水可溶性イソフラボン組成物およびその製造方法並びにその用途
α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、必要によりイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、 α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量に対する、イソフラボンとイソフラボンアグリコンとの合計中に含まれるアグリコン量の比［α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量／（イソフラボン中のアグリコン量＋イソフラボンアグリコン量）］が、２．５／１以上である水可溶性イソフラボン組成物、または、 α−グルコシルイソフラボンとイソフラボンとイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、該組成物中のイソフラボンアグリコン量が、該組成物中の全アグリコン量の０．０１〜２０％である水可溶性イソフラボン組成物、あるいは、該組成物を含む飲料、化粧品、医薬品又は飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水可溶性イソフラボン組成物およびその製造方法並びにその用途に関し、さらに詳しくは、水可溶性に優れ、吸収における即効性と、吸収後の薬理作用の持続性等に優れた水可溶性イソフラボン組成物およびその製造方法並びにその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソフラボンおよびその誘導体（イソフラボン誘導体）は、骨のカルシウムの過剰な流出を防ぎ、補給したカルシウムを逃さない効果があり、高齢者に多い骨粗鬆症を防止し、また女性ホルモンのアンバランスを緩和し、女性ホルモンの役割を果たすものを補充して更年期障害を防止し、コレステロールの酸化を防ぎ動脈硬化を防止し、高脂血症等の成人疾患の防止に有効であることが知られている。そのため大豆イソフラボンおよびその誘導体の摂取が推奨され、大豆イソフラボンおよびその誘導体を抽出する方法が種々提案されている。
【０００３】
例えば、上記した骨粗鬆症の薬剤による治療法としては、従来よりカルシウム剤、活性ビタミンＤ３剤、女性ホルモン剤などの投与が挙げられる。また、骨粗鬆症の発症を予防するには、日ごろから食事、運動を含めた生活習慣の改善を図ることによって骨密度を低下させないようにすることが有効である。特に閉経後の女性では、女性ホルモンのエストロゲンの分泌量が低下するが、その影響を受けて動脈硬化、高脂血症、高血圧などの更年期障害に加えて、閉経後骨粗鬆症の発症のリスクも高まる。したがって、そうした疾患に対する予防策としても大豆イソフラボンおよびその誘導体などを積極的に摂取することが望ましい。
【０００４】
また、もし、体内に速やかに吸収され、かつ、より長期間体内に高濃度で止まることができるイソフラボン誘導体あるいはその組成物が開発できれば、その意義は大きい。
【０００５】
しかしながら、これまでのところ、その栄養分や薬効成分が速やかに吸収され、吸収後はより長期間体内に止まり、骨粗鬆症、動脈硬化、更年期障害などの発症をより積極的に防止しうるような、栄養分や薬効成分を含む食品や医薬品などは提案されていない。
【０００６】
そのため、日常的に食品または健康食品などを摂取することによりカルシウムの流出を低減・防止でき、骨密度を維持させ、骨粗鬆症の発症を予防でき、あるいは骨粗鬆症を治療できれば、その有用性は高い。このため手軽にそして安全に骨密度を向上させ、骨粗鬆症を予防できるような新規な健康食品または医薬品の出現が望まれていた。
【０００７】
これと同様に、女性ホルモンのアンバランスを緩和し、女性ホルモンの役割を果たすものを補充して更年期障害を防止し、コレステロールの酸化を防ぎ動脈硬化を防止し、高脂血症等の成人疾患を予防できるような新規な健康食品、医薬品あるいは化粧品の出現も望まれていた。
【０００８】
さらにまた、本発明者らは、従来より提案されている、大豆イソフラボン誘導体の抽出方法、あるいはその水可溶性を向上させる方法、さらには、それにより得られたものなどについても鋭意検討した。
【０００９】
大豆イソフラボン誘導体を抽出する方法あるいはその水可溶性を向上させる方法などとしては、例えば、大豆抽出液を合成吸着樹脂に接触させて該樹脂にイソフラボンを吸着させた後、有機溶媒または有機溶媒と水との混合物でイソフラボンを溶出させる方法（特開昭６２−１２６１８６号公報：特許文献１）、
大豆胚芽を水可溶性有機溶媒で抽出し濃縮した後、疎水性有機溶媒により親油性成分を除去し、再び濃縮、精製、乾燥してイソフラボン化合物を製造する方法（特開平１１−２６３７８６号公報：特許文献２）、
大豆由来のイソフラボン誘導体抽出物をエタノール溶液中で分岐型マルトシルα−サイクロデキストリンの共存下で加温溶解し、冷却後不溶物を除去する、水溶解性イソフラボン誘導体抽出物の製造方法（特開２００２−１５５０７２号公報：特許文献３）、また、
大豆原料から得た粗抽出物を、水溶液中でサイクロデキストリンと混合させた後、不溶物を除去する、水易溶性大豆イソフラボンの製造方法（特開平１０−２９８１７５号公報：特許文献４）、
などが挙げられる。
【００１０】
また、イソフラボン誘導体をβ−またはγ−サイクロデキストリンで包接させてなり、苦味などが抑制され、水に対する溶解性が高く、体内への吸収効率の高い包接物（特開平９−３０９９０２号公報：特許文献５）も提案されている。
【００１１】
しかしながら、例えば、上記特開昭６２−１２６１８６号公報、特開平１１−２６３７８６号公報に記載の方法で得られた抽出物は、特開２００２−１５５０７２号公報にも記載されているように、水溶液への溶解性が悪い。同様に、特開平９−３０９９０２号公報に記載の包接物も、水溶液への溶解性、水溶液中での安定性の点で改良の余地がある。
【００１２】
また、上記特開２００２−１５５０７２号公報に記載の方法によれば、イソフラボン誘導体抽出物を効率的に回収できる旨記載されているが、大豆粗抽出物中のエタノール可溶性の不純物までも濾液中に流出し回収されてしまうため、イソフラボンあるいはその誘導体の収率などの点で更なる改良の余地があり、また得られたイソフラボンあるいはその誘導体の包接物は、次いで、糖および糖転移酵素の存在下にα−グルコシル化して用いようとすると、含まれているエタノールが酵素活性を阻害するため、酵素処理に先立ちエタノールを揮散・除去しておく必要がある。また、特開平１０−２９８１７５号公報に記載の方法では、上記特開２００２−１５５０７２号公報にも記載されているように、約１０％程度回収できるに過ぎず、イソフラボンあるいはその誘導体の収率の点で更なる改良の余地がある。
【００１３】
なお、特開２０００−３２７６９１号公報（特許文献６）には、大豆及び／または大豆加工品からｐＨ８以上のアルカリ性溶液でイソフラボン誘導体を抽出し、あるいは熱水または有機溶媒でイソフラボン誘導体を抽出し、次いで、α−グリコシル糖化合物と糖転移酵素を作用させα−グリコシルイソフラボン誘導体を生成した後、ｐＨ５．５以下の酸性にするか冷却することにより不純物を沈澱として除去する、大豆由来イソフラボン誘導体またはそのアグリコンの製造方法が記載されている。
【００１４】
しかしながら、この公報（特開２０００−３２７６９１号公報）に記載の方法では、得られた大豆由来α−グルコシルイソフラボン誘導体は、イソフラボンおよびその誘導体以外の大豆不純物を含みアルカリ側で酵素反応を行っているため、不純物に由来する色価が高く、また分解反応も起こりやすく、改良の余地があった。
【００１５】
【特許文献１】特開昭６２−１２６１８６号公報
【特許文献２】特開平１１−２６３７８６号公報
【特許文献３】特開２００２−１５５０７２号公報
【特許文献４】特開平１０−２９８１７５号公報
【特許文献５】特開平９−３０９９０２号公報
【特許文献６】特開２０００−３２７６９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、体内に速やかに吸収され、かつより長期間に亘り体内に高濃度で止まることができ、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などの効果が期待でき、骨密度向上剤などの医薬品として利用でき、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品あるいは飼料に添加して用いることにより、骨代謝の改善をバランスよく効率的に図ることができる酵素処理イソフラボン類組成物（イソフラボン誘導体組成物）を提供することを目的としている。
【００１７】
本発明は、水可溶性イソフラボン組成物の特性を生かした化粧品など、水可溶性イソフラボン組成物の好適な用途を提供することを目的としている。
【００１８】
本発明は、原料として大豆イソフラボン類を含む大豆イソフラボン抽出物を用いて、酵素処理されたイソフラボン類を高収率で製造し得るような、酵素処理イソフラボン類の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、驚くべきことに特定組成比のフラボノイド類を摂取すると、従来のフラボノイド類を摂取する場合に比して、より長期間に亘って体内に止まり、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などに効果が期待できること、また、上記特定組成比のフラボノイド類は、骨密度向上剤などの医薬品として利用でき、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品および飼料に添加して用いることにより、骨代謝の改善をバランスよく効率的に図ることができることなどを見出して本発明を完成するに至った。
【００２０】
さらに、本発明者らは、水可溶性イソフラボン組成物の調製に好適に用い得るイソフラボン誘導体自体の抽出効率を上げるべく鋭意研究を重ねた結果、大豆イソフラボン類を含む粗大豆抽出物からイソフラボン類を抽出するに際して、特開２００２−１５５０７２号公報に示すようにエタノールを用いるのではなくアルカリを用い、またサイクロデキストリンによる包接後は、不純物を酸の存在下に沈殿させると、濾別にて効率よく濾液からイソフラボン類を分取でき、さらに必要により、容易に酵素処理反応を行って水可溶性イソフラボン組成物あるいはその調製用などとして好適に用いることもできることなどを見出して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の事項に関する。
【００２１】
本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、必要によりイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、
α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量に対する、イソフラボンとイソフラボンアグリコンとの合計中に含まれるアグリコン量の比＝［α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量／（イソフラボン中のアグリコン量＋イソフラボンアグリコン量）］が、２．５／１以上、好ましくは５／１以上であることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンとイソフラボンとイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、該組成物中のイソフラボンアグリコン量が、該組成物中の全アグリコン量の０．０１〜２０％であることを特徴としている。
【００２３】
本発明においては、上記α−グルコシルイソフラボンは、イソフラボンにグルコースがα−結合にて平均２．０〜２０個付加したものであることが望ましい。
【００２４】
本発明においては、上記イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、イソフラボンアグリコンとを含むことが好ましい。
【００２５】
本発明においては、上記α−グルコシルイソフラボンが、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む組成物に、サイクロデキストリンと糖転移酵素とを作用させて得られたものであることが好ましい。
【００２６】
本発明においては、上記α−グルコシルイソフラボンが、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む組成物に、サイクロデキストリンを作用させ、次いで、酸性条件下に冷却して生じた沈殿物を濾別除去した後、糖転移酵素を作用させることにより得られたものであることが好ましい。
【００２７】
本発明においては、上記何れの態様においても、上記サイクロデキストリンが、β−サイクロデキストリンまたは分岐β−サイクロデキストリンであることが水可溶性良好のものが得られるため好ましい。
【００２８】
本発明に係る飲食物、化粧品、医薬又は飼料は、上記の何れかに記載の水可溶性イソフラボン組成物を含むことを特徴としている。
【００２９】
本発明においては、上記飲食物が酸性飲料であることが好ましい。
【００３０】
本発明においては、上記飲食物は、さらに、酵素処理ヘスペリジンおよび／または酵素処理ルチンを含んでいてもよい。
【００３１】
本発明においては、大豆イソフラボン抽出物を水又は水性媒体に懸濁させ、得られた懸濁液にサイクロデキストリンを加え、４０〜１００℃に加熱してサイクロデキストリンを溶解させた後、得られた溶液に、アルカリを添加混合してｐＨ８〜１３に調整してイソフラボン類を溶解させると共に、イソフラボン類をサイクロデキストリンに包接させ、次いで、
サイクロデキストリンに包接されたイソフラボン類の含有液に、酸を添加混合してｐＨ５．５〜２．０に調整した後降温し、生じた沈殿物を濾過にて除去し、得られた濾液を、次いで、ｐＨ５．０〜７．０に調整して、濾液中に含まれているイソフラボン類の酵素処理を行うことを特徴としている。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、体内に速やかに吸収され即効性を有し、かつより長期間に亘り体内に高濃度で止まることができ効果の持続性を有し、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などのより優れた効果が期待でき、骨密度向上剤などの医薬品として利用でき、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品あるいは飼料に添加して用いることにより、骨代謝の改善をバランスよく効率的に図ることができる水可溶性イソフラボン組成物（酵素処理イソフラボン類組成物）が提供される。
