炎症性疾患の予防又は治療方法及び薬学的組成物(METHODANDPHARMACEUTICALCOMPOSITIONFORPREVENTINGORTREATINGDISEASESASSOCIATEDWITHINFLAMMATION)
本発明は炎症性疾患の予防又は治療方法及び薬学的組成物に関する。より具体的には、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤を、これを必要とする固体(subject)に投与することを含むリンパ球-内皮細胞付着を抑制する方法又は炎症性疾患の治療方法、前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤を含む薬学的組成物、前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途及びFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤を選別することを特徴とするリンパ球内皮細胞付着反応を抑制する薬剤又は炎症性疾患の治療用薬剤のスクリーニング方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は2004年10月21日付で出願された大韓民国特許出願番号第10-2004-81498号にもとづく優先権を主張するものである。
【0002】
本発明は炎症性疾患の予防又は治療方法及び薬学的組成物に関する。より具体的に本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤をそれを必要とする個体(subject)に投与することを含む、リンパ球-内皮細胞付着を抑制する方法又は炎症性疾患の治療方法、前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤を含む薬学的組成物、前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤の用途及びFEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤を選別することを特徴とするリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤又は炎症性疾患の治療用薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0003】
炎症は白血球が病原体の侵入から組織を保護し、組織損傷により生ずる組織破片を除去する為の一連の反応である。前記白血球はリンパ球、単球及び顆粒球(好中球、好酸球及び好塩球)に分類される。
【0004】
一方、炎症反応(inflammation reaction)が起こる為の重要な過程の内、一つは循環系から炎症進行部位又は傷部位に白血球が移動することである。前記白血球の移動は毛細管後細静脈(postcapillary venule)で白血球が内皮細胞と相互作用をする多段階の過程を経て起こる。つまり、白血球は一連の捕獲(sequential capture)、ローリング(rolling)及び付着(firm adhesion)段階に次いで隣接した内皮細胞の間を通過する過程(transmigration)を経て血管外の部位に移動するようになる(Muller, W. A. et al., Lab. Invest. 82:521-533, 2002)。前記のような過程を経て白血球は内皮細胞に付着した後、細胞表面を移動して細胞内接合部(intracellular junction)を通じて炎症進行部位又は傷部位に移動できるようになる(Harlan J. M., Blood, 65:513-525, 1985)。
【0005】
一方、前記のような炎症反応が不適切に調節される場合には、多くの種類の炎症性疾患が誘発される。主要炎症性疾患としては感染性鼻炎、アレルギー性鼻炎、慢性鼻炎、急性副鼻腔炎等のような鼻炎及び副鼻腔炎;急性化膿性中耳炎及び慢性化膿性中耳炎等のような中耳炎;細菌性肺炎、気管支肺炎、大葉性肺炎、レジオレラ肺炎及びウイルス性肺炎等のような肺炎;急性又は慢性慢性胃炎、感染性小腸結腸炎、クローン氏病(Crohn's disease)、特発性潰瘍性大腸炎、胃膜性大腸炎等のような腸炎;化膿性関節炎、結核性関節炎、退行性関節炎及びリウマチ関節炎等のような関節炎;及び糖尿性眼疾患等がある。
【0006】
細胞付着分子(cell adhesion molecule, CAM)は炎症反応において、白血球の血管内皮細胞付着を媒介すると知られている。一方、前記細胞付着分子は白血球の血管内皮細胞付着を媒介する作用の他にも特定組織の構造の保持するか又は機能するようにせしめるにおいて、必須的であり、人体の構造を恒常性(homeostasis)を維持するのに重要な役割をする(Edelman, G.M., Annu. Rev Cell Bio., 2:81-116, 1986; Gumbiner, B.M., Cell, 84:345-357, 1996)。
【0007】
今まで、知られた細胞付着分子としてはカドヘリン(cadherin)、インテグリン(integrin)、セレクチン(selectin)及び免疫グロブリン細胞付着分子(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecule, IgCAM)等がある(Humphries, M.J. et al., Trends Cell Biol., 8:78-83, 1998)。この中でセレクチンは血小板又は内皮細胞に対する白血球の付着を開始するカルシウムイオン依存性細胞膜結合レクチンファミリとして知られており(Lasky, Science 258: 964-969, 1992)、白血球より発現されるL-セレクチン、シトキン活性内皮細胞で発現されるE-セレクチン及びトロンビン活性血小板及び内皮細胞で発現されるP-セレクチンの3種類に区分される。最近は前記セレクチンのように内皮細胞付着を媒介して炎症を誘発する細胞付着分子の活性を阻害する物質を開発し、抗炎症剤として使用しようとする研究が活発に進められている。
【0008】
大韓民国特許公開公報第2004-0039440号にはセレクチン媒介炎症抑制剤が開示されており、大韓民国特許第371784号には炎症性疾患の治療のためのL-セレクチンと特異的に反応する人間化された抗体が開示されている。
【0009】
一方、fas-1ドメインは哺乳類、昆虫、ウニ、植物、酵母及び細菌を含む多くの種の分泌タンパク質又は膜タンパク質から見出される極めて保存的な配列である(Kawamoto T. et al., Biochim. Biophys, Acta, 288-292, 1998)。fas-1ドメインは約110乃至140個のアミノ酸で構成され、特に、相同性が高い約10個のアミノ酸で構成された極めて保存的な二つの部分(H1及びH2)を含んでいる(Kawamoto, T. et al., Biochim. Biophys. Acta., 288292, 1998)。fas-1ドメインを含むタンパク質にはβig-h3、ペリオスチン(periostin)、ファスシクリンI(fasciclin I)、ウニHLC-2(sea urchin HLC-2)、アルガル-CAM(algal-CAM)、アルガル-CAM(algal-CAM)及びマイコバクテリウムMPB70(mycobacterium MPB70)等がある(Huber, O. et al., EMBO J., 4212-4222, 1994; Matsumoto, S. et al., J. Immunol., 281-287, 1995; Takeshita, S. et al., Biochem. J., 271-278, 1993; Wang, W. C. et al., J. Biol. Chem., 1448-1455, 1993)。前記タンパク質の内βig-h3、ペリオスチン(periostin)、ファスシクリンI(fasciclin I)は4個のfas-1ドメインを有し、HLC-2は2個、さらにMPB70は唯1個のfas-1ドメインを有している。fas-1ドメインを含むタンパク質等の生物学的機能が正確に究明されたのではないものの、幾つかのタンパク質等が細胞付着分子(cell adhesion molecule)として作用することが報告されている。その中でβig-h3は繊維芽細胞と上皮細胞に、ペリオスチンは骨芽細胞に、さらに、ファスシクリンIは神経細胞の付着を媒介するものと報告されている(LeBaron, R. G. et al., J. Invest. Dermatol., 844-849, 1995; Horinchi, K. et al., J. Bone Miner. Res., 1239-1249, 1999; Wang, W. C. et al., J. Biol. Chem., 1448-1455, 1993)。さらに、アルガル-CAMは鳥類ボルボックス(volvox)の胚(embryos)に存在する細胞付着分子であることが究明されている(Huber, O. et al., EMBO J., 4212-4222, 1994)。
【0010】
上述した通り、fas-1ドメインを含む幾つかのタンパク質等が細胞付着分子として作用するとの事実が究明はされたものの、fas-1ドメインを含む全ての種類のタンパク質が細胞付着活性を呈するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
ここに、本発明者らは新たな炎症関連治療剤の研究を重ねていく中で、内皮細胞に存在するFEX-2ポリペプチドがリンパ球の付着を媒介する新たな細胞付着分子だという事実を見出し、それを基に前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤がリンパ球の内皮細胞付着を阻害し、炎症関連疾患の治療剤として使用できることを確認することにより本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【0012】
従って、本発明の目的はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤を、それを必要とする個体(subject)に投与することを含むリンパ球-内皮細胞付着を抑制する方法を提供する。
【0013】
さらに、本発明の他の目的はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤を、それを必要とする個体(subject)に投与することを含む炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0014】
さらに、本発明のさらに他の目的はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含むリンパ球-内皮細胞付着抑制用薬学的組成物を提供することである。
【0015】
さらに、本発明の他の目的はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む炎症性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することである。
【0016】
さらに、本発明の他の目的はリンパ球-内皮細胞付着抑制用薬剤の製造の為の前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途を提供することである。
【0017】
さらに、本発明の他の目的は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造のための、前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤の用途を提供することである。
【0018】
さらに、本発明の他の目的は試験製剤がFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着を抑制するか否かを確認することを特徴とするリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法を提供することである。
【0019】
さらに、本発明の他の目的は試験製剤がFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着を抑制するか否かを測定することを特徴とする炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法を提供することである。
【0020】
前記のような本発明の目的を達成する為に、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤をそれを必要とする個体(subject)に投与することを含むリンパ球-内皮細胞付着を抑制する方法を提供する。
さらに、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤をそれを必要とする個体(subject)に投与することを含む炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0021】
さらに、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含むリンパ球-内皮細胞付着抑制用薬学的組成物を提供する。
【0022】
さらに、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【0023】
さらに、本発明はリンパ球-内皮細胞付着抑制用薬剤の製造の為のFEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤の用途を提供する。
【0024】
さらに、本発明は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造のための、FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途を提供する。
【0025】
さらに、本発明は試験製剤がFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着を抑制するか否かを確認することを特徴とするリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【0026】
さらに、本発明は試験製剤がFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着を抑制するか否かを測定することを特徴とする炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【0027】
以下、本発明を詳細に説明する。
他の定義が無い限り、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的用語は当業者らにより、一般的に理解されるものと同一の意味を有する。次の参考文献は本発明の明細書に使用された多くの用語らの一般的な定義を有する技術(skill)の一つを提供する。Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); 及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. さらに、次の定義は本発明の実施の為、読者の便宜の為に提供する。
【0028】
本発明で‘ポリペプチド(polypeptide)’は‘ポリペプチド等(polypeptides)又はタンパク質(等)'と互換性のあるように使用され、例えば、自然状態のタンパク質で一般的に見出される通りアミノ酸残基の重合体をいう。
【0029】
本発明でFEX-2ポリペプチドは哺乳動物から由来したものでもあり得、好ましくは人間、ラット及びマウスからなるグループの中で選ばれるいずれか一つから由来したものでもあり得る。より好ましくは、配列番号1で表示される人間FEX-2ポリペプチド又は配列番号9で表示されるマウスFEX-2ポリペプチドでもあり得る。最も好ましくは、配列番号1で表示される人間FEX-2ポリペプチドでもあり得る。
【0030】
前記FEX-2ポリペプチドは本発明者らにより、公知のポリヌクレオチドデータベースでクローニングされた遺伝子であり、実験を通じて血管内皮細胞に存在しながらリンパ球が血管内皮細胞に付着するのを媒介する機能を行うことが確認できた。
【0031】
つまり、本発明者らはfas-1ドメインを含むタンパク質らが細胞付着分子で発現される事実を基に、fas-1ドメインを含む部分的な人間cDNAを公知のヌクレオチドデータベースで検索し、この中で未だにその特性が明らかにされていない三つのcDNAを選抜した。前記cDNAを基にしてプライマーをデザインした後、人間の脾臓から抽出した総RNAを鋳型にして、前記にてデザインされたプライマーでRT-PCR及び5'RACE PCRを行うことによりfas-1ドメインを含む人間遺伝子を新たにクローニングした(実施例1参照)。
【0032】
前記本発明者らが合成した遺伝子は7個のデザイン、23個のEGF-類似ドメイン、1個のX-リンクドメイン及び1個の膜横断ドメインを有していた(図1参照)。前記のようなドメイン構造を基にし、前記遺伝子をFEX-2に命名して前記遺伝子配列をジーンバンクに登録した(YA311388)。人間FEX-2のアミノ酸配列は配列番号1に示した通りである。
【0033】
本発明者らは本発明で製造した組換えFEX-2タンパク質が細胞付着分子として作用するか否かを確認する為に、先ず、FEX-2が細胞表面で発現されるか否かを調査した。
【0034】
この為、本発明者らは人間FEX-2遺伝子を含む組換えベクトルを製造してマウス繊維芽細胞のL細胞に形質転換した後、それをL/FEX-2と命名した(実施例1参照)。その後人間FEX-2に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体をそれぞれ製造し、前記抗体が人間脾臓組織及びL/FEX-2細胞でFEX-2の発現を検出できるか否かを免疫ブロット法で調査した(実施例2参照)。その結果、本発明のFEX-2抗体が人間脾臓組織及びL/FEX-2細胞で発現されるFEX-2タンパク質を特異的に検出できることを確認した(図2参照)。
【0035】
ここに、本発明者らは前記FEX-2に特異的な抗体を利用してL/FEX-2細胞の表面にFEX-2が発現されるか否かをFACS分析法とバイオチン化法で調査した(実施例3参照)。その結果、L/FEX-2細胞表面にFEX-2が発現することが確認できた(図3及び図4参照)。
【0036】
さらに、本発明者らはFEX-2がどの組織で発現されるかを調査する為に、多くの人間組織でFEX-2の発現可否を人間FEX-2ポリクローナル抗体を利用した免疫組織化学染色法で調査した(実施例3参照)。その結果、FEX-2が人間脾臓のシヌソイド(sinusoidal)血管内皮細胞で発現されることを確認した(図5参照)。さらに、肝臓とリンパ質のシヌソイド(sinusoidal)血管内皮細胞でもFEX-2が発現されることを確認した(結果は未図示)。
【0037】
これより、FEX-2が、血管内皮細胞で発現され、血液内に存在する細胞と相互作用ができると推定した。そして、本発明者らはFEX-2タンパク質が発現されるように、形質転換されたL/FEX-2細胞にリンパ球が付着する活性があるか否かを調査した(実施例5参照)。その結果、対照群細胞に比べてL/FEX-2細胞の表面に多数のリンパ球が付着することを確認することができた(図6及び図7参照)。
【0038】
さらに、本発明者らはL/FEX-2細胞にリンパ球が付着するのがFEX-2タンパク質によるものか否かを確認する為に、抗-FEX-2抗体の存在下で前記L/FEX-2細胞にリンパ球が付着するか否かを調査した(実施例6参照)。その結果、L/FEX-2細胞にリンパ球の付着が抗-FEX-2抗体により、特異的に阻害されたことが確認できた(図8参照)。
【0039】
従って、本発明者らは前記実験結果から、FEX-2がリンパ球の付着を媒介する細胞付着分子として機能するという新たな事実が確認できた。
【0040】
さらには、本発明者らは細胞付着分子としてのFEX-2の特性をより具体的に調査する為に、前記FEX-2に対する細胞表面受容体を同定した。
【0041】
この為、本発明の一実施例ではFEX-2に対するリンパ球の付着において、マンガン、マグネシウム及びイオンが及ぼす影響を調査した(実施例7参照)。その結果、リンパ球のFEX-2に対する細胞付着はマンガンイオンにより、最も高く促進されたことを確認することができ、その次にはマグネシウムイオンにより促進されたことを確認することができた(図9参照)。これよりFEX-2に対する細胞表面受容体はリガンドとの作用において、前記の2価陽イオンを必要とすることが分かり、これは、細胞付着活性においてリガンドに結合するインテグリン受容体の特徴と一致した。
【0042】
そこで、本発明者らはFEX-2に対するリンパ球の付着を媒介するインテグリン受容体を同定した(実施例7参照)。その結果、αLβ2インテグリン及びαMβ2インテグリンがFEX-2と相互作用してリンパ球の付着に関与したことが確認できた(図10参照)。
【0043】
前記実験結果から、本発明者らはFEX-2が血管内皮細胞に存在し、リンパ球の-αLβ2インテグリン又はαMβ2インテグリンの相互作用を通じて前記FEX-2がリンパ球の血管内皮細胞への付着を媒介する活性があることを初めて明らかにすることができた。
【0044】
さらには、本発明者らは前記FEX-2のどの部分がリンパ球の付着と直接的な関連があるかをより具体的に調査し、リンパ球の付着と関連したFEX-2の一部分を含むポリペプチドがFEX-2に対するリンパ球の付着を抑制する阻害剤として使用できるかを調査した。
【0045】
この為、本発明の一実施例で前記FEX-2タンパク質を4個の小単位体に分け、それぞれの組換えタンパク質を製造し(図11参照)、前記小単位体とリンパ球を前培養した後FEX-2を発現するL/FEX-2細胞にリンパ球を添加して培養し、FEX-2に対するリンパ球の付着程度を調査した(実施例<8-1>参照)。その結果、前記小単位体とリンパ球を前培養した後L/FEX-2細胞にリンパ球を添加した場合に、全てのFEX-2に対するリンパ球の付着が大きく阻害されたことが確認できた(図12参照)。
【0046】
さらに、本発明者らは前記FEX-2タンパク質の小単位体中、3番目に属するNus-U3をさらに3部分に区分してFEX-2の3番目のEGF-類似繰返しドメインを含むポリペプチド(Nus-EGF3)とFEX-2のそれぞれ5番目及び6番目のfas-1ドメインを含むポリペプチド(Nus-Fas5, Nus-Fas6)をそれぞれ製造し(図13参照)、前記ポリペプチドとリンパ球を前培養した後、L/FEX-2細胞にリンパ球を添加してFEX-2に対するリンパ球の付着程度を調査した(実施例8参照)。その結果、fas-1ドメインを含むNus-Fas5及びNus-Fas6ポリペプチドとリンパ球を前培養した場合には、L/FEX-2細胞に対するリンパ球の付着が抑制されたものの、EGF-類似繰返しドメインを含む、ポリペプチドの場合にはリンパ球の付着を阻害する活性が表われなかった(図14参照)。
【0047】
さらに、本発明の一実施例では前記fas-1ドメインを含むポリペプチドを濃度別に処理してリンパ球を前培養した後L/FEX-2細胞にリンパ球を添加してFEX-2タンパク質に対するリンパ球の付着程度を調査した結果(実施例9参照)、前記ポリペプチドの処理濃度が増加する程FEX-2に対するリンパ球の付着阻害程度が増加した(図15参照)。
【0048】
これにより、本発明者らは前記実験結果からリンパ球をfas-1ドメインを含むポリペプチドと前培養した場合に前記fas-1ドメイン部分がリンパ球に付着してL/FEX-2細胞により発現されるFEX-2タンパク質と競争的に作用することが分かった。従って、FEX-2タンパク質のfas-1ドメイン部分にリンパ球が付着し、前記fas-1ドメインを含むポリペプチドはFEX-2タンパク質に対するリンパ球の付着を阻害する阻害剤として使用できることが確認できた。
【0049】
さらには、本発明者らは人間FEX-2タンパク質内に含まれた個のfas-1ドメインを含むポリペプチド及び前記人間FEX-2タンパク質以外に他の種類のタンパク質である結核菌タンパク質mpt83とmpt70のfas-1ドメインを含むポリペプチドがFEX-2タンパク質に対するリンパ球の付着を阻害することができるか否かを調査した(実施例10参照)。その結果、FEX-2タンパク質に含まれた7個のfas-1ドメインを含むポリペプチドが全てFEX-2に対するリンパ球の付着を阻害する活性を有していることが確認できた(図16)。さらに、結核菌のタンパク質であるmpt83とmpt70内のfas-1ドメインを含むポリペプチドもまた、FEX-2に対するリンパ球の付着を阻害する活性を有し、前記リンパ球付着阻害活性はポリペプチドの処理濃度に依存的なものとして表われた(図17参照)。
【0050】
上述した通り、本発明ではリンパ球のαLβ2インテグリン又はαMβ2インテグリンの相互作用を通じてFEX-2が血管内皮細胞とリンパ球の付着を媒介する活性のあることが初めて明らかにされた。さらに、本発明ではリンパ球の内皮細胞付着がFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤により抑制されることが確認できた。
【0051】
従って、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、リンパ球の内皮細胞付着を抑制する方法を提供する。前記リンパ球の内皮細胞付着はfas-1ドメインを含む細胞付着分子により、媒介されることを特徴とし、好ましくはFEX-2ポリペプチドにより媒介される。
一方、炎症反応はリンパ球が血管内皮細胞に付着した後、炎症部位に移動することにより起こり、血管内皮細胞に存在する細胞付着分子に対するリンパ球の付着活性を阻害すれば、リンパ球の炎症部位への移動を阻害して炎症反応を阻害できるようになる(Ulbrich, H. et al., Trends Pharmacol. Sci. 24:640-647, 2003; Harlan, J. M. et al., Crit. Care Med. 30(5 Suppl):S214-219, 2002; van Assche, G. et al., Inflamm. Bowel Dis. 8:291-300, 2002)。そこで、血管内皮細胞に存在する細胞付着分子であるFEX-2に対するリンパ球の付着活性の阻害は炎症部位へのリンパ球の移動を阻害して炎症反応を抑制できるようになる。
従って、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤をそれを必要とする固体に投与することを含む炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0052】
本発明で‘固体(subject)'とは、動物、好ましくは哺乳動物の場合もあって動物から由来した細胞、組織、器官の場合もあり得る。
本発明で‘FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤'はFEX-2ポリペプチドに結合してリンパ球の付着を抑制するか又はリンパ球に結合して前記リンパ球がFEX-2に結合することを抑制する活性を有する化合物又は前記FEX-2タンパク質をコーディングする遺伝子の発現を抑制できる活性がある化合物をいう。
前記にてFEX-2タンパク質とリンパ球の付着を阻害する活性を有したものには、例えば、これに限定はされないものの、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド模造物、化合物及び生物製剤でもあり得る。
好ましくは、FEX-2に結合してFEX-2に対するリンパ球の結合を抑制する化合物には、抗-FEX-2抗体が含まれる。さらに、リンパ球に結合してリンパ球のFEX-2に対する結合を抑制する化合物には、fas-1ドメインを含むポリペプチドを含み得る。
【0053】
