Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ誘導剤
【課題】本発明は、ポリフェノール誘導体が癌細胞に対してアポトーシスを誘導することを明らかにした上で、ポリフェノール誘導体を新規な医薬品および健康補助食品として提供するものである。
【解決手段】ポリフェノール誘導体のヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対するアポトーシス誘導を調べた結果、ポリフェノール誘導体がアポトーシスを誘導することを見出し、癌細胞に対してアポトーシスを誘導できることを見出した。ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対してもアポトーシスを誘導剤できることを見出した。
【解決手段】ポリフェノール誘導体のヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対するアポトーシス誘導を調べた結果、ポリフェノール誘導体がアポトーシスを誘導することを見出し、癌細胞に対してアポトーシスを誘導できることを見出した。ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対してもアポトーシスを誘導剤できることを見出した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）誘導体を有効成分として含有する、癌細胞に対するアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導剤に関する。すなわち、ヒトまたは動物の癌細胞内にあるプロテアーゼ、特に、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）が不活性化されることにより増殖する癌細胞に対するアポトーシスの誘導に有効であって、ヒトまたは動物の癌細胞内のカスパーゼを活性化することによりアポトーシスを誘導し、癌細胞を死滅させることに関する。より詳しくは、茶の抽出物であって、環式炭化水素の環と６員芳香環とを含有する環式炭化水素の中の６員環をもつものに関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、細胞内の核の破壊を伴う細胞死である。癌細胞におけるアポトーシスの死分子機構として、カルシウム経路、死のシグナル経路、セラミド経路、ミトコンドリア経路、及びｐ５３アポトーシス経路の５つの経路を介して誘導される分子機構が知られている（非特許文献１、橋本嘉幸：新アポトーシスの分子医学、羊土社、２００１年４月：１０−５８）。
【０００３】
カルシウム経路では、アポトーシス誘導刺激によりグルココルチコイドがマウスの胸腺細胞の細胞外膜に存在するグルココルチコイド受容体に作用して細胞内のアイピー３アール３（ＩＰ３Ｒ３）が活性化され、引き続き細胞内のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度が上昇し、プロテアーゼであるカルパインを活性化する。カルパインは、カスパーゼ１／インターロイキン−１β−変換酵素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、ＩＣＥ）、カスパーゼ３を順次活性化、更に、カスパーゼ３はエンドヌクレアーゼを活性化し、活性化エンドヌクレアーゼの作用により核ＤＮＡが切断を受け、結果としてアポトーシスを誘導する（非特許文献１）。
【０００４】
死のシグナル経路では、アポトーシス誘導刺激により腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）、ファスリガンド（ＦＳ−７−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＦａｓＬ）などの細胞外タンパク質分子が、胸腺細胞やリンパ球の細胞外膜に存在するそれぞれの受容体に接触する。これらの受容体から細胞内のアダプター分子、即ち、ドメインに会合するタンパク分子、トラッド（ＴＮＦＲ１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＴＲＡＤＤ）並びにファッド（ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＦＡＤＤ）を介してカスパーゼ８を活性化する。活性型カスパーゼ８はカスパーゼ１／ＩＣＥを活性化、更に、活性型カスパーゼ１／ＩＣＥがカスパーゼ３を順次活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献１）。
【０００５】
セラミド経路では、アポトーシス誘導刺激により細胞間の情報伝達を司るスフィンゴ脂質が細胞内に入り、スフィンゴミエリナーゼの酵素分解を受け、細胞内セラミドが増加する。これがサップキナーゼ／ジュン−Ｎ末端キナーゼ（ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ／ｃ−ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ）を活性化し、更に、活性型ＳＡＰＫ／ＪＮＫはカスパーゼ１／ＩＥＣを活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献１）。
【０００６】
ミトコンドリア経路では、アポトーシス誘導刺激によりミトコンドリア膜上に存在するタンパク質であるアポトーシス促進因子のバックス（Ｂｃｌ−２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｂａｘ）が活性化され、アント（ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ、ＡＮＴ）とピーティーピーシー（ｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｔｙ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＰＴＰＣ）のタンパク質と会合後、ミトコンドリア膜に細孔を開ける。ミトコンドリア内から細孔を通してチトクロームｃが細胞質内に放出され、チトクロームｃはアポトーシス誘導因子−１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−１、Ａｐａｆ−１）を活性化、活性化Ａｐａｆ−１はカスパーゼ９を活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献１）。
【０００７】
ｐ５３アポトーシス経路について、抗癌剤を用いた場合では、癌抑制遺伝子であるｐ５３が活性化を受け、次に、カスパーゼ１、カスパーゼ３を順次活性化し、アポトーシスを誘導する。一方、抗癌剤耐性細胞においては、癌制御遺伝子であるｐ５３が突然変異を受けていることが多いため、ミトコンドリア経路でのチトクロームｃの放出が妨げられ、アポトーシスの誘導が困難であることも報告されている（非特許文献１）。
【０００８】
ポリフェノールは、タンパク質やアルカロイド等と結合して、その結果難溶化の傾向を示す多価フェノール類であり、タンニンなどの化合物を含む（非特許文献２、川崎敏男、他：天然薬物化学、廣川書店、１９８６年４月：１２４）。茶ポリフェノールは通称カテキン類とも言われており、近年では多くの生理活性が報告されている。例えば、抗酸化作用（非特許文献３、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７：３９６−４０１、２００３）、抗ＨＩＶ作用（非特許文献４、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、６：６９５−７００、１９９６）、抗アレルギー作用（非特許文献５、Ｙａｍａｄａ、Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｓ．、５：１−８、１９９９）、ＤＮＡ切断作用（非特許文献６、Ｏｈａｓｈｉ、Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６６：７７０−７７６、２００２）、抗トポイソメラーゼＩ及びＩＩ作用（非特許文献７、Ｓｕｚｕｋｉ、Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２４：１０８８−１０９０、２００１）、突然変異抑制作用（非特許文献８、Ｙｅｎ、Ｇ．Ｃ． ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｙ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、４３：２７−３２、１９９５）、抗癌作用（非特許文献９、中村好志：茶の抗突然変異・抗癌作用、朝倉書店、１９９７年９月：１３１−１４３）など、たくさんの報告がある。
【０００９】
茶ポリフェノールは、緑茶、紅茶、烏龍茶、黒茶から単離され、７０種以上ものポリフェノール類が含有され、それらの化学構造が既に明らかにされている（非特許文献１０、橋本文雄：各種茶のポリフェノールに関する化学的研究、１９８８年２月：１−２２２；非特許文献１１、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３５：６１１−６１６、１９８７；非特許文献１２、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３６：１６７６−１６８４、１９８８；非特許文献１３、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３７：７７−８５、１９８９；非特許文献１４、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３７：３２５５−３２６３、１９８９；非特許文献１５、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、４０：１３８３−１３８９、１９９２）。
【００１０】
茶ポリフェノールは、その生合成機構の違いにより、二つに分類されている。即ち、生葉中に元来含まれる一次ポリフェノールと、紅茶、烏龍茶等の製造工程（萎凋、発酵）で、フラバン３−オール（ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ）類から変換した二次ポリフェノールとに大別される。一次ポリフェノールには、フラバン３−オール（ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ）類、プロアントシアニジン（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）類、加水分解型タンニン（ｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ ｔａｎｎｉｎ）類、チャルカン−フラバン二量体（ｃｈａｌｃａｎ−ｆｌａｖａｎ ｄｉｍｅｒ）類、ウーロンホモビスフラバン（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ）類が含まれる。一方、二次ポリフェノールとして、テアシネンシン（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ）類、テアフラガリン（ｔｈｅａｆｌａｇａｌｌｉｎ）類、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）類が含まれる（非特許文献９）。
【００１１】
いわゆる茶カテキン類と称する主ポリフェノールの、エピガロカテキン３−ガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ３−Ｏ−ｇａｌｌｔｅ、ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＧＣ）、エピカテキン３−ガレート（（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ ３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ、ＥＣＧ）、エピカテキン（（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＣ）、ガロカテキン（（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＧＣ）、カテキン（（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ、ＣＡ）を除く、種々のポリフェノール類は、茶葉からの単離が容易ではなかったこともあって、種々の生物活性試験を行うことが困難であった問題点がある。
【００１２】
茶ポリフェノールが抗癌作用を有するという事実が明らかにされたものの、ポリフェノールの癌細胞増殖抑制効果と、癌細胞のアポトーシス誘導による細胞死との関係は、明らかではなかったなどの問題点がある（非特許文献１；非特許文献９）。
【００１３】
Ｕ９３７のリンパ球癌細胞を用いたアポトーシスの誘導には、茶ポリフェノールの化学構造のピロガロール環が重要であることが明らかにされている（非特許文献１６、Ｓａｅｋｉ、Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５３：３９１−３９４、２０００）。また、二次ポリフェノールであるテアシネンシン類やテアフラビン類がＵ９３７のリンパ球がん細胞に対して、アポトーシスを誘導することが報告されているが、他のがん細胞を用いたアポトーシス誘導の報告例はない（非特許文献１７、Ｐａｎ、Ｍ．−Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、４８：６３３７−６３４６、２０００）。
【００１４】
その他、特開平２０００−２２６３２９号（以下、特許文献１という）に、ＭＭＰ阻害剤（特許文献１の第０００１〜００１４段落）の記載がある。「カテキン化合物の抗酸化活性や抗ウィルス活性、など多様な生物活性に着目し、カテキン化合物がＭＭＰｓに対して阻害作用を有するかもしれないと推測し、カテキンのＭＭＰｓ阻害活性を調べた結果、カテキンが、その多様な生物活性と併せて、ＭＭＰ阻害作用を示し、結果として、ＭＭＰｓ活性の調節不能に起因する難治性疾患の治療及び予防に対する有用性が期待できることを見出した」という記載がある（特許文献１の第００１３段落）。
特開平２０００−３４４６７２号（以下、特許文献２という）には、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（特許文献２の第０００１〜００１４段落）の記載がある。「ポリフェノール類であるタンニン化合物についても、ＭＭＰｓ阻害活性を調べた結果、該化合物が、優れたＭＭＰ阻害作用を示し、結果として、ＭＭＰｓ活性の調節不能に起因する難治性疾患の治療および予防に対して有用性が期待できることを見出し、本発明を完成した」という記載がある（特許文献２の第００１３段落）。
【００１５】
特願２００２−０８４６６６号（以下、特許文献３という）には、抗癌剤（特許文献３の第０００１〜０００６段落）の記載がある。「発癌プロモーターＴＰＡによる細胞癌化実験を行ったところ、アントシアニジン誘導体、特に、ブルーベリーの果実から抽出したアントシアニジン配糖体であるアントシアニンを含有した培地においては、細胞癌化が抑制されることを見出した」という記載がある（特許文献３の第０００５段落）。
特願２００３−１５７８６２号（以下、特許文献４という）には、アポトーシス誘導剤（特許文献４の第００１５、００１６段落）と記載した。「紅茶から抽出されたプルプロガリン誘導体並びにその合成したプルプロガリン誘導体のヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）に対するアポトーシス誘導を調べた結果、プルプロガリン（ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）が濃度依存的および経時的にアポトーシスを誘導することと併せて、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）類も同様にＨＬ−６０細胞に対してアポトーシスを誘導することを見出し、結果として、正常細胞に対してアポトーシス誘導を起こさせなくて、癌細胞に対してのみアポトーシスを誘導できることを見出した。」、「プルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）がＨＬ−６０細胞に対してカスパーゼ８を活性化し、カスパーゼ８の直接作用によりカスパーゼ３を活性化し、引き続いてＤＮＡが断片化され、アポトーシスが誘導されることを見出した。また、カスパーゼ８からはビッド（Ｂｉｄ）は切断されず、ミトコンドリアからも細胞質へチトクロームｃは放出されず、カスパーゼ９は結果として活性化されないことを見出した。この細胞死機構は、ＨＬ−６０細胞内の活性酸素の増加を伴わないでアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成した。」という記載がある。
【００１６】
【特許文献１】特開平２０００−２２６３２９号公報（第３頁）
【特許文献２】特開平２０００−３４４６７２号公報（第３頁）
【特許文献３】特願２００２−０８４６６６号
【特許文献４】特願２００３−１５７８６２号
【非特許文献１】橋本嘉幸、「アポトーシスとは」、新アポトーシスの分子医学、羊土社、２００１年４月、Ｐ．１０−５８。
【非特許文献２】川崎敏男、他１０名、「タンニン」、天然薬物化学、廣川書店、１９８６年４月、Ｐ．１２４。
【非特許文献３】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他９名、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔ （ｉｎ ｖｉｔｒｏ） ｏｆ Ｔｅａ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第６７巻、Ｐ．３９６−４０１。
【非特許文献４】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他６名、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅａ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ａｓ Ａｎｔｉ−ＨＩＶ Ａｇｅｎｔｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９６年、第６巻、Ｐ．６９５−７００。
【非特許文献５】Ｙａｍａｄａ、Ｋ．、他４名、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｆｏｏｄｓｔｕｆｆｓ」、Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｓ．、１９９９年、第５巻、Ｐ．１−８。
【非特許文献６】Ｏｈａｓｈｉ、Ｙ．、他４名、「Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ Ｇａｌｌａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ＤＮＡ Ｓｃｉｓｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｆｅ（ＩＩ）」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００２年、第６６巻、Ｐ．７７０−７７６。
【非特許文献７】Ｓｕｚｕｋｉ、Ｋ．、他３名、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ （−）−Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｉ ａｎｄ ＩＩ」、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２００１年、第２４巻、Ｐ．１０８８−１０９０。
【非特許文献８】Ｙｅｎ、Ｇ．Ｃ． ａｎｄ Ｃｈｅｎ、Ｈ．Ｙ．、「Ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｔｅａ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｉｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅｉｒ Ａｎｔｉｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ」、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、１９９５年、第４３巻、Ｐ．２７−３２。
【非特許文献９】西岡五夫、「茶のポリフェノール」、茶の科学、朝倉書店、１９９７年９月、Ｐ．１１５−１２３。
【非特許文献１０】橋本文雄、「各種茶のポリフェノールに関する化学的研究」、博士論文、１９８８年２月、Ｐ．１−２２２。
