ＣＨＯ細胞由来の糖タンパク質産物におけるガラクトース−α−１，３−ガラクトース含有Ｎ−グリカン
本発明は、哺乳類細胞発現系から発現されたタンパク質において特定のグリカン構造を検出するための方法および材料に関する。本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞集団を、前記細胞によって産生される末端ガラクトース−α−１，３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することで、評価するための方法であって、ＣＨＯ細胞が、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではない、方法を提供するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類細胞発現系から発現されたタンパク質において特定のグリカン構造を検出するための方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの治療用組換え生物医薬品が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞といった哺乳類の細胞培養物で生成されている。ヒトが一般に認識して許容するグリコシル化パターンを持つ糖タンパク質が哺乳類の細胞培養物によって産生されることが主な理由で、組換え糖タンパク質の生成には主に酵母や原核生物系などの他の発現系より哺乳類の細胞培養物のほうが好ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
末端α−結合型ガラクトース（ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ）結合の潜在的な有害作用が周知である Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ３５８：１１ （２００８）。このような末端α−ｇａｌ結合は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生される組換え糖タンパク質には存在しないことがすでに報告されている。たとえば、ＮＳＯすなわちマウス骨髄腫細胞系で産生される抗−ＣＤｗ５２抗体であるＣａｍｐａｔｈは、正常なヒトＩｇＧと一致する３つの糖型に主に含まれるＣＨＯ細胞から産生される非還元末端α−結合型ガラクトース残基Ｃａｍｐａｔｈを有する潜在的に免疫原性の糖型を含む。Ｓｈｅｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４７：１０２〜１１０ （１９９７）。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ひとつには、組換えＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質が、当該糖タンパク質の治療目的での使用に悪影響をおよぼし得る末端ガラクトース−α−１，３−ガラクトース結合を有するグリカン構造を含むという発見に立脚するものである。たとえば、末端α−ｇａｌ結合を有する糖タンパク質を治療目的でヒトに投与すると、以後の投与の効果が落ちたり、患者に有害な過敏性反応が引き起こされたりすることすらある形で、患者で組換え糖タンパク質に対するモノクローナル抗体が形成される場合がある。
【０００５】
こうした過去の教示内容に反して、本出願人らは、驚くべきことに、ＣＨＯ細胞培養物で産生される組換え糖タンパク質の重要な画分が、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の存在を呈することがあり、患者に投与されるタンパク質およびペプチジル産物に対する有害反応の可能性を示していることを見出した。
【０００６】
本発明は、ＣＨＯ細胞からの組換え糖タンパク質および当該糖タンパク質を含有する組成物の生成および分析に有用な化合物および方法であって、糖タンパク質が、調節された（低減されるか、場合によっては増加するなど）レベルの末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合を含む、化合物および方法を提供するものである。
【０００７】
よって、第１の態様では、本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞集団を評価するための方法を含む。特定の実施形態では、この試験方法は、
（ａ）上記の集団から１つ以上のＣＨＯ細胞を提供し、
（ｂ）前記細胞によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することを含み、ＣＨＯ細胞は、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではない。
【０００８】
測定するステップが、以下のいずれかを含むものであってもよい。（ａ）細胞によって産生される糖タンパク質を単離し、この糖タンパク質上で末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定する、（ｂ）細胞によって産生される特定の糖タンパク質組成物を単離し、単離された糖タンパク質組成物上で末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定する、（ｃ）細胞によって産生される糖タンパク質からグリカンを単離し、単離されたグリカンにて末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定する、（ｄ）糖タンパク質または１つ以上のＣＨＯ細胞上に存在するグリカンから単糖を切断し、切断された単糖から末端放出α−ガラクトース残基を検出する、（ｅ）細胞によって産生される糖タンパク質から少なくとも１つのペプチドを提供し、この少なくとも１つのペプチド上で末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定する、（ｆ）１つ以上のＣＨＯ細胞の細胞表面上のグリカンを測定することによって、糖タンパク質上で末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンの相対レベルを測定する。末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いる技術は、以下の方法およびこれらの方法の任意の組み合わせのうち１つ以上を含み得る：クロマトグラフによる方法、質量分析（ＭＳ）法、電気泳動法（細管式電気泳動など）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、単糖分析、蛍光法、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度、酵素による方法、検出分子（抗体またはレクチンなど）の使用。
【０００９】
ステップ２での測定用のグリカンの起源は、ＣＨＯ細胞の集団；ＣＨＯ細胞の表面で発現される糖タンパク質またはグリカン；ＣＨＯ細胞の集団の細胞表面に存在するタンパク質の切断由来のペプチド；ＣＨＯ細胞の集団の表面に存在するグリカン；ＣＨＯ細胞の集団によって分泌または発現される糖タンパク質、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞の集団から発現される単離された糖タンパク質発現産物；ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞の集団から発現される単離されたタンパク質発現産物由来のペプチド；またはＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞の集団から直接的に発現される単離されたタンパク質発現産物由来のグリカンからなる群から選択されるものであってもよい。いくつかの実施形態では、この方法が、グリカンまたは糖ペプチドの起源を、α−ガラクトシダーゼ酵素を含む１種類以上のエキソグリコシダーゼで処理した後、グリカン集団を分析することを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、使用する方法が、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンの定量的な方策を提供するものである。いくつかの実施形態では、使用する方法が、定性的な方策を提供するものである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＨＯ細胞の培養物から糖タンパク質調製物を調製し、１つ以上のグリカンを糖タンパク質調製物（α−１，３−ガラクトシダーゼ；α−１，４−ガラクトシダーゼ；またはα−１，６−ガラクトシダーゼなどの１つ以上のグリコシダーゼを有するなど）から切断し、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することも含む。
【００１２】
特定の実施形態では、生成ラインのＣＨＯ細胞培養物から試料を得ることで、上記の方法を治療用糖タンパク質の生成実施時に実施して、たとえば生成時にグリカン構造を監視する。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞の培養時間のあいだに、測定するステップを少なくとも１回、２回、３回またはそれより多く繰り返すなど、測定するステップを時間の経過とともに少なくとも１回繰り返す。他の実施形態では、たとえば糖タンパク質産物の品質または放出試験の一部として、ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質産物で上記の方法を実施する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、測定するステップが、ＣＨＯ細胞の第１の集団から産生される第１の糖タンパク質調製物における末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンのレベルを、ＣＨＯ細胞の第２の集団から産生される第２の糖タンパク質調製物における末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンのレベルと比較することを含む。このようないくつかの実施形態では、異なる培養条件下で培養されたＣＨＯ細胞の集団からの糖タンパク質調製物のグリカンを判断し、比較する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、この方法が、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンのレベルを、基準レベル（対照レベルまたは製品仕様における範囲または値など）と比較するステップをさらに含むものであってもよい。
【００１５】
この方法の特定の実施形態では、測定するステップが、末端α−ガラクトシル残基の有無を検出できる検出分子の使用を含む。特定の実施形態では、検出分子が、末端α−ガラクトシルエピトープに結合できる抗体を含む。本発明の他の実施形態では、検出分子がレクチンを含む。いくつかの実施形態では、検出分子が、蛍光部分または放射性同位元素部分を含むものであってもよい。
【００１６】
ＣＨＯ細胞集団は、クローン細胞集団を含むものであってもよい。ＣＨＯ細胞集団は、治療用糖タンパク質を製造するためのバイオリアクタ内で、培養物中など、あるいは細胞培養物由来の試料中にあってもよい。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞集団が、治療用糖タンパク質をコードする少なくとも１つのベクターで形質転換されることになる。治療用糖タンパク質は、ヒト由来のものであってもよいし、非ヒト由来または合成由来のものであってもよい。治療用糖タンパク質は、ヒトの治療用であってもよいし、獣医学的適応症の治療用であってもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、この方法は、動物モデルなどにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏなどで、糖タンパク質の免疫原性潜在力の存在またはレベルを評価するなど、細胞によって生成される糖タンパク質の生物活性を評価するステップをさらに含む。
【００１８】
第２の態様では、本発明は、糖タンパク質上にて末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを産生する機能について、１つ以上のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）複数のＣＨＯ細胞集団であって、複数のうちいずれもグリカン上で末端α−ガラクトシル残基を発現するよう遺伝子操作されていない（α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されていないなど）細胞集団を提供し、
（ｂ）複数のＣＨＯ細胞の各々を、糖タンパク質発現産物の発現に適した条件下で培養し、
（ｃ）複数のＣＨＯ細胞各々によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定し、
（ｄ）選択されたＣＨＯ細胞調製物によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基の標的レベルの存在に基づいて、複数のＣＨＯ細胞調製物のうちの１つ以上を選択することを含む、方法を含む。
【００１９】
末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを、ＣＨＯ細胞調製物によって産生された糖タンパク質から、ＣＨＯ細胞調製物の単離された糖タンパク質発現産物から、ＣＨＯ細胞調製物の糖タンパク質発現産物から得られるペプチドから、ＣＨＯ細胞調製物の細胞表面グリカンから、あるいはＣＨＯ細胞調製物またはその糖タンパク質発現産物から得られるグリカン調製物から得て、測定することができる。特定の実施形態では、スクリーニング方法が、糖タンパク質発現産物を細胞培養物から単離し、ステップ（ｃ）で細胞によって産生される糖タンパク質の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を測定するステップをさらに含む。特定の実施形態では、細胞スクリーニング方法が、糖タンパク質発現産物上に存在するα−ガラクトシル残基の量を定量化するステップをさらに含む。特定の実施形態では、細胞スクリーニング方法のステップ（ｂ）を、バイオリアクタ内で実施する。
【００２０】
複数のＣＨＯ細胞集団は各々、治療用糖タンパク質の製造トレインにおける細胞培養物からの異なるＣＨＯ株集団、異なるクローン細胞集団または異なる試料（経時的に得られた試料など）を含むものであってもよい。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞集団が、ヒト治療用糖タンパク質などの治療用糖タンパク質をコードする少なくとも１種のベクターで形質転換されることになる。細胞スクリーニング方法の特定の実施形態では、糖タンパク質発現産物が、ＣＨＯ細胞から発現される分泌糖タンパク質である。
【００２１】
スクリーニング方法の測定するステップは、糖タンパク質上の末端α−ガラクトシル残基を同定および／または定量化するために本明細書に開示のどの技術を含むものであってもよい。
【００２２】
第３の態様では、本発明は、ＣＨＯ細胞宿主で産生される糖タンパク質組成物を評価するための方法を含む。この方法は、糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することを含み、この糖タンパク質組成物は、ＣＨＯ宿主細胞で産生されたものであり、ＣＨＯ宿主細胞は、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではなかった。
【００２３】
いくつかの実施形態では、この方法は、糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースのレベルを、印刷またはコンピュータ読み取り可能な媒体に記録することを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、この方法は、糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの測定レベルを、対照または基準規格などの基準レベルと比較することも含む。基準レベルは、規格（ＦＤＡラベルまたは医師による添付物など）であってもよいし、糖タンパク質組成物を含有する製剤調製物の品質基準であっても構わない。
【００２５】
いくつかの実施形態では、基準レベルまたは品質基準は、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％、０．２５％、０．２％、０．１％またはそれ未満など、糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースが５％以下である。糖タンパク質組成物中に存在するガラクトース−α−１−３−ガラクトースのレベルは、糖タンパク質調製物などの試料中のグリカンの総量に対する、ガラクトース−α−１−３−ガラクトースを含有するグリカンのレベルとして測定可能である。
【００２６】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、クロマトグラフによる方法を含む。
【００２７】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、質量分析（ＭＳ）法を含む。
【００２８】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、電気泳動法（細管式電気泳動など）を含む。
【００２９】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法を含む。
【００３０】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、単糖分析を含む。
【００３１】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、蛍光法を含む。
【００３２】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度を含む。
【００３３】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、酵素による方法を含む。
【００３４】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、および検出分子（抗体またはレクチンなど）の使用を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ｎ−グリカン構造に共通するコア五糖の図である。
【図２】末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合を有する非還元末端Ｎ−グリカン構造の図である。
【図３】ガラクトース−α−１−３結合型ガラクトース含有構造に対応し得る組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１のグリカン種の検出を示している、Ａｂａｔａｃｅｐｔ由来のグリカンの画分の蛍光クロマトグラムである。
【図４】組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１のＡｂａｔａｃｅｐｔ由来のグリカン種のＭＳ２スペクトルを示す。このスペクトルは、非還元末端ガラクトース−α１−３−ガラクトースを含有するグリカン構造と相関している。
【図５】α−ガラクトシダーゼでの処理前後のＡｂａｔａｃｅｐｔおよび対照タンパク質（同じく組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１のグリカンを含有する）由来のグリカン画分の蛍光クロマトグラムである。
【図６】Ａｂａｔｅｃｅｐｔ由来のグリカン画分をαガラクトシダーゼで処理して生成した組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ５Ｆｕｃ１の種のＭＳ２スペクトルである。
【図７】異なるエキソグリコシダーゼで処理したＡｂａｔａｃｅｐｔ由来のグリカン画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
以下に明示的に定義しないかぎり、本明細書で使用する用語はいずれも、当業者であれば理解できるであろう通常の意味で用いられる。
【００３７】
およそ、約、だいたい：本明細書で使用する場合、１以上の目的の値に適用される「およそ」、「約」または「だいたい」という表現は、明記された参照値に近い値を示す。特定の実施形態では、「およそ」、「約」または「だいたい」という表現は、明記された参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満以内に入る値の範囲を示す。
【００３８】
検出、検出する：本明細書で使用する場合、「検出する」、「検出」、「検出手段」という表現は、末端α−１，３−ガラクトシル残基などの特定の化学部分が、化合物、組成物、細胞または細胞集団内またはその表面に存在するか否かの判断を示すものとして同義に用いられる。検出手段は、選択可能なマーカーあるいは、蛍光または放射性部分などの同定可能な特徴を伴うものであってもよく、試薬、化合物、細胞または細胞集団の標識を伴うものであってもよい。検出は、質量分析または関連の方法、電気泳動法、核磁気共鳴、クロマトグラフによる方法あるいは上記の組み合わせなどの技術を使用して、化合物、組成物、細胞または細胞集団を分析し、化合物、組成物、細胞または細胞集団内またはその表面に化学部分が存在するか否かを判断することも示し得る。また、検出は、検出対象となる化学部分の絶対レベルまたは関連レベルの定量化を伴うものであってもよい。
【００３９】
グリカン：当該技術分野において周知のように、かつ本明細書で使用する場合、「グリカン」とは糖である。グリカンは、糖残基のモノマーまたはポリマーであってもよいが、一般に少なくとも３つの糖を含み得るものであり、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。グリカンには、天然の糖残基（ブドウ糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、ヘキソース、アラビノース、リボース、キシロースなど）および／または修飾糖（２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、ホスホマンノース、６’スルホＮ−アセチルグルコサミンなど）を含むこともある。「グリカン」という用語は、糖残基のホモポリマーおよびヘテロポリマーを含む。「グリカン」という用語はまた、（糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンなどの）糖タンパク質のグリカン成分も包含する。この用語はまた、糖タンパク質から切断されたか、そうでなければ放出されたグリカンをはじめとする、遊離グリカンも包含する。
