皮膚老化防止外用剤
【課題】 加齢に伴い皮膚機能が低下した肌の改善を目的とした老化防止用皮膚外用剤を見出すこと。
【解決手段】 グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物を有効成分とし、優れたコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、これらを配合した皮膚外用剤を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。
【解決手段】 グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物を有効成分とし、優れたコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、これらを配合した皮膚外用剤を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚老化防止用外用剤、肌荒れ防止用として用い得る、グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）抽出物を有効成分とする皮膚外用剤に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
老化皮膚では、線維芽細胞の活性低下に伴い、真皮マトリックス成分であるコラーゲン線維、エラスチン線維、酸性ムコ多糖の質的、量的な変化が起こる。コラーゲン線維は齢をとるにつれて減少するだけでなく、異常な老化架橋が形成されるため硬直化し、本来の弾力性に富む張りが失われる。エラスチン線維は変性崩壊し、変わってアミノ酸組成の異なるエラスチンが代償性に生産されて機能障害が進行する。またヒアルロン酸は齢をとるにつれて減少し、本来の機能である細胞間隙に水を保持したり、組織内にジェリー状のマトリックスを形成して細胞を保持したり、皮膚の潤滑性と柔軟性を保ち、外力（機械的障害）および細菌感染を防止する機能低下がおこる。その結果皮膚は柔軟性を失って、シワやたるみ、かさつき等の老化現象が発生する。生理的老化皮膚では、このような増殖能の低下、生理的機能低下が観察される。
【０００３】
生理的老化皮膚の一因として、線維芽細胞の活性低下に伴う、コラーゲン産生能およびヒアルロン酸産生能の低下があり、これらの増殖能を促進させることは、皮膚にハリや潤いを与え、皮膚の老化防止に重要である。現在まで、皮膚老化防止目的で、コラーゲン産生促進剤が開発されている（例えば、特許文献１参照）。またヒアルロン酸産生促進剤としては、オウバク、レモンおよびユズの抽出物、ゴレンシ、月桃の抽出物などが報告されている。（特許文献２参照）
【０００４】
またエラスチンの変性、破壊は、エラスチン分解酵素であるエラスターゼの過剰発現によって起こる。一方、アレルギー疾患に伴う種々の皮膚のトラブルは、加齢と共に皮膚の老化を助長する。従って、皮膚アレルギーを予防することは、皮膚老化を抑えることにつながる。抗アレルギー活性の指標の一つとしてヒアルロニダーゼの阻害活性については、広く知られている。エラスターゼ、ヒアルロニダーゼの活性を抑制することは、皮膚に弾力性やハリを与え、皮膚の老化防止に重要である。現在まで、これら皮膚老化を予防する目的でいくつかのエラスターゼ阻害剤が開発されてきた（例えば、特許文献３参照）。またヒアルロニターゼ活性阻害剤としては、栗又は琵琶の抽出物（例えば、特許文献４参照）を用いることが知られている。
【特許文献１】特開平１１−３３５２９３号公報、
【特許文献２】特開２００１−１５８７２８号公報、特開２００３−５５２４４号公報
【特許文献３】特開平９−８７１３６号公報、特開平９−９５４２０号公報、特開平１０−１７４６０号公報、特開平１０−２９９２５号公報、特開平１０−３６２８１号公報、特開平１０−１８２４１４号公報、特開平１１−１４７８３２号公報、特開平１１−１７１７５８号公報、特開平１１−２４６３３７号公報、特開平１１−２４６３８５号公報、特開平１１−２６３７２０号公報、特開平１１−３３５２２９号公報、特開２０００−５３５７８号公報、特開２０００−１１９１８９号公報、特開２０００−２４７８３０号公報、特開２００１−３９８２２号公報、特開２００１−５８９２０号公報
【特許文献２】特開平８−２１７６８８号公報、特開２００１−２５３８３０号公報、特開２０００−１７８１９６号公報、特開平９−６７２６６号公報、特開平６−２７９２５５号公報
【特許文献４】特開２００３−１３７７２６号公報、特開２００１−２５３８３０号公報、特開２０００−１７８１９６号公報、特開平９−６７２６６号公報、特開平８−２１７６８８号公報、特開平６−２７９２５５号公報、
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これまでのコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びエラスターゼ阻害剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤の効果は必ずしも十分でなく製品への配合では、有効な結果を得るに至っていない。本発明は、真皮層線維芽細胞における有効なコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、またエラスターゼ、ヒアルロニダーゼの酵素活性を抑え、皮膚の張り、弾力を回復・維持することにより、皮膚の老化を防止し、シワやタルミのない若々しい肌を保つ効果を有する抗老化剤、及びこれらの有効なコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、エラスターゼ阻害剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤を配合し、老化防止、あれ肌防止の皮膚外用剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、以上のような現状に鑑み、広く種々の物質についてコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用を調べた結果、グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物に優れたコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）抽出物に関しては、美白について検討されている（非特許文献１参照）。しかしグネモン抽出物のコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用に関する報告はこれまでになく、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、エラスターゼ阻害剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤としての皮膚外用剤、美容食品への応用も全く知られていない。
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７（３），６６３−６６５，２００３
【発明の効果】
【０００６】
本発明の皮膚老化防止剤は、優れたコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、これらを配合した皮膚外用剤は、皮膚の老化を防止、改善し、弾力のある、しわやたるみのない、若々しい肌の状態を維持することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明に係る皮膚老化防止外用剤について詳述する。本発明に係る老化防止用皮膚外用剤は、グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）を含有することを特徴とする。グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）はグネツム科に属する植物であり、アジアの熱帯、亜熱帯、南米、アフリカ南西海岸地域に分布する。本発明では、グネモンの葉、果実、果皮などの地上部を使用することができ、各部位を単独で或いは二種以上の部位を混合して使用することもできる。
