サーモビフィダ・フスカのリパーゼを含む洗剤組成物、及びその使用方法
本発明の組成物及び方法は、サーモビフィダ・フスカからクローニングされたリパーゼ、そのリパーゼをコードするポリヌクレオチド、及びそれらの使用方法に関する。本組成物及び方法は、洗剤洗浄用組成物及び方法において特に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年１２月２１日出願の米国特許仮出願第６１／２８８，６６６号、及び２０１０年６月２日出願の同第６１／３５０，７４７号に基づく優先権を主張するものであり、これらの出願をいずれもその全容にわたって本出願に援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の組成物及び方法は、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）からクローニングされたリパーゼ、そのリパーゼをコードしたポリヌクレオチド、及びそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在の洗濯洗剤及び／又は衣類ケア組成物は、界面活性剤、酵素（プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、及び／又はセルラーゼ）、漂白剤、ビルダーシステム、泡抑制剤、汚れ懸濁剤、汚れ放出剤、蛍光増白剤、柔軟剤、分散剤、移染防止化合物、研磨剤、殺菌剤、及び香料などの複雑な有効成分の組み合わせを含んでいる。
【０００４】
トリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成することによって油性の染みを除去するため、リパーゼ及びクチナーゼなどの脂肪分解酵素が洗剤洗浄組成物中に使用されてきた。しかしながら、これらの酵素は、洗浄組成物中に存在する界面活性剤及び他の成分によってしばしば阻害され、油性の染みを除去する性能が妨げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、洗浄組成物の過酷な環境中で機能しうるリパーゼ及びクチナーゼが求められている。
【０００６】
また、バイオ燃料、潤滑剤、及び他の合成及び半合成炭化水素の製造におけるエステル交換反応を行ううえで、よりロバストかつ効果的なリパーゼ及びクチナーゼが求められている。こうした酵素は、天然又は一般的に入手可能な開始物質を用いるものであることが好ましく、また、合成を複雑なものとし、毒性廃棄物質の生成につながる合成反応における保護及び脱保護工程を必要としないものであることが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の組成物及び方法は、サーモビフィダ・フスカからクローニングされたリパーゼ２（ＴｆｕＬｉｐ２）に関する。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２は３残基（ＡＧＫ）のアミノ末端延長部を有する。
【０００８】
本開示の一態様では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と８０％〜９９％同一（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一）である。更なる実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは所定のアミノ末端延長部を有する。いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）内で発現させられる。本開示は更に、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを、プロモーターと協働可能な組み合わせでコードしたポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【０００９】
本開示の好ましい一態様では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む洗剤組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）である。更なる実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は界面活性剤（イオン性又は非イオン性）を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、Ｃ１２〜１４パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス硫酸ナトリウム、Ｃ１４〜１５パレス−４からなる群の１以上のものを含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤はイオン性界面活性剤を含む。いくつかの好ましい実施形態では、イオン性界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、洗剤は８．０〜１０．０のｐＨで配合される。いくつかの実施形態では、洗剤は、洗濯洗い用洗剤、食器用洗剤、及び硬質表面洗浄用洗剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、洗剤は、液体、粉末、粒状固形物、及び錠剤からなる群から選択される形態である。特定の好ましい実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、３０℃〜４０℃の温度で洗剤中で酵素活性を有する。
【００１０】
別の態様では、サーモビフィダ・フスカから得られるリパーゼと、界面活性剤とを含む洗剤組成物であって、洗浄しようとする表面から油性の染みを除去するうえで、そのリパーゼを含まない同等の洗剤組成物よりも効果的である洗剤組成物が提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、リパーゼはＴｆｕＬｉｐ２リパーゼである。いくつかの実施形態では、リパーゼは、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リパーゼは、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、リパーゼは組換えリパーゼである。いくつかの実施形態では、リパーゼはバチルス内で発現される組換えリパーゼである。いくつかの実施形態では、リパーゼはバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）内で発現される組換えリパーゼである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、界面活性剤はイオン性又は非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１以上の界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、Ｃ１２〜１４パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス硫酸ナトリウム、及びＣ１４〜１５パレス−４からなる群から選択される１以上の界面活性剤を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、約８．０〜約１０．０のｐＨで配合される。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、約８．２〜約１０．０のｐＨで配合される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、洗濯洗剤、食器洗い用洗剤、及び硬質表面洗浄用洗剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、洗剤組成物の形態は、液体、粉末、粒状固形物、及び錠剤からなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、約３０℃〜約４０℃の温度で脂質を加水分解するうえで効果的である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、サーモビフィダ・フスカのリパーゼの代わりにシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）のリパーゼ変異体Ｍ２１Ｌ（ＬＩＰＯＭＡＸ（商標））を含む同等の洗剤組成物と比較して、Ｃ４〜Ｃ１６の基質を加水分解するうえでより効果的である。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、特定の鎖長を有する基質に対する選択性がより低いことから、Ｃ４〜Ｃ１６の範囲の基質を加水分解するうえでより効果的である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は更にプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は更にサブチリシンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、サーモビフィダ・フスカリパーゼの安定性は、サーモビフィダ・フスカリパーゼの代わりにサーモマイセス・ラヌギノーサ（Thermomyces lanuginosus）のＬｉｐ３リパーゼ（ＬＩＰＥＸ（登録商標））を含む同等の洗剤組成物中におけるサーモマイセス・ラヌギノーサＬｉｐ３リパーゼの安定性よりも高い。いくつかの実施形態では、リパーゼの安定性は最終的な洗浄媒質中で測定される。
【００１９】
別の態様では、表面の汚れ又は染み中に存在する脂質を加水分解する方法であって、前記表面を、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド及び界面活性剤を含む洗剤組成物と接触させる工程を含む方法が提供される。上記の段落、説明文、及び実施例の洗剤組成物はこの目的に適している。
【００２０】
更なる態様では、エステル交換反応を行うための方法であって、ドナー分子を、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物と接触させる工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ドナー分子はＣ４〜１６の炭素鎖を有する。好ましい一実施形態では、ドナー分子はＣ８の炭素鎖を有する。
【００２１】
ＴｆｕＬｉｐ２組成物及び方法のこれらの態様並びに他の態様は、以下の説明より明らかとなるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｉ．序論
以下に、サーモビフィダ・フスカよりクローニングされたリパーゼ（ＴｆｕＬｉｐ２）に関連する組成物及び方法について述べる。当該組成物及び方法は、クローニング及び発現されたＴｆｕＬｉｐ２が、洗剤組成物の存在下でカルボン酸エステル加水分解酵素の活性を有するという観察に一部基づいたものである。ＴｆｕＬｉｐ２はまた、洗剤組成物中でプロテアーゼが存在する場合であっても優れた安定性を示す。これらの特徴のため、ＴｆｕＬｉｐ２は様々な洗浄用途における使用に極めて適したものであり、この酵素は、洗剤組成物中に見出される界面活性剤及び他の成分の存在下で脂質を加水分解することができる。
【００２３】
ＴｆｕＬｉｐ２は様々な天然及び合成基質に対して活性を示すが、この酵素はＣ４〜Ｃ１６の基質に対して選択性を示し、Ｃ８の基質に対してピーク活性を示すことが分かっている。この特異性のため、ＴｆｕＬｉｐ２は、短鎖トリグリセリドの加水分解、及び短鎖脂肪酸が関与するエステル交換反応を行ううえで極めて適したものである。
【００２４】
ＩＩ．用語の定義
本発明の組成物及び方法を詳細に述べるのに先立って、理解を助けるため、以下の用語を定義する。定義されない用語及び略語は、当該技術分野において用いられるそれらの通常の意味を有するものとする。
【００２５】
本明細書において使用するところの「カルボン酸エステル加水分解酵素」（Ｅ．Ｃ．３．１．１）とは、カルボン酸エステルに作用する酵素のことを指す。
【００２６】
本明細書において使用するところの「リパーゼ」、「リパーゼ酵素」、「脂肪分解酵素」、「脂肪分解ポリペプチド」、又は「脂肪分解タンパク質」とは、トリグリセリド又はリン脂質の分解能などの脂質分解能を示す酵素、ポリペプチド、又はタンパク質のことを指す。脂肪分解酵素は、例えばリパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ又はクチナーゼであってよい。本明細書において使用するところの脂肪分解活性とは、当該技術分野では周知の任意の方法によって測定することができる（例えば、Ｇｕｐｔａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７：６３〜７１，２００３、米国特許第５，９９０，０６９号、及び国際特許出願公開第９６／１８７２９Ａ１号を参照）。
【００２７】
本明細書において使用するところの「脂肪酸」なる用語は、動物性又は植物性の油脂から誘導されるか、又は油脂中に含有されるカルボン酸のことを指す。脂肪酸は、一般的に４〜２２個の炭素原子を有し、末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）によって特徴づけられるアルキル基の鎖で構成される。脂肪酸は、飽和又は不飽和であってよく、固体、半固体、又は液体であってよい。
【００２８】
本明細書において使用するところの「トリグリセリド」なる用語は、脂肪酸とグリセロールとの天然に存在する任意のエステルのことを指す。トリグリセリドは油脂の主成分である。トリグリセリドは、ＣＨ２（ＯＯＣＲ１）ＣＨ（ＯＯＣＲ２）ＣＨ２（ＯＯＣＲ３）の一般式を有し、ただしＲ１、Ｒ２、及びＲ３は異なる鎖長であってよい。
【００２９】
本明細書において使用するところの「アシル」とは、カルボン酸から−ＯＨ基を除くことによって一般的に得られる有機酸基（ＲＣＯ−）の一般的名称である。
【００３０】
本明細書において使用するところの「アシル化」なる用語は、通常は分子の−ＯＨ基の側にアシル基を置換／付加する化学変換のことを指す。
【００３１】
本明細書において使用するところの「アシル鎖基質」とは、カルボン酸エステル加水分解酵素（例えば、クチナーゼ、リパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、トランスフェラーゼなど）に対するドナー分子である。基質はその炭素鎖長によって記述することができる。例えば、Ｃ４基質／ドナーは炭素４個の鎖長を有し、Ｃ８基質／ドナーは炭素８個の鎖長を有する、といった具合である。
【００３２】
本明細書において使用するところの「トランスフェラーゼ」なる用語は、基質への分子又は基（例えばアシル基）の転移を触媒する酵素のことを指す。
【００３３】
本明細書において使用するところの「脱離基」とは、別の求核物質による置換によってアシルドナーから開裂する求核物質のことを指す。
【００３４】
本明細書において使用するところの「洗剤安定性」なる語句は、洗剤組成物混合物中の特定の洗剤組成物成分（加水分解酵素など）の安定性のことを指す。代表的な加水分解酵素はプロテアーゼであり、安定性は、プロテアーゼによる加水分解に対するリパーゼの耐性のことを指しうる。本発明のリパーゼの安定性は、本明細書において述べる標準的な、例えばＬＩＰＯＭＡＸ（商標）又はＬＩＰＥＸ（商標）などの市販のリパーゼの安定性と比較することができる。
【００３５】
本明細書において使用するところの「ペルヒドロラーゼ」とは、洗浄、漂白、及び消毒などの用途に適した過酸を生成する反応を触媒する能力を有する酵素である。
【００３６】
本明細書において使用するところの、「水性組成物」及び「水性環境」といった語句で用いられる「水性」なる用語は、少なくとも５０％が水で構成された組成物のことを指す。水性組成物は、少なくとも５０％の水、少なくとも６０％の水、少なくとも７０％の水、少なくとも８０％の水、少なくとも９０％の水、少なくとも９５％の水、少なくとも９７％の水、少なくとも９９％の水、又は更には少なくとも９９％の水を含みうる。
【００３７】
本明細書において使用するところの「界面活性剤」なる用語は、当該技術分野において、界面活性作用を有するものとして一般的に認識されている任意の化合物のことを指す。界面活性剤には一般的に、アニオン性、カチオン性、非イオン性、及び両性イオン性化合物が含まれるが、これらについては更に後述する。
【００３８】
本明細書において使用するところの「表面特性」とは、静電荷に関連して、また、タンパク質の表面が示す疎水性及び親水性のような性質に関連して用いられる。
【００３９】
「酸化安定性」なる用語は、例えば漂白剤又は酸化合物剤に曝露又は接触させられる際に、脂肪分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書において開示される他のプロセスにおいて、優勢な条件下で一定の時間にわたって所定量の酵素活性を維持する本開示のリパーゼのことを指す。いくつかの実施形態では、当該リパーゼは、所定の時間、例えば少なくとも約１分、約３分、約５分、約８分、約１２分、約１６分、約２０分といった時間にわたって漂白剤又は酸化剤に接触させられた後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の脂肪分解活性を維持する。
【００４０】
「キレート化剤安定性」なる用語は、例えばキレート化剤に曝露又は接触させられる際に、脂肪分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書において開示される他のプロセスにおいて、優勢な条件下で一定の時間にわたって所定量の酵素活性を維持する本開示のリパーゼのことを指す。いくつかの実施形態では、当該リパーゼは、所定の時間、例えば少なくとも約１０分、約２０分、約４０分、約６０分、約１００分といった時間にわたってキレート化剤に接触させられた後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の脂肪分解活性を維持する。
【００４１】
「熱安定性」及び「熱安定的」なる用語は、例えば温度変化に曝される際に、脂肪分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書において開示される他のプロセスにおいて優勢な条件下で一定の時間にわたって特定の温度に曝された後、所定量の酵素活性を維持する本開示のリパーゼのことを指す。温度変化には、温度の上昇、又は低下が含まれる。いくつかの実施形態では、当該リパーゼは、所定の時間、例えば少なくとも約６０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約３００分といった時間にわたって温度変化に曝された後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の脂肪分解活性を維持する。
【００４２】
「洗浄活性」なる用語は、脂肪分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書において開示される他のプロセスにおいて、優勢な条件下で当該リパーゼによって得られる洗浄性能のことを指す。いくつかの実施形態では、洗浄性能は、例えば、草、血液、ミルク、又は卵のタンパク質などの酵素感受性の染みを標準的な洗浄条件に供した後、各種のクロマトグラフィー、分光光度法又は他の定量的方法によって測定されるように、こうした染みについて各種の洗浄アッセイを適用することによって測定される。代表的なアッセイには、これらに限定されるものではないが、国際特許出願公開第９９／３４０１１号及び米国特許第６，６０５，４５８号（これらをいずれも本願に援用する）に述べられるもの、並びに実施例に含まれる方法がある。
【００４３】
リパーゼの「洗浄有効量」なる用語は、特定の洗浄組成物中の所望の酵素活性のレベルを実現する上記に述べたリパーゼの量のことを指す。このような有効量は当業者によって容易に求められるものであり、使用される特定のリパーゼ、洗浄用途、洗浄組成物の特定の組成、及び、液体又は乾燥（例えば、粒状、バー）組成物のいずれが必要とされるか、といった多くの因子に基づいている。
【００４４】
本明細書において使用するところの「洗浄添加物質」なる用語は、所望の洗浄組成物の具体的な種類、及び製品の形態（例えば、液体、顆粒、粉末、バー、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、又はフォーム組成物）に対して選択される任意の液体、固体又は気体状物質を意味し、これらの物質はまた、組成物中に用いられるリパーゼ酵素と適合性を有することが好ましい。いくつかの実施形態では、粒状組成物は「圧縮」形態であり、他の実施形態では、液体組成物は「濃縮」形態である。
【００４５】
本明細書において使用するところの「洗浄組成物」及び「洗浄配合物」とは、衣類、食器、コンタクトレンズ、他の固体表面、毛髪、皮膚、歯などの洗浄しようとする物品からの望ましくない化合物（例えば、汚れ又は染み）の除去において有用な化学成分の混合物のことを指す。当該組成物又は配合物は、洗浄しようとする表面、物品又は衣類、及び組成物又は配合物の所望の形態に応じて、液体、ゲル、顆粒、粉末、又はスプレーの形態であってよい。
【００４６】
本明細書において使用するところの「洗剤組成物」及び「洗剤配合物」なる用語は、汚れた対象物の洗浄用の洗浄媒質中での使用を目的とした化学成分の混合物のことを指す。洗剤組成物／配合物は一般的に少なくとも１種類の界面活性剤を含み、更に必要に応じて、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤及び蛍光染料、凝固防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、酸化防止剤、及び可溶化剤が含まれる。
【００４７】
本明細書において使用するところの「食器洗い用組成物」とは、粒子及び液体状形態を含むがこれらに限定されない、カトラリー類を含む食器を洗浄するための組成物のあらゆる形態のことを指す。いくつかの実施形態では、食器洗い用組成物は、自動食器洗い機において有用な「自動食器洗い用」組成物である。本開示が任意の特定の種類又は食器用組成物に限定されることは意図するところではない。実際、本開示は、セラミック、プラスチック、金属、陶磁器、ガラス、アクリルなどを含むがこれらに限定されない任意の材料の食器（例えば、プレート、カップ、グラス、ボールなどを含むがこれらに限定されない皿類）及びカトラリー（例えば、スプーン、ナイフ、フォーク、給仕器具などの器具）の洗浄において有用なものである。「食器」なる用語は、本明細書においては皿類及びカトラリー類の両方を指して用いられる。
【００４８】
本明細書において使用するところの「漂白」なる用語は、材料（例えば、衣類、洗濯物、パルプなど）の光沢化（すなわち増白）及び／又は洗浄を行ううえで充分な長さの時間、かつ適当なｐＨ及び温度条件下で行われる材料又は表面の処理のことを指す。漂白に適した化学物質の例としては、これらに限定されるものではないが、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２などが挙げられる。
【００４９】
本明細書において使用するところの変異型リパーゼの「洗浄性能」とは、組成物に変異型リパーゼを加えることなく洗剤に更なる洗浄性能を与える、洗浄に対する変異型リパーゼの寄与のことを指す。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。
【００５０】
「関連する洗浄条件」なる用語は、本明細書においては、特に、食器又は洗濯洗剤市場区分において家庭で実際に使用される洗浄温度、時間、洗浄力学、泡濃度（sud concentration）、洗剤の種類及び水の硬度といった条件を示す。
【００５１】
本明細書において使用するところの「消毒」なる用語は、物品の表面上の微生物の阻害又は殺滅のことを指す。本開示が、特定の表面、物品、又は除去しようとする汚染物質若しくは微生物に限定されることは意図するところではない。
【００５２】
本明細書における洗浄組成物の「圧縮」形態とは、密度に最もよく反映され、組成物の観点からは無機充填剤塩の量に反映される。無機充填剤塩は、粉末形態の洗剤組成物の従来の成分である。従来の洗剤組成物では、充填剤塩は、相当量、通常は全組成物の約１７〜約３５重量％の量で存在する。これに対して圧縮組成物では、充填剤塩は全組成物の約１５％以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、充填剤塩は、組成物の約１０重量％以下、又はより好ましくは約５重量％以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、無機充填剤塩は、硫酸塩及び塩酸塩のアルカリ及びアルカリ土類金属塩から選択される。いくつかの実施形態では、好ましい充填剤塩は硫酸ナトリウムである。
【００５３】
本明細書において使用するところの「織物」又は「織物材料」なる用語は、織布、並びに紡糸、織物、編物、及び不織布への転換又はそれらとしての使用に適したステープルファイバー及びフィラメントのことを指す。この用語には、天然及び合成（例えば製造された）繊維から製造される紡糸が含まれる。
【００５４】
本明細書において使用するところの「精製された」又は「単離された」なる用語は、タンパク質、核酸、脂質、媒質成分などの他の分子からＴｆｕＬｉｐ２などの対象とする分子を物理的に分離することを指す。対象とする分子は、精製又は単離後には、試料中の物質の全体量の少なくとも５０％、及び更には少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上を占めうる（重量／重量）。
【００５５】
本明細書において使用するところの「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して連結された複数の連続したアミノ酸残基を有する分子のことを指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換可能に用いられる。タンパク質は必要に応じて修飾される（例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化、ファルネシル化、プレニル化、スルホン化など）ことによって、官能基が付加されてもよい。このようなアミノ酸配列が活性を示す場合、これらのアミノ酸配列を「酵素」と呼ぶことができる。アミノ酸配列は標準的なアミノ末端からカルボキシ末端に向かう方向で示し（すなわちＮ→Ｃ）、従来のアミノ酸残基の１文字又は３文字の略号を使用する。
【００５６】
「ポリヌクレオチド」なる用語には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ２本鎖、及びポリペプチドをコードすることが可能な合成分子が含まれる。核酸は１本鎖又は２本鎖であってよく、化学修飾されてもよい。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換可能に用いられる。遺伝子コードは縮重性であるため、特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンが用いられうるものであり、本発明の組成物及び方法には、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる。特に断らないかぎり、核酸配列は５’から３’末端に向かう方向で示される。
【００５７】
本明細書において使用するところの「野生型」及び「天然型」なる用語は、自然界で見出されるポリペプチド又はポリヌクレオチドのことを指す。
【００５８】
ポリペプチドに関し、「野生型」、「親の」、又は「参照」なる用語は、１以上のアミノ酸位置において人工的な置換、挿入、又は欠失を有さない、天然型ポリペプチドのことを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関し、「野生型」、「親の」、又は「参照」なる用語は、人工的なヌクレオシドの変化を有さない、天然型ポリヌクレオチドのことを指す。しかしながら、野生型、親の又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは天然型ポリヌクレオチドに限定されるわけではなく、野生型、親の又は参照ポリペプチドをコードするあらゆるポリヌクレオチドが含まれる。
【００５９】
本明細書において使用するところの「変異型ポリペプチド」とは、通常は組換えＤＮＡ技術によって、１以上のアミノ酸の置換、付加、又は欠失により親（又は参照）ポリペプチドから誘導されるポリペプチドのことを指す。変異型ポリペプチドは、親ポリペプチドと小数のアミノ酸残基だけ異なりうるものであり、親ポリペプチドとの一次アミノ酸配列の相同性／同一性のレベルによって定義される。好ましくは、変異型ポリペプチドは、親ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％のアミノ酸配列の同一性を有する。
【００６０】
配列同一性は、標準的なパラメータを用いてＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、及びＣＬＵＳＴＡＬなどの既知のプログラムによって求めることができる。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５；Ｋａｒｉｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３；及び、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７〜２４４を参照）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。更に、ＦＡＳＴＡを用いてデータベースを検索することが可能である（Ｐｅａｒｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４〜２４４８）。２つのポリペプチドがほぼ一致することを示すものとして、第１のポリペプチドは第２のポリペプチドとの免疫交差反応性を示すことがある。一般的に、保存的なアミノ酸置換において異なるポリペプチド同士は、免疫交差反応性を示す。したがって、あるポリペプチドは第２のポリペプチドと、例えば２つのペプチド同士が保存的置換のみにおいて異なる場合にほぼ同一である。
【００６１】
本明細書において使用するところの「変異型ポリヌクレオチド」とは、変異型ポリペプチドをコードするか、親ポリヌクレオチドと特定の程度の相同性／同一性を有するか、あるいは、親ポリヌクレオチド又はその相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。好ましくは、変異型ポリヌクレオチドは、親ポリヌクレオチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％のヌクレオチド配列の同一性を有する。一致率（％）を求めるための方法は当該技術分野では周知のものであり、直前に述べたとおりである。
【００６２】
「〜から誘導される」なる用語は、「〜を由来とする」、「〜から得られる」、「〜から得ることが可能な」、「〜から単離される」、及び「〜から生成される」という用語を含み、ある特定の物質の起源が別の特定の物質にあるか、又はある特定の物質が別の特定の物質に関連して述べられる特徴を有することを一般的に示す。
【００６３】
本明細書において使用するところの「ハイブリダイゼーション」なる用語は、当該技術分野では周知のように、核酸の鎖が塩基の対合を介して相補鎖と結合するプロセスのことを指す。
【００６４】
本明細書において使用するところの「ハイブリダイゼーション条件」なる語句とは、ハイブリダイゼーション反応が行われる条件のことを指す。これらの条件は、ハイブリダイゼーションが測定される条件の「ストリンジェンシー」の程度によって一般的に分類される。ストリンジェンシーの程度は、例えば、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいたものでありうる。例えば一般的に、「最大のストリンジェンシー」は約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５°低い温度）で、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０°低い温度で、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０°低い温度で、「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５°低い温度で起こる。これに代えるかあるいはこれに加えて、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション及び／又は１回以上のストリンジェンシー洗浄の塩又はイオン強度条件に基づいたものであってもよく、例えば、６×ＳＳＣ＝極めて低いストリンジェンシー、３×ＳＳＣ＝低〜中度のストリンジェンシー、１×ＳＳＣ＝中度のストリンジェンシー、及び０．５×ＳＳＣ＝高ストリンジェンシーである。機能的には、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する核酸配列を特定するためには最大のストリンジェンシー条件を用いることが可能であるのに対して、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列を特定するためには高ストリンジェンシー条件が用いられる。高い選択性が求められる用途では、比較的ストリンジェントな条件を用いてハイブリッドを形成させることが一般的に望ましい（例えば、比較的低い塩濃度及び／又は高い温度条件が用いられる）。本明細書において使用するところのストリンジェントな条件とは、５０℃で０．２×ＳＳＣとして定義される（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ ７．０）。
【００６５】
少なくとも２個の核酸又はポリペプチドとの関連で「ほぼ同様」及び「ほぼ同一」なる語句は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、親配列又は参照配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むか、官能性を付与することなく本開示の記載を回避する目的のみで行われるアミノ酸の置換、挿入、欠失、又は修飾を有さないことを意味する。
【００６６】
本明細書において使用するところの「発現ベクター」とは、特定のポリペプチドをコードし、適当なホスト内でそのポリペプチドを発現させることが可能な適当な調節配列に機能的に連結された、ＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトのことを指す。このような調節配列としては、転写を引き起こすプロモーター、こうした転写を調節する、場合により存在するオペレーター配列、適当なｍＲＮＡのリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の停止を調節する配列がある。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単純に潜在的なゲノムインサートであってよい。適当なホスト内に形質転換されると、ベクターは複製され、ホストのゲノムとは独立して機能するか、場合によってはゲノム自体に組み込まれうる。
【００６７】
「組換え」なる用語は、例えば、コード配列に突然変異を導入することで変化したポリペプチドを生成すること、コード配列を別の遺伝子のコード配列と融合させること、遺伝子を異なるプロモーターの制御下に置くこと、遺伝子を異種生物内で発現させること、遺伝子の発現レベルを低下又は上昇させること、遺伝子をその自然の発現プロファイルとは異なる発現プロファイルで条件的又は構成的に発現させることなどにより、配列又は発現特性を変化させるように改変された遺伝物質（すなわち、核酸、核酸がコードするポリペプチド、並びにこうしたポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞）のことを指す。一般的に組換え核酸、ポリペプチド、及びこれらに基づく細胞は、関連する核酸、ポリペプチド、及び自然に見られる細胞とは同一ではなくなるように人為的に操作されている。
【００６８】
「シグナル配列」とは、ポリペプチドのＮ末端部分に結合したアミノ酸の配列のことを指し、タンパク質の成熟型の細胞からの分泌を促進するものである。細胞外タンパク質の成熟型は、分泌プロセスの際に切断されるシグナル配列は有していない。
【００６９】