【００４０】
グリカン調製物：「グリカン調製物」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の製造方法で得られる一組のグリカンを示す。いくつかの実施形態では、グリカン調製物は、糖タンパク質調製物（下記の糖タンパク質調製物の定義を参照のこと）から得られる一組のグリカンを示す。いくつかの実施形態では、グリカン調製物が糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、グリカン調製物が放出されたグリカンを含む。
【００４１】
糖タンパク質：本明細書で使用する場合、「糖タンパク質」という用語は、１つ以上の糖部分（すなわちグリカン）に共有結合されたペプチド骨格を有するタンパク質（本明細書で定義されるもの）を示す。当業者であれば理解できるように、ペプチド骨格は一般に、アミノ酸残基の直鎖を含む。糖部分は、単糖、二糖、オリゴ糖および／または多糖の形であってもよい。糖部分は、糖残基の単一の非分岐鎖を含むものであってもよいし、１つ以上の分岐鎖を含むものであってもよい。特定の実施形態では、糖部分は、硫酸基および／またはリン酸基を含むものであってもよい。上記の他にまたは上記に加えて、糖部分は、アセチル、グリコリル、プロピルまたは他のアルキル修飾を含むものであってもよい。特定の実施形態では、糖タンパク質がＯ−結合型糖部分を有する。特定の実施形態では、糖タンパク質がＮ−結合型糖部分を有する。
【００４２】
糖タンパク質調製物：「糖タンパク質調製物」とは、この用語を本明細書で使用する場合、各々が少なくとも１つのグリコシル化部と共有結合した少なくとも１つのグリカンと特定のアミノ酸配列（このアミノ酸配列は少なくとも１つのグリコシル化部位を含む）を有するポリペプチドを含む個々の糖タンパク質分子の組を示す。糖タンパク質調製物中の特定の糖タンパク質の個々の分子は一般に、同じアミノ酸配列を有するが、少なくとも１つのグリコシル化部位の占有率および／または少なくとも１つのグリコシル化部位に結合されたグリカンのアイデンティティが異なっていてもよい。すなわち、糖タンパク質調製物は、特定の糖タンパク質の糖型を１つだけ含むものであってもよいが、より一般には複数の糖型を含む。同じ糖タンパク質の異なる調製物同士で、存在する糖型のアイデンティティが異なる（１つの調製物に存在する糖型が他の糖型には存在しなくてもよい）および／または異なる糖型の相対量が異なっていてもよい。
【００４３】
グリコシダーゼ：「グリコシダーゼ」という用語は、本明細書で使用する場合、グリカンにおける連続した糖と糖との間または糖と骨格部分との間（糖タンパク質のペプチド骨格と糖との間など）の共有結合を切断する作用剤を示す。いくつかの実施形態では、グリコシダーゼが酵素である。特定の実施形態では、グリコシダーゼが、１つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質（タンパク質酵素など）である。特定の実施形態では、グリコシダーゼがヒドラジンなどの化学的な切断剤である。
【００４４】
Ｎ−グリカン：「Ｎ−グリカン」という用語は、本明細書で使用する場合、糖タンパク質から放出されたが、それまでは窒素結合によって糖タンパク質に結合されていた糖のポリマーを示す（下記のＮ−結合型グリカンの定義を参照のこと）。
【００４５】
Ｎ−結合型グリカン：Ｎ−結合型グリカンとは、窒素結合によって糖タンパク質に結合されたグリカンである。種々雑多なＮ−結合型グリカンが存在するが、これらは一般に共通の五糖コア（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）（ＧｌｃＮＡｃ）をベースにしている。
【００４６】
Ｏ−グリカン：「Ｏ−グリカン」という用語は、本明細書で使用する場合、複合糖質から放出されたが、それまでは酸素結合によって複合糖質に結合されていた糖のポリマーを示す（下記のＯ−結合型グリカンの定義を参照のこと）。
【００４７】
Ｏ−結合型グリカン：Ｏ−結合型グリカンとは、酸素結合によって複合糖質に結合されたグリカンである。Ｏ−結合型グリカンは一般に、Ｌ＆＃８２１２：セリン（Ｓｅｒ）またはＬ−トレオニン（Ｔｌｉｒ）の水酸基に対するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を介して糖タンパク質に結合されている。Ｏ−結合型グリカンの中にはアセチル化および硫酸化などの修飾を有するものもある。
【００４８】
調節する：「調節する」という表現は、本明細書で使用する場合、所定の制限内で、糖タンパク質組成物中に存在するα−ガラクトース残基のレベルなどのパラメータの値を制御する機能または動作主を示す。よって、いくつかの実施形態では、α−ガラクトース残基のレベルが所定の制限内におさまるようにこれを調節すればよい。いくつかの実施形態では、糖タンパク質組成物中に存在する全Ｎ−グリカンの５．０％、１．０％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％を超えないようにα−ガラクトース残基のレベルを調節すればよい。他の実施形態では、α−ガラクトース残基のレベルが、所定のレベルまたは所望のレベルの１０．０％、５．０％、１．０％、０．５％または０．１％を超えて変わらないように、これを調節してもよい。
【００４９】
プロテアーゼ：「プロテアーゼ」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリペプチド鎖における連続したアミノ酸の間にあるペプチド結合を切断する作用剤を示す。いくつかの実施形態では、プロテアーゼが酵素（すなわちタンパク質分解酵素）である。特定の実施形態では、プロテアーゼが、１つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質（タンパク質酵素など）である。特定の実施形態では、プロテアーゼが化学的な切断剤である。
【００５０】
提供する：「提供する」という表現は、本明細書で使用する場合、動作主が、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞調製物または糖タンパク質調製物などの対象品目を、何らかの起源から得ることを示し、動作主自身の製造または動作主が他の第三者からその品目を受け取って入手することを含むが、これに限定されるものではない。たとえば、ＣＨＯ細胞調製物は、機械、人間または実体によって製造または受け取られると、提供されることになる。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞調製物を機械によって受け取った上で、この機械で、糖タンパク質調製物の試験、加工または精製の１つ以上を実施してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞調製物を人間が受け取ってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞調製物を外部の実体から受け取ってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞調製物を、別の人間または事業のために特徴付けのサービスを実施している人間または事業が受け取ってもよい。
【００５１】
末端α−１，３−ガラクトース残基；末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合：「末端α−１，３−ガラクトース残基」、「末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合」および「非還元末端α−１，３結合型ガラクトース残基」という用語は、本明細書で使用する場合、図２に示すグリカン構造を同義に説明するものであり、図中、ペプチドまたはタンパク質に結合できるグリカン構造が、それぞれガラクトース分子の１および３残基で示される残基で互いに結合された２つのガラクトース残基で終端する。
【００５２】
（特定の実施形態の詳細な説明）
組換え糖タンパク質の合成に用いる宿主細胞は、複雑なグリコシル化を生成するための細胞内機構を有するが、これらの細胞は糖タンパク質が天然に発現される細胞と常に同じ酵素の相補体を持つわけではない。製造条件で細胞系や変種をクローン選択することで、培養細胞で発現される糖タンパク質における異種性が生じることもある。糖タンパク質活性におけるグリコシル化の機能的な役割には、細胞系で産生される治療用産物の慎重な特徴付けが必要である。
【００５３】
末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生される組換え糖タンパク質には存在しないことがすでに報告されている。Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ３５８：１１ （２００８）。本開示は、少なくともある程度は、ＣＨＯ細胞によって産生される糖タンパク質上に末端α−１，３−ガラクトース残基を見いだすことが可能であるという想定外の所見に基づくものであり、そのことは、ＣＨＯ細胞を用いて治療用産物を生成する際に、このグリカン構造の態様を同定、監視、制御する上で重要である。
【００５４】
本開示は、ＣＨＯ細胞によって産生される糖タンパク質上のグリカンの組成物を分析する方法を提供するものである。本開示によれば、ＣＨＯ細胞において産生される糖タンパク質調製物由来のグリカンを分析し、末端α−１，３−ガラクトース残基を含むか否か判断することが可能である。本開示は、このような修飾を検出する方法ならびに、このような修飾を含むまたは欠いている糖タンパク質を生成する方法を提供するものである。
【００５５】
グリカン調製物
本開示は、ＣＨＯ細胞によって産生される糖タンパク質上の末端α−ガラクトシル残基を評価するといった、ＣＨＯ細胞によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを評価することなど、グリカン調製物中の個々のグリカンの構造および／または組成を分析する方法を提供するものである。グリカン調製物は、従来技術において利用できる任意の方法で、細胞調製物から得られるものであってもよいし、糖タンパク質から得られるものであってもよい。通常、グリカン調製物を得ることは、（１）細胞または糖タンパク質調製物を得るステップと、（２）場合によって、細胞または糖タンパク質調製物からグリカンを放出するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、グリカン調製物を得ることが、場合によって、グリカン調製物を検出可能な標識で標識することを含む。
【００５６】
糖タンパク質調製物
糖タンパク質の組換え生成用の方法については説明がなされている。培養細胞によって分泌される糖タンパク質は、陰イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、ゲル濾過、イムノアフィニティクロマトグラフィ、これらの組み合わせなどの利用可能な任意の手段で単離・精製可能なものである。
【００５７】
Ｎ−結合型グリカン調製物
いくつかの実施形態では、糖タンパク質集団を提供し、集団中の糖タンパク質からＮ−結合型グリカンを除去することでＮ−グリカン調製物が得られる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、消化によってＮ−結合型グリカンを糖タンパク質（糖タンパク質など）から除去する。通常、本開示に基づいて用いられるグリカナーゼが、コアのＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃまたはＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃ残基の間を切断する。糖タンパク質からＮ−結合型グリカンを除去するのに使用可能な酵素の例として、Ｎ−グリカナーゼＦおよび／またはＮ−グリカナーゼ−Ａ、Ｏ−グリカナーゼおよび／またはＥｎｄｏ Ｈがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００５９】
いくつかの実施形態では、化学的切断によってＮ−結合型グリカンを糖タンパク質から除去する。いくつか例をあげると、ヒドラジン、水素化ホウ素ナトリウム、および／またはトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）を用いてグリカンを糖タンパク質から除去することができる。
【００６０】
Ｏ−結合型グリカン調製物
いくつかの実施形態では、糖タンパク質（糖タンパク質など）集団を提供し、集団においてＯ−結合型グリカンを糖タンパク質から除去することで、Ｏ−結合型グリカン調製物を得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ｂ−脱離によってＯ−結合型グリカンを糖タンパク質（糖タンパク質など）から除去する。いくつかの実施形態では、還元的ｂ−脱離によって、Ｏ−結合型グリカンを糖タンパク質（糖タンパク質など）から除去する。いくつかの実施形態では、非還元的ｂ−脱離によって、Ｏ−グリカンを糖タンパク質（糖タンパク質など）から除去する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、テトラヒドロホウ酸アルカリを含む溶液中で調製物をインキュベートすることで、Ｏ−結合型グリカンを糖タンパク質（糖タンパク質など）調製物から除去する。いくつかの実施形態では、重水素標識を取り込んでＯ−結合型グリカンの検出を容易にするなど、テトラジュウテリウムホウ酸塩（ｔｅｔｒａｄｅｕｔｅｒｉｏｂｏｒａｔｅ）を使用する。さまざまな例示的な方法では、糖タンパク質調製物を、０．８〜１．０ＭのＮａＢＨ４と０．０５〜０．１ＭのＮａＯＨとを含有する溶液中で、４２〜４５℃で２〜２４時間インキュベートする。Ｏ−結合型グリカンを除去するための反応を終端させるには、酸（１．０ＭのＨＣｌなど）を加えればよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＮａＯＨを含む溶液中で調製物をインキュベートすることで、Ｏ−結合型グリカンを糖タンパク質調製物から除去する。さまざまな例示的な方法では、糖タンパク質を、５０〜２００ｍＭのＮａＯＨを含有する溶液中で、２７〜４５℃で２〜４８時間インキュベートする。反応を終端させるには、酸を加えればよい。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＮＨ４ＯＨを含む溶液中で調製物をインキュベートすることで、Ｏ−結合型グリカンを糖タンパク質調製物から除去する。さまざまな例示的な方法では、糖タンパク質を、２５〜２８％のＮＨ４ＯＨを含有する溶液中で、４５〜６０℃で２〜４０時間インキュベートする。反応を終端させるには、真空下でＮＨ４ＯＨを除去すればよい。いくつかの実施形態では、溶液が、炭酸アンモニウム（飽和濃度でなど）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＨ４ＯＨ処理調製物を酸（ホウ酸など）で処理する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、エチルアミン（約７０％のエチルアミンなど）またはメチルアミン（約４０％のメチルアミンなど）を含む水溶液中で、約４〜２４時間調製物をインキュベートすることで、Ｏ−結合型グリカンを糖タンパク質調製物から除去する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｎ−結合型グリカンを除去した糖タンパク質集団から、Ｏ−結合型グリカン調製物を得る。
【００６７】
グリカンの標識
いくつかの実施形態では、糖タンパク質からの放出の前または後にグリカンを標識と会合させることが可能である。Ｎ−結合型グリカンまたはＯ−結合型グリカン（糖タンパク質集団から除去されたＮ−グリカンなど）を１つ以上の検出可能な標識と会合させることが可能である。検出可能な標識は一般に、Ｎ−グリカンの還元末端に会合する。いくつかの実施形態では、検出可能な標識が蛍光部分である。本開示に基づいて使用可能なフルオロフォアの例として、２−アミノ安息香酸（２ＡＡ）、２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）および／または２−アミノプリン（２ＡＰ）があげられるが、これに限定されるものではない。通常、本開示に基づいて用いられるフルオロフォアには、グリカンを損傷および／または破壊しない条件下でオリゴ糖および／または単糖の還元末端との反応性があるという特徴がある。いくつかの実施形態では、蛍光部分は、還元末端に直接的に結合される。たとえば、この直接結合を還元的アミノ化による直接的な共役によって達成可能である。いくつかの実施形態では、蛍光部分が還元末端に間接的に結合される。たとえば、この間接結合を反応性リンカーアームによって達成可能である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、放射性部分または同位体標識された分子を含む。本開示に基づいて使用可能な放射性部分の例としては、トリチウム（３Ｈ）、ジュウテリウム（２Ｈ）および／または３５Ｓがあげられるが、これに限定されるものではない。一般に、このような部分はフルオロフォアに対して直接的に結合または会合される。放射性フルオロフォアの一例をあげると、すべての水素が重水素化されるように２ＡＰを修飾することが可能である。
【００６９】
Ｎ−結合型グリカンの消化
本開示は、糖タンパク質のグリコシル化パターンを判断する改良された方法を提供するものである。このような方法は、グリカン集団を１種類以上のエキソグリコシダーゼに曝露し、消化産物の構造および／または組成を分析することを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示に基づいて用いられるエキソグリコシダーゼが、特定の１つのタイプのグリコシド結合だけを認識および切断する。いくつかの実施形態では、本開示に基づいて用いられるエキソグリコシダーゼが、特定の２以上のタイプのグリコシド結合を認識および切断する。エキソグリコシダーゼのうち、本発明に有用となり得るのは、表１に示すように、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ；ヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼ；これらの組み合わせである。
【００７０】
エキソグリコシダーゼ
エキソグリコシダーゼは、末端グリコシド結合をグリカンの非還元末端から切断する酵素である。この酵素は一般に、特定の単糖結合およびアノマ性（α／β）に対して極めて特異性が高い。いくつかの実施形態では、隣り合った分岐パターンがエキソグリコシダーゼの特異性に影響することがある。エキソグリコシダーゼ処理によって、通常は、標準的な分岐型結合が五糖コア（Ｍ３Ｎ２）（３マンノースおよび２ＧｌｃＮＡｃ残基を含む）に切断されたグリカンが得られる。しかしながら、異常修飾種（分岐型またはコアフコシル化種、高マンノースおよびハイブリッド型グリカン、ラクトサミン伸長グリカン、硫酸化グリカン、リン酸化グリカンなど）は、エキソグリコシダーゼ処理がきかないため、クロマトグラフ的に分離してＭ３Ｎ２五糖に対して定量化することが可能である。本開示に基づいて用いられるエキソグリコシダーゼの例としては、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼ、マンノシダーゼがあげられるが、これに限定されるものではない。エキソグリコシダーゼについては、商業的供給源をはじめとするどのような供給源から入手することも、または細胞源（細菌、酵母、植物など）からの単離および／または精製により入手することも可能である。いくつかの実施形態では、エキソグリコシダーゼ（シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼおよびマンノシダーゼなど）を複数のカテゴリすなわち「サブセット」に分けることが可能である。いくつかの実施形態では、サブセットが違えば、異なるタイプの結合を切断するための機能も異なる。表１に、エキソグリコシダーゼ、その結合特異性、由来となった生物体の例をいくつかあげておく。このエキソグリコシダーゼの一覧は一例にすぎず、包括的なものではない旨、また、どのような結合特異性を持つ、どのようなエキソグリコシダーゼでも本開示に基づいて使用できる旨は、当業者であれば理解できよう。
【００７１】
【表１】
【００７２】
本開示によれば、どのエキソグリコシダーゼまたは一組のエキソグリコシダーゼでもＮ−グリカン集団を消化することが可能である。通常、エキソグリコシダーゼ反応は、酵素活性に合った条件下で実施される。たとえば、所望のエキソグリコシダーゼ活性レベルを実現するために、ｐＨ、温度、反応溶液成分間、濃度（塩、洗剤など）、反応時間の長さを最適化することができる。国際公開第２００８／１３０９２６号パンフレット（その内容を参照により本明細書に援用する）などを参照のこと。
【００７３】
グリカン構造と活性の分析
通常、本開示に基づく方法は、グリカン調製物を分析し、グリカンが特定タイプの修飾（末端α−１，３−ガラクトース残基など）を含むか否かを判断することを含む。いくつかの実施形態では、分析が、ある起源由来のひとつの糖タンパク質調製物におけるグリカンの構造および／または機能を、別の起源由来の少なくとも１種類の他の糖タンパク質調製物におけるグリカンの構造および／または機能と比較することを含む。いくつかの実施形態では、分析が、１つ以上の試料におけるグリカンの構造および／または機能を、基準試料のグリカンの構造および／または機能と比較することを含む。
【００７４】