本発明でfas-1ドメインを含むポリペプチドは哺乳動物から由来したものでもあり得、好ましくは人間、ラット及びマウスからなるグループの中で選ばれるいずれかの一つから由来したものでもあり得る。本発明のfas-1ドメインを含むポリペプチドは従来fas-1ドメインを含んでいるものと知られた全ての種類のタンパク質から由来したfas-1ドメインが全て使用できる。従って、本発明のfas-1ドメインは当業界に公知のタンパク質配列検索データベース、例えば、(NCBI Entrez(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/), EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/) 又はSMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)を通じて検索されるfas-1ドメインが全て使用できる。
【0054】
本発明では、好ましくはFEX-2、mpt70、mpt83、βig-h3、ペリオスチン及びFEX-1からなるグループの中で選ばれたタンパク質から由来したfas-1ドメインを含むポリペプチドが使用できる。より好ましくは配列番号1乃至配列番号12で表示される人間FEX-2のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号13及び配列番号14で表示される結核菌タンパク質mpt70及びmpt83から由来したfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号15乃至配列番号21で表示されるマウスFEX-2のfas-1ドメインを含むポリペプチド及び配列番号22乃至配列番号25で表示されるラットFEX-2のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号配26乃至配列番号29で表示される人間βig-h3のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号30乃至配列番号33で表示されるβig-h3のfas-1ドメイン含むポリペプチド、配列番号34又は配列番号35で表示されるラットβig-h3のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号配36乃至配列番号39で表示される人間ペリオスチンのfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号40乃至配列番号43で表示されるマウスペリオスチンのfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号44乃至配列番号47で表示されるラットペリオスチンのfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号48乃至配列番号54で表示される人間FEX-2のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号55又は配列番号60で表示されるマウスFEX-1のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号61乃至配列番号66で表示されるラットFEX-1のfas-1ドメインを含むポリペプチドが使用できる。最も好ましくは配列番号1乃至配列番号12で表示される人間FEX-2のfas-1ドメインを含むポリペプチド又は配列番号13及び配列番号14で表示されるmpt83及びmpt70のfas-1ドメインを含むポリペプチドを使用することができる。
【0055】
さらに、本発明にはfas-1ドメイン含有タンパク質から由来したfas-1ドメイン1個又は2個以上の組合せが使用できる。
【0056】
さらに、本発明のfas-1ドメインを含むポリペプチドの範囲ではfas-1ドメインの機能的同等物及びこれらの塩が含まれる。前記にて‘機能的同等物’とは、本発明に伴うfas-1ドメインと実質的に同等な生理活性を表わすポリペプチドをいう。つまり、本発明のポリペプチドと実質的に同等な生理活性を表わす限りアミノ酸配列のみならず、構造学的に同一又は類似したポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。前記にて‘実質的に同等な生理活性’とは、リンパ球が細胞付着分子であるFEX-2に付着することを阻害する活性をいう。より具体的には、リンパ球のインテグリンαLβ2又はαMβ2と相互作用して前記リンパ球がFEX-2に付着することを阻害する活性をいう。
【0057】
さらに、本発明の機能的同等物の範囲には本発明におけるポリペプチドの基本骨格及びこれの生理活性を維持しながらポリペプチドの化学構造が変形されたポリペプチド誘導体が含まれる。例えば、ポリペプチドの安定性、貯蔵性、揮発性又は溶解度等を変更させる為に、構造が変更されたポリペプチドが含まれる。
【0058】
本発明のfas-1ドメインを含むポリペプチドは当業界に公知の化学的合成(Creightion, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)により、容易に製造できる。代表的な方法としてはこれに限定されるのではないものの、液体又は固体状合成法、断片凝縮法、F-MOCはT-BOC化学法等がある(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989)。
【0059】
さらに、本発明のfas-1ドメインを含むポリペプチドは遺伝工学的方法により、製作され得る。つまり、通常的な方法により前記ポリペプチドをコーディングするDNA 配列を製造する。DNA配列は適切なプライマーを使用してPCR増幅することにより、製造できる。他の方法として当業界に公知の標準方法により、例えば、自動DNA合成機(Biosearch又はApplied Biosystems社で販売するもの)を使用してDNA配列を合成することもできる。製造されたDNA配列はこのDNA配列に作動可能に連結され(operatively linked)そのDNA配列の発現を調節する一つ又はそれ以上の発現調節配列(expression control sequence)(例:プロモータ、エンハンサ等)を含むベクターに挿入させ、これより形成された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換体させる。生成された形質転換体を前記DNA配列が発現されるようにするために適切な培地及び条件下で培養し、培養物から前記DNA配列によりコーディングされた実質的に純粋なポリペプチドを回収する。前記回収は当業界に公知の方法(例えば、クロマトグラフィー)を利用して行うことができる。前記にて‘実質的に純粋なポリペプチド’とは、本発明に伴うポリペプチドが宿主細胞から由来した、いかなる他のタンパク質も実質的に含まないことを意味する。本発明のポリペプチド合成の為の遺伝工学的方法は下記の文献を参考にできる:(Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990)。
【0060】
本発明で抗-FEX-2抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でもあり得る。本発明の抗体はFEX-2タンパク質を抗原として免疫学分野で広く知られている通常の方法で製造できる。
ポリクローナル抗体は馬、牛、山羊、羊、犬、鶏、七面鳥、兎、マウス又はラットのような種々の恒温動物から当該分野の通常的な技術の中の一つを利用できる。つまり、抗原を腹膜内、筋肉内、眼内又は皮下注射を通じて動物を免疫させる。前記抗原に対する免疫性は補助剤、例えば、フラウント(Freund)の完全補助剤又は不完全補助剤を使用して増加させ得る。ブースター(booster)免疫処理に従った後血清の小型サンプルを収集し、目的とする抗原に対する反応性をテストする。動物の力価が一旦抗原に対する反応性の観点から停滞状態に到達すれば、多量のポリクローナル免疫血清を1週間毎の出血又は動物を放血させることにより収得することができる。
【0061】
モノクローナル抗体も公知の技術を利用して生成することができる(Kennettm McKearn, and Bechtol(eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, 1980)。モノクローナル抗体はFEX-2タンパク質を免疫原として動物を免疫化し、免疫化した動物の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成し、FEX-2タンパク質を選択的に認識するハイブリドーマを選別し、選別したハイブリドーマを培養して、ハイブリドーマの培養液から抗体を分離することにより製造できる。さらに、本発明のモノクローナル抗体はFEX-2タンパク質を選択的に認識する抗-FEX-2抗体を生産する前記のハイブリドーマを動物に注入し、注入後一定期間経過後回収した動物の腹水から分離することにより製造できる。
【0062】
本発明の一実施例で製造した人間FEX-2モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ5G3は、ブタペスト条約下の国際寄託機関である韓国生命工学院遺伝資源センター遺伝子銀行(KCTC)(大韓民国大田市儒城区魚隠洞52番地韓国生命工学研究院)に2004年5月21日付で寄託番号KCTC-10639BPで寄託した。前記寄託物は登録特許(issued patent)の全期間中、韓国生命工学院遺伝資源センータ遺伝子銀行で生きている状態で維持でき、寄託物管理法の規定により無制限に非商業的用途に全ての人(any person or entity)が入手できる。
【0063】
さらに、前記FEX-2タンパク質をコーディングする遺伝子の発現を抑制できる活性を有した物質には前記遺伝子の転写を抑制するか又はタンパク質への翻訳を抑制できる物質をいう。前記にて遺伝子発現抑制は遺伝子発現を完全に停止させることばかりでなく、発現が減少されるようにすることも含まれる。
【0064】
上述した通りの遺伝子の発現を抑制する活性を有した物質には、特定の内在性遺伝子の発現を抑制できるアンチセンス分子が最も代表的である。アンチセンス分子が標的遺伝子の発現を抑制する作用には三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼにより局部的な開状ループ構造が作られた部位でハイブリッド形成による転写抑制、合成が進行しているRNAでハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でハイブリッド形成によるスプライシン抑制、スプライソゾム形成部位でハイブリッド形成によるスプライシン抑制、Mrnaとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、翻訳開始因子結合部位でハイブリッド形成による翻訳開始抑制等がある。これらは転写、スプライシン又は翻訳過程を阻害し、標的遺伝子の発現を抑制する。
【0065】
本発明に使用されるアンチセンス分子は前記のいずれの作用でも標的遺伝子の発現を抑制してもよい。代表的なアンチセンス分子にはトリプルヘリックスフォーミングエージェント、リボザイム(ribozyme)、RNAi、又はアンチセンス核酸等が含まれる。トリプロルリックスフォーミングエージェントは2重螺旋DNA周辺を巻いて3本鎖螺旋を形成するようにすることにより、転写開始が抑制されるようにする(Maher et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991)。
【0066】
リボザイムは1本鎖RNAを特異的に切断する能力を保有したRNA酵素である。リボザイムは標的RNA分子内の特定ポリヌクレオチド配列を認識して部位特異的に切断することにより、標的遺伝子のタンパク質発現を抑制する(Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1998; Sarver et al., Science 247:1222-1225, 1990)。
【0067】
RNAi(RNA interference)は塩基配列特異的に作用するヘアピン状の小分子のRNAを使用して転写水準或いは転写後水準で遺伝子発現を抑制させる方法である(Mette et al., EMBO J., 19: 5194-5201, 2000)。前記RNAi方法に使用される小分子RNAは標的遺伝子と相同性を有する二本鎖RNA分子である。
前記にてRNA分子を製造する方法には公知の化学的合成方法及び酵素的方法を利用できる。例えば、RNA分子の化学的合成は文献に開示されている方法を利用でき(Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67, 99-134, 1999)、RNA分子の酵素的合成はT7、T3及びSP6RNAポリメラーゼのようなファージRNAポリメラーゼを利用する方法が文献に開示されている(Milligan and Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180:51-62, 1989)。
【0068】
アンチセンス核酸は標的mRNA分子と少なくとも一部分が相補的なDNA又はRNA分子をいう(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990)。細胞内でアンチセンス核酸はそれに相応するmRNAと混成化され、二本鎖分子を形成することにより、標的遺伝子のmRNA解読を阻害してタンパク質発現を抑制する(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988)。前記アンチセンス核酸は特に本発明のFEX-2の発現を抑制する抑制剤として有用に使用できる。前記アンチセンス核酸は好ましくはオリゴポリヌクレオチド形態であり、当業界に公知の任意の適合した方法により製造できる。前記アンチセンスオリゴポリヌクレオチドは化学合成法、例えば、文献(Tetrahedron Lett., 1991, 32, 30005-30008)に記載された通り、アセトニトリルの中でテトラエチルチウラムジスルフィドに硫化させるホスホアミダイト化学のような方法により極めて容易に製造できる。
【0069】
本発明の方法により予防又は治療できる‘炎症性疾患’には体内の炎症反応自体又は前記炎症反応により誘発されるすべての疾患が含まれる。例えば、これに限定はされないものの、炎症、炎症性腸疾患、糖尿性眼疾患、腹膜炎、骨髄炎、蜂巣炎、脳膜炎、脳炎、膵臓炎、外傷誘発ショック、気管支喘息、鼻炎、中耳炎、肺炎、胃炎、嚢疱性繊維症、卒中、気管支炎、細気管支炎、肝臓炎、腎臓炎、関節炎、通風、脊椎炎、ライター症候群、結節性多発動脈炎、過敏性血管炎、ルゲニック肉芽腫症、リウマチ性多発性筋肉痛、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着関節病症、仮性通風、非関節リウマチズム、点液嚢炎、乾草炎、上顆炎(テニスエルボー)、神経病症状関節疾患(Charcot's joint)、出血性関節症(hemarthro sis)、ヘノフシェンライン紫斑病、鼻喉性骨関節病症、多重芯性細網組織球腫、スルコイロシス(surcoilosis)、血色素症、鎌状赤血球症及びその他の血色素症、高脂蛋白血症、低ガンマグロブリン血症、副甲状腺機能昂進症、末端巨大症、家族性地中海熱、ベハト病、全身性紅斑性ループス、再帰熱、乾癬、多発性硬化症、敗血症、敗血性ショック、急性呼吸困難症候群、多発性臓器不全、慢性閉鎖性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease)、急性肺損傷(acute lung injury)及び気管支肺形成障害(broncho-pulmonary dysplasia)等が含まれる。
【0070】
本発明の他の面として本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含むリンパ球の内皮細胞付着反応抑制用薬学的組成物を提供する。
【0071】
さらに、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【0072】
前記にて‘薬学的に許容される’とは、生理学的に許容され、人間に投与される時、一般的に胃腸障害、めまい症等のようなアレルギー反応又はこれと類似した反応を起こさない組成物をいう。薬学的に許容される担体には、例えば、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸等のような経口投与用担体及び水、適合したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコール等のような非経口投与用担体等があり、安定化剤及び保存剤を追加して保存することができる。適合した安定化剤には亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適合した保存剤としてはベンズアルコニウムクロライド、メチル又はプロピルパラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体には次の文献に記載されているのことを参考にすることができる(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995)。
【0073】
前記本発明に伴う薬学的組成物は上述したような薬学的に許容される担体と共に当業界に公知の方法により、適合した形態で剤型化できる。つまり、本発明の薬学的組成物は公知の方法により多様な非経口又は経口投与用の形態で製造できる。非経口投与用剤型の代表的なものには、注射用剤型として等張性水溶液又は懸濁液が好ましい。注射用剤型は適合した分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して当業界に公知の技術により製造できる。例えば、各成分を食塩水又は緩衝液に溶解させ、注射用として剤型化することができる。さらに、経口投与用剤型としてはこれに限定はされないものの、粉末、顆粒、錠剤、丸薬及びカプセル等がある。
【0074】
前記のような方法で剤型化された薬学的組成物は有効量で経口、経皮、皮下、静脈又は筋肉を含む多くの経路を通じて投与できる。
【0075】
前記にて‘有効量’とは、患者に投与した際、予防又は治療効果を表わす化合物又は抽出物の量をいう。本発明における薬学的組成物の投与量は投与経路、投与対象、年齢、性別体重、個人差及び疾病状態により適宜選択できる。好ましくは本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物は疾患の程度によって、有効成分の含量を異にすることができるものの、成人を基準にした場合、一般的に1回投与の際10μg乃至10mgの有効容量で1日数回繰返し投与できる。
【0076】
さらに、本発明はリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤の製造の為の、FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途を提供する。
さらに、本発明は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造の為のFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途を提供する。
【0077】
引き続き本発明は、リンパ球の内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、試験製剤がFEX-2を発現する細胞と特異的に作用する場合、本発明のスクリーニング方法は(a)FEX-2ポリペプチドを発現する細胞を試験製剤と共に、又は試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に、前培養した細胞又は試験製剤無しに前培養した細胞にリンパ球を添加して追加培養する段階;及び
(c)試験製剤と共に前培養した細胞に対するリンパ球の付着程度を測定し、試験製剤無しに前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階を含む。
【0078】
さらに、試験製剤がリンパ球と特異的に作用する場合、本発明のスクリーニング方法は
(a)リンパ球を試験製剤と共に、又は試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に、前培養したリンパ球又は試験製剤無しに前培養したリンパ球をFEX-2ポリペプチドを発現する細胞に添加して追加培養する段階;及び
(c)試験製剤と共に、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度を測定し、試験製剤無しに前培養した細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階を含む。
【0079】
さらに、本発明は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明における炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法は、前記リンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法に(d)前記(c)段階でリンパ球の付着を抑制するものと確認された試験製剤を炎症性疾患を有している動物に投与して治療効果を表わすかを検査する段階を追加して含む。
【0080】
前記にて動物は人間でない動物(non-human animal)であることが好ましい。さらに、前記(d)段階で‘治療効果’とは、炎症性疾患及びこの症状を緩和又は改善する効果及び炎症性疾患の進行を抑制する効果を意味する。
【0081】
本発明で‘製剤(agent)’又は‘試験製剤(test agent)’とは、任意の物質(substance)、分子(molecule)、元素(element)、化合物(compound)、実在物(entity)又はこれらの組合せを含む。例えば、これに制限はされないものの、タンパク質、ポリペプチド、小有機物質(small organic molecule)、多糖類(polysaccharide)、ポリヌクレオチド等を含む。さらに、自然産物(natural product)、合成化合物又は化学化合物又は2個以上の物質の組合せでもあり得る。特に指定されない限り、製剤、物質及び化合物は互換性があるように(interchangeably)使用できる。
【0082】
本発明の方法でスクリーニング若しくは同定でき、試験製剤は、ポリペプチド、ベータターンミメチック(beta-turn mimetics)、多糖類、燐脂質、ホルモン、プロスタグラチン、ステロイド、芳香族化合物、ヘテロサイクリック化合物、ベンゾジアゼピン(benzodiazepines)、オリゴマリックN-置換グリシン(oligomeric N-substituted glycines)、オリゴカルバメート(oligocarbamates)、糖類(saccharides)、脂肪酸、ヒューリン、ピリマジン又はこれらの誘導体、構造的アナログ又は組合せを含む。ある試験製剤は合成物質でもあり、他の試験製剤は天然物質でもあり得る。前記試験製剤は合成又は自然化合物のライブラリーを含む広範囲で多様な出処から得られる。組合せ(combinatorial)ライブラリーはステップ-バイ-ステップ方式で合成できる種々の化合物から生産できる。多数の組合せライブラリー化合物等はESL(encoded synthetic libraries)方法(WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503及びWO 95/30642)により製造できる。バクテリア、黴、植物及び動物抽出物形態の自然化合物のライブラリーは商業的な出処から得るか又はフィールド(field)で収集できる。公知の薬理学的(pharmacological)製剤が構造的アナログを製造する為に、アシル化、エステル化反応(esterification)、イミド化反応(amidification)のような指示されるか(direct)無作為な化学的修飾に適用できる。前記試験製剤は自然的に生成されるタンパク質又はその断片でもあり得る。このような試験製剤は自然出処(natural source)、例えば、細胞又は組織溶解物から収得できる。ポリペプチド製剤のライブラリーは例えば、一般的な方法により、生成若しくは商業的に入手できるcDNAライブラリーから収得できる。前記試験製剤はペプチド、例えば、約5-30個、好ましくは約5-20個、より好ましくは約7-15個のアミノ酸を有するペプチドでもあり得る。前記ペプチドは自然的に生産されるタンパク質、ランダムペプチド又は“バイアス化(biased)”ランダムペプチドの切断物でもあり得る。
【0083】
さらに、前記試験製剤は“核酸”の場合もあり得る。核酸試験製剤は自然的に生成される核酸、ランダム核酸、又は“バイアス化”ランダム核酸でもあり得る。例えば、原核又は真核ゲノムの切断物を前記に記載したのと類似して使用できる。
【0084】
さらに、前記試験製剤は小分子(例:約1,000以下の分子量を有する分子)でもあり得る。小分子の調節製剤をスクリーニングするための方法には、好ましくは高速分析アッセイ(high throughput assay)が適用できる。前記に記載した通り小分子試験製剤の組合せライブラリーが本発明のスクリーニング方法に容易に適用することもできる。多くのアッセイが前記スクリーニングに有用である(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol. Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997)。
【0085】
前記にて‘FEX-2ポリペプチドを発現する細胞’とは、好ましくは前記FEX-2ポリペプチドをコーディングする遺伝子を含むベクターに形質転換される細胞をいう。前記細胞としては、特に、限定はされないものの、FEX-2ポリペプチド以外の細胞付着分子が存在しない細胞であることが好ましい。本発明で例示されたものには、マウス繊維芽細胞であるL細胞がある。前記マウスのL細胞以外にも中国のハムスタ-卵巣細胞CHO、マウス肉腫細胞S180及びドロソフィラー(Drosophila)S2細胞が使用できる。
【0086】
前記にてFEX-2ポリペプチドをコーディングする遺伝子を含むベクターは、公知のFEX-2遺伝子配列から公知の方法によりcDNAを製造し、前記cDNAを適合したベクターにクローニングすることにより、容易に製造することもできる。本発明で例示された発現ベクターはpcDNA FEX-2がある。
【0087】
前記にてリンパ球は蛍光色素で表示されたものであることが好ましい。前記蛍光色素には細胞膜への拡散を通じて染色され、蛍光顕微鏡で確認が可能な全ての種類の蛍光色素を使用することができる。
【0088】
前記形質転換された細胞に対するリンパ球の付着程度は蛍光顕微鏡と光学顕微鏡で形質転換細胞に付着されたリンパ球の数を計数して測定するか又は形質転換細胞とリンパ球を一緒に培養した後、前記細胞を細胞溶解緩衝液で溶解させて収得した溶解液(lysate)内の蛍光の量を定量することにより、測定できる。
【0089】
前記にて顕微鏡を利用して付着されたリンパ球の数を計数する場合には、形質転換し細胞とリンパ球を一緒に培養した後、付着していないリンパ球を洗浄して除去し、無作為に定めた10箇所の顕微鏡で観察して付着したリンパ球の数を計数して平均を求める方法が利用できる。
前記細胞溶解液内の蛍光の量を測定する場合には、形質転換細胞とリンパ球を一緒に培養した後、付着していないリンパ球を洗浄して除去し、細胞溶解緩衝液を加えて収得した細胞溶解液の蛍光の量を蛍光マイクロプレートリーダー(fluorescent microplate reader)で測定する方法を利用できる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記実施例等は本発明を例示するものであり、本発明の内容は実施例により限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【0090】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するものであり、本発明の内容はこれに限定されない。