【０００８】
本発明で用いられる抽出物の調製方法は特に限定されないが、例えば種々の溶媒を用い、低温から加温下において抽出する方法があげられる。
【０００９】
具体的に抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等の低級一価アルコール、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、ベンゼン、ヘキサン、ペンタン等の炭化水素、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジプロピルエーテル、アセトニトリル等のエーテル類が例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができる。
【００１０】
本発明で使用する抽出物は、そのまま用いてもよいが、必要に応じてろ過、濃縮してもよい。また、抽出物をカラムクロマト法、向流分配法等により、分画、精製して用いることもできる。
【００１１】
更に、上記のものを減圧乾燥又は凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製し、適宜製剤化して用いることもできる。
【００１２】
（グネモン抽出物の製造例１）
乾燥したグネモンの葉１００ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液３ｋｇを加え、６０℃にて８時間攪拌抽出を行い、冷後、ろ過し、抽出物Ａ約２８００ｇを得る。
【００１３】
（グネモン抽出物の製造例２）
グネモンの果実１００ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液３ｋｇを加え、６０℃にて８時間攪拌抽出を行い、冷後、ろ過し、抽出物Ｂ約２８００ｇを得る。
【００１４】
（グネモン抽出物の製造例３）
グネモンの果皮１００ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液３ｋｇを加え、６０℃にて８時間攪拌抽出を行い、冷後、ろ過し、抽出物Ｃ約２８００ｇを得る。
【００１５】
（グネモン抽出物の製造例４）
グネモン果実、果皮２００ｇに精製水３ｋｇを加え、８０℃にて５時間攪拌抽出する。冷後、ろ過し、抽出物Ｄ約２６００ｇを得る。更に、ろ過残渣に５０ｖｏｌ％エタノール３ｋｇを加え、６０℃にて５時間攪拌抽出する。冷後、ろ過し、抽出物Ｅ約２８００ｇを得る。更にろ過残渣に９５ｖｏｌ％エタノール３ｋｇを加え、５０℃にて５時間攪拌抽出する。冷後、ろ過し、抽出物Ｆ約２８００ｇを得る。
【００１６】
（グネモン抽出物の製造例５）
上記抽出物Ｄを減圧下約２００ｇまで濃縮した後、合成吸着体ダイヤイオンＨＰ−２０を充填したカラムにて処理し、水洗浄後の１０ｖｏｌ％エタノール溶液溶出液、１５ｖｏｌ％エタノール溶液溶出液及び２０ｖｏｌ％エタノール溶液溶出液を得る。各々の溶出液をそれぞれ５０ｇまで減圧濃縮し、エタノール５０ｇを加え抽出物Ｇ，Ｈ，Ｉとする。
【００１７】
（グネモン抽出物の製造例６）
グネモン果実、果皮２００ｇに３０ｖｏｌ％エタノール４ｋｇを加え、６０℃にて５時間攪拌抽出する。冷後、ろ過し、得られたろ液を２００ｇまで減圧濃縮する。濃縮液をカラムクロマト用オクタデジシルシリカ化シリカゲルを充填したカラムにて処理し、１０〜２０ｖｏｌ％エタノールにて溶出した画分を併せ、減圧濃縮後、減圧乾燥し粉末とした抽出物Ｊ約１５ｇを得る。
【００１８】
本発明の抽出物は、皮膚老化防止剤としてそのまま利用できるほか、皮膚外用剤にも配合できるが、その配合量は特に規定するものではない。配合する製品の種類、性状、品質、期待する効果の程度により異なるが、乾燥固形物に換算して好ましくは、０．００００１〜２．５重量％（以下、単に「％」で示す）、特に０．００１〜１．０％がより好ましい。抽出液を使用する場合は、溶質である乾燥固形分の含有量が上記範囲内であれば、その抽出液濃度等は何ら限定されるものではない。
【００１９】
本発明の皮膚老化防止剤を皮膚外用剤に用いる場合、上記成分に加えて、さらに必要により、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば界面活性剤、油分、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、紫外線防御剤、アルコール類、粉末成分、色剤、香料、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２０】
さらに、金属イオン封鎖剤、防腐抗菌剤、細胞賦活剤、皮脂分泌調整剤、消炎剤、収斂剤、美白剤、活性酸素抑制剤、抗アレルギー剤、老化防止剤等、さらに生理活性作用を有する植物抽出物、微生物抽出物及びこれらの抽出分画、精製物等も適宜配合することができる。
【００２１】
本発明の皮膚老化防止剤及びこれを配合してなる皮膚外用剤は、一般皮膚化粧料に限定されるものではなく、医薬品、医薬部外品、薬用化粧料等を包含するものである。本発明の皮膚外用剤の剤型は、可溶化系、乳化系、粉末分散系、粉末系等何れでもよく、用途も、化粧水、乳液、クリーム、パック等の基礎化粧料、ファンデーション等のメークアップ化粧料、シャンプー、リンス、石けん、ボディーシャンプーなどのトイレタリー製品、浴用剤等を問わない。
【００２２】
次に実施例をあげて説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
（試験例１）コラーゲン産生促進作用の測定
ヒト皮膚由来線維芽細胞を１０％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳと略記）を含むＭＥＭ培地にて調製し、９６穴プレートに２×１０４個／穴ずつ播種し、３７℃、５％炭酸ガス下、２４時間培養した。２４時間培養後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄後、試験試料を添加した無血清培地（５ｇ／ＬのＢＳＡ、０．０１ｍｇ／ＬのＥＧＦ、１ｍｇ／Ｌのインシュリン及び１ｍｇ／Ｌのハイドロコーチゾンを添加したＭＥＭ培地）にて、４８時間同条件にて培養した。培養後、培養上清のコラーゲン量をＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。同時に蛋白定量（Ｌｏｗｒｙ法）をおこない、単位蛋白当たりのコラーゲン産生量を算出して、試料を含有しない対照の細胞当たりのコラーゲン産生量を１００とした相対値にて表１に示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
（試験結果）
表１のごとく、グネモン抽出物は、高いコラーゲン産生促進作用があることが確認された。
【００２６】
（試験例２）ヒアルロン酸産生促進作用の測定
ヒト皮膚由来線維芽細胞を０．５％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳと略記）を含むＭＥＭ培地にて調製し、９６穴プレートに２×１０４個／穴ずつ播種し、３７℃、５％炭酸ガス下、２４時間培養した。２４時間培養後、試験試料を添加した０．５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、５日間同条件にて培養した。培養上清のヒアルロン酸量をＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。同時に線維芽細胞数を計測し、細胞当たりのヒアルロン酸産生量を算出して、試料を含有しないブランクの細胞当たりのヒアルロン酸産生量を１００とした相対値にて表２に示した。
【００２７】
【表２】
【００２８】
（試験結果）
表２のごとく、グネモン抽出物は、高いヒアルロン酸産生促進作用があることが確認された。
