌ３ ０．１ｍＭ、Ｈ２Ｏ２ １ｍＭ及びアスコルビン酸０．１ｍＭを混合して１ｍｌになるようにして３７℃で６０分間反応させた。前記反応液に２０％ＴＣＡ２５０μｌ及び１％ＴＢＡ溶液（５０ｍＭ ＮａＯＨに溶解）２５０μｌを添加して９５℃で５分間熱反応させた。前記反応後、５３２ｎｍで吸光度を測定した。ヒドロキシルラジカル消去活性は、下記の数式３によって計算した。陽性対照群にはＢＨＡ及びα−トコフェロールを使用した。
【００８０】
＜数式３＞
ヒドロキシルラジカル消去活性（％）＝（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｓａｍｐｌｅ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）×１００
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：対照群ウェルの吸光度
Ａｓａｍｐｌｅ：試料を添加した反応群ウェルの吸光度
Ａｂｌａｎｋ：試料、ＴＣＡ及びＴＢＡ溶液を添加していないウェルの吸光度
【００８１】
ヒドロキシルラジカル消去活性を検索した結果、フラボノイド系、スチルベン系及びフェノール酸系化合物は、対照群と比較して１２．７乃至５４．０％程度の消去活性を示した。特に、化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式７（没食子酸メチル）、化学式８（没食子酸エチル）及び化学式１３（ミリセチン−３−Ｏ−（２−Ｏ−ガロイル）−ａ−Ｌ−ラムノピラノシド）等ガロイルグループが置換された化合物が強いヒドロキシルラジカル消去活性を示した（表５）。
【００８２】
また、ニトリックオキシド消去活性を検索した結果、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１６（（＋）−カテキン）、化学式９（ミリセチン）等が比較的強い活性を示した（表５）。
【００８３】
（表５）
【００８４】
実施例５：スーパーオキシドラジカル消去活性（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）測定
スーパーオキシドラジカル（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ，Ｏ２−）自体は、反応性が比較的弱いが、簡単にＨ２Ｏ２に変換され結局、反応性が強いヒドロキシルラジカルを生成したり、ニトリックオキシド（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ，ＮＯ・）と反応したりして反応性が強いフェロキシニトラート（ｐｅｒｏｘｙ ｎｉｔｒｉｔｅ，ＯＮＯＯ−）を生成してＳＨ−グループの酸化、タンパク質チロシンの硝酸化（ｎｉｔｒａｔｉｏｎ）、脂質過酸化、ＤＮＡ損傷等を起こす原因になる。それで、前記実施例１で分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物の抗酸化活性を確認するために他の有害活性酸素類の前駆物質に作用するスーパーオキシドラジカル（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ，Ｏ２−）の消去活性を測定した。スーパーオキシドラジカル消去活性は、スーパーオキシドを不均化（ｄｉｓｍｕｔａｔｉｏｎ）させることによりスーパーオキシドを消去する酵素のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の活性を測定して検索できる。本発明では、キサンチン／キサンチン酸化酵素（ｘａｎｔｈｉｎｅ／ｘａｎｔｈｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ）の酵素反応によるスーパーオキシド発生系及びニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，以下「ＮＢＴ」と略称する）が還元されホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）が生成される反応（ＮＢＴ＋２Ｏ２−→ＮＢＴＨ２＋２Ｏ２）に対する試料の抑制程度を測定した。詳細には、９６ウェルプレートに４ｍＭキサンチン（ｘａｎｔｈｉｎｅ，Ｓｉｇｍａ）５０μｌ、２５０ｍＭ ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）５０μｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）５０μｌ及び試料１０μｌを入れた後、キサンチン酸化酵素（Ｓｉｇｍａ）４０μｌを入れて反応させた。前記反応後、時間別に各反応液を集めてＥＬＩＳＡ測定機で５５０ｎｍで吸光度を測定した。各試料のスーパーオキシドラジカル消去活性は、下記の数式４に示したように対照群に対するＮＢＴの還元減少程度として算出した。スーパーオキシドラジカルを５０％消去させる試料の濃度をＩＣ５０とした。陽性対照群には、α−トコフェロール及びカフェー酸（ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）を使用して抗酸化効果を比較した。
【００８５】
＜数式４＞
スーパーオキシドラジカル消去活性（％）＝（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｓａｍｐｌｅ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）×１００
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：試料を添加していない対照群ウェルの吸光度
Ａｓａｍｐｌｅ：試料を添加した反応群ウェルの吸光度
Ａｂｌａｎｋ：試料、ＴＣＡおよびＴＢＡを添加していないウェルの吸光度
【００８６】
その結果、フラボノイド系、スチルベン系及びフェノール酸系化合物が濃度依存的に強いスーパーオキシドラジカル消去活性を示した。特に、フラバン−３−オル（ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ）の化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）及び化学式１５（ミリセチン−３−Ｏ−（２−Ｏ−ガロイル）−ａ−Ｌ−ラムノピラノシド）のＩＣ５０値は、各々１１．９±２．１、２４．０±３．５及び１３．２±２．５ｇ／ｍｌで、強力なスーパーオキシドラジカル消去剤として知られているカフェー酸（ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＩＣ５０ １１．０±１．８ｇ／ｍｌ）と同等の強い活性を示した。また、フラボノイド系及びフェノール酸系化合物が強いスーパーオキシドラジカル消去活性を示した。化学式９（ミリセチン）、化学式１６（（＋）−カテキン）、化学式７（没食子酸メチル）及び化学式８（没食子酸エチル）のＩＣ５０値は、各々１２．１±１．１、１６．５±２．０、１６．５±１．４及び１５．８±１．６ｇ／ｍｌ程度の強い活性を示した。しかし、カルコン系化合物の場合は、比較的活性が弱く現れた。スーパーオキシドラジカル消去活性の場合も、スーパーオキシドと反応して生成されたフェノキシラジカルを容易に安定化させられる構造を有する化合物が良い活性を示した。特に、ガロイルグループが置換された化合物が強い活性を示すことが確認された（表６）。
【００８７】
（表６）
【００８８】
実施例６：ｔ−ブチル過酸化物で誘導される酸化的損傷に対する細胞保護活性
ｔ−ブチル過酸化物は、細胞に入って自由ラジカル中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）で代謝され脂質過酸化を誘発させ、結局細胞損傷を起こすものと知られている。このような現象は、細胞と組織で起きる酸化的ストレスと類似していて、実質的な意味で酸化的ストレスによる老化抑制を評価できる有用な方法である。新生児表皮細胞のＨＥＫ−Ｎ／Ｆ細胞にｔ−ブチル過酸化物１．５ｍＭを３時間処理した結果、細胞の生存率が１１．２±１．２％程度に顕著に減少した反面、分離された化合物を５０．０ｇ／ｍｌの濃度で共に処理した時には、顕著な細胞保護活性を示した。特に、化学式５（ピセアタンノール）を併用処理した時、細胞生存率が８４．７±６．９％で最も強い活性を示した。化学式９（ミリセチン）、化学式１１（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）等のフラボン３−オル化合物も各々６１．０±４．５％と４８．１±５．７％の細胞生存率を示した。また、化学式６（没食子酸）、化学式７（没食子酸メチル）、化学式８（没食子酸エチル）等も各々４１．５±３．１％、４３．０±５．６％、４３．１±４．１％程度の細胞保護活性を示した。前記結果を通じて本発明のハナズオウ抽出物から収得した化合物は、細胞の酸化的ストレスを効果的に抑制して過酸化による細胞死滅を抑制することにより、酸化的ストレスによる老化を抑制できることを確認した。
【００８９】
（表７）
【００９０】
実施例７：ＵＶ照射で誘導される酸化的ストレスに対する保護活性
＜７−１＞ＵＶ照射に対する細胞保護効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ＵＶ照射は、細胞内活性酸素を顕著に増加させＤＮＡ損傷、ＤＮＡ−タンパク質連結等を誘発する。ＨＥＫ−Ｎ／Ｆ細胞に３５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射すると、核のＤＮＡ 鎖が切れる。これをＤＮＡ鎖インターキレーティング（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）蛍光染料のエチジウムホモダイマー（Ｅｔ２）と結合させた後、蛍光の強さを測定することにより定量した。詳細には、ＨＥＫ−Ｎ／Ｆ細胞を無血清ＫＧＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）に入れ培養した後、２４−ウェルプレートに０．５乃至４×１０４細胞数／２ｃｍ２になるように接種した。細胞を１８時間培養した後、２時間試料を処理した。ＰＢＳで洗浄した後、ＵＶ検出器（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ＵＶ ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ ＥＢＦ−２６０，ｔｈｅ ｍａｘｉｍａｌ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ，３１２ｎｍ；ａ ｈａｌｆ−ｐｅａｋ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｒａｎｇｅ，２９７−３２８ｎｍ）を使用して細胞にＵＶを照射した。ＵＶ照射した細胞を１−７時間培養して５Ｍエチジウムホモダイマー（Ｅｔ２，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を投与した。３０分後、ミリポレマイクロプレートフルオロメーターサイトフルオア２３５０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ２３５０，ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４８５ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６４５ｎｍ）を使用して蛍光を測定した。
【００９１】
その結果、図６ａ及び図６ｂに示したように、ハナズオウ抽出物、化学式９（ミリセチン）及び化学式５（ピセアタンノール）を処理した時には、対照群の蛍光より各々５４．７％及び６６．７％程度低い蛍光を示した。即ち、ハナズオウ抽出物及びそれから分離した活性成分は、ＵＶによる酸化的ストレスを抑制してＤＮＡ損傷を顕著に減少させた。
【００９２】
＜７−２＞ＵＶ照射に対する皮膚組織保護効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
５−６週齢のメス無毛ネズミ（ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍｏｕｓｅ，ＳＫＨ−ｈｒ−１）を温度２４±２℃、相対湿度５０±１０％、昼夜１２時間のサイクルで１４日程度適応させた後、実験に使用した。実験の３０−６０分前に試料を無毛ネズミの５地点に皮下注射した後、ネズミの背にＵＶＢを照射した。次に２０×１５×５ｃｍケージにグループ当り５匹のネズミを入れて１５ｃｍの距離からＵＶランプ（ＨＰ−１５Ｍ，２８０−４００ｎｍ，ｍａｘ．３１２ｎｍ；Ａｔｔｏ Ｃｏ．，日本）で、一平方メーター当り１５ｋＪになるようにＵＶＢを照射した。ＵＶを２４時間照射した後、背側の皮膚を切取り過酸化測定時まで−７０℃で保管した。
【００９３】
ＵＶＢ照射は、皮膚組織に顕著な脂質過酸化を誘発させるため、過酸化された脂質の含量を測定することにより皮膚の損傷程度を測定できる。それで、脂質過酸化を測定した。詳細には、ＳＫＨ−１無毛ネズミの背表面にＵＶＢを照射して４８時間後に背の皮膚組織を切取りチオバルビツール酸（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ，ＴＢＡ）法で脂質過酸化を測定した。無毛ネズミの背側皮膚を１０倍の５０ｍＭ Ｋ−Ｐ緩衝液に入れた後、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｉｏｎ）させた。
【００９４】
次に、ハイドロゲンペルオキシド化を観察した。冷凍した背の皮膚切片を１ｍｇ／ｍｌグルコースと１ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＤＡＢ）を含有する０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に入れて３７℃で５乃至６時間培養した。蒸溜水で洗浄した後、２％メチルグリーン（ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｅｅｎ）で６０分間染色した。顕微鏡で茶色のＤＡＢ−ペルオキシダーゼと青色に染色された核を観察した。
【００９５】
ＵＶ照射は、皮膚組織に活性酸素種の生成を誘導してＤＮＡ損傷、タンパク質の酸化、脂質過酸化等を誘発させ、結局、炎症や癌、皮膚老化のような皮膚の損傷を起こすものと知られている。図７に示したように９０ｍＪ／ｃｍ２でＵＶＢを照射した時には顕著な皮膚損傷が観察された。しかし、ハナズオウ抽出物及び化学式５（ピセアタンノール）を５０ｍｇ／ｋｇの濃度で前処理した時には、ＳＫＨ−１無毛ネズミの皮膚損傷が顕著に抑制された。前記実施例の結果から分かるように、ハナズオウ抽出物及びその活性成分である化学式５（ピセアタンノール）は、強力なラジカル消去活性、脂質過酸化抑制活性及び酸化的ストレスに対する皮膚細胞の保護活性を示したので、ＵＶＢ照射で誘導される皮膚損傷に対する保護効果は、このような抗酸化活性に起因したものと思料された。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）は、組織のペルオキシダーゼと反応して濃い茶色のＤＡＢ−ペルオキシダーゼを生成するので、これを使用してＵＶＢ照射により生成されるＨ２Ｏ２を観察した。図７に示したように９０ｍＪ／ｃｍ２でＵＶＢを照射した時には、濃い茶色のＤＡＢ−ペルオキシダーゼが多く観察されたが、ハナズオウ抽出物及び化学式５（ピセアタンノール）を５０ｍｇ／ｋｇの濃度で前処理した時には、ＳＫＨ−１無毛ネズミの皮膚組織でＨ２Ｏ２生成が顕著に抑制された。
【００９６】
脂質過酸化を測定した結果、ＵＶＢを照射した群の平均ＴＢＡＲＳ（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）含量は、約０．６８ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質で、ＵＶＢを照射していない対照群（０．３２±０．０５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）に比べて２倍程度脂質過酸化が起きた（表８）。ハナズオウ抽出物及び化学式５（ピセアタンノール）を処理した群は、濃度依存的に皮膚の脂質過酸化が減少した。特に、化学式５は同じ濃度で陽性対照群に使用したＭＡＰ（マグネシウム−Ｌ−アスコルビル−２−ホスファート）よりも高い活性を示した。
【００９７】
（表８）
【００９８】
実施例８：細胞寿命に対する延長効果
ＨＥＫ−Ｎ／Ｆ細胞は、皮膚のまた他の主成分である繊維芽細胞をウリジンブロマイド（ｕｒｉｄｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）で処理した後、ヒト新生児表皮から得て、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。ＨＥＫ−Ｎ／Ｆ細胞は、１：４の希釈比率で連続的に培養した。試料を処理する前に約３のＰＤＬ（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ）になるまで成長させ、以後培養の間各々の試料を３ｇ／ｍｌの濃度で投与した。培地交換は、同一濃度の試料を含む培養液を添加して３日毎に行なった。細胞培養後、本発明のハナズオウ抽出物、化学式５（ピセアタンノール）及び化学式９（ミリセチン）を処理して細胞分裂を観察した。
【００９９】
その結果、ハナズオウ抽出物及び活性成分は、皮膚細胞の寿命を延長させるものと現れた。なにも処理していない対照群は、平均寿命が約３５日であるのに反してハナズオウ抽出物を３μｇ／ｍｌずつ処理して培養した時には、平均寿命が４２日程度に、対照群に比べて約１．２培程度寿命が延長された。活性成分の化学式９（ミリセチン）と化学式５（ピセアタンノール）を処理して培養した時には、平均寿命が各々５６日と７６日に、対照群に比べて各々１．６培及び２．１培程度細胞の寿命が延長された（図８）。したがって、本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した活性成分は、細胞寿命延長効果を有していることが分かった。
【０１００】
実施例９：テロメアの長さと細胞寿命に対する延長効果