【0091】
<実施例1>
人間FEX-2cDNAクローニング
<1-1> 発現ベクターの製造
fas-1ドメインを含む新規の細胞付着分子を同定する為に、fas-1ドメインを含む配列をジーンバンク(Genbank)とセレラゲノミックス(Celera genomics)のポリヌクレオチドデータベースで検索した。その結果、特徴が究明されない人間の部分的cDNAクローン(FLJ00112, DZKZp434E0321, CD44-like precursor FELL)が検索された。前記の全長cDNA配列はRT-PCRと5'RACE PCRにより人間脾臓細胞から製造した。
【0092】
まず、前記にてfas-1ドメインを含んでいるものと検索された3種類の人間脾臓の部分的なcDNAクローンを基に2対のプライマー(配列番号67乃至配列番号70)をデザインした(表1)。人間の脾臓から抽出したRNA2μgを鋳型にして前記にてデザインしたそれぞれのプライマー対を利用して逆転写酵素重合酵素連鎖反応(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)を行うことにより、fas-1ドメインを含むタンパク質の部分的なcDNAを2部分に別けて収得した。前記にてPCR反応はPCRシステム(Expand high fidelity PCR system, Roche)を利用して95℃で2分間反応させ、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を30回繰返して行った。その結果、3.6kbと2.0kbの増幅産物をそれぞれ収得した。前記増幅産物の内3.6kb cDNAを制限酵素ClaI及びSacI(TaKaRa)で切断した後、(pBluescript-KS(+)(Stratagene)ベクターの同一の制限酵素の座にT4リガーゼ(ligase, Invitrogen)を用いて挿入することにより、組換えベクター‘pBS-Fex23’を製造した。さらに、前記増幅産物の内、2.0kb cDNAを制限酵素SacI及びHindIII(TaKaRa)で切断した後、pET-29bベクター(Novagen)の同一の制限酵素の座にT4リガーゼ(ligase, Invitrogen)を用いて挿入することにより、組換えベクター‘pET-Fex45’を製造した。その後、前記二つのcDNA塩基配列を合わせる為に、pET-Fex45をEcoRIで切断して収得した断片をクレウナ(klenow)酵素で処理してブラント(blunt)断片を製造し、これをさらにSacIで切断して前記組換えベクターPET-Fex23の同一の制限酵素の座にクローニングして組換えベクター‘pET-Fex2345’を製造した。
【0093】
fas-1ドメインを含むcDNAの5'末端は下記のような方法で製造した。人間の脾臓から収得したRNAを表1に表わしたプライマー(配列番号71)を用いて増幅してcDNAを製造し、前記cDNAを鋳型にして表1に表わしたプライマー(配列番号72及び配列番号73)と5' RACE system(5' RACE system for Rapid Amplification of cDNA Ends version 2.0, Invitrogen)で提供するアダプトプライマーを利用して製造者が指示する方法により、5’RACE PCRを行い、増幅産物を収得した。その後前記増幅産物を塩基配列分析機(Applied Biosystems AB13700)で分析してFEX-25'末端の塩基配列を究明した後、前記5'末端の塩基配列を基に、プライマーを製造した。人間の脾臓から抽出したRNA 2μgを鋳型にして前記の5'塩基配列を基にデザインしたプライマー対(配列番号74及び配列番号75)を利用して逆転写酵素重合酵素連鎖反応(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)を行うことにより、2.5kbの5'末端cDNAを収得した。前記増幅産物を制限酵素EcoRI及びClaI(TaKaRa)で切断してpBluescript-KS(+)ベクター(Stratagene)の同一の制限酵素位置に挿入することにより、組換えベクター‘pBS-Fex1’を製造した。完全な塩基配列を発現ベクターにクローニングする為に、まず、前記にて製造したpET-Fex2345をKpnIとHindIIIで切断してpcDNA3.1(-)/Myc-Hisベクター(Invitrogen)の同一の制限酵素位置に挿入して‘pcDNA-Fex45’を製造した。さらに、再度pET-Fex2345をBamHIとKpnIで切断してpcDNA-Fex45の同一の制限酵素位置に挿入して‘pcDNA-Fex2345’を製造し、最後に前記pBS-Fex1をEcoRIとClaIで切断してpcDNA-Fex2345の同一の制限酵素位置に挿入して完全な塩基配列をクローニングした。
【0094】
前記にて製造されたプラスミドを塩基配列分析機(Applied Biosystems AB13700)で分析し、塩基配列はジーンバンク(GenebankTM accession number AY311388)に登録し、前記にて製造されたFEX-2の完全な塩基配列を含む発現ベクターを‘pcDNA-Fex2’と命名した。
【0095】
前記塩基配列分析結果から推定されるアミノ酸配列はスケビンザー受容体FEEL-2(Scavenger receptor FEEL-2)(Adachi H. et al., J. Biol. Chem. 277:34264-34270, 2002)とヒアルロナン受容体スタビリン-2(encocytic hyaluronan receptor Stabilin-2)(Politz O. et al., Biochem J. 362:155-164, 2002)と殆ど同一なものとして表われ、それらのドメイン構造は7個のfas-1ドメイン、23個のEGF類似ドメイン、1個のX-リンクドメイン及び1個の膜横断ドメインを有していた(図1)。
【0096】
【表1】
【0097】
<1-2> L細胞の形質転換
前記実施例<1-1>の発現ベクターpcDNA-Fex2でマウス繊維芽細胞であるL細胞ATCC CCL-1、東京大学生物物理学科のタケチ博士より提供された)を形質転換した。前記L細胞を10%熱不活性化FBS、ペニシリンG及びストレプトマイシンが添加されたDMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培地で培養した。前記マウスL細胞は代表的な細胞付着物質であるカドヘリンが発現されない細胞株として細胞付着活性の研究に普遍的に使用される細胞である(Nose, A. Cell 54:993-1001, 1988)。
前記L細胞を組換えベクターpcDNA-Fex2に形質転換する為に、リポフェクタミン(Lipofectamine, Invitrogen)を使用し、製造者が指示する方法により形質転換した。形質転換後48時間にG418(400μg/ml)を処理して10乃至12日間培養しながら抵抗性を表わすそれぞれのコロニーを分離した。前記のような方法により、形質転換された細胞をL/FEX-2に命名した。陰性対照群(L/Mock)には、FEX-2遺伝子が含まれないベクトルであるpcDNA3.1(-)/Myc-Hisに形質転換した細胞を使用した。
【0098】
<実施例2>
FEX-2に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の製造
<2-1> 人間FEX-2に対するポリクローナル抗体の製造
人間FEX-2に対するポリクローナル抗体を製造する為に、人間FEX-2の全体アミノ酸配列(配列番号1)の中でアミノ酸554番から655番に該当する塩基配列を含むcDNAとアミノ酸2188番から2551番に該当する塩基配列を含むcDNAをPCR増幅して製造した。前記cDNAは実施例<1-1>のpcDNA-Fex2 DNAを鋳型にして下記のプライマー(配列番号76乃至配列番号79)を利用してPCRを行うことにより収得した(表2)。PCR反応条件は95℃で2分反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返し行った。アミノ酸554番から655番に該当する塩基配列を含む増幅産物は制限酵素SalI及びHindIII(TaKaRa)で切断し、pET-29bベクター(Novagen)の同一の制限酵素位置にそれぞれ挿入し、アミノ酸2188番から2551番に該当する塩基配列を含む増幅産物は制限酵素BamHI及びXhoI(TaKaRa)で切断してpET28aベクター(Novagen)の同一の制限酵素位置に挿入した。
【0099】
【表2】
【0100】
前記にて製造された発現ベクターをそれぞれ‘pET-FEX2-5’と‘pET-FEX2-2’と命名し、前記ベクターで大腸菌BL21 DE3を形質転換体した。形質転換された大腸菌を50mg/mlカナマイシン(kanamycin)を含むLB培地で培養し、組換えタンパク質の発現を誘導する為に、培養液の吸光度が600nmから0.5乃至0.6になった時、1mM IPTG(isopropyl-D(-)-thiogalactopyranoside)を添加して37℃で3時間追加して培養した。以降、発現されたタンパク質を公知の方法により精製した(Kim, J.-E. et al., J. Cell. Biochem., 77:169-187, 2000)。まず、前記形質転換大腸菌の培養液を遠心分離して細胞を収得した後、溶解緩衝液(50mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT)に再懸濁した。前記細胞懸濁液を超音波で粉砕し、封入体(inclusion body)形態で発現されたタンパク質は8M尿酸変性緩衝液で溶解させ、変性タンパク質等をNi-NTA樹脂(resin, Qiagen)を利用して精製した。前記組換えタンパク質は200mMイミダゾール(imidazole)溶液で溶離し、50mM塩化ナトリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液内で高濃度から低濃度の尿酸の順に透析して精製した。前記精製された組換えタンパク質をSDS-PAGEにより確認できた(結果は未図示)。
【0101】
前記にて製造された2種類の組換えタンパク質(200μg/ml)をそれぞれ別の兎に注射して抗体を製造した。つまり、前記組換えタンパク質1mlずつ同一の量の完全フラウント免疫増強剤(complete Freund's adjuvant)と混合して注射し、その次には前記組換えタンパク質を同一の量の不完全フラウント免疫増強剤(incomplete Freund's adjuvant)と混合して2週間に1度ずつ8週間兎に皮下注射し、抗体生成後採血した。採血後室温で2時間程放置した後、4℃で1000×gで30分間遠心分離して抗血清を分離した。前記抗血清をタンパク質Aセファローズ(Protein A Sepharose, Amersham Pharmacia)ビードを使用し、製造者が指示する方法により精製することにより、免疫グロブリン分画を収得した。
【0102】
<2-2> 人間FEX-2に対するモノクローナル抗体の製造
人間FEX-2に対するモノクローナル抗体を製造するには、人間FEX-2の全体アミノ酸配列(配列番号1)の内、アミノ酸1173番から1727番に該当する塩基配列を含むcDNAを製造した。前記cDNAは前記実施例<1-1>のpcDNA-fex2 DNAを鋳型にし、下記のプライマー(配列番号80及び配列番号81)を使用してPCRを行うことにより収得した(表3)。PCRは95℃で2分間反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返し行った。前記増幅された産物を制限酵素BamHI及びXhoI(TaKaRa)で切断し、pET43.1aベクター(Novagen)の同一な制限酵素の座に挿入した。
【0103】
【表3】
【0104】
前記にて製造された発現ベクターを‘pET-4E5’と命名し、タンパク質の発現と分離は<2-1>での方法と同一の方法で行った。モノクローナル抗体の製造はダイノナ社(Dinona Inc., Seoul, Korea)に依頼して製造した。つまり、前記にて製造されたタンパク質20μgを6匹の鼠に2週間隔で免疫接種して陽性のハイブリドーマクローン(clone 5G3)を収得し、これを鼠の腹腔に注入させ、腹水で採集することにより、モノクローナル抗体を得た。前記にて収得したハイブリドーマ5G3はブタペスト条約下の国際寄託機関である韓国生命工学院遺伝資源センター遺伝子銀行(KCTC)に2004年5月21日付で寄託番号KCTC-10639BPで寄託した。
【0105】
前記モノクローナル抗体のアイソタイプ(isotype)はイソストリップマウスモノクローナル抗体イソタイピングキット(IsoStrip mouse monoclonal antibody isotyping kit, Roche)を使用して確認した。その結果、本発明のモノクローナル抗体のアイソタイプはIgGラムダチェーン(lambda chain)だと確認された。
【0106】
<2-3> 人間FEX-2モノクローナル抗体を利用して人間脾臓組織及びL/FEX-2細胞にてFEX-2タンパク質の発現測定
前記実施例<2-2>で製造した人間FEX-2に対するモノクローナル抗体5G3が人間脾臓組織より発現されるFEX-2タンパク質が検出できるか否かをウェスタンブロット分析により測定した。さらに、前記実施例1-2のL/FEX-2細胞で人間FEX-2タンパク質が発現されるか否かをウェスタンブロット分析により測定した。対照群にはL/Mock細胞を使用した。
【0107】
まず、人間脾臓組織0.5mgに細胞溶解緩衝液5mlを添加し、氷の上で組織粉砕機(tissue homogenizer)で粉砕し、氷の上で1時間放置して細胞溶解物を収得した。さらに、L/FEX-2細胞と対照群であるL/Mock細胞をPBSで複数回洗浄した後、細胞溶解緩衝液を添加して溶解させ、前記細胞溶解物を4℃で12,000rpmで10分間遠心分離して溶解性タンパク質が存在する上層液を収得した。以降、タンパク質の濃度を定量分析する為に、BSAを定量基準タンパク質として利用し、ブラッドフォードアッセイ(Bradford assay; BioRad, Hercules, CA)を行った。前記にて製造した脾臓組織、L/FEX-2細胞及びL/Mockから抽出したタンパク質試料30μgを6%SDSを含むポリアクリルアミドゲル状で電気泳動した。ゲル状のタンパク質を電気移動法を利用してニトロセルロース膜に移動し、このタンパク質と5%脱脂粉乳溶液を1時間反応させ、非特異的タンパク質結合を遮断した。以降、抗FEX-2モノクローナル抗体(5G3)をTBS-T(50mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)溶液に希釈して冷蔵状態で16時間以上ニトロセルロース膜と結合反応させた。反応完了後膜をTBS-T溶液で3回洗浄した。以降、再度HRP-結合2次抗体(hrp-結合-抗-マウスIgG;Santa Cruz社、CA州米国)を添加して常温で1時間結合反応させた。膜を再び3回洗浄した後、化学発光溶液のECL 1mlを添加して抗原-抗体反応が起こる部位を蛍光で可視化し、X線フィルムで感光した。
【0108】
実験の結果、人間脾臓細胞の場合、約270kDa及び約200kDa大のバンドが検出され、L/FEX-2においても同一な大きさのバンドが検出された(図2)。前記実験結果から人間FEX-2に対するモノクローナル抗体が実際に脾臓組織及びL/FEX-2細胞のFEX-2と特異的に反応することが確認できた。
【0109】
<実施例3>
L/FEX-2細胞表面でFEX-2発現可否確認
<3-1> FACS分析
前記実施例1-2のL/FEX-2細胞の表面でFEX-2が発現されるか否かを確認する為に、実施例<2-3>で製造したFEX-2に特異的な人間モノクローナル抗体(5G3)を利用してFACS分析を行った。
L/FEX-2細胞が完全に培養された(confluent)プレートに0.25%トリプシン及び0.05%EDTAを含むPBS緩衝液を処理してプレート表面から細胞を取除いた。細胞をPBSバッファで2回洗浄後再びPBSバッファに再懸濁した。細胞懸濁液に抗-FEX-2モノクローナル抗体(5G3)を添加して4℃で1時間培養した。10μg/mlのFITCと結合された2次兎-抗マウスIgG抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)を添加して4℃で1時間細胞をさらに培養させ、5ワット(watt)レザーが装着されたフローサイトメーター(flow cytometer FACS Calibur system, Becton Dickinson, San Jose, CA)を利用して488nmで分析した。対照群には前記抗-FEX-2モノクローナル抗体の代わりにマウス免疫グロブリンを使用した。
実験の結果、L/FEX-2細胞の表面にFEX-2が発現されることが確認できた。反面、L/Mock細胞表面にはFEX-2が発現されないことが確認できた(図3)。
【0110】
<3-2> 表面ビオチン化分析(surface biotinylaion assay)
L/FEX-2細胞表面にFEX-2が発現されるか否かをさらに究明する為、表面ビオチン化分析を行った。前記実施例<1-2>のL/FEX-2細胞を冷たいリン酸緩衝液(pH8.0)で3回洗浄した。次に、前記細胞をリン酸緩衝液で2.5×107細胞/mlの濃度になるように懸濁後、スルホ-NHS-LS-ビオチン(Pierce)1mgを添加して室温で30分間反応させた。対照群にはビオチンを添加しなかった。前記反応物に免疫沈殿緩衝液(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2とタンパク質分解酵素阻害剤混合物(Roche)が含まれている、pH7.4)を加えて溶解後、前記細胞溶解物を4℃で12,000rpmで10分間遠心分離して溶解性タンパク質が存在する上層液を収得した。ビードとの非特異的な反応を減少させる為、前記細胞溶解物をGタンパク質ビード(protein G beads)に入れて4℃で2時間反応後、ビードを除去した。そして、実施例<2-1>のFEX-2ポリクローナル抗体が結合されたGタンパク質セファローズマトリックスと4℃で夜通しで反応後、免疫沈殿した。前記ビードを3回洗浄後20μl試料緩衝液を添加して沸かせ、6%SDSを含むポリアクリルアミドゲル状で電気泳動した。ゲル状のタンパク質を電気泳動法を利用してニトロセルロース膜に移動させた。膜に移動されたタンパク質と5%の脱脂粉乳溶液を1時間反応させ、非特異的タンパク質結合を遮断した。以降、抗FEX-2抗体をTBS-T溶液(50mM Tris-HCl, pH 7.6, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)に希釈して冷蔵状態で16時間以上ニトロセルロース膜と結合反応させた。反応が完了した後、膜をTBST溶液で3回洗浄した。以降、HRP-結合-抗-兎-IgG抗体(Santa Cruz社、CA州、米国)を添加して常温で1時間結合反応させた。膜を再び3回洗浄し、化学発光溶液であるECL1mlを添加して抗原-抗体反応が起った部位を蛍光で可視化し、X線フィルムで感光させた。さらに、前記ニトロセルロース膜を抗-FEX-2抗体と反応させずに、HRP-結合-ストレプタビジンと常温で1時間結合反応をさせ、化学発光溶液であるECL1MLを添加して抗原-抗体反応が起こる部位を蛍光で可視化してX線フィルムで感光させた。
【0111】
実験の結果、ビオチンを処理しない対照群ではFEX-2抗体により免疫沈殿したFEX-2タンパク質がFEX-2抗体により、検出されたものの、ストレプタビジンによっては検出されなかった。反面ビオチンを処理した群では抗FEX-2抗体とストレプタビジンにより、FEX-2タンパク質が全て検出された(図4)。
前記実験結果から細胞表面に存在するFEX-2タンパク質がビオチンを処理することにより、ビオチン化された後、これがFEX-2抗体が結合されたビードにより、免疫沈殿した後抗FEX-2抗体及びストレプタビジンにより、検出され得ることが確認でき、ビオチンを処理しない場合にはFEX-2タンパク質のビオチン化が誘発されず、ストレプタビジンによっては検出されなかったことが分かった。従って、FEX-2タンパク質がL/FEX-2の細胞表面に存在することが確認できた。
【0112】
<実施例4>
免疫組織化学染色法によるFEX-2が発現される組織の同定
FEX-2の発現様相を調査する為、人間の肝臓、脾臓、膵臓、心臓、睾丸、肺、リンパ節、卵巣、皮膚及び副腎等の20余種の組織(慶北大学校病理学室で収得)で実施例<2-1>で製造した人間FEX-2ポリクローナル抗体を使用して免疫組織化学染色を実施した。まず、各組織を3.7%パラホルムアルデヒドに入れ、室温で一晩夜通しで固めて、組織を5μm間隔で切断した。その後キシレンとアルコールにそれぞれ5分程漬け、内在的なペルオキシダーゼの活性を抑制する為、0.5%過酸化水素を10分間処理した。非特異的な反応を遮断する為、各組織の断片を50mM NH4Clに30分間放置した後、遮断溶液(1×PBS, 1%BSA, 0.05%サポニン及び0.2%ゼラチン)を加え、4℃で1時間反応させた。以降、前記人間FEX-2多ポリクローナル抗体と4℃で夜通しで結合反応させた。反応完了後組織を洗浄し、再度HRP-結合2次抗体を添加して反応させた。組織を再び3回洗浄し、化学反応試薬を添加して抗原-抗体反応が起った部分を発色で可視化した。対照群には抗原と前培養した抗体を使用した。
【0113】
実験の結果、FEX-2タンパク質は人間脾臓の静脈洞(venous sinus)で発現されることが観察できた(図5)。さらに、FEX-2タンパク質はリンパ節の上顎洞(maxillary sinus)と肝臓のシヌソイド血管(sinusoid)でも発現されるものとして表われた(結果は未図示)。これよりFEX-2はシヌソイド(sinusoidal)内皮細胞で発現され、血液内の細胞と相互作用をするものと推定することができた。
【0114】
<実施例5>
FEX-2とリンパ球の付着活性調査
FEX-2とリンパ球の付着活性を調査する為、血管からフィコル(Ficoll)(Pharmacia Biotech)勾配遠心分離法を利用して末梢血液リンパ球(peripheral blood lymphocytes)を分離した(Johnson-Leger C.A. et al., Blood, 100, 2479-2486, 2002)。前記実施例<1-2>で調査したL/FEX-2細胞と対照群であるL/Mock細胞をDMEM培地が含まれた12-ウェルプレートで完全に(confluent)培養した後、ここに1×105個のDiI蛍光色素(Molecular Probe)で標識させたリンパ球を添加して37℃で30分間培養した。その後、同一な培地で3回洗浄し、HMMF(high magnification fields, ×400)下で任意に選択した10箇所を光学顕微鏡で観察してL/FEX-2細胞に付着されたリンパ球の数を計数した。
実験の結果、FEX-2を発現するL/FEX-2細胞には対照群のL/Mock細胞に比べて多数のリンパ球が付着されたことを確認した(図6及び図7)。
【0115】
<実施例6>
FEX-2モノクローナル抗体によるFEX-2に対するリンパ球の付着阻害
前記実施例5でL/FEX-2細胞にリンパ球が付着するのをFEX-2によるものであるかを確認する為に、FEX-2に特異的な抗体が前記L/FEX-2細胞にリンパ球が付着されるのを抑制するか否かを調査した。
まず、前記実施例1のL/FEX-2細胞を35mmプレートに培養し、前記実施例<2-2>のFEX-2モノクローナル抗体(5G3)を添加して37℃で30分間前培養した。以降、前培養された細胞にDiI蛍光色素(Molecular Probe)で標識させたリンパ球を添加して37℃で30分間前培養し、L/FEX-2にリンパ球が付着されるか否かを前記実施例5と同一の方法で調査した。対照群(control)として前記FEX-2モノクローナル抗体の代わりに免疫グロブリンGを使用した。
実験の結果、L/FEX-2細胞表面にリンパ球が付着され活性はFEX-2モノクローナル抗体に特異的に阻害されることが確認できた(図8)。
【0116】
<実施例7>
インテグリン受容体の同定
<7-1> 2価陽イオンによるリンパ球とFEX-2の付着活性変化調査
リンパ球の細胞付着を媒介するインテグリン受容体は2価陽イオンを必要とする。前記のような特徴に基づいてリンパ球がFEX-2に付着する活性がMn2+、Mg2+及びCa2+により、影響を受けるか否かを調査した。この為、カルシウムとマグネシウムのないHBSS(Hank's Balanced Salt Solution)にCaCl2、MgCl2及びMnCl2をそれぞれ2mMずつ添加した。前記2価陽イオンが含まれた溶液を前記実施例5のL/FEX-2とリンパ球の培養の際添加して培養し、実施例5と同一の方法でL/FEX-2細胞に付着されたリンパ球の数を計数した。
実験の結果、Mn2+を添加した場合、L/FEX-2に付着するリンパ球の活性が最も大きく促進されることを確認することができ、その後にはMg2+により促進されることを確認することができた。Ca2+によってもリンパ球の付着活性が促進されたものの、対照群と有意的な差を示さなかった(図9)。
【0117】
<7-2> リンパ球とFEX-2付着に関与するインテグリン受容体の同定
リンパ球とFEX-2の付着に関与するインテグリン受容体を同定する為に、インテグリンの機能を特異的に阻害する種々の抗体を利用して細胞付着阻害分析を行った。
多くの種類のインテグリン-特異的モノクローナル抗体(Chemicon, International Inc, Temecula, CA)10μg/mlを1mlの培養溶液から3×105細胞/ml濃度のリンパ球と37℃で30分間それぞれ前培養させた。本実験に使用された抗体は次の通りである:P5D2(β1に対する抗体)、25.3(αLに対する抗体)、Bear 1(αMに対する抗体)、3.9(αXに対する抗体)、この際、対照群には前記インテグリン-特異的モノクローナル抗体の代わりに正常鼠の免疫グロブリンと共に前培養したものを使用した。以降、培養されたL/FEX-2細胞に前記にてそれぞれの抗体と前培養したリンパ球を添加して37℃で30分間追加して培養した。付着された細胞は前記実施例5と同一の方法で定量した。
実験の結果、FEX-2に対するリンパ球の付着はαLインテグリン及びαMインテグリンに対する抗体により、特異的に阻害される反面、αX、β1インテグリンに対する抗体によっては阻害されなかった(図10)。
従って、リンパ球はαLβ2インテグリンとαMβ2インテグリンを通じてFEX-2タンパク質を有する細胞に付着することが確認できた。
【0118】
<実施例8>
FEX-2タンパク質の欠失突然変異組換え体によるFEX-2に対するリンパ球付着阻害
<8-1> FEX-2 4個の小単位によるFEX-2に対するリンパ球付着阻害
FEX-2の細胞外の部分を4個の小単位であるNus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4に区分した(図11)。前記にてNus-U1、Nus-U2及びNus-U3はそれぞれ極めて類似した構造を有している。具体的に前記Nus-U1、Nus-U2及びNus-U3は1個のEGF-類似繰返しドメインと2個のfas-1ドメインを有する。Nus-U4はEGF-類似繰返しドメイン、fas-1ドメイン及びX-リンクドメインをそれぞれ1個ずつ有する。
組換えタンパク質Nus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4を製造する為、FEX-2タンパク質(配列番号1)の66-655、691-1268、1303-1883及び1913-2449アミノ酸をコーディングするそれぞれのcDNA切片等を前記実施例<1-1>のpcDNA-fex2 DNAを鋳型にして下記のプライマー(配列番号82乃至配列番号89)でPCR増幅することにより、収得した(表4)。PCRは95℃で2分間反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返して行った。前記増幅された産物はそれぞれ制限酵素BamHI(TaKaRa)及びXhoI(TaKaRa)で切断し、切断された産物をpET-43.1aベクター(Novage)の同一の制限酵素の座に挿入した。前記にて製造した発現ベクターを‘pET-U1’、‘pET-U2’、‘pET-U3’及び ‘pET-U4’と命名した。前記発現ベクターを実施例<2-1>と同一の方法で大腸菌に形質転換した後、タンパク質の発現を誘導して分離及び精製することにより、組換えタンパク質Nus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4を製造した。
