植物細胞壁分解酵素間の融合タンパク質及びその使用
本発明は、Ｃ末端の糖質結合分子（ＣＢＭ）を含まない少なくとも二つの植物細胞壁分解酵素、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質の使用に関するものであり、当該酵素及びＣＢＭは、植物又は野菜の副産物からの植物細胞壁内に存在する目的の化合物の調製の枠組みにおいて、又はパルプ及び紙の漂白の枠組みにおいて植物細胞壁分解のプロセスを行うための、菌類の天然タンパク質又はその変異型に対応する組換えタンパク質である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学処理した多機能型の植物細胞壁分解酵素の構築及び過剰産生、並びに農業副産物の価値化のための改善された酵素ツールとしてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
農業廃棄物は、リグノセルロースの生物変換のための重要な再生可能な資源である。毎日、食品産業の生産により、除去すべき汚染廃棄物と見なされるこれらの多くの副産物が発生している。バイオテクノロジー分野において、これらの副産物の価値化について多くの研究が行われている。価値化可能な成分の中で、フェルラ酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−桂皮酸）は、植物界で最も豊富なヒドロキシ桂皮酸であると見出された非常に魅力的なフェノール化合物である。例えば、フェルラ酸は抗酸化剤（２３）として使用するか、又は、微生物変換により、食品産業、化粧品産業及び医薬産業における高価な香料として「天然の」バニリンに変換することができる（４、２６）。農業副産物の中で、トウモロコシふすま及び小麦ふすまは、細胞壁中に大量の、すなわちそれぞれ３％及び１％（ｗ／ｗ）のフェルラ酸を含んでいるため、潜在的な基質である（４３）。植物生理学においてフェルラ酸は、植物細胞壁の重要な物理的特性及び化学的特性を有する、鍵となる構成成分である。実際、フェルラ酸はリグニンと炭水化物との間又は炭水化物同士の間の架橋剤として作用することができ（１６）、細胞壁の完全性に影響を与え、それにより微生物酵素による生分解性の程度を低減する（６）。
【０００３】
微生物は、フェルラ酸を植物細胞壁の多糖に連結しているエステル結合を加水分解することができるフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）等の酵素を進化させた。これらの酵素により、他のリグノセルロース分解性酵素が多糖骨格へ接近することが容易になる（概説として１２を参照されたい）。これまでの研究により、フェルロイルエステラーゼはβ−（１，４）−エンドキシラナーゼ等の主鎖分解酵素と相乗的に作用して、植物細胞壁からのフェルラ酸の放出を増大させ、そして応用するために必要な十分な量を産生させることが示されている（２、１５、５０)。黒こうじ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等の糸状菌は、植物細胞壁分解酵素を産生することがよく知られている。黒こうじ菌由来のフェルロイルエステラーゼをコードする二つの異なる遺伝子は既にクローンニングされており（１０、１１）、これらの対応する組換えタンパク質はメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及び黒こうじ菌で過剰産生されている（２４、３０、４１）。幾つかの菌類性フェルロイルエステラーゼが精製され解析されたが（１８、４７）、いずれの遺伝子もさらにクローニングはされなかった。以前の研究により、ファミリー１の糖質結合モジュール（ＣＢＭ）に非常に類似したＣ末端ドメインを有する第一の菌類性シンナモイルエステラーゼ（Ｂ型）の、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）からの単離が報告されている（２７）。嫌気性微生物及び好気性微生物由来のグリコシル加水分解酵素の多くはモジュール構造を有している。触媒ドメインに加えて、一つ又は複数の非触媒性ＣＢＭが、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか又はその両方に位置し得る。ＣＢＭは、類似のアミノ酸配列及び三次元構造によって複数のファミリーに分類されている（ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。ＣＢＭは不溶性基質の分解に対して主な役割を果たす（４５）。例えば、ＣＢＭは触媒コアドメインを基質の近傍に維持することに関与し、接触の長さと緊密性を増大させる。さらに場合によっては、ＣＢＭは、集合したセルロース鎖の水素結合を弱めることにより、セルロースミクロフィブリル構造を変化させることもできる（１３、１４、３３）。
【非特許文献１】ｄｅ Ｖｒｉｅｓ Ｒ． Ｐ．， Ｂ． Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎ， Ｃ． Ｈ． Ｐｏｕｌｓｅｎ．， Ｐ． Ａ． Ｋｒｏｏｎ， Ｒ． Ｈ． Ｈ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｕｖｅｌ， Ｃ． Ｂ． Ｆａｕｌｄｓ， Ｇ． Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， Ｊ． Ｐ． Ｔ． Ｗ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｂｅｒｇｈ， ａｎｄ Ｊ． Ｖｉｓｓｅｒ． １９９７． Ｔｈｅ ｆａｅＡ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｎｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ ｅｎｃｏｄｅ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３： ４６３８−４６４４．
【非特許文献２】Ｋｒｏｏｎ， Ｐ． Ａ．， Ｇ． Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， Ｎ． Ｍ． Ｆｉｓｈ， Ｄ． Ｂ． Ａｒｃｈｅｒ， ａｎｄ Ｎ． Ｊ． Ｂｅｌｓｈａｗ． ２０００． Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ｗｈｉｃｈ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｓ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７： ６７４０−６７５２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、菌類、例えば黒こうじ菌の遊離植物細胞壁分解酵素と融合植物細胞壁分解酵素との間の相乗効果についての考察に関する。遺伝子工学処理された細菌性セルロソームに基づいた近年の研究において、二つの触媒成分の物理的近接により、扱い難い基質に対する相乗作用の増大が観察された（１７）。これに基づき、本発明者は、菌類性フェルロイルエステラーゼと第二の酵素がグラフトされるクロストリジムドッケリンドメインとを細菌性のＣＢＭを有する足場タンパク質上に結びつけたキメラタンパク質を設計した（３１）。しかし、組換えタンパク質の産生収率は工業規模での試験的応用に十分な高さではなく、新たな戦略が構想された。本発明の研究において、本発明者は、高度にグリコシル化されたリンカーペプチドにより分離される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ（ＦＡＥＡ）及びキシラナーゼＢ（ＸＹＮＢ）の二つの菌類性酵素を融合し、フェルラ酸放出の効率が増大した二機能性酵素（ＦＬＸ）を得た。さらに本発明者は、第二の構築物において、この二機能性酵素のＣ末端に黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ（ＣＢＨＢ）由来の菌類性ＣＢＭも付加した（ＦＬＸＬＣ）。両ハイブリッド酵素は黒こうじ菌で良好に産生され、生化学的観点及び動態学的観点について十分に解析され、そして最終的に、天然基質であるトウモロコシふすま及び小麦ふすまからフェルラ酸を放出するために使用された。この研究の目的は、遊離酵素又は融合酵素を用いてフェルラ酸放出の効率を比較して、菌類性酵素の物理的近接によって生じる酵素の相乗効果を研究することであった。さらに、二機能性酵素のＣ末端でのＣＢＭ付加の効果をＦＬＸＬＣ構築物において研究した。
【０００５】
本発明は、遊離植物細胞壁分解酵素の使用と比較した場合の、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素の単一のキメラタンパク質における、融合の相乗効果の実証に依るものである。
【０００６】
したがって、本発明の主な目的は、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素間の新規な融合タンパク質を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、上記融合タンパク質を、基質である植物に、また有利には農業副産物に適用することによって、植物細胞壁に連結した目的の化合物を調製するための新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、植物もしくは野菜の副産物から植物細胞壁に存在する目的の化合物を調製する枠組みにおいて、又はパルプもしくは紙の漂白の枠組みにおいて、植物細胞壁分解のプロセスを実施するための、Ｃ末端の糖質結合モジュール（ＣＢＭ）を含まない少なくとも二つの植物細胞壁分解酵素、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質の使用に関するものであり、前記酵素及びＣＢＭは、菌類の天然タンパク質又はその変異型に対応する組換えタンパク質である。
【０００９】
「植物細胞壁分解酵素」という表現は、細胞壁の成分、例えばセルロース、ヘミセルロース及びリグニンの消化を行うことが可能な酵素を表す。上記融合タンパク質における植物細胞壁分解酵素は同一であるか、又は互いに異なる。
【００１０】
「Ｃ末端の糖質結合モジュール」という表現は、その関連する酵素をセルロースに標的化する、セルロースへの親和性を有する分子を表す。
【００１１】
本発明は、より詳細には、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、
−セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びエキソグルカナーゼ等のセルラーゼ、又はβ−グルコシダーゼ、
−キシラナーゼ等のヘミセルラーゼ、
−ラッカーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、多機能型ペルオキシダーゼ等の、リグニンを分解することが可能なリグニナーゼ、又は、セロビオースデヒドロゲナーゼ及びアリールアルコールオキシダーゼ等の補助的な酵素、
−フェルロイルエステラーゼ、シンナモイルエステラーゼ、及びクロロゲン酸加水分解酵素等の、フェルラ酸等の桂皮酸を放出すること及びヘミセルロース鎖間のジフェルラ酸架橋を加水分解することが可能なシンナモイルエステル加水分解酵素
から選択される加水分解酵素である、上記のような使用に関する。
【００１２】
本発明は、より詳細には、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素がフェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼから選択される、上記のような使用に関する。
【００１３】
本発明はより詳細には、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、
＊子嚢菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株、またより詳細には黒こうじ菌、
＊担子菌、例えばピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）株又はハロシフィナ（Ｈａｌｏｃｉｐｈｉｎａ）株、またより詳細にはシュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、ピクノポラス・サンギネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｓａｎｇｕｉｏｎｅｕｓ）、又はハロシフィナ・ビロサ（Ｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ ｖｉｌｌｏｓａ）
から選択される菌類に由来する天然酵素又はその変異型に対応する、上記のような使用に関する。
【００１４】
本発明は、より詳細には、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、黒こうじ菌等のアスペルギルス株由来の天然酵素又はその変異型に対応する、上記のような使用に関する。
【００１５】
本発明は、より詳細には、植物細胞壁分解酵素の少なくとも一つが、
−配列番号１で表される核酸でコードされる、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ、又は
−配列番号３で表される核酸でコードされる、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢ
から選択されるフェルロイルエステラーゼである、上記のような使用に関する。
【００１６】
本発明は、より詳細には、植物細胞壁分解酵素のうちの少なくとも一つが、配列番号５で表される核酸でコードされる配列番号６で表される、黒こうじ菌のキシラナーゼＢ等の上記のキシラナーゼである、上記のような使用に関する。
【００１７】
本発明は、より詳細には、ＣＢＭであるタンパク質が、子嚢菌、例えばアスペルギルス株、またより詳細には黒こうじ菌から選択される菌類に由来する天然酵素又はその変異型に存在するＣＢＭから選択される、上記のような使用に関する。
【００１８】
本発明に従って使用され得るＣＢＭはファミリー１のものである。
【００１９】
本発明は、より詳細には、ＣＢＭが、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号７で表される核酸でコードされる、配列番号８で表されるＣＢＭである、上記のような使用に関する。
【００２０】
本発明は、自身に含まれるタンパク質の少なくとも二つの間にリンカーを含む融合タンパク質の上記のような使用にも関するものであり、当該リンカーは１０〜１００アミノ酸、有利には約５０アミノ酸のポリペプチドである。
【００２１】
本発明は、より詳細には、自身に含まれるタンパク質のそれぞれの間にリンカーが包まれる融合タンパク質の上記のような使用に関する。
【００２２】
本発明は、より詳細には、リンカーが、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号９で表される核酸でコードされる配列番号１０で表される配列等の、高度にグリコシル化されたポリペプチドである、上記のような使用に関する。
【００２３】
本発明は、より詳細には、フェルロイルエステラーゼとキシラナーゼ、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関する。
【００２４】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ又は配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関する。
【００２５】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質の上記のような使用に関するものであり、当該融合タンパク質は、二つの前記タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１２で表される。
【００２６】
本発明は、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質の、上記のような使用にも関する。
【００２７】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関するものであり、当該融合タンパク質は、三つの前記タンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１４で表される。
【００２８】
本発明は、より詳細には、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関するものであり、当該融合タンパク質は、二つの前記タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１６で表される。
【００２９】
本発明は、より詳細には、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関する。
【００３０】
本発明は、より詳細には、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関するものであり、当該融合タンパク質は、三つの前記タンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１８で表される。
【００３１】
本発明は、以下の目的の化合物、
−バイオエタノール、
−抗酸化剤、例えば、フェルラ酸、又は桂皮酸及びヒドロキシチロソールであるカフェ酸、又は没食子酸、
−香料、例えば、フェルラ酸又はｐ−クマル酸の生体内変換によりそれぞれ得られる、バニリン又はｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド
の調製の枠組みにおいて、又はパルプ及び紙の漂白の枠組みにおいて、植物細胞壁分解のプロセスを行うための、上記のような使用に関する。
【００３２】
本発明は、前記融合タンパク質が、基質である植物もしくは野菜の副産物に直接加えられるか、又は前記融合タンパク質をコードする核酸で形質転換された上記の菌類等の菌類細胞、より詳細には黒こうじ菌及びシュタケによって前記融合タンパク質が分泌され、前記菌類が、基質である前記植物もしくは野菜の副産物と接触させられる、上記のような使用に関する。
【００３３】
本発明は、植物又は野菜の副産物から植物細胞壁に存在する目的の化合物を調製するための、植物細胞壁を分解する方法であって、
−植物又は野菜の副産物又は産業廃棄物を上記の融合タンパク質又は上記の形質転換された菌類細胞によって酵素処理する工程、
−任意選択で、融合タンパク質の作用と組み合わせた蒸気爆発を用いて植物又は野菜の副産物を物理的に処理する工程、
−任意選択で、適切な微生物又は酵素により、上記酵素処理中に細胞壁から放出された化合物を生体内変換する工程、
−上記酵素処理中に細胞壁から放出された、又は上記生体内変換工程中に得られた目的の化合物を回収し、必要であれば精製する工程
を含むことを特徴とする方法にも関する。
【００３４】
好ましくは、本発明による方法において融合タンパク質で処理される植物は、サトウダイコン、コムギ、トウモロコシ、イネ、又は製紙業に使用される全ての樹木から選択される。
【００３５】
好ましくは、本発明による方法において融合タンパク質で処理される野菜の副産物又は産業廃棄物は、麦わら、トウモロコシふすま、小麦ふすま、米ぬか、リンゴの絞りかす、コーヒーかす、コーヒーの副産物、オリーブ工場の排水から選択される。
【００３６】
本発明は、より詳細には、目的の化合物として抗酸化剤を調製するための上記のような方法であって、
−ＣＢＭを含まない細胞壁分解酵素、すなわちフェルロイルエステラーゼＡ、フェルロイルエステラーゼＢ、クロロゲン酸ヒドロラーゼ、キシラナーゼのうちの少なくとも二つを含む融合タンパク質による植物又は野菜の副産物の処理であって、融合タンパク質が好ましくは、フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、クロロゲン酸ヒドロラーゼ−キシラナーゼから選択される処理、
−前記植物又は野菜の副産物の細胞壁から放出された抗酸化剤の回収、また必要であればその精製
を含む方法に関する。
【００３７】
本発明は、より詳細には、目的の抗酸化剤としてフェルラ酸等の桂皮酸を調製するための上記のような方法に関するものであり、使用される融合タンパク質は上記のように、フェルロイルエステラーゼとキシラナーゼ、及び任意選択でＣＢＭを含み、より詳細には、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１８から選択される。
【００３８】
有利には、フェルラ酸等の抗酸化剤の調製の枠組みにおいて、上記の融合タンパク質で処理される植物がサトウダイコン、コムギ、トウモロコシ、イネから選択されるか、又は上記の融合タンパク質で処理される野菜の副産物もしくは産業廃棄物が麦わら、トウモロコシふすま、小麦ふすま、米ぬか、リンゴの絞りかす、コーヒーかす、コーヒーの副産物、オリーブ工場の排水から選択される。
【００３９】
本発明は、目的の化合物として香料を調製するための上記のような方法であって、
−上記の抗酸化剤の調製の枠組みで使用した融合タンパク質による、植物又は野菜の副産物の処理、
−黒こうじ菌等の子嚢菌又はシュタケ等の担子菌から選択される微生物により産生された無規定の酵素と接触させることによる、上記工程中に細胞壁から放出された化合物の生体内変換、
−上記生体内変換の工程で得られた香料の回収、また必要であればその精製
を含む方法にも関する。
【００４０】
本発明は、より詳細には、目的の香料としてバニリンを調製するための上記のような方法に関するものであり、使用される融合タンパク質は、上記のフェルラ酸の調製に使用されるものから選択され、生体内変換の工程は、細胞壁から放出されるフェルラ酸を黒こうじ菌等の子嚢菌又はシュタケ等の担子菌により産生される無規定の酵素と接触させることによって行われる。
【００４１】
有利には、バニリン等の香料の調製において使用される植物及び野菜の副産物又は産業廃棄物は、抗酸化剤の調製のための上記のものから選択される。
【００４２】
本発明は、目的の化合物としてバイオエタノールを調製するための上記のような方法であって、
−ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素、すなわちセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、アリールアルコールオキシダーゼのうちの少なくとも二つを含む融合タンパク質による、植物又は野菜の副産物の処理であって、融合タンパク質が好ましくは、エンドグルカナーゼ−エキソグルカナーゼ、ラッカーゼ−キシラナーゼ、キシラナーゼ−セルラーゼ（エンドグルカナーゼ又はエキソグルカナーゼ）から選択される処理であり、有利には前記植物又は野菜の副産物の物理的処理と組み合わせられる処理、
−セルラーゼ、ヘミセルラーゼもしくはエステラーゼから選択される酵素、又は黒こうじ菌もしくはセルラーゼ生産性糸状菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）等の子嚢菌から選択される微生物と組み合わせた、上記の融合タンパク質の使用による、又は融合タンパク質を分泌する形質転換された菌類による、上記工程から得られる処理された植物又は野菜の副産物の、発酵性糖への生体内変換、
−酵母による、発酵性糖のバイオエタノールへの生体内変換
を含む方法にも関する。
【００４３】
本発明は、より詳細には、融合タンパク質がエンドグルカナーゼ−エキソグルカナーゼ、ラッカーゼ−キシラナーゼ、キシラナーゼ−セルラーゼ（エンドグルカナーゼ又はエキソグルカナーゼ）から選択される、その後のバイオエタノールの製造のための発酵性糖を調製するための上記のような方法に関する。
【００４４】
有利には、バイオエタノールの調製の枠組みにおいて使用される植物及び野菜の副産物又は産業廃棄物は、樹木、一年生植物、又は農業副産物から選択される。
【００４５】
本発明は、パルプ及び紙を漂白する方法であって、
−ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素、すなわちフェルロイルエステラーゼＡ、フェルロイルエステラーゼＢ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、多機能型ペルオキシダーゼ、又はセロビオースデヒドロゲナーゼのうちの少なくとも二つを含む融合タンパク質と組合せた、植物又は野菜の副産物の化学的及び物理的処理、
−任意選択で、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素、すなわちフェルロイルエステラーゼＡ、フェルロイルエステラーゼＢ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、多機能型ペルオキシダーゼ、又はセロビオースデヒドロゲナーゼのうちの少なくとも二つを含む融合タンパク質を分泌する形質転換された菌類による、上記工程で得られる処理された植物又は野菜の副産物のバイオパルプ化、
−ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素、すなわちフェルロイルエステラーゼＡ、フェルロイルエステラーゼＢ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、多機能型ペルオキシダーゼ、又はセロビオースデヒドロゲナーゼのうちの少なくとも二つを含む融合タンパク質による、上記工程で得られる処理された植物又は野菜の副産物のバイオ漂白
を含む方法にも関する。
【００４６】
本発明は、より詳細には、植物及び野菜の副産物の処理の第一の工程で使用される融合タンパク質が、フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、ラッカーゼ−キシラナーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ−マンガンペルオキシダーゼから選択され、バイオパルプ化の工程で使用される形質転換された菌類により分泌される融合タンパク質が、シュタケ又は黒こうじ菌により過剰生成された、フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、ラッカーゼ−キシラナーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ−マンガンペルオキシダーゼから選択され、バイオ漂白の工程で使用される融合タンパク質が、フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、ラッカーゼ−キシラナーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ−マンガンペルオキシダーゼから選択される、パルプ及び紙の漂白のための上記のような方法に関する。
【００４７】
