月経過多、月経困難症又は子宮内膜症の治療
雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症に対処する方法であり、プロキネチシンレセプターに対するプロキネチシン１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤を該個体に投与することを含む。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、治療方法、特に月経過多、月経困難症および子宮内膜症の治療方法に関する。
【０００２】
月経過多は月経排出の過剰である。月経困難症は痛みを伴う月経を意味する。子宮内膜症は子宮外着床および子宮内膜の成長であって、したがって、子宮内膜の異常な細胞成長と考慮されうる。
月経過多、月経困難症および子宮内膜症は、特に西側諸国の多くの女性に多く、著しい健康問題を現す。英国の３４〜４９歳の２０人に少なくとも１人の女性が、月経問題のために一般開業医にかかっているであろう。これらの女性は全ての婦人科外来患者の１０の１以上を占めており、医薬処方単独では年間７百万を上回るＮＨＳを占めている。毎年行われる少なくとも７０，０００の子宮切除術の７０％に異常な膣出血が認められると言われている。
現時点では、月経過多に用いられる治療にはトラネキサム酸又はメフェナム酸を含む。重症例では治療が子宮切除術（膣または腹部）となるが、これは深刻な罹患率およびいくらかの死亡のリスクを伴う重大な手術である。月経過多の治療については、Stirrat (1999) The Lancet 353, 2175-2176を参照のこと。更なる代替治療の開発が望まれる。
【０００３】
血管新生は、周期的な組織再生および子宮内膜成長と、月経過多および子宮内膜症を含む子宮内膜性疾患の発達において非常に重要である。子宮内膜性血管新生の制御の際の主な役割は、遺伝子のＶＥＧＦファミリーおよびそのレセプターを含む多くの因子と線維芽細胞成長因子について明らかにされてきた(Smith (2001) Trends Endocrinol. Metab. 12[4]: 147-51)。しかしながら、子宮内膜の血管新生のメカニズムは完全に解明されないままである。
プロキネチシン、内分泌腺由来血管内皮成長因子（ＥＧ-ＶＥＧＦ）としても知られるプロキネチシン１（ＰＫ１）と、Ｂｖ８としても知られるプロキネチシン２（ＰＫ２）は６０％の配列同一性を有する２つの近年同定された血管形成因子である(LeCouterら (2001) Nature 412: 877-884；Liら (2001) Mol. Pharmacol. 59: 692-698；およびLeCouterら (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 2685-2690)。ＰＫ１ ｍＲＮＡ発現は、ステロイド産生腺、すなわち卵巣、精巣および副腎および胃腸管、神経系、膀胱および前立腺を含む他の組織を含む様々な組織において示されている(LeCouterら (2001)；Liら (2001))。ＰＫ2発現は同類の分布を示すが、通常その発現は弱く、精巣および末梢血白血球で最も強い発現を示す(Liら(2001)；LeCouterら (2403))。ＲＮＡによる分析又はノーザンハイブリダイゼーションによると、ヒト子宮でのＰＫ１発現とＰＫ２発現のレベルは低いが、ＰＫ１の発現はより大きいことが示された(Liら (2001))。
【０００４】
プロキネチシンは、２つの非常に相同なＧタンパク質結合レセプター、プロキネチシンレセプター１（ＰＫＲ１）、およびプロキネチシンレセプター２（ＰＫＲ2）のリガンドであり、その活性化によってカルシウム流通、ホスホイノシチド代謝回転の刺激およびＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の活性化が起こる。プロキネチシンレセプターの発現は、精巣、皮膚および中枢神経系を含む多くの組織において同定された(Linら (2002) J Biol. Chem. 277[22]: 19276-280；Sogaら (2002) Biochimica et Biophysica Acta 1579: 173-179)。
ＰＫ１およびＰＫ２の機能を検討する初期の研究により、それらが器官特異的な方法で内皮細胞増殖および化学走性を引き起こすことによって血管形成を促進することが示された(LeCouterら (2001); LeCouteら (2003))。加えて、それらが酸素圧低下に応答して分泌され、視交差上核のサーカディアンリズムの伝達に関与するという所見がある(LeCouterら (2001)；Chengら (2002) Nature 417: 405-410)。
ＷＯ０２／００７１１ (Genentech, Inc.)には、ＰＫ１（ＥＧ-ＶＥＧＦと称する）が記載されており、その生物学的役割が考察されている。ＷＯ０２／００７１１は、ＥＧ-ＶＥＧＦ又はそのアゴニスト又はそのアンタゴニストは、癌（例えば子宮癌および子宮内膜上皮癌）を含む多くの疾患症状を治療する際に有効であると述べている。他の子宮症状（例えば月経過多、月経困難症又は子宮内膜症）を治療するためにＥＧ-ＶＥＧＦのアンタゴニストを用いることは開示も提案もされていない。
【０００５】
我々は、月経周期中の子宮のプロキネチシンおよびプロキネチシンレセプターの発現を検討して、他の段階と比較して子宮内膜の分泌期の間にＰＫ１の発現レベルがより高いことを示した。また、ＰＫ１発現は同様に月経期において上昇する。プロキネチシンレセプターＰＫＲ１およびＰＫＲ２はともに、周期の他の段階と比較して、周期の月経期に発現が増加した。また、免疫組織化学によると、子宮内膜の腺性上皮細胞、間質性細胞、血管内皮細胞と、子宮筋層の内皮細胞および平滑筋細胞にＰＫ１が局在化していた。これらの所見はプロキネチシンレセプターに対するＰＫ１の効果を低下させるかまたは予防し、月経過多、月経困難症および子宮内膜症に対処する可能性を示唆している。
【０００６】
本発明の第一の態様では、雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症に対処する方法であり、プロキネチシンレセプター（ＰＫＲ）に対するプロキネチシン１（ＰＫ１）の効果を減退させる少なくとも一の作用剤を該個体に投与することを含む方法を提供する。
前記方法は、月経過多、月経困難症又は子宮内膜症（の症状を緩和するためすなわち緩和剤使用）に用いてもよい、又は症状の重症度を低下させるために用いてもよい、又は症状を治療するために用いてもよい、または、症状を予防するために予防的に用いてもよい。したがって、疾患又は症状「に対処する」には、疾患又は症状を治療する、減退させる又は予防する、あるいは、疾患又は症状の兆候を緩和するという意味が含まれる。
ゆえに、本発明は、雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症を治療する、減退させる、予防する、あるいは雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症の兆候を緩和する方法であり、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤を該個体に投与することを含む方法を含む。
【０００７】
本発明の第二の態様では、雌性個体の月経過多、月経困難症または子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤の使用を提供する。
ゆえに、本発明は、雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症を治療する、減退させる、予防する、あるいは雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症の兆候を緩和するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤の使用を含む。
ＰＫ１には、ヒトプロキネチシン１遺伝子（ＰＲＯＫ１）およびその天然に生じる変異体の遺伝子産物が含まれる。ヒトＰＫ１のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ委託番号ＮＭ＿０３２４１４およびＮＰ＿１１５７９０に明らかである。また、ＰＫ１はLeCouterら (2001)およびWO 02/00711に記載されている。
ＰＫ１はＰＫＲ１およびＰＫＲ２両方のリガンドとして示されている(Masudaら(2002) Biochemical and Biophysical Research Communications 293: 396402；Sogaら (2002)；Linら (2002))。したがって、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤には、ＰＫＲ１に対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤とＰＫＲ２に対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が含まれる。
【０００８】
ＰＫＲ１には、ヒトプロキネチシンレセプター１遺伝子（ＰＫＲ１）およびその天然に生じる変異体の遺伝子産物が含まれる。ヒトＰＫＲ１のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ委託番号ＡＦ５０６２８７およびＡＡＭ４８１２７に明らかである。
ＰＫＲ２には、ヒトプロキネチシンレセプター２遺伝子（ＰＫＲ２）およびその天然に生じる変異体の遺伝子産物が含まれる。ヒトＰＫＲ２のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ委託番号ＡＦ５０６２８８およびＡＡＭ４８１２８に明らかである。
月経過多、月経困難症および／または子宮内膜症をともに持つ可能性があり、本発明の方法および使用を用いて同一患者の複数の症状に対処しうる。あるいは、前記方法および使用を用いて、月経過多、月経困難症および子宮内膜症の何れかを別々に対処することもできる。
【０００９】
したがって、本発明は、雌性個体の月経過多に対処する方法であり、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤を該個体に投与することを含む方法を含む。
本発明は、雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤の使用を提供する。
また、本発明は、雌性個体の月経困難症に対処する方法であり、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤を該個体に投与することを含む方法を含む。
したがって、本発明は、雌性個体の月経困難症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤の使用を提供する。
また、本発明は、雌性個体の子宮内膜症に対処する方法であり、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤を該個体に投与することを含む方法を含む。
したがって、本発明は、雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤の使用を提供する。
【００１０】
雌性個体は月経過多、月経困難症および／または子宮内膜症に罹患しているかまたはその症状のリスクがある任意の個体であり得る。
閉経前又は閉経後の女性の何れにも月経過多及び／又は月経困難症のリスクがある；しかし、月経過多は女性の生殖期間の始まりから終わりまで共通してあるものであり、概して、女性の月経が初めて始まるとき及び４０歳以上の女性により大きなリスクがある。
治療される患者は、このような処置により利益を得るいかなる女性であってもよい。典型的に、及び、好ましくは、治療される患者は、人間の女性である。しかしながら、本発明の方法は、雌の哺乳類、例えば以下の種の雌：ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコおよびイヌを治療するために用いてもよい。このように、方法は人間および獣医学の用途がある。
獣医学的治療法など、本発明の非ヒト態様には、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は治療する種に効果を有するものであることが好ましいことが理解される。
典型的に、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫＲのＰＫ１媒介性シグナル伝達を阻害するかまたは低下させるかまたは破壊するものである。
【００１１】
本発明の一実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤がＰＫＲに対する効果を有するＰＫ２を阻害しない（完全またはある程度）ことが好ましい。この実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫＲに対するＰＫ２の効果をさほど減退させないか、またはＰＫＲに対するＰＫ２の効果を全く（または検出不可能なレベルでしか）減退させない。したがって、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫ１自体を標的とするか、ＰＫ１とＰＫＲとの相互作用を標的とすることが好ましい。
好ましくは、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤はＰＫＲに対するＰＫ１の結合を阻害するか、減退させるか破壊する。あるいはまたは加えて、前記作用剤は、ＰＫ１とＰＫＲとの相互作用、またはＰＫＲと関連Ｇタンパク質との相互作用に影響して、ＰＫ１−ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害または破壊しうる。
好ましい実施態様では、前記作用剤は、ＰＫ１のアンタゴニストであり得る。ＰＫ１アンタゴニストは一般的に、ＰＫ１に結合する分子であり、そのレセプターに対するＰＫ１結合を阻害、減退または破壊するもので、それによってＰＫ１−ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害または破壊する。一般的にレセプターまたは抗体の何れか一部がＰＫ１に結合する「可溶性レセプター」手法である。
【００１２】
「アンタゴニスト」なる用語は広義で用いられ、ＰＫ１の生物学的活性を部分的にまたは完全に遮断するか、阻止するか、抑制するか、減退させるか中和させる任意の分子を含む。好適なアンタゴニスト分子には特に、抗体または抗体断片、ＰＫ１またはＰＫＲの断片またはアミノ酸配列変異体、ペプチドおよび小有機分子が含まれる。
他の好ましい実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫ１またはＰＫＲの発現を阻害するか、減退させるか破壊する作用剤であり得る。前記作用剤は、ＰＲＯＫ１、ＰＫＲ１またはＰＫＲ２遺伝子の転写を阻害するか、減退させるか破壊するか、あるいは前記遺伝子転写物の安定性や翻訳を阻害するか、減退させるか破壊する。好適な作用剤には、小干渉ＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重形成オリゴヌクレオチドおよびリボザイムが含まれうる。
あるいは、ＰＫ１アンタゴニストは、ＰＫＲに対するＰＫ１の結合を抑制または減退させることなくＰＫ１に結合するが、ＰＫ１とＰＫＲとの相互作用を破壊してＰＫ１−ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害または破壊する分子であり得る。これは、ＰＫ１に共有結合性の様式で結合して、結合能力には影響を及ぼさないでシグナル伝達メカニズムに影響する分子であり得る。
【００１３】
好ましい一実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤には、ＰＫＲのアンタゴニストが含まれ、それは、患者への投与に好適なＰＫＲアンタゴニストでもよい。一般的に、レセプターアンタゴニストは特定のレセプターに対して選択的であり、好ましくはＰＫ１自体よりもＰＫＲと同じかより高い結合親和性を有する。アンタゴニストは天然のリガンドよりレセプターに対する親和性が高いことが好ましいが、より高い濃度で用いることが必要であるが、より親和性が低いアンタゴニストも用いることができる。好ましくは、アンタゴニストは可逆的にＰＫＲに結合する。好ましくは、アンタゴニストは特定のレセプターに対して選択的であり、他のレセプターに影響しない；したがって、一般的にＰＫＲアンタゴニストはＰＫＲには結合するが、他のＰＫＲには実質的に結合しない。
一実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫＲのアンタゴニストであり得る。ＰＫＲアンタゴニストは一般的に、ＰＫＲに結合し、天然のリガンドＰＫ１の結合と拮抗し、ＰＫ１−ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害または破壊する分子である。
【００１４】
一実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させることには、ＰＫＲ上のＰＫ１結合部位を占領し、Ｇαｑを介する正常なシグナル伝達が起こるような天然のリガンド（ＰＫ１）の結合を阻害する（完全にまたはある程度）ことが含まれる。
あるいは、前記レセプターアンタゴニストは、ＰＫＲへのＰＫ１結合を阻害することなくＰＫＲに結合するが、ＰＫ１とＰＫＲとの正常な相互作用を破壊し、ＰＫ１−ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害、減退または破壊する分子であり得る。
さらに、択一的に、ＰＫＲアンタゴニストは、ＰＫＲに結合して、ＰＫＲと関連Ｇタンパク質との相互作用を破壊して、ＰＫ１媒介性シグナル伝達経路を阻害または破壊する分子であり得る。
潜在的なアンタゴニストのより具体的な例には、抗ＰＫ１抗体および抗ＰＫＲ抗体が含まれる。抗体には、限定するものではないが、ポリ-およびモノクローナル抗体および抗体断片、一本鎖抗体、抗イデオタイプ抗体、およびそのような抗体または断片のキメラないしヒト化型、並びにヒト抗体および抗体断片が含まれる。
【００１５】
抗ＰＫ１または抗ＰＫＲ抗体はポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調整方法は当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤と必要であればアジュバントを１回またはそれ以上注射することによって哺乳動物内で生じうる。典型的に、免疫化剤および／またはアジュバントは複数回の皮下投与または腹腔内投与によって哺乳動物に注射するであろう。免疫化剤は、ＰＫ１ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を、免疫化する哺乳動物内で免疫原性であることが知られているタンパク質とコンジュゲート（共役）させることが有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例には、限定するものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよびダイズトリプシンインヒビターが含まれる。使用されうるアジュバントの例には、フロインド完全アジュバントおよびＭＰＬ―ＴＤＭアジュバント（一リン酸化リビドＡ、合成トレハロースジコリノマイコレート(dicorynomycolate)が含まれる。免疫化の手順は、過度の実験を要することなく技術者によって選択されうる。
あるいは、およびより好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein, Nature, 256: 495 (1975)に示されるようなハイブリドーマ法を用いて調製しうる。ハイブリドーマ法では、一般的に、マウス、ハムスターまたは他の好適な宿主動物を免疫化剤にて免疫化して、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化してもよい。
【００１６】
免疫剤は、典型的にはＰＫ１ポリペプチドないしＰＫＲポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、或いは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103)。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００１７】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカ培養細胞系統保存期間（ＡＴＣＣ）より入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、モノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【００１８】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる(Goding, 1986)。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。或いは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００１９】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、或いは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、或いは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体でもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。或いは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
【００２０】
一価抗体の調製には、同じくインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成が可能である。
好ましい実施態様では、抗体はヒト化抗体又はヒト抗体でもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖或いはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２或いは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全て或いはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て或いはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００２１】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, (1986)；Riechmannら, (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００２２】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:381 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77 (1985); Boerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方はＰＫ１又はＰＫＲに対するものであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対するものであり得る。あるいは、二重特異性抗体はＰＫ１又はＰＫＲ上の異なる２つのエピトープに結合してもよい。
【００２３】
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順がＷＯ９３／０８８２９、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性（抗体-抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【００２４】
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第二の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆａｂ二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ’)２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’-チオールに再転換し、他のＦａｂ’-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００２５】
大腸菌からＦａｂ’フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ’)２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【００２６】
また、組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離するために様々な方法が記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60 (1991)。
【００２７】
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、二つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため（米国特許第４，６７６，９８０号）及びＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６７，９８０号に開示されたものが含まれる。
【００２８】
また、抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲート（抱合）され得る。また、リポソームを用いて細胞内に抗体または抗体断片を移送することができる。
【００２９】
抗体断片が患者に投与される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の抑制断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは化学的に合成し、及び／又は組換えＤＮＡ技術により生産することができる。例としてMarasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893 (1993)を参照のこと。
【００３０】
本発明における使用に適する抗ＰＫ１抗体には、Ferraraら (Genentech, Inc.)によって出願された米国特許第２００２／０１９２６３４号に、ＰＫ１（ＥＧ−ＶＥＧＦ）活性を中和すると報告されている抗ＰＫ１モノクローナル抗体１Ｃ６、２Ａ３、２Ａ８および４Ｈ９が含まれる。抗体４Ｈ９は、１０μｇ／ｍｌ以上の用量で投与する場合（実施例２１）、１０ｎＭ ＥＧ−ＶＥＧＦの活性を完全に中和すると報告された。抗ＰＫ１アンタゴニスト、特に抗ＰＫ１抗体に関するＵＳ２００２／０１９２６３４のすべての開示は出典明記によりここに組み込まれる。材料第ＤＮＡ６０６２１−１５１６は、１９９８年８月４日にアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に、委託番号２０３０９１として寄託した。