【００２９】
（試験例３）エラスターゼ阻害作用の測定
本発明者らは、線維芽細胞由来エラスターゼ酵素及び合成基質としてＳｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて評価した。
【００３０】
（試験方法）
ヒト正常皮膚線維芽細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地にて調製し、９６穴プレートに１×１０５個／穴ずつ播種し、３７℃、５％炭酸ガス下、２４時間培養した。培養後、培地を除去しＰＢＳ（−）にて洗浄した後、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳ（−）５０μＬを各穴に添加し３０分放置したものを酵素として用いた。また合成基質をＤＭＳＯにて溶解し１５ｍＭとし、１ｍＬずつマイクロチューブに分注し凍結保存した。使用前に０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５，０．５Ｍ ＮａＣｌ）を用いて希釈し６．０ｍＭとした。細胞懸濁液を酵素とした９６穴プレートに、それぞれ試験試料２５μＬ、合成基質５０μＬ、を加え、３７℃にて２時間インキュベーションした。その後、プレートリーダーで４０５ｎｍにて吸光度を測定した。
【００３１】
測定結果より次式によりエラスターゼ阻害率を算出した。
エラスターゼ阻害率（％）＝〔１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）〕×１００
Ａ：試料溶液添加、エラスターゼ添加時の吸光度
Ｂ：試料溶液添加、エラスターゼ無添加時の吸光度
Ｃ：試料無添加、エラスターゼ添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加、エラスターゼ無添加時の吸光度
ただし、各無添加のときには、それぞれ精製水、緩衝液を代わりに用いた。各阻害率を表３に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
（試験結果）
表３のごとく、グネモン抽出物は、高いエラスターゼ阻害作用があることが確認された。
【００３４】
（試験例４）ヒアルロニダーゼ活性阻害作用の測定
ヒアルロニダーゼは、結合組織に分布するヒアルロン酸の加水分解酵素であり、炎症時において活性化され、結合組織のマトリックスを破壊し、炎症系の細胞及び血管の透過性を高める役割を演じると考えられている。また起炎酵素として知られており、抗炎症剤や抗アレルギー剤により阻害されることも知られている。従って、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用は、抗アレルギー活性の一つとされている。
【００３５】
（試験方法）
陽性対照として、阻害活性が既に知られているクロモグリク酸ナトリウム（藤沢薬品工業製）を試験に用いた。試験方法は、Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法を応用する方法にて行なった。
【００３６】
試料の適当量を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５に調製）にて希釈した溶液０．２ｍＬにヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製，ＴｙｐｅＩＶ−Ｓ，最終酵素活性を４００ＮＦｕｎｉｔ／ｍＬ）０．１ｍＬを加え、３７℃にて２０分間で放置後、活性化剤としてｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０（Ｓｉｇｍａ社製）の酢酸緩衝液溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬを加え、更に３７℃にて２０分間放置する。これにヒアルロン酸カリウム（和光純薬工業製）溶液（最終濃度０．４ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを加え、３７℃にて４０分間放置する。次に、氷上にて０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．２ｍＬを加えて反応を停止させた後、ホウ酸溶液（ホウ酸４．９５ｇに水５０ｍＬを加え、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液にてｐＨ９．１に調製した後、水を加えて１００ｍＬとする）０．２ｍＬを加え、混和後沸騰水浴中にて３分間加熱し酵素を失活させる。次に氷上にて室温まで冷却し、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬（和光純薬工業製、１０ｇに１０Ｎ塩酸溶液１２．５ｍＬ、酢酸８７．５ｍＬを混合溶解し、使用直前に酢酸にて１０倍に希釈する）６ｍＬを加え、３７℃にて２０分間放置した後、５８５ｎｍにて吸光度を測定する。なお、試料溶液の代わりに酢酸緩衝液を入れたものを対照とし、各試料溶液、対照について酵素を入れないものブランクとし、次式により阻害活性率を求め、試料濃度を調整することにより５０％阻害活性濃度（ＩＣ５０）を求めた。また陽性試料として、クロモグリク酸ナトリウムを用いた。各阻害率を表４に示す。
阻害率（％）＝〔１−（試料溶液の吸光度−試料溶液ブランクの吸光度）／（対照溶液 の吸光度−対照溶液ブランクの吸光度）〕×１００
【００３７】
【表４】
【００３８】
（試験結果）
表４のごとく、グネモン抽出物は、高いヒアルロニダーゼ活性阻害作用があることが確認された。
【００３９】
以下にさらに、本発明の処方例を示す。
【００４０】
（実施例１）クリーム
下記成分（１）〜（１０）、別に下記成分（１１）〜（１５）を７５℃に加温溶解しそれぞれＡ液及びＢ液とする。Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１６）を加え、クリームを調製した。
（成分） （重量％）
（１）ホホバ油 ３．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）メチルポリシロキサン ０．５％
（４）ステアリルアルコール ０．５％
（５）セチルアルコール ０．５％
（６）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル１２．５％
（７）モノステアリン酸グリセリル ５．０％
（８）モノステアリン酸ジグリセリル １．５％
（９）モノステアリン酸デカグリセリル ３．０％
（１０）パラオキシ安息香酸プロピル ０．１％
（１１）キサンタンガム ０．１％
（１２）グネモン抽出物（抽出物Ｃ） ２．５％
（１３）１，３−ブチレングリコール ２．５％
（１４）パラオキシ安息香酸メチル ０．２％
（１５）精製水 ６６．０％
（１６）香料 ０．１％
【００４１】
（実施例２）化粧水
下記成分（５）〜（８）を混合溶解させＡ液とし、これとは別に下記成分（１）〜（４）及び（９）を混合溶解させてＢ液とし、Ａ液とＢ液を均等に混合し、化粧水を調整した。
（成分） （重量％）
（１）クインスシードエキス ８．０％
（２）グリセリン ３．０％
（３）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（４）グネモン抽出物（抽出物Ａ） １０．０％
（５）ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル １．２％
（６）エチルアルコール ３．０％
（７）パラオキシ安息香酸メチル ０．２％
（８）香料 ０．１％
（９）精製水 ６９．５％
【００４２】
（実施例３）乳液
下記成分（１）〜（１０）、別に（１１）〜（１４）及び（１６）を７５℃で加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１５）を加え、乳液を調製した。
（成分） （重量％）
