新規オリゴヌクレオチド、および脱色剤として、メラニン色素合成に含まれる酵素の発現を調節するオリゴヌクレオチドの使用
【課題】メラニン色素の合成経路に含まれる必須酵素の１つをコードする遺伝子および遺伝子転写物とハイブリダイズできる新規オリゴヌクレオチド配列、および／または、その誘導体を提供する。
【解決手段】チロシナーゼをコードする遺伝子もしくは遺伝子転写物、またはチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）をコードする遺伝子もしくは遺伝子転写物と特異的にハイブリダイズできる新規オリゴヌクレオチド配列。また、化粧用組成物または皮膚病用組成物における脱色剤または漂白剤としての、これらの新規オリゴヌクレオチド配列の使用。
【解決手段】チロシナーゼをコードする遺伝子もしくは遺伝子転写物、またはチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）をコードする遺伝子もしくは遺伝子転写物と特異的にハイブリダイズできる新規オリゴヌクレオチド配列。また、化粧用組成物または皮膚病用組成物における脱色剤または漂白剤としての、これらの新規オリゴヌクレオチド配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規オリゴヌクレオチド配列およびまた、その誘導体に関する。
【０００２】
これらの新規オリゴヌクレオチド配列は、メラニン色素の合成経路に含まれる必須酵素の１つをコードする遺伝子または遺伝子産物とハイブリダイズできる。
【０００３】
本発明は、化粧用組成物または皮膚病用組成物における皮膚の脱色剤または漂白剤として、これらの新規オリゴヌクレオチド配列の使用にも関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒトにおいて、色素沈着は、皮膚、毛包または眼におけるメラニン色素の合成と分配から生じる。色素沈着は遺伝的に予め定まっているが、多くの内的または外的因子によって調整される。メラノサイトによって産生されるメラニンやまた、メラノサイトの数、それらのチロシナーゼ活性やメラニンをケラチノサイトへ輸送するそれらの能力、およびメラニン顆粒を含むメラノソームの大きさは、ヒト皮膚の色の条件となるであろう。各個人について、皮膚の色は、紫外（ＵＶ）線からの照射の多かれ少なかれ有意量の関数として主として変動する。換言すれば、各個人について、ＵＶ照射の最小量を受けるときの基礎的皮膚色素沈着（それは、各個人の最も薄い皮膚色に対応する）、ＵＶ照射のより強い量を受けた場合のより強い皮膚の色素沈着、山の高度で出会いうるような強いＵＶ照射に持続した期間曝されるときの各個人の最も濃い皮膚色に対応する最大の色素沈着までの範囲が存在する。
【０００５】
さらに、周知のように、世界の人々において、皮膚色素沈着に関する非常に大きな遺伝的多様性が存在する。すなわち、集団により、上記に規定した基礎的色素沈着に対応する皮膚色は、２つの極端（すなわち、非常に薄いのと非常に濃い）の間に存在するより薄い肌色またはより濃い肌色を示す。また、集団により、基礎的色素沈着と最大色素沈着の間の皮膚の肌色における差異は、多かれ少なかれ重要である。すなわち、薄い皮膚（基礎的色素沈着）をもつある集団に属する個人は、ＵＶ照射作用に急速および／または著しく反応し、それ故、これらの個人が、持続した期間、故意に太陽に曝されなかったときでさえ、容易に濃い皮膚色を有し得ることは周知である。本明細書の残りの部分で、これらの個人は、表現「ＵＶ照射に非常に反応性のある個人」によって表される。これは、特に、アジア起源の集団または混合−人種集団と命名されたある集団について当てはまる。
【０００６】
さらに、個人によって、皮膚におけるより濃い、すなわちより色のついた部分の外観、または皮膚における斑点、特に顔と手における斑点（それは、皮膚にある種の不均一性を与える）が証明される。これらの斑点は、表皮のケラチノサイトにおけるメラニンのかなりの濃度によるものである。
【０００７】
皮膚色素沈着の形成の機構は、メラニン合成を含む。この機構は特に複雑であり、スキームとして、以下の主要ステップを含む。
【０００８】
【数１】
【０００９】
反応のこのシリーズに含まれることが知られる酵素は本質的にチロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）である。これらの酵素は、チロシンのドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）への変換の反応およびドーパのドーパキノンへの変換の反応を特に触媒し、メラニン色素形成を導く。これらの酵素は、メラニン形成の反応機構の間に、個々に含まれるようにはならない。事実、チロシナーゼとＴＲＰ−１は酵素複合体を形成する（Winderら、（1994） Cell. Mol. Biol. Res. 40:7-8； Orlowら、（1994） J. of Investigative Dermatology 103: 196-211）。それ故、これらの２つの酵素は、協奏的に作用し、互いの存在無くして決して機能しないように思われる。細胞がＴＲＰ−１欠失であるとき、チロシナーゼ活性の喪失が観察されることが知られ（Orlowら、（1994））、このことは、活性であるために、チロシナーゼはＴＲＰ−１の存在を必要とすることを意味する（Zhaoら、（1996） J. of Investigative Dermatology 106: 744-752）。
【００１０】
本明細書の残りの部分で、メラニンの合成経路に含まれるこれらの必須酵素は、表現「色素沈着に必須の酵素」によって表される。
【００１１】
表皮メラノサイトの活性を阻害することによって、表皮メラノサイトに直接的に作用するならば、および／またはメラニン生合成のステップの１つを阻止するならば、分子は、脱色分子であると認められる。これは特に、その分子がメラニン形成に含まれる酵素の１つを阻害するとき、そうであるか、またはその分子がメラニン合成鎖の化学化合物と反応するとき、そうである。
【００１２】
公知の脱色物質は特に、ヒドロキノンとその誘導体、アスコルビン酸とその誘導体、胎盤エキス、麹酸、フェルラ酸、アルブチン、ジヒドロキシベンゼン誘導体（WO 00/47045）、グアイアコール誘導体（WO 00/47179）、４−（２，３−ジヒドロキシフェニル）シクロヘキサノール（WO 00/56279）、レゾルシノール誘導体（WO 00/56702）およびフェノールアミド（WO 99/32077）である。これらの物質はある欠点を有し得る。それらは、不安定であり得、高濃度での使用を必要としえ、それらの作用モードに関し特異性を欠き得、または細胞毒性力もしくは刺激力を有し得る。
【００１３】
有効で無害の脱色物質の局所使用は特に、化粧品や皮膚病学において望ましい。該物質は特に、特発性黒皮症などのメラノサイト活動過剰による局所性色素過剰症、老年性色素斑点（老年性黒子）として知られる色素斑点などの、良性メラノサイト活動過剰と増殖による局所性色素過剰症、光感受性もしくは瘢痕性色素過剰症などの偶発性色素過剰症、および白斑（vitiligo）などのある種の白斑症（leukodermias）を治療するために用いられる。後者の場合には、皮膚を再び着色することは可能ではないので、脱色区域の縁の周りの色素沈着を、皮膚により均一な色を与えるように軽減させる。
【００１４】
脱色物質はまた、肌色、特に顔と手の肌色を明るくし、できるだけ薄い、もしくはできるだけ均一な皮膚色を保存するように、または少なくとも、ＵＶ線の色素沈着効果を減少させるように、ある個人、特にＵＶ照射に非常に反応性のある、上記の個人によって、皮膚の漂白剤としても使用される。
【００１５】
それ故、プロフェッショナルに直面する問題は、既知物質の欠点を持たない（すなわち、皮膚にとって非刺激性で、非毒性で、および／または非アレルギー性であり、組成物中で安定である）、ヒト皮膚、体毛、または頭髪のための新規脱色物質あるいは新規漂白剤の設計、製造または単離である。
【００１６】
メラノサイト機能不全による疾患、特に白斑や他の脱色疾患の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、WO 99/25819に記載されている。これらの病理的皮膚状態において、低色素症は、異常に高いテネイシン含量から生じる。該文献に記載されたオリゴヌクレオチドは、テネイシン発現を調節することによって、低色素症に対し作用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
一方、本発明の目的は、メラニン形成のプロセスに作用し、第１に、ほぼ均一な色素沈着の場合に、皮膚、体毛、もしくは頭髪を漂白する、すなわち、それらの色素沈着を減少させるように意図された、第２に、皮膚の色素過剰症（すなわち、皮膚が不均一な色素沈着を示すとき）と闘うように意図された脱色剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の発明者らは、オリゴヌクレオチドが、色素沈着に必須の酵素をコードする遺伝子、または（ＲＮＡなどの）遺伝子産物とハイブリダイズできることを見出した。
【００１９】
すなわち、メラノサイトにおける色素沈着に必須の酵素の発現を調節する本発明のオリゴヌクレオチドは、上記のメラニン形成反応の上流に含まれる。この活性は、非常に低濃度でさえ存在する。これは、これらのオリゴヌクレオチドの利点を増大させる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞毒性を示さない。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、通常使用される物質によって提出される問題に理想的な解決策を提供する。チロシナーゼまたはＴＲＰ−１の活性を阻害する公知の物質（特に、ヒドロキノンとその誘導体、アスコルビン酸とその誘導体、胎盤エキス、麹酸、およびアルブチン）は、それらの特異性の少なさのために多数の受け入れられない副作用を有する。それ故、本発明は、脱色効果を得るために、色素沈着に必須の酵素を直接阻害する代わりに、該酵素の産生を調節することによって、以前の研究者が出会った問題を解決する。
【００２１】
該必須酵素は、複合体の形態で協奏的に機能するので、本発明者らは、提出された問題を解決するために、複合体の酵素の一方または他方の発現を阻害する新規オリゴヌクレオチドを記載した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチドはそれ自体新規であり、医薬品として新規である。
【００２３】
本発明は、色素沈着に必須な酵素の１つをコードする遺伝子または遺伝子産物とハイブリダイズできる、７〜２５、好ましくは９〜２５、１２〜２５、１５〜２５または１８〜２５のヌクレオチド数を含むオリゴヌクレオチドに関する。特に、該オリゴヌクレオチドは、チロシナーゼをコードする遺伝子もしくは遺伝子産物、またはチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）をコードする遺伝子もしくは遺伝子産物とハイブリダイズできる。
【００２４】
より詳細には、本発明は、上記で規定された、そして、チロシナーゼをコードする遺伝子もしくは遺伝子産物またはＴＲＰ−１をコードする遺伝子もしくは遺伝子産物と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドに関する。
【００２５】
特に、それは、その配列が以下に示す配列番号１〜１１の配列から選択されるオリゴヌクレオチドである。
【００２６】
【化１】
【００２７】
本発明の主題はまた、その配列が上記の配列番号１〜１１の配列の１つである新規産物としてのオリゴヌクレオチドである。
【００２８】
本発明の文脈において、表現「チロシナーゼをコードする遺伝子」は、チロシナーゼ遺伝子のゲノム配列を意味するように意図される。同様に、表現「ＴＲＰ−１をコードする遺伝子」は、ＴＲＰ−１遺伝子のゲノム配列を意味するように意図される。
【００２９】
メラニン形成におけるチロシナーゼとＴＲＰ−１の鍵となる役割は、公知である。酵素またはタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの発現を調節するために、該メッセンジャーＲＮＡに対し向けられたオリゴヌクレオチドの使用も公知である。しかし、本発明の発明者らによって開発された技術は、脱色の手段としては決して使用されなかった。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡまたは遺伝子と直接的にハイブリダイズするように決定される。それ故、それらは、遺伝子によって産生されるチロシナーゼまたはＴＲＰ−１の量の究極の調節を行うことを可能とする。
【００３１】
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、二重ヘリックスの形態で二本鎖を形成するように、通常核酸の２つの鎖上の相補的塩基の間で、ワトソン−クリック対としても知られる、水素結合の形成を示すように使用される。
【００３２】
同一の長さの２つの核酸配列の間の相補性の程度は、アラインメント後、第１配列を、第２配列に相補的な配列と比較することによって決定される。相補性の程度は、比較される２つの配列の間で同一位置のヌクレオチドが同一である同一位置の数を決定し、同一位置のこの数を、位置の総数で割り、得られた結果を１００倍し、これらの２つの配列の間の相補性の程度を得ることによって計算される。
【００３３】
「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、特異的な結合が望まれる条件下、非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるために十分な相補性の程度が存在することを特に意味する。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするために、標的核酸配列と１００％の相補性を有する必要はないことが理解される。特に、少なくとも約８０％に等しい相補性の程度を有するオリゴヌクレオチドは、標的として選択された核酸と特異的にハイブリダイズできる。
【００３４】
本発明のオリゴヌクレオチドは好ましくは、色素沈着に必須の酵素をコードする遺伝子または遺伝子産物と特異的にハイブリダイズする。特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、チロシナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡもしくはＴＲＰ−１をコードする遺伝子のＤＮＡ、あるいはこれらの遺伝子の一方もしくは他方由来のｍＲＮＡとハイブリダイズできる。本発明のオリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするために、同一性と数において十分なヌクレオチド数を含む。この性質は通常「アンチセンス」と言われる。
【００３５】
それ故、本発明の主題は、関係する遺伝子のコーディング領域の上流に、もしくはその領域と、あるいはこの遺伝子の翻訳の開始コドンを示す領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００３６】
本発明の主題はまた、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードするＤＮＡかまたはメッセンジャーＲＮＡのいずれかと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００３７】
本発明の主題はまた、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子またはｍＲＮＡの、５’非コーディング領域、開始コドンを示す領域、コーディング領域または３’非コーディング領域のいずれかと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００３８】
本発明の文脈において、「チロシナーゼをコードするＤＮＡ」または「ＴＲＰ−１をコードするＤＮＡ」という表現は、エキソンとイントロンの両方、特にエキソンを意味するように意図される。
【００３９】
・ 配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＲＰ−１をコードする遺伝子またはｍＲＮＡの５’非コーディング領域と特異的にハイブリダイズする；
・ 配列番号５の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＲＰ−１をコードする遺伝子またはｍＲＮＡの開始コドンを示す領域と特異的にハイブリダイズする；
・ 配列番号６、配列番号７および配列番号８の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、チロシナーゼをコードする遺伝子またはｍＲＮＡの５’非コーディング領域と特異的にハイブリダイズする；