【００３３】
本発明によれば、水可溶性イソフラボン組成物の特性を生かした用途である飲食物、化粧品、医薬品、飼料などが提供される。
【００３４】
本発明によれば、原料として（粗）大豆イソフラボン抽出物を用いて、酵素処理イソフラボン類を製造するに際して、粗大豆イソフラボン抽出物からエタノール溶解に依らずに、アルカリを用いてイソフラボン類の溶解、抽出などを行っているため、イソフラボン類の酵素処理に先立つエタノールの除去工程が不要であり、より少ない工程数で、効率よく酵素処理イソフラボン類を製造でき、しかも、エタノールを使用しないため、抽出液（溶解液）中にエタノール可溶性の不純物の流入がなく、高収率で高純度の酵素処理イソフラボン類を製造し得るような、酵素処理イソフラボン類の製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下、本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物およびその製造方法並びにその用途について、具体的に説明する。
【００３６】
＜水可溶性イソフラボン組成物＞
本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、必要によりイソフラボンアグリコンとを含み、
α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量に対する、イソフラボンとイソフラボンアグリコンとの合計中に含まれるアグリコンの量の比（Ｃｇ）＝［α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量／（イソフラボン中のアグリコン量＋イソフラボンアグリコン量）］が、２．５／１以上であることが水溶液中での安定性と、経口摂取時の吸収における即効性と、吸収後の薬効の持続性の点から望ましい。
【００３７】
なお、アグリコン量比は、重量比、モル比の何れでもよいが、特に断らない限り重量比で示す。また、上記アグリコン量比（Ｃｇ）の算出等に際し、α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量、イソフラボン中のアグリコン量、イソフラボンアグリコン中のアグリコン量等は、何れも、ゲニステインに換算して求める。
【００３８】
なお、このアグリコン量比（Ｃｇ）の上限値は、通常２５／１かそれ以下であることが、該組成物が体内に速やかに吸収され即効性を有し、かつより長期間に亘り体内に高濃度で止まることができ効果の持続性を有し、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などのより優れた効果が期待でき、骨密度向上剤などの医薬品として利用でき、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品あるいは飼料に添加して用いることにより、骨代謝の改善をバランスよく効率的に図ることができる点から望ましい。
【００３９】
なお、このイソフラボン組成物中の上記アグリコン量比（Ｃｇ）（重量比）が２．５／１未満では、該組成物の溶液安定性が低くなることから、特に飲料等の液体中での使用に好ましくない。
【００４０】
また本発明では、上記α−グルコシルイソフラボンにおいて、イソフラボンにα−結合したグルコース（Ｇ）の数が平均２．０〜２０個であることが該組成物中のイソフラボンとイソフラボンアグリコンが水溶液中での安定性を保つことができる点から望ましい。
【００４１】
本発明に係る上記イソフラボン組成物には、α−グルコシルイソフラボンとイソフラボンとが必須成分として含まれているが、その好ましい態様においては、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、イソフラボンアグリコンとが含まれていることが上記効果、すなわち、体内により速やかに吸収され強い即効性を有し、かつより長期間に亘り体内に高濃度で止まることができ効果のより優れた持続性を有し、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などのより優れた効果が期待でき、骨密度向上剤などの医薬品として利用でき、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品あるいは飼料に添加して用いることにより、骨代謝の改善をバランスよく効率的に図ることができる点から望ましい。
【００４２】
本発明に係る上記イソフラボン組成物には、上記α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、必要により含まれるイソフラボンアグリコン以外に、デキストリン（サイクロデキストリン（ＣＤ）を含む。）、オリゴ糖などの糖類、タンパク質、ペプチド、他のフラボノイド類などが、本発明の目的に反しない範囲で含まれていてもよい。
【００４３】
なお、イソフラボンアグリコンは、下記式［Ｉ］：
【００４４】
【００４５】
【表１】
【００４６】
で表されるイソフラボンにおいて、その基Ｒ３がＨである構造のものである。（式［Ｉ］中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の定義は、上記表１の通りである。）
本発明では、α−グルコシルイソフラボンの付加糖数（付加グルコース数）（ｎ）、すなわち、上記式［Ｉ］の化合物におけるＲ３が、α−結合で連なる複数のグルコースからなる場合にこのα−結合にて付加したグルコースの数が、平均２．０個以上であることが、本発明のイソフラボン組成物の水可溶性の向上、該組成物中のイソフラボンとイソフラボンアグリコンの水溶液中での安定性を保つ点から望ましい。なお、該α−グルコシルイソフラボンの付加糖数（ｎ）の上限値は、特に限定されないが、通常、２０個程度までである。
【００４７】
このようなアグリコン量比（Ｃｇ）のイソフラボン組成物を得るには、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、必要により用いられるイソフラボンアグリコンとを、（Ｃｇ）＝［α−グルコシルイソフラボンのアグリコン／（イソフラボンのアグリコン−イソフラボンアグリコン）］（重量比）で２．５／１以上となるようにこれら成分を配合するか、あるいはイソフラボンのα−グルコシル化反応等を実施すればよい。
【００４８】
なお、重量比では、α−グルコシルイソフラボンにおける付加糖数が多いほど、単位α−グルコシルイソフラボン重量におけるアグリコン重量の割合は減るから、その付加糖数を考慮して、α−グルコシルイソフラボン重量を増加させる必要がある。
【００４９】
また、本発明では、上記α−グルコシルイソフラボンが、後述するように、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む組成物に、サイクロデキストリンを作用させ、次いで、酸性条件下に冷却して生じた沈殿物を濾別除去した後、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む濾液にｐＨ５．０〜７．０で糖転移酵素を作用させることにより得られたものであると、イソフラボン及びイソフラボン誘導体の分解がほとんど生じず、収率良くα−グルコシルイソフラボン及びその組成物が得られることから好ましい。
【００５０】
本発明では、上記サイクロデキストリンとしては、α−タイプ、β−タイプ、γ−タイプが挙げられる。これらのうちでは、β−サイクロデキストリンまたは分岐β−サイクロデキストリンが、イソフラボンを効率よく包接し、安定化させることから、該組成物の製造上好ましい。
【００５１】
また、本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンとイソフラボンとイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、該組成物中のイソフラボンアグリコン量が、該組成物中の全アグリコン量の０．０１〜２０％であることが好ましく、さらに好ましくは０．５〜１０．０％であることが望ましい。
【００５２】
このような量でイソフラボンアグリコンを含む水可溶性イソフラボン組成物は、特に即効性と持続性に優れる傾向がある。なお、このイソフラボンアグリコン量が特に０．０１％に満たないと即効性に欠ける傾向があり、また２０％を超えると溶液中で沈殿を生じやすい傾向にある。
【００５３】
＜用途（飲食物、医薬など）＞
本発明に係る飲食物、化粧品、医薬又は飼料（これらをまとめて、「飲食物等」ともいう。）は、上記の水可溶性イソフラボン組成物を含むことを特徴としている。
【００５４】
例えば、この飲食物中に含まれる水可溶性イソフラボン組成物は、水可溶性に優れ、例えば、５℃の水１リットルに、１ｇの量で溶解させることができ、呈味は良好であり、苦味、渋味、収斂味などの異味が殆どない。
【００５５】
またこの飲食物中に含まれる水可溶性イソフラボン組成物は、水や、天然ジュース、コーヒー、ウーロン茶、紅茶、麦茶、緑茶、コーラ、ラムネ、サイダー、ミルクココア、ココアなどの清涼飲料、加工乳、発酵乳、乳製品、乳酸菌飲料などの水性飲料；
みそ、醤油、そばつゆ、めんつゆ、焼き肉のたれ、だし汁、ソース、ケチャップ、マヨネーズ、ドレッシング等の液体または半固体の調味料；
ゼリー、プリン等の水性菓子；
などへの溶解性に優れており、その配合量は、特に限定されず、飲食物の種類などに応じて適宜設定できる。
【００５６】
これらの飲食物のうちでは、特に酸性飲料に対する溶解性に優れ、例えば、柑橘ジュース、リンゴジュース、トマトジュース、パイナップルジュース、コーラ、乳酸菌飲料などの酸性飲料１リットル中に、０．００１〜１０ｇの量で用いることが好ましい。
【００５７】
このような飲食物、あるいは化粧品、医薬又は飼料は、さらに酵素処理ヘスペリジンおよび／または酵素処理ルチンを水可溶性イソフラボン組成物に対して任意の割合で含んでいてもよい。この酵素処理ヘスペリジンと上記水可溶性イソフラボン組成物、または酵素処理ヘスペリジンと酵素処理ルチンと上記水可溶性イソフラボン組成物を含む飲食物は、骨粗鬆症の予防および改善効果、循環器疾患の改善という点で優れている。
【００５８】
本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、経口摂取すると、体内に速やかに吸収される即効性を有し、かつより長期間に亘り体内に高濃度で止まることができ効果の持続性を有し、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などのより優れた効果が期待でき、骨密度向上剤、骨粗鬆症予防・治療剤、更年期障害予防・治療剤、ガン細胞増殖抑制剤などの医薬品として利用できる。
【００５９】
このように上記用途の医薬品あるいは健康食品などとして、水可溶性イソフラボン組成物を用いる場合には、体重１ｋｇ当たり、０．０００２〜２ｇ／日の量で経口摂取すればよい。
【００６０】
この水可溶性イソフラボン組成物を、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品、嗜好品、飼料、医薬部外品などに任意量で添加して用いることにより、骨代謝の改善などをバランスよく効率的に図ることができる。
【００６１】
一般飲食物としては、より具体的には、例えば、菓子、洋菓子、氷菓、シロップ、果実加工品、野菜加工品、漬け物、魚肉、ハム、ソーセージ、缶詰、瓶詰め品、酒類等；嗜好品としては、タバコ、ガム等；飼料としては、家畜、家禽、魚、ペットなどの飼料、餌等；化粧品としては、口紅、リップクリーム、化粧水、乳液、クリーム等の美容液や整髪料等；医薬部外品としては、練り歯磨きなどが挙げられる。
【００６２】
このように本発明の水可溶性イソフラボン組成物を、上記用途に経口剤、外用剤、薬用剤として用い、また各種食品用、化粧品用、飼料用の添加剤として用いてもよい。
【００６３】
＜水可溶性イソフラボン組成物の製造＞
本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、大豆イソフラボン類を０．０５〜０．３５％（重量％）の量で含む大豆胚芽、大豆粉、脱脂加工大豆、きな粉、豆乳、おから等の粗大豆抽出物（粗大豆加工品）を用いることもできるが、好ましくはイソフラボンを５〜９０％含有する大豆イソフラボン抽出物を用い、まず大豆イソフラボン抽出物を水あるいは水性媒体１リットル当たり、１〜２００ｇ程度加え混合し、次いで、得られた懸濁液に前記サイクロデキストリン、好ましくは優れた溶解性、経済性の点からβ−サイクロデキストリンまたは分岐β−サイクロデキストリンを加え、４０〜１００℃に加熱してサイクロデキストリンを溶解させる。
【００６４】
この際のサイクロデキストリン使用量は、懸濁液１リットル当たり、０．１〜４０００ｇ、好ましくは１〜２０００ｇの量で用いられる。
【００６５】
このように懸濁液にサイクロデキストリンを溶解させた後、得られた溶液に、アルカリを添加混合してｐＨ８〜１３、好ましくはｐＨ９〜１２に調整してイソフラボン類を溶解させると共に、イソフラボン類をサイクロデキストリンに包接させる。
【００６６】
アルカリとしては、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【００６７】
なお、イソフラボン類がサイクロデキストリンに包接されたことは、懸濁液が透明になることから確認できる。
【００６８】
次いで、本発明では、サイクロデキストリンに包接されたイソフラボン類の含有液に、酸を添加混合してｐＨ５．５〜２．０、好ましくはｐＨ４．５〜３．０に調整した後、通常、１〜６０℃、好ましくは１３〜２０℃に降温して沈殿を生じさせる。酸としては、有機酸でも無機酸でもよく、酢酸、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、クエン酸等が挙げられる。
【００６９】
次いで、生じた沈殿物を濾過にて除去し、さらに、下記のように酵素処理して水可溶性イソフラボン組成物を調製する。
【００７０】
すなわち、本発明では、上記のように沈殿物を濾過にて除去して得られた上記濾液を酵素活性の良好な条件である、ｐＨ５．０〜９．０、好ましくはｐＨ５．５〜７．０に調整して、常法により酵素処理を行う。
【００７１】
このようにサイクロデキストリンに包接されたイソフラボン類の酵素処理を行なうと、イソフラボン類にサイクロデキストリン由来の糖が転移される。この糖は、通常、イソフラボン類を包接しているサイクロデキストリンの一部（あるいは全部）を利用すればよいが、酵素処理に際し、新たに澱粉やその部分分解物、糖などを添加し、これを糖転移に利用してもよい。
【００７２】