本発明は、Ｃ末端の糖質結合分子（ＣＢＭ）を含まない少なくとも二つの植物細胞壁分解酵素、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質に関するものであり、前記酵素及びＣＢＭは、上記のような菌類の天然タンパク質又はその変異型に対応する組換えタンパク質である。
【００４８】
本発明は、より詳細には、自身に含まれるタンパク質の少なくとも二つの間にリンカーを含む、上記のような融合タンパク質に関するものであり、前記リンカーは上記のようなものである。
【００４９】
本発明は、より詳細には、フェルロイルエステラーゼとキシラナーゼ、及び任意選択でＣＢＭの間の、上記のような融合タンパク質に関する。
【００５０】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ又は配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の、上記のような融合タンパク質に関する。
【００５１】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の上記のような融合タンパク質に関するものであり、当該融合タンパク質は、二つの前記タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１２で表される。
【００５２】
本発明は、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢ、及び黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭの間の、上記のような融合タンパク質にも関する。
【００５３】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢ、及び配列番号８で表されるＣＢＭの間の、上記のような融合タンパク質に関するものであり、当該融合タンパク質は、三つの前記タンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１４で表される。
【００５４】
本発明は、より詳細には、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の上記のような融合タンパク質に関するものであり、当該融合タンパク質は、二つの前記タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１６で表される。
【００５５】
本発明は、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢ、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢ、及び黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭの間の、上記のような融合タンパク質にも関する。
【００５６】
本発明は、より詳細には、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢ、配列番号４で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢ、及び配列番号６で表されるＣＢＭの間の、上記のような融合タンパク質に関するものであり、当該融合タンパク質は、三つの前記タンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１８で表される。
【００５７】
本発明は、上記のような融合タンパク質をコードする核酸にも関する。
【００５８】
本発明は、より詳細には、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１８で表される融合タンパク質をそれぞれコードする、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７で表される核酸に関する。
【００５９】
本発明は、配列番号１の配列が、配列番号２４に対応するプレフェルロイルエステラーゼＡをコードする配列番号２３の配列に置き換えられている、配列番号１１及び配列番号１３に対応する配列番号１９及び配列番号２１で表される核酸にも関するものであり、当該配列番号１９及び配列番号２１の核酸は、配列番号２０及び配列番号２２の配列に対応する融合プレタンパク質をコードする。
【００６０】
本発明は、配列番号３の配列が、配列番号３０に対応するプレフェルロイルエステラーゼＢをコードする配列番号２９の配列に置き換えられている、配列番号１５及び配列番号１７に対応する、配列番号２５及び配列番号２７で表される核酸にも関するものであり、当該配列番号２５及び配列番号２７の核酸は、配列番号２０及び配列番号２２の配列に対応する融合のプレタンパク質をコードする。
【００６１】
本発明は、上記のような核酸で形質転換したｐＡＮ５２．３等のベクターにも関する。
【００６２】
本発明は、上記のようなベクターを使用することによって上記のような核酸で形質転換した、子嚢菌又は担子菌、より詳細には黒こうじ菌又はシュタケ等の宿主細胞にも関する。
【００６３】
本発明は、上記のような宿主細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養、培養中に前記宿主細胞により産生された融合タンパク質の回収、及び必要であればその精製を含む、上記のような融合タンパク質を調製する方法にも関する。
【００６４】
本発明は、キメラ酵素ＦＬＸ（配列番号１２）及びＦＬＸＬＣ（配列番号１４）の調製及び特性についての以下の詳細な記載でさらに説明される。
【００６５】
二つのキメラ酵素ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣを設計し、黒こうじ菌で良好に過剰産生させた。ＦＬＸ構築物は、黒こうじ菌のエンドキシラナーゼＢ（ＸＹＮＢ）に融合したフェルロイルエステラーゼＡ（ＦＡＥＡ）をコードする配列から成る。Ｃ末端の糖質結合モジュール（ＣＢＭファミリー１）をＦＬＸにグラフトし、第二のハイブリッド酵素ＦＬＸＬＣを生成した。各パートナーの間に、構築物を安定化するための高度にグリコシル化されたリンカーを含めた。ハイブリッドタンパク質を均一に精製し、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの分子量をそれぞれ７２ｋＤａ及び９７ｋＤａと推定した。ハイブリッド酵素の完全性を、ＦＡＥＡ及びポリヒスチジンタグに対する抗体を使用して、単一形態を示す免疫検出で確認した。二機能性酵素の各触媒モジュールの物理化学的特性は、遊離酵素のそれに相当する。さらに、本発明者は、ＦＬＸＬＣが微結晶性セルロース（アビセル）に強い親和性を示し、結合パラメータが、解離定数はＫｄ＝９．９×１０−８Ｍに相当し、結合能はアビセル１ｇ当たり０．９８μｍｏｌに相当することを確認した。両方の二機能性酵素を、天然基質であるトウモロコシふすま及び小麦ふすまからフェルラ酸を放出するそれらの能力について研究した。遊離酵素ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢと比較して、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣを使用した方が、両基質で高い相乗効果が得られた。さらに、基質としてトウモロコシふすまを使用したフェルラ酸の放出では、ＦＬＸと比較してＦＬＸＬＣで相乗効果が増大し、これにより、ＣＢＭの正の役割が確認された。結論として、これらの結果は、黒こうじ菌由来の天然で遊離している複数の細胞壁加水分解酵素とＣＢＭの、二機能性酵素への融合により、複雑な基質の分解に対する相乗効果が増大することを示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
材料及び方法
【００６７】
株及び培養培地
大腸菌ＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ）をベクターの構築及び増殖に使用し、黒こうじ菌株Ｄ１５＃２６（ｐｙｒｇ−）（２２）を組換えタンパク質の産生に使用した。ｐｙｒＧ遺伝子及び発現カセットＦＬＸ又はＦＬＸＬＣ（図１）をそれぞれ含むベクターによる同時形質転換の後、黒こうじ菌を、選択のために、７０ｍＭのＮａＮＯ３、７ｍＭのＫＣｌ、１１ｍＭのＫＨ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、グルコース１％（ｗ／ｖ）、及び微量元素［１０００×ストック溶液：７６ｍＭのＺｎＳＯ４、２５ｍＭのＭｎＣｌ２、１８ｍＭのＦｅＳＯ４、７．１ｍＭのＣｏＣｌ２、６．４ｍＭのＣｕＳＯ４、６．２ｍＭのＮａ２ＭｏＯ４、１７４ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］を含む（ウリジンを含まない）固体最少培地で成長させた。液体培地における組換えタンパク質の産生について形質転換体をスクリーニングするために、７０ｍＭのＮａＮＯ３、７ｍＭのＫＣｌ、２００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、グルコース６％（ｗ／ｖ）及び微量元素を含む１００ｍｌの培養培地を、５００ｍＬのバッフルフラスコにおいて１×１０６胞子／ｍｌで培養した。黒こうじ菌ＢＲＦＭ１３１（Ｂａｎｑｕｅ ｄｅ Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｓ Ｆｏｎｇｉｑｕｅｓ ｄｅ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ）をゲノムＤＮＡの抽出に使用し、得られたＤＮＡをリンカー−ｃｂｍ配列のＰＣＲ増幅法のための鋳型として使用した。
【００６８】
発現ベクターの構築と菌類の形質転換
黒こうじ菌由来のＦＡＥＡ（配列番号１９、Ｙ０９３３０）、ＸＹＮＢ（配列番号５、ＡＹ１２６４８１）、及びＣＢＭ（配列番号７、ＡＦ１５６２６９）をコードする配列の融合を、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法（２５）によって行った。黒こうじ菌のＦＡＥＡコード領域を、フォワードプライマー
及びリバースプライマー５’−ＡＣＴＧＧＡＧＴＡＡＧＴＣＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＴＣＣＧＣＴ−３’を使用して、ｃＤＮＡから増幅した（４１）。ＣＢＨＢのリンカー領域をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号９、ＡＦ１５６２６９）を、フォワードプライマー５’−ＡＧＣＧＧＡＧＣＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＧＧＣＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＡＧＴ−３’及びリバースプライマー５’−ＧＧＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＡＡＣＴ−３’を使用して、黒こうじ菌ＢＲＦＭ１３１から増幅した。最後に、ｘｙｎＢ遺伝子を、フォワードプライマー５’−ＡＧＴＴＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＣＣ−３’及びリバースプライマー
によって、ｃＤＮＡから増幅した（２９）（Ｈｉｓタグは全ての配列において点線で示されている）。得られたオーバーラップしている断片を混合し、融合配列を両方の外部プライマーを使用して一工程反応で合成した。構築物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングし、クローニングされたＰＣＲ産物を配列決定して確認した。融合断片を、線状化したＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ内にクローニングし、ｐＡＮ５２．３を脱リン酸化して、ｐＦＬＸプラスミドを得た（図１、Ａ）。フォワードプライマー
及びリバースプライマー５’−ＡＣＴＧＧＡＧＴＡＡＧＴＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＣＧＡ−３’を用いる、組換えＦＡＥＡ−リンカー−ＸＹＮＢ配列をコードする断片の増幅のための鋳型としてｐＦＬＸを使用して、ＦＬＸＬＣプラスミドを構築した。黒こうじ菌ＢＲＦＭ１３１由来のゲノムＤＮＡを、利用可能なｃｂｈＢ配列（ＡＦ１５６２６９）から設計した二つの特異的なプライマー、フォワードプライマー５’−ＴＣＧＴＣＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＣＡＧＧＧＣＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＡＧＴ−３’及びリバースプライマー
を用いるリンカー−ＣＢＭ配列のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。融合断片を、両方の外部プライマーを使用してオーバーラップ伸長ＰＣＲ法で合成し、配列決定によって管理し、ｐＡＮ５２．３にクローニングして、ｐＦＬＸＬＣベクターを得た（図１、Ｂ）。両発現ベクターにおいて、アスペルギルス・ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）のプロモーター、ｇｐｄＡのｍＲＮＡの５’非翻訳領域、及びアスペルギルス・ニダランスのｔｒｐＣターミネーターを、組換え配列の発現を誘発するために使用した。さらに、ＦＡＥＡのシグナルペプチド（２１アミノ酸）を、両組換えタンパク質の分泌を標的化するために使用した。
【００６９】
菌類の同時形質転換の両者を、ｐＦＬＸ発現ベクター又はｐＦＬＸＬＣ発現ベクターをそれぞれと、ｐｙｒＧ選択マーカーを含むｐＡＢ４−１（４８）とを１０：１の比で使用して、Ｐｕｎｔ及びｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ（３９）によって記載されているようにして行った。さらに、黒こうじ菌Ｄ１５＃２６を、対照実験のための発現ベクターを用いずにｐｙｒＧ遺伝子で形質転換した。同時形質転換体を、選択最少培地プレート（ウリジンを含まない）におけるウリジン原栄養性について選択し、３０℃で８日間インキュベートした。形質転換体をスクリーニングするために、各構築物についての４０個の個々のクローンを培養し、毎日確認した。
【００７０】
フェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼの活性のスクリーニング
培養物を、振盪培養器（１３０ｒｐｍ）において３０℃で１４日間観察した。ｐＨは１Ｍのクエン酸溶液で毎日５．５に調整した。各培養条件を二重で実施した。液体培養培地からアリコート（１ｍｌ）を毎日回収し、菌糸体を濾過により取り除いた。フェルラ酸メチル（ＭＦＡ）を基質として使用してこれまでに記載されたようにエステラーゼ活性を評価し（４０）、キシラナーゼの活性を、Ｂａｉｌｅｙらの方法（１）に基づいた、１％（ｗ／ｖ）カバノキのキシランから放出されたキシロースの量の測定によって算出した。これらの酵素を、キシラン溶液［カバノキ由来の１％（ｗ／ｖ）キシラン、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）］と共に４５℃で５分間インキュベートした。放出された還元糖を、標準としてキシロースを用いてＤＮＳ法によって求めた（３５）。酵素及び基質のサンプルにおける任意のバックグラウンドを補正するためにブランクを用いて全てのアッセイを行った。
【００７１】
活性はｎｋａｔａｌ（ｎｋａｔ）で表され、１ｎｋａｔは、規定の条件下で１秒当たり１ｎｍｏｌのフェルラ酸又は１ｎｍｏｌの還元糖の放出を触媒する酵素の量として定義される。それぞれの実験は二重で行い、測定は三重で行い、標準偏差は、エステラーゼ活性については平均の２％未満、キシラナーゼ活性については５％未満であった。
【００７２】
組換えタンパク質の精製
各構築物の最良の単離物をスクリーニング手順と同じ条件で播種した。培養物を成長の８日後に採取し、濾過し（０．７μｍ）、ポリエーテルスルホン膜（３０ｋＤａのカットオフ分子量）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して限外濾過により濃縮した。濃縮された画分を、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）結合緩衝液に対して透析し、Ｈｉｓタグを付けられたタンパク質の精製を、キレート化セファロース高速カラム（１３×１５ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った（３８）。遊離タンパク質に関して、ｈｉｓタグ配列を含む組換えキシラナーゼＢも、前述したようにキレート化セファロース高速カラムで精製した（２９）。最後に、組換えＦＡＥＡを前述したようにフェニルセファロースカラムを使用して一工程手順で精製した（４１）。
【００７３】
組換えタンパク質の解析
タンパク質の分析及びＮ末端アミノ酸配列の決定
標準としてウシ血清アルブミンを用いて、Ｌｏｗｒｙら（３４）に従ってタンパク質濃度を求めた。タンパク質の産生及び精製を、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１１％ポリアクリルアミド）スラブゲルを使用して確認した。Ｎ末端配列を、ポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にエレクトロブロットしたＦＬＸ及びＦＬＸＬＣのサンプル（１００μｇ）からエドマン分解に従って決定した。分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７０Ａで行った。
【００７４】
ウェスタンブロット分析
全タンパク質及び精製タンパク質を、Ｌａｅｍｍｌｉ（２８）に従って１１％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、室温で４５分間、ＢＡ８５ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ）にエレクトロブロットした。膜を４℃で一晩、ブロッキング溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び２％（ｖ／ｖ）ミルク（ｐＨ７．５））中でインキュベートした。それから、膜をＴＢＳ−０．２％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、抗ＦＡＥＡ血清を１／８０００の希釈率で含むか、又は抗ポリヒスチジン−ペルオキシダーゼ血清（Ｓｉｇｍａ）を含む、ブロッキング溶液で処理した。抗ＦＡＥＡ抗体については、その後、膜を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と結合したヤギ抗ウサギ免疫グロビンＧとインキュベートした。製造業者の手順に従って、化学発光ウェスタンブロッティングキット（Ｒｏｃｈｅ）によってシグナルを検出した。
【００７５】
組換えタンパク質の温度及びｐＨの安定性
精製した組換えタンパク質の熱安定性を３０〜７０℃の範囲で試験した。アリコートを指定温度でプレインキュベートし、０℃で冷却した後、標準的な条件下で先に示したようにエステラーゼ及びキシラナーゼの活性を評価した。二機能性タンパク質の完全性を確認するために、インキュベーションの後にサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質の安定性に対するｐＨの効果を、精製した組換えタンパク質をリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ２．５〜７．０）及びリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０〜８．０）においてインキュベートして試験した。全てのインキュベートは９０分間行い、それからアリコートを標準的な反応混合物に移し、残存している活性の量を求めた。プレインキュベーションの前に求めた活性を１００％とした。
【００７６】
エステラーゼ及びキシラナーゼの活性に対する温度及びｐＨの効果
用いる条件下での最適な温度を求めるために、精製した組換えタンパク質のアリコートを様々な温度（３０〜７０℃）でインキュベートし、エステラーゼ及びキシラナーゼの活性を評価した。標準的な条件を用いて、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ２．５〜７．０）及びリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を使用して最適ｐＨを求めた。
【００７７】
セルロース結合能及び解離定数の決定
精製したＦＬＸ及びＦＬＸＬＣのサンプルを、２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）中のセルロースを含む２ｍｌのマイクロ遠心チューブに加え、最終容量を１ｍｌとした。ＦＬＸ（対照）及びＦＬＸＬＣの、アビセルＰＨ１０１セルロース（Ｆｌｕｋａ）への結合能を、様々な量の組換えタンパク質（３０〜１７０μｇ）及び一定量のセルロース（２ｍｇ）を使用して求めた。両組換えタンパク質をセルロースと共に４℃で１時間、ゆっくりと撹拌しながらインキュベートした。遠心分離（４０００×ｇ、１０分間）の後、上清液に残ったタンパク質（遊離酵素）の量を求めた。セルロースに結合した酵素の量を、加えた全量から遊離ＦＬＸ又は遊離ＦＬＸＬＣの量を差し引くことによって算出した。「１／遊離酵素」に対する「１／結合した酵素」の両逆数プロットを描くことによってデータを分析した。解離定数は、１／Ｂ＝（Ｋｄ／Ｂｍａｘ×１／Ｆ）＋１／Ｂｍａｘ（式中、Ｂは結合した酵素の濃度であり、Ｆは遊離酵素の濃度である）として定義される（２１、３７）。
【００７８】
適用試験
酵素的加水分解
小麦ふすま（ＷＢ）及びトウモロコシふすま（ＭＢ）を脱デンプン化した。これらの基質を１３０℃で１０分間の熱処理に付した。酵素的加水分解を、０．０１％アジ化ナトリウムを含むｐＨ６．０の０．１Ｍの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液内で、４０℃のサーモスタット制御振盪培養器において行った。ＷＢ又はＭＢ（２００ｍｇ）を、別個に、精製したＦＡＥＡ（配列番号２）、ＸＹＮＢ（配列番号６）、ＦＡＥＡ＋ＸＹＮＢ、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣと、最終容量５ｍｌでインキュベートした。遊離酵素及び二機能性酵素の精製した酵素の濃度は、各アッセイで、乾燥ふすま２００ｍｇ当たり１１ｎｋａｔａｌのエステラーゼ活性及び６４９６ｎｋａｔａｌのキシラナーゼ活性であった。この比は、精製した二機能性酵素で見られたモル濃度対モル濃度の様相に対応する。各アッセイは二重で行い、標準偏差は、ＷＢ及びＭＢで値の平均の５％未満であった。
【００７９】
アルカリ抽出可能なヒドロキシ桂皮酸の調製
アルカリ抽出可能なヒドロキシ桂皮酸含の総含有量を、２０ｍｇのＷＢ又はＭＢを２ＮのＮａＯＨ中に加えることによって求め、暗所で３５℃で３０分間インキュベートした。ｐＨを２ＮのＨＣｌで２に調整した。フェノール酸を３ｍｌのエーテルで三回抽出した。有機相を試験管に移し、４０℃で乾燥した。１ｍｌのメタノール／Ｈ２Ｏ（５０：５０）（ｖ／ｖ）を乾燥抽出物に加え、サンプルを、次の節に記載するようなＨＰＬＣ系に注入した。アルカリ抽出可能なフェルラ酸の総含有量は、酵素的加水分解では１００％であると考えられた。
【００８０】
フェルラ酸の測定
酵素的加水分解物を１００％メタノールで１／２に希釈し、１２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を０．２μｍのナイロンフィルター（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ａｃｒｏｄｉｓｃ １３， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ）を通して濾過した。濾液をＨＰＬＣで分析した（２５μＬを注入）。ＨＰＬＣ分析は、可変ＵＶ／ＶＩＳ検出器、１００個の位置のオートサンプラー−オートインジェクターを備えたＨＰ１１００モデル（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）で、２８０ｎｍ及び３０℃で行った。分離は、Ｍｅｒｃｋ ＲＰ−１８逆相カラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）で行った。流速は１．４ｍｌ／分であった。使用した移動相は、２０分間の総ラン時間で、１％酢酸及び１０％アセトニトリル水溶液（Ａ）対１００％アセトニトリル（Ｂ）であり、勾配は以下のように変化した：溶媒Ｂは最初２分間は０％であり、その後１０分間で５０％まで上昇し、３分間で１００％まで上昇し実行の終了まで継続した。データをＨＰ３３６５ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎで処理し、外部標準較正によって定量を行った。
【００８１】
結果
【００８２】
二機能性酵素の産生の設計及び研究
黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ（ＦＡＥＡ）及びキシラナーゼＢ（ＸＹＮＢ）のコード配列を、高度にグリコシル化されたリンカーをコードするセロビオヒドロラーゼＢ遺伝子（ｃｂｈＢ）由来の配列を両パートナーの間に付加することによって、遺伝子的に融合した（図１Ａ）。第二の構築物ＦＬＸＬＣについては、対応する融合ＦＬＸを、リンカー−ＣＢＭをコードする黒こうじ菌のｃｂｈＢ遺伝子の部分配列に融合した（図１Ｂ）。両方の翻訳融合は、分泌を標的化する内因性ｆａｅＡシグナル配列と共に強く構成的なｇｐｄＡプロモーター及びｔｒｐＣターミネーターの制御下に置いた。黒こうじ菌Ｄ１５＃２６のプロトプラストを、発現ベクターｐＦＬＸ又はｐＦＬＸＬＣとｐｙｒＧ遺伝子を含むプラスミドｐＡＢ４−１との混合物で同時形質転換した。形質転換体を、ウリジンを含まない最少培地プレートで成長するこれらの能力について選択した。各構築物について４０個の形質転換体を、内因性ｆａｅＡ及びｘｙｎＢ遺伝子の発現を抑制するグルコース最少培地に播種した。ｐＡＢ４−１で形質転換した対照宿主では、エステラーゼ又はキシラナーゼの活性は全く検出されなかった。両構築物で、２日間の成長の後、形質転換体の細胞外培地でエステラーゼ及びキシラナーゼの活性が検出された（図２）。フェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼの活性が、培養中に共時的に検出された。最良のＦＬＸＬＣ及びＦＬＸの形質転換体ではそれぞれ１０日目及び１１日目まで活性が増大し、１４日目までにおおよそ安定したレベルに達した。最大エステラーゼ活性は、ＦＬＸについては１３．０ｎｋａｔ／ｍｌ、そしてＦＬＸＬＣ形質転換体については９．８ｎｋａｔ／ｍｌに達した。キシラナーゼの活性に関しては、ＦＬＸ形質転換体では２８７０ｎｋａｔ／ｍｌ、そしてＦＬＸＬＣ形質転換体では２０３８ｎｋａｔ／ｍｌの最大値が得られた。二機能性酵素内のＦＡＥＡパートナーの比活性を考慮すると、産生収率はＦＬＸ形質転換体及びＦＬＸＬＣ形質転換体でそれぞれ１．４ｇ／Ｌ及び１．５ｇ／Ｌと推測された。
