ＤＮＡの抽出、増幅、及び分析のためのマイクロ流体装置及び方法
一体型ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置であり、犯罪の法医学的現場検証に適する、増幅チャンバと流体共働すると共に分離及び検出チャネルと流体共働する少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバを形成する複数のマイクロチャネルを有する基体を具え、前記サンプルの処理に必要なＤＮＡ抽出材料とゲル系反応試薬を含有し、前記装置は、更に外部電源に接続するための電気接点を具え、前記装置を通して前記ゲル系試薬と前記サンプルから抽出されたＤＮＡの動電学的操作を生じさせる装置が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体サンプル処理装置、方法とシステムに関するものである。より詳しくは、本発明は、ゲルに担持させたサンプルや試薬を有するマイクロチャネルを具え、このマイクロチャネルを使用する完全に一体型にされた携帯可能なＤＮＡ分析器を具えるマイクロ流体サンプル処理装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
「Ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」や「微小化学物質分析システム」としても知られる最新のマイクロ流体装置は、一般に基体と、マイクロチャネルやポートのようなマイクロ構造とを具える。このようなマイクロ流体装置の使用により、シリコン、ガラス、ポリマーのような材料の多層体を特色とする専用マイクロチャネルの使用が可能となり、これによって通常サイズの器具が小型化されて、容易に携帯できるようになる。
【０００３】
標準サイズの同じ種類の装置と比較すると、このようなマイクロ流体装置には、サンプルと試薬の量が非常に少なくてすむということ、分析に必要な時間がより短く、内部で実行される検査の感度が標準サイズの装置より高いことを含む様々な有利な点がある。加えて、汚染の可能性の削減や、現場分析サイトへのより良い可搬性がより簡単になる。
【０００４】
伝統的なＤＮＡ指紋鑑定法のような方法は、一日または場合によっては一週間を要し、手順を完了させるのに多くの異なる装置を使用する。従って、犯罪が起きた直後にＤＮＡを使って、例えば容疑者の迅速なリストを作成することは困難である。しかしながら、化学反応、合成、精製、抽出、産生及び／又は分析など、従来技術のマイクロ流体装置で実行可能である様々な操作が存在する。このため、マイクロ流体装置は、ＤＮＡ指紋鑑定法、遺伝子分析、臨床診断、薬物スクリーニング、環境モニタリングのような分析診断分野において広い実用性を見出すことができる。
【０００５】
マイクロ流体装置に関連する製造手順は、一の装置上で様々な工程の統合の可能性を取り入れているため、最新の調査器具の発展へつながる魅力的なルートを提供し、更にこれが分析測定のロバスト化を強化する自動化システムにつながる。しかしポンプのような補助器具を装置に連結することなく装置のある領域から他の領域に個別容量のサンプルを上手く移送をすることが非常に複雑であるため、いくつかのケースでは、一体化が困難であるとされていた。
【０００６】
通常使用される最新式のマイクロ流体装置又はシステムでは、全て外付けの流体力学ポンプを必要する。例外として電気泳動的分離があるが、これは過大なデッドボリュームを必要とするため、マイクロリットルの流体を操作する方法として非常に非効率的である可能性がある。更に、従来技術の装置は一般に溶液ベースの技術から成り、特に例えば、気泡がシステムに侵入したり、溶液が乾いてしまった場合、サンプルの安定した動電学的制御を提供する態様でマイクロ流体装置内に試薬を準備して保管することは困難である。
【０００７】
特に、組織からのＤＮＡ抽出と精製、ＤＮＡ増幅、サンプル分離及び検出用の単一チップモジュールを実用的な移送メカニズムと組み合わせ、これらのステップが、マイクロ流体連通した構成部品によって上手く実行できる実用的な装置は、効率的な生産と操作が困難であった。様々な試薬の有効かつ一貫性のある局在性、実体面での溶解組織サンプルを受けるインターフェースの効率的な提供、チップを通して連結的に抽出されたサンプルを確実に移送する効率的な移送メカニズムは、特に困難である。
【０００８】
例えば、ＷＯ９９／６４８４８は、部分的に統合されたマイクロ流体装置を記載している。移動は、液体内で動電学的移動（電気浸透）により行われ、電気泳動的な分離が生じるゲル内への動電学的注入を特徴とする。検出は、蛍光発光により、シークエンシングアプリケーションに基づいている。しかし、ＤＮＡの抽出と精製は、チップ外でなされる。
【０００９】
ＵＳ２００３／１９０６０８では、相補的ＤＮＡ／ＲＮＡを有するビーズがゲル内に保持されており、ここを通りサンプルが流体力学的に圧送されるシステムを記載している。熱的増幅を含むハイブリゼーション工程が述べられているが、試薬は装置内に配置されているのではなく、ポンプを用いて容器を介して添加される。蛍光発光検出はチップ上でなされるが、分離は記載されていないか又は特別なアプリケーションを必要とする。更に、ＤＮＡ抽出もチップ外でなされる。
【００１０】
ＵＳ２００５／１６１３２７の装置は、動電学的なものではなく２つの電気泳動ポンプに基づく装置である。サンプルの調整は、試薬の添加と同様に装置外でなされ、全体の工程は、溶液ベースである。分離工程については述べられていない。
【００１１】
ＷＯ２００７／１３３７１０は、プラグ又は水滴ベースの溶液処理を記載しており、主に混合や分離のような水滴操作工程に焦点を当てている。試薬は、装置上に保持されていない。
【００１２】
抽出、増幅と分離と検出を単一装置内で統合することに関連する主な問題点の１つは、統合によって、個々の工程の既知の動作条件が損なわれることである。動作条件の再最適化は、個々の工程間の相互作用を調和させて、システムを独立した複合工程として稼働させなければならないため、達成が困難である。
【００１３】
これらの及び他の理由から、単一チップ上で、抽出と精製、増幅、サンプル分離と検出を効果的に行うマイクロ流体装置は、実現困難であるとされていた。
【発明の概要】
【００１４】
本発明によれば、一体型ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置であって、増幅チャンバと流体共働すると共に分離及び検出チャネルと流体共働する少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバを形成する複数のマイクロチャネルを有する基体を具え、前記サンプルの処理に必要なＤＮＡ抽出材料とゲル系反応試薬を含有し、前記装置は、更に外部電源に接続するための電気接点を具え、前記装置を通して前記ゲル系試薬と前記サンプルから抽出されたＤＮＡの動電学的操作を生じさせる装置が提供される。
【００１５】
“ゲル系試薬”という用語は、抽出されたＤＮＡサンプルの精製及び溶出、及びＰＣＲ反応サポートに必要な試薬が、マイクロ流体装置内でゲルマトリックスに担持されていることを意味する。
【００１６】
マイクロ流体装置の基体は、不活性で非導電性であり、好ましくはガラス又はその他の同様の物質又は材料のような光学的に透明な材料で形成するのが望ましい。基体は、一般に使用まで蓋で密封されて、その中に画定されている内部マイクロチャネルを封入している。蓋は、適当な手段によって基体に固着又は連結できる。
【００１７】
装置のサイズは、その中に設置する分析機器によって決定できる。あるいは、１２０ｍｍ×６０ｍｍであるが、最大１２０ｍｍ又はそれ以上×で最大６０ｍｍ又はそれ以上のサイズも適している。携帯用システムでの利用に適するように小型の装置が好ましい。さらにこの装置は、容易に製造することができる。
【００１８】
ＤＮＡ抽出チャンバは、例えば入口ポートなどを有する溶解サンプルをチャンバへ導入する手段を具える。好都合なことに、このチャンバは、サンプル受け取り手段を具えるか又は、サンプル受け取り手段と流体連通している。サンプル受け取り手段は、溶解サンプルが、直接ＤＮＡ抽出チャンバ内へ導入されるよう構成することができる。好ましい実施例では、溶解剤との混合物中にＤＮＡ材料を含むサンプルを受け取り手段で受け取ることができる。このように、サンプル受け取り手段は、非溶解組織サンプルを収容し、これを溶解させ、ＤＮＡ抽出チャンバに溶解サンプルを導入するように構成できる。例えば、サンプル受け取り手段は、使用時に組織サンプルを受け取る吸収部材を具え、溶解剤を予充填して、使用に際してＤＮＡ抽出チャンバ導入ポートに流体連通して配置し、このように配置された時に溶解サンプルを受け取り、溶解させ導入する。好適な溶解剤はカオトロピック塩溶液である。好適なカオトロピック塩はグアニジン塩酸である。なぜなら、組織サンプルの溶解液に加えたときに、塩が続いて生じるＤＮＡ抽出材料へのＤＮＡの結合を容易にし（以下に述べる）、抽出したＤＮＡを酵素的に切断するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）を不活性化するためである。
【００１９】
ＤＮＡ抽出材料は、ＤＮＡを捕捉することができ、残存量の溶解サンプルをこの材料に通過させるか、ＤＮＡを吸着させて、主容量の溶解サンプルを捕捉して、ＤＮＡをこの材料に通過させることができる。望ましくは、ＤＮＡ抽出材料を荷電してＤＮＡを捕捉し、ＤＮＡ抽出チャンバ内に配置させるようにする。より望ましくは、ＤＮＡ抽出材料は、多孔性固相抽出材料である。固相抽出（ＳＰＥ）により、サンプルの予濃縮と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような下流のアプリケーションを阻害する潜在的な汚染の除去が可能になる。更に、ＳＰＥはＤＮＡの予濃縮を行うこともできる。これはわずかなサンプルを取り扱うときに重要である。
【００２０】
より好ましくは、ＤＮＡ抽出材料はシリカ系抽出材料であり、例えばシリカビーズ、又はより好ましくはシリカ系モノリスである。シリカ系モノリスのようなシリカ系抽出材料は、溶解サンプルからＤＮＡを抽出するだけでなく、電気浸透流（ＥＯＦ）用ポンプとして作動し、これにより、下記により詳しく述べるよう抽出ステップの効率が上がる。
【００２１】
シリカ系モノリス内のように、ＤＮＡ抽出材料が負に荷電している所に、例えばカオトロピック塩溶液のようなカオトロピック剤が存在すると、溶解がチップ上で行われる溶解剤か、あるいは溶解がチップ外で行われる装置の関連チャネルに予充填した溶解剤が、溶解サンプル中に存在するＤＮＡとＤＮＡ抽出材料との結合を容易にする。これは、カオトロピック剤のイオン強度が高いため、抽出材料の表面における負電位を減少させることができるからである。これによって、ＤＮＡと抽出材料表面が脱水され、ＤＮＡ／抽出材料接触中の分子間水素結合が形成されて優勢になり、これにより、ＤＮＡ抽出材料へのＤＮＡの結合が強化される。更にカオトロピック剤は、水分子を閉じ込めることにより水和イオンを形成し、ＤＮＡ及び抽出材料表面の溶媒化を減少させる。更にカオトロピック剤は、ＤＮＡを変性させて、１本鎖ＤＮＡ分子の露出したベースを抽出材料表面に水素結合させる。
【００２２】
本発明の好ましい実施例は、装置上で組織細胞の溶解が行われ、この溶解剤は更にリボ核酸（ＲＮＡ）のようなキャリア分子を具える。このようなキャリアＲＮＡの使用は、特にサンプル中に存在するＤＮＡが少量のときに、ＤＮＡ抽出の効率増加に顕著な効果を有する。シリカ系モノリスのような抽出材料上には、所定量の核酸が不可逆的に結合する部位が常に存在することが知られている。溶解剤中にキャリアＲＮＡを含めることにより、このキャリアＲＮＡがこれらの部位に犠牲的に結合して、重要なＤＮＡの損失を最小限にし、より大きな回収につながる。
【００２３】
シリカ系モノリスは、熱的活性型か光開始型であることが望ましい。使い易さ、速度、再現性、及び作製したマイクロ流体装置上での正確な局在化といった特有の利点を有することから、熱的活性化型のシリカ系モノリスが、光開始型のものより望ましい。モノリスは一般に多孔性であり、モノリス内部の又はモノリスに隣接している導入口を介して溶解したサンプルを受け入れることができる。
【００２４】
ＤＮＡ抽出チャンバは、チャンバに流体連結する洗浄用入口と洗浄用出口を具えることが望ましい。望ましい実施例では、ＤＮＡ抽出チャンバが、ゲル内に担持された溶出試薬を含むチャネルを更に具えており、チャンバが冷却されると、ＤＮＡ抽出材料からＤＮＡを溶出することができる。溶出ゲルは、例えば水のような低イオン強度の緩衝材を含んでいることが望ましい。
【００２５】
この装置は、また、装置の周囲に、導入又は移動用の、又は試薬の除去又は廃棄用の複数の入口と出口を具える。
【００２６】
望ましくは、少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバ、増幅チャンバ、及び分離及び検出チャネルの各々の中のゲル系試薬がそこで行われる工程の性質に関連している。このようなゲル系試薬は、所望であれば、装置内の原位置にあるときにマトリックスを形成する能力により選択することができる。ゲル系電気泳動に適切であり、特に装置内の原位置にあるときにマトリックスを形成する能力があることが知られているゲルは、線状多糖類系ものを含む。好ましくは、このゲルは少なくとも一の線状多糖類を具え、この線状多糖類は、選択的に、別の線状多糖類と、及び／又は、少なくとも一の非線状多糖類と混合されていることが好ましい。アガロース系ゲルは特に適している。従って、この少なくとも１の線状多糖類は、好ましくは、アガロースを含有しており、このアガロースは、いくつかの実施例においては、重要であるか、ゲルを形成する唯一の材料として存在するだけである。
【００２７】
電気泳動的分離に使用する望ましいゲルは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）系又は線状ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）系である。そのようなゲル中に存在するポリマー濃度によって、注入に続いてゲルが分離チャネルに局在するよう流れを制御できる。好ましくは、このポリマー濃度は、分離ゲル培地の３重量％から７重量％である。これらのポリマーレベルは、ＰＣＲ増幅産物を減速するポリマーマトリックスを形成して、好適な分離を行えるからである。
【００２８】
このように、ゲル系試薬の使用により、本発明によって作製したマイクロ流体装置上に様々な工程試薬を正確に局在化させて固着することができる。溶解サンプルからのＤＮＡ抽出、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用したＤＮＡ増幅、分離および検出の全てのステージは、本発明によるマイクロ流体装置上のマイクロ流体結合した構成部品によって、連続的に局在化された方法で実行できる。特に、溶解サンプルからＤＮＡを抽出することにより、抽出チャンバは、より効果的な実体インターフェースを抽出、増幅、分離及び検出の全てのステージが連続的に局在化された方法で実行されるマイクロ流体装置に提供する。
【００２９】
ゲル系試薬は、また、選択されたＤＮＡフラグメントに結合し、分離工程で検出できる光プローブを具える。この光プローブは、ＤＮＡフラグメントに結合するか、発光するＤＮＡフラグメント上で光る光を反射又は吸収することができる。好ましくは、光プローブは、蛍光染料又は化学染料である。より好ましくは、光プローブは、ＤＮＡフラグメントの５’末端に結合し、増幅する間にＰＣＲ産物内に取り込まれる蛍光染料である。適切なプローブは、一又はそれ以上の以下の蛍光染料：５−カルボキシフルオレカイン（ＦＡＭ）、５’−ジクロロ−ジメトキシ−フルオレカイン（ＪＯＥ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びカルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）を含む。
【００３０】
従って、ここで使用される分離は、包括的な全てのメカニズムとして広範囲にわたって説明するべきである。ＤＮＡフラグメントの空間的な及び／又は一時的な物理的分離、及び／又は、複合試薬と並用する複数の分離によって補充されるか否かにかかわらず、例えば蛍光染料又は化学染料のようなオプトルミネッセンス技術を介する視覚的な分離を含む分離により、増幅産物のＤＮＡフラグメントは検出用に選択的に識別される。このような光学的分離は使用する蛍光染料が異なる固有波長で発生するため生じる。従って、蛍光染料が同時に存在する場合でも、すなわち、分離及び検出チャネル中の同じ位置にあっても、標準スペクトロメータは個々のプローブの存在を識別し、装置へ導入されたＤＮＡサンプルのプロファイルを検出することができる。
【００３１】
この装置は、ゲル系試薬、サンプルから抽出されたＤＮＡ、及び本装置を通過するＰＣＲ産物を動電学的に操作するべく複数の電極を具えている。これらの電極は、一端が装置に密閉可能に連結されており、他端は電源に連結できる。動電学的という用語は、電気泳動、電気浸透流、及び当業者にとって明らかなあらゆる電気的操作手段を含む。好ましい操作モードでは、次いで行われるステージを通して増幅チャンバに到達するまで、抽出されたＤＮＡは、電気浸透により操作される。その後は、一般的に電気泳動による操作が望ましい。
【００３２】
この発明の更なる態様によれば、生体サンプル中でのＤＮＡ分析用の携帯可能な一体型システムを提供しており、このシステムは、前記サンプルからのＤＮＡフラグメントを抽出、精製、増幅、分離、及び分析する動電学的駆動システムを具え、更に増幅チャンバと流体共働する少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバを形成する複数のマイクロチャネルを有する基体を具える、ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置を具え、前記増幅チャンバは、分離及び検出チャネルに流体共働しており、前記マイクロ流体装置内に配置され、電源に連結された複数の電極がマイクロ流体装置の周りでゲル系試薬とＤＮＡとＤＮＡフラグメントを動電学的に操作するよう構成されており、前記マイクロ流体装置は前記ＤＮＡ抽出チャンバを介して前記サンプルを受け取るよう構成されており、このシステムは更に、前記マイクロ流体サンプル処理装置に連結又は隣接した発熱体を具えており；検出可能な信号により、ＤＮＡフラグメントを検出するべく配置された検出器と；マイクロ流体装置、動電学的に駆動されるシステム、前記検出器及び電源を含むよう構成された携帯可能なハウジングを具える。
【００３３】
この発熱体は、ＤＮＡフラグメントの熱循環を達成する好適な手段を具え、特別な冷却部材を具えてもよい。発熱体は、接触式又は非接触式発熱体である。通常使用されている接触式発熱体は、例えばペルチェヒータなどの蓄熱ヒータ、又はプラチナなどの薄膜蒸着抵抗のマイクロ流体装置の外側への蒸着を含む。ペルチェヒータは、加熱の信頼性が高いため、ＤＮＡ増幅の熱循環を達成させるのに広く使用されているが、温度勾配が比較的低いという問題があった。マイクロ流体システムのＤＮＡ増幅について述べた非接触式加熱方法は、赤外線やハロゲンランプの使用、誘導加熱やジュール加熱を誘導する交流電流を含む。好ましくは、発熱体は、マイクロウェーブ放射源を具える。
【００３４】
本発明のこの態様の一体型システムは、本発明の第一態様のマイクロ流体サンプル処理装置を使用しており、システムの好ましい事項は類推理解される。
【００３５】
その発明の更なる態様で、ＤＮＡ分析の方法は以下のステップを含む。
ａ）分析システムに配置されたゲル系マイクロ流体サンプル処理装置のＤＮＡ抽出チャンバへサンプルを導入するステップと；
ｂ）前記ＤＮＡ抽出チャンバ内で前記サンプルを動電学的に操作して、ＤＮＡを洗浄し浄化するステップと；
ｃ）前記ＤＮＡ抽出チャンバ内のＤＮＡを増幅チャンバへ溶出させるステップと；
ｄ）前記増幅チャンバ内のＤＮＡフラグメントを増幅してゲル内で増幅産物（ＤＮＡフラグメント）を形成するステップと；
ｅ）分離チャネルに動電学的に前記増幅産物を注入するステップと；
ｆ）前記増幅産物を動電学的に分離してＤＮＡプロファイルを形成するステップ。
【００３６】
好ましくは、サンプルは、装置のＤＮＡ抽出チャンバへ導入される前に溶解される。
【００３７】
この方法の一の実施例では、サンプルは、装置へ導入される前に溶解される。例えば溶液として、カオトロピック塩と混合したＤＮＡを含む溶解サンプルが導入される。例えば、カオトロピック塩溶液中の溶解サンプルは、続く洗浄及び溶出溶液の流れに直交するシリカモノリスのような抽出材料構造上に手動で充填される。
【００３８】
この方法の別の実施例では、サンプル溶解ステップは、装置で又は装置上で行われる。例えば、サンプルは次のステップにより導入される：
溶解剤を充填した吸収部材を提供するステップ；
非溶解生体サンプルを前記吸収部材へ適用するステップ；