・ 配列番号９の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、チロシナーゼをコードする遺伝子またはｍＲＮＡのコーディング領域と特異的にハイブリダイズする；
・ 配列番号１０の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、チロシナーゼをコードする遺伝子またはｍＲＮＡの開始コドンを示す領域と特異的にハイブリダイズする；
・ 配列番号１１の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＲＰ−１をコードする遺伝子またはｍＲＮＡの５’非コーディング領域と特異的にハイブリダイズする；
ということを明記する。
【００４０】
本発明の主題はまた、生体利用性の増大、標的配列へのアフィニティの増大、細胞内部取り込みの増大、またはより良好な生物学的安定性もしくは細胞ヌクレアーゼの存在下の安定性の増大などの本発明のオリゴヌクレオチドに所望の物理化学的特徴を付与する、糖成分、ヌクレオベース成分、またはヌクレオチド間骨格への１つ以上の化学修飾を含むオリゴヌクレオチドである。
【００４１】
例を挙げると、これらの特徴を付与できる修飾は、ヌクレオシドの糖成分上の２’−Ｏ−アルキルや２’−Ｏ−フルオロ誘導体、およびヌクレオチド間骨格内のホスホロチオエート誘導体もしくはメチル・ホスホネート誘導体である。
【００４２】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然のホスホジエステル結合を介し互いに結合するヌクレオシドを形成する天然のヌクレオベース基とペンタフラノシル（糖）基から作製されるポリヌクレオチドを指す。それ故、「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然サブユニットまたはその密接なホモローグから作製される天然の種または合成の種を指す。
【００４３】
「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、天然オリゴヌクレオチドと同様の機能をもつが、非天然部分を有し得るコンポーネントをも指し得る。該オリゴヌクレオチドは、修飾された糖成分、修飾されたヌクレオベース成分または修飾されたヌクレオチド間結合を有し得る。可能な修飾のうち、好適な修飾は、糖成分上の２’−Ｏ−アルキル誘導体、特に２’−Ｏ−エチルオキシメチルもしくは２’−Ｏ−メチル誘導体、またはヌクレオチド間骨格のホスホロチオエートもしくはメチル・ホスホネートである。
【００４４】
キメラオリゴヌクレオチドは、本発明の優先的な修飾に含まれる。該オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの化学的に異なる領域を含み、各々は少なくとも１つのヌクレオチドを含む。特にそれは、例えば、より良好な生物学的安定性、生体利用性の増大、細胞内取り込みの増大、または標的ＲＮＡへのアフィニティの増大などの１つ以上の有益な性質を付与する修飾ヌクレオチドを含む１つ以上の領域を含む。
【００４５】
好ましくは、ヌクレオチド間骨格は、完全に、または部分的にホスホジエステル、ホスホロチオエート、もしくはメチル・ホスホネート、またはホスホジエステルおよび／もしくはホスホロチオエートおよび／もしくはメチル・ホスホネート結合の組み合わせからなりうる。
【００４６】
それ故、本発明のオリゴヌクレオチドは、そのヌクレオチド間骨格のホスホジエステル基の幾つかが、ホスホロチオエート基および／またはメチル・ホスホネート基で置き換えられていることを特徴とする。
【００４７】
あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル基の全てが、ホスホロチオエート基またはメチル・ホスホネート基によって置き換えられることを特徴とする。
【００４８】
あるいは、ホスホジエステル基は完全に、または部分的に、ホスホロチオエート基および／またはメチル・ホスホネート基によって置き換えられる。
【００４９】
「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、オリゴヌクレオチドの上に、プラスミド型の環状投与ベクターまたは核酸型もしくはペプチド型の線形投与ベクターが接ぎ木されたオリゴヌクレオチドをも指し得る。
【００５０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、医薬品として新規である。
【００５１】
本発明の主題はまた、上記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと化粧用もしくは皮膚病用に許容され得る媒質を含む化粧用組成物もしくは皮膚病用組成物である。このような組成物はまた、所望の効果を強化することを意図した１つ以上の活性剤を含みうる。
【００５２】
本発明の主題はまた、ヒト皮膚、体毛もしくは頭髪の脱色もしくは漂白、またはヒト皮膚上の色素斑点の除去もしくは軽減のための、化粧用組成物または皮膚病用組成物の製造における、またはそのための、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列の使用である。
【００５３】
本発明はまた、特にヒト皮膚、体毛もしくは頭髪の脱色もしくは漂白、およびヒト皮膚上の色素斑点の軽減のための化粧剤として、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子または遺伝子産物と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００５４】
本発明の主題はまた、メラニン合成の阻害剤として化粧用組成物または皮膚病用組成物の製造における、またはそのための、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列の使用である。
【００５５】
本発明はまた、局所経路を介しての、チロシナーゼおよび／またはＴＲＰ−１の過剰発現を生じる疾患の治療または予防を意図した医薬品の製造のための上記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの使用にも関する。この医薬品は、メラニン合成の阻害、特に皮膚の脱色もしくは漂白のためばかりではなく、特発性黒皮症などのメラノサイト活動過剰による局所性色素過剰症、老年性色素斑点（老年性黒子）などの良性メラノサイト活動過剰と増殖による局所性色素過剰症、および光感受性もしくは病変後瘢痕化などの偶発性色素過剰症の治療もしくは予防、並びに白斑などのある種の白斑症の治療が意図され得る。
【００５６】
本発明の主題はまた、ヒト皮膚用の脱色用もしくは漂白用化粧用組成物における、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列の使用である。
【００５７】
本発明はまた、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１の発現を制御するための、上記オリゴヌクレオチドの使用にも関する。
【００５８】
本発明の主題はまた、ヒト皮膚用の脱色用もしくは漂白用皮膚病用組成物の製造のための、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列の使用でもある。
【００５９】
本発明はまた、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含む化粧用組成物を、色素沈着皮膚に適用することに存する、ヒト皮膚を脱色または漂白する化粧用または皮膚病用処置方法にも関する。
【００６０】
本発明の主題はまた、化粧用または皮膚病用に許容され得る媒質中に、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴とする脱色用組成物である。
【００６１】
上記組成物、使用および処置方法のための本発明の好適な実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、その配列が以下に規定されるものの１つであるものである。
【００６２】
【化２】
【００６３】
本発明の化粧用または皮膚病用組成物は局所使用に適切であり、それ故、化粧用または皮膚病用に許容され得る媒質、すなわち、皮膚と適合性のある媒質を含む。本発明のオリゴヌクレオチド配列は、組成物の総重量の０．００００１％〜１０％、好ましくは０．０００３％〜３％の範囲の量で存在し得る。
【００６４】
本発明の組成物は、局所適用のために通常使用される全ての医薬形態、特に、水性、水性−アルコールもしくは油性溶液の形態で、水中油型、油中水型もしくはマルチプルエマルションの形態で、水性ゲルもしくは油性ゲルの形態で、液体産物、ペースト産物もしくは固体無水産物の形態で、水相もしくは油相中の、ナノ球体やナノカプセルなどの重合粒子の分散の形態で、または米国特許第4,508,703号に記載のイオン性もしくは非イオン性型の液体ベシクルの分散の形態で提供し得る。
【００６５】
この組成物は多かれ少なかれ流動性であり得、白もしくは色のついたクリーム、軟膏、ミルク、ゲル、ローション、セラム、ペーストまたはムースの外観を有し得る。それは場合によっては、エーロゾルの形態で皮膚に適用し得る。それはまた、粉末でもよく、もしくはそうでなくともよい固体形態で、例えば、スティックもしくはぎっしり詰まった粉末の形態でも提供し得る。それはまた、パッチの形態で、鉛筆の形態で、ブラシの形態で、および顔もしくは手の斑点への局所適用を可能とする塗薬用具の形態で提供し得る。それは、医療産物または化粧産物として使用され得る。
【００６６】
公知の様式において、本発明の組成物はまた、親水性もしくは親油性ゲル化剤、親水性もしくは親油性活性剤、保存剤、抗酸化剤、溶剤、香料、充填剤、遮蔽剤、色素、臭い吸収剤および染料などの、化粧品や皮膚病学で普通であるアジュバントを含みうる。これらの種々のアジュバントの量は、考慮分野で通常使用される量である。性質により、これらのアジュバントは、脂肪相、水性相、液体ベシクル、またはナノ粒子中に導入され得る。
【００６７】
本発明の化粧用組成物または皮膚病用組成物がエマルションであるとき、脂肪相の割合は、一般的に、組成物の総重量に対し５〜８０重量％、好ましくは５〜５０重量％の範囲でありうる。エマルション形態の組成物で使用される油、乳化剤および乳化補助剤は、考慮分野で通常使用されるものから選択される。乳化剤および乳化補助剤は、一般的に組成物の総重量に対し０．３〜３０重量％、好ましくは０．５〜２０重量％の範囲の割合で組成物に存在する。
【００６８】
本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用し得る油として、鉱油（液体ワセリン）、植物起源の油（アボカド油、大豆油）、動物起源の油（ラノリン）、合成油（ペルヒドロスクアレン）、シリコーン油（シクロメチコン）およびフルオロ油（ペルフルオロポリエーテル）に言及できる。脂肪アルコール（セチルアルコール）、脂肪酸およびワックス（カルナウバワックス、オゾケライト）も脂肪物質として使用できる。
【００６９】
本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用できる乳化剤および乳化補助剤は、例えば、ＰＥＧ−２０ ステアレートなどの、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステルや、グリセリルステアレートなどの、グリセロールの脂肪酸エステルに言及できる。
【００７０】
本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用できる親水性ゲル化剤として、特に、カルボキシビニルポリマー（カルボマー）、アクリレート／アルキルアクリレートコポリマーなどのアクリル酸コポリマー、ポリアクリルアミド、ポリサッカライド、天然ゴムおよび粘土に言及できる。親油性ゲル化剤として、ベントンなどの改変粘土、脂肪酸の金属塩、疎水性シリカおよびポリエチレンに言及できる。
【００７１】
本発明の主題は、少なくとも１つの上記オリゴヌクレオチドと１つ以上の他の活性剤を含む化粧用または皮膚病用組成物である。
【００７２】
本発明はまた、１つ以上の活性剤と組み合わせて、同時に、もしくは別々に、または時間をかけた方法で投与するように意図された医薬品の製造のための、少なくとも１つの上記オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００７３】
本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用でき、純粋に使用する、またはこれらの分子を含む抽出物起源の活性剤は、特に以下の化合物である。エラグ酸とその誘導体；ヒドロキノン；アルブチン；レゾルシノールとその誘導体；ビタミンＣとその誘導体；パントテネート・スルホネートとその誘導体；麹酸；胎盤エキス；アルファ−メラノサイト−刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）もしくはそのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を、直接的または間接的に妨害する分子；グリセロール、グリコールまたはプロピレングリコールなどのポリオール；ビタミン；サリチル酸とその誘導体などの角質溶解剤または落屑剤；単独または接ぎ木された、乳酸またはリンゴ酸などのα−ヒドロキシ酸；アスコルビン酸とその誘導体；レチノイン酸；レチンアルデヒド；リポソーム調製物中でありうるし、またはそうでないこともありうるレチノールと、パルミテート、プロピオネートまたはアセテートなどのその誘導体；トコフェロールとその誘導体、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミン・ピロホスフェート、ピリドキサミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシン、アデノシン・トリホスフェートなど、単独で、または組み合わせての抗グリケーション剤または抗酸化剤；グリチルレチン酸ステアリルなどの抗炎症剤；無痛化剤とその混合物、微粉状酸化亜鉛、酸化チタン、ブチルメトキシジベンゾイルメタンおよびメトキシケイヒ酸オクチルなどの化学的または物理的日焼け止め；並びにデオキシリボ核酸または核酸。不適合の場合、これらの他の活性剤および／または本発明のオリゴヌクレオチドは、小球体、特に、米国特許第4,508,703号に記載のイオン性または非イオン性両親媒性脂質から作製されるベシクル中に導入され得る。
【００７４】
以下の実施例は、本発明を限定すること無しに本発明を説明する。
【００７５】
インビトロの培養培地での安定性のために、そして通常の実施に従い、実施例２〜４は、ホスホロチオエート誘導体で行い、実施例５〜１２は、ホスホロチオエート誘導体またはホスホジエステル誘導体で等しく準備された。
【００７６】
以下の実施例では、全てのパーセンテージは、異なるように記載されていなければ、重量による。
【実施例】
【００７７】
実施例１：オリゴヌクレオチド合成
実施例として、標準ホスホルアミダイト誘導体化学による自動合成器（PerseptiveBiosystems Expedite モデル8909）を用い、製造者のプロトコルを用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。会社Perseptive Biosystemsによってβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトが供給された。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドについて、ヨウ素溶液を用いてホスファイト酸化工程を実施した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに関して、無水アセトニトリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドの０．０５Ｍ溶液を用いて、ホスファイト酸化工程を実施した。カラム（Controlled Pore Glass, Perseptive Biosystems）からの切断、および３３％水性アンモニア溶液を用いて５５℃、１８時間の処理による配列の全脱保護の後、酢酸ナトリウムの存在下、エタノール中で沈殿させることによって、オリゴヌクレオチドを精製した。塩化ナトリウムの勾配を用いた溶離によるイオン交換クロマトグラフィーによって、および酢酸トリエチルアンモニウムの存在下でアセトニトリルの勾配を用いた溶離によるＣ１８逆相クロマトグラフィーによって、高速液体クロマトグラフィーの制御を実施した。