酵素としては、イソフラボン類に糖転移可能な酵素であれば特に制限されないが、本発明では、バチルス・ステアロサーモフィラスやバチルス・マセランス等バチルス属の微生物由来のサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）などが好ましく使用でき、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅが糖転移効率が高い点からより好ましい。その他に、バチルス・メガテリウム、バチルス・サーキュランス等の同じバチルス属に属する微生物由来のＣＧＴａｓｅも使用できる。本発明では、２種以上の酵素を併用してもよい。酵素使用量、酵素処理条件（温度、水量、ｐＨ、時間）などは、常法によればよい。
【００７３】
このように酵素処理された水可溶性イソフラボン組成物は、酵素処理前のイソフラボン類と同様の生理活性を有し、水可溶性の点で未処理物に比して、非常に優れている。
【００７４】
このように酵素処理された水可溶性イソフラボン組成物は、必要により、予め１０〜９９．５％（重量％）エタノールなどの含水有機溶媒、有機溶媒などで活性化された無極性多孔性吸着樹脂に、上記酵素処理イソフラボン類の水溶液として通液し、水洗した後、１０〜９９．５％（重量％）エタノールなどの含水有機溶媒、有機溶媒などを通液して、吸着しているイソフラボン類を溶出させ、溶出液を回収し、溶媒を留去した後、凍結乾燥等してもよい。このように、多孔性吸着樹脂による処理を行うと、酵素処理イソフラボン類の「総イソフラボン含量」（定義は後述する。）は、通常２０〜８０％程度にまで高めることができる。なお、多孔性吸着樹脂としては、特開２０００−３２７６９１号公報第４頁［０００９］欄に記載のもの、例えば、「ダイヤイオンＨＰ」、「デュオライトＳ」、「アンバーライトＸＡＤ」等を使用すればよい。また、このように多孔性吸着樹脂を使用して総イソフラボン含量を高める代わりに、クロマト分離により総イソフラボン含量を高めても良い。
【００７５】
この水可溶性イソフラボン組成物（乾燥固形物）中の総イソフラボン含量は、通常、５〜９０％、好ましくは２０〜４０％であることが前記比（Ｃｇ）を好ましい範囲に維持する点から望ましい。
【００７６】
本発明の水可溶性イソフラボン組成物の製造においては、酵素反応に供するイソフラボン類の溶解用としてエタノールを使用していないため、その後の酵素処理に先立ち、酵素活性を阻害するエタノールの除去工程が不要化できる。その結果、より少ない工程数で、効率よく水可溶性イソフラボン組成物を製造できる。
【００７７】
さらに、本発明では、大豆イソフラボン抽出物（抽出液）を用いた水可溶性イソフラボン組成物の製造工程でこのようにエタノールを使用しないため、抽出液中にエタノール可溶性の不純物の流入がなく、高収率でα−グルコシルイソフラボンを製造し得るような、水可溶性イソフラボン組成物の製造方法が提供される。
【００７８】
本発明の水可溶性イソフラボン組成物では、該組成物中に含まれるα−グルコシルイソフラボンの平均付加糖数（ｎ）が、２．０個以上であることが望ましい。
【００７９】
上記のようにして得られた水可溶性イソフラボン組成物は、前記イソフラボン組成物中の上記アグリコン量比（Ｃｇ）が２．５／１以上となるようにそのままで用い、またはα−グルコシルイソフラボンとイソフラボンアグリコンとイソフラボンとを適宜配合すればよい。なお、このアグリコン量比（Ｃｇ）の上限値は特に限定されないが通常２５／１程度である。
【００８０】
本発明に係る上記水可溶性イソフラボン組成物は、その好ましい態様においては、α−グルコシルイソフラボンとイソフラボンとイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、該組成物中のイソフラボンアグリコン量が、前述したように、該組成物中の全アグリコン量の０．０１〜２０％であることが好ましいが、このようにイソフラボンアグリコン量を調整するには、例えば、酵素処理イソフラボン中に含まれるα−グルコシルイソフラボンとイソフラボン中のアグリコン量に対して、所定量となるように既知のイソフラボンアグリコンを添加し、アルカリ溶解した後、所望のｐＨに調整すればよい。
【００８１】
以下、本発明について実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、係る実施例により何ら限定されるものではない。
【００８２】
以下の実施例、比較例などで、「％」は、特に断らない限り、「重量％」の意味である。
【００８３】
＜総イソフラボン含量の測定＞
総イソフラボン含量（イソフラボン含量（単位：重量％）の総和を意味する。）は、酵素処理イソフラボンの場合は、糖転移酵素（ＣＧＴａｓｅ）の作用によりイソフラボンに付加されている糖を加水分解酵素（グルコアミラーゼ）で外して測定する。
【００８４】
具体的には、試料の酵素処理イソフラボン１ｇを２５℃の水０．１リットルに溶解し、グルコアミラーゼを０．０１ｇ添加した後、ｐＨ５．０、温度５０℃の条件で３時間反応させて、酵素処理イソフラボン中のα−１，４結合で結合している糖（Ｇ）を加水分解させてから、既知の方法（（財）日本健康・栄養食品協会発行、健康補助食品規格規準集に記載された、大豆イソフラボンの試験方法に準拠）に基づき、下記の条件下でＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）にてイソフラボン量を測定する。
【００８５】
ＨＰＬＣ条件
使用機器：Ｗａｔｅｒｓ９９６（ウォーターズ社製）
使用カラム：資生堂カプセルパックＯＤＳ−Ｃ１８ ＵＧ１２０（２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
溶離液：水／メタノール／酢酸＝６５／３０／５（ｖ／ｖ／ｖ）
検出：ＵＶ ２５４ｎｍ
注入量：１０μｌ
【００８６】
＜付加糖数の測定＞
酵素処理イソフラボン５ｇを２５℃のイオン交換水５０ｍｌに溶解し、吸着樹脂５０ｍｌに通液・水洗してα−グルコシルイソフラボン以外の物質を除去する。吸着画分を６０％エタノール１５０ｍｌで脱着し、アルコールを留去した後、グルコアミラーゼを０．０１ｇ添加して、ｐＨ５．０、温度５０℃で５時間作用させる。
【００８７】
グルコアミラーゼ処理した液は、水を用いて同様の処理した液をブランクとし、市販のグルコース測定キット（ムタロターゼ・ＧＯＤ法）により、グルコース量を求め、そのモル数を算出する（Ｄ）。
【００８８】
一方、上述した総イソフラボン含量の測定方法で求めた酵素処理イソフラボン中の総イソフラボン量をゲニスチンに換算し、そのモル数を求める（Ｅ）。
【００８９】
平均付加糖数（個）は、（Ｄ）を（Ｅ）で割る、次式により求める。
付加糖数（個）＝Ｄ／Ｅ
【００９０】
＜（Ｃｇ）の測定＞
試料Ａ：０．０５ｇを２５℃のイオン交換水１００ｍｌに溶解し、総イソフラボン含量の測定の項目で既述したＨＰＬＣ条件と同じ条件で測定する。（財）日本健康・栄養食品協会発行の健康補助食品規格基準集の「大豆イソフラボンの試験方法」に基づき、試料中のイソフラボン（Ｆ）およびイソフラボンアグリコン（Ｇ）を、標準としてダイズイン標準品を使用し、ゲニステインとしてアグリコン量を求める。すなわち、アグリコン量は、ゲニステインに換算して求めた量である。
【００９１】
また、上述した総イソフラボン含量の測定方法に従い、試料中の総イソフラボンをゲニステインとして測定し、これより、上記（Ｆ）および（Ｇ）を引いた値をα−グルコシルイソフラボンのアグリコン量とする。
【実施例１】
【００９２】
＜サイクロデキストリンによる包接工程＞
４０％（重量％）の量でイソフラボンを含む大豆イソフラボン抽出物３ｇを６００ｍｌのイオン交換水に懸濁させた。次に、得られた懸濁液にβ−サイクロデキストリン２７ｇを加え、７０℃に加温し、β−サイクロデキストリンを溶解させた。この溶液に、濃度１５％の水酸化ナトリウム水溶液を９ｍｌ添加混合しｐＨ１１．３に調整してイソフラボンを完全に溶解し、イソフラボンをβ−サイクロデキストリンに包接させた。
【００９３】
次に、β−サイクロデキストリンに包接されたイソフラボンの含有液に、濃度２０％の硫酸５．５ｍｌを６０℃で添加混合してｐＨ４．０に調整した後降温し、液温が１２℃になるまで冷却した。
【００９４】
その結果生じた沈殿物を濾過にて取り除き、濾液を分取した。（これを、「試料Ｃ」ともいう。）
＜酵素処理反応工程（酵素処理）＞
得られた濾液を、１５％水酸化ナトリウム溶液１ｍｌを用いてｐＨ５．５に調整した。
【００９５】
次いで、この濾液６１０ｍｌにバチルス・ステアロサーモフィラス由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ［（株）林原生物化学研究所製、０．３ｍｌ］を添加して６０℃で一晩加温し、イソフラボンに糖を転移反応させた。
【００９６】
なお、イソフラボンに、糖が転移したことは、ＨＰＬＣにより確認した。
【００９７】
このようにイソフラボンへの糖の転移反応を行った後、反応液を９０℃以上の温度で１時間加温し酵素を失活させた。その後、濾過を行った。分取された濾液を濃縮後に凍結乾燥し、乾燥物２７．６ｇを得た。
該乾燥物中の「総イソフラボン含量」は４．０２％であった。
【００９８】
＜多孔性吸着樹脂による精製工程＞
次いで、予め５０％エタノールを通液して活性化させた無極性多孔性吸着樹脂（オルガノ（株）製、型番：ＸＡＤ−７）に、上記乾燥物の水溶液（濃度：５．５重量％）５００ｍｌを通液してイソフラボン類を該樹脂に吸着させた後、１０００ｍｌの水を流下させて該樹脂を水洗し、サイクロデキストリン（ＣＤ）およびＣＤ分解物を溶出・除去した。その後、５０％エタノールを通液して吸着していたイソフラボン類を溶出させた。イソフラボンを含んだ出液を回収し、出液中のアルコールを留去した後、凍結乾燥させ、固形物３．５ｇを得た。本品（水可溶性イソフラボン組成物）の総イソフラボン含量は３５．８％であった（これを「試料Ａ」とする）。本品を分析したところ、α−グルコシルイソフラボン（イソフラボンとして）２９．２％（アグリコンとして１８．３％）、イソフラボン６．６％（アグリコンとして４．１％）、イソフラボンアグリコン０％であり、平均付加糖数は、３．６であった。
【００９９】
［比較例１］
＜サイクロデキストリンによる包接工程＞
総イソフラボン含量４０％の大豆イソフラボン抽出物１．２ｇに、濃度約３０％のエタノール水溶液３８ｍｌを添加して混合し、次いで、この大豆イソフラボン抽出物の９倍量のβ−サイクロデキストリン１０．８ｇを添加した後、攪拌下に６０℃に加熱して、その温度で３０分間保持して、イソフラボン類をβ−サイクロデキストリンに包接させた。
【０１００】
次いで、常温（２５℃）まで放冷した後に濾過した。分取された濾液よりエタノールを留去させ、濃縮乾固して固形物２．６７ｇを得た（特開２００２−１５５０７２号公報に準拠。）（試料Ｂとする）。
【０１０１】
得られた固形物のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析を行い、総イソフラボン含量を求めたところ、３．８５％となった。
＜酵素処理反応工程＞
次いで、上記試料Ｂを用いて、サイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させて酵素処理反応を行なう際に、溶媒が３０％エタノールの場合は酵素の作用が低下し、酵素処理がほとんど進行せず、酵素処理前にエタノールを留去する必要があった。
【０１０２】
また本発明の実施例１における、大豆イソフラボン抽出物１．２ｇをｐＨ８以上にして溶解し、β−サイクロデキストリン１０．８ｇに包接させ酸性域に戻した後に濾過をした、実施例１における酵素処理直前のもの（試料Ｃ）を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析したところ、試料Ｃの総イソフラボン含量は４．１２％となった。
【０１０３】
試料Ｂと試料Ｃの総イソフラボン量を比較検討した。
＜考察＞
（１）総イソフラボン含量は、ＨＰＬＣ分析の結果、３０％エタノールを溶媒として包接させた試料Ｂの総イソフラボン含量３．８５％に対して、本発明の試料Ｃの総イソフラボン含量は４．１２％と、総イソフラボン含量が高い。その理由は、試料Ｂでは大豆イソフラボン抽出物のエタノール可溶性の不純物が濾液中に流出し回収されてしまうが、試料Ｃでは調整時にエタノールを使わないため、濾液中への不純物の混入が抑えられて総イソフラボン含量が高くなったものと思われる。
【０１０４】
（２）比較例１では、サイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させて酵素処理反応を行なう際に、溶媒が３０％エタノールの場合は酵素の作用が低下し、酵素処理がほとんど進行せず、酵素処理前にエタノールを留去する必要があった。
これに対し、本発明の実施例１では、ｐＨ８以上にしてイソフラボンを溶解してサイクロデキストリンで包接させたのち、中性域にｐＨ調整しており、エタノールを留去する必要が無く、そのまま酵素反応へと進めることができるため、酵素処理反応の工程をより簡便にすることができるという利点がある。
【０１０５】
［血中動態試験］
（ｉ）５週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系の雄ラット（体重範囲：１０８〜１３４ｇ）を日本チャールズリバー株式会社より購入し、７日間の検疫を行ない、検疫期間終了後に用いた。
（ｉｉ）ラットは、室温２２±３℃、相対湿度５０±２０％、換気回数１０回以上／時間（オールフレッシュエアー方式）、照明１２時間／日（午前６時より午後６時まで照明、１５０〜３００ルクス）に設定した飼育室で、ステンレス製のラット用ブラケットケージ、１ケージあたり１匹ずつ収容し、飼育した。
（ｉｉｉ）飼料は、精製飼料（ＡＩＮ−７６Ａ配合固形飼料、オリエンタル酵母株式会社製）をケージ付属の給餌器により与え、入荷時から自由摂取させた。また、飲料水は自家用水道水をポリカーボネイト製給水瓶により与え、自由摂取させた。
（ｉｖ）群分けは、健康状態を評価し健康な動物の中から体重の層別無作為化法により９匹づつ３群に配分し、各群の平均体重ができるだけ等しくなるようにした。投与開始日のラットの週齢は６週齢、体重範囲は１３７〜１７９ｇであった。
（ｖ）群構成は、酵素処理イソフラボン投与群、イソフラボンのアグリコン投与群、α−グルコシルイソフラボン／（イソフラボン＋イソフラボンのアグリコン）のアグリコン重量比が３．６／１の混合試料投与群の３群構成とした。
【０１０６】
被験物質として、イソフラボンのアグリコンには、「ソイアクトＷ」（イソフラボンのアグリコン３３．３％含有、キッコーマン株式会社 製）を使用し、酵素処理イソフラボンには、実施例１で作った「試料Ａ」を用いた。
【０１０７】
混合試料は、試料ＡとソイアクトＷをアルカリ溶解し、ｐＨ５．５に調整したものを使用した。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