【非特許文献１１】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＬＶＩ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ Ｎｅｗ Ａｃｙｌａｔｅｄ Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｏｏｌｏｎｇ Ｔｅａ．（Ｉ）」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８７年、第３５巻、Ｐ．６１１−６１６。
【非特許文献１２】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＬＸＩＸ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ，Ｂ'−ｌｉｎｋｅｄ Ｂｉｓｆｌａｖａｎｏｉｄｓ， Ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎｓ Ｄ−Ｇ ａｎｄ Ｏｏｌｏｎｇｔｈａｎｉｎ ｆｒｏｍ Ｏｏｌｏｎｇ Ｔｅａ （２）」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８８年、第３６巻、Ｐ．１６７６−１６８４。
【非特許文献１３】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＬＸＸＶＩＩ．Ｎｏｖｅｌ Ｃｈａｌｃａｎ−ｆｌａｖａｎ Ｄｉｍｅｒｓ， Ａｓｓａｍｉｃａｉｎｓ Ａ， Ｂ ａｎｄＣ， ａｎｄ ａ Ｎｅｗ Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ ａｎｄ Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｆｒｅｓｈ Ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｌ． ｖａｒ． ａｓｓａｍｉｃａ Ｋｉｔａｍｕｒａ」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８９年、第３７巻、Ｐ．７７−８５。
【非特許文献１４】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＸＣ．８−Ｃ−Ａｓｃｏｒｂｙｌ （−）−Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌｓ， Ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ， ｆｒｏｍ Ｏｏｌｏｎｇ Ｔｅａ（３）」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８９年、第３７巻、Ｐ．３２５５−３２６３。
【非特許文献１５】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＣＸＩＶ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｔｈｅｏｇａｌｌｉｎｉｎ， Ｔｈｅａｆｌａｖｏｎｉｎ ａｎｄ Ｄｅｓｇａｌｌｏｙｌ Ｔｈｅａｆｌａｖｏｎｉｎ ｆｒｏｍ Ｂｌａｃｋ Ｔｅａ， ａｎｄ Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｔｅａ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９９２年、第４０巻、Ｐ．１３８３−１３８９。
【非特許文献１６】Ｓａｅｋｉ、Ｋ．、他３名、「Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ａ Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ−ｔｙｐｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ Ｃａｔｅｃｈｉｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、第５３巻、Ｐ．３９１−３９４。
【非特許文献１７】Ｐａｎ、Ｍ．−Ｈ．、他５名、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｏｏｌｏｎｇ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ Ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ−９ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ−３ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｕ９３７ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、２０００年、第４８巻、Ｐ．６３３７−６３４６。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、ポリフェノール誘導体の癌細胞増殖を抑制する分子機構が、その細胞を自死に至らしめたかどうかについては不明であることから、日常的に飲茶として摂取しているポリフェノール類を医薬品、または健康補助食品として実用化することに問題点がある。また、特許文献１及び特許文献２に記載のある、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤としての効果・効能についても、臨床的有用性は明らかにされておらず、実用化には至っていない。さらに、正常細胞には安全で癌細胞に対してアポトーシスを誘導する医薬品の供給が必要であるなどの問題点がある。
【００１８】
本発明は、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体並びにその合成したポリフェノール誘導体が癌細胞に対してアポトーシスを誘導することを明らかにした上で、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体並びにそれらを合成したポリフェノール誘導体を新規な医薬品および健康補助食品として提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体並びにその合成したポリフェノール誘導体のヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対するアポトーシス誘導を調べた結果、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２）が濃度依存的および経時的にアポトーシスを誘導することと併せて、ポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）類も同様にＨＬ−６０細胞、ＬｏＶｏ細胞に対してアポトーシスを誘導すること、癌細胞に対してアポトーシスを誘導できることを見出した。より詳しくは、
【００２０】
プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２）がＨＬ−６０細胞に対してカスパーゼ８を活性化し、カスパーゼ８の直接作用によりカスパーゼ３を活性化し、引き続いてＤＮＡが断片化され、アポトーシスが誘導されることを見出した。また、カスパーゼ９も活性化されることを見出した。この細胞死機序は、ＨＬ−６０細胞内の活性酸素の増加を伴いアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成した。
【００２１】
本発明のＡｐｏｐｔｏｓｉｓ誘導剤は、ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する。このポリフェノール誘導体とは、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出、単離、精製されたポリフェノール類、例えば、（−）−エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１）、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（２）、（−）−エピガロカテキン−３、５−ジ−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ３、５−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（３）、（＋）−ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（４）、８−Ｃ−アスコルビルエピガロカテキン（８−Ｃ−ａｓｃｏｒｂｙｌ ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（５）、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２）（６）、プロデルフィニジンＢ−２ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（７）、プロデルフィニジンＢ−２ ３、３'−ジ−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３、３'−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（８）、（−）−エピガロカテキン （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（９）、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１０）、プロシアニジンＢ−４（ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎＢ−４）（１１）、（＋）−ガロカテキン （４α−８） （−）−エピカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）（１２）、（＋）−カテキン （４α−８） （−）−エピガロカテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１３）、プロデルフィニジンＢ−４（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４）（１４）、プロデルフィニジンＢ−４ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１５）、ウーロンホモビスフラバンＡ（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１６）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（ｍｏｎｏｄｅｓｇａｌｌｏｙｌ ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１７）、アッサミカインＡ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ａ）（１８）、アッサミカインＢ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ｂ）（１９）、テアシネンシンＡ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ａ）（２０）、テアシネンシンＢ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｂ）（２１）、テアシネンシンＣ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｃ）（２２）、テアシネンシンＤ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｄ）（２３）、テアシネンシンＥ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｅ）（２４）、ストリクティニン（ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）（２５）、没食子酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）（２６）であり、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ）の癌細胞、癌細胞、または抗癌剤耐性細胞などの疾患細胞に対してアポトーシスを誘導することのできる化合物である。
ポリフェノール誘導体（化合物（１）〜（２４））は、一般式（Ｉ）で示す（式中Ｒ１〜Ｒ６は表１〜表６にそれぞれ対応する化学式を示す）。表１には、単量体ポリフェノール類、表２には、プロアントシアニジン類（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）、表３には、プロアントシアニジン類（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）、表４には、ウーロンホモビスフラバン、表５には、アッサミカイン類（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ）、表６には、テアシネンシン類（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ）を示す。化２にストリクティニン（ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）（２５）を示す。化３に没食子酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）（２６）を示す。
【００２２】
【化１】
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【００２９】
【化２】
【００３０】
【化３】
【００３１】
本発明のアポトーシス誘導剤とは、ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する。
【００３２】
本発明のアポトーシス誘導剤には、ポリフェノール誘導体が、（−）−エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１）、（−）−エピガロカテキン−３、５−ジ−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ３、５−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（３）、（＋）−ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（４）、８−Ｃ−アスコルビルエピガロカテキン（８−Ｃ−ａｓｃｏｒｂｙｌ ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（５）、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２）（６）、プロデルフィニジンＢ−２ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（７）、プロデルフィニジンＢ−２ ３、３'−ジ−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３、３'−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（８）、（−）−エピガロカテキン （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（９）、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１０）、プロシアニジンＢ−４（ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎＢ−４）（１１）、（＋）−ガロカテキン （４α−８） （−）−エピカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）（１２）、（＋）−カテキン （４α−８） （−）−エピガロカテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１３）、プロデルフィニジンＢ−４（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４）（１４）、プロデルフィニジンＢ−４ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１５）、ウーロンホモビスフラバンＡ（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１６）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（ｍｏｎｏｄｅｓｇａｌｌｏｙｌ ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１７）、アッサミカインＡ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ａ）（１８）、アッサミカインＢ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ｂ）（１９）、テアシネンシンＢ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｂ）（２１）、テアシネンシンＣ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｃ）（２２）、テアシネンシンＤ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｄ）（２３）、テアシネンシンＥ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｅ）（２４）、ストリクティニン（ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）（２５）、没食子酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）（２６）、が含まれる。また、これらのポリフェノール誘導体は緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、癌疾患細胞に対するものである。
【００３３】
本発明のアポトーシス誘導剤には、ポリフェノール誘導体が、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（２）、テアシネンシンＡ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ａ）（２０）、が含まれる。また、これらのポリフェノール誘導体は緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、癌疾患細胞（Ｕ９３７のリンパ球癌細胞を除く）に対するものである。
【００３４】
本発明のアポトーシス誘導剤は、ポリフェノール誘導体が緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ）に対するものである。本発明のアポトーシス誘導剤は、胃癌、肺癌、すい臓癌、腎臓癌、大腸癌、血液癌などの癌疾患細胞に対するものである。
【００３５】
本発明のアポトーシス誘導剤は、ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、癌疾患細胞に対するものである。また、ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対するものである。
【発明の効果】
【００３６】
ポリフェノール誘導体の癌細胞増殖を抑制する分子機構が、その細胞を自死に至らしめたかどうかについて明らかにした。日常的に飲茶として摂取しているポリフェノール類を医薬品、または健康補助食品として実用化できる。
本発明は、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体が癌細胞に対してアポトーシスを誘導することを明らかにした上で、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体を新規な医薬品および健康補助食品として提供できる。
本発明によって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対する優れたアポトーシス誘導剤として、ポリフェノール誘導体を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
本発明において、例えば、紅茶の茶葉から、水、低級アルコール、アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いてテアフラビン類を抽出することができる。また、紅茶など市販茶葉中のテアフラビン類は０．７〜１．５％含まれている（非特許文献３）。