【0119】
【表4】
【0120】
前記組換えタンパク質Nus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4がFEX-2に対するリンパ球の付着を抑制するか否かを調査する為、DiI蛍光色素で標識させたリンパ球に前記組換えタンパク質Nus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4をそれぞれ10μMずつ添加して37℃で30分間前培養した。以降、FEX-2を発現するL/FEX-2細胞に前培養されたリンパ球を添加して37℃で30分間前培養してL/FEX-2にリンパ球が付着されるか否かを前記実施例5と同一の方法で調査した。対照群(control)でNusタンパク質を使用した。
実験の結果、組換えタンパク質Nus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4とリンパ球を前培養した場合、FEX-2に対するリンパ球の付着が大きく阻害されたことを確認できた(図12)。
【0121】
<8-2> 組換えタンパク質Nus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6のFEX-2に対するリンパ球付着阻害
前記実施例<8-1>の小単位体の中でNus-U3をより細分化してNus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6をそれぞれ製造し、前記組換えタンパク質がFEX-2に対するリンパ球の付着を阻害するか否かを調査した。前記Nus-EGF3はFEX-2タンパク質で3番目のEGF-類似繰返しドメインを含むポリペプチドであり、Nus-Fas5及びNus-Fas6はそれぞれ5番目と6番目FEX-1ドメインを含むポリペプチドである(図13)。
前記FEX-2タンパク質の欠失突然変異体であるNus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6をそれぞれ製造する為に、FEX-2タンパク質の1301-1596、1631-1727及び1778-1883アミノ酸をコーディングする cDNAの各切片を前記実施例<1-1>のpcDNA-FEX2を鋳型にして下記のプライマー(配列番号90乃至配列番号95)を使用してPCR増幅することにより、収得した(表5)。PCRは95℃で2分間反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返して行った。前記増幅された産物はそれぞれ制限酵素BamHI(TaKaRa)及びXhoI(TaKaRa)で切断し、切断された産物はpET-43.1aベクター(Novagen)の同一の制限酵素の座に挿入した。前記にて製造されたそれぞれの発現ベクターを‘pET-EGF3’、‘pET-Fas5’及び‘pET-Fas6’と命名した後、それを前記実施例<2-1>と同一の方法で大腸菌に形質転換し、タンパク質の発現を誘導して組替えタンパク質Nus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6をそれぞれ製造した。
【0122】
【表5】
前記組換えタンパク質Nus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6がFEX-2に対するリンパ球の付着を抑制するか否かを調査する為に、DiI蛍光色素で標識させたリンパ球に前記組換えタンパク質Nus-U3、Nus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6をそれぞれ10μM添加して37℃で30分間前培養した。以降、FEX-2を発現するL/FEX-2細胞に前培養されたリンパ球を添加して30分間37℃で培養してL/FEX-2にリンパ球が付着されるか否かを前記実施例5と同一の方法で調査した。対照群(control)としてはNusタンパク質を使用した。
実験の結果、fas-1ドメインを含むNus-Fas5及びNus-Fas6ポリペプチドを添加した場合にはリンパ球の付着が大きく阻害されたことが確認できた。しかしながら、EGF-類似ドメインを含む組換えタンパク質を添加した場合には、リンパ球の付着に影響を及ぼしていないことが確認できた(図14)。
【0123】
<実施例9>
fas-1ドメインを含むポリペプチドの添加濃度によるリンパ球の付着阻害
前記実施例8と同一の方法でリンパ球の付着阻害程度を調査し、前記実施例8で製造したNus-U3、Nus-EGF3及びNus-Fas5の添加濃度を 0.1、1、10μMに変えて実験した。
実験の結果、fas-1ドメインを含む組換えタンパク質の添加濃度が増加する程、リンパ球の付着が抑制されたことが確認できた。反面、EGF-類似ドメインを含む組換えタンパク質は添加濃度が増加する程リンパ球の付着活性が若干増加することが示されたものの、大きく影響を及ぼさないことが確認できた(図15)。
【0124】
<実施例10>
種々のfas-1ドメインを含むポリペプチドのFEX-2に対するリンパ球の付着阻害活性
<10-1> FEX-2タンパク質内のfas-1ドメインのFEX-2に対するリンパ球の付着阻害
FEX-2タンパク質内に含まれた全てのfas-1ドメインがFEX-2に対するリンパ球の付着を阻害する活性があるかを調査した。
前記FEX-2タンパク質内に含まれた全てのfas-1ドメインの組換えタンパク質を製造する為に、pcDNA-Fex2 DNAを鋳型にして下記のプライマーを使用して(配列番号96乃至配列番号105)PCRを行うことにより、FEX-2アミノ酸406番-508番、554-655番、1030番-1130番、1173番-1268番、及び 2356番-1449番をそれぞれコーディングするcDNAの切片を収得した(表6)。PCR反応条件としては、95℃で2分間反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返して行った。7番目fas-1ドメインを除いた前記増幅されたFEX-2タンパク質のfas-1ドメインをそれぞれ制限酵素BamHI(TaKaRa)及びXhoI(TaKaRa)で切断し、pET-43.1aベクター(Novagen)の同一の制限酵素の座に挿入した。前記増幅されたFEX-2タンパク質の7番目のfas-1ドメインは制限酵素BamHI(TaKaRa)及びEcoRI(TaKaRa)で切断し、pET-43.1aベクター(Novagen)の同一の制限酵素の座に挿入した。前記にて製造された発現ベクターをそれぞれ‘pET-Fas1’、‘pET-Fas2’、‘pET-Fas3’、‘pET-Fas4’及び‘pET-Fas7’と命名し、前記実施例<2-1>と同一の方法で大腸菌に形質転換した後、タンパク質の発現を誘導して組換えタンパク質Nus-Fas1、Nus-Fas2、Nus-Fas3、Nus-Fas4及びNus-Fas7をそれぞれ製造した。
【0125】
【表6】
前記にて製造されたNus-Fas1、Nus-Fas2、Nus-Fas3、Nus-Fas4及びNus-Fas7と前記実施例<8-2>で製造されたNus-Fas5及びNus-Fas6がFEX-2に対するリンパ球の付着を阻害するか否かを実施例 8-2と同一の方法で調査した。
実験の結果、FEX-2内に存在する全てのfas-1ドメインを含む組換えタンパク質により、リンパ球の付着が大きく阻害されたことが確認できた(図16)。
【0126】
<10-2> 結核菌タンパク質のfas-1ドメインのFEX-2に対するリンパ球の付着阻害
結核菌のタンパク質であるmpt83とmpt70内のfas-1ドメインがFEX-2に対するリンパ球の付着を抑制するかを調査した。この為に、まず、マイコバクテリウムツベルクロシス(M. Tuberculosis)のRNAを鋳型にして下記のプライマー(配列番号106乃至配列番号109)を使用して(表7)RT-PCRを行うことによりmpt70タンパク質の130番-256番アミノ酸をコーディングするcDNA切片とmpt83タンパク質の123番-218番アミノ酸をコーディングする cDNA切片を収得した。前記にて結核菌からRNAの抽出はトリゾール(Trizol, Invitrogen)を使用して製造者の指示の通り行い、PCR反応は95℃で2分間反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返して行った。前記にて増幅されたmpt70タンパク質及びmpt83タンパク質のfas-1ドメインをそれぞれ制限酵素BamHI(TaKaRa)とXhoIで切断し、pET-28aベクター(Novagen)の同一の制限酵素の座に挿入した。前記にて製造された発現ベクターをそれぞれ‘pET-mpt70’及び‘pET-mpt83’と命名し、前記実施例<2-1>と同一の方法で大腸菌に形質転換した後、タンパク質の発現を誘導して組換えタンパク質Nus-mpt70及びNus-mpt83を分離精製して製造した。
【0127】
【表7】
前記にて製造されたNus-mpt70とNus-mpt83がFEX-2に対するリンパ球の付着を阻害するかを実施例<8-2>と同一の方法で調査した。この際、前記Nus-mpt70とNus-mpt83をそれぞれ0.1,1,10μMの濃度で添加した。
実験の結果、結核菌のタンパク質であるmpt83とmpt70内のfas-1ドメインを含むポリペプチドの場合にもFEX-2に対するリンパ球の付着を抑制することが示された。さらに、前記ポリペプチドの添加濃度が増加するにつれて、リンパ球の付着阻害程度が増加することが確認できた(図17)。
【0128】
<適用例1> 関節炎
関節炎は、自家免疫異常が原因であるものの、病気が進むにつれて関節間の滑液腔に生じた慢性炎症により軟骨が破壊される。関節炎には感染性関節炎、退行性関節炎、リウマチ性関節炎、大腿骨頭無血症潰死、強直性脊椎炎、先天性奇形による関節炎等の多様な種類があるものの、原因を問わず病気が進行する過程で滑液腔に慢性炎症が発生すると知られている。この際、種類により炎症反応が1次的、2次的に生じ、軟骨を破壊して病気の進行に重要な役割をし、この時、白血球が内皮細胞との相互作用を通じて関節内に入ってくるのが重要な病理メカニズムとして作用すると報告されている(Haskard D. O. Curr. Opin. Rheumatol. 7:229-34, 1995)。関節炎の治療は原因により、治療よりは痛症を抑制することと炎症現象を抑制して関節や筋肉等の破壊速度を最大限遅らせ、機能消失を最小化することを優先とする。従って、本発明の薬学的組成物は関節炎の進行防止と治療に極めて効果的である。
【0129】
<適用例2> 糖尿性眼疾患
糖尿性眼疾患は、失明を招き得る糖尿病の主要合併症の一つであり、血糖調節程度とは関係なく、罹病期間が長くなると発生する。最近糖尿病の治療法が向上するにつれて、糖尿病患者の寿命が延長されながら糖尿網膜病症も併行して増加する趨勢にある。従って、糖尿網膜病症は西欧では勿論韓国でも成人失明の最も大きい原因となっている。糖尿性網膜病症を有している患者より細胞付着物質が増加されており、このような付着物質により、白血球増滞症(leukostasis)、非灌流(non-perfusion)、血管漏出(vascular leakage)及び内皮細胞の損傷等を起こすと報告されている(Miyamoto K. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96:10836-41, 1999; Joussen A. M. Am. J. Pathol. 158:147-52, 2001; Barouch F. C. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 41(5):1153-8, 2000)。特に、糖尿性眼疾患において付着性白血球による炎症反応が重要な役割をすると報告されている(Joussen A. M. FASEB J. 18:1450-1452, 2004)。従って、本発明の薬学的組成物が糖尿性眼疾患の予防及び治療に極めて効果的である。
【0130】
<適用例3> 炎症
炎症とは、局所的な損傷に対し、血管のある生きている組織の反応であり、感染、外傷等の多くの要因により発生し得るが、原因と反応組織の差に関係なく殆ど類似した変化を表わす。この変化には血流の増加、血管壁の透過性増加、白血球の浸潤があるが、この全ての変化に細胞付着物が関与すると報告されている(Jackson, J. R. et al., FASEB, J. 11:457-465, 1997)。炎症とは、損傷に対する修復メカニズムであり、悪い反応では無いものの、発生し過ぎるとか、自家免疫の場合のように不適切に起る場合、炎症変化自体により組織の損傷と変形を招くこともあり得る。このような過度であったり不適切な炎症反応を調節する場合に、本発明の炎症反応抑制用組成物が効果的である。
【産業上の利用可能性】
【0131】
以上の通り、本発明における炎症性疾患の予防又は治療方法及び薬学的組成物はFEX-2ポリペプチドとリンパ球との付着を阻害することにより、リンパ球の内皮細胞付着を阻害して炎症性疾患を予防又は治療できる効果がある。さらに、本発明におけるスクリーニング方法によれば、試験製剤がFEX-2ポリペプチドに対するリンパ球の付着活性を阻害するか否かを確認することにより、リンパ球-内皮細胞付着阻害剤又は炎症性疾患の治療剤をスクリーニングできる。
【図面の簡単な説明】
【0132】
【図1】図1は人間FEX-2タンパク質の各ドメインを図示化した模式図である。
【図2】図2は人間FEX-2モノクローナル抗体を利用して人間脾臓組織、L/FEX-2細胞及びL/Mock細胞よりFEX-2タンパク質の発現をウェスタンブロット分析法で測定した結果である。
【図3】図3は人間FEX-2モノクローナル抗体を利用してL/Mock細胞とL/FEX-2細胞の表面でFEX-2タンパク質の発現をFACS(Fluoresence Activated Cell Sorter)で分析した結果である。
【図4】図4はL/FEX-2細胞表面におけるFEX-2タンパク質の発現を表面バイオチン化分析法で測定した結果である(−:添加せず、+:添加する)。
【図5】図5は人間の脾臓組織から人間FEX-2ポリクローナル抗体を利用して免疫組織染色を行った結果である(a:対照群、b:実験群)。
【図6】図6はL/Mock細胞とL/FEX-2細胞においてリンパ球の付着程度を顕微鏡で観察した写真である(a:L/Mock細胞、b:L/FEX-2細胞、矢印:リンパ球)。
【図7】図7はL/Mock細胞とL/FEX-2細胞においてリンパ球の付着程度を表わしたグラフである。
【図8】図8は人間FEX-2モノクローナル抗体がL/FEX-2細胞に対するリンパ球の付着活性を阻害する程度を表わしたグラフである。
【図9】図9は多くの種類の2価陽イオンがL/FEX-2細胞に対するリンパ球の付着活性に及ぼす影響を表わしたグラフである。
【図10】図10は多くの種類のインテグリンに対する機能阻害抗体等がL/FEX-2細胞に対するリンパ球の付着活性を阻害する程度を表わしたグラフである。 β1 :抗-β1抗体処理、αLβ2:抗-αL抗体処理 αMβ2:抗-αM抗体処理、αXβ2:抗-αX抗体処理
【図11】図11は人間FEX-2タンパク質を4個の小単位体に区分した模式図を表わしたものである。
【図12】図12は人間FEX-2タンパク質を4個の小単位体のFEX-2に対するリンパ球の付着阻害程度を表わしたグラフである。 Nus-U1:FEX-2タンパク質の一番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの Nus-U2:FEX-2タンパク質の二番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの Nus-U3:FEX-2タンパク質の三番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの Nus-U4:FEX-2タンパク質の四番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの
【図13】図13は人間FEX-2タンパク質の小単位体の内、三番目部分(Nus-U3)をさらに三つの部分に区分した模式図である。
【図14】図14は人間FEX-2タンパク質のNus-U3を三つの部分に分けて製造したポリペプチドのFEX-2に対するリンパ球の付着阻害程度を表わしたグラフである。 Nus-U3:FEX-2タンパク質の三番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの Nus-EGF3:FEX-2タンパク質の三番目のEGF-類似繰返しドメインがNusタンパク質の後に付いているもの Nus-Fas5:FEX-2タンパク質の五番目のfas-1ドメインがNusタンパク質の後に付いているもの Nus-Fas6:FEX-2タンパク質の六番目のfas-1ドメインがNusタンパク質の後に付いているもの
【図15】図15は人間FEX-2タンパク質のNus-U3を三つの部分に分けて製造したポリペプチドの処理濃度によりFEX-2に対するリンパ球の付着程度を表わしたグラフである。 Nus-Unit:FEX-2タンパク質の三番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの Nus-EGF:FEX-2タンパク質の三番目のEGF-類似繰返しドメインがNusタンパク質の後に付いているもの Nus-Fas:FEX-2タンパク質の五番目のfas-1ドメインがNusタンパク質の後に付いているもの
【図16】図16はFEX-2タンパク質内の7個のfas-1ドメインを含むポリペプチドによるFEX-2に対するリンパ球の付着阻害程度を表わしたグラフである。
【図17】図17は結核菌タンパク質であるmpt70とmpt83内のfas-1ドメインを含むポリペプチドによるFEX-2に対するリンパ球の付着程度を表わしたグラフである。
【技術分野】
【0001】
本出願は2004年10月21日付で出願された大韓民国特許出願番号第10-2004-81498号にもとづく優先権を主張するものである。
【0002】
本発明は炎症性疾患の予防又は治療方法及び薬学的組成物に関する。より具体的に本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤をそれを必要とする個体(subject)に投与することを含む、リンパ球-内皮細胞付着を抑制する方法又は炎症性疾患の治療方法、前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤を含む薬学的組成物、前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤の用途及びFEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤を選別することを特徴とするリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤又は炎症性疾患の治療用薬剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0003】
炎症は白血球が病原体の侵入から組織を保護し、組織損傷により生ずる組織破片を除去する為の一連の反応である。前記白血球はリンパ球、単球及び顆粒球(好中球、好酸球及び好塩球)に分類される。
【0004】
一方、炎症反応(inflammation reaction)が起こる為の重要な過程の内、一つは循環系から炎症進行部位又は傷部位に白血球が移動することである。前記白血球の移動は毛細管後細静脈(postcapillary venule)で白血球が内皮細胞と相互作用をする多段階の過程を経て起こる。つまり、白血球は一連の捕獲(sequential capture)、ローリング(rolling)及び付着(firm adhesion)段階に次いで隣接した内皮細胞の間を通過する過程(transmigration)を経て血管外の部位に移動するようになる(Muller, W. A. et al., Lab. Invest. 82:521-533, 2002)。前記のような過程を経て白血球は内皮細胞に付着した後、細胞表面を移動して細胞内接合部(intracellular junction)を通じて炎症進行部位又は傷部位に移動できるようになる(Harlan J. M., Blood, 65:513-525, 1985)。
【0005】
一方、前記のような炎症反応が不適切に調節される場合には、多くの種類の炎症性疾患が誘発される。主要炎症性疾患としては感染性鼻炎、アレルギー性鼻炎、慢性鼻炎、急性副鼻腔炎等のような鼻炎及び副鼻腔炎;急性化膿性中耳炎及び慢性化膿性中耳炎等のような中耳炎;細菌性肺炎、気管支肺炎、大葉性肺炎、レジオレラ肺炎及びウイルス性肺炎等のような肺炎;急性又は慢性慢性胃炎、感染性小腸結腸炎、クローン氏病(Crohn's disease)、特発性潰瘍性大腸炎、胃膜性大腸炎等のような腸炎;化膿性関節炎、結核性関節炎、退行性関節炎及びリウマチ関節炎等のような関節炎;及び糖尿性眼疾患等がある。
【0006】
細胞付着分子(cell adhesion molecule, CAM)は炎症反応において、白血球の血管内皮細胞付着を媒介すると知られている。一方、前記細胞付着分子は白血球の血管内皮細胞付着を媒介する作用の他にも特定組織の構造の保持するか又は機能するようにせしめるにおいて、必須的であり、人体の構造を恒常性(homeostasis)を維持するのに重要な役割をする(Edelman, G.M., Annu. Rev Cell Bio., 2:81-116, 1986; Gumbiner, B.M., Cell, 84:345-357, 1996)。
【0007】
今まで、知られた細胞付着分子としてはカドヘリン(cadherin)、インテグリン(integrin)、セレクチン(selectin)及び免疫グロブリン細胞付着分子(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecule, IgCAM)等がある(Humphries, M.J. et al., Trends Cell Biol., 8:78-83, 1998)。この中でセレクチンは血小板又は内皮細胞に対する白血球の付着を開始するカルシウムイオン依存性細胞膜結合レクチンファミリとして知られており(Lasky, Science 258: 964-969, 1992)、白血球より発現されるL-セレクチン、シトキン活性内皮細胞で発現されるE-セレクチン及びトロンビン活性血小板及び内皮細胞で発現されるP-セレクチンの3種類に区分される。最近は前記セレクチンのように内皮細胞付着を媒介して炎症を誘発する細胞付着分子の活性を阻害する物質を開発し、抗炎症剤として使用しようとする研究が活発に進められている。
【0008】
大韓民国特許公開公報第2004-0039440号にはセレクチン媒介炎症抑制剤が開示されており、大韓民国特許第371784号には炎症性疾患の治療のためのL-セレクチンと特異的に反応する人間化された抗体が開示されている。
【0009】
一方、fas-1ドメインは哺乳類、昆虫、ウニ、植物、酵母及び細菌を含む多くの種の分泌タンパク質又は膜タンパク質から見出される極めて保存的な配列である(Kawamoto T. et al., Biochim. Biophys, Acta, 288-292, 1998)。fas-1ドメインは約110乃至140個のアミノ酸で構成され、特に、相同性が高い約10個のアミノ酸で構成された極めて保存的な二つの部分(H1及びH2)を含んでいる(Kawamoto, T. et al., Biochim. Biophys. Acta., 288292, 1998)。fas-1ドメインを含むタンパク質にはβig-h3、ペリオスチン(periostin)、ファスシクリンI(fasciclin I)、ウニHLC-2(sea urchin HLC-2)、アルガル-CAM(algal-CAM)、アルガル-CAM(algal-CAM)及びマイコバクテリウムMPB70(mycobacterium MPB70)等がある(Huber, O. et al., EMBO J., 4212-4222, 1994; Matsumoto, S. et al., J. Immunol., 281-287, 1995; Takeshita, S. et al., Biochem. J., 271-278, 1993; Wang, W. C. et al., J. Biol. Chem., 1448-1455, 1993)。前記タンパク質の内βig-h3、ペリオスチン(periostin)、ファスシクリンI(fasciclin I)は4個のfas-1ドメインを有し、HLC-2は2個、さらにMPB70は唯1個のfas-1ドメインを有している。fas-1ドメインを含むタンパク質等の生物学的機能が正確に究明されたのではないものの、幾つかのタンパク質等が細胞付着分子(cell adhesion molecule)として作用することが報告されている。その中でβig-h3は繊維芽細胞と上皮細胞に、ペリオスチンは骨芽細胞に、さらに、ファスシクリンIは神経細胞の付着を媒介するものと報告されている(LeBaron, R. G. et al., J. Invest. Dermatol., 844-849, 1995; Horinchi, K. et al., J. Bone Miner. Res., 1239-1249, 1999; Wang, W. C. et al., J. Biol. Chem., 1448-1455, 1993)。さらに、アルガル-CAMは鳥類ボルボックス(volvox)の胚(embryos)に存在する細胞付着分子であることが究明されている(Huber, O. et al., EMBO J., 4212-4222, 1994)。
【0010】
上述した通り、fas-1ドメインを含む幾つかのタンパク質等が細胞付着分子として作用するとの事実が究明はされたものの、fas-1ドメインを含む全ての種類のタンパク質が細胞付着活性を呈するものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
ここに、本発明者らは新たな炎症関連治療剤の研究を重ねていく中で、内皮細胞に存在するFEX-2ポリペプチドがリンパ球の付着を媒介する新たな細胞付着分子だという事実を見出し、それを基に前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤がリンパ球の内皮細胞付着を阻害し、炎症関連疾患の治療剤として使用できることを確認することにより本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【0012】
従って、本発明の目的はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤を、それを必要とする個体(subject)に投与することを含むリンパ球-内皮細胞付着を抑制する方法を提供する。
【0013】
さらに、本発明の他の目的はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤を、それを必要とする個体(subject)に投与することを含む炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0014】
さらに、本発明のさらに他の目的はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含むリンパ球-内皮細胞付着抑制用薬学的組成物を提供することである。
【0015】