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる他の潜在的な作用剤は、アンチセンス核酸分子であり、例えば、アンチセンスＲＮＡないしＤＮＡ分子は標的としたｍＲＮＡにハイブリダイズしてタンパク質翻訳を阻害することによって直接的に翻訳をブロックするように働く。ＰＫ１またはＰＫＲに特異性を有するＲＮＡないしＤＮＡである好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの公知なヌクレオチド配列（上記参照）に基づいて設定することができ、これは当分野の標準的な技術者の技術および能力の十分範囲内である。
【００３１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的な核酸配列に特異的に結合する一本鎖核酸である。特有の標的配列に結合することによって、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖が形成される。これら核酸は、遺伝子のセンス鎖ないしコード鎖に相補的なので、「アンチセンス」と呼称されることが多い。
アンチセンス技術を用いて、三重鎖ヘリックス形成（以下を参照）またはアンチセンスＤＮＡないしＲＮＡを介する遺伝子発現を制御することができ、この何れの方法もＤＮＡないしＲＮＡにポリヌクレオチドが結合することに基づいている。例えば、本明細書中の成熟ＰＫ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部位を用いて、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設定する。個のアンチセンスオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする(Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, Fla., USA, 1988))。また、上記のオリゴヌクレオチドは細胞に移送されると、アンチセンスＲＮＡがインビボで発現され、ポリペプチドの産生を抑制する。アンチセンスＤＮＡを用いる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列のおよそ−１０から＋１０の部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００３２】
標的核酸に結合することによって、前記のオリゴヌクレオチドが標的核酸の機能を阻害することができる。その結果、例えば、転写、プロセシング、ポリＡ付加工程、複製、翻訳のブロックまたはＲＮＡ分解の促進などの細胞の抑制的機能の促進が起こる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは研究室で調製してからマイクロインジェクションや細胞培養培地から細胞内への取り込みなどによって細胞内に導入するか、アンチセンス遺伝子を持つプラスミドないしレトロウイルスないし他のベクターを形質移入した細胞で発現させる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ラウス肉腫ウイルス、水疱性口炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、シミアンウィルスおよびインフルエンザウイルスの細胞培養物中でのウイルスのウイルス複製や発現を阻害することが初めて明らかにされた。それ以来、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｍＲＮＡ翻訳の阻害は、ウサギ網状赤血球溶解物および小麦麦芽抽出物を含む無細胞系において、広範囲に調べられている。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるウイルス機能の阻害は、ＡＩＤＳ ＨＩＶレトロウイルスＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを用いてインビトロで明らかにされた(Goodchild, J. (1988) .Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85[15]: 5507-11)。Goodchildの研究により、最も効果的なオリゴヌクレオチドはポリＡシグナルに相補的なオリゴヌクレオチドであり；また、ＲＮＡの５’末端を標的としたもの、特にプライマー結合部位の隣およびプライマー結合部位のキャップ(cap)および５’非翻訳領域も効果的であることが示された。キャップ、５’非翻訳領域およびポリＡシグナルはレトロウイルスＲＮＡ（Ｒ領域）の末端で反復する配列内にあり、これらに相補的なオリゴヌクレオチドはＲＮＡに二度結合するかもしれない。
【００３３】
典型的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは１５〜３５塩基長である。例えば、２０マーのオリゴヌクレオチドは上皮成長因子レセプターｍＲＮＡの発現を阻害することが示され(Wittersら, Breast Cancer Res Treat 53:41-50 (1999))、２５マーのオリゴヌクレオチドは副腎皮質刺激ホルモンの発現を９０％以上減少することが示された(Frankelら, J Neurosurg 91:261-7 (1999))。しかしながら、この範囲外、例えば１０、１１、１２、１３ないし１４塩基、または３６、３７、３８、３９ないし４０塩基の長さのオリゴヌクレオチドを用いることが望ましいかもしれないことが理解される。
オリゴヌクレオチドは細胞内の核酸分解酵素によって分解または不活性化される。この問題に対処するために、天然に生じるホスホジエステル結合が他の結合に置き換えられる変更したヌクレオチド間結合を有するなどの修飾したオリゴヌクレオチドを用いることができる。例えば、Agrawalら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083では、オリゴヌクレオチドアミド亜リン酸エステルおよびホスホロチオネートを用いたＨＩＶ−１組織培養の抑制増加が示された。Sarinら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451では、オリゴヌクレオチドメチルホスホナートを用いたＨＩＶ−１の抑制増加が示された。Agrawalら (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 7790-7794では、ヌクレオチド配列特異的オリゴヌクレオチドホスホロチオエートを用いて初期感染細胞培養物および慢性感染細胞培養物におけるＨＩＶ−１複製の抑制が示された。Leitherら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートによる組織培養物のインフルエンザウイルス複製の抑制を報告している。
【００３４】
本発明で有効なオリゴヌクレオチドは、好ましくは、内在性核酸分解酵素による分解に耐えるように設定される。オリゴヌクレオチドのインビボ分解により、長さが減少したオリゴヌクレオチド分解生成物が生じる。このような分解生成物は、おそらく非特異的なハイブリダイゼーションに関与し、完全長相対物と比較して効率が低い。したがって、体内での分解に抵抗性があり、標的細胞に到達することができるオリゴヌクレオチドを用いることが望まれる。本オリゴヌクレオチドは、天然のホスホジエステル結合を一以上の内部人工ヌクレオチド間結合に置換することによって、例えば、結合内のリン酸と硫黄を置換することによってインビボでの分解に対してより抵抗性を示すようになりうる。用いられてもよい結合の実施例は、ホスホロチオネート、メチルホスホネート、スルホン、硫酸エステル、ケチル、ホスホロジチオエート、様々なホスホラミデート、リン酸エステル、架橋したホスホロチオネート、架橋したホスホラミデートが含まれる。他のヌクレオチド間結合が当分野で周知であるので、このような例は制限するものではなく例示するものである。例として、Cohen, (1990) Trends in Biotechnologyを参照のこと。
ホスホジエステルヌクレオチド間結合を置換した結合のうちの一つ以上を有するオリゴヌクレオチドの合成は当分野で周知であり、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを生成するための合成系が含まれる。オリゴヌクレオシドメチルホスホン酸、ホスホロジチオエート、ホスホラミデート、リン酸エステル、架橋ホスホラミデートおよび架橋ホスホロチオネートの合成は、当分野において周知である。例として、AgrawalおよびGoodchild (1987) Tetrahedron Letters 28, 3539；Nielsenら(1988) Tetrahedron Letters 29, 2911；Jagerら(1988) Biochemistry 27, 7237；Uznanskiら(1987) Tetrahedron Letters 28, 3401；Bannwarth (1988) Helv. Chim. Acta. 71, 1517；CrosstickおよびVyle (1989) Tetrahedron Letters 34, 4693；Agrawalら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405を参照し、これらに教示されることは出典明記によってここに組み込まれる：合成又は生成のための他の方法も可能である。
【００３５】
オリゴヌクレオチドの５’または３’末端のヌクレオチドに類似の基を「キャッピングする」または組み込むことによって内在性の酵素による分解に対する抵抗性をつけることができる。キャッピングのための試薬はApplied BioSystems Inc, Foster City, CA.からAmino-Link IITMとして市販されている。キャッピングの方法は、Shawら (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750およびAgrawalら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88[17], 7595-7599によって記載されており、これらに教示されることは出典明記によってここに組み込まれる。
出典明記によってここに組み込まれるTangら (1993) Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735に記載されているように、核酸分解酵素の作用に対して耐性のオリゴヌクレオチドを作製する更なる方法は、「自己安定化」させることである。自己安定化オリゴヌクレオチドはその３’末端にヘアピンループ構造を持ち、蛇毒ホスホジエステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび胎仔ウシ血清による分解に対して亢進した耐性を示す。オリゴヌクレオチドの自己安定化領域は相補的核酸とのハイブリダイゼーションに干渉せず、マウスでの薬物動態学的研究および安定性研究ではそれらの線形相当物と比較して自己安定化したオリゴヌクレオチドのインビボ持続性が亢進していた。
【００３６】
ＰＫレセプターに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫ１遺伝子またはＰＫＲ遺伝子との三重鎖ヘリックス形成を亢進するオリゴヌクレオチドであり得る。
近年、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二重鎖へ結合する三重鎖ヘリックス形成が起こりうることが示された。オリゴヌクレオチドはＤＮＡ二重鎖ヘリックスの主要な溝(major groove)の配列を認識することができることが明らかとなった。それにより三重鎖ヘリックスが形成された。これは、主要な溝の水素結合部位の認識を介して二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する配列特異的分子を合成することができることを示唆している。
転写を阻害するために三重鎖ヘリックスを形成する核酸分子は一本鎖であり、デオキシヌクレオチドからなる。これらオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般的に二本鎖のうちの一本鎖にプリンまたはピリミジンのかなりの伸展を必要とするフーグスティン塩基対の様式を介する三重鎖ヘリックスを促進するように設定する。更なる詳細についてはＷＯ９７／３３５５１を参照のこと。
【００３７】
アンチセンス方法と同じように、これは、ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチド配列の結合に基づく。この方法への使用に適するポリヌクレオチドは２０〜４０塩基長が好ましく、転写に関与する遺伝子の領域に対して相補的に設定する(Leeら., Nucl. Acids Res. 6: 3073 (1979)；Cooneyら., Science 15241: 456 (1988)；およびDervanら., Science 251: 1360 (1991))。最適には、三重鎖ヘリックス形成によって、ＤＮＡからのＲＮＡ転写が停止する。ＰＫ１に特異性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、それらの公知のヌクレオチド配列に基づいて設定され（上記参照）、当分野の平均的な技術者の技能および能力の十分範囲内である。
ＰＫレセプターに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤はリボザイムでもよい。リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは相補的標的ＲＮＡ配列特異的にハイブリダイゼーションすることによって作用し、内ヌクレオチド結合分解性の切断が起こる。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位を公知の技術によって同定することができる。更なる詳細については、例としてRossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994)、およびWO 97/33551を参照のこと。したがって、リボザイム（例としてハンマーヘッド型リボザイム(Haselhoff & Gerlach (1988) Nature 334:.585-591)に記載）を用いて、ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断してそれによってｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。
【００３８】
ＰＫ１またはＰＫＲに特性を有するリボザイムはそれらの公知のヌクレオチド配列（上記参照）に基づいて設定することができ、当分野の標準的な技術者の技能と能力の範囲内のものである。あるいは、ＰＫ１ ｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特定のＲＮＡ分解酵素活性を有する触媒的なＲＮＡを選択することができる。例として、Bartelら., (1993) Science 261: 1411-1418を参照のこと。
ＰＫレセプターに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子でもよい。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、サイレンスする遺伝子に配列が相同な二本鎖（ｄｓＲＮＡ）によって生じる動物内での配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの工程である。典型的に、配列特異的ｍＲＮＡ分解のメディエーターは、インビボでより長いｄｓＲＮＡからＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ切断によって生成される２１および２２ヌクレオチド小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。Elbashirら. (2001, Nature 411, 494-498)は、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖が例えば哺乳動物細胞内で内在性および異種性の遺伝子の発現をともに特異的に抑制することを示した。哺乳動物細胞内では、より長い二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡはＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質リン酸化酵素）を活性化し、全体のタンパク質合成を抑制するので、ｓｉＲＮＡは以下に示すような２本の相補的な２１マーからなるに違いないと思われる。
【００３９】
ＰＫ１に選択的な二重鎖ｓｉＲＮＡ分子はＰＫ１ｃＤＮＡ配列を参照することによってすぐに設定することができる（上記参照）。典型的に、まず、開始メチオニンコドンから少なくとも１２０ヌクレオチド下流であるＡＡジヌクレオチドで始まる２１マー配列を選択する。これに完全に相補的なＲＮＡ配列が第一ＲＮＡオリゴヌクレオチドとなる。第二ＲＮＡ配列は第一ＲＮＡのはじめの１９残基に完全に相補的なもので、３’末端に付加的なＵＵジヌクレオチドを有するであろう。設定すると、合成ＲＮＡ分子は当分野で公知の方法を用いて合成することができる。
他の潜在的なＰＫ１アンタゴニストには、ＰＫ１の活性部位、レセプター結合部位または他の相対的な結合部位に結合して、その正常な生物学的活性をブロックする小分子が含まれる。小分子の例には、限定するものではないが、小ペプチドまたはペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、および合成非ペプチジル有機ないし無機化合物が含まれる。
したがって、ある実施態様では、ＰＫ１アンタゴニストは非常に関連したタンパク質、例えばＰＫＲを認識するが効果を障害しないＰＫ１ポリペプチドの変異型であり、ＰＫＲに対するＰＫ１ポリペプチドの活性を競合的に阻害するものでよい。
【００４０】
本発明の使用に適するＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤（すなわちアンタゴニスト）を同定する方法の範囲は、ＷＯ０２／００７１１および米国特許出願番号２００２／０１９２６３４に詳述されており、出典明記によりそれら両方がここに組み込まれる。
一実施態様では、活性がポジティブフィードバックによって制御される場合、アゴニストの過剰発現はアンタゴニストとして作用しうる。
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、本発明の治療剤または本発明の化合物と呼称するかもしれない。
治療剤は、月経過多、月経困難症または子宮内膜症に対処するために有効な量で雌性個体に投与する。治療剤は任意の剤形および任意の好適な方法で投与しうる。
一実施態様では、本発明の使用のための治療剤は、ＰＫＲの少なくとも７５％（ＥＤ７５）およびより好ましくはＰＫＲの少なくとも９０％（ＥＤ９０）が有効量として輸送されるために十分な量と頻度で投与する。当該分子の有効性により用量、剤形および投与方法を決定するであろう。
【００４１】
本発明に用いる上述した治療剤又はその製剤は、経口および非経口（例えば皮下ないし筋肉内）注射を含む任意の従来法によって投与してもよい。治療は、一回量又は一定期間にわたる複数の用量から成ってもよい。投与される用量は、年齢、体重、投与様式、治療の継続期間および治療剤ないし作用剤の薬物動態学的および毒物的な特性を考慮して決定する。患者に有益な治療的効果を生じる用量（または、複数用量）で治療剤を投与する。一般的に、治療剤は、他の医学的徴候に用いる場合と同じか類似の用量で投与する。どんな場合でも、患者の治療に適する用量は、医師によって決定されうる。
本発明の治療剤が単独または他の前記治療剤と組み合わせて投与することができる一方で、一以上の受容可能な担体とともに医薬製剤としてそれまたはそれらを投与するのが好ましい。担体は、本発明の治療剤とともに含まれる場合には「受容可能で」あり、受容者側にとって毒性があってはならない。一般的に、担体は、無菌で、発熱因子フリーである水ないし生理食塩水である。
【００４２】
製剤は、単位剤形で都合よくあってもよく、薬剤学の分野で公知の任意の方法によって調整してもよい。このような方法には、一つ以上の補助的配合剤を構成する担体とともに治療剤又は作用剤を会合させる工程を含む。概して、製剤は、均一かつ緊密に液体担体又は微粉固体担体又はその両方と活性成分（すなわち治療剤又は作用剤）とを会合させ、必要に応じて生成物を成形することによって調製する。
経口投与に適する本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤又は錠剤（各々は予め定められた量の活性成分を含む）のような分離型の単位として；粉又は顆粒として；水性液体ないし非水溶液体の溶液ないし懸濁液として；または、水中油(oil-in-water)液体エマルジョン又は油中水(water-in-oil)形液体エマルジョンとしてもよい。また、活性成分はボーラス、舐剤またはペーストとしてもよい。
【００４３】
場合によって一以上の補助的成分とともに、錠剤を圧縮又は成形して作ってもよい。圧縮錠剤は、適切な機械にて、場合によって結合剤（例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑油、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えばナトリウム澱粉グリコール酸(sodium starch gycolate)、架橋ポビドン、架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤と混合して、粉又は顆粒などの自由流動形に活性成分を圧縮することによって調製してもよい。成形した錠剤は、不活性液体希釈液で湿らせた粉末状の合成物の混合物を適切な機械で成形することによって作製してもよい。場合によって、錠剤は、コートするか又は切り目をつけてもよく、所望の放出特性が得られるように性質を変化する際に例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて活性成分の放出を緩慢にするようにまたは制御できるように調製しうる。
口の局所投与に適する製剤には、風味をつけた基剤、通常スクロースおよびアカシア又はトラガカンタに活性成分を含むトローチ剤(lozenge)；ゼラチンおよびグリセリン又はスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤に活性成分を含む錠剤(pastille)；及び、適切な液体担体に活性成分を含むうがい薬(mouth-washes)が含まれる。また、舌下錠(Buccal)投与も好ましい。
【００４４】
非経口投与に適する製剤には、抗酸化剤、緩衝液、細菌発育阻止因子および対象とする受容者の血液に等張な製剤となるような溶質を含みうる水溶性および非水溶性滅菌注射液、および沈澱防止剤および増粘剤を含みうる水溶性および非水溶性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位-用量又は複数投与用コンテナ、例えば密封されたアンプルおよびバイアルにしておいたり、使用前に滅菌液体担体、例えば注射用蒸留水を加えるだけの冷凍乾燥させた（凍結乾燥された）状態で貯蔵してもよい。即席の注射溶液および懸濁液は、既に示した種類の滅菌した粉末、顆粒および錠剤から調製してもよい。
好適な単位用量製剤は、活性成分の一日量又は単位用量、１日の標準以下の用量又はそれらの適当な分量を含んでいるものである。
特に前述の成分に加えて本発明の製剤には、問題とする製剤のタイプを考慮した当分野の従来の他の作用剤が含まれうる。例えば経口投与に適するものには風味付け作用剤が含まれる。
【００４５】
治療剤にはタンパク質又はペプチドであるものもある。タンパク質およびペプチドは、注射可能な徐放性ドラッグデリバリーシステムを用いて供給してもよい。これらは、具体的には、注射の頻度を減らすように設計されている。このようなシステムの例は、組換え体ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を生物分解可能なミクロスフィアにカプセル化するNutropin Depotであり、注射すると継続時間を通してゆっくりｒｈＧＨを放出する。
タンパク質およびペプチドは、受容部位に直接薬剤を放出する外科的移植装置によって投与することができる。
また、電気穿孔治療法（ＥＰＴ）システムは、タンパク質およびペプチドの投与に用いることができる。パルス化された電場を細胞に供給する装置は、薬剤に対する細胞膜の透過性を増やし、その結果、細胞内ドラッグデリバリーが有意に亢進される。
【００４６】
タンパク質およびペプチドは電気的取り込み法（ＥＩ）によって供給することができる。細胞表面上の直径３０ミクロン以下の小粒子が電気穿孔法に用いたのと同じか類似の電気的パルスを感じるとＥＩが起こる。ＥＩでは、これら粒子は角質層および皮膚のより深い層に移行する。当該粒子は薬剤ないし遺伝子に負荷したりそれらでコートするか、単に薬剤が進入しうる皮膚に孔を生じさせる「弾丸(bullet)」として作用することもできる。
タンパク質およびペプチド供給の代替的方法は温度感受性のＲｅＧｅｌ注射用システムである。体温以下では、ＲｅＧｅｌは注射可能な液体であり、体温では、ゆっくりと浸食して公知の安全な生物分解可能なポリマーに分解するゲルをすぐに形成する。バイオポリマー分解の時間の間治療剤が供給される。
【００４７】
また、タンパク質およびペプチド医薬は経口投与することができる。この工程は、タンパク質とペプチドを同時に供給するための、体内のビタミンＢ１２の経口摂取の天然の工程をたどる。ビタミンＢ１２摂取系とまたがることによって、タンパク質又はペプチドは腸管壁を通り抜けることができる。ビタミンＢ１２類似体と前記薬剤との間で複合体を合成し、該複合体のビタミンＢ１２部位の内因性因子の顕著な親和性と該複合体の薬剤部位の顕著な生物学的活性の両方が維持される。
タンパク質およびポリペプチドは「Ｔｒｏｊａｎペプチド」によって細胞内に導入することができる。転移性の特性を有し、原形質膜を越えて親水性化合物を輸送することができるペネトラチン(penetratin)と呼称されるポリペプチドの種別がある。この系により細胞質および核へオリゴペプチドを直接標的とすることができ、これは非細胞型特異的で非常に効率がよい。Derossiら (1998), Trends Cell Biol 8, 84-87を参照。
【００４８】
また、治療剤ないし製剤は、パッチ、ゲル、ローション、クリームまたはオイルなどで経皮的に投与してもよい。
１種類または複数種類の治療剤は経口投与するのが好ましい。
さらに、１種類または複数種類の治療剤は雌性生殖系に投与するのが好ましい。例えば、１種類または複数種類の治療剤は、ゲルまたはクリームまたは膣リングまたはタンポンを用いて適切に経膣投与する。また、治療剤は、例えば子宮内デバイスなどの当分野に公知の方法を用いた子宮内供給によって投与するのが有益であろう。
典型的に、ゲルまたはクリームは、膣投与のために調製するものである。オイルベースまたは水ベースでもよい。典型的に、１種類または複数種類の治療剤は、単回（または繰り返し）の適用で有効量が投与されるように十分な濃度でクリームまたはゲル中に存在する。
【００４９】