グリカンの構造および組成については、利用できるどのような方法で分析してもよい。いくつかの実施形態では、グリカンの構造および組成を、クロマトグラフによる方法、質量分析（ＭＳ）方法、クロマトグラフによる方法に続いてＭＳ、電気泳動法、電気泳動法に続いてＭＳ、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、およびこれらの組み合わせで分析される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、グリカンの構造および組成を、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、アミドカラムクロマトグラフィ、およびこれらの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない、クロマトグラフによる方法で分析することが可能である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、グリカンの構造および組成を、タンデムＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、イオン移動度質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）、電子移動解離（ＥＴＤ−ＭＳ）、およびこれらの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない、質量分析（ＭＳ）および関連の方法で分析することが可能である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、グリカンの構造および組成を、細管式電気泳動（ＣＥ）、ＣＥ−ＭＳ、ゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に続いて特定のグリカン構造を認識する抗体を用いるウェスタンブロッティング、およびこれらの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない、電気泳動法で分析することが可能である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、グリカンの構造および組成を、一次元ＮＭＲ（１Ｄ−ＮＭＲ）、二次元ＮＭＲ（２Ｄ−ＮＭＲ）、相関分光磁気角スピニングＮＭＲ（ＣＯＳＹ−ＮＭＲ）、全相関分光ＮＭＲ（ＴＯＣＳＹ−ＮＭＲ）、異種核一量子コヒーレンスＮＭＲ（ＨＳＱＣ−ＮＭＲ）、異種核多重量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ−ＮＭＲ）、回転系での核オーバーハウザー効果分光ＮＭＲ（ＲＯＥＳＹ−ＮＭＲ）、核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ−ＮＭＲ）、およびこれらの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および関連の方法で分析することが可能である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術を、グリカンまたは糖タンパク質を検出、分析およびまたは単離するための１つ以上の他の技術と組み合わせてもよい。たとえば、特定の実施形態では、本開示に基づいて、１つ以上の利用可能な方法を用いてグリカンを分析する（ほんの一例をあげるには、Ａｎｕｍｕｌａ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５０（１）：１， ２００６；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １７９：１６２， １９８９；および／またはＴｏｗｎｓｅｎｄ， Ｒ．Ｒ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」 Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．， Ｅｄ． Ｚ． Ｅｌ Ｒａｓｓｉ， ｐｐ １８１〜２０９， １９９５（各々その内容全体を参照により本明細書に援用する）を参照のこと。たとえば、いくつかの実施形態では、クロマトグラフによる方法、電気泳動法、核磁気共鳴法、これらの組み合わせのうちの１つ以上を用いて、グリカンを特徴付ける。例示的なこのような方法として、たとえば、ＮＭＲ、質量分析、液体クロマトグラフィ、２次元クロマトグラフィ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗体染色、レクチン染色、単糖定量、細管式電気泳動、蛍光体支援炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）、ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）、エキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼ処理、これらの組み合わせがあげられる。当業者であれば、本明細書に記載の方法を併用してグリカンを特徴付けるのに使用可能な他の技術がわかるであろう。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、グリカン集団に低濃度で存在するグリカン種（末端α−ガラクトシル残基など）の検出を可能にするものである。たとえば、本方法は、グリカン集団に、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０７５％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満または０．０１％未満の濃度で存在するグリカン種の検出を可能にするものである。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、グリカン集団に低濃度で存在する特定の構造（末端α−ガラクトシル残基など）の検出を可能にするものである。たとえば、本方法は、グリカン集団に、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０７５％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満または０．０１％未満で存在する特定の構造の検出を可能にするものである。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、グリカン集団における個々のグリカン種の相対濃度の検出を可能にするものである。たとえば、液体クロマトグラフの各ピークの下の面積を測定し、全体に対する割合として表すことができる。このような分析をすることで、グリカン集団における各グリカン種の量の相対的な比率が分かる。他の例では、個々のグリカン種の相対レベルを、１Ｄ−ＮＭＲ実験でのピークの面積から、あるいは１Ｈ−１５ＨＳＱＣスペクトルからのクロスピークの量から判断する（標準からの応答に基づいて補正など）、あるいは複数の試料同士を同じピークについて比較して定量化することで、判断する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、糖タンパク質調製物（糖タンパク質調製物など）の生物活性を評価する。糖タンパク質調製物の生物活性を分析するには、利用可能な任意の方法を用いればよい。いくつかの実施形態では、糖タンパク質の結合活性（受容体に対する結合など）を評価する。いくつかの実施形態では、糖タンパク質の治療活性（疾患または症状の重篤度または症候を低減あるいは、疾患または症状の症候の出現を遅らせるにあたっての糖タンパク質の活性など）を評価する。いくつかの実施形態では、糖タンパク質の薬理学的活性（バイオアベイラビリティ、薬物動態、薬物動力学など）を評価する。糖タンパク質治療薬のバイオアベイラビリティ、薬物動態、薬物動力学を分析する方法については、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ． １５（５）：５７１〜９， １９９７；Ｓｒｉｎｉｖａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８５（１）：１〜４， １９９６；Ｓｒｉｎｉｖａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １４（７）：９１１〜６， １９９７などを参照のこと。
【００８４】
当業者であれば理解できるであろうように、試験可能な特定の生物活性または治療活性は、特定の糖タンパク質に応じて変化する。
【００８５】
糖タンパク質調製物の潜在的な有害活性または毒性（高血圧症、アレルギー反応、血栓事象、てんかんまたは他の有害事象を引き起こす傾向など）を、利用できる任意の方法で分析可能である。いくつかの実施形態では、調製物が被検体で抗体応答を誘発するか否かを判断することなどで、糖タンパク質調製物の免疫原性を評価する。
【００８６】
さまざまな実施形態において、末端α−ガラクトシル残基を有する糖タンパク質調製物の生物活性、治療活性などを、末端α−ガラクトシル残基のない糖タンパク質調製物と比較する。さまざまな実施形態において、末端α−ガラクトシル残基を有する糖タンパク質調製物の生物活性、治療活性などを、異なるレベルの末端α−ガラクトシル残基を有する糖タンパク質調製物と比較する。
【００８７】
用途
本開示の方法を利用して、たとえば遊離グリカン、糖タンパク質（糖ペプチド、糖脂質、プロテオグリカンなど）、細胞関連グリカン（核関連グリカン、細胞質関連グリカン、細胞膜関連グリカンなど）；細胞、細胞外、細胞内および／または細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）成分に関連したグリカン（タンパク質など）；細胞外間隙のグリカン（細胞培養液など）などを含む、多岐にわたる状態のいずれでも糖タンパク質からのグリカンを分析することが可能である。
【００８８】
本開示の方法を、治療用または他の商業的に関連のある糖タンパク質製造用のプロセス開発の１つ以上の段階に使用してもよい。本開示の方法を採用可能なこのようなプロセス開発段階の非限定的な例としては、細胞選択、クローン選択、培地の最適化、培養条件、プロセス条件および／または精製手法があげられる。当業者には他のプロセス開発段階も分かるであろう。
【００８９】
また、たとえば特定の所望のグリコシル化パターンを実現または特定の望ましくないグリコシル化パターンの発生を回避する目的で、本開示を利用して、特定の細胞培養物で起こっているグリコシル化の程度および／またはタイプ（細胞培養物中で産生される糖タンパク質調製物の末端α−ガラクトシル残基の程度など）を監視し、これによって培養物を調節または場合によっては終了できるようにすることも可能である。
【００９０】
さらに、本開示を利用して、（たとえば、細胞または細胞系を操作して糖タンパク質を産生あるいは糖タンパク質を商業的に関連のあるレベルで産生する前であっても）特定の所望の糖タンパク質の製造で検討対象となっている細胞または細胞系（ＣＨＯ細胞系など）のグリコシル化の特徴を評価することも可能である。
【００９１】
たとえば、標的糖タンパク質が１つ以上の国で法令による審査があるなどの治療用糖タンパク質である場合、培養物を監視して、厳密に同一の経路で製造されるか否かを問わず、グリコシル化パターンがすでに確立された医薬製品のグリコシル化パターンにできるだけ近い産物（末端α−ガラクトシル残基の程度が医薬製品の程度に近いものなど）が生成される尤度を評価すると望ましいことが多い。本明細書で使用する場合、「近い」とは、すでに確立された医薬製品のグリコシル化パターンに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％相関するグリコシル化パターンを示す。このような実施形態では、相対的なグリコシル化を評価するために、産生培養物の試料は一般に、複数の時点で採取され、確立された標準または対照培養物と比較される。
【００９２】
たとえば、いくつかの実施形態では、糖タンパク質の生成を監視するための方法が、（ｉ）糖タンパク質の生成時に、少なくとも第１および第２のグリカン含有試料を生成系から除去するステップと、（ｉｉ）第１および第２のグリカン含有試料の各々を分析し、特定の修飾（末端α−ガラクトシル残基など）が存在するか否かを判断するステップと、（ｉｉｉ）差を判断して、これによって糖タンパク質生成の進行具合を監視できるように第１のグリカン含有試料から得られる産物を第２のグリカン含有試料から得られる産物と比較するステップと、を含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、糖タンパク質がアバタセプトである。いくつかの実施形態では、生成系がＣＨＯ細胞を含む。
【００９３】
特定の標的タンパク質の産生を品質制御目的で監視するか否かを問わず、本開示を利用して、たとえば、特定の発達段階で、あるいは特定の成長条件下で、グリコシル化を監視することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、治療用産物の品質を特性決定、調節および／または制御または比較することが可能である。一例をあげると、本方法論を使用して、治療用タンパク質産物を産生する細胞でのグリコシル化を評価することが可能である。特に、グリコシル化が治療用タンパク質産物の活性やバイオアベイラビリティまたは他の特徴に影響し得ることが多いとすれば、このような治療用タンパク質産物の産生時に細胞グリコシル化を評価するための方法が特に望ましい。とりわけ、本開示は、治療用タンパク質の産生系でのグリコシル化のリアルタイム分析を容易にし得るものであり、このゆえに、グリコシル化の調節を達成してもよい。
【００９５】
本開示によって産生および／または品質を監視可能な代表的な治療用糖タンパク質産物としては、たとえば、多岐にわたる血液作用剤（たとえば、エリスロポエチン、血液凝固因子など）、インターフェロン、コロニー刺激因子、抗体、酵素およびホルモンがあげられる。
【００９６】
代表的な市販の糖タンパク質産物としては、ＣＨＯ細胞で産生されるのであれば、たとえば表２に示したものがあげられる。
【００９７】
【表２】
【００９８】
【表３】
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
いくつかの実施形態では、開示が、異なる起源または試料由来の糖タンパク質からのグリカンを、互いに比較する方法を提供するものである。このようないくつかの例では、同じ起源に由来する（同じＣＨＯ細胞起源からなど）複数の試料を経時的に得て、グリコシル化パターン（特に細胞表面グリコシル化パターン）の変化（末端α−ガラクトシル残基の存在または度合いの変化など）を監視する。いくつかの実施形態では、試料のひとつが歴史的試料または歴史的試料の記録である。いくつかの実施形態では、試料のひとつが基準試料である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、開示が、異なる細胞起源によって発現される糖タンパク質からのグリカンを、互いに比較する方法を提供するものである。いくつかの実施形態では、比較された細胞起源の１つ以上がＣＨＯ細胞である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の選択されたパラメータ（細胞型、培養のタイプ［連続供給対バッチ供給など］、培養条件［培地のタイプ、特定培地の特定の成分の存在または濃度（ａ）、モル浸透圧濃度、ｐＨ、温度、タイミングまたは１つ以上の成分のシフトの度合い、たとえばモル浸透圧濃度、ｐＨ、温度など］、培養時間、単離ステップなど）は異なるがそれ以外は同じ条件下で調製した、異なる細胞培養試料からのグリカン同士を比較するため、選択されたパラメータがグリコシル化におよぼす影響を判断できる。特定の実施形態では、選択された単一のパラメータがグリコシル化パターン（末端α−ガラクトシル残基の有無など）におよぼす影響を判断できるように、選択された単一のパラメータが異なる条件下で調製した、異なる細胞培養試料からのグリカンを比較する。よって、その他の用途として、本明細書に記載したような技法を用いることで、特定のパラメータが細胞のグリコシル化パターンにおよぼす影響を判断しやすくできるのである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、糖タンパク質の異なるバッチからのグリカン同士を、同一の方法で調製するか異なる方法で調製するかを問わず、かつ、同時に調製するか別々に調製するかを問わず、比較する。このような実施形態では、本開示は、糖タンパク質調製物の品質制御を容易にするものである。上記の他にまたは上記に加えて、このような実施形態のいくつかは、糖タンパク質を産生する特定の培養物の進行の監視を容易にするものである（異なる時点で培養物から試料を除去し、分析して互いに比較する場合）。いくつかの例では、同一の供給源から時間をかけて複数の試料を取得し、グリコシル化パターンの変化を監視できるようにする。いくつかの実施形態では、約３０秒間、約１分間、約２分間、約５分間、約１０分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約１０時間、約１２時間または約１８時間の間隔、あるいはそれよりも長い間隔で、グリカン含有試料を除去する。いくつかの実施形態では、グリカン含有試料を不規則な間隔で除去する。いくつかの実施形態では、グリカン含有試料を５時間間隔で除去する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本開示による方法を使用して、細胞が糖タンパク質を産生する過程で、そのグリコシル化パターンを監視してもよい。たとえば、糖タンパク質の産生（量産など）は、（１）糖タンパク質を産生する細胞を培養するステップと、（２）培養時に試料を一定間隔または不規則な間隔で取得するステップと、（３）取得した試料で産生された糖タンパク質のグリコシル化パターンを分析するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、このような方法は、取得した試料で産生された糖タンパク質のグリコシル化パターンを互いに比較するステップを含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、このような方法は、取得した試料で産生された糖タンパク質のグリコシル化パターンと参照試料のグリコシル化パターンとを比較するステップを含むものであってもよい。
【０１０６】
これらの実施形態のいずれにおいても、グリカン分析の特徴を、たとえば品質制御記録に記録することが可能である。上述したように、いくつかの実施形態では、比較が、糖タンパク質の事前または標準的なバッチの履歴記録および／または参照試料との間で実施されるものである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、異なるバッチの特定の糖タンパク質からのグリカンを、同一の方法で調製するか異なる方法で調製するかを問わず、かつ、同時に調製するか別々に調製するかを問わず、互いにおよび／または参照試料と比較する。いくつかの実施形態では、バッチ間比較が、（ｉ）糖タンパク質の第１のバッチから第１のグリカン調製物を提供するステップと、（ｉｉ）糖タンパク質の第２のバッチから第２のグリカン調製物を提供するステップと、（ｉｉｉ）第１および第２のグリカン調製物の各々に分析手順をほどこすステップと、（ｉｖ）２つのバッチの一貫性を評価できるように、第１のグリカン調製物から得られた分析結果を第２の調製物から得られた切断産物と比較するステップと、を含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、バッチからの少なくとも１つのグリカンを少なくとも１つの糖タンパク質から除去し、場合によって、除去したグリカンを単離することで、グリカン調製物を提供してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載したようにしてグリカン調製物を標識してもよい（蛍光的および／または放射線的になど；たとえば、単離の前および／または後など）。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本開示は、糖タンパク質調製物の品質制御を容易にするものである。グリカン分析の特徴を、たとえば品質制御記録で記録することが可能である。上述したように、いくつかの実施形態では、比較が、糖タンパク質の事前または標準的なバッチの履歴記録との間でなされる。いくつかの実施形態では、比較が参照糖タンパク質試料との間でなされる。
【０１０９】
特定の実施形態では、本開示を研究に利用して、細胞のグリコシル化の特徴を修飾し、末端α−ガラクトシル残基を有するまたはこれを欠いている糖タンパク質を産生する細胞系など、たとえば１つ以上の所望のグリコシル化の特徴を有する細胞系および／または培養条件を確立してもよい。その後、必要があれば、このような細胞系および／または培養条件を、このようなグリコシル化の特徴に利益があると想定される特定の標的糖タンパク質の生成に利用する。特定の実施形態では、細胞がＣＨＯ細胞である。
【０１１０】
本開示によれば、本明細書に記載の技法を用いて、望ましいグリカンまたは望ましくないグリカンを検出し、たとえば糖タンパク質産物中の１種類以上の汚染物質を検出または定量化あるいは、１種類以上の活性種または所望の種の存在を検出または定量化することが可能である。
【０１１１】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、供給源（生物学的試料、グリカン調製物など）に極低濃度で存在するグリカンの検出を容易にする。このような実施形態では、グリカン集団に、約１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０７５％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満または０．０１％未満の濃度で存在するグリカンの濃度を検出および／または任意に定量化することが可能である。いくつかの実施形態では、０．１％から５％、たとえば０．１％から２％、たとえば０．１％から１％のグリカン調製物を含むグリカンの濃度を検出および／または任意に定量化することが可能である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、グリカン集団に低濃度で存在する特定の結合（末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合など）の検出を可能にするものである。たとえば、本方法は、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０７５％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満または０．０１％未満の濃度でグリカン集団に存在する特定の結合の検出を可能にするものである。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、グリカン集団中の個々のグリカン種の相対濃度の検出を可能にするものである。たとえば、液体クロマトグラフの各ピークの下にある面積を測定し、全体に対する割合として表すことができる。このような分析をすることで、グリカン集団における各グリカン種の量の相対的な比率が分かる。