（ｖｉ）被験物質は、それぞれ０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）水溶液に懸濁、または溶解した。これを１８時間の絶食を行なったラットに、ラット用経口ゾンデを用いてラット体重あたり５０μｍｏｌとなるように強制経口投与した。投与２４時間後の採血、および尿の採取まで、給餌は行なわず給水のみとした。
（ｖｉｉ）被験物質投与前（以下０時間とする）、および投与から０．５、１、２、４、８、１２、１６、２４時間後に頚静脈より２ｍｌづつ採血し、それぞれプラスチックチューブに入れ、ハイキャパシティ冷却遠心器（株式会社久保田製作所製）により遠心分離（３５００×Ｇ、４℃、１０分間）をし、血漿を分離した。また、２４時間尿を採取して尿量を測定し、血液と同様に遠心分離した。得られた血漿、および２４時間尿は分析するまでサンヨー超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）にて−８０℃で冷凍保存した。
（ｖｉｉｉ）得られた血漿０．５ｍｌと、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．５ｍｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに取り、充分に攪拌した後に３７℃で２分間、プレインキュベーションした。次に、β−グルクロニダーゼ／スルファターゼ（シグマ社製、Ｔｙｐｅ−Ｈ−２；１０５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，４３００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を、５．５×１０２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、２×１０２ｕｎｉｔｓ／ｍｌになるように添加し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、直ちに氷冷し、０．０１Ｍシュウ酸０．５ｍｌを加えて攪拌し、８０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。得られた上清を予めメタノールにて活性化させておいた「Ｓｅｐ−Ｐａｃｋ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ」（ウォーターズ社製）に注入し、０．０１Ｍシュウ酸１ｍｌ、イオン交換水１０ｍｌを順次に流して洗浄した。吸着物を２５％メタノール５ｍｌ、１００％メタノール１０ｍｌで溶出し、試験管に分取した。
【０１１０】
これをロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡＮ−２、東京理化器械株式会社製）を用いて減圧乾固した。これを分析直前まで、サンヨー超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）にて−８０℃で冷凍保存した。
（ｉｘ）ＨＰＬＣ分析は、得られた減圧乾固残留物に１００％メタノール１００μｌを加えて溶解し、１５０００ｒｐｍ、０℃で２分間遠心分離（ＳＩＧＭＡ ＫＵＢＯＴＡ３６１５：株式会社久保田製作所製）してＨＰＬＣ試料とし、以下に示すＨＰＬＣ条件にて分析し、定量した。
【０１１１】
なお、本分析では、標準物質として、ダイゼイン（関東化学製）、ゲニステイン（関東化学製）を用いてそれぞれの検量線を作成することにより定量し、ダイゼインとダイゼイン抱合体を併せてダイゼイン量として、同様にゲニステインとゲニステイン抱合体を併せてゲニステイン量として算出した。これらを合わせて、血中の総イソフラボン含量とした。（なお、上記ダイゼイン抱合体、ゲニステイン抱合体とは、ダイゼインやゲニステインのグルクロン酸抱合体や硫酸抱合体のことを意味する。）
その結果を図１および表３に示す。
【０１１２】
【表３】
【０１１３】
＜ＨＰＬＣ条件＞
前記に同じ。
すなわち、使用機器：Ｗａｔｅｒｓ９９６（ウォーターズ社製）
使用カラム：資生堂カプセルパックＯＤＳ−Ｃ１８ ＵＧ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
溶離液：水／メタノール／酢酸＝６５／３０／５（ｖ／ｖ／ｖ）
検出：ＵＶ ２５４ｎｍ
注入量：１０μｌ。
【０１１４】
＜考察＞
図１、および表３からもわかるように、本発明の「水可溶性イソフラボン組成物」、および「水可溶性イソフラボン組成物とイソフラボンアグリコンの混合物」は、イソフラボンアグリコンに比べ、血中での初期総イソフラボン濃度も高く、かつ高い総イソフラボン濃度を長時間維持（持続）できることがわかる。
【０１１５】
［溶解安定性試験１］
α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量に対する、イソフラボンとイソフラボンアグリコンとの合計中に含まれるアグリコン量の比（Ｃｇ）＝［α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量／（イソフラボン中のアグリコン量＋イソフラボンアグリコン量）］を、溶解安定性の点から調べた。
【０１１６】
被験物質として、イソフラボンアグリコンに「ソイアクトＷ」（イソフラボンアグリコン３３．３％、キッコーマン株式会社製）を使用し、酵素処理イソフラボンには実施例１で作った「試料Ａ」を用いた。
【０１１７】
これらを全アグリコン量として２５０ｐｐｍとなるように適宜量の水に分散し、１５％水酸化ナトリウムにてｐＨ１２．０で溶解後、２０％硫酸にて中和し組成比（Ｃｇ）が、２．０／１、２．５／１、３．０／１の試験液（サンプルＳＡ、ＳＢ、ＳＣ）とした。
【０１１８】
結果を表４に示す。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
なお、表４中、「組成比（Ｃｇ）」は、［α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量／（イソフラボン中のアグリコン量＋イソフラボンアグリコン量）］を示す。
【０１２１】
表４中の記号の意味は、以下の通り。
「−」：析出なし。「±」：僅かに析出する。「＋」：析出する。
【０１２２】
［溶解安定性試験２］
即効性と持続性を有する組成物において、即効性の面からイソフラボンアグリコンの添加は、重要な要因となる。しかしその量が多くなり過ぎると析出が生じ、商品ライフに大きな影響をきたす結果となる。
【０１２３】
そこで、組成物中のイソフラボンアグリコン量と全アグリコン量との関係が長期保存下で析出にどのように影響するかを調べた。
【０１２４】
被験物質としてイソフラボンアグリコンに「ソイアクトＷ」（イソフラボンアグリコン３３．３％、キッコーマン株式会社製）を使用し、酵素処理イソフラボンには実施例１で作った「試料Ａ」を用いた。
【０１２５】
これらを全アグリコン量として２５０ｐｐｍとなるように適宜量の水に分散し、１５％水酸化ナトリウムにてｐＨ１２．０で溶解後、２０％硫酸にて中和し、重量比「イソフラボンアグリコン／全アグリコン」が表５に示すように、それぞれ３．０／１００、１０．０／１００、２０．０／１００、３０．０／１００の試験液（サンプルＳＤ〜ＳＧ）を調製した。該試験液を１ヶ月間、常温で保存し、保存に伴う析出の有無を調べた。
【０１２６】
結果を、表５に示す。
【０１２７】
【表５】
【０１２８】
表５中の記号の意味は、以下の通り。
「−」：析出なし。「±」：僅かに析出する。「＋」：析出する。
【０１２９】
［飲食物の調製例１］
＜清涼飲料＞
表６に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．０／１、イソフラボンアグリコン＝２．２％）と他の骨密度改善効果を有する物質とを併含する清涼飲料を調製した。
【０１３０】
【表６】
【０１３１】
このように、水可溶性イソフラボン組成物と、他の骨密度改善効果を持つ成分と併用することによって、骨密度の維持・回復効果が期待できる清涼飲料が得られる。
【０１３２】
［飲食物の調製例２］
＜オレンジジュース＞
表７に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．０／１、イソフラボンアグリコン＝２．２％）を含有するオレンジジュース飲料を調製した。
【０１３３】
【表７】
【０１３４】
本製品（オレンジジュース）は、イソフラボンの沈殿を生じない果汁飲料として、骨粗鬆症を気にするヒトに好適に利用可能である。
【０１３５】
［飲食物の調製例３］
＜乳酸飲料＞
表８に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．０／１、イソフラボンアグリコン＝２．２％）を含有する乳酸飲料を調製した。
【０１３６】
【表８】
【０１３７】
この乳酸飲料は、ｐＨが低い（酸性）にも拘わらず、析出の生じないイソフラボン含有乳酸飲料として利用できる。
【０１３８】
［飲食物の調製例４］
＜ゼリー＞
表９に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．３／１、イソフラボンアグリコン＝１．２％）を含有するゼリーを調製した。
【０１３９】
【表９】
【０１４０】
本製品（ゼリー）は、（半）固形物であるにも拘わらず濁りがなく、味質に影響のない澄明なイソフラボン含有ゼリーとして利用できる。
【０１４１】
［化粧料組成物の調製例１］
＜含水化粧料＞
表１０に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．３／１、イソフラボンアグリコン＝１．２％）を含有する、弱酸性の柔軟化粧水を調製した。
【０１４２】
【表１０】
【０１４３】
［化粧料組成物の調製例２］
＜クリーム化粧料＞
表１１に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．３／１、イソフラボンアグリコン＝１．２％）を含有するクリーム化粧料を調製した。
【０１４４】
【表１１】
【０１４５】
このクリーム化粧料は、イソフラボンの持つ「肌の老化を防ぐ」作用を持ちつつ、クリームとして安定している。
【０１４６】
また、クリームの配合組成を化粧水用に変えることにより、化粧水としても水可溶性の安定な商品が得られる。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
［図１］図１は、水可溶性イソフラボン組成物（◆）、「水可溶性イソフラボン組成物とイソフラボンアグリコンの混合物」である混合試料（■）、イソフラボンアグリコン（▲）を２５時間に亘って、被験動物に経口投与し、投与開始からの経過時間（ｈ）（横軸）と、血中総イソフラボン濃度（ｎｍｏｌ／ｍｌ）（縦軸）との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１４８】
▲・・・・・イソフラボンアグリコン投与群
■・・・・・混合試料投与群
◆・・・・・水可溶性イソフラボン組成物投与群
【図１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水可溶性イソフラボン組成物およびその製造方法並びにその用途に関し、さらに詳しくは、水可溶性に優れ、吸収における即効性と、吸収後の薬理作用の持続性等に優れた水可溶性イソフラボン組成物およびその製造方法並びにその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソフラボンおよびその誘導体（イソフラボン誘導体）は、骨のカルシウムの過剰な流出を防ぎ、補給したカルシウムを逃さない効果があり、高齢者に多い骨粗鬆症を防止し、また女性ホルモンのアンバランスを緩和し、女性ホルモンの役割を果たすものを補充して更年期障害を防止し、コレステロールの酸化を防ぎ動脈硬化を防止し、高脂血症等の成人疾患の防止に有効であることが知られている。そのため大豆イソフラボンおよびその誘導体の摂取が推奨され、大豆イソフラボンおよびその誘導体を抽出する方法が種々提案されている。
【０００３】
例えば、上記した骨粗鬆症の薬剤による治療法としては、従来よりカルシウム剤、活性ビタミンＤ３剤、女性ホルモン剤などの投与が挙げられる。また、骨粗鬆症の発症を予防するには、日ごろから食事、運動を含めた生活習慣の改善を図ることによって骨密度を低下させないようにすることが有効である。特に閉経後の女性では、女性ホルモンのエストロゲンの分泌量が低下するが、その影響を受けて動脈硬化、高脂血症、高血圧などの更年期障害に加えて、閉経後骨粗鬆症の発症のリスクも高まる。したがって、そうした疾患に対する予防策としても大豆イソフラボンおよびその誘導体などを積極的に摂取することが望ましい。
【０００４】
また、もし、体内に速やかに吸収され、かつ、より長期間体内に高濃度で止まることができるイソフラボン誘導体あるいはその組成物が開発できれば、その意義は大きい。
【０００５】
しかしながら、これまでのところ、その栄養分や薬効成分が速やかに吸収され、吸収後はより長期間体内に止まり、骨粗鬆症、動脈硬化、更年期障害などの発症をより積極的に防止しうるような、栄養分や薬効成分を含む食品や医薬品などは提案されていない。
【０００６】
そのため、日常的に食品または健康食品などを摂取することによりカルシウムの流出を低減・防止でき、骨密度を維持させ、骨粗鬆症の発症を予防でき、あるいは骨粗鬆症を治療できれば、その有用性は高い。このため手軽にそして安全に骨密度を向上させ、骨粗鬆症を予防できるような新規な健康食品または医薬品の出現が望まれていた。
【０００７】
これと同様に、女性ホルモンのアンバランスを緩和し、女性ホルモンの役割を果たすものを補充して更年期障害を防止し、コレステロールの酸化を防ぎ動脈硬化を防止し、高脂血症等の成人疾患を予防できるような新規な健康食品、医薬品あるいは化粧品の出現も望まれていた。
【０００８】
さらにまた、本発明者らは、従来より提案されている、大豆イソフラボン誘導体の抽出方法、あるいはその水可溶性を向上させる方法、さらには、それにより得られたものなどについても鋭意検討した。
【０００９】
大豆イソフラボン誘導体を抽出する方法あるいはその水可溶性を向上させる方法などとしては、例えば、大豆抽出液を合成吸着樹脂に接触させて該樹脂にイソフラボンを吸着させた後、有機溶媒または有機溶媒と水との混合物でイソフラボンを溶出させる方法（特開昭６２−１２６１８６号公報：特許文献１）、
大豆胚芽を水可溶性有機溶媒で抽出し濃縮した後、疎水性有機溶媒により親油性成分を除去し、再び濃縮、精製、乾燥してイソフラボン化合物を製造する方法（特開平１１−２６３７８６号公報：特許文献２）、
大豆由来のイソフラボン誘導体抽出物をエタノール溶液中で分岐型マルトシルα−サイクロデキストリンの共存下で加温溶解し、冷却後不溶物を除去する、水溶解性イソフラボン誘導体抽出物の製造方法（特開２００２−１５５０７２号公報：特許文献３）、また、