さらに、本発明の他の目的はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む炎症性疾患の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することである。
【0016】
さらに、本発明の他の目的はリンパ球-内皮細胞付着抑制用薬剤の製造の為の前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途を提供することである。
【0017】
さらに、本発明の他の目的は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造のための、前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤の用途を提供することである。
【0018】
さらに、本発明の他の目的は試験製剤がFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着を抑制するか否かを確認することを特徴とするリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法を提供することである。
【0019】
さらに、本発明の他の目的は試験製剤がFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着を抑制するか否かを測定することを特徴とする炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法を提供することである。
【0020】
前記のような本発明の目的を達成する為に、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤をそれを必要とする個体(subject)に投与することを含むリンパ球-内皮細胞付着を抑制する方法を提供する。
さらに、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤をそれを必要とする個体(subject)に投与することを含む炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0021】
さらに、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含むリンパ球-内皮細胞付着抑制用薬学的組成物を提供する。
【0022】
さらに、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【0023】
さらに、本発明はリンパ球-内皮細胞付着抑制用薬剤の製造の為のFEX-2ポリペプチドとリンパ球付着阻害剤の用途を提供する。
【0024】
さらに、本発明は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造のための、FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途を提供する。
【0025】
さらに、本発明は試験製剤がFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着を抑制するか否かを確認することを特徴とするリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【0026】
さらに、本発明は試験製剤がFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着を抑制するか否かを測定することを特徴とする炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【0027】
以下、本発明を詳細に説明する。
他の定義が無い限り、本明細書に使用される全ての技術的及び科学的用語は当業者らにより、一般的に理解されるものと同一の意味を有する。次の参考文献は本発明の明細書に使用された多くの用語らの一般的な定義を有する技術(skill)の一つを提供する。Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY (2d ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); 及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY. さらに、次の定義は本発明の実施の為、読者の便宜の為に提供する。
【0028】
本発明で‘ポリペプチド(polypeptide)’は‘ポリペプチド等(polypeptides)又はタンパク質(等)'と互換性のあるように使用され、例えば、自然状態のタンパク質で一般的に見出される通りアミノ酸残基の重合体をいう。
【0029】
本発明でFEX-2ポリペプチドは哺乳動物から由来したものでもあり得、好ましくは人間、ラット及びマウスからなるグループの中で選ばれるいずれか一つから由来したものでもあり得る。より好ましくは、配列番号1で表示される人間FEX-2ポリペプチド又は配列番号9で表示されるマウスFEX-2ポリペプチドでもあり得る。最も好ましくは、配列番号1で表示される人間FEX-2ポリペプチドでもあり得る。
【0030】
前記FEX-2ポリペプチドは本発明者らにより、公知のポリヌクレオチドデータベースでクローニングされた遺伝子であり、実験を通じて血管内皮細胞に存在しながらリンパ球が血管内皮細胞に付着するのを媒介する機能を行うことが確認できた。
【0031】
つまり、本発明者らはfas-1ドメインを含むタンパク質らが細胞付着分子で発現される事実を基に、fas-1ドメインを含む部分的な人間cDNAを公知のヌクレオチドデータベースで検索し、この中で未だにその特性が明らかにされていない三つのcDNAを選抜した。前記cDNAを基にしてプライマーをデザインした後、人間の脾臓から抽出した総RNAを鋳型にして、前記にてデザインされたプライマーでRT-PCR及び5'RACE PCRを行うことによりfas-1ドメインを含む人間遺伝子を新たにクローニングした(実施例1参照)。
【0032】
前記本発明者らが合成した遺伝子は7個のデザイン、23個のEGF-類似ドメイン、1個のX-リンクドメイン及び1個の膜横断ドメインを有していた(図1参照)。前記のようなドメイン構造を基にし、前記遺伝子をFEX-2に命名して前記遺伝子配列をジーンバンクに登録した(YA311388)。人間FEX-2のアミノ酸配列は配列番号1に示した通りである。
【0033】
本発明者らは本発明で製造した組換えFEX-2タンパク質が細胞付着分子として作用するか否かを確認する為に、先ず、FEX-2が細胞表面で発現されるか否かを調査した。
【0034】
この為、本発明者らは人間FEX-2遺伝子を含む組換えベクトルを製造してマウス繊維芽細胞のL細胞に形質転換した後、それをL/FEX-2と命名した(実施例1参照)。その後人間FEX-2に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体をそれぞれ製造し、前記抗体が人間脾臓組織及びL/FEX-2細胞でFEX-2の発現を検出できるか否かを免疫ブロット法で調査した(実施例2参照)。その結果、本発明のFEX-2抗体が人間脾臓組織及びL/FEX-2細胞で発現されるFEX-2タンパク質を特異的に検出できることを確認した(図2参照)。
【0035】
ここに、本発明者らは前記FEX-2に特異的な抗体を利用してL/FEX-2細胞の表面にFEX-2が発現されるか否かをFACS分析法とバイオチン化法で調査した(実施例3参照)。その結果、L/FEX-2細胞表面にFEX-2が発現することが確認できた(図3及び図4参照)。
【0036】
さらに、本発明者らはFEX-2がどの組織で発現されるかを調査する為に、多くの人間組織でFEX-2の発現可否を人間FEX-2ポリクローナル抗体を利用した免疫組織化学染色法で調査した(実施例3参照)。その結果、FEX-2が人間脾臓のシヌソイド(sinusoidal)血管内皮細胞で発現されることを確認した(図5参照)。さらに、肝臓とリンパ質のシヌソイド(sinusoidal)血管内皮細胞でもFEX-2が発現されることを確認した(結果は未図示)。
【0037】
これより、FEX-2が、血管内皮細胞で発現され、血液内に存在する細胞と相互作用ができると推定した。そして、本発明者らはFEX-2タンパク質が発現されるように、形質転換されたL/FEX-2細胞にリンパ球が付着する活性があるか否かを調査した(実施例5参照)。その結果、対照群細胞に比べてL/FEX-2細胞の表面に多数のリンパ球が付着することを確認することができた(図6及び図7参照)。
【0038】
さらに、本発明者らはL/FEX-2細胞にリンパ球が付着するのがFEX-2タンパク質によるものか否かを確認する為に、抗-FEX-2抗体の存在下で前記L/FEX-2細胞にリンパ球が付着するか否かを調査した(実施例6参照)。その結果、L/FEX-2細胞にリンパ球の付着が抗-FEX-2抗体により、特異的に阻害されたことが確認できた(図8参照)。
【0039】
従って、本発明者らは前記実験結果から、FEX-2がリンパ球の付着を媒介する細胞付着分子として機能するという新たな事実が確認できた。
【0040】
さらには、本発明者らは細胞付着分子としてのFEX-2の特性をより具体的に調査する為に、前記FEX-2に対する細胞表面受容体を同定した。
【0041】
この為、本発明の一実施例ではFEX-2に対するリンパ球の付着において、マンガン、マグネシウム及びイオンが及ぼす影響を調査した(実施例7参照)。その結果、リンパ球のFEX-2に対する細胞付着はマンガンイオンにより、最も高く促進されたことを確認することができ、その次にはマグネシウムイオンにより促進されたことを確認することができた(図9参照)。これよりFEX-2に対する細胞表面受容体はリガンドとの作用において、前記の2価陽イオンを必要とすることが分かり、これは、細胞付着活性においてリガンドに結合するインテグリン受容体の特徴と一致した。
【0042】
そこで、本発明者らはFEX-2に対するリンパ球の付着を媒介するインテグリン受容体を同定した(実施例7参照)。その結果、αLβ2インテグリン及びαMβ2インテグリンがFEX-2と相互作用してリンパ球の付着に関与したことが確認できた(図10参照)。
【0043】
前記実験結果から、本発明者らはFEX-2が血管内皮細胞に存在し、リンパ球の-αLβ2インテグリン又はαMβ2インテグリンの相互作用を通じて前記FEX-2がリンパ球の血管内皮細胞への付着を媒介する活性があることを初めて明らかにすることができた。
【0044】
さらには、本発明者らは前記FEX-2のどの部分がリンパ球の付着と直接的な関連があるかをより具体的に調査し、リンパ球の付着と関連したFEX-2の一部分を含むポリペプチドがFEX-2に対するリンパ球の付着を抑制する阻害剤として使用できるかを調査した。
【0045】
この為、本発明の一実施例で前記FEX-2タンパク質を4個の小単位体に分け、それぞれの組換えタンパク質を製造し(図11参照)、前記小単位体とリンパ球を前培養した後FEX-2を発現するL/FEX-2細胞にリンパ球を添加して培養し、FEX-2に対するリンパ球の付着程度を調査した(実施例<8-1>参照)。その結果、前記小単位体とリンパ球を前培養した後L/FEX-2細胞にリンパ球を添加した場合に、全てのFEX-2に対するリンパ球の付着が大きく阻害されたことが確認できた(図12参照)。
【0046】
さらに、本発明者らは前記FEX-2タンパク質の小単位体中、3番目に属するNus-U3をさらに3部分に区分してFEX-2の3番目のEGF-類似繰返しドメインを含むポリペプチド(Nus-EGF3)とFEX-2のそれぞれ5番目及び6番目のfas-1ドメインを含むポリペプチド(Nus-Fas5, Nus-Fas6)をそれぞれ製造し(図13参照)、前記ポリペプチドとリンパ球を前培養した後、L/FEX-2細胞にリンパ球を添加してFEX-2に対するリンパ球の付着程度を調査した(実施例8参照)。その結果、fas-1ドメインを含むNus-Fas5及びNus-Fas6ポリペプチドとリンパ球を前培養した場合には、L/FEX-2細胞に対するリンパ球の付着が抑制されたものの、EGF-類似繰返しドメインを含む、ポリペプチドの場合にはリンパ球の付着を阻害する活性が表われなかった(図14参照)。
【0047】
さらに、本発明の一実施例では前記fas-1ドメインを含むポリペプチドを濃度別に処理してリンパ球を前培養した後L/FEX-2細胞にリンパ球を添加してFEX-2タンパク質に対するリンパ球の付着程度を調査した結果(実施例9参照)、前記ポリペプチドの処理濃度が増加する程FEX-2に対するリンパ球の付着阻害程度が増加した(図15参照)。
【0048】
これにより、本発明者らは前記実験結果からリンパ球をfas-1ドメインを含むポリペプチドと前培養した場合に前記fas-1ドメイン部分がリンパ球に付着してL/FEX-2細胞により発現されるFEX-2タンパク質と競争的に作用することが分かった。従って、FEX-2タンパク質のfas-1ドメイン部分にリンパ球が付着し、前記fas-1ドメインを含むポリペプチドはFEX-2タンパク質に対するリンパ球の付着を阻害する阻害剤として使用できることが確認できた。
【0049】
さらには、本発明者らは人間FEX-2タンパク質内に含まれた個のfas-1ドメインを含むポリペプチド及び前記人間FEX-2タンパク質以外に他の種類のタンパク質である結核菌タンパク質mpt83とmpt70のfas-1ドメインを含むポリペプチドがFEX-2タンパク質に対するリンパ球の付着を阻害することができるか否かを調査した(実施例10参照)。その結果、FEX-2タンパク質に含まれた7個のfas-1ドメインを含むポリペプチドが全てFEX-2に対するリンパ球の付着を阻害する活性を有していることが確認できた(図16)。さらに、結核菌のタンパク質であるmpt83とmpt70内のfas-1ドメインを含むポリペプチドもまた、FEX-2に対するリンパ球の付着を阻害する活性を有し、前記リンパ球付着阻害活性はポリペプチドの処理濃度に依存的なものとして表われた(図17参照)。
【0050】
上述した通り、本発明ではリンパ球のαLβ2インテグリン又はαMβ2インテグリンの相互作用を通じてFEX-2が血管内皮細胞とリンパ球の付着を媒介する活性のあることが初めて明らかにされた。さらに、本発明ではリンパ球の内皮細胞付着がFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤により抑制されることが確認できた。
【0051】
従って、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤を、それを必要とする個体に投与することを含む、リンパ球の内皮細胞付着を抑制する方法を提供する。前記リンパ球の内皮細胞付着はfas-1ドメインを含む細胞付着分子により、媒介されることを特徴とし、好ましくはFEX-2ポリペプチドにより媒介される。
一方、炎症反応はリンパ球が血管内皮細胞に付着した後、炎症部位に移動することにより起こり、血管内皮細胞に存在する細胞付着分子に対するリンパ球の付着活性を阻害すれば、リンパ球の炎症部位への移動を阻害して炎症反応を阻害できるようになる(Ulbrich, H. et al., Trends Pharmacol. Sci. 24:640-647, 2003; Harlan, J. M. et al., Crit. Care Med. 30(5 Suppl):S214-219, 2002; van Assche, G. et al., Inflamm. Bowel Dis. 8:291-300, 2002)。そこで、血管内皮細胞に存在する細胞付着分子であるFEX-2に対するリンパ球の付着活性の阻害は炎症部位へのリンパ球の移動を阻害して炎症反応を抑制できるようになる。
従って、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤をそれを必要とする固体に投与することを含む炎症性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0052】
本発明で‘固体(subject)'とは、動物、好ましくは哺乳動物の場合もあって動物から由来した細胞、組織、器官の場合もあり得る。
本発明で‘FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤'はFEX-2ポリペプチドに結合してリンパ球の付着を抑制するか又はリンパ球に結合して前記リンパ球がFEX-2に結合することを抑制する活性を有する化合物又は前記FEX-2タンパク質をコーディングする遺伝子の発現を抑制できる活性がある化合物をいう。
前記にてFEX-2タンパク質とリンパ球の付着を阻害する活性を有したものには、例えば、これに限定はされないものの、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド模造物、化合物及び生物製剤でもあり得る。
好ましくは、FEX-2に結合してFEX-2に対するリンパ球の結合を抑制する化合物には、抗-FEX-2抗体が含まれる。さらに、リンパ球に結合してリンパ球のFEX-2に対する結合を抑制する化合物には、fas-1ドメインを含むポリペプチドを含み得る。
【0053】
本発明でfas-1ドメインを含むポリペプチドは哺乳動物から由来したものでもあり得、好ましくは人間、ラット及びマウスからなるグループの中で選ばれるいずれかの一つから由来したものでもあり得る。本発明のfas-1ドメインを含むポリペプチドは従来fas-1ドメインを含んでいるものと知られた全ての種類のタンパク質から由来したfas-1ドメインが全て使用できる。従って、本発明のfas-1ドメインは当業界に公知のタンパク質配列検索データベース、例えば、(NCBI Entrez(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/), EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/) 又はSMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)を通じて検索されるfas-1ドメインが全て使用できる。
【0054】
本発明では、好ましくはFEX-2、mpt70、mpt83、βig-h3、ペリオスチン及びFEX-1からなるグループの中で選ばれたタンパク質から由来したfas-1ドメインを含むポリペプチドが使用できる。より好ましくは配列番号1乃至配列番号12で表示される人間FEX-2のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号13及び配列番号14で表示される結核菌タンパク質mpt70及びmpt83から由来したfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号15乃至配列番号21で表示されるマウスFEX-2のfas-1ドメインを含むポリペプチド及び配列番号22乃至配列番号25で表示されるラットFEX-2のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号配26乃至配列番号29で表示される人間βig-h3のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号30乃至配列番号33で表示されるβig-h3のfas-1ドメイン含むポリペプチド、配列番号34又は配列番号35で表示されるラットβig-h3のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号配36乃至配列番号39で表示される人間ペリオスチンのfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号40乃至配列番号43で表示されるマウスペリオスチンのfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号44乃至配列番号47で表示されるラットペリオスチンのfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号48乃至配列番号54で表示される人間FEX-2のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号55又は配列番号60で表示されるマウスFEX-1のfas-1ドメインを含むポリペプチド、配列番号61乃至配列番号66で表示されるラットFEX-1のfas-1ドメインを含むポリペプチドが使用できる。最も好ましくは配列番号1乃至配列番号12で表示される人間FEX-2のfas-1ドメインを含むポリペプチド又は配列番号13及び配列番号14で表示されるmpt83及びmpt70のfas-1ドメインを含むポリペプチドを使用することができる。
【0055】
さらに、本発明にはfas-1ドメイン含有タンパク質から由来したfas-1ドメイン1個又は2個以上の組合せが使用できる。
【0056】
さらに、本発明のfas-1ドメインを含むポリペプチドの範囲ではfas-1ドメインの機能的同等物及びこれらの塩が含まれる。前記にて‘機能的同等物’とは、本発明に伴うfas-1ドメインと実質的に同等な生理活性を表わすポリペプチドをいう。つまり、本発明のポリペプチドと実質的に同等な生理活性を表わす限りアミノ酸配列のみならず、構造学的に同一又は類似したポリペプチドも本発明の範囲に含まれる。前記にて‘実質的に同等な生理活性’とは、リンパ球が細胞付着分子であるFEX-2に付着することを阻害する活性をいう。より具体的には、リンパ球のインテグリンαLβ2又はαMβ2と相互作用して前記リンパ球がFEX-2に付着することを阻害する活性をいう。
【0057】
さらに、本発明の機能的同等物の範囲には本発明におけるポリペプチドの基本骨格及びこれの生理活性を維持しながらポリペプチドの化学構造が変形されたポリペプチド誘導体が含まれる。例えば、ポリペプチドの安定性、貯蔵性、揮発性又は溶解度等を変更させる為に、構造が変更されたポリペプチドが含まれる。
【0058】
本発明のfas-1ドメインを含むポリペプチドは当業界に公知の化学的合成(Creightion, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)により、容易に製造できる。代表的な方法としてはこれに限定されるのではないものの、液体又は固体状合成法、断片凝縮法、F-MOCはT-BOC化学法等がある(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989)。
【0059】
さらに、本発明のfas-1ドメインを含むポリペプチドは遺伝工学的方法により、製作され得る。つまり、通常的な方法により前記ポリペプチドをコーディングするDNA 配列を製造する。DNA配列は適切なプライマーを使用してPCR増幅することにより、製造できる。他の方法として当業界に公知の標準方法により、例えば、自動DNA合成機(Biosearch又はApplied Biosystems社で販売するもの)を使用してDNA配列を合成することもできる。製造されたDNA配列はこのDNA配列に作動可能に連結され(operatively linked)そのDNA配列の発現を調節する一つ又はそれ以上の発現調節配列(expression control sequence)(例:プロモータ、エンハンサ等)を含むベクターに挿入させ、これより形成された組換え発現ベクターで宿主細胞を形質転換体させる。生成された形質転換体を前記DNA配列が発現されるようにするために適切な培地及び条件下で培養し、培養物から前記DNA配列によりコーディングされた実質的に純粋なポリペプチドを回収する。前記回収は当業界に公知の方法(例えば、クロマトグラフィー)を利用して行うことができる。前記にて‘実質的に純粋なポリペプチド’とは、本発明に伴うポリペプチドが宿主細胞から由来した、いかなる他のタンパク質も実質的に含まないことを意味する。本発明のポリペプチド合成の為の遺伝工学的方法は下記の文献を参考にできる:(Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990)。
【0060】
本発明で抗-FEX-2抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でもあり得る。本発明の抗体はFEX-2タンパク質を抗原として免疫学分野で広く知られている通常の方法で製造できる。
ポリクローナル抗体は馬、牛、山羊、羊、犬、鶏、七面鳥、兎、マウス又はラットのような種々の恒温動物から当該分野の通常的な技術の中の一つを利用できる。つまり、抗原を腹膜内、筋肉内、眼内又は皮下注射を通じて動物を免疫させる。前記抗原に対する免疫性は補助剤、例えば、フラウント(Freund)の完全補助剤又は不完全補助剤を使用して増加させ得る。ブースター(booster)免疫処理に従った後血清の小型サンプルを収集し、目的とする抗原に対する反応性をテストする。動物の力価が一旦抗原に対する反応性の観点から停滞状態に到達すれば、多量のポリクローナル免疫血清を1週間毎の出血又は動物を放血させることにより収得することができる。
【0061】
モノクローナル抗体も公知の技術を利用して生成することができる(Kennettm McKearn, and Bechtol(eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, 1980)。モノクローナル抗体はFEX-2タンパク質を免疫原として動物を免疫化し、免疫化した動物の脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成し、FEX-2タンパク質を選択的に認識するハイブリドーマを選別し、選別したハイブリドーマを培養して、ハイブリドーマの培養液から抗体を分離することにより製造できる。さらに、本発明のモノクローナル抗体はFEX-2タンパク質を選択的に認識する抗-FEX-2抗体を生産する前記のハイブリドーマを動物に注入し、注入後一定期間経過後回収した動物の腹水から分離することにより製造できる。
【0062】
本発明の一実施例で製造した人間FEX-2モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ5G3は、ブタペスト条約下の国際寄託機関である韓国生命工学院遺伝資源センター遺伝子銀行(KCTC)(大韓民国大田市儒城区魚隠洞52番地韓国生命工学研究院)に2004年5月21日付で寄託番号KCTC-10639BPで寄託した。前記寄託物は登録特許(issued patent)の全期間中、韓国生命工学院遺伝資源センータ遺伝子銀行で生きている状態で維持でき、寄託物管理法の規定により無制限に非商業的用途に全ての人(any person or entity)が入手できる。
【0063】
さらに、前記FEX-2タンパク質をコーディングする遺伝子の発現を抑制できる活性を有した物質には前記遺伝子の転写を抑制するか又はタンパク質への翻訳を抑制できる物質をいう。前記にて遺伝子発現抑制は遺伝子発現を完全に停止させることばかりでなく、発現が減少されるようにすることも含まれる。
【0064】
上述した通りの遺伝子の発現を抑制する活性を有した物質には、特定の内在性遺伝子の発現を抑制できるアンチセンス分子が最も代表的である。アンチセンス分子が標的遺伝子の発現を抑制する作用には三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼにより局部的な開状ループ構造が作られた部位でハイブリッド形成による転写抑制、合成が進行しているRNAでハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でハイブリッド形成によるスプライシン抑制、スプライソゾム形成部位でハイブリッド形成によるスプライシン抑制、Mrnaとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、翻訳開始因子結合部位でハイブリッド形成による翻訳開始抑制等がある。これらは転写、スプライシン又は翻訳過程を阻害し、標的遺伝子の発現を抑制する。
【0065】
本発明に使用されるアンチセンス分子は前記のいずれの作用でも標的遺伝子の発現を抑制してもよい。代表的なアンチセンス分子にはトリプルヘリックスフォーミングエージェント、リボザイム(ribozyme)、RNAi、又はアンチセンス核酸等が含まれる。トリプロルリックスフォーミングエージェントは2重螺旋DNA周辺を巻いて3本鎖螺旋を形成するようにすることにより、転写開始が抑制されるようにする(Maher et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991)。