【０１１４】
以下の実施例を参照し、本開示を一層具体的に示す。しかしながら、本開示はこれらの実施例に何ら限定されるものではない旨は理解されたい。
【０１１５】
当業者であれば、ここに提供する明細書を参照した実施例を考慮することで、本発明の範囲内でのさまざまな他の組み合わせを容易に想像できよう。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：
Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）（アバタセプト）は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）の修飾されたＦｃ（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン）部分に結合されるヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）の細胞外ドメインからなる可溶性融合タンパク質である。アバタセプトは、哺乳類細胞発現系で組換えＤＮＡ技術によって生成される。アバタセプトの見かけの分子量は９２キロダルトンである。アバタセプトを使用して、関節リウマチの症候を治療する、関節損傷の進行を示す、物理的機能を改善する。この生物治療薬でグリコシル化（３つのＮ−結合型と２つのＯ−結合型グリコシル化部位）がゆえに生じる大幅な複雑さがゆえに、慎重な生成と特徴付けが必要とされる。タンパク質化学組成物に対する異なる修飾（タンパク質骨格修飾、グリコシル化など）によって糖タンパク質の生物学的機能に影響する可能性があるため、製造時にこの生物治療薬の化学的および物理的特性に対する良好な制御を保証することが重要である。
【０１１７】
Ｇａｌ−α１−３Ｇａｌエピトープ（「α−ｇａｌ」）は、一般にヒトタンパク質には見られず、ＣＨＯ由来産物では想定されない。このエピトープは一般に、ブタおよびマウスから単離されたタンパク質で観察される。ヒトは、Ｇａｌα１−３Ｇａｌ末端に対する循環抗体を有するため、糖タンパク質の治療薬でこれらの種を監視し、これがプロセス開発にどのように関連するのかを理解することが重要である。本開示は、アバタセプトにおけるα−ｇａｌ構造の存在を示すものである（これはＣＨＯ細胞で発現される）。
【０１１８】
グリカン種の分析に用いられる手順：
ＰＮＧＡＳＥ−Ｆで処理した後、固相抽出精製によって、薬剤物質からＮ−グリカンを単離した。次に、グリカンを２ＡＢ標識した後、選択された画分をＬＣ−ＭＳ−ＭＳで分析した。エキソグリコシダーゼ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、Ｌｃ−ＭＳ／ＭＳの組み合わせによって、グリカン構造をさらに確認した。
【０１１９】
このデータは、アバタセプト−ＣＴＬＡ４糖タンパク質Ｎ−グリカンにおける末端α結合型ガラクトースの存在を示す。ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）の修飾されたＦｃ（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン）部分に結合されるヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）からなる可溶性融合タンパク質であるＯｒｅｎｃｉａ（商標）（アバタセプト）のＮ−結合型グリカン試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。図３に、ガラクトース−α−１−３ガラクトース含有構造に対応し得る組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１のグリカン種の検出を示している、Ａｂａｔａｃｅｐｔ由来のグリカンの画分の蛍光クロマトグラムを示す。
【０１２０】
組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１のＯｒｅｎｃｉａ（商標）由来のグリカン種からのＭＳ２スペクトルでは、非還元末端ガラクトース−α−１−３結合型ガラクトースの存在が示唆された（図４）が、ハイブリット型グリカンなどの他の潜在的な構造の可能性を排除するものではない。
【０１２１】
異なるエキソグリコシダーゼ処理に続いてＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳの組み合わせを用いて、この構造をさらに確認した。Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）および対照タンパク質の両方に由来するＮ−グリカン画分に、エキソグリコシダーゼ酵素処理を実施した。どちらの試料も、（ｉ）α−ガラクトシダーゼおよび（ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミノダーゼ、マンノシダーゼの混合物で処理し、潜在的な非還元末端ガラクトース−α−１−３結合型ガラクトース構造を分解した。２つの反応での産物の蛍光クロマトグラムを比較したものを、図５に示す。
【０１２２】
α−ガラクトシダーゼ処理の前後で対照タンパク質由来のグリカンに大きな差は観察されなかった。一方、Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）では、ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１組成の種の明らかな減少に伴う種ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ５Ｆｕｃ１組成の増加が観察された。酵素処理の結果としてのアバタセプトからのＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１組成の種のＭＳ２も図６に示す。
【０１２３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した場合の異なる組のエキソグリコシダーゼ（β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼ）を含む処理結果を、さらに確認した（図７）。
【０１２４】
このデータから、Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）におけるＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１組成を有する種が、主に非還元末端ガラクトース−α１−３結合型ガラクトースを含有することが示唆される。
【０１２５】
拡張と代用
以上、本方法を具体的な例示の実施形態を参照しつつ特に図示し、説明してきたが、本開示の主旨および範囲から逸脱することなく形態および詳細にさまざまな変更をほどこし得ることは理解されたい。したがって、本方法の範囲および主旨に包含されるすべての実施形態ならびにその等価物も、権利請求されることを意図している。本開示の方法、系、アッセイについての特許請求の範囲、説明、図面は、説明した要素の順序に限定的なものとして読まれるべきではない（その効果が明記される場合を除く）。
【０１２６】
特許、特許出願、記事、書籍、論文、ウェブページを含むがこれに限定されるものではない、本出願にて引用したすべての文献および類似の資料（このような文献および類似の資料の形式を問わない）は、その内容全体を明示的に援用するものである。援用した文献および類似の資料の１つ以上が、定義した用語、用語の使用法、説明した技術などを含むがこれに限定されるものではない本出願と異なるまたは相反する場合は、本出願が優先する。本明細書で使用する章の見出しは構成上の目的のものにすぎず、どのように説明されているものであっても主題を限定するものと解釈されるものではない。本方法をさまざまな実施形態および実施例に関して説明したが、この方法を当該実施形態または実施例に限定することを意図するものではない。逆に、本方法は、当業者であれば自明であろうさまざまな選択肢、改変、等価物を包含する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類細胞発現系から発現されたタンパク質において特定のグリカン構造を検出するための方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの治療用組換え生物医薬品が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞といった哺乳類の細胞培養物で生成されている。ヒトが一般に認識して許容するグリコシル化パターンを持つ糖タンパク質が哺乳類の細胞培養物によって産生されることが主な理由で、組換え糖タンパク質の生成には主に酵母や原核生物系などの他の発現系より哺乳類の細胞培養物のほうが好ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
末端α−結合型ガラクトース（ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ）結合の潜在的な有害作用が周知である Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ３５８：１１ （２００８）。このような末端α−ｇａｌ結合は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生される組換え糖タンパク質には存在しないことがすでに報告されている。たとえば、ＮＳＯすなわちマウス骨髄腫細胞系で産生される抗−ＣＤｗ５２抗体であるＣａｍｐａｔｈは、正常なヒトＩｇＧと一致する３つの糖型に主に含まれるＣＨＯ細胞から産生される非還元末端α−結合型ガラクトース残基Ｃａｍｐａｔｈを有する潜在的に免疫原性の糖型を含む。Ｓｈｅｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４７：１０２〜１１０ （１９９７）。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、ひとつには、組換えＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質が、当該糖タンパク質の治療目的での使用に悪影響をおよぼし得る末端ガラクトース−α−１，３−ガラクトース結合を有するグリカン構造を含むという発見に立脚するものである。たとえば、末端α−ｇａｌ結合を有する糖タンパク質を治療目的でヒトに投与すると、以後の投与の効果が落ちたり、患者に有害な過敏性反応が引き起こされたりすることすらある形で、患者で組換え糖タンパク質に対するモノクローナル抗体が形成される場合がある。
【０００５】
こうした過去の教示内容に反して、本出願人らは、驚くべきことに、ＣＨＯ細胞培養物で産生される組換え糖タンパク質の重要な画分が、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の存在を呈することがあり、患者に投与されるタンパク質およびペプチジル産物に対する有害反応の可能性を示していることを見出した。
【０００６】
本発明は、ＣＨＯ細胞からの組換え糖タンパク質および当該糖タンパク質を含有する組成物の生成および分析に有用な化合物および方法であって、糖タンパク質が、調節された（低減されるか、場合によっては増加するなど）レベルの末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合を含む、化合物および方法を提供するものである。
【０００７】
よって、第１の態様では、本発明は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞集団を評価するための方法を含む。特定の実施形態では、この試験方法は、
（ａ）上記の集団から１つ以上のＣＨＯ細胞を提供し、
（ｂ）前記細胞によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することを含み、ＣＨＯ細胞は、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではない。
【０００８】
測定するステップが、以下のいずれかを含むものであってもよい。（ａ）細胞によって産生される糖タンパク質を単離し、この糖タンパク質上で末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定する、（ｂ）細胞によって産生される特定の糖タンパク質組成物を単離し、単離された糖タンパク質組成物上で末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定する、（ｃ）細胞によって産生される糖タンパク質からグリカンを単離し、単離されたグリカンにて末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定する、（ｄ）糖タンパク質または１つ以上のＣＨＯ細胞上に存在するグリカンから単糖を切断し、切断された単糖から末端放出α−ガラクトース残基を検出する、（ｅ）細胞によって産生される糖タンパク質から少なくとも１つのペプチドを提供し、この少なくとも１つのペプチド上で末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定する、（ｆ）１つ以上のＣＨＯ細胞の細胞表面上のグリカンを測定することによって、糖タンパク質上で末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンの相対レベルを測定する。末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いる技術は、以下の方法およびこれらの方法の任意の組み合わせのうち１つ以上を含み得る：クロマトグラフによる方法、質量分析（ＭＳ）法、電気泳動法（細管式電気泳動など）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、単糖分析、蛍光法、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度、酵素による方法、検出分子（抗体またはレクチンなど）の使用。
【０００９】
ステップ２での測定用のグリカンの起源は、ＣＨＯ細胞の集団；ＣＨＯ細胞の表面で発現される糖タンパク質またはグリカン；ＣＨＯ細胞の集団の細胞表面に存在するタンパク質の切断由来のペプチド；ＣＨＯ細胞の集団の表面に存在するグリカン；ＣＨＯ細胞の集団によって分泌または発現される糖タンパク質、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞の集団から発現される単離された糖タンパク質発現産物；ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞の集団から発現される単離されたタンパク質発現産物由来のペプチド；またはＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞の集団から直接的に発現される単離されたタンパク質発現産物由来のグリカンからなる群から選択されるものであってもよい。いくつかの実施形態では、この方法が、グリカンまたは糖ペプチドの起源を、α−ガラクトシダーゼ酵素を含む１種類以上のエキソグリコシダーゼで処理した後、グリカン集団を分析することを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、使用する方法が、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンの定量的な方策を提供するものである。いくつかの実施形態では、使用する方法が、定性的な方策を提供するものである。
【００１１】
いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＨＯ細胞の培養物から糖タンパク質調製物を調製し、１つ以上のグリカンを糖タンパク質調製物（α−１，３−ガラクトシダーゼ；α−１，４−ガラクトシダーゼ；またはα−１，６−ガラクトシダーゼなどの１つ以上のグリコシダーゼを有するなど）から切断し、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することも含む。
【００１２】
特定の実施形態では、生成ラインのＣＨＯ細胞培養物から試料を得ることで、上記の方法を治療用糖タンパク質の生成実施時に実施して、たとえば生成時にグリカン構造を監視する。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞の培養時間のあいだに、測定するステップを少なくとも１回、２回、３回またはそれより多く繰り返すなど、測定するステップを時間の経過とともに少なくとも１回繰り返す。他の実施形態では、たとえば糖タンパク質産物の品質または放出試験の一部として、ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質産物で上記の方法を実施する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、測定するステップが、ＣＨＯ細胞の第１の集団から産生される第１の糖タンパク質調製物における末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンのレベルを、ＣＨＯ細胞の第２の集団から産生される第２の糖タンパク質調製物における末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンのレベルと比較することを含む。このようないくつかの実施形態では、異なる培養条件下で培養されたＣＨＯ細胞の集団からの糖タンパク質調製物のグリカンを判断し、比較する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、この方法が、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンのレベルを、基準レベル（対照レベルまたは製品仕様における範囲または値など）と比較するステップをさらに含むものであってもよい。
【００１５】
この方法の特定の実施形態では、測定するステップが、末端α−ガラクトシル残基の有無を検出できる検出分子の使用を含む。特定の実施形態では、検出分子が、末端α−ガラクトシルエピトープに結合できる抗体を含む。本発明の他の実施形態では、検出分子がレクチンを含む。いくつかの実施形態では、検出分子が、蛍光部分または放射性同位元素部分を含むものであってもよい。
【００１６】
ＣＨＯ細胞集団は、クローン細胞集団を含むものであってもよい。ＣＨＯ細胞集団は、治療用糖タンパク質を製造するためのバイオリアクタ内で、培養物中など、あるいは細胞培養物由来の試料中にあってもよい。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞集団が、治療用糖タンパク質をコードする少なくとも１つのベクターで形質転換されることになる。治療用糖タンパク質は、ヒト由来のものであってもよいし、非ヒト由来または合成由来のものであってもよい。治療用糖タンパク質は、ヒトの治療用であってもよいし、獣医学的適応症の治療用であってもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、この方法は、動物モデルなどにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏなどで、糖タンパク質の免疫原性潜在力の存在またはレベルを評価するなど、細胞によって生成される糖タンパク質の生物活性を評価するステップをさらに含む。
【００１８】
第２の態様では、本発明は、糖タンパク質上にて末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを産生する機能について、１つ以上のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）複数のＣＨＯ細胞集団であって、複数のうちいずれもグリカン上で末端α−ガラクトシル残基を発現するよう遺伝子操作されていない（α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されていないなど）細胞集団を提供し、
（ｂ）複数のＣＨＯ細胞の各々を、糖タンパク質発現産物の発現に適した条件下で培養し、
（ｃ）複数のＣＨＯ細胞各々によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定し、
（ｄ）選択されたＣＨＯ細胞調製物によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基の標的レベルの存在に基づいて、複数のＣＨＯ細胞調製物のうちの１つ以上を選択することを含む、方法を含む。
【００１９】
末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを、ＣＨＯ細胞調製物によって産生された糖タンパク質から、ＣＨＯ細胞調製物の単離された糖タンパク質発現産物から、ＣＨＯ細胞調製物の糖タンパク質発現産物から得られるペプチドから、ＣＨＯ細胞調製物の細胞表面グリカンから、あるいはＣＨＯ細胞調製物またはその糖タンパク質発現産物から得られるグリカン調製物から得て、測定することができる。特定の実施形態では、スクリーニング方法が、糖タンパク質発現産物を細胞培養物から単離し、ステップ（ｃ）で細胞によって産生される糖タンパク質の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を測定するステップをさらに含む。特定の実施形態では、細胞スクリーニング方法が、糖タンパク質発現産物上に存在するα−ガラクトシル残基の量を定量化するステップをさらに含む。特定の実施形態では、細胞スクリーニング方法のステップ（ｂ）を、バイオリアクタ内で実施する。
【００２０】
複数のＣＨＯ細胞集団は各々、治療用糖タンパク質の製造トレインにおける細胞培養物からの異なるＣＨＯ株集団、異なるクローン細胞集団または異なる試料（経時的に得られた試料など）を含むものであってもよい。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞集団が、ヒト治療用糖タンパク質などの治療用糖タンパク質をコードする少なくとも１種のベクターで形質転換されることになる。細胞スクリーニング方法の特定の実施形態では、糖タンパク質発現産物が、ＣＨＯ細胞から発現される分泌糖タンパク質である。
【００２１】
スクリーニング方法の測定するステップは、糖タンパク質上の末端α−ガラクトシル残基を同定および／または定量化するために本明細書に開示のどの技術を含むものであってもよい。
【００２２】