前記実施例８で本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した活性成分は、細胞寿命延長効果を有することを確認した。それで、細胞寿命延長効果とテロメアの長さとの関係を調べた。詳細には、ゲノミックＤＮＡは、ヘキサン抽出キット（ＩｓｏＱｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，ＯＲＣＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を使用して各々の年齢の細胞から抽出した。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して４℃で保存した。１．５ｍｌチューブに１０×Ｈ緩衝液（ＴａＫａＲａ）２μｌ、前記で抽出したゲノミックＤＮＡ溶液２μｌを入れて３次蒸溜水を入れ全体を１９μｌになるようにした後、制限酵素Ｈｉｎｆ Ｉ（６Ｕ／ｌ，ＴａＫａＲａ）１μｌを添加した。前記混合液を３７℃で３乃至４時間反応させた後、電気泳動をさせた。電気泳動時にアガロース（ｔｙｐｅ Ｉ，Ｓｉｇｍａ）ゲルは、ブリッジ部分が１％、ベッド部分が０．８％になるようにゲル濃度を調節してゲル板を製作し（マリソルＫＳ−８４０５，２０×１４ｃｍ）、１×ボイアー緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１８ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を使用した。マーカーには、１Ｋｂ ＤＮＡラダーを使用して０．５μｇをローディングした。すべてのサンプルは、ローディングバッファー３μｌずつを入れて３５Ｖ／ｃｍで２０時間電気泳動を実施した。電気泳動が完了した後、エチジウムブロマイド（２μｇ／ｍｌ）で１５分間染色してＵＶで確認した。続けてゲルを０．２５Ｎ ＨＣｌに入れて１５分間振盪した後、蒸溜水で２回洗浄した。そのゲルを変性液（０．２Ｎ ＮａＯＨ、０．６Ｍ ＮａＣｌ）に浸けて室温で２５分間振盪した後、蒸溜水で３回洗浄した。６×ＳＳＣを満したブロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）装置にニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｏｐｔｉｔｒａｎ ＢＡ−Ｓ８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌ）、３ｍｍろ紙、ペーパータオル、ガラス板、重り（２ｋｇ）の順序でのせて一晩中ブロッティングさせた。ブロッティングが完了した後に膜フィルターを３×ＳＳＣに浸けて軽く水分を除去した後、ＵＶでウェルの位置を確認した。ろ紙に挿して８０℃で一晩べーキング（ｂａｋｉｎｇ）して６５℃で変性された鮭精子（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡ（Ｗａｋｏ）で前混成化（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）させた後、５０℃で混成緩衝液（１×Ｄｅｎｈａｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，１Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ ＳＤＳ，５０ｇ／ｍｌ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ）と５’−末端［３２Ｐ］−標識された（ＴＴＡＧＧＧ）４で混成化させた。混成化された膜を洗浄液（４×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ）に浸けて５５℃で１５分振盪した後、乾燥させラップで覆いＸ−線フイルム（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｉｌｍ，Ｋｏｄａｋ）と共に増感紙を付けたカセットにセットして−８０℃で一晩中同位元素現象（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）を実施した。現像したフイルムと膜の位置を合わせてマジックでウェルの位置を表示した。ＴＲＦｓの密度ピークをレーザーデンシトメーター（ｌａｓｅｒ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＵｌｔｒｏＳｃａｎ ＸＬ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で検出して、その移動度を算出した。
【０１０１】
その結果、細胞分裂をするにしたがってテロメアの長さが漸進的に減少することを観察できた。図９に示したように、対照群は１４．８回分裂した後のテロメアの長さが約８．０ｋｂｐ程度に減少してそれ以上分裂できなかった。反面、ハナズオウ抽出物や活性成分を処理した群は、対照群に比べてずっと多くの分裂をした後にテロメアの長さが臨界値（本発明では、約８．０ｋｂｐ）に到達した。細胞分裂は、テロメリックＤＮＡが臨界値（ヒト皮膚表皮細胞は、７．９−８．４ｋｂであると推定）以上に維持される限り継続可能だった。このような観点からテロメアが短縮される速度を遅延させ臨界値に到達する速度を遅らせることにより細胞分裂能力が終了する周期を延長させられるものと現れた。即ち、対照群の最大ＰＤＬは、１４．１であるのに反してハナズオウ抽出物を投与した時には最大ＰＤＬが１７．２、化学式９（ミリセチン）は２３．１、化学式５（ピセアタンノール）は２９．９で、最大ＰＤＬが顕著に増加した。
【０１０２】
また、細胞分裂回数と前記測定したテロメアの長さの関係からテロメア短縮速度を計算した結果、ハナズオウ抽出物、化学式９（ミリセチン）及び化学式５（ピセアタンノール）を投与した群のテロメア短縮速度は、対照群に比べて各々１．２、１．６及び２．１倍ずつ遅れたことを確認した（図１０）。したがって、ハナズオウ抽出物及び活性成分の皮膚細胞寿命延長効果は、テロメア短縮速度を遅らせることにより現れた結果であると思われた。
【０１０３】
製剤例１：ハナズオウ抽出物を含む化粧料組成物の製造
本発明者らは、前記ハナズオウ抽出物を有効成分として含む化粧料組成物（製剤１乃至製剤６）を下記表９乃至表１１のように製造した。また、下記製造例に含まれたハナズオウ抽出物以外にも通常的に化粧品を製造するのに使用できる他の抽出物が追加に含まれ得る。その例として、桑白皮、褐藻、当帰、ハトムギ、牧丹皮、馬歯、柿の葉、アメリカマンサク（witch hazel）及びセンテラ（centella）抽出物等がある。
【０１０４】
まず、本発明のハナズオウ抽出物を含む柔軟化粧水及び粘稠性液を下記表９に記載した組成により通常の方法で製造した。
【０１０５】
（表９）柔軟化粧水及び粘稠性液の製造
【０１０６】
次に、本発明のハナズオウ抽出物を含む乳液及びローションを下記表１０に記載した組成により通常の方法で製造した。
【０１０７】
（表１０）乳液及びローションの製造
【０１０８】
次に、本発明のハナズオウ抽出物を含むクリームを下記表１１に記載した組成により通常の方法で製造した。
【０１０９】
（表１１）クリームの製造
【０１１０】
製剤例２：抗酸化及び老化抑制用薬学的組成物の製造
本発明者らは、前記ハナズオウ抽出物を有効成分として含む、抗酸化用及び老化抑制用薬学的組成物を下記のように製造した。
【０１１１】
＜２−１＞シロップ剤の製造方法
本発明のハナズオウ抽出物を有効成分として２％（重量／体積）で含むシロップを下記の方法で製造する。
【０１１２】
ハナズオウ抽出物、サッカリン、糖を温水８０ｇに溶解させた。この溶液を冷却させた後、そこにグリセリン、サッカリン、香味料、エタノール、ソルブ酸及び蒸溜水からなる溶液を製造して混合した。この混合物に水を添加して１００ｍｌになるようにした（表１２）。
【０１１３】
（表１２）
【０１１４】
＜２−２＞錠剤の製造方法
有効成分１５ｍｇを含有した錠剤は、下記の方法で製造する。
【０１１５】
ハナズオウ抽出物２５０ｇ、ラクトース１７５．９ｇ、ジャガイモ澱粉１８０ｇ及びコロイド性硅酸３２ｇと混合した。前記混合物に１０％ゼラチン溶液を添加した後、粉砕して１４メッシュを通過させた。それを乾燥させてジャガイモ澱粉１６０ｇ、滑石５０ｇ及びステアリン酸マグネシウム５ｇを添加して得られる混合物を錠剤にした（表１３）。
【０１１６】
（表１３）
【０１１７】
以上で詳しく見たように、本発明のハナズオウ抽出物は、抗酸化活性が高いので、ハナズオウ抽出物を有効成分として含む薬学的組成物は、過酸化と関係した疾患の治療及び予防に使用できる。
【０１１８】
以下、本発明のハナズオウ抽出物を含む薬学的組成物が適用できる具体的な疾患に対して説明する。
【０１１９】
但し、下記の適用例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の適用例に限定されるものではない。
【０１２０】
適用例１：癌
癌は無数に多くの原因により起きるものだけれど、最も根本的な原因として活性酸素による細胞の破壊及びその復旧不能により細胞機能の障害を起こし、それが進行して癌に転移すると明らかにされている（Ａｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３年，第２２１巻頁，１２５６−１２６４頁）。一方、果物にあるフェノール酸の肝癌に対する効果（Ｓｕｎ Ｊ等，Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００２年，第４；５０（２５）巻，７４４９−７４５４頁）、トマトにあるリコフェン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ）の乳癌に対する効果（Ｈａｄｌｅｙ ＣＷ等，Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００２年，第２２７（１０）巻，８６９−８０頁）、イソベルバスコシド（ｉｓｏｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ）の胃癌に対する効果（Ｃｈｅｎ ＲＣ等，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ，２００２年，第２３（１１）巻，９９７−１００１頁）等、現在報告されている色々な抗酸化剤が他の癌にも効果がある。したがって、抗酸化剤は様々な種類の癌の治療及び予防に効果的に使用できることが分かり、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、癌の治療及び予防に効果的に使用できる。
【０１２１】
適用例２：老化
正常的な代謝過程で付随的に生成される活性酸素は、細胞構成成分の脂質、タンパク質、糖またはＤＮＡ等を非選択、非可逆的に破壊することにより酸化的損傷を与え、それが長い時間蓄積されると老化と死に至る（Ｈａｒｍａｎ，Ｄ，Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ，１９８６年，３−４９頁）。また、実験条件を変えて食餌を制限したり運動量を減少させる等基礎代謝率、即ち酸素消費量を減少させることにより寿命が延長されることが観察された（Ｍｅｄｖｅｄｅｖ，Ｚ．Ａ．，Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ．，１９９０年，第６５巻，３７５−３９８頁；Ｌｏｅ，Ｊ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７１年，第３２巻，１０３−１２１頁；Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．，Ａｇｉｎｇ，１９８２年，第５巻，２１−２４頁）。即ち、活性酸素を除去することが老化を遅延させられる方法であり、現在活性酸素を除去する抗酸化剤が多く開発されている。したがって、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、老化を遅延させられる。
【０１２２】
適用例３：冠状心臓疾患、高脂肪血症及び動脈硬化
冠状心臓疾患及び高脂肪血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）患者にコレステロール生合成酵素阻害剤を処理すると低密度脂肪にあるコレステロール含量を減少させるが、活性酸素による過酸化に対してはユビキノンＱ１０（ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ Ｑ１０）の生合成を抑制して低密度脂タンパク質を保護する作用をして前記疾患の治療に効果的ではなく前記患者に抗酸化物質のセラビスタチン（ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）またはプロブコル（ｐｒｏｂｕｃｏｌ）を投与すると低密度脂タンパク質の含量が急撃に減少した（Ｌａｎｋｉｎ ＶＺ等，Ｂｕｌｌ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００２年，第１３４（１）巻，３９−４２頁）。また、抗酸化剤のジヒドロピリジンカルシウム拮抗体ラシジピン（ｌａｃｉｄｉｐｉｎｅ）を動脈硬化患者に投与した臨床実験で血圧降下と共に血管壁のコレステロール数値を下げて動脈硬化病変の大きさが減少した（Ｈａｌｌｅｒ Ｈ等，Ｄｒｕｇｓ Ｒ Ｄ，２００２年，第３（５）巻，３１１−２３頁）。即ち、抗酸化物質は、冠状心臓疾患、高脂肪血症及び動脈硬化のようなコレステロールと関連した血管系疾患の治療及び予防において、優秀な物質であることが分かり、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、冠状心臓疾患、高脂肪血症及び動脈硬化のような血管系疾患の治療または予防に使用できる。
【０１２３】
適用例４：多発性硬化症及び自己免疫性脳脊髄炎
多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）及び自己免疫性脳脊髄炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）疾患モデルマウスに抗酸化剤の一種であるＡＬＡ（ａｌｐｈａ ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ）を投与した臨床実験で前記の病症度が弱まる現象を観察した。即ち、酸化的ストレスは、多発性硬化症及び自己免疫性脳脊髄炎において主な原因であり抗酸化剤を使用して前記のような神経関連疾患を治療できる（Ｍａｒｒａｃｃｉ ＧＨ等，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，２００２年，第１３１（１−２）巻，１０４−１４頁）。したがって、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、多発性硬化症及び自己免疫性脳脊髄炎のような神経関連疾患の治療または予防に使用できる。
【０１２４】
適用例５：脳卒中及びアルツハイマー病
酸化的ストレス、即ち、活性酸素は細胞の構成成分を酸化させそれらの機能障害をもたらし、それらの機能障害により神経細胞の機能にも障害を与える。このような神経細胞機能障害による発作（ｓｔｒｏｋｅ）、ショック（ｔｒａｕｍａ）等を起こすことになる。しかし、このような症状が治療されずに持続的な酸化的ストレスが与えられた場合、深刻な脳疾患、即ち、脳卒中、アルツハイマー病のような疾患が起きることになる。また、活性酸素を除去できる抗酸化剤を使用して脳卒中、アルツハイマー病のような脳疾患を治療できる（Ｐｅｒｒｙ Ｇ等，Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａａｒｍａｃｏｌ，２００２年，第１３３（４）巻，５０７−１３頁；Ｃｅｃｃｈｉ Ｃ等，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００２年，第１５：３３（１０）巻，１３７２−９頁；Ｓｍｉｔｈ ＭＡ等，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００２年，第１：３３（９）巻，１１９４−９頁）。したがって、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、脳卒中、アルツハイマー病のような脳疾患の治療または予防に使用できる。
【０１２５】
適用例６：腸炎
腸炎患者の白血球には過量の過酸化副産物が蓄積されていて、蓄積された過酸化副産物による細胞の損傷は、腸の感染において一次的または二次的病理学メカニズムの原因である。即ち、酸化的ストレスは腸の感染を誘導して炎症性腸炎を起こす主な原因である（Ｋｒｕｉｄｅｎｉｅｒ Ｌ等，Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ，２００２年，第１６（１２）巻，１９９７−２０１５頁）。したがって、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、炎症性腸炎等の炎症と関連した疾患の治療または予防に使用できる。
【０１２６】
産業上の利用可能性
前記で詳しく見たように、本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物は、合成抗酸化剤とは異り人体に無害で、他の天然抗酸化剤と比べて抗酸化活性が優秀で、細胞内酸化的ストレスを効果的に抑制するだけではなく、細胞老化と関連したテロメアの長さの短縮を抑制することにより皮膚細胞の寿命を延長させられるので、それを有効成分として含む本発明の化粧料組成物は、皮膚老化抑制、皮膚弾力保護、シワ改善のために有用に使用できる。
【０１２７】
当業者は、前述の記載により開示された概念および特定の態様が、本発明の同様の目的を実行するためのその他の態様の改変および設計の基盤として容易に利用されうることを、理解するであろう。当業者はまた、そのような同等の態様が、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の目的および範囲から逸脱しないことを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
本発明の好ましい態様の適用は、添付の図面を参照することで最も良く理解される。
【図１】ハナズオウからエタノール粗抽出物を得て、それをヘキサン、エチルアセテート、ブタノール順に抽出する過程を示した模式図である。
【図２】ハナズオウからエタノールを０％から順次的に１０％ずつ増やして１００％濃度まで抽出したエタノール粗抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性を測定したグラフである。
【図３】ヘキサン、エチルアセテート、ブタノール、水分画及びエタノール抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性を測定したグラフである。
【図４】エチルアセテート画分から抗酸化活性を示す化合物を分離する過程を示した模式図である。
【図５】ブタノール画分から抗酸化活性を示す化合物を分離する過程を示した模式図である。
【図６】ａは、本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物のＵＶ照射に対する細胞保護効果を示したＤＮＡ損傷程度を示した細胞写真である。ｂは、本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物のＵＶ照射に対する細胞保護効果を示したＤＮＡ損傷程度を示す蛍光の強さを示すグラフである。
【図７】本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物がＵＶ照射に対して保護効果を示すかどうかを確認した無毛ネズミの皮膚損傷写真である。