「選択的マーカー」又は「選択可能なマーカー」なる用語は、導入された核酸又はベクターを含むホストの選択を容易にする、ホスト細胞において発現させることが可能な遺伝子のことを指す。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗微生物物質（例えば、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は、ホスト細胞に栄養的優位性のような代謝的優位性を与える遺伝子が挙げられる。
【００７０】
本明細書において使用するところの「調節要素」なる用語は、核酸配列の発現の特定の側面を調節する遺伝子要素のことを指す。例えばプロモーターは、機能的に連結されたコード領域の転写の開始を促進する調節要素である。更なる調節要素としては、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び停止シグナルが挙げられる。
【００７１】
本明細書において使用するところの「ホスト細胞」とは、当該技術分野では周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターを形質転換又はトランスフェクトした原核生物又は真核生物のホストである。形質転換されたホスト細胞は、タンパク質変異体をコードするベクターを複製するか、あるいは所望のタンパク質変異体を発現することが可能である。タンパク質変異体の前駆体、又はプレプロ体をコードするベクターの場合、一般的にこうした変異体は、発現されるとホスト細胞からホスト細胞の培地中へと分泌される。
【００７２】
細胞に核酸配列を挿入することに関連して「導入された」なる用語は、形質転換、形質導入、又はトランスフェクションを意味する。形質転換の手段としては、当該技術分野では周知のプロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈降法、電気穿孔法、ネイキッドＤＮＡ法などが挙げられる（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１〜１１５；Ｓｍｉｔｈら（１９８６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４；及びＦｅｒｒａｒｉらによるＨａｒｗｏｏｄ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｐｐ．５７〜７２，１９８９の総説を参照）。
【００７３】
本明細書において使用するところの「選択可能なマーカー」又は「選択可能な遺伝子産物」なる用語は、選択可能なマーカーが発現される細胞に抗生物質又は薬剤に対する耐性を与える酵素活性をコードする遺伝子の使用のことを指す。
【００７４】
他の技術的及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；及びＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）を参照）。
【００７５】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、内容的に明らかに示されていないかぎり、複数の対象物が含まれる。
【００７６】
各見出しは、便宜上示されるものであって、限定的に解釈されるべきではない。１つの見出しの下に含まれる説明は、明細書全体に適用されうるものである。
【００７７】
ＩＩＩ．ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド及びポリヌクレオチド
Ａ．ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド
一態様では、本発明の組成物及び方法は、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド又はその変異体を提供する。代表的なＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドとしては、サーモビフィダ・フスカ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＹＰ＿２８８９４４）から単離されたものがある。成熟したＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。同様のほぼ同一のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが、例えばＴ．フスカの他の株又は単離物など、自然に存在しうる。本発明の組成物及び方法には、これら及び他の組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが含まれる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、上記の代表的なＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと特定のアミノ酸配列の相同性、例えば配列番号２（下記）又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の配列相同性を有する変異型ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドである。相同性は、例えば本明細書において述べるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、アミノ酸配列を整合することにより決定することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、ポリヌクレオチドの構造及び／又は機能に大きく影響しない置換を有する。代表的な置換は、表Ｉにまとめたような保存的突然変異である。
【表１】
【００８０】
天然型アミノ酸が関与する置換は、組換えＴｆｕＬｉｐ２をコードする核酸に突然変異を導入し、次いでこの変異型ポリヌクレオチドを特定の生物で発現させることにより一般的に行われる。非天然型アミノ酸が関与する置換、又はアミノ酸に対する化学修飾は、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが特定の生物によって合成された後に組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを化学的に修飾することにより一般的に行われる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、変異型組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは配列番号３とほぼ同一であり、これは変異型組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが、ポリヌクレオチドの構造、機能又は発現に大きく影響しないアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有さないことを意味する。このような変異型組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドには、本発明の記載を回避する目的でのみ設計されたものが含まれる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド（その変異型を含む）は、リパーゼ、エステラーゼ、トランスエステラーゼ、及び／又はアシルトランスフェラーゼ活性を含むカルボン酸エステル加水分解酵素活性を有する。カルボン酸エステル加水分解酵素活性は、本明細書において述べるアッセイを用いるか、又は当該技術分野では周知の他のアッセイによって決定及び測定することができる。いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、洗剤組成物の存在下で活性を有する。
【００８３】
ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドには、カルボン酸エステル加水分解酵素活性を維持する「完全長」のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドのフラグメントが含まれる。こうしたフラグメントは、完全長ポリヌクレオチドの活性部位を保持していることが好ましいが、重要ではないアミノ酸残基の欠失を有してもよい。フラグメントの活性は、本明細書において述べるアッセイを用いるか、又は当該技術分野では周知の他のアッセイによって容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドのフラグメントは、洗剤組成物の存在下でカルボン酸エステル加水分解酵素活性を維持する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの細胞外分泌を指示するシグナルペプチドと融合される。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、異種生物、すなわちバチルス・サブチリス以外の生物内で発現される。代表的な異種生物としては、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、ジオバチルス（Geobacillus（以前のバチルス）ステアロサーモフィラス（stearothermophilus））、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、又はストレプトマイセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）などのグラム陽性菌；大腸菌などのグラム陰性菌；例えばサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロマイセス属、又はシゾサッカロマイセス属などの酵母；並びに、例えばアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスベルギルス属、及びトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）などの糸状菌が挙げられる。これらの生物内に核酸を形質転換するための方法は当該技術分野では周知のものである。アスペルギルス属のホスト細胞の形質転換に適した方法が、欧州特許出願公開第２３８ ０２３号に述べられている。
【００８５】
特定の実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは異種生物内で分泌型ポリペプチドとして発現され、その場合、本組成物及び方法には、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを異種生物内で分泌型ポリペプチドとして発現させるための方法が含まれる。
【００８６】
Ｂ．ＴｆｕＬｉｐ２ポリヌクレオチド
本組成物及び方法の別の態様は、本明細書において特定されるもののような異種生物内でＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを発現させるための発現ベクターとの関連で提供される、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド（その変異体及びフラグメントを含む）をコードするポリヌクレオチドである。ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチドの発現を助けるための調節要素（例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなど）と機能的に連結させることができる。
【００８７】
ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する。ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードするほぼ同一のものを含む同様のポリヌクレオチド及び変異体は、例えばＴ・フスカの他の株又は単離物など、自然に存在しうる。遺伝子コードの縮重性を考慮すると、異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが、同じＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド、変異体、又はフラグメントをコードしうることを理解できよう。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードする上記の代表的なポリヌクレオチドと特定のアミノ酸配列の相同性、例えば配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の配列相同性を有する。相同性は、例えば本明細書において述べるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、アミノ酸配列を整合することにより決定することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２をコードするポリヌクレオチドは、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの細胞外分泌を指示するシグナルペプチドのコード配列の後ろ（すなわち、その下流）のフレームに融合される。異種シグナル配列には、細菌のセルラーゼ遺伝子から得られるものが含まれる。発現ベクターは、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを発現させるのに適した、又は適当なホスト細胞内に発現ベクターを導入するのに先立って発現ベクターを増殖させるのに適した、異種ホスト細胞中に与えることができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定のハイブリダイゼーション条件下で配列番号１の代表的なポリヌクレオチド（又はその相補体）とハイブリダイズする。代表的な条件は、本明細書において述べられるストリンジェントな条件、及び高ストリンジェント条件である。
【００９１】
ＴｆｕＬｉｐ２ポリヌクレオチドは天然型であっても合成（すなわち、人工の）ものであってもよく、異なるホスト内での発現にコドンを最適化させるか、クローニング部位を導入するために突然変異させるか、あるいは官能性を付与するために改変することができる。
【００９２】
ＩＶ．ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの活性及び性質
本明細書において開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、広範なｐＨ条件にわたって酵素活性を有しうる。特定の実施形態では、開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、約ｐＨ ４〜約ｐＨ １１．５で酵素活性を有する。好ましい実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２は約ｐＨ ８〜約ｐＨ １０で活性である。本明細書において述べるｐＨの値は、±０．２だけ変化しうることに注意されたい。例えば、約８のｐＨの値は、ｐＨ ７．８〜ｐＨ ８．２で変化しうる。
【００９３】
本明細書において開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、例えば１０℃以下〜約５０℃の広範な温度にわたって酵素活性を有しうる。特定の実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼの最適な温度範囲は、約１０℃〜約２０℃、約２０℃〜約３０℃、約３０℃〜約４０℃、又は約４０℃〜約５０℃である。本明細書において述べる温度の値は、±０．２℃だけ変化しうることに注意されたい。例えば、約１０℃の温度は、９．８℃〜１０．２℃で変化しうる。
【００９４】
実施例３に示されるように、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの活性はＣ８の基質を用いた場合に最も高かったが、Ｃ４及びＣ１６の基質を用いた場合にも活性が認められた。これに対して、商業的に製造されているリパーゼであるＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（すなわち、シュードモナス・シュードアルカリゲネスリパーゼ変異体Ｍ２１Ｌ（ダニスコ・ユー・エス社（Danisco US.Inc.）ジェネンコア（Genencor）部門、米国カリフォルニア州、パロアルト））は、Ｃ１０の基質に対する選択性を有し、基質がより小さくなる（例えばＣ８）か又はより大きくなる（例えばＣ１６）と、活性は急速に低下した（示さず）。したがって、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、特定の長さの基質に対してはＬＩＰＯＭＡＸ（商標）よりも選択性が低いが、より短い鎖長の基質に対してＬＩＰＯＭＡＸ（商標）よりも選択的であるようである。実際、ＴｆｕＬｉｐ２は、溶液中（実施例４）、及び染みが布地上にある場合（実施例５）のいずれにおいても、洗剤組成物の存在下で代表的な油性染み物質に対して加水分解活性を示した。
【００９５】
優れた洗浄性能及び幅広い基質特異性を有すること以外に、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、洗剤組成物中で、特にプロテアーゼの存在下において安定性も有する。ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼの安定性を、同等のアッセイ条件を用いて、ＬＩＰＥＸ（商標）の安定性に対して測定することが便宜上可能である。代表的なアッセイ条件については本明細書に述べる（実施例１４を含むが、これに限定されない）。安定性については、最終的な洗浄条件下、又は洗剤配合物の濃縮された保存形態中においてアッセイを行うことができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含まない同等の洗剤組成物中で約１週間にわたって、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、又は更には少なくとも約２０％、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含まない同等の洗剤組成物中で約１５日間にわたって、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、又は更には少なくとも約２０％、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。代表的な洗剤組成物は、ＯＭＯ（商標）Ｓｍａｌｌ ａｎｄ Ｍｉｇｈｔｙ及びＡＲＩＥＬ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含まない同等の洗剤組成物中で約１週間にわたって、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、又は更には少なくとも約１．５倍、ＬＩＰＥＸ（商標）より安定的である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含まない同等の洗剤組成物中で約１５日間にわたって、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、又は更には少なくとも約１．５倍、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。代表的な洗剤組成物は、ＯＭＯ（商標）Ｓｍａｌｌ ａｎｄ Ｍｉｇｈｔｙ及びＡＲＩＥＬ（商標）である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含む同等の洗剤組成物中で約１週間にわたって、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、又は更には少なくとも約５００％、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含む同等の洗剤組成物中で約約１５日間にわたって、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、少なくとも約１，０００％、少なくとも約１，１００％、少なくとも約１，２００％、少なくとも約１，３００％、少なくとも約１，４００％、少なくとも約１，５００％、少なくとも約１，６００％、少なくとも約１，７００％、又は更には少なくとも約１，８００％、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。代表的な洗剤組成物は、ＯＭＯ（商標）Ｓｍａｌｌ ａｎｄ Ｍｉｇｈｔｙ及びＡＲＩＥＬ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含む同等の洗剤組成物中で約１週間にわたって、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、又は更には少なくとも約５倍、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含む同等の洗剤組成物中で約１５日間にわたって、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、又は更には少なくとも約１８倍、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。代表的な洗剤組成物は、ＯＭＯ（商標）Ｓｍａｌｌ ａｎｄ Ｍｉｇｈｔｙ及びＡＲＩＥＬ（商標）である。
【００９８】
ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼのこれらの、並びに他の性質及び利点について本明細書において述べる。
【００９９】
Ｖ．ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む洗剤組成物
本明細書において開示される組成物及び方法の一態様は、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド（その変異体又はフラグメントを含む）を含む洗剤組成物、及び洗浄用途においてこうした組成物を使用するための方法である。洗浄用途としては、これらに限定されるものではないが、洗濯又は繊維製品のクリーニング、食器洗い（手洗い及び自動）、染みの前処理などが挙げられる。特定の用途は、脂質が除去すべき汚れ又は染みの成分であるような用途である。洗剤組成物は、通常、ＴｆｕＬｉｐ２又はその変異体の有効量、例えば、少なくとも０．０００１重量％、約０．０００１〜約１、約０．００１〜約０．５、約０．０１〜約０．１重量％、又は更には約０．１〜約１重量％、又はそれよりも多い量を含む。約０．４ｇ／Ｌ〜約２．２ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約１．７ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約０．８ｇ／Ｌ、又は約０．４ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの濃度を有する洗剤組成物を、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼの有効量と混合することができる。洗剤組成物は、約０．４ｍＬ／Ｌ〜約２．６ｍＬ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ〜約２．０ｍＬ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ〜約１．５ｍ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ〜約１ｍＬ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ〜約０．８ｍＬ／Ｌ、又は約０．４ｍＬ／Ｌ〜約０．５ｍＬ／Ｌの濃度で存在してもよい。
【０１００】
特に断らないかぎり、本明細書において与えられるすべての成分又は組成物の濃度は、その成分又は組成物の活性濃度に関して記載されるものであり、市販の供給源中に存在しうる例えば残留溶媒又は副生成物のような不純物は除外される。酵素成分の重量は、全活性タンパク質に基づいたものである。比率（％）及び比はすべて、特に断らないかぎりは重量で計算している。比率（％）及び比はすべて、特に断らないかぎりは全組成物を基準として計算している。代表的な洗剤組成物において、酵素濃度は全組成物中の純粋な酵素の重量によって表し、特に断らないかぎり、各洗剤成分は全組成物中の重量によって表している。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、非イオン性、半極性、アニオン性、カチオン性、双性イオン性、又はこれらの組み合わせ及び混合物でありうる、１以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、通常、約０．１重量％〜６０重量％の濃度で存在する。代表的な界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｃ１２〜１４パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス硫酸ナトリウム、Ｃ１４〜１５パレス−４、ラウレス硫酸ナトリウム（例えば、Ｓｔｅｏｌ ＣＳ−３７０）、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、Ｃ１２エトキシレート（Ａｌｆｏｎｉｃ １０１２〜６、Ｈｅｔｏｘｏｌ ＬＡ７、Ｈｅｔｏｘｏｌ ＬＡ４）、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（例えば、Ｎａｃｃｏｎｏｌ ９０Ｇ）、並びにこれらの組み合わせ及び混合物が挙げられる。
【０１０２】
本明細書において述べる洗剤組成物とともに使用することが可能なアニオン性界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、アルキル硫酸エステル（脂肪アルコール硫酸エステル）（ＡＳ）、アルコールエトキシ硫酸エステル（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）、２級アルカンスルホン酸塩（ＳＡＳ）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−若しくはアルケニルコハク酸、又は石鹸が挙げられる。洗剤組成物は、アルコールエトキシレート（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシルアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、国際特許出願公開第９２／０６１５４号に述べられる）、並びにこれらの組み合わせ及び混合物などの０〜４０％の非イオン性界面活性剤を更に含みうる。
【０１０３】
本明細書において述べる洗剤組成物とともに使用することが可能な非イオン性界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ＴＷＥＥＮ類）、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレンイソアルコール、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ＴＲＩＴＯＮ類及びＢＲＩＪ）、ポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェノール又はオクチルフェニル−エチレンオキシド縮合物（例えば、ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ４０）、エチレンオキシドと脂肪アルコールとの縮合物（例えば、ＬＵＢＲＯＬ）、ポリオキシエチレンノニルフェノール、ポリアルキレングリコール（ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ Ｆ１０８）、糖ベースの界面活性剤（例えば、グリコピラノシド、チオグリコピラノシド）、並びにこれらの組み合わせ及び混合物が挙げられる。
【０１０４】
本明細書において開示される洗剤組成物は、これらに限定されるものではないが、５〜１５％のアニオン性界面活性剤、＜５％の非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、ホスホネート、石鹸、酵素、香料、ブチルフェニルメチルプロピオネート、ゲラニオール、ゼオライト、ポリカルボキシレート、ヘキシルシンナマル、リモネン、カチオン性界面活性剤、シトロネロール、及びベンズイソチアゾリノンを含む混合物を有しうる。
【０１０５】
洗剤組成物は更に、１以上の洗剤ビルダー又はビルダーシステム、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定化剤、起泡促進剤、泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、ヒドロトロープ、変色防止剤、蛍光増白剤、柔軟剤、及び香料を更に含んでもよい。洗剤組成物は、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、又は更なるカルボン酸エステル加水分解酵素を含むがこれらに限定されない、酵素を更に含んでもよい。洗剤組成物のｐＨは、本明細書において述べるように中性〜塩基性でなければならない。
【０１０６】
少なくとも１種類のビルダーを含むいくつかの実施形態では、洗剤組成物は、洗浄組成物の少なくとも約１重量％（すなわち、ｗｔ／ｗｔ、重量パーセント）、約３重量％〜約６０重量％、又は更には約５重量％〜約４０重量％のビルダーを含む。ビルダーとしては、これらに限定されるものではないが、ポリリン酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及びアルカノールアンモニウム塩、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類及びアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸塩、ポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカルボキシレート、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、並びにカルボキシメチルオキシコハク酸、エチレンジアミン４酢酸及びニトリロ３酢酸のようなポリ酢酸の各種のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及び置換アンモニウム塩、並びに、例えばメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸のようなポリカルボキシレート、並びにこれらの可溶性塩が挙げられる。実際、任意の適当なビルダーが本開示の異なる実施形態において有用であると考えられる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ビルダーは、クエン酸塩及びポリリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム及びトリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリン酸カリウム、及びトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムとの混合物など）などの水溶性の硬度イオン複合体（例えば封鎖ビルダー）を形成する。当該技術分野では周知のものを含む（例えば、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）任意の適当なビルダーが、本開示において有用であると考えられる。
【０１０８】
本明細書において示されるように、いくつかの実施形態では、本明細書において述べる洗浄組成物は、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白剤活性剤、漂白剤触媒、他の酵素、酵素安定システム、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ放出ポリマー、移染剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、着色剤、充填剤塩、ヒドロトロープ、光活性剤、蛍光剤、柔軟剤、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、収縮防止剤、シワ防止剤、殺菌剤、防カビ剤、カラースペックル（color speckles）、シルバーケア（silvercare）、変色防止及び／又は腐蝕防止剤、アルカリ性付与剤、可溶化剤、キャリア、加工助剤、顔料、及びｐＨ調整剤を含む添加物質を更に含む（例えば、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４及び同第５，６４６，１０１号を参照）。特定の洗浄組成物物質の実施形態を以下に詳しく例示する。洗浄添加物質が、洗浄組成物中のＴｆｕＬｉｐ２変異体と適合性を有さないような実施形態では、洗浄添加物質とリパーゼとを、これら２つの成分を合わせることが適切となるまで分離（すなわち、互いに接触しないように）しておくのに適当な方法が用いられる。このような分離方法には、当該技術分野では周知のあらゆる適当な方法が含まれる（例えば、ジェルキャップ、カプセル化、錠剤、物理的分離など）。
【０１０９】
本明細書において述べる洗浄組成物は、例えば、洗濯用途、硬質表面の洗浄、食器洗い用途、並びに入れ歯、歯、毛髪及び皮膚などの美容用途において効果的に使用することができる。更に、本明細書において述べるＴｆｕＬｉｐ２酵素は、低温溶液中において高い効果を示すという特有の効果のために、洗濯用途に特に適している。更に、ＴｆｕＬｉｐ２酵素は、粒状及び液体組成物中で使用することができる。
【０１１０】
本明細書において述べるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、添加用製品における洗浄用途に使用することもできる。いくつかの実施形態では、低温溶液洗浄用途において有用である。いくつかの実施形態では、本開示は、更なる漂白効果が望ましい場合に、洗浄プロセスにおいて添加するのに特に適した少なくとも１種類の開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む、洗浄添加用製品を提供する。こうした場合には、これに限定されないが、低温溶液洗浄用途が含まれる。いくつかの実施形態では、添加用製品はその最も単純な形態、すなわち１以上のリパーゼである。いくつかの実施形態では、添加用製品は洗浄プロセスに添加される剤形にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、添加用製品は、過酸素源が使用され、高い漂白効果が望まれる場合に、洗浄プロセスに添加される剤形にパッケージングされる。これらに限定されるものではないが、ピル、錠剤、ジェルキャップ、又は予め計量された粉末若しくは液体などの他の一回用量単位を含む、任意の適当な一回容量単位の形態が、本開示とともに使用するのに有用である。いくつかの実施形態では、こうした組成物の体積を増すために充填剤又はキャリア物質が添加される。適当な充填剤又はキャリア物質としては、これらに限定されるものではないが、硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩といった各種の塩、並びにタルク、粘土などが挙げられる。液体組成物に適した充填剤又はキャリア物質としては、これらに限定されるものではないが、水、又はポリオール及びジオールなどの低分子量の一級及び二級アルコールが挙げられる。このようなアルコールの例としては、これらに限定されるものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが挙げられる。いくつかの実施形態では、本組成物は、約５％〜約９０％のこうした物質を含む。ｐＨを低下させるうえで、酸性充填剤が有用である。また、いくつかの実施形態では、洗浄添加用製品は、下記により詳細に述べるような添加成分を含む。
【０１１１】