（１）ホホバ油 １．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）ベヘニルアルコール １．０％
（４）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル ２．０％
（５）テトラグリセリン縮合シリノレイン酸 ０．１％
（６）モノオレイン酸プロピレングリコール ０．５％
（７）モノステアリン酸グリセリン １．０％
（８）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル １．０％
（９）モノミリスチン酸デカグリセリル ０．５％
（１０）パラオキシ安息香酸プロピル ０．１％
（１１）クインスシードエキス ５．０％
（１２）グネモン抽出物（抽出物Ｂ） ３．０％
（１３）１，３−ブチレングリコール ３．０％
（１４）パラオキシ安息香酸メチル ０．１％
（１５）香料 ０．１％
（１６）精製水 ７９．６％
【００４３】
（実施例４）クレンジングジェル
下記成分（１）〜（３）、別に（４）〜（６）及び（８）を７０℃で加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて均一になるまで攪拌する。攪拌しながら、５０℃まで冷却し、成分（７）を加え、クレンジングジェルを調製した。
（成分） （重量％）
（１）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル ２０．０％
（２）流動パラフィン ５９．７％
（３）パラオキシ安息香酸エステル ０．３％
（４）グネモン抽出物（抽出物Ｇ） ５．０％
（５）濃グリセリン ５．０％
（６）ソルビトール ５．０％
（７）香料 ０．１％
（８）精製水 ４．９％
【００４４】
（実施例６）パック剤
Ａ相、Ｂ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ａ相にＢ相を加えて可溶化し、次いでＣ相を加えて均一に溶解し、製する。
（成分） （重量％）
（Ａ相）ジプロピレングリコール ５．０％
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ５．０％
（Ｂ相）オリーブ油 ５．０％
酢酸トコフェノール ０．２％
パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（Ｃ相）亜硫酸水素ナトリウム ０．０３％
ポリビニルアルコール １３．０％
グネモン抽出物（抽出物Ｅ） １．０％
エタノール ７．０％
精製水 ６３．７７％
【００４５】
（実施例７）乳化型ファンデーション
下記成分（１）〜（６）を充分に混合粉砕した粉末部をＡとし、（７）（８）をＢ液、（９）〜（１２）及び（１４）をＣ液とする。Ｃ液を加熱攪拌後、Ａを添加しホモミキサー処理し、さらに過熱混合したＢ液を加えてホモミキサー処理する。攪拌しながら５０℃まで冷却し、（１３）を加え、さらに室温まで冷却して製する。
（成分） （重量％）
（１）二酸化チタン １０．３％
（２）セリサイト ５．４％
（３）カオリン ３．０％
（４）黄色酸化鉄 ０．７％
（５）ベンガラ ０．４％
（６）黒色酸化鉄 ０．２％
（７）デカメチルシクロペンタシロキサン １１．５％
（８）流動パラフィン ８．５％
（９）セスキオレイン酸ソルビタン ３．０％
（１０）グネモン抽出物（抽出物Ｆ） １．５％
（１１）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（１２）パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（１３）香料 ０．２％
（１４）精製水 ５０．１％
【００４６】
（実施例８）固形ファンデーション
下記成分（１）〜（７）をブレンダーで均一に混合し、これに（８）〜（１４）を加え、よく混練して製する。
（成分） （重量％）
（１）タルク ４１．９％
（２）カオリン １５．５％
（３）セリサイト １０．０％
（４）亜鉛華 ７．０％
（５）二酸化チタン ３．８％
（６）黄色酸化鉄 ２．９％
（７）ベンガラ ０．５％
（８）黒色酸化鉄 ０．２％
（９）スクワラン ８．０％
（１０）イソステアリン酸 ４．０％
（１１）モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン ３．０％
（１２）オクタン酸イソセチル ２．０％
（１３）グネモン抽出物（抽出物Ｈ） １．０％
（１４）パラオキシ安息香酸エステル ０．１％
（１５）香料 ０．１％
【００４７】
（実施例９）ヘアートニック
下記成分（５）に（１）〜（４）及び（７）を加え、攪拌溶解した後、（６）及び（８）を加えてさらに攪拌して製する。
（成分） （重量％）
（１）グリセリン ３．０％
（２）Ｌ−メントール ０．１％
（３）センブリエキス ２．０％
（４）グネモン抽出物（抽出物Ｉ） ５．０％
（５）エタノール ５３．０％
（６）香料 ０．２％
（８）精製水 ３６．７％
【００４８】
（実施例１０）シャンプー
下記成分を加温均一に混合し製する。
（成分） （重量％）
（１） Ｎ−ヤシ油脂肪酸グルタミン酸トリエタノール ２５．０％
アミン
（２）ラウリン酸ジエタノールアミド ５．０％
（３）ミリスチン酸カリウム ５．０％
（４）ジステアリン酸エチレングリコール ２．０％
（５）ポリエチレングリコール４００ １５．０％
（６）ホホバ油 １．０％
（７）グネモン抽出物（抽出物Ａ） ３．０％
（８）クロルキシレノール ０．１％
（９）ビタミンＥ ０．１％
（１０）パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（１１）香料 ０．３％
（１２）精製水 ４３．３％
【００４９】
（実施例１１）浴用剤
（成分） （重量％）
（１）乾燥硫酸ナトリウム ４０．０％
（２）炭酸水素ナトリウム ５７．５％
（３）オリーブ油 ０．２％
（４）グネモン抽出物（抽出物Ｂ） ０．１％
（５）軽質無水ケイ酸 ０．３％
（６）香料 １．７％
（７）黄色２０２号の（１） ０．２％
【００５０】
（試験例２）使用効果試験
本発明の皮膚外用剤を使用した場合の効果試験を行った。使用テストは、乾燥、シワ、つや・張りのない肌で悩む女性４０名（３０〜６０歳）をパネラーとして、毎日朝夕の２回、洗顔後に２０名には実施例３の乳液適量を３ケ月間塗布した。また対照として２０名には、グネモン抽出物を精製水に置き換えたものを使用した。評価方法は、下記の基準で行い、結果を表５に記載した。使用期間中に皮膚の異常を訴えた者はなかった。
【００５１】
「つや・張り」
有効 ：肌のつや・張りが増した
やや有効 ：肌のつや・張りがやや増した
無効または不明 ：使用前と変化なし、またはわからない
「肌あれ」
有効 ：肌あれが改善した
やや有効 ：肌あれがやや改善した
無効または不明 ：使用前と変化なし、またはわからない
【００５２】
【表５】
【００５３】
表５に示したように、皮膚の老化を防止、肌あれを改善し、弾力のあるシワやたるみのない、若々しい肌の状態を維持することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚老化防止用外用剤、肌荒れ防止用として用い得る、グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）抽出物を有効成分とする皮膚外用剤に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
老化皮膚では、線維芽細胞の活性低下に伴い、真皮マトリックス成分であるコラーゲン線維、エラスチン線維、酸性ムコ多糖の質的、量的な変化が起こる。コラーゲン線維は齢をとるにつれて減少するだけでなく、異常な老化架橋が形成されるため硬直化し、本来の弾力性に富む張りが失われる。エラスチン線維は変性崩壊し、変わってアミノ酸組成の異なるエラスチンが代償性に生産されて機能障害が進行する。またヒアルロン酸は齢をとるにつれて減少し、本来の機能である細胞間隙に水を保持したり、組織内にジェリー状のマトリックスを形成して細胞を保持したり、皮膚の潤滑性と柔軟性を保ち、外力（機械的障害）および細菌感染を防止する機能低下がおこる。その結果皮膚は柔軟性を失って、シワやたるみ、かさつき等の老化現象が発生する。生理的老化皮膚では、このような増殖能の低下、生理的機能低下が観察される。