【図８】本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物が細胞寿命を延長させることを示したグラフである。
【図９】本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物がテロメアの長さの短縮速度を抑制するテロメアの長さのサダンブロット写真である。
【図１０】本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物がテロメアの長さ延長作用をすることを示したテロメア短縮速度のグラフである。
【図１１】ハナズオウの花、葉、茎及び実を示した写真である。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、皮膚老化抑制活性を有する植物抽出物及びそれを有効成分として含む老化抑制用化粧料組成物に関するもので、詳細には酸化的ストレスに対する抑制活性及び皮膚細胞寿命延長効果が優秀なハナズオウ抽出物を含む皮膚老化抑制用化粧料組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
老化は、時間の経過と共に起きる身体のすべての生理的変化を総称するもので、個体により数多くの要因によりとても多様に起きる生命現象である。老化は、個体毎にその様相と速度が異なり、一個体内においても各組織毎にその様相が異なるため、老化を個体水準で研究するには多くの難しさがある。一方、老化現象を具体的に詳しく見てみると、各構成器官及び組織の機能変化が起きるもので、これは構成単位である細胞の機能変化に起因する。即ち、脳の神経細胞消失により認知機能が低下したり、皮下脂肪細胞の消失により皮膚の弾力が減少したり、毛根メラニン細胞がメラニン色素生成能力を失うことにより髪の毛が白くなる等、個体の老化は結局その個体を構成する細胞の老化に起因する。ゆえに、最近では老化の研究も細胞水準で多く行われている。この数十年間数多くの科学者らが細胞の老化に関して研究してきたが、老化の多様な現象と複合的な特徴のため、いまだ正確なメカニズムを糾明できずにいる。しかし、多数の現象学的研究を通じて老化に関する様々な仮説が提起され、その中で正常的な代謝過程で発生する活性酸素による酸化的ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）が蓄積され老化の原因になるという老化の活性酸素説と染色体末端部分にあるテロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）が細胞分裂を繰り返すにしたがって漸次消失して細胞分裂が停止し、結局死滅に至るという老化のテロメア説が関心を集めている。その他にも様々な仮説があるがこのような仮説は、お互いに相反するものではなくお互いに補完的に老化を説明している。老化の活性酸素説というのは、正常的な代謝過程で付随的に生成される活性酸素は、反応性が強くて細胞構成成分の脂質、タンパク質、糖、またはＤＮＡ等を非選択的、非可逆的に破壊して細胞や組織の酸化的ストレスを誘発させることにより、癌を始めとする脳卒中及び粥状動脈硬化のような心血関係疾患、リューマチのような慢性炎症疾患、呼吸器疾患または自己免疫疾患等の各種疾病を誘発するだけではなく（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂ ａｎｄ Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｍ．Ｃ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９８４年，第２１９巻，１−１４頁；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｂ．Ａ．ａｎｄ Ｇｒａｐｏ，Ｊ．Ｄ．，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，１９８２年，第４７巻，４１２−４２６頁；Ａｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３年，第２２１巻，１２５６−１２６４頁；Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｉ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９８６年，第２４７巻，１−１１頁；Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈ，Ｍ．Ｓ．，Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，１９９５年，第１０巻，１９−２５頁）、このような酸化的損傷が長い時間蓄積されて老化と死に至るというものである。このような老化の活性酸素説は、１９５６年にハルマン（Ｈａｒｍａｎ）によって始めて提案され（Ｈａｒｍａｎ，Ｄ．，Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６年，３−４９頁）、以後、色々な実験結果が前記仮説を裏付けいている。実験条件を変えて食餌を制限したり運動量を減少させる等、基礎代謝率、即ち、酸素消費量を減少させることにより寿命が延長されることが観察された（Ｍｅｄｖｅｄｅｖ，Ｚ．Ａ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９０年，第６５巻，３７５−３９８頁；Ｌｏｅ，Ｊ．，Ｎｏｒｔｈｒｏｐ，Ｊ．Ｈ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７１年，第３２巻，１０３−１２１頁；Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．，Ｉｎｓｅｃｔ ａｇｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１９８６年，２３−４４頁；Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．，Ａｇｉｎｇ，１９８２年，第５巻，２１−２４頁）。
【０００３】
一方、生体内には酸化的損傷から防御するための抗酸化物質等とスーパーオキシドジスムターゼ（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，以下「ＳＯＤ」と略称する）、カタラーゼ（ｃａｔａｌａｓｅ）またはペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）のような抗酸化酵素が存在する。年を取って老いるにつれて活性酸素に対する防御能力が減少するという事実が報告された（Ｏｒｒ，Ｗ．Ｃ．ａｎｄ Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４年，第２６３巻，１１２８−１１３０頁；Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５年，第２７０巻，１５６７１−１５６７４頁）。即ち、年老いたネズミの肝から分離されたＳＯＤは、若いネズミのＳＯＤより活性が低く、特にショウジョウバエに抗酸化酵素のＳＯＤとカタラーゼの活性を高めると寿命が３０％以上増加し、活性酸素と老化が密接な関連があることが分かる。したがって、活性酸素を消去できる物質や脂質過酸化抑制物質のような抗酸化剤は、活性酸素によって誘発される各種疾患治療剤及び老化予防のための抑制剤として期待を集めている。
【０００４】
また、大気汚染、紫外線露出、ストレスまたは疾病等の有害環境から酸化的ストレスに継続的に露出すると、体内にラジカルが増加して真皮の結合組織であるコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸等を破壊して皮膚の一定部位沈下現象（シワ）を作り得る。また、細胞膜の脂質部分を酸化させ細胞の破壊現象を起こして皮膚炎、ニキビまたは皮膚癌等の疾病を誘発し得る。その他にもラジカルは、メラニン形成過程に関与してシミ、そばかす及びシワ生成の原因になったりする。以前からアスコルビン酸、α−トコフェロールまたはＳＯＤ等が自由ラジカル消去機能物質として化粧料や医薬品に配合され、シワ及びその他皮膚疾患を防止するために使用されてきたが、これらの価格が高価なだけではなく配合時の化学的安定性が良くないため実質的な効果を期待することが難しい問題点があった。そのような理由から安全でありながら自由ラジカル消去効果が高い物質を開発することが医薬品や食品分野だけだはなく化粧品産業分野にも重要な課題として台頭し多くの研究が進められている。
【０００５】
老化現象を理解するためのまた一つの理論として、老化のテロメア仮説がある。ヒトの正常細胞は、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で決められた回数だけ細胞分裂をしてそれ以上分裂しない。これを複製老化というが、このような現象がなぜ起きるのかを説明するのがテロメア仮説である（Ｋｉｍ，Ｓ．Ｈ．，等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２年，第２１巻，５０３−５１１頁；Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．，等，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０年，第３４５巻，４５８−４６０頁；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ｂｉｏｌ．１９７３年，第４１巻，１８１−１９０頁；Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．１９９２年，第２７巻，３７５−３８２頁；Ａｌｌｓｏｐｐ，Ｒ．Ｃ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２年，第２１巻，３２７０−３２７３頁）。テロメアは、真核細胞線形染色体の末端部分にＴＴＡＧＧＧ塩基配列が反復する特異な構造からなっている。特に、グアニン（Ｇ）は、水素結合により非常に安定なＧ−四分体（ｑｕａｒｔｅｔ）構造を形成することにより染色体を安定化させ染色体を保護するのに重要な役割を果たす（Ｍｏｙｚｉｓ，Ｒ．Ｋ．，等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８８年，第８５巻，６６２２−６６２６頁）。しかし、ヒトの体細胞は、細胞分裂をする度にテロメアの長さが段々減少することが明らかにされた（Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．，Ｆｕｔｃｈｅｒ，Ａ．Ｂ．，Ｇｒｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０年，第３４５巻，４５８−４６０頁；Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．等，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．１９９２年，第２７巻，３７５−３８２頁；Ａｌｌｓｏｐｐ，Ｒ．Ｃ．，Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００２年，第２１巻，３２７０−３２７３頁）。このような現象は、ＤＮＡが複製される時、３’−末端のプライマー部分が複製されない、いわゆる「末端複製問題（Ｅｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｂｌｅｍ）」のために起きる（Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｔｈｅｏｒｅｔ．Ｂｉｏｌ．１９７３年，第４１巻，１８１−１９０頁）。ゆえに、細胞は一度分裂する度にプライマー部分だけ短いＤＮＡが複製され、分裂を重ねるにつれて染色体のテロメアの長さが短くなり臨界長さ以下になるとＤＮＡの単一鎖と二重鎖が切れて、結局、サイクリン依存キナーゼ（ｃｙｃｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ）の抑制剤等を誘導させ細胞分裂がＧ１期に停滞する（Ｈａｒｌｅｙ，Ｃ．Ｂ．等，Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．１９９２年，第２７巻，３７５−３８２頁）。最近の研究によると、テロメアの長さは、酸化的ストレスの影響を受けるものと明らかにされた。即ち、酸化的ストレスはテロメア短縮速度を増加させる。これは酸化的損傷が染色体の他の部分に比べてテロメリックＤＮＡ部分が不十分に復旧されるためであると考えられている（Ｓａｒｅｔｚｋｉ，Ｇ．，ｖｏｎ Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ，Ｔ．，Ａｎｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００２年，第９５９巻、２４−２９頁；ｖｏｎ Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ，Ｔ．，Ａｎｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００年，第９０８巻，９９−１１０頁；ｖｏｎ Ｚｇｌｉｎｉｃｋｉ，Ｔ．，ＴＲＥＮＤＳ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２００２年，第２７巻，３３９−３４４頁；Ｌｏｒｅｎｚ，Ｍ．，等，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２００１年，第３１巻、８２４−８３１頁）。
【０００６】
このような老化の理論に基づき植物から皮膚老化を抑制させられる物質を探した。植物は、光合成過程で副産物としてスーパーオキサイドラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ）を始め色々な活性酸素が生成されるため、このような酸化的ストレスから自らを保護できる防御体系が良く発達しているものと考えられる。ゆえに、植物はそれ自体が抗酸化物質を含有している重要な資源になり得る。それで、３５０余種の植物を対象にラジカル消去活性及び脂質過酸化抑制活性を調査して、抗酸化活性がある数種の候補植物を選定した。文献考察及び資源確保の容易性等を考慮して、比較的成分及び活性に関する報告がなく資源確保が容易なハナズオウ（Ｃｅｒｃｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）を最終候補植物に選定した。
【０００７】
ハナズオウ（Ｃｅｒｃｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）は、マメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）に属する落葉潅木であり中国原産である。高さは、３乃至５ｍで小さい枝には毛がなく、数個の皮目がある。葉は、互生して単葉で、形は丸い心臓型で、直径は６乃至１１ｃｍで毛はなく縁が単調である。葉の表は濃い緑色で、潤気が出て、裏面は薄緑である。托葉は四角形で、早く散る。花は長さが１乃至２ｃｍで、葉のわきが数房付き、花がなく花梗だけがある。萼は鐘模様で、外側の縁に５個の鈍いノコギリ葉がある。花冠は蝶模様で紫紅色で、花びらは５枚で大きさが一定ではない。雄しべは１０個で、分離している。基部は萼内に付いている。花糸は細長い。雌しべは１つで、子房は光沢があり、毛はなく、袋がある。花柱上部分は曲がっていて、柱頭は短くて小さく、押されて扁平になった模様である。開花期は、４月頃で葉より先に咲く。実は莢果で扁平な帯模様で、端は少し収縮して短いくちばし模様である。さやは長さ７乃至１２ｃｍで８〜９月に熟し、種子は丸く扁平で黒色に近い（李永魯、原色韓国植物図鑑、教学社、ソウル、１９９６年、３６２−３６３頁）。漢方薬では、ハナズオウの樹皮、根皮、木質部、実、花等を各々紫荊皮、紫荊根皮、紫荊木、紫荊果、紫荊花といい、風寒湿痺、通経、生理痛、喉痺、淋疾、血液循環促進等に使用している（Ｂａｅ, Ｋ．Ｈ．，Ｔｈｅ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｋｏｒｅａ，Ｋｙｏ−Ｈａｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ，２０００）。
【０００８】
本発明者らは、ハナズオウから分離した抽出物が合成抗酸化剤とは異り人体に無害で、他の天然抗酸化剤に比べて酸化的ストレスに対する細胞保護活性が優秀であるだけではなく、テロメアの長さの短縮速度を遅くすることにより細胞寿命を延長させられるため老化防止、皮膚弾力保護またはシワ改善のための化粧料組成物として有用に使用できることを確認することにより本発明を完成した。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明の目的は、水またはアルコール水溶液を抽出溶媒に使用して抽出した抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用ハナズオウ抽出物を提供することである。
【００１０】
また、本発明の別の目的は、前記抽出物またはそれから分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物からなる群から選択された化合物を有効成分として含む抗酸化用、皮膚弾力保護用またはシワ改善用化粧料組成物を提供することである。
【００１１】
また、本発明の別の目的は、前記抽出物を有効成分として含む薬学的組成物を提供することである。
【００１２】
また、本発明の目的は、本発明の前記抽出物を製造する方法を提供することである。
【００１３】
発明の詳細な説明
前記目的を達成するために、本発明は、水またはアルコール水溶液を抽出溶媒に使用して抽出した抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用ハナズオウ抽出物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、前記抽出物またはそれから分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物からなる群から選択された化合物を有効成分として含む抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ改善用化粧料組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、前記抽出物を有効成分として含む薬学的組成物を提供する。
【００１６】
また、本発明は、前記抽出物を製造する方法を提供する。
【００１７】