本発明の洗浄組成物及び洗浄添加用製品は、本明細書において述べるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの少なくとも１つのものの有効量を、単独で、又は他のリパーゼ及び／又は更なる酵素と組み合わせて必要とする。必要とされる酵素の濃度は、１以上の開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを添加することによって得られる。一般的に、本発明の洗浄組成物は、少なくとも約０．０００１重量％、約０．０００１〜約１０、約０．００１〜約１、又は更には約０．０１〜約０．１重量％の開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの少なくとも１つのものを含む。
【０１１２】
本明細書における洗浄組成物は、水による洗浄動作における使用時に、洗浄水が約５．０〜約１１．５、又は更には約７．５〜約１０．５のｐＨを有するように一般的に配合される。液体製品の配合物は、約３．０〜約９．０、又は更には約３〜約５の無希釈ｐＨを有するように一般的に配合される。粒状洗濯製品は、約９〜約１１のｐＨを有するように一般的に配合される。推奨される使用レベルにｐＨを調節する技術としては、緩衝剤、アルカリ、酸などの使用が挙げられ、これらは当業者には周知のものである。
【０１１３】
適当な低ｐＨ洗浄組成物は、約３〜約５の無希釈ｐＨを一般的に有し、このようなｐＨ環境において加水分解する界面活性剤は一般的に含まない。このような界面活性剤には、少なくとも１個のエチレンオキシド部分、又は更には約１〜約１６モルのエチレンオキシドを有するアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤が含まれる。このような洗浄組成物は、洗浄組成物に約３〜約５の無希釈ｐＨを与えるうえで充分な量の、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン、又は塩酸などのｐＨ改変剤を一般的に含む。このような組成物は、少なくとも１種類の酸安定的酵素を一般的に含む。いくつかの実施形態では組成物は液体であり、他の実施形態では固体である。このような液体組成物のｐＨは、無希釈ｐＨとして一般的に測定される。このような固体組成物のｐＨは、溶媒が蒸溜水であるような前記組成物の１０％固形物溶液として測定される。これらの実施形態では、特に断らないかぎり、ｐＨの測定はすべて２０℃で行われる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが粒状組成物又は液体中で使用される場合、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、保管時に粒状組成物の他の成分からＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを保護するためにカプセル化された粒子の形態であることが望ましい。更にカプセル化は、洗浄プロセスの際にＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの利用性を調節する手段でもある。いくつかの実施形態では、カプセル化によって、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド及び／又は更なる酵素の性能が高められる。この点に関し、本開示のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、当該技術分野では周知の任意の適当なカプセル化物質によってカプセル化される。いくつかの実施形態では、カプセル化物質は、本明細書に述べるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドに対する触媒の少なくとも一部をカプセル化する。一般的には、カプセル化材料は、水溶性及び／又は水分散性である。いくつかの実施形態では、カプセル化物質は、０℃又はそれよりも高いガラス転移温度（Ｔｇ）を有する。ガラス転移温度については、国際特許出願公開第９７／１１１５１号により詳細に述べられている。カプセル化物質は、炭水化物、天然又は合成ゴム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィン蝋、並びにこれらの組み合わせからなる群から一般的に選択される。カプセル化物質が炭水化物である場合、カプセル化物質は、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、及びこれらの組み合わせから一般的に選択される。いくつかの一般的な実施形態では、カプセル化物質はデンプンである（例えば、欧州特許出願公開第０ ９２２ ４９９号、米国特許第４，９７７，２５２号、同第５，３５４，５５９号、及び同第５，９３５，８２６号を参照）。いくつかの実施形態では、カプセル化物質は、熱可塑性物質、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、及びこれらの混合物などのプラスチックで形成されたマイクロスフェアであり、有用な市販のマイクロスフェアとしては、これらに限定されるものではないが、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（ストックビクスベルケン、スウェーデン）、及びＰＭ ６５４５、ＰＭ ６５５０、ＰＭ ７２２０、ＰＭ７ ２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）、及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ピー・キュー社（PQ Corp.）ペンシルベニア州バレーフォージ）により供給されるものがある。
【０１１５】
洗浄用途におけるＴｆｕＬｉｐ２を含む洗剤組成物の使用に際しては、衣類、繊維製品、食器、又は洗浄しようとする他の表面を、汚れ又は染み中に存在する脂質をＴｆｕＬｉｐ２が加水分解するのに充分な時間にわたってＴｆｕＬｉｐ２洗剤組成物の存在下でインキュベートした後、通常は水又は別の水性溶媒で洗い流すことによって、加水分解された脂質と一緒にＴｆｕＬｉｐ２洗剤組成物を除去する。
【０１１６】
本明細書において述べるように、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、洗濯及び食器洗い用洗剤を含むが、これらに限定されない洗浄産業において特に有用である。これらの用途では、酵素は様々な環境ストレス下に置かれる。ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、異なる条件下でのその安定性のため、多くの現在使用されている酵素と比較して優れた利点を与えるものである。
【０１１７】
実際、洗浄に用いられるリパーゼが曝露される異なる洗剤配合、洗浄水の量、洗浄水の温度、及び洗浄時間の長さを含む様々な洗浄条件が存在する。更に、異なる地理的地域で使用される洗剤配合物は、洗浄水中に存在する関連成分の濃度が異なる。例えば、ヨーロッパの洗剤では、洗浄水中の洗剤成分は一般的に約４，５００〜５，０００ｐｐｍであるのに対して、日本の洗剤では、洗浄水中の洗剤成分は一般的に約６６７ｐｐｍである。北米、特に米国では、洗剤の洗浄水中に存在する洗剤成分は一般的に約９７５ｐｐｍである。
【０１１８】
低洗剤濃度システムでは、洗浄水中に存在する洗剤成分が約８００ｐｐｍ未満であるような洗剤が用いられる。日本の洗剤は、洗浄水中に存在する洗剤成分が約６６７ｐｐｍであることから、低洗剤濃度システムと一般的に考えられる。
【０１１９】
中洗剤濃度システムでは、洗浄水中に存在する洗剤成分が約８００ｐｐｍ〜約２，０００ｐｐｍであるような洗剤が用いられる。北米の洗剤は、洗浄水中に存在する洗剤成分が約９７５ｐｐｍであることから、中洗剤濃度システムと一般的に考えられる。ブラジルでは、洗浄水中に存在する洗剤成分は一般的に約１，５００ｐｐｍである。
【０１２０】
高洗剤濃度システムでは、洗浄水中に存在する洗剤成分が約２０００ｐｐｍよりも高濃度であるような洗剤が用いられる。ヨーロッパの洗剤は、洗浄水中に存在する洗剤成分が約４５００〜５０００ｐｐｍであることから、高洗剤濃度システムと一般的に考えられる。
【０１２１】
南米の洗剤は、一般的に起泡力の高いリン酸塩ビルダー洗剤であり、南米において使用される洗剤の範囲は、洗浄水中の洗剤成分の範囲が１，５００ｐｐｍ〜６０００ｐｐｍであることから中及び高洗剤濃度の両方に当てはまる。上記に述べたように、ブラジルでは、洗浄水中に存在する洗剤成分は一般的に約１，５００ｐｐｍである。しかしながら、起泡力の高いリン酸塩ビルダー洗剤を使用している他の地理的地域（他の南米諸国に限定されない）では、洗浄水中に存在する洗剤成分が最大で約６，０００ｐｐｍであるような高洗剤濃度システムでありうる。
【０１２２】
上記を考慮すると、世界全体では、一般的な洗浄液中の洗剤成分の濃度は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分（「低洗剤濃度地域」）、例えば日本における約６６７ｐｐｍから、約８００ｐｐｍ〜約２，０００ｐｐｍの間（「中洗剤濃度地域」）、例えば米国における約９７５ｐｐｍ及びブラジルにおける約１，５００ｐｐｍ、約２，０００ｐｐｍよりも高い濃度（「高洗剤濃度地域」）、例えばヨーロッパにおける約４，５００ｐｐｍ〜約５，０００ｐｐｍ、及び起泡力の高いリン酸塩ビルダーの使用地域における約６，０００ｐｐｍまで変化することが明らかである。
【０１２３】
一般的な洗浄液の濃度は経験的に求められる。例えば、米国では、一般的な洗濯機には約６４．４Ｌの体積の洗浄液が入る。したがって、洗浄液中で約９７５ｐｐｍの洗剤の濃度を得るには、６４．４Ｌの洗浄液には約６２．７９ｇの洗剤組成物を加えなければならない。この量は、洗剤と一緒に提供される計量カップを用いて、消費者によって洗浄水中に計り入れられる一般的な量である。
【０１２４】
更なる例として、異なる地理的地域では異なる洗浄温度が用いられていることがある。日本における洗浄水の温度は、ヨーロッパで用いられるよりも一般的に低い。例えば、北米及び日本における洗浄水の温度が一般的に約１０〜約３０℃（例えば約２０℃）であるのに対して、ヨーロッパにおける洗浄水の温度は一般的に約３０〜約６０℃（例えば約４０℃）である。しかしながら、エネルギー節約の観点から、多くの消費者が冷水による洗浄の使用に切り換えつつある。更に、一部の更なる地域では、一般的に冷水は洗濯ばかりでなく、食器洗い用途においても使用されている。いくつかの実施形態では、本開示の「冷水洗浄」は、約１０℃〜約４０℃、又は約２０℃〜約３０℃、又は約１５℃〜約２５℃の温度、並びに約１５℃〜約３５℃の範囲内のすべての他の組み合わせ、及び１０℃〜４０℃内のすべての範囲の温度における洗浄を利用する。
【０１２５】
更なる例として、異なる地理的地域では、一般的に水の硬度が異なることがある。水の硬度は、通常、１ガロン当たりの混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋のグレーン数によって記述される（ｍｇ／Ｌ）。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量の尺度である。米国における大部分の水は硬水であるが、硬度は異なっている。中度の硬さ（６０〜１２０ｐｐｍ）〜硬い（１２１〜１８１ｐｐｍ）水は、６０〜１８１ｐｐｍの硬度鉱物を含んでいる（ｐｐｍからグレーン／ＵＳガロンへの変換は、ｐｐｍ数を１７．１で割るとグレーン／ガロンとなる）。
【表２】
【０１２６】
ヨーロッパの水の硬度は、通常、約１０．５（例えば、約１０．５〜約２０．０）グレーン／ガロン（１７９．５（例えば、約１７９．５〜３４２．０）ｍｇ／Ｌ）の混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（例えば、１５グレーン／ガロン（２５６．５ｍｇ／Ｌ）の混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋）である。北米の水の硬度は一般的に日本の水の硬度よりも高いが、ヨーロッパの水の硬度よりも低い。例えば、北米の水の硬度は、約３〜約１０グレーン、約３〜約８グレーン又は約６グレーンでありうる（約５１．３〜約１７１．０ｍｇ／Ｌ、約５１．３〜約１３６．８ｍｇ／Ｌ又は約１０２．６ｍｇ／Ｌ）。日本の水の硬度は一般的に北米の水の硬度よりも低く、通常は約４グレーン／ガロン未満、例えば約３グレーン／ガロン（約６８．４ｍｇ／Ｌ未満、例えば約５１．３ｍｇ／Ｌ）の混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋である。
【０１２７】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１組の洗浄条件（例えば、水温、水の硬度、及び／又は洗剤濃度）において驚くべき洗浄性能を示すＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、洗浄性能において他のリパーゼと同等である。いくつかの実施形態では、本ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、現在市販されているリパーゼと比較して高い洗浄性能を示す。すなわち、いくつかの好ましい実施形態では、本明細書において提供される本ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、高い酸化安定性、高い熱安定性、異なる条件下での高い洗浄能力、及び／又は高いキレート剤安定性を示す。更に、本ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、やはり単独又はビルダー及び安定化剤との組み合わせで、洗剤を含まない洗浄組成物において有用でありうる。
【０１２８】
本開示のいくつかの実施形態では、洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと、洗浄添加物質からなる組成物の残部（例えば、組成物の約９９．９９９重量％〜約９０．０重量％）とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと、洗浄添加物質からなる洗浄組成物の残部（例えば、約９９．９９９９重量％〜約９０．０重量％、約９９．９９９重量％〜約９８重量％、約９９．９９５重量％〜約９９．５重量％）とを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書において述べる洗浄組成物は、洗浄性能及び／又は衣類ケア及び／又は食器洗い効果を与える１以上の更なる洗剤酵素を含む。適当な酵素の例としては、これらに限定されるものではないが、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、又はこれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ及び／又はセルラーゼなどの従来の使用可能な酵素を、アミラーゼと組み合わせて含む酵素の組み合わせ（すなわち「カクテル」）が用いられる。
【０１３０】
本明細書において提供されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド以外にも、他の任意の適当なリパーゼが本開示の組成物において有用である。適当なリパーゼとしては、これらに限定されるものではないが、細菌又は真菌由来のものがある。化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体は本開示に含まれる。有用なリパーゼの例としては、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ（例えば、欧州特許出願公開第２５８ ０６８号及び同第ＥＰ ３０５ ２１６号を参照）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ（例えば、欧州特許出願公開第２３８ ０２３号を参照）、Ｃ．アンタークティカ（C.antarctica）リパーゼ（例えば、Ｃ．アンタークティカリパーゼＡ又はＢ；例えば、欧州特許出願公開第２１４ ７６１号を参照）などのカンジダリパーゼ、Ｐ．アルカリゲネス（P.alcaligenes）リパーゼ及びＰ．シュードアルカリゲネス（P.pseudoalcaligenes）リパーゼなどのシュードモナスリパーゼ（例えば、欧州特許出願公開第２１８ ２７２号を参照）、Ｐ．カパシア（P.cepacia）リパーゼ（例えば、欧州特許出願公開第３３１ ３７６号を参照）、Ｐ．スツゼリ（P.stutzeri）リパーゼ（例えば、英国特許出願公開第１，３７２，０３４号を参照）、Ｐ．フルオレセンス（P.fluorescens）リパーゼ、バチルスリパーゼ（例えば、Ｂ．サブチリス（B.subtilis）リパーゼ；Ｄａｒｔｏｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１：２５３〜２６０，１９９３）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B.stearothermophilus）リパーゼ（例えば、特開昭第６４／７４４９９２号を参照）、及びＢ．プミルス（B.pumilus）リパーゼ（例えば、国際特許出願公開第９１／１６４２２号を参照）が挙げられる。
【０１３１】
更に、ペニシリウム・カメンベルディ（Penicillium camembertii）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅ １０３：６１〜６７，１９９１を参照）、ゲオトリクム・カンジダム（Geotricum candidum）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３〜３８８，１９８９を参照）、並びに、Ｒ．デレマー（R.delemar）リパーゼ（Ｈａｓｓら、Ｇｅｎｅ １０９：１１７〜１１３，１９９１を参照）、Ｒ．ニベウス（R.niveus）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６〜７１９，１９９２）、及びＲ．オリザエ（R.oryzae）リパーゼなどの各種のリゾパスリパーゼを含むが、これらに限定されない多くのクローニングされたリパーゼが、本開示のいくつかの実施形態において有用である。
【０１３２】
これらに限定されるものではないが、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）に由来するクチナーゼ（国際特許出願公開第８８／０９３６７号を参照）、及びフザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）に由来するクチナーゼ（国際特許出願公開第９０／０９４４６号を参照）を含む、クチナーゼなどの他の種類の脂肪分解酵素も本開示のいくつかの実施形態において有用である。
【０１３３】
更なる適当なリパーゼとしては、Ｍ１ ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（ジェネンコア社（Genencor））；ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（ノボザイムズ社（Novozymes））；並びにＬＩＰＡＳＥ Ｐ（商標）「Ａｍａｎｏ」（天野エンザイム株式会社、日本）などの市販のリパーゼが挙げられる。
【０１３４】
本開示のいくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の更なるリパーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、本開示の洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のリパーゼを含む。
【０１３５】
本開示のいくつかの実施形態では、任意の適当なプロテアーゼを使用することもできる。適当なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、当該技術分野では周知の多数の操作されたサブチリシンプロテアーゼのすべてを含む、サブチリシンプロテアーゼである。各種のプロテアーゼについては、国際特許出願公開第９５／２３２２１号、同第９２／２１７６０号、米国特許出願公開第２００８／００９０７４７号、並びに米国特許第５，８０１，０３９号、同第５，３４０，７３５号、同第５，５００，３６４号、同第５，８５５，６２５号、米国再発行特許第ＲＥ ３４，６０６号、米国特許第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、及び同第６，４８２，６２８号、並びに他の多くの特許に述べられている。いくつかの更なる実施形態では、国際特許出願公開第０７／０４４９９３号に述べられる中性メタロプロテアーゼを含むがこれに限定されない、メタロプロテアーゼが本開示において有用である。
【０１３６】
本開示のいくつかの実施形態では、任意の適当なアミラーゼを使用することもできる。いくつかの実施形態では、アルカリ溶液中での使用に適した任意のアミラーゼ（例えば、α及び／又はβ）も有用である。適当なアミラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、細菌又は真菌由来のものがある。いくつかの実施形態では、化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体が含まれる。本開示において有用なアミラーゼとしては、これに限定されるものではないが、Ｂ．リケニフォルミスから得られるα−アミラーゼが挙げられる（例えば、英国特許出願公開第１，２９６，８３９号を参照）。本開示において有用な市販のアミラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、及びＢＡＮ（商標）（ノボザイムズ社（Novozymes））、並びにＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、及びＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（ダニスコ・ユー・エス社ジェネンコア部門（Danisco US Inc.，Genencor Division））が挙げられる。
【０１３７】
本開示のいくつかの実施形態では、開示される洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の更なるアミラーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のアミラーゼを含む。
【０１３８】
いくつかの更なる実施形態では、任意の適当なセルラーゼが本開示の洗浄組成物において有用である。適当なセルラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、細菌又は真菌由来のものがある。いくつかの実施形態では、化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体が含まれる。適当なセルラーゼとしては、これに限定されるものではないが、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼが挙げられる（例えば、米国特許第４，４３５，３０７号を参照）。特に適当なセルラーゼは、カラーケア効果を有するセルラーゼである（例えば、欧州特許出願公開第０ ４９５ ２５７号を参照）。本開示において有用な市販のセルラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（ノボザイムズ社（Novozymes））、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。いくつかの実施形態では、セルラーゼは、Ｎ末端の一部が除去された成熟した野生型又は変異型セルラーゼの一部又はフラグメントとして添加される（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号を参照）。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の更なるセルラーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のセルラーゼを含む。
【０１３９】
洗剤組成物中での使用に適した任意のマンナナーゼも本開示において有用である。適当なマンナナーゼとしては、これらに限定されるものではないが、細菌又は真菌由来のものがある。いくつかの実施形態では、化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体が含まれる。本開示において有用な各種のマンナナーゼが知られている（例えば、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第６，５６６，１１４号、同第６，６０２，８４２号、及び同第６，４４０，９９１号を参照）。いくつかの実施形態では、開示される洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の更なるマンナナーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のマンナナーゼを含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物中に、ペルオキシダーゼが、過酸化水素又はその供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩、又は過硫酸塩）と組み合わせて使用される。いくつかの代替的実施形態では、オキシダーゼが酸素と組み合わせて使用される。いずれの種類の酵素も、「溶液漂白」（すなわち、染色衣類と別の衣類が洗浄液中で一緒に洗われる場合に、染色衣類から別の衣類への繊維染料の移行を防止する）の目的で、好ましくは増強剤と共に使用される（例えば、国際特許出願公開第９４／１２６２１号及び同第９５／０１４２６号を参照）。適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、これらに限定されるものではないが、植物、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の更なるペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素と、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度の更なるペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ペルヒドロラーゼを含むがこれに限定されない、更なる酵素が有用である（例えば、国際特許出願公開第０５／０５６７８２号を参照）。更に、いくつかの特に好ましい実施形態では、上記に述べた酵素、特に、１以上の更なるプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又は少なくとも１種類のセルラーゼの混合物が本明細書に含まれる。実際、これらの酵素の様々な混合物が本開示において有用であると考えられる。やはり考えられる可能性として、異なる濃度のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド及び１以上の更なる酵素は、いずれも独立して約１０％までの範囲であってよく、洗浄組成物の残部が洗浄添加物質であってもよい。洗浄添加物質の具体的な選択は、洗浄しようとする表面、物品、又は衣類、及び使用時（例えば、洗濯洗剤としての使用）の洗浄条件に対する望ましい組成物の形態を考慮することにより容易に行うことができる。
【０１４２】
適当な洗浄添加物質の例としては、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化システム、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ放出ポリマー、移染剤、移染防止剤、触媒物質、過酸化水素、過酸化水素の供給源、予め生成された過酸（preformed peracis）、ポリマー分散剤、粘土汚れ除去剤、構造弾性化剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、着色剤、充填剤塩、ヒドロトロープ、光活性剤、蛍光剤、柔軟仕上げ剤、柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤、溶媒、顔料、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、収縮防止剤、シワ防止剤、殺菌剤、防カビ剤、カラースペックル（color speckles）、シルバーケア（silvercare）、変色防止及び／又は腐蝕防止剤、アルカリ性付与剤、可溶化剤、キャリア、加工助剤、顔料、及びｐＨ調整剤が挙げられる（例えば、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号、及び同第５，６４６，１０１号を参照）。特定の洗浄組成物物質の実施形態を以下に詳しく例示する。洗浄添加物質が、洗浄組成物中の開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと適合性を有さないような実施形態では、洗浄添加物質とリパーゼとを、これら２つの成分を合わせることが適切となるまで分離（すなわち、互いに接触しないように）しておくのに適当な方法が用いられる。このような分離方法には、当該技術分野では周知のあらゆる適当な方法が含まれる（例えば、ジェルキャップ、カプセル化、錠剤、物理的分離など）。
【０１４３】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書において提供される１以上のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの有効量が、染みを除去する必要のある様々な表面を洗浄するうえで有用な組成物中に含まれる。このような洗浄組成物には、硬質表面、衣類、及び食器の洗浄などの用途のための洗浄組成物が含まれる。実際、いくつかの実施形態では、本開示は衣類洗浄用組成物を提供するものであるが、他の実施形態では、本開示は衣類以外の洗浄用組成物を提供する。特に、本開示は、口腔ケア（歯磨き剤、歯磨き粉、マウスウォッシュなど、並びに入れ歯洗浄用組成物）を含むパーソナルケアに適した洗浄組成物、皮膚及び毛髪洗浄用組成物を更に提供する。本開示は、任意の形態の洗剤組成物（すなわち、液体、粒状、バー、半固体、ジェル、エマルション、錠剤、カプセルなど）を含むものとする。
【０１４４】
一例として、開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが有用であるようないくつかの洗浄組成物について下記により詳しく述べる。開示される洗浄組成物が、洗濯機による洗浄方法における使用に適した組成物として配合されるいくつかの実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも１種類の界面活性剤及び少なくとも１種類のビルダー化合物、並びに、有機ポリマー化合物、漂白剤、更なる酵素、泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸分散剤、汚れ懸濁及び再付着防止剤、及び腐蝕防止剤から好ましくは選択される１以上の洗浄添加物質を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、洗濯用組成物は、更に柔軟剤を含む（すなわち、更なる洗浄添加物質として）。本開示の組成物は、固体又は液体の形態の洗剤添加用製品においても有用である。このような添加用製品は、従来の洗剤組成物の性能を補い、かつ／又は高めることを目的としたものであり、洗浄プロセスのいずれの段階で添加してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書における洗濯洗剤組成物の密度は約４００〜約１２００ｇ／Ｌの範囲であり、他の実施形態では、密度は２０℃で測定した場合に組成物１Ｌ当たり約５００〜約９５０ｇの範囲である。
【０１４５】
手による食器洗いの方法において使用するための組成物として配合された実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも１種類の界面活性剤、並びに、好ましくは、有機ポリマー化合物、起泡促進剤、ＩＩ族の金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ、及び更なる酵素から選択される少なくとも１種類の更なる洗浄添加物質を含むことが好ましい。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、米国特許第６，６０５，４５８号において提供されるような各種の洗浄組成物が、本開示のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと使用するのに有用である。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物は、圧縮粒状衣類洗浄用組成物であり、他の実施形態では、組成物は、着色された衣類の洗濯に有用な粒状衣類洗浄用組成物であり、更なる実施形態では、組成物は、洗浄能力を介して柔軟効果を与える粒状衣類洗浄用組成物であり、更なる実施形態では、組成物は、高負荷の衣類洗浄用組成物である。いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に述べられるような衣類洗浄用組成物である。更に、本開示のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、ヨーロッパ又は日本の洗浄条件下において特に有用な粒状洗濯洗剤組成物（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号を参照）において有用である。
【０１４７】
いくつかの代替的実施形態では、本開示は、本明細書において提供される少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む硬質表面洗浄用組成物を提供する。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，３７６，４５０号、及び同第６，３７６，４５０号に述べられるような硬質表面洗浄用組成物である。
【０１４８】
更なる実施形態では、本開示は、本明細書において提供される少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む食器洗い用組成物を提供する。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に述べられるような硬質表面洗浄用組成物である。更なるいくつかの実施形態では、本開示は、本明細書において提供される少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む食器洗い用組成物を提供する。いくつかの更なる実施形態では、本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，３７６，４５０号及び同第６，３７６，４５０号に述べられるような口腔ケア用組成物を含む。上記に述べた米国特許第６，３７６，４５０号、同第６，６０５，４５８号、同第６，６０５，４５８号、及び同第６，６１０，６４２号に含まれる化合物及び洗浄添加物質の配合及び説明は、本明細書において提供されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと共に使用するのに有用である。
【０１４９】
本開示の洗浄組成物は、任意の適当な形態に配合され、配合者によって選択される任意のプロセスによって調製されるものであり、その非限定的な例が、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２、及び同第５，４８６，３０３号に述べられている。低いｐＨの洗浄組成物が望ましい場合、こうした組成物のｐＨは、モノエタノールアミンなどの物質又はＨＣｌなどの酸性物質を添加することによって調整される。
【０１５０】