【００８３】
二機能性酵素の生化学的及び動態学的解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析
両方の場合において、産生したタンパク質をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動で確認した（図３のレーン１及びレーン３）。ＦＬＸ形質転換体及びＦＬＸＬＣ形質転換体からの全細胞外タンパク質においてそれぞれ７２ｋＤａ及び９７ｋＤａ付近に顕著なバンドが見られた。ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの観測された分子量と理論上の分子量との間の差異は、それぞれ約１２％（ｗ／ｗ）及び２６％（ｗ／ｗ）のグリコシル化を示唆していた。組換え酵素をキレート化セファロース高速カラム上で精製し、画分の均一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって管理した（レーン２及びレーン４）。
【００８４】
全タンパク質の上清及び精製した画分から得た両キメラ酵素を、ＦＡＥＡに対する抗体を使用して免疫検出した（図４Ａ）。一つのシングルバンドが、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの形質転換体のそれぞれで、全タンパク質抽出物（レーン１、レーン３）及び精製したサンプル（レーン２、レーン４）から示された。キシラナーゼ又はＣＢＭに対する抗体が利用可能ではなかったので、組換えタンパク質の完全性を管理するために、Ｃ末端のヒスチジン−タグに対する抗体も免疫検出に使用した（図４Ｂ）。一つのシングルバンドがＦＬＸ及びＦＬＸＬＣで検出され、これによって、分解された形態を全く有さない無傷タンパク質として二機能性酵素が産生されたことが確認された（レーン５〜レーン８）。陰性対照（Ｃ）により、両方の抗体がエピトープ特異的であること、及び内因性ＦＡＥＡがこれらの培養条件で産生されないことが確認された。
【００８５】
Ｎ末端の配列決定
ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの最初の５つのアミノ酸を配列決定し（ＡＳＴＱＧ）、天然ＦＡＥＡとアラインした。アラインメントは、組換えタンパク質と天然ＦＡＥＡとの間で１００％の同一性を示した。これらの結果により、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣが正しく処理されたことが確認された。
【００８６】
二機能性酵素−セルロースの親和性及び結合能の分析
ＦＬＸとは対照的に、ＦＬＸＬＣはＣ末端に黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ由来のＣＢＭを含む。ＣＢＭの結合パラメータを求めるために、ＦＬＸＬＣのセルロースとの相互作用のアッセイを行った。ＦＬＸＬＣのセルロース結合親和性及びセルロール結合能を微結晶性セルロースであるアビセルＰＨ１０１に対して求めた。測定値は、解離定数（Ｋｄ）が９．９×１０−８Ｍであり、結合能が０．９８μｍｏｌ／ｇアビセルであった。予測通り、キメラ酵素ＦＬＸ（ＣＢＭを含まない）に関しては相互作用が見られなかった。
【００８７】
生化学的及び動態学的パラメータ
ＣＢＭを含むか又は含まない、両方の酵素パートナーの融合が、各酵素の特徴を変更させているか否かを管理するために、エステラーゼ及びキシラナーゼの活性に従って、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの生化学的及び動態学的パラメータを、遊離した組換えＦＡＥＡ及びＸＹＮＢと比較した（表１）。最適ｐＨ及びｐＨ安定性に関しては、二機能性酵素と遊離ＦＡＥＡ又はＸＹＮＢの両者との間に有意な差は見られなかった。最適温度及び温度安定性については、唯一の差はキシラナーゼの活性で測定されたわずかな違いだけであった。さらに、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの完全性を様々な温度でのインキュベーションの後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって管理したところ、両方の二機能性酵素は４５℃まで完全に安定であり、５０℃で部分的に切断された。切断型の第一のアミノ酸を配列決定し、ＧＳＧＳＳと同定した。この配列をＦＬＸ及びＦＬＸＬＣとアラインしたところ、リンカー内で見られる配列と１００％の同一性が示された。これらの結果により、高度にグリコシル化されたリンカーが４５℃まで安定であり、ＧＳＧＳＳ配列の手前で５０℃で切断が生じることが示された。二つのリンカー配列を含むキメラＦＬＸＬＣタンパク質は、Ｃ末端のリンカーでのみ切断された（ＸＹＮＢとＣＢＭとの間）。プロテアーゼに対する潜在的な切断部位を、ペプチド切断ツールを使用して両ハイブリッドタンパク質のアミノ酸配列上で確認したところ（１９）、ＧＳＧＳＳ近辺に切断部位は見出されなかった。
【００８８】
動態学的特性に関して、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣのミカエリス定数を、ＭＦＡ及びカバノキキシランを基質として使用してラインウィーバー・バークプロットから測定した。ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣで見られた値は、遊離した組換えＦＡＥＡ及びＸＹＮＢで見られた値と一致していた（表１）。二機能性酵素の比活性をフェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼの活性に基づいて求め、遊離ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢと比較した（表１）。二機能性酵素で見られた値は、遊離ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢで見られた値に近かった。
【００８９】
つまり、これらの結果により、融合酵素モジュール（ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢ）の生化学的及び動態学的パラメータが主に二機能性複合体ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣに保存されていることが確認された。
【００９０】
小麦ふすま及びトウモロコシふすまからのフェルラ酸の酵素放出
二機能性タンパク質内の二つの酵素の物理的近接によって生じる相乗効果及びＣＢＭ付加の影響を研究するために、ＦＡ放出の効率について、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣを遊離酵素ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢと比較した。全ての酵素を均一に精製し、細胞壁に含まれるＦＡの量が天然で高いＷＢ及びＭＢとインキュベートした。遊離ＦＡＥＡを使用した場合、４時間後及び１６時間後にそれぞれ、ＷＢ由来の全アルカリ抽出性ＦＡの４１％及び５１％が放出された（図５、Ａ）。これらの割合は、遊離ＸＹＮＢの追加によって５１％（４時間）及び５４％（１６時間）にわずかに増大した。ＦＬＸ又はＦＬＸＬＣの効果に関して、本発明者は、わずか４時間のインキュベーションの後にＦＡの全放出を観察した。基質としてＭＢを用いると（図５Ｂ）、遊離ＦＡＥＡは４時間後及び１６時間後にそれぞれ４．２％及び４．８％のＦＡを放出したが、ＸＹＮＢの追加ではこの割合は増大しなかった。しかし、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣは、４時間の加水分解の後にそれぞれ６．２％及び７．２％を放出することができた。酵素処理を一晩１６時間行った場合、放出はＦＬＸ及びＦＬＸＬＣで６．３％及び７．９％に増大した。相乗因子を求め遊離酵素（ＦＡＥＡ＋ＸＹＮＢ）と融合酵素（ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣ）との間で比較した。表２で算出されるように、算出比は１よりも大きく、これにより、両基質について、相乗効果は、対応する遊離酵素よりも二機能性酵素で良好であることが示された。ＭＢのＦＡ放出に関して、相乗効果は４時間後及び１６時間後でそれぞれ、ＦＬＸ（１．５３及び１．３０）よりもＦＬＸＬＣ（１．８０及び１．６２）で高かった。結論として、これらの結果により、両基質に関して、二機能性酵素ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣが、対応する遊離酵素（ＦＡＥＡ＋ＸＹＮＢ）と比べて、ＦＡ放出に効果的であることが示された。さらに、これらの結果により、基質としてＭＢを使用したＦＡ放出にＦＬＸＬＣがより適していることが示されると考えられ、これによりＣＢＭによって生じる正の効果が示唆される。
【００９１】
結論
植物細胞壁の生分解には、その組成及び構造における不均一性のために、広範な酵素が必要とされる。異なる主鎖加水分解酵素と補助的な加水分解酵素との間の幾つかの組み合わせにより、細胞壁の効果的な分解を導く重要な相乗効果が示された（９、１２）。本研究では、黒こうじ菌の二つの植物細胞壁分解酵素及び糖質結合モジュールを融合し、天然基質の分解に対する相乗効果を研究した。このようなハイブリッドタンパク質の構築は、広範な潜在的な用途を広げるタンパク質工学の本来の側面である。ここで、概念は、二つの機能的単位を採用して、改善された二機能性タンパク質を作り出すことにある（３、３６）。このような複数のモジュールの組織化は一般的に自然に見出され、二つ以上の酵素活性又はタンパク質機能を有する酵素の産生をもたらす。バイオテクノロジー分野では幾つかの二機能性タンパク質が既に研究されており、これには、例えばα−アミラーゼとグルコアミラーゼとのハイブリッドが含まれる（４４）。この研究の結果により、生デンプンの消化に対して、遊離酵素と比較して酵素効率の増大が示された。別の実験では、内部ＣＢＭを有するキメラキシラナーゼ／エンドグルカナーゼ（ＸｙｎＣｅｎＡ）が構築されたが、この結果は、ハイブリッド酵素が、遊離酵素と比べて、均一なキシラン又はセルロース基質に対する加水分解に有意な影響を与えなかったことを示し、一方で、天然基質に対しての適用試験は行われなかった（４６）。
【００９２】
二つの細胞壁ヒドロラーゼの物理的近接によって生じる効果を評価するために、ＦＡＥＡをＸＹＮＢと融合した（構築物ＦＬＸ）。黒こうじ菌のＣＢＨＢ由来の菌類性ＣＢＭを第二の構築物（ＦＬＸＬＣ）においてＣ末端で融合し、二機能性酵素をセルロースに標的化した。両構築物に関して、高度にグリコシル化したリンカーペプチドを、三つの主な理由から、各モジュール（ＦＡＥＡ、ＸＹＮＢ、又はＣＢＭ）間で融合した。第一に、リンカーは、モジュールの、独立して折り畳む能力、及び互いに対する立体配座の自由度を保つ能力を維持することが知られている（３６）。本願の場合、フェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼの両方がこの立体配座を採用することができ、遺伝子工学処理された二機能性タンパク質は、遊離酵素に対応する生物学的及び動態学的特性で活性であった。第二に、リンカーの高度なグリコシル化が、リンカーをプロテアーゼの活性から保護すること、最終的には融合されたモジュール間の切断の頻繁に起こる問題を回避することによって、タンパク質配列の安定性を改善する（８、３６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析で示されるように両方の二機能性酵素が安定であったため、この効果は確認された。しかし、ハイブリッド酵素の安定性は熱処理によっていくらか制限を受けることが示された。実際に、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの完全性に対する熱処理の影響は、これらが４５℃まで安定であり、そして５０℃でリンカー配列において切断されることを示した。最後に、黒こうじ菌のグルコアミラーゼ由来の高度にグリコシル化されたリンカーで実証されたように、高度にグリコシル化されたリンカーは、産生収率を増大させる分泌に正の役割を果たし得る（３２）。実際に、ＦＬＸおよびＦＬＸＬＣでの一つ又は二つのリンカーの存在に起因するグリコシル化部位は、小胞体での組換えタンパク質の滞留を延長させることができ、これにより正確な折り畳みのための追加の時間が与えられ、産生の増大がもたらされる（４２）。この後者の仮説は、両方の二機能性酵素の産生収率が、対応する遊離した組換え酵素について得られた産生収率よりも高かった理由を説明し得る（２９、４１）。
【００９３】
両酵素モジュールの近接により生じる相乗効果であって、且つ折り畳みの間のタンパク質の立体配座の変化の結果としての酵素特性の変化に起因する利益ではない相乗効果を研究するために、各モジュールの生化学的及び動態学的特徴を注意深く管理した。二機能性タンパク質ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの両方の主な生化学的及び動態学的特性、すなわち、温度安定性及びｐＨ安定性、最適な温度及びｐＨ、Ｋｍ並びに比活性は、遊離酵素と同じ範囲内にある。今までに解析されていなかったため、黒こうじ菌のＣＢＨＢ由来のＣＢＭに関して、結合アッセイをセルロースに対して行った（２０）。アビセルセルロースは、１００〜２５０のグルコピラノース単位の非常に高い重合度と、高等植物のＩβ型の特徴で本質的に構成される結晶相の５０〜６０％の結晶形態とを有する（４９）。結果は、ＦＬＸＬＣがアビセルに対する親和性を有していることを示し、これによって、ＣＢＭの構造が乱されていないこと、及びＣＢＭがハイブリッド酵素でもその機能を保持していることが確認された。
【００９４】
最終的に、二機能性タンパク質ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの両方を試験して、酵素の相乗効果に対する二つの相補的な菌類酵素の物理的近接の効果、及びＣＭＢ付加の影響を研究した。適用試験は、それぞれ約１％及び３％（ｗ／ｗ）である植物細胞壁におけるＦＡ量の多さで知られている二つの天然のモデル基質（ＷＢ及びＭＢ）からのＦＡ放出に基づいている（４３）。両基質は農業で生じ、農業食品分野、化粧品分野及び医薬分野において価値化することができる（４、２６）。遊離酵素は、ＷＢ及びＭＢからそれぞれＦＡ含量の５４％及び４.８％を放出することができた。対照的に、二機能性酵素は、ＷＢからは全ＦＡを、そしてＭＢからはＣＢＭの存否に応じて６.３％又は７.９％まで、効率的に放出した。今までのところ、ＷＢからのＦＡ放出で見られたこれまでの結果はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）のキシラナーゼ及び黒こうじ菌由来のＦＡＥＡで得られ、ここでは、全フェルラ酸の最大９５％（ｗ／ｗ）が放出された（１５）。ＭＢに関して、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来の市販製剤Ｎｏｖｏｚｙｍ３４２を使用することで大量のＦＡが放出された（最大１３．６％）（５）。しかし、本発明者は、この市販製剤が様々な種類の酵素活性を含んでいることを考慮する必要があった。本発明のアッセイにおいて、ＷＢからの全ＦＡが二機能性酵素処理によって放出された一方で、ＭＢでは８％未満が得られたにすぎない。トウモロコシふすまのフェルラ酸含有量は小麦ふすまで見られたものよりも高いが、トウモロコシふすまのキシランの方がキシロース残基、アラビノース残基、及びガラストース残基によって多く置換されている（７、１５）。従って、この差異は、酵素の近接を著しく制限する、トウモロコシにおけるヘテロキシラン骨格上の置換の数、側鎖における高度に枝分かれしたキシロースの存在、及びＦＡ基の近傍でのアラビノースとキシロースとの間の連結の存在によって説明することができる。最後に、ＦＬＸＬＣによるＭＢの加水分解を考慮すると、ＣＢＭはＦＡ放出に対する正の効果を示し、それはおそらく、（ｉ）基質の近くでの酵素の濃度を増大させるセルロース標的化、及び／又は（ｉｉ）基質をより接近可能にするセルロース構造の不安定化によるものである。ＦＬＸ又はＦＬＸＬＣを使用することによる適用試験の結論として、遊離酵素ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢと比較して、両基質に対するより良好な相乗効果がＦＡ放出に関して得られた。全ての主な生化学的及び動態学的特性がハイブリッドタンパク質における各パートナーで変化しなかったので、全般的に高められた相乗効果が二機能性酵素内の各酵素パートナーの物理的近接に起因することが示唆された。ＦＬＸＬＣの場合、相乗効果はＣ末端ＣＢＭの付加によって正の影響を受けた。 さらに、活性部位の空間的位置が融合モジュール間で変化していないことも示され得る。
【００９５】
全般的な結論として、補助的な酵素（ＦＡＥＡ）及び主鎖切断酵素（ＸＹＮＢ）等の相補的な細胞壁ヒドロラーゼを結びつける、植物細胞壁分解のための新規な酵素ツールの構築が、酵素パートナーの相乗効果を増大させる興味深い戦略であることが示された。バイオテクノロジー上の応用では、このようなハイブリッドタンパク質の利用は、高価でかつ汚染性である化学処理の代替となるか、又はパルプ及び紙、農産業及びバイオ燃料生産の分野における野菜の副産物の価値化のために既存の酵素処理を改善するものである。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本研究で使用した発現カセットを示す図である。ＦＬＸインサートを設計するために（Ａ）、ＦＡＥＡ、ＣＢＨＢ由来のリンカー領域、及びＸＹＮＢをコードする黒こうじ菌の配列を共に融合した。第二の構築物において（Ｂ）、ＦＬＸの鋳型を、リンカー配列及びＣＢＭをコードするｃｂｈｂ配列と融合し、ＦＬＸＬＣ挿入を生じさせた。発現カセットは、ｇｐｄＡプロモーター及びｔｒｐＣターミネーターの制御下にある。両構築物は３’末端で６つのヒスチジンコード配列を含んでいた。（１）リンカーコード配列：ＧＳＴＹＳＳＧＳＳＳＧＳＧＳＳＳＳＳＳＳＴＴＴＫＡＴＳＴＴＬＫＴＴＳＴＴＳＳＧＳＳＳＴＳＡＡ。
【図２】黒こうじ菌における細胞外のフェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼの経時的な活性を示す図である。フェルロイルエステラーゼ（Ａ）及びキシラナーゼ（Ｂ）の活性は、最良のＦＬＸ（◆）形質転換体及びＦＬＸＬＣ（■）形質転換体で測定した。活性は、エステラーゼ及びキシラナーゼの活性にそれぞれ基質としてＭＦＡ及びカバノキキシランを使用して求めた。
【図３】ＦＬＸ形質転換体及びＦＬＸＬＣ形質転換体により産生された細胞外タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＦＬＸ由来の全タンパク質及び精製したタンパク質（それぞれ、レーン１及びレーン２）及びＦＬＸＬＣ由来の全タンパク質及び精製したタンパク質（それぞれ、レーン３及びレーン４）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１１％ポリアクリルアミド）にロードした。ゲルをクマシーブルーで染色した。ＳＤ：分子量標準。
【図４】ＦＬＸ形質転換体及びＦＬＸＬＣ形質転換体により産生された全タンパク質及び精製したタンパク質のウェスタンブロット分析を示す図である。ＦＡＥＡ（Ａ）又はＨｉｓ−タグ（Ｂ）に対する抗体を、ＦＬＸ形質転換体及びＦＬＸＬＣ形質転換体由来の全細胞外タンパク質及び精製したタンパク質の免疫検出に使用した。レーン１、レーン５：ＦＬＸ形質転換体由来の全細胞外タンパク質。レーン２、レーン６：精製したＦＬＸ。レーン３、レーン７：ＦＬＸＬＣ形質転換体由来の全細胞外タンパク質。レーン４、レーン８：精製したＦＬＸＬＣ。Ｃ：ｐＡＢ４−１で形質転換した対照株Ｄ１５＃２６。検出は化学発光で行った。
【図５】遊離酵素又は二機能性酵素の作用によるフェルラ酸放出効率の比較を示す図である。小麦ふすま（Ａ）及びとうもろこしふすま（Ｂ）を、遊離酵素又は二機能性酵素によるＦＡの加水分解に使用した。ＦＡ放出は、４時間後（白色の棒）及び１６時間後（黒色の棒）のＨＰＬＣによって求めた。活性は、基質中に存在するＦＡの総量に対する割合で示した。標準偏差は、ＷＢ及びＭＢについて値の平均の５％未満であった。
【００９９】
参考文献
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１７． Ｆｉｅｒｏｂｅ， Ｈ． Ｐ．， Ｆ． Ｍｉｎｇａｒｄｏｎ， Ａ． Ｍｅｃｈａｌｙ， Ａ． Ｂｅｌａｉｃｈ， Ｍ． Ｔ． Ｒｉｎｃｏｎ， Ｓ． Ｐａｇｅｓ， Ｒ． Ｌａｍｅｄ， Ｃ． Ｔａｒｄｉｆ， Ｊ． Ｐ． Ｂｅｌａｉｃｈ， ａｎｄ Ｅ． Ａ． Ｂａｙｅｒ． ２００５． Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅｓ ｏｎ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｖｅｒｓｕｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ： ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｔｏ ａ ｄｅｆｉｎｅｄ ｔｒｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０： １６３２５−３４．
１８． Ｇａｒｃｉａ−Ｃｏｎｅｓａ， Ｍ． Ｔ．， Ｖ． Ｆ． Ｃｒｅｐｉｎ， Ａ． Ｊ． Ｇｏｌｄｓｏｎ， Ｇ． Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， Ｎ． Ｊ． Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｉ． Ｆ． Ｃｏｎｎｅｒｔｏｎ， Ｃ． Ｂ． Ｆａｕｌｄｓ， ａｎｄ Ｐ． Ａ． Ｋｒｏｏｎ． ２００４． Ｔｈｅ ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ： ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｅｎｚｙｍｅ， ＴｓＦａｅＣ， ｗｉｔｈ ａ ｂｒｏａｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０８： ２２７−２４１．
１９． Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ， Ｅ．， Ｃ． Ｈｏｏｇｌａｎｄ， Ａ． Ｇａｔｔｉｋｅｒ， Ｓ． Ｄｕｖａｕｄ， Ｍ． Ｒ． Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｒ． Ｄ． Ａｐｐｅｌ， ａｎｄ Ａ． Ｂａｉｒｏｃｈ． ２００５． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｓｅｒｖｅｒ． Ｊｏｈｎ Ｍ． Ｗａｌｋｅｒ （ｅｄ）： Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．
２０． Ｇｉｅｌｋｅｎｓ， Ｍ． Ｍ．， Ｅ． Ｄｅｋｋｅｒｓ， Ｊ． Ｖｉｓｓｅｒ， ａｎｄ Ｌ． Ｈ． ｄｅ Ｇｒａａｆｆ． １９９９． Ｔｗｏ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｒｅｑｕｉｒｅ Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｘ１ｎＲ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５： ４３４０−５．
２１． Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｍ． Ａ．， Ｍ． Ｔａｋａｇｉ， Ｓ． Ｈａｓｈｉｄａ， Ｏ． Ｓｈｏｓｅｙｏｖ， Ｒ． Ｈ． Ｄｏｉ， ａｎｄ Ｉ． Ｈ． Ｓｅｇｅｌ． １９９３． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５： ５７６２−５７６８．
２２． Ｇｏｒｄｏｎ， Ｃ． Ｌ．， Ｄ． Ｂ． Ａｒｃｈｅｒ， Ｄ． Ｊ． Ｊｅｅｎｅｓ， Ｊ． Ｈ． Ｄｏｏｎａｎ， Ｂ． Ｗｅｌｌｓ， Ａ． Ｐ． Ｊ． Ｔｒｉｎｃｉ， ａｎｄ Ｇ． Ｄ． Ｒｏｂｓｏｎ． ２０００． Ａ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ：： ＧＦＰ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｈｙｐｈａｅ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ４２： ３９−４８．
２３． Ｇｒａｆ， Ｅ． １９９２． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １３： ４３５−４４８．
２４． Ｊｕｇｅ， Ｎ．， Ｇ． Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， Ａ． Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ， Ｎ． Ｊ． Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｉ． Ｆ． Ｃｏｎｎｅｒｔｏｎ， ａｎｄ Ｃ． Ｂ． Ｆａｕｌｄｓ． ２００１． Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｃｉｎｎａｍｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ （ＦＡＥＡ） ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ． ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ． １： １２７−１３２．
２５． Ｈｏ， Ｓ． Ｎ．， Ｈ． Ｄ． Ｈｕｎｔ， Ｒ． Ｍ． Ｈｏｒｔｏｎ， Ｊ． Ｋ． Ｐｕｌｌｅｎ， Ｌ． Ｒ． Ｐｅａｓｅ． １９８９． Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｇｅｎｅ． ７７： ５１−５９．
２６． Ｋｉｋｕｚａｋｉ， Ｈ．， Ｍ． Ｈｉｓａｍｏｔｏ， Ｋ． Ｈｉｒｏｓｅ， Ｋ． Ａｋｉｙａｍａ， ａｎｄ Ｈ． Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ． ２００２． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｆｅｒｕｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ５０： ２１６１−２１６８．