【０００３】
生理的老化皮膚の一因として、線維芽細胞の活性低下に伴う、コラーゲン産生能およびヒアルロン酸産生能の低下があり、これらの増殖能を促進させることは、皮膚にハリや潤いを与え、皮膚の老化防止に重要である。現在まで、皮膚老化防止目的で、コラーゲン産生促進剤が開発されている（例えば、特許文献１参照）。またヒアルロン酸産生促進剤としては、オウバク、レモンおよびユズの抽出物、ゴレンシ、月桃の抽出物などが報告されている。（特許文献２参照）
【０００４】
またエラスチンの変性、破壊は、エラスチン分解酵素であるエラスターゼの過剰発現によって起こる。一方、アレルギー疾患に伴う種々の皮膚のトラブルは、加齢と共に皮膚の老化を助長する。従って、皮膚アレルギーを予防することは、皮膚老化を抑えることにつながる。抗アレルギー活性の指標の一つとしてヒアルロニダーゼの阻害活性については、広く知られている。エラスターゼ、ヒアルロニダーゼの活性を抑制することは、皮膚に弾力性やハリを与え、皮膚の老化防止に重要である。現在まで、これら皮膚老化を予防する目的でいくつかのエラスターゼ阻害剤が開発されてきた（例えば、特許文献３参照）。またヒアルロニターゼ活性阻害剤としては、栗又は琵琶の抽出物（例えば、特許文献４参照）を用いることが知られている。
【特許文献１】特開平１１−３３５２９３号公報、
【特許文献２】特開２００１−１５８７２８号公報、特開２００３−５５２４４号公報
【特許文献３】特開平９−８７１３６号公報、特開平９−９５４２０号公報、特開平１０−１７４６０号公報、特開平１０−２９９２５号公報、特開平１０−３６２８１号公報、特開平１０−１８２４１４号公報、特開平１１−１４７８３２号公報、特開平１１−１７１７５８号公報、特開平１１−２４６３３７号公報、特開平１１−２４６３８５号公報、特開平１１−２６３７２０号公報、特開平１１−３３５２２９号公報、特開２０００−５３５７８号公報、特開２０００−１１９１８９号公報、特開２０００−２４７８３０号公報、特開２００１−３９８２２号公報、特開２００１−５８９２０号公報
【特許文献２】特開平８−２１７６８８号公報、特開２００１−２５３８３０号公報、特開２０００−１７８１９６号公報、特開平９−６７２６６号公報、特開平６−２７９２５５号公報
【特許文献４】特開２００３−１３７７２６号公報、特開２００１−２５３８３０号公報、特開２０００−１７８１９６号公報、特開平９−６７２６６号公報、特開平８−２１７６８８号公報、特開平６−２７９２５５号公報、
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これまでのコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤及びエラスターゼ阻害剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤の効果は必ずしも十分でなく製品への配合では、有効な結果を得るに至っていない。本発明は、真皮層線維芽細胞における有効なコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、またエラスターゼ、ヒアルロニダーゼの酵素活性を抑え、皮膚の張り、弾力を回復・維持することにより、皮膚の老化を防止し、シワやタルミのない若々しい肌を保つ効果を有する抗老化剤、及びこれらの有効なコラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、エラスターゼ阻害剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤を配合し、老化防止、あれ肌防止の皮膚外用剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、以上のような現状に鑑み、広く種々の物質についてコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用を調べた結果、グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物に優れたコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）抽出物に関しては、美白について検討されている（非特許文献１参照）。しかしグネモン抽出物のコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用に関する報告はこれまでになく、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、エラスターゼ阻害剤、ヒアルロニダーゼ阻害剤としての皮膚外用剤、美容食品への応用も全く知られていない。
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７（３），６６３−６６５，２００３
【発明の効果】
【０００６】
本発明の皮膚老化防止剤は、優れたコラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、エラスターゼ阻害作用、ヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、これらを配合した皮膚外用剤は、皮膚の老化を防止、改善し、弾力のある、しわやたるみのない、若々しい肌の状態を維持することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明に係る皮膚老化防止外用剤について詳述する。本発明に係る老化防止用皮膚外用剤は、グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）を含有することを特徴とする。グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）はグネツム科に属する植物であり、アジアの熱帯、亜熱帯、南米、アフリカ南西海岸地域に分布する。本発明では、グネモンの葉、果実、果皮などの地上部を使用することができ、各部位を単独で或いは二種以上の部位を混合して使用することもできる。
【０００８】
本発明で用いられる抽出物の調製方法は特に限定されないが、例えば種々の溶媒を用い、低温から加温下において抽出する方法があげられる。
【０００９】
具体的に抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等の低級一価アルコール、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール、酢酸エチル等の低級アルキルエステル、ベンゼン、ヘキサン、ペンタン等の炭化水素、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジプロピルエーテル、アセトニトリル等のエーテル類が例示され、これらの一種又は二種以上の混合溶媒を用いることができる。
【００１０】
本発明で使用する抽出物は、そのまま用いてもよいが、必要に応じてろ過、濃縮してもよい。また、抽出物をカラムクロマト法、向流分配法等により、分画、精製して用いることもできる。
【００１１】
更に、上記のものを減圧乾燥又は凍結乾燥した後、粉末又はペースト状に調製し、適宜製剤化して用いることもできる。
【００１２】
（グネモン抽出物の製造例１）
乾燥したグネモンの葉１００ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液３ｋｇを加え、６０℃にて８時間攪拌抽出を行い、冷後、ろ過し、抽出物Ａ約２８００ｇを得る。
【００１３】
（グネモン抽出物の製造例２）