本発明のポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）類を、文献記載の方法を用いて単離した（非特許文献１０）。
また、テアシネンシン類、ウーロンホモビスフラバン（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ）類を合成した。
【実施例１】
【００３８】
［ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）の調整］
ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）倍地の作成：
ＲＭＰＩ１６４０を２．０４ｇ秤取し、蒸留水にて全量を２００ｍｌとし、攪拌して溶解した後、溶液をオートクレーブで滅菌した（１２１℃、２０分）。冷後、これに、１０％炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を４ｍｌ、ＦＢＳ（予め非動化したもの）を２０ｍｌ、抗生物質溶液（ペニシリン・ストレプトマイシン）２ｍｌを加え、４℃で保存した。
【００３９】
ＨＬ−６０細胞の融解と増殖：
予め−８０℃で凍結させておいたＨＬ−６０細胞を３７℃で溶解し、予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）倍地５ｍｌに混入し、よく混合した。培地を、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上澄みを除去した。これにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）倍地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、さらにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地５ｍｌを加え、混合した後、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）を行い、上澄みを除去した。これにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、さらにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地５ｍｌを加え、混合した後、シャーレ（６ｃｍ）に培地を流し込み、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターでＨＬ−６０細胞を培養した。
【００４０】
ＨＬ−６０細胞の継代：
培養し、増殖されたＨＬ−６０細胞を１５ｍｌチューブで回収し、丁寧に拡販した後、その少量を血球計算盤に採取し、細胞数をカウントした。１５ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上澄みを除去した。これに予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、先の細胞数を計算した値から、倍地中の細胞の濃度が２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／６ｍｌとなるように、ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で濃度を調整した。調整した培地を、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターで培養し、ＨＬ−６０細胞を継代した。
【００４１】
ＨＬ−６０細胞の保存：
継代されたＨＬ−６０細胞を１５ｍｌチューブで回収し、丁寧に拡販した後、その少量を血球計算盤に採取し、細胞数をカウントした。１５ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上澄みを除去した。これに予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、先の細胞数を計算した値から、倍地中の細胞の濃度が２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌとなるように、ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地を８０％、ＦＢＳを１０％、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を１０％の組成を有する培地で、濃度を調整した。これをセラムチューブに１ｍｌずつ分注し、−２０℃で一夜保存後、翌日より−８０℃にて保存した。
【実施例２】
【００４２】
［エムエムティ・アッセイ（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）；ＨＬ−６０細胞の５０％生存率の検定方法］
本法は、文献記載の方法を参考にした（Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｔ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５：５５−６３、１９８３）。２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌのＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で継代したＨＬ−６０細胞を、平底の１ ｐｌａｔｅ ９６ ｗｅｌｌの１ ｗｅｌｌあたり２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌのＨＬ−６０細胞数になるように培地でＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で希釈し、２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌのＨＬ−６０細胞を各ｗｅｌｌへ分注した。これを５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターで２４時間培養した。
【００４３】
培養後各ｗｅｌｌに、各ポリフェノール誘導体の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度になるように、また、各ｗｅｌｌの培地量が全量で３０μｌとなるように添加した。添加後、プレート毎に規定した時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。
【００４４】
培養後、各ｗｅｌｌにＭＴＴ溶液（３-（４，５−ジメチルチアゾ−２−イル）−２，５−ジフェニル テトラゾリウム ブロミド；３-（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＭＴＴ、の１５０ｍｇをＰＢＳの３０ｍｌに溶解したもの）を１０μｌずつ分注した。プレート毎に４時間、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌに０．０４Ｎ ＨＣｌ−イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏl）溶液を１００μｌずつ分注した。室温で１０分間放置した後、マイクロプレートリーダーのマルチラベルカウンター（５９５ｎｍ）で吸光度を測定した。細胞生存率（％）として、ポリフェノールを添加していない（コントロール細胞の）吸光度から各ポリフェノールを添加した細胞の吸光度を引いたものを、コントロール細胞の吸光度で割った値に１００を乗じて算出した。
【実施例３】
【００４５】
［ＨＬ−６０細胞に対するアポトーシスの誘導方法］
ＨＬ−６０細胞の継代と各ポリフェノール誘導体の添加：
ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地中のＨＬ−６０細胞の濃度が１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌの濃度で継代された培養細胞液１ｍｌとＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地２ｍｌをシャーレ中で混合し（これを３ｍｌ細胞液という）、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで２４時間培養した。これに各ポリフェノール誘導体を倍地中の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭとなるように添加し、規定時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。
【００４６】
アポトーシス誘導後のＨＬ−６０細胞からの核ＤＮＡの回収：
各ポリフェノール誘導体で規定時間処理した後、培地から細胞液を１５ｍｌチューブに回収した。１５ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（２０００ｒｐｍ、８分間）した後、上澄みを除去した。これに、予め氷冷しておいた滅菌ＰＢＳ溶液１ｍｌを加え、ＨＬ−６０細胞を懸濁し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注して遠心分離（２０００ｒｐｍ、８分間、４℃）を行った後、上澄みを除去した。各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにライシスバッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を２０μｌ加え、よく混和した。次に、各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ、１ｍｇ／ｍｌ濃度）を５μｌ加え、よく混和し、水浴で加温（５０℃、３０分）した。加温後、各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにプロテイン分解酵素Ｋ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ Ｋ、１０ｍｇ／ｍｌ濃度）を４０μｌ加え、よく混和し、水浴で加温（５０℃、３時間）し、冷後、-２０℃で保存した。
【００４７】
電気泳動法によるＨＬ−６０細胞の核ＤＮＡ断片化の観察法：
ＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化については文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに保存したＨＬ−６０細胞の処理溶液にローディングバッファーを添加し、よく混和後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分間）を行い、核ＤＮＡ以外のたんぱく質を沈殿、除去した。予め電気泳動槽内にタエバッファー（ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ）を満たしたアガロースゲルの各レーンに、遠心分離して除タンパクした核ＤＮＡを含む上澄み溶液を分注し、１００Ｖで泳動を開始した。電気泳動後、アガロースゲルを取り出し、シーソー上で揺らしながらエチジウムブロミドで１５分間染色する。染色した後、紫外線（ＵＶ、ＵＶトランスイルーミネーター）照射により、ＤＮＡの断片の様子を観察した。
【実施例４】
【００４８】
［抗酸化剤を用いたＨＬ−６０細胞の核ＤＮＡ断片化の阻害実験］
方法は前記したＨＬ−６０細胞に対するアポトーシスの誘導方法と同様である。各ポリフェノール誘導体の添加の１時間前に抗酸化剤を添加し、電気泳動法によるＨＬ−６０細胞の核ＤＮＡ断片化を観察した。添加した酸化剤は、３種類であった。抗酸化剤であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎ、ＮＡＣ）の１Ｍ溶液を３ｍｌ細胞液に１５μｌ添加した。抗酸化剤であるカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＡＴ）の１００Ｕ／μｌ溶液を３ｍｌ細胞液に３μｌ添加した。抗酸化剤であるアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、ＡＡ）の４０ｍＭ溶液を３ｍｌ細胞液に４．５μｌ添加した。
【実施例５】
【００４９】
［ＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の検出］
ＨＬ−６０細胞の継代と各ポリフェノール誘導体の添加：
ＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の検出については文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地中のＨＬ−６０細胞の濃度が２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／６ｍｌの濃度で継代された培養細胞液６ｍｌ（以下、６ｍｌ細胞液という）をシャーレに注入し、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで２４時間培養した。これに各ポリフェノール誘導体を倍地中の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭとなるように添加し、規定時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。
【００５０】
ＨＬ−６０細胞由来のタンパク質の回収：
各ポリフェノール誘導体で規定時間処理した後、培地から細胞液を５０ｍｌチューブに回収した。５０ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（２０００ｒｐｍ、８分間）した後、上澄みを除去した。これに、予め氷冷しておいた滅菌ＰＢＳ溶液１ｍｌを加え、ＨＬ−６０細胞を懸濁し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注して遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）を行った後、上澄みを除去した。これに懸濁バッファー溶液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を８０μｌ加え、超音波洗浄装置にてよく懸濁した。これにＳＤＳ溶液（５０％ＳＤＳを０．３ｍｌ、２００μＭ ＤＴＴを１２０μｌ、蒸留水を１８０μｌ混合した溶液）を８０μｌ加え、よく攪拌し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブの蓋をよく閉めたまま、加熱（１００℃、５分間）した。冷後、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブごと−８０℃で保存した。
【００５１】
ウェスタンブロッティング：
予め電気泳動槽内にランニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を満たしたランニングゲル（ｒｕｎｎｉｎｇ ｇｅｌ）の各レーンに、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブごと−８０℃で保存し、解凍した溶液を分注し、１００Ｖ（１０〜２０ｍＡ）で泳動を開始した。電気泳動後、ランニングゲルを取り出し、目的としたタンパク質が泳動されたランニングゲルをカッターで切り出した。トランスファー装置にろ紙を３枚重ね、この上に切り出したランニングゲルを静置し、さらにこの上に、メンブラン、ろ紙を３枚重ね、蓋をした後、電流を流した（メンブラン面積ｘ２ｍＡの電流で２時間）。トランスファーの終了後、シーソー上で軽く揺らしながらメンブランをＴＢＳ（２５ｍｌ）に５分間浸漬し、次に、固定バッファー溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）の３０ｍｌに浸漬し（２時間）、タンパク質を固定化する。予め一次抗体を添加した一次抗体希釈バッファー溶液（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）の１０ｍｌにタンパク質を固定化したメンブランをシーソー上で軽く揺らしながら１２時間以上反応した。反応後、ＴＢＳ−Ｔ（３０ｍｌ）でメンブランを洗浄し（５分間、３回）、予め２次抗体を添加した固定バッファー溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）の３０ｍｌに浸漬し（１時間）、２次抗体と反応した。反応後、ＴＢＳ−Ｔ（３０ｍｌ）でメンブランを洗浄し（５分間、３回）、自動化学発光検出装置でオートモニタリングを行い、メンブラン上のタンパク質を検出した。
【実施例６】
【００５２】
［抗酸化剤を用いたＨＬ−６０細胞の産生する特異タンパク質の活性阻害実験］
方法は前記したＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の検出と同様である。また、方法は、文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各ポリフェノール誘導体の添加の１時間前に抗酸化剤を添加し、ＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の活性阻害をウェスタンブロッティングにより観察した。添加した酸化剤は、３種類であった。抗酸化剤であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎ、ＮＡＣ）の１Ｍ溶液を６ｍｌ細胞液に３０μｌ添加した。抗酸化剤であるカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＡＴ）の１００Ｕ／μｌ溶液を６ｍｌ細胞液に６μｌ添加した。抗酸化剤であるアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、ＡＡ）の４０ｍＭ溶液を６ｍｌ細胞液に９μｌ添加した。
【実施例７】
【００５３】
［ＨＬ−６０細胞内の過酸化水素発生によるアポトーシスの発現実験］
２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌのＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で継代したＨＬ−６０細胞を、平底の１ ｐｌａｔｅ ４８ ｗｅｌｌの１ ｗｅｌｌあたり２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／４００μｌのＨＬ−６０細胞数になるように培地でＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で希釈し、２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／４００μｌのＨＬ−６０細胞を各ｗｅｌｌへ分注した。これを５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターで２４時間培養した。
【００５４】
培養後各ｗｅｌｌに、各ポリフェノール誘導体の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度になるように、また、各ｗｅｌｌの培地量が全量で３０μｌとなるように添加した。添加後、プレート毎に規定した時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで１５分培養した。
【００５５】
培養後、各ｗｅｌｌにＤＣＦＡ−ＤＡ溶液（ジクロロフルオレシン−ジアセテート；ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｃｉｎ−ｄｉａｃｅｔａｔｅ、の１ｍｇをエタノールの４１３μｌに溶解したもの）を１．６μｌずつ分注した。プレート毎に３０分間、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。培養終了後、マイクロプレートリーダーで蛍光を測定した（励起波長：４８５ｎｍ、エミッション波長：５３０ｎｍ）。ポリフェノールを添加することによってＨＬ−６０細胞で発生する活性酸素量は次のようにして算出した。ポリフェノールを添加した、ＤＣＦＡ−ＤＡ溶液を加えたものと加えなかったものの蛍光を引いた値を分子として、ポリフェノールを添加しなかった細胞で、ＤＣＦＡ−ＤＡ溶液を加えたものと加えなかったものの蛍光を引いた値を分母として、これらの数値で計算した値を、活性酸素量として算出した。
【実施例８】
【００５６】
ポリフェノール誘導体のＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化について検討した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各ポリフェノール誘導体（１）〜（２６）を１００μＭ濃度用いて、ＨＬ−６０細胞を６時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図１〜図３に示した。
【００５７】