２７． Ｋｒｏｏｎ， Ｐ． Ａ．， Ｇ． Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， Ｎ． Ｍ． Ｆｉｓｈ， Ｄ． Ｂ． Ａｒｃｈｅｒ， ａｎｄ Ｎ． Ｊ． Ｂｅｌｓｈａｗ． ２０００． Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ｗｈｉｃｈ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｓ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７： ６７４０−６７５２．
２８． Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ． Ｋ． １９７０． Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４． Ｎａｔｕｒｅ． ２２７： ６８０−６８５．
２９． Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ， Ａ．， Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ， ａｎｄ Ｅ． Ｒｅｃｏｒｄ． ２００５． Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌａｎａｓｅ Ｂ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５１： １７７−１８３．
３０． Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ， Ａ．， Ｉ． Ｂｅｎｏｉｔ， ， Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ， Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ， ａｎｄ Ｅ． Ｒｅｃｏｒｄ． ２００４． Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ Ｂ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ３７： １２６−１３３．
３１． Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ， Ａ．， Ｓ． Ｐａｇｅｓ， Ｈ． Ｐ． Ｆｉｅｒｏｂｅ， Ｄ． Ｎａｖａｒｒｏ， Ｐ． Ｊ． Ｐｕｎｔ， Ｊ． Ｐ． Ｂｅｌａｉｃｈ， Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ ａｎｄ Ｅ． Ｒｅｃｏｒｄ． ２００４． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｏｆ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ ａ ｆｕｎｇａｌ ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ ａｎｄ ａ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｄｏｃｋｅｒｉｎ ｄｏｍａｉｎ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７０： ６９８４−６９９１．
３２． Ｌｉｂｂｙ， Ｃ． Ｂ．， Ｃ． Ａ． Ｃｏｒｎｅｔｔ， Ｐ． Ｊ． Ｒｅｉｌｌｙ， ａｎｄ Ｃ． Ｆｏｒｄ． １９９４． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ７： １１０９−１１１４．
３３． Ｌｉｎｄｅｒ， Ｍ．， ａｎｄ Ｔ． Ｔ． Ｔｅｅｒｉ． １９９７． Ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５７： １５−２８．
３４． Ｌｏｗｒｙ， Ｏ． Ｈ．， Ｎ． Ｊ． Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ， Ａ． Ｌ． Ｆａｒｒ， ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ｒａｎｄａｌｌ． １９５１． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｆｏｌｉｎ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９３： ２６５−２７５．
３５． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｇ． Ｌ． １９５９． Ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ３１： ４２６−４２８．
３６． Ｎｉｘｏｎ， Ａ． Ｅ．， Ｍ． Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ， ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｂｅｎｋｏｖｉｃ． １９９８． Ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １６： ２５８−２６４．
３７． Ｐａｇｅｓ， Ｓ．， Ｌ． Ｇａｌ， Ａ． Ｂｅｌａｉｃｈ， Ｃ． Ｇａｕｄｉｎ， Ｃ． Ｔａｒｄｉｆ， ａｎｄ Ｊ． Ｐ． Ｂｅｌａｉｃｈ． １９９７． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣｉｐＣ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．． １７９： ２８１０−２８１６．
３８． Ｐｏｒａｔｈ， Ｊ．， Ｊ． Ｃａｒｌｓｓｏｎ， Ｉ． Ｏｌｓｓｏｎ， Ｇ． Ｂｅｌｆｒａｇｅ． １９７５． Ｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ． ２５８： ５９８−５９９．
３９． Ｐｕｎｔ， Ｐ． Ｊ．， ａｎｄ Ｃ． Ａ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ． １９９２． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ａｎｄ ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１６： ４４７−４５７．
４０． Ｒａｌｅｔ， Ｍ． Ｃ．， Ｃ． Ｂ． Ｆａｕｌｄｓ， Ｇ． Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， ａｎｄ Ｊ． Ｆ． Ｔｈｉｂａｕｌｔ． １９９４． Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｕｌｏｙｌａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｓｕｇａｒ−ｂｅｅｔ ｐｕｌｐ ａｎｄ ｗｈｅａｔ ｂｒａｎ ｂｙ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． ２６３： ２５７−２６９．
４１． Ｒｅｃｏｒｄ， Ｅ．， Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ， Ｃ． Ｓｉｇｏｉｌｌｏｔ， Ｓ． Ｐａｇｅｓ， Ｐ． Ｊ． Ｐｕｎｔ， Ｍ． Ｄｅｌａｔｔｒｅ， Ｍ． Ｈａｏｎ， Ｃ． Ａ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ， Ｊ． Ｃ． Ｓｉｇｏｉｌｌｏｔ， Ｌ． Ｌｅｓａｇｅ−Ｍｅｅｓｓｅｎ， ａｎｄ Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ． ２００３． Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｏｒ ｐｕｌｐ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６２： ３４９−３５５．
４２． Ｓａｇｔ， Ｃ． Ｍ．， Ｂ． Ｋｌｅｉｚｅｎ， Ｒ． Ｖｅｒｗａａｌ， Ｍ． Ｄ． ｄｅＪｏｎｇ， Ｗ． Ｈ． Ｍｕｌｌｅｒ， Ａ． Ｓｍｉｔｓ， Ｃ． Ｖｉｓｓｅｒ， Ｊ． Ｂｏｏｎｓｔｒａ， Ａ． Ｊ． Ｖｅｒｋｌｅｉｊ， ａｎｄ Ｃ． Ｔ． Ｖｅｒｒｉｐｓ． ２０００． Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｙｅａｓｔｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６６： ４９４０−４９４４．
４３． Ｓａｕｌｎｉｅｒ， Ｌ． ａｎｄ Ｊ． Ｆ． Ｔｈｉｂａｕｌｔ． １９９９． Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｄｉｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄｓ ａｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｓｕｇａｒ−ｂｅｅｔ ｐｅｃｔｉｎｓ ａｎｄ ｍａｉｚｅ ｂｒａｎ ｈｅｔｅｒｏｘｙｌａｎｓ． Ｊ． Ｓｃｉ． Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ． ７９： ３９６−４０２．
４４． Ｓｈｉｂｕｙａ， Ｉ．， Ｇ． Ｔａｍｕｒａ， Ｈ． Ｓｈｉｍａ， Ｔ． Ｉｓｈｉｋａｗａ， ａｎｄ Ｓ． Ｈａｒａ． １９９２． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ α−ａｍｙｌａｓｅ／ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６： ８８４−８８９．
４５． Ｓｒｉｓｏｄｓｕｋ， Ｍ．， Ｊ． Ｌｅｈｔｉｏ， Ｍ． Ｌｉｎｄｅｒ， Ｅ． Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ， ａｎｄ Ｔ． Ｒｅｉｎｉｋａｉｎｅｎ， Ｔ． Ｔ． Ｔｅｅｒｉ． １９９７． Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｉ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ： ａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５７： ４９−５７．
４６． Ｔｏｍｍｅ， Ｐ． Ｎ．， Ｒ． Ｇｉｌｋｅｓ， Ｃ． Ｍ． Ｊｒ． Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ． Ｊ． Ｗａｒｒｅｎ ａｎｄ Ｄ． Ｇ． Ｋｉｌｂｕｒｎ． １９９４． Ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｘｙｌａｎａｓｅ／ｃｅｌｌｕｌａｓｅ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ７： １１７−１２３．
４７． Ｔｏｐａｋａｓ， Ｅ．， Ｈ． Ｓｔａｍａｔｉｓ， Ｐ． Ｂｉｅｌｙ， ａｎｄ Ｐ． Ｃｈｒｉｓｔａｋｏｐｏｕｌｏｓ． ２００４． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｙｐｅ Ｂ ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ （ＳｔＦＡＥ−Ａ） ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６３： ６８６−６９０．
４８． ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ， Ｗ．， Ｉ． Ｅ． Ｍａｔｔｅｒｎ， Ｃ． Ｍ． ｖａｎ Ｚｅｉｊｌ， Ｐ． Ｈ． Ｐｏｕｗｅｌｌｓ， ａｎｄ Ｃ． Ａ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ． １９８７． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｙｒＧ ｇｅｎｅ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０６： ７１−７５．
４９． Ｗｏｏｄ， Ｔ． Ｍ． １９８８． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ， ａｍｏｒｐｈｏｕｓ， ａｎｄ ｄｙｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １６０： １９−２５．
５０． Ｙｕ， Ｐ．， Ｄ． Ｄ． Ｍａｅｎｚ， Ｊ． Ｊ． ＭｃＫｉｎｎｏｎ， Ｖ． Ｊ． Ｒａｃｚ， ａｎｄ Ｄ． Ａ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ． ２００２． Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｆｅｒｕｌｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｏａｔ Ｈｕｌｌｓ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｆｅｒｕｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｓｔｅｒａｓｅ ａｎｄ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｘｙｌａｎａｓｅ， Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ５０： １６２５ −１６３０．
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学処理した多機能型の植物細胞壁分解酵素の構築及び過剰産生、並びに農業副産物の価値化のための改善された酵素ツールとしてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
農業廃棄物は、リグノセルロースの生物変換のための重要な再生可能な資源である。毎日、食品産業の生産により、除去すべき汚染廃棄物と見なされるこれらの多くの副産物が発生している。バイオテクノロジー分野において、これらの副産物の価値化について多くの研究が行われている。価値化可能な成分の中で、フェルラ酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシ−桂皮酸）は、植物界で最も豊富なヒドロキシ桂皮酸であると見出された非常に魅力的なフェノール化合物である。例えば、フェルラ酸は抗酸化剤（２３）として使用するか、又は、微生物変換により、食品産業、化粧品産業及び医薬産業における高価な香料として「天然の」バニリンに変換することができる（４、２６）。農業副産物の中で、トウモロコシふすま及び小麦ふすまは、細胞壁中に大量の、すなわちそれぞれ３％及び１％（ｗ／ｗ）のフェルラ酸を含んでいるため、潜在的な基質である（４３）。植物生理学においてフェルラ酸は、植物細胞壁の重要な物理的特性及び化学的特性を有する、鍵となる構成成分である。実際、フェルラ酸はリグニンと炭水化物との間又は炭水化物同士の間の架橋剤として作用することができ（１６）、細胞壁の完全性に影響を与え、それにより微生物酵素による生分解性の程度を低減する（６）。
【０００３】
微生物は、フェルラ酸を植物細胞壁の多糖に連結しているエステル結合を加水分解することができるフェルロイルエステラーゼ（ＥＣ３．１．１．７３）等の酵素を進化させた。これらの酵素により、他のリグノセルロース分解性酵素が多糖骨格へ接近することが容易になる（概説として１２を参照されたい）。これまでの研究により、フェルロイルエステラーゼはβ−（１，４）−エンドキシラナーゼ等の主鎖分解酵素と相乗的に作用して、植物細胞壁からのフェルラ酸の放出を増大させ、そして応用するために必要な十分な量を産生させることが示されている（２、１５、５０)。黒こうじ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）等の糸状菌は、植物細胞壁分解酵素を産生することがよく知られている。黒こうじ菌由来のフェルロイルエステラーゼをコードする二つの異なる遺伝子は既にクローンニングされており（１０、１１）、これらの対応する組換えタンパク質はメタノール資化性酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）及び黒こうじ菌で過剰産生されている（２４、３０、４１）。幾つかの菌類性フェルロイルエステラーゼが精製され解析されたが（１８、４７）、いずれの遺伝子もさらにクローニングはされなかった。以前の研究により、ファミリー１の糖質結合モジュール（ＣＢＭ）に非常に類似したＣ末端ドメインを有する第一の菌類性シンナモイルエステラーゼ（Ｂ型）の、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）からの単離が報告されている（２７）。嫌気性微生物及び好気性微生物由来のグリコシル加水分解酵素の多くはモジュール構造を有している。触媒ドメインに加えて、一つ又は複数の非触媒性ＣＢＭが、Ｎ末端もしくはＣ末端のいずれか又はその両方に位置し得る。ＣＢＭは、類似のアミノ酸配列及び三次元構造によって複数のファミリーに分類されている（ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ−ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。ＣＢＭは不溶性基質の分解に対して主な役割を果たす（４５）。例えば、ＣＢＭは触媒コアドメインを基質の近傍に維持することに関与し、接触の長さと緊密性を増大させる。さらに場合によっては、ＣＢＭは、集合したセルロース鎖の水素結合を弱めることにより、セルロースミクロフィブリル構造を変化させることもできる（１３、１４、３３）。
【非特許文献１】ｄｅ Ｖｒｉｅｓ Ｒ． Ｐ．， Ｂ． Ｍｉｃｈｅｌｓｅｎ， Ｃ． Ｈ． Ｐｏｕｌｓｅｎ．， Ｐ． Ａ． Ｋｒｏｏｎ， Ｒ． Ｈ． Ｈ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｕｖｅｌ， Ｃ． Ｂ． Ｆａｕｌｄｓ， Ｇ． Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， Ｊ． Ｐ． Ｔ． Ｗ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｍｂｅｒｇｈ， ａｎｄ Ｊ． Ｖｉｓｓｅｒ． １９９７． Ｔｈｅ ｆａｅＡ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｎｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ ｅｎｃｏｄｅ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３： ４６３８−４６４４．
【非特許文献２】Ｋｒｏｏｎ， Ｐ． Ａ．， Ｇ． Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， Ｎ． Ｍ． Ｆｉｓｈ， Ｄ． Ｂ． Ａｒｃｈｅｒ， ａｎｄ Ｎ． Ｊ． Ｂｅｌｓｈａｗ． ２０００． Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ｗｈｉｃｈ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｓ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７： ６７４０−６７５２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、菌類、例えば黒こうじ菌の遊離植物細胞壁分解酵素と融合植物細胞壁分解酵素との間の相乗効果についての考察に関する。遺伝子工学処理された細菌性セルロソームに基づいた近年の研究において、二つの触媒成分の物理的近接により、扱い難い基質に対する相乗作用の増大が観察された（１７）。これに基づき、本発明者は、菌類性フェルロイルエステラーゼと第二の酵素がグラフトされるクロストリジムドッケリンドメインとを細菌性のＣＢＭを有する足場タンパク質上に結びつけたキメラタンパク質を設計した（３１）。しかし、組換えタンパク質の産生収率は工業規模での試験的応用に十分な高さではなく、新たな戦略が構想された。本発明の研究において、本発明者は、高度にグリコシル化されたリンカーペプチドにより分離される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ（ＦＡＥＡ）及びキシラナーゼＢ（ＸＹＮＢ）の二つの菌類性酵素を融合し、フェルラ酸放出の効率が増大した二機能性酵素（ＦＬＸ）を得た。さらに本発明者は、第二の構築物において、この二機能性酵素のＣ末端に黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ（ＣＢＨＢ）由来の菌類性ＣＢＭも付加した（ＦＬＸＬＣ）。両ハイブリッド酵素は黒こうじ菌で良好に産生され、生化学的観点及び動態学的観点について十分に解析され、そして最終的に、天然基質であるトウモロコシふすま及び小麦ふすまからフェルラ酸を放出するために使用された。この研究の目的は、遊離酵素又は融合酵素を用いてフェルラ酸放出の効率を比較して、菌類性酵素の物理的近接によって生じる酵素の相乗効果を研究することであった。さらに、二機能性酵素のＣ末端でのＣＢＭ付加の効果をＦＬＸＬＣ構築物において研究した。
【０００５】
本発明は、遊離植物細胞壁分解酵素の使用と比較した場合の、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素の単一のキメラタンパク質における、融合の相乗効果の実証に依るものである。
【０００６】
したがって、本発明の主な目的は、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素間の新規な融合タンパク質を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、上記融合タンパク質を、基質である植物に、また有利には農業副産物に適用することによって、植物細胞壁に連結した目的の化合物を調製するための新規な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、植物もしくは野菜の副産物から植物細胞壁に存在する目的の化合物を調製する枠組みにおいて、又はパルプもしくは紙の漂白の枠組みにおいて、植物細胞壁分解のプロセスを実施するための、Ｃ末端の糖質結合モジュール（ＣＢＭ）を含まない少なくとも二つの植物細胞壁分解酵素、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質の使用に関するものであり、前記酵素及びＣＢＭは、菌類の天然タンパク質又はその変異型に対応する組換えタンパク質である。
【０００９】
「植物細胞壁分解酵素」という表現は、細胞壁の成分、例えばセルロース、ヘミセルロース及びリグニンの消化を行うことが可能な酵素を表す。上記融合タンパク質における植物細胞壁分解酵素は同一であるか、又は互いに異なる。
【００１０】
「Ｃ末端の糖質結合モジュール」という表現は、その関連する酵素をセルロースに標的化する、セルロースへの親和性を有する分子を表す。
【００１１】
本発明は、より詳細には、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、
−セロビオヒドロラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びエキソグルカナーゼ等のセルラーゼ、又はβ−グルコシダーゼ、
−キシラナーゼ等のヘミセルラーゼ、
−ラッカーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、多機能型ペルオキシダーゼ等の、リグニンを分解することが可能なリグニナーゼ、又は、セロビオースデヒドロゲナーゼ及びアリールアルコールオキシダーゼ等の補助的な酵素、
−フェルロイルエステラーゼ、シンナモイルエステラーゼ、及びクロロゲン酸加水分解酵素等の、フェルラ酸等の桂皮酸を放出すること及びヘミセルロース鎖間のジフェルラ酸架橋を加水分解することが可能なシンナモイルエステル加水分解酵素
から選択される加水分解酵素である、上記のような使用に関する。
【００１２】
本発明は、より詳細には、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素がフェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼから選択される、上記のような使用に関する。
【００１３】
本発明はより詳細には、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、
＊子嚢菌、例えばアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株、またより詳細には黒こうじ菌、
＊担子菌、例えばピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）株又はハロシフィナ（Ｈａｌｏｃｉｐｈｉｎａ）株、またより詳細にはシュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、ピクノポラス・サンギネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｓａｎｇｕｉｏｎｅｕｓ）、又はハロシフィナ・ビロサ（Ｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ ｖｉｌｌｏｓａ）
から選択される菌類に由来する天然酵素又はその変異型に対応する、上記のような使用に関する。
【００１４】
本発明は、より詳細には、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、黒こうじ菌等のアスペルギルス株由来の天然酵素又はその変異型に対応する、上記のような使用に関する。
【００１５】
本発明は、より詳細には、植物細胞壁分解酵素の少なくとも一つが、
−配列番号１で表される核酸でコードされる、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ、又は
−配列番号３で表される核酸でコードされる、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢ
から選択されるフェルロイルエステラーゼである、上記のような使用に関する。
【００１６】
本発明は、より詳細には、植物細胞壁分解酵素のうちの少なくとも一つが、配列番号５で表される核酸でコードされる配列番号６で表される、黒こうじ菌のキシラナーゼＢ等の上記のキシラナーゼである、上記のような使用に関する。