【００７８】
合成したオリゴヌクレオチドを表１に記載する。それらは、配列番号１から配列番号１１まで番号付けられた、この表の最初の１１の配列である。それらの脱色活性は、以下の実施例で報告する研究の主題であった。
【００７９】
表１では、配列の各端部の下に付けられた番号は、起源の配列におけるオリゴヌクレオチドの位置を示す。
【００８０】
配列は、それぞれ、ヒトチロシナーゼｃＤＮＡの「ＨＵＭＴＹＲＡ」と呼ばれる配列（Shibaharaら、Tohoku J. Exp. Med. 156: 403（1988）により発行）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ２７１６０）、ヒトＴＲＰ−１ ｃＤＮＡの「ＨＳＴＹＲＲＰ」と呼ばれる配列（Cohenら、Nucl. Acides Res. 18: 2807（1990）により発行）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ５１４２０）および「ＡＦ００１２９５」と呼ばれるＴＲＰ−１の別の配列 （Boxら、Mamm. Genome 9:50（1998）により発行）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００１２９５）由来である。
【００８１】
さらに、チロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子または遺伝子の産物に関して、本発明のオリゴヌクレオチドの特異性を確認するための比較として、本発明の配列番号２に基づく２つのオリゴヌクレオチドを合成した。すなわち：
※ 表１に配列番号１２で示した、「センスコントロール」と呼ばれる配列。これは配列番号２の塩基の順序を逆にしてなる。
※ 同様に表１に配列番号１３で示した、「スクランブルコントロール」と呼ばれる配列。これは配列番号２の塩基と性質および数が同じ塩基を含むが、任意の順序で配置されている。
【００８２】
【表１】
【００８３】
実施例２：正常ヒトメラノサイト（ＮＨＭ）に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの脱色効果
実施例１の表１にある、本発明のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号１１）を、メラニン形成に対するそれらの作用について、それ故メラノサイトによるメラニン色素の産生を調節するそれらの能力について研究する。「センスコントロール」（配列番号１２）および「スクランブルコントロール」（配列番号１３）オリゴヌクレオチドもまた、比較の要素として、この作用について研究する。
【００８４】
メラニン形成の反応機構の間、チロシナーゼおよびＴＲＰ−１が酵素複合体を形成し、この複合体がＬ−ドーパのドーパキノンへの、次いでドーパクロムへの変換を触媒することが思い出される。これらの２つの酵素は協力して作用し、それらはお互いがないと決して機能しないようである。実際、ＴＲＰ−１に対して指向したアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって細胞をＴＲＰ−１枯渇させる場合、チロシナーゼ（「ドーパオキシダーゼ」とも呼ばれる）活性の減少が観察される。チロシナーゼはまた、その多機能特性のため、「ドーパオキシダーゼ」とも呼ばれる；実際、チロシンのドーパへの酸化の間にドーパオキシダーゼと同じ機能を実行する。
【００８５】
本アッセイの原理は、基質として用いたＬ−ドーパのドーパクロムへの変換におけるドーパオキシダーゼについての反応速度を測定することに基づく。ドーパクロムの発現は、所定の時間間隔で光学濃度を測定することによって定量され、これによって、試験した各オリゴヌクレオチドに関して、およびコントロールアッセイに関して、ドーパオキシダーゼについての反応速度を計算することが可能となる。得られる結果に基づいて、それ故試験したオリゴヌクレオチドのメラニン形成に対する作用を評価することが可能である。コントロールアッセイと比較した反応速度の低下は、酵素活性の減少、およびその結果としてのメラニン色素の形成の減少、それ故脱色効果に対応する。
【００８６】
メラノサイト培養物の調製およびオリゴヌクレオチドでの処理
メラノサイトをコーカソイド系の子供の包皮から得る。皮膚フラグメントをＰＢＳ（Gibco, Paisley, GB）、次いで７０％エタノールですすぐ。ＰＢＳでの最後の洗浄後、最小限の真皮を含む細い１ｍｍの細片に皮膚を切断する。細片を０．２５％トリプシン溶液（Gibco, Paisley, GB）中、４℃で一晩インキュベートすることによって、真皮および表皮を分離する。インキュベーション後、細胞をメスでこすることによって表皮細胞を回収する。ウシ胎仔血清（Gibco, Paisley, GB）を１０％（Ｖ／Ｖ）含むＥ−１９９培地（Gibco, Paisley, GB）中に細胞を置くことによって、トリプシンの作用を停止させる。ホモジナイズし、表面に浮遊する角質細胞の除去後、細胞懸濁物を濾過し、遠心分離し、そしてペレットを接着培地（培地１）中に置く。その組成を以下の表に与える。ここで、ＥＧＦは表皮成長因子を示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
細胞集団の計数後、細胞を２０００００／ｃｍ2の割合でフラスコ中に接種する。湿度を飽和させ、かつ５％のＣＯ2を含む大気中、３７℃で細胞を維持する。細胞を接着させた後、接着培地をＫＳＦＭ培地（Gibco, Paisley, GB）で置き換え、これを４８時間毎に取り替える。
【００８９】
そのようにして培養中に置いた表皮細胞によって、ケラチノサイト−メラノサイト共培養物を得ることが可能となる。この共培養物が約７０％の集密になるとすぐに、ＫＳＦＭ培地を選択培地（培地２）で置き換える。この選択培地は、メラノサイトの増殖を促進し、その組成は以下の表にある。ここで、ＩＢＭＸは３−イソブチル−１−メチルキサンチンを示し、ＰＭＡはホルボール１２−ミリステート１３−アセテートを示す。
【００９０】
【表３】
【００９１】
４８〜７２時間後、０．１％トリプシン−０．０５％ＥＤＴＡ混合物（Gibco, Paisley, GB）を室温で１〜２分間用い、細胞をフラスコから引き離す。得られる細胞懸濁物を遠心分離し、選択培地に最懸濁させる。２４〜４８時間後、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．１％−０．０５％）混合物を用い、室温で１〜２分間、細胞を再び処理し、次いでメラノサイトに特異的な増殖培地（培地３）に再接種する。
【００９２】
培地３は１０％の培地２と９０％の培地Ａとからなる。培地Ａはケラチノサイト培地ＳＦＭ（Gibco, 17005-034）である。
【００９３】
この段階では、得られる細胞集団は純粋であり、正常ヒトメラノサイト（ＮＨＭ）のみからなる。
【００９４】
研究前、強力な代謝活性化剤、例えばホルボールエステルまたはＩＢＭＸを含まない培地（培地４）にＮＨＭを１週間置く。
【００９５】
培地４は１０％の培地Ｂと９０％の上記の培地Ａとからなる。培地Ｂの組成は以下の表に記載する。
【００９６】
【表４】
【００９７】
２００μｌの培地４中、ウェル当たり１００００細胞の割合で、ＮＨＭを９６ウェルマイクロプレート（Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA）に接種する。
【００９８】
試験するオリゴヌクレオチドを、それぞれ１０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭおよび１μＭの濃度で、研究培地中でその場で調製する。種々のオリゴヌクレオチドでの処理は、７日間毎日行う。各濃度について、３回のアッセイを実施する。
【００９９】
ドーパオキシダーゼ活性についての反応速度の測定
７日間にわたって分けられたこれらの処理の終わりに、チロシナーゼすなわち「ドーパオキシダーゼ」活性を測定する。
【０１００】
細胞をＰＢＳですすぎ、次いで、ＰＢＳ（Gibco, 14190-094）中の溶解緩衝剤（０．５％ Triton X100（Sigma, T-9284））５０μｌをウェルに加え、プレートを４℃で１時間振盪する。各ウェルに５０μｌの基質（１０ｍＭ Ｌ−ＤＯＰＡ、Sigma）を加えることによって、反応を開始させる。光学濃度読み取り器であるマイクロプレート読み取り器340 ATTC（SLT-Labinstrument, Grodig/Salzburg, Austria）を用い、一定に振盪しつつ、３７℃で１時間、２分毎に４５０ｎｍで、ドーパクロムの発現を測定する。反応速度を計算し、１０-4ＯＤ単位／分として表す。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドで処理した培養物について、およびコントロール（処理していない）培養物について、得られた結果を表２（σ：標準偏差）に与える。
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
本発明のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号１１）でメラノサイト培養物を処理することにより、ドーパオキシダーゼ活性についての反応速度の減少が導かれることが、表２にある結果から明確に分かる。この減少は、配列番号１〜配列番号６のオリゴヌクレオチドについて特に明確である。
【０１０６】
一方、配列番号２のオリゴヌクレオチドに関しての比較のために試験したオリゴヌクレオチド、すなわち配列番号１２の「センスコントロール」および配列番号１３の「スクランブルコントロール」について、ドーパオキシダーゼ活性についての反応速度の増加は、試験した各濃度で顕著である。例えば、１００ｎＭの濃度では、「センスコントロール」および「スクランブルコントロール」について、反応速度はそれぞれ２．２％および１１．７％増加し、一方、本発明による配列番号２のアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合は２８．８％減少する。
【０１０７】
本発明のオリゴヌクレオチド（これはドーパオキシダーゼ活性についての反応速度を減少させる）の活性は、チロシナーゼをコードするかまたはＴＲＰ−１をコードする標的メッセンジャーＲＮＡとの、該オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションに起因することが、後者の観察から推定することができる。
【０１０８】
結果として、このオリゴヌクレオチド／ｍＲＮＡ相互作用は、標的化メッセンジャーＲＮＡによって行われる情報の翻訳を妨げ、それ故、使用するアンチセンス配列に応じてチロシナーゼまたはＴＲＰ−１の細胞内発現の減少を導く。言い換えれば、この相互作用は、チロシナーゼまたはＴＲＰ−１の新合成（neosynthesis）を減少させる。これらの酵素の天然の再生ゆえに、これは、細胞中のチロシナーゼおよびＴＲＰ−１の量の減少、およびその結果としてメラニンの合成と一致したこれらの酵素の活性の減少を導く。実際、本発明のオリゴヌクレオチドは、メラノサイト中に既に存在するチロシナーゼに作用する代わりに、チロシナーゼおよびＴＲＰ−１の再生を減少させることによって作用する。
【０１０９】
メラノサイトに対するこの作用の結果は、これらの細胞のメラニンを合成する能力が減少し、それ故場合および関係する個体に応じて、漂白または脱色効果が生み出されることである。
【０１１０】
実施例３：ムラートの成人ドナー由来の正常ヒトメラノサイトに対する、本発明のオリゴヌクレオチドの脱色効果
ここで使用するメラノサイトは、ムラートの成人ドナーの大腿由来の皮膚から得る。皮膚断片をＰＢＳ（Gibco, Paisley, GB）でリンスし、次いでＰＢＳ中５０％まで希釈した７０％エタノール（Ｖ／Ｖ）で洗浄する。ＰＢＳによる洗浄後、コーンカッターを使用して皮膚断片をこする。得られる小片を０．０５％トリプシン（Difco Laboratories, WestMolesy, GB）中で３７℃１時間こすり、解離させる。次いで、表皮を、ウシ胎仔血清（FCS, Gibco, Paisley, GB）を１０％含むＥ−１９９培地（Gibco, Paisley, GB）中に回収する。ホモジナイズし、表面に浮遊する角質層断片を除去した後、細胞懸濁物をろ過し、次いで遠心分離する。得られる細胞ペレットを実施例２に記載した培地１中にとる。細胞をカウントし、トリパンブルー排除アッセイを用いて、Ｔｈｏｍａ細胞において細胞生存度を測定する。表皮細胞を、８００００細胞／ｃｍ2の割合で、フラスコ中の培地１に最終的に接種する。湿気を飽和させＣＯ2を５％含む雰囲気で、３７℃で細胞を維持する。
【０１１１】
培地１を培地６と交換する。培地６の組成は下記の表に明記する。表中、Ｂ−ＦＧＦは塩基性線維芽細胞成長因子を示し、ＰｄＢｕはホルボール１２，１３−ジブチラートを示す。
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
この培地を１〜２週間、４８時間ごとに新しくする。
【０１１４】
このメラノサイトの選択の後、培地６を培地７に換えることによって、ＮＨＭ増殖を促す。
【０１１５】
培地７は、培地Ｃ（１０％）と上述した培地Ａ（９０％）からなり、ＰｄＢｕ（Sigma,
P-1269）を補充する（培地中での最終濃度は０．２５μｇ／ｍｌ）。
【０１１６】
【表９】
【０１１７】
この段階では、得られる細胞集団は純粋なものである。それはＮＨＭのみからなる。
【０１１８】
ＮＨＭを、培地６中、９６ウェルマイクロプレート（Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA）に接種する。２４時間後、培地を培地８と交換する（これをこの研究の最後まで使用する）。培地８の組成を以下に記載する。
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
オリゴヌクレオチド（配列番号２）を５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭおよび１μＭの濃度で、研究培地に即座に加える。この処理を７日間毎日行う。各濃度について、６回のアッセイを行う。
【０１２１】
ドーパオキシダーゼ活性の反応速度の測定
７日間に分けたこれらの処理の終わりに、ドーパオキシダーゼ活性を測定する。これらの測定は実施例２と同じ方法で行う。反応速度を計算し、１０-4ＯＤ単位／分として表す。
【０１２２】
オリゴヌクレオチド（配列番号２）で処理した培養物および未処理コントロール培養物について得られる結果を表３に示す（σ：標準偏差）。
【０１２３】
【表１１】
【０１２４】
上記結果により、極めて低いオリゴヌクレオチド濃度（１００ｎＭ）以上で、ドーパオキシダーゼ活性の反応速度は極めてかなり減少することが観察される。
【０１２５】
従って、実施例２の結論で既に説明したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、メラノサイトがメラニンを合成する能力を減少させる。本アッセイにおいて、この減少が関係者の遺伝的性質とは関係がないことが示される。
【０１２６】
本実施例では、浅黒い肌の色に相当する基本的な色素沈着を有するムラートのドナーを含んでいるので、本発明のオリゴヌクレオチドの使用は、漂白効果、すなわち皮膚の色を明るくすることを導くだろう。
【０１２７】
実施例４：本発明のオリゴヌクレオチドによる、正常ヒトメラノサイトにおけるＵＶ誘導メラニン形成の阻害の研究
上記実施例の結果に引き続き、本アッセイの目的は、メラノサイトを刺激により（この場合、ＵＶＢ紫外線照射（２８０〜３２０ｎｍ）により）活性化した場合、本発明のオリゴヌクレオチドもまた活性であるかどうかを確認することである。換言すれば、オリゴヌクレオチドが、メラニン形成の刺激とは無関係に、メラノサイトのドーパオキシダーゼ活性を減少させる能力を評価することを含んでいる。
【０１２８】
この趣旨で、本アッセイは、コーカソイド系の成人ドナー由来のメラノサイトに関する。ここで使用するメラノサイトは、乳房形成術由来の皮膚から得る。これらのメラノサイトを得る技術は、実施例３で使用し記載したものと同じである。
【０１２９】
実験は３５ｍｍディッシュで行う。メラノサイトを３５ｍｍディッシュ（Falcon, Flanklin Lakes, NJ. USA）に、１ディッシュあたり、２５００００細胞および培地８（２ｍｌ）の割合で接種する。培地８の組成は実施例３に記載する。オリゴヌクレオチド（配列番号２）、また８ｍＪ／ｃｍ2のＵＶＢ照射（Bio-Energie, Vilbert-Lourmat, Marne-la-Vallee, France）による処理を接種後２４時間後に始める。
【０１３０】
各ＵＶＢ照射の前に、ＮＨＭをＰＢＳ（２ｍｌ／ディッシュ）中に置く。照射後、オリゴヌクレオチド（配列番号２）を含むかもしれないし、含まないかもしれない培地８（２ｍｌ）中に細胞を再び置く。