本開示の目的において不可欠ではないが、以下に示す添加物質の非限定的な一覧は、本発明の洗浄組成物における使用に適したものである。いくつかの実施形態では、これらの添加物質は、例えば、洗浄能力を補助又は高める目的、洗浄しようとする基材を処理する目的、又は香料、着色剤、染料などと同様に、洗浄組成物の美観を改変する目的で添加される。こうした添加物質は、本開示のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドに追加されるものであることは理解される。このような追加的成分の正確な性質及びその添加濃度は、組成物の物理的形態、及び組成物が使用される洗浄操作の性質によって決まる。適当な補助剤物質としては、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、付着補助剤、分散剤、更なる酵素及び酵素安定化剤、触媒物質、漂白活性化剤、漂白促進剤、過酸化水素、過酸化水素の供給源、予め生成された過酸、ポリマー分散剤、粘土汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、泡抑制剤、染料、香料、構造弾性化剤、柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤、及び／又は顔料が挙げられる。下記の開示以外に、こうした他の添加物質及び使用濃度の適当な例が、援用される米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２号、及び同第６，３２６，３４８号に見られる。上記の添加成分は、本開示の洗浄組成物の残部を構成してよい。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本開示に基づく洗浄組成物は、少なくとも１種類の界面活性剤及び／又は界面活性剤システムを含み、その場合、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの混合物から選択される。いくつかの低いｐＨの洗浄組成物の実施形態（例えば、約３〜約５の無希釈ｐＨを有する組成物）では、組成物はアルキルエトキシル化硫酸塩を一般的に含まないが、これはこうした界面活性剤はこのような組成物酸性成分によって加水分解されうるためである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、洗浄組成物の約０．１重量％〜約６０重量％の濃度で存在し、代替的な実施形態では、濃度は約１重量％〜約５０重量％であり、更なる実施形態では、濃度は約５重量％〜約４０重量％である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は少なくとも１種類のキレート剤を含む。適当なキレート剤としては、これらに限定されるものではないが、銅、鉄及び／又はマンガンキレート剤、並びにこれらの混合物が挙げられる。少なくとも１種類のキレート剤が用いられる実施形態では、本開示の洗浄組成物は、本発明の洗浄組成物の約０．１重量％〜約１５重量％、又は更には約３．０重量％〜約１０重量％のキレート剤を含む。
【０１５３】
いくつかの更なる実施形態では、本明細書において提供される洗浄組成物は、少なくとも１種類の付着補助剤を含む。適当な付着補助剤としては、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボキシレート、ポリテレフタル酸などの汚れ放出ポリマー、カオリナイト、モンモリロナイト、アタパルガイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイトなどの粘土、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１５４】
本明細書において示されるように、いくつかの実施形態では、再付着防止剤が本開示のいくつかの実施形態において有用である。いくつかの好ましい実施形態では、非イオン性界面活性剤が有用である。例えば、自動食器洗いの実施形態では、非イオン性界面活性剤が表面改質の目的、特にフィルム形成及びスポット形成を避け、ツヤを改善するためのシート化効果の目的で有用である。これらの非イオン性界面活性剤は、汚れの再付着を防止するうえでも有用である。いくつかの好ましい実施形態では、再付着防止剤は、当該技術分野では周知の非イオン性界面活性剤である（例えば、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、１以上の移染防止剤を含む。適当なポリマー移染防止剤としては、これらに限定されるものではないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はこれらの混合物が挙げられる。少なくとも１種類の移染防止剤が用いられる実施形態では、本開示の洗浄組成物は、洗浄組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、又は更には約０．１重量％〜約３重量％を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物にはケイ酸塩が含まれる。いくつかのこうした実施形態では、ケイ酸ナトリウム（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶性フィロケイ酸塩）が有用である。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は約１％〜約２０％の濃度で存在する。いくつかの好ましい実施形態では、ケイ酸塩は、組成物の約５重量％〜約１５重量％の濃度で存在する。
【０１５７】
いくつかの更なる実施形態では、本開示の洗浄組成物は更に分散剤を含む。適当な水溶性有機物質としては、これらに限定されるものではないが、ホモポリマー若しくはコポリマーである酸又はそれらの塩が挙げられ、その場合、ポリカルボン酸は、炭素原子２個以下分だけ互いに離れた少なくとも２個のカルボキシルラジカルを有する。
【０１５８】
いくつかの更なる実施形態では、洗浄組成物中に使用される酵素は、任意の適当な方法によって安定化される。いくつかの実施形態では、本明細書において用いられる酵素は、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンの水溶性の供給源が最終組成物中に存在し、こうした供給源が酵素に上記のイオンを与えることによって安定化される。いくつかの実施形態では、酵素安定化剤として、オリゴ糖類、多糖類、及び、カルシウム塩などの、アルカリ土類金属を含む無機の２価金属塩が挙げられる。酵素安定化のための様々な技術が本開示において有用であるものと考えられる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書において用いられる酵素は、亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）イオン及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオン、並びに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びオキソバナジウム（ＩＶ））の水溶性の供給源が最終組成物中に存在し、こうした供給源が酵素に上記のイオンを与えることによって安定化される。塩酸塩及び硫酸塩も本開示のいくつかの実施形態において有用である。適当なオリゴ糖類及び多糖類（例えばデキストリン）の例は、当該技術分野では周知である（例えば、国際特許出願公開第０７／１４５９６４号を参照）。いくつかの実施形態では、ホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルボロン酸）及び／又はトリペプチドアルデヒドなどの可逆的プロテアーゼ阻害剤が、必要に応じて更に安定性を高めるうえで有用である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、漂白剤、漂白活性化剤、及び／又は漂白触媒が、本開示の組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は無機及び／又は有機漂白化合物を含む。無機漂白剤としては、これらに限定されるものではないが、過水和物塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、無機過水和物塩はアルカリ金属塩である。いくつかの実施形態では、無機過水和物塩は更なる保護はされずに結晶固体として含まれるが、いくつかの他の実施形態では塩はコーティングされる。当該技術分野では周知の任意の適当な塩が、本開示において有用である（例えば、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、漂白活性化剤が本開示の組成物中に使用される。漂白活性化剤は、一般的に、６０℃以下の温度での洗浄過程において漂白作用を高める有機過酸前駆物質である。本明細書における使用に適した漂白活性化剤としては、過加水分解条件下において、好ましくは約１個〜約１０個の炭素原子、特に約２個〜約４個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸、及び／又は場合により置換された過安息香酸を与える化合物が挙げられる。更なる漂白活性化剤は当該技術分野では周知のものであり、本開示において有用である（例えば、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【０１６１】
更に、いくつかの実施形態では、また、本明細書において更に述べるように、本開示の洗浄組成物は少なくとも１種類の漂白触媒を更に含む。いくつかの実施形態では、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、並びにコバルト、銅、マンガン、及び鉄の錯体が有用である。更なる漂白触媒も本開示において有用である（例えば、米国特許第４，２４６，６１２号、同第５，２２７，０８４号、同第４，８１０４１０号、国際特許出願公開第９９／０６５２１号、及び欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は１以上の触媒金属錯体を含む。いくつかの実施形態では、金属含有漂白触媒が有用である。いくつかの好ましい実施形態では、規定の漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンのカチオン）、漂白触媒活性をほとんどあるいはまったく有さない補助金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムのカチオン）、並びに触媒金属及び補助金属のカチオンに対して規定の安定度定数を有する金属イオン封鎖剤、特にエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）及びこれらの水溶性の塩を含む触媒システムを含む金属漂白触媒が用いられる（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号を参照）。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物はマンガン化合物によって触媒される。こうした化合物及び使用濃度は、当該技術分野では周知のものである（例えば、米国特許第５，５７６，２８２号を参照）。更なる実施形態では、コバルト漂白触媒が本開示の洗浄組成物において有用である。各種のコバルト漂白触媒が当該技術分野で知られており（例えば、米国特許第５，５９７，９３６号及び同第５，５９５，９６７号を参照）、公知の方法によって容易に調製される。
【０１６３】
いくつかの更なる実施形態では、本開示の洗浄組成物は、巨大多環式剛性配位子（macropolycyclic rigid ligand）（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含む。実用上の問題として、限定するものではないが、いくつかの実施形態において、本開示により提供される組成物及び洗浄プロセスは、水性洗浄媒質中に少なくとも約１億分の１のオーダーの活性ＭＲＬ種を与えるように調整され、いくつかの好ましい実施形態では、約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、より好ましくは約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、最も好ましくは約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬを洗浄液中に与えるように調整される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明の遷移金属漂白触媒中の好ましい遷移金属としては、これらに限定されるものではないが、マンガン、鉄及びクロムが挙げられる。好ましいＭＲＬとしては、これらに限定されるものではないが、架橋された特殊な超剛性配位子が挙げられる（例えば、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン）。適当な遷移金属ＭＲＬは、公知の方法によって容易に調製される（例えば、国際特許出願公開第２０００／３２６０１号、及び米国特許第６，２２５，４６４号を参照）。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は金属ケア剤を含む。金属ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、及び非鉄金属（例えば、銀及び銅）などの金属の変色、腐蝕、及び／又は酸化を防止及び／又は低減するうえで有用である。適当な金属ケア剤としては、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号、国際特許出願公開第９４２６８６０号及び同第９４／２６８５９号に述べられるものがある。いくつかの実施形態では、金属ケア剤は亜鉛塩である。更なるいくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、約０．１重量％〜約５重量％の１以上の金属ケア剤を含む。
【０１６６】
上記に述べたように、本開示の洗浄組成物は、任意の適当な形態に配合され、配合者によって選択される任意のプロセスによって調製されるものであり、その非限定的な例が、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２、及び同第５，４８６，３０３号に述べられている。低いｐＨの洗浄組成物が望ましいいくつかの実施形態では、こうした組成物のｐＨは、ＨＣｌなどの酸性物質を添加することによって調整される。
【０１６７】
本明細書において開示される洗浄組成物は、所定の場所（例えば、表面、食器、又は衣類）を洗浄するうえで有用である。通常は、その場所の少なくとも一部を、無希釈の形態、又は洗浄液で希釈された本発明の洗浄組成物の特定の実施形態と接触させ、次いで必要に応じてその場所を洗い、かつ／又は濯ぐ。本開示の目的において、「洗浄」には、これらに限定されるものではないが、こすり洗い、及び機械的な攪拌が含まれる。いくつかの実施形態では、洗浄組成物は一般的に、溶液中で約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である場合、水の温度は、通常約５℃〜約９０℃の範囲であり、場所が衣類を含む場合、衣類に対する水の質量比は、通常約１：１〜約３０：１である。
【０１６８】
ＶＩ．化学試薬としてのＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド
短鎖の脂質に対するＴｆｕＬｉｐ２の選択性のために、本発明のポリペプチドは、Ｃ４〜Ｃ１６の基質が関与するエステル交換反応を行ううえで特に有用である。代表的な用途としては、ミルク脂肪の加水分解、構造化トリグリセリドの合成、ポリマーの合成及び分解、乳化剤及び界面活性剤の生成、香料及び芳香剤として使用されるエステルを製造する目的、バイオ燃料及び合成潤滑剤を製造する目的、過酸を生成する目的、並びに油脂化学産業における他の用途での、パーソナルケア製品、医薬品及び農薬の成分の合成がある。上記に述べた酵素の更なる使用については、米国特許出願公開第２００７００２６１０６号、同第２００６００７８６４８号、及び同第２００５０１９６７６６号、並びに国際特許出願公開第２００５／０６６３４７号に述べられており、これらの文書を援用するものである。
【０１６９】
大まかに言えば、基質と受容分子を、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド又はその変異体の存在下、エステル交換反応を行うのに適した条件下でインキュベートした後、必要に応じて反応から生成物を単離する。あるいは、条件は、食品に関連したものである場合もあり、生成物は単離されずに食品の成分となりうる。
【０１７０】
本発明の組成物及び方法の他の態様並びに実施形態は、上記の説明及び以下の実施例より明らかとなるであろう。
【実施例】
【０１７１】
以下の実施例は、本開示の特定の好ましい実施形態及び態様を実証及び例示する目的で示されるものであって、限定的に解釈されるべきものではない。
【０１７２】
以下の実験の開示では以下の略語を用いる。Ｍ（モル（濃度））；ｍＭ（ミリモル（濃度））；μＭ（マイクロモル（濃度））；ｎＭ（ナノモル（濃度））；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）；μｌ及びμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈ及びｈｒ（時間）；℃（摂氏）；ＱＳ（適量）；ＮＤ（行わず）；ｒｐｍ（回転／分）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；（ＨＣｌ（塩酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（塩基対）；ｋｂ（キロ塩基対）；ｋＤ（キロダルトン）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ｗ／ｖ（重量−体積比）；ｖ／ｖ（体積−体積比）；ｇ（重力加速度）；ＯＤ（光学密度）；ｐｐｍ（１００万分の１）；ｍ−（メタ−）；ｏ−（オルト−）；ｐ−（パラ−）；ＢＣＥ（ＢＣＥ１０３セルラーゼ）；Ｇｌｕ−ＢＬ（バチルス・リケニフォルミスグルタミルエンドペプチダーゼＩ）；ＴｆｕＬｉｐ２（サーモビフィダ・フスカリパーゼ２）；ＮＥＦＡ（非エステル化脂肪酸）；ｐ−ＮＰ（ｐ−ニトロフェニル）；ＳＲＩ（染み除去指数）。
【０１７３】
（実施例１）
サーモビフィダ・フスカリパーゼ２（ＴｆｕＬｉｐ２）のクローニング及び発現
サーモビフィダ・フスカリパーゼ２（又はＢＴＡ加水分解酵素２）の遺伝子はこれまでに同定されており（Ｌｙｋｉｄｉｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８９：２４７７〜２４８６，２００７）、その配列は、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＹＰ＿２８８９４４として公開されている。Ｂ．サブチリス発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）を制限酵素ＢｓｓＨＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＢＣＥ１０３−ＢＢＩ融合遺伝子配列を含まないＤＮＡフラグメントを単離して、発現用のバックボーンとして使用した。このフラグメントを、ＴｆｕＬｉｐ２酵素をコードした合成遺伝子にライゲートすることにより、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドのＮ末端を、ｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩによってコードされるバチルス・サブチリスのＡｐｒＥプロペプチドの３番目のアミノ酸に融合させた。ホスト内での天然のシグナルペプチダーゼによる切断後、このようにして生成された組換えＴｆｕＬｉｐ２タンパク質は、アミノ末端に３個の更なるアミノ酸（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）を有していた。
【０１７４】
サーモビフィダ・フスカリパーゼ２（ＴｆｕＬｉｐ２）の合成遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号１に示す。
【０１７５】
ＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＴＣＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＴＡＧＣＧＣＧＴＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＴＧＧＣＧＧＧＡＣＡＡＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＴＡＣＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＴＣＴＣＴＣＣＧＧＧＧＴＡＣＡＣＧＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＡＴＣＴＡＴＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＣＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＴＣＡＣＡＡＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＴＡＣＧＡＣＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＴＧＡＡＴＧＣＡＧＣＣＣＴＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＡＣＧＧＴＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＧＡＴＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＣＡＴＡＧＣＡＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＡＣＴＴＡＧＡＴＴＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＣＣＴＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＡＴＴＣＣＧＴＴＧＡＣＧＣＣＴＴＧＧＣＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＴＣＣＣＧＡＣＧＣＴＣＡＴＴＡＴＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＡＣＧＡＴＴＧＣＡＣＣＧＧＴＣＧＣＧＡＣＡＣＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＧＴＴＣＴＡＴＡＡＣＴＣＡＴＴＧＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣＣＴＡＴＴＴＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧＡＡＴＡＴＴＣＣＧＡＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣＧＧＴＡＡＡＴＡＴＴＣＡＧＴＣＧＣＡＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＧＡＴＴＴＧＴＡＧＡＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＧＡＴＡＴＡＣＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＧＧＣＣＴＡＧＡＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＴＣＧＧＡＧＡＧＧＴＴＧＡＡＧＡＧＴＡＴＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＧＣＣＣＧＴＴＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴ
成熟したＴｆｕＬｉｐ２酵素のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１７６】
ＡＮＰＹＥＲＧＰＮＰＴＤＡＬＬＥＡＳＳＧＰＦＳＶＳＥＥＮＶＳＲＬＳＡＳＧＦＧＧＧＴＩＹＹＰＲＥＮＮＴＹＧＡＶＡＩＳＰＧＹＴＧＴＥＡＳＩＡＷＬＧＥＲＩＡＳＨＧＦＶＶＩＴＩＤＴＩＴＴＬＤＱＰＤＳＲＡＥＱＬＮＡＡＬＮＨＭＩＮＲＡＳＳＴＶＲＳＲＩＤＳＳＲＬＡＶＭＧＨＳＭＧＧＧＧＴＬＲＬＡＳＱＲＰＤＬＫＡＡＩＰＬＴＰＷＨＬＮＫＮＷＳＳＶＴＶＰＴＬＩＩＧＡＤＬＤＴＩＡＰＶＡＴＨＡＫＰＦＹＮＳＬＰＳＳＩＳＫＡＹＬＥＬＤＧＡＴＨＦＡＰＮＩＰＮＫＩＩＧＫＹＳＶＡＷＬＫＲＦＶＤＮＤＴＲＹＴＱＦＬＣＰＧＰＲＤＧＬＦＧＥＶＥＥＹＲＳＴＣＰＦ
３個のアミノ酸からなるアミノ末端の延長部分を有するＴｆｕＬｉｐ２酵素のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。
【０１７７】
ＡＧＫＡＮＰＹＥＲＧＰＮＰＴＤＡＬＬＥＡＳＳＧＰＦＳＶＳＥＥＮＶＳＲＬＳＡＳＧＦＧＧＧＴＩＹＹＰＲＥＮＮＴＹＧＡＶＡＩＳＰＧＹＴＧＴＥＡＳＩＡＷＬＧＥＲＩＡＳＨＧＦＶＶＩＴＩＤＴＩＴＴＬＤＱＰＤＳＲＡＥＱＬＮＡＡＬＮＨＭＩＮＲＡＳＳＴＶＲＳＲＩＤＳＳＲＬＡＶＭＧＨＳＭＧＧＧＧＴＬＲＬＡＳＱＲＰＤＬＫＡＡＩＰＬＴＰＷＨＬＮＫＮＷＳＳＶＴＶＰＴＬＩＩＧＡＤＬＤＴＩＡＰＶＡＴＨＡＫＰＦＹＮＳＬＰＳＳＩＳＫＡＹＬＥＬＤＧＡＴＨＦＡＰＮＩＰＮＫＩＩＧＫＹＳＶＡＷＬＫＲＦＶＤＮＤＴＲＹＴＱＦＬＣＰＧＰＲＤＧＬＦＧＥＶＥＥＹＲＳＴＣＰＦ
ＴｆｕＬｉｐ２タンパク質を、これまでに述べられている方法（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）を用いて、バチルス・サブチリス細胞（ｄｅｇＵＨｙ３２，ｏｐｐＡ，ΔｓｐｏＩＩＥ，ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，Δｅｐｒ，ΔｉｓｐＡ，Δｂｐｒ，Δｖｐｒ，ΔｗｐｒＡ，Δｍｐｒ−ｙｂｆＪ，ΔｎｐｒＢ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｅｒｍＣ）内で産生させた。
【０１７８】
（実施例２）
ＴｆｕＬｉｐ２の単離及び特性決定
限外濾過濃縮物を、発現用のバチルス・サブチリス株の１４Ｌスケールの回分発酵より得た。清澄化したブロスを、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの特性決定に用いた。
【０１７９】
ＴｆｕＬｉｐ２を精製するには、限外濾過濃縮物を１４Ｌスケールの回分発酵より得て、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０バッファーで５倍に希釈し、硫酸アンモニウムを最終濃度が１Ｍとなるように加える。硫酸アンモニウム沈殿により得られたペレットを回収し、更なる精製に供する。５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０バッファー中の１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化したＦａｓｔＦｌｏｗフェニルセファロースカラムを使用する。試料を平衡化流速（１２ｍＬ／分）の半分の速度でロードし、ローディング後に平衡化バッファーで洗う。勾配を用いて、バッファー中の濃度を１Ｍの硫酸アンモニウムから０Ｍにまで低下させる。５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ ８．０バッファーで、カラムから夾雑タンパク質を洗い流す。５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ ８．０、及び４０％プロピレングリコールを含むバッファーで、ＴｆｕＬｉｐ２タンパク質を溶出させる。各分画を、下記に述べる酪酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）アッセイを用いてアッセイする。リパーゼ活性を有する分画をプールし、５Ｋのメンブレンを備える攪拌式セルを用いて濃縮し、後の使用に備える。
【０１８０】
（実施例３）
ＴｆｕＬｉｐ２によるｐ−ニトロフェニルエステルの加水分解
エステル鎖の長さが異なる３種類の異なるｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）エステル基質に対してリパーゼ活性についてＴｆｕＬｉｐ２タンパク質をアッセイし、ＬｉｐＡの鎖長選択性を調べた。表３−１に、ｐＮＰエステル基質の詳細を示す。
【表３】
【０１８１】
予めエタノール（５％）に懸濁した０．８ｍＭのｐＮＰエステルを以下の２種類のバッファーの一方に加えて、ｐＮＰエステル基質を含む反応エマルションを調製した。すなわち、０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、６ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ ８．２に調整）、又は０．０５Ｍ ＣＡＰＳ、６ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ １０に調整）。ｐＮＰエステルの乳化を促進するため、０．５％アラビアゴムを両方のバッファーに加えた。
【０１８２】
このｐＮＰエステル／バッファー懸濁液を混合し、２分間超音波処理してから、それぞれ１００μＬを、２０μＬの酵素試料が入った９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに移した。遊離したｐＮＰの生成を、ブランク値（酵素なしの値）を用いてＯＤ４０５ｎｍで１５分間にわたって測定及び修正した。１分当たりに生成されるｐＮＰ生成物を記録し、ウェル中の加えた酵素試料に対して正規化した（加えた酵素１ｍｇ当たりのΔ ＯＤ／分）。異なる基質に対する相対的な酵素活性を計算し、各基質を用いて得られた生成物の放出速度を最も高い活性に対して正規化した（例えば、カプリル酸ｐＮＰ基質に対する活性を１００とした）。
【表４】
【０１８３】
表３−２に示されるように、ＴｆｕＬｉｐ２はｐＨ ８．２及びｐＨ １０の両方において、炭素４〜１６個の長さのｐＮＰエステル基質に対して活性を示した。
【０１８４】
（実施例４）
洗剤の存在下及び非存在下でのＴｆｕＬｉｐ２によるトリグリセリドの加水分解
ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを、洗剤の存在下及び非存在下でトリオクタン酸エステル及びトリオレイン酸エステル基質の加水分解についてアッセイした。トリオクタン酸グリセロール（ＣＡＳ ５３８−２３−８）及びトリオレイン酸グリセロール（ＣＡＳ １２２−３２−７）基質をシグマ社（Sigma）より購入した。この実験では以下の市販の洗剤を使用した。（１）ユニリーバ社（Unilever）より販売されるＯＭＯ色物用液体洗剤、（２）プロクター・アンド・ギャンブル社（Procter & Gamble）より販売されるＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤、（３）ブルモラー社（Blumoller）より販売されるＢｉｏｔｅｘ色物用粉末洗剤、及び（４）プロクター・アンド・ギャンブル社より販売されるＡｒｉｅｌ色物用粉末洗剤。
【０１８５】
ＯＭＯ色物用液体洗剤
ＯＭＯ色物用液体洗剤組成物は、５〜１５％のアニオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤、＜５％石鹸、カチオン性界面活性剤、ホスホン酸塩、香料、ブチルフェニルメチルプロピオネート、シトロネロール、酵素、及びベンゾイソチアゾリノンを含む。ＯＭＯ色物用液体洗剤は、以下の界面活性剤を含んでいる。すなわち、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス−７、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、及び水添ヤシ脂肪酸ナトリウム。
【０１８６】
ＯＭＯ色物用液体洗剤の成分は以下の通りである。水、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス−７、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、プロピレングリコール、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸ナトリウム、香料、硫酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ブチルフェニルメチルプロピオナール、ソルビトール、シトロネロール、プロテアーゼ、ベンゾイソチアゾリノン、ボロン酸、（４−ホルミルフェニル）、アミラーゼ、ＣＩ−４５１００、及びＣＩ−４２０５１。
【０１８７】
Ａｒｉｅｌ色物用液体洗剤
Ａｒｉｅｌ色物用液体洗剤組成物は、５〜１５％のアニオン性界面活性剤、＜５％非イオン性界面活性剤、ホスホン酸塩、石鹸、酵素、香料、ブチルフェニルメチルプロピオネート、及びゲラニオールを含む。Ａｒｉｅｌ色物用液体洗剤は、以下の界面活性剤を含んでいる。すなわち、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１４パレス−７、ラウレス硫酸ナトリウム、及びＣ１２〜Ｃ１４パレス−４。
【０１８８】
Ａｒｉｅｌ色物用液体洗剤の成分は以下の通りである。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、パーム核脂肪酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１４パレス−７、ラウレス硫酸ナトリウム、変性アルコール、Ｃ１４〜Ｃ１５パレス−４、ｍｅａホウ酸エステル、硫酸化エトキシル化ヘキサメチレンジアミン四級化プロピレングリコール、水、水添ヒマシ油、香料、プロテアーゼ、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１５アルコール、グリコシダーゼ、ポリビニルピリジン−ｎ−オキシド、ポリエチレングリコール、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ジメチコン、着色剤、シリカ、ブチルフェニルメチルプロピオナール、及びゲラニオール。
【０１８９】
Ｂｉｏｔｅｘ色物用粉末洗剤
Ｂｉｏｔｅｘ色物用粉末洗剤組成物は、１５〜３０％のゼオライト、５〜１５％のアニオン性界面活性剤、＜５％石鹸、ポリカルボキシレート、ホスホン酸塩、酵素、及び香料を含む。Ｂｉｏｔｅｘ色物用粉末洗剤は、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス−７界面活性剤を含んでいる。
【０１９０】
Ｂｉｏｔｅｘ色物用液体洗剤の成分は以下の通りである。ゼオライト、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、水、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス−７、牛脂脂肪酸ナトリウム、マレイン酸−アクリル酸コポリマーナトリウム塩、クエン酸ナトリウム、ラウレス−７、セルロースガム、ラウレス−５、ナトリウムＥＤＴＭＰ、香料、エチドロン酸４ナトリウム、サブチリシン、アミラーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、及びセルロース。
【０１９１】
Ａｒｉｅｌ色物用粉末洗剤
Ａｒｉｅｌ色物用粉末洗剤組成物は、５〜１５％のアニオン性界面活性剤、ゼオライト、＜５％非イオン性界面活性剤、ポリカルボキシレート、ホスホン酸塩、酵素、香料、ヘキシルシンナマル、リモネン、及びブチルフェニルメチルプロピオネートを含む。Ａｒｉｅｌ色物用粉末洗剤は、以下の界面活性剤を含んでいる。すなわち、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス硫酸ナトリウム、及びＣ１２〜Ｃ１５パレス−７。
【０１９２】
Ａｒｉｅｌ色物用粉末洗剤の成分は以下の通りである。硫酸ナトリウム，炭酸ナトリウム、ベントナイト、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、シリコアルミン酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス硫酸ナトリウム、ナトリウムアクリル酸／ＭＡコポリマー、水、クエン酸、ジメチコン、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス−７、硫酸マグネシウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、香料、セルロースガム、塩化ナトリウム、エチドロン酸４ナトリウム、トルエンスルホン酸ナトリウム、デンプン、オクテニルコハク酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、グリコシダーゼ、エチレンジアミンジコハク酸３ナトリウム、硫酸、グリコール酸ナトリウム、フェニルプロピルエーテルメチコン、ポリアクリル酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸、シリカを含むジクロロジメチルシランＲＸ、着色剤、グリセリン、ラウレス硫酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、Ｃ１０〜１６アルキルベンゼンスルホン酸、ブチルフェニルメチルプロピオナール、ヘキシルシンナマル、及びリナロール。