一般的には、膣リングは膣にフィットする「ドーナツ」形に成形されたポリマーを含んでなる。１種類又は複数種類の治療剤がポリマー内に、一般的にはコアとして存在し、それはポリマーから放出され、コントロールされた仕方で膣及び／又は頸部に入る。膣リングは当業者には公知である。膣リングは使い捨てでもよく、女性生殖期間に膣内に保持される、したがって、女性生殖期間に放出され、効果を示すのに十分な量の治療剤を含んでいる。あるいは、膣リングは約３ヵ月〜１年間用いて、その一定期間、十分な量の治療剤が放出され有益な効果を示す。リングが製造されるポリマー、リングと治療剤の内容物のサイズおよび形状、並びに他のパラメータは、１周期またはしばらくの間使用するためのリングかどうかを考慮して選択するのがよいことは理解できるであろう。
一般的にはタンポンに１種類又は複数種類の治療薬をしみ込ませ、十分な量の治療薬（１種類又は複数種類）がタンポンに存在するようにする。
【００５０】
一般的には子宮内デバイスは子宮内に長期間、例えば１ないし５年間置くためのものである。一般的には子宮内デバイスはプラスチック製フレーム（「Ｔ」形であることが多い）を有し、使用期間中放出するのに十分な量の治療剤（類）を含む。一般的にその薬剤は、そのデバイスの部分を構成している除放性ポリマー内に存在し、又は前記除放性ポリマーに封入される。上記デバイスの部分は、普通は除放性膜で覆われている「Ｔ」字形の長い方のアームの周囲を包む「ソーセージ」形薬剤のような形に構成されている。子宮内デバイスは当業者には公知である。
ある種の治療剤は、それらをコードする核酸分子から発現されうるタンパク質またはペプチドである。ある種の治療剤はポリヌクレオチドであり、それらをコードする核酸分子から発現されうる。本発明のポリヌクレオチド治療剤、または本発明の治療剤をコードする核酸分子など、患者に核酸分子を投与するための方法、組成物およびベクターは当業者に公知である。
【００５１】
好適なデリバリーシステムには、リポソーム、ビロゾーム、ミクロスフィア又はマイクロカプセルおよびウイルス性および非ウイルス性ベクターなどの遺伝的ベクターが含まれる。
ポリヌクレオチド治療剤、または治療剤をコードする核酸分子を全身投与してもよい。あるいは、本発明の核酸分子の有効性を生体内での意図する局部に制限して、より低い用量を用いて、全身的な効果を最小にすることによって、特徴的塩基対への固有の結合特異性を亢進する。したがって、核酸分子は、所望の効果を達成するために、局所的に適用してもよい。所望の局部における本発明のポリヌクレオチド治療剤の濃度は、全身投与する場合よりもより高く、明らかに低い全量を用いても治療効果が達成されうる。本発明のポリヌクレオチド治療剤の局所濃度が高いことによって標的細胞の透過性が亢進する。
ポリヌクレオチド治療剤、または治療剤をコードする核酸分子は、薬剤の局所投与に好適な方法で局部に供給することができる。例えば、核酸分子またはベクターの溶液を部位に直接注射したり、注入ポンプを用いた注入によって供給することができる。また、核酸分子またはベクターは、移植用デバイス内に取り込ませて、特定の部位に隣接して設置してその周辺部位にそれらを放出させることもできる。
【００５２】
ポリヌクレオチド治療剤又は治療剤をコードする核酸分子は、ヒドロゲル材料によって投与してもよい。ヒドロゲルは非炎症性で生物分解可能である。このような材料は、天然および合成のポリマーからできたものを含み現在多く知られている。好ましい実施形態では、前記方法に、体温の以下の液体であるが、体温又はその温度近くの保形半流動ヒドロゲルを形成するジェルであるヒドロゲルを用いる。好ましいヒドロゲルはエチレンオキシド−プロピレンオキシド繰り返し単位のポリマーである。ポリマーの特性は、ポリマーの分子量およびポリマー中のポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドの相対的な割合に依存する。好適なヒドロゲルは、約１０〜約８０エチレンオキシド重量％と、約２０〜約９０プロピレンオキシド重量％を含む。特に好適なヒドロゲルは、約７０％のポリエチレンオキシドと、３０％のポリプロピレンオキシドを含む。使用可能なヒドロゲルは、例えば商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）でBASF Corp., Parsippany, NJより入手可能である。
【００５３】
この実施態様では、ヒドロゲルは液体にまで冷却し、オリゴヌクレオチドはヒドロゲル１ｇ当たり約１ｍｇのポリヌクレオチドの濃度で液体に混合する。次いで、結果として生じた混合液を、例えばカテーテルや内視鏡手技を用いた外科的手術の間に噴霧又は塗布することによって治療すべき表面に適用する。ポリマーが暖まるにつれて、ゲルを形成するように凝固し、厳密なゲル組成物に応じた期間中ゲルから周辺細胞へポリヌクレオチドが拡散する。
ポリヌクレオチド治療剤、又は治療剤をコードする核酸分子は、リポソーム、マイクロカプセルおよび移植用デバイスを含む、市販の又は科学的文献に記載された他の移植組織（インプラント）によって投与することができる。例えば、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびそれらのコポリマーなどの生物分解可能な材料、コラーゲンおよびタンパク質ポリマー、又はエチレン酢酸ビニル、ポリビニルアセテート、エチレンビニルアルコールおよびそれの誘導体のような生物分解性でない材料でできている移植組織は、本発明の化合物を局所に供給するために用いることができる。それらは、融解又は溶媒蒸発法や機械的に材料と混合させて重合又は凝固させるにつれて材料内に取り込まれうる。一実施態様では、本発明の化合物は、移植用デバイス（例えばデキストランコート二酸化ケイ素ビーズ、ステム又はカテーテル）のための被覆剤と混合するかその上に適用する。
【００５４】
ポリヌクレオチド治療剤、又は治療剤をコードする核酸分子は、治療及び／又は予防目的で患者全身に投与してもよい。前記化合物は、任意の効果的な方法、例えば、非経口的（例えば静脈内、皮下、筋内）、または、経口、鼻又は患者の血流に入って循環させる他の方法によって投与してもよい。好ましくは全身的に投与される核酸分子又はベクターは、局所投与に加えて投与するが、局所投与をしない場合でも有用である。一般的に、この目的には成人のヒトへの投与につき約０．１〜約１０グラムの範囲の用量が効果的であろう。
治療剤は、好適なポリヌクレオチド、遺伝的コンストラクト又はここに記載のようなベクターから発現させ、患者に供給してもよい。治療剤の供給のための遺伝的コンストラクトはＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡが好ましい。
好ましくは、遺伝的コンストラクト又はベクターはヒト細胞への供給に適する。
【００５５】
動物体内の細胞に遺伝的コンストラクトを導入する手段と方法は当分野で公知である。例えば、本発明のコンストラクトは、コンストラクトが細胞のゲノム内に挿入されるための任意の簡便な方法、例えばレトロウイルスを伴う方法によって細胞内に導入してもよい。（例として、Kuriyamaら (1991) Cell Struc. and Func. 16, 503-510を参照）。細胞内にレトロウイルスを導入するために、１０μｇ／ｍｌのポリブレンを添加してあるレトロウイルス上清を直接注入するのがよい。直径１０ｍｍ以上の組織には、レトロウイルス上清を０．１から１ｍｌ；好ましくは０．５ｍｌ注入するのが好適である。あるいは、Culverら (1992) Science 256, 1550-1552に記載のように、レトロウイルスを産生する細胞を注入する。
また、標的 (Targeted)レトロウイルスは本発明の使用に有益である；例えば、特定の結合親和性を付与する配列を予め存在するウイルスのｅｎｖ遺伝子内に操作してもよい（この概要及び遺伝子治療の他の標的ベクターについては、Miller & Vile (1995) Faseb J. 9, 190-199を参照）。
【００５６】
他の方法では、限られた期間、又はゲノム内に組み込まれた後長期間、組み込まれたところで発現するために細胞内にコンストラクトを単に移送することを伴う。後者のアプローチの例にはリポソームが含まれる。(Nassanderら (1992) Cancer Res. 52, 646-653)。
イムノリポソームの調整には、ＭＰＢ−ＰＥ(N-[4-(p-マレイミドフェニル)ブチリル]-フォスファチジルエタノールアミン)をMartin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem. 257, 286-288の方法に従って合成する。
移送の他の方法には、抗体-ポリリジン架橋を介した外因性ＤＮＡを持つアデノウイルス（Curiel Prog. Med. Virol. 40, 1-18を参照）及び担体としてのトランスフェリン-ポリカチオンコンジュゲート（Wagnerら (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87, 3410-3414）が含まれる。
【００５７】
また、ポリヌクレオチド治療剤、又は治療剤をコードする核酸分子は、例えば以下に記載のアデノウイルス粒子内に存在するアデノウイルスによって移送してもよい。
代替方法では、細胞内にＤＮＡマクロ分子を運ぶために、レセプター媒介性エンドサイトーシスを用いる高効率性核酸デリバリーシステムを、例えば核酸に結合するポリカチオンにイオン輸送タンパク質トランスフェリンをコンジュゲートさせることによって行う。
陽イオン性及び中性の脂質と複合体化した「裸の(naked)ＤＮＡ」及びＤＮＡは、治療すべき個体の細胞内に本発明の化合物を導入するために有用でありうることが理解されるであろう。遺伝子治療の非ウイルス性手法は、Ledley (1995) Human Gene Therapy 6, 11291144に記載されている。
また、代替的標的デリバリーシステムは公知であり、例えば、典型的にＤＮＡをアデノウイルス又はアデノウイルス様粒子内に持つ、ＷＯ９４／１０３２３に記載の変更したアデノウイルスシステムがある。他の好適なウイルス又はウイルス様粒子には、ＨＳＶ、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニア及びパルボウイルスが含まれる。したがって、更なる本発明の態様では本発明の化合物を含むウイルス又はウイルス様粒子が提供されることが理解されるであろう。
【００５８】
また、本発明は、ここに記載の一以上の治療剤と、現在月経過多の治療に用いられる一以上の医薬、例えばトラネキサム酸又はメフェナム酸との組み合わせ（医薬製剤においてなど）を提供する。
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸又はメフェナム酸とを含む月経過多に対処するためのキット・オブ・パーツを包含する。
また、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸又はメフェナム酸とを含む組成物を包含する。
さらに、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸又はメフェナム酸とを含む医薬の使用のための組成物を包含する。
【００５９】
加えて、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸又はメフェナム酸と、薬理学的許容性のある担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物を包含する。
本発明は雌性個体の月経過多に対処する方法であり、該方法が雌性個体にＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子（上記記載のような）と、トラネキサム酸又はメフェナム酸を投与することを含む方法を包含する。
【００６０】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤とトラネキサム酸又はメフェナム酸を連続的に又は（実質的に）同時に投与することができることが理解されるであろう。それらは同じ医薬製剤又は医薬内にあってもよいし、別々に製剤化又は投与されてもよい。
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸又はメフェナム酸との組合せを雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製への使用を包含する。
【００６１】
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製への使用であり、該個体はトラネキサム酸又はメフェナム酸を投与されている使用を包含する。たとえ雌性個体が少なくとも一作用剤又は核酸分子を含んでなる医薬を投与される前（又は投与の後）にトラネキサム酸又はメフェナム酸を投与された（又は投与される）場合でも、典型的に雌性個体は医薬として同時にトラネキサム酸又はメフェナム酸を投与される。
本発明は、トラネキサム酸又はメフェナム酸を雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製への使用であり、該個体はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を投与されている使用を包含する。たとえ雌性個体がトラネキサム酸又はメフェナム酸を含んでなる医薬を投与される前（又は投与の後）に作用剤又は核酸分子を投与された（又は投与される）場合でも、典型的に雌性個体は医薬として同時に作用剤又は核酸分子を投与される。
【００６２】
また、本発明は、ここに記載の治療剤の一以上と、エストロゲンレベルを低下させる、または、エストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤との組合せを提供する。そのような組合せは子宮内膜症の治療に有用でありうる。
エストロゲンレベルを低下させる作用剤には、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニスト、ＧｎＲＨアンタゴニスト及びエストロゲン合成インヒビターが含まれる。エストロゲンレセプターに拮抗する作用剤、すなわちエストロゲンレセプターアンタゴニストは抗エストロゲンを含む。
好適なＧｎＲＨアゴニストには、典型的に４週ごとに３．７５ｍｇを皮下（ｓ．ｃ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）のレベルで投与するか３か月ごとに１１．２５ｍｇを皮下のレベルで投与するリュープロレリン(leuprorelin)(Wyethより提供のProstap)；典型的に８時間ごとに０．５ｍｇを皮下的にまたは１日６回、０．２ｍｇを鼻腔内のレベルで投与するブセレリン(buserelin)(Shireより提供のSuprefact)；典型的に２８日ごとに３．６ｍｇ皮下的インプラントまたは１２週ごとに１０．８ｍｇインプラントとして投与するゴセレリン(goserelin)(Astra Zenecaより提供のZoladex)；典型的に４週ごとに３ｍｇのレベルで投与するトリプトレリン(triptorelin)(Ipsenより提供のDe-capeptyl sr)；ナファレリン(nafarelin)(Searleより提供のSynarel)；デスロレリン(deslorelin)(Shireより提供のSomagard)；及びヒストレリン／サプレリン(histrelin/supprelin)(Ortho Pharmaceutical Corp/Shire)が含まれる。
【００６３】
好適なＧｎＲＨアンタゴニストには、テベレリクス(teverelix)（アンタレリクス(antarelix)としても知られる）；アベレリクス(abarelix)(Praecis Pharmaceuticals Incより提供のプレナキス(Plenaxis))；典型的に毎日０．２５〜０．３ｍｇ皮下のレベルで投与するセトロレシキス(cetrorelix)(ASTA Medicaより提供のセトロチド(Cetrotide))；及び典型的に毎日０．２５ｍｇ皮下のレベルで投与するガニレリクス(ganirelix)(Organonより提供のオルガルトラン(Orgalutran))が含まれる。
好適な抗エストロゲンには、タモキシフェン、ファスロデクス(ICI 182,750；Astra Zeneca)、イドキシフェン（Coombesら(1995) Cancer Res 55, 1070-1074を参照）、ラロキシフェン又はＥＭ−６５２（Labrie, Fら, (2001) J Steroid Biochem Mol Biol 79, 213が含まれる。
好適なエストロゲン合成インヒビターにはアロマターゼインヒビターが含まれる。当業者には周知のように、アロマターゼインヒビターの例には、ホルメスタン（４-ＯＨアンドロステンジオン）、エクセメスタン（ステロイド性、非可逆的（タイプ１）インヒビター）、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）およびレトロキソール（非ステロイド性、可逆的（タイプ２）インヒビター）が含まれる。両方のタイプのインヒビターの使用が有用な患者もいるであろう（Harper-Wynne & Coombes (1999) Eur J Cancer 35, 744-746）。
また、骨粗鬆症、骨折又は他の筋骨格疾患のリスクに対処するために２ホスホン酸塩および／またはカルシウム補助剤を含有することが有用でありうる。
【００６４】
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一以上の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤とを含む子宮内膜症に対処するためのキット・オブ・パーツを包含する。
また、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤とを含む組成物を包含する。
さらに、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤とを含む医薬の使用のための組成物を包含する。
【００６５】
加えて、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤と、薬理学的許容性のある担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物を包含する。
本発明は雌性個体の子宮内膜症に対処する方法であり、該方法が雌性個体にＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子（上記記載のような）と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を投与することを含む方法を包含する。
【００６６】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤とエストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する作用剤を連続的に又は（実質的に）同時に投与することができることが理解されるであろう。それらは同じ医薬製剤又は医薬内にあってもよいし、別々に製剤化又は投与されてもよい。
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤との組合せを雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製への使用を包含する。
【００６７】
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製への使用であり、該個体はエストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を投与されている使用を包含する。たとえ雌性個体が前記医薬を投与される前（又は投与された後）に該作用剤を投与された（又は投与される）場合でも、典型的に雌性個体は医薬として同時にエストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する作用剤を投与される。
本発明は、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製への使用であり、該個体はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を投与されている使用を包含する。たとえ雌性個体が前記医薬を投与される前（又は投与の後）に作用剤又は核酸分子を投与された（又は投与される）場合でも、典型的に雌性個体は医薬として同時に作用剤又は核酸分子が投与される。
【００６８】
本明細書で示した文書のすべては出典明記により全体に組み込まれる。
本明細書中の既に発行された文書のリストまたは考察は、文書が最先端又は共通した一般的な知識であると認識する上で必ずしも必要でない。
本発明を以下の図及び実施例によってより詳細に記載する。
【実施例】
【００６９】
実施例１：月経周期中のヒト子宮内膜におけるプロキネチシン（ＥＧ−ＶＥＧＦおよびＢｖ８）およびそのレセプターの発現と局在
概要
２つの非常に相同なＧタンパク結合レセプター、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２である、プロキネチシン（ＰＫ１およびＰＫ２、それぞれ内分泌腺血管内皮成長因子（ＥＧ−ＶＥＧＦ）およびＢｖ８としても知られる）は、内分泌組織の新規の血管形成因子として同定された。しかしながら、子宮におけるそれらの発現および分布についての情報はほとんどなかった。
本研究の目的は、正常なヒト子宮内膜におけるプロキネチシンおよびそれらのレセプターの発現を示すことと、月経周期中のそれらの発現における時間的変化を調べることである。加えて、プロゲステロンによるＰＫ１の調節を、インビトロでインキュベートした正常な子宮内膜組織において検討した。
我々は、月経周期中の子宮内膜組織におけるプロキネチシンおよびそのレセプターの発現および局在化を調査した。規則的な月経周期の女性から子宮内膜組織（ｎ＝３５）を得た。Lothian Research Ethics委員会からの倫理的承認と書面でのインフォームドコンセントを得た。ＰＫ１、ＰＫ２およびそれらのレセプターの経時的発現を、リアルタイム（Ｔａｑｍａｎ）量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＰＫ１の局在化は免疫組織化学によって調べ、ＰＫ２の分布について、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２は、インサイツハイブリダイゼーションによって検討した。加えて、我々は、ＰＫ１の発現に対するプロゲステロンの効果を検討した。子宮内膜組織（ｎ＝５）は１μＭプロゲステロンにて２４時間インキュベートし、ＲＮＡを抽出して、量的ＲＴ−ＰＣＲに用いた。
【００７０】
ＰＫ２の発現は周期によって変化しないのに対して、ＰＫ１発現は増殖期（Ｐ＜０．０５）と比較して月経周期の分泌期において有意に増加した。ＰＫＲ１およびＰＫＲ２はともに、後期分泌期から月経期への変化の間の子宮内膜組織において有意な上方制御が示された（Ｐ＜０．０５）。ＰＫ１、ＰＫ２、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２は、子宮内膜の腺性上皮細胞、間質性細胞および内皮細胞と、子宮筋層の内皮細胞に局所化していた。ＰＫＲ２と比較してＰＫＲ１でより大きな染色強度が観察された。
これらのデータにより、ヒト子宮内膜におけるプロキネチシンおよびそれらのレセプターの周期的調節が確認され、子宮内膜血管機能における新規の血管形成因子としての働きが示唆される。
【００７１】
要旨
本研究ではプロキネチシン１（ＰＫ１又はＥＧ−ＶＥＧＦ）およびプロキネチシン２（ＰＫ２又はＢｖ８）、およびそれらのレセプター（ＰＫＲ１およびＰＫＲ２）の経時的な発現を妊娠していないヒト子宮内膜において検討した。ＰＫ１の発現（量的ＲＴ−ＰＣＲによる）は、増殖期と比較して、月経周期の分泌期において有意に増加した（ｐ＜０．０５）。ＰＫＲ１およびＰＫＲ２発現が後期分泌期と比較して月経期で有意に上昇する一方、ＰＫ２発現は月経周期の時期に有意な変化がみられなかった。
免疫組織化学によると、ＰＫ１は、子宮内膜の腺性上皮細胞、間質性細胞および血管内皮細胞と、子宮筋層の内皮および平滑筋細胞に局所化されていた。ＰＫ１と同じ部位にＰＫ２の弱い反応が検出された。ＰＫＲ１の発現は試料によって異なるが、いくつかの組織、特に機能層の腺性上皮細胞、間質性細胞および内皮細胞と、子宮筋層の内皮細胞において強い反応が見られた。対照的に、ＰＫＲ２はわずかに発現されるのみであった。１μＭプロゲステロンでの子宮内膜組織の処置によって、ＰＫ１の発現は対照と比較して２．９１倍上昇した（ｐ＜０．０５）。これらのデータにより、ヒト子宮内膜におけるプロキネチシンおよびそれらのレセプターの局在化および周期的な調節が確認された。
【００７２】
材料および方法
患者および組織採取
月経周期の種々の段階の子宮内膜生検を、生検採取前の３ヶ月間にホルモン調製を受けていない規則的な月経周期の（２５−３５日）女性から集めた。試料は子宮内膜吸引キュレット（ピペット、Laboratoire CCD, Paris, France）を使って、又は良性の婦人科的兆候のために子宮切除術を受けた女性から全厚（機能層及び基底-子宮筋層結合部を含む）の子宮内膜生検を採取した。採取後すぐに、組織をドライアイス中で急速に凍結し、−７０℃で保存し（ＲＮＡ抽出のため）、中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で固定し、ワックスに埋め込むか（免疫組織化学的分析のため）、又はＲＰＭＩ１６４０（２ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−グルタミン、１００Ｕペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む）中に置き、研究室に移してインビトロ培養を行った。
生検は申告された最終月経期（ＬＭＰ）に基づいて日付を付け、Noyes及び共同者の基準に従って組織検査によって確認した(Noyes等, Am. J. Obstet. Gynecol. 122: 262-263)。さらに生検時の循環エストラジオール及びプロゲステロン濃度は、申告されたＬＭＰと月経周期段階の組織検査との両方で一致した。試料は、月経周期の時期に応じて、月経期（第１−４日目）、初期〜中期増殖期（ＥＰ−ＭＰ；第５−１０日目）、後期増殖期〜黄体期（ＬＰ−Ｏｖ；第１１−１４日目）、初期分泌期（ＥＳ；第１５−１８日目）および中期〜後期分泌期（ＭＳ−ＬＳ；第１９−２８日目）に分類した。ロジアン・リサーチ倫理委員会（Lothian Research Ethics Committee）から倫理的承認を得て、組織の採集前に全被験者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。
【００７３】
Ｔａｑｍａｎ量的ＲＴ−ＰＣＲ