第３の態様では、本発明は、ＣＨＯ細胞宿主で産生される糖タンパク質組成物を評価するための方法を含む。この方法は、糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することを含み、この糖タンパク質組成物は、ＣＨＯ宿主細胞で産生されたものであり、ＣＨＯ宿主細胞は、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではなかった。
【００２３】
いくつかの実施形態では、この方法は、糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースのレベルを、印刷またはコンピュータ読み取り可能な媒体に記録することを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、この方法は、糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの測定レベルを、対照または基準規格などの基準レベルと比較することも含む。基準レベルは、規格（ＦＤＡラベルまたは医師による添付物など）であってもよいし、糖タンパク質組成物を含有する製剤調製物の品質基準であっても構わない。
【００２５】
いくつかの実施形態では、基準レベルまたは品質基準は、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％、０．２５％、０．２％、０．１％またはそれ未満など、糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースが５％以下である。糖タンパク質組成物中に存在するガラクトース−α−１−３−ガラクトースのレベルは、糖タンパク質調製物などの試料中のグリカンの総量に対する、ガラクトース−α−１−３−ガラクトースを含有するグリカンのレベルとして測定可能である。
【００２６】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、クロマトグラフによる方法を含む。
【００２７】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、質量分析（ＭＳ）法を含む。
【００２８】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、電気泳動法（細管式電気泳動など）を含む。
【００２９】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法を含む。
【００３０】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、単糖分析を含む。
【００３１】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、蛍光法を含む。
【００３２】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度を含む。
【００３３】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、酵素による方法を含む。
【００３４】
一実施形態では、末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合の測定に用いられる技術が、および検出分子（抗体またはレクチンなど）の使用を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】Ｎ−グリカン構造に共通するコア五糖の図である。
【図２】末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合を有する非還元末端Ｎ−グリカン構造の図である。
【図３】ガラクトース−α−１−３結合型ガラクトース含有構造に対応し得る組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１のグリカン種の検出を示している、Ａｂａｔａｃｅｐｔ由来のグリカンの画分の蛍光クロマトグラムである。
【図４】組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１のＡｂａｔａｃｅｐｔ由来のグリカン種のＭＳ２スペクトルを示す。このスペクトルは、非還元末端ガラクトース−α１−３−ガラクトースを含有するグリカン構造と相関している。
【図５】α−ガラクトシダーゼでの処理前後のＡｂａｔａｃｅｐｔおよび対照タンパク質（同じく組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１のグリカンを含有する）由来のグリカン画分の蛍光クロマトグラムである。
【図６】Ａｂａｔｅｃｅｐｔ由来のグリカン画分をαガラクトシダーゼで処理して生成した組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ５Ｆｕｃ１の種のＭＳ２スペクトルである。
【図７】異なるエキソグリコシダーゼで処理したＡｂａｔａｃｅｐｔ由来のグリカン画分のＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
以下に明示的に定義しないかぎり、本明細書で使用する用語はいずれも、当業者であれば理解できるであろう通常の意味で用いられる。
【００３７】
およそ、約、だいたい：本明細書で使用する場合、１以上の目的の値に適用される「およそ」、「約」または「だいたい」という表現は、明記された参照値に近い値を示す。特定の実施形態では、「およそ」、「約」または「だいたい」という表現は、明記された参照値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満以内に入る値の範囲を示す。
【００３８】
検出、検出する：本明細書で使用する場合、「検出する」、「検出」、「検出手段」という表現は、末端α−１，３−ガラクトシル残基などの特定の化学部分が、化合物、組成物、細胞または細胞集団内またはその表面に存在するか否かの判断を示すものとして同義に用いられる。検出手段は、選択可能なマーカーあるいは、蛍光または放射性部分などの同定可能な特徴を伴うものであってもよく、試薬、化合物、細胞または細胞集団の標識を伴うものであってもよい。検出は、質量分析または関連の方法、電気泳動法、核磁気共鳴、クロマトグラフによる方法あるいは上記の組み合わせなどの技術を使用して、化合物、組成物、細胞または細胞集団を分析し、化合物、組成物、細胞または細胞集団内またはその表面に化学部分が存在するか否かを判断することも示し得る。また、検出は、検出対象となる化学部分の絶対レベルまたは関連レベルの定量化を伴うものであってもよい。
【００３９】
グリカン：当該技術分野において周知のように、かつ本明細書で使用する場合、「グリカン」とは糖である。グリカンは、糖残基のモノマーまたはポリマーであってもよいが、一般に少なくとも３つの糖を含み得るものであり、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。グリカンには、天然の糖残基（ブドウ糖、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、ヘキソース、アラビノース、リボース、キシロースなど）および／または修飾糖（２’−フルオロリボース、２’−デオキシリボース、ホスホマンノース、６’スルホＮ−アセチルグルコサミンなど）を含むこともある。「グリカン」という用語は、糖残基のホモポリマーおよびヘテロポリマーを含む。「グリカン」という用語はまた、（糖タンパク質、糖脂質、プロテオグリカンなどの）糖タンパク質のグリカン成分も包含する。この用語はまた、糖タンパク質から切断されたか、そうでなければ放出されたグリカンをはじめとする、遊離グリカンも包含する。
【００４０】
グリカン調製物：「グリカン調製物」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の製造方法で得られる一組のグリカンを示す。いくつかの実施形態では、グリカン調製物は、糖タンパク質調製物（下記の糖タンパク質調製物の定義を参照のこと）から得られる一組のグリカンを示す。いくつかの実施形態では、グリカン調製物が糖タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、グリカン調製物が放出されたグリカンを含む。
【００４１】
糖タンパク質：本明細書で使用する場合、「糖タンパク質」という用語は、１つ以上の糖部分（すなわちグリカン）に共有結合されたペプチド骨格を有するタンパク質（本明細書で定義されるもの）を示す。当業者であれば理解できるように、ペプチド骨格は一般に、アミノ酸残基の直鎖を含む。糖部分は、単糖、二糖、オリゴ糖および／または多糖の形であってもよい。糖部分は、糖残基の単一の非分岐鎖を含むものであってもよいし、１つ以上の分岐鎖を含むものであってもよい。特定の実施形態では、糖部分は、硫酸基および／またはリン酸基を含むものであってもよい。上記の他にまたは上記に加えて、糖部分は、アセチル、グリコリル、プロピルまたは他のアルキル修飾を含むものであってもよい。特定の実施形態では、糖タンパク質がＯ−結合型糖部分を有する。特定の実施形態では、糖タンパク質がＮ−結合型糖部分を有する。
【００４２】
糖タンパク質調製物：「糖タンパク質調製物」とは、この用語を本明細書で使用する場合、各々が少なくとも１つのグリコシル化部と共有結合した少なくとも１つのグリカンと特定のアミノ酸配列（このアミノ酸配列は少なくとも１つのグリコシル化部位を含む）を有するポリペプチドを含む個々の糖タンパク質分子の組を示す。糖タンパク質調製物中の特定の糖タンパク質の個々の分子は一般に、同じアミノ酸配列を有するが、少なくとも１つのグリコシル化部位の占有率および／または少なくとも１つのグリコシル化部位に結合されたグリカンのアイデンティティが異なっていてもよい。すなわち、糖タンパク質調製物は、特定の糖タンパク質の糖型を１つだけ含むものであってもよいが、より一般には複数の糖型を含む。同じ糖タンパク質の異なる調製物同士で、存在する糖型のアイデンティティが異なる（１つの調製物に存在する糖型が他の糖型には存在しなくてもよい）および／または異なる糖型の相対量が異なっていてもよい。
【００４３】
グリコシダーゼ：「グリコシダーゼ」という用語は、本明細書で使用する場合、グリカンにおける連続した糖と糖との間または糖と骨格部分との間（糖タンパク質のペプチド骨格と糖との間など）の共有結合を切断する作用剤を示す。いくつかの実施形態では、グリコシダーゼが酵素である。特定の実施形態では、グリコシダーゼが、１つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質（タンパク質酵素など）である。特定の実施形態では、グリコシダーゼがヒドラジンなどの化学的な切断剤である。
【００４４】
Ｎ−グリカン：「Ｎ−グリカン」という用語は、本明細書で使用する場合、糖タンパク質から放出されたが、それまでは窒素結合によって糖タンパク質に結合されていた糖のポリマーを示す（下記のＮ−結合型グリカンの定義を参照のこと）。
【００４５】
Ｎ−結合型グリカン：Ｎ−結合型グリカンとは、窒素結合によって糖タンパク質に結合されたグリカンである。種々雑多なＮ−結合型グリカンが存在するが、これらは一般に共通の五糖コア（Ｍａｎ）３（ＧｌｃＮＡｃ）（ＧｌｃＮＡｃ）をベースにしている。
【００４６】
Ｏ−グリカン：「Ｏ−グリカン」という用語は、本明細書で使用する場合、複合糖質から放出されたが、それまでは酸素結合によって複合糖質に結合されていた糖のポリマーを示す（下記のＯ−結合型グリカンの定義を参照のこと）。
【００４７】
Ｏ−結合型グリカン：Ｏ−結合型グリカンとは、酸素結合によって複合糖質に結合されたグリカンである。Ｏ−結合型グリカンは一般に、Ｌ＆＃８２１２：セリン（Ｓｅｒ）またはＬ−トレオニン（Ｔｌｉｒ）の水酸基に対するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）またはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を介して糖タンパク質に結合されている。Ｏ−結合型グリカンの中にはアセチル化および硫酸化などの修飾を有するものもある。
【００４８】
調節する：「調節する」という表現は、本明細書で使用する場合、所定の制限内で、糖タンパク質組成物中に存在するα−ガラクトース残基のレベルなどのパラメータの値を制御する機能または動作主を示す。よって、いくつかの実施形態では、α−ガラクトース残基のレベルが所定の制限内におさまるようにこれを調節すればよい。いくつかの実施形態では、糖タンパク質組成物中に存在する全Ｎ−グリカンの５．０％、１．０％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％を超えないようにα−ガラクトース残基のレベルを調節すればよい。他の実施形態では、α−ガラクトース残基のレベルが、所定のレベルまたは所望のレベルの１０．０％、５．０％、１．０％、０．５％または０．１％を超えて変わらないように、これを調節してもよい。
【００４９】
プロテアーゼ：「プロテアーゼ」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリペプチド鎖における連続したアミノ酸の間にあるペプチド結合を切断する作用剤を示す。いくつかの実施形態では、プロテアーゼが酵素（すなわちタンパク質分解酵素）である。特定の実施形態では、プロテアーゼが、１つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質（タンパク質酵素など）である。特定の実施形態では、プロテアーゼが化学的な切断剤である。
【００５０】
提供する：「提供する」という表現は、本明細書で使用する場合、動作主が、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞調製物または糖タンパク質調製物などの対象品目を、何らかの起源から得ることを示し、動作主自身の製造または動作主が他の第三者からその品目を受け取って入手することを含むが、これに限定されるものではない。たとえば、ＣＨＯ細胞調製物は、機械、人間または実体によって製造または受け取られると、提供されることになる。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞調製物を機械によって受け取った上で、この機械で、糖タンパク質調製物の試験、加工または精製の１つ以上を実施してもよい。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞調製物を人間が受け取ってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞調製物を外部の実体から受け取ってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞調製物を、別の人間または事業のために特徴付けのサービスを実施している人間または事業が受け取ってもよい。
【００５１】
末端α−１，３−ガラクトース残基；末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合：「末端α−１，３−ガラクトース残基」、「末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合」および「非還元末端α−１，３結合型ガラクトース残基」という用語は、本明細書で使用する場合、図２に示すグリカン構造を同義に説明するものであり、図中、ペプチドまたはタンパク質に結合できるグリカン構造が、それぞれガラクトース分子の１および３残基で示される残基で互いに結合された２つのガラクトース残基で終端する。
【００５２】
（特定の実施形態の詳細な説明）
組換え糖タンパク質の合成に用いる宿主細胞は、複雑なグリコシル化を生成するための細胞内機構を有するが、これらの細胞は糖タンパク質が天然に発現される細胞と常に同じ酵素の相補体を持つわけではない。製造条件で細胞系や変種をクローン選択することで、培養細胞で発現される糖タンパク質における異種性が生じることもある。糖タンパク質活性におけるグリコシル化の機能的な役割には、細胞系で産生される治療用産物の慎重な特徴付けが必要である。
【００５３】
末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生される組換え糖タンパク質には存在しないことがすでに報告されている。Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ， ３５８：１１ （２００８）。本開示は、少なくともある程度は、ＣＨＯ細胞によって産生される糖タンパク質上に末端α−１，３−ガラクトース残基を見いだすことが可能であるという想定外の所見に基づくものであり、そのことは、ＣＨＯ細胞を用いて治療用産物を生成する際に、このグリカン構造の態様を同定、監視、制御する上で重要である。
【００５４】
本開示は、ＣＨＯ細胞によって産生される糖タンパク質上のグリカンの組成物を分析する方法を提供するものである。本開示によれば、ＣＨＯ細胞において産生される糖タンパク質調製物由来のグリカンを分析し、末端α−１，３−ガラクトース残基を含むか否か判断することが可能である。本開示は、このような修飾を検出する方法ならびに、このような修飾を含むまたは欠いている糖タンパク質を生成する方法を提供するものである。
【００５５】
グリカン調製物
本開示は、ＣＨＯ細胞によって産生される糖タンパク質上の末端α−ガラクトシル残基を評価するといった、ＣＨＯ細胞によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを評価することなど、グリカン調製物中の個々のグリカンの構造および／または組成を分析する方法を提供するものである。グリカン調製物は、従来技術において利用できる任意の方法で、細胞調製物から得られるものであってもよいし、糖タンパク質から得られるものであってもよい。通常、グリカン調製物を得ることは、（１）細胞または糖タンパク質調製物を得るステップと、（２）場合によって、細胞または糖タンパク質調製物からグリカンを放出するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、グリカン調製物を得ることが、場合によって、グリカン調製物を検出可能な標識で標識することを含む。
【００５６】
糖タンパク質調製物
糖タンパク質の組換え生成用の方法については説明がなされている。培養細胞によって分泌される糖タンパク質は、陰イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、ゲル濾過、イムノアフィニティクロマトグラフィ、これらの組み合わせなどの利用可能な任意の手段で単離・精製可能なものである。
【００５７】
Ｎ−結合型グリカン調製物
いくつかの実施形態では、糖タンパク質集団を提供し、集団中の糖タンパク質からＮ−結合型グリカンを除去することでＮ−グリカン調製物が得られる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、消化によってＮ−結合型グリカンを糖タンパク質（糖タンパク質など）から除去する。通常、本開示に基づいて用いられるグリカナーゼが、コアのＧｌｃＮＡｃ−Ａｓｎ、ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃまたはＭａｎ−ＧｌｃＮＡｃ残基の間を切断する。糖タンパク質からＮ−結合型グリカンを除去するのに使用可能な酵素の例として、Ｎ−グリカナーゼＦおよび／またはＮ−グリカナーゼ−Ａ、Ｏ−グリカナーゼおよび／またはＥｎｄｏ Ｈがあげられるが、これに限定されるものではない。
【００５９】
いくつかの実施形態では、化学的切断によってＮ−結合型グリカンを糖タンパク質から除去する。いくつか例をあげると、ヒドラジン、水素化ホウ素ナトリウム、および／またはトリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）を用いてグリカンを糖タンパク質から除去することができる。
【００６０】
Ｏ−結合型グリカン調製物
いくつかの実施形態では、糖タンパク質（糖タンパク質など）集団を提供し、集団においてＯ−結合型グリカンを糖タンパク質から除去することで、Ｏ−結合型グリカン調製物を得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ｂ−脱離によってＯ−結合型グリカンを糖タンパク質（糖タンパク質など）から除去する。いくつかの実施形態では、還元的ｂ−脱離によって、Ｏ−結合型グリカンを糖タンパク質（糖タンパク質など）から除去する。いくつかの実施形態では、非還元的ｂ−脱離によって、Ｏ−グリカンを糖タンパク質（糖タンパク質など）から除去する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、テトラヒドロホウ酸アルカリを含む溶液中で調製物をインキュベートすることで、Ｏ−結合型グリカンを糖タンパク質（糖タンパク質など）調製物から除去する。いくつかの実施形態では、重水素標識を取り込んでＯ−結合型グリカンの検出を容易にするなど、テトラジュウテリウムホウ酸塩（ｔｅｔｒａｄｅｕｔｅｒｉｏｂｏｒａｔｅ）を使用する。さまざまな例示的な方法では、糖タンパク質調製物を、０．８〜１．０ＭのＮａＢＨ４と０．０５〜０．１ＭのＮａＯＨとを含有する溶液中で、４２〜４５℃で２〜２４時間インキュベートする。Ｏ−結合型グリカンを除去するための反応を終端させるには、酸（１．０ＭのＨＣｌなど）を加えればよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＮａＯＨを含む溶液中で調製物をインキュベートすることで、Ｏ−結合型グリカンを糖タンパク質調製物から除去する。さまざまな例示的な方法では、糖タンパク質を、５０〜２００ｍＭのＮａＯＨを含有する溶液中で、２７〜４５℃で２〜４８時間インキュベートする。反応を終端させるには、酸を加えればよい。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＮＨ４ＯＨを含む溶液中で調製物をインキュベートすることで、Ｏ−結合型グリカンを糖タンパク質調製物から除去する。さまざまな例示的な方法では、糖タンパク質を、２５〜２８％のＮＨ４ＯＨを含有する溶液中で、４５〜６０℃で２〜４０時間インキュベートする。反応を終端させるには、真空下でＮＨ４ＯＨを除去すればよい。いくつかの実施形態では、溶液が、炭酸アンモニウム（飽和濃度でなど）を含む。いくつかの実施形態では、ＮＨ４ＯＨ処理調製物を酸（ホウ酸など）で処理する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、エチルアミン（約７０％のエチルアミンなど）またはメチルアミン（約４０％のメチルアミンなど）を含む水溶液中で、約４〜２４時間調製物をインキュベートすることで、Ｏ−結合型グリカンを糖タンパク質調製物から除去する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｎ−結合型グリカンを除去した糖タンパク質集団から、Ｏ−結合型グリカン調製物を得る。