本発明を、以下で詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、水またはアルコール水溶液を抽出溶媒に使用して抽出した抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用ハナズオウ抽出物を提供する。
【００１９】
本発明者らは、老化の活性酸素説に基づき１４０余種の生薬と全国で採集した２１０余種の植物を対象に抗酸化活性を検索して、数種の候補植物を選定し、その中で資源確保が容易で抗酸化活性に関する報告がなかったハナズオウの抽出物から抗酸化活性を確認した。本発明に使用したハナズオウは、２００１年９月中旬、大徳研究団地及び忠南大学校で採集したものを植物図鑑と比較して確証した。確証標本（HK1122）は、（株）韓国新薬慈光研究所に保管されている。
【００２０】
本発明のハナズオウ抽出物を製造するのに使用した溶媒は、アルコール水溶液である。前記アルコール水溶液は、メタノール水溶液、エタノール水溶液、プロパノール水溶液及びブタノール水溶液からなる群から選択することが好ましい。また、前記アルコール水溶液は、エタノール水溶液であることが好ましく、エタノール水溶液は５０乃至８０％エタノール水溶液であることが好ましく、６０％エタノール水溶液であることがさらに好ましい。
【００２１】
本発明において、ハナズオウ抽出物は、前記したハナズオウのアルコール粗抽出物、好ましくはエタノール（ＥｔＯＨ）粗抽出物をヘキサン、エチルアセテート（ＥｔＯＡｃ）及びブタノール（ＢｕＯＨ）で抽出して各々の分画を収得した後、抗酸化活性を示すエチルアセテート画分及びブタノール画分からクロマトグラフィー過程を経て製造され、エチルアセテート画分及びブタノール画分から下記化学式１乃至化学式２０で表される化合物を含む抽出物が収得される（図４及び図５参照）。また、構造分析の結果、本発明で収得した化学式１５で表される化合物（シリンゲチン−３−Ｏ−（２”−Ｏ−ガロイル）−ルチノシド）は、現在まで報告されていない新規な化合物であることを確認した。
<化学式１>
<化学式２>
<化学式３>
<化学式４>
<化学式５>
<化学式６>
<化学式７>
<化学式８>
<化学式９>
<化学式１０>
<化学式１１>
<化学式１２>
<化学式１３>
<化学式１４>
<化学式１５>
<化学式１６>
<化学式１７>
<化学式１８>
<化学式１９>
<化学式２０>
【００２２】
前記化学式１乃至化学式２０で表される本発明の化合物の場合、ハナズオウ抽出物総重量に対して化学式６で表される化合物は、０．０１乃至１．００重量％、化学式１２で表される化合物は、０．０１乃至１．００重量％、化学式５で表される化合物は、０．０１乃至０．５重量％で含むことが好ましい。
【００２３】
前記化学式１乃至化学式２０で表される本発明の化合物は、ラジカル消去活性（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−Ｐｙｃｒｙｌ−Ｈｙｄｒａｚｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（表３参照）、脂質過酸化抑制活性（Ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（表４参照）、ヒドロキシルラジカル消去活性（Ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）とニトリックオキシド消去活性（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（表６参照）及びスーパーオキシドラジカル消去活性（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（表５参照）等の抗酸化活性を有する。
【００２４】
好気性生物体は、酸素を使用してエネルギー代謝を行っているが、生体内酸素が各種物理的、化学的及び生物学的なストレスを受けるとスーパーオキシド陰イオンラジカル（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ）、過酸化水素及びヒドロキシラジカル（ｈｙｄｒｏｘｙ ｒａｄｉｃａｌ）等の有害な活性酸素種（ａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）に変化して人体に致命的な生理的障害を引き起こす。前記のような活性酸素種は、細胞生体膜の構成成分である不飽和脂肪酸を攻撃して過酸化反応を起こし、それにより生体内に蓄積された過酸化脂質は老化と各種疾病の原因になり得る。本発明では、前記の活性酸素種の消去機能及び脂質過酸化抑制能力を調査することにより、ハナズオウ抽出物の抗酸化活性を測定した。その結果、前記ハナズオウ抽出物は、既存の抗酸化物質として知られているビタミンＥ及び合成抗酸化剤の ＢＨＡ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ−４−ｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｓｏｌｅ）と活性が同等またはより高く現れ、前記結果からハナズオウ抽出物は、抗酸化活性が優秀な抽出物であることを確認できた。
【００２５】
また、化学式１乃至化学式２０で表される本発明の化合物は、ｔ−ブチル過酸化物（ｔ−ＢｕＯＯＨ）で誘導される酸化的損傷に対する細胞保護活性（表７参照）、ＵＶ照射に対する細胞保護効果（図６ａ及び図６ｂ参照）、無毛マウスでのＵＶ照射に対する保護効果（図７参照）、ＵＶ照射による脂質過酸化の生成抑制活性（表８参照）、細胞寿命延長効果（図８参照）、テロメアの長さ延長効果（図９及び図１０参照）を示す。即ち、本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した活性成分は、抗酸化活性を示すだけではなく細胞老化抑制効果も優れていることがわかる。
【００２６】
また、本発明は、前記ハナズオウ抽出物またはそれから分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物から選択された化合物を有効成分として含む、抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用化粧料組成物を提供する。
【００２７】
本発明の化粧料組成物に含まれるハナズオウ抽出物から分離した活性成分は、化学式１（イソリキリチゲニン：イソリキリチゲニン）、化学式２（２’，４’−ジヒドロキシ−４−メトキシカルコン）、化学式３（リキリチゲニン）、化学式４（リスベラトロール）、化学式５（ピセアタンノール）、化学式６（没食子酸）、化学式７（没食子酸メチル）、化学式８（没食子酸エチル）、化学式９（ミリセチン）、化学式１０（アフゼリン（afzelin））、化学式１１（ケルシトリン）、化学式１２（ミリシトリン）、化学式１３（ミリセチン−３−Ｏ−（２”−Ｏ−ガロイル）−α−Ｌ−ラムノピラノシド）、化学式１４（シリンゲチン−３−Ｏ−ルチノシド）、化学式１５（シリンゲチン−３−Ｏ−２”−Ｏ−ガロイル）−ルチノシド）、化学式１６（（＋）−カテキン）、化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１９（（−）−リオニレシノール３ａ−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシド）及び化学式２０（（＋）−リオニレシノール３ａ−Ｏ−β−Ｄ−グリコピラノシド）で表される化合物からなる群から選択された化合物であることが好ましい。
【００２８】
本発明の化粧料組成物において、ハナズオウ抽出物またはそれから分離した活性成分は、過酸化沮害活性及びラジカル除去活性が優秀で高い抗酸化活性を有し、細胞保護効果、細胞寿命延長効果等が優れ、皮膚老化抑制、皮膚弾力保護またはシワ改善のための化粧品試料として使用できる。
【００２９】
本発明の化粧料組成物は、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、エッセンス、パックまたは風呂用パウダーの基礎化粧品試料または皮膚外用剤の形で使用できる。
【００３０】
化粧料組成物の製造時に油状成分の含量は油化能力補強及び経済性等を考慮して選択され、油状成分として主に使用されるオイルには、植物性オイル、鉱物性オイル、シリコン油及び合成油の中から選択された一つ以上を使用できる。それ以外に油化能力を補強するためには界面活性剤、高級アルコール等を０．１乃至５重量％添加できる。このような界面活性剤には、非イオン界面活性剤のような通常的な界面活性剤を使用でき、高級アルコールとしては炭素数が１２乃至２０のアルコールを単独または２種以上を混合して使用できる。
【００３１】
また、化粧料組成物の製造時に水状成分は、粘度または硬度を調節するためにカーボマー、キサンタンガム、ベントナイト等の１種以上の増粘剤を０．００１乃至５重量％さらに添加できる。
【００３２】
また、本発明の化粧料組成物には必要に応じて、高級脂肪酸、ビタミン等の薬効成分と紫外線遮断剤、酸化防止剤、防腐剤、香料、着色剤、ｐＨ調節剤等の通常的な化粧品に使用される成分をさらに添加できる。
【００３３】
本発明の好ましい態様では、本発明のハナズオウ抽出物を使用して柔軟化粧水、粘組成液、乳液、ローション及びクリームを製造した（表９乃至表１１参照）。
【００３４】
本発明のハナズオウ抽出物を含む化粧料組成物において、通常的に含有される化粧料組成物に本発明のハナズオウ抽出物が１乃至１５重量％、好ましくは２乃至１０重量％の量で添加する。
【００３５】
また、本発明は、前記ハナズオウ抽出物を有効成分として含む、抗酸化用及び老化抑制用薬学的組成物を提供する。
【００３６】
本発明のハナズオウ抽出物を有効成分として含む、抗酸化用及び老化抑制用薬学的組成物は、活性酸素による細胞構成成分の酸化により誘発される疾患の治療または予防に有用に使用できる。このような疾患としては例えば、癌、老化、冠状心臓疾患、高脂肪血症、動脈硬化、多発性硬化症、自己免疫性脳脊髄炎、脳卒中、アルツハイマー病及び腸炎等があり、必ずしもこれに限定されない。
【００３７】
ハナズオウ抽出物を有効成分として含む薬学的組成物は、通常的に使用される賦形剤、崩解剤、甘味剤、滑沢剤、香味剤等をさらに含むことができ、通常的な方法により錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、その他液剤に剤形化できる。
【００３８】
詳細には、本発明のハナズオウ抽出物を有効成分として含む薬学的組成物は、経口投与用剤形、例えば錠剤、トローチ、ロゲンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、水溶性または油性懸濁液、調剤粉末または顆粒、エマルジョン、ハードまたはソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）に製剤化される。錠剤及びカプセル等の剤形に製剤するためにはラクトース、スクロース、サッカロース、ソルビトール、マニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロースまたはゼラチンのような結合剤、ジカルシウムホスファートのような賦形剤、トウモロコシ澱粉またはサツマイモ澱粉のような崩解剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマール酸ナトリウムまたはポリエチレングリコールワックスのような潤滑油が含有される。カプセル剤形の場合は、前記で言及した物質以外にも脂肪油のような液体担体を含有する。
【００３９】
また、本発明のハナズオウ抽出物を有効成分として含む薬学的組成物は、非経口で投与でき、非経口投与は、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式による。非経口投与用剤形としては、製剤化するためには本発明のハナズオウ抽出物を安定剤または緩衝剤と共に水に混合して溶液または懸濁液に製造してそれをアンプルまたはバイアルの単位投与形に製剤する。
【００４０】
本発明の有効成分の投与量は、体内で活性成分の吸収度、不活性化率及び排泄速度、患者の年齢、性別及び状態、治療する疾病の重症程度により適切に選択され、経口投与剤の場合一般的に成人に１日に体重１ｋｇ当り本発明のハナズオウ抽出物を２〜２００ｍｇの量で１回乃至数回に分けて投与でき、１０〜１００ｍｇの量で投与することが好ましい。
【００４１】
また、本発明は、前記ハナズオウ抽出物の製造方法を提供する。
【００４２】
本発明のハナズオウ抽出物の調製方法は、
１）ハナズオウの微粉砕粉末をアルコールで粗抽出する工程；
２）前記工程１のアルコール粗抽出物をヘキサン、エチルアセテート、ブタノールの順に抽出する工程；
３）前記工程２のエチルアセテート画分またはブタノール画分を収得してメタノール：水の濃度勾配カラムクロマトグラフィーを実施する工程；及び
４）前記工程３の抗酸化活性画分を収得してカラムクロマトグラフィー、ＴＬＣまたはＨＰＬＣを実施して最終抗酸化抽出物を得る工程からなる。
【００４３】
工程１において、アルコールはメタノール、エタノール、プロパノールまたはブタノールであることが好ましく、その中でもエタノールが好ましい。前記でエタノールは６０％エタノールが最も好ましい。本発明の好ましい実施例では、０％乃至１００％の濃度のハナズオウエタノール粗抽出物を使用してＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した結果、６０％エタノール粗抽出物の活性が最も高かった（図２参照）。
【００４４】
実施例
本発明の実践的かつ現在好ましい態様を、以下の実施例により詳細に説明する。
【００４５】
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例の内容によって限定されるものではない。
【００４６】
実施例１：ハナズオウからの有効成分抽出
＜１−１＞第１次抗酸化活性画分分離
ハナズオウから抗酸化活性を示す有効成分を抽出するために図１の模式図に示した順序で実験を進行した。詳細には、陰乾したハナズオウの葉と茎１ｋｇを磨砕器でおろして粉末にし、エタノールで室温で２週間ずつ２回抽出した。ここで、エタノールの濃度を０％から順次的に１０％ずつ増やして最終１００％エタノールを調製した後、それを使用して抽出した。エタノールの濃度による抽出物の抗酸化活性を確認するためにＤＰＰＨ（１，１−Ｄｉｐｈｅｎｙｌ−２−Ｐｙｃｒｙｌ−Ｈｙｄｒａｚｙｌ）方法を遂行して抗酸化活性を測定した（Ｔａｃｏ，Ｔ．等，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９４年，第５８巻，１７８０−１７８３頁；Ｎａ，Ｍ．Ｋ．等，Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｓｃｉ．，２００２年，第８巻，２６−２９頁）。ＤＰＰＨは、比較的安定な自由ラジカルで、ラジカル状態で存在時に５１７ｎｍで最大吸光度を示し、消去されると吸光性を失うためこのような原理を使用して抗酸化活性を測定する方法である。詳細には、ハナズオウの濃度別エタノール抽出物を取って、ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）を使用して３．１２５、６．２５、１２．２５、２５及び５０μｇ／ｍｌに希釈した後、９６ウェルプレートに前記溶液１０μｌずつを各々入れ２×１０−４Ｍ／ｍｌエタノール濃度のＤＰＰＨ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ，ＵＳＡ）溶液１９０μｌを入れ室温で３０分間放置した後、５１７ｎｍでＯＤ５１７を測定した。対照群には、試料の代わりにＤＭＳＯを加え試料の吸光度減少程度を調査した。ＤＰＰＨラジカル消去活性を下記の数式１により計算して、ＤＰＰＨラジカルを５０％消去させる試料の濃度をＩＣ５０と定めた。
【００４７】
＜数式１＞
ＤＰＰＨラジカル消去活性（％）＝（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｓａｍｐｌｅ）／Ａｃｏｎｔｒｏｌ×１００
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：試料を添加していない対照群の吸光度
Ａｓａｍｐｌｅ：試料を添加した反応群の吸光度
【００４８】
その結果、抽出時に使用したエタノールの濃度が増加するにつれＤＰＰＨラジカル消去活性は増加した。０％、１０％、２０％及び９０％エタノール抽出物は、ラジカル消去活性が低い反面、程度の差があるが３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％及び１００％エタノール抽出物の場合、大体的にラジカル消去活性が高かった。特に、６０％エタノール抽出物の場合、抽出物の濃度増加によるラジカル消去活性が最も高く、ＩＣ５０値が２６．６で最も低く、エタノール抽出物中で最も高い抗酸化活性を示す抽出物であることが分かった（表１及び図２）。
【００４９】
（表１）
【００５０】
前記で６０％エタノール抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性が最も高いことを確認した後、それから溶媒別抽出物を収得した。詳細には、６０％エタノール抽出物を蒸溜水で懸濁させた後、ヘキサンで３回抽出して減圧濃縮してヘキサン分画（Ｆｒａｃｔｉｏｎ，以下「Ｆｒ」と略称する）１１ｇを得た。残った懸濁液をエチルアセテートで３回抽出して減圧濃縮してエチルアセテート画分（以下「ＥｔＯＡｃ Ｆｒ」と略称する）２５ｇを得た。残った懸濁液を再び水泡化させたブタノール（ｂｕｔａｎｏｌ，ＢｕＯＨ）で３回抽出して減圧濃縮してブタノール画分（以下「ＢｕＯＨ Ｆｒ」と略称する）１９ｇを得た。そして、残った分画２０ｇは、水分画と見なした（図１）。
【００５１】
前記で溶媒抽出したヘキサンＦｒ、ＥｔＯＡｃ Ｆｒ及びＢｕＯＨ Ｆｒから抗酸化活性がある分画をさがすために、前記と同様な方法で各分画別抽出物を使用してＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。ここで、ＤＰＰＨラジカル消去活性が高いと知られているビタミンＥを比較群に使用した。
【００５２】
その結果、ＥｔＯＡｃ ＦｒとＢｕＯＨ Ｆｒの場合、ＩＣ５０値が各々２４．０と２７．０μｇ／ｍｌと現れ比較群に使用したビタミンＥ（ＩＣ５０ ２４．９μｇ／ｍｌ）と類似な程度の強い活性を示したが、他の分画物は活性が微弱だった（図３）。
【００５３】
＜１−２＞第２次抗酸化活性画分の分離
前記実施例＜１−１＞の結果にしたがい活性が強いＥｔＯＡｃ Ｆｒ及びＢｕＯＨ Ｆｒに対して下記のカラムクロマトグラフィーを実施して、その結果収得された各々の分画に対して再び抗酸化活性実験を行なって高い活性を示す分画だけを選択した。
【００５４】