前記ＤＮＡ抽出チャンバと流体連通するサンプル受け取り部位において前記吸収部材を適用及び／又は保持して、その中に前記溶解サンプルを導入ステップ。
【００３９】
ＤＮＡ抽出チャンバは、ＤＮＡ抽出材料を含む。ＤＮＡ抽出材料が、溶解サンプルの残存量を捕捉するときに、ＤＮＡの抽出と溶出が一ステップで行われ、ＤＮＡフラグメントを材料は通過させる。代替的にＤＮＡ抽出材料が、ＤＮＡフラグメントを捕捉できる場合には、ＤＮＡの溶出は抽出とは別のステップで行われる。
【００４０】
ＤＮＡ抽出材料の好ましい特徴は、上記に記載されている。特に、ＤＮＡ抽出材料は、荷電されていることが好ましい。より好ましくは、ＤＮＡ抽出材料が固相抽出材料である。更に好ましくは、ＤＮＡ抽出材料がシリカ系抽出材料であり、例えば少なくとも一のシリカビーズ又はより好ましくはシリカ系モノリスを具える。
【００４１】
溶解サンプルは、ＤＮＡ抽出チャンバの洗浄入口から洗浄出口まで、動電学的に試薬を操作することにより洗浄される。本発明の好ましい実施例では、装置のＤＮＡ抽出チャンバ内での洗浄試薬の動電学的な操作が、電気浸透的な操作により行われる。
【００４２】
上記の通り、シリカ系抽出材料の使用は、それが電気浸透流（ＥＯＦ）用ポンプとして作動するため好ましく、それにより、溶解サンプルからのＤＮＡの抽出及び洗浄ステップが促進される。これは負に荷電したどの抽出材料にも言えることであり、例えば、チャネルの表面積と比較して、シリカ系抽出材料がより大きい表面積を有する結果として生じる。ＥＯＦは、表面効果であり、表面積の増大はポンプサポートの増大をもたらす。更に、そのような抽出材料は、流体力学的抵抗によりサンプルの流体力学的な逆流を制限する一方向弁として作動する。流体力学的抵抗は、材料内の小さな孔の存在に起因するものであり、この小さな孔は、流体力学的な圧流に対して高い毛細血管抵抗を有する。逆流を制御する装置がないので、逆流を防止することは非常に重要である。逆流は流体力学的な圧力の差違が原因であり、前方ＥＯＦと均衡を迅速に保つので、サンプルの移動は即座に停止する。
【００４３】
発明の好ましい実施例では、増幅チャンバへのＤＮＡ抽出チャンバ内のＤＮＡの溶出は、動電学的な操作により行われる。
【００４４】
電気浸透的な操作は、ゲルとＤＮＡ抽出材料を通してサンプルのバルク移動をもたらし、溶解サンプルからＤＮＡを抽出して、このＤＮＡを増幅チャンバへ移送させるので、ステップｂ）とｃ）において好ましい。
【００４５】
本発明の方法のこの態様は、通常、本発明の第一又は第二態様のマイクロ流体サンプル処理装置又一体型システムを使用しており、システムの好ましい特徴は類推理解される。
【００４６】
好ましくは、ＤＮＡフラグメントを形成するためにサンプルから抽出したＤＮＡの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して行われる。
【００４７】
ＤＮＡプロファイルを形成するための増幅産物の電動学的な注入及び分離は、電気泳動により行われる。電気泳動的分離は、電界中でイオンの変位を引き起こし、これにより、ＤＮＡフラグメントを分離（通常は、フラグメントのサイズが基準となる）してＤＮＡプロファイルを作成するため、好ましい方法である。
【００４８】
この方法は、更に動電学的な分離によって処理された、ＤＮＡプロファイルを検出するステップを含む。ＤＮＡプロファイルを検出することにより発生した検出信号は、次いで、プロファイルが図形で見られるよう出力手段に送信される。更にこの方法は、作製されたプロファイルを英国犯罪科学局又は関連データベース内に保存されているＤＮＡデータベースに保存されているような、既知のプロファイルと比較するステップを具える。
【００４９】
本発明は、例えば犯罪シーンにおいて現場で使用するために、犯罪科学捜査の分野に、特別なアプリケーションを有するよう意図されているが、食品真正に関する遺伝形質の決定、父子鑑定例、細菌／ウイルス感染、菌株同定及びＤＮＡを基にした安全マーキングのような様々なアプリケーションも想定されている。
【００５０】
本発明による完全一体型の携帯可能なＤＮＡ分析器によれば、例えば、現場でＤＮＡ指紋鑑定するために犯罪シーンで得たＤＮＡサンプルの処理を約１時間以内で汚染の問題を減らして又は無くして、行うことができる。このようなことは、診断及び分析工程の合理化によって可能となる。診断及び分析工程の速度でも、保管室や空港の安全施設のような現場での分析が鍵となる他の多くの状況でのこれらの装置の使用が適したものになる。特に、そのような分析器を用いたＤＮＡ分析は、細胞回収はマイクロ流体装置の外で行うが、ＤＮＡ抽出、ＤＮＡフラグメントの増幅及び増幅産物の分離、及び選択的な場合のサンプル溶解ステージの任意の少なくとも一部もマイクロ流体装置内で行われるので、上手く行われる。
【００５１】
分析器の特定のコンパクト性によって、各工程ステップ間の調整が行われ、ＤＮＡフラグメントが交互に加熱され、冷却される増幅処理を非常に迅速に行うことができる。その結果、一体型分析器システムは、ＤＮＡ抽出から分析（例えば遺伝子プロファイリング）までの全行程を約１時間で完了することができる。
【００５２】
本発明のＤＮＡ分析器システムは、ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置を利用しており、従って、マイクロ流体装置内での試薬、ＤＮＡ、及びＰＣＲ産物の動電学的流体移動を利用してＤＮＡ分析を達成する。更に、ゲル系マイクロ流体サンプル処理においてＤＮＡ抽出材料とゲル系試薬を経由して担持材料を組み込むことは、試薬とサンプルを液体／溶液相中でのみ使用する従来の市販の装置よりも優れた結果を提供する。
【００５３】
マイクロ流体装置内でのゲル又はゲルマトリックスの形成は、長時間その中に試薬を担持さることができ、システム内に泡が存在しても、溶解サンプル、ＤＮＡ及び増幅ＤＮＡフラグメントのより安定した動電的制御を提供する。
【００５４】
加えてそのような装置は、溶解サンプルの装置への導入を可能にし、次いで装置内での連続的な抽出及び／又は精製、増幅、及び分離により多数の処理を行う。そのような処理は、その中でゲル系試薬との一連の相互作用を通じ、主に溶解サンプル及び／又はＤＮＡの動電学的な操作により達成される。これは程度の差はあるが、“単一ステップ”装置である従来技術の装置と対照的である。
【００５５】
本発明は、生体サンプル中のＤＮＡフラグメント分析に関して記載されているが、当業者は本発明が、例えばＲＮＡなどの核酸材料の分析に同様に適用され、そこでこの工程がＰＣＲの使用に適したＤＮＡを形成する逆転写を含むことを理解するであろう。従ってこの方法は、逆転写を行うことを含み、この装置は、このステップを行うのに適した試薬を具えていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
本発明の実施例を、例示として添付図面を参照して以下に説明する。
【００５７】
【図１】第一構成部品、すなわちハードウェアを含む本発明のシステムの格納手段を示す。
【図２】原位置にマイクロ流体装置を有する、本発明のシステム格納手段を示す。
【図３】本発明のマイクロ流体装置の重要な部分を示す。
【図４】本発明のマイクロ流体装置の概略図を示す。
【図５】代替のサンプル導入装置を具える、本発明の第二実施例によるマイクロ流体装置を示す。
【図６】本発明によるマイクロ流体装置におけるシリカ系モノリス上での電気浸透流による８０％のエタノール洗浄溶液（ｖ／ｖ）とゲル中の８０％のエタノール洗浄液（ｖ／ｖ）の移動を示する。
【図７】本発明の方法論によって得られたＰＣＲ産物のＵＶトランスイルミネータ画像を示したものであり、特にＰＣＲ試薬へのＤＮＡの動電学的移動を通じて得られたものである。ここで、安定性テスト１は、室温で３０分間放置したゲルにより、安定性テスト２は、室温で１時間放置したゲルによる。
【図８ａ】ゲル濃度の安定性テストで得られたＰＣＲ産物のＵＶトランスイルミネータ画像を示す。
【図８ｂ】本発明の方法論によって４℃で４週間保存したゲルの安定性テストから得たＰＣＲ産物のＵＶトランスイルミネータ画像を示す。
【図９】表２に見られる配列に関連する印加電圧に起因する電動学的移動を視覚化した図であり、ここでＡとＢはそれぞれ最も有効な二つの配列を視覚化した本発明の方法論によるものである。
【図１０】本発明のマイクロ流体装置の図であり、アガロースゲルで満たされたＴ−セクションから、ポリエチレンオキシド分離媒体で満たされたキャピラリ電気泳動分離チャネルへのサンプルの電動学的注入を行うマイクロ流体装置を示しており、ここでＡ−Ｄは白金電極の配置を示す。
【図１１】本発明の方法論によるアガロースゲルマトリックスでの、失敗した動電学的注入を視覚化した図である。
【図１２ａ】本発明の方法論によるＴＥ溶液中でＥＫ注入から得たプロファイルを図形化して示す。
【図１２ｂ】本発明の方法論による１．５％のアガロースゲル中でＥＫ注入から得られたプロファイルを図形化して示す。
【図１３】本発明の方法論による１．５％のアガロースゲル中で最適化ＥＫ注入から得たプロファイルの一例を図形化して示す。
【図１４】本発明の方法論によるアガロースゲルマトリックス中での、（ａ）泡が存在する場合と、（ｂ）泡が存在しない場合の成功した動電学的注入を視覚化して示ており、動作電圧と時間は、表１に示す。
【図１５】一体化したＤＮＡ抽出チャンバと増幅チャンバと、電気浸透ポンピング用の電極の配置を示すマイクロ流体装置の図を示す。
【図１６】溶出ステップ間にモノリスから回収されＤＮＡの量を図１５に示す装置に最初に添加されたＤＮＡの量との比較をグラフで示す。
【図１７ａ】図１５に示すシステムによって作られた、ＰＣＲ産物を示すアガロースゲルを視覚化して示す。
【図１７ｂ】図１５に示すシステムによって作られ、キャピラリ電気泳動により正確なサイズを分析した、アメロゲニンＰＣＲ産物を図形化して示す。
【図１８】本発明によるマイクロ流体装置に熱循環を適用するのに適切なマイクロウェーブヒーターの断面を示す。
【図１９】ネットワーク分析器からの図形出力を示しており、これは図１８に示すヒーターの操作パラメータを決定するマイクロ流体装置の正確な共鳴周波数を示す反射能の低下を表示する。
【図２０】図１８に示すヒーターから得た熱循環を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
マイクロチャネルを具えるマイクロ流体サンプル処理装置が提供されている。マイクロチャネルは基体に刻み込まれている。この基体は、望ましくはガラスであるが、プラスチック又はその他適当な物質でもよい。約１２０ｍｍ×６０ｍｍの範囲の大きさであるか、あるいは使用するアプリケーション又はシステムによって決まる他の適当なサイズであってもよい。基体は、更にそのマイクロチャネル内にゲル系分離媒体と試薬を具え、基体を電源へ接続し、ＤＮＡ分析システム内で機能するのに必要な電気接点を具えている。ゲル系分離媒体と試薬は、流体力学ポンプによってマイクロチャネル内に予め充填されており、例えば吸引又は圧力によって注入を静水学的に制御する。ガラスの基体は、基体に接着した蓋で密封されており、基体内に画定されているマイクロチャネルを封入する。蓋を取り付けるその他の手段も好適であり、接着以外の手段による蓋の取り付けを排除するものではない。
【００５９】
マイクロ流体装置用の基体材料は、ガラス技術が既に確立され、ほとんどの反応に対する化学的応答に関して十分に特徴付けされているので、ガラスが好ましい。
【００６０】
マイクロ流体処理装置（３００）は、３つの主要な構成部分を具えている。すなわち、ＤＮＡ抽出チャンバ（３０２）、ＰＣＲチャンバ（３０３）、分離検出チャネル（３０４）であり、これらはすべて図３、４に示されており、互いに対して流体連結／共働している。
【００６１】
上述したとおり、従来技術と異なり、本発明のマイクロ流体装置（３００）は、例えばＤＮＡ分析システムに使用する際に外付ポンプを必要としない。代わりに、複数の電極を使用して流体を動電学的に操作し、マイクロチャネル内のゲル系の試薬構造内にバルク流を生じさせるか、あるいは電気浸透流又は電気泳動で、荷電された化学種の動きを分離させる。本願では、７つの電極を使用しているが、より多いまたは少ない電極でもよい。
【００６２】
本発明のマイクロ流体装置（３００）は、必要なハードウェアをすべてマイクロ流体装置に外付けすることによって、安価に製造するように特別に設計されている。これにより、マイクロ流体装置の経済性が維持され、単回の分析に適する。従って単回使用の分析には理想的である。単回使用の分析は、証拠の基礎を固めるのに使用済みのマイクロ流体装置を必要とする科学捜査又は犯罪シーンの調査分野で特に有利である。
【００６３】
本発明のマイクロ流体装置（３００）においては、プロセス試薬やサンプルＤＮＡを担持するゲルを満たしたチャネルやキャピラリを使用しており、システム内に泡が存在する場合でも、溶液ベース（従来技術）の手法と比較して、サンプルＤＮＡの動電的な制御に関して、安定性を強化している。ゲルはマトリックス形状だが、どのような形状であってもよく、様々なプロセス試薬をマイクロ流体装置内の正確な位置に長期間にわたって固定できるものでなければならない。
【００６４】
マイクロチャネルを具えるマイクロ流体装置（３００）を使用する前に、図４に示すマイクロ流体装置の概略図を特に参照し、下記で詳細に説明するよう準備しなければならない。
【００６５】
マイクロ流体装置の準備
モノリスの準備：ケイ酸カリウムとホルムアルデヒド１０：１の溶液をサンプル導入ポート（３０１）に圧力注入することによって、マイクロ流体装置（３００）の６角形抽出チャンバ（３０２）内にシリカ系抽出モノリスを形成する。周囲のチャネルを３％のグリセロールヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）ゲルで満たして、１２時間、９５℃で硬化させる間、シリカ溶液を、６角形抽出チャンバ（３０２）内に確実に維持する。硬化工程に続いて、水を用いてチャネルからＨＥＣゲルを洗い流す。シリカ系モノリスは、ケイ酸カリウム（９％酸化カリウム、２１％酸化ケイ素）とホルムアルデヒド９８％を用いて製造する。
【００６６】
チャネルＡの準備：アガロース洗浄液送達ゲルは、低融点アガロースゲルを脱イオン水に溶かして、濃度３％（ｗ／ｖ）（１００μｌ脱イオン水中に０．００３０ｇアガロース）とし、７５℃で加熱して作る。ゲルが形成されるがまだ溶解しているときに、８０％のエタノールと２０％ １Ｍの塩化ナトリウムを加え、混合して、ポートＡ内に圧力注入して、ポートＡの入り口から抽出チャンバ（３０２）に位置するモノリスまでのチャネル長を満たす。
【００６７】
チャネルＢの準備：低融点アガロースを、ＤＮＡ／ＲＮＡを含まない水に溶解させ、７５℃で１０分間加熱し、大容量の水がゲルを通って自由に移動できるように、ゲルの濃度を低く保つ。ゲルが形成されたがまだ溶解しているときにゲルをポートＢに圧力注入して、ポートＢの入り口から抽出チャンバ（３０２）に位置するモノリスまでのチャネル長を満たす。
【００６８】
チャネルＣの準備：低融点アガロースを、ＤＮＡ／ＲＮＡを含まない水に溶かし、７５℃で１０分間加熱する。まだ溶解しているときに、ゲルをポートＣに圧力注入する。
【００６９】
分離チャネル（３０４）の準備：ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）ゲルを、長時間撹拌法によって、１×Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中２．５％濃度になるように作り、次いで圧力注入によってポートＧに導入する。ゲルの粘度によって流れを制御して、チャネルＤ−Ｆの交差箇所にだけ注入が行われるようにできる。代替の実施例では、１×Ｔｒｉｓ ＴＡＰＳ ＥＤＴＡ（ＴＴＥ）緩衝液中の６Ｍの尿素を有する線状のポリアクリルアミドゲルなどの、適当な粘度を有するその他のゲルを分離チャネルに用いても良い。
【００７０】
ＰＣＲチャンバ（３０３）の準備：低融点アガロースを、ＤＮＡ／ＲＮＡを含まない水に溶かし、７５℃で１０分間加熱する。ゲルが形成されているがまだ溶解しているときに、ＰＣＲ試薬を加えて（ＮＨ４緩衝液、ＢＳＡ、順方向プライマーと逆方向プライマー、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＣＬ２、Ｔａｑポリメラーゼ）混合する。“ＰＣＲゲル”は、ゲルがまだ溶解している状態でポートＤへの圧力注入を介してＰＣＲチャンバ（３０３）に注入し、チャネルＤ−ＦとポートＥを満たす。
【００７１】
次いで、ポートＡ−Ｇを導電性ポリマープラグで閉鎖する。このプラグは電極に接続されており、統合分析システムの第一構成部品に配置できる電源によって電力が供給される。
【００７２】
全分析方法の段階（少なくとも細胞溶解後）を、上述の密閉したマイクロ流体装置（３００）内で行なう。分析システムで使用する前に、マイクロ流体装置（３００）は、必要な各段階に適した化学的性質を有する試薬を予め充填しなければならず、装置は４℃で保管されることが望ましい。一の運転モードでは、ユーザーが現場にいれば、引き続き溶解したサンプルを手動で装置に充填できる。別の運転モードでは、サンプルの溶解も装置で行われる。これらの代替例については、下記に詳しく述べる。
【００７３】
溶解サンプルとＤＮＡのキャピラリーチャネルへの注入の制御は、再現可能な分離と確実な検出分解能を得るためとても重要である。マイクロ流体装置への注入は、吸引、圧力又は重力によって静力学的に、又は動電学的に制御できる。本質的に動電学的な制御は、静力学的なシステムよりも、より的確で正確にサンプルを導入できると共に、外付けポンプ、アクチュエーター、バルブなどを必要としない。この実施形態では、サンプルの充填を、サンプル導入ポート（３０１）を、例えば数マイクロリットのル溶解サンプルをサンプル導入ポート（３０１）に分注して、又はサンプルを、溶解剤を浸透させたスポンジ（５０１）に加え、そのスポンジ（５０１）をサンプル導入ポートに加えるか配置するかして実行する（図５参照）。そこからサンプルは、ＤＮＡ抽出チャンバ（５０２）内のシリカ多孔モノリス内に浸透する。次いで、キャップで導入ポートを密閉し、図４に示すようにＡ−Ｇに位置する電極に電界を印加することにより、チャンバやチャネル内でサンプルの操作をする。
【００７４】
このシステム自体は、完全に統合された、携帯可能なＤＮＡ分析システムを具える。この分析システムは、異なるものであるが共働する２つの構成部品を有する格納手段を具えている（図１と図２参照）。第１の構成部品は、コントロールユニットである。このコントールユニットは、熱循環や検出のような工程の制御に必要なハードウェアとソフトウェアを全て含む。第２の又は更なる構成部品は、マイクロ流体装置である。このマイクロ流体装置は、サンプルと関連する処理試薬を含む。
【００７５】
細胞溶解後の全分析手法を、上述したタイプの密閉したマイクロ流体装置（３００）内で行う。溶解剤を充填したスポンジ（５０１）内で細胞溶解を行い、このステージもまた装置（５００）上で行うことが好ましい。サンプルの移動、ＰＣＲ増幅と分析の制御に必要な全てのハードウェアを具える格納手段の第１の構成要素は、マイクロ流体装置（３００、５００）の外にある。第１の構成部品を有するシステムの格納手段、すなわちこのハードウェアは図１に示されており、マイクロ流体装置は、図２に示すシステム格納手段内の原位置にある。
【００７６】
本発明の分析システムは、タッチコントロールパネルで制御される。そして一旦蓋を閉じると、必要なＤＮＡプロファイルの作成が完了するまで、分析的工程が稼働するよう完全に自動化されている。サンプル／溶解サンプルが充填されたマイクロ流体装置（３００、５００）をシステム内に配置し、電極ＡとＣの間に電気的バイアスをかけて、上記のチャネルＡの調整で述べたようにアルコール溶液で溶解サンプルからＤＮＡを洗い流して、例えば血液サンプル中に存在するヘム分子のような工程を妨げる可能性がある細胞残屑とその他の物質を取り除く。次いで、ポートＢとポートＤにバイアスをかけて、装置（３００、５００）の抽出チャンバ（３０２、５０２）内のシリカモノリスの上にチャネルＢから水をくみ上げて、ゲルで満たされたＰＣＲチャンバ（３０３）へＤＮＡを溶出させる。ＤＮＡプロファイリングに必要なＤＮＡフラグメントの増幅に適した既知試薬の存在下で、３つのＰＣＲ温度で約２５回乃至３０回循環させる。これらの試薬は蛍光染料も含有している。この蛍光染料は、選択されたＤＮＡフラグメントに結合して分離工程を行う間に選択されたＤＮＡを検出できようにする。増幅されたフラグメント（例えば、標準ＤＮＡ指紋検査法に使用する１１遺伝子座の増幅によるＰＣＲ産物）を、分離チャネル（３０４）のネック部分に動電的に引き寄せ、分離チャネル（３０４）に少量で明確な量の増幅されたフラグメントを導入する。これは、電極Ｇ及びＥにおいて、分離チャネル（３０４）に大きな電気バイアスがかかっている電場を用いても行われ、バイアスが下がると増幅した産物のＤＮＡフラグメントが分離する。
【００７７】
電気接点は、一般に直径約５００μｍの形状であり、白金線が好ましい。より好ましくは、導電性高分子、例えばカーボン充填ポリスチレンを装置の電気接点として使用し、金被膜銅電極を使用して、制御装置の電源を高分子電極に接続する。