製造者の指示書に従って、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ(Sigma, Poole, UK)を用いて月経周期を通して得た子宮内膜生検（ｎ＝３５）からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料を定量して、５．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／ｌの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、２．５μｍｏｌ／ｌランダムヘキサマー、リボヌクレアーゼインヒビター（０．４Ｕ／μｌ）及び１．２５Ｕ／μｌマルチスクラブ逆転写酵素(すべてApplied Biosystems, Warrington, UKより)を用いて逆転写を行った。各逆転写反応液にＲＮＡ（４００ｎｇ）を加えて、２５℃で９０分、４８℃で４５分、及び９５℃で５分で試料をインキュベートした。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の反応混合液は、１×マスターミックス、リボソーム１８Ｓフォワード及びリバースプライマー、リボソーム１８Ｓプローブ（５０ｎｍｏｌ／ｌ；すべてApplied Biosystems, Warrington, UKより)、ＰＫ１、ＰＫ２、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２（３００ｎｍｏｌ／ｌ）のフォワード及びリバースプライマー、及びそれらのプローブ（２００ｎｍｏｌ／ｌ）(すべてBiosource UK, Nivelles, Belgiumより)からなる。反応混合液（４８μｌ）をチューブに等分割し、２μｌのｃＤＮＡを加えた。分割した２４μｌの試料と、ポジティブ及びネガティブコントロールをＰＣＲプレートに設置し、光学キャップでウェルを密閉した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００(Applied Biosystems, Warrington, UK)を用いてＰＣＲ反応を行った。すべてのプライマー及びプローブはＰＲＩＭＥＲエクスプレスプログラム（Applied Biosystems, Warrington, UK）によって設定した。プライマーおよびプローブの配列を表１に示す。データは、Sequence Detectorバージョン1.6.3(Applied Biosystems, Warrington, UK)を用いて製造者の指示に従って分析して処理した。結果は、すべての反応に含まれる内因性ポジティブ基準値（子宮内膜組織の単一試料から得たｃＤＮＡ）との相対で表す。
【００７４】
インサイツハイブリダイゼーション
ＰＫ２、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２用に特別に合成されたオリゴヌクレオチド二重フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ｃＤＮＡプローブをＢｉｏｇｎｏｓｔｉｋ(Gottingen, Germany)から入手した。月経周期全体から採取した全厚ヒト子宮生検（ｎ＝１２）から切片（５μＭ）をゼラチン被覆スライド上に切り取った。切片のワックス除去を行い、再水和した後、プロテイナーゼＫ処理（５０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡを含む１００ｍｍｏｌ／ｌトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６中２０μｇ／ｍｌ）を３７℃で１５分間行い、ｃＤＮＡプローブのアクセスを高めた。切片をジエチルピロカルボネート処理水中で洗浄後、あらかじめ９５℃で熱処理したプローブを加えたハイブリダイゼーションバッファー２５μｌを用いて３０℃で４時間プレハイブリを行った。その後、ＰＫＲ１では６Ｕ／μｌ、ＰＫ２およびＰＫＲ２には１２Ｕ／μｌのｃＤＮＡプローブを含むハイブリダイゼーションバッファー中で３０℃で終夜ハイブリダイズを行った。ハイブリダイゼーション後、１×標準的クエン酸生理食塩水（ＳＳＣ）にて室温で５分間（２回）及び０.１×ＳＳＣにて３９℃で１５分間（２回）の洗浄を行った。ＴＢＳですすいだ後、１０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含むメタノールにて内因性のペルオキシダーゼ活性を失活した。付加的増幅工程を有する標準的免疫組織化学的試薬(TSA Biotin System, NEN Life Science Products, Hounslow, UK)を使用してＦＩＴＣ標的プローブを検出した。切片を３０分間ブロッキングバッファーにてインキュベートした。共役抗−ＦＩＴＣ−西洋わさびペルオキシダーゼ(Roche, Diagnostics Ltd.,Lewes, UK)を１／２００の希釈率でブロッキング緩衝液に加え、切片を３０分間インキュベートした。洗浄後、ビオチニルチラミド増幅試薬（１／５０）を各スライドに加え、１５分間インキュベートした。洗浄後ストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（１／１００）を加え、３０分間インキュベートし、プローブの局在を３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質で可視化した。バックグラウンドハイブリダイゼーションを評価するために同じ比率のシトシン（Ｃ）及びグアニン（Ｇ）塩基をＰＫ２、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２プローブとして含む二重ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドプローブで対照切片を処理した。全処理は特に記載のない限り室温で行った。
【００７５】
免疫組織化学
月経周期を通して採取した子宮内膜切片（ｎ＝１２）（５μｍ）はキシレンでワックス除去し、漸増濃度のエタノールを使用して再水和した。煮沸した０．１％クエン酸バッファー（ｐＨ３．０）中で圧力機で５分間、切片を処理することによって抗原検索を行った。室温の１０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含むメタノールにより内在性のペルオキシダーゼ活性を失活した。非免疫のブタ血清（２０％血清ＰＢＳ）を１時間適用して、１／２０００に希釈したウサギ抗ヒトプロキネチシン１(Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont, CA)とともに４℃で終夜インキュベーションした。そして、色素原としてＤＡＢを用いてアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ検出システムを適用した(DAKO Ltd.,Cambridge, UK)。
【００７６】
組織培養
子宮内膜生検（ｎ＝５）をはさみで微細に細かく切り刻んで、２つに分けた。組織を、加湿した５％ＣＯ２恒温器中で、１００ＩＵペニシリンおよび１００μｇストレプトマイシンを含むＬ-グルタミン(Invitrogen Ltd., Paisley, UK)を添加した２ｍｌのフェノールレッドフリーＤ-ＭＥＭ／Ｆ-１２培地にて３７℃で終夜インキュベートした。次いで、組織を、１μＭプロゲステロンまたは当量のエタノールの何れかが含まれる同じ培地中で２４時間処理した。
【００７７】
統計
適切な場合は、データをＡＮＯＶＡ統計分析及びフィッシャーＰＬＳＤ検定にかけ（Statview 4.0；Abacus Concepts Inc.,USA）、ｐ＜０.０５の場合に統計的に有意であるとした。
【００７８】
結果
月経周期中のＰＫ１およびＰＫ２およびそのレセプターの発現をリアルタイム量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた（図１ａ）。調べたすべての試料（Ｎ＝３５）でＰＫ１が検出され、月経周期の増殖期（第５−１４日目）と比較して分泌期（第１５−２８日目）で有意に発現が亢進されていた（１０７．３５±２４．０７対３．２９±０．９８；ｐ＜０．０１）。周期の月経期におけるＰＫ１の発現（８４．４３±４０．５２）は増殖期または分泌期と有意な差はなかった。また、調べたすべての試料においてＰＫ２の発現がみられたが（図１ｂ）、月経周期の段階と有意差は示されなかった（月経期：５．４４±２．５３；増殖期：３．１７±０．６１；分泌期２．８８±０．４７）。ＰＫＲ１およびＰＫＲ２の発現は月経周期の増殖期および分泌期と比較して違いはなかった（それぞれ１．３８±０．１６対１．２１±０．１９および３．０８±０．５２対３．４５±０．６２）が、分泌期と比較して月経期ではＰＫＲ１およびＰＫＲ２ともに有意に発現が高かった（３．１７±２．２６；１６．１６±１２）（ＰＫＲ１ではｐ＜０．０５；ＰＫＲ２ではｐ＜０．０１）（図１ｃおよび１ｄ）。また、ＰＫＲ２に関して月経期および増殖期の間に有意差があった（ｐ＜０．０１）。
月経周期を通して採取した全厚のヒト子宮内膜生検におけるＰＫ１の免疫組織化学染色を行った（図２ａ−２ｃ）。反応は可変的でありネガティブな組織もあった。機能層および基底層の腺性上皮細胞の細胞質および核周囲に発現が検出された（図２ｂおよび２ｃ）。機能層の内皮細胞および間質性細胞に核周辺免疫反応が検出され、基底層の内皮細胞および間質性細胞はより弱い染色が観察された。また、子宮筋層の血管に並ぶ内皮細胞および子宮筋平滑筋細胞にも核周辺に免疫反応が示された。
【００７９】
インサイツハイブリダイゼーションによりＰＫ２発現を調べた（図２ｄ−２ｆ）。一般的に、発現は弱く、調べた試料すべてにはみられなかった。上皮の管腔表面に対して強く染色される主に機能層（図２ｆ）の腺性上皮細胞の細胞質に反応が検出された。また、機能層の間質性細胞および上皮細胞にわずかに反応が表れ（図２ｆ）、基底層にも血管染色されるものもあった。また、まれに子宮筋平滑筋細胞が弱く染色される子宮筋層の脈管構造にもＰＫ２が発現された。
インサイツハイブリダイゼーションにより子宮内膜にＰＫＲ１の強い発現が示されたが、月経周期の後期増殖期から中期分泌期に採取した試料はとても弱いか、ネガティブなＰＫＲ１染色を示した。機能層および基底層の腺性上皮細胞並びに両層の内皮細胞の細胞質に反応が検出された（図３ａ−３ｃ）。また間質性細胞も反応を示すが、機能層でより強かった（図３ｃ）。子宮筋層の血管に顕著なＰＫＲ１発現があり、平滑筋細胞も反応を示した。ＰＫＲ２はＰＫＲ１よりあまり発現されず（図３ｄ−３ｆ）、染色は弱く、主に機能層の腺性上皮細胞および内皮細胞の細胞質に限定していた（図３ｆ）。
月経周期の分泌期にＰＫ１の発現が著しく上方制御されることにより、プロゲステロンによりＰＫ１が調節されている可能性が示唆された。ゆえに、この仮定を調べるために、子宮内膜組織試料（ｎ＝５）を１μＭプロゲステロンまたは当量のエタノール存在下にて２４時間インキュベートした。ＴａｑｍａｎＲＴ−ＰＣＲにより対照と比較すると、プロゲステロンとともにインキュベートした組織のＰＫ１発現は２．９１（±０．７５）倍の増加を示した。
【００８０】
表１
【００８１】
実施例２：ＰＫ１アンタゴニストを用いた月経過多の治療
月経過多に罹患した患者に、公開された米国特許出願第２００２／０１９２６３４号に記載されるモノクローナル抗体４Ｈ９などの抗ＰＫ１抗体を、治療部位での活性作用剤の治療的濃度が治療期間を通じて理想的にはＥＣ９０のレベルに、好ましくはＥＣ５０以下にならないように維持される用量及び頻度で投与する。典型的には、少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度に抗体を維持する。この治療は、患者の容認性、副作用の回避及び全身的バイオアベイラビリティに応じて、経口的に、あるいはより局所的に処方される。
【００８２】
実施例３：ＰＫ１アンタゴニストを用いた月経困難症の治療
月経困難症に罹患した患者に、公開された米国特許出願第２００２／０１９２６３４号に記載されるモノクローナル抗体４Ｈ９などの抗ＰＫ１抗体を、治療部位での活性作用剤の治療的濃度が治療期間を通じて理想的にはＥＣ９０のレベルに、好ましくはＥＣ５０以下にならないように維持される用量及び頻度で投与する。典型的には、少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度に抗体を維持する。この治療は、患者の容認性、副作用の回避及び全身的バイオアベイラビリティに応じて、経口的に、あるいはより局所的に処方される。
【００８３】
実施例４：ＰＫ１アンタゴニストを用いた子宮内膜症の治療
子宮内膜症に罹患した患者に、公開された米国特許出願第２００２／０１９２６３４号に記載されるモノクローナル抗体４Ｈ９などの抗ＰＫ１抗体を、治療部位での活性作用剤の治療的濃度が治療期間を通じて理想的にはＥＣ９０のレベルに、好ましくはＥＣ５０以下にならないように維持される用量及び頻度で投与する。典型的には、少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度に抗体を維持する。この治療は、患者の容認性、副作用の回避及び全身的バイオアベイラビリティに応じて、経口的に、あるいはより局所的に処方される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】月経周期中のヒト子宮内膜におけるＰＫＩ（ａ）、ＰＫ２（ｂ）、ＰＫＲ１（ｃ）及びＰＫＲ２（ｄ）の量的ＲＴ−ＰＣＲ。それぞれの記号は一つの組織試料を表す。平均を棒線で示した。
【図２】（ａ−ｃ）ヒト子宮内膜組織（機能層及び基底-子宮筋層結合部）におけるＰＫ１の免疫組織学的局在。基底層（Ｂ）及び機能層（Ｆ）の両方に腺性上皮性染色（Ｇ）がみられ、子宮筋層（Ｍ）に平滑筋細胞の反応が検出された。機能層（図２ｂ）及び基底層（図２ｃ）に間質性細胞の発現が検出され、組織全体に内皮細胞の反応が見られた（図２ｂ及び２ｃの矢印で示す）。ＮＥＧ＝ネガティブコントロール；大きさの基準＝１００μＭ（図２ａ）及び５０μＭ（図２ｂ）。（ｄ−ｆ）ヒト子宮内膜組織（機能層及び基底-子宮筋層結合部）におけるＰＫ２のインサイツハイブリダイゼーション。ＰＫ２は、表面皮覆組織（ＳＥ）に対して強い反応性を有する基底層（Ｂ）（図２ｆ）及び機能層（Ｆ）（図２ｅ）の腺性上皮細胞（Ｇ）で発現した。反応性は、主に機能層の間質性細胞および内皮細胞に検出された（図２ｆの矢印で示す）。
【図３】（ａ−ｃ）ヒト子宮内膜組織（機能層及び基底-子宮筋層結合部）におけるＰＫＲ１のインサイツハイブリダイゼーション。腺性上皮細胞（Ｇ）および間質性細胞（図３ｂ）の機能層（Ｆ）、および基底層（Ｂ）の腺性上皮細胞に強い染色が検出された。また、ＰＫＲ１は、子宮内膜および子宮筋層（Ｍ）の全体にわたる内皮細胞（図３ｃの矢印で示す）および、子宮筋層平滑筋細胞に発現した。ＮＥＧ＝ネガティブコントロール；大きさの基準＝１００μＭ（図３ａ）及び５０μＭ（図３ｂ）。ＳＥ＝表面被覆組織。（ｄ−ｆ）ヒト子宮内膜組織（機能層及び基底-子宮筋層結合部）におけるＰＫＲ２のインサイツハイブリダイゼーション。腺性上皮細胞（Ｇ）および内皮細胞の子宮内膜(Ｆ)の機能層において主にＰＫＲ２の弱い発現が検出された（図３ｆの矢印で示す）。ＮＥＧ＝ネガティブコントロール；大きさの基準＝１００μＭ（図３ｄ）及び５０μＭ（図３ｅ）。ＳＥ＝表面被覆組織。
【図４】２４時間の１μＭプロゲステロン処置に応答する子宮内膜組織（ｎ＝５）におけるＰＫ１発現。結果は、ＰＫ１±ＳＥＭ（＊はｐ＜０．０５を意味する）の平均倍数増加として表す。
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、治療方法、特に月経過多、月経困難症および子宮内膜症の治療方法に関する。
【０００２】
月経過多は月経排出の過剰である。月経困難症は痛みを伴う月経を意味する。子宮内膜症は子宮外着床および子宮内膜の成長であって、したがって、子宮内膜の異常な細胞成長と考慮されうる。
月経過多、月経困難症および子宮内膜症は、特に西側諸国の多くの女性に多く、著しい健康問題を現す。英国の３４〜４９歳の２０人に少なくとも１人の女性が、月経問題のために一般開業医にかかっているであろう。これらの女性は全ての婦人科外来患者の１０の１以上を占めており、医薬処方単独では年間７百万を上回るＮＨＳを占めている。毎年行われる少なくとも７０，０００の子宮切除術の７０％に異常な膣出血が認められると言われている。
現時点では、月経過多に用いられる治療にはトラネキサム酸又はメフェナム酸を含む。重症例では治療が子宮切除術（膣または腹部）となるが、これは深刻な罹患率およびいくらかの死亡のリスクを伴う重大な手術である。月経過多の治療については、Stirrat (1999) The Lancet 353, 2175-2176を参照のこと。更なる代替治療の開発が望まれる。
【０００３】
血管新生は、周期的な組織再生および子宮内膜成長と、月経過多および子宮内膜症を含む子宮内膜性疾患の発達において非常に重要である。子宮内膜性血管新生の制御の際の主な役割は、遺伝子のＶＥＧＦファミリーおよびそのレセプターを含む多くの因子と線維芽細胞成長因子について明らかにされてきた(Smith (2001) Trends Endocrinol. Metab. 12[4]: 147-51)。しかしながら、子宮内膜の血管新生のメカニズムは完全に解明されないままである。
プロキネチシン、内分泌腺由来血管内皮成長因子（ＥＧ-ＶＥＧＦ）としても知られるプロキネチシン１（ＰＫ１）と、Ｂｖ８としても知られるプロキネチシン２（ＰＫ２）は６０％の配列同一性を有する２つの近年同定された血管形成因子である(LeCouterら (2001) Nature 412: 877-884；Liら (2001) Mol. Pharmacol. 59: 692-698；およびLeCouterら (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 2685-2690)。ＰＫ１ ｍＲＮＡ発現は、ステロイド産生腺、すなわち卵巣、精巣および副腎および胃腸管、神経系、膀胱および前立腺を含む他の組織を含む様々な組織において示されている(LeCouterら (2001)；Liら (2001))。ＰＫ2発現は同類の分布を示すが、通常その発現は弱く、精巣および末梢血白血球で最も強い発現を示す(Liら(2001)；LeCouterら (2403))。ＲＮＡによる分析又はノーザンハイブリダイゼーションによると、ヒト子宮でのＰＫ１発現とＰＫ２発現のレベルは低いが、ＰＫ１の発現はより大きいことが示された(Liら (2001))。
【０００４】
プロキネチシンは、２つの非常に相同なＧタンパク質結合レセプター、プロキネチシンレセプター１（ＰＫＲ１）、およびプロキネチシンレセプター２（ＰＫＲ2）のリガンドであり、その活性化によってカルシウム流通、ホスホイノシチド代謝回転の刺激およびＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の活性化が起こる。プロキネチシンレセプターの発現は、精巣、皮膚および中枢神経系を含む多くの組織において同定された(Linら (2002) J Biol. Chem. 277[22]: 19276-280；Sogaら (2002) Biochimica et Biophysica Acta 1579: 173-179)。
ＰＫ１およびＰＫ２の機能を検討する初期の研究により、それらが器官特異的な方法で内皮細胞増殖および化学走性を引き起こすことによって血管形成を促進することが示された(LeCouterら (2001); LeCouteら (2003))。加えて、それらが酸素圧低下に応答して分泌され、視交差上核のサーカディアンリズムの伝達に関与するという所見がある(LeCouterら (2001)；Chengら (2002) Nature 417: 405-410)。
ＷＯ０２／００７１１ (Genentech, Inc.)には、ＰＫ１（ＥＧ-ＶＥＧＦと称する）が記載されており、その生物学的役割が考察されている。ＷＯ０２／００７１１は、ＥＧ-ＶＥＧＦ又はそのアゴニスト又はそのアンタゴニストは、癌（例えば子宮癌および子宮内膜上皮癌）を含む多くの疾患症状を治療する際に有効であると述べている。他の子宮症状（例えば月経過多、月経困難症又は子宮内膜症）を治療するためにＥＧ-ＶＥＧＦのアンタゴニストを用いることは開示も提案もされていない。
【０００５】
我々は、月経周期中の子宮のプロキネチシンおよびプロキネチシンレセプターの発現を検討して、他の段階と比較して子宮内膜の分泌期の間にＰＫ１の発現レベルがより高いことを示した。また、ＰＫ１発現は同様に月経期において上昇する。プロキネチシンレセプターＰＫＲ１およびＰＫＲ２はともに、周期の他の段階と比較して、周期の月経期に発現が増加した。また、免疫組織化学によると、子宮内膜の腺性上皮細胞、間質性細胞、血管内皮細胞と、子宮筋層の内皮細胞および平滑筋細胞にＰＫ１が局在化していた。これらの所見はプロキネチシンレセプターに対するＰＫ１の効果を低下させるかまたは予防し、月経過多、月経困難症および子宮内膜症に対処する可能性を示唆している。
【０００６】
本発明の第一の態様では、雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症に対処する方法であり、プロキネチシンレセプター（ＰＫＲ）に対するプロキネチシン１（ＰＫ１）の効果を減退させる少なくとも一の作用剤を該個体に投与することを含む方法を提供する。
前記方法は、月経過多、月経困難症又は子宮内膜症（の症状を緩和するためすなわち緩和剤使用）に用いてもよい、又は症状の重症度を低下させるために用いてもよい、又は症状を治療するために用いてもよい、または、症状を予防するために予防的に用いてもよい。したがって、疾患又は症状「に対処する」には、疾患又は症状を治療する、減退させる又は予防する、あるいは、疾患又は症状の兆候を緩和するという意味が含まれる。
ゆえに、本発明は、雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症を治療する、減退させる、予防する、あるいは雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症の兆候を緩和する方法であり、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤を該個体に投与することを含む方法を含む。
【０００７】
本発明の第二の態様では、雌性個体の月経過多、月経困難症または子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤の使用を提供する。
ゆえに、本発明は、雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症を治療する、減退させる、予防する、あるいは雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症の兆候を緩和するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤の使用を含む。
ＰＫ１には、ヒトプロキネチシン１遺伝子（ＰＲＯＫ１）およびその天然に生じる変異体の遺伝子産物が含まれる。ヒトＰＫ１のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ委託番号ＮＭ＿０３２４１４およびＮＰ＿１１５７９０に明らかである。また、ＰＫ１はLeCouterら (2001)およびWO 02/00711に記載されている。
ＰＫ１はＰＫＲ１およびＰＫＲ２両方のリガンドとして示されている(Masudaら(2002) Biochemical and Biophysical Research Communications 293: 396402；Sogaら (2002)；Linら (2002))。したがって、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤には、ＰＫＲ１に対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤とＰＫＲ２に対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が含まれる。
【０００８】
ＰＫＲ１には、ヒトプロキネチシンレセプター１遺伝子（ＰＫＲ１）およびその天然に生じる変異体の遺伝子産物が含まれる。ヒトＰＫＲ１のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ委託番号ＡＦ５０６２８７およびＡＡＭ４８１２７に明らかである。
ＰＫＲ２には、ヒトプロキネチシンレセプター２遺伝子（ＰＫＲ２）およびその天然に生じる変異体の遺伝子産物が含まれる。ヒトＰＫＲ２のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ委託番号ＡＦ５０６２８８およびＡＡＭ４８１２８に明らかである。
月経過多、月経困難症および／または子宮内膜症をともに持つ可能性があり、本発明の方法および使用を用いて同一患者の複数の症状に対処しうる。あるいは、前記方法および使用を用いて、月経過多、月経困難症および子宮内膜症の何れかを別々に対処することもできる。
【０００９】
したがって、本発明は、雌性個体の月経過多に対処する方法であり、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤を該個体に投与することを含む方法を含む。
本発明は、雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤の使用を提供する。
また、本発明は、雌性個体の月経困難症に対処する方法であり、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤を該個体に投与することを含む方法を含む。
したがって、本発明は、雌性個体の月経困難症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤の使用を提供する。
また、本発明は、雌性個体の子宮内膜症に対処する方法であり、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤を該個体に投与することを含む方法を含む。
したがって、本発明は、雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤の使用を提供する。
【００１０】
雌性個体は月経過多、月経困難症および／または子宮内膜症に罹患しているかまたはその症状のリスクがある任意の個体であり得る。
閉経前又は閉経後の女性の何れにも月経過多及び／又は月経困難症のリスクがある；しかし、月経過多は女性の生殖期間の始まりから終わりまで共通してあるものであり、概して、女性の月経が初めて始まるとき及び４０歳以上の女性により大きなリスクがある。
治療される患者は、このような処置により利益を得るいかなる女性であってもよい。典型的に、及び、好ましくは、治療される患者は、人間の女性である。しかしながら、本発明の方法は、雌の哺乳類、例えば以下の種の雌：ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ネコおよびイヌを治療するために用いてもよい。このように、方法は人間および獣医学の用途がある。
獣医学的治療法など、本発明の非ヒト態様には、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は治療する種に効果を有するものであることが好ましいことが理解される。
典型的に、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫＲのＰＫ１媒介性シグナル伝達を阻害するかまたは低下させるかまたは破壊するものである。
【００１１】
本発明の一実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤がＰＫＲに対する効果を有するＰＫ２を阻害しない（完全またはある程度）ことが好ましい。この実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫＲに対するＰＫ２の効果をさほど減退させないか、またはＰＫＲに対するＰＫ２の効果を全く（または検出不可能なレベルでしか）減退させない。したがって、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫ１自体を標的とするか、ＰＫ１とＰＫＲとの相互作用を標的とすることが好ましい。