【００６７】
グリカンの標識
いくつかの実施形態では、糖タンパク質からの放出の前または後にグリカンを標識と会合させることが可能である。Ｎ−結合型グリカンまたはＯ−結合型グリカン（糖タンパク質集団から除去されたＮ−グリカンなど）を１つ以上の検出可能な標識と会合させることが可能である。検出可能な標識は一般に、Ｎ−グリカンの還元末端に会合する。いくつかの実施形態では、検出可能な標識が蛍光部分である。本開示に基づいて使用可能なフルオロフォアの例として、２−アミノ安息香酸（２ＡＡ）、２−アミノベンズアミド（２ＡＢ）および／または２−アミノプリン（２ＡＰ）があげられるが、これに限定されるものではない。通常、本開示に基づいて用いられるフルオロフォアには、グリカンを損傷および／または破壊しない条件下でオリゴ糖および／または単糖の還元末端との反応性があるという特徴がある。いくつかの実施形態では、蛍光部分は、還元末端に直接的に結合される。たとえば、この直接結合を還元的アミノ化による直接的な共役によって達成可能である。いくつかの実施形態では、蛍光部分が還元末端に間接的に結合される。たとえば、この間接結合を反応性リンカーアームによって達成可能である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、放射性部分または同位体標識された分子を含む。本開示に基づいて使用可能な放射性部分の例としては、トリチウム（３Ｈ）、ジュウテリウム（２Ｈ）および／または３５Ｓがあげられるが、これに限定されるものではない。一般に、このような部分はフルオロフォアに対して直接的に結合または会合される。放射性フルオロフォアの一例をあげると、すべての水素が重水素化されるように２ＡＰを修飾することが可能である。
【００６９】
Ｎ−結合型グリカンの消化
本開示は、糖タンパク質のグリコシル化パターンを判断する改良された方法を提供するものである。このような方法は、グリカン集団を１種類以上のエキソグリコシダーゼに曝露し、消化産物の構造および／または組成を分析することを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示に基づいて用いられるエキソグリコシダーゼが、特定の１つのタイプのグリコシド結合だけを認識および切断する。いくつかの実施形態では、本開示に基づいて用いられるエキソグリコシダーゼが、特定の２以上のタイプのグリコシド結合を認識および切断する。エキソグリコシダーゼのうち、本発明に有用となり得るのは、表１に示すように、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ；ヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼ；これらの組み合わせである。
【００７０】
エキソグリコシダーゼ
エキソグリコシダーゼは、末端グリコシド結合をグリカンの非還元末端から切断する酵素である。この酵素は一般に、特定の単糖結合およびアノマ性（α／β）に対して極めて特異性が高い。いくつかの実施形態では、隣り合った分岐パターンがエキソグリコシダーゼの特異性に影響することがある。エキソグリコシダーゼ処理によって、通常は、標準的な分岐型結合が五糖コア（Ｍ３Ｎ２）（３マンノースおよび２ＧｌｃＮＡｃ残基を含む）に切断されたグリカンが得られる。しかしながら、異常修飾種（分岐型またはコアフコシル化種、高マンノースおよびハイブリッド型グリカン、ラクトサミン伸長グリカン、硫酸化グリカン、リン酸化グリカンなど）は、エキソグリコシダーゼ処理がきかないため、クロマトグラフ的に分離してＭ３Ｎ２五糖に対して定量化することが可能である。本開示に基づいて用いられるエキソグリコシダーゼの例としては、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼ、マンノシダーゼがあげられるが、これに限定されるものではない。エキソグリコシダーゼについては、商業的供給源をはじめとするどのような供給源から入手することも、または細胞源（細菌、酵母、植物など）からの単離および／または精製により入手することも可能である。いくつかの実施形態では、エキソグリコシダーゼ（シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼおよびマンノシダーゼなど）を複数のカテゴリすなわち「サブセット」に分けることが可能である。いくつかの実施形態では、サブセットが違えば、異なるタイプの結合を切断するための機能も異なる。表１に、エキソグリコシダーゼ、その結合特異性、由来となった生物体の例をいくつかあげておく。このエキソグリコシダーゼの一覧は一例にすぎず、包括的なものではない旨、また、どのような結合特異性を持つ、どのようなエキソグリコシダーゼでも本開示に基づいて使用できる旨は、当業者であれば理解できよう。
【００７１】
【表１】
【００７２】
本開示によれば、どのエキソグリコシダーゼまたは一組のエキソグリコシダーゼでもＮ−グリカン集団を消化することが可能である。通常、エキソグリコシダーゼ反応は、酵素活性に合った条件下で実施される。たとえば、所望のエキソグリコシダーゼ活性レベルを実現するために、ｐＨ、温度、反応溶液成分間、濃度（塩、洗剤など）、反応時間の長さを最適化することができる。国際公開第２００８／１３０９２６号パンフレット（その内容を参照により本明細書に援用する）などを参照のこと。
【００７３】
グリカン構造と活性の分析
通常、本開示に基づく方法は、グリカン調製物を分析し、グリカンが特定タイプの修飾（末端α−１，３−ガラクトース残基など）を含むか否かを判断することを含む。いくつかの実施形態では、分析が、ある起源由来のひとつの糖タンパク質調製物におけるグリカンの構造および／または機能を、別の起源由来の少なくとも１種類の他の糖タンパク質調製物におけるグリカンの構造および／または機能と比較することを含む。いくつかの実施形態では、分析が、１つ以上の試料におけるグリカンの構造および／または機能を、基準試料のグリカンの構造および／または機能と比較することを含む。
【００７４】
グリカンの構造および組成については、利用できるどのような方法で分析してもよい。いくつかの実施形態では、グリカンの構造および組成を、クロマトグラフによる方法、質量分析（ＭＳ）方法、クロマトグラフによる方法に続いてＭＳ、電気泳動法、電気泳動法に続いてＭＳ、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、およびこれらの組み合わせで分析される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、グリカンの構造および組成を、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、アミドカラムクロマトグラフィ、およびこれらの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない、クロマトグラフによる方法で分析することが可能である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、グリカンの構造および組成を、タンデムＭＳ、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、マトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、イオン移動度質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）、電子移動解離（ＥＴＤ−ＭＳ）、およびこれらの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない、質量分析（ＭＳ）および関連の方法で分析することが可能である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、グリカンの構造および組成を、細管式電気泳動（ＣＥ）、ＣＥ−ＭＳ、ゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に続いて特定のグリカン構造を認識する抗体を用いるウェスタンブロッティング、およびこれらの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない、電気泳動法で分析することが可能である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、グリカンの構造および組成を、一次元ＮＭＲ（１Ｄ−ＮＭＲ）、二次元ＮＭＲ（２Ｄ−ＮＭＲ）、相関分光磁気角スピニングＮＭＲ（ＣＯＳＹ−ＮＭＲ）、全相関分光ＮＭＲ（ＴＯＣＳＹ−ＮＭＲ）、異種核一量子コヒーレンスＮＭＲ（ＨＳＱＣ−ＮＭＲ）、異種核多重量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ−ＮＭＲ）、回転系での核オーバーハウザー効果分光ＮＭＲ（ＲＯＥＳＹ−ＮＭＲ）、核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ−ＮＭＲ）、およびこれらの組み合わせを含むがこれに限定されるものではない、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および関連の方法で分析することが可能である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術を、グリカンまたは糖タンパク質を検出、分析およびまたは単離するための１つ以上の他の技術と組み合わせてもよい。たとえば、特定の実施形態では、本開示に基づいて、１つ以上の利用可能な方法を用いてグリカンを分析する（ほんの一例をあげるには、Ａｎｕｍｕｌａ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３５０（１）：１， ２００６；Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １７９：１６２， １９８９；および／またはＴｏｗｎｓｅｎｄ， Ｒ．Ｒ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ」 Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．， Ｅｄ． Ｚ． Ｅｌ Ｒａｓｓｉ， ｐｐ １８１〜２０９， １９９５（各々その内容全体を参照により本明細書に援用する）を参照のこと。たとえば、いくつかの実施形態では、クロマトグラフによる方法、電気泳動法、核磁気共鳴法、これらの組み合わせのうちの１つ以上を用いて、グリカンを特徴付ける。例示的なこのような方法として、たとえば、ＮＭＲ、質量分析、液体クロマトグラフィ、２次元クロマトグラフィ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗体染色、レクチン染色、単糖定量、細管式電気泳動、蛍光体支援炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）、ミセル動電クロマトグラフィ（ＭＥＫＣ）、エキソグリコシダーゼまたはエンドグリコシダーゼ処理、これらの組み合わせがあげられる。当業者であれば、本明細書に記載の方法を併用してグリカンを特徴付けるのに使用可能な他の技術がわかるであろう。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、グリカン集団に低濃度で存在するグリカン種（末端α−ガラクトシル残基など）の検出を可能にするものである。たとえば、本方法は、グリカン集団に、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０７５％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満または０．０１％未満の濃度で存在するグリカン種の検出を可能にするものである。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、グリカン集団に低濃度で存在する特定の構造（末端α−ガラクトシル残基など）の検出を可能にするものである。たとえば、本方法は、グリカン集団に、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０７５％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満または０．０１％未満で存在する特定の構造の検出を可能にするものである。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、グリカン集団における個々のグリカン種の相対濃度の検出を可能にするものである。たとえば、液体クロマトグラフの各ピークの下の面積を測定し、全体に対する割合として表すことができる。このような分析をすることで、グリカン集団における各グリカン種の量の相対的な比率が分かる。他の例では、個々のグリカン種の相対レベルを、１Ｄ−ＮＭＲ実験でのピークの面積から、あるいは１Ｈ−１５ＨＳＱＣスペクトルからのクロスピークの量から判断する（標準からの応答に基づいて補正など）、あるいは複数の試料同士を同じピークについて比較して定量化することで、判断する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、糖タンパク質調製物（糖タンパク質調製物など）の生物活性を評価する。糖タンパク質調製物の生物活性を分析するには、利用可能な任意の方法を用いればよい。いくつかの実施形態では、糖タンパク質の結合活性（受容体に対する結合など）を評価する。いくつかの実施形態では、糖タンパク質の治療活性（疾患または症状の重篤度または症候を低減あるいは、疾患または症状の症候の出現を遅らせるにあたっての糖タンパク質の活性など）を評価する。いくつかの実施形態では、糖タンパク質の薬理学的活性（バイオアベイラビリティ、薬物動態、薬物動力学など）を評価する。糖タンパク質治療薬のバイオアベイラビリティ、薬物動態、薬物動力学を分析する方法については、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ． １５（５）：５７１〜９， １９９７；Ｓｒｉｎｉｖａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８５（１）：１〜４， １９９６；Ｓｒｉｎｉｖａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １４（７）：９１１〜６， １９９７などを参照のこと。
【００８４】
当業者であれば理解できるであろうように、試験可能な特定の生物活性または治療活性は、特定の糖タンパク質に応じて変化する。
【００８５】
糖タンパク質調製物の潜在的な有害活性または毒性（高血圧症、アレルギー反応、血栓事象、てんかんまたは他の有害事象を引き起こす傾向など）を、利用できる任意の方法で分析可能である。いくつかの実施形態では、調製物が被検体で抗体応答を誘発するか否かを判断することなどで、糖タンパク質調製物の免疫原性を評価する。
【００８６】
さまざまな実施形態において、末端α−ガラクトシル残基を有する糖タンパク質調製物の生物活性、治療活性などを、末端α−ガラクトシル残基のない糖タンパク質調製物と比較する。さまざまな実施形態において、末端α−ガラクトシル残基を有する糖タンパク質調製物の生物活性、治療活性などを、異なるレベルの末端α−ガラクトシル残基を有する糖タンパク質調製物と比較する。
【００８７】
用途
本開示の方法を利用して、たとえば遊離グリカン、糖タンパク質（糖ペプチド、糖脂質、プロテオグリカンなど）、細胞関連グリカン（核関連グリカン、細胞質関連グリカン、細胞膜関連グリカンなど）；細胞、細胞外、細胞内および／または細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）成分に関連したグリカン（タンパク質など）；細胞外間隙のグリカン（細胞培養液など）などを含む、多岐にわたる状態のいずれでも糖タンパク質からのグリカンを分析することが可能である。
【００８８】
本開示の方法を、治療用または他の商業的に関連のある糖タンパク質製造用のプロセス開発の１つ以上の段階に使用してもよい。本開示の方法を採用可能なこのようなプロセス開発段階の非限定的な例としては、細胞選択、クローン選択、培地の最適化、培養条件、プロセス条件および／または精製手法があげられる。当業者には他のプロセス開発段階も分かるであろう。
【００８９】
また、たとえば特定の所望のグリコシル化パターンを実現または特定の望ましくないグリコシル化パターンの発生を回避する目的で、本開示を利用して、特定の細胞培養物で起こっているグリコシル化の程度および／またはタイプ（細胞培養物中で産生される糖タンパク質調製物の末端α−ガラクトシル残基の程度など）を監視し、これによって培養物を調節または場合によっては終了できるようにすることも可能である。
【００９０】
さらに、本開示を利用して、（たとえば、細胞または細胞系を操作して糖タンパク質を産生あるいは糖タンパク質を商業的に関連のあるレベルで産生する前であっても）特定の所望の糖タンパク質の製造で検討対象となっている細胞または細胞系（ＣＨＯ細胞系など）のグリコシル化の特徴を評価することも可能である。
【００９１】
たとえば、標的糖タンパク質が１つ以上の国で法令による審査があるなどの治療用糖タンパク質である場合、培養物を監視して、厳密に同一の経路で製造されるか否かを問わず、グリコシル化パターンがすでに確立された医薬製品のグリコシル化パターンにできるだけ近い産物（末端α−ガラクトシル残基の程度が医薬製品の程度に近いものなど）が生成される尤度を評価すると望ましいことが多い。本明細書で使用する場合、「近い」とは、すでに確立された医薬製品のグリコシル化パターンに対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％相関するグリコシル化パターンを示す。このような実施形態では、相対的なグリコシル化を評価するために、産生培養物の試料は一般に、複数の時点で採取され、確立された標準または対照培養物と比較される。
【００９２】
たとえば、いくつかの実施形態では、糖タンパク質の生成を監視するための方法が、（ｉ）糖タンパク質の生成時に、少なくとも第１および第２のグリカン含有試料を生成系から除去するステップと、（ｉｉ）第１および第２のグリカン含有試料の各々を分析し、特定の修飾（末端α−ガラクトシル残基など）が存在するか否かを判断するステップと、（ｉｉｉ）差を判断して、これによって糖タンパク質生成の進行具合を監視できるように第１のグリカン含有試料から得られる産物を第２のグリカン含有試料から得られる産物と比較するステップと、を含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、糖タンパク質がアバタセプトである。いくつかの実施形態では、生成系がＣＨＯ細胞を含む。
【００９３】
特定の標的タンパク質の産生を品質制御目的で監視するか否かを問わず、本開示を利用して、たとえば、特定の発達段階で、あるいは特定の成長条件下で、グリコシル化を監視することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、治療用産物の品質を特性決定、調節および／または制御または比較することが可能である。一例をあげると、本方法論を使用して、治療用タンパク質産物を産生する細胞でのグリコシル化を評価することが可能である。特に、グリコシル化が治療用タンパク質産物の活性やバイオアベイラビリティまたは他の特徴に影響し得ることが多いとすれば、このような治療用タンパク質産物の産生時に細胞グリコシル化を評価するための方法が特に望ましい。とりわけ、本開示は、治療用タンパク質の産生系でのグリコシル化のリアルタイム分析を容易にし得るものであり、このゆえに、グリコシル化の調節を達成してもよい。
【００９５】
本開示によって産生および／または品質を監視可能な代表的な治療用糖タンパク質産物としては、たとえば、多岐にわたる血液作用剤（たとえば、エリスロポエチン、血液凝固因子など）、インターフェロン、コロニー刺激因子、抗体、酵素およびホルモンがあげられる。
【００９６】
代表的な市販の糖タンパク質産物としては、ＣＨＯ細胞で産生されるのであれば、たとえば表２に示したものがあげられる。
【００９７】
【表２】
【００９８】
【表３】
【００９９】
【表４】
【０１００】
【表５】
【０１０１】
いくつかの実施形態では、開示が、異なる起源または試料由来の糖タンパク質からのグリカンを、互いに比較する方法を提供するものである。このようないくつかの例では、同じ起源に由来する（同じＣＨＯ細胞起源からなど）複数の試料を経時的に得て、グリコシル化パターン（特に細胞表面グリコシル化パターン）の変化（末端α−ガラクトシル残基の存在または度合いの変化など）を監視する。いくつかの実施形態では、試料のひとつが歴史的試料または歴史的試料の記録である。いくつかの実施形態では、試料のひとつが基準試料である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、開示が、異なる細胞起源によって発現される糖タンパク質からのグリカンを、互いに比較する方法を提供するものである。いくつかの実施形態では、比較された細胞起源の１つ以上がＣＨＯ細胞である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、１つ以上の選択されたパラメータ（細胞型、培養のタイプ［連続供給対バッチ供給など］、培養条件［培地のタイプ、特定培地の特定の成分の存在または濃度（ａ）、モル浸透圧濃度、ｐＨ、温度、タイミングまたは１つ以上の成分のシフトの度合い、たとえばモル浸透圧濃度、ｐＨ、温度など］、培養時間、単離ステップなど）は異なるがそれ以外は同じ条件下で調製した、異なる細胞培養試料からのグリカン同士を比較するため、選択されたパラメータがグリコシル化におよぼす影響を判断できる。特定の実施形態では、選択された単一のパラメータがグリコシル化パターン（末端α−ガラクトシル残基の有無など）におよぼす影響を判断できるように、選択された単一のパラメータが異なる条件下で調製した、異なる細胞培養試料からのグリカンを比較する。よって、その他の用途として、本明細書に記載したような技法を用いることで、特定のパラメータが細胞のグリコシル化パターンにおよぼす影響を判断しやすくできるのである。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、糖タンパク質の異なるバッチからのグリカン同士を、同一の方法で調製するか異なる方法で調製するかを問わず、かつ、同時に調製するか別々に調製するかを問わず、比較する。このような実施形態では、本開示は、糖タンパク質調製物の品質制御を容易にするものである。上記の他にまたは上記に加えて、このような実施形態のいくつかは、糖タンパク質を産生する特定の培養物の進行の監視を容易にするものである（異なる時点で培養物から試料を除去し、分析して互いに比較する場合）。いくつかの例では、同一の供給源から時間をかけて複数の試料を取得し、グリコシル化パターンの変化を監視できるようにする。いくつかの実施形態では、約３０秒間、約１分間、約２分間、約５分間、約１０分間、約３０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約１０時間、約１２時間または約１８時間の間隔、あるいはそれよりも長い間隔で、グリカン含有試料を除去する。いくつかの実施形態では、グリカン含有試料を不規則な間隔で除去する。いくつかの実施形態では、グリカン含有試料を５時間間隔で除去する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本開示による方法を使用して、細胞が糖タンパク質を産生する過程で、そのグリコシル化パターンを監視してもよい。たとえば、糖タンパク質の産生（量産など）は、（１）糖タンパク質を産生する細胞を培養するステップと、（２）培養時に試料を一定間隔または不規則な間隔で取得するステップと、（３）取得した試料で産生された糖タンパク質のグリコシル化パターンを分析するステップと、を含む。いくつかの実施形態では、このような方法は、取得した試料で産生された糖タンパク質のグリコシル化パターンを互いに比較するステップを含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、このような方法は、取得した試料で産生された糖タンパク質のグリコシル化パターンと参照試料のグリコシル化パターンとを比較するステップを含むものであってもよい。