【００７８】
増幅産物のＤＮＡフラグメントの分離は、ＤＮＡフラグメントがゲルマトリックスを通過する時に、その電荷やサイズに影響される。ＤＮＡフラグメントの泳動時間は、原則として、サイズによって区分される。サイズに基づく核酸フラグメントの電気泳動分離工程は良く知られた技術であり、ここでこれ以上の説明は必要ない。本発明のこの実施例では、少なくとも２つのレーザーと２つのスペクトロメータを使用して、これらのフラグメントの検出を行なう。検出器は、レーザーが極めて正確な光の波長を放射することを知るだけに必要であり、核酸フラグメントをマークするために使用した蛍光塗料の４つの周波数から識別することができる。要するに、２台のレーザーが、蛍光塗料（ここでは４つ）を励起して、２台のスペクトロメータ又は２台の検出器（システムが２つのレーザーの光を感知出来なくても、なお４つの蛍光塗料の認識するために２台必要）が、フラグメントが出口近くの検出窓をいつ通過したか特定できるようにし、ＤＮＡプロファイルやＤＮＡ指紋鑑定法を適用できる。この機械は、稼働が完了すると、通常ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｌｔｄ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）で作成される商業用シークエンスに類した図形で、プロファイルを出力する。
【００７９】
分析システムにおいてマイクロ流体装置を用いる方法も提供されており、以下により詳細に述べられている。原則的に、検査する溶解サンプルを手動でマイクロ流体装置に導入するか、あるいは検査するサンプルを装置の溶解試薬を充填したスポンジ上に導入する。次いで、溶解サンプルがシリカモノリスに吸収され、シリカモノリス上でインサイチュウでＤＮＡを抽出し、溶出する前に洗浄し、ＰＣＲ法を用いて増幅し、その後蛍光標識したＤＮＡセグメントを分離して遺伝子パターンを得る。システムの出力は英国犯罪科学局に保存されているＤＮＡデータベースと互換性があるが、必要であれば他国のものと互換性を持つように容易に構築できる。
【００８０】
分析システムに本願のマイクロ流体装置を用いる方法を、図４を参照して以下詳細に述べる。
【００８１】
ａ）１０−５０μｌのサンプル溶解液と塩酸グアニジンを、サンプル導入ポート（３０１）を用いてマイクロ流体装置（３００）のＤＮＡ抽出チャンバ（３０２）内に配置したシリカモノリス上に手動で充填する。
【００８２】
ｂ）マイクロ流体装置（３００）のポートＡとポートＣに配置した電極を用いて、洗浄入口（ポートＡ）からシリカ系抽出モノリスを含有するＤＮＡ抽出チャンバ（３０２）を経て、洗浄出口（ポートＣ）に８０％エタノール溶液を流すことによりＤＮＡを含有する溶解サンプルを洗浄する。これは、ポートにバイアスをかけて電気浸透流（ＥＯＦ）を誘発することにより達成される。ＥＯＦを誘発する一般的な電圧は、５０−１５０ｖ／ｃｍである（表１参照）。８０％のエタノール溶液で細胞残屑及び不要なマトリックスのモノリスを洗浄し、溶解サンプル内に含まれるＤＮＡを回収できるようにする。
【００８３】
ｃ）次いで、シリカモノリス上に残っているＤＮＡを、マイクロ流体装置（３００）のポートＢとポートＤにバイアスをかけてＥＯＦ流を誘発し、Ｈ２Ｏを用いてＰＣＲ（３０３）中に溶出させる（表１を参照）。
【００８４】
ｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＤＮＡを増幅してＤＮＡフラグメントを形成する。ＰＣＲチャンバ（３０３）は、３つの個別の温度を介し周期的に温められて、その結果、選択されたＤＮＡフラグメントが指数関数的に増幅する。適当なプローブを使用して、目的の増幅されたＤＮＡを得る。ＰＣＲ工程の２５乃至３０サイクルが完了すると、増幅産物を含んだゲルが凝固する。すなわち外気温に戻してもかまわない。
【００８５】
ｅ）ＤＮＡフラグメントを含むＰＣＲ産物を、電気泳動的にＰＣＲチャンバ（３０３）から分離チャネル（３０４）のネック部分に移動させ、当技術分野でよく知られているピンチ注入法を使用してマイクロ流体装置（３００）の分離チャネル（３０４）に注入する。このように、ほんのわずかのＤＮＡフラグメントを含むＰＣＲ産物が、制御された時間で分離チャネル（３０４）に引き込まれ（表１参照）、次いで電極Ｄ、ＥとＦに電圧をかけて、分離チャネル（３０４）に注入されなかったＰＣＲ産物を引き戻し、注入したＰＣＲ産物の個別スラグを形成する。次いで、電極Ｄ、Ｅ、ＦとＧに電圧を印加して（表１に詳細表示）、分離が開始する前にＰＣＲ産物の個別スラグの荷電したＤＮＡフラグメントに焦点を合わせる。
【００８６】
ｆ）ポートＤ−Ｇ間にバイアスをかけることで、注入したＰＣＲ産物のＤＮＡフラグメントが、マイクロ流体装置（３００）の分離チャネル（３０４）に沿って電気泳動的に分離される（表１参照）。
【００８７】
表１−試薬を用いたＤＮＡフラグメントの移動に印加した電圧と適用時間
【００８８】
その他の適当な電源を使用することもできるが、上述の電位は、４×０−１０００Ｖの直流電源ユニットを用いて発生させた。更に、１０００Ｖ以上の高電圧が必要なときは、１０ｋＶ電源を用いた。両電源共、適当なソフトウェアを用いて正確に制御される。
【００８９】
図面を参照し、以下に実施例を用いて発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の一体型マイクロ流体装置で行われる、統合した結果妥協した個々の工程（ＤＮＡ抽出、増幅、分離及び検出）の再最適化操作条件を示している。装置の様々な部分間の相互作用を認識することによって、発明者らはこれらの各工程で統合が持つ効果を理解した。したがって、以下に定める条件は、本願の一体型マイクロ流体装置内で効果的に使用できる抽出、増幅、分離及び検出の妥協した操作条件を表している。
【実施例１】
【００９０】
ＤＮＡの回収と充填
本発明の使用の１の実施例では、ボランティアの頬から採取した口腔細胞からＤＮＡを含む生体サンプルを抽出した。
【００９１】
第一の代替実施例では、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡマイクロキット抽出キットまたは類似品を用いて口腔組織から生体サンプルを採取した。ＰＯＬＡＲＳｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ プレートリーダーを用いて抽出したサンプルの量を測定し、次いで標準濃度５ｎｇ／μｌになるよう希釈した。
【００９２】
１×ＴＥ緩衝液でシリカ表面を活性化させてシリカ系モノリスを作った。サンプル標準溶液５μｌを塩酸グアニジン１２０μｌと混合し、流速５μｌ／分の水圧ポンプにより、モノリスに充填した。
【００９３】
第二の代替実施例では、頬の内側に沿って滅菌綿棒で掻き取って、固体から生体サンプルとして使用する口腔細胞を採取した。マイクロ流体装置は、３ｍｍのトッププレートを具えており、ＤＮＡ抽出チャンバ（５０２）上に生体サンプルの入口として作用する３ｍｍの穴が設けられていた。この入口は、塩酸グアニジン溶液に漬けた多孔性スポンジ（５０１）で満たされていた。口腔細胞は、手動インターフェースを介して綿棒からスポンジ（５０１）へと移動する。
【００９４】
塩酸グアニジン溶液は、口腔細胞を溶解させ、ＤＮＡを放出させ、続いてＤＮＡ抽出モノリスへのＤＮＡの結合を容易にする働きをする。次いで綿棒を取り除き、二重機能プラグを用いて、マイクロ流体装置（５００）を密封し、サンプルの減少／汚染を防止する。更に、プラグがスポンジ（５０１）を加圧する結果、溶解サンプル−塩酸グアニジン溶液がモノリスを通って廃棄チャネルに移動する。ＤＮＡはモノリスに結合したままであり、ＤＮＡ抽出工程を完了するのに必要な洗浄と溶出ステップを行うことができる状態にある。
【００９５】
排液の除去
モノリスの孔にまだ存在している細胞残屑を８０％のエタノール洗浄液（％ｖ／ｖ）で洗い流した。アガロース洗浄液デリバリーゲル（チャネルＡ内にある）を濃度３％（１００μｌＤＮＡ／ＲＮＡ水中０．００３０ｇアガロース）とし、７５℃に加熱し、ゲルが形成されているがまだ溶解した状態で８０％のエタノール１００μｌと２０％ １Ｍの塩化ナトリウムを加え、次いで冷却してゲルを再形成し、内部にエタノール溶液を得た。まだ溶解した状態でエタノールゲルをチャネルＡに導入して、シリカモノリスとインターフェースさせた。次いで、点ＡとＣにある白金電極を所定の位置に固定し、５分間１００Ｖｃｍ−１の電界強度をかけて、シリカモノリスから細胞残屑を洗い流した。例えば表２にあるように、電界強度を比較して、最適電界強度を定め、ゲルと自由溶液の両方の８０％のエタノールと２０％ １Ｍの塩化ナトリウム溶液のＥＯＦ移動を行った。
【実施例２】
【００９６】
ＰＣＲゲルの調整
低融点アガロースゲルをＤＮＡ／ＲＮＡを含まない蒸留水に溶解させて、７５℃に１０分間加熱してＰＣＲゲルを製造した。ゲルが形成され、まだ溶解状態にあるときに、ＰＣＲ試薬（２μｌの１０×ＮＨ４緩衝液、２μｌのＢＳＡ、２μｌの順方向プライマー、２μｌの逆方向プライマー、１μｌのｄＮＴＰｓ、０．４μｌのＭｇＣｌ及び０．４μｌのＴａｑポリメラーゼ）を加えて混合し、ゲルを冷却して試薬を保持した。電極ＢとＤを所定の位置に固定し、５分間１００Ｖｃｍ−１の電位をかけ、アイスブロックの上で実験を行ってＰＣＲ試薬の結合性を維持した。動電学的移動が完了したら、圧力注入によりＰＣＲゲルをチャネルから取り出して、回収した。次いで、得られた溶液をサーマルサイクラーで増幅し、スラブゲル電気泳動法で分離し、ＵＶトランスイルミネータを介して観察した。
【００９７】
試薬の安定性を維持しながら、ＰＣＲ増幅工程を容易にするのに最も適した条件を決定するゲルと試薬の濃度を調べた。試薬ゲルの短期間安定性と長期間安定性を調べた。例えば、試薬ゲルを上述のように用意して、室温と４℃で保存した。ＤＮＡ鋳型をコントロールサンプルに加え、次いで、制御された期間サーマルサイクラー中で指数関数的に増幅させた。
【００９８】
様々な電極電位と時間を調べて、システムの柔軟性を測定した。この電極印加電圧の組み合わせを、表２に詳細に示す。
【００９９】
表２−電極と印加した電界の組み合わせ
【０１００】
結果と結論
排液の除去
通常ＤＮＡ抽出クリーンアップにおける洗浄ステップに使用されるイソプロパノールのは、電気浸透流をおこさないので、８０％のエタノール溶液を用いた。図６は、シリカモノリス上での、溶液（ｖ／ｖ）中の８０％のエタノール洗浄液とゲル（ｖ／ｖ）中の８０％のエタノール洗浄液の電気浸透流による動きを示す。
【０１０１】
予想通り、洗浄液の流速（図６の上側のライン）は、ゲルフォーマット中の同じ溶液（図６の下側のライン）から得られた流速より速かった。ゲルでは、液体のバルク流上のクロスポリマーネットワークの干渉効果が原因で、電界強度と流動速度の関係が非線形である。しかし、アガロースゲル溶液は、許容流速でモノリス上で電気浸透ポンピングを起こして、細胞残屑をモノリスから除去できることがわかった。このことは、溶解サンプルのＤＮＡはモノリス表面に吸着されるが、細胞残屑や赤血球（溶解サンプル内に存在することがある）はチャネルＡからＣへのエタノール溶液のバルク移動によってモノリスから洗い流されるという上述のメカニズムによって達成される。次いで、チャネルＢからの水を用いてモノリスから（ＰＣＲに適した形式で）ＤＮＡフラグメントがクリーンに溶出される。
【実施例３】
【０１０２】
試薬ゲルの作成
電位を印加した後、各電極にたまった溶液を回収した。回収したＤＮＡの６５％の定量化されたＤＮＡは陰極で見られたが、２２％は陽極（図４の入口ポートＦ）から回収された。これは、おそらくＤＮＡが同じポートに導入された場合に生じる、電気泳動による少量の移動によるものであった。残りのＤＮＡ（１３％）は、エタノール中で検出された。これらの結果は、ＰＣＲ増幅に必要な濃度で電気浸透流によって、モノリスから上手くＤＮＡを抽出できるという特許請求の範囲をサポートしている。
【０１０３】
電気浸透ポンピングによりモノリスから抽出したＤＮＡは、実行するべきＰＣＲ増幅に充分な量と質を有していた。この結果も、比較的高い電界を使用した場合でも、ゲル状の試薬の安定性を立証した。
【０１０４】
次いで、一連のアガロースゲルの濃度（１０％、５％、３％、１．５％、１％、及び０．７５％）を調べて、長期間試薬の安定性を維持しながら、ＰＣＲ反応を生じさせるゲルの理想濃度を決定した。調査した濃度のうち、０．７５％−３％の溶液の結果が可視的に図８ａに表示されており、濃度５％と１０％の溶液から得られた結果はゲルの逆の粘性効果が原因で芳しくなく、すぐ調査から除外した。図８ａより、より強いバンドがプレート上に存在することにより、０．７５％ゲルでＰＣＲ反応が上手くいったことがわかる。しかし、予備テストは、このゲル濃度では、長期の安定性は低く、試薬の保護がなされないことを示した。１％と１．５％のゲル濃度で得られたバンドは互に区別できないので、反応させ、試薬の安定性を維持するため、１．５％のゲル濃度で進めることを決定した。
【０１０５】
この安定性テストの結果は、図７に見ることができる。これは、ＰＣＲ試薬へのＤＮＡの動電学的移動を通じて得たＰＣＲ産物のＵＶトランスイルミネータ画像であり、冷蔵保存されていない場合、ＰＣＲ試薬の安定性は減少する傾向にあることを示している。ゲルを３０分間室温で放置するという安定性テスト１によれば、ＰＣＲ反応はある程度進むが、誤プライミングが明らかであることが証明された。一方、ゲルを１時間室温で放置するという安定性テスト２では、試薬が完全に使用できなかったことを図７が示している。第２安定性テストの結果は図８ｂに見ることができ、試薬ゲルを４℃で４週間保存することができ、ゲルマトリックスに組み込まれると、試薬の安定性が非常に高まることを示唆している。
【０１０６】
様々な印加電位の調査から得られた結果（表２参照）は、システムが非常に柔軟であり、従って他のアプリケーションへ移行する可能性が高いことを示している。この結果は、調査された他のものよりシーケンス８が好ましいことを強調している。
【実施例４】
【０１０７】
試薬ゲルの作成
例えば図３又は４に示す、マイクロ流体装置（３００）に、１Ｍの塩酸を流し、続いて乾燥する前に１Ｍの水酸化ナトリウムと脱イオンを流すことにより、洗浄し準備した。ポートＧに圧力注入することにより、マイクロ流体装置（３００）の分離チャネル（３０４）にＰＥＯゲルを充填した。
【０１０８】
ＤＮＡ／ＲＮＡを含んでいない水１００μｌに０．００２９ｇの低融点アガロースを溶解させて、アガロースゲルを作り、ゲル濃度２．９４％になるようにした。この溶液を水槽内で７５℃で１０分間加熱し、ゲルを形成した。ゲルがまだ液状のときに、９．８μｌのサンプルに１０．２μｌのゲルを加え、可視化物質（ここでは蛍光標識したプライマー）を加えて混合した。濃度１．５％の最終ゲル溶液をポートＥに圧力注入することにより、ゆっくりとマイクロ流体装置に注入して、クロスバー（Ｄ−Ｆ）の両腕をサンプルマトリックスで均等に満たした。最後に、図１０に示すように２つのゲルに白金線電極を押し込んだ。
【０１０９】
図１０において、Ｔ−セクション（９０１）からポートＤまでの分離チャネル（９０２）の長さは８００ｍｍであり、チャネル（９０２）の直径は０．２ｍｍである。Ｔ−セクションにおける、ポートＡ、ＢまたはＣまでのチャネルの長さは５ｍｍであり、垂直チャネルの直径は０．６ｍｍである。
【０１１０】
マイクロ流体装置（３００）の用意ができたら、サンプルと分離マトリクスを検査して、印加した電界を中断することがある泡や屑が注入工程で入り込んでいないことを確認した。電圧プロフィールは、ＬａｂＶｉｅｗソフトウェアによって入力したプリセットプログラムから自動的に印加された。
【０１１１】
結果と考察
溶液ベース（従来技術）とゲルベースの動電学的注入比較
最初に、溶液からの動電学的注入に使用される最適電圧プロフィールを、ゲルマトリックスに印加して、ゲル系システムのＥＫ注入を最適化する出発点を確立した。図１１に示す結果は、右側の写真が示すように、蛍光プライマーが、より広いサンプルチャネルからより狭い分離チャネルへ移動していないので、アガロースゲルマトリックスからＰＥＯゲルへのサンプル注入が失敗したことを示している。
【０１１２】
最も可能性のある注入失敗の２つの理由は、より密度の高い分離ゲルが物理的にサンプルの移動を妨害したことと、ゲルのインターフェースがチャネルを横切る電界強度に悪影響を与えたことである。
【０１１３】
しかし、図１２ａと１２ｂがそれぞれ示すように、溶液注入とゲル注入用に得たプロファイルを検討したところ、実際には、プロファイルはほとんど同一であり、唯一の違いは、ゲルシステムで見られるプロファイルが、ほんの少しより矩形であるだけである。このことは、溶液システムとゲルシステムの電気抵抗が類似しているので、ゲルの密度増加は、印加された電界に影響しないことを示している。
【０１１４】
従って、観察されたサンプル注入の妨害は、より密度の高いゲルマトリックスによって生じた物理的抵抗に起因する可能性が高い。これは、同じ移動基本メカニズムが、ゲルと溶液の両方に適用されており、唯一の違いは、同様の移動が生じるために、ゲルの物理的影響がが、より高い電圧とより長い時間を必要とすることを示唆している。
【０１１５】
その結果、ゲルシステムにおける注入の再最適化を実行し、溶液システム用のものと比較した結果を表３に示す。
【０１１６】
表３−ＴＥ緩衝溶液とアガロースゲル中の、動電学的注入に必要な最適電圧と時間を示す。
【０１１７】
予測通り、ゲル又はゲルマトリックス中で注入を行うときに、必要な消費電力がかなり大きくなった。この電力の増加は、電気泳動移動度（μｅｐ）（ｑは正味電荷、ｆは並進摩擦係数、ｖは成分の移動速度、Ｅは電界）を示す下記式１と、ポリマー溶液（μｏ）種の電気泳動運動（ηは溶媒粘度、ｑはポリイオン荷電、Ｒはポリイオンの半径）を考慮した修正電気泳動移動度の方程式であるフュッケルの式（式２）とから説明できる。
【０１１８】
電気泳動移動度は、並進摩擦係数に対する電荷によって表されるが、ポリマー溶液の導入には、溶媒の粘度だけでなく、ポリイオンの半径も必要である。両方程式では、電荷が同じであるが、粘性とポリイオンの半径が与える影響が、ゲル内での電気泳動移動度にかなりの変化を与えることになる。
【０１１９】
ゲル担持注入のロバスト性の証明
ゲル中での最適ＥＫ注入用プロファイルを検討すると（図１３）、以前のゲル注入（図１２ｂ）に表示されたものと同じ矩形特性が観測された。一般に、ゲルにおける注入は、より高い安定性を示し、これは溶液中で得られたプロファイルのものと比較して、むしろ直線状のプロファイルによって表されている。一般的にゲル内での注入は、データの直線均等ラインが示す安定性の程度がより大きいことを示す。
【０１２０】
システム内に泡が存在していても（図１４ａ）、動電学的注入が上手く実行できれば、ゲルの安定性はさらに増した（図１４ｂ）。
【０１２１】
溶液ベースシステムでは、電気泳動的注入する間の泡の存在は、大抵、流体移動の工程の失敗につながる支障をきたした。しかし、本発明のゲルシステムでは、泡の存在が、泡無しで行った連続注入と比較して、より大きな直径を有するより拡散したサンプルスラグを、発生する（図１４ｂ）。更に、注入工程の後半段階で消失する泡の周辺領域で生じているサンプルの濃度に増加が観察される。しかし、上手く注入することは可能であり、注入チャネルに泡がない注入と比較できる。
【実施例５】
【０１２２】
マイクロ流体装置内におけるアガロースゲル系 ポリメラーゼ連鎖反応と統合した、キャリアＲＮＡを使用したＤＮＡ抽出
生体サンプルからのＤＮＡ抽出は、ＰＣＲのような下流工程の成功を左右する。この実施例で述べるように、固相抽出法の使用は、ＤＮＡの予濃縮を容易にするので有利であり、サンプル物質の入手が制限されている場合に重要である。
【０１２３】
この実施例では、図１５を参照するに、標準的なフォトリソグラフィー技術とウエットエッチングを用いて、すべてガラスでできたマイクロ流体装置を作成した。モノリスは、ＤＮＡ抽出チャンバ（１４０１）で、ケイ酸カリウムとホルムアミドの混合物を加熱硬化させ作成した。次に動的不動態化用に、牛の血清アルブミンとポリビニルピロリジンとツイン２０を含むアメロゲニン遺伝子座増幅用ＰＣＲ試薬を、低融点アガロースの融解溶液に加え、ＰＣＲ増幅チャンバ（１４０２）に注入し、必要時まで４℃で保存した。
【０１２４】
ポリＡキャリアＲＮＡと共に、又は伴うことなく、ＤＮＡを５Ｍ塩酸グアニジン溶液に加え、モノリスに注入した。例えば、血液からのヘムタンパク質といった、下流アプリケーションにおける潜在的汚染は、電極Ｂへ正電位を、電極Ｃに負電位をかけることによって、ＥＯＰ系エタノール洗浄により取り除かれて、バルク電気浸透流ができる（図１５）。最後に、正電位を電極Ｂに、負電位を電極Ｄにかけることにより、ＥＯＰを使用した水によって、ＤＮＡを増幅チャンバに溶出させた。予め充填されたＰＣＲゲル中にＤＮＡが移行すると、ペルチェ加熱システムを用いて熱循環を行った。標準キャピラリ電気泳動を用いて、ＰＣＲ産物をチップ外で分析した。
【０１２５】
結果と結論