【００１７】
本発明は、より詳細には、ＣＢＭであるタンパク質が、子嚢菌、例えばアスペルギルス株、またより詳細には黒こうじ菌から選択される菌類に由来する天然酵素又はその変異型に存在するＣＢＭから選択される、上記のような使用に関する。
【００１８】
本発明に従って使用され得るＣＢＭはファミリー１のものである。
【００１９】
本発明は、より詳細には、ＣＢＭが、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号７で表される核酸でコードされる、配列番号８で表されるＣＢＭである、上記のような使用に関する。
【００２０】
本発明は、自身に含まれるタンパク質の少なくとも二つの間にリンカーを含む融合タンパク質の上記のような使用にも関するものであり、当該リンカーは１０〜１００アミノ酸、有利には約５０アミノ酸のポリペプチドである。
【００２１】
本発明は、より詳細には、自身に含まれるタンパク質のそれぞれの間にリンカーが包まれる融合タンパク質の上記のような使用に関する。
【００２２】
本発明は、より詳細には、リンカーが、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号９で表される核酸でコードされる配列番号１０で表される配列等の、高度にグリコシル化されたポリペプチドである、上記のような使用に関する。
【００２３】
本発明は、より詳細には、フェルロイルエステラーゼとキシラナーゼ、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関する。
【００２４】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ又は配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関する。
【００２５】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質の上記のような使用に関するものであり、当該融合タンパク質は、二つの前記タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１２で表される。
【００２６】
本発明は、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質の、上記のような使用にも関する。
【００２７】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関するものであり、当該融合タンパク質は、三つの前記タンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１４で表される。
【００２８】
本発明は、より詳細には、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関するものであり、当該融合タンパク質は、二つの前記タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１６で表される。
【００２９】
本発明は、より詳細には、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関する。
【００３０】
本発明は、より詳細には、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質の、上記のような使用に関するものであり、当該融合タンパク質は、三つの前記タンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１８で表される。
【００３１】
本発明は、以下の目的の化合物、
−バイオエタノール、
−抗酸化剤、例えば、フェルラ酸、又は桂皮酸及びヒドロキシチロソールであるカフェ酸、又は没食子酸、
−香料、例えば、フェルラ酸又はｐ−クマル酸の生体内変換によりそれぞれ得られる、バニリン又はｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド
の調製の枠組みにおいて、又はパルプ及び紙の漂白の枠組みにおいて、植物細胞壁分解のプロセスを行うための、上記のような使用に関する。
【００３２】
本発明は、前記融合タンパク質が、基質である植物もしくは野菜の副産物に直接加えられるか、又は前記融合タンパク質をコードする核酸で形質転換された上記の菌類等の菌類細胞、より詳細には黒こうじ菌及びシュタケによって前記融合タンパク質が分泌され、前記菌類が、基質である前記植物もしくは野菜の副産物と接触させられる、上記のような使用に関する。
【００３３】
本発明は、植物又は野菜の副産物から植物細胞壁に存在する目的の化合物を調製するための、植物細胞壁を分解する方法であって、
−植物又は野菜の副産物又は産業廃棄物を上記の融合タンパク質又は上記の形質転換された菌類細胞によって酵素処理する工程、
−任意選択で、融合タンパク質の作用と組み合わせた蒸気爆発を用いて植物又は野菜の副産物を物理的に処理する工程、
−任意選択で、適切な微生物又は酵素により、上記酵素処理中に細胞壁から放出された化合物を生体内変換する工程、
−上記酵素処理中に細胞壁から放出された、又は上記生体内変換工程中に得られた目的の化合物を回収し、必要であれば精製する工程
を含むことを特徴とする方法にも関する。
【００３４】
好ましくは、本発明による方法において融合タンパク質で処理される植物は、サトウダイコン、コムギ、トウモロコシ、イネ、又は製紙業に使用される全ての樹木から選択される。
【００３５】
好ましくは、本発明による方法において融合タンパク質で処理される野菜の副産物又は産業廃棄物は、麦わら、トウモロコシふすま、小麦ふすま、米ぬか、リンゴの絞りかす、コーヒーかす、コーヒーの副産物、オリーブ工場の排水から選択される。
【００３６】
本発明は、より詳細には、目的の化合物として抗酸化剤を調製するための上記のような方法であって、
−ＣＢＭを含まない細胞壁分解酵素、すなわちフェルロイルエステラーゼＡ、フェルロイルエステラーゼＢ、クロロゲン酸ヒドロラーゼ、キシラナーゼのうちの少なくとも二つを含む融合タンパク質による植物又は野菜の副産物の処理であって、融合タンパク質が好ましくは、フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、クロロゲン酸ヒドロラーゼ−キシラナーゼから選択される処理、
−前記植物又は野菜の副産物の細胞壁から放出された抗酸化剤の回収、また必要であればその精製
を含む方法に関する。
【００３７】
本発明は、より詳細には、目的の抗酸化剤としてフェルラ酸等の桂皮酸を調製するための上記のような方法に関するものであり、使用される融合タンパク質は上記のように、フェルロイルエステラーゼとキシラナーゼ、及び任意選択でＣＢＭを含み、より詳細には、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１８から選択される。
【００３８】
有利には、フェルラ酸等の抗酸化剤の調製の枠組みにおいて、上記の融合タンパク質で処理される植物がサトウダイコン、コムギ、トウモロコシ、イネから選択されるか、又は上記の融合タンパク質で処理される野菜の副産物もしくは産業廃棄物が麦わら、トウモロコシふすま、小麦ふすま、米ぬか、リンゴの絞りかす、コーヒーかす、コーヒーの副産物、オリーブ工場の排水から選択される。
【００３９】
本発明は、目的の化合物として香料を調製するための上記のような方法であって、
−上記の抗酸化剤の調製の枠組みで使用した融合タンパク質による、植物又は野菜の副産物の処理、
−黒こうじ菌等の子嚢菌又はシュタケ等の担子菌から選択される微生物により産生された無規定の酵素と接触させることによる、上記工程中に細胞壁から放出された化合物の生体内変換、
−上記生体内変換の工程で得られた香料の回収、また必要であればその精製
を含む方法にも関する。
【００４０】
本発明は、より詳細には、目的の香料としてバニリンを調製するための上記のような方法に関するものであり、使用される融合タンパク質は、上記のフェルラ酸の調製に使用されるものから選択され、生体内変換の工程は、細胞壁から放出されるフェルラ酸を黒こうじ菌等の子嚢菌又はシュタケ等の担子菌により産生される無規定の酵素と接触させることによって行われる。
【００４１】
有利には、バニリン等の香料の調製において使用される植物及び野菜の副産物又は産業廃棄物は、抗酸化剤の調製のための上記のものから選択される。
【００４２】
本発明は、目的の化合物としてバイオエタノールを調製するための上記のような方法であって、
−ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素、すなわちセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、アリールアルコールオキシダーゼのうちの少なくとも二つを含む融合タンパク質による、植物又は野菜の副産物の処理であって、融合タンパク質が好ましくは、エンドグルカナーゼ−エキソグルカナーゼ、ラッカーゼ−キシラナーゼ、キシラナーゼ−セルラーゼ（エンドグルカナーゼ又はエキソグルカナーゼ）から選択される処理であり、有利には前記植物又は野菜の副産物の物理的処理と組み合わせられる処理、
−セルラーゼ、ヘミセルラーゼもしくはエステラーゼから選択される酵素、又は黒こうじ菌もしくはセルラーゼ生産性糸状菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）等の子嚢菌から選択される微生物と組み合わせた、上記の融合タンパク質の使用による、又は融合タンパク質を分泌する形質転換された菌類による、上記工程から得られる処理された植物又は野菜の副産物の、発酵性糖への生体内変換、
−酵母による、発酵性糖のバイオエタノールへの生体内変換
を含む方法にも関する。
【００４３】
本発明は、より詳細には、融合タンパク質がエンドグルカナーゼ−エキソグルカナーゼ、ラッカーゼ−キシラナーゼ、キシラナーゼ−セルラーゼ（エンドグルカナーゼ又はエキソグルカナーゼ）から選択される、その後のバイオエタノールの製造のための発酵性糖を調製するための上記のような方法に関する。
【００４４】
有利には、バイオエタノールの調製の枠組みにおいて使用される植物及び野菜の副産物又は産業廃棄物は、樹木、一年生植物、又は農業副産物から選択される。
【００４５】
本発明は、パルプ及び紙を漂白する方法であって、
−ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素、すなわちフェルロイルエステラーゼＡ、フェルロイルエステラーゼＢ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、多機能型ペルオキシダーゼ、又はセロビオースデヒドロゲナーゼのうちの少なくとも二つを含む融合タンパク質と組合せた、植物又は野菜の副産物の化学的及び物理的処理、
−任意選択で、ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素、すなわちフェルロイルエステラーゼＡ、フェルロイルエステラーゼＢ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、多機能型ペルオキシダーゼ、又はセロビオースデヒドロゲナーゼのうちの少なくとも二つを含む融合タンパク質を分泌する形質転換された菌類による、上記工程で得られる処理された植物又は野菜の副産物のバイオパルプ化、
−ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素、すなわちフェルロイルエステラーゼＡ、フェルロイルエステラーゼＢ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、多機能型ペルオキシダーゼ、又はセロビオースデヒドロゲナーゼのうちの少なくとも二つを含む融合タンパク質による、上記工程で得られる処理された植物又は野菜の副産物のバイオ漂白
を含む方法にも関する。
【００４６】
本発明は、より詳細には、植物及び野菜の副産物の処理の第一の工程で使用される融合タンパク質が、フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、ラッカーゼ−キシラナーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ−マンガンペルオキシダーゼから選択され、バイオパルプ化の工程で使用される形質転換された菌類により分泌される融合タンパク質が、シュタケ又は黒こうじ菌により過剰生成された、フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、ラッカーゼ−キシラナーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ−マンガンペルオキシダーゼから選択され、バイオ漂白の工程で使用される融合タンパク質が、フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＡ−キシラナーゼ、フェルロイルエステラーゼＡ−フェルロイルエステラーゼＢ−キシラナーゼ、ラッカーゼ−キシラナーゼ、アリールアルコールオキシダーゼ−マンガンペルオキシダーゼから選択される、パルプ及び紙の漂白のための上記のような方法に関する。
【００４７】
本発明は、Ｃ末端の糖質結合分子（ＣＢＭ）を含まない少なくとも二つの植物細胞壁分解酵素、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質に関するものであり、前記酵素及びＣＢＭは、上記のような菌類の天然タンパク質又はその変異型に対応する組換えタンパク質である。
【００４８】
本発明は、より詳細には、自身に含まれるタンパク質の少なくとも二つの間にリンカーを含む、上記のような融合タンパク質に関するものであり、前記リンカーは上記のようなものである。
【００４９】
本発明は、より詳細には、フェルロイルエステラーゼとキシラナーゼ、及び任意選択でＣＢＭの間の、上記のような融合タンパク質に関する。
【００５０】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ又は配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の、上記のような融合タンパク質に関する。
【００５１】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の上記のような融合タンパク質に関するものであり、当該融合タンパク質は、二つの前記タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１２で表される。
【００５２】
本発明は、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢ、及び黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭの間の、上記のような融合タンパク質にも関する。
【００５３】
本発明は、より詳細には、配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢ、及び配列番号８で表されるＣＢＭの間の、上記のような融合タンパク質に関するものであり、当該融合タンパク質は、三つの前記タンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１４で表される。
【００５４】
本発明は、より詳細には、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の上記のような融合タンパク質に関するものであり、当該融合タンパク質は、二つの前記タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１６で表される。
【００５５】
本発明は、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢ、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢ、及び黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭの間の、上記のような融合タンパク質にも関する。
【００５６】
本発明は、より詳細には、配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢ、配列番号４で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢ、及び配列番号６で表されるＣＢＭの間の、上記のような融合タンパク質に関するものであり、当該融合タンパク質は、三つの前記タンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１８で表される。
【００５７】
本発明は、上記のような融合タンパク質をコードする核酸にも関する。
【００５８】
本発明は、より詳細には、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、及び配列番号１８で表される融合タンパク質をそれぞれコードする、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７で表される核酸に関する。
【００５９】
本発明は、配列番号１の配列が、配列番号２４に対応するプレフェルロイルエステラーゼＡをコードする配列番号２３の配列に置き換えられている、配列番号１１及び配列番号１３に対応する配列番号１９及び配列番号２１で表される核酸にも関するものであり、当該配列番号１９及び配列番号２１の核酸は、配列番号２０及び配列番号２２の配列に対応する融合プレタンパク質をコードする。
【００６０】
本発明は、配列番号３の配列が、配列番号３０に対応するプレフェルロイルエステラーゼＢをコードする配列番号２９の配列に置き換えられている、配列番号１５及び配列番号１７に対応する、配列番号２５及び配列番号２７で表される核酸にも関するものであり、当該配列番号２５及び配列番号２７の核酸は、配列番号２０及び配列番号２２の配列に対応する融合のプレタンパク質をコードする。
【００６１】
本発明は、上記のような核酸で形質転換したｐＡＮ５２．３等のベクターにも関する。
【００６２】
本発明は、上記のようなベクターを使用することによって上記のような核酸で形質転換した、子嚢菌又は担子菌、より詳細には黒こうじ菌又はシュタケ等の宿主細胞にも関する。
【００６３】
本発明は、上記のような宿主細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養、培養中に前記宿主細胞により産生された融合タンパク質の回収、及び必要であればその精製を含む、上記のような融合タンパク質を調製する方法にも関する。
【００６４】
本発明は、キメラ酵素ＦＬＸ（配列番号１２）及びＦＬＸＬＣ（配列番号１４）の調製及び特性についての以下の詳細な記載でさらに説明される。
【００６５】
二つのキメラ酵素ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣを設計し、黒こうじ菌で良好に過剰産生させた。ＦＬＸ構築物は、黒こうじ菌のエンドキシラナーゼＢ（ＸＹＮＢ）に融合したフェルロイルエステラーゼＡ（ＦＡＥＡ）をコードする配列から成る。Ｃ末端の糖質結合モジュール（ＣＢＭファミリー１）をＦＬＸにグラフトし、第二のハイブリッド酵素ＦＬＸＬＣを生成した。各パートナーの間に、構築物を安定化するための高度にグリコシル化されたリンカーを含めた。ハイブリッドタンパク質を均一に精製し、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの分子量をそれぞれ７２ｋＤａ及び９７ｋＤａと推定した。ハイブリッド酵素の完全性を、ＦＡＥＡ及びポリヒスチジンタグに対する抗体を使用して、単一形態を示す免疫検出で確認した。二機能性酵素の各触媒モジュールの物理化学的特性は、遊離酵素のそれに相当する。さらに、本発明者は、ＦＬＸＬＣが微結晶性セルロース（アビセル）に強い親和性を示し、結合パラメータが、解離定数はＫｄ＝９．９×１０−８Ｍに相当し、結合能はアビセル１ｇ当たり０．９８μｍｏｌに相当することを確認した。両方の二機能性酵素を、天然基質であるトウモロコシふすま及び小麦ふすまからフェルラ酸を放出するそれらの能力について研究した。遊離酵素ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢと比較して、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣを使用した方が、両基質で高い相乗効果が得られた。さらに、基質としてトウモロコシふすまを使用したフェルラ酸の放出では、ＦＬＸと比較してＦＬＸＬＣで相乗効果が増大し、これにより、ＣＢＭの正の役割が確認された。結論として、これらの結果は、黒こうじ菌由来の天然で遊離している複数の細胞壁加水分解酵素とＣＢＭの、二機能性酵素への融合により、複雑な基質の分解に対する相乗効果が増大することを示した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
材料及び方法
【００６７】
株及び培養培地
大腸菌ＪＭ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ）をベクターの構築及び増殖に使用し、黒こうじ菌株Ｄ１５＃２６（ｐｙｒｇ−）（２２）を組換えタンパク質の産生に使用した。ｐｙｒＧ遺伝子及び発現カセットＦＬＸ又はＦＬＸＬＣ（図１）をそれぞれ含むベクターによる同時形質転換の後、黒こうじ菌を、選択のために、７０ｍＭのＮａＮＯ３、７ｍＭのＫＣｌ、１１ｍＭのＫＨ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、グルコース１％（ｗ／ｖ）、及び微量元素［１０００×ストック溶液：７６ｍＭのＺｎＳＯ４、２５ｍＭのＭｎＣｌ２、１８ｍＭのＦｅＳＯ４、７．１ｍＭのＣｏＣｌ２、６．４ｍＭのＣｕＳＯ４、６．２ｍＭのＮａ２ＭｏＯ４、１７４ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）］を含む（ウリジンを含まない）固体最少培地で成長させた。液体培地における組換えタンパク質の産生について形質転換体をスクリーニングするために、７０ｍＭのＮａＮＯ３、７ｍＭのＫＣｌ、２００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、グルコース６％（ｗ／ｖ）及び微量元素を含む１００ｍｌの培養培地を、５００ｍＬのバッフルフラスコにおいて１×１０６胞子／ｍｌで培養した。黒こうじ菌ＢＲＦＭ１３１（Ｂａｎｑｕｅ ｄｅ Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｓ Ｆｏｎｇｉｑｕｅｓ ｄｅ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ）をゲノムＤＮＡの抽出に使用し、得られたＤＮＡをリンカー−ｃｂｍ配列のＰＣＲ増幅法のための鋳型として使用した。
【００６８】
発現ベクターの構築と菌類の形質転換
黒こうじ菌由来のＦＡＥＡ（配列番号１９、Ｙ０９３３０）、ＸＹＮＢ（配列番号５、ＡＹ１２６４８１）、及びＣＢＭ（配列番号７、ＡＦ１５６２６９）をコードする配列の融合を、オーバーラップ伸長ＰＣＲ法（２５）によって行った。黒こうじ菌のＦＡＥＡコード領域を、フォワードプライマー
及びリバースプライマー５’−ＡＣＴＧＧＡＧＴＡＡＧＴＣＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＣＴＣＣＧＣＴ−３’を使用して、ｃＤＮＡから増幅した（４１）。ＣＢＨＢのリンカー領域をコードするゲノムＤＮＡ（配列番号９、ＡＦ１５６２６９）を、フォワードプライマー５’−ＡＧＣＧＧＡＧＣＴＴＧＴＡＣＴＴＧＧＧＧＣＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＡＧＴ−３’及びリバースプライマー５’−ＧＧＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧＴＣＧＡＡＣＴ−３’を使用して、黒こうじ菌ＢＲＦＭ１３１から増幅した。最後に、ｘｙｎＢ遺伝子を、フォワードプライマー５’−ＡＧＴＴＣＧＡＣＡＴＣＧＧＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＣＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＣＣ−３’及びリバースプライマー
によって、ｃＤＮＡから増幅した（２９）（Ｈｉｓタグは全ての配列において点線で示されている）。得られたオーバーラップしている断片を混合し、融合配列を両方の外部プライマーを使用して一工程反応で合成した。構築物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローニングし、クローニングされたＰＣＲ産物を配列決定して確認した。融合断片を、線状化したＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ内にクローニングし、ｐＡＮ５２．３を脱リン酸化して、ｐＦＬＸプラスミドを得た（図１、Ａ）。フォワードプライマー
及びリバースプライマー５’−ＡＣＴＧＧＡＧＴＡＡＧＴＣＧＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＡＣＧＡ−３’を用いる、組換えＦＡＥＡ−リンカー−ＸＹＮＢ配列をコードする断片の増幅のための鋳型としてｐＦＬＸを使用して、ＦＬＸＬＣプラスミドを構築した。黒こうじ菌ＢＲＦＭ１３１由来のゲノムＤＮＡを、利用可能なｃｂｈＢ配列（ＡＦ１５６２６９）から設計した二つの特異的なプライマー、フォワードプライマー５’−ＴＣＧＴＣＣＡＴＣＡＣＴＧＴＴＣＡＧＧＧＣＴＣＧＡＣＴＴＡＣＴＣＣＡＧＴ−３’及びリバースプライマー
を用いるリンカー−ＣＢＭ配列のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。融合断片を、両方の外部プライマーを使用してオーバーラップ伸長ＰＣＲ法で合成し、配列決定によって管理し、ｐＡＮ５２．３にクローニングして、ｐＦＬＸＬＣベクターを得た（図１、Ｂ）。両発現ベクターにおいて、アスペルギルス・ニダランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｇｐｄＡ）のプロモーター、ｇｐｄＡのｍＲＮＡの５’非翻訳領域、及びアスペルギルス・ニダランスのｔｒｐＣターミネーターを、組換え配列の発現を誘発するために使用した。さらに、ＦＡＥＡのシグナルペプチド（２１アミノ酸）を、両組換えタンパク質の分泌を標的化するために使用した。
【００６９】
菌類の同時形質転換の両者を、ｐＦＬＸ発現ベクター又はｐＦＬＸＬＣ発現ベクターをそれぞれと、ｐｙｒＧ選択マーカーを含むｐＡＢ４−１（４８）とを１０：１の比で使用して、Ｐｕｎｔ及びｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ（３９）によって記載されているようにして行った。さらに、黒こうじ菌Ｄ１５＃２６を、対照実験のための発現ベクターを用いずにｐｙｒＧ遺伝子で形質転換した。同時形質転換体を、選択最少培地プレート（ウリジンを含まない）におけるウリジン原栄養性について選択し、３０℃で８日間インキュベートした。形質転換体をスクリーニングするために、各構築物についての４０個の個々のクローンを培養し、毎日確認した。