化合物１１であるプロシアニジンＢ−４を除く、全てのポリフェノール誘導体によってＨＬ−６０細胞のＤＮＡが断片化されたことがわかる。図中Ｍと記載してあるものはＤＮＡマーカーを示す。図中Ｃと記載してあるものはコントロールを示す。図１中、ｅｃｇは（−）−エピカテキン３−ガレート、ｅｃは（−）−エピカテキン、ｃａは（＋）−カテキン、ｍｇは（−）−エピカテキン３−メチルガレートを示し、いずれも茶葉より単離されたものである。図２中、ｐＱと記載されてあるものは３−Ｏ−ｐ−クマロイルキナ酸、ｃａｆと記載されてあるものはカフェインで、いずれも茶葉より単離されたものである。図３中、ｔｒｉＧと記載されてあるものは、１，４，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースであり、茶葉より単離されたものである。
【実施例９】
【００５８】
プロアントシアニジン誘導体（６）〜（１０）（４β−８結合のプロアントシアニジン類）（表２）を、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度でＭＴＴ ａｓｓａｙを行い、ＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖の抑制効果を調べた。その結果を表７に示した。表中のＩＣ５０は、ＨＬ−６０細胞生存率に対する５０％抑制濃度を示す。
【００５９】
【表７】
【００６０】
表７から、化合物９の（−）−エピガロカテキン （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレートが最も低いＩＣ５０の値を与え、したがって、最も強いＨＬ−６０細胞増殖抑制効果を有した。他のプロアントシアニジン誘導体（６）〜（８）、（１０）も強い抑制効果を示すことがわかる。
【実施例１０】
【００６１】
プロアントシアニジン誘導体（１１）〜（１５）（４α−８結合のプロアントシアニジン類）（表３）を、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度でＭＴＴ ａｓｓａｙを行い、ＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖の抑制効果を調べた。その結果を表８に示した。表中のＩＣ５０は、ＨＬ−６０細胞生存率に対する５０％抑制濃度を示す。
【００６２】
【表８】
【００６３】
表８から、化合物１４のプロデルフィニジンＢ−４が最も低いＩＣ５０の値を与え、したがって、最も強いＨＬ−６０細胞増殖抑制効果を有した。プロシアニジンＢ−４（１１）はＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖の抑制効果を示さない。他のプロアントシアニジン誘導体（１２）、（１３）、（１５）も強い抑制効果を示すことがわかる。
【００６４】
表７と表８の結果から、プロアントシアニジン二量体の化学構造について、上部ユニットが２Ｒ、３Ｓ構造を有するものが、より強いＨＬ−６０細胞増殖の抑制効果を示した。また、上部ユニットのＢ環はピロガロールタイプであり、下部ユニットのＢ環はカテコールタイの化学構造を有するものが、より強いＨＬ−６０細胞増殖の抑制効果を示した。一方、上部と下部が同一ユニットであるプロアントシアニジンでは、ガロイル基の結合する数が増加するとＨＬ−６０細胞増殖の抑制効果が減少することがわかる。
【実施例１１】
【００６５】
プロアントシアニジン誘導体のＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化について検討した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各プロアントシアニジン誘導体（６）〜（１５）を７５μＭ濃度用いて、ＨＬ−６０細胞を６時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図４に示した。
【００６６】
化合物１１であるプロシアニジンＢ−４を除く、全てのプロアントシアニジン誘導体によってＨＬ−６０細胞のＤＮＡが断片化されたことがわかる。中でも、化合物６のプロデルフィニジンＢ−２と化合物７のプロデルフィニジンＢ−２ ３−Ｏ−ガレートは、特に強くＨＬ−６０細胞のＤＮＡを断片化した。
【実施例１２】
【００６７】
プロデルフィニジンＢ−２（６）によるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化について、アポトーシスを誘導する最適時間と最適濃度を詳しく調べた。プロデルフィニジンＢ−２（６）を７５μＭで固定し、ＨＬ−６０細胞を０、２、４、６、１２、１８時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。一方、プロデルフィニジンＢ−２（６）を０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度でＨＬ−６０細胞を６時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。各々得られた核由来のＤＮＡについて、アガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図５に示した。プロデルフィニジンＢ−２（６）は、図５の（１）に示すようにＨＬ−６０細胞のＤＮＡを４時間以降に断片化を誘導し、その誘導は６時間で最大となった。図５の（２）に示すように濃度が上昇するに伴いＤＮＡを強く断片化し、７５μＭ以上からその誘導は最大となった。この結果から、プロデルフィニジンＢ−２（６）のアポトーシス誘導能は、図５の時間（１）と濃度（２）に依存した。図中Ｍと記載してあるものはＤＮＡマーカーを示す。
【実施例１３】
【００６８】
プロデルフィニジンＢ−２（６）によるＨＬ−６０細胞のカスパーゼ３、ポリＡＤＰ−リボース ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、カスパーゼ９、カスパーゼ８の活性について調べた。方法は、文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。その結果を図６に示す。図６の（１）に示すように、プロデルフィニジンＢ−２（６）により４時間後、カスパーゼ３が切断され、活性化された。また、図６の（２）および（３）に示すように、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ９も同様に４時間後切断され、活性化された。図６の（４）に示すように、カスパーゼ９は２時間後に切断が起こり、活性化された。この結果、プロデルフィニジンＢ−２（６）は、カスパーゼ８を活性化し、続いてカスパーゼ３を活性化する。また、ミトコンドリアを経由してカスパーゼ９を刺激し、同様にカスパーゼ３を活性化し、ＤＮＡが断片化されてアポトーシスを発現することがわかる。
【実施例１４】
【００６９】
プロデルフィニジンＢ−２（６）がＨＬ−６０細胞内の過酸化水素を発生するかどうかについて、ＤＣＦＨ−ＤＡを用いて調べた。その結果を図４に示した。図７の（１）に示すように、プロデルフィニジンＢ−２（６）の添加濃度が上がるにつれて、細胞内の相対活性酸素量も増加した。また、図７の２に示すように、プロデルフィニジンＢ−２（６）の濃度を７５μＭに固定して経時的変化を観察したところ、細胞内の相対活性酸素量は１５分の誘導時間で約１１倍量となることがわかる。
【実施例１５】
【００７０】
プロデルフィニジンＢ−２（６）によるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化が活性酸素を介して発現するかどうかを確かめるため、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、カタラーゼ、およびアスコルビン酸の三つの抗酸化剤を用いて調べた。ＮＡＣとカタラーゼは、プロデルフィニジンＢ−２（６）処理の１時間前に培地に添加した。その結果を図８に示す。ＮＡＣ処理区とカタラーゼ処理区では、プロデルフィニジンＢ−２によるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化は認められなかった。また、アスコルビン酸処理区では、ＤＮＡ断片化が認められた。この結果、ＮＡＣとカタラーゼの抗酸化剤がプロデルフィニジンＢ−２によるＤＮＡ断片化を抑制したことが分かり、結果として、プロデルフィニジンＢ−２（６）が活性酸素を介してカスパーゼ８を活性化し、ＨＬ−６０細胞のＤＮＡを断片化したことがわかる。
【実施例１６】
【００７１】
Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、カタラーゼ、およびアスコルビン酸の三つの抗酸化剤が、プロデルフィニジンＢ−２（６）のＨＬ−６０細胞内の過酸化水素の発生を阻害するかどうかについて、ＤＣＦＨ−ＤＡを用いて調べた。その結果を図９に示した。ＮＡＣ処理区とカタラーゼ処理区では、プロデルフィニジンＢ−２によるＨＬ−６０細胞内の過酸化水素の発生を阻害した。また、アスコルビン酸処理区でも、プロデルフィニジンＢ−２によるＨＬ−６０細胞内の過酸化水素の発生を阻害した。この結果、プロデルフィニジンＢ−２（６）がＨＬ−６０細胞内の活性酸素を産生することがわかる。
【実施例１７】
【００７２】
テアシネンシン誘導体（２０）〜（２４）（表６）とエピガロカテキン３−Ｏ−ガレート（２）を、２５、５０、１００、２００μＭの濃度でＭＴＴ ａｓｓａｙを行い、ＬｏＶｏ細胞に対する細胞増殖の抑制効果を調べた。その結果を図１０に示した。テアシネンシンＥ（２４）を除く全てのテアシネンシン類にＬｏＶｏ細胞の増殖を抑制する効果があることがわかる。この結果より、ＩＣ５０を算出した。その結果を表９に示す。表中のＩＣ５０は、ＬｏＶｏ細胞生存率に対する５０％抑制濃度を示す。
【００７３】
【表９】
【００７４】
表８から、化合物２０のテアシネンシンＡが最も低いＩＣ５０の値を与えた。したがって、最も強いＬｏＶｏ細胞増殖抑制効果を有した。フラバン骨格の３位にガロイル基の結合する数が増すにつれて活性がつよくなることがわかる。
【実施例１８】
【００７５】
テアシネンシンＡ（２０）によるＬｏＶｏ細胞のＤＮＡ断片化について、アポトーシスを誘導する最適濃度を詳しく調べた。テアシネンシンＡ（２０）を０、２５、５０、１００μＭの濃度でＬｏＶｏ細胞を４８時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。各々得られた核由来のＤＮＡについて、アガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図１１に示した。図１１に示すように、濃度が上昇するに伴いＬｏＶｏ細胞のＤＮＡを強く断片化することがわかる。図中Ｍと記載してあるものはＤＮＡマーカーを示す。図中Ｃと記載してあるものはコントロールを示す。
【実施例１９】
【００７６】
テアシネンシンＡ（２０）によるＬｏＶｏ細胞のポリＡＤＰ−リボース ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の活性について調べた。方法は、文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＰＡＲＰは４８時間後切断され、活性化された。また、テアシネンシンＡ（２０）の濃度が上昇すると強くＰＡＲＰを活性化することがわかる。
【実施例２０】
【００７７】
［ウーロンホモビスフラバンＡ（１６）およびモノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（１７）の合成］
５ｇの（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（２）を４０ｍｌのエタノールに溶解する。これに、１規定塩酸−エタノール溶液を加える。これを室温下攪拌しながら、４％ホルマリン−エタノール溶液７０ｍｌを約１時間かけて滴下する。反応液は直接、デキストランゲル（セファデックスＬＨ−２０）のカラムクロマトグラフィーに付し、分画した。各分画はさらにポリスチレンゲル（ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ）、オーディーエス（ＯＤＳ）のカラムクロマトを繰り返し行い、３４４ｍｇの化合物（１６）と１８８ｍｇの化合物（１７）とを合成した。
【実施例２１】
【００７８】
［テアシネンシンＡ（２０）とテアシネンシンＤ（２３）の合成］
１０ｇの（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（２）を５００ｍｌの蒸留水に溶解する。予め、フェリシアン化カリウム（Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）（６ｇ）と炭酸水素ナトリウム（６ｇ）を１００ｍｌの蒸留水に溶解した溶液を、氷冷下攪拌しながら１時間かけて滴下した。反応液は直接、ポリスチレンゲル（ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ）に付し、分画した。各分画はさらにデキストランゲル（セファデックスＬＨ−２０）、オーディーエス（ＯＤＳ）のカラムクロマトを繰り返し行い、３９２ｍｇの化合物（２０）と８９ｍｇの化合物（２３）とを合成した。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例８）
【図２】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例８）
【図３】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例８）
【図４】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１１）
【図５】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１２）（１）ＤＮＡ断片化の経時的変化（２）ＤＮＡ断片化の濃度的変化
【図６】ウエスタンブロッティングの図である。（実施例１３）（１）カスパーゼ３の活性化ＰＡＲＰの活性化（３）カスパーゼ９の活性化（４）カスパーゼ８の活性化
【図７】相対活性酸素量の図である。（実施例１４）（１）活性酸素の濃度的変化（２）活性酸素の経時的変化
【図８】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１５）
【図９】相対活性酸素量の図である。（実施例１６）
【図１０】ＬｏＶｏ細胞生存率（％）の図である。（実施例１７）
【図１１】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１８）
【図１２】ウエスタンブロッティングの図でＰＡＲＰの活性化の図である。（実施例１９）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）誘導体を有効成分として含有する、癌細胞に対するアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）誘導剤に関する。すなわち、ヒトまたは動物の癌細胞内にあるプロテアーゼ、特に、カスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）が不活性化されることにより増殖する癌細胞に対するアポトーシスの誘導に有効であって、ヒトまたは動物の癌細胞内のカスパーゼを活性化することによりアポトーシスを誘導し、癌細胞を死滅させることに関する。より詳しくは、茶の抽出物であって、環式炭化水素の環と６員芳香環とを含有する環式炭化水素の中の６員環をもつものに関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは、細胞内の核の破壊を伴う細胞死である。癌細胞におけるアポトーシスの死分子機構として、カルシウム経路、死のシグナル経路、セラミド経路、ミトコンドリア経路、及びｐ５３アポトーシス経路の５つの経路を介して誘導される分子機構が知られている（非特許文献１、橋本嘉幸：新アポトーシスの分子医学、羊土社、２００１年４月：１０−５８）。
【０００３】
カルシウム経路では、アポトーシス誘導刺激によりグルココルチコイドがマウスの胸腺細胞の細胞外膜に存在するグルココルチコイド受容体に作用して細胞内のアイピー３アール３（ＩＰ３Ｒ３）が活性化され、引き続き細胞内のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）濃度が上昇し、プロテアーゼであるカルパインを活性化する。カルパインは、カスパーゼ１／インターロイキン−１β−変換酵素（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ、ＩＣＥ）、カスパーゼ３を順次活性化、更に、カスパーゼ３はエンドヌクレアーゼを活性化し、活性化エンドヌクレアーゼの作用により核ＤＮＡが切断を受け、結果としてアポトーシスを誘導する（非特許文献１）。
【０００４】
死のシグナル経路では、アポトーシス誘導刺激により腫瘍壊死因子−α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）、ファスリガンド（ＦＳ−７−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ、ＦａｓＬ）などの細胞外タンパク質分子が、胸腺細胞やリンパ球の細胞外膜に存在するそれぞれの受容体に接触する。これらの受容体から細胞内のアダプター分子、即ち、ドメインに会合するタンパク分子、トラッド（ＴＮＦＲ１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＴＲＡＤＤ）並びにファッド（ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅａｔｈ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＦＡＤＤ）を介してカスパーゼ８を活性化する。活性型カスパーゼ８はカスパーゼ１／ＩＣＥを活性化、更に、活性型カスパーゼ１／ＩＣＥがカスパーゼ３を順次活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献１）。
【０００５】
セラミド経路では、アポトーシス誘導刺激により細胞間の情報伝達を司るスフィンゴ脂質が細胞内に入り、スフィンゴミエリナーゼの酵素分解を受け、細胞内セラミドが増加する。これがサップキナーゼ／ジュン−Ｎ末端キナーゼ（ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ／ｃ−ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ、ＳＡＰＫ／ＪＮＫ）を活性化し、更に、活性型ＳＡＰＫ／ＪＮＫはカスパーゼ１／ＩＥＣを活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献１）。
【０００６】
ミトコンドリア経路では、アポトーシス誘導刺激によりミトコンドリア膜上に存在するタンパク質であるアポトーシス促進因子のバックス（Ｂｃｌ−２ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｘ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｂａｘ）が活性化され、アント（ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｏｒ、ＡＮＴ）とピーティーピーシー（ｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｔｙ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｐｏｒｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＰＴＰＣ）のタンパク質と会合後、ミトコンドリア膜に細孔を開ける。ミトコンドリア内から細孔を通してチトクロームｃが細胞質内に放出され、チトクロームｃはアポトーシス誘導因子−１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ−１、Ａｐａｆ−１）を活性化、活性化Ａｐａｆ−１はカスパーゼ９を活性化し、アポトーシスを誘導する（非特許文献１）。
【０００７】
ｐ５３アポトーシス経路について、抗癌剤を用いた場合では、癌抑制遺伝子であるｐ５３が活性化を受け、次に、カスパーゼ１、カスパーゼ３を順次活性化し、アポトーシスを誘導する。一方、抗癌剤耐性細胞においては、癌制御遺伝子であるｐ５３が突然変異を受けていることが多いため、ミトコンドリア経路でのチトクロームｃの放出が妨げられ、アポトーシスの誘導が困難であることも報告されている（非特許文献１）。
【０００８】