キャリアＲＮＡの使用は、ＤＮＡ抽出効率を高めることにつながった（図１６）。キャリアＲＮＡを含むサンプル（１５０１）（ＲＮＡ：ＤＮＡ＝５０：１）を、キャリアＲＮＡを加えていないサンプル（１５０３）と比較した。理論的に１００％の回収率であることを４５°のラインが示している（１５０５）。
【０１２６】
キャリアＲＮＡをシステムに加えていないときは回収ＤＮＡはわずか５ｎｇであるのに対し、キャリアＲＮＡを使用すると、ＤＮＡ抽出効率が最大２５ｎｇの理想である１００％の理論回収率となる。より多量のＤＮＡでは、キャリアＲＮＡの存在により、溶出ステップの間、ＤＮＡの収率がより高くなり続ける。ＰＣＲ試薬を封入するためにアガロースゲルを使用することは、ＤＮＡ増幅に悪影響を与えるものではないが、４℃で少なくとも８週間、マイクロ流体装に試薬を長期保存できるという利点を提供する。このシステムを用いて生成したＰＣＲ産物の例が、図１７ａと１７ｂに示されている。図１７ａは、ＤＮＡサイズラダー（レーン１）、陽性対照（レーン２）、陰性対照（レーン３）とマイクロ流体装置でのゲル系増幅から得られたＰＣＲ産物（レーン４）を示している。
【０１２７】
キャリアＲＮＡをＤＮＡ結合溶液に添加すると、熱的に活性化されたシリカモノリスのＤＮＡの抽出効率を高めることになる。ＰＣＲ試薬を封入するためにアガロースゲルを使用することによって、ＰＣＲ試薬をマイクロ流体装置で保存することができる。これは、水圧ポンプではなくＥＯＰを使用することにより、携帯アプリケーションと汚染の可能性の減少に大きな利点を提供する。
【０１２８】
代替ヒーター
上に提言されているが、このシステムは、ペルチェ加熱／冷却素子のような従来の設計の熱サイクラーと互換性があるが、本発明によるシステムの急速な熱サイクルに特に効果的な代替物はマイクロウェーブヒーターである。図１８に一例を示す。
【０１２９】
サンプルを加熱するのに使用される共鳴空洞（１７０２）は、マイクロウェーブ周波数で作動したが、加熱工程は、従来のマイクロウェーブ加熱ではない。従来のマイクロウェーブ加熱においては、ターゲットの大きさは、一般に空洞（１７０２）の波長を上回る。８ＧＨｚでは、空気中の波長は３７．５ｍｍであり、従って、ガラス中では、約１６ｍｍとなる。関連する軸に沿ったサンプルの大きさは、ちょうど２ｍｍである。このように、加熱メカニズムは、まさに空洞のリエントラントポスト間のガラスの無線周波数（ＲＦ）誘電加熱であり、空洞の共鳴モードは、低周波数の観点から、よく理解されている。
【０１３０】
Ｃ字形状に曲げられた導電性円筒棒（１７０１）は共鳴周波数を有し、従ってこの棒の互いに対向する端部がコンデンサを形成し、棒の長さはコンデンサと直列の単回コイルのインダクタを形成する。従って、この構造は、棒の長さに沿って交流電流が行ったり来たりする非常に単純なモードで共鳴できる。しかし、電源をそのような共鳴器に接続することが困難であり、問題となるレベルの電力がそこから発生することがある。
【０１３１】
シールド共鳴構造に共鳴棒（１７０１）を位相的に展解させるには、この棒をコンデンサの軸を中心にの周りで３６０°回転させて、個体を作るだけでいい。出来上がった構造体は、リエントラント準トロイダル空洞であり、そこからは何も放射しない。容量値に変化はないが、インダクタンスはかなり減少し、いくつかのシングルターンインダクターを並列にしたものに類似する。共鳴モードは、１つだけであり、対向する中心ポスト間のコンデンサの軸に平行なＲＦ電界を有する。ポストが互いに近接しており、サンプルフィンガーのガラスの誘電率は約６なので、その他どこにも電界はほとんどない。ＲＦ磁界は、ポスト周辺のトロイダル空洞スペースの方向に流れており、磁界ループにより容易に励起される。ここでは、この磁界ループは、直径２．２ｍｍ、５０Ωのセミグリッド同軸ケーブルから作られる。
【０１３２】
空洞（１７０２）は、同一形状をした２つの部分から構成されている（図１８参照）。リエントラントポストは、軸方向に直径１．６ｍｍの穴があけられており、冷気供給源（１７０３）からの冷気が入って、サンプルフィンガーに直接影響あたる。サンプルフィンガーが入る矩形スロットを、結合ループに対向する空洞側に機械加工した。
【０１３３】
これは、下記の誘電体を充填したカットオフ導波管のような挙動をし、その減衰は以下の通りである。
ここでλｃはカットオフ周波数、εはガラスの誘電率である。この空洞デザインの減衰は２０ｄＢ以上であり、空洞の外径が大きくなると、減衰も大きくなるが、これは必要なことではない。リエントラント円筒空洞の共鳴波長は、以下の通りである。
ここでρ１はポスト、ρ２は空洞半径、ｚ０は長さである。サンプルフィンガーの存在は、共鳴周波数を要素
分減少させる。ｚ０が短く、サンプルフィンガーと結合ループが空洞に侵入しているので、計算は概算であり、増分の機械加工により８ＧＨｚに調整した。
【０１３４】
マイクロウェーブ電源は、５Ｗまでの電力レベルで使用され、マイクロウェーブ信号発生器によって駆動されるＧＨｚ２０Ｗ進行波管増幅器である。サンプルフィンガーを空洞（１７０２）に挿入した後、反射能信号内の共鳴の低下を観測することにより、共鳴周波数が低電力で決定される。周波数がその後記録され、信号発生器に伝送された。空洞（１７０２）への結合を、結合ループの挿入深度を変化させることにより、最小１０ｄＢのリターンロスに調整した。
【０１３５】
ＤＮＡ増幅工程間の熱循環温度のリアルタイム調整が可能な制御システムが開発された。３つの工程温度（ＤＮＡ変性、プライマーアニーリング、及びＤＮＡ伸長）での滞留時間は、１乃至９９秒で調整可能であり、初期ＤＮＡ変性と最終ＤＮＡ伸長温度では、１乃至９９９秒で調整可能である。
【０１３６】
各マイクロ流体装置を、マイクロウェーブ空洞（１７０２）に配置すると、ネットワーク分析器を用いて正確な共鳴が得られる。反射能を監視することによって、反射能が１０ｄＢ低下したとき、正確な周波数を得ることができる。このことが、図１９に示されている。空洞（１７０２）の調整は、マイクロウェーブ空洞（１７０２）の２つの部分の結合を締めることにより、達成することができる。次いでこの周波数が信号発生器に伝送され、当該マイクロ流体装置の最適周波数でマイクロウェーブが発生されるようにしている。
【０１３７】
高度に制御されたマイクロウェーブ加熱と空冷を使用することで、このシステムは、３つの設定温度のいずれにおいても、わずかなオーバーシュート又はアンダーシュートを示した。マイクロウェーブシステムが所望の温度に達すると、変動はわずか±０．１℃であり、このシステムを非常に正確なものとしている。加熱と冷却のランプ速度は、６５℃／秒であり、温度間の非常に速い推移が可能である。図２０は、オシロスコープからの軌跡であり、熱循環プロファイルを拡大して示す。マイクロウェーブシステムは、Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて完全なＤＮＡ変性を確実に行うことが不可欠な場合に、初期変性ステップを実行できるよう設計された。また、ＰＣＲ産物の完全なアデニル化が確実に生じることを含む最終伸長ステップも含まれている。両ステップは、シークエンスへ自動化されており、時間と温度の両方に関して制御可能である。
【０１３８】
［概要］
要約すると本発明は、ゲル担持マトリックスからポリマーゲル分離マトリックスへの、ＤＮＡフラグメントのモノリス−ゲル及びゲル−ゲルの動電学的注入の良好な最適化と適用を提供する。溶液系注入を超えたゲル担持注入の制御性、安定性とロバスト性の向上の証拠を示した。更に、本発明は、反応の安定性を長引かせることで知られているゲル担持サンプルマトリックスが、装置の全体の消費電力を損なうことなく、流体装置内で動電学的サンプル注入の操作性と移動性を改良することを示している。
【０１３９】
更に、本発明に係る、ゲルを用いて調整したマイクロ流体装置における泡の形成は、ジュール熱が過剰な溶液系システムで通常観察されるいかなる問題も引き起こさなかった。泡は、注入メカニズムの経路を大幅に変えるが、流れは維持され、注入がなされた。溶液のみの流体システムでは、泡が発生すると、結果として生じる乱流が、電界を中断して、これが注入工程に大きな支障をきたしてしまう。最後に、一のゲルから別のゲルへのＤＮＡフラグメントの移動は、マトリックスインターフェースへのマトリックスの移動によっては影響は受けなかった。それ故、ゲル担持ＤＮＡフラグメントと試薬を有する本発明によるマイクロ流体装置の使用は、従来の技術を超えた上述したようなより多くの利点をもたらす。
【０１４０】
要約すると本発明は、電気浸透流と電気泳動を用いた分析器で使用する特有のゲル系電動学的マイクロ流体装置を提供するものであり、これによって装置内の生体サンプルのＤＮＡフラグメントの抽出、精製、増幅、分離の全てのステップを１つの工程で行うことができる。これは事実上“単一ステップ”デバイスである装置を提供する従来技術と対照的である。更に、本発明のマイクロ流体装置とともに用いる、本発明の完全に一体化された携帯可能な分析器によれば、ＤＮＡ分析の各ステップ間を調整し、より迅速な処理を行うことができる。より大きな装置と比較して速くなった、このような分析器の処理速度は、ＰＣＲステップ中に特に顕著に見られる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体サンプル処理装置、方法とシステムに関するものである。より詳しくは、本発明は、ゲルに担持させたサンプルや試薬を有するマイクロチャネルを具え、このマイクロチャネルを使用する完全に一体型にされた携帯可能なＤＮＡ分析器を具えるマイクロ流体サンプル処理装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
「Ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐ」や「微小化学物質分析システム」としても知られる最新のマイクロ流体装置は、一般に基体と、マイクロチャネルやポートのようなマイクロ構造とを具える。このようなマイクロ流体装置の使用により、シリコン、ガラス、ポリマーのような材料の多層体を特色とする専用マイクロチャネルの使用が可能となり、これによって通常サイズの器具が小型化されて、容易に携帯できるようになる。
【０００３】
標準サイズの同じ種類の装置と比較すると、このようなマイクロ流体装置には、サンプルと試薬の量が非常に少なくてすむということ、分析に必要な時間がより短く、内部で実行される検査の感度が標準サイズの装置より高いことを含む様々な有利な点がある。加えて、汚染の可能性の削減や、現場分析サイトへのより良い可搬性がより簡単になる。
【０００４】
伝統的なＤＮＡ指紋鑑定法のような方法は、一日または場合によっては一週間を要し、手順を完了させるのに多くの異なる装置を使用する。従って、犯罪が起きた直後にＤＮＡを使って、例えば容疑者の迅速なリストを作成することは困難である。しかしながら、化学反応、合成、精製、抽出、産生及び／又は分析など、従来技術のマイクロ流体装置で実行可能である様々な操作が存在する。このため、マイクロ流体装置は、ＤＮＡ指紋鑑定法、遺伝子分析、臨床診断、薬物スクリーニング、環境モニタリングのような分析診断分野において広い実用性を見出すことができる。
【０００５】
マイクロ流体装置に関連する製造手順は、一の装置上で様々な工程の統合の可能性を取り入れているため、最新の調査器具の発展へつながる魅力的なルートを提供し、更にこれが分析測定のロバスト化を強化する自動化システムにつながる。しかしポンプのような補助器具を装置に連結することなく装置のある領域から他の領域に個別容量のサンプルを上手く移送をすることが非常に複雑であるため、いくつかのケースでは、一体化が困難であるとされていた。
【０００６】
通常使用される最新式のマイクロ流体装置又はシステムでは、全て外付けの流体力学ポンプを必要する。例外として電気泳動的分離があるが、これは過大なデッドボリュームを必要とするため、マイクロリットルの流体を操作する方法として非常に非効率的である可能性がある。更に、従来技術の装置は一般に溶液ベースの技術から成り、特に例えば、気泡がシステムに侵入したり、溶液が乾いてしまった場合、サンプルの安定した動電学的制御を提供する態様でマイクロ流体装置内に試薬を準備して保管することは困難である。
【０００７】
特に、組織からのＤＮＡ抽出と精製、ＤＮＡ増幅、サンプル分離及び検出用の単一チップモジュールを実用的な移送メカニズムと組み合わせ、これらのステップが、マイクロ流体連通した構成部品によって上手く実行できる実用的な装置は、効率的な生産と操作が困難であった。様々な試薬の有効かつ一貫性のある局在性、実体面での溶解組織サンプルを受けるインターフェースの効率的な提供、チップを通して連結的に抽出されたサンプルを確実に移送する効率的な移送メカニズムは、特に困難である。
【０００８】
例えば、ＷＯ９９／６４８４８は、部分的に統合されたマイクロ流体装置を記載している。移動は、液体内で動電学的移動（電気浸透）により行われ、電気泳動的な分離が生じるゲル内への動電学的注入を特徴とする。検出は、蛍光発光により、シークエンシングアプリケーションに基づいている。しかし、ＤＮＡの抽出と精製は、チップ外でなされる。
【０００９】
ＵＳ２００３／１９０６０８では、相補的ＤＮＡ／ＲＮＡを有するビーズがゲル内に保持されており、ここを通りサンプルが流体力学的に圧送されるシステムを記載している。熱的増幅を含むハイブリゼーション工程が述べられているが、試薬は装置内に配置されているのではなく、ポンプを用いて容器を介して添加される。蛍光発光検出はチップ上でなされるが、分離は記載されていないか又は特別なアプリケーションを必要とする。更に、ＤＮＡ抽出もチップ外でなされる。
【００１０】
ＵＳ２００５／１６１３２７の装置は、動電学的なものではなく２つの電気泳動ポンプに基づく装置である。サンプルの調整は、試薬の添加と同様に装置外でなされ、全体の工程は、溶液ベースである。分離工程については述べられていない。
【００１１】
ＷＯ２００７／１３３７１０は、プラグ又は水滴ベースの溶液処理を記載しており、主に混合や分離のような水滴操作工程に焦点を当てている。試薬は、装置上に保持されていない。
【００１２】
抽出、増幅と分離と検出を単一装置内で統合することに関連する主な問題点の１つは、統合によって、個々の工程の既知の動作条件が損なわれることである。動作条件の再最適化は、個々の工程間の相互作用を調和させて、システムを独立した複合工程として稼働させなければならないため、達成が困難である。
【００１３】
これらの及び他の理由から、単一チップ上で、抽出と精製、増幅、サンプル分離と検出を効果的に行うマイクロ流体装置は、実現困難であるとされていた。
【発明の概要】
【００１４】
本発明によれば、一体型ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置であって、増幅チャンバと流体共働すると共に分離及び検出チャネルと流体共働する少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバを形成する複数のマイクロチャネルを有する基体を具え、前記サンプルの処理に必要なＤＮＡ抽出材料とゲル系反応試薬を含有し、前記装置は、更に外部電源に接続するための電気接点を具え、前記装置を通して前記ゲル系試薬と前記サンプルから抽出されたＤＮＡの動電学的操作を生じさせる装置が提供される。
【００１５】
“ゲル系試薬”という用語は、抽出されたＤＮＡサンプルの精製及び溶出、及びＰＣＲ反応サポートに必要な試薬が、マイクロ流体装置内でゲルマトリックスに担持されていることを意味する。
【００１６】
マイクロ流体装置の基体は、不活性で非導電性であり、好ましくはガラス又はその他の同様の物質又は材料のような光学的に透明な材料で形成するのが望ましい。基体は、一般に使用まで蓋で密封されて、その中に画定されている内部マイクロチャネルを封入している。蓋は、適当な手段によって基体に固着又は連結できる。
【００１７】
装置のサイズは、その中に設置する分析機器によって決定できる。あるいは、１２０ｍｍ×６０ｍｍであるが、最大１２０ｍｍ又はそれ以上×で最大６０ｍｍ又はそれ以上のサイズも適している。携帯用システムでの利用に適するように小型の装置が好ましい。さらにこの装置は、容易に製造することができる。
【００１８】
ＤＮＡ抽出チャンバは、例えば入口ポートなどを有する溶解サンプルをチャンバへ導入する手段を具える。好都合なことに、このチャンバは、サンプル受け取り手段を具えるか又は、サンプル受け取り手段と流体連通している。サンプル受け取り手段は、溶解サンプルが、直接ＤＮＡ抽出チャンバ内へ導入されるよう構成することができる。好ましい実施例では、溶解剤との混合物中にＤＮＡ材料を含むサンプルを受け取り手段で受け取ることができる。このように、サンプル受け取り手段は、非溶解組織サンプルを収容し、これを溶解させ、ＤＮＡ抽出チャンバに溶解サンプルを導入するように構成できる。例えば、サンプル受け取り手段は、使用時に組織サンプルを受け取る吸収部材を具え、溶解剤を予充填して、使用に際してＤＮＡ抽出チャンバ導入ポートに流体連通して配置し、このように配置された時に溶解サンプルを受け取り、溶解させ導入する。好適な溶解剤はカオトロピック塩溶液である。好適なカオトロピック塩はグアニジン塩酸である。なぜなら、組織サンプルの溶解液に加えたときに、塩が続いて生じるＤＮＡ抽出材料へのＤＮＡの結合を容易にし（以下に述べる）、抽出したＤＮＡを酵素的に切断するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）を不活性化するためである。
【００１９】
ＤＮＡ抽出材料は、ＤＮＡを捕捉することができ、残存量の溶解サンプルをこの材料に通過させるか、ＤＮＡを吸着させて、主容量の溶解サンプルを捕捉して、ＤＮＡをこの材料に通過させることができる。望ましくは、ＤＮＡ抽出材料を荷電してＤＮＡを捕捉し、ＤＮＡ抽出チャンバ内に配置させるようにする。より望ましくは、ＤＮＡ抽出材料は、多孔性固相抽出材料である。固相抽出（ＳＰＥ）により、サンプルの予濃縮と、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような下流のアプリケーションを阻害する潜在的な汚染の除去が可能になる。更に、ＳＰＥはＤＮＡの予濃縮を行うこともできる。これはわずかなサンプルを取り扱うときに重要である。
【００２０】
より好ましくは、ＤＮＡ抽出材料はシリカ系抽出材料であり、例えばシリカビーズ、又はより好ましくはシリカ系モノリスである。シリカ系モノリスのようなシリカ系抽出材料は、溶解サンプルからＤＮＡを抽出するだけでなく、電気浸透流（ＥＯＦ）用ポンプとして作動し、これにより、下記により詳しく述べるよう抽出ステップの効率が上がる。
【００２１】
シリカ系モノリス内のように、ＤＮＡ抽出材料が負に荷電している所に、例えばカオトロピック塩溶液のようなカオトロピック剤が存在すると、溶解がチップ上で行われる溶解剤か、あるいは溶解がチップ外で行われる装置の関連チャネルに予充填した溶解剤が、溶解サンプル中に存在するＤＮＡとＤＮＡ抽出材料との結合を容易にする。これは、カオトロピック剤のイオン強度が高いため、抽出材料の表面における負電位を減少させることができるからである。これによって、ＤＮＡと抽出材料表面が脱水され、ＤＮＡ／抽出材料接触中の分子間水素結合が形成されて優勢になり、これにより、ＤＮＡ抽出材料へのＤＮＡの結合が強化される。更にカオトロピック剤は、水分子を閉じ込めることにより水和イオンを形成し、ＤＮＡ及び抽出材料表面の溶媒化を減少させる。更にカオトロピック剤は、ＤＮＡを変性させて、１本鎖ＤＮＡ分子の露出したベースを抽出材料表面に水素結合させる。
【００２２】
本発明の好ましい実施例は、装置上で組織細胞の溶解が行われ、この溶解剤は更にリボ核酸（ＲＮＡ）のようなキャリア分子を具える。このようなキャリアＲＮＡの使用は、特にサンプル中に存在するＤＮＡが少量のときに、ＤＮＡ抽出の効率増加に顕著な効果を有する。シリカ系モノリスのような抽出材料上には、所定量の核酸が不可逆的に結合する部位が常に存在することが知られている。溶解剤中にキャリアＲＮＡを含めることにより、このキャリアＲＮＡがこれらの部位に犠牲的に結合して、重要なＤＮＡの損失を最小限にし、より大きな回収につながる。
【００２３】
シリカ系モノリスは、熱的活性型か光開始型であることが望ましい。使い易さ、速度、再現性、及び作製したマイクロ流体装置上での正確な局在化といった特有の利点を有することから、熱的活性化型のシリカ系モノリスが、光開始型のものより望ましい。モノリスは一般に多孔性であり、モノリス内部の又はモノリスに隣接している導入口を介して溶解したサンプルを受け入れることができる。
【００２４】
ＤＮＡ抽出チャンバは、チャンバに流体連結する洗浄用入口と洗浄用出口を具えることが望ましい。望ましい実施例では、ＤＮＡ抽出チャンバが、ゲル内に担持された溶出試薬を含むチャネルを更に具えており、チャンバが冷却されると、ＤＮＡ抽出材料からＤＮＡを溶出することができる。溶出ゲルは、例えば水のような低イオン強度の緩衝材を含んでいることが望ましい。
【００２５】
この装置は、また、装置の周囲に、導入又は移動用の、又は試薬の除去又は廃棄用の複数の入口と出口を具える。