大豆原料から得た粗抽出物を、水溶液中でサイクロデキストリンと混合させた後、不溶物を除去する、水易溶性大豆イソフラボンの製造方法（特開平１０−２９８１７５号公報：特許文献４）、
などが挙げられる。
【００１０】
また、イソフラボン誘導体をβ−またはγ−サイクロデキストリンで包接させてなり、苦味などが抑制され、水に対する溶解性が高く、体内への吸収効率の高い包接物（特開平９−３０９９０２号公報：特許文献５）も提案されている。
【００１１】
しかしながら、例えば、上記特開昭６２−１２６１８６号公報、特開平１１−２６３７８６号公報に記載の方法で得られた抽出物は、特開２００２−１５５０７２号公報にも記載されているように、水溶液への溶解性が悪い。同様に、特開平９−３０９９０２号公報に記載の包接物も、水溶液への溶解性、水溶液中での安定性の点で改良の余地がある。
【００１２】
また、上記特開２００２−１５５０７２号公報に記載の方法によれば、イソフラボン誘導体抽出物を効率的に回収できる旨記載されているが、大豆粗抽出物中のエタノール可溶性の不純物までも濾液中に流出し回収されてしまうため、イソフラボンあるいはその誘導体の収率などの点で更なる改良の余地があり、また得られたイソフラボンあるいはその誘導体の包接物は、次いで、糖および糖転移酵素の存在下にα−グルコシル化して用いようとすると、含まれているエタノールが酵素活性を阻害するため、酵素処理に先立ちエタノールを揮散・除去しておく必要がある。また、特開平１０−２９８１７５号公報に記載の方法では、上記特開２００２−１５５０７２号公報にも記載されているように、約１０％程度回収できるに過ぎず、イソフラボンあるいはその誘導体の収率の点で更なる改良の余地がある。
【００１３】
なお、特開２０００−３２７６９１号公報（特許文献６）には、大豆及び／または大豆加工品からｐＨ８以上のアルカリ性溶液でイソフラボン誘導体を抽出し、あるいは熱水または有機溶媒でイソフラボン誘導体を抽出し、次いで、α−グリコシル糖化合物と糖転移酵素を作用させα−グリコシルイソフラボン誘導体を生成した後、ｐＨ５．５以下の酸性にするか冷却することにより不純物を沈澱として除去する、大豆由来イソフラボン誘導体またはそのアグリコンの製造方法が記載されている。
【００１４】
しかしながら、この公報（特開２０００−３２７６９１号公報）に記載の方法では、得られた大豆由来α−グルコシルイソフラボン誘導体は、イソフラボンおよびその誘導体以外の大豆不純物を含みアルカリ側で酵素反応を行っているため、不純物に由来する色価が高く、また分解反応も起こりやすく、改良の余地があった。
【００１５】
【特許文献１】特開昭６２−１２６１８６号公報
【特許文献２】特開平１１−２６３７８６号公報
【特許文献３】特開２００２−１５５０７２号公報
【特許文献４】特開平１０−２９８１７５号公報
【特許文献５】特開平９−３０９９０２号公報
【特許文献６】特開２０００−３２７６９１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、体内に速やかに吸収され、かつより長期間に亘り体内に高濃度で止まることができ、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などの効果が期待でき、骨密度向上剤などの医薬品として利用でき、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品あるいは飼料に添加して用いることにより、骨代謝の改善をバランスよく効率的に図ることができる酵素処理イソフラボン類組成物（イソフラボン誘導体組成物）を提供することを目的としている。
【００１７】
本発明は、水可溶性イソフラボン組成物の特性を生かした化粧品など、水可溶性イソフラボン組成物の好適な用途を提供することを目的としている。
【００１８】
本発明は、原料として大豆イソフラボン類を含む大豆イソフラボン抽出物を用いて、酵素処理されたイソフラボン類を高収率で製造し得るような、酵素処理イソフラボン類の製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、鋭意研究を進めた結果、驚くべきことに特定組成比のフラボノイド類を摂取すると、従来のフラボノイド類を摂取する場合に比して、より長期間に亘って体内に止まり、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などに効果が期待できること、また、上記特定組成比のフラボノイド類は、骨密度向上剤などの医薬品として利用でき、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品および飼料に添加して用いることにより、骨代謝の改善をバランスよく効率的に図ることができることなどを見出して本発明を完成するに至った。
【００２０】
さらに、本発明者らは、水可溶性イソフラボン組成物の調製に好適に用い得るイソフラボン誘導体自体の抽出効率を上げるべく鋭意研究を重ねた結果、大豆イソフラボン類を含む粗大豆抽出物からイソフラボン類を抽出するに際して、特開２００２−１５５０７２号公報に示すようにエタノールを用いるのではなくアルカリを用い、またサイクロデキストリンによる包接後は、不純物を酸の存在下に沈殿させると、濾別にて効率よく濾液からイソフラボン類を分取でき、さらに必要により、容易に酵素処理反応を行って水可溶性イソフラボン組成物あるいはその調製用などとして好適に用いることもできることなどを見出して本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の事項に関する。
【００２１】
本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、必要によりイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、
α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量に対する、イソフラボンとイソフラボンアグリコンとの合計中に含まれるアグリコン量の比＝［α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量／（イソフラボン中のアグリコン量＋イソフラボンアグリコン量）］が、２．５／１以上、好ましくは５／１以上であることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンとイソフラボンとイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、該組成物中のイソフラボンアグリコン量が、該組成物中の全アグリコン量の０．０１〜２０％であることを特徴としている。
【００２３】
本発明においては、上記α−グルコシルイソフラボンは、イソフラボンにグルコースがα−結合にて平均２．０〜２０個付加したものであることが望ましい。
【００２４】
本発明においては、上記イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、イソフラボンアグリコンとを含むことが好ましい。
【００２５】
本発明においては、上記α−グルコシルイソフラボンが、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む組成物に、サイクロデキストリンと糖転移酵素とを作用させて得られたものであることが好ましい。
【００２６】
本発明においては、上記α−グルコシルイソフラボンが、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む組成物に、サイクロデキストリンを作用させ、次いで、酸性条件下に冷却して生じた沈殿物を濾別除去した後、糖転移酵素を作用させることにより得られたものであることが好ましい。
【００２７】
本発明においては、上記何れの態様においても、上記サイクロデキストリンが、β−サイクロデキストリンまたは分岐β−サイクロデキストリンであることが水可溶性良好のものが得られるため好ましい。
【００２８】
本発明に係る飲食物、化粧品、医薬又は飼料は、上記の何れかに記載の水可溶性イソフラボン組成物を含むことを特徴としている。
【００２９】
本発明においては、上記飲食物が酸性飲料であることが好ましい。
【００３０】
本発明においては、上記飲食物は、さらに、酵素処理ヘスペリジンおよび／または酵素処理ルチンを含んでいてもよい。
【００３１】
本発明においては、大豆イソフラボン抽出物を水又は水性媒体に懸濁させ、得られた懸濁液にサイクロデキストリンを加え、４０〜１００℃に加熱してサイクロデキストリンを溶解させた後、得られた溶液に、アルカリを添加混合してｐＨ８〜１３に調整してイソフラボン類を溶解させると共に、イソフラボン類をサイクロデキストリンに包接させ、次いで、
サイクロデキストリンに包接されたイソフラボン類の含有液に、酸を添加混合してｐＨ５．５〜２．０に調整した後降温し、生じた沈殿物を濾過にて除去し、得られた濾液を、次いで、ｐＨ５．０〜７．０に調整して、濾液中に含まれているイソフラボン類の酵素処理を行うことを特徴としている。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、体内に速やかに吸収され即効性を有し、かつより長期間に亘り体内に高濃度で止まることができ効果の持続性を有し、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などのより優れた効果が期待でき、骨密度向上剤などの医薬品として利用でき、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品あるいは飼料に添加して用いることにより、骨代謝の改善をバランスよく効率的に図ることができる水可溶性イソフラボン組成物（酵素処理イソフラボン類組成物）が提供される。
【００３３】
本発明によれば、水可溶性イソフラボン組成物の特性を生かした用途である飲食物、化粧品、医薬品、飼料などが提供される。
【００３４】
本発明によれば、原料として（粗）大豆イソフラボン抽出物を用いて、酵素処理イソフラボン類を製造するに際して、粗大豆イソフラボン抽出物からエタノール溶解に依らずに、アルカリを用いてイソフラボン類の溶解、抽出などを行っているため、イソフラボン類の酵素処理に先立つエタノールの除去工程が不要であり、より少ない工程数で、効率よく酵素処理イソフラボン類を製造でき、しかも、エタノールを使用しないため、抽出液（溶解液）中にエタノール可溶性の不純物の流入がなく、高収率で高純度の酵素処理イソフラボン類を製造し得るような、酵素処理イソフラボン類の製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下、本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物およびその製造方法並びにその用途について、具体的に説明する。
【００３６】
＜水可溶性イソフラボン組成物＞
本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、必要によりイソフラボンアグリコンとを含み、
α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量に対する、イソフラボンとイソフラボンアグリコンとの合計中に含まれるアグリコンの量の比（Ｃｇ）＝［α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量／（イソフラボン中のアグリコン量＋イソフラボンアグリコン量）］が、２．５／１以上であることが水溶液中での安定性と、経口摂取時の吸収における即効性と、吸収後の薬効の持続性の点から望ましい。
【００３７】
なお、アグリコン量比は、重量比、モル比の何れでもよいが、特に断らない限り重量比で示す。また、上記アグリコン量比（Ｃｇ）の算出等に際し、α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量、イソフラボン中のアグリコン量、イソフラボンアグリコン中のアグリコン量等は、何れも、ゲニステインに換算して求める。
【００３８】
なお、このアグリコン量比（Ｃｇ）の上限値は、通常２５／１かそれ以下であることが、該組成物が体内に速やかに吸収され即効性を有し、かつより長期間に亘り体内に高濃度で止まることができ効果の持続性を有し、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などのより優れた効果が期待でき、骨密度向上剤などの医薬品として利用でき、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品あるいは飼料に添加して用いることにより、骨代謝の改善をバランスよく効率的に図ることができる点から望ましい。
【００３９】
なお、このイソフラボン組成物中の上記アグリコン量比（Ｃｇ）（重量比）が２．５／１未満では、該組成物の溶液安定性が低くなることから、特に飲料等の液体中での使用に好ましくない。
【００４０】
また本発明では、上記α−グルコシルイソフラボンにおいて、イソフラボンにα−結合したグルコース（Ｇ）の数が平均２．０〜２０個であることが該組成物中のイソフラボンとイソフラボンアグリコンが水溶液中での安定性を保つことができる点から望ましい。
【００４１】
本発明に係る上記イソフラボン組成物には、α−グルコシルイソフラボンとイソフラボンとが必須成分として含まれているが、その好ましい態様においては、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、イソフラボンアグリコンとが含まれていることが上記効果、すなわち、体内により速やかに吸収され強い即効性を有し、かつより長期間に亘り体内に高濃度で止まることができ効果のより優れた持続性を有し、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などのより優れた効果が期待でき、骨密度向上剤などの医薬品として利用でき、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品あるいは飼料に添加して用いることにより、骨代謝の改善をバランスよく効率的に図ることができる点から望ましい。
【００４２】
本発明に係る上記イソフラボン組成物には、上記α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、必要により含まれるイソフラボンアグリコン以外に、デキストリン（サイクロデキストリン（ＣＤ）を含む。）、オリゴ糖などの糖類、タンパク質、ペプチド、他のフラボノイド類などが、本発明の目的に反しない範囲で含まれていてもよい。
【００４３】
なお、イソフラボンアグリコンは、下記式［Ｉ］：