好ましくは、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤はＰＫＲに対するＰＫ１の結合を阻害するか、減退させるか破壊する。あるいはまたは加えて、前記作用剤は、ＰＫ１とＰＫＲとの相互作用、またはＰＫＲと関連Ｇタンパク質との相互作用に影響して、ＰＫ１−ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害または破壊しうる。
好ましい実施態様では、前記作用剤は、ＰＫ１のアンタゴニストであり得る。ＰＫ１アンタゴニストは一般的に、ＰＫ１に結合する分子であり、そのレセプターに対するＰＫ１結合を阻害、減退または破壊するもので、それによってＰＫ１−ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害または破壊する。一般的にレセプターまたは抗体の何れか一部がＰＫ１に結合する「可溶性レセプター」手法である。
【００１２】
「アンタゴニスト」なる用語は広義で用いられ、ＰＫ１の生物学的活性を部分的にまたは完全に遮断するか、阻止するか、抑制するか、減退させるか中和させる任意の分子を含む。好適なアンタゴニスト分子には特に、抗体または抗体断片、ＰＫ１またはＰＫＲの断片またはアミノ酸配列変異体、ペプチドおよび小有機分子が含まれる。
他の好ましい実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫ１またはＰＫＲの発現を阻害するか、減退させるか破壊する作用剤であり得る。前記作用剤は、ＰＲＯＫ１、ＰＫＲ１またはＰＫＲ２遺伝子の転写を阻害するか、減退させるか破壊するか、あるいは前記遺伝子転写物の安定性や翻訳を阻害するか、減退させるか破壊する。好適な作用剤には、小干渉ＲＮＡ分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重形成オリゴヌクレオチドおよびリボザイムが含まれうる。
あるいは、ＰＫ１アンタゴニストは、ＰＫＲに対するＰＫ１の結合を抑制または減退させることなくＰＫ１に結合するが、ＰＫ１とＰＫＲとの相互作用を破壊してＰＫ１−ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害または破壊する分子であり得る。これは、ＰＫ１に共有結合性の様式で結合して、結合能力には影響を及ぼさないでシグナル伝達メカニズムに影響する分子であり得る。
【００１３】
好ましい一実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤には、ＰＫＲのアンタゴニストが含まれ、それは、患者への投与に好適なＰＫＲアンタゴニストでもよい。一般的に、レセプターアンタゴニストは特定のレセプターに対して選択的であり、好ましくはＰＫ１自体よりもＰＫＲと同じかより高い結合親和性を有する。アンタゴニストは天然のリガンドよりレセプターに対する親和性が高いことが好ましいが、より高い濃度で用いることが必要であるが、より親和性が低いアンタゴニストも用いることができる。好ましくは、アンタゴニストは可逆的にＰＫＲに結合する。好ましくは、アンタゴニストは特定のレセプターに対して選択的であり、他のレセプターに影響しない；したがって、一般的にＰＫＲアンタゴニストはＰＫＲには結合するが、他のＰＫＲには実質的に結合しない。
一実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫＲのアンタゴニストであり得る。ＰＫＲアンタゴニストは一般的に、ＰＫＲに結合し、天然のリガンドＰＫ１の結合と拮抗し、ＰＫ１−ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害または破壊する分子である。
【００１４】
一実施態様では、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させることには、ＰＫＲ上のＰＫ１結合部位を占領し、Ｇαｑを介する正常なシグナル伝達が起こるような天然のリガンド（ＰＫ１）の結合を阻害する（完全にまたはある程度）ことが含まれる。
あるいは、前記レセプターアンタゴニストは、ＰＫＲへのＰＫ１結合を阻害することなくＰＫＲに結合するが、ＰＫ１とＰＫＲとの正常な相互作用を破壊し、ＰＫ１−ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害、減退または破壊する分子であり得る。
さらに、択一的に、ＰＫＲアンタゴニストは、ＰＫＲに結合して、ＰＫＲと関連Ｇタンパク質との相互作用を破壊して、ＰＫ１媒介性シグナル伝達経路を阻害または破壊する分子であり得る。
潜在的なアンタゴニストのより具体的な例には、抗ＰＫ１抗体および抗ＰＫＲ抗体が含まれる。抗体には、限定するものではないが、ポリ-およびモノクローナル抗体および抗体断片、一本鎖抗体、抗イデオタイプ抗体、およびそのような抗体または断片のキメラないしヒト化型、並びにヒト抗体および抗体断片が含まれる。
【００１５】
抗ＰＫ１または抗ＰＫＲ抗体はポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調整方法は当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤と必要であればアジュバントを１回またはそれ以上注射することによって哺乳動物内で生じうる。典型的に、免疫化剤および／またはアジュバントは複数回の皮下投与または腹腔内投与によって哺乳動物に注射するであろう。免疫化剤は、ＰＫ１ポリペプチドまたはその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を、免疫化する哺乳動物内で免疫原性であることが知られているタンパク質とコンジュゲート（共役）させることが有用であり得る。そのような免疫原性タンパク質の例には、限定するものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよびダイズトリプシンインヒビターが含まれる。使用されうるアジュバントの例には、フロインド完全アジュバントおよびＭＰＬ―ＴＤＭアジュバント（一リン酸化リビドＡ、合成トレハロースジコリノマイコレート(dicorynomycolate)が含まれる。免疫化の手順は、過度の実験を要することなく技術者によって選択されうる。
あるいは、およびより好ましくは、前記抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein, Nature, 256: 495 (1975)に示されるようなハイブリドーマ法を用いて調製しうる。ハイブリドーマ法では、一般的に、マウス、ハムスターまたは他の好適な宿主動物を免疫化剤にて免疫化して、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球はインビトロで免疫化してもよい。
【００１６】
免疫剤は、典型的にはＰＫ１ポリペプチドないしＰＫＲポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、或いは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103)。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００１７】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカ培養細胞系統保存期間（ＡＴＣＣ）より入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、モノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【００１８】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる(Goding, 1986)。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。或いは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００１９】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、或いは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、或いは本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体でもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られている。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。或いは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
【００２０】
一価抗体の調製には、同じくインビトロ法が適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成が可能である。
好ましい実施態様では、抗体はヒト化抗体又はヒト抗体でもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖或いはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２或いは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全て或いはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て或いはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００２１】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(Winter)及び共同研究者［Jonesら, (1986)；Riechmannら, (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
【００２２】
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381(1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:381 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77 (1985); Boerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方はＰＫ１又はＰＫＲに対するものであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対するものであり得る。あるいは、二重特異性抗体はＰＫ１又はＰＫＲ上の異なる２つのエピトープに結合してもよい。
【００２３】
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順がＷＯ９３／０８８２９、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性（抗体-抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【００２４】
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第一抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第二の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆａｂ二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ’)２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’-チオールに再転換し、他のＦａｂ’-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００２５】
大腸菌からＦａｂ’フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ’)２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【００２６】
また、組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離するために様々な方法が記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の二つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、二つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60 (1991)。
【００２７】
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲内である。ヘテロコンジュゲート抗体は、二つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため（米国特許第４，６７６，９８０号）及びＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６７，９８０号に開示されたものが含まれる。
【００２８】
また、抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epsteinら, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲート（抱合）され得る。また、リポソームを用いて細胞内に抗体または抗体断片を移送することができる。
【００２９】
抗体断片が患者に投与される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の抑制断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは化学的に合成し、及び／又は組換えＤＮＡ技術により生産することができる。例としてMarasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893 (1993)を参照のこと。
【００３０】
本発明における使用に適する抗ＰＫ１抗体には、Ferraraら (Genentech, Inc.)によって出願された米国特許第２００２／０１９２６３４号に、ＰＫ１（ＥＧ−ＶＥＧＦ）活性を中和すると報告されている抗ＰＫ１モノクローナル抗体１Ｃ６、２Ａ３、２Ａ８および４Ｈ９が含まれる。抗体４Ｈ９は、１０μｇ／ｍｌ以上の用量で投与する場合（実施例２１）、１０ｎＭ ＥＧ−ＶＥＧＦの活性を完全に中和すると報告された。抗ＰＫ１アンタゴニスト、特に抗ＰＫ１抗体に関するＵＳ２００２／０１９２６３４のすべての開示は出典明記によりここに組み込まれる。材料第ＤＮＡ６０６２１−１５１６は、１９９８年８月４日にアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に、委託番号２０３０９１として寄託した。
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる他の潜在的な作用剤は、アンチセンス核酸分子であり、例えば、アンチセンスＲＮＡないしＤＮＡ分子は標的としたｍＲＮＡにハイブリダイズしてタンパク質翻訳を阻害することによって直接的に翻訳をブロックするように働く。ＰＫ１またはＰＫＲに特異性を有するＲＮＡないしＤＮＡである好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの公知なヌクレオチド配列（上記参照）に基づいて設定することができ、これは当分野の標準的な技術者の技術および能力の十分範囲内である。
【００３１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的な核酸配列に特異的に結合する一本鎖核酸である。特有の標的配列に結合することによって、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖が形成される。これら核酸は、遺伝子のセンス鎖ないしコード鎖に相補的なので、「アンチセンス」と呼称されることが多い。
アンチセンス技術を用いて、三重鎖ヘリックス形成（以下を参照）またはアンチセンスＤＮＡないしＲＮＡを介する遺伝子発現を制御することができ、この何れの方法もＤＮＡないしＲＮＡにポリヌクレオチドが結合することに基づいている。例えば、本明細書中の成熟ＰＫ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部位を用いて、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設定する。個のアンチセンスオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳をブロックする(Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, Fla., USA, 1988))。また、上記のオリゴヌクレオチドは細胞に移送されると、アンチセンスＲＮＡがインビボで発現され、ポリペプチドの産生を抑制する。アンチセンスＤＮＡを用いる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列のおよそ−１０から＋１０の部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００３２】
標的核酸に結合することによって、前記のオリゴヌクレオチドが標的核酸の機能を阻害することができる。その結果、例えば、転写、プロセシング、ポリＡ付加工程、複製、翻訳のブロックまたはＲＮＡ分解の促進などの細胞の抑制的機能の促進が起こる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは研究室で調製してからマイクロインジェクションや細胞培養培地から細胞内への取り込みなどによって細胞内に導入するか、アンチセンス遺伝子を持つプラスミドないしレトロウイルスないし他のベクターを形質移入した細胞で発現させる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ラウス肉腫ウイルス、水疱性口炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、シミアンウィルスおよびインフルエンザウイルスの細胞培養物中でのウイルスのウイルス複製や発現を阻害することが初めて明らかにされた。それ以来、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｍＲＮＡ翻訳の阻害は、ウサギ網状赤血球溶解物および小麦麦芽抽出物を含む無細胞系において、広範囲に調べられている。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるウイルス機能の阻害は、ＡＩＤＳ ＨＩＶレトロウイルスＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを用いてインビトロで明らかにされた(Goodchild, J. (1988) .Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85[15]: 5507-11)。Goodchildの研究により、最も効果的なオリゴヌクレオチドはポリＡシグナルに相補的なオリゴヌクレオチドであり；また、ＲＮＡの５’末端を標的としたもの、特にプライマー結合部位の隣およびプライマー結合部位のキャップ(cap)および５’非翻訳領域も効果的であることが示された。キャップ、５’非翻訳領域およびポリＡシグナルはレトロウイルスＲＮＡ（Ｒ領域）の末端で反復する配列内にあり、これらに相補的なオリゴヌクレオチドはＲＮＡに二度結合するかもしれない。
【００３３】
典型的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは１５〜３５塩基長である。例えば、２０マーのオリゴヌクレオチドは上皮成長因子レセプターｍＲＮＡの発現を阻害することが示され(Wittersら, Breast Cancer Res Treat 53:41-50 (1999))、２５マーのオリゴヌクレオチドは副腎皮質刺激ホルモンの発現を９０％以上減少することが示された(Frankelら, J Neurosurg 91:261-7 (1999))。しかしながら、この範囲外、例えば１０、１１、１２、１３ないし１４塩基、または３６、３７、３８、３９ないし４０塩基の長さのオリゴヌクレオチドを用いることが望ましいかもしれないことが理解される。
オリゴヌクレオチドは細胞内の核酸分解酵素によって分解または不活性化される。この問題に対処するために、天然に生じるホスホジエステル結合が他の結合に置き換えられる変更したヌクレオチド間結合を有するなどの修飾したオリゴヌクレオチドを用いることができる。例えば、Agrawalら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079-7083では、オリゴヌクレオチドアミド亜リン酸エステルおよびホスホロチオネートを用いたＨＩＶ−１組織培養の抑制増加が示された。Sarinら (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7448-7451では、オリゴヌクレオチドメチルホスホナートを用いたＨＩＶ−１の抑制増加が示された。Agrawalら (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86, 7790-7794では、ヌクレオチド配列特異的オリゴヌクレオチドホスホロチオエートを用いて初期感染細胞培養物および慢性感染細胞培養物におけるＨＩＶ−１複製の抑制が示された。Leitherら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3430-3434は、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートによる組織培養物のインフルエンザウイルス複製の抑制を報告している。
【００３４】
本発明で有効なオリゴヌクレオチドは、好ましくは、内在性核酸分解酵素による分解に耐えるように設定される。オリゴヌクレオチドのインビボ分解により、長さが減少したオリゴヌクレオチド分解生成物が生じる。このような分解生成物は、おそらく非特異的なハイブリダイゼーションに関与し、完全長相対物と比較して効率が低い。したがって、体内での分解に抵抗性があり、標的細胞に到達することができるオリゴヌクレオチドを用いることが望まれる。本オリゴヌクレオチドは、天然のホスホジエステル結合を一以上の内部人工ヌクレオチド間結合に置換することによって、例えば、結合内のリン酸と硫黄を置換することによってインビボでの分解に対してより抵抗性を示すようになりうる。用いられてもよい結合の実施例は、ホスホロチオネート、メチルホスホネート、スルホン、硫酸エステル、ケチル、ホスホロジチオエート、様々なホスホラミデート、リン酸エステル、架橋したホスホロチオネート、架橋したホスホラミデートが含まれる。他のヌクレオチド間結合が当分野で周知であるので、このような例は制限するものではなく例示するものである。例として、Cohen, (1990) Trends in Biotechnologyを参照のこと。
ホスホジエステルヌクレオチド間結合を置換した結合のうちの一つ以上を有するオリゴヌクレオチドの合成は当分野で周知であり、混合ヌクレオチド間結合を有するオリゴヌクレオチドを生成するための合成系が含まれる。オリゴヌクレオシドメチルホスホン酸、ホスホロジチオエート、ホスホラミデート、リン酸エステル、架橋ホスホラミデートおよび架橋ホスホロチオネートの合成は、当分野において周知である。例として、AgrawalおよびGoodchild (1987) Tetrahedron Letters 28, 3539；Nielsenら(1988) Tetrahedron Letters 29, 2911；Jagerら(1988) Biochemistry 27, 7237；Uznanskiら(1987) Tetrahedron Letters 28, 3401；Bannwarth (1988) Helv. Chim. Acta. 71, 1517；CrosstickおよびVyle (1989) Tetrahedron Letters 34, 4693；Agrawalら (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1401-1405を参照し、これらに教示されることは出典明記によってここに組み込まれる：合成又は生成のための他の方法も可能である。
【００３５】
オリゴヌクレオチドの５’または３’末端のヌクレオチドに類似の基を「キャッピングする」または組み込むことによって内在性の酵素による分解に対する抵抗性をつけることができる。キャッピングのための試薬はApplied BioSystems Inc, Foster City, CA.からAmino-Link IITMとして市販されている。キャッピングの方法は、Shawら (1991) Nucleic Acids Res. 19, 747-750およびAgrawalら (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88[17], 7595-7599によって記載されており、これらに教示されることは出典明記によってここに組み込まれる。
出典明記によってここに組み込まれるTangら (1993) Nucl. Acids Res. 21, 2729-2735に記載されているように、核酸分解酵素の作用に対して耐性のオリゴヌクレオチドを作製する更なる方法は、「自己安定化」させることである。自己安定化オリゴヌクレオチドはその３’末端にヘアピンループ構造を持ち、蛇毒ホスホジエステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび胎仔ウシ血清による分解に対して亢進した耐性を示す。オリゴヌクレオチドの自己安定化領域は相補的核酸とのハイブリダイゼーションに干渉せず、マウスでの薬物動態学的研究および安定性研究ではそれらの線形相当物と比較して自己安定化したオリゴヌクレオチドのインビボ持続性が亢進していた。
【００３６】
ＰＫレセプターに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、ＰＫ１遺伝子またはＰＫＲ遺伝子との三重鎖ヘリックス形成を亢進するオリゴヌクレオチドであり得る。
近年、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二重鎖へ結合する三重鎖ヘリックス形成が起こりうることが示された。オリゴヌクレオチドはＤＮＡ二重鎖ヘリックスの主要な溝(major groove)の配列を認識することができることが明らかとなった。それにより三重鎖ヘリックスが形成された。これは、主要な溝の水素結合部位の認識を介して二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する配列特異的分子を合成することができることを示唆している。
転写を阻害するために三重鎖ヘリックスを形成する核酸分子は一本鎖であり、デオキシヌクレオチドからなる。これらオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般的に二本鎖のうちの一本鎖にプリンまたはピリミジンのかなりの伸展を必要とするフーグスティン塩基対の様式を介する三重鎖ヘリックスを促進するように設定する。更なる詳細についてはＷＯ９７／３３５５１を参照のこと。
【００３７】