【００２６】
望ましくは、少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバ、増幅チャンバ、及び分離及び検出チャネルの各々の中のゲル系試薬がそこで行われる工程の性質に関連している。このようなゲル系試薬は、所望であれば、装置内の原位置にあるときにマトリックスを形成する能力により選択することができる。ゲル系電気泳動に適切であり、特に装置内の原位置にあるときにマトリックスを形成する能力があることが知られているゲルは、線状多糖類系ものを含む。好ましくは、このゲルは少なくとも一の線状多糖類を具え、この線状多糖類は、選択的に、別の線状多糖類と、及び／又は、少なくとも一の非線状多糖類と混合されていることが好ましい。アガロース系ゲルは特に適している。従って、この少なくとも１の線状多糖類は、好ましくは、アガロースを含有しており、このアガロースは、いくつかの実施例においては、重要であるか、ゲルを形成する唯一の材料として存在するだけである。
【００２７】
電気泳動的分離に使用する望ましいゲルは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）系又は線状ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）系である。そのようなゲル中に存在するポリマー濃度によって、注入に続いてゲルが分離チャネルに局在するよう流れを制御できる。好ましくは、このポリマー濃度は、分離ゲル培地の３重量％から７重量％である。これらのポリマーレベルは、ＰＣＲ増幅産物を減速するポリマーマトリックスを形成して、好適な分離を行えるからである。
【００２８】
このように、ゲル系試薬の使用により、本発明によって作製したマイクロ流体装置上に様々な工程試薬を正確に局在化させて固着することができる。溶解サンプルからのＤＮＡ抽出、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用したＤＮＡ増幅、分離および検出の全てのステージは、本発明によるマイクロ流体装置上のマイクロ流体結合した構成部品によって、連続的に局在化された方法で実行できる。特に、溶解サンプルからＤＮＡを抽出することにより、抽出チャンバは、より効果的な実体インターフェースを抽出、増幅、分離及び検出の全てのステージが連続的に局在化された方法で実行されるマイクロ流体装置に提供する。
【００２９】
ゲル系試薬は、また、選択されたＤＮＡフラグメントに結合し、分離工程で検出できる光プローブを具える。この光プローブは、ＤＮＡフラグメントに結合するか、発光するＤＮＡフラグメント上で光る光を反射又は吸収することができる。好ましくは、光プローブは、蛍光染料又は化学染料である。より好ましくは、光プローブは、ＤＮＡフラグメントの５’末端に結合し、増幅する間にＰＣＲ産物内に取り込まれる蛍光染料である。適切なプローブは、一又はそれ以上の以下の蛍光染料：５−カルボキシフルオレカイン（ＦＡＭ）、５’−ジクロロ−ジメトキシ−フルオレカイン（ＪＯＥ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びカルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）を含む。
【００３０】
従って、ここで使用される分離は、包括的な全てのメカニズムとして広範囲にわたって説明するべきである。ＤＮＡフラグメントの空間的な及び／又は一時的な物理的分離、及び／又は、複合試薬と並用する複数の分離によって補充されるか否かにかかわらず、例えば蛍光染料又は化学染料のようなオプトルミネッセンス技術を介する視覚的な分離を含む分離により、増幅産物のＤＮＡフラグメントは検出用に選択的に識別される。このような光学的分離は使用する蛍光染料が異なる固有波長で発生するため生じる。従って、蛍光染料が同時に存在する場合でも、すなわち、分離及び検出チャネル中の同じ位置にあっても、標準スペクトロメータは個々のプローブの存在を識別し、装置へ導入されたＤＮＡサンプルのプロファイルを検出することができる。
【００３１】
この装置は、ゲル系試薬、サンプルから抽出されたＤＮＡ、及び本装置を通過するＰＣＲ産物を動電学的に操作するべく複数の電極を具えている。これらの電極は、一端が装置に密閉可能に連結されており、他端は電源に連結できる。動電学的という用語は、電気泳動、電気浸透流、及び当業者にとって明らかなあらゆる電気的操作手段を含む。好ましい操作モードでは、次いで行われるステージを通して増幅チャンバに到達するまで、抽出されたＤＮＡは、電気浸透により操作される。その後は、一般的に電気泳動による操作が望ましい。
【００３２】
この発明の更なる態様によれば、生体サンプル中でのＤＮＡ分析用の携帯可能な一体型システムを提供しており、このシステムは、前記サンプルからのＤＮＡフラグメントを抽出、精製、増幅、分離、及び分析する動電学的駆動システムを具え、更に増幅チャンバと流体共働する少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバを形成する複数のマイクロチャネルを有する基体を具える、ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置を具え、前記増幅チャンバは、分離及び検出チャネルに流体共働しており、前記マイクロ流体装置内に配置され、電源に連結された複数の電極がマイクロ流体装置の周りでゲル系試薬とＤＮＡとＤＮＡフラグメントを動電学的に操作するよう構成されており、前記マイクロ流体装置は前記ＤＮＡ抽出チャンバを介して前記サンプルを受け取るよう構成されており、このシステムは更に、前記マイクロ流体サンプル処理装置に連結又は隣接した発熱体を具えており；検出可能な信号により、ＤＮＡフラグメントを検出するべく配置された検出器と；マイクロ流体装置、動電学的に駆動されるシステム、前記検出器及び電源を含むよう構成された携帯可能なハウジングを具える。
【００３３】
この発熱体は、ＤＮＡフラグメントの熱循環を達成する好適な手段を具え、特別な冷却部材を具えてもよい。発熱体は、接触式又は非接触式発熱体である。通常使用されている接触式発熱体は、例えばペルチェヒータなどの蓄熱ヒータ、又はプラチナなどの薄膜蒸着抵抗のマイクロ流体装置の外側への蒸着を含む。ペルチェヒータは、加熱の信頼性が高いため、ＤＮＡ増幅の熱循環を達成させるのに広く使用されているが、温度勾配が比較的低いという問題があった。マイクロ流体システムのＤＮＡ増幅について述べた非接触式加熱方法は、赤外線やハロゲンランプの使用、誘導加熱やジュール加熱を誘導する交流電流を含む。好ましくは、発熱体は、マイクロウェーブ放射源を具える。
【００３４】
本発明のこの態様の一体型システムは、本発明の第一態様のマイクロ流体サンプル処理装置を使用しており、システムの好ましい事項は類推理解される。
【００３５】
その発明の更なる態様で、ＤＮＡ分析の方法は以下のステップを含む。
ａ）分析システムに配置されたゲル系マイクロ流体サンプル処理装置のＤＮＡ抽出チャンバへサンプルを導入するステップと；
ｂ）前記ＤＮＡ抽出チャンバ内で前記サンプルを動電学的に操作して、ＤＮＡを洗浄し浄化するステップと；
ｃ）前記ＤＮＡ抽出チャンバ内のＤＮＡを増幅チャンバへ溶出させるステップと；
ｄ）前記増幅チャンバ内のＤＮＡフラグメントを増幅してゲル内で増幅産物（ＤＮＡフラグメント）を形成するステップと；
ｅ）分離チャネルに動電学的に前記増幅産物を注入するステップと；
ｆ）前記増幅産物を動電学的に分離してＤＮＡプロファイルを形成するステップ。
【００３６】
好ましくは、サンプルは、装置のＤＮＡ抽出チャンバへ導入される前に溶解される。
【００３７】
この方法の一の実施例では、サンプルは、装置へ導入される前に溶解される。例えば溶液として、カオトロピック塩と混合したＤＮＡを含む溶解サンプルが導入される。例えば、カオトロピック塩溶液中の溶解サンプルは、続く洗浄及び溶出溶液の流れに直交するシリカモノリスのような抽出材料構造上に手動で充填される。
【００３８】
この方法の別の実施例では、サンプル溶解ステップは、装置で又は装置上で行われる。例えば、サンプルは次のステップにより導入される：
溶解剤を充填した吸収部材を提供するステップ；
非溶解生体サンプルを前記吸収部材へ適用するステップ；
前記ＤＮＡ抽出チャンバと流体連通するサンプル受け取り部位において前記吸収部材を適用及び／又は保持して、その中に前記溶解サンプルを導入ステップ。
【００３９】
ＤＮＡ抽出チャンバは、ＤＮＡ抽出材料を含む。ＤＮＡ抽出材料が、溶解サンプルの残存量を捕捉するときに、ＤＮＡの抽出と溶出が一ステップで行われ、ＤＮＡフラグメントを材料は通過させる。代替的にＤＮＡ抽出材料が、ＤＮＡフラグメントを捕捉できる場合には、ＤＮＡの溶出は抽出とは別のステップで行われる。
【００４０】
ＤＮＡ抽出材料の好ましい特徴は、上記に記載されている。特に、ＤＮＡ抽出材料は、荷電されていることが好ましい。より好ましくは、ＤＮＡ抽出材料が固相抽出材料である。更に好ましくは、ＤＮＡ抽出材料がシリカ系抽出材料であり、例えば少なくとも一のシリカビーズ又はより好ましくはシリカ系モノリスを具える。
【００４１】
溶解サンプルは、ＤＮＡ抽出チャンバの洗浄入口から洗浄出口まで、動電学的に試薬を操作することにより洗浄される。本発明の好ましい実施例では、装置のＤＮＡ抽出チャンバ内での洗浄試薬の動電学的な操作が、電気浸透的な操作により行われる。
【００４２】
上記の通り、シリカ系抽出材料の使用は、それが電気浸透流（ＥＯＦ）用ポンプとして作動するため好ましく、それにより、溶解サンプルからのＤＮＡの抽出及び洗浄ステップが促進される。これは負に荷電したどの抽出材料にも言えることであり、例えば、チャネルの表面積と比較して、シリカ系抽出材料がより大きい表面積を有する結果として生じる。ＥＯＦは、表面効果であり、表面積の増大はポンプサポートの増大をもたらす。更に、そのような抽出材料は、流体力学的抵抗によりサンプルの流体力学的な逆流を制限する一方向弁として作動する。流体力学的抵抗は、材料内の小さな孔の存在に起因するものであり、この小さな孔は、流体力学的な圧流に対して高い毛細血管抵抗を有する。逆流を制御する装置がないので、逆流を防止することは非常に重要である。逆流は流体力学的な圧力の差違が原因であり、前方ＥＯＦと均衡を迅速に保つので、サンプルの移動は即座に停止する。
【００４３】
発明の好ましい実施例では、増幅チャンバへのＤＮＡ抽出チャンバ内のＤＮＡの溶出は、動電学的な操作により行われる。
【００４４】
電気浸透的な操作は、ゲルとＤＮＡ抽出材料を通してサンプルのバルク移動をもたらし、溶解サンプルからＤＮＡを抽出して、このＤＮＡを増幅チャンバへ移送させるので、ステップｂ）とｃ）において好ましい。
【００４５】
本発明の方法のこの態様は、通常、本発明の第一又は第二態様のマイクロ流体サンプル処理装置又一体型システムを使用しており、システムの好ましい特徴は類推理解される。
【００４６】
好ましくは、ＤＮＡフラグメントを形成するためにサンプルから抽出したＤＮＡの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して行われる。
【００４７】
ＤＮＡプロファイルを形成するための増幅産物の電動学的な注入及び分離は、電気泳動により行われる。電気泳動的分離は、電界中でイオンの変位を引き起こし、これにより、ＤＮＡフラグメントを分離（通常は、フラグメントのサイズが基準となる）してＤＮＡプロファイルを作成するため、好ましい方法である。
【００４８】
この方法は、更に動電学的な分離によって処理された、ＤＮＡプロファイルを検出するステップを含む。ＤＮＡプロファイルを検出することにより発生した検出信号は、次いで、プロファイルが図形で見られるよう出力手段に送信される。更にこの方法は、作製されたプロファイルを英国犯罪科学局又は関連データベース内に保存されているＤＮＡデータベースに保存されているような、既知のプロファイルと比較するステップを具える。
【００４９】
本発明は、例えば犯罪シーンにおいて現場で使用するために、犯罪科学捜査の分野に、特別なアプリケーションを有するよう意図されているが、食品真正に関する遺伝形質の決定、父子鑑定例、細菌／ウイルス感染、菌株同定及びＤＮＡを基にした安全マーキングのような様々なアプリケーションも想定されている。
【００５０】
本発明による完全一体型の携帯可能なＤＮＡ分析器によれば、例えば、現場でＤＮＡ指紋鑑定するために犯罪シーンで得たＤＮＡサンプルの処理を約１時間以内で汚染の問題を減らして又は無くして、行うことができる。このようなことは、診断及び分析工程の合理化によって可能となる。診断及び分析工程の速度でも、保管室や空港の安全施設のような現場での分析が鍵となる他の多くの状況でのこれらの装置の使用が適したものになる。特に、そのような分析器を用いたＤＮＡ分析は、細胞回収はマイクロ流体装置の外で行うが、ＤＮＡ抽出、ＤＮＡフラグメントの増幅及び増幅産物の分離、及び選択的な場合のサンプル溶解ステージの任意の少なくとも一部もマイクロ流体装置内で行われるので、上手く行われる。
【００５１】
分析器の特定のコンパクト性によって、各工程ステップ間の調整が行われ、ＤＮＡフラグメントが交互に加熱され、冷却される増幅処理を非常に迅速に行うことができる。その結果、一体型分析器システムは、ＤＮＡ抽出から分析（例えば遺伝子プロファイリング）までの全行程を約１時間で完了することができる。
【００５２】
本発明のＤＮＡ分析器システムは、ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置を利用しており、従って、マイクロ流体装置内での試薬、ＤＮＡ、及びＰＣＲ産物の動電学的流体移動を利用してＤＮＡ分析を達成する。更に、ゲル系マイクロ流体サンプル処理においてＤＮＡ抽出材料とゲル系試薬を経由して担持材料を組み込むことは、試薬とサンプルを液体／溶液相中でのみ使用する従来の市販の装置よりも優れた結果を提供する。
【００５３】
マイクロ流体装置内でのゲル又はゲルマトリックスの形成は、長時間その中に試薬を担持さることができ、システム内に泡が存在しても、溶解サンプル、ＤＮＡ及び増幅ＤＮＡフラグメントのより安定した動電的制御を提供する。
【００５４】
加えてそのような装置は、溶解サンプルの装置への導入を可能にし、次いで装置内での連続的な抽出及び／又は精製、増幅、及び分離により多数の処理を行う。そのような処理は、その中でゲル系試薬との一連の相互作用を通じ、主に溶解サンプル及び／又はＤＮＡの動電学的な操作により達成される。これは程度の差はあるが、“単一ステップ”装置である従来技術の装置と対照的である。
【００５５】
本発明は、生体サンプル中のＤＮＡフラグメント分析に関して記載されているが、当業者は本発明が、例えばＲＮＡなどの核酸材料の分析に同様に適用され、そこでこの工程がＰＣＲの使用に適したＤＮＡを形成する逆転写を含むことを理解するであろう。従ってこの方法は、逆転写を行うことを含み、この装置は、このステップを行うのに適した試薬を具えていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
本発明の実施例を、例示として添付図面を参照して以下に説明する。
【００５７】
【図１】第一構成部品、すなわちハードウェアを含む本発明のシステムの格納手段を示す。
【図２】原位置にマイクロ流体装置を有する、本発明のシステム格納手段を示す。
【図３】本発明のマイクロ流体装置の重要な部分を示す。
【図４】本発明のマイクロ流体装置の概略図を示す。
【図５】代替のサンプル導入装置を具える、本発明の第二実施例によるマイクロ流体装置を示す。
【図６】本発明によるマイクロ流体装置におけるシリカ系モノリス上での電気浸透流による８０％のエタノール洗浄溶液（ｖ／ｖ）とゲル中の８０％のエタノール洗浄液（ｖ／ｖ）の移動を示する。
【図７】本発明の方法論によって得られたＰＣＲ産物のＵＶトランスイルミネータ画像を示したものであり、特にＰＣＲ試薬へのＤＮＡの動電学的移動を通じて得られたものである。ここで、安定性テスト１は、室温で３０分間放置したゲルにより、安定性テスト２は、室温で１時間放置したゲルによる。
【図８ａ】ゲル濃度の安定性テストで得られたＰＣＲ産物のＵＶトランスイルミネータ画像を示す。
【図８ｂ】本発明の方法論によって４℃で４週間保存したゲルの安定性テストから得たＰＣＲ産物のＵＶトランスイルミネータ画像を示す。
【図９】表２に見られる配列に関連する印加電圧に起因する電動学的移動を視覚化した図であり、ここでＡとＢはそれぞれ最も有効な二つの配列を視覚化した本発明の方法論によるものである。
【図１０】本発明のマイクロ流体装置の図であり、アガロースゲルで満たされたＴ−セクションから、ポリエチレンオキシド分離媒体で満たされたキャピラリ電気泳動分離チャネルへのサンプルの電動学的注入を行うマイクロ流体装置を示しており、ここでＡ−Ｄは白金電極の配置を示す。
【図１１】本発明の方法論によるアガロースゲルマトリックスでの、失敗した動電学的注入を視覚化した図である。
【図１２ａ】本発明の方法論によるＴＥ溶液中でＥＫ注入から得たプロファイルを図形化して示す。
【図１２ｂ】本発明の方法論による１．５％のアガロースゲル中でＥＫ注入から得られたプロファイルを図形化して示す。
【図１３】本発明の方法論による１．５％のアガロースゲル中で最適化ＥＫ注入から得たプロファイルの一例を図形化して示す。
【図１４】本発明の方法論によるアガロースゲルマトリックス中での、（ａ）泡が存在する場合と、（ｂ）泡が存在しない場合の成功した動電学的注入を視覚化して示ており、動作電圧と時間は、表１に示す。
【図１５】一体化したＤＮＡ抽出チャンバと増幅チャンバと、電気浸透ポンピング用の電極の配置を示すマイクロ流体装置の図を示す。
【図１６】溶出ステップ間にモノリスから回収されＤＮＡの量を図１５に示す装置に最初に添加されたＤＮＡの量との比較をグラフで示す。
【図１７ａ】図１５に示すシステムによって作られた、ＰＣＲ産物を示すアガロースゲルを視覚化して示す。
【図１７ｂ】図１５に示すシステムによって作られ、キャピラリ電気泳動により正確なサイズを分析した、アメロゲニンＰＣＲ産物を図形化して示す。
【図１８】本発明によるマイクロ流体装置に熱循環を適用するのに適切なマイクロウェーブヒーターの断面を示す。
【図１９】ネットワーク分析器からの図形出力を示しており、これは図１８に示すヒーターの操作パラメータを決定するマイクロ流体装置の正確な共鳴周波数を示す反射能の低下を表示する。
【図２０】図１８に示すヒーターから得た熱循環を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
マイクロチャネルを具えるマイクロ流体サンプル処理装置が提供されている。マイクロチャネルは基体に刻み込まれている。この基体は、望ましくはガラスであるが、プラスチック又はその他適当な物質でもよい。約１２０ｍｍ×６０ｍｍの範囲の大きさであるか、あるいは使用するアプリケーション又はシステムによって決まる他の適当なサイズであってもよい。基体は、更にそのマイクロチャネル内にゲル系分離媒体と試薬を具え、基体を電源へ接続し、ＤＮＡ分析システム内で機能するのに必要な電気接点を具えている。ゲル系分離媒体と試薬は、流体力学ポンプによってマイクロチャネル内に予め充填されており、例えば吸引又は圧力によって注入を静水学的に制御する。ガラスの基体は、基体に接着した蓋で密封されており、基体内に画定されているマイクロチャネルを封入する。蓋を取り付けるその他の手段も好適であり、接着以外の手段による蓋の取り付けを排除するものではない。
【００５９】
マイクロ流体装置用の基体材料は、ガラス技術が既に確立され、ほとんどの反応に対する化学的応答に関して十分に特徴付けされているので、ガラスが好ましい。
【００６０】
マイクロ流体処理装置（３００）は、３つの主要な構成部分を具えている。すなわち、ＤＮＡ抽出チャンバ（３０２）、ＰＣＲチャンバ（３０３）、分離検出チャネル（３０４）であり、これらはすべて図３、４に示されており、互いに対して流体連結／共働している。
【００６１】
上述したとおり、従来技術と異なり、本発明のマイクロ流体装置（３００）は、例えばＤＮＡ分析システムに使用する際に外付ポンプを必要としない。代わりに、複数の電極を使用して流体を動電学的に操作し、マイクロチャネル内のゲル系の試薬構造内にバルク流を生じさせるか、あるいは電気浸透流又は電気泳動で、荷電された化学種の動きを分離させる。本願では、７つの電極を使用しているが、より多いまたは少ない電極でもよい。
【００６２】
本発明のマイクロ流体装置（３００）は、必要なハードウェアをすべてマイクロ流体装置に外付けすることによって、安価に製造するように特別に設計されている。これにより、マイクロ流体装置の経済性が維持され、単回の分析に適する。従って単回使用の分析には理想的である。単回使用の分析は、証拠の基礎を固めるのに使用済みのマイクロ流体装置を必要とする科学捜査又は犯罪シーンの調査分野で特に有利である。
【００６３】