グネモンの果実１００ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液３ｋｇを加え、６０℃にて８時間攪拌抽出を行い、冷後、ろ過し、抽出物Ｂ約２８００ｇを得る。
【００１４】
（グネモン抽出物の製造例３）
グネモンの果皮１００ｇに５０ｖｏｌ％エタノール溶液３ｋｇを加え、６０℃にて８時間攪拌抽出を行い、冷後、ろ過し、抽出物Ｃ約２８００ｇを得る。
【００１５】
（グネモン抽出物の製造例４）
グネモン果実、果皮２００ｇに精製水３ｋｇを加え、８０℃にて５時間攪拌抽出する。冷後、ろ過し、抽出物Ｄ約２６００ｇを得る。更に、ろ過残渣に５０ｖｏｌ％エタノール３ｋｇを加え、６０℃にて５時間攪拌抽出する。冷後、ろ過し、抽出物Ｅ約２８００ｇを得る。更にろ過残渣に９５ｖｏｌ％エタノール３ｋｇを加え、５０℃にて５時間攪拌抽出する。冷後、ろ過し、抽出物Ｆ約２８００ｇを得る。
【００１６】
（グネモン抽出物の製造例５）
上記抽出物Ｄを減圧下約２００ｇまで濃縮した後、合成吸着体ダイヤイオンＨＰ−２０を充填したカラムにて処理し、水洗浄後の１０ｖｏｌ％エタノール溶液溶出液、１５ｖｏｌ％エタノール溶液溶出液及び２０ｖｏｌ％エタノール溶液溶出液を得る。各々の溶出液をそれぞれ５０ｇまで減圧濃縮し、エタノール５０ｇを加え抽出物Ｇ，Ｈ，Ｉとする。
【００１７】
（グネモン抽出物の製造例６）
グネモン果実、果皮２００ｇに３０ｖｏｌ％エタノール４ｋｇを加え、６０℃にて５時間攪拌抽出する。冷後、ろ過し、得られたろ液を２００ｇまで減圧濃縮する。濃縮液をカラムクロマト用オクタデジシルシリカ化シリカゲルを充填したカラムにて処理し、１０〜２０ｖｏｌ％エタノールにて溶出した画分を併せ、減圧濃縮後、減圧乾燥し粉末とした抽出物Ｊ約１５ｇを得る。
【００１８】
本発明の抽出物は、皮膚老化防止剤としてそのまま利用できるほか、皮膚外用剤にも配合できるが、その配合量は特に規定するものではない。配合する製品の種類、性状、品質、期待する効果の程度により異なるが、乾燥固形物に換算して好ましくは、０．００００１〜２．５重量％（以下、単に「％」で示す）、特に０．００１〜１．０％がより好ましい。抽出液を使用する場合は、溶質である乾燥固形分の含有量が上記範囲内であれば、その抽出液濃度等は何ら限定されるものではない。
【００１９】
本発明の皮膚老化防止剤を皮膚外用剤に用いる場合、上記成分に加えて、さらに必要により、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常化粧品、医薬部外品、医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば界面活性剤、油分、保湿剤、増粘剤、酸化防止剤、紫外線防御剤、アルコール類、粉末成分、色剤、香料、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。
【００２０】
さらに、金属イオン封鎖剤、防腐抗菌剤、細胞賦活剤、皮脂分泌調整剤、消炎剤、収斂剤、美白剤、活性酸素抑制剤、抗アレルギー剤、老化防止剤等、さらに生理活性作用を有する植物抽出物、微生物抽出物及びこれらの抽出分画、精製物等も適宜配合することができる。
【００２１】
本発明の皮膚老化防止剤及びこれを配合してなる皮膚外用剤は、一般皮膚化粧料に限定されるものではなく、医薬品、医薬部外品、薬用化粧料等を包含するものである。本発明の皮膚外用剤の剤型は、可溶化系、乳化系、粉末分散系、粉末系等何れでもよく、用途も、化粧水、乳液、クリーム、パック等の基礎化粧料、ファンデーション等のメークアップ化粧料、シャンプー、リンス、石けん、ボディーシャンプーなどのトイレタリー製品、浴用剤等を問わない。
【００２２】
次に実施例をあげて説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
（試験例１）コラーゲン産生促進作用の測定
ヒト皮膚由来線維芽細胞を１０％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳと略記）を含むＭＥＭ培地にて調製し、９６穴プレートに２×１０４個／穴ずつ播種し、３７℃、５％炭酸ガス下、２４時間培養した。２４時間培養後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄後、試験試料を添加した無血清培地（５ｇ／ＬのＢＳＡ、０．０１ｍｇ／ＬのＥＧＦ、１ｍｇ／Ｌのインシュリン及び１ｍｇ／Ｌのハイドロコーチゾンを添加したＭＥＭ培地）にて、４８時間同条件にて培養した。培養後、培養上清のコラーゲン量をＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。同時に蛋白定量（Ｌｏｗｒｙ法）をおこない、単位蛋白当たりのコラーゲン産生量を算出して、試料を含有しない対照の細胞当たりのコラーゲン産生量を１００とした相対値にて表１に示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
（試験結果）
表１のごとく、グネモン抽出物は、高いコラーゲン産生促進作用があることが確認された。
【００２６】
（試験例２）ヒアルロン酸産生促進作用の測定
ヒト皮膚由来線維芽細胞を０．５％ウシ胎児血清（以下ＦＢＳと略記）を含むＭＥＭ培地にて調製し、９６穴プレートに２×１０４個／穴ずつ播種し、３７℃、５％炭酸ガス下、２４時間培養した。２４時間培養後、試験試料を添加した０．５％ＦＢＳを含むＭＥＭ培地にて、５日間同条件にて培養した。培養上清のヒアルロン酸量をＥｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。同時に線維芽細胞数を計測し、細胞当たりのヒアルロン酸産生量を算出して、試料を含有しないブランクの細胞当たりのヒアルロン酸産生量を１００とした相対値にて表２に示した。
【００２７】
【表２】
【００２８】
（試験結果）
表２のごとく、グネモン抽出物は、高いヒアルロン酸産生促進作用があることが確認された。
【００２９】
（試験例３）エラスターゼ阻害作用の測定
本発明者らは、線維芽細胞由来エラスターゼ酵素及び合成基質としてＳｕｃｃｉｎｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて評価した。
【００３０】
（試験方法）
ヒト正常皮膚線維芽細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地にて調製し、９６穴プレートに１×１０５個／穴ずつ播種し、３７℃、５％炭酸ガス下、２４時間培養した。培養後、培地を除去しＰＢＳ（−）にて洗浄した後、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳ（−）５０μＬを各穴に添加し３０分放置したものを酵素として用いた。また合成基質をＤＭＳＯにて溶解し１５ｍＭとし、１ｍＬずつマイクロチューブに分注し凍結保存した。使用前に０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５，０．５Ｍ ＮａＣｌ）を用いて希釈し６．０ｍＭとした。細胞懸濁液を酵素とした９６穴プレートに、それぞれ試験試料２５μＬ、合成基質５０μＬ、を加え、３７℃にて２時間インキュベーションした。その後、プレートリーダーで４０５ｎｍにて吸光度を測定した。
【００３１】
測定結果より次式によりエラスターゼ阻害率を算出した。
エラスターゼ阻害率（％）＝〔１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）〕×１００
Ａ：試料溶液添加、エラスターゼ添加時の吸光度
Ｂ：試料溶液添加、エラスターゼ無添加時の吸光度
Ｃ：試料無添加、エラスターゼ添加時の吸光度
Ｄ：試料無添加、エラスターゼ無添加時の吸光度
ただし、各無添加のときには、それぞれ精製水、緩衝液を代わりに用いた。各阻害率を表３に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】