ポリフェノールは、タンパク質やアルカロイド等と結合して、その結果難溶化の傾向を示す多価フェノール類であり、タンニンなどの化合物を含む（非特許文献２、川崎敏男、他：天然薬物化学、廣川書店、１９８６年４月：１２４）。茶ポリフェノールは通称カテキン類とも言われており、近年では多くの生理活性が報告されている。例えば、抗酸化作用（非特許文献３、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７：３９６−４０１、２００３）、抗ＨＩＶ作用（非特許文献４、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、６：６９５−７００、１９９６）、抗アレルギー作用（非特許文献５、Ｙａｍａｄａ、Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｓ．、５：１−８、１９９９）、ＤＮＡ切断作用（非特許文献６、Ｏｈａｓｈｉ、Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６６：７７０−７７６、２００２）、抗トポイソメラーゼＩ及びＩＩ作用（非特許文献７、Ｓｕｚｕｋｉ、Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２４：１０８８−１０９０、２００１）、突然変異抑制作用（非特許文献８、Ｙｅｎ、Ｇ．Ｃ． ａｎｄ Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｙ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、４３：２７−３２、１９９５）、抗癌作用（非特許文献９、中村好志：茶の抗突然変異・抗癌作用、朝倉書店、１９９７年９月：１３１−１４３）など、たくさんの報告がある。
【０００９】
茶ポリフェノールは、緑茶、紅茶、烏龍茶、黒茶から単離され、７０種以上ものポリフェノール類が含有され、それらの化学構造が既に明らかにされている（非特許文献１０、橋本文雄：各種茶のポリフェノールに関する化学的研究、１９８８年２月：１−２２２；非特許文献１１、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３５：６１１−６１６、１９８７；非特許文献１２、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３６：１６７６−１６８４、１９８８；非特許文献１３、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３７：７７−８５、１９８９；非特許文献１４、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、３７：３２５５−３２６３、１９８９；非特許文献１５、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、４０：１３８３−１３８９、１９９２）。
【００１０】
茶ポリフェノールは、その生合成機構の違いにより、二つに分類されている。即ち、生葉中に元来含まれる一次ポリフェノールと、紅茶、烏龍茶等の製造工程（萎凋、発酵）で、フラバン３−オール（ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ）類から変換した二次ポリフェノールとに大別される。一次ポリフェノールには、フラバン３−オール（ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ）類、プロアントシアニジン（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）類、加水分解型タンニン（ｈｙｄｒｏｌｙｚａｂｌｅ ｔａｎｎｉｎ）類、チャルカン−フラバン二量体（ｃｈａｌｃａｎ−ｆｌａｖａｎ ｄｉｍｅｒ）類、ウーロンホモビスフラバン（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ）類が含まれる。一方、二次ポリフェノールとして、テアシネンシン（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ）類、テアフラガリン（ｔｈｅａｆｌａｇａｌｌｉｎ）類、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）類が含まれる（非特許文献９）。
【００１１】
いわゆる茶カテキン類と称する主ポリフェノールの、エピガロカテキン３−ガレート（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ３−Ｏ−ｇａｌｌｔｅ、ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＧＣ）、エピカテキン３−ガレート（（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ ３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ、ＥＣＧ）、エピカテキン（（−）−ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ、ＥＣ）、ガロカテキン（（＋）−ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ、ＧＣ）、カテキン（（＋）−ｃａｔｅｃｈｉｎ、ＣＡ）を除く、種々のポリフェノール類は、茶葉からの単離が容易ではなかったこともあって、種々の生物活性試験を行うことが困難であった問題点がある。
【００１２】
茶ポリフェノールが抗癌作用を有するという事実が明らかにされたものの、ポリフェノールの癌細胞増殖抑制効果と、癌細胞のアポトーシス誘導による細胞死との関係は、明らかではなかったなどの問題点がある（非特許文献１；非特許文献９）。
【００１３】
Ｕ９３７のリンパ球癌細胞を用いたアポトーシスの誘導には、茶ポリフェノールの化学構造のピロガロール環が重要であることが明らかにされている（非特許文献１６、Ｓａｅｋｉ、Ｋ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５３：３９１−３９４、２０００）。また、二次ポリフェノールであるテアシネンシン類やテアフラビン類がＵ９３７のリンパ球がん細胞に対して、アポトーシスを誘導することが報告されているが、他のがん細胞を用いたアポトーシス誘導の報告例はない（非特許文献１７、Ｐａｎ、Ｍ．−Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、４８：６３３７−６３４６、２０００）。
【００１４】
その他、特開平２０００−２２６３２９号（以下、特許文献１という）に、ＭＭＰ阻害剤（特許文献１の第０００１〜００１４段落）の記載がある。「カテキン化合物の抗酸化活性や抗ウィルス活性、など多様な生物活性に着目し、カテキン化合物がＭＭＰｓに対して阻害作用を有するかもしれないと推測し、カテキンのＭＭＰｓ阻害活性を調べた結果、カテキンが、その多様な生物活性と併せて、ＭＭＰ阻害作用を示し、結果として、ＭＭＰｓ活性の調節不能に起因する難治性疾患の治療及び予防に対する有用性が期待できることを見出した」という記載がある（特許文献１の第００１３段落）。
特開平２０００−３４４６７２号（以下、特許文献２という）には、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（特許文献２の第０００１〜００１４段落）の記載がある。「ポリフェノール類であるタンニン化合物についても、ＭＭＰｓ阻害活性を調べた結果、該化合物が、優れたＭＭＰ阻害作用を示し、結果として、ＭＭＰｓ活性の調節不能に起因する難治性疾患の治療および予防に対して有用性が期待できることを見出し、本発明を完成した」という記載がある（特許文献２の第００１３段落）。
【００１５】
特願２００２−０８４６６６号（以下、特許文献３という）には、抗癌剤（特許文献３の第０００１〜０００６段落）の記載がある。「発癌プロモーターＴＰＡによる細胞癌化実験を行ったところ、アントシアニジン誘導体、特に、ブルーベリーの果実から抽出したアントシアニジン配糖体であるアントシアニンを含有した培地においては、細胞癌化が抑制されることを見出した」という記載がある（特許文献３の第０００５段落）。
特願２００３−１５７８６２号（以下、特許文献４という）には、アポトーシス誘導剤（特許文献４の第００１５、００１６段落）と記載した。「紅茶から抽出されたプルプロガリン誘導体並びにその合成したプルプロガリン誘導体のヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）に対するアポトーシス誘導を調べた結果、プルプロガリン（ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）が濃度依存的および経時的にアポトーシスを誘導することと併せて、テアフラビン（ｔｈｅａｆｌａｖｉｎ）類も同様にＨＬ−６０細胞に対してアポトーシスを誘導することを見出し、結果として、正常細胞に対してアポトーシス誘導を起こさせなくて、癌細胞に対してのみアポトーシスを誘導できることを見出した。」、「プルプロガリン（Ｐｕｒｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）がＨＬ−６０細胞に対してカスパーゼ８を活性化し、カスパーゼ８の直接作用によりカスパーゼ３を活性化し、引き続いてＤＮＡが断片化され、アポトーシスが誘導されることを見出した。また、カスパーゼ８からはビッド（Ｂｉｄ）は切断されず、ミトコンドリアからも細胞質へチトクロームｃは放出されず、カスパーゼ９は結果として活性化されないことを見出した。この細胞死機構は、ＨＬ−６０細胞内の活性酸素の増加を伴わないでアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成した。」という記載がある。
【００１６】
【特許文献１】特開平２０００−２２６３２９号公報（第３頁）
【特許文献２】特開平２０００−３４４６７２号公報（第３頁）
【特許文献３】特願２００２−０８４６６６号
【特許文献４】特願２００３−１５７８６２号
【非特許文献１】橋本嘉幸、「アポトーシスとは」、新アポトーシスの分子医学、羊土社、２００１年４月、Ｐ．１０−５８。
【非特許文献２】川崎敏男、他１０名、「タンニン」、天然薬物化学、廣川書店、１９８６年４月、Ｐ．１２４。
【非特許文献３】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他９名、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔ （ｉｎ ｖｉｔｒｏ） ｏｆ Ｔｅａ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００３年、第６７巻、Ｐ．３９６−４０１。
【非特許文献４】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他６名、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｅａ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ａｓ Ａｎｔｉ−ＨＩＶ Ａｇｅｎｔｓ」、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９６年、第６巻、Ｐ．６９５−７００。
【非特許文献５】Ｙａｍａｄａ、Ｋ．、他４名、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｆｏｏｄｓｔｕｆｆｓ」、Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｒｅｓ．、１９９９年、第５巻、Ｐ．１−８。
【非特許文献６】Ｏｈａｓｈｉ、Ｙ．、他４名、「Ｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ Ｇａｌｌａｔｅ ｏｎ ｔｈｅ ＤＮＡ Ｓｃｉｓｓｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｆｅ（ＩＩ）」、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００２年、第６６巻、Ｐ．７７０−７７６。
【非特許文献７】Ｓｕｚｕｋｉ、Ｋ．、他３名、「Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ （−）−Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｉ ａｎｄ ＩＩ」、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２００１年、第２４巻、Ｐ．１０８８−１０９０。
【非特許文献８】Ｙｅｎ、Ｇ．Ｃ． ａｎｄ Ｃｈｅｎ、Ｈ．Ｙ．、「Ａｎｔｉ−ｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｔｅａ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｉｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅｉｒ Ａｎｔｉｍｕｔａｇｅｎｉｃｉｔｙ」、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、１９９５年、第４３巻、Ｐ．２７−３２。
【非特許文献９】西岡五夫、「茶のポリフェノール」、茶の科学、朝倉書店、１９９７年９月、Ｐ．１１５−１２３。
【非特許文献１０】橋本文雄、「各種茶のポリフェノールに関する化学的研究」、博士論文、１９８８年２月、Ｐ．１−２２２。
【非特許文献１１】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＬＶＩ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ Ｎｅｗ Ａｃｙｌａｔｅｄ Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌｓ ｆｒｏｍ Ｏｏｌｏｎｇ Ｔｅａ．（Ｉ）」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８７年、第３５巻、Ｐ．６１１−６１６。
【非特許文献１２】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＬＸＩＸ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ，Ｂ'−ｌｉｎｋｅｄ Ｂｉｓｆｌａｖａｎｏｉｄｓ， Ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎｓ Ｄ−Ｇ ａｎｄ Ｏｏｌｏｎｇｔｈａｎｉｎ ｆｒｏｍ Ｏｏｌｏｎｇ Ｔｅａ （２）」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８８年、第３６巻、Ｐ．１６７６−１６８４。
【非特許文献１３】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＬＸＸＶＩＩ．Ｎｏｖｅｌ Ｃｈａｌｃａｎ−ｆｌａｖａｎ Ｄｉｍｅｒｓ， Ａｓｓａｍｉｃａｉｎｓ Ａ， Ｂ ａｎｄＣ， ａｎｄ ａ Ｎｅｗ Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌ ａｎｄ Ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｆｒｅｓｈ Ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｌ． ｖａｒ． ａｓｓａｍｉｃａ Ｋｉｔａｍｕｒａ」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８９年、第３７巻、Ｐ．７７−８５。
【非特許文献１４】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＸＣ．８−Ｃ−Ａｓｃｏｒｂｙｌ （−）−Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｄｉｍｅｒｉｃ Ｆｌａｖａｎ−３−ｏｌｓ， Ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ， ｆｒｏｍ Ｏｏｌｏｎｇ Ｔｅａ（３）」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９８９年、第３７巻、Ｐ．３２５５−３２６３。
【非特許文献１５】Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、Ｆ．、他２名、「Ｔａｎｎｉｎｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．ＣＸＩＶ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｔｈｅｏｇａｌｌｉｎｉｎ， Ｔｈｅａｆｌａｖｏｎｉｎ ａｎｄ Ｄｅｓｇａｌｌｏｙｌ Ｔｈｅａｆｌａｖｏｎｉｎ ｆｒｏｍ Ｂｌａｃｋ Ｔｅａ， ａｎｄ Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｔｅａ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１９９２年、第４０巻、Ｐ．１３８３−１３８９。
【非特許文献１６】Ｓａｅｋｉ、Ｋ．、他３名、「Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ａ Ｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ−ｔｙｐｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ Ｃａｔｅｃｈｉｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｏｒ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、第５３巻、Ｐ．３９１−３９４。
【非特許文献１７】Ｐａｎ、Ｍ．−Ｈ．、他５名、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｏｏｌｏｎｇ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ Ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ−９ ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ−３ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｕ９３７ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．、２０００年、第４８巻、Ｐ．６３３７−６３４６。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、ポリフェノール誘導体の癌細胞増殖を抑制する分子機構が、その細胞を自死に至らしめたかどうかについては不明であることから、日常的に飲茶として摂取しているポリフェノール類を医薬品、または健康補助食品として実用化することに問題点がある。また、特許文献１及び特許文献２に記載のある、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤としての効果・効能についても、臨床的有用性は明らかにされておらず、実用化には至っていない。さらに、正常細胞には安全で癌細胞に対してアポトーシスを誘導する医薬品の供給が必要であるなどの問題点がある。
【００１８】
本発明は、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体並びにその合成したポリフェノール誘導体が癌細胞に対してアポトーシスを誘導することを明らかにした上で、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体並びにそれらを合成したポリフェノール誘導体を新規な医薬品および健康補助食品として提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体並びにその合成したポリフェノール誘導体のヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対するアポトーシス誘導を調べた結果、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２）が濃度依存的および経時的にアポトーシスを誘導することと併せて、ポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）類も同様にＨＬ−６０細胞、ＬｏＶｏ細胞に対してアポトーシスを誘導すること、癌細胞に対してアポトーシスを誘導できることを見出した。より詳しくは、
【００２０】
プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２）がＨＬ−６０細胞に対してカスパーゼ８を活性化し、カスパーゼ８の直接作用によりカスパーゼ３を活性化し、引き続いてＤＮＡが断片化され、アポトーシスが誘導されることを見出した。また、カスパーゼ９も活性化されることを見出した。この細胞死機序は、ＨＬ−６０細胞内の活性酸素の増加を伴いアポトーシスを誘導することを見出し、本発明を完成した。
【００２１】