本発明のマイクロ流体装置（３００）においては、プロセス試薬やサンプルＤＮＡを担持するゲルを満たしたチャネルやキャピラリを使用しており、システム内に泡が存在する場合でも、溶液ベース（従来技術）の手法と比較して、サンプルＤＮＡの動電的な制御に関して、安定性を強化している。ゲルはマトリックス形状だが、どのような形状であってもよく、様々なプロセス試薬をマイクロ流体装置内の正確な位置に長期間にわたって固定できるものでなければならない。
【００６４】
マイクロチャネルを具えるマイクロ流体装置（３００）を使用する前に、図４に示すマイクロ流体装置の概略図を特に参照し、下記で詳細に説明するよう準備しなければならない。
【００６５】
マイクロ流体装置の準備
モノリスの準備：ケイ酸カリウムとホルムアルデヒド１０：１の溶液をサンプル導入ポート（３０１）に圧力注入することによって、マイクロ流体装置（３００）の６角形抽出チャンバ（３０２）内にシリカ系抽出モノリスを形成する。周囲のチャネルを３％のグリセロールヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）ゲルで満たして、１２時間、９５℃で硬化させる間、シリカ溶液を、６角形抽出チャンバ（３０２）内に確実に維持する。硬化工程に続いて、水を用いてチャネルからＨＥＣゲルを洗い流す。シリカ系モノリスは、ケイ酸カリウム（９％酸化カリウム、２１％酸化ケイ素）とホルムアルデヒド９８％を用いて製造する。
【００６６】
チャネルＡの準備：アガロース洗浄液送達ゲルは、低融点アガロースゲルを脱イオン水に溶かして、濃度３％（ｗ／ｖ）（１００μｌ脱イオン水中に０．００３０ｇアガロース）とし、７５℃で加熱して作る。ゲルが形成されるがまだ溶解しているときに、８０％のエタノールと２０％ １Ｍの塩化ナトリウムを加え、混合して、ポートＡ内に圧力注入して、ポートＡの入り口から抽出チャンバ（３０２）に位置するモノリスまでのチャネル長を満たす。
【００６７】
チャネルＢの準備：低融点アガロースを、ＤＮＡ／ＲＮＡを含まない水に溶解させ、７５℃で１０分間加熱し、大容量の水がゲルを通って自由に移動できるように、ゲルの濃度を低く保つ。ゲルが形成されたがまだ溶解しているときにゲルをポートＢに圧力注入して、ポートＢの入り口から抽出チャンバ（３０２）に位置するモノリスまでのチャネル長を満たす。
【００６８】
チャネルＣの準備：低融点アガロースを、ＤＮＡ／ＲＮＡを含まない水に溶かし、７５℃で１０分間加熱する。まだ溶解しているときに、ゲルをポートＣに圧力注入する。
【００６９】
分離チャネル（３０４）の準備：ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）ゲルを、長時間撹拌法によって、１×Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液中２．５％濃度になるように作り、次いで圧力注入によってポートＧに導入する。ゲルの粘度によって流れを制御して、チャネルＤ−Ｆの交差箇所にだけ注入が行われるようにできる。代替の実施例では、１×Ｔｒｉｓ ＴＡＰＳ ＥＤＴＡ（ＴＴＥ）緩衝液中の６Ｍの尿素を有する線状のポリアクリルアミドゲルなどの、適当な粘度を有するその他のゲルを分離チャネルに用いても良い。
【００７０】
ＰＣＲチャンバ（３０３）の準備：低融点アガロースを、ＤＮＡ／ＲＮＡを含まない水に溶かし、７５℃で１０分間加熱する。ゲルが形成されているがまだ溶解しているときに、ＰＣＲ試薬を加えて（ＮＨ４緩衝液、ＢＳＡ、順方向プライマーと逆方向プライマー、ｄＮＴＰｓ、ＭｇＣＬ２、Ｔａｑポリメラーゼ）混合する。“ＰＣＲゲル”は、ゲルがまだ溶解している状態でポートＤへの圧力注入を介してＰＣＲチャンバ（３０３）に注入し、チャネルＤ−ＦとポートＥを満たす。
【００７１】
次いで、ポートＡ−Ｇを導電性ポリマープラグで閉鎖する。このプラグは電極に接続されており、統合分析システムの第一構成部品に配置できる電源によって電力が供給される。
【００７２】
全分析方法の段階（少なくとも細胞溶解後）を、上述の密閉したマイクロ流体装置（３００）内で行なう。分析システムで使用する前に、マイクロ流体装置（３００）は、必要な各段階に適した化学的性質を有する試薬を予め充填しなければならず、装置は４℃で保管されることが望ましい。一の運転モードでは、ユーザーが現場にいれば、引き続き溶解したサンプルを手動で装置に充填できる。別の運転モードでは、サンプルの溶解も装置で行われる。これらの代替例については、下記に詳しく述べる。
【００７３】
溶解サンプルとＤＮＡのキャピラリーチャネルへの注入の制御は、再現可能な分離と確実な検出分解能を得るためとても重要である。マイクロ流体装置への注入は、吸引、圧力又は重力によって静力学的に、又は動電学的に制御できる。本質的に動電学的な制御は、静力学的なシステムよりも、より的確で正確にサンプルを導入できると共に、外付けポンプ、アクチュエーター、バルブなどを必要としない。この実施形態では、サンプルの充填を、サンプル導入ポート（３０１）を、例えば数マイクロリットのル溶解サンプルをサンプル導入ポート（３０１）に分注して、又はサンプルを、溶解剤を浸透させたスポンジ（５０１）に加え、そのスポンジ（５０１）をサンプル導入ポートに加えるか配置するかして実行する（図５参照）。そこからサンプルは、ＤＮＡ抽出チャンバ（５０２）内のシリカ多孔モノリス内に浸透する。次いで、キャップで導入ポートを密閉し、図４に示すようにＡ−Ｇに位置する電極に電界を印加することにより、チャンバやチャネル内でサンプルの操作をする。
【００７４】
このシステム自体は、完全に統合された、携帯可能なＤＮＡ分析システムを具える。この分析システムは、異なるものであるが共働する２つの構成部品を有する格納手段を具えている（図１と図２参照）。第１の構成部品は、コントロールユニットである。このコントールユニットは、熱循環や検出のような工程の制御に必要なハードウェアとソフトウェアを全て含む。第２の又は更なる構成部品は、マイクロ流体装置である。このマイクロ流体装置は、サンプルと関連する処理試薬を含む。
【００７５】
細胞溶解後の全分析手法を、上述したタイプの密閉したマイクロ流体装置（３００）内で行う。溶解剤を充填したスポンジ（５０１）内で細胞溶解を行い、このステージもまた装置（５００）上で行うことが好ましい。サンプルの移動、ＰＣＲ増幅と分析の制御に必要な全てのハードウェアを具える格納手段の第１の構成要素は、マイクロ流体装置（３００、５００）の外にある。第１の構成部品を有するシステムの格納手段、すなわちこのハードウェアは図１に示されており、マイクロ流体装置は、図２に示すシステム格納手段内の原位置にある。
【００７６】
本発明の分析システムは、タッチコントロールパネルで制御される。そして一旦蓋を閉じると、必要なＤＮＡプロファイルの作成が完了するまで、分析的工程が稼働するよう完全に自動化されている。サンプル／溶解サンプルが充填されたマイクロ流体装置（３００、５００）をシステム内に配置し、電極ＡとＣの間に電気的バイアスをかけて、上記のチャネルＡの調整で述べたようにアルコール溶液で溶解サンプルからＤＮＡを洗い流して、例えば血液サンプル中に存在するヘム分子のような工程を妨げる可能性がある細胞残屑とその他の物質を取り除く。次いで、ポートＢとポートＤにバイアスをかけて、装置（３００、５００）の抽出チャンバ（３０２、５０２）内のシリカモノリスの上にチャネルＢから水をくみ上げて、ゲルで満たされたＰＣＲチャンバ（３０３）へＤＮＡを溶出させる。ＤＮＡプロファイリングに必要なＤＮＡフラグメントの増幅に適した既知試薬の存在下で、３つのＰＣＲ温度で約２５回乃至３０回循環させる。これらの試薬は蛍光染料も含有している。この蛍光染料は、選択されたＤＮＡフラグメントに結合して分離工程を行う間に選択されたＤＮＡを検出できようにする。増幅されたフラグメント（例えば、標準ＤＮＡ指紋検査法に使用する１１遺伝子座の増幅によるＰＣＲ産物）を、分離チャネル（３０４）のネック部分に動電的に引き寄せ、分離チャネル（３０４）に少量で明確な量の増幅されたフラグメントを導入する。これは、電極Ｇ及びＥにおいて、分離チャネル（３０４）に大きな電気バイアスがかかっている電場を用いても行われ、バイアスが下がると増幅した産物のＤＮＡフラグメントが分離する。
【００７７】
電気接点は、一般に直径約５００μｍの形状であり、白金線が好ましい。より好ましくは、導電性高分子、例えばカーボン充填ポリスチレンを装置の電気接点として使用し、金被膜銅電極を使用して、制御装置の電源を高分子電極に接続する。
【００７８】
増幅産物のＤＮＡフラグメントの分離は、ＤＮＡフラグメントがゲルマトリックスを通過する時に、その電荷やサイズに影響される。ＤＮＡフラグメントの泳動時間は、原則として、サイズによって区分される。サイズに基づく核酸フラグメントの電気泳動分離工程は良く知られた技術であり、ここでこれ以上の説明は必要ない。本発明のこの実施例では、少なくとも２つのレーザーと２つのスペクトロメータを使用して、これらのフラグメントの検出を行なう。検出器は、レーザーが極めて正確な光の波長を放射することを知るだけに必要であり、核酸フラグメントをマークするために使用した蛍光塗料の４つの周波数から識別することができる。要するに、２台のレーザーが、蛍光塗料（ここでは４つ）を励起して、２台のスペクトロメータ又は２台の検出器（システムが２つのレーザーの光を感知出来なくても、なお４つの蛍光塗料の認識するために２台必要）が、フラグメントが出口近くの検出窓をいつ通過したか特定できるようにし、ＤＮＡプロファイルやＤＮＡ指紋鑑定法を適用できる。この機械は、稼働が完了すると、通常ＡＢＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｌｔｄ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）で作成される商業用シークエンスに類した図形で、プロファイルを出力する。
【００７９】
分析システムにおいてマイクロ流体装置を用いる方法も提供されており、以下により詳細に述べられている。原則的に、検査する溶解サンプルを手動でマイクロ流体装置に導入するか、あるいは検査するサンプルを装置の溶解試薬を充填したスポンジ上に導入する。次いで、溶解サンプルがシリカモノリスに吸収され、シリカモノリス上でインサイチュウでＤＮＡを抽出し、溶出する前に洗浄し、ＰＣＲ法を用いて増幅し、その後蛍光標識したＤＮＡセグメントを分離して遺伝子パターンを得る。システムの出力は英国犯罪科学局に保存されているＤＮＡデータベースと互換性があるが、必要であれば他国のものと互換性を持つように容易に構築できる。
【００８０】
分析システムに本願のマイクロ流体装置を用いる方法を、図４を参照して以下詳細に述べる。
【００８１】
ａ）１０−５０μｌのサンプル溶解液と塩酸グアニジンを、サンプル導入ポート（３０１）を用いてマイクロ流体装置（３００）のＤＮＡ抽出チャンバ（３０２）内に配置したシリカモノリス上に手動で充填する。
【００８２】
ｂ）マイクロ流体装置（３００）のポートＡとポートＣに配置した電極を用いて、洗浄入口（ポートＡ）からシリカ系抽出モノリスを含有するＤＮＡ抽出チャンバ（３０２）を経て、洗浄出口（ポートＣ）に８０％エタノール溶液を流すことによりＤＮＡを含有する溶解サンプルを洗浄する。これは、ポートにバイアスをかけて電気浸透流（ＥＯＦ）を誘発することにより達成される。ＥＯＦを誘発する一般的な電圧は、５０−１５０ｖ／ｃｍである（表１参照）。８０％のエタノール溶液で細胞残屑及び不要なマトリックスのモノリスを洗浄し、溶解サンプル内に含まれるＤＮＡを回収できるようにする。
【００８３】
ｃ）次いで、シリカモノリス上に残っているＤＮＡを、マイクロ流体装置（３００）のポートＢとポートＤにバイアスをかけてＥＯＦ流を誘発し、Ｈ２Ｏを用いてＰＣＲ（３０３）中に溶出させる（表１を参照）。
【００８４】
ｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＤＮＡを増幅してＤＮＡフラグメントを形成する。ＰＣＲチャンバ（３０３）は、３つの個別の温度を介し周期的に温められて、その結果、選択されたＤＮＡフラグメントが指数関数的に増幅する。適当なプローブを使用して、目的の増幅されたＤＮＡを得る。ＰＣＲ工程の２５乃至３０サイクルが完了すると、増幅産物を含んだゲルが凝固する。すなわち外気温に戻してもかまわない。
【００８５】
ｅ）ＤＮＡフラグメントを含むＰＣＲ産物を、電気泳動的にＰＣＲチャンバ（３０３）から分離チャネル（３０４）のネック部分に移動させ、当技術分野でよく知られているピンチ注入法を使用してマイクロ流体装置（３００）の分離チャネル（３０４）に注入する。このように、ほんのわずかのＤＮＡフラグメントを含むＰＣＲ産物が、制御された時間で分離チャネル（３０４）に引き込まれ（表１参照）、次いで電極Ｄ、ＥとＦに電圧をかけて、分離チャネル（３０４）に注入されなかったＰＣＲ産物を引き戻し、注入したＰＣＲ産物の個別スラグを形成する。次いで、電極Ｄ、Ｅ、ＦとＧに電圧を印加して（表１に詳細表示）、分離が開始する前にＰＣＲ産物の個別スラグの荷電したＤＮＡフラグメントに焦点を合わせる。
【００８６】
ｆ）ポートＤ−Ｇ間にバイアスをかけることで、注入したＰＣＲ産物のＤＮＡフラグメントが、マイクロ流体装置（３００）の分離チャネル（３０４）に沿って電気泳動的に分離される（表１参照）。
【００８７】
表１−試薬を用いたＤＮＡフラグメントの移動に印加した電圧と適用時間
【００８８】
その他の適当な電源を使用することもできるが、上述の電位は、４×０−１０００Ｖの直流電源ユニットを用いて発生させた。更に、１０００Ｖ以上の高電圧が必要なときは、１０ｋＶ電源を用いた。両電源共、適当なソフトウェアを用いて正確に制御される。
【００８９】
図面を参照し、以下に実施例を用いて発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の一体型マイクロ流体装置で行われる、統合した結果妥協した個々の工程（ＤＮＡ抽出、増幅、分離及び検出）の再最適化操作条件を示している。装置の様々な部分間の相互作用を認識することによって、発明者らはこれらの各工程で統合が持つ効果を理解した。したがって、以下に定める条件は、本願の一体型マイクロ流体装置内で効果的に使用できる抽出、増幅、分離及び検出の妥協した操作条件を表している。
【実施例１】
【００９０】
ＤＮＡの回収と充填
本発明の使用の１の実施例では、ボランティアの頬から採取した口腔細胞からＤＮＡを含む生体サンプルを抽出した。
【００９１】
第一の代替実施例では、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡマイクロキット抽出キットまたは類似品を用いて口腔組織から生体サンプルを採取した。ＰＯＬＡＲＳｔａｒ ＯＰＴＩＭＡ プレートリーダーを用いて抽出したサンプルの量を測定し、次いで標準濃度５ｎｇ／μｌになるよう希釈した。
【００９２】
１×ＴＥ緩衝液でシリカ表面を活性化させてシリカ系モノリスを作った。サンプル標準溶液５μｌを塩酸グアニジン１２０μｌと混合し、流速５μｌ／分の水圧ポンプにより、モノリスに充填した。
【００９３】
第二の代替実施例では、頬の内側に沿って滅菌綿棒で掻き取って、固体から生体サンプルとして使用する口腔細胞を採取した。マイクロ流体装置は、３ｍｍのトッププレートを具えており、ＤＮＡ抽出チャンバ（５０２）上に生体サンプルの入口として作用する３ｍｍの穴が設けられていた。この入口は、塩酸グアニジン溶液に漬けた多孔性スポンジ（５０１）で満たされていた。口腔細胞は、手動インターフェースを介して綿棒からスポンジ（５０１）へと移動する。
【００９４】
塩酸グアニジン溶液は、口腔細胞を溶解させ、ＤＮＡを放出させ、続いてＤＮＡ抽出モノリスへのＤＮＡの結合を容易にする働きをする。次いで綿棒を取り除き、二重機能プラグを用いて、マイクロ流体装置（５００）を密封し、サンプルの減少／汚染を防止する。更に、プラグがスポンジ（５０１）を加圧する結果、溶解サンプル−塩酸グアニジン溶液がモノリスを通って廃棄チャネルに移動する。ＤＮＡはモノリスに結合したままであり、ＤＮＡ抽出工程を完了するのに必要な洗浄と溶出ステップを行うことができる状態にある。
【００９５】
排液の除去
モノリスの孔にまだ存在している細胞残屑を８０％のエタノール洗浄液（％ｖ／ｖ）で洗い流した。アガロース洗浄液デリバリーゲル（チャネルＡ内にある）を濃度３％（１００μｌＤＮＡ／ＲＮＡ水中０．００３０ｇアガロース）とし、７５℃に加熱し、ゲルが形成されているがまだ溶解した状態で８０％のエタノール１００μｌと２０％ １Ｍの塩化ナトリウムを加え、次いで冷却してゲルを再形成し、内部にエタノール溶液を得た。まだ溶解した状態でエタノールゲルをチャネルＡに導入して、シリカモノリスとインターフェースさせた。次いで、点ＡとＣにある白金電極を所定の位置に固定し、５分間１００Ｖｃｍ−１の電界強度をかけて、シリカモノリスから細胞残屑を洗い流した。例えば表２にあるように、電界強度を比較して、最適電界強度を定め、ゲルと自由溶液の両方の８０％のエタノールと２０％ １Ｍの塩化ナトリウム溶液のＥＯＦ移動を行った。
【実施例２】
【００９６】
ＰＣＲゲルの調整
低融点アガロースゲルをＤＮＡ／ＲＮＡを含まない蒸留水に溶解させて、７５℃に１０分間加熱してＰＣＲゲルを製造した。ゲルが形成され、まだ溶解状態にあるときに、ＰＣＲ試薬（２μｌの１０×ＮＨ４緩衝液、２μｌのＢＳＡ、２μｌの順方向プライマー、２μｌの逆方向プライマー、１μｌのｄＮＴＰｓ、０．４μｌのＭｇＣｌ及び０．４μｌのＴａｑポリメラーゼ）を加えて混合し、ゲルを冷却して試薬を保持した。電極ＢとＤを所定の位置に固定し、５分間１００Ｖｃｍ−１の電位をかけ、アイスブロックの上で実験を行ってＰＣＲ試薬の結合性を維持した。動電学的移動が完了したら、圧力注入によりＰＣＲゲルをチャネルから取り出して、回収した。次いで、得られた溶液をサーマルサイクラーで増幅し、スラブゲル電気泳動法で分離し、ＵＶトランスイルミネータを介して観察した。
【００９７】
試薬の安定性を維持しながら、ＰＣＲ増幅工程を容易にするのに最も適した条件を決定するゲルと試薬の濃度を調べた。試薬ゲルの短期間安定性と長期間安定性を調べた。例えば、試薬ゲルを上述のように用意して、室温と４℃で保存した。ＤＮＡ鋳型をコントロールサンプルに加え、次いで、制御された期間サーマルサイクラー中で指数関数的に増幅させた。
【００９８】
様々な電極電位と時間を調べて、システムの柔軟性を測定した。この電極印加電圧の組み合わせを、表２に詳細に示す。
【００９９】
表２−電極と印加した電界の組み合わせ
【０１００】
結果と結論
排液の除去
通常ＤＮＡ抽出クリーンアップにおける洗浄ステップに使用されるイソプロパノールのは、電気浸透流をおこさないので、８０％のエタノール溶液を用いた。図６は、シリカモノリス上での、溶液（ｖ／ｖ）中の８０％のエタノール洗浄液とゲル（ｖ／ｖ）中の８０％のエタノール洗浄液の電気浸透流による動きを示す。
【０１０１】
予想通り、洗浄液の流速（図６の上側のライン）は、ゲルフォーマット中の同じ溶液（図６の下側のライン）から得られた流速より速かった。ゲルでは、液体のバルク流上のクロスポリマーネットワークの干渉効果が原因で、電界強度と流動速度の関係が非線形である。しかし、アガロースゲル溶液は、許容流速でモノリス上で電気浸透ポンピングを起こして、細胞残屑をモノリスから除去できることがわかった。このことは、溶解サンプルのＤＮＡはモノリス表面に吸着されるが、細胞残屑や赤血球（溶解サンプル内に存在することがある）はチャネルＡからＣへのエタノール溶液のバルク移動によってモノリスから洗い流されるという上述のメカニズムによって達成される。次いで、チャネルＢからの水を用いてモノリスから（ＰＣＲに適した形式で）ＤＮＡフラグメントがクリーンに溶出される。
【実施例３】
【０１０２】
試薬ゲルの作成
電位を印加した後、各電極にたまった溶液を回収した。回収したＤＮＡの６５％の定量化されたＤＮＡは陰極で見られたが、２２％は陽極（図４の入口ポートＦ）から回収された。これは、おそらくＤＮＡが同じポートに導入された場合に生じる、電気泳動による少量の移動によるものであった。残りのＤＮＡ（１３％）は、エタノール中で検出された。これらの結果は、ＰＣＲ増幅に必要な濃度で電気浸透流によって、モノリスから上手くＤＮＡを抽出できるという特許請求の範囲をサポートしている。
【０１０３】
電気浸透ポンピングによりモノリスから抽出したＤＮＡは、実行するべきＰＣＲ増幅に充分な量と質を有していた。この結果も、比較的高い電界を使用した場合でも、ゲル状の試薬の安定性を立証した。
【０１０４】
次いで、一連のアガロースゲルの濃度（１０％、５％、３％、１．５％、１％、及び０．７５％）を調べて、長期間試薬の安定性を維持しながら、ＰＣＲ反応を生じさせるゲルの理想濃度を決定した。調査した濃度のうち、０．７５％−３％の溶液の結果が可視的に図８ａに表示されており、濃度５％と１０％の溶液から得られた結果はゲルの逆の粘性効果が原因で芳しくなく、すぐ調査から除外した。図８ａより、より強いバンドがプレート上に存在することにより、０．７５％ゲルでＰＣＲ反応が上手くいったことがわかる。しかし、予備テストは、このゲル濃度では、長期の安定性は低く、試薬の保護がなされないことを示した。１％と１．５％のゲル濃度で得られたバンドは互に区別できないので、反応させ、試薬の安定性を維持するため、１．５％のゲル濃度で進めることを決定した。