まず、ＥｔＯＡｃ Ｆｒ（２５ｇ）に対してメタノール：水（１：４→１：０）を移動相にＹＭＣカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：５×３０ｃｍ）を実施して１１個の小分画（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．１１）を得た。前記１１個の小分画中のＦｒ．１（３．６ ｇ）を再びＹＭＣカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：３×３０ｃｍ）を行なって５個の小分画（Ｆｒ．１−１〜Ｆｒ．１−５）を得た。その中のＦｒ．１−１（４５０ｍｇ）にＨＰＬＣ［カラム：μＢｏｎｄａｐａｋＴＭＣ１８（３．９×３００ｍｍ，水）、移動相：ＡＣＮ：０．１％ＴＣＡ（１６：１８）、流速：１ｍｌ／分、ＵＶ：２８０ｎｍ］を実施して滞留時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，以下「ｔＲ」と略称する）が各々１１．１分と６．２分の化合物１８ｍｇ及び２１ｍｇの化合物を得て、各々を「ＣＣＥＡ１１１」及び「ＣＣＥＡ１１２」と命名した。
【００５５】
次に、Ｆｒ．１−２（５００ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａカラム（２０×２５０ｍｍ）、移動相：メタノール：水（３：７）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施してｔＲが１６分の化合物７７ｍｇ及びｔＲが２４分の化合物１９ｍｇを得て、各々を「ＣＣＥＡ１２１１」及び「ＣＣＥＡ１２１２」と命名した。
【００５６】
次に、Ｆｒ．３（４．８ｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−Ａカラム（２０×２５０ｍｍ）、移動相：ＡＣＮ：０．１％ＴＣＡ（２５：７５）、流速：６ｍｌ／分、ｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＵＶ（２８０ｎｍ）］を実施してｔＲが２４．５分の化合物１９ｍｇを得て、「ＣＣＥＡ３３」と命名した。
【００５７】
次に、Ｆｒ．４（４．０ｇ）は、移動相クロロホルム：メタノール（８５：１５）でシリカゲルカラムクロマトグラフィー（４×２５ｃｍ、２３０−４００メッシュ）を実施して、再び６個の小分画（Ｆｒ．４−１〜Ｆｒ．４−６）に分けた。その中のＦｒ．４−１（３２０ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（３５：６５）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが２５分の化合物３０ｍｇを得て、それを「ＣＣＥＡ４１３」と命名して、Ｆｒ．４−４（１ｇ）もまた分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（１：１）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが１５分の化合物５７ｍｇを得て、「ＣＣＥＡ４４２」と命名した。
【００５８】
次に、Ｆｒ．６（２．２ｇ）は、移動相クロロホルム：メタノール（１０：１）でシリカゲルクロマトグラフィー（３×３０ｃｍ、２３０−４００メッシュ）を実施して、３個の小分画（Ｆｒ．６−１〜Ｆｒ．６−３）に分けた。その中のＦｒ．６−２（２００ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（１：１）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施してｔＲが２０分の化合物２５ｍｇを得て、それを「ＣＣＥＡ６２２」と命名した。
【００５９】
次に、Ｆｒ．８（２．１ｇ）に対して移動相溶媒にクロロホルム：メタノール（１０：１）を使用したシリカゲルクロマトグラフィーを実施して化合物２０ｍｇを得て、それを「ＣＣＥＡ８２」と命名した。前記ＣＣＥＡ８２を分離して残った分画物をメタノールに溶解して再結晶させて収得した化合物１０ｍｇを「ＣＣＥＡ８３」と命名した。
【００６０】
次に、Ｆｒ．９（２．８ｇ）に対して移動相クロロホルム：メタノール（１５：１）でシリカゲルクロマトグラフィーを実施して２個の小分画（Ｆｒ．９−１〜Ｆｒ．９−２）に分けた。その中のＦｒ．９−１（２２０ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（４：１）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが２５分の化合物３２ｍｇを得てそれを「ＣＣＥＡ９１３」と命名した（図４）。
【００６１】
ＢｕＯＨ Ｆｒ（１９ｇ）に対しても、メタノール：水（０：１→１：０）を移動相にしてＹＭＣゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：５×３０ｃｍ）を実施して８個の小分画（Ｆｒ．１〜Ｆｒ．８）を得た。
【００６２】
Ｆｒ．２（３．８ｇ）を移動相クロロホルム：メタノール：水（７０：３０：５）でシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３×３０ｃｍ、２３０−４００メッシュ）を実施して再び５個の小分画（Ｆｒ．２−１〜Ｆｒ．２−５）に分けた。その中のＦｒ．２−３（４２０ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：アセトニトリル：水（１８：８２）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施してＦｒ．２−３−１及び２−３−２を得た。その中のＦｒ．２−３−１に対して再び分取用ＨＰＬＣ［移動相：アセトニトリル：水（１０：９０）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが１５分の化合物３２ｍｇを得てそれを「ＣＣＢｔ２３１」と命名した。
【００６３】
次に、Ｆｒ．５（３ｇ）を移動相クロロホルム：メタノール：水（７０：３０：５）でシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３×３０ｃｍ、２３０−４００メッシュ）を実施して、再び４個の小分画（Ｆｒ．５−１〜Ｆｒ．５−４）に分けた。その中のＦｒ．５−２（３００ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（３５：６５）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが２５分の化合物２０ｍｇ及びｔＲが３０分の化合物１３ｍｇを得て、それを各々「ＣＣＢｔ５２１」及び「ＣＣＢｔ５２２」と命名した。また、Ｆｒ．５−３（６００ｍｇ）に対して３０％メタノールを移動相に使用してＹＭＣゲルカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：３×３０ｃｍ）を実施して、再び４個の小分画（Ｆｒ．５−３−１〜Ｆｒ．５−３−４）に分離した。その中のＦｒ．５−３−３から沈澱して生じた物質を精製して化合物２９ｍｇを得、それを「ＣＣＢｔ５３３」と命名した。
【００６４】
次に、Ｆｒ．６（３．２ｇ）を再びＹＭＣカラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：３×３０ｃｍ）を実施して４個の小分画（Ｆｒ．６−１〜Ｆｒ．６−４）を得た。その中のＦｒ．６−２（３７０ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ［移動相：メタノール：水（３：７）、流速：６ｍｌ／分、ＵＶ：２５４ｎｍ］を実施して、ｔＲが２６分の化合物９ｍｇ及びｔＲが２８分の化合物１６ｍｇを得て、それを各々「ＣＣＢｔ６２２」及び「ＣＣＢｔ６２３」と命名した。また、Ｆｒ．６−４（２００ｍｇ）に対して分取用ＨＰＬＣ（移動相：メタノール：水（４：６）、流速：６ｍｌ／分）を実施して、ｔＲが１８分の化合物５ｍｇを得てそれを「ＣＣＢｔ６４１」と命名した。
【００６５】
次に、Ｆｒ．７（１．９ｇ）を移動相クロロホルム：メタノールでシリカゲルクロマトグラフィー（カラムサイズ：３×３０ｃｍ）を実施して４個の小分画（Ｆｒ．７−１〜Ｆｒ．７−４）を得た。Ｆｒ．７−２（５０ｍｇ）を再び移動相８０％メタノールでセパデクスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィー（カラムサイズ：３×３０ｃｍ）を実施して５個の小分画（Ｆｒ．７−２−１〜Ｆｒ．７−２−５）に分けた。その中のＦｒ．７−２−２をメタノールで再結晶させて化合物９ｍｇを得て、それを「ＣＣＢｔ７２２」と命名した。また、沈澱で析出したＦｒ．７−２−４を精製して化合物１０ｍｇを得て、それを「ＣＣＢｔ７２４」と命名した（図５）。
【００６６】
＜１−３＞分離した化合物の構造分析
前記実施例＜１−２＞で分離した２１種の分画物の構造を分析した。詳細には、分離した化合物の融点は、電気的温度融点分析機（ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ ａｐｐａｒａｔｕｓ）（Ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ Ｅｎｇ．Ｌｔｄ．，ＡＺ ９００３）を使用して、旋光度は、ＤＩＰ−３７０デジタル旋光計（ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ）（ＪＡＳＣＯ）を使用して、ＩＲスペクトルは、ＩＲレポート１００分光光度計（ＪＡＳＣＯ）を使用して、質量分析は、タンデム質量分析計（Ｊｅｏｌ，ＪＭＳ ＨＸ−１１０／１１０Ａ）を使用し、ＮＭＲ分析は、ＮＭＲ分光光度計（Ｂｒｕｋｅｒ，ＮＭＲ ＡＭＸ−６００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を使用して、ガスクロマトグラフィーは、ＳＴＡＲ ３４００ＣＸ ＧＣ（Ｖａｒｉａｎ）を使用して製造社の指針にしたがって分析した。分析した融点、旋光度、ＩＲスペクトル、質量、ＮＭＲ分析結果を使用して各化合物の構造を決定した。
【００６７】
その結果、構造分析した化合物は、下記の表２に示したようにカルコン系、スチルベン系、フェノール系、フラボノール系、フラバノール系及びリグナン系で表される群れで特定づけられた。各々は、化学式１乃至化学式２０で表される化合物であることが分かった。また、分析した化合物中に化学式１５で表される化合物（シリンゲチン−３−Ｏ−（２”−Ｏ−ガロイル）−ルチノシド）は、下記のような特性を有しその内容から前記化合物は新規な化合物であることが分かった。
【００６８】
＜化学式１５の特性＞
薄い黄色パウダー、
ＦｅＣｌ３、Ｍｇ−ＨＣｌ、Ｚｎ−ＨＣｌテスト：陽性
陽性ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ８２３［Ｍ＋Ｈ］＋
［α］Ｄ−８０（ｃ ０．１，ＭｅＯＨ）
ＩＲ νｍａｘ ｃｍ−１：３４００（−ＯＨ）、１６５０（Ｃ＝Ｏ）、１６１０，１５００，１４５５（ａｒｏｍａｔｉｃ Ｃ＝Ｃ）、１２００，１０２０（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ Ｃ−Ｏ）
ＵＶ λｍａｘ ｎｍ（ｌｏｇ ε）：２５７（３．６０），３６０（３．８２）
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：７．４６（２Ｈ，ｓ，Ｈ−２，６），６．９１（２Ｈ，ｓ，ガロイル−２，６），６．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−８），６．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−６），５．４８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ｇｌｃ−１），４．４９（１Ｈ，ｓ，ｒｈａｍ−１），３．８４（６Ｈ，ｓ，ＯＭｅ−３，５），３．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，ｇｌｃ−６），３．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，ｇｌｃ−６），１．００（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，ｒｈａｍ−６）
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：１５６．３（Ｃ−２），１３３．１ （Ｃ−３），１７７．３（Ｃ−４），１６１．１（Ｃ−５），９８．６（Ｃ−６），１６４．０（Ｃ−７），９３．９（Ｃ−８），１５６．４（Ｃ−９），１０４．０（Ｃ−１０），１１９．７（Ｃ−１），１０６．９（Ｃ−２，６），１４７．４（Ｃ−３，５），１３８．６（Ｃ−４），１００．８（ｇｌｃ−１），７６．４（ｇｌｃ−２），７４．９ （ｇｌｃ−３），７０．１（ｇｌｃ−４），７４．３（ｇｌｃ−５），６６．７（ｇｌｃ−６），１０１．０（ｒｈａ−１），７０．２（ｒｈａ−２），７０．５（ｒｈａ−３），７１．７（ｒｈａ−４），６８．３（ｒｈａ−５），１７．６（ｒｈａ−６），１６５．３（Ｃ＝Ｏ），１２０．４（ガロイル−１），１０８．７（ガロイル−２，６），１４５．３（ガロイル−３，５），１３７．９（ガロイル−４）。
【００６９】
（表２）
【００７０】
実施例２：ＤＰＰＨラジカル消去活性（ＤＰＰＨ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の測定
本発明者らは、前記実施例１で分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物を含む抽出物の抗酸化活性を測定するために前記実施例１と同一な方法でＤＰＰＨラジカル消去活性を測定した。ここで、合成抗酸化剤のＢＨＡ（タート−ブチル−４−ヒドロキシアニソール）及びα−トコフェロールを陽性対照群に使用した。
【００７１】
その結果、フェノール酸及びフラボノイド化合物等が濃度依存的に強いラジカル消去活性を示した。スチルベン化合物も比較的強いラジカル消去活性を示した。特に、没食子酸を始めとするガロイルエステルが強い活性を示した。詳細には化学式６（没食子酸）、化学式７（没食子酸メチル）、化学式８（没食子酸エチル）、化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）及び化学式１３（ミリセチン−３−Ｏ−（２−Ｏ−ガロイル）−ａ−Ｌ−ラムノピラノシド）のＩＣ５０値は、各々５．１±０．４、５．３±０．３、７．０±１．１、６．８±０．５、６．７±０．４及び８．６±０．７ｇ／ｍｌで前記化合物間に顕著な活性の差は無かったが、これらの化合物すべてが陽性対照群に使用したα−トコフェロール（ＩＣ５０ ２５．４±０．９ｇ／ｍｌ）及びＢＨＡ（ＩＣ５０ １５．３±０．６ｇ／ｍｌ）より顕著に強いラジカル消去活性を示した（表３）。
【００７２】
ベンゼン環のｏｒｔｈｏ−位置に電子供与グループ（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｏｎａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）が置換されているとフェノキシラジカルを容易に安定化させられるため、ラジカル消去活性が増加するものと知られている（Ｃｕｖｅｌｉｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈ．，Ｂｅｒｓｅｔ，Ｃ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２年，第５６巻，３２４−３２５頁；Ｋｉｋｕｚａｋｉ，Ｈ．，等，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２００２年，第５０巻，２１６１−２１６８頁）。ガロイルグループの場合３個のヒドロキシルグループが鄰接した位置に置換されていて効果的にフェノキシラジカルを安定化させられるため強力なラジカル消去活性を示すものと思料される。表３に示したようにガロイルエステル以外にも化学式１６（（＋）−カテキン）、化学式９（ミリセチン）、化学式１０（アフゼリン）、化学式１１（ケルシトリン）、化学式１２（ミリシトリン）等のフラボノイド系化合物も強いラジカル消去活性を示した。これは、フラボノイド構造中に生成されたフェノキシラジカルを効果的に安定化させられるフェノリック置換基が存在するためと考えられる。即ち、電子供与能力が大きい置換基を有する化合物であるほどラジカル消去活性が増加する結果を示す。これは、ペッカリネン（Ｐｅｋｋａｒｉｎｅｎ）等の報告と一致した（Ｐｅｋｋａｒｉｎｅｎ，Ｓ．Ｓ．，等，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９９９年，第４７巻，３０３６−３０４３頁）。
【００７３】
（表３）
【００７４】
実施例３：脂質過酸化抑制活性（Ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ）測定