【００４４】
【００４５】
【表１】
【００４６】
で表されるイソフラボンにおいて、その基Ｒ３がＨである構造のものである。（式［Ｉ］中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の定義は、上記表１の通りである。）
本発明では、α−グルコシルイソフラボンの付加糖数（付加グルコース数）（ｎ）、すなわち、上記式［Ｉ］の化合物におけるＲ３が、α−結合で連なる複数のグルコースからなる場合にこのα−結合にて付加したグルコースの数が、平均２．０個以上であることが、本発明のイソフラボン組成物の水可溶性の向上、該組成物中のイソフラボンとイソフラボンアグリコンの水溶液中での安定性を保つ点から望ましい。なお、該α−グルコシルイソフラボンの付加糖数（ｎ）の上限値は、特に限定されないが、通常、２０個程度までである。
【００４７】
このようなアグリコン量比（Ｃｇ）のイソフラボン組成物を得るには、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、必要により用いられるイソフラボンアグリコンとを、（Ｃｇ）＝［α−グルコシルイソフラボンのアグリコン／（イソフラボンのアグリコン−イソフラボンアグリコン）］（重量比）で２．５／１以上となるようにこれら成分を配合するか、あるいはイソフラボンのα−グルコシル化反応等を実施すればよい。
【００４８】
なお、重量比では、α−グルコシルイソフラボンにおける付加糖数が多いほど、単位α−グルコシルイソフラボン重量におけるアグリコン重量の割合は減るから、その付加糖数を考慮して、α−グルコシルイソフラボン重量を増加させる必要がある。
【００４９】
また、本発明では、上記α−グルコシルイソフラボンが、後述するように、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む組成物に、サイクロデキストリンを作用させ、次いで、酸性条件下に冷却して生じた沈殿物を濾別除去した後、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む濾液にｐＨ５．０〜７．０で糖転移酵素を作用させることにより得られたものであると、イソフラボン及びイソフラボン誘導体の分解がほとんど生じず、収率良くα−グルコシルイソフラボン及びその組成物が得られることから好ましい。
【００５０】
本発明では、上記サイクロデキストリンとしては、α−タイプ、β−タイプ、γ−タイプが挙げられる。これらのうちでは、β−サイクロデキストリンまたは分岐β−サイクロデキストリンが、イソフラボンを効率よく包接し、安定化させることから、該組成物の製造上好ましい。
【００５１】
また、本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンとイソフラボンとイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、該組成物中のイソフラボンアグリコン量が、該組成物中の全アグリコン量の０．０１〜２０％であることが好ましく、さらに好ましくは０．５〜１０．０％であることが望ましい。
【００５２】
このような量でイソフラボンアグリコンを含む水可溶性イソフラボン組成物は、特に即効性と持続性に優れる傾向がある。なお、このイソフラボンアグリコン量が特に０．０１％に満たないと即効性に欠ける傾向があり、また２０％を超えると溶液中で沈殿を生じやすい傾向にある。
【００５３】
＜用途（飲食物、医薬など）＞
本発明に係る飲食物、化粧品、医薬又は飼料（これらをまとめて、「飲食物等」ともいう。）は、上記の水可溶性イソフラボン組成物を含むことを特徴としている。
【００５４】
例えば、この飲食物中に含まれる水可溶性イソフラボン組成物は、水可溶性に優れ、例えば、５℃の水１リットルに、１ｇの量で溶解させることができ、呈味は良好であり、苦味、渋味、収斂味などの異味が殆どない。
【００５５】
またこの飲食物中に含まれる水可溶性イソフラボン組成物は、水や、天然ジュース、コーヒー、ウーロン茶、紅茶、麦茶、緑茶、コーラ、ラムネ、サイダー、ミルクココア、ココアなどの清涼飲料、加工乳、発酵乳、乳製品、乳酸菌飲料などの水性飲料；
みそ、醤油、そばつゆ、めんつゆ、焼き肉のたれ、だし汁、ソース、ケチャップ、マヨネーズ、ドレッシング等の液体または半固体の調味料；
ゼリー、プリン等の水性菓子；
などへの溶解性に優れており、その配合量は、特に限定されず、飲食物の種類などに応じて適宜設定できる。
【００５６】
これらの飲食物のうちでは、特に酸性飲料に対する溶解性に優れ、例えば、柑橘ジュース、リンゴジュース、トマトジュース、パイナップルジュース、コーラ、乳酸菌飲料などの酸性飲料１リットル中に、０．００１〜１０ｇの量で用いることが好ましい。
【００５７】
このような飲食物、あるいは化粧品、医薬又は飼料は、さらに酵素処理ヘスペリジンおよび／または酵素処理ルチンを水可溶性イソフラボン組成物に対して任意の割合で含んでいてもよい。この酵素処理ヘスペリジンと上記水可溶性イソフラボン組成物、または酵素処理ヘスペリジンと酵素処理ルチンと上記水可溶性イソフラボン組成物を含む飲食物は、骨粗鬆症の予防および改善効果、循環器疾患の改善という点で優れている。
【００５８】
本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、経口摂取すると、体内に速やかに吸収される即効性を有し、かつより長期間に亘り体内に高濃度で止まることができ効果の持続性を有し、骨密度の向上、骨粗鬆症の予防・治療などのより優れた効果が期待でき、骨密度向上剤、骨粗鬆症予防・治療剤、更年期障害予防・治療剤、ガン細胞増殖抑制剤などの医薬品として利用できる。
【００５９】
このように上記用途の医薬品あるいは健康食品などとして、水可溶性イソフラボン組成物を用いる場合には、体重１ｋｇ当たり、０．０００２〜２ｇ／日の量で経口摂取すればよい。
【００６０】
この水可溶性イソフラボン組成物を、さらに一般飲食物、健康食品、機能性食品、嗜好品、飼料、医薬部外品などに任意量で添加して用いることにより、骨代謝の改善などをバランスよく効率的に図ることができる。
【００６１】
一般飲食物としては、より具体的には、例えば、菓子、洋菓子、氷菓、シロップ、果実加工品、野菜加工品、漬け物、魚肉、ハム、ソーセージ、缶詰、瓶詰め品、酒類等；嗜好品としては、タバコ、ガム等；飼料としては、家畜、家禽、魚、ペットなどの飼料、餌等；化粧品としては、口紅、リップクリーム、化粧水、乳液、クリーム等の美容液や整髪料等；医薬部外品としては、練り歯磨きなどが挙げられる。
【００６２】
このように本発明の水可溶性イソフラボン組成物を、上記用途に経口剤、外用剤、薬用剤として用い、また各種食品用、化粧品用、飼料用の添加剤として用いてもよい。
【００６３】
＜水可溶性イソフラボン組成物の製造＞
本発明に係る水可溶性イソフラボン組成物は、大豆イソフラボン類を０．０５〜０．３５％（重量％）の量で含む大豆胚芽、大豆粉、脱脂加工大豆、きな粉、豆乳、おから等の粗大豆抽出物（粗大豆加工品）を用いることもできるが、好ましくはイソフラボンを５〜９０％含有する大豆イソフラボン抽出物を用い、まず大豆イソフラボン抽出物を水あるいは水性媒体１リットル当たり、１〜２００ｇ程度加え混合し、次いで、得られた懸濁液に前記サイクロデキストリン、好ましくは優れた溶解性、経済性の点からβ−サイクロデキストリンまたは分岐β−サイクロデキストリンを加え、４０〜１００℃に加熱してサイクロデキストリンを溶解させる。
【００６４】
この際のサイクロデキストリン使用量は、懸濁液１リットル当たり、０．１〜４０００ｇ、好ましくは１〜２０００ｇの量で用いられる。
【００６５】
このように懸濁液にサイクロデキストリンを溶解させた後、得られた溶液に、アルカリを添加混合してｐＨ８〜１３、好ましくはｐＨ９〜１２に調整してイソフラボン類を溶解させると共に、イソフラボン類をサイクロデキストリンに包接させる。
【００６６】
アルカリとしては、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【００６７】
なお、イソフラボン類がサイクロデキストリンに包接されたことは、懸濁液が透明になることから確認できる。
【００６８】
次いで、本発明では、サイクロデキストリンに包接されたイソフラボン類の含有液に、酸を添加混合してｐＨ５．５〜２．０、好ましくはｐＨ４．５〜３．０に調整した後、通常、１〜６０℃、好ましくは１３〜２０℃に降温して沈殿を生じさせる。酸としては、有機酸でも無機酸でもよく、酢酸、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、クエン酸等が挙げられる。
【００６９】
次いで、生じた沈殿物を濾過にて除去し、さらに、下記のように酵素処理して水可溶性イソフラボン組成物を調製する。
【００７０】
すなわち、本発明では、上記のように沈殿物を濾過にて除去して得られた上記濾液を酵素活性の良好な条件である、ｐＨ５．０〜９．０、好ましくはｐＨ５．５〜７．０に調整して、常法により酵素処理を行う。
【００７１】
このようにサイクロデキストリンに包接されたイソフラボン類の酵素処理を行なうと、イソフラボン類にサイクロデキストリン由来の糖が転移される。この糖は、通常、イソフラボン類を包接しているサイクロデキストリンの一部（あるいは全部）を利用すればよいが、酵素処理に際し、新たに澱粉やその部分分解物、糖などを添加し、これを糖転移に利用してもよい。
【００７２】
酵素としては、イソフラボン類に糖転移可能な酵素であれば特に制限されないが、本発明では、バチルス・ステアロサーモフィラスやバチルス・マセランス等バチルス属の微生物由来のサイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）などが好ましく使用でき、バチルス・ステアロサーモフィラス由来のＣＧＴａｓｅが糖転移効率が高い点からより好ましい。その他に、バチルス・メガテリウム、バチルス・サーキュランス等の同じバチルス属に属する微生物由来のＣＧＴａｓｅも使用できる。本発明では、２種以上の酵素を併用してもよい。酵素使用量、酵素処理条件（温度、水量、ｐＨ、時間）などは、常法によればよい。
【００７３】
このように酵素処理された水可溶性イソフラボン組成物は、酵素処理前のイソフラボン類と同様の生理活性を有し、水可溶性の点で未処理物に比して、非常に優れている。
【００７４】
このように酵素処理された水可溶性イソフラボン組成物は、必要により、予め１０〜９９．５％（重量％）エタノールなどの含水有機溶媒、有機溶媒などで活性化された無極性多孔性吸着樹脂に、上記酵素処理イソフラボン類の水溶液として通液し、水洗した後、１０〜９９．５％（重量％）エタノールなどの含水有機溶媒、有機溶媒などを通液して、吸着しているイソフラボン類を溶出させ、溶出液を回収し、溶媒を留去した後、凍結乾燥等してもよい。このように、多孔性吸着樹脂による処理を行うと、酵素処理イソフラボン類の「総イソフラボン含量」（定義は後述する。）は、通常２０〜８０％程度にまで高めることができる。なお、多孔性吸着樹脂としては、特開２０００−３２７６９１号公報第４頁［０００９］欄に記載のもの、例えば、「ダイヤイオンＨＰ」、「デュオライトＳ」、「アンバーライトＸＡＤ」等を使用すればよい。また、このように多孔性吸着樹脂を使用して総イソフラボン含量を高める代わりに、クロマト分離により総イソフラボン含量を高めても良い。
【００７５】
この水可溶性イソフラボン組成物（乾燥固形物）中の総イソフラボン含量は、通常、５〜９０％、好ましくは２０〜４０％であることが前記比（Ｃｇ）を好ましい範囲に維持する点から望ましい。
【００７６】
本発明の水可溶性イソフラボン組成物の製造においては、酵素反応に供するイソフラボン類の溶解用としてエタノールを使用していないため、その後の酵素処理に先立ち、酵素活性を阻害するエタノールの除去工程が不要化できる。その結果、より少ない工程数で、効率よく水可溶性イソフラボン組成物を製造できる。
【００７７】
さらに、本発明では、大豆イソフラボン抽出物（抽出液）を用いた水可溶性イソフラボン組成物の製造工程でこのようにエタノールを使用しないため、抽出液中にエタノール可溶性の不純物の流入がなく、高収率でα−グルコシルイソフラボンを製造し得るような、水可溶性イソフラボン組成物の製造方法が提供される。
【００７８】
本発明の水可溶性イソフラボン組成物では、該組成物中に含まれるα−グルコシルイソフラボンの平均付加糖数（ｎ）が、２．０個以上であることが望ましい。
【００７９】
上記のようにして得られた水可溶性イソフラボン組成物は、前記イソフラボン組成物中の上記アグリコン量比（Ｃｇ）が２．５／１以上となるようにそのままで用い、またはα−グルコシルイソフラボンとイソフラボンアグリコンとイソフラボンとを適宜配合すればよい。なお、このアグリコン量比（Ｃｇ）の上限値は特に限定されないが通常２５／１程度である。
【００８０】
本発明に係る上記水可溶性イソフラボン組成物は、その好ましい態様においては、α−グルコシルイソフラボンとイソフラボンとイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、該組成物中のイソフラボンアグリコン量が、前述したように、該組成物中の全アグリコン量の０．０１〜２０％であることが好ましいが、このようにイソフラボンアグリコン量を調整するには、例えば、酵素処理イソフラボン中に含まれるα−グルコシルイソフラボンとイソフラボン中のアグリコン量に対して、所定量となるように既知のイソフラボンアグリコンを添加し、アルカリ溶解した後、所望のｐＨに調整すればよい。
【００８１】
以下、本発明について実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、係る実施例により何ら限定されるものではない。
【００８２】
以下の実施例、比較例などで、「％」は、特に断らない限り、「重量％」の意味である。
【００８３】
＜総イソフラボン含量の測定＞
総イソフラボン含量（イソフラボン含量（単位：重量％）の総和を意味する。）は、酵素処理イソフラボンの場合は、糖転移酵素（ＣＧＴａｓｅ）の作用によりイソフラボンに付加されている糖を加水分解酵素（グルコアミラーゼ）で外して測定する。
【００８４】
具体的には、試料の酵素処理イソフラボン１ｇを２５℃の水０．１リットルに溶解し、グルコアミラーゼを０．０１ｇ添加した後、ｐＨ５．０、温度５０℃の条件で３時間反応させて、酵素処理イソフラボン中のα−１，４結合で結合している糖（Ｇ）を加水分解させてから、既知の方法（（財）日本健康・栄養食品協会発行、健康補助食品規格規準集に記載された、大豆イソフラボンの試験方法に準拠）に基づき、下記の条件下でＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）にてイソフラボン量を測定する。
【００８５】
ＨＰＬＣ条件