アンチセンス方法と同じように、これは、ＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチド配列の結合に基づく。この方法への使用に適するポリヌクレオチドは２０〜４０塩基長が好ましく、転写に関与する遺伝子の領域に対して相補的に設定する(Leeら., Nucl. Acids Res. 6: 3073 (1979)；Cooneyら., Science 15241: 456 (1988)；およびDervanら., Science 251: 1360 (1991))。最適には、三重鎖ヘリックス形成によって、ＤＮＡからのＲＮＡ転写が停止する。ＰＫ１に特異性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、それらの公知のヌクレオチド配列に基づいて設定され（上記参照）、当分野の平均的な技術者の技能および能力の十分範囲内である。
ＰＫレセプターに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤はリボザイムでもよい。リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは相補的標的ＲＮＡ配列特異的にハイブリダイゼーションすることによって作用し、内ヌクレオチド結合分解性の切断が起こる。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位を公知の技術によって同定することができる。更なる詳細については、例としてRossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994)、およびWO 97/33551を参照のこと。したがって、リボザイム（例としてハンマーヘッド型リボザイム(Haselhoff & Gerlach (1988) Nature 334:.585-591)に記載）を用いて、ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断してそれによってｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。
【００３８】
ＰＫ１またはＰＫＲに特性を有するリボザイムはそれらの公知のヌクレオチド配列（上記参照）に基づいて設定することができ、当分野の標準的な技術者の技能と能力の範囲内のものである。あるいは、ＰＫ１ ｍＲＮＡを用いて、ＲＮＡ分子のプールから特定のＲＮＡ分解酵素活性を有する触媒的なＲＮＡを選択することができる。例として、Bartelら., (1993) Science 261: 1411-1418を参照のこと。
ＰＫレセプターに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子でもよい。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、サイレンスする遺伝子に配列が相同な二本鎖（ｄｓＲＮＡ）によって生じる動物内での配列特異的転写後遺伝子サイレンシングの工程である。典型的に、配列特異的ｍＲＮＡ分解のメディエーターは、インビボでより長いｄｓＲＮＡからＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ切断によって生成される２１および２２ヌクレオチド小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。Elbashirら. (2001, Nature 411, 494-498)は、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖が例えば哺乳動物細胞内で内在性および異種性の遺伝子の発現をともに特異的に抑制することを示した。哺乳動物細胞内では、より長い二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡはＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質リン酸化酵素）を活性化し、全体のタンパク質合成を抑制するので、ｓｉＲＮＡは以下に示すような２本の相補的な２１マーからなるに違いないと思われる。
【００３９】
ＰＫ１に選択的な二重鎖ｓｉＲＮＡ分子はＰＫ１ｃＤＮＡ配列を参照することによってすぐに設定することができる（上記参照）。典型的に、まず、開始メチオニンコドンから少なくとも１２０ヌクレオチド下流であるＡＡジヌクレオチドで始まる２１マー配列を選択する。これに完全に相補的なＲＮＡ配列が第一ＲＮＡオリゴヌクレオチドとなる。第二ＲＮＡ配列は第一ＲＮＡのはじめの１９残基に完全に相補的なもので、３’末端に付加的なＵＵジヌクレオチドを有するであろう。設定すると、合成ＲＮＡ分子は当分野で公知の方法を用いて合成することができる。
他の潜在的なＰＫ１アンタゴニストには、ＰＫ１の活性部位、レセプター結合部位または他の相対的な結合部位に結合して、その正常な生物学的活性をブロックする小分子が含まれる。小分子の例には、限定するものではないが、小ペプチドまたはペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、および合成非ペプチジル有機ないし無機化合物が含まれる。
したがって、ある実施態様では、ＰＫ１アンタゴニストは非常に関連したタンパク質、例えばＰＫＲを認識するが効果を障害しないＰＫ１ポリペプチドの変異型であり、ＰＫＲに対するＰＫ１ポリペプチドの活性を競合的に阻害するものでよい。
【００４０】
本発明の使用に適するＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤（すなわちアンタゴニスト）を同定する方法の範囲は、ＷＯ０２／００７１１および米国特許出願番号２００２／０１９２６３４に詳述されており、出典明記によりそれら両方がここに組み込まれる。
一実施態様では、活性がポジティブフィードバックによって制御される場合、アゴニストの過剰発現はアンタゴニストとして作用しうる。
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤は、本発明の治療剤または本発明の化合物と呼称するかもしれない。
治療剤は、月経過多、月経困難症または子宮内膜症に対処するために有効な量で雌性個体に投与する。治療剤は任意の剤形および任意の好適な方法で投与しうる。
一実施態様では、本発明の使用のための治療剤は、ＰＫＲの少なくとも７５％（ＥＤ７５）およびより好ましくはＰＫＲの少なくとも９０％（ＥＤ９０）が有効量として輸送されるために十分な量と頻度で投与する。当該分子の有効性により用量、剤形および投与方法を決定するであろう。
【００４１】
本発明に用いる上述した治療剤又はその製剤は、経口および非経口（例えば皮下ないし筋肉内）注射を含む任意の従来法によって投与してもよい。治療は、一回量又は一定期間にわたる複数の用量から成ってもよい。投与される用量は、年齢、体重、投与様式、治療の継続期間および治療剤ないし作用剤の薬物動態学的および毒物的な特性を考慮して決定する。患者に有益な治療的効果を生じる用量（または、複数用量）で治療剤を投与する。一般的に、治療剤は、他の医学的徴候に用いる場合と同じか類似の用量で投与する。どんな場合でも、患者の治療に適する用量は、医師によって決定されうる。
本発明の治療剤が単独または他の前記治療剤と組み合わせて投与することができる一方で、一以上の受容可能な担体とともに医薬製剤としてそれまたはそれらを投与するのが好ましい。担体は、本発明の治療剤とともに含まれる場合には「受容可能で」あり、受容者側にとって毒性があってはならない。一般的に、担体は、無菌で、発熱因子フリーである水ないし生理食塩水である。
【００４２】
製剤は、単位剤形で都合よくあってもよく、薬剤学の分野で公知の任意の方法によって調整してもよい。このような方法には、一つ以上の補助的配合剤を構成する担体とともに治療剤又は作用剤を会合させる工程を含む。概して、製剤は、均一かつ緊密に液体担体又は微粉固体担体又はその両方と活性成分（すなわち治療剤又は作用剤）とを会合させ、必要に応じて生成物を成形することによって調製する。
経口投与に適する本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤又は錠剤（各々は予め定められた量の活性成分を含む）のような分離型の単位として；粉又は顆粒として；水性液体ないし非水溶液体の溶液ないし懸濁液として；または、水中油(oil-in-water)液体エマルジョン又は油中水(water-in-oil)形液体エマルジョンとしてもよい。また、活性成分はボーラス、舐剤またはペーストとしてもよい。
【００４３】
場合によって一以上の補助的成分とともに、錠剤を圧縮又は成形して作ってもよい。圧縮錠剤は、適切な機械にて、場合によって結合剤（例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑油、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えばナトリウム澱粉グリコール酸(sodium starch gycolate)、架橋ポビドン、架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤と混合して、粉又は顆粒などの自由流動形に活性成分を圧縮することによって調製してもよい。成形した錠剤は、不活性液体希釈液で湿らせた粉末状の合成物の混合物を適切な機械で成形することによって作製してもよい。場合によって、錠剤は、コートするか又は切り目をつけてもよく、所望の放出特性が得られるように性質を変化する際に例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて活性成分の放出を緩慢にするようにまたは制御できるように調製しうる。
口の局所投与に適する製剤には、風味をつけた基剤、通常スクロースおよびアカシア又はトラガカンタに活性成分を含むトローチ剤(lozenge)；ゼラチンおよびグリセリン又はスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤に活性成分を含む錠剤(pastille)；及び、適切な液体担体に活性成分を含むうがい薬(mouth-washes)が含まれる。また、舌下錠(Buccal)投与も好ましい。
【００４４】
非経口投与に適する製剤には、抗酸化剤、緩衝液、細菌発育阻止因子および対象とする受容者の血液に等張な製剤となるような溶質を含みうる水溶性および非水溶性滅菌注射液、および沈澱防止剤および増粘剤を含みうる水溶性および非水溶性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位-用量又は複数投与用コンテナ、例えば密封されたアンプルおよびバイアルにしておいたり、使用前に滅菌液体担体、例えば注射用蒸留水を加えるだけの冷凍乾燥させた（凍結乾燥された）状態で貯蔵してもよい。即席の注射溶液および懸濁液は、既に示した種類の滅菌した粉末、顆粒および錠剤から調製してもよい。
好適な単位用量製剤は、活性成分の一日量又は単位用量、１日の標準以下の用量又はそれらの適当な分量を含んでいるものである。
特に前述の成分に加えて本発明の製剤には、問題とする製剤のタイプを考慮した当分野の従来の他の作用剤が含まれうる。例えば経口投与に適するものには風味付け作用剤が含まれる。
【００４５】
治療剤にはタンパク質又はペプチドであるものもある。タンパク質およびペプチドは、注射可能な徐放性ドラッグデリバリーシステムを用いて供給してもよい。これらは、具体的には、注射の頻度を減らすように設計されている。このようなシステムの例は、組換え体ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）を生物分解可能なミクロスフィアにカプセル化するNutropin Depotであり、注射すると継続時間を通してゆっくりｒｈＧＨを放出する。
タンパク質およびペプチドは、受容部位に直接薬剤を放出する外科的移植装置によって投与することができる。
また、電気穿孔治療法（ＥＰＴ）システムは、タンパク質およびペプチドの投与に用いることができる。パルス化された電場を細胞に供給する装置は、薬剤に対する細胞膜の透過性を増やし、その結果、細胞内ドラッグデリバリーが有意に亢進される。
【００４６】
タンパク質およびペプチドは電気的取り込み法（ＥＩ）によって供給することができる。細胞表面上の直径３０ミクロン以下の小粒子が電気穿孔法に用いたのと同じか類似の電気的パルスを感じるとＥＩが起こる。ＥＩでは、これら粒子は角質層および皮膚のより深い層に移行する。当該粒子は薬剤ないし遺伝子に負荷したりそれらでコートするか、単に薬剤が進入しうる皮膚に孔を生じさせる「弾丸(bullet)」として作用することもできる。
タンパク質およびペプチド供給の代替的方法は温度感受性のＲｅＧｅｌ注射用システムである。体温以下では、ＲｅＧｅｌは注射可能な液体であり、体温では、ゆっくりと浸食して公知の安全な生物分解可能なポリマーに分解するゲルをすぐに形成する。バイオポリマー分解の時間の間治療剤が供給される。
【００４７】
また、タンパク質およびペプチド医薬は経口投与することができる。この工程は、タンパク質とペプチドを同時に供給するための、体内のビタミンＢ１２の経口摂取の天然の工程をたどる。ビタミンＢ１２摂取系とまたがることによって、タンパク質又はペプチドは腸管壁を通り抜けることができる。ビタミンＢ１２類似体と前記薬剤との間で複合体を合成し、該複合体のビタミンＢ１２部位の内因性因子の顕著な親和性と該複合体の薬剤部位の顕著な生物学的活性の両方が維持される。
タンパク質およびポリペプチドは「Ｔｒｏｊａｎペプチド」によって細胞内に導入することができる。転移性の特性を有し、原形質膜を越えて親水性化合物を輸送することができるペネトラチン(penetratin)と呼称されるポリペプチドの種別がある。この系により細胞質および核へオリゴペプチドを直接標的とすることができ、これは非細胞型特異的で非常に効率がよい。Derossiら (1998), Trends Cell Biol 8, 84-87を参照。
【００４８】
また、治療剤ないし製剤は、パッチ、ゲル、ローション、クリームまたはオイルなどで経皮的に投与してもよい。
１種類または複数種類の治療剤は経口投与するのが好ましい。
さらに、１種類または複数種類の治療剤は雌性生殖系に投与するのが好ましい。例えば、１種類または複数種類の治療剤は、ゲルまたはクリームまたは膣リングまたはタンポンを用いて適切に経膣投与する。また、治療剤は、例えば子宮内デバイスなどの当分野に公知の方法を用いた子宮内供給によって投与するのが有益であろう。
典型的に、ゲルまたはクリームは、膣投与のために調製するものである。オイルベースまたは水ベースでもよい。典型的に、１種類または複数種類の治療剤は、単回（または繰り返し）の適用で有効量が投与されるように十分な濃度でクリームまたはゲル中に存在する。
【００４９】
一般的には、膣リングは膣にフィットする「ドーナツ」形に成形されたポリマーを含んでなる。１種類又は複数種類の治療剤がポリマー内に、一般的にはコアとして存在し、それはポリマーから放出され、コントロールされた仕方で膣及び／又は頸部に入る。膣リングは当業者には公知である。膣リングは使い捨てでもよく、女性生殖期間に膣内に保持される、したがって、女性生殖期間に放出され、効果を示すのに十分な量の治療剤を含んでいる。あるいは、膣リングは約３ヵ月〜１年間用いて、その一定期間、十分な量の治療剤が放出され有益な効果を示す。リングが製造されるポリマー、リングと治療剤の内容物のサイズおよび形状、並びに他のパラメータは、１周期またはしばらくの間使用するためのリングかどうかを考慮して選択するのがよいことは理解できるであろう。
一般的にはタンポンに１種類又は複数種類の治療薬をしみ込ませ、十分な量の治療薬（１種類又は複数種類）がタンポンに存在するようにする。
【００５０】
一般的には子宮内デバイスは子宮内に長期間、例えば１ないし５年間置くためのものである。一般的には子宮内デバイスはプラスチック製フレーム（「Ｔ」形であることが多い）を有し、使用期間中放出するのに十分な量の治療剤（類）を含む。一般的にその薬剤は、そのデバイスの部分を構成している除放性ポリマー内に存在し、又は前記除放性ポリマーに封入される。上記デバイスの部分は、普通は除放性膜で覆われている「Ｔ」字形の長い方のアームの周囲を包む「ソーセージ」形薬剤のような形に構成されている。子宮内デバイスは当業者には公知である。
ある種の治療剤は、それらをコードする核酸分子から発現されうるタンパク質またはペプチドである。ある種の治療剤はポリヌクレオチドであり、それらをコードする核酸分子から発現されうる。本発明のポリヌクレオチド治療剤、または本発明の治療剤をコードする核酸分子など、患者に核酸分子を投与するための方法、組成物およびベクターは当業者に公知である。
【００５１】
好適なデリバリーシステムには、リポソーム、ビロゾーム、ミクロスフィア又はマイクロカプセルおよびウイルス性および非ウイルス性ベクターなどの遺伝的ベクターが含まれる。
ポリヌクレオチド治療剤、または治療剤をコードする核酸分子を全身投与してもよい。あるいは、本発明の核酸分子の有効性を生体内での意図する局部に制限して、より低い用量を用いて、全身的な効果を最小にすることによって、特徴的塩基対への固有の結合特異性を亢進する。したがって、核酸分子は、所望の効果を達成するために、局所的に適用してもよい。所望の局部における本発明のポリヌクレオチド治療剤の濃度は、全身投与する場合よりもより高く、明らかに低い全量を用いても治療効果が達成されうる。本発明のポリヌクレオチド治療剤の局所濃度が高いことによって標的細胞の透過性が亢進する。
ポリヌクレオチド治療剤、または治療剤をコードする核酸分子は、薬剤の局所投与に好適な方法で局部に供給することができる。例えば、核酸分子またはベクターの溶液を部位に直接注射したり、注入ポンプを用いた注入によって供給することができる。また、核酸分子またはベクターは、移植用デバイス内に取り込ませて、特定の部位に隣接して設置してその周辺部位にそれらを放出させることもできる。
【００５２】
ポリヌクレオチド治療剤又は治療剤をコードする核酸分子は、ヒドロゲル材料によって投与してもよい。ヒドロゲルは非炎症性で生物分解可能である。このような材料は、天然および合成のポリマーからできたものを含み現在多く知られている。好ましい実施形態では、前記方法に、体温の以下の液体であるが、体温又はその温度近くの保形半流動ヒドロゲルを形成するジェルであるヒドロゲルを用いる。好ましいヒドロゲルはエチレンオキシド−プロピレンオキシド繰り返し単位のポリマーである。ポリマーの特性は、ポリマーの分子量およびポリマー中のポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドの相対的な割合に依存する。好適なヒドロゲルは、約１０〜約８０エチレンオキシド重量％と、約２０〜約９０プロピレンオキシド重量％を含む。特に好適なヒドロゲルは、約７０％のポリエチレンオキシドと、３０％のポリプロピレンオキシドを含む。使用可能なヒドロゲルは、例えば商品名Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）でBASF Corp., Parsippany, NJより入手可能である。
【００５３】
この実施態様では、ヒドロゲルは液体にまで冷却し、オリゴヌクレオチドはヒドロゲル１ｇ当たり約１ｍｇのポリヌクレオチドの濃度で液体に混合する。次いで、結果として生じた混合液を、例えばカテーテルや内視鏡手技を用いた外科的手術の間に噴霧又は塗布することによって治療すべき表面に適用する。ポリマーが暖まるにつれて、ゲルを形成するように凝固し、厳密なゲル組成物に応じた期間中ゲルから周辺細胞へポリヌクレオチドが拡散する。
ポリヌクレオチド治療剤、又は治療剤をコードする核酸分子は、リポソーム、マイクロカプセルおよび移植用デバイスを含む、市販の又は科学的文献に記載された他の移植組織（インプラント）によって投与することができる。例えば、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびそれらのコポリマーなどの生物分解可能な材料、コラーゲンおよびタンパク質ポリマー、又はエチレン酢酸ビニル、ポリビニルアセテート、エチレンビニルアルコールおよびそれの誘導体のような生物分解性でない材料でできている移植組織は、本発明の化合物を局所に供給するために用いることができる。それらは、融解又は溶媒蒸発法や機械的に材料と混合させて重合又は凝固させるにつれて材料内に取り込まれうる。一実施態様では、本発明の化合物は、移植用デバイス（例えばデキストランコート二酸化ケイ素ビーズ、ステム又はカテーテル）のための被覆剤と混合するかその上に適用する。
【００５４】
ポリヌクレオチド治療剤、又は治療剤をコードする核酸分子は、治療及び／又は予防目的で患者全身に投与してもよい。前記化合物は、任意の効果的な方法、例えば、非経口的（例えば静脈内、皮下、筋内）、または、経口、鼻又は患者の血流に入って循環させる他の方法によって投与してもよい。好ましくは全身的に投与される核酸分子又はベクターは、局所投与に加えて投与するが、局所投与をしない場合でも有用である。一般的に、この目的には成人のヒトへの投与につき約０．１〜約１０グラムの範囲の用量が効果的であろう。
治療剤は、好適なポリヌクレオチド、遺伝的コンストラクト又はここに記載のようなベクターから発現させ、患者に供給してもよい。治療剤の供給のための遺伝的コンストラクトはＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡが好ましい。
好ましくは、遺伝的コンストラクト又はベクターはヒト細胞への供給に適する。
【００５５】
動物体内の細胞に遺伝的コンストラクトを導入する手段と方法は当分野で公知である。例えば、本発明のコンストラクトは、コンストラクトが細胞のゲノム内に挿入されるための任意の簡便な方法、例えばレトロウイルスを伴う方法によって細胞内に導入してもよい。（例として、Kuriyamaら (1991) Cell Struc. and Func. 16, 503-510を参照）。細胞内にレトロウイルスを導入するために、１０μｇ／ｍｌのポリブレンを添加してあるレトロウイルス上清を直接注入するのがよい。直径１０ｍｍ以上の組織には、レトロウイルス上清を０．１から１ｍｌ；好ましくは０．５ｍｌ注入するのが好適である。あるいは、Culverら (1992) Science 256, 1550-1552に記載のように、レトロウイルスを産生する細胞を注入する。
また、標的 (Targeted)レトロウイルスは本発明の使用に有益である；例えば、特定の結合親和性を付与する配列を予め存在するウイルスのｅｎｖ遺伝子内に操作してもよい（この概要及び遺伝子治療の他の標的ベクターについては、Miller & Vile (1995) Faseb J. 9, 190-199を参照）。
【００５６】
他の方法では、限られた期間、又はゲノム内に組み込まれた後長期間、組み込まれたところで発現するために細胞内にコンストラクトを単に移送することを伴う。後者のアプローチの例にはリポソームが含まれる。(Nassanderら (1992) Cancer Res. 52, 646-653)。
イムノリポソームの調整には、ＭＰＢ−ＰＥ(N-[4-(p-マレイミドフェニル)ブチリル]-フォスファチジルエタノールアミン)をMartin & Papahadjopoulos (1982) J. Biol. Chem. 257, 286-288の方法に従って合成する。
移送の他の方法には、抗体-ポリリジン架橋を介した外因性ＤＮＡを持つアデノウイルス（Curiel Prog. Med. Virol. 40, 1-18を参照）及び担体としてのトランスフェリン-ポリカチオンコンジュゲート（Wagnerら (1990) Proc. Natl. Acad Sci. USA 87, 3410-3414）が含まれる。
【００５７】
また、ポリヌクレオチド治療剤、又は治療剤をコードする核酸分子は、例えば以下に記載のアデノウイルス粒子内に存在するアデノウイルスによって移送してもよい。
代替方法では、細胞内にＤＮＡマクロ分子を運ぶために、レセプター媒介性エンドサイトーシスを用いる高効率性核酸デリバリーシステムを、例えば核酸に結合するポリカチオンにイオン輸送タンパク質トランスフェリンをコンジュゲートさせることによって行う。
陽イオン性及び中性の脂質と複合体化した「裸の(naked)ＤＮＡ」及びＤＮＡは、治療すべき個体の細胞内に本発明の化合物を導入するために有用でありうることが理解されるであろう。遺伝子治療の非ウイルス性手法は、Ledley (1995) Human Gene Therapy 6, 11291144に記載されている。
また、代替的標的デリバリーシステムは公知であり、例えば、典型的にＤＮＡをアデノウイルス又はアデノウイルス様粒子内に持つ、ＷＯ９４／１０３２３に記載の変更したアデノウイルスシステムがある。他の好適なウイルス又はウイルス様粒子には、ＨＳＶ、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニア及びパルボウイルスが含まれる。したがって、更なる本発明の態様では本発明の化合物を含むウイルス又はウイルス様粒子が提供されることが理解されるであろう。
【００５８】
また、本発明は、ここに記載の一以上の治療剤と、現在月経過多の治療に用いられる一以上の医薬、例えばトラネキサム酸又はメフェナム酸との組み合わせ（医薬製剤においてなど）を提供する。
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸又はメフェナム酸とを含む月経過多に対処するためのキット・オブ・パーツを包含する。
また、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸又はメフェナム酸とを含む組成物を包含する。
さらに、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸又はメフェナム酸とを含む医薬の使用のための組成物を包含する。
【００５９】
加えて、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸又はメフェナム酸と、薬理学的許容性のある担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物を包含する。
本発明は雌性個体の月経過多に対処する方法であり、該方法が雌性個体にＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子（上記記載のような）と、トラネキサム酸又はメフェナム酸を投与することを含む方法を包含する。
【００６０】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤とトラネキサム酸又はメフェナム酸を連続的に又は（実質的に）同時に投与することができることが理解されるであろう。それらは同じ医薬製剤又は医薬内にあってもよいし、別々に製剤化又は投与されてもよい。
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸又はメフェナム酸との組合せを雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製への使用を包含する。
【００６１】
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製への使用であり、該個体はトラネキサム酸又はメフェナム酸を投与されている使用を包含する。たとえ雌性個体が少なくとも一作用剤又は核酸分子を含んでなる医薬を投与される前（又は投与の後）にトラネキサム酸又はメフェナム酸を投与された（又は投与される）場合でも、典型的に雌性個体は医薬として同時にトラネキサム酸又はメフェナム酸を投与される。