【０１０６】
これらの実施形態のいずれにおいても、グリカン分析の特徴を、たとえば品質制御記録に記録することが可能である。上述したように、いくつかの実施形態では、比較が、糖タンパク質の事前または標準的なバッチの履歴記録および／または参照試料との間で実施されるものである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、異なるバッチの特定の糖タンパク質からのグリカンを、同一の方法で調製するか異なる方法で調製するかを問わず、かつ、同時に調製するか別々に調製するかを問わず、互いにおよび／または参照試料と比較する。いくつかの実施形態では、バッチ間比較が、（ｉ）糖タンパク質の第１のバッチから第１のグリカン調製物を提供するステップと、（ｉｉ）糖タンパク質の第２のバッチから第２のグリカン調製物を提供するステップと、（ｉｉｉ）第１および第２のグリカン調製物の各々に分析手順をほどこすステップと、（ｉｖ）２つのバッチの一貫性を評価できるように、第１のグリカン調製物から得られた分析結果を第２の調製物から得られた切断産物と比較するステップと、を含むものであってもよい。いくつかの実施形態では、バッチからの少なくとも１つのグリカンを少なくとも１つの糖タンパク質から除去し、場合によって、除去したグリカンを単離することで、グリカン調製物を提供してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載したようにしてグリカン調製物を標識してもよい（蛍光的および／または放射線的になど；たとえば、単離の前および／または後など）。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本開示は、糖タンパク質調製物の品質制御を容易にするものである。グリカン分析の特徴を、たとえば品質制御記録で記録することが可能である。上述したように、いくつかの実施形態では、比較が、糖タンパク質の事前または標準的なバッチの履歴記録との間でなされる。いくつかの実施形態では、比較が参照糖タンパク質試料との間でなされる。
【０１０９】
特定の実施形態では、本開示を研究に利用して、細胞のグリコシル化の特徴を修飾し、末端α−ガラクトシル残基を有するまたはこれを欠いている糖タンパク質を産生する細胞系など、たとえば１つ以上の所望のグリコシル化の特徴を有する細胞系および／または培養条件を確立してもよい。その後、必要があれば、このような細胞系および／または培養条件を、このようなグリコシル化の特徴に利益があると想定される特定の標的糖タンパク質の生成に利用する。特定の実施形態では、細胞がＣＨＯ細胞である。
【０１１０】
本開示によれば、本明細書に記載の技法を用いて、望ましいグリカンまたは望ましくないグリカンを検出し、たとえば糖タンパク質産物中の１種類以上の汚染物質を検出または定量化あるいは、１種類以上の活性種または所望の種の存在を検出または定量化することが可能である。
【０１１１】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、供給源（生物学的試料、グリカン調製物など）に極低濃度で存在するグリカンの検出を容易にする。このような実施形態では、グリカン集団に、約１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０７５％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満または０．０１％未満の濃度で存在するグリカンの濃度を検出および／または任意に定量化することが可能である。いくつかの実施形態では、０．１％から５％、たとえば０．１％から２％、たとえば０．１％から１％のグリカン調製物を含むグリカンの濃度を検出および／または任意に定量化することが可能である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、グリカン集団に低濃度で存在する特定の結合（末端ｇａｌ−α−１，３−ｇａｌ結合など）の検出を可能にするものである。たとえば、本方法は、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．７５％未満、０．５％未満、０．２５％未満、０．１％未満、０．０７５％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満または０．０１％未満の濃度でグリカン集団に存在する特定の結合の検出を可能にするものである。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、グリカン集団中の個々のグリカン種の相対濃度の検出を可能にするものである。たとえば、液体クロマトグラフの各ピークの下にある面積を測定し、全体に対する割合として表すことができる。このような分析をすることで、グリカン集団における各グリカン種の量の相対的な比率が分かる。
【０１１４】
以下の実施例を参照し、本開示を一層具体的に示す。しかしながら、本開示はこれらの実施例に何ら限定されるものではない旨は理解されたい。
【０１１５】
当業者であれば、ここに提供する明細書を参照した実施例を考慮することで、本発明の範囲内でのさまざまな他の組み合わせを容易に想像できよう。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：
Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）（アバタセプト）は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）の修飾されたＦｃ（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン）部分に結合されるヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）の細胞外ドメインからなる可溶性融合タンパク質である。アバタセプトは、哺乳類細胞発現系で組換えＤＮＡ技術によって生成される。アバタセプトの見かけの分子量は９２キロダルトンである。アバタセプトを使用して、関節リウマチの症候を治療する、関節損傷の進行を示す、物理的機能を改善する。この生物治療薬でグリコシル化（３つのＮ−結合型と２つのＯ−結合型グリコシル化部位）がゆえに生じる大幅な複雑さがゆえに、慎重な生成と特徴付けが必要とされる。タンパク質化学組成物に対する異なる修飾（タンパク質骨格修飾、グリコシル化など）によって糖タンパク質の生物学的機能に影響する可能性があるため、製造時にこの生物治療薬の化学的および物理的特性に対する良好な制御を保証することが重要である。
【０１１７】
Ｇａｌ−α１−３Ｇａｌエピトープ（「α−ｇａｌ」）は、一般にヒトタンパク質には見られず、ＣＨＯ由来産物では想定されない。このエピトープは一般に、ブタおよびマウスから単離されたタンパク質で観察される。ヒトは、Ｇａｌα１−３Ｇａｌ末端に対する循環抗体を有するため、糖タンパク質の治療薬でこれらの種を監視し、これがプロセス開発にどのように関連するのかを理解することが重要である。本開示は、アバタセプトにおけるα−ｇａｌ構造の存在を示すものである（これはＣＨＯ細胞で発現される）。
【０１１８】
グリカン種の分析に用いられる手順：
ＰＮＧＡＳＥ−Ｆで処理した後、固相抽出精製によって、薬剤物質からＮ−グリカンを単離した。次に、グリカンを２ＡＢ標識した後、選択された画分をＬＣ−ＭＳ−ＭＳで分析した。エキソグリコシダーゼ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、Ｌｃ−ＭＳ／ＭＳの組み合わせによって、グリカン構造をさらに確認した。
【０１１９】
このデータは、アバタセプト−ＣＴＬＡ４糖タンパク質Ｎ−グリカンにおける末端α結合型ガラクトースの存在を示す。ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）の修飾されたＦｃ（ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン）部分に結合されるヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）からなる可溶性融合タンパク質であるＯｒｅｎｃｉａ（商標）（アバタセプト）のＮ−結合型グリカン試料を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。図３に、ガラクトース−α−１−３ガラクトース含有構造に対応し得る組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１のグリカン種の検出を示している、Ａｂａｔａｃｅｐｔ由来のグリカンの画分の蛍光クロマトグラムを示す。
【０１２０】
組成ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１のＯｒｅｎｃｉａ（商標）由来のグリカン種からのＭＳ２スペクトルでは、非還元末端ガラクトース−α−１−３結合型ガラクトースの存在が示唆された（図４）が、ハイブリット型グリカンなどの他の潜在的な構造の可能性を排除するものではない。
【０１２１】
異なるエキソグリコシダーゼ処理に続いてＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳの組み合わせを用いて、この構造をさらに確認した。Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）および対照タンパク質の両方に由来するＮ−グリカン画分に、エキソグリコシダーゼ酵素処理を実施した。どちらの試料も、（ｉ）α−ガラクトシダーゼおよび（ｉｉ）β−ガラクトシダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミノダーゼ、マンノシダーゼの混合物で処理し、潜在的な非還元末端ガラクトース−α−１−３結合型ガラクトース構造を分解した。２つの反応での産物の蛍光クロマトグラムを比較したものを、図５に示す。
【０１２２】
α−ガラクトシダーゼ処理の前後で対照タンパク質由来のグリカンに大きな差は観察されなかった。一方、Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）では、ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１組成の種の明らかな減少に伴う種ＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ５Ｆｕｃ１組成の増加が観察された。酵素処理の結果としてのアバタセプトからのＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１組成の種のＭＳ２も図６に示す。
【０１２３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した場合の異なる組のエキソグリコシダーゼ（β−ガラクトシダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、マンノシダーゼ）を含む処理結果を、さらに確認した（図７）。
【０１２４】
このデータから、Ｏｒｅｎｃｉａ（商標）におけるＨｅｘＮＡｃ４Ｈｅｘ６Ｆｕｃ１組成を有する種が、主に非還元末端ガラクトース−α１−３結合型ガラクトースを含有することが示唆される。
【０１２５】
拡張と代用
以上、本方法を具体的な例示の実施形態を参照しつつ特に図示し、説明してきたが、本開示の主旨および範囲から逸脱することなく形態および詳細にさまざまな変更をほどこし得ることは理解されたい。したがって、本方法の範囲および主旨に包含されるすべての実施形態ならびにその等価物も、権利請求されることを意図している。本開示の方法、系、アッセイについての特許請求の範囲、説明、図面は、説明した要素の順序に限定的なものとして読まれるべきではない（その効果が明記される場合を除く）。
【０１２６】
特許、特許出願、記事、書籍、論文、ウェブページを含むがこれに限定されるものではない、本出願にて引用したすべての文献および類似の資料（このような文献および類似の資料の形式を問わない）は、その内容全体を明示的に援用するものである。援用した文献および類似の資料の１つ以上が、定義した用語、用語の使用法、説明した技術などを含むがこれに限定されるものではない本出願と異なるまたは相反する場合は、本出願が優先する。本明細書で使用する章の見出しは構成上の目的のものにすぎず、どのように説明されているものであっても主題を限定するものと解釈されるものではない。本方法をさまざまな実施形態および実施例に関して説明したが、この方法を当該実施形態または実施例に限定することを意図するものではない。逆に、本方法は、当業者であれば自明であろうさまざまな選択肢、改変、等価物を包含する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞集団を評価するための方法であって、
（ａ）前記集団から１つ以上のＣＨＯ細胞を提供し、
（ｂ）前記細胞によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することを含み、
前記ＣＨＯ細胞は、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではない、方法。
【請求項２】
前記測定するステップが、
（ａ）前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質を単離し、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを前記糖タンパク質上で測定する、
（ｂ）前記ＣＨＯ細胞から産生される特定の糖タンパク質組成物を単離し、前記単離された糖タンパク質組成物からの末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定する、
（ｃ）前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質調製物または単離された糖タンパク質からグリカン調製物を得て、前記グリカン調製物中の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定する、
（ｄ）前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質上に存在するグリカンから、または前記１つ以上のＣＨＯ細胞の表面におけるグリカンから、単糖を切断し、前記切断された単糖から末端放出α−ガラクトース残基を検出する、
（ｅ）前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質調製物から少なくとも１つのペプチドを提供し、前記少なくとも１つのペプチド上の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定する、
（ｆ）前記１つ以上のＣＨＯ細胞の前記細胞表面上のグリカンからの末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することのいずれかを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＨＯ細胞集団がクローン細胞集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）で測定したレベルと基準レベルまたは規格とを比較するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
測定することが、クロマトグラフによる方法、質量分析（ＭＳ）法、電気泳動法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、単糖分析、蛍光法、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度、酵素による方法、検出分子の使用、これらの組み合わせからなる群から選択される、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを同定または定量化するための方法を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＨＯ細胞集団が、治療用糖タンパク質を製造するためのバイオリアクタ内の細胞培養物からの試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記提供および測定するステップを、時間の経過とともに少なくとも１回繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記測定するステップが、ガラクトース−α−１−３−ガラクトースエピトープに結合する検出分子を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出分子が、ガラクトース−α−１−３−ガラクトースエピトープに結合できるレクチンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出分子が、ガラクトース−α−１−３−ガラクトースエピトープに対する抗体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出分子が、標識された部分を含む分子を含むか、これに結合される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記測定するステップの結果を印刷またはコンピュータ読み取り可能な媒体に記録するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＨＯ細胞が、細胞培養物に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＨＯ細胞が、ヒト治療用糖タンパク質をコードするベクターで形質転換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＨＯ細胞上に存在する、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースエピトープまたは前記エピトープを含有するグリカンの量を定量化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
測定することが、前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質を単離し、前記糖タンパク質上の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
測定することが、前記ＣＨＯ細胞から産生される特定の糖タンパク質組成物を単離し、前記単離された糖タンパク質組成物からの末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
測定することが、前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質調製物または単離された糖タンパク質からグリカン調製物を得て、前記グリカン調製物中の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定することが、（ｄ）前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質上に存在するグリカンから、あるいは、前記１つ以上のＣＨＯ細胞の表面のグリカンから、単糖を切断し、前記末端を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
測定することが、前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質調製物から少なくとも１つのペプチドを提供し、前記少なくとも１つのペプチド上で末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
測定することが、前記１つ以上のＣＨＯ細胞の前記細胞表面における複合糖質上の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記測定するステップが、クロマトグラフによる方法を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記測定するステップが、質量分析（ＭＳ）法を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記測定するステップが、電気泳動法を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記測定するステップが、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