【0066】
リボザイムは1本鎖RNAを特異的に切断する能力を保有したRNA酵素である。リボザイムは標的RNA分子内の特定ポリヌクレオチド配列を認識して部位特異的に切断することにより、標的遺伝子のタンパク質発現を抑制する(Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1998; Sarver et al., Science 247:1222-1225, 1990)。
【0067】
RNAi(RNA interference)は塩基配列特異的に作用するヘアピン状の小分子のRNAを使用して転写水準或いは転写後水準で遺伝子発現を抑制させる方法である(Mette et al., EMBO J., 19: 5194-5201, 2000)。前記RNAi方法に使用される小分子RNAは標的遺伝子と相同性を有する二本鎖RNA分子である。
前記にてRNA分子を製造する方法には公知の化学的合成方法及び酵素的方法を利用できる。例えば、RNA分子の化学的合成は文献に開示されている方法を利用でき(Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67, 99-134, 1999)、RNA分子の酵素的合成はT7、T3及びSP6RNAポリメラーゼのようなファージRNAポリメラーゼを利用する方法が文献に開示されている(Milligan and Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180:51-62, 1989)。
【0068】
アンチセンス核酸は標的mRNA分子と少なくとも一部分が相補的なDNA又はRNA分子をいう(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990)。細胞内でアンチセンス核酸はそれに相応するmRNAと混成化され、二本鎖分子を形成することにより、標的遺伝子のmRNA解読を阻害してタンパク質発現を抑制する(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988)。前記アンチセンス核酸は特に本発明のFEX-2の発現を抑制する抑制剤として有用に使用できる。前記アンチセンス核酸は好ましくはオリゴポリヌクレオチド形態であり、当業界に公知の任意の適合した方法により製造できる。前記アンチセンスオリゴポリヌクレオチドは化学合成法、例えば、文献(Tetrahedron Lett., 1991, 32, 30005-30008)に記載された通り、アセトニトリルの中でテトラエチルチウラムジスルフィドに硫化させるホスホアミダイト化学のような方法により極めて容易に製造できる。
【0069】
本発明の方法により予防又は治療できる‘炎症性疾患’には体内の炎症反応自体又は前記炎症反応により誘発されるすべての疾患が含まれる。例えば、これに限定はされないものの、炎症、炎症性腸疾患、糖尿性眼疾患、腹膜炎、骨髄炎、蜂巣炎、脳膜炎、脳炎、膵臓炎、外傷誘発ショック、気管支喘息、鼻炎、中耳炎、肺炎、胃炎、嚢疱性繊維症、卒中、気管支炎、細気管支炎、肝臓炎、腎臓炎、関節炎、通風、脊椎炎、ライター症候群、結節性多発動脈炎、過敏性血管炎、ルゲニック肉芽腫症、リウマチ性多発性筋肉痛、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着関節病症、仮性通風、非関節リウマチズム、点液嚢炎、乾草炎、上顆炎(テニスエルボー)、神経病症状関節疾患(Charcot's joint)、出血性関節症(hemarthro sis)、ヘノフシェンライン紫斑病、鼻喉性骨関節病症、多重芯性細網組織球腫、スルコイロシス(surcoilosis)、血色素症、鎌状赤血球症及びその他の血色素症、高脂蛋白血症、低ガンマグロブリン血症、副甲状腺機能昂進症、末端巨大症、家族性地中海熱、ベハト病、全身性紅斑性ループス、再帰熱、乾癬、多発性硬化症、敗血症、敗血性ショック、急性呼吸困難症候群、多発性臓器不全、慢性閉鎖性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease)、急性肺損傷(acute lung injury)及び気管支肺形成障害(broncho-pulmonary dysplasia)等が含まれる。
【0070】
本発明の他の面として本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含むリンパ球の内皮細胞付着反応抑制用薬学的組成物を提供する。
【0071】
さらに、本発明はFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【0072】
前記にて‘薬学的に許容される’とは、生理学的に許容され、人間に投与される時、一般的に胃腸障害、めまい症等のようなアレルギー反応又はこれと類似した反応を起こさない組成物をいう。薬学的に許容される担体には、例えば、ラクトース、澱粉、セルロース誘導体、マグネシウムステアレート、ステアリン酸等のような経口投与用担体及び水、適合したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコール等のような非経口投与用担体等があり、安定化剤及び保存剤を追加して保存することができる。適合した安定化剤には亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適合した保存剤としてはベンズアルコニウムクロライド、メチル又はプロピルパラベン及びクロロブタノールがある。その他の薬学的に許容される担体には次の文献に記載されているのことを参考にすることができる(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995)。
【0073】
前記本発明に伴う薬学的組成物は上述したような薬学的に許容される担体と共に当業界に公知の方法により、適合した形態で剤型化できる。つまり、本発明の薬学的組成物は公知の方法により多様な非経口又は経口投与用の形態で製造できる。非経口投与用剤型の代表的なものには、注射用剤型として等張性水溶液又は懸濁液が好ましい。注射用剤型は適合した分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して当業界に公知の技術により製造できる。例えば、各成分を食塩水又は緩衝液に溶解させ、注射用として剤型化することができる。さらに、経口投与用剤型としてはこれに限定はされないものの、粉末、顆粒、錠剤、丸薬及びカプセル等がある。
【0074】
前記のような方法で剤型化された薬学的組成物は有効量で経口、経皮、皮下、静脈又は筋肉を含む多くの経路を通じて投与できる。
【0075】
前記にて‘有効量’とは、患者に投与した際、予防又は治療効果を表わす化合物又は抽出物の量をいう。本発明における薬学的組成物の投与量は投与経路、投与対象、年齢、性別体重、個人差及び疾病状態により適宜選択できる。好ましくは本発明のポリペプチドを含む薬学的組成物は疾患の程度によって、有効成分の含量を異にすることができるものの、成人を基準にした場合、一般的に1回投与の際10μg乃至10mgの有効容量で1日数回繰返し投与できる。
【0076】
さらに、本発明はリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤の製造の為の、FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途を提供する。
さらに、本発明は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造の為のFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途を提供する。
【0077】
引き続き本発明は、リンパ球の内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、試験製剤がFEX-2を発現する細胞と特異的に作用する場合、本発明のスクリーニング方法は(a)FEX-2ポリペプチドを発現する細胞を試験製剤と共に、又は試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に、前培養した細胞又は試験製剤無しに前培養した細胞にリンパ球を添加して追加培養する段階;及び
(c)試験製剤と共に前培養した細胞に対するリンパ球の付着程度を測定し、試験製剤無しに前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階を含む。
【0078】
さらに、試験製剤がリンパ球と特異的に作用する場合、本発明のスクリーニング方法は
(a)リンパ球を試験製剤と共に、又は試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に、前培養したリンパ球又は試験製剤無しに前培養したリンパ球をFEX-2ポリペプチドを発現する細胞に添加して追加培養する段階;及び
(c)試験製剤と共に、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度を測定し、試験製剤無しに前培養した細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階を含む。
【0079】
さらに、本発明は炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法を提供する。
本発明における炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法は、前記リンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法に(d)前記(c)段階でリンパ球の付着を抑制するものと確認された試験製剤を炎症性疾患を有している動物に投与して治療効果を表わすかを検査する段階を追加して含む。
【0080】
前記にて動物は人間でない動物(non-human animal)であることが好ましい。さらに、前記(d)段階で‘治療効果’とは、炎症性疾患及びこの症状を緩和又は改善する効果及び炎症性疾患の進行を抑制する効果を意味する。
【0081】
本発明で‘製剤(agent)’又は‘試験製剤(test agent)’とは、任意の物質(substance)、分子(molecule)、元素(element)、化合物(compound)、実在物(entity)又はこれらの組合せを含む。例えば、これに制限はされないものの、タンパク質、ポリペプチド、小有機物質(small organic molecule)、多糖類(polysaccharide)、ポリヌクレオチド等を含む。さらに、自然産物(natural product)、合成化合物又は化学化合物又は2個以上の物質の組合せでもあり得る。特に指定されない限り、製剤、物質及び化合物は互換性があるように(interchangeably)使用できる。
【0082】
本発明の方法でスクリーニング若しくは同定でき、試験製剤は、ポリペプチド、ベータターンミメチック(beta-turn mimetics)、多糖類、燐脂質、ホルモン、プロスタグラチン、ステロイド、芳香族化合物、ヘテロサイクリック化合物、ベンゾジアゼピン(benzodiazepines)、オリゴマリックN-置換グリシン(oligomeric N-substituted glycines)、オリゴカルバメート(oligocarbamates)、糖類(saccharides)、脂肪酸、ヒューリン、ピリマジン又はこれらの誘導体、構造的アナログ又は組合せを含む。ある試験製剤は合成物質でもあり、他の試験製剤は天然物質でもあり得る。前記試験製剤は合成又は自然化合物のライブラリーを含む広範囲で多様な出処から得られる。組合せ(combinatorial)ライブラリーはステップ-バイ-ステップ方式で合成できる種々の化合物から生産できる。多数の組合せライブラリー化合物等はESL(encoded synthetic libraries)方法(WO 95/12608, WO 93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503及びWO 95/30642)により製造できる。バクテリア、黴、植物及び動物抽出物形態の自然化合物のライブラリーは商業的な出処から得るか又はフィールド(field)で収集できる。公知の薬理学的(pharmacological)製剤が構造的アナログを製造する為に、アシル化、エステル化反応(esterification)、イミド化反応(amidification)のような指示されるか(direct)無作為な化学的修飾に適用できる。前記試験製剤は自然的に生成されるタンパク質又はその断片でもあり得る。このような試験製剤は自然出処(natural source)、例えば、細胞又は組織溶解物から収得できる。ポリペプチド製剤のライブラリーは例えば、一般的な方法により、生成若しくは商業的に入手できるcDNAライブラリーから収得できる。前記試験製剤はペプチド、例えば、約5-30個、好ましくは約5-20個、より好ましくは約7-15個のアミノ酸を有するペプチドでもあり得る。前記ペプチドは自然的に生産されるタンパク質、ランダムペプチド又は“バイアス化(biased)”ランダムペプチドの切断物でもあり得る。
【0083】
さらに、前記試験製剤は“核酸”の場合もあり得る。核酸試験製剤は自然的に生成される核酸、ランダム核酸、又は“バイアス化”ランダム核酸でもあり得る。例えば、原核又は真核ゲノムの切断物を前記に記載したのと類似して使用できる。
【0084】
さらに、前記試験製剤は小分子(例:約1,000以下の分子量を有する分子)でもあり得る。小分子の調節製剤をスクリーニングするための方法には、好ましくは高速分析アッセイ(high throughput assay)が適用できる。前記に記載した通り小分子試験製剤の組合せライブラリーが本発明のスクリーニング方法に容易に適用することもできる。多くのアッセイが前記スクリーニングに有用である(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol. Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997)。
【0085】
前記にて‘FEX-2ポリペプチドを発現する細胞’とは、好ましくは前記FEX-2ポリペプチドをコーディングする遺伝子を含むベクターに形質転換される細胞をいう。前記細胞としては、特に、限定はされないものの、FEX-2ポリペプチド以外の細胞付着分子が存在しない細胞であることが好ましい。本発明で例示されたものには、マウス繊維芽細胞であるL細胞がある。前記マウスのL細胞以外にも中国のハムスタ-卵巣細胞CHO、マウス肉腫細胞S180及びドロソフィラー(Drosophila)S2細胞が使用できる。
【0086】
前記にてFEX-2ポリペプチドをコーディングする遺伝子を含むベクターは、公知のFEX-2遺伝子配列から公知の方法によりcDNAを製造し、前記cDNAを適合したベクターにクローニングすることにより、容易に製造することもできる。本発明で例示された発現ベクターはpcDNA FEX-2がある。
【0087】
前記にてリンパ球は蛍光色素で表示されたものであることが好ましい。前記蛍光色素には細胞膜への拡散を通じて染色され、蛍光顕微鏡で確認が可能な全ての種類の蛍光色素を使用することができる。
【0088】
前記形質転換された細胞に対するリンパ球の付着程度は蛍光顕微鏡と光学顕微鏡で形質転換細胞に付着されたリンパ球の数を計数して測定するか又は形質転換細胞とリンパ球を一緒に培養した後、前記細胞を細胞溶解緩衝液で溶解させて収得した溶解液(lysate)内の蛍光の量を定量することにより、測定できる。
【0089】
前記にて顕微鏡を利用して付着されたリンパ球の数を計数する場合には、形質転換し細胞とリンパ球を一緒に培養した後、付着していないリンパ球を洗浄して除去し、無作為に定めた10箇所の顕微鏡で観察して付着したリンパ球の数を計数して平均を求める方法が利用できる。
前記細胞溶解液内の蛍光の量を測定する場合には、形質転換細胞とリンパ球を一緒に培養した後、付着していないリンパ球を洗浄して除去し、細胞溶解緩衝液を加えて収得した細胞溶解液の蛍光の量を蛍光マイクロプレートリーダー(fluorescent microplate reader)で測定する方法を利用できる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記実施例等は本発明を例示するものであり、本発明の内容は実施例により限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【0090】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するものであり、本発明の内容はこれに限定されない。
【0091】
<実施例1>
人間FEX-2cDNAクローニング
<1-1> 発現ベクターの製造
fas-1ドメインを含む新規の細胞付着分子を同定する為に、fas-1ドメインを含む配列をジーンバンク(Genbank)とセレラゲノミックス(Celera genomics)のポリヌクレオチドデータベースで検索した。その結果、特徴が究明されない人間の部分的cDNAクローン(FLJ00112, DZKZp434E0321, CD44-like precursor FELL)が検索された。前記の全長cDNA配列はRT-PCRと5'RACE PCRにより人間脾臓細胞から製造した。
【0092】
まず、前記にてfas-1ドメインを含んでいるものと検索された3種類の人間脾臓の部分的なcDNAクローンを基に2対のプライマー(配列番号67乃至配列番号70)をデザインした(表1)。人間の脾臓から抽出したRNA2μgを鋳型にして前記にてデザインしたそれぞれのプライマー対を利用して逆転写酵素重合酵素連鎖反応(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)を行うことにより、fas-1ドメインを含むタンパク質の部分的なcDNAを2部分に別けて収得した。前記にてPCR反応はPCRシステム(Expand high fidelity PCR system, Roche)を利用して95℃で2分間反応させ、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を30回繰返して行った。その結果、3.6kbと2.0kbの増幅産物をそれぞれ収得した。前記増幅産物の内3.6kb cDNAを制限酵素ClaI及びSacI(TaKaRa)で切断した後、(pBluescript-KS(+)(Stratagene)ベクターの同一の制限酵素の座にT4リガーゼ(ligase, Invitrogen)を用いて挿入することにより、組換えベクター‘pBS-Fex23’を製造した。さらに、前記増幅産物の内、2.0kb cDNAを制限酵素SacI及びHindIII(TaKaRa)で切断した後、pET-29bベクター(Novagen)の同一の制限酵素の座にT4リガーゼ(ligase, Invitrogen)を用いて挿入することにより、組換えベクター‘pET-Fex45’を製造した。その後、前記二つのcDNA塩基配列を合わせる為に、pET-Fex45をEcoRIで切断して収得した断片をクレウナ(klenow)酵素で処理してブラント(blunt)断片を製造し、これをさらにSacIで切断して前記組換えベクターPET-Fex23の同一の制限酵素の座にクローニングして組換えベクター‘pET-Fex2345’を製造した。
【0093】
fas-1ドメインを含むcDNAの5'末端は下記のような方法で製造した。人間の脾臓から収得したRNAを表1に表わしたプライマー(配列番号71)を用いて増幅してcDNAを製造し、前記cDNAを鋳型にして表1に表わしたプライマー(配列番号72及び配列番号73)と5' RACE system(5' RACE system for Rapid Amplification of cDNA Ends version 2.0, Invitrogen)で提供するアダプトプライマーを利用して製造者が指示する方法により、5’RACE PCRを行い、増幅産物を収得した。その後前記増幅産物を塩基配列分析機(Applied Biosystems AB13700)で分析してFEX-25'末端の塩基配列を究明した後、前記5'末端の塩基配列を基に、プライマーを製造した。人間の脾臓から抽出したRNA 2μgを鋳型にして前記の5'塩基配列を基にデザインしたプライマー対(配列番号74及び配列番号75)を利用して逆転写酵素重合酵素連鎖反応(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)を行うことにより、2.5kbの5'末端cDNAを収得した。前記増幅産物を制限酵素EcoRI及びClaI(TaKaRa)で切断してpBluescript-KS(+)ベクター(Stratagene)の同一の制限酵素位置に挿入することにより、組換えベクター‘pBS-Fex1’を製造した。完全な塩基配列を発現ベクターにクローニングする為に、まず、前記にて製造したpET-Fex2345をKpnIとHindIIIで切断してpcDNA3.1(-)/Myc-Hisベクター(Invitrogen)の同一の制限酵素位置に挿入して‘pcDNA-Fex45’を製造した。さらに、再度pET-Fex2345をBamHIとKpnIで切断してpcDNA-Fex45の同一の制限酵素位置に挿入して‘pcDNA-Fex2345’を製造し、最後に前記pBS-Fex1をEcoRIとClaIで切断してpcDNA-Fex2345の同一の制限酵素位置に挿入して完全な塩基配列をクローニングした。
【0094】
前記にて製造されたプラスミドを塩基配列分析機(Applied Biosystems AB13700)で分析し、塩基配列はジーンバンク(GenebankTM accession number AY311388)に登録し、前記にて製造されたFEX-2の完全な塩基配列を含む発現ベクターを‘pcDNA-Fex2’と命名した。
【0095】
前記塩基配列分析結果から推定されるアミノ酸配列はスケビンザー受容体FEEL-2(Scavenger receptor FEEL-2)(Adachi H. et al., J. Biol. Chem. 277:34264-34270, 2002)とヒアルロナン受容体スタビリン-2(encocytic hyaluronan receptor Stabilin-2)(Politz O. et al., Biochem J. 362:155-164, 2002)と殆ど同一なものとして表われ、それらのドメイン構造は7個のfas-1ドメイン、23個のEGF類似ドメイン、1個のX-リンクドメイン及び1個の膜横断ドメインを有していた(図1)。
【0096】
【表1】
【0097】
<1-2> L細胞の形質転換
前記実施例<1-1>の発現ベクターpcDNA-Fex2でマウス繊維芽細胞であるL細胞ATCC CCL-1、東京大学生物物理学科のタケチ博士より提供された)を形質転換した。前記L細胞を10%熱不活性化FBS、ペニシリンG及びストレプトマイシンが添加されたDMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)培地で培養した。前記マウスL細胞は代表的な細胞付着物質であるカドヘリンが発現されない細胞株として細胞付着活性の研究に普遍的に使用される細胞である(Nose, A. Cell 54:993-1001, 1988)。
前記L細胞を組換えベクターpcDNA-Fex2に形質転換する為に、リポフェクタミン(Lipofectamine, Invitrogen)を使用し、製造者が指示する方法により形質転換した。形質転換後48時間にG418(400μg/ml)を処理して10乃至12日間培養しながら抵抗性を表わすそれぞれのコロニーを分離した。前記のような方法により、形質転換された細胞をL/FEX-2に命名した。陰性対照群(L/Mock)には、FEX-2遺伝子が含まれないベクトルであるpcDNA3.1(-)/Myc-Hisに形質転換した細胞を使用した。
【0098】
<実施例2>
FEX-2に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の製造
<2-1> 人間FEX-2に対するポリクローナル抗体の製造
人間FEX-2に対するポリクローナル抗体を製造する為に、人間FEX-2の全体アミノ酸配列(配列番号1)の中でアミノ酸554番から655番に該当する塩基配列を含むcDNAとアミノ酸2188番から2551番に該当する塩基配列を含むcDNAをPCR増幅して製造した。前記cDNAは実施例<1-1>のpcDNA-Fex2 DNAを鋳型にして下記のプライマー(配列番号76乃至配列番号79)を利用してPCRを行うことにより収得した(表2)。PCR反応条件は95℃で2分反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返し行った。アミノ酸554番から655番に該当する塩基配列を含む増幅産物は制限酵素SalI及びHindIII(TaKaRa)で切断し、pET-29bベクター(Novagen)の同一の制限酵素位置にそれぞれ挿入し、アミノ酸2188番から2551番に該当する塩基配列を含む増幅産物は制限酵素BamHI及びXhoI(TaKaRa)で切断してpET28aベクター(Novagen)の同一の制限酵素位置に挿入した。
【0099】
【表2】
【0100】
前記にて製造された発現ベクターをそれぞれ‘pET-FEX2-5’と‘pET-FEX2-2’と命名し、前記ベクターで大腸菌BL21 DE3を形質転換体した。形質転換された大腸菌を50mg/mlカナマイシン(kanamycin)を含むLB培地で培養し、組換えタンパク質の発現を誘導する為に、培養液の吸光度が600nmから0.5乃至0.6になった時、1mM IPTG(isopropyl-D(-)-thiogalactopyranoside)を添加して37℃で3時間追加して培養した。以降、発現されたタンパク質を公知の方法により精製した(Kim, J.-E. et al., J. Cell. Biochem., 77:169-187, 2000)。まず、前記形質転換大腸菌の培養液を遠心分離して細胞を収得した後、溶解緩衝液(50mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT)に再懸濁した。前記細胞懸濁液を超音波で粉砕し、封入体(inclusion body)形態で発現されたタンパク質は8M尿酸変性緩衝液で溶解させ、変性タンパク質等をNi-NTA樹脂(resin, Qiagen)を利用して精製した。前記組換えタンパク質は200mMイミダゾール(imidazole)溶液で溶離し、50mM塩化ナトリウムを含む20mMトリス塩酸緩衝液内で高濃度から低濃度の尿酸の順に透析して精製した。前記精製された組換えタンパク質をSDS-PAGEにより確認できた(結果は未図示)。
【0101】
前記にて製造された2種類の組換えタンパク質(200μg/ml)をそれぞれ別の兎に注射して抗体を製造した。つまり、前記組換えタンパク質1mlずつ同一の量の完全フラウント免疫増強剤(complete Freund's adjuvant)と混合して注射し、その次には前記組換えタンパク質を同一の量の不完全フラウント免疫増強剤(incomplete Freund's adjuvant)と混合して2週間に1度ずつ8週間兎に皮下注射し、抗体生成後採血した。採血後室温で2時間程放置した後、4℃で1000×gで30分間遠心分離して抗血清を分離した。前記抗血清をタンパク質Aセファローズ(Protein A Sepharose, Amersham Pharmacia)ビードを使用し、製造者が指示する方法により精製することにより、免疫グロブリン分画を収得した。
【0102】
<2-2> 人間FEX-2に対するモノクローナル抗体の製造