本発明は、トラネキサム酸又はメフェナム酸を雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製への使用であり、該個体はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を投与されている使用を包含する。たとえ雌性個体がトラネキサム酸又はメフェナム酸を含んでなる医薬を投与される前（又は投与の後）に作用剤又は核酸分子を投与された（又は投与される）場合でも、典型的に雌性個体は医薬として同時に作用剤又は核酸分子を投与される。
【００６２】
また、本発明は、ここに記載の治療剤の一以上と、エストロゲンレベルを低下させる、または、エストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤との組合せを提供する。そのような組合せは子宮内膜症の治療に有用でありうる。
エストロゲンレベルを低下させる作用剤には、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アゴニスト、ＧｎＲＨアンタゴニスト及びエストロゲン合成インヒビターが含まれる。エストロゲンレセプターに拮抗する作用剤、すなわちエストロゲンレセプターアンタゴニストは抗エストロゲンを含む。
好適なＧｎＲＨアゴニストには、典型的に４週ごとに３．７５ｍｇを皮下（ｓ．ｃ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）のレベルで投与するか３か月ごとに１１．２５ｍｇを皮下のレベルで投与するリュープロレリン(leuprorelin)(Wyethより提供のProstap)；典型的に８時間ごとに０．５ｍｇを皮下的にまたは１日６回、０．２ｍｇを鼻腔内のレベルで投与するブセレリン(buserelin)(Shireより提供のSuprefact)；典型的に２８日ごとに３．６ｍｇ皮下的インプラントまたは１２週ごとに１０．８ｍｇインプラントとして投与するゴセレリン(goserelin)(Astra Zenecaより提供のZoladex)；典型的に４週ごとに３ｍｇのレベルで投与するトリプトレリン(triptorelin)(Ipsenより提供のDe-capeptyl sr)；ナファレリン(nafarelin)(Searleより提供のSynarel)；デスロレリン(deslorelin)(Shireより提供のSomagard)；及びヒストレリン／サプレリン(histrelin/supprelin)(Ortho Pharmaceutical Corp/Shire)が含まれる。
【００６３】
好適なＧｎＲＨアンタゴニストには、テベレリクス(teverelix)（アンタレリクス(antarelix)としても知られる）；アベレリクス(abarelix)(Praecis Pharmaceuticals Incより提供のプレナキス(Plenaxis))；典型的に毎日０．２５〜０．３ｍｇ皮下のレベルで投与するセトロレシキス(cetrorelix)(ASTA Medicaより提供のセトロチド(Cetrotide))；及び典型的に毎日０．２５ｍｇ皮下のレベルで投与するガニレリクス(ganirelix)(Organonより提供のオルガルトラン(Orgalutran))が含まれる。
好適な抗エストロゲンには、タモキシフェン、ファスロデクス(ICI 182,750；Astra Zeneca)、イドキシフェン（Coombesら(1995) Cancer Res 55, 1070-1074を参照）、ラロキシフェン又はＥＭ−６５２（Labrie, Fら, (2001) J Steroid Biochem Mol Biol 79, 213が含まれる。
好適なエストロゲン合成インヒビターにはアロマターゼインヒビターが含まれる。当業者には周知のように、アロマターゼインヒビターの例には、ホルメスタン（４-ＯＨアンドロステンジオン）、エクセメスタン（ステロイド性、非可逆的（タイプ１）インヒビター）、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）およびレトロキソール（非ステロイド性、可逆的（タイプ２）インヒビター）が含まれる。両方のタイプのインヒビターの使用が有用な患者もいるであろう（Harper-Wynne & Coombes (1999) Eur J Cancer 35, 744-746）。
また、骨粗鬆症、骨折又は他の筋骨格疾患のリスクに対処するために２ホスホン酸塩および／またはカルシウム補助剤を含有することが有用でありうる。
【００６４】
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一以上の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤とを含む子宮内膜症に対処するためのキット・オブ・パーツを包含する。
また、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤とを含む組成物を包含する。
さらに、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤とを含む医薬の使用のための組成物を包含する。
【００６５】
加えて、本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤と、薬理学的許容性のある担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物を包含する。
本発明は雌性個体の子宮内膜症に対処する方法であり、該方法が雌性個体にＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子（上記記載のような）と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を投与することを含む方法を包含する。
【００６６】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤とエストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する作用剤を連続的に又は（実質的に）同時に投与することができることが理解されるであろう。それらは同じ医薬製剤又は医薬内にあってもよいし、別々に製剤化又は投与されてもよい。
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤との組合せを雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製への使用を包含する。
【００６７】
本発明は、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製への使用であり、該個体はエストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を投与されている使用を包含する。たとえ雌性個体が前記医薬を投与される前（又は投与された後）に該作用剤を投与された（又は投与される）場合でも、典型的に雌性個体は医薬として同時にエストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する作用剤を投与される。
本発明は、エストロゲンレベルを低下させるかエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製への使用であり、該個体はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、又はＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を投与されている使用を包含する。たとえ雌性個体が前記医薬を投与される前（又は投与の後）に作用剤又は核酸分子を投与された（又は投与される）場合でも、典型的に雌性個体は医薬として同時に作用剤又は核酸分子が投与される。
【００６８】
本明細書で示した文書のすべては出典明記により全体に組み込まれる。
本明細書中の既に発行された文書のリストまたは考察は、文書が最先端又は共通した一般的な知識であると認識する上で必ずしも必要でない。
本発明を以下の図及び実施例によってより詳細に記載する。
【実施例】
【００６９】
実施例１：月経周期中のヒト子宮内膜におけるプロキネチシン（ＥＧ−ＶＥＧＦおよびＢｖ８）およびそのレセプターの発現と局在
概要
２つの非常に相同なＧタンパク結合レセプター、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２である、プロキネチシン（ＰＫ１およびＰＫ２、それぞれ内分泌腺血管内皮成長因子（ＥＧ−ＶＥＧＦ）およびＢｖ８としても知られる）は、内分泌組織の新規の血管形成因子として同定された。しかしながら、子宮におけるそれらの発現および分布についての情報はほとんどなかった。
本研究の目的は、正常なヒト子宮内膜におけるプロキネチシンおよびそれらのレセプターの発現を示すことと、月経周期中のそれらの発現における時間的変化を調べることである。加えて、プロゲステロンによるＰＫ１の調節を、インビトロでインキュベートした正常な子宮内膜組織において検討した。
我々は、月経周期中の子宮内膜組織におけるプロキネチシンおよびそのレセプターの発現および局在化を調査した。規則的な月経周期の女性から子宮内膜組織（ｎ＝３５）を得た。Lothian Research Ethics委員会からの倫理的承認と書面でのインフォームドコンセントを得た。ＰＫ１、ＰＫ２およびそれらのレセプターの経時的発現を、リアルタイム（Ｔａｑｍａｎ）量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ＰＫ１の局在化は免疫組織化学によって調べ、ＰＫ２の分布について、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２は、インサイツハイブリダイゼーションによって検討した。加えて、我々は、ＰＫ１の発現に対するプロゲステロンの効果を検討した。子宮内膜組織（ｎ＝５）は１μＭプロゲステロンにて２４時間インキュベートし、ＲＮＡを抽出して、量的ＲＴ−ＰＣＲに用いた。
【００７０】
ＰＫ２の発現は周期によって変化しないのに対して、ＰＫ１発現は増殖期（Ｐ＜０．０５）と比較して月経周期の分泌期において有意に増加した。ＰＫＲ１およびＰＫＲ２はともに、後期分泌期から月経期への変化の間の子宮内膜組織において有意な上方制御が示された（Ｐ＜０．０５）。ＰＫ１、ＰＫ２、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２は、子宮内膜の腺性上皮細胞、間質性細胞および内皮細胞と、子宮筋層の内皮細胞に局所化していた。ＰＫＲ２と比較してＰＫＲ１でより大きな染色強度が観察された。
これらのデータにより、ヒト子宮内膜におけるプロキネチシンおよびそれらのレセプターの周期的調節が確認され、子宮内膜血管機能における新規の血管形成因子としての働きが示唆される。
【００７１】
要旨
本研究ではプロキネチシン１（ＰＫ１又はＥＧ−ＶＥＧＦ）およびプロキネチシン２（ＰＫ２又はＢｖ８）、およびそれらのレセプター（ＰＫＲ１およびＰＫＲ２）の経時的な発現を妊娠していないヒト子宮内膜において検討した。ＰＫ１の発現（量的ＲＴ−ＰＣＲによる）は、増殖期と比較して、月経周期の分泌期において有意に増加した（ｐ＜０．０５）。ＰＫＲ１およびＰＫＲ２発現が後期分泌期と比較して月経期で有意に上昇する一方、ＰＫ２発現は月経周期の時期に有意な変化がみられなかった。
免疫組織化学によると、ＰＫ１は、子宮内膜の腺性上皮細胞、間質性細胞および血管内皮細胞と、子宮筋層の内皮および平滑筋細胞に局所化されていた。ＰＫ１と同じ部位にＰＫ２の弱い反応が検出された。ＰＫＲ１の発現は試料によって異なるが、いくつかの組織、特に機能層の腺性上皮細胞、間質性細胞および内皮細胞と、子宮筋層の内皮細胞において強い反応が見られた。対照的に、ＰＫＲ２はわずかに発現されるのみであった。１μＭプロゲステロンでの子宮内膜組織の処置によって、ＰＫ１の発現は対照と比較して２．９１倍上昇した（ｐ＜０．０５）。これらのデータにより、ヒト子宮内膜におけるプロキネチシンおよびそれらのレセプターの局在化および周期的な調節が確認された。
【００７２】
材料および方法
患者および組織採取
月経周期の種々の段階の子宮内膜生検を、生検採取前の３ヶ月間にホルモン調製を受けていない規則的な月経周期の（２５−３５日）女性から集めた。試料は子宮内膜吸引キュレット（ピペット、Laboratoire CCD, Paris, France）を使って、又は良性の婦人科的兆候のために子宮切除術を受けた女性から全厚（機能層及び基底-子宮筋層結合部を含む）の子宮内膜生検を採取した。採取後すぐに、組織をドライアイス中で急速に凍結し、−７０℃で保存し（ＲＮＡ抽出のため）、中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で固定し、ワックスに埋め込むか（免疫組織化学的分析のため）、又はＲＰＭＩ１６４０（２ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−グルタミン、１００Ｕペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含む）中に置き、研究室に移してインビトロ培養を行った。
生検は申告された最終月経期（ＬＭＰ）に基づいて日付を付け、Noyes及び共同者の基準に従って組織検査によって確認した(Noyes等, Am. J. Obstet. Gynecol. 122: 262-263)。さらに生検時の循環エストラジオール及びプロゲステロン濃度は、申告されたＬＭＰと月経周期段階の組織検査との両方で一致した。試料は、月経周期の時期に応じて、月経期（第１−４日目）、初期〜中期増殖期（ＥＰ−ＭＰ；第５−１０日目）、後期増殖期〜黄体期（ＬＰ−Ｏｖ；第１１−１４日目）、初期分泌期（ＥＳ；第１５−１８日目）および中期〜後期分泌期（ＭＳ−ＬＳ；第１９−２８日目）に分類した。ロジアン・リサーチ倫理委員会（Lothian Research Ethics Committee）から倫理的承認を得て、組織の採集前に全被験者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。
【００７３】
Ｔａｑｍａｎ量的ＲＴ−ＰＣＲ
製造者の指示書に従って、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ(Sigma, Poole, UK)を用いて月経周期を通して得た子宮内膜生検（ｎ＝３５）からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ試料を定量して、５．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ２、０．５ｍｍｏｌ／ｌの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、２．５μｍｏｌ／ｌランダムヘキサマー、リボヌクレアーゼインヒビター（０．４Ｕ／μｌ）及び１．２５Ｕ／μｌマルチスクラブ逆転写酵素(すべてApplied Biosystems, Warrington, UKより)を用いて逆転写を行った。各逆転写反応液にＲＮＡ（４００ｎｇ）を加えて、２５℃で９０分、４８℃で４５分、及び９５℃で５分で試料をインキュベートした。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の反応混合液は、１×マスターミックス、リボソーム１８Ｓフォワード及びリバースプライマー、リボソーム１８Ｓプローブ（５０ｎｍｏｌ／ｌ；すべてApplied Biosystems, Warrington, UKより)、ＰＫ１、ＰＫ２、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２（３００ｎｍｏｌ／ｌ）のフォワード及びリバースプライマー、及びそれらのプローブ（２００ｎｍｏｌ／ｌ）(すべてBiosource UK, Nivelles, Belgiumより)からなる。反応混合液（４８μｌ）をチューブに等分割し、２μｌのｃＤＮＡを加えた。分割した２４μｌの試料と、ポジティブ及びネガティブコントロールをＰＣＲプレートに設置し、光学キャップでウェルを密閉した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００(Applied Biosystems, Warrington, UK)を用いてＰＣＲ反応を行った。すべてのプライマー及びプローブはＰＲＩＭＥＲエクスプレスプログラム（Applied Biosystems, Warrington, UK）によって設定した。プライマーおよびプローブの配列を表１に示す。データは、Sequence Detectorバージョン1.6.3(Applied Biosystems, Warrington, UK)を用いて製造者の指示に従って分析して処理した。結果は、すべての反応に含まれる内因性ポジティブ基準値（子宮内膜組織の単一試料から得たｃＤＮＡ）との相対で表す。
【００７４】
インサイツハイブリダイゼーション
ＰＫ２、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２用に特別に合成されたオリゴヌクレオチド二重フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識ｃＤＮＡプローブをＢｉｏｇｎｏｓｔｉｋ(Gottingen, Germany)から入手した。月経周期全体から採取した全厚ヒト子宮生検（ｎ＝１２）から切片（５μＭ）をゼラチン被覆スライド上に切り取った。切片のワックス除去を行い、再水和した後、プロテイナーゼＫ処理（５０ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡを含む１００ｍｍｏｌ／ｌトリス−ＨＣｌ ｐＨ７．６中２０μｇ／ｍｌ）を３７℃で１５分間行い、ｃＤＮＡプローブのアクセスを高めた。切片をジエチルピロカルボネート処理水中で洗浄後、あらかじめ９５℃で熱処理したプローブを加えたハイブリダイゼーションバッファー２５μｌを用いて３０℃で４時間プレハイブリを行った。その後、ＰＫＲ１では６Ｕ／μｌ、ＰＫ２およびＰＫＲ２には１２Ｕ／μｌのｃＤＮＡプローブを含むハイブリダイゼーションバッファー中で３０℃で終夜ハイブリダイズを行った。ハイブリダイゼーション後、１×標準的クエン酸生理食塩水（ＳＳＣ）にて室温で５分間（２回）及び０.１×ＳＳＣにて３９℃で１５分間（２回）の洗浄を行った。ＴＢＳですすいだ後、１０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含むメタノールにて内因性のペルオキシダーゼ活性を失活した。付加的増幅工程を有する標準的免疫組織化学的試薬(TSA Biotin System, NEN Life Science Products, Hounslow, UK)を使用してＦＩＴＣ標的プローブを検出した。切片を３０分間ブロッキングバッファーにてインキュベートした。共役抗−ＦＩＴＣ−西洋わさびペルオキシダーゼ(Roche, Diagnostics Ltd.,Lewes, UK)を１／２００の希釈率でブロッキング緩衝液に加え、切片を３０分間インキュベートした。洗浄後、ビオチニルチラミド増幅試薬（１／５０）を各スライドに加え、１５分間インキュベートした。洗浄後ストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ（１／１００）を加え、３０分間インキュベートし、プローブの局在を３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）基質で可視化した。バックグラウンドハイブリダイゼーションを評価するために同じ比率のシトシン（Ｃ）及びグアニン（Ｇ）塩基をＰＫ２、ＰＫＲ１およびＰＫＲ２プローブとして含む二重ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドプローブで対照切片を処理した。全処理は特に記載のない限り室温で行った。
【００７５】
免疫組織化学
月経周期を通して採取した子宮内膜切片（ｎ＝１２）（５μｍ）はキシレンでワックス除去し、漸増濃度のエタノールを使用して再水和した。煮沸した０．１％クエン酸バッファー（ｐＨ３．０）中で圧力機で５分間、切片を処理することによって抗原検索を行った。室温の１０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含むメタノールにより内在性のペルオキシダーゼ活性を失活した。非免疫のブタ血清（２０％血清ＰＢＳ）を１時間適用して、１／２０００に希釈したウサギ抗ヒトプロキネチシン１(Phoenix Pharmaceuticals Inc., Belmont, CA)とともに４℃で終夜インキュベーションした。そして、色素原としてＤＡＢを用いてアビジン−ビオチンペルオキシダーゼ検出システムを適用した(DAKO Ltd.,Cambridge, UK)。
【００７６】
組織培養
子宮内膜生検（ｎ＝５）をはさみで微細に細かく切り刻んで、２つに分けた。組織を、加湿した５％ＣＯ２恒温器中で、１００ＩＵペニシリンおよび１００μｇストレプトマイシンを含むＬ-グルタミン(Invitrogen Ltd., Paisley, UK)を添加した２ｍｌのフェノールレッドフリーＤ-ＭＥＭ／Ｆ-１２培地にて３７℃で終夜インキュベートした。次いで、組織を、１μＭプロゲステロンまたは当量のエタノールの何れかが含まれる同じ培地中で２４時間処理した。
【００７７】
統計
適切な場合は、データをＡＮＯＶＡ統計分析及びフィッシャーＰＬＳＤ検定にかけ（Statview 4.0；Abacus Concepts Inc.,USA）、ｐ＜０.０５の場合に統計的に有意であるとした。
【００７８】
結果
月経周期中のＰＫ１およびＰＫ２およびそのレセプターの発現をリアルタイム量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた（図１ａ）。調べたすべての試料（Ｎ＝３５）でＰＫ１が検出され、月経周期の増殖期（第５−１４日目）と比較して分泌期（第１５−２８日目）で有意に発現が亢進されていた（１０７．３５±２４．０７対３．２９±０．９８；ｐ＜０．０１）。周期の月経期におけるＰＫ１の発現（８４．４３±４０．５２）は増殖期または分泌期と有意な差はなかった。また、調べたすべての試料においてＰＫ２の発現がみられたが（図１ｂ）、月経周期の段階と有意差は示されなかった（月経期：５．４４±２．５３；増殖期：３．１７±０．６１；分泌期２．８８±０．４７）。ＰＫＲ１およびＰＫＲ２の発現は月経周期の増殖期および分泌期と比較して違いはなかった（それぞれ１．３８±０．１６対１．２１±０．１９および３．０８±０．５２対３．４５±０．６２）が、分泌期と比較して月経期ではＰＫＲ１およびＰＫＲ２ともに有意に発現が高かった（３．１７±２．２６；１６．１６±１２）（ＰＫＲ１ではｐ＜０．０５；ＰＫＲ２ではｐ＜０．０１）（図１ｃおよび１ｄ）。また、ＰＫＲ２に関して月経期および増殖期の間に有意差があった（ｐ＜０．０１）。
月経周期を通して採取した全厚のヒト子宮内膜生検におけるＰＫ１の免疫組織化学染色を行った（図２ａ−２ｃ）。反応は可変的でありネガティブな組織もあった。機能層および基底層の腺性上皮細胞の細胞質および核周囲に発現が検出された（図２ｂおよび２ｃ）。機能層の内皮細胞および間質性細胞に核周辺免疫反応が検出され、基底層の内皮細胞および間質性細胞はより弱い染色が観察された。また、子宮筋層の血管に並ぶ内皮細胞および子宮筋平滑筋細胞にも核周辺に免疫反応が示された。
【００７９】
インサイツハイブリダイゼーションによりＰＫ２発現を調べた（図２ｄ−２ｆ）。一般的に、発現は弱く、調べた試料すべてにはみられなかった。上皮の管腔表面に対して強く染色される主に機能層（図２ｆ）の腺性上皮細胞の細胞質に反応が検出された。また、機能層の間質性細胞および上皮細胞にわずかに反応が表れ（図２ｆ）、基底層にも血管染色されるものもあった。また、まれに子宮筋平滑筋細胞が弱く染色される子宮筋層の脈管構造にもＰＫ２が発現された。
インサイツハイブリダイゼーションにより子宮内膜にＰＫＲ１の強い発現が示されたが、月経周期の後期増殖期から中期分泌期に採取した試料はとても弱いか、ネガティブなＰＫＲ１染色を示した。機能層および基底層の腺性上皮細胞並びに両層の内皮細胞の細胞質に反応が検出された（図３ａ−３ｃ）。また間質性細胞も反応を示すが、機能層でより強かった（図３ｃ）。子宮筋層の血管に顕著なＰＫＲ１発現があり、平滑筋細胞も反応を示した。ＰＫＲ２はＰＫＲ１よりあまり発現されず（図３ｄ−３ｆ）、染色は弱く、主に機能層の腺性上皮細胞および内皮細胞の細胞質に限定していた（図３ｆ）。
月経周期の分泌期にＰＫ１の発現が著しく上方制御されることにより、プロゲステロンによりＰＫ１が調節されている可能性が示唆された。ゆえに、この仮定を調べるために、子宮内膜組織試料（ｎ＝５）を１μＭプロゲステロンまたは当量のエタノール存在下にて２４時間インキュベートした。ＴａｑｍａｎＲＴ−ＰＣＲにより対照と比較すると、プロゲステロンとともにインキュベートした組織のＰＫ１発現は２．９１（±０．７５）倍の増加を示した。
【００８０】
表１
【００８１】
実施例２：ＰＫ１アンタゴニストを用いた月経過多の治療
月経過多に罹患した患者に、公開された米国特許出願第２００２／０１９２６３４号に記載されるモノクローナル抗体４Ｈ９などの抗ＰＫ１抗体を、治療部位での活性作用剤の治療的濃度が治療期間を通じて理想的にはＥＣ９０のレベルに、好ましくはＥＣ５０以下にならないように維持される用量及び頻度で投与する。典型的には、少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度に抗体を維持する。この治療は、患者の容認性、副作用の回避及び全身的バイオアベイラビリティに応じて、経口的に、あるいはより局所的に処方される。
【００８２】
実施例３：ＰＫ１アンタゴニストを用いた月経困難症の治療
月経困難症に罹患した患者に、公開された米国特許出願第２００２／０１９２６３４号に記載されるモノクローナル抗体４Ｈ９などの抗ＰＫ１抗体を、治療部位での活性作用剤の治療的濃度が治療期間を通じて理想的にはＥＣ９０のレベルに、好ましくはＥＣ５０以下にならないように維持される用量及び頻度で投与する。典型的には、少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度に抗体を維持する。この治療は、患者の容認性、副作用の回避及び全身的バイオアベイラビリティに応じて、経口的に、あるいはより局所的に処方される。
【００８３】
実施例４：ＰＫ１アンタゴニストを用いた子宮内膜症の治療
子宮内膜症に罹患した患者に、公開された米国特許出願第２００２／０１９２６３４号に記載されるモノクローナル抗体４Ｈ９などの抗ＰＫ１抗体を、治療部位での活性作用剤の治療的濃度が治療期間を通じて理想的にはＥＣ９０のレベルに、好ましくはＥＣ５０以下にならないように維持される用量及び頻度で投与する。典型的には、少なくとも１０μｇ／ｍｌの濃度に抗体を維持する。この治療は、患者の容認性、副作用の回避及び全身的バイオアベイラビリティに応じて、経口的に、あるいはより局所的に処方される。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】月経周期中のヒト子宮内膜におけるＰＫＩ（ａ）、ＰＫ２（ｂ）、ＰＫＲ１（ｃ）及びＰＫＲ２（ｄ）の量的ＲＴ−ＰＣＲ。それぞれの記号は一つの組織試料を表す。平均を棒線で示した。