本発明のＡｐｏｐｔｏｓｉｓ誘導剤は、ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する。このポリフェノール誘導体とは、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出、単離、精製されたポリフェノール類、例えば、（−）−エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１）、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（２）、（−）−エピガロカテキン−３、５−ジ−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ３、５−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（３）、（＋）−ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（４）、８−Ｃ−アスコルビルエピガロカテキン（８−Ｃ−ａｓｃｏｒｂｙｌ ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（５）、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２）（６）、プロデルフィニジンＢ−２ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（７）、プロデルフィニジンＢ−２ ３、３'−ジ−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３、３'−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（８）、（−）−エピガロカテキン （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（９）、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１０）、プロシアニジンＢ−４（ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎＢ−４）（１１）、（＋）−ガロカテキン （４α−８） （−）−エピカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）（１２）、（＋）−カテキン （４α−８） （−）−エピガロカテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１３）、プロデルフィニジンＢ−４（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４）（１４）、プロデルフィニジンＢ−４ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１５）、ウーロンホモビスフラバンＡ（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１６）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（ｍｏｎｏｄｅｓｇａｌｌｏｙｌ ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１７）、アッサミカインＡ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ａ）（１８）、アッサミカインＢ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ｂ）（１９）、テアシネンシンＡ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ａ）（２０）、テアシネンシンＢ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｂ）（２１）、テアシネンシンＣ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｃ）（２２）、テアシネンシンＤ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｄ）（２３）、テアシネンシンＥ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｅ）（２４）、ストリクティニン（ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）（２５）、没食子酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）（２６）であり、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ）の癌細胞、癌細胞、または抗癌剤耐性細胞などの疾患細胞に対してアポトーシスを誘導することのできる化合物である。
ポリフェノール誘導体（化合物（１）〜（２４））は、一般式（Ｉ）で示す（式中Ｒ１〜Ｒ６は表１〜表６にそれぞれ対応する化学式を示す）。表１には、単量体ポリフェノール類、表２には、プロアントシアニジン類（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）、表３には、プロアントシアニジン類（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）、表４には、ウーロンホモビスフラバン、表５には、アッサミカイン類（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ）、表６には、テアシネンシン類（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ）を示す。化２にストリクティニン（ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）（２５）を示す。化３に没食子酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）（２６）を示す。
【００２２】
【化１】
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
【表５】
【００２８】
【表６】
【００２９】
【化２】
【００３０】
【化３】
【００３１】
本発明のアポトーシス誘導剤とは、ポリフェノール誘導体を有効成分として含有する。
【００３２】
本発明のアポトーシス誘導剤には、ポリフェノール誘導体が、（−）−エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１）、（−）−エピガロカテキン−３、５−ジ−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ３、５−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（３）、（＋）−ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（４）、８−Ｃ−アスコルビルエピガロカテキン（８−Ｃ−ａｓｃｏｒｂｙｌ ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（５）、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２）（６）、プロデルフィニジンＢ−２ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（７）、プロデルフィニジンＢ−２ ３、３'−ジ−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３、３'−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（８）、（−）−エピガロカテキン （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（９）、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１０）、プロシアニジンＢ−４（ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎＢ−４）（１１）、（＋）−ガロカテキン （４α−８） （−）−エピカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）（１２）、（＋）−カテキン （４α−８） （−）−エピガロカテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１３）、プロデルフィニジンＢ−４（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４）（１４）、プロデルフィニジンＢ−４ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１５）、ウーロンホモビスフラバンＡ（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１６）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（ｍｏｎｏｄｅｓｇａｌｌｏｙｌ ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１７）、アッサミカインＡ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ａ）（１８）、アッサミカインＢ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ｂ）（１９）、テアシネンシンＢ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｂ）（２１）、テアシネンシンＣ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｃ）（２２）、テアシネンシンＤ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｄ）（２３）、テアシネンシンＥ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｅ）（２４）、ストリクティニン（ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）（２５）、没食子酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）（２６）、が含まれる。また、これらのポリフェノール誘導体は緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、癌疾患細胞に対するものである。
【００３３】
本発明のアポトーシス誘導剤には、ポリフェノール誘導体が、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（２）、テアシネンシンＡ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ａ）（２０）、が含まれる。また、これらのポリフェノール誘導体は緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、癌疾患細胞（Ｕ９３７のリンパ球癌細胞を除く）に対するものである。
【００３４】
本発明のアポトーシス誘導剤は、ポリフェノール誘導体が緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ）に対するものである。本発明のアポトーシス誘導剤は、胃癌、肺癌、すい臓癌、腎臓癌、大腸癌、血液癌などの癌疾患細胞に対するものである。
【００３５】
本発明のアポトーシス誘導剤は、ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、癌疾患細胞に対するものである。また、ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対するものである。
【発明の効果】
【００３６】
ポリフェノール誘導体の癌細胞増殖を抑制する分子機構が、その細胞を自死に至らしめたかどうかについて明らかにした。日常的に飲茶として摂取しているポリフェノール類を医薬品、または健康補助食品として実用化できる。
本発明は、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体が癌細胞に対してアポトーシスを誘導することを明らかにした上で、緑茶、烏龍茶、紅茶から抽出されたポリフェノール誘導体を新規な医薬品および健康補助食品として提供できる。
本発明によって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対する優れたアポトーシス誘導剤として、ポリフェノール誘導体を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
本発明において、例えば、紅茶の茶葉から、水、低級アルコール、アセトン、酢酸エチルなどの有機溶媒を用いてテアフラビン類を抽出することができる。また、紅茶など市販茶葉中のテアフラビン類は０．７〜１．５％含まれている（非特許文献３）。
本発明のポリフェノール（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）類を、文献記載の方法を用いて単離した（非特許文献１０）。
また、テアシネンシン類、ウーロンホモビスフラバン（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ）類を合成した。
【実施例１】
【００３８】
［ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）の調整］
ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）倍地の作成：
ＲＭＰＩ１６４０を２．０４ｇ秤取し、蒸留水にて全量を２００ｍｌとし、攪拌して溶解した後、溶液をオートクレーブで滅菌した（１２１℃、２０分）。冷後、これに、１０％炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）を４ｍｌ、ＦＢＳ（予め非動化したもの）を２０ｍｌ、抗生物質溶液（ペニシリン・ストレプトマイシン）２ｍｌを加え、４℃で保存した。
【００３９】
ＨＬ−６０細胞の融解と増殖：
予め−８０℃で凍結させておいたＨＬ−６０細胞を３７℃で溶解し、予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）倍地５ｍｌに混入し、よく混合した。培地を、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上澄みを除去した。これにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）倍地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、さらにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地５ｍｌを加え、混合した後、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）を行い、上澄みを除去した。これにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、さらにＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地５ｍｌを加え、混合した後、シャーレ（６ｃｍ）に培地を流し込み、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターでＨＬ−６０細胞を培養した。
【００４０】
ＨＬ−６０細胞の継代：
培養し、増殖されたＨＬ−６０細胞を１５ｍｌチューブで回収し、丁寧に拡販した後、その少量を血球計算盤に採取し、細胞数をカウントした。１５ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上澄みを除去した。これに予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、先の細胞数を計算した値から、倍地中の細胞の濃度が２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／６ｍｌとなるように、ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で濃度を調整した。調整した培地を、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターで培養し、ＨＬ−６０細胞を継代した。
【００４１】
ＨＬ−６０細胞の保存：
継代されたＨＬ−６０細胞を１５ｍｌチューブで回収し、丁寧に拡販した後、その少量を血球計算盤に採取し、細胞数をカウントした。１５ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上澄みを除去した。これに予め３７℃で保温したＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地１ｍｌを加え、軽く攪拌し、先の細胞数を計算した値から、倍地中の細胞の濃度が２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌとなるように、ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地を８０％、ＦＢＳを１０％、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を１０％の組成を有する培地で、濃度を調整した。これをセラムチューブに１ｍｌずつ分注し、−２０℃で一夜保存後、翌日より−８０℃にて保存した。
【実施例２】
【００４２】
［エムエムティ・アッセイ（ＭＴＴ ａｓｓａｙ）；ＨＬ−６０細胞の５０％生存率の検定方法］
本法は、文献記載の方法を参考にした（Ｍｏｓｍａｎｎ、Ｔ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５：５５−６３、１９８３）。２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌのＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で継代したＨＬ−６０細胞を、平底の１ ｐｌａｔｅ ９６ ｗｅｌｌの１ ｗｅｌｌあたり２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌのＨＬ−６０細胞数になるように培地でＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で希釈し、２ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／１００μｌのＨＬ−６０細胞を各ｗｅｌｌへ分注した。これを５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターで２４時間培養した。
【００４３】
培養後各ｗｅｌｌに、各ポリフェノール誘導体の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度になるように、また、各ｗｅｌｌの培地量が全量で３０μｌとなるように添加した。添加後、プレート毎に規定した時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。
【００４４】
培養後、各ｗｅｌｌにＭＴＴ溶液（３-（４，５−ジメチルチアゾ−２−イル）−２，５−ジフェニル テトラゾリウム ブロミド；３-（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＭＴＴ、の１５０ｍｇをＰＢＳの３０ｍｌに溶解したもの）を１０μｌずつ分注した。プレート毎に４時間、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。培養終了後、各ｗｅｌｌに０．０４Ｎ ＨＣｌ−イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏl）溶液を１００μｌずつ分注した。室温で１０分間放置した後、マイクロプレートリーダーのマルチラベルカウンター（５９５ｎｍ）で吸光度を測定した。細胞生存率（％）として、ポリフェノールを添加していない（コントロール細胞の）吸光度から各ポリフェノールを添加した細胞の吸光度を引いたものを、コントロール細胞の吸光度で割った値に１００を乗じて算出した。
【実施例３】
【００４５】
［ＨＬ−６０細胞に対するアポトーシスの誘導方法］
ＨＬ−６０細胞の継代と各ポリフェノール誘導体の添加：
ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地中のＨＬ−６０細胞の濃度が１ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌの濃度で継代された培養細胞液１ｍｌとＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地２ｍｌをシャーレ中で混合し（これを３ｍｌ細胞液という）、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで２４時間培養した。これに各ポリフェノール誘導体を倍地中の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭとなるように添加し、規定時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。
【００４６】
アポトーシス誘導後のＨＬ−６０細胞からの核ＤＮＡの回収：
各ポリフェノール誘導体で規定時間処理した後、培地から細胞液を１５ｍｌチューブに回収した。１５ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（２０００ｒｐｍ、８分間）した後、上澄みを除去した。これに、予め氷冷しておいた滅菌ＰＢＳ溶液１ｍｌを加え、ＨＬ−６０細胞を懸濁し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注して遠心分離（２０００ｒｐｍ、８分間、４℃）を行った後、上澄みを除去した。各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにライシスバッファー（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を２０μｌ加え、よく混和した。次に、各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ、１ｍｇ／ｍｌ濃度）を５μｌ加え、よく混和し、水浴で加温（５０℃、３０分）した。加温後、各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブにプロテイン分解酵素Ｋ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ Ｋ、１０ｍｇ／ｍｌ濃度）を４０μｌ加え、よく混和し、水浴で加温（５０℃、３時間）し、冷後、-２０℃で保存した。
【００４７】
電気泳動法によるＨＬ−６０細胞の核ＤＮＡ断片化の観察法：
ＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化については文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに保存したＨＬ−６０細胞の処理溶液にローディングバッファーを添加し、よく混和後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分間）を行い、核ＤＮＡ以外のたんぱく質を沈殿、除去した。予め電気泳動槽内にタエバッファー（ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ）を満たしたアガロースゲルの各レーンに、遠心分離して除タンパクした核ＤＮＡを含む上澄み溶液を分注し、１００Ｖで泳動を開始した。電気泳動後、アガロースゲルを取り出し、シーソー上で揺らしながらエチジウムブロミドで１５分間染色する。染色した後、紫外線（ＵＶ、ＵＶトランスイルーミネーター）照射により、ＤＮＡの断片の様子を観察した。
【実施例４】
【００４８】
［抗酸化剤を用いたＨＬ−６０細胞の核ＤＮＡ断片化の阻害実験］
方法は前記したＨＬ−６０細胞に対するアポトーシスの誘導方法と同様である。各ポリフェノール誘導体の添加の１時間前に抗酸化剤を添加し、電気泳動法によるＨＬ−６０細胞の核ＤＮＡ断片化を観察した。添加した酸化剤は、３種類であった。抗酸化剤であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎ、ＮＡＣ）の１Ｍ溶液を３ｍｌ細胞液に１５μｌ添加した。抗酸化剤であるカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＡＴ）の１００Ｕ／μｌ溶液を３ｍｌ細胞液に３μｌ添加した。抗酸化剤であるアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、ＡＡ）の４０ｍＭ溶液を３ｍｌ細胞液に４．５μｌ添加した。
【実施例５】
【００４９】
［ＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の検出］
ＨＬ−６０細胞の継代と各ポリフェノール誘導体の添加：
ＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の検出については文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。ＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地中のＨＬ−６０細胞の濃度が２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／６ｍｌの濃度で継代された培養細胞液６ｍｌ（以下、６ｍｌ細胞液という）をシャーレに注入し、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで２４時間培養した。これに各ポリフェノール誘導体を倍地中の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭとなるように添加し、規定時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。
【００５０】
ＨＬ−６０細胞由来のタンパク質の回収：
各ポリフェノール誘導体で規定時間処理した後、培地から細胞液を５０ｍｌチューブに回収した。５０ｍｌチューブで回収したＨＬ−６０細胞を、遠心分離（２０００ｒｐｍ、８分間）した後、上澄みを除去した。これに、予め氷冷しておいた滅菌ＰＢＳ溶液１ｍｌを加え、ＨＬ−６０細胞を懸濁し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注して遠心分離（２０００ｒｐｍ、５分間、４℃）を行った後、上澄みを除去した。これに懸濁バッファー溶液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を８０μｌ加え、超音波洗浄装置にてよく懸濁した。これにＳＤＳ溶液（５０％ＳＤＳを０．３ｍｌ、２００μＭ ＤＴＴを１２０μｌ、蒸留水を１８０μｌ混合した溶液）を８０μｌ加え、よく攪拌し、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブの蓋をよく閉めたまま、加熱（１００℃、５分間）した。冷後、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブごと−８０℃で保存した。
【００５１】
ウェスタンブロッティング：
予め電気泳動槽内にランニングバッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を満たしたランニングゲル（ｒｕｎｎｉｎｇ ｇｅｌ）の各レーンに、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブごと−８０℃で保存し、解凍した溶液を分注し、１００Ｖ（１０〜２０ｍＡ）で泳動を開始した。電気泳動後、ランニングゲルを取り出し、目的としたタンパク質が泳動されたランニングゲルをカッターで切り出した。トランスファー装置にろ紙を３枚重ね、この上に切り出したランニングゲルを静置し、さらにこの上に、メンブラン、ろ紙を３枚重ね、蓋をした後、電流を流した（メンブラン面積ｘ２ｍＡの電流で２時間）。トランスファーの終了後、シーソー上で軽く揺らしながらメンブランをＴＢＳ（２５ｍｌ）に５分間浸漬し、次に、固定バッファー溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）の３０ｍｌに浸漬し（２時間）、タンパク質を固定化する。予め一次抗体を添加した一次抗体希釈バッファー溶液（ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）の１０ｍｌにタンパク質を固定化したメンブランをシーソー上で軽く揺らしながら１２時間以上反応した。反応後、ＴＢＳ−Ｔ（３０ｍｌ）でメンブランを洗浄し（５分間、３回）、予め２次抗体を添加した固定バッファー溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）の３０ｍｌに浸漬し（１時間）、２次抗体と反応した。反応後、ＴＢＳ−Ｔ（３０ｍｌ）でメンブランを洗浄し（５分間、３回）、自動化学発光検出装置でオートモニタリングを行い、メンブラン上のタンパク質を検出した。
【実施例６】
【００５２】
［抗酸化剤を用いたＨＬ−６０細胞の産生する特異タンパク質の活性阻害実験］
方法は前記したＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の検出と同様である。また、方法は、文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各ポリフェノール誘導体の添加の１時間前に抗酸化剤を添加し、ＨＬ−６０細胞が産生する特異タンパク質の活性阻害をウェスタンブロッティングにより観察した。添加した酸化剤は、３種類であった。抗酸化剤であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎ、ＮＡＣ）の１Ｍ溶液を６ｍｌ細胞液に３０μｌ添加した。抗酸化剤であるカタラーゼ（Ｃａｔａｌａｓｅ、ＣＡＴ）の１００Ｕ／μｌ溶液を６ｍｌ細胞液に６μｌ添加した。抗酸化剤であるアスコルビン酸（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ、ＡＡ）の４０ｍＭ溶液を６ｍｌ細胞液に９μｌ添加した。
【実施例７】
【００５３】
［ＨＬ−６０細胞内の過酸化水素発生によるアポトーシスの発現実験］
２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／１ｍｌのＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で継代したＨＬ−６０細胞を、平底の１ ｐｌａｔｅ ４８ ｗｅｌｌの１ ｗｅｌｌあたり２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／４００μｌのＨＬ−６０細胞数になるように培地でＲＭＰＩ１６４０（１０％ＦＢＳ＋）培地で希釈し、２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／４００μｌのＨＬ−６０細胞を各ｗｅｌｌへ分注した。これを５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件で、インキュベーターで２４時間培養した。
【００５４】
培養後各ｗｅｌｌに、各ポリフェノール誘導体の濃度が０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度になるように、また、各ｗｅｌｌの培地量が全量で３０μｌとなるように添加した。添加後、プレート毎に規定した時間について、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで１５分培養した。
【００５５】
培養後、各ｗｅｌｌにＤＣＦＡ−ＤＡ溶液（ジクロロフルオレシン−ジアセテート；ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｃｉｎ−ｄｉａｃｅｔａｔｅ、の１ｍｇをエタノールの４１３μｌに溶解したもの）を１．６μｌずつ分注した。プレート毎に３０分間、５％二酸化炭素含有大気中３７℃の条件下、インキュベーターで培養した。培養終了後、マイクロプレートリーダーで蛍光を測定した（励起波長：４８５ｎｍ、エミッション波長：５３０ｎｍ）。ポリフェノールを添加することによってＨＬ−６０細胞で発生する活性酸素量は次のようにして算出した。ポリフェノールを添加した、ＤＣＦＡ−ＤＡ溶液を加えたものと加えなかったものの蛍光を引いた値を分子として、ポリフェノールを添加しなかった細胞で、ＤＣＦＡ−ＤＡ溶液を加えたものと加えなかったものの蛍光を引いた値を分母として、これらの数値で計算した値を、活性酸素量として算出した。
【実施例８】
【００５６】
ポリフェノール誘導体のＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化について検討した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各ポリフェノール誘導体（１）〜（２６）を１００μＭ濃度用いて、ＨＬ−６０細胞を６時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図１〜図３に示した。
【００５７】
化合物１１であるプロシアニジンＢ−４を除く、全てのポリフェノール誘導体によってＨＬ−６０細胞のＤＮＡが断片化されたことがわかる。図中Ｍと記載してあるものはＤＮＡマーカーを示す。図中Ｃと記載してあるものはコントロールを示す。図１中、ｅｃｇは（−）−エピカテキン３−ガレート、ｅｃは（−）−エピカテキン、ｃａは（＋）−カテキン、ｍｇは（−）−エピカテキン３−メチルガレートを示し、いずれも茶葉より単離されたものである。図２中、ｐＱと記載されてあるものは３−Ｏ−ｐ−クマロイルキナ酸、ｃａｆと記載されてあるものはカフェインで、いずれも茶葉より単離されたものである。図３中、ｔｒｉＧと記載されてあるものは、１，４，６−トリ−Ｏ−ガロイル−β−Ｄ−グルコースであり、茶葉より単離されたものである。
【実施例９】
【００５８】
プロアントシアニジン誘導体（６）〜（１０）（４β−８結合のプロアントシアニジン類）（表２）を、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度でＭＴＴ ａｓｓａｙを行い、ＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖の抑制効果を調べた。その結果を表７に示した。表中のＩＣ５０は、ＨＬ−６０細胞生存率に対する５０％抑制濃度を示す。
【００５９】
【表７】
【００６０】
表７から、化合物９の（−）−エピガロカテキン （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレートが最も低いＩＣ５０の値を与え、したがって、最も強いＨＬ−６０細胞増殖抑制効果を有した。他のプロアントシアニジン誘導体（６）〜（８）、（１０）も強い抑制効果を示すことがわかる。
【実施例１０】
【００６１】
プロアントシアニジン誘導体（１１）〜（１５）（４α−８結合のプロアントシアニジン類）（表３）を、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度でＭＴＴ ａｓｓａｙを行い、ＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖の抑制効果を調べた。その結果を表８に示した。表中のＩＣ５０は、ＨＬ−６０細胞生存率に対する５０％抑制濃度を示す。
【００６２】
【表８】
【００６３】
表８から、化合物１４のプロデルフィニジンＢ−４が最も低いＩＣ５０の値を与え、したがって、最も強いＨＬ−６０細胞増殖抑制効果を有した。プロシアニジンＢ−４（１１）はＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖の抑制効果を示さない。他のプロアントシアニジン誘導体（１２）、（１３）、（１５）も強い抑制効果を示すことがわかる。
【００６４】
表７と表８の結果から、プロアントシアニジン二量体の化学構造について、上部ユニットが２Ｒ、３Ｓ構造を有するものが、より強いＨＬ−６０細胞増殖の抑制効果を示した。また、上部ユニットのＢ環はピロガロールタイプであり、下部ユニットのＢ環はカテコールタイの化学構造を有するものが、より強いＨＬ−６０細胞増殖の抑制効果を示した。一方、上部と下部が同一ユニットであるプロアントシアニジンでは、ガロイル基の結合する数が増加するとＨＬ−６０細胞増殖の抑制効果が減少することがわかる。
【実施例１１】
【００６５】
プロアントシアニジン誘導体のＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化について検討した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。各プロアントシアニジン誘導体（６）〜（１５）を７５μＭ濃度用いて、ＨＬ−６０細胞を６時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡについてアガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図４に示した。
【００６６】
化合物１１であるプロシアニジンＢ−４を除く、全てのプロアントシアニジン誘導体によってＨＬ−６０細胞のＤＮＡが断片化されたことがわかる。中でも、化合物６のプロデルフィニジンＢ−２と化合物７のプロデルフィニジンＢ−２ ３−Ｏ−ガレートは、特に強くＨＬ−６０細胞のＤＮＡを断片化した。
【実施例１２】
【００６７】
プロデルフィニジンＢ−２（６）によるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化について、アポトーシスを誘導する最適時間と最適濃度を詳しく調べた。プロデルフィニジンＢ−２（６）を７５μＭで固定し、ＨＬ−６０細胞を０、２、４、６、１２、１８時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。一方、プロデルフィニジンＢ−２（６）を０、２５、５０、７５、１００、１２５μＭの濃度でＨＬ−６０細胞を６時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。各々得られた核由来のＤＮＡについて、アガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図５に示した。プロデルフィニジンＢ−２（６）は、図５の（１）に示すようにＨＬ−６０細胞のＤＮＡを４時間以降に断片化を誘導し、その誘導は６時間で最大となった。図５の（２）に示すように濃度が上昇するに伴いＤＮＡを強く断片化し、７５μＭ以上からその誘導は最大となった。この結果から、プロデルフィニジンＢ−２（６）のアポトーシス誘導能は、図５の時間（１）と濃度（２）に依存した。図中Ｍと記載してあるものはＤＮＡマーカーを示す。
【実施例１３】
【００６８】
プロデルフィニジンＢ−２（６）によるＨＬ−６０細胞のカスパーゼ３、ポリＡＤＰ−リボース ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、カスパーゼ９、カスパーゼ８の活性について調べた。方法は、文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。その結果を図６に示す。図６の（１）に示すように、プロデルフィニジンＢ−２（６）により４時間後、カスパーゼ３が切断され、活性化された。また、図６の（２）および（３）に示すように、ＰＡＲＰおよびカスパーゼ９も同様に４時間後切断され、活性化された。図６の（４）に示すように、カスパーゼ９は２時間後に切断が起こり、活性化された。この結果、プロデルフィニジンＢ−２（６）は、カスパーゼ８を活性化し、続いてカスパーゼ３を活性化する。また、ミトコンドリアを経由してカスパーゼ９を刺激し、同様にカスパーゼ３を活性化し、ＤＮＡが断片化されてアポトーシスを発現することがわかる。
【実施例１４】
【００６９】
プロデルフィニジンＢ−２（６）がＨＬ−６０細胞内の過酸化水素を発生するかどうかについて、ＤＣＦＨ−ＤＡを用いて調べた。その結果を図４に示した。図７の（１）に示すように、プロデルフィニジンＢ−２（６）の添加濃度が上がるにつれて、細胞内の相対活性酸素量も増加した。また、図７の２に示すように、プロデルフィニジンＢ−２（６）の濃度を７５μＭに固定して経時的変化を観察したところ、細胞内の相対活性酸素量は１５分の誘導時間で約１１倍量となることがわかる。
【実施例１５】
【００７０】
プロデルフィニジンＢ−２（６）によるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化が活性酸素を介して発現するかどうかを確かめるため、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、カタラーゼ、およびアスコルビン酸の三つの抗酸化剤を用いて調べた。ＮＡＣとカタラーゼは、プロデルフィニジンＢ−２（６）処理の１時間前に培地に添加した。その結果を図８に示す。ＮＡＣ処理区とカタラーゼ処理区では、プロデルフィニジンＢ−２によるＨＬ−６０細胞のＤＮＡ断片化は認められなかった。また、アスコルビン酸処理区では、ＤＮＡ断片化が認められた。この結果、ＮＡＣとカタラーゼの抗酸化剤がプロデルフィニジンＢ−２によるＤＮＡ断片化を抑制したことが分かり、結果として、プロデルフィニジンＢ−２（６）が活性酸素を介してカスパーゼ８を活性化し、ＨＬ−６０細胞のＤＮＡを断片化したことがわかる。