本発明者らは、前記実施例１で分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物の抗酸化活性を測定するために脂質過酸化抑制活性を測定した。脂質の酸化は、脂質過酸化物（ｌｉｐｉｄ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ）、コンジュゲートされた脂肪酸（ＨＯＤＥｓ）、エポキシ脂肪酸、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、４−ヒドロキシノネナル（４−ｈｙｄｒｏｘｙｎｏｎｅｎａｌ，４−ＨＮＥ）等の酸化物を生成させ細胞を構成する生体膜を直接損傷させたり他の細胞構成成分と２次的な反応を起こしたりして、様々な退行性疾患及び老化過程の重要な原因として知られている（Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｈ．等，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，１９９１年，第１１巻、８１−１２８頁；Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ，Ｈ．，Ｃｈｅｅｓｅｍａｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９０年，第１８６巻，４０７−４２１頁；Ｊｉｒａ，Ｗ．，等，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ，１９９６年，第８４巻，１６５−１７３頁；Ｊｉｒａ，Ｗ．等，Ｂｉｏｓｃｉ，１９９８年，第５３巻，１０６１−１０７１頁）。一般的に、ミトコンドリアやミクロゾーム等の細胞内電子伝達系で生成されたスーパーオキシドラジカルは、体内酵素反応を通じてＨ２Ｏ２に転換され、それが再びカタラーゼやグルタチオンペルオキシダーゼのような酵素により毒性がない物に変換される。しかし、色々な要因により体内活性酸素が多く生成されるとＨ２Ｏ２はフェントン（Ｆｅｎｔｏｎ）反応（Ｆｅ２＋＋Ｈ２Ｏ２→Ｆｅ３＋＋ＨＯ・＋ＨＯ−）やメタルカタライズされたハーバーウエイス反応（ｍｅｔａｌ−ｃａｔａｌｙｓｅｄ Ｈａｂｅｒ−Ｗｅｉｓｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｏ２−＋Ｈ２Ｏ２→Ｏ２＋ＨＯ・＋ＨＯ−）を通じて反応性が大きいヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）を発生させ脂質過酸化物を生成させ、これが再び体内 金属イオンと反応して脂質ラジカル（Ｌ・）や脂質ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）を誘導して脂質過酸化連鎖反応を起こすものと良く知られている（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂ．，Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｍ．Ｃ．，Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９９年；Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂ．，Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｍ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９９９年，第２１９巻，１−１４頁；Ｈａｒｍａｎ，Ｄ．，Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ．Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６年，３−４９頁；Ｓｔａｄｔｍａｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｒ．Ｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００年，第８９９巻，１９１−２０８頁）。それで、電子供与能力を有する化合物は、結果的に脂質の過酸化を抑制できるものと受け入れられている。
【００７５】
脂質過酸化抑制活性を測定することは、Ｆｅ２＋／アスコルビン酸反応系により最終生成されたヒドロキシルラジカル（ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ）が脂質を酸化させて生成するマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）をチオバルビツール酸（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ，以下「ＴＢＡ」と略称する）と反応させ分光学的方法で定量することである。詳細には、化学式１乃至化学式２０で表される化合物試料各々１０μｌと１０ｍｇタンパク質／ｍｌ濃度のネズミの脳均質化物（Ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）５０μｌ及び５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ７．４）７４０μｌを混合した後、０．１ｍＭ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ２と１ｍＭアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）混合液２００μｌを入れて３７℃で３０分間反応させた。前記反応液に２０％トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ，以下「ＴＣＡ」と略称する）（Ｓｉｇｍａ）２５０μｌを加えて反応を停止させた後、１％ＴＢＡ（Ｓｉｇｍａ）２５０μｌを加えて１００℃で１０分間反応させた。前記反応液を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、５３２ｎｍで吸光度を測定した。各試料の脂質過酸化抑制活性は、下記の数式２により算出した。脂質過酸化反応を５０％抑制する濃度をＩＣ５０とした。比較群には、α−トコフェロール及びＢＨＡを使用し、対照群には試料及び溶液を何も添加していないものを使用した。
【００７６】
＜数式２＞
脂質過酸化抑制活性（％）＝（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｓａｍｐｌｅ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）×１００
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：試料を添加していない対照群の吸光度
Ａｓａｍｐｌｅ：試料を添加した反応群の吸光度
Ａｂｌａｎｋ：試料、ＴＣＡ及びＴＢＡ溶液を添加していない吸光度
【００７７】
その結果、フラボノイド系、スチルベン系及びフェノール酸系化合物が濃度依存的に強い脂質過酸化抑制活性を示した。特に、スチルベン系の化学式５（ピセアタンノール）は、ＩＣ５０値が０．０９±０．０１ｇ／ｍｌで強力な脂質過酸化抑制剤として知られているＢＨＡ（ＩＣ５０ ０．１１±０．０２ｇ／ｍｌ）と同じ程度の強い活性を示した。また、活性を検索した大部分のフラボノイド系化合物が強い脂質過酸化抑制活性を示した。詳細には、化学式９（ミリセチン）、化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１１（ケルシトリン）、化学式１２（ミリシトリン）及び化学式１３（ミリセチン−３−Ｏ−（２−Ｏ−ガロイル）−ａ−Ｌ−ラムノピラノシド）のＩＣ５０値が各々０．９５±０．０６、２．９±０．０６、１．０±０．０８、６．２１±０．４０、５．２７±０．３２及び４．７３±０．４１ｇ／ｍｌと現れ、陽性対照群に使用したα−トコフェロールより顕著に強い脂質過酸化抑制活性を示した（表４）。脂質過酸化抑制活性の場合も前記実施例２で実施したＤＰＰＨラジカル消去活性結果と同じく、ベンゼン環に電子供与グループが多く置換されているほどフェノキシラジカルを容易に安定化させるので活性が増加すると思料された。特に、フラボノイド系化合物の構造は、効果的にフェノキシラジカルを安定化させるだけではなく金属イオンをキレート化させられるため強力な脂質過酸化抑制活性を示すものと思料される。
【００７８】
（表４）
【００７９】
実施例４：ヒドロキシルラジカル消去活性（Ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）及びニトリックオキシド（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）消去活性測定
ヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）は、体内金属イオンまたはスーパーオキシドラジカルと反応して生成される。反応性がとても高く直接的に体内タンパク質、脂質及びＤＮＡの酸化的損傷を起こすものと知られている。ニトリックオキシド（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ，ＮＯ・）もまたスーパーオキシドラジカルと反応して反応性が強いフェノキシニトラート（ＯＮＯＯ−）を生成することによりヒドロキシルラジカルと似た作用を示すものと知られている（Ｙａｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２０００，２９：１１４３−１１５０）。それで、本発明者らは、前記実施例１で分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物の抗酸化活性を測定するためにハリウェルの方法（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ，Ｂ．等，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７，１６５，２１５−２１９）にしたがってヒドロキシルラジカル除去活性を測定した。詳細には、化合物をＤＭＳＯに溶解した試料１０μｌ、リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．４）、デオキシリボース（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）５．６ｍＭ、ＦｅＣｌ３ ０．１ｍＭ、Ｈ２Ｏ２ １ｍＭ及びアスコルビン酸０．１ｍＭを混合して１ｍｌになるようにして３７℃で６０分間反応させた。前記反応液に２０％ＴＣＡ２５０μｌ及び１％ＴＢＡ溶液（５０ｍＭ ＮａＯＨに溶解）２５０μｌを添加して９５℃で５分間熱反応させた。前記反応後、５３２ｎｍで吸光度を測定した。ヒドロキシルラジカル消去活性は、下記の数式３によって計算した。陽性対照群にはＢＨＡ及びα−トコフェロールを使用した。
【００８０】
＜数式３＞
ヒドロキシルラジカル消去活性（％）＝（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｓａｍｐｌｅ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）×１００
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：対照群ウェルの吸光度
Ａｓａｍｐｌｅ：試料を添加した反応群ウェルの吸光度
Ａｂｌａｎｋ：試料、ＴＣＡ及びＴＢＡ溶液を添加していないウェルの吸光度
【００８１】
ヒドロキシルラジカル消去活性を検索した結果、フラボノイド系、スチルベン系及びフェノール酸系化合物は、対照群と比較して１２．７乃至５４．０％程度の消去活性を示した。特に、化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式７（没食子酸メチル）、化学式８（没食子酸エチル）及び化学式１３（ミリセチン−３−Ｏ−（２−Ｏ−ガロイル）−ａ−Ｌ−ラムノピラノシド）等ガロイルグループが置換された化合物が強いヒドロキシルラジカル消去活性を示した（表５）。
【００８２】
また、ニトリックオキシド消去活性を検索した結果、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１６（（＋）−カテキン）、化学式９（ミリセチン）等が比較的強い活性を示した（表５）。
【００８３】
（表５）
【００８４】
実施例５：スーパーオキシドラジカル消去活性（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ）測定
スーパーオキシドラジカル（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ，Ｏ２−）自体は、反応性が比較的弱いが、簡単にＨ２Ｏ２に変換され結局、反応性が強いヒドロキシルラジカルを生成したり、ニトリックオキシド（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ，ＮＯ・）と反応したりして反応性が強いフェロキシニトラート（ｐｅｒｏｘｙ ｎｉｔｒｉｔｅ，ＯＮＯＯ−）を生成してＳＨ−グループの酸化、タンパク質チロシンの硝酸化（ｎｉｔｒａｔｉｏｎ）、脂質過酸化、ＤＮＡ損傷等を起こす原因になる。それで、前記実施例１で分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物の抗酸化活性を確認するために他の有害活性酸素類の前駆物質に作用するスーパーオキシドラジカル（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｒａｄｉｃａｌ，Ｏ２−）の消去活性を測定した。スーパーオキシドラジカル消去活性は、スーパーオキシドを不均化（ｄｉｓｍｕｔａｔｉｏｎ）させることによりスーパーオキシドを消去する酵素のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の活性を測定して検索できる。本発明では、キサンチン／キサンチン酸化酵素（ｘａｎｔｈｉｎｅ／ｘａｎｔｈｉｎｅ ｏｘｉｄａｓｅ）の酵素反応によるスーパーオキシド発生系及びニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏ ｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，以下「ＮＢＴ」と略称する）が還元されホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）が生成される反応（ＮＢＴ＋２Ｏ２−→ＮＢＴＨ２＋２Ｏ２）に対する試料の抑制程度を測定した。詳細には、９６ウェルプレートに４ｍＭキサンチン（ｘａｎｔｈｉｎｅ，Ｓｉｇｍａ）５０μｌ、２５０ｍＭ ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ）５０μｌ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）５０μｌ及び試料１０μｌを入れた後、キサンチン酸化酵素（Ｓｉｇｍａ）４０μｌを入れて反応させた。前記反応後、時間別に各反応液を集めてＥＬＩＳＡ測定機で５５０ｎｍで吸光度を測定した。各試料のスーパーオキシドラジカル消去活性は、下記の数式４に示したように対照群に対するＮＢＴの還元減少程度として算出した。スーパーオキシドラジカルを５０％消去させる試料の濃度をＩＣ５０とした。陽性対照群には、α−トコフェロール及びカフェー酸（ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）を使用して抗酸化効果を比較した。
【００８５】
＜数式４＞
スーパーオキシドラジカル消去活性（％）＝（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｓａｍｐｌｅ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ−Ａｂｌａｎｋ）×１００
Ａｃｏｎｔｒｏｌ：試料を添加していない対照群ウェルの吸光度
Ａｓａｍｐｌｅ：試料を添加した反応群ウェルの吸光度
Ａｂｌａｎｋ：試料、ＴＣＡおよびＴＢＡを添加していないウェルの吸光度
【００８６】
その結果、フラボノイド系、スチルベン系及びフェノール酸系化合物が濃度依存的に強いスーパーオキシドラジカル消去活性を示した。特に、フラバン−３−オル（ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ）の化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）及び化学式１５（ミリセチン−３−Ｏ−（２−Ｏ−ガロイル）−ａ−Ｌ−ラムノピラノシド）のＩＣ５０値は、各々１１．９±２．１、２４．０±３．５及び１３．２±２．５ｇ／ｍｌで、強力なスーパーオキシドラジカル消去剤として知られているカフェー酸（ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＩＣ５０ １１．０±１．８ｇ／ｍｌ）と同等の強い活性を示した。また、フラボノイド系及びフェノール酸系化合物が強いスーパーオキシドラジカル消去活性を示した。化学式９（ミリセチン）、化学式１６（（＋）−カテキン）、化学式７（没食子酸メチル）及び化学式８（没食子酸エチル）のＩＣ５０値は、各々１２．１±１．１、１６．５±２．０、１６．５±１．４及び１５．８±１．６ｇ／ｍｌ程度の強い活性を示した。しかし、カルコン系化合物の場合は、比較的活性が弱く現れた。スーパーオキシドラジカル消去活性の場合も、スーパーオキシドと反応して生成されたフェノキシラジカルを容易に安定化させられる構造を有する化合物が良い活性を示した。特に、ガロイルグループが置換された化合物が強い活性を示すことが確認された（表６）。
【００８７】
（表６）
【００８８】
実施例６：ｔ−ブチル過酸化物で誘導される酸化的損傷に対する細胞保護活性
ｔ−ブチル過酸化物は、細胞に入って自由ラジカル中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）で代謝され脂質過酸化を誘発させ、結局細胞損傷を起こすものと知られている。このような現象は、細胞と組織で起きる酸化的ストレスと類似していて、実質的な意味で酸化的ストレスによる老化抑制を評価できる有用な方法である。新生児表皮細胞のＨＥＫ−Ｎ／Ｆ細胞にｔ−ブチル過酸化物１．５ｍＭを３時間処理した結果、細胞の生存率が１１．２±１．２％程度に顕著に減少した反面、分離された化合物を５０．０ｇ／ｍｌの濃度で共に処理した時には、顕著な細胞保護活性を示した。特に、化学式５（ピセアタンノール）を併用処理した時、細胞生存率が８４．７±６．９％で最も強い活性を示した。化学式９（ミリセチン）、化学式１１（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）等のフラボン３−オル化合物も各々６１．０±４．５％と４８．１±５．７％の細胞生存率を示した。また、化学式６（没食子酸）、化学式７（没食子酸メチル）、化学式８（没食子酸エチル）等も各々４１．５±３．１％、４３．０±５．６％、４３．１±４．１％程度の細胞保護活性を示した。前記結果を通じて本発明のハナズオウ抽出物から収得した化合物は、細胞の酸化的ストレスを効果的に抑制して過酸化による細胞死滅を抑制することにより、酸化的ストレスによる老化を抑制できることを確認した。
【００８９】
（表７）
【００９０】
実施例７：ＵＶ照射で誘導される酸化的ストレスに対する保護活性
＜７−１＞ＵＶ照射に対する細胞保護効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ＵＶ照射は、細胞内活性酸素を顕著に増加させＤＮＡ損傷、ＤＮＡ−タンパク質連結等を誘発する。ＨＥＫ−Ｎ／Ｆ細胞に３５ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射すると、核のＤＮＡ 鎖が切れる。これをＤＮＡ鎖インターキレーティング（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）蛍光染料のエチジウムホモダイマー（Ｅｔ２）と結合させた後、蛍光の強さを測定することにより定量した。詳細には、ＨＥＫ−Ｎ／Ｆ細胞を無血清ＫＧＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）に入れ培養した後、２４−ウェルプレートに０．５乃至４×１０４細胞数／２ｃｍ２になるように接種した。細胞を１８時間培養した後、２時間試料を処理した。ＰＢＳで洗浄した後、ＵＶ検出器（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ＵＶ ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ ＥＢＦ−２６０，ｔｈｅ ｍａｘｉｍａｌ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ，３１２ｎｍ；ａ ｈａｌｆ−ｐｅａｋ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｒａｎｇｅ，２９７−３２８ｎｍ）を使用して細胞にＵＶを照射した。ＵＶ照射した細胞を１−７時間培養して５Ｍエチジウムホモダイマー（Ｅｔ２，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を投与した。３０分後、ミリポレマイクロプレートフルオロメーターサイトフルオア２３５０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ ２３５０，ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：４８５ｎｍ，ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６４５ｎｍ）を使用して蛍光を測定した。