【０１３１】
オリゴヌクレオチド（配列番号２）を研究培地（実施例３の培地７）に、１００ｎＭ、２５０ｎＭおよび５００ｎＭの濃度で即座に加える。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドによるこれらの処理を９日間毎日行う。照射は、５日目と６日目以外は毎日行う。各濃度について、３回のアッセイを行う。
【０１３３】
ドーパオキシダーゼ活性の反応速度の測定：
これらの処理（すなわちオリゴヌクレオチドでの９日間の処理と７回の照射）の終わりに、ドーパオキシダーゼ活性を測定する。
【０１３４】
この趣旨で、ＮＨＭを５００μｌの０．１％トリプシン−０．０５％ＥＤＴＡを用いて３５ｍｍディッシュから引き離し、フェノールレッド（Gibco）を含まず１０％のウシ胎仔血清を補充したＥ−１９９培地（１．５ｍｌ）にとる。この細胞懸濁物のアリコート部分を細胞の計測に使用し、その他は遠心分離し、得られるメラノサイトのペレットを５０μｌの溶解緩衝液に取り出して、実施例２に記載したようにドーパオキシダーゼの反応速度を測定する。
【０１３５】
ドーパオキシダーゼ活性の反応速度を計算し、１０-4ＯＤ単位／分／１０6ＮＨＭとして表す。得られる結果を表４に示す（σ：標準偏差）。
【０１３６】
【表１２】
【０１３７】
上記結果は本発明のオリゴヌクレオチドが、ＵＶＢ照射の影響下刺激を受けたメラノサイトの場合、ドーパオキシダーゼ活性の反応速度を、極めてかなり減少させることを明確に示している。
【０１３８】
従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、先の実施例で示されたような、基底の活性状態にあるメラノサイトがメラニンを合成する能力を減少させるだけでなく、活性化状態にあるメラノサイトのこの能力も減少させる。それ故、これらのオリゴヌクレオチドはまた、特に日光に存在する紫外線照射により誘発される色素沈着を予防または軽減するために使用され得る。
【０１３９】
実施例５：顔の肌の色を明るくするためのパウダー
マイクロセルロース ２０．００％
ラウリルスルホ酢酸ナトリウム １５．００％
オリゴヌクレオチド（配列番号５）（ホスホジエステル） １．００％
香料、着色料、保存剤 適量
タルク 適量で１００％
【０１４０】
このパウダーは２つの作用を有する。それは、皮膚の汚れを落とすことを可能にし、さらに、数日間定期的に使用した場合、それは、肌の色を明るくすることを可能にする。それは、顔の皮膚に１日１〜２回適用され得る。
【０１４１】
実施例６：顔用脱色デイエマルションゲル
グリセロール ５．００％
カプリル酸／カプリン酸／コハク酸トリグリセリド ５．００％
メトキシケイヒ酸オクチル １．００％
ジメチコンコポリオール ０．５０％
アクリレート／Ｃ10−Ｃ30アルキルアクリレートクロスポリマー ０．５０％
オリゴヌクレオチド（配列番号３）（ホスホジエステル） ０．０１％
中和剤 適量
保存剤、香料、着色料 適量
水 適量で１００％
【０１４２】
多かれ少なかれ日光からまたは直接太陽光からさえ激しい照射に曝されているいくらかの個人は、明るい肌の色を維持し、色素性の斑点の出現をさけたいと思っている。上記エマルションゲルの使用は、この目的を達成することを可能とするだろう。この組成物は通常朝、顔に適用する。それは、顔の色素沈着に対して、予防的および治癒的の両方で作用する（それは等しいかもしれないし等しくないかもしれない）。
【０１４３】
実施例７：色素斑点を予防するためのＳＰＦ３０保護液
揮発性ペンタシクロメチコン ４９．００％
二酸化チタン １５．００％
メトキシケイヒ酸オクチル ７．５０％
グリセロール ５．００％
フェニルトリメチコン ５．００％
ジメチコンコポリオール ３．００％
ポリメチルメタクリレート ２．５０％
ブチルメトキシジベンゾイルメタン １．００％
オリゴヌクレオチド（配列番号２）（ホスホジエステル） ０．１％
中和剤、香料、保存料、抗酸化剤 適量
水 適量で１００％
【０１４４】
この組成物は、色素斑点の出現を、この現象が起こりやすい個体において、予防するために、太陽からの激しい照射に曝される前に、使用されるものである。高濃度の日焼け止めの存在が、メラニンレベルの低下の結果である生来の保護の減少を補填することを可能とすることに留意すべきである。
【０１４５】
実施例８：脱色フェイスクリーム
グリセリルステアレート＋Ｐｅｇ−１００ステアレート ５．００％
硬化ポリイソブテン ４．００％
マグネシウムアスコルビルホスフェート ３．３０％
トリカプリル酸／カプリン酸グリセリル ３．００％
スクアレン ３．００％
グリセロール ２．００％
ミツロウ １．５０％
セテアリルオクタノエート １．５０％
セチルアルコール １．００％
ステアリルアルコール １．００％
ジメチコン １．００％
キサンタンガム ０．３０％
エチレンジアミンテトラ酢酸 ０．２０％
クエン酸 ０．１０％
クエン酸ナトリウム ０．１０％
オリゴヌクレオチド（配列番号６）（ホスホジエステル） ０．１０％
中和剤、香料、保存剤 適量
水 適量で１００％
【０１４６】
このクリームの使用は、老年性色素斑点または光線性色素斑点を軽減するかまたは除去することによって、皮膚の色素沈着の不規則性を処置することを可能とする。それは、皮膚の色を均一にし、肌の色を明るくする。
【０１４７】
実施例９：肌の色を明るくするためのフェイスローション
エチルアルコール ３０．００％
ＰＰＧ−３ミリスチルエーテル ５．００％
グリセロール ２．００％
カルボマー ０．２０％
ポリソルベート２０ ０．２０％
オリゴヌクレオチド（配列番号４）（ホスホロチオエート） ０．０１％
中和剤、香料、保存剤 適量
水 適量で１００％
【０１４８】
この肌の色を明るくするためのローションは、化粧を落とし、肌の汚れを落とした後に、使用される。
【０１４９】
実施例１０：肌の色を明るくするためのフェイスセラム
【０１５０】
【表１３】
【０１５１】
この非常に濃縮されたセラム組成物１滴を、通常フェイスクリームの塗布前に顔に適用する。このセラムは、肌の色を明るくすることを達成するかまたは維持するために、１〜２週間の処置として通常は使用される。
【０１５２】
実施例１１：頭髪を明るくするためのヘアローション
水 適量で１００％
アルコール ５０％
パンテニルエチルエーテル ０．５％
酢酸ＤＬ−α−トコフェロール ０．２％
ポリソルベート６０ １％
オリゴヌクレオチド（配列番号１）（ホスホロチオエート） ０．０１％
香料 ０．２％
グリセロール ０．５％
着色料 適量
【０１５３】
このローションは、頭髪を徐々に明るくするために必要な期間、朝晩、髪に適用する。この期間は通常数週である。
【０１５４】
実施例１２：ハンドクリーム（抗斑点ゲルクリーム）
カプリル酸／カプリン酸ジグリセリルスクシネート ６％
オクチルオクタノエート ２．５％
メトキシケイヒ酸オクチル ６％
オリゴヌクレオチド（配列番号５）（ホスホジエステル） ０．００１％
フェニルトリメチコン ２．５％
ベンゾフェノン−３ ０．５％
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０５％
キサンタンガム ０．２％
アクリレート／Ｃ10−Ｃ30アルキルアクリレートコポリマー ０．５％
グリセロール ２％
ＰＥＧ１５０ ３％
中和剤、着色剤、香料、保存剤 適量
精製水 適量で１００％
【０１５５】
このクリームは、手の老年性色素斑点（老年性黒子）に、その着色を軽減するため、直接適用すべきである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規オリゴヌクレオチド配列およびまた、その誘導体に関する。
【０００２】
これらの新規オリゴヌクレオチド配列は、メラニン色素の合成経路に含まれる必須酵素の１つをコードする遺伝子または遺伝子産物とハイブリダイズできる。
【０００３】
本発明は、化粧用組成物または皮膚病用組成物における皮膚の脱色剤または漂白剤として、これらの新規オリゴヌクレオチド配列の使用にも関する。
【背景技術】
【０００４】
ヒトにおいて、色素沈着は、皮膚、毛包または眼におけるメラニン色素の合成と分配から生じる。色素沈着は遺伝的に予め定まっているが、多くの内的または外的因子によって調整される。メラノサイトによって産生されるメラニンやまた、メラノサイトの数、それらのチロシナーゼ活性やメラニンをケラチノサイトへ輸送するそれらの能力、およびメラニン顆粒を含むメラノソームの大きさは、ヒト皮膚の色の条件となるであろう。各個人について、皮膚の色は、紫外（ＵＶ）線からの照射の多かれ少なかれ有意量の関数として主として変動する。換言すれば、各個人について、ＵＶ照射の最小量を受けるときの基礎的皮膚色素沈着（それは、各個人の最も薄い皮膚色に対応する）、ＵＶ照射のより強い量を受けた場合のより強い皮膚の色素沈着、山の高度で出会いうるような強いＵＶ照射に持続した期間曝されるときの各個人の最も濃い皮膚色に対応する最大の色素沈着までの範囲が存在する。
【０００５】
さらに、周知のように、世界の人々において、皮膚色素沈着に関する非常に大きな遺伝的多様性が存在する。すなわち、集団により、上記に規定した基礎的色素沈着に対応する皮膚色は、２つの極端（すなわち、非常に薄いのと非常に濃い）の間に存在するより薄い肌色またはより濃い肌色を示す。また、集団により、基礎的色素沈着と最大色素沈着の間の皮膚の肌色における差異は、多かれ少なかれ重要である。すなわち、薄い皮膚（基礎的色素沈着）をもつある集団に属する個人は、ＵＶ照射作用に急速および／または著しく反応し、それ故、これらの個人が、持続した期間、故意に太陽に曝されなかったときでさえ、容易に濃い皮膚色を有し得ることは周知である。本明細書の残りの部分で、これらの個人は、表現「ＵＶ照射に非常に反応性のある個人」によって表される。これは、特に、アジア起源の集団または混合−人種集団と命名されたある集団について当てはまる。
【０００６】
さらに、個人によって、皮膚におけるより濃い、すなわちより色のついた部分の外観、または皮膚における斑点、特に顔と手における斑点（それは、皮膚にある種の不均一性を与える）が証明される。これらの斑点は、表皮のケラチノサイトにおけるメラニンのかなりの濃度によるものである。
【０００７】
皮膚色素沈着の形成の機構は、メラニン合成を含む。この機構は特に複雑であり、スキームとして、以下の主要ステップを含む。
【０００８】
【数１】
【０００９】
反応のこのシリーズに含まれることが知られる酵素は本質的にチロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）である。これらの酵素は、チロシンのドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）への変換の反応およびドーパのドーパキノンへの変換の反応を特に触媒し、メラニン色素形成を導く。これらの酵素は、メラニン形成の反応機構の間に、個々に含まれるようにはならない。事実、チロシナーゼとＴＲＰ−１は酵素複合体を形成する（Winderら、（1994） Cell. Mol. Biol. Res. 40:7-8； Orlowら、（1994） J. of Investigative Dermatology 103: 196-211）。それ故、これらの２つの酵素は、協奏的に作用し、互いの存在無くして決して機能しないように思われる。細胞がＴＲＰ−１欠失であるとき、チロシナーゼ活性の喪失が観察されることが知られ（Orlowら、（1994））、このことは、活性であるために、チロシナーゼはＴＲＰ−１の存在を必要とすることを意味する（Zhaoら、（1996） J. of Investigative Dermatology 106: 744-752）。
【００１０】
本明細書の残りの部分で、メラニンの合成経路に含まれるこれらの必須酵素は、表現「色素沈着に必須の酵素」によって表される。
【００１１】
表皮メラノサイトの活性を阻害することによって、表皮メラノサイトに直接的に作用するならば、および／またはメラニン生合成のステップの１つを阻止するならば、分子は、脱色分子であると認められる。これは特に、その分子がメラニン形成に含まれる酵素の１つを阻害するとき、そうであるか、またはその分子がメラニン合成鎖の化学化合物と反応するとき、そうである。
【００１２】
公知の脱色物質は特に、ヒドロキノンとその誘導体、アスコルビン酸とその誘導体、胎盤エキス、麹酸、フェルラ酸、アルブチン、ジヒドロキシベンゼン誘導体（WO 00/47045）、グアイアコール誘導体（WO 00/47179）、４−（２，３−ジヒドロキシフェニル）シクロヘキサノール（WO 00/56279）、レゾルシノール誘導体（WO 00/56702）およびフェノールアミド（WO 99/32077）である。これらの物質はある欠点を有し得る。それらは、不安定であり得、高濃度での使用を必要としえ、それらの作用モードに関し特異性を欠き得、または細胞毒性力もしくは刺激力を有し得る。
【００１３】
有効で無害の脱色物質の局所使用は特に、化粧品や皮膚病学において望ましい。該物質は特に、特発性黒皮症などのメラノサイト活動過剰による局所性色素過剰症、老年性色素斑点（老年性黒子）として知られる色素斑点などの、良性メラノサイト活動過剰と増殖による局所性色素過剰症、光感受性もしくは瘢痕性色素過剰症などの偶発性色素過剰症、および白斑（vitiligo）などのある種の白斑症（leukodermias）を治療するために用いられる。後者の場合には、皮膚を再び着色することは可能ではないので、脱色区域の縁の周りの色素沈着を、皮膚により均一な色を与えるように軽減させる。
【００１４】
脱色物質はまた、肌色、特に顔と手の肌色を明るくし、できるだけ薄い、もしくはできるだけ均一な皮膚色を保存するように、または少なくとも、ＵＶ線の色素沈着効果を減少させるように、ある個人、特にＵＶ照射に非常に反応性のある、上記の個人によって、皮膚の漂白剤としても使用される。
【００１５】
それ故、プロフェッショナルに直面する問題は、既知物質の欠点を持たない（すなわち、皮膚にとって非刺激性で、非毒性で、および／または非アレルギー性であり、組成物中で安定である）、ヒト皮膚、体毛、または頭髪のための新規脱色物質あるいは新規漂白剤の設計、製造または単離である。
【００１６】
メラノサイト機能不全による疾患、特に白斑や他の脱色疾患の治療のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、WO 99/25819に記載されている。これらの病理的皮膚状態において、低色素症は、異常に高いテネイシン含量から生じる。該文献に記載されたオリゴヌクレオチドは、テネイシン発現を調節することによって、低色素症に対し作用する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
一方、本発明の目的は、メラニン形成のプロセスに作用し、第１に、ほぼ均一な色素沈着の場合に、皮膚、体毛、もしくは頭髪を漂白する、すなわち、それらの色素沈着を減少させるように意図された、第２に、皮膚の色素過剰症（すなわち、皮膚が不均一な色素沈着を示すとき）と闘うように意図された脱色剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の発明者らは、オリゴヌクレオチドが、色素沈着に必須の酵素をコードする遺伝子、または（ＲＮＡなどの）遺伝子産物とハイブリダイズできることを見出した。
【００１９】
すなわち、メラノサイトにおける色素沈着に必須の酵素の発現を調節する本発明のオリゴヌクレオチドは、上記のメラニン形成反応の上流に含まれる。この活性は、非常に低濃度でさえ存在する。これは、これらのオリゴヌクレオチドの利点を増大させる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、細胞毒性を示さない。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、通常使用される物質によって提出される問題に理想的な解決策を提供する。チロシナーゼまたはＴＲＰ−１の活性を阻害する公知の物質（特に、ヒドロキノンとその誘導体、アスコルビン酸とその誘導体、胎盤エキス、麹酸、およびアルブチン）は、それらの特異性の少なさのために多数の受け入れられない副作用を有する。それ故、本発明は、脱色効果を得るために、色素沈着に必須の酵素を直接阻害する代わりに、該酵素の産生を調節することによって、以前の研究者が出会った問題を解決する。
【００２１】
該必須酵素は、複合体の形態で協奏的に機能するので、本発明者らは、提出された問題を解決するために、複合体の酵素の一方または他方の発現を阻害する新規オリゴヌクレオチドを記載した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチドはそれ自体新規であり、医薬品として新規である。
【００２３】