使用機器：Ｗａｔｅｒｓ９９６（ウォーターズ社製）
使用カラム：資生堂カプセルパックＯＤＳ−Ｃ１８ ＵＧ１２０（２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
溶離液：水／メタノール／酢酸＝６５／３０／５（ｖ／ｖ／ｖ）
検出：ＵＶ ２５４ｎｍ
注入量：１０μｌ
【００８６】
＜付加糖数の測定＞
酵素処理イソフラボン５ｇを２５℃のイオン交換水５０ｍｌに溶解し、吸着樹脂５０ｍｌに通液・水洗してα−グルコシルイソフラボン以外の物質を除去する。吸着画分を６０％エタノール１５０ｍｌで脱着し、アルコールを留去した後、グルコアミラーゼを０．０１ｇ添加して、ｐＨ５．０、温度５０℃で５時間作用させる。
【００８７】
グルコアミラーゼ処理した液は、水を用いて同様の処理した液をブランクとし、市販のグルコース測定キット（ムタロターゼ・ＧＯＤ法）により、グルコース量を求め、そのモル数を算出する（Ｄ）。
【００８８】
一方、上述した総イソフラボン含量の測定方法で求めた酵素処理イソフラボン中の総イソフラボン量をゲニスチンに換算し、そのモル数を求める（Ｅ）。
【００８９】
平均付加糖数（個）は、（Ｄ）を（Ｅ）で割る、次式により求める。
付加糖数（個）＝Ｄ／Ｅ
【００９０】
＜（Ｃｇ）の測定＞
試料Ａ：０．０５ｇを２５℃のイオン交換水１００ｍｌに溶解し、総イソフラボン含量の測定の項目で既述したＨＰＬＣ条件と同じ条件で測定する。（財）日本健康・栄養食品協会発行の健康補助食品規格基準集の「大豆イソフラボンの試験方法」に基づき、試料中のイソフラボン（Ｆ）およびイソフラボンアグリコン（Ｇ）を、標準としてダイズイン標準品を使用し、ゲニステインとしてアグリコン量を求める。すなわち、アグリコン量は、ゲニステインに換算して求めた量である。
【００９１】
また、上述した総イソフラボン含量の測定方法に従い、試料中の総イソフラボンをゲニステインとして測定し、これより、上記（Ｆ）および（Ｇ）を引いた値をα−グルコシルイソフラボンのアグリコン量とする。
【実施例１】
【００９２】
＜サイクロデキストリンによる包接工程＞
４０％（重量％）の量でイソフラボンを含む大豆イソフラボン抽出物３ｇを６００ｍｌのイオン交換水に懸濁させた。次に、得られた懸濁液にβ−サイクロデキストリン２７ｇを加え、７０℃に加温し、β−サイクロデキストリンを溶解させた。この溶液に、濃度１５％の水酸化ナトリウム水溶液を９ｍｌ添加混合しｐＨ１１．３に調整してイソフラボンを完全に溶解し、イソフラボンをβ−サイクロデキストリンに包接させた。
【００９３】
次に、β−サイクロデキストリンに包接されたイソフラボンの含有液に、濃度２０％の硫酸５．５ｍｌを６０℃で添加混合してｐＨ４．０に調整した後降温し、液温が１２℃になるまで冷却した。
【００９４】
その結果生じた沈殿物を濾過にて取り除き、濾液を分取した。（これを、「試料Ｃ」ともいう。）
＜酵素処理反応工程（酵素処理）＞
得られた濾液を、１５％水酸化ナトリウム溶液１ｍｌを用いてｐＨ５．５に調整した。
【００９５】
次いで、この濾液６１０ｍｌにバチルス・ステアロサーモフィラス由来のサイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ［（株）林原生物化学研究所製、０．３ｍｌ］を添加して６０℃で一晩加温し、イソフラボンに糖を転移反応させた。
【００９６】
なお、イソフラボンに、糖が転移したことは、ＨＰＬＣにより確認した。
【００９７】
このようにイソフラボンへの糖の転移反応を行った後、反応液を９０℃以上の温度で１時間加温し酵素を失活させた。その後、濾過を行った。分取された濾液を濃縮後に凍結乾燥し、乾燥物２７．６ｇを得た。
該乾燥物中の「総イソフラボン含量」は４．０２％であった。
【００９８】
＜多孔性吸着樹脂による精製工程＞
次いで、予め５０％エタノールを通液して活性化させた無極性多孔性吸着樹脂（オルガノ（株）製、型番：ＸＡＤ−７）に、上記乾燥物の水溶液（濃度：５．５重量％）５００ｍｌを通液してイソフラボン類を該樹脂に吸着させた後、１０００ｍｌの水を流下させて該樹脂を水洗し、サイクロデキストリン（ＣＤ）およびＣＤ分解物を溶出・除去した。その後、５０％エタノールを通液して吸着していたイソフラボン類を溶出させた。イソフラボンを含んだ出液を回収し、出液中のアルコールを留去した後、凍結乾燥させ、固形物３．５ｇを得た。本品（水可溶性イソフラボン組成物）の総イソフラボン含量は３５．８％であった（これを「試料Ａ」とする）。本品を分析したところ、α−グルコシルイソフラボン（イソフラボンとして）２９．２％（アグリコンとして１８．３％）、イソフラボン６．６％（アグリコンとして４．１％）、イソフラボンアグリコン０％であり、平均付加糖数は、３．６であった。
【００９９】
［比較例１］
＜サイクロデキストリンによる包接工程＞
総イソフラボン含量４０％の大豆イソフラボン抽出物１．２ｇに、濃度約３０％のエタノール水溶液３８ｍｌを添加して混合し、次いで、この大豆イソフラボン抽出物の９倍量のβ−サイクロデキストリン１０．８ｇを添加した後、攪拌下に６０℃に加熱して、その温度で３０分間保持して、イソフラボン類をβ−サイクロデキストリンに包接させた。
【０１００】
次いで、常温（２５℃）まで放冷した後に濾過した。分取された濾液よりエタノールを留去させ、濃縮乾固して固形物２．６７ｇを得た（特開２００２−１５５０７２号公報に準拠。）（試料Ｂとする）。
【０１０１】
得られた固形物のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析を行い、総イソフラボン含量を求めたところ、３．８５％となった。
＜酵素処理反応工程＞
次いで、上記試料Ｂを用いて、サイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させて酵素処理反応を行なう際に、溶媒が３０％エタノールの場合は酵素の作用が低下し、酵素処理がほとんど進行せず、酵素処理前にエタノールを留去する必要があった。
【０１０２】
また本発明の実施例１における、大豆イソフラボン抽出物１．２ｇをｐＨ８以上にして溶解し、β−サイクロデキストリン１０．８ｇに包接させ酸性域に戻した後に濾過をした、実施例１における酵素処理直前のもの（試料Ｃ）を、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析したところ、試料Ｃの総イソフラボン含量は４．１２％となった。
【０１０３】
試料Ｂと試料Ｃの総イソフラボン量を比較検討した。
＜考察＞
（１）総イソフラボン含量は、ＨＰＬＣ分析の結果、３０％エタノールを溶媒として包接させた試料Ｂの総イソフラボン含量３．８５％に対して、本発明の試料Ｃの総イソフラボン含量は４．１２％と、総イソフラボン含量が高い。その理由は、試料Ｂでは大豆イソフラボン抽出物のエタノール可溶性の不純物が濾液中に流出し回収されてしまうが、試料Ｃでは調整時にエタノールを使わないため、濾液中への不純物の混入が抑えられて総イソフラボン含量が高くなったものと思われる。
【０１０４】
（２）比較例１では、サイクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼを作用させて酵素処理反応を行なう際に、溶媒が３０％エタノールの場合は酵素の作用が低下し、酵素処理がほとんど進行せず、酵素処理前にエタノールを留去する必要があった。
これに対し、本発明の実施例１では、ｐＨ８以上にしてイソフラボンを溶解してサイクロデキストリンで包接させたのち、中性域にｐＨ調整しており、エタノールを留去する必要が無く、そのまま酵素反応へと進めることができるため、酵素処理反応の工程をより簡便にすることができるという利点がある。
【０１０５】
［血中動態試験］
（ｉ）５週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系の雄ラット（体重範囲：１０８〜１３４ｇ）を日本チャールズリバー株式会社より購入し、７日間の検疫を行ない、検疫期間終了後に用いた。
（ｉｉ）ラットは、室温２２±３℃、相対湿度５０±２０％、換気回数１０回以上／時間（オールフレッシュエアー方式）、照明１２時間／日（午前６時より午後６時まで照明、１５０〜３００ルクス）に設定した飼育室で、ステンレス製のラット用ブラケットケージ、１ケージあたり１匹ずつ収容し、飼育した。
（ｉｉｉ）飼料は、精製飼料（ＡＩＮ−７６Ａ配合固形飼料、オリエンタル酵母株式会社製）をケージ付属の給餌器により与え、入荷時から自由摂取させた。また、飲料水は自家用水道水をポリカーボネイト製給水瓶により与え、自由摂取させた。
（ｉｖ）群分けは、健康状態を評価し健康な動物の中から体重の層別無作為化法により９匹づつ３群に配分し、各群の平均体重ができるだけ等しくなるようにした。投与開始日のラットの週齢は６週齢、体重範囲は１３７〜１７９ｇであった。
（ｖ）群構成は、酵素処理イソフラボン投与群、イソフラボンのアグリコン投与群、α−グルコシルイソフラボン／（イソフラボン＋イソフラボンのアグリコン）のアグリコン重量比が３．６／１の混合試料投与群の３群構成とした。
【０１０６】
被験物質として、イソフラボンのアグリコンには、「ソイアクトＷ」（イソフラボンのアグリコン３３．３％含有、キッコーマン株式会社 製）を使用し、酵素処理イソフラボンには、実施例１で作った「試料Ａ」を用いた。
【０１０７】
混合試料は、試料ＡとソイアクトＷをアルカリ溶解し、ｐＨ５．５に調整したものを使用した。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
（ｖｉ）被験物質は、それぞれ０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）水溶液に懸濁、または溶解した。これを１８時間の絶食を行なったラットに、ラット用経口ゾンデを用いてラット体重あたり５０μｍｏｌとなるように強制経口投与した。投与２４時間後の採血、および尿の採取まで、給餌は行なわず給水のみとした。
（ｖｉｉ）被験物質投与前（以下０時間とする）、および投与から０．５、１、２、４、８、１２、１６、２４時間後に頚静脈より２ｍｌづつ採血し、それぞれプラスチックチューブに入れ、ハイキャパシティ冷却遠心器（株式会社久保田製作所製）により遠心分離（３５００×Ｇ、４℃、１０分間）をし、血漿を分離した。また、２４時間尿を採取して尿量を測定し、血液と同様に遠心分離した。得られた血漿、および２４時間尿は分析するまでサンヨー超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）にて−８０℃で冷凍保存した。
（ｖｉｉｉ）得られた血漿０．５ｍｌと、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）０．５ｍｌを１．５ｍｌ容量のエッペンドルフチューブに取り、充分に攪拌した後に３７℃で２分間、プレインキュベーションした。次に、β−グルクロニダーゼ／スルファターゼ（シグマ社製、Ｔｙｐｅ−Ｈ−２；１０５００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ，４３００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を、５．５×１０２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、２×１０２ｕｎｉｔｓ／ｍｌになるように添加し、３７℃で２０分間インキュベーションした。その後、直ちに氷冷し、０．０１Ｍシュウ酸０．５ｍｌを加えて攪拌し、８０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。得られた上清を予めメタノールにて活性化させておいた「Ｓｅｐ−Ｐａｃｋ Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ」（ウォーターズ社製）に注入し、０．０１Ｍシュウ酸１ｍｌ、イオン交換水１０ｍｌを順次に流して洗浄した。吸着物を２５％メタノール５ｍｌ、１００％メタノール１０ｍｌで溶出し、試験管に分取した。
【０１１０】
これをロータリーエバポレーター（ＥＹＥＬＡＮ−２、東京理化器械株式会社製）を用いて減圧乾固した。これを分析直前まで、サンヨー超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）にて−８０℃で冷凍保存した。
（ｉｘ）ＨＰＬＣ分析は、得られた減圧乾固残留物に１００％メタノール１００μｌを加えて溶解し、１５０００ｒｐｍ、０℃で２分間遠心分離（ＳＩＧＭＡ ＫＵＢＯＴＡ３６１５：株式会社久保田製作所製）してＨＰＬＣ試料とし、以下に示すＨＰＬＣ条件にて分析し、定量した。
【０１１１】
なお、本分析では、標準物質として、ダイゼイン（関東化学製）、ゲニステイン（関東化学製）を用いてそれぞれの検量線を作成することにより定量し、ダイゼインとダイゼイン抱合体を併せてダイゼイン量として、同様にゲニステインとゲニステイン抱合体を併せてゲニステイン量として算出した。これらを合わせて、血中の総イソフラボン含量とした。（なお、上記ダイゼイン抱合体、ゲニステイン抱合体とは、ダイゼインやゲニステインのグルクロン酸抱合体や硫酸抱合体のことを意味する。）
その結果を図１および表３に示す。
【０１１２】
【表３】
【０１１３】
＜ＨＰＬＣ条件＞
前記に同じ。
すなわち、使用機器：Ｗａｔｅｒｓ９９６（ウォーターズ社製）
使用カラム：資生堂カプセルパックＯＤＳ−Ｃ１８ ＵＧ（２５０ｍｍ×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
カラム温度：４０℃
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
溶離液：水／メタノール／酢酸＝６５／３０／５（ｖ／ｖ／ｖ）
検出：ＵＶ ２５４ｎｍ
注入量：１０μｌ。
【０１１４】
＜考察＞
図１、および表３からもわかるように、本発明の「水可溶性イソフラボン組成物」、および「水可溶性イソフラボン組成物とイソフラボンアグリコンの混合物」は、イソフラボンアグリコンに比べ、血中での初期総イソフラボン濃度も高く、かつ高い総イソフラボン濃度を長時間維持（持続）できることがわかる。
【０１１５】
［溶解安定性試験１］
α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量に対する、イソフラボンとイソフラボンアグリコンとの合計中に含まれるアグリコン量の比（Ｃｇ）＝［α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量／（イソフラボン中のアグリコン量＋イソフラボンアグリコン量）］を、溶解安定性の点から調べた。
【０１１６】
被験物質として、イソフラボンアグリコンに「ソイアクトＷ」（イソフラボンアグリコン３３．３％、キッコーマン株式会社製）を使用し、酵素処理イソフラボンには実施例１で作った「試料Ａ」を用いた。