【００９１】
その結果、図６ａ及び図６ｂに示したように、ハナズオウ抽出物、化学式９（ミリセチン）及び化学式５（ピセアタンノール）を処理した時には、対照群の蛍光より各々５４．７％及び６６．７％程度低い蛍光を示した。即ち、ハナズオウ抽出物及びそれから分離した活性成分は、ＵＶによる酸化的ストレスを抑制してＤＮＡ損傷を顕著に減少させた。
【００９２】
＜７−２＞ＵＶ照射に対する皮膚組織保護効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
５−６週齢のメス無毛ネズミ（ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍｏｕｓｅ，ＳＫＨ−ｈｒ−１）を温度２４±２℃、相対湿度５０±１０％、昼夜１２時間のサイクルで１４日程度適応させた後、実験に使用した。実験の３０−６０分前に試料を無毛ネズミの５地点に皮下注射した後、ネズミの背にＵＶＢを照射した。次に２０×１５×５ｃｍケージにグループ当り５匹のネズミを入れて１５ｃｍの距離からＵＶランプ（ＨＰ−１５Ｍ，２８０−４００ｎｍ，ｍａｘ．３１２ｎｍ；Ａｔｔｏ Ｃｏ．，日本）で、一平方メーター当り１５ｋＪになるようにＵＶＢを照射した。ＵＶを２４時間照射した後、背側の皮膚を切取り過酸化測定時まで−７０℃で保管した。
【００９３】
ＵＶＢ照射は、皮膚組織に顕著な脂質過酸化を誘発させるため、過酸化された脂質の含量を測定することにより皮膚の損傷程度を測定できる。それで、脂質過酸化を測定した。詳細には、ＳＫＨ−１無毛ネズミの背表面にＵＶＢを照射して４８時間後に背の皮膚組織を切取りチオバルビツール酸（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ，ＴＢＡ）法で脂質過酸化を測定した。無毛ネズミの背側皮膚を１０倍の５０ｍＭ Ｋ−Ｐ緩衝液に入れた後、均質化（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｉｏｎ）させた。
【００９４】
次に、ハイドロゲンペルオキシド化を観察した。冷凍した背の皮膚切片を１ｍｇ／ｍｌグルコースと１ｍｇ／ｍｌジアミノベンジジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ＤＡＢ）を含有する０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に入れて３７℃で５乃至６時間培養した。蒸溜水で洗浄した後、２％メチルグリーン（ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｅｅｎ）で６０分間染色した。顕微鏡で茶色のＤＡＢ−ペルオキシダーゼと青色に染色された核を観察した。
【００９５】
ＵＶ照射は、皮膚組織に活性酸素種の生成を誘導してＤＮＡ損傷、タンパク質の酸化、脂質過酸化等を誘発させ、結局、炎症や癌、皮膚老化のような皮膚の損傷を起こすものと知られている。図７に示したように９０ｍＪ／ｃｍ２でＵＶＢを照射した時には顕著な皮膚損傷が観察された。しかし、ハナズオウ抽出物及び化学式５（ピセアタンノール）を５０ｍｇ／ｋｇの濃度で前処理した時には、ＳＫＨ−１無毛ネズミの皮膚損傷が顕著に抑制された。前記実施例の結果から分かるように、ハナズオウ抽出物及びその活性成分である化学式５（ピセアタンノール）は、強力なラジカル消去活性、脂質過酸化抑制活性及び酸化的ストレスに対する皮膚細胞の保護活性を示したので、ＵＶＢ照射で誘導される皮膚損傷に対する保護効果は、このような抗酸化活性に起因したものと思料された。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）は、組織のペルオキシダーゼと反応して濃い茶色のＤＡＢ−ペルオキシダーゼを生成するので、これを使用してＵＶＢ照射により生成されるＨ２Ｏ２を観察した。図７に示したように９０ｍＪ／ｃｍ２でＵＶＢを照射した時には、濃い茶色のＤＡＢ−ペルオキシダーゼが多く観察されたが、ハナズオウ抽出物及び化学式５（ピセアタンノール）を５０ｍｇ／ｋｇの濃度で前処理した時には、ＳＫＨ−１無毛ネズミの皮膚組織でＨ２Ｏ２生成が顕著に抑制された。
【００９６】
脂質過酸化を測定した結果、ＵＶＢを照射した群の平均ＴＢＡＲＳ（ｔｈｉｏｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）含量は、約０．６８ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質で、ＵＶＢを照射していない対照群（０．３２±０．０５ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質）に比べて２倍程度脂質過酸化が起きた（表８）。ハナズオウ抽出物及び化学式５（ピセアタンノール）を処理した群は、濃度依存的に皮膚の脂質過酸化が減少した。特に、化学式５は同じ濃度で陽性対照群に使用したＭＡＰ（マグネシウム−Ｌ−アスコルビル−２−ホスファート）よりも高い活性を示した。
【００９７】
（表８）
【００９８】
実施例８：細胞寿命に対する延長効果
ＨＥＫ−Ｎ／Ｆ細胞は、皮膚のまた他の主成分である繊維芽細胞をウリジンブロマイド（ｕｒｉｄｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ）で処理した後、ヒト新生児表皮から得て、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。ＨＥＫ−Ｎ／Ｆ細胞は、１：４の希釈比率で連続的に培養した。試料を処理する前に約３のＰＤＬ（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ）になるまで成長させ、以後培養の間各々の試料を３ｇ／ｍｌの濃度で投与した。培地交換は、同一濃度の試料を含む培養液を添加して３日毎に行なった。細胞培養後、本発明のハナズオウ抽出物、化学式５（ピセアタンノール）及び化学式９（ミリセチン）を処理して細胞分裂を観察した。
【００９９】
その結果、ハナズオウ抽出物及び活性成分は、皮膚細胞の寿命を延長させるものと現れた。なにも処理していない対照群は、平均寿命が約３５日であるのに反してハナズオウ抽出物を３μｇ／ｍｌずつ処理して培養した時には、平均寿命が４２日程度に、対照群に比べて約１．２培程度寿命が延長された。活性成分の化学式９（ミリセチン）と化学式５（ピセアタンノール）を処理して培養した時には、平均寿命が各々５６日と７６日に、対照群に比べて各々１．６培及び２．１培程度細胞の寿命が延長された（図８）。したがって、本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した活性成分は、細胞寿命延長効果を有していることが分かった。
【０１００】
実施例９：テロメアの長さと細胞寿命に対する延長効果
前記実施例８で本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した活性成分は、細胞寿命延長効果を有することを確認した。それで、細胞寿命延長効果とテロメアの長さとの関係を調べた。詳細には、ゲノミックＤＮＡは、ヘキサン抽出キット（ＩｓｏＱｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，ＯＲＣＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を使用して各々の年齢の細胞から抽出した。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して４℃で保存した。１．５ｍｌチューブに１０×Ｈ緩衝液（ＴａＫａＲａ）２μｌ、前記で抽出したゲノミックＤＮＡ溶液２μｌを入れて３次蒸溜水を入れ全体を１９μｌになるようにした後、制限酵素Ｈｉｎｆ Ｉ（６Ｕ／ｌ，ＴａＫａＲａ）１μｌを添加した。前記混合液を３７℃で３乃至４時間反応させた後、電気泳動をさせた。電気泳動時にアガロース（ｔｙｐｅ Ｉ，Ｓｉｇｍａ）ゲルは、ブリッジ部分が１％、ベッド部分が０．８％になるようにゲル濃度を調節してゲル板を製作し（マリソルＫＳ−８４０５，２０×１４ｃｍ）、１×ボイアー緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭ 酢酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１８ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を使用した。マーカーには、１Ｋｂ ＤＮＡラダーを使用して０．５μｇをローディングした。すべてのサンプルは、ローディングバッファー３μｌずつを入れて３５Ｖ／ｃｍで２０時間電気泳動を実施した。電気泳動が完了した後、エチジウムブロマイド（２μｇ／ｍｌ）で１５分間染色してＵＶで確認した。続けてゲルを０．２５Ｎ ＨＣｌに入れて１５分間振盪した後、蒸溜水で２回洗浄した。そのゲルを変性液（０．２Ｎ ＮａＯＨ、０．６Ｍ ＮａＣｌ）に浸けて室温で２５分間振盪した後、蒸溜水で３回洗浄した。６×ＳＳＣを満したブロッティング（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）装置にニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｏｐｔｉｔｒａｎ ＢＡ−Ｓ８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌ）、３ｍｍろ紙、ペーパータオル、ガラス板、重り（２ｋｇ）の順序でのせて一晩中ブロッティングさせた。ブロッティングが完了した後に膜フィルターを３×ＳＳＣに浸けて軽く水分を除去した後、ＵＶでウェルの位置を確認した。ろ紙に挿して８０℃で一晩べーキング（ｂａｋｉｎｇ）して６５℃で変性された鮭精子（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡ（Ｗａｋｏ）で前混成化（ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）させた後、５０℃で混成緩衝液（１×Ｄｅｎｈａｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，１Ｍ ＮａＣｌ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ ＳＤＳ，５０ｇ／ｍｌ ｄｅｎａｔｕｒｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ）と５’−末端［３２Ｐ］−標識された（ＴＴＡＧＧＧ）４で混成化させた。混成化された膜を洗浄液（４×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ）に浸けて５５℃で１５分振盪した後、乾燥させラップで覆いＸ−線フイルム（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｆｉｌｍ，Ｋｏｄａｋ）と共に増感紙を付けたカセットにセットして−８０℃で一晩中同位元素現象（ａｕｔｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｙ）を実施した。現像したフイルムと膜の位置を合わせてマジックでウェルの位置を表示した。ＴＲＦｓの密度ピークをレーザーデンシトメーター（ｌａｓｅｒ ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ ＵｌｔｒｏＳｃａｎ ＸＬ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で検出して、その移動度を算出した。
【０１０１】
その結果、細胞分裂をするにしたがってテロメアの長さが漸進的に減少することを観察できた。図９に示したように、対照群は１４．８回分裂した後のテロメアの長さが約８．０ｋｂｐ程度に減少してそれ以上分裂できなかった。反面、ハナズオウ抽出物や活性成分を処理した群は、対照群に比べてずっと多くの分裂をした後にテロメアの長さが臨界値（本発明では、約８．０ｋｂｐ）に到達した。細胞分裂は、テロメリックＤＮＡが臨界値（ヒト皮膚表皮細胞は、７．９−８．４ｋｂであると推定）以上に維持される限り継続可能だった。このような観点からテロメアが短縮される速度を遅延させ臨界値に到達する速度を遅らせることにより細胞分裂能力が終了する周期を延長させられるものと現れた。即ち、対照群の最大ＰＤＬは、１４．１であるのに反してハナズオウ抽出物を投与した時には最大ＰＤＬが１７．２、化学式９（ミリセチン）は２３．１、化学式５（ピセアタンノール）は２９．９で、最大ＰＤＬが顕著に増加した。
【０１０２】
また、細胞分裂回数と前記測定したテロメアの長さの関係からテロメア短縮速度を計算した結果、ハナズオウ抽出物、化学式９（ミリセチン）及び化学式５（ピセアタンノール）を投与した群のテロメア短縮速度は、対照群に比べて各々１．２、１．６及び２．１倍ずつ遅れたことを確認した（図１０）。したがって、ハナズオウ抽出物及び活性成分の皮膚細胞寿命延長効果は、テロメア短縮速度を遅らせることにより現れた結果であると思われた。
【０１０３】
製剤例１：ハナズオウ抽出物を含む化粧料組成物の製造
本発明者らは、前記ハナズオウ抽出物を有効成分として含む化粧料組成物（製剤１乃至製剤６）を下記表９乃至表１１のように製造した。また、下記製造例に含まれたハナズオウ抽出物以外にも通常的に化粧品を製造するのに使用できる他の抽出物が追加に含まれ得る。その例として、桑白皮、褐藻、当帰、ハトムギ、牧丹皮、馬歯、柿の葉、アメリカマンサク（witch hazel）及びセンテラ（centella）抽出物等がある。
【０１０４】
まず、本発明のハナズオウ抽出物を含む柔軟化粧水及び粘稠性液を下記表９に記載した組成により通常の方法で製造した。
【０１０５】
（表９）柔軟化粧水及び粘稠性液の製造
【０１０６】
次に、本発明のハナズオウ抽出物を含む乳液及びローションを下記表１０に記載した組成により通常の方法で製造した。
【０１０７】
（表１０）乳液及びローションの製造
【０１０８】
次に、本発明のハナズオウ抽出物を含むクリームを下記表１１に記載した組成により通常の方法で製造した。
【０１０９】
（表１１）クリームの製造
【０１１０】
製剤例２：抗酸化及び老化抑制用薬学的組成物の製造
本発明者らは、前記ハナズオウ抽出物を有効成分として含む、抗酸化用及び老化抑制用薬学的組成物を下記のように製造した。
【０１１１】
＜２−１＞シロップ剤の製造方法
本発明のハナズオウ抽出物を有効成分として２％（重量／体積）で含むシロップを下記の方法で製造する。
【０１１２】
ハナズオウ抽出物、サッカリン、糖を温水８０ｇに溶解させた。この溶液を冷却させた後、そこにグリセリン、サッカリン、香味料、エタノール、ソルブ酸及び蒸溜水からなる溶液を製造して混合した。この混合物に水を添加して１００ｍｌになるようにした（表１２）。
【０１１３】
（表１２）
【０１１４】
＜２−２＞錠剤の製造方法
有効成分１５ｍｇを含有した錠剤は、下記の方法で製造する。
【０１１５】
ハナズオウ抽出物２５０ｇ、ラクトース１７５．９ｇ、ジャガイモ澱粉１８０ｇ及びコロイド性硅酸３２ｇと混合した。前記混合物に１０％ゼラチン溶液を添加した後、粉砕して１４メッシュを通過させた。それを乾燥させてジャガイモ澱粉１６０ｇ、滑石５０ｇ及びステアリン酸マグネシウム５ｇを添加して得られる混合物を錠剤にした（表１３）。
【０１１６】
（表１３）
【０１１７】
以上で詳しく見たように、本発明のハナズオウ抽出物は、抗酸化活性が高いので、ハナズオウ抽出物を有効成分として含む薬学的組成物は、過酸化と関係した疾患の治療及び予防に使用できる。
【０１１８】
以下、本発明のハナズオウ抽出物を含む薬学的組成物が適用できる具体的な疾患に対して説明する。
【０１１９】
但し、下記の適用例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の適用例に限定されるものではない。
【０１２０】
適用例１：癌
癌は無数に多くの原因により起きるものだけれど、最も根本的な原因として活性酸素による細胞の破壊及びその復旧不能により細胞機能の障害を起こし、それが進行して癌に転移すると明らかにされている（Ａｍｅｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８３年，第２２１巻頁，１２５６−１２６４頁）。一方、果物にあるフェノール酸の肝癌に対する効果（Ｓｕｎ Ｊ等，Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２００２年，第４；５０（２５）巻，７４４９−７４５４頁）、トマトにあるリコフェン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ）の乳癌に対する効果（Ｈａｄｌｅｙ ＣＷ等，Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００２年，第２２７（１０）巻，８６９−８０頁）、イソベルバスコシド（ｉｓｏｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ）の胃癌に対する効果（Ｃｈｅｎ ＲＣ等，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ，２００２年，第２３（１１）巻，９９７−１００１頁）等、現在報告されている色々な抗酸化剤が他の癌にも効果がある。したがって、抗酸化剤は様々な種類の癌の治療及び予防に効果的に使用できることが分かり、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、癌の治療及び予防に効果的に使用できる。
【０１２１】
適用例２：老化