（試験結果）
表３のごとく、グネモン抽出物は、高いエラスターゼ阻害作用があることが確認された。
【００３４】
（試験例４）ヒアルロニダーゼ活性阻害作用の測定
ヒアルロニダーゼは、結合組織に分布するヒアルロン酸の加水分解酵素であり、炎症時において活性化され、結合組織のマトリックスを破壊し、炎症系の細胞及び血管の透過性を高める役割を演じると考えられている。また起炎酵素として知られており、抗炎症剤や抗アレルギー剤により阻害されることも知られている。従って、ヒアルロニダーゼ活性阻害作用は、抗アレルギー活性の一つとされている。
【００３５】
（試験方法）
陽性対照として、阻害活性が既に知られているクロモグリク酸ナトリウム（藤沢薬品工業製）を試験に用いた。試験方法は、Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法を応用する方法にて行なった。
【００３６】
試料の適当量を０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．５に調製）にて希釈した溶液０．２ｍＬにヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製，ＴｙｐｅＩＶ−Ｓ，最終酵素活性を４００ＮＦｕｎｉｔ／ｍＬ）０．１ｍＬを加え、３７℃にて２０分間で放置後、活性化剤としてｃｏｍｐｏｕｎｄ４８／８０（Ｓｉｇｍａ社製）の酢酸緩衝液溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）０．２ｍＬを加え、更に３７℃にて２０分間放置する。これにヒアルロン酸カリウム（和光純薬工業製）溶液（最終濃度０．４ｍｇ／ｍＬ）０．５ｍＬを加え、３７℃にて４０分間放置する。次に、氷上にて０．４Ｎ水酸化ナトリウム溶液０．２ｍＬを加えて反応を停止させた後、ホウ酸溶液（ホウ酸４．９５ｇに水５０ｍＬを加え、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液にてｐＨ９．１に調製した後、水を加えて１００ｍＬとする）０．２ｍＬを加え、混和後沸騰水浴中にて３分間加熱し酵素を失活させる。次に氷上にて室温まで冷却し、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド試薬（和光純薬工業製、１０ｇに１０Ｎ塩酸溶液１２．５ｍＬ、酢酸８７．５ｍＬを混合溶解し、使用直前に酢酸にて１０倍に希釈する）６ｍＬを加え、３７℃にて２０分間放置した後、５８５ｎｍにて吸光度を測定する。なお、試料溶液の代わりに酢酸緩衝液を入れたものを対照とし、各試料溶液、対照について酵素を入れないものブランクとし、次式により阻害活性率を求め、試料濃度を調整することにより５０％阻害活性濃度（ＩＣ５０）を求めた。また陽性試料として、クロモグリク酸ナトリウムを用いた。各阻害率を表４に示す。
阻害率（％）＝〔１−（試料溶液の吸光度−試料溶液ブランクの吸光度）／（対照溶液 の吸光度−対照溶液ブランクの吸光度）〕×１００
【００３７】
【表４】
【００３８】
（試験結果）
表４のごとく、グネモン抽出物は、高いヒアルロニダーゼ活性阻害作用があることが確認された。
【００３９】
以下にさらに、本発明の処方例を示す。
【００４０】
（実施例１）クリーム
下記成分（１）〜（１０）、別に下記成分（１１）〜（１５）を７５℃に加温溶解しそれぞれＡ液及びＢ液とする。Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１６）を加え、クリームを調製した。
（成分） （重量％）
（１）ホホバ油 ３．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）メチルポリシロキサン ０．５％
（４）ステアリルアルコール ０．５％
（５）セチルアルコール ０．５％
（６）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル１２．５％
（７）モノステアリン酸グリセリル ５．０％
（８）モノステアリン酸ジグリセリル １．５％
（９）モノステアリン酸デカグリセリル ３．０％
（１０）パラオキシ安息香酸プロピル ０．１％
（１１）キサンタンガム ０．１％
（１２）グネモン抽出物（抽出物Ｃ） ２．５％
（１３）１，３−ブチレングリコール ２．５％
（１４）パラオキシ安息香酸メチル ０．２％
（１５）精製水 ６６．０％
（１６）香料 ０．１％
【００４１】
（実施例２）化粧水
下記成分（５）〜（８）を混合溶解させＡ液とし、これとは別に下記成分（１）〜（４）及び（９）を混合溶解させてＢ液とし、Ａ液とＢ液を均等に混合し、化粧水を調整した。
（成分） （重量％）
（１）クインスシードエキス ８．０％
（２）グリセリン ３．０％
（３）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（４）グネモン抽出物（抽出物Ａ） １０．０％
（５）ポリオキシエチレンソルビタンラウリン酸エステル １．２％
（６）エチルアルコール ３．０％
（７）パラオキシ安息香酸メチル ０．２％
（８）香料 ０．１％
（９）精製水 ６９．５％
【００４２】
（実施例３）乳液
下記成分（１）〜（１０）、別に（１１）〜（１４）及び（１６）を７５℃で加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて乳化し、攪拌しながら５０℃まで冷却し、成分（１５）を加え、乳液を調製した。
（成分） （重量％）
（１）ホホバ油 １．０％
（２）スクワラン ２．０％
（３）ベヘニルアルコール １．０％
（４）トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル ２．０％
（５）テトラグリセリン縮合シリノレイン酸 ０．１％
（６）モノオレイン酸プロピレングリコール ０．５％
（７）モノステアリン酸グリセリン １．０％
（８）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル １．０％
（９）モノミリスチン酸デカグリセリル ０．５％
（１０）パラオキシ安息香酸プロピル ０．１％
（１１）クインスシードエキス ５．０％
（１２）グネモン抽出物（抽出物Ｂ） ３．０％
（１３）１，３−ブチレングリコール ３．０％
（１４）パラオキシ安息香酸メチル ０．１％
（１５）香料 ０．１％
（１６）精製水 ７９．６％
【００４３】
（実施例４）クレンジングジェル
下記成分（１）〜（３）、別に（４）〜（６）及び（８）を７０℃で加熱溶解させてそれぞれＡ液及びＢ液とし、Ａ液にＢ液を加えて均一になるまで攪拌する。攪拌しながら、５０℃まで冷却し、成分（７）を加え、クレンジングジェルを調製した。
（成分） （重量％）
（１）モノミリスチン酸ヘキサグリセリル ２０．０％
（２）流動パラフィン ５９．７％
（３）パラオキシ安息香酸エステル ０．３％
（４）グネモン抽出物（抽出物Ｇ） ５．０％
（５）濃グリセリン ５．０％
（６）ソルビトール ５．０％
（７）香料 ０．１％
（８）精製水 ４．９％
【００４４】
（実施例６）パック剤
Ａ相、Ｂ相、Ｃ相をそれぞれ均一に溶解し、Ａ相にＢ相を加えて可溶化し、次いでＣ相を加えて均一に溶解し、製する。
（成分） （重量％）
（Ａ相）ジプロピレングリコール ５．０％
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ５．０％
（Ｂ相）オリーブ油 ５．０％
酢酸トコフェノール ０．２％
パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（Ｃ相）亜硫酸水素ナトリウム ０．０３％
ポリビニルアルコール １３．０％
グネモン抽出物（抽出物Ｅ） １．０％
エタノール ７．０％
精製水 ６３．７７％
【００４５】
（実施例７）乳化型ファンデーション