本発明は、色素沈着に必須な酵素の１つをコードする遺伝子または遺伝子産物とハイブリダイズできる、７〜２５、好ましくは９〜２５、１２〜２５、１５〜２５または１８〜２５のヌクレオチド数を含むオリゴヌクレオチドに関する。特に、該オリゴヌクレオチドは、チロシナーゼをコードする遺伝子もしくは遺伝子産物、またはチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）をコードする遺伝子もしくは遺伝子産物とハイブリダイズできる。
【００２４】
より詳細には、本発明は、上記で規定された、そして、チロシナーゼをコードする遺伝子もしくは遺伝子産物またはＴＲＰ−１をコードする遺伝子もしくは遺伝子産物と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドに関する。
【００２５】
特に、それは、その配列が以下に示す配列番号１〜１１の配列から選択されるオリゴヌクレオチドである。
【００２６】
【化１】
【００２７】
本発明の主題はまた、その配列が上記の配列番号１〜１１の配列の１つである新規産物としてのオリゴヌクレオチドである。
【００２８】
本発明の文脈において、表現「チロシナーゼをコードする遺伝子」は、チロシナーゼ遺伝子のゲノム配列を意味するように意図される。同様に、表現「ＴＲＰ−１をコードする遺伝子」は、ＴＲＰ−１遺伝子のゲノム配列を意味するように意図される。
【００２９】
メラニン形成におけるチロシナーゼとＴＲＰ−１の鍵となる役割は、公知である。酵素またはタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡの発現を調節するために、該メッセンジャーＲＮＡに対し向けられたオリゴヌクレオチドの使用も公知である。しかし、本発明の発明者らによって開発された技術は、脱色の手段としては決して使用されなかった。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡまたは遺伝子と直接的にハイブリダイズするように決定される。それ故、それらは、遺伝子によって産生されるチロシナーゼまたはＴＲＰ−１の量の究極の調節を行うことを可能とする。
【００３１】
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、二重ヘリックスの形態で二本鎖を形成するように、通常核酸の２つの鎖上の相補的塩基の間で、ワトソン−クリック対としても知られる、水素結合の形成を示すように使用される。
【００３２】
同一の長さの２つの核酸配列の間の相補性の程度は、アラインメント後、第１配列を、第２配列に相補的な配列と比較することによって決定される。相補性の程度は、比較される２つの配列の間で同一位置のヌクレオチドが同一である同一位置の数を決定し、同一位置のこの数を、位置の総数で割り、得られた結果を１００倍し、これらの２つの配列の間の相補性の程度を得ることによって計算される。
【００３３】
「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、特異的な結合が望まれる条件下、非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を避けるために十分な相補性の程度が存在することを特に意味する。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするために、標的核酸配列と１００％の相補性を有する必要はないことが理解される。特に、少なくとも約８０％に等しい相補性の程度を有するオリゴヌクレオチドは、標的として選択された核酸と特異的にハイブリダイズできる。
【００３４】
本発明のオリゴヌクレオチドは好ましくは、色素沈着に必須の酵素をコードする遺伝子または遺伝子産物と特異的にハイブリダイズする。特に、本発明のオリゴヌクレオチドは、チロシナーゼをコードする遺伝子のＤＮＡもしくはＴＲＰ−１をコードする遺伝子のＤＮＡ、あるいはこれらの遺伝子の一方もしくは他方由来のｍＲＮＡとハイブリダイズできる。本発明のオリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズするために、同一性と数において十分なヌクレオチド数を含む。この性質は通常「アンチセンス」と言われる。
【００３５】
それ故、本発明の主題は、関係する遺伝子のコーディング領域の上流に、もしくはその領域と、あるいはこの遺伝子の翻訳の開始コドンを示す領域と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００３６】
本発明の主題はまた、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードするＤＮＡかまたはメッセンジャーＲＮＡのいずれかと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００３７】
本発明の主題はまた、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子またはｍＲＮＡの、５’非コーディング領域、開始コドンを示す領域、コーディング領域または３’非コーディング領域のいずれかと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。
【００３８】
本発明の文脈において、「チロシナーゼをコードするＤＮＡ」または「ＴＲＰ−１をコードするＤＮＡ」という表現は、エキソンとイントロンの両方、特にエキソンを意味するように意図される。
【００３９】
・ 配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＲＰ−１をコードする遺伝子またはｍＲＮＡの５’非コーディング領域と特異的にハイブリダイズする；
・ 配列番号５の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＲＰ−１をコードする遺伝子またはｍＲＮＡの開始コドンを示す領域と特異的にハイブリダイズする；
・ 配列番号６、配列番号７および配列番号８の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、チロシナーゼをコードする遺伝子またはｍＲＮＡの５’非コーディング領域と特異的にハイブリダイズする；
・ 配列番号９の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、チロシナーゼをコードする遺伝子またはｍＲＮＡのコーディング領域と特異的にハイブリダイズする；
・ 配列番号１０の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、チロシナーゼをコードする遺伝子またはｍＲＮＡの開始コドンを示す領域と特異的にハイブリダイズする；
・ 配列番号１１の配列の本発明のオリゴヌクレオチドは、ＴＲＰ−１をコードする遺伝子またはｍＲＮＡの５’非コーディング領域と特異的にハイブリダイズする；
ということを明記する。
【００４０】
本発明の主題はまた、生体利用性の増大、標的配列へのアフィニティの増大、細胞内部取り込みの増大、またはより良好な生物学的安定性もしくは細胞ヌクレアーゼの存在下の安定性の増大などの本発明のオリゴヌクレオチドに所望の物理化学的特徴を付与する、糖成分、ヌクレオベース成分、またはヌクレオチド間骨格への１つ以上の化学修飾を含むオリゴヌクレオチドである。
【００４１】
例を挙げると、これらの特徴を付与できる修飾は、ヌクレオシドの糖成分上の２’−Ｏ−アルキルや２’−Ｏ−フルオロ誘導体、およびヌクレオチド間骨格内のホスホロチオエート誘導体もしくはメチル・ホスホネート誘導体である。
【００４２】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然のホスホジエステル結合を介し互いに結合するヌクレオシドを形成する天然のヌクレオベース基とペンタフラノシル（糖）基から作製されるポリヌクレオチドを指す。それ故、「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然サブユニットまたはその密接なホモローグから作製される天然の種または合成の種を指す。
【００４３】
「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、天然オリゴヌクレオチドと同様の機能をもつが、非天然部分を有し得るコンポーネントをも指し得る。該オリゴヌクレオチドは、修飾された糖成分、修飾されたヌクレオベース成分または修飾されたヌクレオチド間結合を有し得る。可能な修飾のうち、好適な修飾は、糖成分上の２’−Ｏ−アルキル誘導体、特に２’−Ｏ−エチルオキシメチルもしくは２’−Ｏ−メチル誘導体、またはヌクレオチド間骨格のホスホロチオエートもしくはメチル・ホスホネートである。
【００４４】
キメラオリゴヌクレオチドは、本発明の優先的な修飾に含まれる。該オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの化学的に異なる領域を含み、各々は少なくとも１つのヌクレオチドを含む。特にそれは、例えば、より良好な生物学的安定性、生体利用性の増大、細胞内取り込みの増大、または標的ＲＮＡへのアフィニティの増大などの１つ以上の有益な性質を付与する修飾ヌクレオチドを含む１つ以上の領域を含む。
【００４５】
好ましくは、ヌクレオチド間骨格は、完全に、または部分的にホスホジエステル、ホスホロチオエート、もしくはメチル・ホスホネート、またはホスホジエステルおよび／もしくはホスホロチオエートおよび／もしくはメチル・ホスホネート結合の組み合わせからなりうる。
【００４６】
それ故、本発明のオリゴヌクレオチドは、そのヌクレオチド間骨格のホスホジエステル基の幾つかが、ホスホロチオエート基および／またはメチル・ホスホネート基で置き換えられていることを特徴とする。
【００４７】
あるいは、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル基の全てが、ホスホロチオエート基またはメチル・ホスホネート基によって置き換えられることを特徴とする。
【００４８】
あるいは、ホスホジエステル基は完全に、または部分的に、ホスホロチオエート基および／またはメチル・ホスホネート基によって置き換えられる。
【００４９】
「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、オリゴヌクレオチドの上に、プラスミド型の環状投与ベクターまたは核酸型もしくはペプチド型の線形投与ベクターが接ぎ木されたオリゴヌクレオチドをも指し得る。
【００５０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、医薬品として新規である。
【００５１】
本発明の主題はまた、上記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと化粧用もしくは皮膚病用に許容され得る媒質を含む化粧用組成物もしくは皮膚病用組成物である。このような組成物はまた、所望の効果を強化することを意図した１つ以上の活性剤を含みうる。
【００５２】
本発明の主題はまた、ヒト皮膚、体毛もしくは頭髪の脱色もしくは漂白、またはヒト皮膚上の色素斑点の除去もしくは軽減のための、化粧用組成物または皮膚病用組成物の製造における、またはそのための、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列の使用である。
【００５３】
本発明はまた、特にヒト皮膚、体毛もしくは頭髪の脱色もしくは漂白、およびヒト皮膚上の色素斑点の軽減のための化粧剤として、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子または遺伝子産物と特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００５４】
本発明の主題はまた、メラニン合成の阻害剤として化粧用組成物または皮膚病用組成物の製造における、またはそのための、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列の使用である。
【００５５】
本発明はまた、局所経路を介しての、チロシナーゼおよび／またはＴＲＰ−１の過剰発現を生じる疾患の治療または予防を意図した医薬品の製造のための上記の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの使用にも関する。この医薬品は、メラニン合成の阻害、特に皮膚の脱色もしくは漂白のためばかりではなく、特発性黒皮症などのメラノサイト活動過剰による局所性色素過剰症、老年性色素斑点（老年性黒子）などの良性メラノサイト活動過剰と増殖による局所性色素過剰症、および光感受性もしくは病変後瘢痕化などの偶発性色素過剰症の治療もしくは予防、並びに白斑などのある種の白斑症の治療が意図され得る。
【００５６】
本発明の主題はまた、ヒト皮膚用の脱色用もしくは漂白用化粧用組成物における、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列の使用である。
【００５７】
本発明はまた、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１の発現を制御するための、上記オリゴヌクレオチドの使用にも関する。
【００５８】
本発明の主題はまた、ヒト皮膚用の脱色用もしくは漂白用皮膚病用組成物の製造のための、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列の使用でもある。
【００５９】
本発明はまた、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含む化粧用組成物を、色素沈着皮膚に適用することに存する、ヒト皮膚を脱色または漂白する化粧用または皮膚病用処置方法にも関する。
【００６０】
本発明の主題はまた、化粧用または皮膚病用に許容され得る媒質中に、色素沈着に必須の酵素の１つ、特にチロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子の転写産物に対し向けられた少なくとも１つのオリゴヌクレオチド配列を含むことを特徴とする脱色用組成物である。
【００６１】
上記組成物、使用および処置方法のための本発明の好適な実施態様によれば、オリゴヌクレオチドは、その配列が以下に規定されるものの１つであるものである。
【００６２】
【化２】
【００６３】
本発明の化粧用または皮膚病用組成物は局所使用に適切であり、それ故、化粧用または皮膚病用に許容され得る媒質、すなわち、皮膚と適合性のある媒質を含む。本発明のオリゴヌクレオチド配列は、組成物の総重量の０．００００１％〜１０％、好ましくは０．０００３％〜３％の範囲の量で存在し得る。
【００６４】
本発明の組成物は、局所適用のために通常使用される全ての医薬形態、特に、水性、水性−アルコールもしくは油性溶液の形態で、水中油型、油中水型もしくはマルチプルエマルションの形態で、水性ゲルもしくは油性ゲルの形態で、液体産物、ペースト産物もしくは固体無水産物の形態で、水相もしくは油相中の、ナノ球体やナノカプセルなどの重合粒子の分散の形態で、または米国特許第4,508,703号に記載のイオン性もしくは非イオン性型の液体ベシクルの分散の形態で提供し得る。
【００６５】
この組成物は多かれ少なかれ流動性であり得、白もしくは色のついたクリーム、軟膏、ミルク、ゲル、ローション、セラム、ペーストまたはムースの外観を有し得る。それは場合によっては、エーロゾルの形態で皮膚に適用し得る。それはまた、粉末でもよく、もしくはそうでなくともよい固体形態で、例えば、スティックもしくはぎっしり詰まった粉末の形態でも提供し得る。それはまた、パッチの形態で、鉛筆の形態で、ブラシの形態で、および顔もしくは手の斑点への局所適用を可能とする塗薬用具の形態で提供し得る。それは、医療産物または化粧産物として使用され得る。
【００６６】
公知の様式において、本発明の組成物はまた、親水性もしくは親油性ゲル化剤、親水性もしくは親油性活性剤、保存剤、抗酸化剤、溶剤、香料、充填剤、遮蔽剤、色素、臭い吸収剤および染料などの、化粧品や皮膚病学で普通であるアジュバントを含みうる。これらの種々のアジュバントの量は、考慮分野で通常使用される量である。性質により、これらのアジュバントは、脂肪相、水性相、液体ベシクル、またはナノ粒子中に導入され得る。
【００６７】
本発明の化粧用組成物または皮膚病用組成物がエマルションであるとき、脂肪相の割合は、一般的に、組成物の総重量に対し５〜８０重量％、好ましくは５〜５０重量％の範囲でありうる。エマルション形態の組成物で使用される油、乳化剤および乳化補助剤は、考慮分野で通常使用されるものから選択される。乳化剤および乳化補助剤は、一般的に組成物の総重量に対し０．３〜３０重量％、好ましくは０．５〜２０重量％の範囲の割合で組成物に存在する。
【００６８】