【００７０】
フェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼの活性のスクリーニング
培養物を、振盪培養器（１３０ｒｐｍ）において３０℃で１４日間観察した。ｐＨは１Ｍのクエン酸溶液で毎日５．５に調整した。各培養条件を二重で実施した。液体培養培地からアリコート（１ｍｌ）を毎日回収し、菌糸体を濾過により取り除いた。フェルラ酸メチル（ＭＦＡ）を基質として使用してこれまでに記載されたようにエステラーゼ活性を評価し（４０）、キシラナーゼの活性を、Ｂａｉｌｅｙらの方法（１）に基づいた、１％（ｗ／ｖ）カバノキのキシランから放出されたキシロースの量の測定によって算出した。これらの酵素を、キシラン溶液［カバノキ由来の１％（ｗ／ｖ）キシラン、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）］と共に４５℃で５分間インキュベートした。放出された還元糖を、標準としてキシロースを用いてＤＮＳ法によって求めた（３５）。酵素及び基質のサンプルにおける任意のバックグラウンドを補正するためにブランクを用いて全てのアッセイを行った。
【００７１】
活性はｎｋａｔａｌ（ｎｋａｔ）で表され、１ｎｋａｔは、規定の条件下で１秒当たり１ｎｍｏｌのフェルラ酸又は１ｎｍｏｌの還元糖の放出を触媒する酵素の量として定義される。それぞれの実験は二重で行い、測定は三重で行い、標準偏差は、エステラーゼ活性については平均の２％未満、キシラナーゼ活性については５％未満であった。
【００７２】
組換えタンパク質の精製
各構築物の最良の単離物をスクリーニング手順と同じ条件で播種した。培養物を成長の８日後に採取し、濾過し（０．７μｍ）、ポリエーテルスルホン膜（３０ｋＤａのカットオフ分子量）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して限外濾過により濃縮した。濃縮された画分を、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）結合緩衝液に対して透析し、Ｈｉｓタグを付けられたタンパク質の精製を、キレート化セファロース高速カラム（１３×１５ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った（３８）。遊離タンパク質に関して、ｈｉｓタグ配列を含む組換えキシラナーゼＢも、前述したようにキレート化セファロース高速カラムで精製した（２９）。最後に、組換えＦＡＥＡを前述したようにフェニルセファロースカラムを使用して一工程手順で精製した（４１）。
【００７３】
組換えタンパク質の解析
タンパク質の分析及びＮ末端アミノ酸配列の決定
標準としてウシ血清アルブミンを用いて、Ｌｏｗｒｙら（３４）に従ってタンパク質濃度を求めた。タンパク質の産生及び精製を、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１１％ポリアクリルアミド）スラブゲルを使用して確認した。Ｎ末端配列を、ポリフッ化ビニリデン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にエレクトロブロットしたＦＬＸ及びＦＬＸＬＣのサンプル（１００μｇ）からエドマン分解に従って決定した。分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４７０Ａで行った。
【００７４】
ウェスタンブロット分析
全タンパク質及び精製タンパク質を、Ｌａｅｍｍｌｉ（２８）に従って１１％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、室温で４５分間、ＢＡ８５ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｕｅｌｌ）にエレクトロブロットした。膜を４℃で一晩、ブロッキング溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び２％（ｖ／ｖ）ミルク（ｐＨ７．５））中でインキュベートした。それから、膜をＴＢＳ−０．２％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、抗ＦＡＥＡ血清を１／８０００の希釈率で含むか、又は抗ポリヒスチジン−ペルオキシダーゼ血清（Ｓｉｇｍａ）を含む、ブロッキング溶液で処理した。抗ＦＡＥＡ抗体については、その後、膜を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と結合したヤギ抗ウサギ免疫グロビンＧとインキュベートした。製造業者の手順に従って、化学発光ウェスタンブロッティングキット（Ｒｏｃｈｅ）によってシグナルを検出した。
【００７５】
組換えタンパク質の温度及びｐＨの安定性
精製した組換えタンパク質の熱安定性を３０〜７０℃の範囲で試験した。アリコートを指定温度でプレインキュベートし、０℃で冷却した後、標準的な条件下で先に示したようにエステラーゼ及びキシラナーゼの活性を評価した。二機能性タンパク質の完全性を確認するために、インキュベーションの後にサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。タンパク質の安定性に対するｐＨの効果を、精製した組換えタンパク質をリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ２．５〜７．０）及びリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０〜８．０）においてインキュベートして試験した。全てのインキュベートは９０分間行い、それからアリコートを標準的な反応混合物に移し、残存している活性の量を求めた。プレインキュベーションの前に求めた活性を１００％とした。
【００７６】
エステラーゼ及びキシラナーゼの活性に対する温度及びｐＨの効果
用いる条件下での最適な温度を求めるために、精製した組換えタンパク質のアリコートを様々な温度（３０〜７０℃）でインキュベートし、エステラーゼ及びキシラナーゼの活性を評価した。標準的な条件を用いて、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ２．５〜７．０）及びリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を使用して最適ｐＨを求めた。
【００７７】
セルロース結合能及び解離定数の決定
精製したＦＬＸ及びＦＬＸＬＣのサンプルを、２５ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）中のセルロースを含む２ｍｌのマイクロ遠心チューブに加え、最終容量を１ｍｌとした。ＦＬＸ（対照）及びＦＬＸＬＣの、アビセルＰＨ１０１セルロース（Ｆｌｕｋａ）への結合能を、様々な量の組換えタンパク質（３０〜１７０μｇ）及び一定量のセルロース（２ｍｇ）を使用して求めた。両組換えタンパク質をセルロースと共に４℃で１時間、ゆっくりと撹拌しながらインキュベートした。遠心分離（４０００×ｇ、１０分間）の後、上清液に残ったタンパク質（遊離酵素）の量を求めた。セルロースに結合した酵素の量を、加えた全量から遊離ＦＬＸ又は遊離ＦＬＸＬＣの量を差し引くことによって算出した。「１／遊離酵素」に対する「１／結合した酵素」の両逆数プロットを描くことによってデータを分析した。解離定数は、１／Ｂ＝（Ｋｄ／Ｂｍａｘ×１／Ｆ）＋１／Ｂｍａｘ（式中、Ｂは結合した酵素の濃度であり、Ｆは遊離酵素の濃度である）として定義される（２１、３７）。
【００７８】
適用試験
酵素的加水分解
小麦ふすま（ＷＢ）及びトウモロコシふすま（ＭＢ）を脱デンプン化した。これらの基質を１３０℃で１０分間の熱処理に付した。酵素的加水分解を、０．０１％アジ化ナトリウムを含むｐＨ６．０の０．１Ｍの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液内で、４０℃のサーモスタット制御振盪培養器において行った。ＷＢ又はＭＢ（２００ｍｇ）を、別個に、精製したＦＡＥＡ（配列番号２）、ＸＹＮＢ（配列番号６）、ＦＡＥＡ＋ＸＹＮＢ、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣと、最終容量５ｍｌでインキュベートした。遊離酵素及び二機能性酵素の精製した酵素の濃度は、各アッセイで、乾燥ふすま２００ｍｇ当たり１１ｎｋａｔａｌのエステラーゼ活性及び６４９６ｎｋａｔａｌのキシラナーゼ活性であった。この比は、精製した二機能性酵素で見られたモル濃度対モル濃度の様相に対応する。各アッセイは二重で行い、標準偏差は、ＷＢ及びＭＢで値の平均の５％未満であった。
【００７９】
アルカリ抽出可能なヒドロキシ桂皮酸の調製
アルカリ抽出可能なヒドロキシ桂皮酸含の総含有量を、２０ｍｇのＷＢ又はＭＢを２ＮのＮａＯＨ中に加えることによって求め、暗所で３５℃で３０分間インキュベートした。ｐＨを２ＮのＨＣｌで２に調整した。フェノール酸を３ｍｌのエーテルで三回抽出した。有機相を試験管に移し、４０℃で乾燥した。１ｍｌのメタノール／Ｈ２Ｏ（５０：５０）（ｖ／ｖ）を乾燥抽出物に加え、サンプルを、次の節に記載するようなＨＰＬＣ系に注入した。アルカリ抽出可能なフェルラ酸の総含有量は、酵素的加水分解では１００％であると考えられた。
【００８０】
フェルラ酸の測定
酵素的加水分解物を１００％メタノールで１／２に希釈し、１２０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を０．２μｍのナイロンフィルター（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ａｃｒｏｄｉｓｃ １３， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ）を通して濾過した。濾液をＨＰＬＣで分析した（２５μＬを注入）。ＨＰＬＣ分析は、可変ＵＶ／ＶＩＳ検出器、１００個の位置のオートサンプラー−オートインジェクターを備えたＨＰ１１００モデル（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）で、２８０ｎｍ及び３０℃で行った。分離は、Ｍｅｒｃｋ ＲＰ−１８逆相カラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ ３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ、Ｍｅｒｃｋ）で行った。流速は１．４ｍｌ／分であった。使用した移動相は、２０分間の総ラン時間で、１％酢酸及び１０％アセトニトリル水溶液（Ａ）対１００％アセトニトリル（Ｂ）であり、勾配は以下のように変化した：溶媒Ｂは最初２分間は０％であり、その後１０分間で５０％まで上昇し、３分間で１００％まで上昇し実行の終了まで継続した。データをＨＰ３３６５ ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎで処理し、外部標準較正によって定量を行った。
【００８１】
結果
【００８２】
二機能性酵素の産生の設計及び研究
黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ（ＦＡＥＡ）及びキシラナーゼＢ（ＸＹＮＢ）のコード配列を、高度にグリコシル化されたリンカーをコードするセロビオヒドロラーゼＢ遺伝子（ｃｂｈＢ）由来の配列を両パートナーの間に付加することによって、遺伝子的に融合した（図１Ａ）。第二の構築物ＦＬＸＬＣについては、対応する融合ＦＬＸを、リンカー−ＣＢＭをコードする黒こうじ菌のｃｂｈＢ遺伝子の部分配列に融合した（図１Ｂ）。両方の翻訳融合は、分泌を標的化する内因性ｆａｅＡシグナル配列と共に強く構成的なｇｐｄＡプロモーター及びｔｒｐＣターミネーターの制御下に置いた。黒こうじ菌Ｄ１５＃２６のプロトプラストを、発現ベクターｐＦＬＸ又はｐＦＬＸＬＣとｐｙｒＧ遺伝子を含むプラスミドｐＡＢ４−１との混合物で同時形質転換した。形質転換体を、ウリジンを含まない最少培地プレートで成長するこれらの能力について選択した。各構築物について４０個の形質転換体を、内因性ｆａｅＡ及びｘｙｎＢ遺伝子の発現を抑制するグルコース最少培地に播種した。ｐＡＢ４−１で形質転換した対照宿主では、エステラーゼ又はキシラナーゼの活性は全く検出されなかった。両構築物で、２日間の成長の後、形質転換体の細胞外培地でエステラーゼ及びキシラナーゼの活性が検出された（図２）。フェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼの活性が、培養中に共時的に検出された。最良のＦＬＸＬＣ及びＦＬＸの形質転換体ではそれぞれ１０日目及び１１日目まで活性が増大し、１４日目までにおおよそ安定したレベルに達した。最大エステラーゼ活性は、ＦＬＸについては１３．０ｎｋａｔ／ｍｌ、そしてＦＬＸＬＣ形質転換体については９．８ｎｋａｔ／ｍｌに達した。キシラナーゼの活性に関しては、ＦＬＸ形質転換体では２８７０ｎｋａｔ／ｍｌ、そしてＦＬＸＬＣ形質転換体では２０３８ｎｋａｔ／ｍｌの最大値が得られた。二機能性酵素内のＦＡＥＡパートナーの比活性を考慮すると、産生収率はＦＬＸ形質転換体及びＦＬＸＬＣ形質転換体でそれぞれ１．４ｇ／Ｌ及び１．５ｇ／Ｌと推測された。
【００８３】
二機能性酵素の生化学的及び動態学的解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析
両方の場合において、産生したタンパク質をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動で確認した（図３のレーン１及びレーン３）。ＦＬＸ形質転換体及びＦＬＸＬＣ形質転換体からの全細胞外タンパク質においてそれぞれ７２ｋＤａ及び９７ｋＤａ付近に顕著なバンドが見られた。ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの観測された分子量と理論上の分子量との間の差異は、それぞれ約１２％（ｗ／ｗ）及び２６％（ｗ／ｗ）のグリコシル化を示唆していた。組換え酵素をキレート化セファロース高速カラム上で精製し、画分の均一性をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって管理した（レーン２及びレーン４）。
【００８４】
全タンパク質の上清及び精製した画分から得た両キメラ酵素を、ＦＡＥＡに対する抗体を使用して免疫検出した（図４Ａ）。一つのシングルバンドが、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの形質転換体のそれぞれで、全タンパク質抽出物（レーン１、レーン３）及び精製したサンプル（レーン２、レーン４）から示された。キシラナーゼ又はＣＢＭに対する抗体が利用可能ではなかったので、組換えタンパク質の完全性を管理するために、Ｃ末端のヒスチジン−タグに対する抗体も免疫検出に使用した（図４Ｂ）。一つのシングルバンドがＦＬＸ及びＦＬＸＬＣで検出され、これによって、分解された形態を全く有さない無傷タンパク質として二機能性酵素が産生されたことが確認された（レーン５〜レーン８）。陰性対照（Ｃ）により、両方の抗体がエピトープ特異的であること、及び内因性ＦＡＥＡがこれらの培養条件で産生されないことが確認された。
【００８５】
Ｎ末端の配列決定
ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの最初の５つのアミノ酸を配列決定し（ＡＳＴＱＧ）、天然ＦＡＥＡとアラインした。アラインメントは、組換えタンパク質と天然ＦＡＥＡとの間で１００％の同一性を示した。これらの結果により、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣが正しく処理されたことが確認された。
【００８６】
二機能性酵素−セルロースの親和性及び結合能の分析
ＦＬＸとは対照的に、ＦＬＸＬＣはＣ末端に黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ由来のＣＢＭを含む。ＣＢＭの結合パラメータを求めるために、ＦＬＸＬＣのセルロースとの相互作用のアッセイを行った。ＦＬＸＬＣのセルロース結合親和性及びセルロール結合能を微結晶性セルロースであるアビセルＰＨ１０１に対して求めた。測定値は、解離定数（Ｋｄ）が９．９×１０−８Ｍであり、結合能が０．９８μｍｏｌ／ｇアビセルであった。予測通り、キメラ酵素ＦＬＸ（ＣＢＭを含まない）に関しては相互作用が見られなかった。
【００８７】
生化学的及び動態学的パラメータ
ＣＢＭを含むか又は含まない、両方の酵素パートナーの融合が、各酵素の特徴を変更させているか否かを管理するために、エステラーゼ及びキシラナーゼの活性に従って、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの生化学的及び動態学的パラメータを、遊離した組換えＦＡＥＡ及びＸＹＮＢと比較した（表１）。最適ｐＨ及びｐＨ安定性に関しては、二機能性酵素と遊離ＦＡＥＡ又はＸＹＮＢの両者との間に有意な差は見られなかった。最適温度及び温度安定性については、唯一の差はキシラナーゼの活性で測定されたわずかな違いだけであった。さらに、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの完全性を様々な温度でのインキュベーションの後にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって管理したところ、両方の二機能性酵素は４５℃まで完全に安定であり、５０℃で部分的に切断された。切断型の第一のアミノ酸を配列決定し、ＧＳＧＳＳと同定した。この配列をＦＬＸ及びＦＬＸＬＣとアラインしたところ、リンカー内で見られる配列と１００％の同一性が示された。これらの結果により、高度にグリコシル化されたリンカーが４５℃まで安定であり、ＧＳＧＳＳ配列の手前で５０℃で切断が生じることが示された。二つのリンカー配列を含むキメラＦＬＸＬＣタンパク質は、Ｃ末端のリンカーでのみ切断された（ＸＹＮＢとＣＢＭとの間）。プロテアーゼに対する潜在的な切断部位を、ペプチド切断ツールを使用して両ハイブリッドタンパク質のアミノ酸配列上で確認したところ（１９）、ＧＳＧＳＳ近辺に切断部位は見出されなかった。
【００８８】
動態学的特性に関して、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣのミカエリス定数を、ＭＦＡ及びカバノキキシランを基質として使用してラインウィーバー・バークプロットから測定した。ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣで見られた値は、遊離した組換えＦＡＥＡ及びＸＹＮＢで見られた値と一致していた（表１）。二機能性酵素の比活性をフェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼの活性に基づいて求め、遊離ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢと比較した（表１）。二機能性酵素で見られた値は、遊離ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢで見られた値に近かった。
【００８９】
つまり、これらの結果により、融合酵素モジュール（ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢ）の生化学的及び動態学的パラメータが主に二機能性複合体ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣに保存されていることが確認された。
【００９０】
小麦ふすま及びトウモロコシふすまからのフェルラ酸の酵素放出
二機能性タンパク質内の二つの酵素の物理的近接によって生じる相乗効果及びＣＢＭ付加の影響を研究するために、ＦＡ放出の効率について、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣを遊離酵素ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢと比較した。全ての酵素を均一に精製し、細胞壁に含まれるＦＡの量が天然で高いＷＢ及びＭＢとインキュベートした。遊離ＦＡＥＡを使用した場合、４時間後及び１６時間後にそれぞれ、ＷＢ由来の全アルカリ抽出性ＦＡの４１％及び５１％が放出された（図５、Ａ）。これらの割合は、遊離ＸＹＮＢの追加によって５１％（４時間）及び５４％（１６時間）にわずかに増大した。ＦＬＸ又はＦＬＸＬＣの効果に関して、本発明者は、わずか４時間のインキュベーションの後にＦＡの全放出を観察した。基質としてＭＢを用いると（図５Ｂ）、遊離ＦＡＥＡは４時間後及び１６時間後にそれぞれ４．２％及び４．８％のＦＡを放出したが、ＸＹＮＢの追加ではこの割合は増大しなかった。しかし、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣは、４時間の加水分解の後にそれぞれ６．２％及び７．２％を放出することができた。酵素処理を一晩１６時間行った場合、放出はＦＬＸ及びＦＬＸＬＣで６．３％及び７．９％に増大した。相乗因子を求め遊離酵素（ＦＡＥＡ＋ＸＹＮＢ）と融合酵素（ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣ）との間で比較した。表２で算出されるように、算出比は１よりも大きく、これにより、両基質について、相乗効果は、対応する遊離酵素よりも二機能性酵素で良好であることが示された。ＭＢのＦＡ放出に関して、相乗効果は４時間後及び１６時間後でそれぞれ、ＦＬＸ（１．５３及び１．３０）よりもＦＬＸＬＣ（１．８０及び１．６２）で高かった。結論として、これらの結果により、両基質に関して、二機能性酵素ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣが、対応する遊離酵素（ＦＡＥＡ＋ＸＹＮＢ）と比べて、ＦＡ放出に効果的であることが示された。さらに、これらの結果により、基質としてＭＢを使用したＦＡ放出にＦＬＸＬＣがより適していることが示されると考えられ、これによりＣＢＭによって生じる正の効果が示唆される。
【００９１】
結論
植物細胞壁の生分解には、その組成及び構造における不均一性のために、広範な酵素が必要とされる。異なる主鎖加水分解酵素と補助的な加水分解酵素との間の幾つかの組み合わせにより、細胞壁の効果的な分解を導く重要な相乗効果が示された（９、１２）。本研究では、黒こうじ菌の二つの植物細胞壁分解酵素及び糖質結合モジュールを融合し、天然基質の分解に対する相乗効果を研究した。このようなハイブリッドタンパク質の構築は、広範な潜在的な用途を広げるタンパク質工学の本来の側面である。ここで、概念は、二つの機能的単位を採用して、改善された二機能性タンパク質を作り出すことにある（３、３６）。このような複数のモジュールの組織化は一般的に自然に見出され、二つ以上の酵素活性又はタンパク質機能を有する酵素の産生をもたらす。バイオテクノロジー分野では幾つかの二機能性タンパク質が既に研究されており、これには、例えばα−アミラーゼとグルコアミラーゼとのハイブリッドが含まれる（４４）。この研究の結果により、生デンプンの消化に対して、遊離酵素と比較して酵素効率の増大が示された。別の実験では、内部ＣＢＭを有するキメラキシラナーゼ／エンドグルカナーゼ（ＸｙｎＣｅｎＡ）が構築されたが、この結果は、ハイブリッド酵素が、遊離酵素と比べて、均一なキシラン又はセルロース基質に対する加水分解に有意な影響を与えなかったことを示し、一方で、天然基質に対しての適用試験は行われなかった（４６）。
【００９２】
二つの細胞壁ヒドロラーゼの物理的近接によって生じる効果を評価するために、ＦＡＥＡをＸＹＮＢと融合した（構築物ＦＬＸ）。黒こうじ菌のＣＢＨＢ由来の菌類性ＣＢＭを第二の構築物（ＦＬＸＬＣ）においてＣ末端で融合し、二機能性酵素をセルロースに標的化した。両構築物に関して、高度にグリコシル化したリンカーペプチドを、三つの主な理由から、各モジュール（ＦＡＥＡ、ＸＹＮＢ、又はＣＢＭ）間で融合した。第一に、リンカーは、モジュールの、独立して折り畳む能力、及び互いに対する立体配座の自由度を保つ能力を維持することが知られている（３６）。本願の場合、フェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼの両方がこの立体配座を採用することができ、遺伝子工学処理された二機能性タンパク質は、遊離酵素に対応する生物学的及び動態学的特性で活性であった。第二に、リンカーの高度なグリコシル化が、リンカーをプロテアーゼの活性から保護すること、最終的には融合されたモジュール間の切断の頻繁に起こる問題を回避することによって、タンパク質配列の安定性を改善する（８、３６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析で示されるように両方の二機能性酵素が安定であったため、この効果は確認された。しかし、ハイブリッド酵素の安定性は熱処理によっていくらか制限を受けることが示された。実際に、ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの完全性に対する熱処理の影響は、これらが４５℃まで安定であり、そして５０℃でリンカー配列において切断されることを示した。最後に、黒こうじ菌のグルコアミラーゼ由来の高度にグリコシル化されたリンカーで実証されたように、高度にグリコシル化されたリンカーは、産生収率を増大させる分泌に正の役割を果たし得る（３２）。実際に、ＦＬＸおよびＦＬＸＬＣでの一つ又は二つのリンカーの存在に起因するグリコシル化部位は、小胞体での組換えタンパク質の滞留を延長させることができ、これにより正確な折り畳みのための追加の時間が与えられ、産生の増大がもたらされる（４２）。この後者の仮説は、両方の二機能性酵素の産生収率が、対応する遊離した組換え酵素について得られた産生収率よりも高かった理由を説明し得る（２９、４１）。
【００９３】
両酵素モジュールの近接により生じる相乗効果であって、且つ折り畳みの間のタンパク質の立体配座の変化の結果としての酵素特性の変化に起因する利益ではない相乗効果を研究するために、各モジュールの生化学的及び動態学的特徴を注意深く管理した。二機能性タンパク質ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの両方の主な生化学的及び動態学的特性、すなわち、温度安定性及びｐＨ安定性、最適な温度及びｐＨ、Ｋｍ並びに比活性は、遊離酵素と同じ範囲内にある。今までに解析されていなかったため、黒こうじ菌のＣＢＨＢ由来のＣＢＭに関して、結合アッセイをセルロースに対して行った（２０）。アビセルセルロースは、１００〜２５０のグルコピラノース単位の非常に高い重合度と、高等植物のＩβ型の特徴で本質的に構成される結晶相の５０〜６０％の結晶形態とを有する（４９）。結果は、ＦＬＸＬＣがアビセルに対する親和性を有していることを示し、これによって、ＣＢＭの構造が乱されていないこと、及びＣＢＭがハイブリッド酵素でもその機能を保持していることが確認された。