下記成分（１）〜（６）を充分に混合粉砕した粉末部をＡとし、（７）（８）をＢ液、（９）〜（１２）及び（１４）をＣ液とする。Ｃ液を加熱攪拌後、Ａを添加しホモミキサー処理し、さらに過熱混合したＢ液を加えてホモミキサー処理する。攪拌しながら５０℃まで冷却し、（１３）を加え、さらに室温まで冷却して製する。
（成分） （重量％）
（１）二酸化チタン １０．３％
（２）セリサイト ５．４％
（３）カオリン ３．０％
（４）黄色酸化鉄 ０．７％
（５）ベンガラ ０．４％
（６）黒色酸化鉄 ０．２％
（７）デカメチルシクロペンタシロキサン １１．５％
（８）流動パラフィン ８．５％
（９）セスキオレイン酸ソルビタン ３．０％
（１０）グネモン抽出物（抽出物Ｆ） １．５％
（１１）１，３−ブチレングリコール ５．０％
（１２）パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（１３）香料 ０．２％
（１４）精製水 ５０．１％
【００４６】
（実施例８）固形ファンデーション
下記成分（１）〜（７）をブレンダーで均一に混合し、これに（８）〜（１４）を加え、よく混練して製する。
（成分） （重量％）
（１）タルク ４１．９％
（２）カオリン １５．５％
（３）セリサイト １０．０％
（４）亜鉛華 ７．０％
（５）二酸化チタン ３．８％
（６）黄色酸化鉄 ２．９％
（７）ベンガラ ０．５％
（８）黒色酸化鉄 ０．２％
（９）スクワラン ８．０％
（１０）イソステアリン酸 ４．０％
（１１）モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン ３．０％
（１２）オクタン酸イソセチル ２．０％
（１３）グネモン抽出物（抽出物Ｈ） １．０％
（１４）パラオキシ安息香酸エステル ０．１％
（１５）香料 ０．１％
【００４７】
（実施例９）ヘアートニック
下記成分（５）に（１）〜（４）及び（７）を加え、攪拌溶解した後、（６）及び（８）を加えてさらに攪拌して製する。
（成分） （重量％）
（１）グリセリン ３．０％
（２）Ｌ−メントール ０．１％
（３）センブリエキス ２．０％
（４）グネモン抽出物（抽出物Ｉ） ５．０％
（５）エタノール ５３．０％
（６）香料 ０．２％
（８）精製水 ３６．７％
【００４８】
（実施例１０）シャンプー
下記成分を加温均一に混合し製する。
（成分） （重量％）
（１） Ｎ−ヤシ油脂肪酸グルタミン酸トリエタノール ２５．０％
アミン
（２）ラウリン酸ジエタノールアミド ５．０％
（３）ミリスチン酸カリウム ５．０％
（４）ジステアリン酸エチレングリコール ２．０％
（５）ポリエチレングリコール４００ １５．０％
（６）ホホバ油 １．０％
（７）グネモン抽出物（抽出物Ａ） ３．０％
（８）クロルキシレノール ０．１％
（９）ビタミンＥ ０．１％
（１０）パラオキシ安息香酸エステル ０．２％
（１１）香料 ０．３％
（１２）精製水 ４３．３％
【００４９】
（実施例１１）浴用剤
（成分） （重量％）
（１）乾燥硫酸ナトリウム ４０．０％
（２）炭酸水素ナトリウム ５７．５％
（３）オリーブ油 ０．２％
（４）グネモン抽出物（抽出物Ｂ） ０．１％
（５）軽質無水ケイ酸 ０．３％
（６）香料 １．７％
（７）黄色２０２号の（１） ０．２％
【００５０】
（試験例２）使用効果試験
本発明の皮膚外用剤を使用した場合の効果試験を行った。使用テストは、乾燥、シワ、つや・張りのない肌で悩む女性４０名（３０〜６０歳）をパネラーとして、毎日朝夕の２回、洗顔後に２０名には実施例３の乳液適量を３ケ月間塗布した。また対照として２０名には、グネモン抽出物を精製水に置き換えたものを使用した。評価方法は、下記の基準で行い、結果を表５に記載した。使用期間中に皮膚の異常を訴えた者はなかった。
【００５１】
「つや・張り」
有効 ：肌のつや・張りが増した
やや有効 ：肌のつや・張りがやや増した
無効または不明 ：使用前と変化なし、またはわからない
「肌あれ」
有効 ：肌あれが改善した
やや有効 ：肌あれがやや改善した
無効または不明 ：使用前と変化なし、またはわからない
【００５２】
【表５】
【００５３】
表５に示したように、皮膚の老化を防止、肌あれを改善し、弾力のあるシワやたるみのない、若々しい肌の状態を維持することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グネツム科グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
請求項１のコラーゲン産生促進剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項３】
グネツム科グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項４】
請求項３のヒアルロン酸産生促進剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項５】
グネツム科グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物を有効成分とするエラスターゼ阻害剤。
【請求項６】
請求項５のエラスターゼ阻害剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項７】
グネツム科グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項８】
請求項７のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項１】
グネツム科グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物を有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項２】
請求項１のコラーゲン産生促進剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項３】
グネツム科グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物を有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項４】
請求項３のヒアルロン酸産生促進剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項５】
グネツム科グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物を有効成分とするエラスターゼ阻害剤。
【請求項６】
請求項５のエラスターゼ阻害剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項７】
グネツム科グネモン（Ｇｕｅｔｕｍ ｇｎｅｍｏｎ）の溶媒抽出物を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項８】
請求項７のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有することを特徴とする皮膚外用剤。
【公開番号】特開２００６−１６９２２５（Ｐ２００６−１６９２２５Ａ）
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３８２５５０（Ｐ２００４−３８２５５０）
【出願日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５９９０００２１２）香栄興業株式会社 (33)
【出願人】（３０００４１５２７）有限会社アクセス・ジェイピイ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月１６日（２００４．１２．１６）
【出願人】（５９９０００２１２）香栄興業株式会社 (33)
【出願人】（３０００４１５２７）有限会社アクセス・ジェイピイ (1)
【Ｆターム（参考）】
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