本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用し得る油として、鉱油（液体ワセリン）、植物起源の油（アボカド油、大豆油）、動物起源の油（ラノリン）、合成油（ペルヒドロスクアレン）、シリコーン油（シクロメチコン）およびフルオロ油（ペルフルオロポリエーテル）に言及できる。脂肪アルコール（セチルアルコール）、脂肪酸およびワックス（カルナウバワックス、オゾケライト）も脂肪物質として使用できる。
【００６９】
本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用できる乳化剤および乳化補助剤は、例えば、ＰＥＧ−２０ ステアレートなどの、ポリエチレングリコールの脂肪酸エステルや、グリセリルステアレートなどの、グリセロールの脂肪酸エステルに言及できる。
【００７０】
本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用できる親水性ゲル化剤として、特に、カルボキシビニルポリマー（カルボマー）、アクリレート／アルキルアクリレートコポリマーなどのアクリル酸コポリマー、ポリアクリルアミド、ポリサッカライド、天然ゴムおよび粘土に言及できる。親油性ゲル化剤として、ベントンなどの改変粘土、脂肪酸の金属塩、疎水性シリカおよびポリエチレンに言及できる。
【００７１】
本発明の主題は、少なくとも１つの上記オリゴヌクレオチドと１つ以上の他の活性剤を含む化粧用または皮膚病用組成物である。
【００７２】
本発明はまた、１つ以上の活性剤と組み合わせて、同時に、もしくは別々に、または時間をかけた方法で投与するように意図された医薬品の製造のための、少なくとも１つの上記オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００７３】
本発明のオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用でき、純粋に使用する、またはこれらの分子を含む抽出物起源の活性剤は、特に以下の化合物である。エラグ酸とその誘導体；ヒドロキノン；アルブチン；レゾルシノールとその誘導体；ビタミンＣとその誘導体；パントテネート・スルホネートとその誘導体；麹酸；胎盤エキス；アルファ−メラノサイト−刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）もしくはそのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を、直接的または間接的に妨害する分子；グリセロール、グリコールまたはプロピレングリコールなどのポリオール；ビタミン；サリチル酸とその誘導体などの角質溶解剤または落屑剤；単独または接ぎ木された、乳酸またはリンゴ酸などのα−ヒドロキシ酸；アスコルビン酸とその誘導体；レチノイン酸；レチンアルデヒド；リポソーム調製物中でありうるし、またはそうでないこともありうるレチノールと、パルミテート、プロピオネートまたはアセテートなどのその誘導体；トコフェロールとその誘導体、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミン・ピロホスフェート、ピリドキサミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシン、アデノシン・トリホスフェートなど、単独で、または組み合わせての抗グリケーション剤または抗酸化剤；グリチルレチン酸ステアリルなどの抗炎症剤；無痛化剤とその混合物、微粉状酸化亜鉛、酸化チタン、ブチルメトキシジベンゾイルメタンおよびメトキシケイヒ酸オクチルなどの化学的または物理的日焼け止め；並びにデオキシリボ核酸または核酸。不適合の場合、これらの他の活性剤および／または本発明のオリゴヌクレオチドは、小球体、特に、米国特許第4,508,703号に記載のイオン性または非イオン性両親媒性脂質から作製されるベシクル中に導入され得る。
【００７４】
以下の実施例は、本発明を限定すること無しに本発明を説明する。
【００７５】
インビトロの培養培地での安定性のために、そして通常の実施に従い、実施例２〜４は、ホスホロチオエート誘導体で行い、実施例５〜１２は、ホスホロチオエート誘導体またはホスホジエステル誘導体で等しく準備された。
【００７６】
以下の実施例では、全てのパーセンテージは、異なるように記載されていなければ、重量による。
【実施例】
【００７７】
実施例１：オリゴヌクレオチド合成
実施例として、標準ホスホルアミダイト誘導体化学による自動合成器（PerseptiveBiosystems Expedite モデル8909）を用い、製造者のプロトコルを用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。会社Perseptive Biosystemsによってβ−シアノエチルジイソプロピルホスホルアミダイトが供給された。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドについて、ヨウ素溶液を用いてホスファイト酸化工程を実施した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに関して、無水アセトニトリル中の３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドの０．０５Ｍ溶液を用いて、ホスファイト酸化工程を実施した。カラム（Controlled Pore Glass, Perseptive Biosystems）からの切断、および３３％水性アンモニア溶液を用いて５５℃、１８時間の処理による配列の全脱保護の後、酢酸ナトリウムの存在下、エタノール中で沈殿させることによって、オリゴヌクレオチドを精製した。塩化ナトリウムの勾配を用いた溶離によるイオン交換クロマトグラフィーによって、および酢酸トリエチルアンモニウムの存在下でアセトニトリルの勾配を用いた溶離によるＣ１８逆相クロマトグラフィーによって、高速液体クロマトグラフィーの制御を実施した。
【００７８】
合成したオリゴヌクレオチドを表１に記載する。それらは、配列番号１から配列番号１１まで番号付けられた、この表の最初の１１の配列である。それらの脱色活性は、以下の実施例で報告する研究の主題であった。
【００７９】
表１では、配列の各端部の下に付けられた番号は、起源の配列におけるオリゴヌクレオチドの位置を示す。
【００８０】
配列は、それぞれ、ヒトチロシナーゼｃＤＮＡの「ＨＵＭＴＹＲＡ」と呼ばれる配列（Shibaharaら、Tohoku J. Exp. Med. 156: 403（1988）により発行）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ２７１６０）、ヒトＴＲＰ−１ ｃＤＮＡの「ＨＳＴＹＲＲＰ」と呼ばれる配列（Cohenら、Nucl. Acides Res. 18: 2807（1990）により発行）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｘ５１４２０）および「ＡＦ００１２９５」と呼ばれるＴＲＰ−１の別の配列 （Boxら、Mamm. Genome 9:50（1998）により発行）（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ００１２９５）由来である。
【００８１】
さらに、チロシナーゼまたはＴＲＰ−１をコードする遺伝子または遺伝子の産物に関して、本発明のオリゴヌクレオチドの特異性を確認するための比較として、本発明の配列番号２に基づく２つのオリゴヌクレオチドを合成した。すなわち：
※ 表１に配列番号１２で示した、「センスコントロール」と呼ばれる配列。これは配列番号２の塩基の順序を逆にしてなる。
※ 同様に表１に配列番号１３で示した、「スクランブルコントロール」と呼ばれる配列。これは配列番号２の塩基と性質および数が同じ塩基を含むが、任意の順序で配置されている。
【００８２】
【表１】
【００８３】
実施例２：正常ヒトメラノサイト（ＮＨＭ）に対する、本発明のオリゴヌクレオチドの脱色効果
実施例１の表１にある、本発明のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号１１）を、メラニン形成に対するそれらの作用について、それ故メラノサイトによるメラニン色素の産生を調節するそれらの能力について研究する。「センスコントロール」（配列番号１２）および「スクランブルコントロール」（配列番号１３）オリゴヌクレオチドもまた、比較の要素として、この作用について研究する。
【００８４】
メラニン形成の反応機構の間、チロシナーゼおよびＴＲＰ−１が酵素複合体を形成し、この複合体がＬ−ドーパのドーパキノンへの、次いでドーパクロムへの変換を触媒することが思い出される。これらの２つの酵素は協力して作用し、それらはお互いがないと決して機能しないようである。実際、ＴＲＰ−１に対して指向したアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることによって細胞をＴＲＰ−１枯渇させる場合、チロシナーゼ（「ドーパオキシダーゼ」とも呼ばれる）活性の減少が観察される。チロシナーゼはまた、その多機能特性のため、「ドーパオキシダーゼ」とも呼ばれる；実際、チロシンのドーパへの酸化の間にドーパオキシダーゼと同じ機能を実行する。
【００８５】
本アッセイの原理は、基質として用いたＬ−ドーパのドーパクロムへの変換におけるドーパオキシダーゼについての反応速度を測定することに基づく。ドーパクロムの発現は、所定の時間間隔で光学濃度を測定することによって定量され、これによって、試験した各オリゴヌクレオチドに関して、およびコントロールアッセイに関して、ドーパオキシダーゼについての反応速度を計算することが可能となる。得られる結果に基づいて、それ故試験したオリゴヌクレオチドのメラニン形成に対する作用を評価することが可能である。コントロールアッセイと比較した反応速度の低下は、酵素活性の減少、およびその結果としてのメラニン色素の形成の減少、それ故脱色効果に対応する。
【００８６】
メラノサイト培養物の調製およびオリゴヌクレオチドでの処理
メラノサイトをコーカソイド系の子供の包皮から得る。皮膚フラグメントをＰＢＳ（Gibco, Paisley, GB）、次いで７０％エタノールですすぐ。ＰＢＳでの最後の洗浄後、最小限の真皮を含む細い１ｍｍの細片に皮膚を切断する。細片を０．２５％トリプシン溶液（Gibco, Paisley, GB）中、４℃で一晩インキュベートすることによって、真皮および表皮を分離する。インキュベーション後、細胞をメスでこすることによって表皮細胞を回収する。ウシ胎仔血清（Gibco, Paisley, GB）を１０％（Ｖ／Ｖ）含むＥ−１９９培地（Gibco, Paisley, GB）中に細胞を置くことによって、トリプシンの作用を停止させる。ホモジナイズし、表面に浮遊する角質細胞の除去後、細胞懸濁物を濾過し、遠心分離し、そしてペレットを接着培地（培地１）中に置く。その組成を以下の表に与える。ここで、ＥＧＦは表皮成長因子を示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
細胞集団の計数後、細胞を２０００００／ｃｍ2の割合でフラスコ中に接種する。湿度を飽和させ、かつ５％のＣＯ2を含む大気中、３７℃で細胞を維持する。細胞を接着させた後、接着培地をＫＳＦＭ培地（Gibco, Paisley, GB）で置き換え、これを４８時間毎に取り替える。
【００８９】
そのようにして培養中に置いた表皮細胞によって、ケラチノサイト−メラノサイト共培養物を得ることが可能となる。この共培養物が約７０％の集密になるとすぐに、ＫＳＦＭ培地を選択培地（培地２）で置き換える。この選択培地は、メラノサイトの増殖を促進し、その組成は以下の表にある。ここで、ＩＢＭＸは３−イソブチル−１−メチルキサンチンを示し、ＰＭＡはホルボール１２−ミリステート１３−アセテートを示す。
【００９０】
【表３】
【００９１】
４８〜７２時間後、０．１％トリプシン−０．０５％ＥＤＴＡ混合物（Gibco, Paisley, GB）を室温で１〜２分間用い、細胞をフラスコから引き離す。得られる細胞懸濁物を遠心分離し、選択培地に最懸濁させる。２４〜４８時間後、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．１％−０．０５％）混合物を用い、室温で１〜２分間、細胞を再び処理し、次いでメラノサイトに特異的な増殖培地（培地３）に再接種する。
【００９２】
培地３は１０％の培地２と９０％の培地Ａとからなる。培地Ａはケラチノサイト培地ＳＦＭ（Gibco, 17005-034）である。
【００９３】
この段階では、得られる細胞集団は純粋であり、正常ヒトメラノサイト（ＮＨＭ）のみからなる。
【００９４】
研究前、強力な代謝活性化剤、例えばホルボールエステルまたはＩＢＭＸを含まない培地（培地４）にＮＨＭを１週間置く。
【００９５】
培地４は１０％の培地Ｂと９０％の上記の培地Ａとからなる。培地Ｂの組成は以下の表に記載する。
【００９６】
【表４】
【００９７】
２００μｌの培地４中、ウェル当たり１００００細胞の割合で、ＮＨＭを９６ウェルマイクロプレート（Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA）に接種する。
【００９８】
試験するオリゴヌクレオチドを、それぞれ１０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭおよび１μＭの濃度で、研究培地中でその場で調製する。種々のオリゴヌクレオチドでの処理は、７日間毎日行う。各濃度について、３回のアッセイを実施する。
【００９９】
ドーパオキシダーゼ活性についての反応速度の測定
７日間にわたって分けられたこれらの処理の終わりに、チロシナーゼすなわち「ドーパオキシダーゼ」活性を測定する。
【０１００】
細胞をＰＢＳですすぎ、次いで、ＰＢＳ（Gibco, 14190-094）中の溶解緩衝剤（０．５％ Triton X100（Sigma, T-9284））５０μｌをウェルに加え、プレートを４℃で１時間振盪する。各ウェルに５０μｌの基質（１０ｍＭ Ｌ−ＤＯＰＡ、Sigma）を加えることによって、反応を開始させる。光学濃度読み取り器であるマイクロプレート読み取り器340 ATTC（SLT-Labinstrument, Grodig/Salzburg, Austria）を用い、一定に振盪しつつ、３７℃で１時間、２分毎に４５０ｎｍで、ドーパクロムの発現を測定する。反応速度を計算し、１０-4ＯＤ単位／分として表す。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドで処理した培養物について、およびコントロール（処理していない）培養物について、得られた結果を表２（σ：標準偏差）に与える。
【０１０２】
【表５】
【０１０３】
【表６】
【０１０４】
【表７】
【０１０５】
本発明のオリゴヌクレオチド（配列番号１〜配列番号１１）でメラノサイト培養物を処理することにより、ドーパオキシダーゼ活性についての反応速度の減少が導かれることが、表２にある結果から明確に分かる。この減少は、配列番号１〜配列番号６のオリゴヌクレオチドについて特に明確である。
【０１０６】
一方、配列番号２のオリゴヌクレオチドに関しての比較のために試験したオリゴヌクレオチド、すなわち配列番号１２の「センスコントロール」および配列番号１３の「スクランブルコントロール」について、ドーパオキシダーゼ活性についての反応速度の増加は、試験した各濃度で顕著である。例えば、１００ｎＭの濃度では、「センスコントロール」および「スクランブルコントロール」について、反応速度はそれぞれ２．２％および１１．７％増加し、一方、本発明による配列番号２のアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合は２８．８％減少する。
【０１０７】
本発明のオリゴヌクレオチド（これはドーパオキシダーゼ活性についての反応速度を減少させる）の活性は、チロシナーゼをコードするかまたはＴＲＰ−１をコードする標的メッセンジャーＲＮＡとの、該オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションに起因することが、後者の観察から推定することができる。
【０１０８】
結果として、このオリゴヌクレオチド／ｍＲＮＡ相互作用は、標的化メッセンジャーＲＮＡによって行われる情報の翻訳を妨げ、それ故、使用するアンチセンス配列に応じてチロシナーゼまたはＴＲＰ−１の細胞内発現の減少を導く。言い換えれば、この相互作用は、チロシナーゼまたはＴＲＰ−１の新合成（neosynthesis）を減少させる。これらの酵素の天然の再生ゆえに、これは、細胞中のチロシナーゼおよびＴＲＰ−１の量の減少、およびその結果としてメラニンの合成と一致したこれらの酵素の活性の減少を導く。実際、本発明のオリゴヌクレオチドは、メラノサイト中に既に存在するチロシナーゼに作用する代わりに、チロシナーゼおよびＴＲＰ−１の再生を減少させることによって作用する。