正常的な代謝過程で付随的に生成される活性酸素は、細胞構成成分の脂質、タンパク質、糖またはＤＮＡ等を非選択、非可逆的に破壊することにより酸化的損傷を与え、それが長い時間蓄積されると老化と死に至る（Ｈａｒｍａｎ，Ｄ，Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ａｇｉｎｇ，１９８６年，３−４９頁）。また、実験条件を変えて食餌を制限したり運動量を減少させる等基礎代謝率、即ち酸素消費量を減少させることにより寿命が延長されることが観察された（Ｍｅｄｖｅｄｅｖ，Ｚ．Ａ．，Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ．，１９９０年，第６５巻，３７５−３９８頁；Ｌｏｅ，Ｊ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７１年，第３２巻，１０３−１２１頁；Ｓｏｈａｌ，Ｒ．Ｓ．，Ａｇｉｎｇ，１９８２年，第５巻，２１−２４頁）。即ち、活性酸素を除去することが老化を遅延させられる方法であり、現在活性酸素を除去する抗酸化剤が多く開発されている。したがって、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、老化を遅延させられる。
【０１２２】
適用例３：冠状心臓疾患、高脂肪血症及び動脈硬化
冠状心臓疾患及び高脂肪血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）患者にコレステロール生合成酵素阻害剤を処理すると低密度脂肪にあるコレステロール含量を減少させるが、活性酸素による過酸化に対してはユビキノンＱ１０（ｕｂｉｑｕｉｎｏｎｅ Ｑ１０）の生合成を抑制して低密度脂タンパク質を保護する作用をして前記疾患の治療に効果的ではなく前記患者に抗酸化物質のセラビスタチン（ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）またはプロブコル（ｐｒｏｂｕｃｏｌ）を投与すると低密度脂タンパク質の含量が急撃に減少した（Ｌａｎｋｉｎ ＶＺ等，Ｂｕｌｌ Ｅｘｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００２年，第１３４（１）巻，３９−４２頁）。また、抗酸化剤のジヒドロピリジンカルシウム拮抗体ラシジピン（ｌａｃｉｄｉｐｉｎｅ）を動脈硬化患者に投与した臨床実験で血圧降下と共に血管壁のコレステロール数値を下げて動脈硬化病変の大きさが減少した（Ｈａｌｌｅｒ Ｈ等，Ｄｒｕｇｓ Ｒ Ｄ，２００２年，第３（５）巻，３１１−２３頁）。即ち、抗酸化物質は、冠状心臓疾患、高脂肪血症及び動脈硬化のようなコレステロールと関連した血管系疾患の治療及び予防において、優秀な物質であることが分かり、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、冠状心臓疾患、高脂肪血症及び動脈硬化のような血管系疾患の治療または予防に使用できる。
【０１２３】
適用例４：多発性硬化症及び自己免疫性脳脊髄炎
多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）及び自己免疫性脳脊髄炎（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）疾患モデルマウスに抗酸化剤の一種であるＡＬＡ（ａｌｐｈａ ｌｉｐｏｉｃ ａｃｉｄ）を投与した臨床実験で前記の病症度が弱まる現象を観察した。即ち、酸化的ストレスは、多発性硬化症及び自己免疫性脳脊髄炎において主な原因であり抗酸化剤を使用して前記のような神経関連疾患を治療できる（Ｍａｒｒａｃｃｉ ＧＨ等，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，２００２年，第１３１（１−２）巻，１０４−１４頁）。したがって、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、多発性硬化症及び自己免疫性脳脊髄炎のような神経関連疾患の治療または予防に使用できる。
【０１２４】
適用例５：脳卒中及びアルツハイマー病
酸化的ストレス、即ち、活性酸素は細胞の構成成分を酸化させそれらの機能障害をもたらし、それらの機能障害により神経細胞の機能にも障害を与える。このような神経細胞機能障害による発作（ｓｔｒｏｋｅ）、ショック（ｔｒａｕｍａ）等を起こすことになる。しかし、このような症状が治療されずに持続的な酸化的ストレスが与えられた場合、深刻な脳疾患、即ち、脳卒中、アルツハイマー病のような疾患が起きることになる。また、活性酸素を除去できる抗酸化剤を使用して脳卒中、アルツハイマー病のような脳疾患を治療できる（Ｐｅｒｒｙ Ｇ等，Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃ Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐｈａａｒｍａｃｏｌ，２００２年，第１３３（４）巻，５０７−１３頁；Ｃｅｃｃｈｉ Ｃ等，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００２年，第１５：３３（１０）巻，１３７２−９頁；Ｓｍｉｔｈ ＭＡ等，Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ，２００２年，第１：３３（９）巻，１１９４−９頁）。したがって、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、脳卒中、アルツハイマー病のような脳疾患の治療または予防に使用できる。
【０１２５】
適用例６：腸炎
腸炎患者の白血球には過量の過酸化副産物が蓄積されていて、蓄積された過酸化副産物による細胞の損傷は、腸の感染において一次的または二次的病理学メカニズムの原因である。即ち、酸化的ストレスは腸の感染を誘導して炎症性腸炎を起こす主な原因である（Ｋｒｕｉｄｅｎｉｅｒ Ｌ等，Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ，２００２年，第１６（１２）巻，１９９７−２０１５頁）。したがって、抗酸化活性が優秀な本発明の抗酸化用薬学的組成物は、炎症性腸炎等の炎症と関連した疾患の治療または予防に使用できる。
【０１２６】
産業上の利用可能性
前記で詳しく見たように、本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物は、合成抗酸化剤とは異り人体に無害で、他の天然抗酸化剤と比べて抗酸化活性が優秀で、細胞内酸化的ストレスを効果的に抑制するだけではなく、細胞老化と関連したテロメアの長さの短縮を抑制することにより皮膚細胞の寿命を延長させられるので、それを有効成分として含む本発明の化粧料組成物は、皮膚老化抑制、皮膚弾力保護、シワ改善のために有用に使用できる。
【０１２７】
当業者は、前述の記載により開示された概念および特定の態様が、本発明の同様の目的を実行するためのその他の態様の改変および設計の基盤として容易に利用されうることを、理解するであろう。当業者はまた、そのような同等の態様が、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の目的および範囲から逸脱しないことを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
本発明の好ましい態様の適用は、添付の図面を参照することで最も良く理解される。
【図１】ハナズオウからエタノール粗抽出物を得て、それをヘキサン、エチルアセテート、ブタノール順に抽出する過程を示した模式図である。
【図２】ハナズオウからエタノールを０％から順次的に１０％ずつ増やして１００％濃度まで抽出したエタノール粗抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性を測定したグラフである。
【図３】ヘキサン、エチルアセテート、ブタノール、水分画及びエタノール抽出物のＤＰＰＨラジカル消去活性を測定したグラフである。
【図４】エチルアセテート画分から抗酸化活性を示す化合物を分離する過程を示した模式図である。
【図５】ブタノール画分から抗酸化活性を示す化合物を分離する過程を示した模式図である。
【図６】ａは、本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物のＵＶ照射に対する細胞保護効果を示したＤＮＡ損傷程度を示した細胞写真である。ｂは、本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物のＵＶ照射に対する細胞保護効果を示したＤＮＡ損傷程度を示す蛍光の強さを示すグラフである。
【図７】本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物がＵＶ照射に対して保護効果を示すかどうかを確認した無毛ネズミの皮膚損傷写真である。
【図８】本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物が細胞寿命を延長させることを示したグラフである。
【図９】本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物がテロメアの長さの短縮速度を抑制するテロメアの長さのサダンブロット写真である。
【図１０】本発明のハナズオウ抽出物及びそれから分離した化合物がテロメアの長さ延長作用をすることを示したテロメア短縮速度のグラフである。
【図１１】ハナズオウの花、葉、茎及び実を示した写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抽出溶媒（extractant）として水またはアルコール水溶液を使用して抽出した、抗酸化活性、皮膚老化抑制活性、皮膚弾力保護活性およびシワ防止活性を有するハナズオウ（Cercis chinensis）抽出物。
【請求項２】
アルコール水溶液が、メタノール水溶液、エタノール水溶液、プロパノール水溶液及びブタノール水溶液からなる群から選択される、請求項１記載の抽出物。
【請求項３】
アルコール水溶液が、５０乃至８０％エタノール水溶液である、請求項２記載の抽出物。
【請求項４】
アルコール水溶液が、６０％エタノール水溶液である、請求項３記載の抽出物。
【請求項５】
前記抽出物が、化学式１（イソリキリチゲニン）、化学式２（２’，４’−ジヒドロキシ−４−メトキシカルコン）、化学式３（リキリチゲニン）、化学式４（リスベラトロール）、化学式５（ピセアタンノール）、化学式６（没食子酸）、化学式７（没食子酸メチル）、化学式８（没食子酸エチル）、化学式９（ミリセチン）、化学式１０（アフゼリン（afzelin））、化学式１１（ケルシトリン）、化学式１２（ミリシトリン）、化学式１３（ミリセチン−３−Ｏ−（２”−Ｏ−ガロイル）−α−Ｌ−ラムノピラノシド（ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、化学式１４（シリンゲチン−３−Ｏ−ルチノシド）、化学式１５（シリンゲチン−３−Ｏ−２”−Ｏ−ガロイル）−ルチノシド），化学式１６（（＋）−カテキン），化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１９（（−）−リオニレシノール３ａ−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシド）及び化学式２０（（＋）−リオニレシノール３ａ−Ｏ−β−Ｄ−グリコピラノシド）で表される化合物からなる群から選択される1つまたは複数の化合物を含む、請求項１記載の抽出物。
【請求項６】
前記抽出物が、化学式６で表される化合物を０．０１〜１．００重量％、化学式１２で表される化合物を０．０１〜１．００重量％、および化学式５で表される化合物を０．０１〜０．５重量％含む、請求項５記載の抽出物。
【請求項７】
請求項１の抽出物を有効成分として含む、抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用化粧料組成物。
【請求項８】
請求項１の抽出物から分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物からなる群より選択される1つまたは複数の化合物を有効成分として含む、抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用化粧料組成物。
【請求項９】
柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、エッセンス、パック及び風呂用パウダーのようなスキンケア基礎化粧品からなる群から選択される、請求項７または８に記載の化粧料組成物。
【請求項１０】
ハナズオウ抽出物を有効成分として含む、抗酸化用及び老化抑制用薬学的組成物。
【請求項１１】
注射剤、錠剤またはシロップ剤の形状で製造される、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
１）ハナズオウの微粉砕粉末をアルコールで粗抽出する工程；
２）前記工程１のアルコール粗抽出物をヘキサン、エチルアセテート、およびブタノールの順で抽出する工程；
３）前記工程２で得たエチルアセテート画分またはブタノール画分を用いて、エタノール：水の濃度勾配カラムクロマトグラフィーを実施する工程；及び、
４）前記工程３で得た抗酸化活性画分を用いてカラムクロマトグラフィー、ＴＬＣまたはＨＰＬＣを実施することにより最終抗酸化抽出物を得る工程を含む、請求項１記載のハナズオウ抽出物の製造方法。
【請求項１３】
アルコールが、６０％エタノールである、請求項１２記載の製造方法。
【請求項１】
抽出溶媒（extractant）として水またはアルコール水溶液を使用して抽出した、抗酸化活性、皮膚老化抑制活性、皮膚弾力保護活性およびシワ防止活性を有するハナズオウ（Cercis chinensis）抽出物。
【請求項２】
アルコール水溶液が、メタノール水溶液、エタノール水溶液、プロパノール水溶液及びブタノール水溶液からなる群から選択される、請求項１記載の抽出物。
【請求項３】
アルコール水溶液が、５０乃至８０％エタノール水溶液である、請求項２記載の抽出物。
【請求項４】
アルコール水溶液が、６０％エタノール水溶液である、請求項３記載の抽出物。
【請求項５】
前記抽出物が、化学式１（イソリキリチゲニン）、化学式２（２’，４’−ジヒドロキシ−４−メトキシカルコン）、化学式３（リキリチゲニン）、化学式４（リスベラトロール）、化学式５（ピセアタンノール）、化学式６（没食子酸）、化学式７（没食子酸メチル）、化学式８（没食子酸エチル）、化学式９（ミリセチン）、化学式１０（アフゼリン（afzelin））、化学式１１（ケルシトリン）、化学式１２（ミリシトリン）、化学式１３（ミリセチン−３−Ｏ−（２”−Ｏ−ガロイル）−α−Ｌ−ラムノピラノシド（ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、化学式１４（シリンゲチン−３−Ｏ−ルチノシド）、化学式１５（シリンゲチン−３−Ｏ−２”−Ｏ−ガロイル）−ルチノシド），化学式１６（（＋）−カテキン），化学式１７（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１８（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）、化学式１９（（−）−リオニレシノール３ａ−Ｏ−β−Ｄ−キシロピラノシド）及び化学式２０（（＋）−リオニレシノール３ａ−Ｏ−β−Ｄ−グリコピラノシド）で表される化合物からなる群から選択される1つまたは複数の化合物を含む、請求項１記載の抽出物。
【請求項６】
前記抽出物が、化学式６で表される化合物を０．０１〜１．００重量％、化学式１２で表される化合物を０．０１〜１．００重量％、および化学式５で表される化合物を０．０１〜０．５重量％含む、請求項５記載の抽出物。
【請求項７】
請求項１の抽出物を有効成分として含む、抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用化粧料組成物。
【請求項８】
請求項１の抽出物から分離した化学式１乃至化学式２０で表される化合物からなる群より選択される1つまたは複数の化合物を有効成分として含む、抗酸化用、皮膚老化抑制用、皮膚弾力保護用またはシワ防止用化粧料組成物。
【請求項９】
柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、エッセンス、パック及び風呂用パウダーのようなスキンケア基礎化粧品からなる群から選択される、請求項７または８に記載の化粧料組成物。
【請求項１０】
ハナズオウ抽出物を有効成分として含む、抗酸化用及び老化抑制用薬学的組成物。
【請求項１１】
注射剤、錠剤またはシロップ剤の形状で製造される、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
１）ハナズオウの微粉砕粉末をアルコールで粗抽出する工程；
２）前記工程１のアルコール粗抽出物をヘキサン、エチルアセテート、およびブタノールの順で抽出する工程；
３）前記工程２で得たエチルアセテート画分またはブタノール画分を用いて、エタノール：水の濃度勾配カラムクロマトグラフィーを実施する工程；及び、
４）前記工程３で得た抗酸化活性画分を用いてカラムクロマトグラフィー、ＴＬＣまたはＨＰＬＣを実施することにより最終抗酸化抽出物を得る工程を含む、請求項１記載のハナズオウ抽出物の製造方法。
【請求項１３】
アルコールが、６０％エタノールである、請求項１２記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００６−５１５５９０（Ｐ２００６−５１５５９０Ａ）
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６２９８６（Ｐ２００４−５６２９８６）
【出願日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００３／００２６５４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８２１３
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０５２４３３５３）ハンコック ファーム．カンパニー インコーポレーティッド (4)
【出願人】（５０５２４３３６４）ハンセン コスメチック カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月４日（２００３．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００３／００２６５４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５８２１３
【国際公開日】平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【出願人】（５０５２４３３５３）ハンコック ファーム．カンパニー インコーポレーティッド (4)
【出願人】（５０５２４３３６４）ハンセン コスメチック カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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