【０１０５】
この安定性テストの結果は、図７に見ることができる。これは、ＰＣＲ試薬へのＤＮＡの動電学的移動を通じて得たＰＣＲ産物のＵＶトランスイルミネータ画像であり、冷蔵保存されていない場合、ＰＣＲ試薬の安定性は減少する傾向にあることを示している。ゲルを３０分間室温で放置するという安定性テスト１によれば、ＰＣＲ反応はある程度進むが、誤プライミングが明らかであることが証明された。一方、ゲルを１時間室温で放置するという安定性テスト２では、試薬が完全に使用できなかったことを図７が示している。第２安定性テストの結果は図８ｂに見ることができ、試薬ゲルを４℃で４週間保存することができ、ゲルマトリックスに組み込まれると、試薬の安定性が非常に高まることを示唆している。
【０１０６】
様々な印加電位の調査から得られた結果（表２参照）は、システムが非常に柔軟であり、従って他のアプリケーションへ移行する可能性が高いことを示している。この結果は、調査された他のものよりシーケンス８が好ましいことを強調している。
【実施例４】
【０１０７】
試薬ゲルの作成
例えば図３又は４に示す、マイクロ流体装置（３００）に、１Ｍの塩酸を流し、続いて乾燥する前に１Ｍの水酸化ナトリウムと脱イオンを流すことにより、洗浄し準備した。ポートＧに圧力注入することにより、マイクロ流体装置（３００）の分離チャネル（３０４）にＰＥＯゲルを充填した。
【０１０８】
ＤＮＡ／ＲＮＡを含んでいない水１００μｌに０．００２９ｇの低融点アガロースを溶解させて、アガロースゲルを作り、ゲル濃度２．９４％になるようにした。この溶液を水槽内で７５℃で１０分間加熱し、ゲルを形成した。ゲルがまだ液状のときに、９．８μｌのサンプルに１０．２μｌのゲルを加え、可視化物質（ここでは蛍光標識したプライマー）を加えて混合した。濃度１．５％の最終ゲル溶液をポートＥに圧力注入することにより、ゆっくりとマイクロ流体装置に注入して、クロスバー（Ｄ−Ｆ）の両腕をサンプルマトリックスで均等に満たした。最後に、図１０に示すように２つのゲルに白金線電極を押し込んだ。
【０１０９】
図１０において、Ｔ−セクション（９０１）からポートＤまでの分離チャネル（９０２）の長さは８００ｍｍであり、チャネル（９０２）の直径は０．２ｍｍである。Ｔ−セクションにおける、ポートＡ、ＢまたはＣまでのチャネルの長さは５ｍｍであり、垂直チャネルの直径は０．６ｍｍである。
【０１１０】
マイクロ流体装置（３００）の用意ができたら、サンプルと分離マトリクスを検査して、印加した電界を中断することがある泡や屑が注入工程で入り込んでいないことを確認した。電圧プロフィールは、ＬａｂＶｉｅｗソフトウェアによって入力したプリセットプログラムから自動的に印加された。
【０１１１】
結果と考察
溶液ベース（従来技術）とゲルベースの動電学的注入比較
最初に、溶液からの動電学的注入に使用される最適電圧プロフィールを、ゲルマトリックスに印加して、ゲル系システムのＥＫ注入を最適化する出発点を確立した。図１１に示す結果は、右側の写真が示すように、蛍光プライマーが、より広いサンプルチャネルからより狭い分離チャネルへ移動していないので、アガロースゲルマトリックスからＰＥＯゲルへのサンプル注入が失敗したことを示している。
【０１１２】
最も可能性のある注入失敗の２つの理由は、より密度の高い分離ゲルが物理的にサンプルの移動を妨害したことと、ゲルのインターフェースがチャネルを横切る電界強度に悪影響を与えたことである。
【０１１３】
しかし、図１２ａと１２ｂがそれぞれ示すように、溶液注入とゲル注入用に得たプロファイルを検討したところ、実際には、プロファイルはほとんど同一であり、唯一の違いは、ゲルシステムで見られるプロファイルが、ほんの少しより矩形であるだけである。このことは、溶液システムとゲルシステムの電気抵抗が類似しているので、ゲルの密度増加は、印加された電界に影響しないことを示している。
【０１１４】
従って、観察されたサンプル注入の妨害は、より密度の高いゲルマトリックスによって生じた物理的抵抗に起因する可能性が高い。これは、同じ移動基本メカニズムが、ゲルと溶液の両方に適用されており、唯一の違いは、同様の移動が生じるために、ゲルの物理的影響がが、より高い電圧とより長い時間を必要とすることを示唆している。
【０１１５】
その結果、ゲルシステムにおける注入の再最適化を実行し、溶液システム用のものと比較した結果を表３に示す。
【０１１６】
表３−ＴＥ緩衝溶液とアガロースゲル中の、動電学的注入に必要な最適電圧と時間を示す。
【０１１７】
予測通り、ゲル又はゲルマトリックス中で注入を行うときに、必要な消費電力がかなり大きくなった。この電力の増加は、電気泳動移動度（μｅｐ）（ｑは正味電荷、ｆは並進摩擦係数、ｖは成分の移動速度、Ｅは電界）を示す下記式１と、ポリマー溶液（μｏ）種の電気泳動運動（ηは溶媒粘度、ｑはポリイオン荷電、Ｒはポリイオンの半径）を考慮した修正電気泳動移動度の方程式であるフュッケルの式（式２）とから説明できる。
【０１１８】
電気泳動移動度は、並進摩擦係数に対する電荷によって表されるが、ポリマー溶液の導入には、溶媒の粘度だけでなく、ポリイオンの半径も必要である。両方程式では、電荷が同じであるが、粘性とポリイオンの半径が与える影響が、ゲル内での電気泳動移動度にかなりの変化を与えることになる。
【０１１９】
ゲル担持注入のロバスト性の証明
ゲル中での最適ＥＫ注入用プロファイルを検討すると（図１３）、以前のゲル注入（図１２ｂ）に表示されたものと同じ矩形特性が観測された。一般に、ゲルにおける注入は、より高い安定性を示し、これは溶液中で得られたプロファイルのものと比較して、むしろ直線状のプロファイルによって表されている。一般的にゲル内での注入は、データの直線均等ラインが示す安定性の程度がより大きいことを示す。
【０１２０】
システム内に泡が存在していても（図１４ａ）、動電学的注入が上手く実行できれば、ゲルの安定性はさらに増した（図１４ｂ）。
【０１２１】
溶液ベースシステムでは、電気泳動的注入する間の泡の存在は、大抵、流体移動の工程の失敗につながる支障をきたした。しかし、本発明のゲルシステムでは、泡の存在が、泡無しで行った連続注入と比較して、より大きな直径を有するより拡散したサンプルスラグを、発生する（図１４ｂ）。更に、注入工程の後半段階で消失する泡の周辺領域で生じているサンプルの濃度に増加が観察される。しかし、上手く注入することは可能であり、注入チャネルに泡がない注入と比較できる。
【実施例５】
【０１２２】
マイクロ流体装置内におけるアガロースゲル系 ポリメラーゼ連鎖反応と統合した、キャリアＲＮＡを使用したＤＮＡ抽出
生体サンプルからのＤＮＡ抽出は、ＰＣＲのような下流工程の成功を左右する。この実施例で述べるように、固相抽出法の使用は、ＤＮＡの予濃縮を容易にするので有利であり、サンプル物質の入手が制限されている場合に重要である。
【０１２３】
この実施例では、図１５を参照するに、標準的なフォトリソグラフィー技術とウエットエッチングを用いて、すべてガラスでできたマイクロ流体装置を作成した。モノリスは、ＤＮＡ抽出チャンバ（１４０１）で、ケイ酸カリウムとホルムアミドの混合物を加熱硬化させ作成した。次に動的不動態化用に、牛の血清アルブミンとポリビニルピロリジンとツイン２０を含むアメロゲニン遺伝子座増幅用ＰＣＲ試薬を、低融点アガロースの融解溶液に加え、ＰＣＲ増幅チャンバ（１４０２）に注入し、必要時まで４℃で保存した。
【０１２４】
ポリＡキャリアＲＮＡと共に、又は伴うことなく、ＤＮＡを５Ｍ塩酸グアニジン溶液に加え、モノリスに注入した。例えば、血液からのヘムタンパク質といった、下流アプリケーションにおける潜在的汚染は、電極Ｂへ正電位を、電極Ｃに負電位をかけることによって、ＥＯＰ系エタノール洗浄により取り除かれて、バルク電気浸透流ができる（図１５）。最後に、正電位を電極Ｂに、負電位を電極Ｄにかけることにより、ＥＯＰを使用した水によって、ＤＮＡを増幅チャンバに溶出させた。予め充填されたＰＣＲゲル中にＤＮＡが移行すると、ペルチェ加熱システムを用いて熱循環を行った。標準キャピラリ電気泳動を用いて、ＰＣＲ産物をチップ外で分析した。
【０１２５】
結果と結論
キャリアＲＮＡの使用は、ＤＮＡ抽出効率を高めることにつながった（図１６）。キャリアＲＮＡを含むサンプル（１５０１）（ＲＮＡ：ＤＮＡ＝５０：１）を、キャリアＲＮＡを加えていないサンプル（１５０３）と比較した。理論的に１００％の回収率であることを４５°のラインが示している（１５０５）。
【０１２６】
キャリアＲＮＡをシステムに加えていないときは回収ＤＮＡはわずか５ｎｇであるのに対し、キャリアＲＮＡを使用すると、ＤＮＡ抽出効率が最大２５ｎｇの理想である１００％の理論回収率となる。より多量のＤＮＡでは、キャリアＲＮＡの存在により、溶出ステップの間、ＤＮＡの収率がより高くなり続ける。ＰＣＲ試薬を封入するためにアガロースゲルを使用することは、ＤＮＡ増幅に悪影響を与えるものではないが、４℃で少なくとも８週間、マイクロ流体装に試薬を長期保存できるという利点を提供する。このシステムを用いて生成したＰＣＲ産物の例が、図１７ａと１７ｂに示されている。図１７ａは、ＤＮＡサイズラダー（レーン１）、陽性対照（レーン２）、陰性対照（レーン３）とマイクロ流体装置でのゲル系増幅から得られたＰＣＲ産物（レーン４）を示している。
【０１２７】
キャリアＲＮＡをＤＮＡ結合溶液に添加すると、熱的に活性化されたシリカモノリスのＤＮＡの抽出効率を高めることになる。ＰＣＲ試薬を封入するためにアガロースゲルを使用することによって、ＰＣＲ試薬をマイクロ流体装置で保存することができる。これは、水圧ポンプではなくＥＯＰを使用することにより、携帯アプリケーションと汚染の可能性の減少に大きな利点を提供する。
【０１２８】
代替ヒーター
上に提言されているが、このシステムは、ペルチェ加熱／冷却素子のような従来の設計の熱サイクラーと互換性があるが、本発明によるシステムの急速な熱サイクルに特に効果的な代替物はマイクロウェーブヒーターである。図１８に一例を示す。
【０１２９】
サンプルを加熱するのに使用される共鳴空洞（１７０２）は、マイクロウェーブ周波数で作動したが、加熱工程は、従来のマイクロウェーブ加熱ではない。従来のマイクロウェーブ加熱においては、ターゲットの大きさは、一般に空洞（１７０２）の波長を上回る。８ＧＨｚでは、空気中の波長は３７．５ｍｍであり、従って、ガラス中では、約１６ｍｍとなる。関連する軸に沿ったサンプルの大きさは、ちょうど２ｍｍである。このように、加熱メカニズムは、まさに空洞のリエントラントポスト間のガラスの無線周波数（ＲＦ）誘電加熱であり、空洞の共鳴モードは、低周波数の観点から、よく理解されている。
【０１３０】
Ｃ字形状に曲げられた導電性円筒棒（１７０１）は共鳴周波数を有し、従ってこの棒の互いに対向する端部がコンデンサを形成し、棒の長さはコンデンサと直列の単回コイルのインダクタを形成する。従って、この構造は、棒の長さに沿って交流電流が行ったり来たりする非常に単純なモードで共鳴できる。しかし、電源をそのような共鳴器に接続することが困難であり、問題となるレベルの電力がそこから発生することがある。
【０１３１】
シールド共鳴構造に共鳴棒（１７０１）を位相的に展解させるには、この棒をコンデンサの軸を中心にの周りで３６０°回転させて、個体を作るだけでいい。出来上がった構造体は、リエントラント準トロイダル空洞であり、そこからは何も放射しない。容量値に変化はないが、インダクタンスはかなり減少し、いくつかのシングルターンインダクターを並列にしたものに類似する。共鳴モードは、１つだけであり、対向する中心ポスト間のコンデンサの軸に平行なＲＦ電界を有する。ポストが互いに近接しており、サンプルフィンガーのガラスの誘電率は約６なので、その他どこにも電界はほとんどない。ＲＦ磁界は、ポスト周辺のトロイダル空洞スペースの方向に流れており、磁界ループにより容易に励起される。ここでは、この磁界ループは、直径２．２ｍｍ、５０Ωのセミグリッド同軸ケーブルから作られる。
【０１３２】
空洞（１７０２）は、同一形状をした２つの部分から構成されている（図１８参照）。リエントラントポストは、軸方向に直径１．６ｍｍの穴があけられており、冷気供給源（１７０３）からの冷気が入って、サンプルフィンガーに直接影響あたる。サンプルフィンガーが入る矩形スロットを、結合ループに対向する空洞側に機械加工した。
【０１３３】
これは、下記の誘電体を充填したカットオフ導波管のような挙動をし、その減衰は以下の通りである。
ここでλｃはカットオフ周波数、εはガラスの誘電率である。この空洞デザインの減衰は２０ｄＢ以上であり、空洞の外径が大きくなると、減衰も大きくなるが、これは必要なことではない。リエントラント円筒空洞の共鳴波長は、以下の通りである。
ここでρ１はポスト、ρ２は空洞半径、ｚ０は長さである。サンプルフィンガーの存在は、共鳴周波数を要素
分減少させる。ｚ０が短く、サンプルフィンガーと結合ループが空洞に侵入しているので、計算は概算であり、増分の機械加工により８ＧＨｚに調整した。
【０１３４】
マイクロウェーブ電源は、５Ｗまでの電力レベルで使用され、マイクロウェーブ信号発生器によって駆動されるＧＨｚ２０Ｗ進行波管増幅器である。サンプルフィンガーを空洞（１７０２）に挿入した後、反射能信号内の共鳴の低下を観測することにより、共鳴周波数が低電力で決定される。周波数がその後記録され、信号発生器に伝送された。空洞（１７０２）への結合を、結合ループの挿入深度を変化させることにより、最小１０ｄＢのリターンロスに調整した。
【０１３５】
ＤＮＡ増幅工程間の熱循環温度のリアルタイム調整が可能な制御システムが開発された。３つの工程温度（ＤＮＡ変性、プライマーアニーリング、及びＤＮＡ伸長）での滞留時間は、１乃至９９秒で調整可能であり、初期ＤＮＡ変性と最終ＤＮＡ伸長温度では、１乃至９９９秒で調整可能である。
【０１３６】
各マイクロ流体装置を、マイクロウェーブ空洞（１７０２）に配置すると、ネットワーク分析器を用いて正確な共鳴が得られる。反射能を監視することによって、反射能が１０ｄＢ低下したとき、正確な周波数を得ることができる。このことが、図１９に示されている。空洞（１７０２）の調整は、マイクロウェーブ空洞（１７０２）の２つの部分の結合を締めることにより、達成することができる。次いでこの周波数が信号発生器に伝送され、当該マイクロ流体装置の最適周波数でマイクロウェーブが発生されるようにしている。
【０１３７】
高度に制御されたマイクロウェーブ加熱と空冷を使用することで、このシステムは、３つの設定温度のいずれにおいても、わずかなオーバーシュート又はアンダーシュートを示した。マイクロウェーブシステムが所望の温度に達すると、変動はわずか±０．１℃であり、このシステムを非常に正確なものとしている。加熱と冷却のランプ速度は、６５℃／秒であり、温度間の非常に速い推移が可能である。図２０は、オシロスコープからの軌跡であり、熱循環プロファイルを拡大して示す。マイクロウェーブシステムは、Ｈｏｔ−Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いて完全なＤＮＡ変性を確実に行うことが不可欠な場合に、初期変性ステップを実行できるよう設計された。また、ＰＣＲ産物の完全なアデニル化が確実に生じることを含む最終伸長ステップも含まれている。両ステップは、シークエンスへ自動化されており、時間と温度の両方に関して制御可能である。
【０１３８】
［概要］
要約すると本発明は、ゲル担持マトリックスからポリマーゲル分離マトリックスへの、ＤＮＡフラグメントのモノリス−ゲル及びゲル−ゲルの動電学的注入の良好な最適化と適用を提供する。溶液系注入を超えたゲル担持注入の制御性、安定性とロバスト性の向上の証拠を示した。更に、本発明は、反応の安定性を長引かせることで知られているゲル担持サンプルマトリックスが、装置の全体の消費電力を損なうことなく、流体装置内で動電学的サンプル注入の操作性と移動性を改良することを示している。
【０１３９】
更に、本発明に係る、ゲルを用いて調整したマイクロ流体装置における泡の形成は、ジュール熱が過剰な溶液系システムで通常観察されるいかなる問題も引き起こさなかった。泡は、注入メカニズムの経路を大幅に変えるが、流れは維持され、注入がなされた。溶液のみの流体システムでは、泡が発生すると、結果として生じる乱流が、電界を中断して、これが注入工程に大きな支障をきたしてしまう。最後に、一のゲルから別のゲルへのＤＮＡフラグメントの移動は、マトリックスインターフェースへのマトリックスの移動によっては影響は受けなかった。それ故、ゲル担持ＤＮＡフラグメントと試薬を有する本発明によるマイクロ流体装置の使用は、従来の技術を超えた上述したようなより多くの利点をもたらす。
【０１４０】
要約すると本発明は、電気浸透流と電気泳動を用いた分析器で使用する特有のゲル系電動学的マイクロ流体装置を提供するものであり、これによって装置内の生体サンプルのＤＮＡフラグメントの抽出、精製、増幅、分離の全てのステップを１つの工程で行うことができる。これは事実上“単一ステップ”デバイスである装置を提供する従来技術と対照的である。更に、本発明のマイクロ流体装置とともに用いる、本発明の完全に一体化された携帯可能な分析器によれば、ＤＮＡ分析の各ステップ間を調整し、より迅速な処理を行うことができる。より大きな装置と比較して速くなった、このような分析器の処理速度は、ＰＣＲステップ中に特に顕著に見られる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一体型ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置において、
増幅チャンバと流体共働すると共に分離及び検出チャネルと流体共働する少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバを形成する複数のマイクロチャネルを有する基体を具え、
前記マイクロチャネルが、前記サンプルの処理に必要なＤＮＡ抽出材料とゲル系反応試薬を含有し、
前記装置が、更に、外部電源に接続するための電気接点を具え、前記装置を通して前記ゲル系試薬と前記サンプルから抽出されたＤＮＡの動電学的操作を生じさせることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記基体が、不活性非導電性材料で形成されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記基体が、ガラス又はガラスに類似するもので形成されていることを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記装置のサイズが、１２０ｍｍ×６０ｍｍの範囲であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記ＤＮＡ抽出材料が、前記ＤＮＡ抽出チャンバに配置された荷電材料であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記ＤＮＡ抽出材料が、前記ＤＮＡ抽出チャンバに配置された固相抽出材料であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記固相抽出材料が、多孔シリカ系固相抽出材料であることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記シリカ系固相抽出材料が、シリカ系モノリスであることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記シリカ系モノリスが、熱開始型シリカ系モノリスであることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバ、増幅チャンバ、分離及び検出チャネルが、その中にゲル系試薬を含んでおり、各々のゲル系試薬は、そこで行われる工程の性質に関連していることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
複数の更なるチャネル、入口ポート、及び出口ポートが、ゲル系試薬の導入又は装置周辺への移動、あるいは除去のために設けられていることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ抽出チャンバが、サンプル導入ポートを具えることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記サンプル導入ポートが、溶解サンプルの導入を提供するサンプル受け取り手段を具えるか、又はサンプル受け取り手段と流体連通していることを特徴とする請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記サンプル受け取り手段が、溶解サンプルがＤＮＡ抽出チャンバ内へ直接導入されるよう構成されていることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記サンプル受け取り手段が、溶解されていない生体サンプルを受け取り、それを溶解し、その溶解サンプルを前記ＤＮＡ抽出チャンバ内へ導入するよう構成されていることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