【０１０９】
メラノサイトに対するこの作用の結果は、これらの細胞のメラニンを合成する能力が減少し、それ故場合および関係する個体に応じて、漂白または脱色効果が生み出されることである。
【０１１０】
実施例３：ムラートの成人ドナー由来の正常ヒトメラノサイトに対する、本発明のオリゴヌクレオチドの脱色効果
ここで使用するメラノサイトは、ムラートの成人ドナーの大腿由来の皮膚から得る。皮膚断片をＰＢＳ（Gibco, Paisley, GB）でリンスし、次いでＰＢＳ中５０％まで希釈した７０％エタノール（Ｖ／Ｖ）で洗浄する。ＰＢＳによる洗浄後、コーンカッターを使用して皮膚断片をこする。得られる小片を０．０５％トリプシン（Difco Laboratories, WestMolesy, GB）中で３７℃１時間こすり、解離させる。次いで、表皮を、ウシ胎仔血清（FCS, Gibco, Paisley, GB）を１０％含むＥ−１９９培地（Gibco, Paisley, GB）中に回収する。ホモジナイズし、表面に浮遊する角質層断片を除去した後、細胞懸濁物をろ過し、次いで遠心分離する。得られる細胞ペレットを実施例２に記載した培地１中にとる。細胞をカウントし、トリパンブルー排除アッセイを用いて、Ｔｈｏｍａ細胞において細胞生存度を測定する。表皮細胞を、８００００細胞／ｃｍ2の割合で、フラスコ中の培地１に最終的に接種する。湿気を飽和させＣＯ2を５％含む雰囲気で、３７℃で細胞を維持する。
【０１１１】
培地１を培地６と交換する。培地６の組成は下記の表に明記する。表中、Ｂ−ＦＧＦは塩基性線維芽細胞成長因子を示し、ＰｄＢｕはホルボール１２，１３−ジブチラートを示す。
【０１１２】
【表８】
【０１１３】
この培地を１〜２週間、４８時間ごとに新しくする。
【０１１４】
このメラノサイトの選択の後、培地６を培地７に換えることによって、ＮＨＭ増殖を促す。
【０１１５】
培地７は、培地Ｃ（１０％）と上述した培地Ａ（９０％）からなり、ＰｄＢｕ（Sigma,
P-1269）を補充する（培地中での最終濃度は０．２５μｇ／ｍｌ）。
【０１１６】
【表９】
【０１１７】
この段階では、得られる細胞集団は純粋なものである。それはＮＨＭのみからなる。
【０１１８】
ＮＨＭを、培地６中、９６ウェルマイクロプレート（Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA）に接種する。２４時間後、培地を培地８と交換する（これをこの研究の最後まで使用する）。培地８の組成を以下に記載する。
【０１１９】
【表１０】
【０１２０】
オリゴヌクレオチド（配列番号２）を５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭおよび１μＭの濃度で、研究培地に即座に加える。この処理を７日間毎日行う。各濃度について、６回のアッセイを行う。
【０１２１】
ドーパオキシダーゼ活性の反応速度の測定
７日間に分けたこれらの処理の終わりに、ドーパオキシダーゼ活性を測定する。これらの測定は実施例２と同じ方法で行う。反応速度を計算し、１０-4ＯＤ単位／分として表す。
【０１２２】
オリゴヌクレオチド（配列番号２）で処理した培養物および未処理コントロール培養物について得られる結果を表３に示す（σ：標準偏差）。
【０１２３】
【表１１】
【０１２４】
上記結果により、極めて低いオリゴヌクレオチド濃度（１００ｎＭ）以上で、ドーパオキシダーゼ活性の反応速度は極めてかなり減少することが観察される。
【０１２５】
従って、実施例２の結論で既に説明したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、メラノサイトがメラニンを合成する能力を減少させる。本アッセイにおいて、この減少が関係者の遺伝的性質とは関係がないことが示される。
【０１２６】
本実施例では、浅黒い肌の色に相当する基本的な色素沈着を有するムラートのドナーを含んでいるので、本発明のオリゴヌクレオチドの使用は、漂白効果、すなわち皮膚の色を明るくすることを導くだろう。
【０１２７】
実施例４：本発明のオリゴヌクレオチドによる、正常ヒトメラノサイトにおけるＵＶ誘導メラニン形成の阻害の研究
上記実施例の結果に引き続き、本アッセイの目的は、メラノサイトを刺激により（この場合、ＵＶＢ紫外線照射（２８０〜３２０ｎｍ）により）活性化した場合、本発明のオリゴヌクレオチドもまた活性であるかどうかを確認することである。換言すれば、オリゴヌクレオチドが、メラニン形成の刺激とは無関係に、メラノサイトのドーパオキシダーゼ活性を減少させる能力を評価することを含んでいる。
【０１２８】
この趣旨で、本アッセイは、コーカソイド系の成人ドナー由来のメラノサイトに関する。ここで使用するメラノサイトは、乳房形成術由来の皮膚から得る。これらのメラノサイトを得る技術は、実施例３で使用し記載したものと同じである。
【０１２９】
実験は３５ｍｍディッシュで行う。メラノサイトを３５ｍｍディッシュ（Falcon, Flanklin Lakes, NJ. USA）に、１ディッシュあたり、２５００００細胞および培地８（２ｍｌ）の割合で接種する。培地８の組成は実施例３に記載する。オリゴヌクレオチド（配列番号２）、また８ｍＪ／ｃｍ2のＵＶＢ照射（Bio-Energie, Vilbert-Lourmat, Marne-la-Vallee, France）による処理を接種後２４時間後に始める。
【０１３０】
各ＵＶＢ照射の前に、ＮＨＭをＰＢＳ（２ｍｌ／ディッシュ）中に置く。照射後、オリゴヌクレオチド（配列番号２）を含むかもしれないし、含まないかもしれない培地８（２ｍｌ）中に細胞を再び置く。
【０１３１】
オリゴヌクレオチド（配列番号２）を研究培地（実施例３の培地７）に、１００ｎＭ、２５０ｎＭおよび５００ｎＭの濃度で即座に加える。
【０１３２】
オリゴヌクレオチドによるこれらの処理を９日間毎日行う。照射は、５日目と６日目以外は毎日行う。各濃度について、３回のアッセイを行う。
【０１３３】
ドーパオキシダーゼ活性の反応速度の測定：
これらの処理（すなわちオリゴヌクレオチドでの９日間の処理と７回の照射）の終わりに、ドーパオキシダーゼ活性を測定する。
【０１３４】
この趣旨で、ＮＨＭを５００μｌの０．１％トリプシン−０．０５％ＥＤＴＡを用いて３５ｍｍディッシュから引き離し、フェノールレッド（Gibco）を含まず１０％のウシ胎仔血清を補充したＥ−１９９培地（１．５ｍｌ）にとる。この細胞懸濁物のアリコート部分を細胞の計測に使用し、その他は遠心分離し、得られるメラノサイトのペレットを５０μｌの溶解緩衝液に取り出して、実施例２に記載したようにドーパオキシダーゼの反応速度を測定する。
【０１３５】
ドーパオキシダーゼ活性の反応速度を計算し、１０-4ＯＤ単位／分／１０6ＮＨＭとして表す。得られる結果を表４に示す（σ：標準偏差）。
【０１３６】
【表１２】
【０１３７】
上記結果は本発明のオリゴヌクレオチドが、ＵＶＢ照射の影響下刺激を受けたメラノサイトの場合、ドーパオキシダーゼ活性の反応速度を、極めてかなり減少させることを明確に示している。
【０１３８】
従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、先の実施例で示されたような、基底の活性状態にあるメラノサイトがメラニンを合成する能力を減少させるだけでなく、活性化状態にあるメラノサイトのこの能力も減少させる。それ故、これらのオリゴヌクレオチドはまた、特に日光に存在する紫外線照射により誘発される色素沈着を予防または軽減するために使用され得る。
【０１３９】
実施例５：顔の肌の色を明るくするためのパウダー
マイクロセルロース ２０．００％
ラウリルスルホ酢酸ナトリウム １５．００％
オリゴヌクレオチド（配列番号５）（ホスホジエステル） １．００％
香料、着色料、保存剤 適量
タルク 適量で１００％
【０１４０】
このパウダーは２つの作用を有する。それは、皮膚の汚れを落とすことを可能にし、さらに、数日間定期的に使用した場合、それは、肌の色を明るくすることを可能にする。それは、顔の皮膚に１日１〜２回適用され得る。
【０１４１】
実施例６：顔用脱色デイエマルションゲル
グリセロール ５．００％
カプリル酸／カプリン酸／コハク酸トリグリセリド ５．００％
メトキシケイヒ酸オクチル １．００％
ジメチコンコポリオール ０．５０％
アクリレート／Ｃ10−Ｃ30アルキルアクリレートクロスポリマー ０．５０％
オリゴヌクレオチド（配列番号３）（ホスホジエステル） ０．０１％
中和剤 適量
保存剤、香料、着色料 適量
水 適量で１００％
【０１４２】
多かれ少なかれ日光からまたは直接太陽光からさえ激しい照射に曝されているいくらかの個人は、明るい肌の色を維持し、色素性の斑点の出現をさけたいと思っている。上記エマルションゲルの使用は、この目的を達成することを可能とするだろう。この組成物は通常朝、顔に適用する。それは、顔の色素沈着に対して、予防的および治癒的の両方で作用する（それは等しいかもしれないし等しくないかもしれない）。
【０１４３】
実施例７：色素斑点を予防するためのＳＰＦ３０保護液
揮発性ペンタシクロメチコン ４９．００％
二酸化チタン １５．００％
メトキシケイヒ酸オクチル ７．５０％
グリセロール ５．００％
フェニルトリメチコン ５．００％
ジメチコンコポリオール ３．００％
ポリメチルメタクリレート ２．５０％
ブチルメトキシジベンゾイルメタン １．００％
オリゴヌクレオチド（配列番号２）（ホスホジエステル） ０．１％
中和剤、香料、保存料、抗酸化剤 適量
水 適量で１００％
【０１４４】
この組成物は、色素斑点の出現を、この現象が起こりやすい個体において、予防するために、太陽からの激しい照射に曝される前に、使用されるものである。高濃度の日焼け止めの存在が、メラニンレベルの低下の結果である生来の保護の減少を補填することを可能とすることに留意すべきである。
【０１４５】
実施例８：脱色フェイスクリーム
グリセリルステアレート＋Ｐｅｇ−１００ステアレート ５．００％
硬化ポリイソブテン ４．００％
マグネシウムアスコルビルホスフェート ３．３０％
トリカプリル酸／カプリン酸グリセリル ３．００％
スクアレン ３．００％
グリセロール ２．００％
ミツロウ １．５０％
セテアリルオクタノエート １．５０％
セチルアルコール １．００％
ステアリルアルコール １．００％
ジメチコン １．００％
キサンタンガム ０．３０％
エチレンジアミンテトラ酢酸 ０．２０％
クエン酸 ０．１０％
クエン酸ナトリウム ０．１０％
オリゴヌクレオチド（配列番号６）（ホスホジエステル） ０．１０％
中和剤、香料、保存剤 適量
水 適量で１００％
【０１４６】
このクリームの使用は、老年性色素斑点または光線性色素斑点を軽減するかまたは除去することによって、皮膚の色素沈着の不規則性を処置することを可能とする。それは、皮膚の色を均一にし、肌の色を明るくする。
【０１４７】
実施例９：肌の色を明るくするためのフェイスローション
エチルアルコール ３０．００％
ＰＰＧ−３ミリスチルエーテル ５．００％
グリセロール ２．００％
カルボマー ０．２０％
ポリソルベート２０ ０．２０％
オリゴヌクレオチド（配列番号４）（ホスホロチオエート） ０．０１％
中和剤、香料、保存剤 適量
水 適量で１００％
【０１４８】
この肌の色を明るくするためのローションは、化粧を落とし、肌の汚れを落とした後に、使用される。
【０１４９】
実施例１０：肌の色を明るくするためのフェイスセラム
【０１５０】
【表１３】
【０１５１】
この非常に濃縮されたセラム組成物１滴を、通常フェイスクリームの塗布前に顔に適用する。このセラムは、肌の色を明るくすることを達成するかまたは維持するために、１〜２週間の処置として通常は使用される。
【０１５２】
実施例１１：頭髪を明るくするためのヘアローション
水 適量で１００％
アルコール ５０％
パンテニルエチルエーテル ０．５％
酢酸ＤＬ−α−トコフェロール ０．２％
ポリソルベート６０ １％
オリゴヌクレオチド（配列番号１）（ホスホロチオエート） ０．０１％
香料 ０．２％
グリセロール ０．５％
着色料 適量
【０１５３】
このローションは、頭髪を徐々に明るくするために必要な期間、朝晩、髪に適用する。この期間は通常数週である。
【０１５４】
実施例１２：ハンドクリーム（抗斑点ゲルクリーム）
カプリル酸／カプリン酸ジグリセリルスクシネート ６％
オクチルオクタノエート ２．５％
メトキシケイヒ酸オクチル ６％
オリゴヌクレオチド（配列番号５）（ホスホジエステル） ０．００１％
フェニルトリメチコン ２．５％
ベンゾフェノン−３ ０．５％
ヒアルロン酸ナトリウム ０．０５％
キサンタンガム ０．２％
アクリレート／Ｃ10−Ｃ30アルキルアクリレートコポリマー ０．５％
グリセロール ２％
ＰＥＧ１５０ ３％
中和剤、着色剤、香料、保存剤 適量
精製水 適量で１００％
【０１５５】
このクリームは、手の老年性色素斑点（老年性黒子）に、その着色を軽減するため、直接適用すべきである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メラニン合成経路に含まれる必須酵素の１つをコードする遺伝子または遺伝子産物とハイブリダイズできる、１８〜２５のクレオチド数を含むオリゴヌクレオチドであって、該酵素がチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）であり、且つ該オリゴヌクレオチドが配列番号１〜配列番号５及び配列番号１１のいずれか１つと少なくとも８０％に等しい相補性の程度を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
２０ヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列が、以下：
【化１】
で示される配列番号１〜５または配列番号１１の配列の１つである、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドの糖成分、ヌクレオベース成分、またはヌクレオチド間骨格への１つ以上の化学修飾を含むオリゴヌクレオチドであって、該修飾が、生体利用性の増大、標的核酸へのアフィニティの増大、細胞内部取り込みの増大、またはより良好な生物学的安定性もしくは細胞ヌクレアーゼの存在下の安定性の増大を付与する、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドの糖成分が２’−Ｏ−フルオロまたは２’−Ｏ−アルキル置換基を含むことを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドの糖成分が２’−Ｏ−エチルオキシメチルまたは２’−Ｏ−メチル置換基を含むことを特徴とする請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間骨格のホスホジエステル基の幾つかが、ホスホロチオエート基で置き換えられていることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間骨格のホスホジエステル基の幾つかが、メチル・ホスホネート基で置き換えられていることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
ホスホジエステル基の全てがホスホロチオエート基で置き換えられていることを特徴とする請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
ホスホジエステル基の全てがメチル・ホスホネート基で置き換えられていることを特徴とする請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ホスホジエステル基が完全に、または部分的に、ホスホロチオエート基および／またはメチル・ホスホネート基で置き換えられていることを特徴とする請求項７または８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチド上に、核酸型もしくはペプチド型の線形投与ベクターまたはプラスミド型の環状投与ベクターが接ぎ木された、請求項１〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む医薬品。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと、化粧用に許容され得る媒質を含む化粧用組成物。
【請求項１５】
ヒト皮膚、体毛、または頭髪の脱色または漂白のための、請求項１４に記載の化粧用組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと、皮膚病用に許容され得る媒質を含む、メラニン合成の阻害に使用するための皮膚病用組成物。
【請求項１７】
メラノサイト活動過剰による局所性色素過剰症、良性メラノサイト活動過剰と増殖による局所性色素過剰症、偶発性色素過剰症、またはある種の白斑症の治療または予防のための、請求項１６に記載の皮膚病用組成物。
【請求項１８】