人間FEX-2に対するモノクローナル抗体を製造するには、人間FEX-2の全体アミノ酸配列(配列番号1)の内、アミノ酸1173番から1727番に該当する塩基配列を含むcDNAを製造した。前記cDNAは前記実施例<1-1>のpcDNA-fex2 DNAを鋳型にし、下記のプライマー(配列番号80及び配列番号81)を使用してPCRを行うことにより収得した(表3)。PCRは95℃で2分間反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返し行った。前記増幅された産物を制限酵素BamHI及びXhoI(TaKaRa)で切断し、pET43.1aベクター(Novagen)の同一な制限酵素の座に挿入した。
【0103】
【表3】
【0104】
前記にて製造された発現ベクターを‘pET-4E5’と命名し、タンパク質の発現と分離は<2-1>での方法と同一の方法で行った。モノクローナル抗体の製造はダイノナ社(Dinona Inc., Seoul, Korea)に依頼して製造した。つまり、前記にて製造されたタンパク質20μgを6匹の鼠に2週間隔で免疫接種して陽性のハイブリドーマクローン(clone 5G3)を収得し、これを鼠の腹腔に注入させ、腹水で採集することにより、モノクローナル抗体を得た。前記にて収得したハイブリドーマ5G3はブタペスト条約下の国際寄託機関である韓国生命工学院遺伝資源センター遺伝子銀行(KCTC)に2004年5月21日付で寄託番号KCTC-10639BPで寄託した。
【0105】
前記モノクローナル抗体のアイソタイプ(isotype)はイソストリップマウスモノクローナル抗体イソタイピングキット(IsoStrip mouse monoclonal antibody isotyping kit, Roche)を使用して確認した。その結果、本発明のモノクローナル抗体のアイソタイプはIgGラムダチェーン(lambda chain)だと確認された。
【0106】
<2-3> 人間FEX-2モノクローナル抗体を利用して人間脾臓組織及びL/FEX-2細胞にてFEX-2タンパク質の発現測定
前記実施例<2-2>で製造した人間FEX-2に対するモノクローナル抗体5G3が人間脾臓組織より発現されるFEX-2タンパク質が検出できるか否かをウェスタンブロット分析により測定した。さらに、前記実施例1-2のL/FEX-2細胞で人間FEX-2タンパク質が発現されるか否かをウェスタンブロット分析により測定した。対照群にはL/Mock細胞を使用した。
【0107】
まず、人間脾臓組織0.5mgに細胞溶解緩衝液5mlを添加し、氷の上で組織粉砕機(tissue homogenizer)で粉砕し、氷の上で1時間放置して細胞溶解物を収得した。さらに、L/FEX-2細胞と対照群であるL/Mock細胞をPBSで複数回洗浄した後、細胞溶解緩衝液を添加して溶解させ、前記細胞溶解物を4℃で12,000rpmで10分間遠心分離して溶解性タンパク質が存在する上層液を収得した。以降、タンパク質の濃度を定量分析する為に、BSAを定量基準タンパク質として利用し、ブラッドフォードアッセイ(Bradford assay; BioRad, Hercules, CA)を行った。前記にて製造した脾臓組織、L/FEX-2細胞及びL/Mockから抽出したタンパク質試料30μgを6%SDSを含むポリアクリルアミドゲル状で電気泳動した。ゲル状のタンパク質を電気移動法を利用してニトロセルロース膜に移動し、このタンパク質と5%脱脂粉乳溶液を1時間反応させ、非特異的タンパク質結合を遮断した。以降、抗FEX-2モノクローナル抗体(5G3)をTBS-T(50mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)溶液に希釈して冷蔵状態で16時間以上ニトロセルロース膜と結合反応させた。反応完了後膜をTBS-T溶液で3回洗浄した。以降、再度HRP-結合2次抗体(hrp-結合-抗-マウスIgG;Santa Cruz社、CA州米国)を添加して常温で1時間結合反応させた。膜を再び3回洗浄した後、化学発光溶液のECL 1mlを添加して抗原-抗体反応が起こる部位を蛍光で可視化し、X線フィルムで感光した。
【0108】
実験の結果、人間脾臓細胞の場合、約270kDa及び約200kDa大のバンドが検出され、L/FEX-2においても同一な大きさのバンドが検出された(図2)。前記実験結果から人間FEX-2に対するモノクローナル抗体が実際に脾臓組織及びL/FEX-2細胞のFEX-2と特異的に反応することが確認できた。
【0109】
<実施例3>
L/FEX-2細胞表面でFEX-2発現可否確認
<3-1> FACS分析
前記実施例1-2のL/FEX-2細胞の表面でFEX-2が発現されるか否かを確認する為に、実施例<2-3>で製造したFEX-2に特異的な人間モノクローナル抗体(5G3)を利用してFACS分析を行った。
L/FEX-2細胞が完全に培養された(confluent)プレートに0.25%トリプシン及び0.05%EDTAを含むPBS緩衝液を処理してプレート表面から細胞を取除いた。細胞をPBSバッファで2回洗浄後再びPBSバッファに再懸濁した。細胞懸濁液に抗-FEX-2モノクローナル抗体(5G3)を添加して4℃で1時間培養した。10μg/mlのFITCと結合された2次兎-抗マウスIgG抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)を添加して4℃で1時間細胞をさらに培養させ、5ワット(watt)レザーが装着されたフローサイトメーター(flow cytometer FACS Calibur system, Becton Dickinson, San Jose, CA)を利用して488nmで分析した。対照群には前記抗-FEX-2モノクローナル抗体の代わりにマウス免疫グロブリンを使用した。
実験の結果、L/FEX-2細胞の表面にFEX-2が発現されることが確認できた。反面、L/Mock細胞表面にはFEX-2が発現されないことが確認できた(図3)。
【0110】
<3-2> 表面ビオチン化分析(surface biotinylaion assay)
L/FEX-2細胞表面にFEX-2が発現されるか否かをさらに究明する為、表面ビオチン化分析を行った。前記実施例<1-2>のL/FEX-2細胞を冷たいリン酸緩衝液(pH8.0)で3回洗浄した。次に、前記細胞をリン酸緩衝液で2.5×107細胞/mlの濃度になるように懸濁後、スルホ-NHS-LS-ビオチン(Pierce)1mgを添加して室温で30分間反応させた。対照群にはビオチンを添加しなかった。前記反応物に免疫沈殿緩衝液(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2とタンパク質分解酵素阻害剤混合物(Roche)が含まれている、pH7.4)を加えて溶解後、前記細胞溶解物を4℃で12,000rpmで10分間遠心分離して溶解性タンパク質が存在する上層液を収得した。ビードとの非特異的な反応を減少させる為、前記細胞溶解物をGタンパク質ビード(protein G beads)に入れて4℃で2時間反応後、ビードを除去した。そして、実施例<2-1>のFEX-2ポリクローナル抗体が結合されたGタンパク質セファローズマトリックスと4℃で夜通しで反応後、免疫沈殿した。前記ビードを3回洗浄後20μl試料緩衝液を添加して沸かせ、6%SDSを含むポリアクリルアミドゲル状で電気泳動した。ゲル状のタンパク質を電気泳動法を利用してニトロセルロース膜に移動させた。膜に移動されたタンパク質と5%の脱脂粉乳溶液を1時間反応させ、非特異的タンパク質結合を遮断した。以降、抗FEX-2抗体をTBS-T溶液(50mM Tris-HCl, pH 7.6, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)に希釈して冷蔵状態で16時間以上ニトロセルロース膜と結合反応させた。反応が完了した後、膜をTBST溶液で3回洗浄した。以降、HRP-結合-抗-兎-IgG抗体(Santa Cruz社、CA州、米国)を添加して常温で1時間結合反応させた。膜を再び3回洗浄し、化学発光溶液であるECL1mlを添加して抗原-抗体反応が起った部位を蛍光で可視化し、X線フィルムで感光させた。さらに、前記ニトロセルロース膜を抗-FEX-2抗体と反応させずに、HRP-結合-ストレプタビジンと常温で1時間結合反応をさせ、化学発光溶液であるECL1MLを添加して抗原-抗体反応が起こる部位を蛍光で可視化してX線フィルムで感光させた。
【0111】
実験の結果、ビオチンを処理しない対照群ではFEX-2抗体により免疫沈殿したFEX-2タンパク質がFEX-2抗体により、検出されたものの、ストレプタビジンによっては検出されなかった。反面ビオチンを処理した群では抗FEX-2抗体とストレプタビジンにより、FEX-2タンパク質が全て検出された(図4)。
前記実験結果から細胞表面に存在するFEX-2タンパク質がビオチンを処理することにより、ビオチン化された後、これがFEX-2抗体が結合されたビードにより、免疫沈殿した後抗FEX-2抗体及びストレプタビジンにより、検出され得ることが確認でき、ビオチンを処理しない場合にはFEX-2タンパク質のビオチン化が誘発されず、ストレプタビジンによっては検出されなかったことが分かった。従って、FEX-2タンパク質がL/FEX-2の細胞表面に存在することが確認できた。
【0112】
<実施例4>
免疫組織化学染色法によるFEX-2が発現される組織の同定
FEX-2の発現様相を調査する為、人間の肝臓、脾臓、膵臓、心臓、睾丸、肺、リンパ節、卵巣、皮膚及び副腎等の20余種の組織(慶北大学校病理学室で収得)で実施例<2-1>で製造した人間FEX-2ポリクローナル抗体を使用して免疫組織化学染色を実施した。まず、各組織を3.7%パラホルムアルデヒドに入れ、室温で一晩夜通しで固めて、組織を5μm間隔で切断した。その後キシレンとアルコールにそれぞれ5分程漬け、内在的なペルオキシダーゼの活性を抑制する為、0.5%過酸化水素を10分間処理した。非特異的な反応を遮断する為、各組織の断片を50mM NH4Clに30分間放置した後、遮断溶液(1×PBS, 1%BSA, 0.05%サポニン及び0.2%ゼラチン)を加え、4℃で1時間反応させた。以降、前記人間FEX-2多ポリクローナル抗体と4℃で夜通しで結合反応させた。反応完了後組織を洗浄し、再度HRP-結合2次抗体を添加して反応させた。組織を再び3回洗浄し、化学反応試薬を添加して抗原-抗体反応が起った部分を発色で可視化した。対照群には抗原と前培養した抗体を使用した。
【0113】
実験の結果、FEX-2タンパク質は人間脾臓の静脈洞(venous sinus)で発現されることが観察できた(図5)。さらに、FEX-2タンパク質はリンパ節の上顎洞(maxillary sinus)と肝臓のシヌソイド血管(sinusoid)でも発現されるものとして表われた(結果は未図示)。これよりFEX-2はシヌソイド(sinusoidal)内皮細胞で発現され、血液内の細胞と相互作用をするものと推定することができた。
【0114】
<実施例5>
FEX-2とリンパ球の付着活性調査
FEX-2とリンパ球の付着活性を調査する為、血管からフィコル(Ficoll)(Pharmacia Biotech)勾配遠心分離法を利用して末梢血液リンパ球(peripheral blood lymphocytes)を分離した(Johnson-Leger C.A. et al., Blood, 100, 2479-2486, 2002)。前記実施例<1-2>で調査したL/FEX-2細胞と対照群であるL/Mock細胞をDMEM培地が含まれた12-ウェルプレートで完全に(confluent)培養した後、ここに1×105個のDiI蛍光色素(Molecular Probe)で標識させたリンパ球を添加して37℃で30分間培養した。その後、同一な培地で3回洗浄し、HMMF(high magnification fields, ×400)下で任意に選択した10箇所を光学顕微鏡で観察してL/FEX-2細胞に付着されたリンパ球の数を計数した。
実験の結果、FEX-2を発現するL/FEX-2細胞には対照群のL/Mock細胞に比べて多数のリンパ球が付着されたことを確認した(図6及び図7)。
【0115】
<実施例6>
FEX-2モノクローナル抗体によるFEX-2に対するリンパ球の付着阻害
前記実施例5でL/FEX-2細胞にリンパ球が付着するのをFEX-2によるものであるかを確認する為に、FEX-2に特異的な抗体が前記L/FEX-2細胞にリンパ球が付着されるのを抑制するか否かを調査した。
まず、前記実施例1のL/FEX-2細胞を35mmプレートに培養し、前記実施例<2-2>のFEX-2モノクローナル抗体(5G3)を添加して37℃で30分間前培養した。以降、前培養された細胞にDiI蛍光色素(Molecular Probe)で標識させたリンパ球を添加して37℃で30分間前培養し、L/FEX-2にリンパ球が付着されるか否かを前記実施例5と同一の方法で調査した。対照群(control)として前記FEX-2モノクローナル抗体の代わりに免疫グロブリンGを使用した。
実験の結果、L/FEX-2細胞表面にリンパ球が付着され活性はFEX-2モノクローナル抗体に特異的に阻害されることが確認できた(図8)。
【0116】
<実施例7>
インテグリン受容体の同定
<7-1> 2価陽イオンによるリンパ球とFEX-2の付着活性変化調査
リンパ球の細胞付着を媒介するインテグリン受容体は2価陽イオンを必要とする。前記のような特徴に基づいてリンパ球がFEX-2に付着する活性がMn2+、Mg2+及びCa2+により、影響を受けるか否かを調査した。この為、カルシウムとマグネシウムのないHBSS(Hank's Balanced Salt Solution)にCaCl2、MgCl2及びMnCl2をそれぞれ2mMずつ添加した。前記2価陽イオンが含まれた溶液を前記実施例5のL/FEX-2とリンパ球の培養の際添加して培養し、実施例5と同一の方法でL/FEX-2細胞に付着されたリンパ球の数を計数した。
実験の結果、Mn2+を添加した場合、L/FEX-2に付着するリンパ球の活性が最も大きく促進されることを確認することができ、その後にはMg2+により促進されることを確認することができた。Ca2+によってもリンパ球の付着活性が促進されたものの、対照群と有意的な差を示さなかった(図9)。
【0117】
<7-2> リンパ球とFEX-2付着に関与するインテグリン受容体の同定
リンパ球とFEX-2の付着に関与するインテグリン受容体を同定する為に、インテグリンの機能を特異的に阻害する種々の抗体を利用して細胞付着阻害分析を行った。
多くの種類のインテグリン-特異的モノクローナル抗体(Chemicon, International Inc, Temecula, CA)10μg/mlを1mlの培養溶液から3×105細胞/ml濃度のリンパ球と37℃で30分間それぞれ前培養させた。本実験に使用された抗体は次の通りである:P5D2(β1に対する抗体)、25.3(αLに対する抗体)、Bear 1(αMに対する抗体)、3.9(αXに対する抗体)、この際、対照群には前記インテグリン-特異的モノクローナル抗体の代わりに正常鼠の免疫グロブリンと共に前培養したものを使用した。以降、培養されたL/FEX-2細胞に前記にてそれぞれの抗体と前培養したリンパ球を添加して37℃で30分間追加して培養した。付着された細胞は前記実施例5と同一の方法で定量した。
実験の結果、FEX-2に対するリンパ球の付着はαLインテグリン及びαMインテグリンに対する抗体により、特異的に阻害される反面、αX、β1インテグリンに対する抗体によっては阻害されなかった(図10)。
従って、リンパ球はαLβ2インテグリンとαMβ2インテグリンを通じてFEX-2タンパク質を有する細胞に付着することが確認できた。
【0118】
<実施例8>
FEX-2タンパク質の欠失突然変異組換え体によるFEX-2に対するリンパ球付着阻害
<8-1> FEX-2 4個の小単位によるFEX-2に対するリンパ球付着阻害
FEX-2の細胞外の部分を4個の小単位であるNus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4に区分した(図11)。前記にてNus-U1、Nus-U2及びNus-U3はそれぞれ極めて類似した構造を有している。具体的に前記Nus-U1、Nus-U2及びNus-U3は1個のEGF-類似繰返しドメインと2個のfas-1ドメインを有する。Nus-U4はEGF-類似繰返しドメイン、fas-1ドメイン及びX-リンクドメインをそれぞれ1個ずつ有する。
組換えタンパク質Nus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4を製造する為、FEX-2タンパク質(配列番号1)の66-655、691-1268、1303-1883及び1913-2449アミノ酸をコーディングするそれぞれのcDNA切片等を前記実施例<1-1>のpcDNA-fex2 DNAを鋳型にして下記のプライマー(配列番号82乃至配列番号89)でPCR増幅することにより、収得した(表4)。PCRは95℃で2分間反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返して行った。前記増幅された産物はそれぞれ制限酵素BamHI(TaKaRa)及びXhoI(TaKaRa)で切断し、切断された産物をpET-43.1aベクター(Novage)の同一の制限酵素の座に挿入した。前記にて製造した発現ベクターを‘pET-U1’、‘pET-U2’、‘pET-U3’及び ‘pET-U4’と命名した。前記発現ベクターを実施例<2-1>と同一の方法で大腸菌に形質転換した後、タンパク質の発現を誘導して分離及び精製することにより、組換えタンパク質Nus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4を製造した。
【0119】
【表4】
【0120】
前記組換えタンパク質Nus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4がFEX-2に対するリンパ球の付着を抑制するか否かを調査する為、DiI蛍光色素で標識させたリンパ球に前記組換えタンパク質Nus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4をそれぞれ10μMずつ添加して37℃で30分間前培養した。以降、FEX-2を発現するL/FEX-2細胞に前培養されたリンパ球を添加して37℃で30分間前培養してL/FEX-2にリンパ球が付着されるか否かを前記実施例5と同一の方法で調査した。対照群(control)でNusタンパク質を使用した。
実験の結果、組換えタンパク質Nus-U1、Nus-U2、Nus-U3及びNus-U4とリンパ球を前培養した場合、FEX-2に対するリンパ球の付着が大きく阻害されたことを確認できた(図12)。
【0121】
<8-2> 組換えタンパク質Nus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6のFEX-2に対するリンパ球付着阻害
前記実施例<8-1>の小単位体の中でNus-U3をより細分化してNus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6をそれぞれ製造し、前記組換えタンパク質がFEX-2に対するリンパ球の付着を阻害するか否かを調査した。前記Nus-EGF3はFEX-2タンパク質で3番目のEGF-類似繰返しドメインを含むポリペプチドであり、Nus-Fas5及びNus-Fas6はそれぞれ5番目と6番目FEX-1ドメインを含むポリペプチドである(図13)。
前記FEX-2タンパク質の欠失突然変異体であるNus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6をそれぞれ製造する為に、FEX-2タンパク質の1301-1596、1631-1727及び1778-1883アミノ酸をコーディングする cDNAの各切片を前記実施例<1-1>のpcDNA-FEX2を鋳型にして下記のプライマー(配列番号90乃至配列番号95)を使用してPCR増幅することにより、収得した(表5)。PCRは95℃で2分間反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返して行った。前記増幅された産物はそれぞれ制限酵素BamHI(TaKaRa)及びXhoI(TaKaRa)で切断し、切断された産物はpET-43.1aベクター(Novagen)の同一の制限酵素の座に挿入した。前記にて製造されたそれぞれの発現ベクターを‘pET-EGF3’、‘pET-Fas5’及び‘pET-Fas6’と命名した後、それを前記実施例<2-1>と同一の方法で大腸菌に形質転換し、タンパク質の発現を誘導して組替えタンパク質Nus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6をそれぞれ製造した。
【0122】
【表5】
前記組換えタンパク質Nus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6がFEX-2に対するリンパ球の付着を抑制するか否かを調査する為に、DiI蛍光色素で標識させたリンパ球に前記組換えタンパク質Nus-U3、Nus-EGF3、Nus-Fas5及びNus-Fas6をそれぞれ10μM添加して37℃で30分間前培養した。以降、FEX-2を発現するL/FEX-2細胞に前培養されたリンパ球を添加して30分間37℃で培養してL/FEX-2にリンパ球が付着されるか否かを前記実施例5と同一の方法で調査した。対照群(control)としてはNusタンパク質を使用した。
実験の結果、fas-1ドメインを含むNus-Fas5及びNus-Fas6ポリペプチドを添加した場合にはリンパ球の付着が大きく阻害されたことが確認できた。しかしながら、EGF-類似ドメインを含む組換えタンパク質を添加した場合には、リンパ球の付着に影響を及ぼしていないことが確認できた(図14)。
【0123】
<実施例9>
fas-1ドメインを含むポリペプチドの添加濃度によるリンパ球の付着阻害
前記実施例8と同一の方法でリンパ球の付着阻害程度を調査し、前記実施例8で製造したNus-U3、Nus-EGF3及びNus-Fas5の添加濃度を 0.1、1、10μMに変えて実験した。
実験の結果、fas-1ドメインを含む組換えタンパク質の添加濃度が増加する程、リンパ球の付着が抑制されたことが確認できた。反面、EGF-類似ドメインを含む組換えタンパク質は添加濃度が増加する程リンパ球の付着活性が若干増加することが示されたものの、大きく影響を及ぼさないことが確認できた(図15)。
【0124】
<実施例10>
種々のfas-1ドメインを含むポリペプチドのFEX-2に対するリンパ球の付着阻害活性
<10-1> FEX-2タンパク質内のfas-1ドメインのFEX-2に対するリンパ球の付着阻害
FEX-2タンパク質内に含まれた全てのfas-1ドメインがFEX-2に対するリンパ球の付着を阻害する活性があるかを調査した。
前記FEX-2タンパク質内に含まれた全てのfas-1ドメインの組換えタンパク質を製造する為に、pcDNA-Fex2 DNAを鋳型にして下記のプライマーを使用して(配列番号96乃至配列番号105)PCRを行うことにより、FEX-2アミノ酸406番-508番、554-655番、1030番-1130番、1173番-1268番、及び 2356番-1449番をそれぞれコーディングするcDNAの切片を収得した(表6)。PCR反応条件としては、95℃で2分間反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返して行った。7番目fas-1ドメインを除いた前記増幅されたFEX-2タンパク質のfas-1ドメインをそれぞれ制限酵素BamHI(TaKaRa)及びXhoI(TaKaRa)で切断し、pET-43.1aベクター(Novagen)の同一の制限酵素の座に挿入した。前記増幅されたFEX-2タンパク質の7番目のfas-1ドメインは制限酵素BamHI(TaKaRa)及びEcoRI(TaKaRa)で切断し、pET-43.1aベクター(Novagen)の同一の制限酵素の座に挿入した。前記にて製造された発現ベクターをそれぞれ‘pET-Fas1’、‘pET-Fas2’、‘pET-Fas3’、‘pET-Fas4’及び‘pET-Fas7’と命名し、前記実施例<2-1>と同一の方法で大腸菌に形質転換した後、タンパク質の発現を誘導して組換えタンパク質Nus-Fas1、Nus-Fas2、Nus-Fas3、Nus-Fas4及びNus-Fas7をそれぞれ製造した。
【0125】
【表6】
前記にて製造されたNus-Fas1、Nus-Fas2、Nus-Fas3、Nus-Fas4及びNus-Fas7と前記実施例<8-2>で製造されたNus-Fas5及びNus-Fas6がFEX-2に対するリンパ球の付着を阻害するか否かを実施例 8-2と同一の方法で調査した。
実験の結果、FEX-2内に存在する全てのfas-1ドメインを含む組換えタンパク質により、リンパ球の付着が大きく阻害されたことが確認できた(図16)。
【0126】
<10-2> 結核菌タンパク質のfas-1ドメインのFEX-2に対するリンパ球の付着阻害
結核菌のタンパク質であるmpt83とmpt70内のfas-1ドメインがFEX-2に対するリンパ球の付着を抑制するかを調査した。この為に、まず、マイコバクテリウムツベルクロシス(M. Tuberculosis)のRNAを鋳型にして下記のプライマー(配列番号106乃至配列番号109)を使用して(表7)RT-PCRを行うことによりmpt70タンパク質の130番-256番アミノ酸をコーディングするcDNA切片とmpt83タンパク質の123番-218番アミノ酸をコーディングする cDNA切片を収得した。前記にて結核菌からRNAの抽出はトリゾール(Trizol, Invitrogen)を使用して製造者の指示の通り行い、PCR反応は95℃で2分間反応し、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を25回繰返して行った。前記にて増幅されたmpt70タンパク質及びmpt83タンパク質のfas-1ドメインをそれぞれ制限酵素BamHI(TaKaRa)とXhoIで切断し、pET-28aベクター(Novagen)の同一の制限酵素の座に挿入した。前記にて製造された発現ベクターをそれぞれ‘pET-mpt70’及び‘pET-mpt83’と命名し、前記実施例<2-1>と同一の方法で大腸菌に形質転換した後、タンパク質の発現を誘導して組換えタンパク質Nus-mpt70及びNus-mpt83を分離精製して製造した。
【0127】
【表7】
前記にて製造されたNus-mpt70とNus-mpt83がFEX-2に対するリンパ球の付着を阻害するかを実施例<8-2>と同一の方法で調査した。この際、前記Nus-mpt70とNus-mpt83をそれぞれ0.1,1,10μMの濃度で添加した。
実験の結果、結核菌のタンパク質であるmpt83とmpt70内のfas-1ドメインを含むポリペプチドの場合にもFEX-2に対するリンパ球の付着を抑制することが示された。さらに、前記ポリペプチドの添加濃度が増加するにつれて、リンパ球の付着阻害程度が増加することが確認できた(図17)。
【0128】
<適用例1> 関節炎
関節炎は、自家免疫異常が原因であるものの、病気が進むにつれて関節間の滑液腔に生じた慢性炎症により軟骨が破壊される。関節炎には感染性関節炎、退行性関節炎、リウマチ性関節炎、大腿骨頭無血症潰死、強直性脊椎炎、先天性奇形による関節炎等の多様な種類があるものの、原因を問わず病気が進行する過程で滑液腔に慢性炎症が発生すると知られている。この際、種類により炎症反応が1次的、2次的に生じ、軟骨を破壊して病気の進行に重要な役割をし、この時、白血球が内皮細胞との相互作用を通じて関節内に入ってくるのが重要な病理メカニズムとして作用すると報告されている(Haskard D. O. Curr. Opin. Rheumatol. 7:229-34, 1995)。関節炎の治療は原因により、治療よりは痛症を抑制することと炎症現象を抑制して関節や筋肉等の破壊速度を最大限遅らせ、機能消失を最小化することを優先とする。従って、本発明の薬学的組成物は関節炎の進行防止と治療に極めて効果的である。
【0129】
<適用例2> 糖尿性眼疾患