【０１９３】
各洗剤を以下のようにして加熱により不活性化した。すなわち、各液体洗剤は９５℃の水浴中に２時間置き、各粉末洗剤はこれを水に加えた０．１ｇ／ｍＬ調合液をホットプレート上で１時間沸騰させた。熱処理により、市販の洗剤配合物中のすべてのタンパク質成分の酵素活性は失活するが、酵素以外の洗剤成分の性質は維持される。加熱処理の後、各洗剤を希釈し、リパーゼ酵素活性についてアッセイした。
【０１９４】
トリオクタン酸エステル及びトリオレイン酸エステルの反応エマルションを、エタノール（５％）に予め懸濁した０．４％トリオクタン酸エステル又はトリオレイン酸エステルを以下の２種類のバッファーの一方に加えることにより調製した。すなわち、ｐＨ ８．２に調整した０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、又はｐＨ １０に調整した０．０５Ｍ ＣＡＰＳである。バッファーは液体洗剤と使用するものはｐＨ ８．２に、粉末洗剤と使用するものはｐＨ １０に調整した。いずれのバッファーも、水の硬度を６ｍＭ ＣａＣｌ２に調整した。トリグリセリドの乳化を促進するため、２％アラビアゴムを両方のバッファーに加えた。
【０１９５】
各洗剤にトリオクタン酸エステルを加えた反応エマルションを、エタノール（５％）に予め懸濁した０．４％トリオクタン酸エステルを以下の２種類のバッファーの一方に加えることにより調製した。すなわち、ｐＨ ８．２に調整した０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、又はｐＨ １０に調整した０．０５Ｍ ＣＡＰＳである。いずれのバッファーも、水の硬度を２４０ｐｐｍに調整した。最終的なアッセイ混合物は、トリグリセリドの乳化を促進するために異なる量の洗剤を含んでいた。
【０１９６】
各反応エマルションは、高剪断混合を２分間行い（２４，０００ｍ−１，Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５、ジャンケ・クンケル社（Janke Kunkel））、次いで１５０μＬを、３０μＬの酵素試料が予め入れられた９６穴マイクロタイタープレートのウェルに移すことによって調製した。遊離脂肪酸の生成を、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）の定量的測定のためのインビトロ酵素比色分析アッセイを用いて測定した。この方法は遊離脂肪酸に対する特異性を有するものであり、添加されたアシルＣｏＡシンテターゼの存在下で、脂肪酸によって補酵素Ａ（ＣｏＡ）がアシル化されることに基づいたものである。このようにして生成したアシルＣｏＡは、添加されたアシルＣｏＡオキシダーゼによって酸化され、ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素が生成する。これにより、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ（β−ヒドロキシエチル）−アニリンが４−アミノアンチピリンと酸化的に縮合して紫色の付加物を生成し、これを比色分析によって測定することができる。３０℃で６分間のインキュベーション後に生成した遊離アミノ酸の量を、ＮＥＦＡ ＨＲ（２）キット（和光純薬工業株式会社（Wako Chemicals GmbH）、ドイツ）の材料を使用し、３０μＬの加水分解溶液を、１２０μＬのＮＥＦＡ Ａ溶液が予め入れられた９６穴マイクロタイタープレートのウェルに移すことによって測定した。３０℃で３分間インキュベートした後、６０μＬのＮＥＦＡ Ｂ溶液を加えた。３０℃で４．５分間インキュベートした後、５２０ｎｍにおけるＯＤを測定した。
【０１９７】
表４−１は、ＴｆｕＬｉｐ２によるトリオレイン酸エステル及びトリオクタン酸エステルの加水分解を示す。トリグリセリドの加水分解のデータは、遊離脂肪酸のμｍｏｌとして求めた。結果は、バッファー中でのトリオクタン酸エステル（Ｃ８）に対する活性を１００としてこの活性に対して示す。
【表５】
【０１９８】
表４−２は、ｐＨ ８．２及びｐＨ １０．０における異なる洗剤の存在下又は非存在下でのＴｆｕＬｉｐ２によるトリオクタン酸エステルの加水分解を示す。洗剤の存在下でのトリオクタン酸エステルの加水分解のデータは、試験を行った両方のｐＨ値における洗剤の非存在下でのトリオクタン酸エステルの加水分解に対する、洗剤の存在下でのトリオクタン酸エステルの加水分解の比率（％）として示す。
【表６】
【０１９９】
ＴｆｕＬｉｐ２は、異なる液体及び粉末洗剤中で洗剤濃度の関数としてリパーゼ活性を示した。
【０２００】
（実施例５）
ＴｆｕＬｉｐ２の洗浄性能
染みが付いた衣類に対するＴｆｕＬｉｐ２の洗浄性能について、微小布片アッセイ方式で試験を行った。２４穴プレート方式（ヌンク社（Nunc）、デンマーク）で設定された脂質含有実験用染み（オランダの試験材料センター（Center for Testmaterials）より購入したＣＳ−６１布片）を使用して、染みの除去実験を行った。各アッセイウェルに、予め切断したＣＳ−６１布片の１３ｍｍの小片が入るように設定した。各布片は、リフレクトメータ（ＣＲ−４００、コニカ・ミノルタ社）を使用して予め読み取ってから、２４穴プレートに置いた。
【０２０１】
使用したバッファーは、液体洗剤の試験用には２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（最終濃度）、ｐＨ ８．２、粉末洗剤の試験用には２０ｍＭ ＣＡＰＳ（最終濃度）、ｐＨ １０．０とした。水の硬度を、両方のバッファーについて２４０ｐｐｍに調整した。使用した加熱不活性化した市販の洗剤は、実施例４のトリグリセリド加水分解アッセイにおいて述べたものと同じものを使用した。
【０２０２】
簡単に述べると、９００μＬの適当なバッファーを、布片が入った２４穴プレートの各ウェルに加えた。反応を開始するため、各ウェルに１００μＬの体積の酵素試料を加えた。各プレートを、３７℃で２００ｒｐｍで３０分間振盪した。インキュベーション後、反応バッファーを除去し、各ウェル内の布地を１ｍＬの蒸溜水で３回洗い流した。洗い流した布片を取り出した後、各布片を５０℃で４時間乾燥してから反射率を測定した。洗浄性能を、各布片の洗浄の前後の反射率測定値の差として計算した。反射率の測定は、分光光度計（ＣＲ−４００、コニカ・ミノルタ社）によりＣＩＥ Ｌ＊ａ＊ｂ＊測定値を取ることによって行った。洗浄された布地の染み除去指数（ΔＳＲＩ）の値の差は、下式を用いて洗浄しない布地に対して計算した。
【数１】
【０２０３】
この式では、ΔＬ、Δａ、Δｂはそれぞれ、洗浄の前後におけるＣＩＥ Ｌ＊、ＣＩＥ ａ＊、及びＣＩＥ ｂ＊値の差であり、ただし、Ｌ＊は明度を規定し、ａ＊及びｂ＊は、色度を規定する（例えば、Ｐｒｅｃｉｓｅ Ｃｏｌｏｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｏｌｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｆｒｏｍ Ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ Ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ，ｐｐ．３２〜５９，１９９８）を参照。
【表７】
【０２０４】
ＴｆｕＬｉｐ２は、ユニリーバ社（Unilever）より販売されるＯＭＯ色物用液体洗剤中では洗浄性能をまったく示していない。しかしながら、ＴｆｕＬｉｐ２は、プロクター・アンド・ギャンブル社（Procter & Gamble）より販売されるＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤及びブルモラー社（Blumoller）より販売されるＢｉｏｔｅｘ色物用粉末洗剤中では顕著な洗浄性能を示し、プロクター・アンド・ギャンブル社より販売されるＡｒｉｅｌ色物用粉末洗剤では更に高い性能を示した。
【０２０５】
（実施例６）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む液体洗濯洗剤組成物
この実施例では、液体洗濯洗剤組成物の異なる配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表８】
【０２０６】
＃１：１Ｎ ＨＣｌ水溶液を加えることにより、配合の無希釈ｐＨを約３〜約５の範囲に調整する。上記の実施例６（Ｉ）〜（ＩＩ）のｐＨは約５〜約７であり、実施例６（ＩＩＩ）〜（Ｖ）のｐＨは約７．５〜約８．５である。
【０２０７】
（実施例７）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む液体食器手洗い用洗剤組成物
この実施例では、異なる食器手洗い用液体洗剤の配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表９】
【０２０８】
実施例７（Ｉ）〜（ＶＩ）のｐＨは約８〜約１１である。
【０２０９】
（実施例８）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む液体自動食器洗い用洗剤組成物
この実施例では、異なる液体自動食器洗い用洗剤の配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１０】
【０２１０】
（実施例９）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む粒状及び／又は錠剤洗濯組成物
この実施例では、粒状及び／又は錠剤洗濯洗剤の異なる配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１１】
【０２１１】
＊ 香料、染料、増白剤／ＳＲＰ１／カルボキシメチルセルロースナトリウム／光漂白剤／ＭｇＳＯ４／ＰＶＰＶＩ／泡抑制剤／高分子量ＰＥＧ／粘土。
【０２１２】
（実施例１０）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む更なる液体洗濯洗剤
この実施例では、液体洗濯洗剤の更なる配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１２】
【０２１３】
（実施例１１）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む高密度食器洗い用洗剤
この実施例では、高密度食器洗い用洗剤の異なる配合を提供する。これらの圧縮型配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１３】
【０２１４】
＊ 増白剤／染料／ＳＲＰ１／カルボキシメチルセルロースナトリウム／光漂白剤／ＭｇＳＯ４／ＰＶＰＶＩ／泡抑制剤／高分子量ＰＥＧ／粘土。実施例１１（Ｉ）〜（ＶＩ）のｐＨは、約９．６〜約１１．３である。
【０２１５】
（実施例１２）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む錠剤食器洗い用洗剤組成物
この実施例は、異なる錠剤食器洗い用洗剤の配合を提供する。以下の本開示の錠剤洗剤組成物は、１２個のヘッドを有する標準的なロータリープレスを使用して、１３ＫＮ／ｃｍ２（１３０ＭＰａ）の圧力で粒状食器洗い用洗剤組成物を圧縮することによって調製される。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１４】
【０２１６】
＊ 増白剤／ＳＲＰ１／カルボキシメチルセルロースナトリウム／光漂白剤／ＭｇＳＯ４／ＰＶＰＶＩ／泡抑制剤／高分子量ＰＥＧ／粘土。実施例１２（Ｉ）〜１２（ＶＩＩ）のｐＨは約１０〜約１１．５であり、実施例１２（ＶＩＩＩ）のｐＨは８〜１０である。実施例１２（Ｉ）〜１２（ＶＩＩＩ）の錠剤重量は約２０ｇ〜約３０ｇである。
【０２１７】
（実施例１３）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む液体硬質表面洗浄用洗剤
この実施例では、液体硬質表面洗浄用洗剤の異なる配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１５】
【０２１８】
実施例１３（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のｐＨは、約７．４〜約９．５である。
【０２１９】
（実施例１４）
プロテアーゼの存在下及び非存在下での洗剤中のＴｆｕＬｉｐ２の安定性
洗剤中のＴｆｕＬｉｐ２の安定性を、市販の洗剤においてプロテアーゼの存在下又は非存在下で調べ、同様の条件下における市販の基準酵素Ｌｉｐｅｘ（登録商標）（サーモマイセス・ラヌギノーサスＬｉｐ３リパーゼ（ノボザイムズ社（Novozymes）、コペンハーゲン、デンマーク））の安定性と比較した。
【０２２０】
ＯＭＯ（商標）Ｓｍａｌｌ ａｎｄ Ｍｉｇｈｔｙ液体洗剤（ユニリーバ社（Unilever））及びＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤（プロクター・アンド・ギャンブル社（（Procter & Gamble））を、使用に先立って９５℃の水浴中に２時間入れることにより加熱不活性化した。加熱による不活性化の後、各洗剤をプロテアーゼ及びリパーゼ活性について試験したところ、すべてについて陰性であった。
【０２２１】
ＴｆｕＬｉｐ２及びＬＩＰＥＸ（登録商標）リパーゼを、各洗剤に０．２ｐｐｍの最終濃度で加えた。サブチリシンプロテアーゼ（Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ；ダニスコ・ユー・エス社ジェネンコア部門（Danisco US Inc.,Genencor Division））を、１．０ｐｐｍの最終濃度で添加した。リパーゼ及びプロテアーゼのこれらの濃度は、洗剤の洗浄媒質において典型的なものであり、洗浄条件における酵素の実際の使用条件を反映している。リパーゼ又はリパーゼ／プロテアーゼを加えた洗剤混合物を３７℃に２８日間置いた。０、２、７、及び１５日目に試料を抜き取り、トリブチリン（ＣＡＳ ６０−０１−５）を基質として使用して、リパーゼ活性についてアッセイした。この方法は、酵素がトリブチリンを加水分解する速度に基づいたものである。リパーゼの作用によって生成した酪酸を水酸化ナトリウムで滴定し、ＮａＯＨの消費量を時間の関数として記録した。
【０２２２】
０．０５Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％アラビアゴム、及び９％グリセロール中に５％トリブチリン（ｖ／ｖ）を含むエマルションを、Ｔ２５ Ｕｌｔｒａ ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）分散装置（ＩＫＡ（登録商標）、ドイツ）を使用して、試料を２０秒間高剪断混合することによって調製した。洗剤試料に加えた２ＭＬの酵素を、２５ＭＬのホモジナイズした基質に加え、試料を３０℃で６分間インキュベートした。反応混合物のＰＨを８．０に維持するのに必要とされる０．０５ＭのＮＡＯＨの量を求め、ＮＡＯＨ塩基の消費量に基づいて酵素活性を計算した。表１４−１に示されるデータは、プロテアーゼを加えていない０日目の活性と比較した残留リパーゼ活性の比率（％）を表している（それぞれの洗剤について）。ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、特にプロテアーゼの存在下で、ＬＩＰＥＸ（登録商標）リパーゼよりも優れた安定性を明らかに示した。
【表１６】
【０２２３】
（実施例１５）
異なる温度におけるＴｆｕＬｉｐ２の洗浄性能
染み付きの布地に対するＴｆｕＬｉｐ２の洗浄性能を、市販の加熱不活性化したＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤及びＡｒｉｅｌ色物用粉末洗剤中で、微小布片アッセイ方式で１５℃、２０℃、３０℃、及び４０℃で試験した。アッセイは、プレートを３７℃ではなく、それぞれ１５、２０、３０、及び４０℃で振盪する変更を行った以外は実施例５で述べたのと同様にして行った。０．２又は０．７Ｕ／ｍＬのＴｆｕＬｉｐ２を添加し、トリオレイン酸エステル（ｐＨ ８．２）から放出される遊離脂肪酸（μｍｏｌ／分）を実施例４で述べたのと同様にして測定した。結果を表１５−１、１５−２、及び１５−３に示す。
【表１７】
【０２２４】
表１５−１の結果は、ＴｆｕＬｉｐ２が、洗剤の非存在下で１５℃〜４０℃の範囲のすべての温度において用量反応的な洗浄性能を示すことを示している。最も高い性能は、４０℃で高用量の酵素を用いた場合に得られている。
【表１８】
【０２２５】
表１５−２の結果は、ＴｆｕＬｉｐ２が、０．６ｇ／ＬのＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤中で１５℃〜４０℃の範囲のすべての温度において用量反応的な洗浄性能を示すことを示している。最も高い性能は、４０℃で高用量の酵素を用いた場合に得られている。３０℃及び４０℃では、０．６ｇ／ＬのＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤の存在下でＴｆｕＬｉｐ２によって得られる洗浄性能は、洗剤の非存在下でＴｆｕＬｉｐ２によって得られる洗浄性能よりも大幅に優れている。
【表１９】
【０２２６】
表１５−３の結果は、ＴｆｕＬｉｐ２が、０．６ｇ／ＬのＡｒｉｅｌ色物用粉末洗剤中において２０℃〜４０℃で用量反応的な洗浄性能を示すことを示している。最も高い性能は、４０℃で高用量の酵素を用いた場合に得られている。３０℃及び４０℃では、０．６ｇ／ＬのＡｒｉｅｌ色物用粉末洗剤の存在下でＴｆｕＬｉｐ２によって得られる洗浄性能は、洗剤の非存在下でＴｆｕＬｉｐ２によって得られる洗浄性能よりも大幅に優れている。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００９年１２月２１日出願の米国特許仮出願第６１／２８８，６６６号、及び２０１０年６月２日出願の同第６１／３５０，７４７号に基づく優先権を主張するものであり、これらの出願をいずれもその全容にわたって本出願に援用するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明の組成物及び方法は、サーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）からクローニングされたリパーゼ、そのリパーゼをコードしたポリヌクレオチド、及びそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在の洗濯洗剤及び／又は衣類ケア組成物は、界面活性剤、酵素（プロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、及び／又はセルラーゼ）、漂白剤、ビルダーシステム、泡抑制剤、汚れ懸濁剤、汚れ放出剤、蛍光増白剤、柔軟剤、分散剤、移染防止化合物、研磨剤、殺菌剤、及び香料などの複雑な有効成分の組み合わせを含んでいる。
【０００４】
トリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成することによって油性の染みを除去するため、リパーゼ及びクチナーゼなどの脂肪分解酵素が洗剤洗浄組成物中に使用されてきた。しかしながら、これらの酵素は、洗浄組成物中に存在する界面活性剤及び他の成分によってしばしば阻害され、油性の染みを除去する性能が妨げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、洗浄組成物の過酷な環境中で機能しうるリパーゼ及びクチナーゼが求められている。
【０００６】
また、バイオ燃料、潤滑剤、及び他の合成及び半合成炭化水素の製造におけるエステル交換反応を行ううえで、よりロバストかつ効果的なリパーゼ及びクチナーゼが求められている。こうした酵素は、天然又は一般的に入手可能な開始物質を用いるものであることが好ましく、また、合成を複雑なものとし、毒性廃棄物質の生成につながる合成反応における保護及び脱保護工程を必要としないものであることが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の組成物及び方法は、サーモビフィダ・フスカからクローニングされたリパーゼ２（ＴｆｕＬｉｐ２）に関する。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２は３残基（ＡＧＫ）のアミノ末端延長部を有する。
【０００８】
本開示の一態様では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と８０％〜９９％同一（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一）である。更なる実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは所定のアミノ末端延長部を有する。いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）内で発現させられる。本開示は更に、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを、プロモーターと協働可能な組み合わせでコードしたポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【０００９】
本開示の好ましい一態様では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む洗剤組成物が提供される。いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）である。更なる実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一）である。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は界面活性剤（イオン性又は非イオン性）を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、Ｃ１２〜１４パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス硫酸ナトリウム、Ｃ１４〜１５パレス−４からなる群の１以上のものを含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤はイオン性界面活性剤を含む。いくつかの好ましい実施形態では、イオン性界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、洗剤は８．０〜１０．０のｐＨで配合される。いくつかの実施形態では、洗剤は、洗濯洗い用洗剤、食器用洗剤、及び硬質表面洗浄用洗剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、洗剤は、液体、粉末、粒状固形物、及び錠剤からなる群から選択される形態である。特定の好ましい実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、３０℃〜４０℃の温度で洗剤中で酵素活性を有する。
【００１０】
別の態様では、サーモビフィダ・フスカから得られるリパーゼと、界面活性剤とを含む洗剤組成物であって、洗浄しようとする表面から油性の染みを除去するうえで、そのリパーゼを含まない同等の洗剤組成物よりも効果的である洗剤組成物が提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、リパーゼはＴｆｕＬｉｐ２リパーゼである。いくつかの実施形態では、リパーゼは、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リパーゼは、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、リパーゼは組換えリパーゼである。いくつかの実施形態では、リパーゼはバチルス内で発現される組換えリパーゼである。いくつかの実施形態では、リパーゼはバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）内で発現される組換えリパーゼである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、界面活性剤はイオン性又は非イオン性界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１以上の界面活性剤である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、Ｃ１２〜１４パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス硫酸ナトリウム、及びＣ１４〜１５パレス−４からなる群から選択される１以上の界面活性剤を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、約８．０〜約１０．０のｐＨで配合される。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、約８．２〜約１０．０のｐＨで配合される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、洗濯洗剤、食器洗い用洗剤、及び硬質表面洗浄用洗剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、洗剤組成物の形態は、液体、粉末、粒状固形物、及び錠剤からなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、約３０℃〜約４０℃の温度で脂質を加水分解するうえで効果的である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、サーモビフィダ・フスカのリパーゼの代わりにシュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）のリパーゼ変異体Ｍ２１Ｌ（ＬＩＰＯＭＡＸ（商標））を含む同等の洗剤組成物と比較して、Ｃ４〜Ｃ１６の基質を加水分解するうえでより効果的である。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、特定の鎖長を有する基質に対する選択性がより低いことから、Ｃ４〜Ｃ１６の範囲の基質を加水分解するうえでより効果的である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は更にプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、洗剤組成物は更にサブチリシンプロテアーゼを含む。いくつかの実施形態では、サーモビフィダ・フスカリパーゼの安定性は、サーモビフィダ・フスカリパーゼの代わりにサーモマイセス・ラヌギノーサ（Thermomyces lanuginosus）のＬｉｐ３リパーゼ（ＬＩＰＥＸ（登録商標））を含む同等の洗剤組成物中におけるサーモマイセス・ラヌギノーサＬｉｐ３リパーゼの安定性よりも高い。いくつかの実施形態では、リパーゼの安定性は最終的な洗浄媒質中で測定される。
【００１９】
別の態様では、表面の汚れ又は染み中に存在する脂質を加水分解する方法であって、前記表面を、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド及び界面活性剤を含む洗剤組成物と接触させる工程を含む方法が提供される。上記の段落、説明文、及び実施例の洗剤組成物はこの目的に適している。
【００２０】
更なる態様では、エステル交換反応を行うための方法であって、ドナー分子を、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物と接触させる工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、ドナー分子はＣ４〜１６の炭素鎖を有する。好ましい一実施形態では、ドナー分子はＣ８の炭素鎖を有する。
【００２１】
ＴｆｕＬｉｐ２組成物及び方法のこれらの態様並びに他の態様は、以下の説明より明らかとなるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｉ．序論
以下に、サーモビフィダ・フスカよりクローニングされたリパーゼ（ＴｆｕＬｉｐ２）に関連する組成物及び方法について述べる。当該組成物及び方法は、クローニング及び発現されたＴｆｕＬｉｐ２が、洗剤組成物の存在下でカルボン酸エステル加水分解酵素の活性を有するという観察に一部基づいたものである。ＴｆｕＬｉｐ２はまた、洗剤組成物中でプロテアーゼが存在する場合であっても優れた安定性を示す。これらの特徴のため、ＴｆｕＬｉｐ２は様々な洗浄用途における使用に極めて適したものであり、この酵素は、洗剤組成物中に見出される界面活性剤及び他の成分の存在下で脂質を加水分解することができる。
【００２３】
ＴｆｕＬｉｐ２は様々な天然及び合成基質に対して活性を示すが、この酵素はＣ４〜Ｃ１６の基質に対して選択性を示し、Ｃ８の基質に対してピーク活性を示すことが分かっている。この特異性のため、ＴｆｕＬｉｐ２は、短鎖トリグリセリドの加水分解、及び短鎖脂肪酸が関与するエステル交換反応を行ううえで極めて適したものである。
【００２４】
ＩＩ．用語の定義
本発明の組成物及び方法を詳細に述べるのに先立って、理解を助けるため、以下の用語を定義する。定義されない用語及び略語は、当該技術分野において用いられるそれらの通常の意味を有するものとする。
【００２５】
本明細書において使用するところの「カルボン酸エステル加水分解酵素」（Ｅ．Ｃ．３．１．１）とは、カルボン酸エステルに作用する酵素のことを指す。
【００２６】
本明細書において使用するところの「リパーゼ」、「リパーゼ酵素」、「脂肪分解酵素」、「脂肪分解ポリペプチド」、又は「脂肪分解タンパク質」とは、トリグリセリド又はリン脂質の分解能などの脂質分解能を示す酵素、ポリペプチド、又はタンパク質のことを指す。脂肪分解酵素は、例えばリパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ又はクチナーゼであってよい。本明細書において使用するところの脂肪分解活性とは、当該技術分野では周知の任意の方法によって測定することができる（例えば、Ｇｕｐｔａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３７：６３〜７１，２００３、米国特許第５，９９０，０６９号、及び国際特許出願公開第９６／１８７２９Ａ１号を参照）。
【００２７】
本明細書において使用するところの「脂肪酸」なる用語は、動物性又は植物性の油脂から誘導されるか、又は油脂中に含有されるカルボン酸のことを指す。脂肪酸は、一般的に４〜２２個の炭素原子を有し、末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）によって特徴づけられるアルキル基の鎖で構成される。脂肪酸は、飽和又は不飽和であってよく、固体、半固体、又は液体であってよい。
【００２８】
本明細書において使用するところの「トリグリセリド」なる用語は、脂肪酸とグリセロールとの天然に存在する任意のエステルのことを指す。トリグリセリドは油脂の主成分である。トリグリセリドは、ＣＨ２（ＯＯＣＲ１）ＣＨ（ＯＯＣＲ２）ＣＨ２（ＯＯＣＲ３）の一般式を有し、ただしＲ１、Ｒ２、及びＲ３は異なる鎖長であってよい。
【００２９】
本明細書において使用するところの「アシル」とは、カルボン酸から−ＯＨ基を除くことによって一般的に得られる有機酸基（ＲＣＯ−）の一般的名称である。
【００３０】
本明細書において使用するところの「アシル化」なる用語は、通常は分子の−ＯＨ基の側にアシル基を置換／付加する化学変換のことを指す。
【００３１】
本明細書において使用するところの「アシル鎖基質」とは、カルボン酸エステル加水分解酵素（例えば、クチナーゼ、リパーゼ、アシルトランスフェラーゼ、トランスフェラーゼなど）に対するドナー分子である。基質はその炭素鎖長によって記述することができる。例えば、Ｃ４基質／ドナーは炭素４個の鎖長を有し、Ｃ８基質／ドナーは炭素８個の鎖長を有する、といった具合である。
【００３２】
本明細書において使用するところの「トランスフェラーゼ」なる用語は、基質への分子又は基（例えばアシル基）の転移を触媒する酵素のことを指す。
【００３３】
本明細書において使用するところの「脱離基」とは、別の求核物質による置換によってアシルドナーから開裂する求核物質のことを指す。
【００３４】
本明細書において使用するところの「洗剤安定性」なる語句は、洗剤組成物混合物中の特定の洗剤組成物成分（加水分解酵素など）の安定性のことを指す。代表的な加水分解酵素はプロテアーゼであり、安定性は、プロテアーゼによる加水分解に対するリパーゼの耐性のことを指しうる。本発明のリパーゼの安定性は、本明細書において述べる標準的な、例えばＬＩＰＯＭＡＸ（商標）又はＬＩＰＥＸ（商標）などの市販のリパーゼの安定性と比較することができる。
【００３５】
本明細書において使用するところの「ペルヒドロラーゼ」とは、洗浄、漂白、及び消毒などの用途に適した過酸を生成する反応を触媒する能力を有する酵素である。
【００３６】
本明細書において使用するところの、「水性組成物」及び「水性環境」といった語句で用いられる「水性」なる用語は、少なくとも５０％が水で構成された組成物のことを指す。水性組成物は、少なくとも５０％の水、少なくとも６０％の水、少なくとも７０％の水、少なくとも８０％の水、少なくとも９０％の水、少なくとも９５％の水、少なくとも９７％の水、少なくとも９９％の水、又は更には少なくとも９９％の水を含みうる。
【００３７】
本明細書において使用するところの「界面活性剤」なる用語は、当該技術分野において、界面活性作用を有するものとして一般的に認識されている任意の化合物のことを指す。界面活性剤には一般的に、アニオン性、カチオン性、非イオン性、及び両性イオン性化合物が含まれるが、これらについては更に後述する。
【００３８】
本明細書において使用するところの「表面特性」とは、静電荷に関連して、また、タンパク質の表面が示す疎水性及び親水性のような性質に関連して用いられる。
【００３９】
「酸化安定性」なる用語は、例えば漂白剤又は酸化合物剤に曝露又は接触させられる際に、脂肪分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書において開示される他のプロセスにおいて、優勢な条件下で一定の時間にわたって所定量の酵素活性を維持する本開示のリパーゼのことを指す。いくつかの実施形態では、当該リパーゼは、所定の時間、例えば少なくとも約１分、約３分、約５分、約８分、約１２分、約１６分、約２０分といった時間にわたって漂白剤又は酸化剤に接触させられた後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の脂肪分解活性を維持する。
【００４０】
「キレート化剤安定性」なる用語は、例えばキレート化剤に曝露又は接触させられる際に、脂肪分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書において開示される他のプロセスにおいて、優勢な条件下で一定の時間にわたって所定量の酵素活性を維持する本開示のリパーゼのことを指す。いくつかの実施形態では、当該リパーゼは、所定の時間、例えば少なくとも約１０分、約２０分、約４０分、約６０分、約１００分といった時間にわたってキレート化剤に接触させられた後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の脂肪分解活性を維持する。
【００４１】
「熱安定性」及び「熱安定的」なる用語は、例えば温度変化に曝される際に、脂肪分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書において開示される他のプロセスにおいて優勢な条件下で一定の時間にわたって特定の温度に曝された後、所定量の酵素活性を維持する本開示のリパーゼのことを指す。温度変化には、温度の上昇、又は低下が含まれる。いくつかの実施形態では、当該リパーゼは、所定の時間、例えば少なくとも約６０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約３００分といった時間にわたって温度変化に曝された後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％の脂肪分解活性を維持する。