【０１１７】
これらを全アグリコン量として２５０ｐｐｍとなるように適宜量の水に分散し、１５％水酸化ナトリウムにてｐＨ１２．０で溶解後、２０％硫酸にて中和し組成比（Ｃｇ）が、２．０／１、２．５／１、３．０／１の試験液（サンプルＳＡ、ＳＢ、ＳＣ）とした。
【０１１８】
結果を表４に示す。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
なお、表４中、「組成比（Ｃｇ）」は、［α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量／（イソフラボン中のアグリコン量＋イソフラボンアグリコン量）］を示す。
【０１２１】
表４中の記号の意味は、以下の通り。
「−」：析出なし。「±」：僅かに析出する。「＋」：析出する。
【０１２２】
［溶解安定性試験２］
即効性と持続性を有する組成物において、即効性の面からイソフラボンアグリコンの添加は、重要な要因となる。しかしその量が多くなり過ぎると析出が生じ、商品ライフに大きな影響をきたす結果となる。
【０１２３】
そこで、組成物中のイソフラボンアグリコン量と全アグリコン量との関係が長期保存下で析出にどのように影響するかを調べた。
【０１２４】
被験物質としてイソフラボンアグリコンに「ソイアクトＷ」（イソフラボンアグリコン３３．３％、キッコーマン株式会社製）を使用し、酵素処理イソフラボンには実施例１で作った「試料Ａ」を用いた。
【０１２５】
これらを全アグリコン量として２５０ｐｐｍとなるように適宜量の水に分散し、１５％水酸化ナトリウムにてｐＨ１２．０で溶解後、２０％硫酸にて中和し、重量比「イソフラボンアグリコン／全アグリコン」が表５に示すように、それぞれ３．０／１００、１０．０／１００、２０．０／１００、３０．０／１００の試験液（サンプルＳＤ〜ＳＧ）を調製した。該試験液を１ヶ月間、常温で保存し、保存に伴う析出の有無を調べた。
【０１２６】
結果を、表５に示す。
【０１２７】
【表５】
【０１２８】
表５中の記号の意味は、以下の通り。
「−」：析出なし。「±」：僅かに析出する。「＋」：析出する。
【０１２９】
［飲食物の調製例１］
＜清涼飲料＞
表６に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．０／１、イソフラボンアグリコン＝２．２％）と他の骨密度改善効果を有する物質とを併含する清涼飲料を調製した。
【０１３０】
【表６】
【０１３１】
このように、水可溶性イソフラボン組成物と、他の骨密度改善効果を持つ成分と併用することによって、骨密度の維持・回復効果が期待できる清涼飲料が得られる。
【０１３２】
［飲食物の調製例２］
＜オレンジジュース＞
表７に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．０／１、イソフラボンアグリコン＝２．２％）を含有するオレンジジュース飲料を調製した。
【０１３３】
【表７】
【０１３４】
本製品（オレンジジュース）は、イソフラボンの沈殿を生じない果汁飲料として、骨粗鬆症を気にするヒトに好適に利用可能である。
【０１３５】
［飲食物の調製例３］
＜乳酸飲料＞
表８に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．０／１、イソフラボンアグリコン＝２．２％）を含有する乳酸飲料を調製した。
【０１３６】
【表８】
【０１３７】
この乳酸飲料は、ｐＨが低い（酸性）にも拘わらず、析出の生じないイソフラボン含有乳酸飲料として利用できる。
【０１３８】
［飲食物の調製例４］
＜ゼリー＞
表９に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．３／１、イソフラボンアグリコン＝１．２％）を含有するゼリーを調製した。
【０１３９】
【表９】
【０１４０】
本製品（ゼリー）は、（半）固形物であるにも拘わらず濁りがなく、味質に影響のない澄明なイソフラボン含有ゼリーとして利用できる。
【０１４１】
［化粧料組成物の調製例１］
＜含水化粧料＞
表１０に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．３／１、イソフラボンアグリコン＝１．２％）を含有する、弱酸性の柔軟化粧水を調製した。
【０１４２】
【表１０】
【０１４３】
［化粧料組成物の調製例２］
＜クリーム化粧料＞
表１１に示す配合組成を有し、水可溶性イソフラボン組成物（Ｃｇ＝４．３／１、イソフラボンアグリコン＝１．２％）を含有するクリーム化粧料を調製した。
【０１４４】
【表１１】
【０１４５】
このクリーム化粧料は、イソフラボンの持つ「肌の老化を防ぐ」作用を持ちつつ、クリームとして安定している。
【０１４６】
また、クリームの配合組成を化粧水用に変えることにより、化粧水としても水可溶性の安定な商品が得られる。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
［図１］図１は、水可溶性イソフラボン組成物（◆）、「水可溶性イソフラボン組成物とイソフラボンアグリコンの混合物」である混合試料（■）、イソフラボンアグリコン（▲）を２５時間に亘って、被験動物に経口投与し、投与開始からの経過時間（ｈ）（横軸）と、血中総イソフラボン濃度（ｎｍｏｌ／ｍｌ）（縦軸）との関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【０１４８】
▲・・・・・イソフラボンアグリコン投与群
■・・・・・混合試料投与群
◆・・・・・水可溶性イソフラボン組成物投与群
【図１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、必要によりイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、
α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量に対する、イソフラボンとイソフラボンアグリコンとの合計中に含まれるアグリコン量の比［α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量／（イソフラボン中のアグリコン量−イソフラボンアグリコン量）］が、２．５／１以上であることを特徴とする水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項２】
α−グルコシルイソフラボンとイソフラボンとイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、該組成物中のイソフラボンアグリコン量が、該組成物中の全アグリコン量の０．０１〜２０％であることを特徴とする水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項３】
上記α−グルコシルイソフラボンは、イソフラボンにα−結合にてグルコースが平均２．０〜２０個付加したものであることを特徴とする請求項１または２に記載の水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項４】
上記イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、イソフラボンアグリコンとを含むことを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項５】
上記α−グルコシルイソフラボンは、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む組成物に、サイクロデキストリン共存下で糖転移酵素を作用させて得られたものであることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項６】
上記α−グルコシルイソフラボンは、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む組成物に、サイクロデキストリンを作用させ、次いで、酸性条件下に冷却して生じた沈殿物を濾別除去した後、糖転移酵素を作用させることにより得られたものであることを特徴とする、請求項５に記載の水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項７】
上記サイクロデキストリンは、β−サイクロデキストリンまたは分岐β−サイクロデキストリンであることを特徴とする請求項５または６に記載の水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項８】
請求項１〜７の何れかに記載の水可溶性イソフラボン組成物を含むこと特徴とする飲食物、化粧品、医薬品または飼料。
【請求項９】
上記飲食物が酸性飲料であることを特徴とする請求項８に記載の飲食物、化粧品、医薬品または飼料。
【請求項１０】
さらに、酵素処理ヘスペリジンおよび／または酵素処理ルチンを含むことを特徴とする請求項８または９に記載の飲食物、化粧品、医薬品または飼料。
【請求項１１】
大豆イソフラボン抽出物を水又は水性媒体に懸濁させ、得られた懸濁液にサイクロデキストリンを加え、４０〜１００℃に加熱してサイクロデキストリンを溶解させた後、得られた溶液に、アルカリを添加混合してｐＨ８〜１３に調整してイソフラボン類を溶解させると共に、イソフラボン類をサイクロデキストリンに包接させ、次いで、
サイクロデキストリンに包接されたイソフラボン類の含有液に、酸を添加混合してｐＨ５．５〜２．０に調整した後降温し、生じた沈殿物を濾過にて除去し、次いで、得られた濾液をｐＨ５．０〜７．０に調整して、濾液中に含まれるイソフラボン類の酵素処理を行うことを特徴とする水可溶性イソフラボン組成物の製造方法。
【請求項１】
α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、必要によりイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、
α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量に対する、イソフラボンとイソフラボンアグリコンとの合計中に含まれるアグリコン量の比［α−グルコシルイソフラボン中のアグリコン量／（イソフラボン中のアグリコン量−イソフラボンアグリコン量）］が、２．５／１以上であることを特徴とする水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項２】
α−グルコシルイソフラボンとイソフラボンとイソフラボンアグリコンとを含むイソフラボン組成物であって、該組成物中のイソフラボンアグリコン量が、該組成物中の全アグリコン量の０．０１〜２０％であることを特徴とする水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項３】
上記α−グルコシルイソフラボンは、イソフラボンにα−結合にてグルコースが平均２．０〜２０個付加したものであることを特徴とする請求項１または２に記載の水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項４】
上記イソフラボン組成物は、α−グルコシルイソフラボンと、イソフラボンと、イソフラボンアグリコンとを含むことを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項５】
上記α−グルコシルイソフラボンは、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む組成物に、サイクロデキストリン共存下で糖転移酵素を作用させて得られたものであることを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項６】
上記α−グルコシルイソフラボンは、イソフラボン及びイソフラボン誘導体を含む組成物に、サイクロデキストリンを作用させ、次いで、酸性条件下に冷却して生じた沈殿物を濾別除去した後、糖転移酵素を作用させることにより得られたものであることを特徴とする、請求項５に記載の水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項７】
上記サイクロデキストリンは、β−サイクロデキストリンまたは分岐β−サイクロデキストリンであることを特徴とする請求項５または６に記載の水可溶性イソフラボン組成物。
【請求項８】
請求項１〜７の何れかに記載の水可溶性イソフラボン組成物を含むこと特徴とする飲食物、化粧品、医薬品または飼料。
【請求項９】
上記飲食物が酸性飲料であることを特徴とする請求項８に記載の飲食物、化粧品、医薬品または飼料。
【請求項１０】
さらに、酵素処理ヘスペリジンおよび／または酵素処理ルチンを含むことを特徴とする請求項８または９に記載の飲食物、化粧品、医薬品または飼料。
【請求項１１】
大豆イソフラボン抽出物を水又は水性媒体に懸濁させ、得られた懸濁液にサイクロデキストリンを加え、４０〜１００℃に加熱してサイクロデキストリンを溶解させた後、得られた溶液に、アルカリを添加混合してｐＨ８〜１３に調整してイソフラボン類を溶解させると共に、イソフラボン類をサイクロデキストリンに包接させ、次いで、
サイクロデキストリンに包接されたイソフラボン類の含有液に、酸を添加混合してｐＨ５．５〜２．０に調整した後降温し、生じた沈殿物を濾過にて除去し、次いで、得られた濾液をｐＨ５．０〜７．０に調整して、濾液中に含まれるイソフラボン類の酵素処理を行うことを特徴とする水可溶性イソフラボン組成物の製造方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０３３８０
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０６３３６（Ｐ２００５−５０６３３６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６７２６
【国際出願日】平成１６年５月１９日（２００４．５．１９）
【出願人】（５９１０６１０６８）東洋精糖株式会社 (17)
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【発行日】平成１８年７月２０日（２００６．７．２０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００６７２６
【国際出願日】平成１６年５月１９日（２００４．５．１９）
【出願人】（５９１０６１０６８）東洋精糖株式会社 (17)
【出願人】（０００１５５９０８）株式会社林原生物化学研究所 (168)
【Ｆターム（参考）】
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