−α−１−３−ガラクトースエピトープを含有するグリカンを含む糖タンパク質を産生する機能について、１つ以上のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）複数のＣＨＯ細胞集団であって、前記複数のうちいずれもグリカン上で末端α−ガラクトシル残基を産生するよう遺伝子操作されていない細胞集団を提供し、
（ｂ）前記複数のＣＨＯ細胞集団の各々を、糖タンパク質発現産物の発現に適した条件下で培養し、
（ｃ）前記複数のＣＨＯ細胞各々によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定し、
（ｄ）前記選択されたＣＨＯ細胞調製物によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基の標的レベルの存在に基づいて、前記複数のＣＨＯ細胞調製物のうちの１つ以上を選択することを含み、前記ＣＨＯ細胞が、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列でトランスフェクトされていない、方法。
【請求項２７】
前記複数のＣＨＯ細胞集団の各々が細胞培養物にある、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記ＣＨＯ細胞調製物の単離された糖タンパク質発現産物上で測定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記ＣＨＯ細胞調製物の糖タンパク質発現産物から得られるペプチド上で測定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記ＣＨＯ細胞調製物の細胞表面グリカンから測定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記ＣＨＯ細胞調製物またはその糖タンパク質発現産物から得られるグリカン調製物上で測定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記測定するステップが、（ｉ）前記複数のＣＨＯ細胞集団の各々から糖タンパク質発現産物を単離するステップと、（ｉｉ）前記末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を前記糖タンパク質発現産物上で測定するステップと、を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞培養物がバイオリアクタ内にある、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
測定することが、クロマトグラフによる方法、質量分析（ＭＳ）法、電気泳動法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、単糖分析、蛍光法、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度、酵素による方法、検出分子の使用、これらの組み合わせからなる群から選択される、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを同定または定量化するための技術を使用することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数のＣＨＯ細胞集団の少なくとも１つが、ヒト治療用糖タンパク質をコードするベクターで形質転換されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
複数のＣＨＯ細胞集団が、治療用糖タンパク質の製造過程トレインからの少なくとも２種類の異なるＣＨＯ株、少なくとも２種類の異なるクローン細胞集団、少なくとも２種類の異なる試料からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記選択されたＣＨＯ細胞調製物を培養して治療用糖タンパク質産物を生成するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
ＣＨＯ細胞宿主で産生される糖タンパク質組成物を評価するための方法であって、糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することを含み、
前記糖タンパク質組成物は、ＣＨＯ宿主細胞で産生されたものであり、前記ＣＨＯ宿主細胞は、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではない、方法。
【請求項３９】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースのレベルを、印刷またはコンピュータ読み取り可能な媒体に記録することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの測定されたレベルを基準レベルと比較することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記基準レベルが、前記糖タンパク質組成物を含有する製剤調製物の規格または品質基準である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記基準レベルが、グリカン／総グリカンベースで末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースが５％以下である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、クロマトグラフによる方法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、質量分析（ＭＳ）法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、単糖分析を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、蛍光法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度による方法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、酵素による方法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、検出分子を使用することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項１】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞集団を評価するための方法であって、
（ａ）前記集団から１つ以上のＣＨＯ細胞を提供し、
（ｂ）前記細胞によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することを含み、
前記ＣＨＯ細胞は、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではない、方法。
【請求項２】
前記測定するステップが、
（ａ）前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質を単離し、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを前記糖タンパク質上で測定する、
（ｂ）前記ＣＨＯ細胞から産生される特定の糖タンパク質組成物を単離し、前記単離された糖タンパク質組成物からの末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定する、
（ｃ）前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質調製物または単離された糖タンパク質からグリカン調製物を得て、前記グリカン調製物中の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定する、
（ｄ）前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質上に存在するグリカンから、または前記１つ以上のＣＨＯ細胞の表面におけるグリカンから、単糖を切断し、前記切断された単糖から末端放出α−ガラクトース残基を検出する、
（ｅ）前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質調製物から少なくとも１つのペプチドを提供し、前記少なくとも１つのペプチド上の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定する、
（ｆ）前記１つ以上のＣＨＯ細胞の前記細胞表面上のグリカンからの末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定することのいずれかを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＨＯ細胞集団がクローン細胞集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）で測定したレベルと基準レベルまたは規格とを比較するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
測定することが、クロマトグラフによる方法、質量分析（ＭＳ）法、電気泳動法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、単糖分析、蛍光法、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度、酵素による方法、検出分子の使用、これらの組み合わせからなる群から選択される、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを同定または定量化するための方法を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＨＯ細胞集団が、治療用糖タンパク質を製造するためのバイオリアクタ内の細胞培養物からの試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記提供および測定するステップを、時間の経過とともに少なくとも１回繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記測定するステップが、ガラクトース−α−１−３−ガラクトースエピトープに結合する検出分子を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記検出分子が、ガラクトース−α−１−３−ガラクトースエピトープに結合できるレクチンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出分子が、ガラクトース−α−１−３−ガラクトースエピトープに対する抗体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出分子が、標識された部分を含む分子を含むか、これに結合される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記測定するステップの結果を印刷またはコンピュータ読み取り可能な媒体に記録するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＨＯ細胞が、細胞培養物に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＨＯ細胞が、ヒト治療用糖タンパク質をコードするベクターで形質転換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＨＯ細胞上に存在する、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースエピトープまたは前記エピトープを含有するグリカンの量を定量化するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
測定することが、前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質を単離し、前記糖タンパク質上の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
測定することが、前記ＣＨＯ細胞から産生される特定の糖タンパク質組成物を単離し、前記単離された糖タンパク質組成物からの末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
測定することが、前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質調製物または単離された糖タンパク質からグリカン調製物を得て、前記グリカン調製物中の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記測定することが、（ｄ）前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質上に存在するグリカンから、あるいは、前記１つ以上のＣＨＯ細胞の表面のグリカンから、単糖を切断し、前記末端を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
測定することが、前記ＣＨＯ細胞から産生される糖タンパク質調製物から少なくとも１つのペプチドを提供し、前記少なくとも１つのペプチド上で末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
測定することが、前記１つ以上のＣＨＯ細胞の前記細胞表面における複合糖質上の末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記測定するステップが、クロマトグラフによる方法を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記測定するステップが、質量分析（ＭＳ）法を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記測定するステップが、電気泳動法を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記測定するステップが、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
−α−１−３−ガラクトースエピトープを含有するグリカンを含む糖タンパク質を産生する機能について、１つ以上のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）複数のＣＨＯ細胞集団であって、前記複数のうちいずれもグリカン上で末端α−ガラクトシル残基を産生するよう遺伝子操作されていない細胞集団を提供し、
（ｂ）前記複数のＣＨＯ細胞集団の各々を、糖タンパク質発現産物の発現に適した条件下で培養し、
（ｃ）前記複数のＣＨＯ細胞各々によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを測定し、
（ｄ）前記選択されたＣＨＯ細胞調製物によって産生される末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基の標的レベルの存在に基づいて、前記複数のＣＨＯ細胞調製物のうちの１つ以上を選択することを含み、前記ＣＨＯ細胞が、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列でトランスフェクトされていない、方法。
【請求項２７】
前記複数のＣＨＯ細胞集団の各々が細胞培養物にある、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記ＣＨＯ細胞調製物の単離された糖タンパク質発現産物上で測定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記ＣＨＯ細胞調製物の糖タンパク質発現産物から得られるペプチド上で測定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記ＣＨＯ細胞調製物の細胞表面グリカンから測定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有する前記グリカンを、前記ＣＨＯ細胞調製物またはその糖タンパク質発現産物から得られるグリカン調製物上で測定する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記測定するステップが、（ｉ）前記複数のＣＨＯ細胞集団の各々から糖タンパク質発現産物を単離するステップと、（ｉｉ）前記末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を前記糖タンパク質発現産物上で測定するステップと、を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞培養物がバイオリアクタ内にある、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
測定することが、クロマトグラフによる方法、質量分析（ＭＳ）法、電気泳動法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、単糖分析、蛍光法、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度、酵素による方法、検出分子の使用、これらの組み合わせからなる群から選択される、末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトース残基を含有するグリカンを同定または定量化するための技術を使用することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数のＣＨＯ細胞集団の少なくとも１つが、ヒト治療用糖タンパク質をコードするベクターで形質転換されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
複数のＣＨＯ細胞集団が、治療用糖タンパク質の製造過程トレインからの少なくとも２種類の異なるＣＨＯ株、少なくとも２種類の異なるクローン細胞集団、少なくとも２種類の異なる試料からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
前記選択されたＣＨＯ細胞調製物を培養して治療用糖タンパク質産物を生成するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
ＣＨＯ細胞宿主で産生される糖タンパク質組成物を評価するための方法であって、糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することを含み、
前記糖タンパク質組成物は、ＣＨＯ宿主細胞で産生されたものであり、前記ＣＨＯ宿主細胞は、α−ガラクトシルトランスフェラーゼコード配列を発現するよう遺伝子操作されたものではない、方法。
【請求項３９】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースのレベルを、印刷またはコンピュータ読み取り可能な媒体に記録することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの測定されたレベルを基準レベルと比較することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記基準レベルが、前記糖タンパク質組成物を含有する製剤調製物の規格または品質基準である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記基準レベルが、グリカン／総グリカンベースで末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースが５％以下である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、クロマトグラフによる方法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、質量分析（ＭＳ）法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、単糖分析を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、蛍光法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度による方法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、酵素による方法を実施することを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記糖タンパク質組成物中に存在する末端ガラクトース−α−１−３−ガラクトースの量を測定することが、検出分子を使用することを含む、請求項３８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５１５９２２（Ｐ２０１２−５１５９２２Ａ）
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４７８９１（Ｐ２０１１−５４７８９１）
【出願日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３１６７８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８５２５１
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５０４３４６２９３）モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２２日（２００９．１．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３１６７８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８５２５１
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５０４３４６２９３）モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
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