前記サンプル受け取り手段が、使用時にサンプルを受け取る吸収部材であって、溶解剤が予め充填されており、ＤＮＡ抽出チャンバの導入ポートに流体連通して配置されて、そのように配置されたときにサンプルを受け取り、溶解し、そこへ導入するよう構成されている吸収部材を具えることを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ抽出チャンバが、洗浄入口と、そこに流体連結した洗浄出口とを、具えることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
前記基体が、使用のときまで蓋で密閉されて基体内に画定された内部マイクロチャネルを封入していることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
前記装置が、ゲル内に担持された試薬、溶解サンプルと抽出ＤＮＡ、及びＤＮＡフラグメントを、装置全体で動電学的に操作する複数の電極を具え、これらの電極は一方の端部が前記装置に密閉可能に連結されており、前記装置から離れている電極端部は電源に連結可能であることを特徴とする請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
前記ゲル系反応薬が、光プローブを具えることを特徴とする請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２１】
前記光プローブが、蛍光染料であることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記光プローブが、化学発光染料であることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
生体サンプル中のＤＮＡ分析用携帯可能な一体型の分析システムであって、前記サンプルからのＤＮＡフラグメントの抽出と精製、増幅、分離及び分析を行う動電学的駆動システムを具える分析システムにおいて、
前記分析システムが更に、溶解チャンバ及び増幅チャンバと流体共働すると共に分離及び検出チャネルと流体共働する少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバを形成する複数のマイクロチャネルを有する基体を具える、ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置を具え、
前記マイクロ流体装置内に配置され、電源に接続された複数の電極であって、前記マイクロ流体装置の周囲でゲル系試薬とＤＮＡとＤＮＡフラグメントを動電学的に操作するよう構成された電極を具え、前記マイクロ流体装置は前記ＤＮＡ抽出チャンバを介して前記サンプルを受け取るよう構成されており、この分析システムが更に、前記マイクロ流体サンプル処理装置に連結又は隣接した発熱体を具えるサンプル処理装置と、
検出可能な信号によりＤＮＡフラグメントを検出するように配置された検出器と、
前記マイクロ流体装置、前記動電学的駆動システム、前記検出器及び前記電源を収納するよう構成された携帯可能なハウジングと、を具えることを特徴とする分析システム。
【請求項２４】
前記発熱体が、非接触式の発熱体であることを特徴とする請求項２３に記載の分析システム。
【請求項２５】
前記発熱体が、マイクロウェーブ放射線源を具えることを特徴とする請求項２４に記載の分析システム。
【請求項２６】
前記ＤＮＡの検出可能な信号をグラフ形式で表示する出力手段を更に具えることを特徴とする請求項２３乃至２５のいずれか１項に記載の分析システム。
【請求項２７】
ＤＮＡ分析の方法において、
ａ）分析システムに配置されたゲル系マイクロ流体サンプル処理装置のＤＮＡ抽出チャンバへサンプルを導入するステップと、
ｂ）ＤＮＡを抽出するために前記ＤＮＡ抽出チャンバ内で前記サンプルの動電学的な操作を行うステップと、
ｃ）前記ＤＮＡ抽出チャンバ内のＤＮＡを前記増幅チャンバへ動電学的に溶出させるステップと、
ｄ）前記増幅チャンバ内のＤＮＡを増幅してゲル内で増幅産物を形成するステップと、
ｅ）前記増幅産物を分離チャネルに動電学的に注入するステップと、
ｆ）前記増幅産物を動電学的に分離してＤＮＡプロファイルを形成するステップと、
を具えることを特徴とするＤＮＡ分析の方法。
【請求項２８】
前記サンプルを、前記ＤＮＡ抽出チャンバに導入する前に溶解することを特徴とする請求項２７に記載の分析方法。
【請求項２９】
前記サンプルを、前記装置に導入する前に溶解することを特徴とする請求項２８に記載の分析方法。
【請求項３０】
前記サンプルを、カオトロピック塩溶液中で前記装置に導入することを特徴とする請求項２９に記載の分析方法。
【請求項３１】
サンプル溶解ステップが、前記装置で又は前記装置上で行われることを特徴とする請求項２８に記載の分析方法。
【請求項３２】
溶解剤を充填した吸収部材を提供するステップと、
生体細胞の非溶解サンプルを前記吸収部材に適用するステップと、
前記ＤＮＡ抽出チャンバと流体連通するサンプル受け取り部位に、前記吸収部材を適用及び／又は保持して、その中に前記溶解サンプルを導入するステップと、
により前記サンプルを導入することを特徴とする請求項３１に記載の分析方法。
【請求項３３】
前記増幅チャンバへの前記ＤＮＡ抽出チャンバ内の前記ＤＮＡの溶出が、動電学的操作により行われることを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３４】
前記サンプルを、前記ＤＮＡ抽出チャンバの洗浄入口から洗浄出口まで洗浄溶液を移動させることにより電動学的に精製することを特徴とする請求項２７乃至３３のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３５】
前記ＤＮＡチャンバ内の前記サンプルの前記動電学的操作を、前記サンプルを電気浸透的操作手段により行うことを特徴とする請求項２７乃至３４のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３６】
前記ＤＮＡフラグメントの増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことを特徴とする請求項２７乃至３５のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３７】
前記増幅産物の前記動電学的な分離を、電気泳動的分離によって行うことを特徴とする請求項２７乃至３６のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡプロファイルの検出ステップと検出信号を出力手段へ送信するステップを更に具え、前記プロファイルをグラフで見ることができることを特徴とする請求項２７乃至３７のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３９】
前記プロファイルと既知のプロファイルとを比較するステップを更に含むことを特徴とする請求項３８に記載の分析方法。
【請求項４０】
図３、４、１０及び１１に関連し実質的に説明されている、ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置。
【請求項４１】
図１と２に関連し実質的に説明されている、携帯可能で一体型の生体サンプルのＤＮＡの分析システム。
【請求項４２】
実施例に関連し実質的に説明されている、ＤＮＡ分析方法。
【請求項１】
一体型ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置において、
増幅チャンバと流体共働すると共に分離及び検出チャネルと流体共働する少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバを形成する複数のマイクロチャネルを有する基体を具え、
前記マイクロチャネルが、前記サンプルの処理に必要なＤＮＡ抽出材料とゲル系反応試薬を含有し、
前記装置が、更に、外部電源に接続するための電気接点を具え、前記装置を通して前記ゲル系試薬と前記サンプルから抽出されたＤＮＡの動電学的操作を生じさせることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記基体が、不活性非導電性材料で形成されていることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記基体が、ガラス又はガラスに類似するもので形成されていることを特徴とする請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記装置のサイズが、１２０ｍｍ×６０ｍｍの範囲であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記ＤＮＡ抽出材料が、前記ＤＮＡ抽出チャンバに配置された荷電材料であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記ＤＮＡ抽出材料が、前記ＤＮＡ抽出チャンバに配置された固相抽出材料であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
前記固相抽出材料が、多孔シリカ系固相抽出材料であることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記シリカ系固相抽出材料が、シリカ系モノリスであることを特徴とする請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記シリカ系モノリスが、熱開始型シリカ系モノリスであることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバ、増幅チャンバ、分離及び検出チャネルが、その中にゲル系試薬を含んでおり、各々のゲル系試薬は、そこで行われる工程の性質に関連していることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
複数の更なるチャネル、入口ポート、及び出口ポートが、ゲル系試薬の導入又は装置周辺への移動、あるいは除去のために設けられていることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ抽出チャンバが、サンプル導入ポートを具えることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記サンプル導入ポートが、溶解サンプルの導入を提供するサンプル受け取り手段を具えるか、又はサンプル受け取り手段と流体連通していることを特徴とする請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記サンプル受け取り手段が、溶解サンプルがＤＮＡ抽出チャンバ内へ直接導入されるよう構成されていることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記サンプル受け取り手段が、溶解されていない生体サンプルを受け取り、それを溶解し、その溶解サンプルを前記ＤＮＡ抽出チャンバ内へ導入するよう構成されていることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
前記サンプル受け取り手段が、使用時にサンプルを受け取る吸収部材であって、溶解剤が予め充填されており、ＤＮＡ抽出チャンバの導入ポートに流体連通して配置されて、そのように配置されたときにサンプルを受け取り、溶解し、そこへ導入するよう構成されている吸収部材を具えることを特徴とする請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ抽出チャンバが、洗浄入口と、そこに流体連結した洗浄出口とを、具えることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
前記基体が、使用のときまで蓋で密閉されて基体内に画定された内部マイクロチャネルを封入していることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
前記装置が、ゲル内に担持された試薬、溶解サンプルと抽出ＤＮＡ、及びＤＮＡフラグメントを、装置全体で動電学的に操作する複数の電極を具え、これらの電極は一方の端部が前記装置に密閉可能に連結されており、前記装置から離れている電極端部は電源に連結可能であることを特徴とする請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
前記ゲル系反応薬が、光プローブを具えることを特徴とする請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２１】
前記光プローブが、蛍光染料であることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記光プローブが、化学発光染料であることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
生体サンプル中のＤＮＡ分析用携帯可能な一体型の分析システムであって、前記サンプルからのＤＮＡフラグメントの抽出と精製、増幅、分離及び分析を行う動電学的駆動システムを具える分析システムにおいて、
前記分析システムが更に、溶解チャンバ及び増幅チャンバと流体共働すると共に分離及び検出チャネルと流体共働する少なくとも一のＤＮＡ抽出チャンバを形成する複数のマイクロチャネルを有する基体を具える、ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置を具え、
前記マイクロ流体装置内に配置され、電源に接続された複数の電極であって、前記マイクロ流体装置の周囲でゲル系試薬とＤＮＡとＤＮＡフラグメントを動電学的に操作するよう構成された電極を具え、前記マイクロ流体装置は前記ＤＮＡ抽出チャンバを介して前記サンプルを受け取るよう構成されており、この分析システムが更に、前記マイクロ流体サンプル処理装置に連結又は隣接した発熱体を具えるサンプル処理装置と、
検出可能な信号によりＤＮＡフラグメントを検出するように配置された検出器と、
前記マイクロ流体装置、前記動電学的駆動システム、前記検出器及び前記電源を収納するよう構成された携帯可能なハウジングと、を具えることを特徴とする分析システム。
【請求項２４】
前記発熱体が、非接触式の発熱体であることを特徴とする請求項２３に記載の分析システム。
【請求項２５】
前記発熱体が、マイクロウェーブ放射線源を具えることを特徴とする請求項２４に記載の分析システム。
【請求項２６】
前記ＤＮＡの検出可能な信号をグラフ形式で表示する出力手段を更に具えることを特徴とする請求項２３乃至２５のいずれか１項に記載の分析システム。
【請求項２７】
ＤＮＡ分析の方法において、
ａ）分析システムに配置されたゲル系マイクロ流体サンプル処理装置のＤＮＡ抽出チャンバへサンプルを導入するステップと、
ｂ）ＤＮＡを抽出するために前記ＤＮＡ抽出チャンバ内で前記サンプルの動電学的な操作を行うステップと、
ｃ）前記ＤＮＡ抽出チャンバ内のＤＮＡを前記増幅チャンバへ動電学的に溶出させるステップと、
ｄ）前記増幅チャンバ内のＤＮＡを増幅してゲル内で増幅産物を形成するステップと、
ｅ）前記増幅産物を分離チャネルに動電学的に注入するステップと、
ｆ）前記増幅産物を動電学的に分離してＤＮＡプロファイルを形成するステップと、
を具えることを特徴とするＤＮＡ分析の方法。
【請求項２８】
前記サンプルを、前記ＤＮＡ抽出チャンバに導入する前に溶解することを特徴とする請求項２７に記載の分析方法。
【請求項２９】
前記サンプルを、前記装置に導入する前に溶解することを特徴とする請求項２８に記載の分析方法。
【請求項３０】
前記サンプルを、カオトロピック塩溶液中で前記装置に導入することを特徴とする請求項２９に記載の分析方法。
【請求項３１】
サンプル溶解ステップが、前記装置で又は前記装置上で行われることを特徴とする請求項２８に記載の分析方法。
【請求項３２】
溶解剤を充填した吸収部材を提供するステップと、
生体細胞の非溶解サンプルを前記吸収部材に適用するステップと、
前記ＤＮＡ抽出チャンバと流体連通するサンプル受け取り部位に、前記吸収部材を適用及び／又は保持して、その中に前記溶解サンプルを導入するステップと、
により前記サンプルを導入することを特徴とする請求項３１に記載の分析方法。
【請求項３３】
前記増幅チャンバへの前記ＤＮＡ抽出チャンバ内の前記ＤＮＡの溶出が、動電学的操作により行われることを特徴とする請求項２７乃至３２のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３４】
前記サンプルを、前記ＤＮＡ抽出チャンバの洗浄入口から洗浄出口まで洗浄溶液を移動させることにより電動学的に精製することを特徴とする請求項２７乃至３３のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３５】
前記ＤＮＡチャンバ内の前記サンプルの前記動電学的操作を、前記サンプルを電気浸透的操作手段により行うことを特徴とする請求項２７乃至３４のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３６】
前記ＤＮＡフラグメントの増幅を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うことを特徴とする請求項２７乃至３５のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３７】
前記増幅産物の前記動電学的な分離を、電気泳動的分離によって行うことを特徴とする請求項２７乃至３６のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡプロファイルの検出ステップと検出信号を出力手段へ送信するステップを更に具え、前記プロファイルをグラフで見ることができることを特徴とする請求項２７乃至３７のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３９】
前記プロファイルと既知のプロファイルとを比較するステップを更に含むことを特徴とする請求項３８に記載の分析方法。
【請求項４０】
図３、４、１０及び１１に関連し実質的に説明されている、ゲル系マイクロ流体サンプル処理装置。
【請求項４１】
図１と２に関連し実質的に説明されている、携帯可能で一体型の生体サンプルのＤＮＡの分析システム。
【請求項４２】
実施例に関連し実質的に説明されている、ＤＮＡ分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７ａ】
【図１７ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８ａ】
【図８ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２ａ】
【図１２ｂ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７ａ】
【図１７ｂ】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１２−５０４９５２（Ｐ２０１２−５０４９５２Ａ）
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３０５７８（Ｐ２０１１−５３０５７８）
【出願日】平成２１年１０月１２日（２００９．１０．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５１３６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４１０８８
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５１１０８９５５０）ユニバーシティー オブ ハル (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＨＵＬＬ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１２日（２００９．１０．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００９／０５１３６０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４１０８８
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５１１０８９５５０）ユニバーシティー オブ ハル (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＨＵＬＬ
【Ｆターム（参考）】
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