【実施例１６】
【００７１】
Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、カタラーゼ、およびアスコルビン酸の三つの抗酸化剤が、プロデルフィニジンＢ−２（６）のＨＬ−６０細胞内の過酸化水素の発生を阻害するかどうかについて、ＤＣＦＨ−ＤＡを用いて調べた。その結果を図９に示した。ＮＡＣ処理区とカタラーゼ処理区では、プロデルフィニジンＢ−２によるＨＬ−６０細胞内の過酸化水素の発生を阻害した。また、アスコルビン酸処理区でも、プロデルフィニジンＢ−２によるＨＬ−６０細胞内の過酸化水素の発生を阻害した。この結果、プロデルフィニジンＢ−２（６）がＨＬ−６０細胞内の活性酸素を産生することがわかる。
【実施例１７】
【００７２】
テアシネンシン誘導体（２０）〜（２４）（表６）とエピガロカテキン３−Ｏ−ガレート（２）を、２５、５０、１００、２００μＭの濃度でＭＴＴ ａｓｓａｙを行い、ＬｏＶｏ細胞に対する細胞増殖の抑制効果を調べた。その結果を図１０に示した。テアシネンシンＥ（２４）を除く全てのテアシネンシン類にＬｏＶｏ細胞の増殖を抑制する効果があることがわかる。この結果より、ＩＣ５０を算出した。その結果を表９に示す。表中のＩＣ５０は、ＬｏＶｏ細胞生存率に対する５０％抑制濃度を示す。
【００７３】
【表９】
【００７４】
表８から、化合物２０のテアシネンシンＡが最も低いＩＣ５０の値を与えた。したがって、最も強いＬｏＶｏ細胞増殖抑制効果を有した。フラバン骨格の３位にガロイル基の結合する数が増すにつれて活性がつよくなることがわかる。
【実施例１８】
【００７５】
テアシネンシンＡ（２０）によるＬｏＶｏ細胞のＤＮＡ断片化について、アポトーシスを誘導する最適濃度を詳しく調べた。テアシネンシンＡ（２０）を０、２５、５０、１００μＭの濃度でＬｏＶｏ細胞を４８時間処理し、細胞核からＤＮＡを抽出した。各々得られた核由来のＤＮＡについて、アガロースゲル電気泳動を行い、その結果を図１１に示した。図１１に示すように、濃度が上昇するに伴いＬｏＶｏ細胞のＤＮＡを強く断片化することがわかる。図中Ｍと記載してあるものはＤＮＡマーカーを示す。図中Ｃと記載してあるものはコントロールを示す。
【実施例１９】
【００７６】
テアシネンシンＡ（２０）によるＬｏＶｏ細胞のポリＡＤＰ−リボース ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ、ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の活性について調べた。方法は、文献記載の方法で測定した（Ｈｏｕ、Ｄ．Ｘ．、ｅｔ．ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、２３：２００３）。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＰＡＲＰは４８時間後切断され、活性化された。また、テアシネンシンＡ（２０）の濃度が上昇すると強くＰＡＲＰを活性化することがわかる。
【実施例２０】
【００７７】
［ウーロンホモビスフラバンＡ（１６）およびモノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（１７）の合成］
５ｇの（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（２）を４０ｍｌのエタノールに溶解する。これに、１規定塩酸−エタノール溶液を加える。これを室温下攪拌しながら、４％ホルマリン−エタノール溶液７０ｍｌを約１時間かけて滴下する。反応液は直接、デキストランゲル（セファデックスＬＨ−２０）のカラムクロマトグラフィーに付し、分画した。各分画はさらにポリスチレンゲル（ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ）、オーディーエス（ＯＤＳ）のカラムクロマトを繰り返し行い、３４４ｍｇの化合物（１６）と１８８ｍｇの化合物（１７）とを合成した。
【実施例２１】
【００７８】
［テアシネンシンＡ（２０）とテアシネンシンＤ（２３）の合成］
１０ｇの（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（２）を５００ｍｌの蒸留水に溶解する。予め、フェリシアン化カリウム（Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６）（６ｇ）と炭酸水素ナトリウム（６ｇ）を１００ｍｌの蒸留水に溶解した溶液を、氷冷下攪拌しながら１時間かけて滴下した。反応液は直接、ポリスチレンゲル（ＭＣＩ ｇｅｌ ＣＨＰ−２０Ｐ）に付し、分画した。各分画はさらにデキストランゲル（セファデックスＬＨ−２０）、オーディーエス（ＯＤＳ）のカラムクロマトを繰り返し行い、３９２ｍｇの化合物（２０）と８９ｍｇの化合物（２３）とを合成した。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例８）
【図２】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例８）
【図３】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例８）
【図４】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１１）
【図５】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１２）（１）ＤＮＡ断片化の経時的変化（２）ＤＮＡ断片化の濃度的変化
【図６】ウエスタンブロッティングの図である。（実施例１３）（１）カスパーゼ３の活性化ＰＡＲＰの活性化（３）カスパーゼ９の活性化（４）カスパーゼ８の活性化
【図７】相対活性酸素量の図である。（実施例１４）（１）活性酸素の濃度的変化（２）活性酸素の経時的変化
【図８】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１５）
【図９】相対活性酸素量の図である。（実施例１６）
【図１０】ＬｏＶｏ細胞生存率（％）の図である。（実施例１７）
【図１１】アガロースゲル電気泳動の図である。（実施例１８）
【図１２】ウエスタンブロッティングの図でＰＡＲＰの活性化の図である。（実施例１９）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノール誘導体を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項２】
ポリフェノール誘導体が、（−）−エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１）、（−）−エピガロカテキン−３、５−ジ−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ３、５−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（３）、（＋）−ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（４）、８−Ｃ−アスコルビルエピガロカテキン（８−Ｃ−ａｓｃｏｒｂｙｌ ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（５）、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２）（６）、プロデルフィニジンＢ−２ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（７）、プロデルフィニジンＢ−２ ３、３'−ジ−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３、３'−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（８）、（−）−エピガロカテキン （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（９）、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１０）、プロシアニジンＢ−４（ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎＢ−４）（１１）、（＋）−ガロカテキン （４α−８） （−）−エピカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）（１２）、（＋）−カテキン （４α−８） （−）−エピガロカテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１３）、プロデルフィニジンＢ−４（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４）（１４）、プロデルフィニジンＢ−４ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１５）、ウーロンホモビスフラバンＡ（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１６）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（ｍｏｎｏｄｅｓｇａｌｌｏｙｌ ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１７）、アッサミカインＡ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ａ）（１８）、アッサミカインＢ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ｂ）（１９）、テアシネンシンＢ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｂ）（２１）、テアシネンシンＣ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｃ）（２２）、テアシネンシンＤ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｄ）（２３）、テアシネンシンＥ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｅ）（２４）、ストリクティニン（ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）（２５）、没食子酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）（２６）、である請求項１記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項３】
前記したポリフェノール誘導体が緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、癌疾患細胞に対する請求項１または請求項２に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項４】
ポリフェノール誘導体が、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（２）、テアシネンシンＡ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ａ）（２０）、である請求項１記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
前記したポリフェノール誘導体が緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、癌疾患細胞（Ｕ９３７のリンパ球癌細胞を除く）に対する請求項１または請求項４記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項６】
ポリフェノール誘導体が緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ）に対する請求項１〜請求項５のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項７】
癌疾患細胞が、胃癌、肺癌、すい臓癌、腎臓癌、大腸癌、血液癌である請求項１〜請求項６のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項８】
ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、癌疾患細胞に対する請求項１〜請求項７のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項９】
ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対する請求項１〜請求項８のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項１】
ポリフェノール誘導体を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤。
【請求項２】
ポリフェノール誘導体が、（−）−エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１）、（−）−エピガロカテキン−３、５−ジ−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ ３、５−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（３）、（＋）−ガロカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（４）、８−Ｃ−アスコルビルエピガロカテキン（８−Ｃ−ａｓｃｏｒｂｙｌ ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（５）、プロデルフィニジンＢ−２（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２）（６）、プロデルフィニジンＢ−２ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（７）、プロデルフィニジンＢ−２ ３、３'−ジ−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−２ ３、３'−ｄｉ−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（８）、（−）−エピガロカテキン （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（９）、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート （４β−８） （−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ（４β−８）ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１０）、プロシアニジンＢ−４（ｐｒｏｃｙａｎｉｄｉｎＢ−４）（１１）、（＋）−ガロカテキン （４α−８） （−）−エピカテキン（ｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）（１２）、（＋）−カテキン （４α−８） （−）−エピガロカテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ （４α−８） ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ）（１３）、プロデルフィニジンＢ−４（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４）（１４）、プロデルフィニジンＢ−４ ３'−Ｏ−ガレート（ｐｒｏｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ Ｂ−４ ３'−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（１５）、ウーロンホモビスフラバンＡ（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１６）、モノデスガロイルウーロンホモビスフラバンＡ（ｍｏｎｏｄｅｓｇａｌｌｏｙｌ ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎ Ａ）（１７）、アッサミカインＡ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ａ）（１８）、アッサミカインＢ（ａｓｓａｍｉｃａｉｎ Ｂ）（１９）、テアシネンシンＢ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｂ）（２１）、テアシネンシンＣ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｃ）（２２）、テアシネンシンＤ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｄ）（２３）、テアシネンシンＥ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ｅ）（２４）、ストリクティニン（ｓｔｒｉｃｔｉｎｉｎ）（２５）、没食子酸（ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ）（２６）、である請求項１記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項３】
前記したポリフェノール誘導体が緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、癌疾患細胞に対する請求項１または請求項２に記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項４】
ポリフェノール誘導体が、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）（２）、テアシネンシンＡ（ｔｈｅａｓｉｎｅｎｓｉｎ Ａ）（２０）、である請求項１記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項５】
前記したポリフェノール誘導体が緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、癌疾患細胞（Ｕ９３７のリンパ球癌細胞を除く）に対する請求項１または請求項４記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項６】
ポリフェノール誘導体が緑茶、ウーロン茶、紅茶などのいわゆる茶葉から抽出されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ）に対する請求項１〜請求項５のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項７】
癌疾患細胞が、胃癌、肺癌、すい臓癌、腎臓癌、大腸癌、血液癌である請求項１〜請求項６のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項８】
ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、癌疾患細胞に対する請求項１〜請求項７のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【請求項９】
ポリフェノール誘導体が合成されたものであって、ヒト急性前骨髄性白血病疾患細胞（ＨＬ−６０細胞）、ヒト大腸癌細胞（ＬｏＶｏ細胞）に対する請求項１〜請求項８のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００５−７５７９０（Ｐ２００５−７５７９０Ａ）
【公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００３−３０９５８０（Ｐ２００３−３０９５８０）
【出願日】平成１５年９月２日（２００３．９．２）
【出願人】（３０２０６８２１０）
【出願人】（５０２０９６００４）
【出願人】（５００５２７４８７）
【出願人】（３０２０６８２０９）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１７年３月２４日（２００５．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年９月２日（２００３．９．２）
【出願人】（３０２０６８２１０）
【出願人】（５０２０９６００４）
【出願人】（５００５２７４８７）
【出願人】（３０２０６８２０９）
【Ｆターム（参考）】
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