【００４２】
「洗浄活性」なる用語は、脂肪分解プロセス、加水分解プロセス、洗浄プロセス又は本明細書において開示される他のプロセスにおいて、優勢な条件下で当該リパーゼによって得られる洗浄性能のことを指す。いくつかの実施形態では、洗浄性能は、例えば、草、血液、ミルク、又は卵のタンパク質などの酵素感受性の染みを標準的な洗浄条件に供した後、各種のクロマトグラフィー、分光光度法又は他の定量的方法によって測定されるように、こうした染みについて各種の洗浄アッセイを適用することによって測定される。代表的なアッセイには、これらに限定されるものではないが、国際特許出願公開第９９／３４０１１号及び米国特許第６，６０５，４５８号（これらをいずれも本願に援用する）に述べられるもの、並びに実施例に含まれる方法がある。
【００４３】
リパーゼの「洗浄有効量」なる用語は、特定の洗浄組成物中の所望の酵素活性のレベルを実現する上記に述べたリパーゼの量のことを指す。このような有効量は当業者によって容易に求められるものであり、使用される特定のリパーゼ、洗浄用途、洗浄組成物の特定の組成、及び、液体又は乾燥（例えば、粒状、バー）組成物のいずれが必要とされるか、といった多くの因子に基づいている。
【００４４】
本明細書において使用するところの「洗浄添加物質」なる用語は、所望の洗浄組成物の具体的な種類、及び製品の形態（例えば、液体、顆粒、粉末、バー、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、又はフォーム組成物）に対して選択される任意の液体、固体又は気体状物質を意味し、これらの物質はまた、組成物中に用いられるリパーゼ酵素と適合性を有することが好ましい。いくつかの実施形態では、粒状組成物は「圧縮」形態であり、他の実施形態では、液体組成物は「濃縮」形態である。
【００４５】
本明細書において使用するところの「洗浄組成物」及び「洗浄配合物」とは、衣類、食器、コンタクトレンズ、他の固体表面、毛髪、皮膚、歯などの洗浄しようとする物品からの望ましくない化合物（例えば、汚れ又は染み）の除去において有用な化学成分の混合物のことを指す。当該組成物又は配合物は、洗浄しようとする表面、物品又は衣類、及び組成物又は配合物の所望の形態に応じて、液体、ゲル、顆粒、粉末、又はスプレーの形態であってよい。
【００４６】
本明細書において使用するところの「洗剤組成物」及び「洗剤配合物」なる用語は、汚れた対象物の洗浄用の洗浄媒質中での使用を目的とした化学成分の混合物のことを指す。洗剤組成物／配合物は一般的に少なくとも１種類の界面活性剤を含み、更に必要に応じて、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、青味剤及び蛍光染料、凝固防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、酸化防止剤、及び可溶化剤が含まれる。
【００４７】
本明細書において使用するところの「食器洗い用組成物」とは、粒子及び液体状形態を含むがこれらに限定されない、カトラリー類を含む食器を洗浄するための組成物のあらゆる形態のことを指す。いくつかの実施形態では、食器洗い用組成物は、自動食器洗い機において有用な「自動食器洗い用」組成物である。本開示が任意の特定の種類又は食器用組成物に限定されることは意図するところではない。実際、本開示は、セラミック、プラスチック、金属、陶磁器、ガラス、アクリルなどを含むがこれらに限定されない任意の材料の食器（例えば、プレート、カップ、グラス、ボールなどを含むがこれらに限定されない皿類）及びカトラリー（例えば、スプーン、ナイフ、フォーク、給仕器具などの器具）の洗浄において有用なものである。「食器」なる用語は、本明細書においては皿類及びカトラリー類の両方を指して用いられる。
【００４８】
本明細書において使用するところの「漂白」なる用語は、材料（例えば、衣類、洗濯物、パルプなど）の光沢化（すなわち増白）及び／又は洗浄を行ううえで充分な長さの時間、かつ適当なｐＨ及び温度条件下で行われる材料又は表面の処理のことを指す。漂白に適した化学物質の例としては、これらに限定されるものではないが、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２などが挙げられる。
【００４９】
本明細書において使用するところの変異型リパーゼの「洗浄性能」とは、組成物に変異型リパーゼを加えることなく洗剤に更なる洗浄性能を与える、洗浄に対する変異型リパーゼの寄与のことを指す。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。
【００５０】
「関連する洗浄条件」なる用語は、本明細書においては、特に、食器又は洗濯洗剤市場区分において家庭で実際に使用される洗浄温度、時間、洗浄力学、泡濃度（sud concentration）、洗剤の種類及び水の硬度といった条件を示す。
【００５１】
本明細書において使用するところの「消毒」なる用語は、物品の表面上の微生物の阻害又は殺滅のことを指す。本開示が、特定の表面、物品、又は除去しようとする汚染物質若しくは微生物に限定されることは意図するところではない。
【００５２】
本明細書における洗浄組成物の「圧縮」形態とは、密度に最もよく反映され、組成物の観点からは無機充填剤塩の量に反映される。無機充填剤塩は、粉末形態の洗剤組成物の従来の成分である。従来の洗剤組成物では、充填剤塩は、相当量、通常は全組成物の約１７〜約３５重量％の量で存在する。これに対して圧縮組成物では、充填剤塩は全組成物の約１５％以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、充填剤塩は、組成物の約１０重量％以下、又はより好ましくは約５重量％以下の量で存在する。いくつかの実施形態では、無機充填剤塩は、硫酸塩及び塩酸塩のアルカリ及びアルカリ土類金属塩から選択される。いくつかの実施形態では、好ましい充填剤塩は硫酸ナトリウムである。
【００５３】
本明細書において使用するところの「織物」又は「織物材料」なる用語は、織布、並びに紡糸、織物、編物、及び不織布への転換又はそれらとしての使用に適したステープルファイバー及びフィラメントのことを指す。この用語には、天然及び合成（例えば製造された）繊維から製造される紡糸が含まれる。
【００５４】
本明細書において使用するところの「精製された」又は「単離された」なる用語は、タンパク質、核酸、脂質、媒質成分などの他の分子からＴｆｕＬｉｐ２などの対象とする分子を物理的に分離することを指す。対象とする分子は、精製又は単離後には、試料中の物質の全体量の少なくとも５０％、及び更には少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上を占めうる（重量／重量）。
【００５５】
本明細書において使用するところの「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して連結された複数の連続したアミノ酸残基を有する分子のことを指す。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換可能に用いられる。タンパク質は必要に応じて修飾される（例えば、グリコシル化、リン酸化、アシル化、ファルネシル化、プレニル化、スルホン化など）ことによって、官能基が付加されてもよい。このようなアミノ酸配列が活性を示す場合、これらのアミノ酸配列を「酵素」と呼ぶことができる。アミノ酸配列は標準的なアミノ末端からカルボキシ末端に向かう方向で示し（すなわちＮ→Ｃ）、従来のアミノ酸残基の１文字又は３文字の略号を使用する。
【００５６】
「ポリヌクレオチド」なる用語には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヘテロ２本鎖、及びポリペプチドをコードすることが可能な合成分子が含まれる。核酸は１本鎖又は２本鎖であってよく、化学修飾されてもよい。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、互換可能に用いられる。遺伝子コードは縮重性であるため、特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンが用いられうるものであり、本発明の組成物及び方法には、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が含まれる。特に断らないかぎり、核酸配列は５’から３’末端に向かう方向で示される。
【００５７】
本明細書において使用するところの「野生型」及び「天然型」なる用語は、自然界で見出されるポリペプチド又はポリヌクレオチドのことを指す。
【００５８】
ポリペプチドに関し、「野生型」、「親の」、又は「参照」なる用語は、１以上のアミノ酸位置において人工的な置換、挿入、又は欠失を有さない、天然型ポリペプチドのことを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関し、「野生型」、「親の」、又は「参照」なる用語は、人工的なヌクレオシドの変化を有さない、天然型ポリヌクレオチドのことを指す。しかしながら、野生型、親の又は参照ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは天然型ポリヌクレオチドに限定されるわけではなく、野生型、親の又は参照ポリペプチドをコードするあらゆるポリヌクレオチドが含まれる。
【００５９】
本明細書において使用するところの「変異型ポリペプチド」とは、通常は組換えＤＮＡ技術によって、１以上のアミノ酸の置換、付加、又は欠失により親（又は参照）ポリペプチドから誘導されるポリペプチドのことを指す。変異型ポリペプチドは、親ポリペプチドと小数のアミノ酸残基だけ異なりうるものであり、親ポリペプチドとの一次アミノ酸配列の相同性／同一性のレベルによって定義される。好ましくは、変異型ポリペプチドは、親ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％のアミノ酸配列の同一性を有する。
【００６０】
配列同一性は、標準的なパラメータを用いてＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、及びＣＬＵＳＴＡＬなどの既知のプログラムによって求めることができる。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５；Ｋａｒｉｎら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３；及び、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８８）Ｇｅｎｅ ７３：２３７〜２４４を参照）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。更に、ＦＡＳＴＡを用いてデータベースを検索することが可能である（Ｐｅａｒｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４〜２４４８）。２つのポリペプチドがほぼ一致することを示すものとして、第１のポリペプチドは第２のポリペプチドとの免疫交差反応性を示すことがある。一般的に、保存的なアミノ酸置換において異なるポリペプチド同士は、免疫交差反応性を示す。したがって、あるポリペプチドは第２のポリペプチドと、例えば２つのペプチド同士が保存的置換のみにおいて異なる場合にほぼ同一である。
【００６１】
本明細書において使用するところの「変異型ポリヌクレオチド」とは、変異型ポリペプチドをコードするか、親ポリヌクレオチドと特定の程度の相同性／同一性を有するか、あるいは、親ポリヌクレオチド又はその相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものである。好ましくは、変異型ポリヌクレオチドは、親ポリヌクレオチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％のヌクレオチド配列の同一性を有する。一致率（％）を求めるための方法は当該技術分野では周知のものであり、直前に述べたとおりである。
【００６２】
「〜から誘導される」なる用語は、「〜を由来とする」、「〜から得られる」、「〜から得ることが可能な」、「〜から単離される」、及び「〜から生成される」という用語を含み、ある特定の物質の起源が別の特定の物質にあるか、又はある特定の物質が別の特定の物質に関連して述べられる特徴を有することを一般的に示す。
【００６３】
本明細書において使用するところの「ハイブリダイゼーション」なる用語は、当該技術分野では周知のように、核酸の鎖が塩基の対合を介して相補鎖と結合するプロセスのことを指す。
【００６４】
本明細書において使用するところの「ハイブリダイゼーション条件」なる語句とは、ハイブリダイゼーション反応が行われる条件のことを指す。これらの条件は、ハイブリダイゼーションが測定される条件の「ストリンジェンシー」の程度によって一般的に分類される。ストリンジェンシーの程度は、例えば、核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいたものでありうる。例えば一般的に、「最大のストリンジェンシー」は約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５°低い温度）で、「高ストリンジェンシー」はＴｍよりも約５〜１０°低い温度で、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０°低い温度で、「低ストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５°低い温度で起こる。これに代えるかあるいはこれに加えて、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション及び／又は１回以上のストリンジェンシー洗浄の塩又はイオン強度条件に基づいたものであってもよく、例えば、６×ＳＳＣ＝極めて低いストリンジェンシー、３×ＳＳＣ＝低〜中度のストリンジェンシー、１×ＳＳＣ＝中度のストリンジェンシー、及び０．５×ＳＳＣ＝高ストリンジェンシーである。機能的には、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性又はほぼ厳密な同一性を有する核酸配列を特定するためには最大のストリンジェンシー条件を用いることが可能であるのに対して、プローブと約８０％以上の配列同一性を有する核酸配列を特定するためには高ストリンジェンシー条件が用いられる。高い選択性が求められる用途では、比較的ストリンジェントな条件を用いてハイブリッドを形成させることが一般的に望ましい（例えば、比較的低い塩濃度及び／又は高い温度条件が用いられる）。本明細書において使用するところのストリンジェントな条件とは、５０℃で０．２×ＳＳＣとして定義される（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ ７．０）。
【００６５】
少なくとも２個の核酸又はポリペプチドとの関連で「ほぼ同様」及び「ほぼ同一」なる語句は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、親配列又は参照配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％の同一性を有する配列を含むか、官能性を付与することなく本開示の記載を回避する目的のみで行われるアミノ酸の置換、挿入、欠失、又は修飾を有さないことを意味する。
【００６６】
本明細書において使用するところの「発現ベクター」とは、特定のポリペプチドをコードし、適当なホスト内でそのポリペプチドを発現させることが可能な適当な調節配列に機能的に連結された、ＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトのことを指す。このような調節配列としては、転写を引き起こすプロモーター、こうした転写を調節する、場合により存在するオペレーター配列、適当なｍＲＮＡのリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の停止を調節する配列がある。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、又は単純に潜在的なゲノムインサートであってよい。適当なホスト内に形質転換されると、ベクターは複製され、ホストのゲノムとは独立して機能するか、場合によってはゲノム自体に組み込まれうる。
【００６７】
「組換え」なる用語は、例えば、コード配列に突然変異を導入することで変化したポリペプチドを生成すること、コード配列を別の遺伝子のコード配列と融合させること、遺伝子を異なるプロモーターの制御下に置くこと、遺伝子を異種生物内で発現させること、遺伝子の発現レベルを低下又は上昇させること、遺伝子をその自然の発現プロファイルとは異なる発現プロファイルで条件的又は構成的に発現させることなどにより、配列又は発現特性を変化させるように改変された遺伝物質（すなわち、核酸、核酸がコードするポリペプチド、並びにこうしたポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞）のことを指す。一般的に組換え核酸、ポリペプチド、及びこれらに基づく細胞は、関連する核酸、ポリペプチド、及び自然に見られる細胞とは同一ではなくなるように人為的に操作されている。
【００６８】
「シグナル配列」とは、ポリペプチドのＮ末端部分に結合したアミノ酸の配列のことを指し、タンパク質の成熟型の細胞からの分泌を促進するものである。細胞外タンパク質の成熟型は、分泌プロセスの際に切断されるシグナル配列は有していない。
【００６９】
「選択的マーカー」又は「選択可能なマーカー」なる用語は、導入された核酸又はベクターを含むホストの選択を容易にする、ホスト細胞において発現させることが可能な遺伝子のことを指す。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗微生物物質（例えば、ヒグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は、ホスト細胞に栄養的優位性のような代謝的優位性を与える遺伝子が挙げられる。
【００７０】
本明細書において使用するところの「調節要素」なる用語は、核酸配列の発現の特定の側面を調節する遺伝子要素のことを指す。例えばプロモーターは、機能的に連結されたコード領域の転写の開始を促進する調節要素である。更なる調節要素としては、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び停止シグナルが挙げられる。
【００７１】
本明細書において使用するところの「ホスト細胞」とは、当該技術分野では周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターを形質転換又はトランスフェクトした原核生物又は真核生物のホストである。形質転換されたホスト細胞は、タンパク質変異体をコードするベクターを複製するか、あるいは所望のタンパク質変異体を発現することが可能である。タンパク質変異体の前駆体、又はプレプロ体をコードするベクターの場合、一般的にこうした変異体は、発現されるとホスト細胞からホスト細胞の培地中へと分泌される。
【００７２】
細胞に核酸配列を挿入することに関連して「導入された」なる用語は、形質転換、形質導入、又はトランスフェクションを意味する。形質転換の手段としては、当該技術分野では周知のプロトプラスト形質転換、塩化カルシウム沈降法、電気穿孔法、ネイキッドＤＮＡ法などが挙げられる（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ（１９７９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１〜１１５；Ｓｍｉｔｈら（１９８６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４；及びＦｅｒｒａｒｉらによるＨａｒｗｏｏｄ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ｐｐ．５７〜７２，１９８９の総説を参照）。
【００７３】
本明細書において使用するところの「選択可能なマーカー」又は「選択可能な遺伝子産物」なる用語は、選択可能なマーカーが発現される細胞に抗生物質又は薬剤に対する耐性を与える酵素活性をコードする遺伝子の使用のことを指す。
【００７４】
他の技術的及び科学的用語は、本開示が関連する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する（例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；及びＨａｌｅ ａｎｄ Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，ＮＹ（１９９１）を参照）。
【００７５】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、内容的に明らかに示されていないかぎり、複数の対象物が含まれる。
【００７６】
各見出しは、便宜上示されるものであって、限定的に解釈されるべきではない。１つの見出しの下に含まれる説明は、明細書全体に適用されうるものである。
【００７７】
ＩＩＩ．ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド及びポリヌクレオチド
Ａ．ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド
一態様では、本発明の組成物及び方法は、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド又はその変異体を提供する。代表的なＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドとしては、サーモビフィダ・フスカ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＹＰ＿２８８９４４）から単離されたものがある。成熟したＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を有する。同様のほぼ同一のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが、例えばＴ．フスカの他の株又は単離物など、自然に存在しうる。本発明の組成物及び方法には、これら及び他の組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが含まれる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、上記の代表的なＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと特定のアミノ酸配列の相同性、例えば配列番号２（下記）又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の配列相同性を有する変異型ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドである。相同性は、例えば本明細書において述べるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、アミノ酸配列を整合することにより決定することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、ポリヌクレオチドの構造及び／又は機能に大きく影響しない置換を有する。代表的な置換は、表Ｉにまとめたような保存的突然変異である。
【表１】
【００８０】
天然型アミノ酸が関与する置換は、組換えＴｆｕＬｉｐ２をコードする核酸に突然変異を導入し、次いでこの変異型ポリヌクレオチドを特定の生物で発現させることにより一般的に行われる。非天然型アミノ酸が関与する置換、又はアミノ酸に対する化学修飾は、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが特定の生物によって合成された後に組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを化学的に修飾することにより一般的に行われる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、変異型組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは配列番号３とほぼ同一であり、これは変異型組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが、ポリヌクレオチドの構造、機能又は発現に大きく影響しないアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を有さないことを意味する。このような変異型組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドには、本発明の記載を回避する目的でのみ設計されたものが含まれる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド（その変異型を含む）は、リパーゼ、エステラーゼ、トランスエステラーゼ、及び／又はアシルトランスフェラーゼ活性を含むカルボン酸エステル加水分解酵素活性を有する。カルボン酸エステル加水分解酵素活性は、本明細書において述べるアッセイを用いるか、又は当該技術分野では周知の他のアッセイによって決定及び測定することができる。いくつかの実施形態では、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、洗剤組成物の存在下で活性を有する。
【００８３】
ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドには、カルボン酸エステル加水分解酵素活性を維持する「完全長」のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドのフラグメントが含まれる。こうしたフラグメントは、完全長ポリヌクレオチドの活性部位を保持していることが好ましいが、重要ではないアミノ酸残基の欠失を有してもよい。フラグメントの活性は、本明細書において述べるアッセイを用いるか、又は当該技術分野では周知の他のアッセイによって容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドのフラグメントは、洗剤組成物の存在下でカルボン酸エステル加水分解酵素活性を維持する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの細胞外分泌を指示するシグナルペプチドと融合される。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、異種生物、すなわちバチルス・サブチリス以外の生物内で発現される。代表的な異種生物としては、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、ジオバチルス（Geobacillus（以前のバチルス）ステアロサーモフィラス（stearothermophilus））、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・ロータス（Bacillus lautus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、又はストレプトマイセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）などのグラム陽性菌；大腸菌などのグラム陰性菌；例えばサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）などのサッカロマイセス属、又はシゾサッカロマイセス属などの酵母；並びに、例えばアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）又はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスベルギルス属、及びトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）などの糸状菌が挙げられる。これらの生物内に核酸を形質転換するための方法は当該技術分野では周知のものである。アスペルギルス属のホスト細胞の形質転換に適した方法が、欧州特許出願公開第２３８ ０２３号に述べられている。
【００８５】
特定の実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは異種生物内で分泌型ポリペプチドとして発現され、その場合、本組成物及び方法には、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを異種生物内で分泌型ポリペプチドとして発現させるための方法が含まれる。
【００８６】
Ｂ．ＴｆｕＬｉｐ２ポリヌクレオチド
本組成物及び方法の別の態様は、本明細書において特定されるもののような異種生物内でＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを発現させるための発現ベクターとの関連で提供される、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド（その変異体及びフラグメントを含む）をコードするポリヌクレオチドである。ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチドの発現を助けるための調節要素（例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサーなど）と機能的に連結させることができる。
【００８７】
ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードする代表的なポリヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する。ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードするほぼ同一のものを含む同様のポリヌクレオチド及び変異体は、例えばＴ・フスカの他の株又は単離物など、自然に存在しうる。遺伝子コードの縮重性を考慮すると、異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが、同じＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド、変異体、又はフラグメントをコードしうることを理解できよう。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードする上記の代表的なポリヌクレオチドと特定のアミノ酸配列の相同性、例えば配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の配列相同性を有する。相同性は、例えば本明細書において述べるＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用して、アミノ酸配列を整合することにより決定することができる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２をコードするポリヌクレオチドは、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの細胞外分泌を指示するシグナルペプチドのコード配列の後ろ（すなわち、その下流）のフレームに融合される。異種シグナル配列には、細菌のセルラーゼ遺伝子から得られるものが含まれる。発現ベクターは、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを発現させるのに適した、又は適当なホスト細胞内に発現ベクターを導入するのに先立って発現ベクターを増殖させるのに適した、異種ホスト細胞中に与えることができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定のハイブリダイゼーション条件下で配列番号１の代表的なポリヌクレオチド（又はその相補体）とハイブリダイズする。代表的な条件は、本明細書において述べられるストリンジェントな条件、及び高ストリンジェント条件である。
【００９１】
ＴｆｕＬｉｐ２ポリヌクレオチドは天然型であっても合成（すなわち、人工の）ものであってもよく、異なるホスト内での発現にコドンを最適化させるか、クローニング部位を導入するために突然変異させるか、あるいは官能性を付与するために改変することができる。
【００９２】
ＩＶ．ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの活性及び性質
本明細書において開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、広範なｐＨ条件にわたって酵素活性を有しうる。特定の実施形態では、開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、約ｐＨ ４〜約ｐＨ １１．５で酵素活性を有する。好ましい実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２は約ｐＨ ８〜約ｐＨ １０で活性である。本明細書において述べるｐＨの値は、±０．２だけ変化しうることに注意されたい。例えば、約８のｐＨの値は、ｐＨ ７．８〜ｐＨ ８．２で変化しうる。
【００９３】
本明細書において開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、例えば１０℃以下〜約５０℃の広範な温度にわたって酵素活性を有しうる。特定の実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼの最適な温度範囲は、約１０℃〜約２０℃、約２０℃〜約３０℃、約３０℃〜約４０℃、又は約４０℃〜約５０℃である。本明細書において述べる温度の値は、±０．２℃だけ変化しうることに注意されたい。例えば、約１０℃の温度は、９．８℃〜１０．２℃で変化しうる。
【００９４】
実施例３に示されるように、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの活性はＣ８の基質を用いた場合に最も高かったが、Ｃ４及びＣ１６の基質を用いた場合にも活性が認められた。これに対して、商業的に製造されているリパーゼであるＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（すなわち、シュードモナス・シュードアルカリゲネスリパーゼ変異体Ｍ２１Ｌ（ダニスコ・ユー・エス社（Danisco US.Inc.）ジェネンコア（Genencor）部門、米国カリフォルニア州、パロアルト））は、Ｃ１０の基質に対する選択性を有し、基質がより小さくなる（例えばＣ８）か又はより大きくなる（例えばＣ１６）と、活性は急速に低下した（示さず）。したがって、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、特定の長さの基質に対してはＬＩＰＯＭＡＸ（商標）よりも選択性が低いが、より短い鎖長の基質に対してＬＩＰＯＭＡＸ（商標）よりも選択的であるようである。実際、ＴｆｕＬｉｐ２は、溶液中（実施例４）、及び染みが布地上にある場合（実施例５）のいずれにおいても、洗剤組成物の存在下で代表的な油性染み物質に対して加水分解活性を示した。
【００９５】