糖尿性眼疾患は、失明を招き得る糖尿病の主要合併症の一つであり、血糖調節程度とは関係なく、罹病期間が長くなると発生する。最近糖尿病の治療法が向上するにつれて、糖尿病患者の寿命が延長されながら糖尿網膜病症も併行して増加する趨勢にある。従って、糖尿網膜病症は西欧では勿論韓国でも成人失明の最も大きい原因となっている。糖尿性網膜病症を有している患者より細胞付着物質が増加されており、このような付着物質により、白血球増滞症(leukostasis)、非灌流(non-perfusion)、血管漏出(vascular leakage)及び内皮細胞の損傷等を起こすと報告されている(Miyamoto K. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96:10836-41, 1999; Joussen A. M. Am. J. Pathol. 158:147-52, 2001; Barouch F. C. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 41(5):1153-8, 2000)。特に、糖尿性眼疾患において付着性白血球による炎症反応が重要な役割をすると報告されている(Joussen A. M. FASEB J. 18:1450-1452, 2004)。従って、本発明の薬学的組成物が糖尿性眼疾患の予防及び治療に極めて効果的である。
【0130】
<適用例3> 炎症
炎症とは、局所的な損傷に対し、血管のある生きている組織の反応であり、感染、外傷等の多くの要因により発生し得るが、原因と反応組織の差に関係なく殆ど類似した変化を表わす。この変化には血流の増加、血管壁の透過性増加、白血球の浸潤があるが、この全ての変化に細胞付着物が関与すると報告されている(Jackson, J. R. et al., FASEB, J. 11:457-465, 1997)。炎症とは、損傷に対する修復メカニズムであり、悪い反応では無いものの、発生し過ぎるとか、自家免疫の場合のように不適切に起る場合、炎症変化自体により組織の損傷と変形を招くこともあり得る。このような過度であったり不適切な炎症反応を調節する場合に、本発明の炎症反応抑制用組成物が効果的である。
【産業上の利用可能性】
【0131】
以上の通り、本発明における炎症性疾患の予防又は治療方法及び薬学的組成物はFEX-2ポリペプチドとリンパ球との付着を阻害することにより、リンパ球の内皮細胞付着を阻害して炎症性疾患を予防又は治療できる効果がある。さらに、本発明におけるスクリーニング方法によれば、試験製剤がFEX-2ポリペプチドに対するリンパ球の付着活性を阻害するか否かを確認することにより、リンパ球-内皮細胞付着阻害剤又は炎症性疾患の治療剤をスクリーニングできる。
【図面の簡単な説明】
【0132】
【図1】図1は人間FEX-2タンパク質の各ドメインを図示化した模式図である。
【図2】図2は人間FEX-2モノクローナル抗体を利用して人間脾臓組織、L/FEX-2細胞及びL/Mock細胞よりFEX-2タンパク質の発現をウェスタンブロット分析法で測定した結果である。
【図3】図3は人間FEX-2モノクローナル抗体を利用してL/Mock細胞とL/FEX-2細胞の表面でFEX-2タンパク質の発現をFACS(Fluoresence Activated Cell Sorter)で分析した結果である。
【図4】図4はL/FEX-2細胞表面におけるFEX-2タンパク質の発現を表面バイオチン化分析法で測定した結果である(−:添加せず、+:添加する)。
【図5】図5は人間の脾臓組織から人間FEX-2ポリクローナル抗体を利用して免疫組織染色を行った結果である(a:対照群、b:実験群)。
【図6】図6はL/Mock細胞とL/FEX-2細胞においてリンパ球の付着程度を顕微鏡で観察した写真である(a:L/Mock細胞、b:L/FEX-2細胞、矢印:リンパ球)。
【図7】図7はL/Mock細胞とL/FEX-2細胞においてリンパ球の付着程度を表わしたグラフである。
【図8】図8は人間FEX-2モノクローナル抗体がL/FEX-2細胞に対するリンパ球の付着活性を阻害する程度を表わしたグラフである。
【図9】図9は多くの種類の2価陽イオンがL/FEX-2細胞に対するリンパ球の付着活性に及ぼす影響を表わしたグラフである。
【図10】図10は多くの種類のインテグリンに対する機能阻害抗体等がL/FEX-2細胞に対するリンパ球の付着活性を阻害する程度を表わしたグラフである。 β1 :抗-β1抗体処理、αLβ2:抗-αL抗体処理 αMβ2:抗-αM抗体処理、αXβ2:抗-αX抗体処理
【図11】図11は人間FEX-2タンパク質を4個の小単位体に区分した模式図を表わしたものである。
【図12】図12は人間FEX-2タンパク質を4個の小単位体のFEX-2に対するリンパ球の付着阻害程度を表わしたグラフである。 Nus-U1:FEX-2タンパク質の一番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの Nus-U2:FEX-2タンパク質の二番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの Nus-U3:FEX-2タンパク質の三番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの Nus-U4:FEX-2タンパク質の四番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの
【図13】図13は人間FEX-2タンパク質の小単位体の内、三番目部分(Nus-U3)をさらに三つの部分に区分した模式図である。
【図14】図14は人間FEX-2タンパク質のNus-U3を三つの部分に分けて製造したポリペプチドのFEX-2に対するリンパ球の付着阻害程度を表わしたグラフである。 Nus-U3:FEX-2タンパク質の三番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの Nus-EGF3:FEX-2タンパク質の三番目のEGF-類似繰返しドメインがNusタンパク質の後に付いているもの Nus-Fas5:FEX-2タンパク質の五番目のfas-1ドメインがNusタンパク質の後に付いているもの Nus-Fas6:FEX-2タンパク質の六番目のfas-1ドメインがNusタンパク質の後に付いているもの
【図15】図15は人間FEX-2タンパク質のNus-U3を三つの部分に分けて製造したポリペプチドの処理濃度によりFEX-2に対するリンパ球の付着程度を表わしたグラフである。 Nus-Unit:FEX-2タンパク質の三番目の小単位がNusタンパク質の後に付いているもの Nus-EGF:FEX-2タンパク質の三番目のEGF-類似繰返しドメインがNusタンパク質の後に付いているもの Nus-Fas:FEX-2タンパク質の五番目のfas-1ドメインがNusタンパク質の後に付いているもの
【図16】図16はFEX-2タンパク質内の7個のfas-1ドメインを含むポリペプチドによるFEX-2に対するリンパ球の付着阻害程度を表わしたグラフである。
【図17】図17は結核菌タンパク質であるmpt70とmpt83内のfas-1ドメインを含むポリペプチドによるFEX-2に対するリンパ球の付着程度を表わしたグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤をそれを必要とする固体(subject)に投与することを含むリンパ球の内皮細胞付着を抑制する方法。
【請求項2】
前記FEX-2ポリペプチドが哺乳動物から由来したことを特徴とする第1項に記載の方法。
【請求項3】
前記FEX-2ポリペプチドが配列番号1又は配列番号9で表示されるアミノ酸を含むことを特徴とする第1項に記載の方法。
【請求項4】
前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤がfas-1ドメインを含むポリペプチド、抗-FEX-2抗体、トリプルヘリックスフォーミングエージェント、リボザイム(ribozyme)、FEX-2 mRNA標的分子に対して相同性を有する二本鎖RNA及びFEX-2遺伝子のアンチセンス核酸からなるグループの中で選ばれることを特徴とする第1項に記載の方法。
【請求項5】
前記fas-1ドメインが哺乳動物から由来したことを特徴とする第4項に記載の方法。
【請求項6】
前記哺乳動物は人間、ラット及びマウスからなるグループの中で選ばれることを特徴とする第5項に記載の方法。
【請求項7】
前記fas-1ドメインはFEX-2、mpt70、mpt83、βig-h3、ペリオスチン及びFEX-1からなるグループの中で選ばれたタンパク質から由来したことを特徴とする第4項に記載の方法。
【請求項8】
前記fas-1ドメインを含むポリペプチドが配列番号1乃至配列番号66からなるグループの中で選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする第7項に記載の方法。
【請求項9】
前記fas-1ドメインを含むポリペプチドが配列番号1乃至配列番号14からなるグループの中で選ばれたアミノ酸配列を含むことを特徴とする第8項に記載の方法。
【請求項10】
前記抗-FEX-2抗体がポリクローナル又はモノクローナル抗体であることを特徴とする第4項に記載の方法。
【請求項11】
第10項において、前記モノクローナル抗体はハイブリドーマ(寄託番号KCTC10639BP)により生成されることを特徴とする方法。
【請求項12】
FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤をそれを必要とする固体(subject)に投与することを含むことを特徴とする炎症性疾患の予防又は治療方法。
【請求項13】
前記FEX-2ポリペプチドが哺乳動物から由来したことを特徴とする第12項に記載の方法。
【請求項14】
前記FEX-2ポリペプチドが配列番号1又は配列番号9で表示されるアミノ酸を含むことを特徴とする第12項に記載の方法。
【請求項15】
前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤がfas-1ドメインを含むポリペプチド、抗-FEX-2抗体、トリプルヘリックスフォーミングエージェント、リボザイム(ribozyme)、FEX-2 mRNA 標的分子に対して相同性を有する二本鎖RNA及びFEX-2遺伝子のアンチセンス核酸からなるグループの中で選ばれることを特徴とする第12項に記載の方法。
【請求項16】
前記fas-1ドメインが哺乳動物から由来したことを特徴とする第15項に記載の方法。
【請求項17】
前記哺乳動物は人間、ラット及びマウスからなるグループの中で選ばれることを特徴とする第16項に記載の方法。
【請求項18】
前記fas-1ドメインはFEX-2、mpt70、mpt83、βig-h3、ペリオスチン及びFEX-1からなるグループの中で選ばれたタンパク質から由来したことを特徴とする第15項に記載の方法。
【請求項19】
第18項において、前記fas-1ドメインを含むポリペプチドが配列番号1乃至配列番号66からなるグループの中で選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項20】
前記fas-1ドメインを含むポリペプチドが配列番号1乃至配列番号14からなるグループの中で選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする第19項に記載の方法。
【請求項21】
前記抗-FEX-2抗体がポリクローナル又はモノクローナル抗体であることを特徴とする第15項に記載の方法。
【請求項22】
前記モノクローナル抗体はハイブリドーマ(寄託番号KCTC10639BP)により生成されることを特徴とする第21項に記載の方法。
【請求項23】
前記炎症性疾患が炎症、炎症性腸疾患、糖尿性眼疾患、腹膜炎、骨髄炎、蜂巣炎、脳膜炎、脳炎、膵臓炎、外傷誘発ショック、気管支喘息、鼻炎、副鼻洞炎、中耳炎、肺炎、胃炎、腸炎、嚢疱性繊維症、卒中、気管支炎、細気管支炎、肝臓炎、腎臓炎、関節炎、通風、脊椎炎、ライター症候群、結節性多発動脈炎、過敏性血管炎、ルゲニック肉芽腫症、リウマチ性多発性筋肉痛、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着関節病症、仮性通風、非関節リウマチズム、静脈嚢炎、乾草炎、上顆炎(テニスエルボー)、神経病症状関節疾患(Charcot's joint)、出血性関節症(hemarthrosis)、ヘノフシェンライン紫斑病、鼻喉性骨関節病症、多重芯性細網組織球腫、スルコイロシス(surcoilosis)、血色素症、鎌状赤血球症及びその他の血色素症、高脂蛋白血症、低ガンマグロブリン血症、副甲状腺機能昂進症、末端巨大症、家族性地中海熱、ベハト病、全身性紅斑性ループス、再帰熱、乾癬、多発性硬化症、敗血症、敗血性ショック、急性呼吸困難症候群、多発性臓器不全、慢性閉鎖性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease)、急性肺損傷(acute lung injury)及び気管支肺形成障害(broncho-pulmonary dysplasia)のグループの中で選ばれることを特徴とする第12項に記載の方法。
【請求項24】
FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含むリンパ球-内皮細胞付着抑制用薬学的組成物。
【請求項25】
FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項26】
リンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤の製造の為のFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途。
【請求項27】
炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造の為のFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途。
【請求項28】
(a)FEX-2ポリペプチドを発現する細胞を試験製剤と共に、又は試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に、前培養した細胞又は試験製剤無しに前培養した細胞にリンパ球を添加して追加培養する段階;及び
(c)試験製剤と共に、前培養した細胞に対するリンパ球の付着程度を測定して試験製剤無しに、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階を含むリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項29】
(a)FEX-2 ポリペプチドを発現する細胞を試験製剤と共に又は、試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に前培養した細胞又は、試験製剤無しに前培養した細胞にリンパ球を添加して追加培養する段階;及び
(c)試験製剤と共に、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度を測定し、試験製剤無しに、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階;及び (d)前記(c)段階でリンパ球の付着を抑制するものと確認された試験製剤を炎症性疾患を有している動物に投与して治療効果を表すか否かを検査する段階を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法。
【請求項30】
(a)リンパ球を試験製剤と共に又は試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に、前培養したリンパ球又は試験製剤無しに前培養したリンパ球をFEX-2ポリペプチドを発現する細胞に追加培養する段階;及び
(c)試験製剤と共に、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度を測定し、試験製剤無しに、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階を含むリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項31】
(a)リンパ球と試験製剤と共に又は試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に、前培養したリンパ球又は試験製剤無しに前培養したリンパ球をFEX-2ポリペプチドを発現する細胞に添加して追加培養する段階;
(c)試験製剤と共に、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度を測定し、試験製剤無しに、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階;及び
(d)前記(c)段階でリンパ球の付着を抑制するものと確認された試験製剤を炎症性疾患を有している動物に投与して治療効果を表すか否かを検査する段階を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法。
【請求項1】
FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤をそれを必要とする固体(subject)に投与することを含むリンパ球の内皮細胞付着を抑制する方法。
【請求項2】
前記FEX-2ポリペプチドが哺乳動物から由来したことを特徴とする第1項に記載の方法。
【請求項3】
前記FEX-2ポリペプチドが配列番号1又は配列番号9で表示されるアミノ酸を含むことを特徴とする第1項に記載の方法。
【請求項4】
前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤がfas-1ドメインを含むポリペプチド、抗-FEX-2抗体、トリプルヘリックスフォーミングエージェント、リボザイム(ribozyme)、FEX-2 mRNA標的分子に対して相同性を有する二本鎖RNA及びFEX-2遺伝子のアンチセンス核酸からなるグループの中で選ばれることを特徴とする第1項に記載の方法。
【請求項5】
前記fas-1ドメインが哺乳動物から由来したことを特徴とする第4項に記載の方法。
【請求項6】
前記哺乳動物は人間、ラット及びマウスからなるグループの中で選ばれることを特徴とする第5項に記載の方法。
【請求項7】
前記fas-1ドメインはFEX-2、mpt70、mpt83、βig-h3、ペリオスチン及びFEX-1からなるグループの中で選ばれたタンパク質から由来したことを特徴とする第4項に記載の方法。
【請求項8】
前記fas-1ドメインを含むポリペプチドが配列番号1乃至配列番号66からなるグループの中で選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする第7項に記載の方法。
【請求項9】
前記fas-1ドメインを含むポリペプチドが配列番号1乃至配列番号14からなるグループの中で選ばれたアミノ酸配列を含むことを特徴とする第8項に記載の方法。
【請求項10】
前記抗-FEX-2抗体がポリクローナル又はモノクローナル抗体であることを特徴とする第4項に記載の方法。
【請求項11】
第10項において、前記モノクローナル抗体はハイブリドーマ(寄託番号KCTC10639BP)により生成されることを特徴とする方法。
【請求項12】
FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤をそれを必要とする固体(subject)に投与することを含むことを特徴とする炎症性疾患の予防又は治療方法。
【請求項13】
前記FEX-2ポリペプチドが哺乳動物から由来したことを特徴とする第12項に記載の方法。
【請求項14】
前記FEX-2ポリペプチドが配列番号1又は配列番号9で表示されるアミノ酸を含むことを特徴とする第12項に記載の方法。
【請求項15】
前記FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤がfas-1ドメインを含むポリペプチド、抗-FEX-2抗体、トリプルヘリックスフォーミングエージェント、リボザイム(ribozyme)、FEX-2 mRNA 標的分子に対して相同性を有する二本鎖RNA及びFEX-2遺伝子のアンチセンス核酸からなるグループの中で選ばれることを特徴とする第12項に記載の方法。
【請求項16】
前記fas-1ドメインが哺乳動物から由来したことを特徴とする第15項に記載の方法。
【請求項17】
前記哺乳動物は人間、ラット及びマウスからなるグループの中で選ばれることを特徴とする第16項に記載の方法。
【請求項18】
前記fas-1ドメインはFEX-2、mpt70、mpt83、βig-h3、ペリオスチン及びFEX-1からなるグループの中で選ばれたタンパク質から由来したことを特徴とする第15項に記載の方法。
【請求項19】
第18項において、前記fas-1ドメインを含むポリペプチドが配列番号1乃至配列番号66からなるグループの中で選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項20】
前記fas-1ドメインを含むポリペプチドが配列番号1乃至配列番号14からなるグループの中で選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする第19項に記載の方法。
【請求項21】
前記抗-FEX-2抗体がポリクローナル又はモノクローナル抗体であることを特徴とする第15項に記載の方法。
【請求項22】
前記モノクローナル抗体はハイブリドーマ(寄託番号KCTC10639BP)により生成されることを特徴とする第21項に記載の方法。
【請求項23】
前記炎症性疾患が炎症、炎症性腸疾患、糖尿性眼疾患、腹膜炎、骨髄炎、蜂巣炎、脳膜炎、脳炎、膵臓炎、外傷誘発ショック、気管支喘息、鼻炎、副鼻洞炎、中耳炎、肺炎、胃炎、腸炎、嚢疱性繊維症、卒中、気管支炎、細気管支炎、肝臓炎、腎臓炎、関節炎、通風、脊椎炎、ライター症候群、結節性多発動脈炎、過敏性血管炎、ルゲニック肉芽腫症、リウマチ性多発性筋肉痛、関節細胞動脈炎、カルシウム結晶沈着関節病症、仮性通風、非関節リウマチズム、静脈嚢炎、乾草炎、上顆炎(テニスエルボー)、神経病症状関節疾患(Charcot's joint)、出血性関節症(hemarthrosis)、ヘノフシェンライン紫斑病、鼻喉性骨関節病症、多重芯性細網組織球腫、スルコイロシス(surcoilosis)、血色素症、鎌状赤血球症及びその他の血色素症、高脂蛋白血症、低ガンマグロブリン血症、副甲状腺機能昂進症、末端巨大症、家族性地中海熱、ベハト病、全身性紅斑性ループス、再帰熱、乾癬、多発性硬化症、敗血症、敗血性ショック、急性呼吸困難症候群、多発性臓器不全、慢性閉鎖性肺疾患(chronic obstructive pulmonary disease)、急性肺損傷(acute lung injury)及び気管支肺形成障害(broncho-pulmonary dysplasia)のグループの中で選ばれることを特徴とする第12項に記載の方法。
【請求項24】
FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含むリンパ球-内皮細胞付着抑制用薬学的組成物。
【請求項25】
FEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項26】
リンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤の製造の為のFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途。
【請求項27】
炎症性疾患の予防又は治療用薬剤の製造の為のFEX-2ポリペプチドとリンパ球の付着阻害剤の用途。
【請求項28】
(a)FEX-2ポリペプチドを発現する細胞を試験製剤と共に、又は試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に、前培養した細胞又は試験製剤無しに前培養した細胞にリンパ球を添加して追加培養する段階;及び
(c)試験製剤と共に、前培養した細胞に対するリンパ球の付着程度を測定して試験製剤無しに、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階を含むリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項29】
(a)FEX-2 ポリペプチドを発現する細胞を試験製剤と共に又は、試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に前培養した細胞又は、試験製剤無しに前培養した細胞にリンパ球を添加して追加培養する段階;及び
(c)試験製剤と共に、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度を測定し、試験製剤無しに、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階;及び (d)前記(c)段階でリンパ球の付着を抑制するものと確認された試験製剤を炎症性疾患を有している動物に投与して治療効果を表すか否かを検査する段階を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法。
【請求項30】
(a)リンパ球を試験製剤と共に又は試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に、前培養したリンパ球又は試験製剤無しに前培養したリンパ球をFEX-2ポリペプチドを発現する細胞に追加培養する段階;及び
(c)試験製剤と共に、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度を測定し、試験製剤無しに、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階を含むリンパ球-内皮細胞付着を抑制する薬剤のスクリーニング方法。
【請求項31】
(a)リンパ球と試験製剤と共に又は試験製剤無しに前培養する段階;
(b)前記(a)段階で試験製剤と共に、前培養したリンパ球又は試験製剤無しに前培養したリンパ球をFEX-2ポリペプチドを発現する細胞に添加して追加培養する段階;
(c)試験製剤と共に、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度を測定し、試験製剤無しに、前培養された細胞に対するリンパ球の付着程度と比較して前記試験製剤がリンパ球の付着を抑制するか否かを確認する段階;及び
(d)前記(c)段階でリンパ球の付着を抑制するものと確認された試験製剤を炎症性疾患を有している動物に投与して治療効果を表すか否かを検査する段階を含む炎症性疾患の予防又は治療用薬剤のスクリーニング方法。
【図5】
【図6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【公表番号】特表2008−515966(P2008−515966A)
【公表日】平成20年5月15日(2008.5.15)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2007−536611(P2007−536611)
【出願日】平成17年10月12日(2005.10.12)
【国際出願番号】PCT/KR2005/003403
【国際公開番号】WO2006/080756
【国際公開日】平成18年8月3日(2006.8.3)
【出願人】(507119515)ギョングブク ナショナル ユニヴァシティ インダストリー−アカデミック コーポレーション フォンデション (2)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成20年5月15日(2008.5.15)
【国際特許分類】
【出願日】平成17年10月12日(2005.10.12)
【国際出願番号】PCT/KR2005/003403
【国際公開番号】WO2006/080756
【国際公開日】平成18年8月3日(2006.8.3)
【出願人】(507119515)ギョングブク ナショナル ユニヴァシティ インダストリー−アカデミック コーポレーション フォンデション (2)
【Fターム(参考)】
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