特発性黒皮症、老年性色素斑点（老年性黒子）、光感受性もしくは瘢痕性色素過剰症、又は白斑の治療または予防のための、請求項１７に記載の皮膚病用組成物。
【請求項１９】
エラグ酸とその誘導体；レゾルシノールとその誘導体；ビタミンＣとその誘導体；パントテネート・スルホネートとその誘導体；アルファ−メラノサイト−刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）もしくはそのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を、直接的または間接的に妨害する分子；グリセロール、グリコールおよびプロピレングリコールからなる群から選択されるポリオール；ビタミン；サリチル酸とその誘導体からなる群から選択される角質溶解剤または落屑剤；単独または接ぎ木された、乳酸またはリンゴ酸からなる群から選択されるα−ヒドロキシ酸；アスコルビン酸とその誘導体；レチノイン酸；レチンアルデヒド；レチノールと、パルミテート、プロピオネートおよびアセテートからなる群から選択されるその誘導体；トコフェロールとその誘導体、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミン・ピロホスフェート、ピリドキサミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシおよびアデノシン・トリホスフェートからなる群から選択される、単独で、または組み合わせての抗グリケーション剤または抗酸化剤；グリチルレチン酸ステアリルからなる群から選択される抗炎症剤；無痛化剤とその混合物、微粉状酸化亜鉛、酸化チタン、ブチルメトキシジベンゾイルメタンおよびメトキシケイヒ酸オクチルからなる群から選択される化学的または物理的日焼け止め；並びにデオキシリボ核酸または核酸から選択される１つ以上の活性剤を含む、請求項１４〜１８のいずれかに記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２０】
レチノールと、パルミテート、プロピオネートおよびアセテートからなる群から選択されるその誘導体が、リポソーム調製物中であることを特徴とする請求項１９に記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、全組成物の０．００００１〜１０重量％に相当することを特徴とする請求項１４〜２０のいずれかに記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドが、全組成物の０．０００３〜３重量％に相当することを特徴とする請求項２１に記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２３】
局所適用のために通常使用される形態で提供されることを特徴とする請求項１４〜２２のいずれかに記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２４】
水性、水性−アルコールもしくは油性溶液の形態で、水中油型、油中水型もしくはマルチプルエマルションの形態で、水性ゲルもしくは油性ゲルの形態で、液体産物、ペースト産物もしくは固体無水産物の形態で、水相もしくは油相中の重合粒子の分散の形態で、またはイオン性もしくは非イオン性型の液体ベシクルの分散の形態で提供されることを特徴とする請求項２３に記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２５】
重合粒子がナノ球体又はナノカプセルである、請求項２４に記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２６】
エラグ酸とその誘導体；ヒドロキノン；アルブチン；レゾルシノールとその誘導体；ビタミンＣとその誘導体；パントテネート・スルホネートとその誘導体；麹酸；胎盤エキス；アルファ−メラノサイト−刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）もしくはそのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を、直接的または間接的に妨害する分子；グリセロール、グリコールおよびプロピレングリコールからなる群から選択されるポリオール；ビタミン；サリチル酸とその誘導体からなる群から選択される角質溶解剤または落屑剤；単独または接ぎ木された、乳酸およびリンゴ酸からなる群から選択されるα−ヒドロキシ酸；アスコルビン酸とその誘導体；レチノイン酸；レチンアルデヒド；レチノールと、パルミテート、プロピオネートおよびアセテートからなる群から選択されるその誘導体；トコフェロールとその誘導体、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミン・ピロホスフェート、ピリドキサミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシンおよびアデノシン・トリホスフェートからなる群から選択される、単独で、または組み合わせての抗グリケーション剤または抗酸化剤；グリチルレチン酸ステアリルからなる群から選択される抗炎症剤；無痛化剤とその混合物、微粉状酸化亜鉛、酸化チタン、ブチルメトキシジベンゾイルメタンおよびメトキシケイヒ酸オクチルからなる群から選択される化学的または物理的日焼け止め；並びにデオキシリボ核酸または核酸から選択される１つ以上の活性剤と組み合わせて、同時に、もしくは別々に、または時間をかけた方法で投与するための、請求項１４〜１８及び２１〜２５のいずれかに記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２７】
レチノールと、パルミテート、プロピオネートおよびアセテートからなる群から選択されるその誘導体が、リポソーム調製物中であることを特徴とする請求項２６に記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項１】
メラニン合成経路に含まれる必須酵素の１つをコードする遺伝子または遺伝子産物とハイブリダイズできる、１８〜２５のクレオチド数を含むオリゴヌクレオチドであって、該酵素がチロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＲＰ−１）であり、且つ該オリゴヌクレオチドが配列番号１〜配列番号５及び配列番号１１のいずれか１つと少なくとも８０％に等しい相補性の程度を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
２０ヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列が、以下：
【化１】
で示される配列番号１〜５または配列番号１１の配列の１つである、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドの糖成分、ヌクレオベース成分、またはヌクレオチド間骨格への１つ以上の化学修飾を含むオリゴヌクレオチドであって、該修飾が、生体利用性の増大、標的核酸へのアフィニティの増大、細胞内部取り込みの増大、またはより良好な生物学的安定性もしくは細胞ヌクレアーゼの存在下の安定性の増大を付与する、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドの糖成分が２’−Ｏ−フルオロまたは２’−Ｏ−アルキル置換基を含むことを特徴とする請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドの糖成分が２’−Ｏ−エチルオキシメチルまたは２’−Ｏ−メチル置換基を含むことを特徴とする請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間骨格のホスホジエステル基の幾つかが、ホスホロチオエート基で置き換えられていることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間骨格のホスホジエステル基の幾つかが、メチル・ホスホネート基で置き換えられていることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
ホスホジエステル基の全てがホスホロチオエート基で置き換えられていることを特徴とする請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
ホスホジエステル基の全てがメチル・ホスホネート基で置き換えられていることを特徴とする請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ホスホジエステル基が完全に、または部分的に、ホスホロチオエート基および／またはメチル・ホスホネート基で置き換えられていることを特徴とする請求項７または８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチド上に、核酸型もしくはペプチド型の線形投与ベクターまたはプラスミド型の環状投与ベクターが接ぎ木された、請求項１〜１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む医薬品。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと、化粧用に許容され得る媒質を含む化粧用組成物。
【請求項１５】
ヒト皮膚、体毛、または頭髪の脱色または漂白のための、請求項１４に記載の化粧用組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと、皮膚病用に許容され得る媒質を含む、メラニン合成の阻害に使用するための皮膚病用組成物。
【請求項１７】
メラノサイト活動過剰による局所性色素過剰症、良性メラノサイト活動過剰と増殖による局所性色素過剰症、偶発性色素過剰症、またはある種の白斑症の治療または予防のための、請求項１６に記載の皮膚病用組成物。
【請求項１８】
特発性黒皮症、老年性色素斑点（老年性黒子）、光感受性もしくは瘢痕性色素過剰症、又は白斑の治療または予防のための、請求項１７に記載の皮膚病用組成物。
【請求項１９】
エラグ酸とその誘導体；レゾルシノールとその誘導体；ビタミンＣとその誘導体；パントテネート・スルホネートとその誘導体；アルファ−メラノサイト−刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）もしくはそのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を、直接的または間接的に妨害する分子；グリセロール、グリコールおよびプロピレングリコールからなる群から選択されるポリオール；ビタミン；サリチル酸とその誘導体からなる群から選択される角質溶解剤または落屑剤；単独または接ぎ木された、乳酸またはリンゴ酸からなる群から選択されるα−ヒドロキシ酸；アスコルビン酸とその誘導体；レチノイン酸；レチンアルデヒド；レチノールと、パルミテート、プロピオネートおよびアセテートからなる群から選択されるその誘導体；トコフェロールとその誘導体、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミン・ピロホスフェート、ピリドキサミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシおよびアデノシン・トリホスフェートからなる群から選択される、単独で、または組み合わせての抗グリケーション剤または抗酸化剤；グリチルレチン酸ステアリルからなる群から選択される抗炎症剤；無痛化剤とその混合物、微粉状酸化亜鉛、酸化チタン、ブチルメトキシジベンゾイルメタンおよびメトキシケイヒ酸オクチルからなる群から選択される化学的または物理的日焼け止め；並びにデオキシリボ核酸または核酸から選択される１つ以上の活性剤を含む、請求項１４〜１８のいずれかに記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２０】
レチノールと、パルミテート、プロピオネートおよびアセテートからなる群から選択されるその誘導体が、リポソーム調製物中であることを特徴とする請求項１９に記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、全組成物の０．００００１〜１０重量％に相当することを特徴とする請求項１４〜２０のいずれかに記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドが、全組成物の０．０００３〜３重量％に相当することを特徴とする請求項２１に記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２３】
局所適用のために通常使用される形態で提供されることを特徴とする請求項１４〜２２のいずれかに記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２４】
水性、水性−アルコールもしくは油性溶液の形態で、水中油型、油中水型もしくはマルチプルエマルションの形態で、水性ゲルもしくは油性ゲルの形態で、液体産物、ペースト産物もしくは固体無水産物の形態で、水相もしくは油相中の重合粒子の分散の形態で、またはイオン性もしくは非イオン性型の液体ベシクルの分散の形態で提供されることを特徴とする請求項２３に記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２５】
重合粒子がナノ球体又はナノカプセルである、請求項２４に記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２６】
エラグ酸とその誘導体；ヒドロキノン；アルブチン；レゾルシノールとその誘導体；ビタミンＣとその誘導体；パントテネート・スルホネートとその誘導体；麹酸；胎盤エキス；アルファ−メラノサイト−刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）もしくはそのレセプターまたは副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）を、直接的または間接的に妨害する分子；グリセロール、グリコールおよびプロピレングリコールからなる群から選択されるポリオール；ビタミン；サリチル酸とその誘導体からなる群から選択される角質溶解剤または落屑剤；単独または接ぎ木された、乳酸およびリンゴ酸からなる群から選択されるα−ヒドロキシ酸；アスコルビン酸とその誘導体；レチノイン酸；レチンアルデヒド；レチノールと、パルミテート、プロピオネートおよびアセテートからなる群から選択されるその誘導体；トコフェロールとその誘導体、チオタウリン、ハイポタウリン、アミノグアニジン、チアミン・ピロホスフェート、ピリドキサミン、リシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、ピリドキシンおよびアデノシン・トリホスフェートからなる群から選択される、単独で、または組み合わせての抗グリケーション剤または抗酸化剤；グリチルレチン酸ステアリルからなる群から選択される抗炎症剤；無痛化剤とその混合物、微粉状酸化亜鉛、酸化チタン、ブチルメトキシジベンゾイルメタンおよびメトキシケイヒ酸オクチルからなる群から選択される化学的または物理的日焼け止め；並びにデオキシリボ核酸または核酸から選択される１つ以上の活性剤と組み合わせて、同時に、もしくは別々に、または時間をかけた方法で投与するための、請求項１４〜１８及び２１〜２５のいずれかに記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【請求項２７】
レチノールと、パルミテート、プロピオネートおよびアセテートからなる群から選択されるその誘導体が、リポソーム調製物中であることを特徴とする請求項２６に記載の化粧用または皮膚病用組成物。
【公開番号】特開２０１０−９０１４５（Ｐ２０１０−９０１４５Ａ）
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２００９−２７７４８５（Ｐ２００９−２７７４８５）
【出願日】平成２１年１２月７日（２００９．１２．７）
【分割の表示】特願２００７−２１０５１９（Ｐ２００７−２１０５１９）の分割
【原出願日】平成１３年２月９日（２００１．２．９）
【出願人】（３０２０７１２１０）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７７４８５（Ｐ２００９−２７７４８５）
【出願日】平成２１年１２月７日（２００９．１２．７）
【分割の表示】特願２００７−２１０５１９（Ｐ２００７−２１０５１９）の分割
【原出願日】平成１３年２月９日（２００１．２．９）
【出願人】（３０２０７１２１０）
【Ｆターム（参考）】
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