優れた洗浄性能及び幅広い基質特異性を有すること以外に、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、洗剤組成物中で、特にプロテアーゼの存在下において安定性も有する。ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼの安定性を、同等のアッセイ条件を用いて、ＬＩＰＥＸ（商標）の安定性に対して測定することが便宜上可能である。代表的なアッセイ条件については本明細書に述べる（実施例１４を含むが、これに限定されない）。安定性については、最終的な洗浄条件下、又は洗剤配合物の濃縮された保存形態中においてアッセイを行うことができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含まない同等の洗剤組成物中で約１週間にわたって、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、又は更には少なくとも約２０％、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含まない同等の洗剤組成物中で約１５日間にわたって、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、又は更には少なくとも約２０％、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。代表的な洗剤組成物は、ＯＭＯ（商標）Ｓｍａｌｌ ａｎｄ Ｍｉｇｈｔｙ及びＡＲＩＥＬ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含まない同等の洗剤組成物中で約１週間にわたって、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、又は更には少なくとも約１．５倍、ＬＩＰＥＸ（商標）より安定的である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含まない同等の洗剤組成物中で約１５日間にわたって、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、又は更には少なくとも約１．５倍、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。代表的な洗剤組成物は、ＯＭＯ（商標）Ｓｍａｌｌ ａｎｄ Ｍｉｇｈｔｙ及びＡＲＩＥＬ（商標）である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含む同等の洗剤組成物中で約１週間にわたって、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、又は更には少なくとも約５００％、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含む同等の洗剤組成物中で約約１５日間にわたって、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、少なくとも約１，０００％、少なくとも約１，１００％、少なくとも約１，２００％、少なくとも約１，３００％、少なくとも約１，４００％、少なくとも約１，５００％、少なくとも約１，６００％、少なくとも約１，７００％、又は更には少なくとも約１，８００％、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。代表的な洗剤組成物は、ＯＭＯ（商標）Ｓｍａｌｌ ａｎｄ Ｍｉｇｈｔｙ及びＡＲＩＥＬ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含む同等の洗剤組成物中で約１週間にわたって、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、又は更には少なくとも約５倍、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、プロテアーゼを含む同等の洗剤組成物中で約１５日間にわたって、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、又は更には少なくとも約１８倍、ＬＩＰＥＸ（商標）よりも安定的である。代表的な洗剤組成物は、ＯＭＯ（商標）Ｓｍａｌｌ ａｎｄ Ｍｉｇｈｔｙ及びＡＲＩＥＬ（商標）である。
【００９８】
ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼのこれらの、並びに他の性質及び利点について本明細書において述べる。
【００９９】
Ｖ．ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む洗剤組成物
本明細書において開示される組成物及び方法の一態様は、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド（その変異体又はフラグメントを含む）を含む洗剤組成物、及び洗浄用途においてこうした組成物を使用するための方法である。洗浄用途としては、これらに限定されるものではないが、洗濯又は繊維製品のクリーニング、食器洗い（手洗い及び自動）、染みの前処理などが挙げられる。特定の用途は、脂質が除去すべき汚れ又は染みの成分であるような用途である。洗剤組成物は、通常、ＴｆｕＬｉｐ２又はその変異体の有効量、例えば、少なくとも０．０００１重量％、約０．０００１〜約１、約０．００１〜約０．５、約０．０１〜約０．１重量％、又は更には約０．１〜約１重量％、又はそれよりも多い量を含む。約０．４ｇ／Ｌ〜約２．２ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約２．０ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約１．７ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約１．５ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約１ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ〜約０．８ｇ／Ｌ、又は約０．４ｇ／Ｌ〜約０．５ｇ／Ｌの濃度を有する洗剤組成物を、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼの有効量と混合することができる。洗剤組成物は、約０．４ｍＬ／Ｌ〜約２．６ｍＬ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ〜約２．０ｍＬ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ〜約１．５ｍ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ〜約１ｍＬ／Ｌ、約０．４ｍＬ／Ｌ〜約０．８ｍＬ／Ｌ、又は約０．４ｍＬ／Ｌ〜約０．５ｍＬ／Ｌの濃度で存在してもよい。
【０１００】
特に断らないかぎり、本明細書において与えられるすべての成分又は組成物の濃度は、その成分又は組成物の活性濃度に関して記載されるものであり、市販の供給源中に存在しうる例えば残留溶媒又は副生成物のような不純物は除外される。酵素成分の重量は、全活性タンパク質に基づいたものである。比率（％）及び比はすべて、特に断らないかぎりは重量で計算している。比率（％）及び比はすべて、特に断らないかぎりは全組成物を基準として計算している。代表的な洗剤組成物において、酵素濃度は全組成物中の純粋な酵素の重量によって表し、特に断らないかぎり、各洗剤成分は全組成物中の重量によって表している。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、洗剤組成物は、非イオン性、半極性、アニオン性、カチオン性、双性イオン性、又はこれらの組み合わせ及び混合物でありうる、１以上の界面活性剤を含む。界面活性剤は、通常、約０．１重量％〜６０重量％の濃度で存在する。代表的な界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｃ１２〜１４パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス硫酸ナトリウム、Ｃ１４〜１５パレス−４、ラウレス硫酸ナトリウム（例えば、Ｓｔｅｏｌ ＣＳ−３７０）、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、Ｃ１２エトキシレート（Ａｌｆｏｎｉｃ １０１２〜６、Ｈｅｔｏｘｏｌ ＬＡ７、Ｈｅｔｏｘｏｌ ＬＡ４）、アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（例えば、Ｎａｃｃｏｎｏｌ ９０Ｇ）、並びにこれらの組み合わせ及び混合物が挙げられる。
【０１０２】
本明細書において述べる洗剤組成物とともに使用することが可能なアニオン性界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩（ＬＡＳ）、α−オレフィンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、アルキル硫酸エステル（脂肪アルコール硫酸エステル）（ＡＳ）、アルコールエトキシ硫酸エステル（ＡＥＯＳ又はＡＥＳ）、２級アルカンスルホン酸塩（ＳＡＳ）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−若しくはアルケニルコハク酸、又は石鹸が挙げられる。洗剤組成物は、アルコールエトキシレート（ＡＥＯ又はＡＥ）、カルボキシルアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、国際特許出願公開第９２／０６１５４号に述べられる）、並びにこれらの組み合わせ及び混合物などの０〜４０％の非イオン性界面活性剤を更に含みうる。
【０１０３】
本明細書において述べる洗剤組成物とともに使用することが可能な非イオン性界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、脂肪酸のポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、ＴＷＥＥＮ類）、ポリオキシエチレンアルコール、ポリオキシエチレンイソアルコール、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ＴＲＩＴＯＮ類及びＢＲＩＪ）、ポリオキシエチレンエステル、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェノール又はオクチルフェニル−エチレンオキシド縮合物（例えば、ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ４０）、エチレンオキシドと脂肪アルコールとの縮合物（例えば、ＬＵＢＲＯＬ）、ポリオキシエチレンノニルフェノール、ポリアルキレングリコール（ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ Ｆ１０８）、糖ベースの界面活性剤（例えば、グリコピラノシド、チオグリコピラノシド）、並びにこれらの組み合わせ及び混合物が挙げられる。
【０１０４】
本明細書において開示される洗剤組成物は、これらに限定されるものではないが、５〜１５％のアニオン性界面活性剤、＜５％の非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、ホスホネート、石鹸、酵素、香料、ブチルフェニルメチルプロピオネート、ゲラニオール、ゼオライト、ポリカルボキシレート、ヘキシルシンナマル、リモネン、カチオン性界面活性剤、シトロネロール、及びベンズイソチアゾリノンを含む混合物を有しうる。
【０１０５】
洗剤組成物は更に、１以上の洗剤ビルダー又はビルダーシステム、錯化剤、ポリマー、漂白システム、安定化剤、起泡促進剤、泡抑制剤、腐蝕防止剤、汚れ懸濁剤、汚れ再付着防止剤、染料、殺菌剤、ヒドロトロープ、変色防止剤、蛍光増白剤、柔軟剤、及び香料を更に含んでもよい。洗剤組成物は、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、又は更なるカルボン酸エステル加水分解酵素を含むがこれらに限定されない、酵素を更に含んでもよい。洗剤組成物のｐＨは、本明細書において述べるように中性〜塩基性でなければならない。
【０１０６】
少なくとも１種類のビルダーを含むいくつかの実施形態では、洗剤組成物は、洗浄組成物の少なくとも約１重量％（すなわち、ｗｔ／ｗｔ、重量パーセント）、約３重量％〜約６０重量％、又は更には約５重量％〜約４０重量％のビルダーを含む。ビルダーとしては、これらに限定されるものではないが、ポリリン酸のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及びアルカノールアンモニウム塩、アルカリ金属ケイ酸塩、アルカリ土類及びアルカリ金属炭酸塩、アルミノケイ酸塩、ポリカルボキシレート化合物、エーテルヒドロキシポリカルボキシレート、無水マレイン酸とエチレン又はビニルメチルエーテルとのコポリマー、１，３，５−トリヒドロキシベンゼン−２，４，６−トリスルホン酸、並びにカルボキシメチルオキシコハク酸、エチレンジアミン４酢酸及びニトリロ３酢酸のようなポリ酢酸の各種のアルカリ金属塩、アンモニウム塩及び置換アンモニウム塩、並びに、例えばメリト酸、コハク酸、クエン酸、オキシジコハク酸、ポリマレイン酸、ベンゼン１，３，５−トリカルボン酸、カルボキシメチルオキシコハク酸のようなポリカルボキシレート、並びにこれらの可溶性塩が挙げられる。実際、任意の適当なビルダーが本開示の異なる実施形態において有用であると考えられる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ビルダーは、クエン酸塩及びポリリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム及びトリポリリン酸ナトリウム六水和物、トリポリリン酸カリウム、及びトリポリリン酸ナトリウムとトリポリリン酸カリウムとの混合物など）などの水溶性の硬度イオン複合体（例えば封鎖ビルダー）を形成する。当該技術分野では周知のものを含む（例えば、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）任意の適当なビルダーが、本開示において有用であると考えられる。
【０１０８】
本明細書において示されるように、いくつかの実施形態では、本明細書において述べる洗浄組成物は、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白剤活性剤、漂白剤触媒、他の酵素、酵素安定システム、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ放出ポリマー、移染剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、着色剤、充填剤塩、ヒドロトロープ、光活性剤、蛍光剤、柔軟剤、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、収縮防止剤、シワ防止剤、殺菌剤、防カビ剤、カラースペックル（color speckles）、シルバーケア（silvercare）、変色防止及び／又は腐蝕防止剤、アルカリ性付与剤、可溶化剤、キャリア、加工助剤、顔料、及びｐＨ調整剤を含む添加物質を更に含む（例えば、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４及び同第５，６４６，１０１号を参照）。特定の洗浄組成物物質の実施形態を以下に詳しく例示する。洗浄添加物質が、洗浄組成物中のＴｆｕＬｉｐ２変異体と適合性を有さないような実施形態では、洗浄添加物質とリパーゼとを、これら２つの成分を合わせることが適切となるまで分離（すなわち、互いに接触しないように）しておくのに適当な方法が用いられる。このような分離方法には、当該技術分野では周知のあらゆる適当な方法が含まれる（例えば、ジェルキャップ、カプセル化、錠剤、物理的分離など）。
【０１０９】
本明細書において述べる洗浄組成物は、例えば、洗濯用途、硬質表面の洗浄、食器洗い用途、並びに入れ歯、歯、毛髪及び皮膚などの美容用途において効果的に使用することができる。更に、本明細書において述べるＴｆｕＬｉｐ２酵素は、低温溶液中において高い効果を示すという特有の効果のために、洗濯用途に特に適している。更に、ＴｆｕＬｉｐ２酵素は、粒状及び液体組成物中で使用することができる。
【０１１０】
本明細書において述べるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、添加用製品における洗浄用途に使用することもできる。いくつかの実施形態では、低温溶液洗浄用途において有用である。いくつかの実施形態では、本開示は、更なる漂白効果が望ましい場合に、洗浄プロセスにおいて添加するのに特に適した少なくとも１種類の開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む、洗浄添加用製品を提供する。こうした場合には、これに限定されないが、低温溶液洗浄用途が含まれる。いくつかの実施形態では、添加用製品はその最も単純な形態、すなわち１以上のリパーゼである。いくつかの実施形態では、添加用製品は洗浄プロセスに添加される剤形にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、添加用製品は、過酸素源が使用され、高い漂白効果が望まれる場合に、洗浄プロセスに添加される剤形にパッケージングされる。これらに限定されるものではないが、ピル、錠剤、ジェルキャップ、又は予め計量された粉末若しくは液体などの他の一回用量単位を含む、任意の適当な一回容量単位の形態が、本開示とともに使用するのに有用である。いくつかの実施形態では、こうした組成物の体積を増すために充填剤又はキャリア物質が添加される。適当な充填剤又はキャリア物質としては、これらに限定されるものではないが、硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩といった各種の塩、並びにタルク、粘土などが挙げられる。液体組成物に適した充填剤又はキャリア物質としては、これらに限定されるものではないが、水、又はポリオール及びジオールなどの低分子量の一級及び二級アルコールが挙げられる。このようなアルコールの例としては、これらに限定されるものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが挙げられる。いくつかの実施形態では、本組成物は、約５％〜約９０％のこうした物質を含む。ｐＨを低下させるうえで、酸性充填剤が有用である。また、いくつかの実施形態では、洗浄添加用製品は、下記により詳細に述べるような添加成分を含む。
【０１１１】
本発明の洗浄組成物及び洗浄添加用製品は、本明細書において述べるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの少なくとも１つのものの有効量を、単独で、又は他のリパーゼ及び／又は更なる酵素と組み合わせて必要とする。必要とされる酵素の濃度は、１以上の開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを添加することによって得られる。一般的に、本発明の洗浄組成物は、少なくとも約０．０００１重量％、約０．０００１〜約１０、約０．００１〜約１、又は更には約０．０１〜約０．１重量％の開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの少なくとも１つのものを含む。
【０１１２】
本明細書における洗浄組成物は、水による洗浄動作における使用時に、洗浄水が約５．０〜約１１．５、又は更には約７．５〜約１０．５のｐＨを有するように一般的に配合される。液体製品の配合物は、約３．０〜約９．０、又は更には約３〜約５の無希釈ｐＨを有するように一般的に配合される。粒状洗濯製品は、約９〜約１１のｐＨを有するように一般的に配合される。推奨される使用レベルにｐＨを調節する技術としては、緩衝剤、アルカリ、酸などの使用が挙げられ、これらは当業者には周知のものである。
【０１１３】
適当な低ｐＨ洗浄組成物は、約３〜約５の無希釈ｐＨを一般的に有し、このようなｐＨ環境において加水分解する界面活性剤は一般的に含まない。このような界面活性剤には、少なくとも１個のエチレンオキシド部分、又は更には約１〜約１６モルのエチレンオキシドを有するアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤が含まれる。このような洗浄組成物は、洗浄組成物に約３〜約５の無希釈ｐＨを与えるうえで充分な量の、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン、又は塩酸などのｐＨ改変剤を一般的に含む。このような組成物は、少なくとも１種類の酸安定的酵素を一般的に含む。いくつかの実施形態では組成物は液体であり、他の実施形態では固体である。このような液体組成物のｐＨは、無希釈ｐＨとして一般的に測定される。このような固体組成物のｐＨは、溶媒が蒸溜水であるような前記組成物の１０％固形物溶液として測定される。これらの実施形態では、特に断らないかぎり、ｐＨの測定はすべて２０℃で行われる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが粒状組成物又は液体中で使用される場合、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、保管時に粒状組成物の他の成分からＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを保護するためにカプセル化された粒子の形態であることが望ましい。更にカプセル化は、洗浄プロセスの際にＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの利用性を調節する手段でもある。いくつかの実施形態では、カプセル化によって、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド及び／又は更なる酵素の性能が高められる。この点に関し、本開示のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、当該技術分野では周知の任意の適当なカプセル化物質によってカプセル化される。いくつかの実施形態では、カプセル化物質は、本明細書に述べるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドに対する触媒の少なくとも一部をカプセル化する。一般的には、カプセル化材料は、水溶性及び／又は水分散性である。いくつかの実施形態では、カプセル化物質は、０℃又はそれよりも高いガラス転移温度（Ｔｇ）を有する。ガラス転移温度については、国際特許出願公開第９７／１１１５１号により詳細に述べられている。カプセル化物質は、炭水化物、天然又は合成ゴム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィン蝋、並びにこれらの組み合わせからなる群から一般的に選択される。カプセル化物質が炭水化物である場合、カプセル化物質は、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、及びこれらの組み合わせから一般的に選択される。いくつかの一般的な実施形態では、カプセル化物質はデンプンである（例えば、欧州特許出願公開第０ ９２２ ４９９号、米国特許第４，９７７，２５２号、同第５，３５４，５５９号、及び同第５，９３５，８２６号を参照）。いくつかの実施形態では、カプセル化物質は、熱可塑性物質、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル、及びこれらの混合物などのプラスチックで形成されたマイクロスフェアであり、有用な市販のマイクロスフェアとしては、これらに限定されるものではないが、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（ストックビクスベルケン、スウェーデン）、及びＰＭ ６５４５、ＰＭ ６５５０、ＰＭ ７２２０、ＰＭ７ ２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）、及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ピー・キュー社（PQ Corp.）ペンシルベニア州バレーフォージ）により供給されるものがある。
【０１１５】
洗浄用途におけるＴｆｕＬｉｐ２を含む洗剤組成物の使用に際しては、衣類、繊維製品、食器、又は洗浄しようとする他の表面を、汚れ又は染み中に存在する脂質をＴｆｕＬｉｐ２が加水分解するのに充分な時間にわたってＴｆｕＬｉｐ２洗剤組成物の存在下でインキュベートした後、通常は水又は別の水性溶媒で洗い流すことによって、加水分解された脂質と一緒にＴｆｕＬｉｐ２洗剤組成物を除去する。
【０１１６】
本明細書において述べるように、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、洗濯及び食器洗い用洗剤を含むが、これらに限定されない洗浄産業において特に有用である。これらの用途では、酵素は様々な環境ストレス下に置かれる。ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、異なる条件下でのその安定性のため、多くの現在使用されている酵素と比較して優れた利点を与えるものである。
【０１１７】
実際、洗浄に用いられるリパーゼが曝露される異なる洗剤配合、洗浄水の量、洗浄水の温度、及び洗浄時間の長さを含む様々な洗浄条件が存在する。更に、異なる地理的地域で使用される洗剤配合物は、洗浄水中に存在する関連成分の濃度が異なる。例えば、ヨーロッパの洗剤では、洗浄水中の洗剤成分は一般的に約４，５００〜５，０００ｐｐｍであるのに対して、日本の洗剤では、洗浄水中の洗剤成分は一般的に約６６７ｐｐｍである。北米、特に米国では、洗剤の洗浄水中に存在する洗剤成分は一般的に約９７５ｐｐｍである。
【０１１８】
低洗剤濃度システムでは、洗浄水中に存在する洗剤成分が約８００ｐｐｍ未満であるような洗剤が用いられる。日本の洗剤は、洗浄水中に存在する洗剤成分が約６６７ｐｐｍであることから、低洗剤濃度システムと一般的に考えられる。
【０１１９】
中洗剤濃度システムでは、洗浄水中に存在する洗剤成分が約８００ｐｐｍ〜約２，０００ｐｐｍであるような洗剤が用いられる。北米の洗剤は、洗浄水中に存在する洗剤成分が約９７５ｐｐｍであることから、中洗剤濃度システムと一般的に考えられる。ブラジルでは、洗浄水中に存在する洗剤成分は一般的に約１，５００ｐｐｍである。
【０１２０】
高洗剤濃度システムでは、洗浄水中に存在する洗剤成分が約２０００ｐｐｍよりも高濃度であるような洗剤が用いられる。ヨーロッパの洗剤は、洗浄水中に存在する洗剤成分が約４５００〜５０００ｐｐｍであることから、高洗剤濃度システムと一般的に考えられる。
【０１２１】
南米の洗剤は、一般的に起泡力の高いリン酸塩ビルダー洗剤であり、南米において使用される洗剤の範囲は、洗浄水中の洗剤成分の範囲が１，５００ｐｐｍ〜６０００ｐｐｍであることから中及び高洗剤濃度の両方に当てはまる。上記に述べたように、ブラジルでは、洗浄水中に存在する洗剤成分は一般的に約１，５００ｐｐｍである。しかしながら、起泡力の高いリン酸塩ビルダー洗剤を使用している他の地理的地域（他の南米諸国に限定されない）では、洗浄水中に存在する洗剤成分が最大で約６，０００ｐｐｍであるような高洗剤濃度システムでありうる。
【０１２２】
上記を考慮すると、世界全体では、一般的な洗浄液中の洗剤成分の濃度は、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分（「低洗剤濃度地域」）、例えば日本における約６６７ｐｐｍから、約８００ｐｐｍ〜約２，０００ｐｐｍの間（「中洗剤濃度地域」）、例えば米国における約９７５ｐｐｍ及びブラジルにおける約１，５００ｐｐｍ、約２，０００ｐｐｍよりも高い濃度（「高洗剤濃度地域」）、例えばヨーロッパにおける約４，５００ｐｐｍ〜約５，０００ｐｐｍ、及び起泡力の高いリン酸塩ビルダーの使用地域における約６，０００ｐｐｍまで変化することが明らかである。
【０１２３】
一般的な洗浄液の濃度は経験的に求められる。例えば、米国では、一般的な洗濯機には約６４．４Ｌの体積の洗浄液が入る。したがって、洗浄液中で約９７５ｐｐｍの洗剤の濃度を得るには、６４．４Ｌの洗浄液には約６２．７９ｇの洗剤組成物を加えなければならない。この量は、洗剤と一緒に提供される計量カップを用いて、消費者によって洗浄水中に計り入れられる一般的な量である。
【０１２４】
更なる例として、異なる地理的地域では異なる洗浄温度が用いられていることがある。日本における洗浄水の温度は、ヨーロッパで用いられるよりも一般的に低い。例えば、北米及び日本における洗浄水の温度が一般的に約１０〜約３０℃（例えば約２０℃）であるのに対して、ヨーロッパにおける洗浄水の温度は一般的に約３０〜約６０℃（例えば約４０℃）である。しかしながら、エネルギー節約の観点から、多くの消費者が冷水による洗浄の使用に切り換えつつある。更に、一部の更なる地域では、一般的に冷水は洗濯ばかりでなく、食器洗い用途においても使用されている。いくつかの実施形態では、本開示の「冷水洗浄」は、約１０℃〜約４０℃、又は約２０℃〜約３０℃、又は約１５℃〜約２５℃の温度、並びに約１５℃〜約３５℃の範囲内のすべての他の組み合わせ、及び１０℃〜４０℃内のすべての範囲の温度における洗浄を利用する。
【０１２５】
更なる例として、異なる地理的地域では、一般的に水の硬度が異なることがある。水の硬度は、通常、１ガロン当たりの混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋のグレーン数によって記述される（ｍｇ／Ｌ）。硬度は、水中のカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）の量の尺度である。米国における大部分の水は硬水であるが、硬度は異なっている。中度の硬さ（６０〜１２０ｐｐｍ）〜硬い（１２１〜１８１ｐｐｍ）水は、６０〜１８１ｐｐｍの硬度鉱物を含んでいる（ｐｐｍからグレーン／ＵＳガロンへの変換は、ｐｐｍ数を１７．１で割るとグレーン／ガロンとなる）。
【表２】
【０１２６】
ヨーロッパの水の硬度は、通常、約１０．５（例えば、約１０．５〜約２０．０）グレーン／ガロン（１７９．５（例えば、約１７９．５〜３４２．０）ｍｇ／Ｌ）の混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（例えば、１５グレーン／ガロン（２５６．５ｍｇ／Ｌ）の混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋）である。北米の水の硬度は一般的に日本の水の硬度よりも高いが、ヨーロッパの水の硬度よりも低い。例えば、北米の水の硬度は、約３〜約１０グレーン、約３〜約８グレーン又は約６グレーンでありうる（約５１．３〜約１７１．０ｍｇ／Ｌ、約５１．３〜約１３６．８ｍｇ／Ｌ又は約１０２．６ｍｇ／Ｌ）。日本の水の硬度は一般的に北米の水の硬度よりも低く、通常は約４グレーン／ガロン未満、例えば約３グレーン／ガロン（約６８．４ｍｇ／Ｌ未満、例えば約５１．３ｍｇ／Ｌ）の混合Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋である。
【０１２７】
したがって、いくつかの実施形態において、本開示は、少なくとも１組の洗浄条件（例えば、水温、水の硬度、及び／又は洗剤濃度）において驚くべき洗浄性能を示すＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、本ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、洗浄性能において他のリパーゼと同等である。いくつかの実施形態では、本ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、現在市販されているリパーゼと比較して高い洗浄性能を示す。すなわち、いくつかの好ましい実施形態では、本明細書において提供される本ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、高い酸化安定性、高い熱安定性、異なる条件下での高い洗浄能力、及び／又は高いキレート剤安定性を示す。更に、本ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、やはり単独又はビルダー及び安定化剤との組み合わせで、洗剤を含まない洗浄組成物において有用でありうる。
【０１２８】
本開示のいくつかの実施形態では、洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと、洗浄添加物質からなる組成物の残部（例えば、組成物の約９９．９９９重量％〜約９０．０重量％）とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと、洗浄添加物質からなる洗浄組成物の残部（例えば、約９９．９９９９重量％〜約９０．０重量％、約９９．９９９重量％〜約９８重量％、約９９．９９５重量％〜約９９．５重量％）とを含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書において述べる洗浄組成物は、洗浄性能及び／又は衣類ケア及び／又は食器洗い効果を与える１以上の更なる洗剤酵素を含む。適当な酵素の例としては、これらに限定されるものではないが、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクテートリアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、リダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、又はこれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ及び／又はセルラーゼなどの従来の使用可能な酵素を、アミラーゼと組み合わせて含む酵素の組み合わせ（すなわち「カクテル」）が用いられる。
【０１３０】
本明細書において提供されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド以外にも、他の任意の適当なリパーゼが本開示の組成物において有用である。適当なリパーゼとしては、これらに限定されるものではないが、細菌又は真菌由来のものがある。化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体は本開示に含まれる。有用なリパーゼの例としては、フミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）リパーゼ（例えば、欧州特許出願公開第２５８ ０６８号及び同第ＥＰ ３０５ ２１６号を参照）、リゾムコル・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）リパーゼ（例えば、欧州特許出願公開第２３８ ０２３号を参照）、Ｃ．アンタークティカ（C.antarctica）リパーゼ（例えば、Ｃ．アンタークティカリパーゼＡ又はＢ；例えば、欧州特許出願公開第２１４ ７６１号を参照）などのカンジダリパーゼ、Ｐ．アルカリゲネス（P.alcaligenes）リパーゼ及びＰ．シュードアルカリゲネス（P.pseudoalcaligenes）リパーゼなどのシュードモナスリパーゼ（例えば、欧州特許出願公開第２１８ ２７２号を参照）、Ｐ．カパシア（P.cepacia）リパーゼ（例えば、欧州特許出願公開第３３１ ３７６号を参照）、Ｐ．スツゼリ（P.stutzeri）リパーゼ（例えば、英国特許出願公開第１，３７２，０３４号を参照）、Ｐ．フルオレセンス（P.fluorescens）リパーゼ、バチルスリパーゼ（例えば、Ｂ．サブチリス（B.subtilis）リパーゼ；Ｄａｒｔｏｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１：２５３〜２６０，１９９３）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B.stearothermophilus）リパーゼ（例えば、特開昭第６４／７４４９９２号を参照）、及びＢ．プミルス（B.pumilus）リパーゼ（例えば、国際特許出願公開第９１／１６４２２号を参照）が挙げられる。
【０１３１】
更に、ペニシリウム・カメンベルディ（Penicillium camembertii）リパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅ １０３：６１〜６７，１９９１を参照）、ゲオトリクム・カンジダム（Geotricum candidum）リパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３〜３８８，１９８９を参照）、並びに、Ｒ．デレマー（R.delemar）リパーゼ（Ｈａｓｓら、Ｇｅｎｅ １０９：１１７〜１１３，１９９１を参照）、Ｒ．ニベウス（R.niveus）リパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６〜７１９，１９９２）、及びＲ．オリザエ（R.oryzae）リパーゼなどの各種のリゾパスリパーゼを含むが、これらに限定されない多くのクローニングされたリパーゼが、本開示のいくつかの実施形態において有用である。
【０１３２】