【図２】（ａ−ｃ）ヒト子宮内膜組織（機能層及び基底-子宮筋層結合部）におけるＰＫ１の免疫組織学的局在。基底層（Ｂ）及び機能層（Ｆ）の両方に腺性上皮性染色（Ｇ）がみられ、子宮筋層（Ｍ）に平滑筋細胞の反応が検出された。機能層（図２ｂ）及び基底層（図２ｃ）に間質性細胞の発現が検出され、組織全体に内皮細胞の反応が見られた（図２ｂ及び２ｃの矢印で示す）。ＮＥＧ＝ネガティブコントロール；大きさの基準＝１００μＭ（図２ａ）及び５０μＭ（図２ｂ）。（ｄ−ｆ）ヒト子宮内膜組織（機能層及び基底-子宮筋層結合部）におけるＰＫ２のインサイツハイブリダイゼーション。ＰＫ２は、表面皮覆組織（ＳＥ）に対して強い反応性を有する基底層（Ｂ）（図２ｆ）及び機能層（Ｆ）（図２ｅ）の腺性上皮細胞（Ｇ）で発現した。反応性は、主に機能層の間質性細胞および内皮細胞に検出された（図２ｆの矢印で示す）。
【図３】（ａ−ｃ）ヒト子宮内膜組織（機能層及び基底-子宮筋層結合部）におけるＰＫＲ１のインサイツハイブリダイゼーション。腺性上皮細胞（Ｇ）および間質性細胞（図３ｂ）の機能層（Ｆ）、および基底層（Ｂ）の腺性上皮細胞に強い染色が検出された。また、ＰＫＲ１は、子宮内膜および子宮筋層（Ｍ）の全体にわたる内皮細胞（図３ｃの矢印で示す）および、子宮筋層平滑筋細胞に発現した。ＮＥＧ＝ネガティブコントロール；大きさの基準＝１００μＭ（図３ａ）及び５０μＭ（図３ｂ）。ＳＥ＝表面被覆組織。（ｄ−ｆ）ヒト子宮内膜組織（機能層及び基底-子宮筋層結合部）におけるＰＫＲ２のインサイツハイブリダイゼーション。腺性上皮細胞（Ｇ）および内皮細胞の子宮内膜(Ｆ)の機能層において主にＰＫＲ２の弱い発現が検出された（図３ｆの矢印で示す）。ＮＥＧ＝ネガティブコントロール；大きさの基準＝１００μＭ（図３ｄ）及び５０μＭ（図３ｅ）。ＳＥ＝表面被覆組織。
【図４】２４時間の１μＭプロゲステロン処置に応答する子宮内膜組織（ｎ＝５）におけるＰＫ１発現。結果は、ＰＫ１±ＳＥＭ（＊はｐ＜０．０５を意味する）の平均倍数増加として表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症に対処する方法であり、プロキネチシンレセプター（ＰＫＲ）に対するプロキネチシン１（ＰＫ１）の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を該個体に投与することを含む方法。
【請求項２】
個体にトラネキサム酸又はメフェナム酸を投与することを更に含む、請求項１に記載の月経過多に対処する方法。
【請求項３】
個体にエストロゲンレベルを低下させる、または、エストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を投与することを更に含む、請求項１に記載の子宮内膜症に対処する方法。
【請求項４】
雌性個体の月経過多、月経困難症または子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子の使用。
【請求項５】
雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸またはメフェナム酸との組合せの使用。
【請求項６】
トラネキサム酸またはメフェナム酸を投与される雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子の使用。
【請求項７】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を投与される雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製における、トラネキサム酸またはメフェナム酸の使用。
【請求項８】
雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤との組合せの使用。
【請求項９】
エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を投与される雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子の使用。
【請求項１０】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を投与される雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤の使用。
【請求項１１】
エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤が、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＧｎＲＨアンタゴニスト、抗エストロゲンまたはエストロゲン合成インヒビターである、請求項３に記載の方法または請求項８ないし１０の何れか一に記載の使用。
【請求項１２】
ＧｎＲＨアゴニストが、リュープロレリン、ブセレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ナファレリン、デスロレリン又はヒストレリン／サプレリンである、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１３】
ＧｎＲＨアンタゴニストが、テベレリクス、アバレリクス、セトロレリクス又はガニレリクスである、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１４】
抗エストロゲンが、タモキシフェン、ファスロデクス、イドキシフェン、ラロキシフェン又はＥＭ−６５２である、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１５】
エストロゲン合成インヒビターが、アロマターゼインヒビター、例えばホルメスタン、エクセメスタン、アナストロゾール又はレトロキソールである、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１６】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫＲのＰＫ１媒介性シグナル伝達を阻害、減少または混乱させる、請求項１ないし１５の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項１７】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫＲへのＰＫ１結合を阻害、減少または混乱させる、請求項１ないし１５の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項１８】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫ１とＰＫＲ間の相互作用またはＰＫＲと関連Ｇタンパク質との相互作用に影響し、ＰＫ１-ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害または混乱させる、請求項１ないし１５の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項１９】
前記作用剤がＰＫ１のアンタゴニストである、請求項１ないし１８の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２０】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫ１を標的とするアンチセンスＲＮＡ、ＰＫ１を標的とするリボザイム、ＰＫ１を標的とする小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＫ１遺伝子と三重ヘリックスを形成する核酸分子、ＰＫＲの断片または抗ＰＫ１抗体である、請求項１ないし１９の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２１】
ＰＫ１アンタゴニストが抗ＰＫ１抗体である、請求項１９または２０に記載の方法または使用。
【請求項２２】
抗ＰＫ１抗体が、公開された米国特許出願第２００２／０１９２６３４号に記載の１Ｃ６、２Ａ３、２Ａ８および４Ｈ９から選択される、請求項２１に記載の方法または使用。
【請求項２３】
ＰＫＲがプロキネチシンレセプター１（ＰＫＲ１）である、請求項１ないし１８の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２４】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤がＰＫＲ１のアンタゴニストである、請求項２３に記載の方法または使用。
【請求項２５】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫＲ１を標的とするアンチセンスＲＮＡ、ＰＫＲ１を標的とするリボザイム、ＰＫＲ１を標的とするｓｉＲＮＡ、ＰＫＲ１遺伝子と三重ヘリックスを形成する核酸分子、ＰＫ１の断片ないし配列変異体、または抗ＰＫＲ１抗体である、請求項２３または２４の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２６】
ＰＫＲがプロキネチシンレセプター２（ＰＫＲ２）である、請求項１ないし１８の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２７】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤がＰＫＲ２のアンタゴニストである、請求項２６に記載の方法または使用。
【請求項２８】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫＲ２を標的とするアンチセンスＲＮＡ、ＰＫＲ２を標的とするリボザイム、ＰＫＲ２を標的とするｓｉＲＮＡ、ＰＫＲ２遺伝子と三重ヘリックスを形成する核酸分子、ＰＫ１の断片ないし配列変異体、または抗ＰＫＲ２抗体である、請求項２６または２７の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２９】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤をコードする核酸分子が、膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具経由で投与される、請求項１ないし３および１１ないし２８の何れか一に記載の方法。
【請求項３０】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤をコードする核酸分子が、膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具経由の投与のために製剤化される、請求項４ないし２８の何れか一に記載の使用。
【請求項３１】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤それぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸またはメフェナム酸を含んでなる、月経過多に対処するためのキット・オブ・パーツ。
【請求項３２】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤それぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を含んでなる、子宮内膜症に対処するためのキット・オブ・パーツ。
【請求項３３】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤それぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸またはメフェナム酸を含んでなる組成物。
【請求項３４】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤それぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を含んでなる組成物。
【請求項３５】
医薬における使用のための、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項３３または請求項３４に記載の組成物と、薬剤的に受容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項３７】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤それぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を含んでなる、膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具。
【請求項３８】
トラネキサム酸またはメフェナム酸をさらに含んでなる、請求項３７に記載の膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具。
【請求項３９】
エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤をさらに含んでなる、請求項３７に記載の膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具。
【請求項４０】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が請求項１６ないし２８の何れか一に定義されるものである、請求項３１または３２に記載のキット・オブ・パーツ、または請求項３３ないし３５の何れか一に記載の組成物、または請求項３６に記載の医薬組成物、または請求項３７ないし３９の何れか一に記載の膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具。
【請求項４１】
エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤が請求項１１ないし１５の何れか一に定義されるものである、請求項３２に記載のキット・オブ・パーツ、または請求項３４または３５に記載の組成物、または請求項３６に記載の医薬組成物、または請求項３８または３９に記載の膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具。
【請求項１】
雌性個体の月経過多、月経困難症又は子宮内膜症に対処する方法であり、プロキネチシンレセプター（ＰＫＲ）に対するプロキネチシン１（ＰＫ１）の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を該個体に投与することを含む方法。
【請求項２】
個体にトラネキサム酸又はメフェナム酸を投与することを更に含む、請求項１に記載の月経過多に対処する方法。
【請求項３】
個体にエストロゲンレベルを低下させる、または、エストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を投与することを更に含む、請求項１に記載の子宮内膜症に対処する方法。
【請求項４】
雌性個体の月経過多、月経困難症または子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子の使用。
【請求項５】
雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸またはメフェナム酸との組合せの使用。
【請求項６】
トラネキサム酸またはメフェナム酸を投与される雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子の使用。
【請求項７】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を投与される雌性個体の月経過多に対処するための医薬の調製における、トラネキサム酸またはメフェナム酸の使用。
【請求項８】
雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤との組合せの使用。
【請求項９】
エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を投与される雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子の使用。
【請求項１０】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤のそれぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を投与される雌性個体の子宮内膜症に対処するための医薬の調製における、エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤の使用。
【請求項１１】
エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤が、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、ＧｎＲＨアンタゴニスト、抗エストロゲンまたはエストロゲン合成インヒビターである、請求項３に記載の方法または請求項８ないし１０の何れか一に記載の使用。
【請求項１２】
ＧｎＲＨアゴニストが、リュープロレリン、ブセレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、ナファレリン、デスロレリン又はヒストレリン／サプレリンである、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１３】
ＧｎＲＨアンタゴニストが、テベレリクス、アバレリクス、セトロレリクス又はガニレリクスである、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１４】
抗エストロゲンが、タモキシフェン、ファスロデクス、イドキシフェン、ラロキシフェン又はＥＭ−６５２である、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１５】
エストロゲン合成インヒビターが、アロマターゼインヒビター、例えばホルメスタン、エクセメスタン、アナストロゾール又はレトロキソールである、請求項１１に記載の方法または使用。
【請求項１６】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫＲのＰＫ１媒介性シグナル伝達を阻害、減少または混乱させる、請求項１ないし１５の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項１７】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫＲへのＰＫ１結合を阻害、減少または混乱させる、請求項１ないし１５の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項１８】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫ１とＰＫＲ間の相互作用またはＰＫＲと関連Ｇタンパク質との相互作用に影響し、ＰＫ１-ＰＫＲ媒介性シグナル伝達経路を阻害または混乱させる、請求項１ないし１５の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項１９】
前記作用剤がＰＫ１のアンタゴニストである、請求項１ないし１８の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２０】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫ１を標的とするアンチセンスＲＮＡ、ＰＫ１を標的とするリボザイム、ＰＫ１を標的とする小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＫ１遺伝子と三重ヘリックスを形成する核酸分子、ＰＫＲの断片または抗ＰＫ１抗体である、請求項１ないし１９の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２１】
ＰＫ１アンタゴニストが抗ＰＫ１抗体である、請求項１９または２０に記載の方法または使用。
【請求項２２】
抗ＰＫ１抗体が、公開された米国特許出願第２００２／０１９２６３４号に記載の１Ｃ６、２Ａ３、２Ａ８および４Ｈ９から選択される、請求項２１に記載の方法または使用。
【請求項２３】
ＰＫＲがプロキネチシンレセプター１（ＰＫＲ１）である、請求項１ないし１８の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２４】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤がＰＫＲ１のアンタゴニストである、請求項２３に記載の方法または使用。
【請求項２５】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫＲ１を標的とするアンチセンスＲＮＡ、ＰＫＲ１を標的とするリボザイム、ＰＫＲ１を標的とするｓｉＲＮＡ、ＰＫＲ１遺伝子と三重ヘリックスを形成する核酸分子、ＰＫ１の断片ないし配列変異体、または抗ＰＫＲ１抗体である、請求項２３または２４の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２６】
ＰＫＲがプロキネチシンレセプター２（ＰＫＲ２）である、請求項１ないし１８の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２７】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤がＰＫＲ２のアンタゴニストである、請求項２６に記載の方法または使用。
【請求項２８】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が、ＰＫＲ２を標的とするアンチセンスＲＮＡ、ＰＫＲ２を標的とするリボザイム、ＰＫＲ２を標的とするｓｉＲＮＡ、ＰＫＲ２遺伝子と三重ヘリックスを形成する核酸分子、ＰＫ１の断片ないし配列変異体、または抗ＰＫＲ２抗体である、請求項２６または２７の何れか一に記載の方法または使用。
【請求項２９】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤をコードする核酸分子が、膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具経由で投与される、請求項１ないし３および１１ないし２８の何れか一に記載の方法。
【請求項３０】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤をコードする核酸分子が、膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具経由の投与のために製剤化される、請求項４ないし２８の何れか一に記載の使用。
【請求項３１】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤それぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸またはメフェナム酸を含んでなる、月経過多に対処するためのキット・オブ・パーツ。
【請求項３２】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤それぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を含んでなる、子宮内膜症に対処するためのキット・オブ・パーツ。
【請求項３３】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤それぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、トラネキサム酸またはメフェナム酸を含んでなる組成物。
【請求項３４】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤それぞれをコードする少なくとも一の核酸分子と、エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤を含んでなる組成物。
【請求項３５】
医薬における使用のための、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項３３または請求項３４に記載の組成物と、薬剤的に受容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項３７】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤、またはＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる少なくとも一の作用剤それぞれをコードする少なくとも一の核酸分子を含んでなる、膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具。
【請求項３８】
トラネキサム酸またはメフェナム酸をさらに含んでなる、請求項３７に記載の膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具。
【請求項３９】
エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤をさらに含んでなる、請求項３７に記載の膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具。
【請求項４０】
ＰＫＲに対するＰＫ１の効果を減退させる作用剤が請求項１６ないし２８の何れか一に定義されるものである、請求項３１または３２に記載のキット・オブ・パーツ、または請求項３３ないし３５の何れか一に記載の組成物、または請求項３６に記載の医薬組成物、または請求項３７ないし３９の何れか一に記載の膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具。
【請求項４１】
エストロゲンレベルを低下させるかまたはエストロゲンレセプターに拮抗する少なくとも一の作用剤が請求項１１ないし１５の何れか一に定義されるものである、請求項３２に記載のキット・オブ・パーツ、または請求項３４または３５に記載の組成物、または請求項３６に記載の医薬組成物、または請求項３８または３９に記載の膣リングないしタンポンないし子宮内避妊器具。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００７−５２６９０３（Ｐ２００７−５２６９０３Ａ）
【公表日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２４４１２（Ｐ２００６−５２４４１２）
【出願日】平成１６年８月２４日（２００４．８．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３６００
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１７５０
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５０５１０３９７６）アーダナ バイオサイエンス リミテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年８月２４日（２００４．８．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００３６００
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１７５０
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５０５１０３９７６）アーダナ バイオサイエンス リミテッド (11)
【Ｆターム（参考）】
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