【００９４】
最終的に、二機能性タンパク質ＦＬＸ及びＦＬＸＬＣの両方を試験して、酵素の相乗効果に対する二つの相補的な菌類酵素の物理的近接の効果、及びＣＭＢ付加の影響を研究した。適用試験は、それぞれ約１％及び３％（ｗ／ｗ）である植物細胞壁におけるＦＡ量の多さで知られている二つの天然のモデル基質（ＷＢ及びＭＢ）からのＦＡ放出に基づいている（４３）。両基質は農業で生じ、農業食品分野、化粧品分野及び医薬分野において価値化することができる（４、２６）。遊離酵素は、ＷＢ及びＭＢからそれぞれＦＡ含量の５４％及び４.８％を放出することができた。対照的に、二機能性酵素は、ＷＢからは全ＦＡを、そしてＭＢからはＣＢＭの存否に応じて６.３％又は７.９％まで、効率的に放出した。今までのところ、ＷＢからのＦＡ放出で見られたこれまでの結果はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）のキシラナーゼ及び黒こうじ菌由来のＦＡＥＡで得られ、ここでは、全フェルラ酸の最大９５％（ｗ／ｗ）が放出された（１５）。ＭＢに関して、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）由来の市販製剤Ｎｏｖｏｚｙｍ３４２を使用することで大量のＦＡが放出された（最大１３．６％）（５）。しかし、本発明者は、この市販製剤が様々な種類の酵素活性を含んでいることを考慮する必要があった。本発明のアッセイにおいて、ＷＢからの全ＦＡが二機能性酵素処理によって放出された一方で、ＭＢでは８％未満が得られたにすぎない。トウモロコシふすまのフェルラ酸含有量は小麦ふすまで見られたものよりも高いが、トウモロコシふすまのキシランの方がキシロース残基、アラビノース残基、及びガラストース残基によって多く置換されている（７、１５）。従って、この差異は、酵素の近接を著しく制限する、トウモロコシにおけるヘテロキシラン骨格上の置換の数、側鎖における高度に枝分かれしたキシロースの存在、及びＦＡ基の近傍でのアラビノースとキシロースとの間の連結の存在によって説明することができる。最後に、ＦＬＸＬＣによるＭＢの加水分解を考慮すると、ＣＢＭはＦＡ放出に対する正の効果を示し、それはおそらく、（ｉ）基質の近くでの酵素の濃度を増大させるセルロース標的化、及び／又は（ｉｉ）基質をより接近可能にするセルロース構造の不安定化によるものである。ＦＬＸ又はＦＬＸＬＣを使用することによる適用試験の結論として、遊離酵素ＦＡＥＡ及びＸＹＮＢと比較して、両基質に対するより良好な相乗効果がＦＡ放出に関して得られた。全ての主な生化学的及び動態学的特性がハイブリッドタンパク質における各パートナーで変化しなかったので、全般的に高められた相乗効果が二機能性酵素内の各酵素パートナーの物理的近接に起因することが示唆された。ＦＬＸＬＣの場合、相乗効果はＣ末端ＣＢＭの付加によって正の影響を受けた。 さらに、活性部位の空間的位置が融合モジュール間で変化していないことも示され得る。
【００９５】
全般的な結論として、補助的な酵素（ＦＡＥＡ）及び主鎖切断酵素（ＸＹＮＢ）等の相補的な細胞壁ヒドロラーゼを結びつける、植物細胞壁分解のための新規な酵素ツールの構築が、酵素パートナーの相乗効果を増大させる興味深い戦略であることが示された。バイオテクノロジー上の応用では、このようなハイブリッドタンパク質の利用は、高価でかつ汚染性である化学処理の代替となるか、又はパルプ及び紙、農産業及びバイオ燃料生産の分野における野菜の副産物の価値化のために既存の酵素処理を改善するものである。
【００９６】
【表１】
【００９７】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】本研究で使用した発現カセットを示す図である。ＦＬＸインサートを設計するために（Ａ）、ＦＡＥＡ、ＣＢＨＢ由来のリンカー領域、及びＸＹＮＢをコードする黒こうじ菌の配列を共に融合した。第二の構築物において（Ｂ）、ＦＬＸの鋳型を、リンカー配列及びＣＢＭをコードするｃｂｈｂ配列と融合し、ＦＬＸＬＣ挿入を生じさせた。発現カセットは、ｇｐｄＡプロモーター及びｔｒｐＣターミネーターの制御下にある。両構築物は３’末端で６つのヒスチジンコード配列を含んでいた。（１）リンカーコード配列：ＧＳＴＹＳＳＧＳＳＳＧＳＧＳＳＳＳＳＳＳＴＴＴＫＡＴＳＴＴＬＫＴＴＳＴＴＳＳＧＳＳＳＴＳＡＡ。
【図２】黒こうじ菌における細胞外のフェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼの経時的な活性を示す図である。フェルロイルエステラーゼ（Ａ）及びキシラナーゼ（Ｂ）の活性は、最良のＦＬＸ（◆）形質転換体及びＦＬＸＬＣ（■）形質転換体で測定した。活性は、エステラーゼ及びキシラナーゼの活性にそれぞれ基質としてＭＦＡ及びカバノキキシランを使用して求めた。
【図３】ＦＬＸ形質転換体及びＦＬＸＬＣ形質転換体により産生された細胞外タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ＦＬＸ由来の全タンパク質及び精製したタンパク質（それぞれ、レーン１及びレーン２）及びＦＬＸＬＣ由来の全タンパク質及び精製したタンパク質（それぞれ、レーン３及びレーン４）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１１％ポリアクリルアミド）にロードした。ゲルをクマシーブルーで染色した。ＳＤ：分子量標準。
【図４】ＦＬＸ形質転換体及びＦＬＸＬＣ形質転換体により産生された全タンパク質及び精製したタンパク質のウェスタンブロット分析を示す図である。ＦＡＥＡ（Ａ）又はＨｉｓ−タグ（Ｂ）に対する抗体を、ＦＬＸ形質転換体及びＦＬＸＬＣ形質転換体由来の全細胞外タンパク質及び精製したタンパク質の免疫検出に使用した。レーン１、レーン５：ＦＬＸ形質転換体由来の全細胞外タンパク質。レーン２、レーン６：精製したＦＬＸ。レーン３、レーン７：ＦＬＸＬＣ形質転換体由来の全細胞外タンパク質。レーン４、レーン８：精製したＦＬＸＬＣ。Ｃ：ｐＡＢ４−１で形質転換した対照株Ｄ１５＃２６。検出は化学発光で行った。
【図５】遊離酵素又は二機能性酵素の作用によるフェルラ酸放出効率の比較を示す図である。小麦ふすま（Ａ）及びとうもろこしふすま（Ｂ）を、遊離酵素又は二機能性酵素によるＦＡの加水分解に使用した。ＦＡ放出は、４時間後（白色の棒）及び１６時間後（黒色の棒）のＨＰＬＣによって求めた。活性は、基質中に存在するＦＡの総量に対する割合で示した。標準偏差は、ＷＢ及びＭＢについて値の平均の５％未満であった。
【００９９】
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１９． Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ， Ｅ．， Ｃ． Ｈｏｏｇｌａｎｄ， Ａ． Ｇａｔｔｉｋｅｒ， Ｓ． Ｄｕｖａｕｄ， Ｍ． Ｒ． Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｒ． Ｄ． Ａｐｐｅｌ， ａｎｄ Ａ． Ｂａｉｒｏｃｈ． ２００５． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｏｎ ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｓｅｒｖｅｒ． Ｊｏｈｎ Ｍ． Ｗａｌｋｅｒ （ｅｄ）： Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．
２０． Ｇｉｅｌｋｅｎｓ， Ｍ． Ｍ．， Ｅ． Ｄｅｋｋｅｒｓ， Ｊ． Ｖｉｓｓｅｒ， ａｎｄ Ｌ． Ｈ． ｄｅ Ｇｒａａｆｆ． １９９９． Ｔｗｏ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｒｅｑｕｉｒｅ Ｄ−ｘｙｌｏｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｘ１ｎＲ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５： ４３４０−５．
２１． Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｍ． Ａ．， Ｍ． Ｔａｋａｇｉ， Ｓ． Ｈａｓｈｉｄａ， Ｏ． Ｓｈｏｓｅｙｏｖ， Ｒ． Ｈ． Ｄｏｉ， ａｎｄ Ｉ． Ｈ． Ｓｅｇｅｌ． １９９３． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７５： ５７６２−５７６８．
２２． Ｇｏｒｄｏｎ， Ｃ． Ｌ．， Ｄ． Ｂ． Ａｒｃｈｅｒ， Ｄ． Ｊ． Ｊｅｅｎｅｓ， Ｊ． Ｈ． Ｄｏｏｎａｎ， Ｂ． Ｗｅｌｌｓ， Ａ． Ｐ． Ｊ． Ｔｒｉｎｃｉ， ａｎｄ Ｇ． Ｄ． Ｒｏｂｓｏｎ． ２０００． Ａ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ：： ＧＦＰ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｈｙｐｈａｅ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ． ４２： ３９−４８．
２３． Ｇｒａｆ， Ｅ． １９９２． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １３： ４３５−４４８．
２４． Ｊｕｇｅ， Ｎ．， Ｇ． Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， Ａ． Ｐｕｉｇｓｅｒｖｅｒ， Ｎ． Ｊ． Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ｉ． Ｆ． Ｃｏｎｎｅｒｔｏｎ， ａｎｄ Ｃ． Ｂ． Ｆａｕｌｄｓ． ２００１． Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｃｉｎｎａｍｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ （ＦＡＥＡ） ｉｎ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ． ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ． １： １２７−１３２．
２５． Ｈｏ， Ｓ． Ｎ．， Ｈ． Ｄ． Ｈｕｎｔ， Ｒ． Ｍ． Ｈｏｒｔｏｎ， Ｊ． Ｋ． Ｐｕｌｌｅｎ， Ｌ． Ｒ． Ｐｅａｓｅ． １９８９． Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｇｅｎｅ． ７７： ５１−５９．
２６． Ｋｉｋｕｚａｋｉ， Ｈ．， Ｍ． Ｈｉｓａｍｏｔｏ， Ｋ． Ｈｉｒｏｓｅ， Ｋ． Ａｋｉｙａｍａ， ａｎｄ Ｈ． Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ． ２００２． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｆｅｒｕｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ５０： ２１６１−２１６８．
２７． Ｋｒｏｏｎ， Ｐ． Ａ．， Ｇ． Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， Ｎ． Ｍ． Ｆｉｓｈ， Ｄ． Ｂ． Ａｒｃｈｅｒ， ａｎｄ Ｎ． Ｊ． Ｂｅｌｓｈａｗ． ２０００． Ａ ｍｏｄｕｌａｒ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ ｗｈｉｃｈ ｒｅｌｅａｓｅｓ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｓ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｎｔａｉｎｓ ａ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｕｌｅ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７： ６７４０−６７５２．
２８． Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ． Ｋ． １９７０． Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４． Ｎａｔｕｒｅ． ２２７： ６８０−６８５．
２９． Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ， Ａ．， Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ， ａｎｄ Ｅ． Ｒｅｃｏｒｄ． ２００５． Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌａｎａｓｅ Ｂ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５１： １７７−１８３．
３０． Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ， Ａ．， Ｉ． Ｂｅｎｏｉｔ， ， Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ， Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ， ａｎｄ Ｅ． Ｒｅｃｏｒｄ． ２００４． Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ Ｂ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． ３７： １２６−１３３．
３１． Ｌｅｖａｓｓｅｕｒ， Ａ．， Ｓ． Ｐａｇｅｓ， Ｈ． Ｐ． Ｆｉｅｒｏｂｅ， Ｄ． Ｎａｖａｒｒｏ， Ｐ． Ｊ． Ｐｕｎｔ， Ｊ． Ｐ． Ｂｅｌａｉｃｈ， Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ ａｎｄ Ｅ． Ｒｅｃｏｒｄ． ２００４． Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｏｆ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ ａ ｆｕｎｇａｌ ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ ａｎｄ ａ ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｄｏｃｋｅｒｉｎ ｄｏｍａｉｎ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ７０： ６９８４−６９９１．
３２． Ｌｉｂｂｙ， Ｃ． Ｂ．， Ｃ． Ａ． Ｃｏｒｎｅｔｔ， Ｐ． Ｊ． Ｒｅｉｌｌｙ， ａｎｄ Ｃ． Ｆｏｒｄ． １９９４． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ７： １１０９−１１１４．
３３． Ｌｉｎｄｅｒ， Ｍ．， ａｎｄ Ｔ． Ｔ． Ｔｅｅｒｉ． １９９７． Ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５７： １５−２８．
３４． Ｌｏｗｒｙ， Ｏ． Ｈ．， Ｎ． Ｊ． Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ， Ａ． Ｌ． Ｆａｒｒ， ａｎｄ Ｒ． Ｊ． Ｒａｎｄａｌｌ． １９５１． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｆｏｌｉｎ ｐｈｅｎｏｌ ｒｅａｇｅｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９３： ２６５−２７５．
３５． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｇ． Ｌ． １９５９． Ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓｕｇａｒ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ３１： ４２６−４２８．
３６． Ｎｉｘｏｎ， Ａ． Ｅ．， Ｍ． Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ， ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｂｅｎｋｏｖｉｃ． １９９８． Ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ： ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １６： ２５８−２６４．
３７． Ｐａｇｅｓ， Ｓ．， Ｌ． Ｇａｌ， Ａ． Ｂｅｌａｉｃｈ， Ｃ． Ｇａｕｄｉｎ， Ｃ． Ｔａｒｄｉｆ， ａｎｄ Ｊ． Ｐ． Ｂｅｌａｉｃｈ． １９９７． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣｉｐＣ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．． １７９： ２８１０−２８１６．
３８． Ｐｏｒａｔｈ， Ｊ．， Ｊ． Ｃａｒｌｓｓｏｎ， Ｉ． Ｏｌｓｓｏｎ， Ｇ． Ｂｅｌｆｒａｇｅ． １９７５． Ｍｅｔａｌ ｃｈｅｌａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ． ２５８： ５９８−５９９．
３９． Ｐｕｎｔ， Ｐ． Ｊ．， ａｎｄ Ｃ． Ａ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ． １９９２． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ａｎｄ ｐｈｌｅｏｍｙｃｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１６： ４４７−４５７．
４０． Ｒａｌｅｔ， Ｍ． Ｃ．， Ｃ． Ｂ． Ｆａｕｌｄｓ， Ｇ． Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ， ａｎｄ Ｊ． Ｆ． Ｔｈｉｂａｕｌｔ． １９９４． Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｕｌｏｙｌａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｓｕｇａｒ−ｂｅｅｔ ｐｕｌｐ ａｎｄ ｗｈｅａｔ ｂｒａｎ ｂｙ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ． Ｒｅｓ． ２６３： ２５７−２６９．
４１． Ｒｅｃｏｒｄ， Ｅ．， Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ， Ｃ． Ｓｉｇｏｉｌｌｏｔ， Ｓ． Ｐａｇｅｓ， Ｐ． Ｊ． Ｐｕｎｔ， Ｍ． Ｄｅｌａｔｔｒｅ， Ｍ． Ｈａｏｎ， Ｃ． Ａ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ， Ｊ． Ｃ． Ｓｉｇｏｉｌｌｏｔ， Ｌ． Ｌｅｓａｇｅ−Ｍｅｅｓｓｅｎ， ａｎｄ Ｍ． Ａｓｔｈｅｒ． ２００３． Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ ｆｏｒ ｐｕｌｐ ｂｌｅａｃｈｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６２： ３４９−３５５．
４２． Ｓａｇｔ， Ｃ． Ｍ．， Ｂ． Ｋｌｅｉｚｅｎ， Ｒ． Ｖｅｒｗａａｌ， Ｍ． Ｄ． ｄｅＪｏｎｇ， Ｗ． Ｈ． Ｍｕｌｌｅｒ， Ａ． Ｓｍｉｔｓ， Ｃ． Ｖｉｓｓｅｒ， Ｊ． Ｂｏｏｎｓｔｒａ， Ａ． Ｊ． Ｖｅｒｋｌｅｉｊ， ａｎｄ Ｃ． Ｔ． Ｖｅｒｒｉｐｓ． ２０００． Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｙｅａｓｔｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６６： ４９４０−４９４４．
４３． Ｓａｕｌｎｉｅｒ， Ｌ． ａｎｄ Ｊ． Ｆ． Ｔｈｉｂａｕｌｔ． １９９９． Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｄｉｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄｓ ａｓ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｓｕｇａｒ−ｂｅｅｔ ｐｅｃｔｉｎｓ ａｎｄ ｍａｉｚｅ ｂｒａｎ ｈｅｔｅｒｏｘｙｌａｎｓ． Ｊ． Ｓｃｉ． Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ． ７９： ３９６−４０２．
４４． Ｓｈｉｂｕｙａ， Ｉ．， Ｇ． Ｔａｍｕｒａ， Ｈ． Ｓｈｉｍａ， Ｔ． Ｉｓｈｉｋａｗａ， ａｎｄ Ｓ． Ｈａｒａ． １９９２． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ α−ａｍｙｌａｓｅ／ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５６： ８８４−８８９．
４５． Ｓｒｉｓｏｄｓｕｋ， Ｍ．， Ｊ． Ｌｅｈｔｉｏ， Ｍ． Ｌｉｎｄｅｒ， Ｅ． Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ， ａｎｄ Ｔ． Ｒｅｉｎｉｋａｉｎｅｎ， Ｔ． Ｔ． Ｔｅｅｒｉ． １９９７． Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｉ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ： ａｃｔｉｏｎ ｏｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５７： ４９−５７．
４６． Ｔｏｍｍｅ， Ｐ． Ｎ．， Ｒ． Ｇｉｌｋｅｓ， Ｃ． Ｍ． Ｊｒ． Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ． Ｊ． Ｗａｒｒｅｎ ａｎｄ Ｄ． Ｇ． Ｋｉｌｂｕｒｎ． １９９４． Ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｍｅｄｉａｔｅｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｘｙｌａｎａｓｅ／ｃｅｌｌｕｌａｓｅ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ７： １１７−１２３．
４７． Ｔｏｐａｋａｓ， Ｅ．， Ｈ． Ｓｔａｍａｔｉｓ， Ｐ． Ｂｉｅｌｙ， ａｎｄ Ｐ． Ｃｈｒｉｓｔａｋｏｐｏｕｌｏｓ． ２００４． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｙｐｅ Ｂ ｆｅｒｕｌｏｙｌ ｅｓｔｅｒａｓｅ （ＳｔＦＡＥ−Ａ） ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ｆｕｎｇｕｓ Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６３： ６８６−６９０．
４８． ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ， Ｗ．， Ｉ． Ｅ． Ｍａｔｔｅｒｎ， Ｃ． Ｍ． ｖａｎ Ｚｅｉｊｌ， Ｐ． Ｈ． Ｐｏｕｗｅｌｌｓ， ａｎｄ Ｃ． Ａ． ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ． １９８７． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｙｒＧ ｇｅｎｅ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０６： ７１−７５．
４９． Ｗｏｏｄ， Ｔ． Ｍ． １９８８． Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ， ａｍｏｒｐｈｏｕｓ， ａｎｄ ｄｙｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １６０： １９−２５．
５０． Ｙｕ， Ｐ．， Ｄ． Ｄ． Ｍａｅｎｚ， Ｊ． Ｊ． ＭｃＫｉｎｎｏｎ， Ｖ． Ｊ． Ｒａｃｚ， ａｎｄ Ｄ． Ａ． Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ． ２００２． Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｆｅｒｕｌｉｃ Ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｏａｔ Ｈｕｌｌｓ ｂｙ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｆｅｒｕｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｅｓｔｅｒａｓｅ ａｎｄ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｘｙｌａｎａｓｅ， Ｊ Ａｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ５０： １６２５ −１６３０．
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ末端の糖質結合分子（ＣＢＭ）を含まない少なくとも二つの植物細胞壁分解酵素、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質の使用方法であって、前記酵素及び前記ＣＢＭが、植物もしくは野菜の副産物からの植物細胞壁内に存在する目的の化合物の調製の枠組みにおいて、又はパルプ及び紙の漂白の枠組みにおいて、植物細胞壁分解のプロセスを行うための、菌類の天然タンパク質又はその変異型に対応する組換えタンパク質である使用方法。
【請求項２】
ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、セルロース、ヘミセルロースを加水分解することができ且つリグニンを分解することができる酵素から選択される、請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、
−エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、及びセロビオヒドロラーゼ等のセルラーゼ、又はβ−グルコシダーゼ、
−キシラナーゼ等のヘミセルラーゼ、
−ラッカーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、多機能型ペルオキシダーゼ等の、リグニンを分解することが可能なリグニナーゼ、又は、セロビオースデヒドロゲナーゼ及びアリールアルコールオキシダーゼ等の補助的な酵素、
−フェルロイルエステラーゼ、シンナモイルエステラーゼ、及びクロロゲン酸加水分解酵素等の、桂皮酸フェルラ酸を放出すること及びヘミセルロース鎖間のジフェルラ酸架橋を加水分解することが可能なシンナモイルエステル加水分解酵素
から選択される加水分解酵素である、請求項１又は２に記載の使用方法。
【請求項４】
ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素がフェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項５】
ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、
＊子嚢菌、例えば
−アスペルギルス株、またより詳細には黒こうじ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、
−トリコデルマ株、またより詳細にはセルラーゼ生産性糸状菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、
＊担子菌、例えばピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）株又はハロシフィナ（Ｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ）株、またより詳細にはシュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、ピクノポラス・サンギネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）、又はハロシフィナ・ビロサ（Ｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ ｖｉｌｌｏｓａ）
から選択される菌類に由来する天然酵素又はその変異型に対応する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項６】
ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、黒こうじ菌等のアスペルギルス株由来の天然酵素又はその変異型に対応する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項７】
植物細胞壁分解酵素の少なくとも一つが、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ、又は
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢ
から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項８】
植物細胞壁分解酵素の少なくとも一つが、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢ等のキシラナーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項９】
ＣＢＭであるタンパク質が、子嚢菌、例えばアスペルギルス株、またより詳細には黒こうじ菌から選択される菌類に由来する天然酵素又はその変異型に存在するＣＢＭから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１０】
ＣＢＭが、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在し且つ配列番号８で表されるＣＢＭである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１１】
自身に含まれるタンパク質の少なくとも二つの間にリンカーを含む融合タンパク質の使用方法であって、当該リンカーが１０〜１００アミノ酸、有利には約５０アミノ酸のポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１２】
自身に含まれる各タンパク質の間にリンカーが含まれる融合タンパク質の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１３】
リンカーが、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号１０で表される配列等の、高度にグリコシル化されたポリペプチドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１４】
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ又は配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質であって、二つの当該タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１２で表される融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質であって、当該三つのタンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１４で表される融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質であって、二つの当該タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１６で表される融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質であって、当該三つのタンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１８で表される融合タンパク質
等の、フェルロイルエステラーゼとキシラナーゼ、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質の、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１５】
以下の目的の化合物、
−バイオエタノール、
−抗酸化剤、例えば、フェルラ酸、又は桂皮酸及びヒドロキシチロソールであるカフェ酸、又は没食子酸、
−香料、例えば、フェルラ酸又はｐ−クマル酸の生体内変換によりそれぞれ得られる、バニリン又はｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド
の調製の枠組みにおいて、又はパルプ及び紙の漂白の枠組みにおいて、植物細胞壁分解のプロセスを行うための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１６】
植物又は野菜の副産物からの植物細胞壁内に存在する目的の化合物の調製の枠組みにおける、植物細胞壁を分解する方法であって、
−植物又は野菜の副産物又は産業廃棄物を上記のような融合タンパク質によって、又は上記のような形質転換された菌類細胞によって酵素処理する工程、
−任意選択で、融合タンパク質の作用と組み合わせた蒸気爆発によって植物又は野菜の副産物を物理的に処理する工程、
−任意選択で、適切な微生物又は酵素によって、上記酵素処理中に細胞壁から放出された化合物を生体内変換する工程、
−上記酵素処理中に細胞壁から放出された、又は上記生体内変換工程中に得られた目的の化合物を回収し、必要であれば精製する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
フェルラ酸、もしくは桂皮酸及びヒドロキシチロソールであるカフェ酸、もしくは没食子酸等の抗酸化剤、フェルラ酸もしくはｐ−クマル酸の生体内変換によりそれぞれ得られるバニリン又はｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド等の香料、バイオエタノールの調製のため、又はパルプ及び紙の漂白のための、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｃ末端の糖質結合分子（ＣＢＭ）を含まない少なくとも二つの植物細胞壁分解酵素、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質であって、前記酵素及びＣＢＭが菌類の天然タンパク質又はその変異型に対応する組換えタンパク質である融合タンパク質。
【請求項１９】
−ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が請求項２〜８のいずれか一項に記載のものであり、
−ＣＢＭが請求項９又は１０に記載のものである、
請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
自身に含まれるタンパク質の少なくとも二つの間にリンカーを含み、当該リンカーが請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のものである、請求項１８又は１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ又は配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質であって、二つの当該タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１２で表される融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質であって、当該三つのタンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１４で表される融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質であって、二つの当該タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１６で表される融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質であって、当該三つのタンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１８で表される融合タンパク質
等の、フェルロイルエステラーゼとキシラナーゼ、及び任意選択でＣＢＭの間の、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸で形質転換されたベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターを使用して請求項２２に記載の核酸で形質転換された宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２４に記載の宿主細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養、培養中に前記宿主細胞により産生された融合タンパク質の回収、及び必要であればその精製を含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を調製する方法。
【請求項１】
Ｃ末端の糖質結合分子（ＣＢＭ）を含まない少なくとも二つの植物細胞壁分解酵素、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質の使用方法であって、前記酵素及び前記ＣＢＭが、植物もしくは野菜の副産物からの植物細胞壁内に存在する目的の化合物の調製の枠組みにおいて、又はパルプ及び紙の漂白の枠組みにおいて、植物細胞壁分解のプロセスを行うための、菌類の天然タンパク質又はその変異型に対応する組換えタンパク質である使用方法。
【請求項２】
ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、セルロース、ヘミセルロースを加水分解することができ且つリグニンを分解することができる酵素から選択される、請求項１に記載の使用方法。
【請求項３】
ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、
−エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、及びセロビオヒドロラーゼ等のセルラーゼ、又はβ−グルコシダーゼ、
−キシラナーゼ等のヘミセルラーゼ、
−ラッカーゼ、マンガンペルオキシダーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、多機能型ペルオキシダーゼ等の、リグニンを分解することが可能なリグニナーゼ、又は、セロビオースデヒドロゲナーゼ及びアリールアルコールオキシダーゼ等の補助的な酵素、
−フェルロイルエステラーゼ、シンナモイルエステラーゼ、及びクロロゲン酸加水分解酵素等の、桂皮酸フェルラ酸を放出すること及びヘミセルロース鎖間のジフェルラ酸架橋を加水分解することが可能なシンナモイルエステル加水分解酵素
から選択される加水分解酵素である、請求項１又は２に記載の使用方法。
【請求項４】
ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素がフェルロイルエステラーゼ及びキシラナーゼから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項５】
ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、
＊子嚢菌、例えば
−アスペルギルス株、またより詳細には黒こうじ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、
−トリコデルマ株、またより詳細にはセルラーゼ生産性糸状菌（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、
＊担子菌、例えばピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）株又はハロシフィナ（Ｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ）株、またより詳細にはシュタケ（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、ピクノポラス・サンギネウス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）、又はハロシフィナ・ビロサ（Ｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ ｖｉｌｌｏｓａ）
から選択される菌類に由来する天然酵素又はその変異型に対応する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項６】
ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が、黒こうじ菌等のアスペルギルス株由来の天然酵素又はその変異型に対応する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項７】
植物細胞壁分解酵素の少なくとも一つが、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ、又は
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢ
から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項８】
植物細胞壁分解酵素の少なくとも一つが、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢ等のキシラナーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項９】
ＣＢＭであるタンパク質が、子嚢菌、例えばアスペルギルス株、またより詳細には黒こうじ菌から選択される菌類に由来する天然酵素又はその変異型に存在するＣＢＭから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１０】
ＣＢＭが、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在し且つ配列番号８で表されるＣＢＭである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１１】
自身に含まれるタンパク質の少なくとも二つの間にリンカーを含む融合タンパク質の使用方法であって、当該リンカーが１０〜１００アミノ酸、有利には約５０アミノ酸のポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１２】
自身に含まれる各タンパク質の間にリンカーが含まれる融合タンパク質の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１３】
リンカーが、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号１０で表される配列等の、高度にグリコシル化されたポリペプチドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１４】
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ又は配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質であって、二つの当該タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１２で表される融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質であって、当該三つのタンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１４で表される融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質であって、二つの当該タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１６で表される融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質であって、当該三つのタンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１８で表される融合タンパク質
等の、フェルロイルエステラーゼとキシラナーゼ、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質の、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１５】
以下の目的の化合物、
−バイオエタノール、
−抗酸化剤、例えば、フェルラ酸、又は桂皮酸及びヒドロキシチロソールであるカフェ酸、又は没食子酸、
−香料、例えば、フェルラ酸又はｐ−クマル酸の生体内変換によりそれぞれ得られる、バニリン又はｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド
の調製の枠組みにおいて、又はパルプ及び紙の漂白の枠組みにおいて、植物細胞壁分解のプロセスを行うための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用方法。
【請求項１６】
植物又は野菜の副産物からの植物細胞壁内に存在する目的の化合物の調製の枠組みにおける、植物細胞壁を分解する方法であって、
−植物又は野菜の副産物又は産業廃棄物を上記のような融合タンパク質によって、又は上記のような形質転換された菌類細胞によって酵素処理する工程、
−任意選択で、融合タンパク質の作用と組み合わせた蒸気爆発によって植物又は野菜の副産物を物理的に処理する工程、
−任意選択で、適切な微生物又は酵素によって、上記酵素処理中に細胞壁から放出された化合物を生体内変換する工程、
−上記酵素処理中に細胞壁から放出された、又は上記生体内変換工程中に得られた目的の化合物を回収し、必要であれば精製する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
フェルラ酸、もしくは桂皮酸及びヒドロキシチロソールであるカフェ酸、もしくは没食子酸等の抗酸化剤、フェルラ酸もしくはｐ−クマル酸の生体内変換によりそれぞれ得られるバニリン又はｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド等の香料、バイオエタノールの調製のため、又はパルプ及び紙の漂白のための、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
Ｃ末端の糖質結合分子（ＣＢＭ）を含まない少なくとも二つの植物細胞壁分解酵素、及び任意選択でＣＢＭの間の融合タンパク質であって、前記酵素及びＣＢＭが菌類の天然タンパク質又はその変異型に対応する組換えタンパク質である融合タンパク質。
【請求項１９】
−ＣＢＭを含まない植物細胞壁分解酵素が請求項２〜８のいずれか一項に記載のものであり、
−ＣＢＭが請求項９又は１０に記載のものである、
請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
自身に含まれるタンパク質の少なくとも二つの間にリンカーを含み、当該リンカーが請求項１１〜１３のいずれか一項に記載のものである、請求項１８又は１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡ又は配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質であって、二つの当該タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１２で表される融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質、
−配列番号２で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＡと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質であって、当該三つのタンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１４で表される融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢとの間の融合タンパク質であって、二つの当該タンパク質の間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１６で表される融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、黒こうじ菌のセロビオヒドロラーゼＢ中に存在する配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質、
−配列番号４で表される黒こうじ菌のフェルロイルエステラーゼＢと、配列番号６で表される黒こうじ菌のキシラナーゼＢと、配列番号８で表されるＣＢＭとの間の融合タンパク質であって、当該三つのタンパク質のそれぞれの間に高度にグリコシル化されたリンカーとして配列番号１０で表される配列を含み、配列番号１８で表される融合タンパク質
等の、フェルロイルエステラーゼとキシラナーゼ、及び任意選択でＣＢＭの間の、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸で形質転換されたベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターを使用して請求項２２に記載の核酸で形質転換された宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２４に記載の宿主細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養、培養中に前記宿主細胞により産生された融合タンパク質の回収、及び必要であればその精製を含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を調製する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００９−５０４１４３（Ｐ２００９−５０４１４３Ａ）
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２５４２６（Ｐ２００８−５２５４２６）
【出願日】平成１８年７月２６日（２００６．７．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００７３７０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１９９４９
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５０５１２９０７９）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミック (15)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＡＧＲＯＮＯＭＩＱＵＥ
【出願人】（５０８０４２９６２）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＦＲＡＮＣＡＩＳ ＤＵ ＰＥＴＲＯＬＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月５日（２００９．２．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２６日（２００６．７．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００７３７０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１９９４９
【国際公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【出願人】（５０５１２９０７９）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ アグロノミック (15)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＡＧＲＯＮＯＭＩＱＵＥ
【出願人】（５０８０４２９６２）
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＦＲＡＮＣＡＩＳ ＤＵ ＰＥＴＲＯＬＥ
【Ｆターム（参考）】
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