これらに限定されるものではないが、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）に由来するクチナーゼ（国際特許出願公開第８８／０９３６７号を参照）、及びフザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）に由来するクチナーゼ（国際特許出願公開第９０／０９４４６号を参照）を含む、クチナーゼなどの他の種類の脂肪分解酵素も本開示のいくつかの実施形態において有用である。
【０１３３】
更なる適当なリパーゼとしては、Ｍ１ ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（ジェネンコア社（Genencor））；ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（ノボザイムズ社（Novozymes））；並びにＬＩＰＡＳＥ Ｐ（商標）「Ａｍａｎｏ」（天野エンザイム株式会社、日本）などの市販のリパーゼが挙げられる。
【０１３４】
本開示のいくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の更なるリパーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、本開示の洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のリパーゼを含む。
【０１３５】
本開示のいくつかの実施形態では、任意の適当なプロテアーゼを使用することもできる。適当なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体が含まれる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、好ましくはアルカリ性微生物プロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼは、当該技術分野では周知の多数の操作されたサブチリシンプロテアーゼのすべてを含む、サブチリシンプロテアーゼである。各種のプロテアーゼについては、国際特許出願公開第９５／２３２２１号、同第９２／２１７６０号、米国特許出願公開第２００８／００９０７４７号、並びに米国特許第５，８０１，０３９号、同第５，３４０，７３５号、同第５，５００，３６４号、同第５，８５５，６２５号、米国再発行特許第ＲＥ ３４，６０６号、米国特許第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、及び同第６，４８２，６２８号、並びに他の多くの特許に述べられている。いくつかの更なる実施形態では、国際特許出願公開第０７／０４４９９３号に述べられる中性メタロプロテアーゼを含むがこれに限定されない、メタロプロテアーゼが本開示において有用である。
【０１３６】
本開示のいくつかの実施形態では、任意の適当なアミラーゼを使用することもできる。いくつかの実施形態では、アルカリ溶液中での使用に適した任意のアミラーゼ（例えば、α及び／又はβ）も有用である。適当なアミラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、細菌又は真菌由来のものがある。いくつかの実施形態では、化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体が含まれる。本開示において有用なアミラーゼとしては、これに限定されるものではないが、Ｂ．リケニフォルミスから得られるα−アミラーゼが挙げられる（例えば、英国特許出願公開第１，２９６，８３９号を参照）。本開示において有用な市販のアミラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、及びＢＡＮ（商標）（ノボザイムズ社（Novozymes））、並びにＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、及びＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（ダニスコ・ユー・エス社ジェネンコア部門（Danisco US Inc.，Genencor Division））が挙げられる。
【０１３７】
本開示のいくつかの実施形態では、開示される洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の更なるアミラーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のアミラーゼを含む。
【０１３８】
いくつかの更なる実施形態では、任意の適当なセルラーゼが本開示の洗浄組成物において有用である。適当なセルラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、細菌又は真菌由来のものがある。いくつかの実施形態では、化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体が含まれる。適当なセルラーゼとしては、これに限定されるものではないが、フミコーラ・インソレンス（Humicola insolens）セルラーゼが挙げられる（例えば、米国特許第４，４３５，３０７号を参照）。特に適当なセルラーゼは、カラーケア効果を有するセルラーゼである（例えば、欧州特許出願公開第０ ４９５ ２５７号を参照）。本開示において有用な市販のセルラーゼとしては、これらに限定されるものではないが、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（ノボザイムズ社（Novozymes））、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。いくつかの実施形態では、セルラーゼは、Ｎ末端の一部が除去された成熟した野生型又は変異型セルラーゼの一部又はフラグメントとして添加される（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号を参照）。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の更なるセルラーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のセルラーゼを含む。
【０１３９】
洗剤組成物中での使用に適した任意のマンナナーゼも本開示において有用である。適当なマンナナーゼとしては、これらに限定されるものではないが、細菌又は真菌由来のものがある。いくつかの実施形態では、化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体が含まれる。本開示において有用な各種のマンナナーゼが知られている（例えば、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第６，５６６，１１４号、同第６，６０２，８４２号、及び同第６，４４０，９９１号を参照）。いくつかの実施形態では、開示される洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の更なるマンナナーゼと、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のマンナナーゼを含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物中に、ペルオキシダーゼが、過酸化水素又はその供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩、又は過硫酸塩）と組み合わせて使用される。いくつかの代替的実施形態では、オキシダーゼが酸素と組み合わせて使用される。いずれの種類の酵素も、「溶液漂白」（すなわち、染色衣類と別の衣類が洗浄液中で一緒に洗われる場合に、染色衣類から別の衣類への繊維染料の移行を防止する）の目的で、好ましくは増強剤と共に使用される（例えば、国際特許出願公開第９４／１２６２１号及び同第９５／０１４２６号を参照）。適当なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、これらに限定されるものではないが、植物、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。いくつかの実施形態では、化学的又は遺伝子的に改変された突然変異体が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の更なるペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素と、洗浄添加物質からなる組成物の重量の残部とを含む。本開示の他の態様では、洗浄組成物は更に、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度の更なるペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ペルヒドロラーゼを含むがこれに限定されない、更なる酵素が有用である（例えば、国際特許出願公開第０５／０５６７８２号を参照）。更に、いくつかの特に好ましい実施形態では、上記に述べた酵素、特に、１以上の更なるプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又は少なくとも１種類のセルラーゼの混合物が本明細書に含まれる。実際、これらの酵素の様々な混合物が本開示において有用であると考えられる。やはり考えられる可能性として、異なる濃度のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド及び１以上の更なる酵素は、いずれも独立して約１０％までの範囲であってよく、洗浄組成物の残部が洗浄添加物質であってもよい。洗浄添加物質の具体的な選択は、洗浄しようとする表面、物品、又は衣類、及び使用時（例えば、洗濯洗剤としての使用）の洗浄条件に対する望ましい組成物の形態を考慮することにより容易に行うことができる。
【０１４２】
適当な洗浄添加物質の例としては、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、漂白触媒、他の酵素、酵素安定化システム、キレート剤、蛍光増白剤、汚れ放出ポリマー、移染剤、移染防止剤、触媒物質、過酸化水素、過酸化水素の供給源、予め生成された過酸（preformed peracis）、ポリマー分散剤、粘土汚れ除去剤、構造弾性化剤、分散剤、泡抑制剤、染料、香料、着色剤、充填剤塩、ヒドロトロープ、光活性剤、蛍光剤、柔軟仕上げ剤、柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤、溶媒、顔料、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、収縮防止剤、シワ防止剤、殺菌剤、防カビ剤、カラースペックル（color speckles）、シルバーケア（silvercare）、変色防止及び／又は腐蝕防止剤、アルカリ性付与剤、可溶化剤、キャリア、加工助剤、顔料、及びｐＨ調整剤が挙げられる（例えば、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号、及び同第５，６４６，１０１号を参照）。特定の洗浄組成物物質の実施形態を以下に詳しく例示する。洗浄添加物質が、洗浄組成物中の開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと適合性を有さないような実施形態では、洗浄添加物質とリパーゼとを、これら２つの成分を合わせることが適切となるまで分離（すなわち、互いに接触しないように）しておくのに適当な方法が用いられる。このような分離方法には、当該技術分野では周知のあらゆる適当な方法が含まれる（例えば、ジェルキャップ、カプセル化、錠剤、物理的分離など）。
【０１４３】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書において提供される１以上のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの有効量が、染みを除去する必要のある様々な表面を洗浄するうえで有用な組成物中に含まれる。このような洗浄組成物には、硬質表面、衣類、及び食器の洗浄などの用途のための洗浄組成物が含まれる。実際、いくつかの実施形態では、本開示は衣類洗浄用組成物を提供するものであるが、他の実施形態では、本開示は衣類以外の洗浄用組成物を提供する。特に、本開示は、口腔ケア（歯磨き剤、歯磨き粉、マウスウォッシュなど、並びに入れ歯洗浄用組成物）を含むパーソナルケアに適した洗浄組成物、皮膚及び毛髪洗浄用組成物を更に提供する。本開示は、任意の形態の洗剤組成物（すなわち、液体、粒状、バー、半固体、ジェル、エマルション、錠剤、カプセルなど）を含むものとする。
【０１４４】
一例として、開示されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドが有用であるようないくつかの洗浄組成物について下記により詳しく述べる。開示される洗浄組成物が、洗濯機による洗浄方法における使用に適した組成物として配合されるいくつかの実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも１種類の界面活性剤及び少なくとも１種類のビルダー化合物、並びに、有機ポリマー化合物、漂白剤、更なる酵素、泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸分散剤、汚れ懸濁及び再付着防止剤、及び腐蝕防止剤から好ましくは選択される１以上の洗浄添加物質を含むことが好ましい。いくつかの実施形態では、洗濯用組成物は、更に柔軟剤を含む（すなわち、更なる洗浄添加物質として）。本開示の組成物は、固体又は液体の形態の洗剤添加用製品においても有用である。このような添加用製品は、従来の洗剤組成物の性能を補い、かつ／又は高めることを目的としたものであり、洗浄プロセスのいずれの段階で添加してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書における洗濯洗剤組成物の密度は約４００〜約１２００ｇ／Ｌの範囲であり、他の実施形態では、密度は２０℃で測定した場合に組成物１Ｌ当たり約５００〜約９５０ｇの範囲である。
【０１４５】
手による食器洗いの方法において使用するための組成物として配合された実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも１種類の界面活性剤、並びに、好ましくは、有機ポリマー化合物、起泡促進剤、ＩＩ族の金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ、及び更なる酵素から選択される少なくとも１種類の更なる洗浄添加物質を含むことが好ましい。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、米国特許第６，６０５，４５８号において提供されるような各種の洗浄組成物が、本開示のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと使用するのに有用である。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物は、圧縮粒状衣類洗浄用組成物であり、他の実施形態では、組成物は、着色された衣類の洗濯に有用な粒状衣類洗浄用組成物であり、更なる実施形態では、組成物は、洗浄能力を介して柔軟効果を与える粒状衣類洗浄用組成物であり、更なる実施形態では、組成物は、高負荷の衣類洗浄用組成物である。いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に述べられるような衣類洗浄用組成物である。更に、本開示のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは、ヨーロッパ又は日本の洗浄条件下において特に有用な粒状洗濯洗剤組成物（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号を参照）において有用である。
【０１４７】
いくつかの代替的実施形態では、本開示は、本明細書において提供される少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む硬質表面洗浄用組成物を提供する。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，３７６，４５０号、及び同第６，３７６，４５０号に述べられるような硬質表面洗浄用組成物である。
【０１４８】
更なる実施形態では、本開示は、本明細書において提供される少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む食器洗い用組成物を提供する。すなわち、いくつかの実施形態では、本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に述べられるような硬質表面洗浄用組成物である。更なるいくつかの実施形態では、本開示は、本明細書において提供される少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む食器洗い用組成物を提供する。いくつかの更なる実施形態では、本開示の少なくとも１種類のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを含む組成物は、米国特許第６，３７６，４５０号及び同第６，３７６，４５０号に述べられるような口腔ケア用組成物を含む。上記に述べた米国特許第６，３７６，４５０号、同第６，６０５，４５８号、同第６，６０５，４５８号、及び同第６，６１０，６４２号に含まれる化合物及び洗浄添加物質の配合及び説明は、本明細書において提供されるＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドと共に使用するのに有用である。
【０１４９】
本開示の洗浄組成物は、任意の適当な形態に配合され、配合者によって選択される任意のプロセスによって調製されるものであり、その非限定的な例が、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２、及び同第５，４８６，３０３号に述べられている。低いｐＨの洗浄組成物が望ましい場合、こうした組成物のｐＨは、モノエタノールアミンなどの物質又はＨＣｌなどの酸性物質を添加することによって調整される。
【０１５０】
本開示の目的において不可欠ではないが、以下に示す添加物質の非限定的な一覧は、本発明の洗浄組成物における使用に適したものである。いくつかの実施形態では、これらの添加物質は、例えば、洗浄能力を補助又は高める目的、洗浄しようとする基材を処理する目的、又は香料、着色剤、染料などと同様に、洗浄組成物の美観を改変する目的で添加される。こうした添加物質は、本開示のＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドに追加されるものであることは理解される。このような追加的成分の正確な性質及びその添加濃度は、組成物の物理的形態、及び組成物が使用される洗浄操作の性質によって決まる。適当な補助剤物質としては、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、付着補助剤、分散剤、更なる酵素及び酵素安定化剤、触媒物質、漂白活性化剤、漂白促進剤、過酸化水素、過酸化水素の供給源、予め生成された過酸、ポリマー分散剤、粘土汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、泡抑制剤、染料、香料、構造弾性化剤、柔軟剤、キャリア、ヒドロトロープ、加工助剤、及び／又は顔料が挙げられる。下記の開示以外に、こうした他の添加物質及び使用濃度の適当な例が、援用される米国特許第５，５７６，２８２号、同第６，３０６，８１２号、及び同第６，３２６，３４８号に見られる。上記の添加成分は、本開示の洗浄組成物の残部を構成してよい。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本開示に基づく洗浄組成物は、少なくとも１種類の界面活性剤及び／又は界面活性剤システムを含み、その場合、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、半極性非イオン性界面活性剤、及びこれらの混合物から選択される。いくつかの低いｐＨの洗浄組成物の実施形態（例えば、約３〜約５の無希釈ｐＨを有する組成物）では、組成物はアルキルエトキシル化硫酸塩を一般的に含まないが、これはこうした界面活性剤はこのような組成物酸性成分によって加水分解されうるためである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、洗浄組成物の約０．１重量％〜約６０重量％の濃度で存在し、代替的な実施形態では、濃度は約１重量％〜約５０重量％であり、更なる実施形態では、濃度は約５重量％〜約４０重量％である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は少なくとも１種類のキレート剤を含む。適当なキレート剤としては、これらに限定されるものではないが、銅、鉄及び／又はマンガンキレート剤、並びにこれらの混合物が挙げられる。少なくとも１種類のキレート剤が用いられる実施形態では、本開示の洗浄組成物は、本発明の洗浄組成物の約０．１重量％〜約１５重量％、又は更には約３．０重量％〜約１０重量％のキレート剤を含む。
【０１５３】
いくつかの更なる実施形態では、本明細書において提供される洗浄組成物は、少なくとも１種類の付着補助剤を含む。適当な付着補助剤としては、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカルボキシレート、ポリテレフタル酸などの汚れ放出ポリマー、カオリナイト、モンモリロナイト、アタパルガイト、イライト、ベントナイト、ハロイサイトなどの粘土、及びこれらの混合物が挙げられる。
【０１５４】
本明細書において示されるように、いくつかの実施形態では、再付着防止剤が本開示のいくつかの実施形態において有用である。いくつかの好ましい実施形態では、非イオン性界面活性剤が有用である。例えば、自動食器洗いの実施形態では、非イオン性界面活性剤が表面改質の目的、特にフィルム形成及びスポット形成を避け、ツヤを改善するためのシート化効果の目的で有用である。これらの非イオン性界面活性剤は、汚れの再付着を防止するうえでも有用である。いくつかの好ましい実施形態では、再付着防止剤は、当該技術分野では周知の非イオン性界面活性剤である（例えば、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、１以上の移染防止剤を含む。適当なポリマー移染防止剤としては、これらに限定されるものではないが、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールとのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はこれらの混合物が挙げられる。少なくとも１種類の移染防止剤が用いられる実施形態では、本開示の洗浄組成物は、洗浄組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％、又は更には約０．１重量％〜約３重量％を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物にはケイ酸塩が含まれる。いくつかのこうした実施形態では、ケイ酸ナトリウム（例えば、二ケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、及び結晶性フィロケイ酸塩）が有用である。いくつかの実施形態では、ケイ酸塩は約１％〜約２０％の濃度で存在する。いくつかの好ましい実施形態では、ケイ酸塩は、組成物の約５重量％〜約１５重量％の濃度で存在する。
【０１５７】
いくつかの更なる実施形態では、本開示の洗浄組成物は更に分散剤を含む。適当な水溶性有機物質としては、これらに限定されるものではないが、ホモポリマー若しくはコポリマーである酸又はそれらの塩が挙げられ、その場合、ポリカルボン酸は、炭素原子２個以下分だけ互いに離れた少なくとも２個のカルボキシルラジカルを有する。
【０１５８】
いくつかの更なる実施形態では、洗浄組成物中に使用される酵素は、任意の適当な方法によって安定化される。いくつかの実施形態では、本明細書において用いられる酵素は、カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンの水溶性の供給源が最終組成物中に存在し、こうした供給源が酵素に上記のイオンを与えることによって安定化される。いくつかの実施形態では、酵素安定化剤として、オリゴ糖類、多糖類、及び、カルシウム塩などの、アルカリ土類金属を含む無機の２価金属塩が挙げられる。酵素安定化のための様々な技術が本開示において有用であるものと考えられる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書において用いられる酵素は、亜鉛（ＩＩ）、カルシウム（ＩＩ）イオン及び／又はマグネシウム（ＩＩ）イオン、並びに他の金属イオン（例えば、バリウム（ＩＩ）、スカンジウム（ＩＩ）、鉄（ＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、スズ（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、及びオキソバナジウム（ＩＶ））の水溶性の供給源が最終組成物中に存在し、こうした供給源が酵素に上記のイオンを与えることによって安定化される。塩酸塩及び硫酸塩も本開示のいくつかの実施形態において有用である。適当なオリゴ糖類及び多糖類（例えばデキストリン）の例は、当該技術分野では周知である（例えば、国際特許出願公開第０７／１４５９６４号を参照）。いくつかの実施形態では、ホウ素含有化合物（例えば、ホウ酸塩、４−ホルミルフェニルボロン酸）及び／又はトリペプチドアルデヒドなどの可逆的プロテアーゼ阻害剤が、必要に応じて更に安定性を高めるうえで有用である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、漂白剤、漂白活性化剤、及び／又は漂白触媒が、本開示の組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は無機及び／又は有機漂白化合物を含む。無機漂白剤としては、これらに限定されるものではないが、過水和物塩（例えば、過ホウ酸塩、過炭酸塩、過リン酸塩、過硫酸塩、及び過ケイ酸塩）が挙げられる。いくつかの実施形態では、無機過水和物塩はアルカリ金属塩である。いくつかの実施形態では、無機過水和物塩は更なる保護はされずに結晶固体として含まれるが、いくつかの他の実施形態では塩はコーティングされる。当該技術分野では周知の任意の適当な塩が、本開示において有用である（例えば、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、漂白活性化剤が本開示の組成物中に使用される。漂白活性化剤は、一般的に、６０℃以下の温度での洗浄過程において漂白作用を高める有機過酸前駆物質である。本明細書における使用に適した漂白活性化剤としては、過加水分解条件下において、好ましくは約１個〜約１０個の炭素原子、特に約２個〜約４個の炭素原子を有する脂肪族ペルオキシカルボン酸、及び／又は場合により置換された過安息香酸を与える化合物が挙げられる。更なる漂白活性化剤は当該技術分野では周知のものであり、本開示において有用である（例えば、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【０１６１】
更に、いくつかの実施形態では、また、本明細書において更に述べるように、本開示の洗浄組成物は少なくとも１種類の漂白触媒を更に含む。いくつかの実施形態では、マンガントリアザシクロノナン及び関連する錯体、並びにコバルト、銅、マンガン、及び鉄の錯体が有用である。更なる漂白触媒も本開示において有用である（例えば、米国特許第４，２４６，６１２号、同第５，２２７，０８４号、同第４，８１０４１０号、国際特許出願公開第９９／０６５２１号、及び欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号を参照）。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は１以上の触媒金属錯体を含む。いくつかの実施形態では、金属含有漂白触媒が有用である。いくつかの好ましい実施形態では、規定の漂白触媒活性を有する遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン、又はマンガンのカチオン）、漂白触媒活性をほとんどあるいはまったく有さない補助金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムのカチオン）、並びに触媒金属及び補助金属のカチオンに対して規定の安定度定数を有する金属イオン封鎖剤、特にエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）及びこれらの水溶性の塩を含む触媒システムを含む金属漂白触媒が用いられる（例えば、米国特許第４，４３０，２４３号を参照）。いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物はマンガン化合物によって触媒される。こうした化合物及び使用濃度は、当該技術分野では周知のものである（例えば、米国特許第５，５７６，２８２号を参照）。更なる実施形態では、コバルト漂白触媒が本開示の洗浄組成物において有用である。各種のコバルト漂白触媒が当該技術分野で知られており（例えば、米国特許第５，５９７，９３６号及び同第５，５９５，９６７号を参照）、公知の方法によって容易に調製される。
【０１６３】
いくつかの更なる実施形態では、本開示の洗浄組成物は、巨大多環式剛性配位子（macropolycyclic rigid ligand）（ＭＲＬ）の遷移金属錯体を含む。実用上の問題として、限定するものではないが、いくつかの実施形態において、本開示により提供される組成物及び洗浄プロセスは、水性洗浄媒質中に少なくとも約１億分の１のオーダーの活性ＭＲＬ種を与えるように調整され、いくつかの好ましい実施形態では、約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、より好ましくは約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、最も好ましくは約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬを洗浄液中に与えるように調整される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明の遷移金属漂白触媒中の好ましい遷移金属としては、これらに限定されるものではないが、マンガン、鉄及びクロムが挙げられる。好ましいＭＲＬとしては、これらに限定されるものではないが、架橋された特殊な超剛性配位子が挙げられる（例えば、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン）。適当な遷移金属ＭＲＬは、公知の方法によって容易に調製される（例えば、国際特許出願公開第２０００／３２６０１号、及び米国特許第６，２２５，４６４号を参照）。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は金属ケア剤を含む。金属ケア剤は、アルミニウム、ステンレス鋼、及び非鉄金属（例えば、銀及び銅）などの金属の変色、腐蝕、及び／又は酸化を防止及び／又は低減するうえで有用である。適当な金属ケア剤としては、欧州特許出願公開第２ １００ ９４９号、国際特許出願公開第９４２６８６０号及び同第９４／２６８５９号に述べられるものがある。いくつかの実施形態では、金属ケア剤は亜鉛塩である。更なるいくつかの実施形態では、本開示の洗浄組成物は、約０．１重量％〜約５重量％の１以上の金属ケア剤を含む。
【０１６６】
上記に述べたように、本開示の洗浄組成物は、任意の適当な形態に配合され、配合者によって選択される任意のプロセスによって調製されるものであり、その非限定的な例が、いずれも本明細書に援用するところの米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２、及び同第５，４８６，３０３号に述べられている。低いｐＨの洗浄組成物が望ましいいくつかの実施形態では、こうした組成物のｐＨは、ＨＣｌなどの酸性物質を添加することによって調整される。
【０１６７】
本明細書において開示される洗浄組成物は、所定の場所（例えば、表面、食器、又は衣類）を洗浄するうえで有用である。通常は、その場所の少なくとも一部を、無希釈の形態、又は洗浄液で希釈された本発明の洗浄組成物の特定の実施形態と接触させ、次いで必要に応じてその場所を洗い、かつ／又は濯ぐ。本開示の目的において、「洗浄」には、これらに限定されるものではないが、こすり洗い、及び機械的な攪拌が含まれる。いくつかの実施形態では、洗浄組成物は一般的に、溶液中で約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である場合、水の温度は、通常約５℃〜約９０℃の範囲であり、場所が衣類を含む場合、衣類に対する水の質量比は、通常約１：１〜約３０：１である。
【０１６８】
ＶＩ．化学試薬としてのＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド
短鎖の脂質に対するＴｆｕＬｉｐ２の選択性のために、本発明のポリペプチドは、Ｃ４〜Ｃ１６の基質が関与するエステル交換反応を行ううえで特に有用である。代表的な用途としては、ミルク脂肪の加水分解、構造化トリグリセリドの合成、ポリマーの合成及び分解、乳化剤及び界面活性剤の生成、香料及び芳香剤として使用されるエステルを製造する目的、バイオ燃料及び合成潤滑剤を製造する目的、過酸を生成する目的、並びに油脂化学産業における他の用途での、パーソナルケア製品、医薬品及び農薬の成分の合成がある。上記に述べた酵素の更なる使用については、米国特許出願公開第２００７００２６１０６号、同第２００６００７８６４８号、及び同第２００５０１９６７６６号、並びに国際特許出願公開第２００５／０６６３４７号に述べられており、これらの文書を援用するものである。
【０１６９】
大まかに言えば、基質と受容分子を、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチド又はその変異体の存在下、エステル交換反応を行うのに適した条件下でインキュベートした後、必要に応じて反応から生成物を単離する。あるいは、条件は、食品に関連したものである場合もあり、生成物は単離されずに食品の成分となりうる。
【０１７０】
本発明の組成物及び方法の他の態様並びに実施形態は、上記の説明及び以下の実施例より明らかとなるであろう。
【実施例】
【０１７１】
以下の実施例は、本開示の特定の好ましい実施形態及び態様を実証及び例示する目的で示されるものであって、限定的に解釈されるべきものではない。
【０１７２】
以下の実験の開示では以下の略語を用いる。Ｍ（モル（濃度））；ｍＭ（ミリモル（濃度））；μＭ（マイクロモル（濃度））；ｎＭ（ナノモル（濃度））；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇｍ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ｐｇ（ピコグラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）；μｌ及びμＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈ及びｈｒ（時間）；℃（摂氏）；ＱＳ（適量）；ＮＤ（行わず）；ｒｐｍ（回転／分）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）；（ＨＣｌ（塩酸）；ａａ（アミノ酸）；ｂｐ（塩基対）；ｋｂ（キロ塩基対）；ｋＤ（キロダルトン）；ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）；ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）；ｗ／ｖ（重量−体積比）；ｖ／ｖ（体積−体積比）；ｇ（重力加速度）；ＯＤ（光学密度）；ｐｐｍ（１００万分の１）；ｍ−（メタ−）；ｏ−（オルト−）；ｐ−（パラ−）；ＢＣＥ（ＢＣＥ１０３セルラーゼ）；Ｇｌｕ−ＢＬ（バチルス・リケニフォルミスグルタミルエンドペプチダーゼＩ）；ＴｆｕＬｉｐ２（サーモビフィダ・フスカリパーゼ２）；ＮＥＦＡ（非エステル化脂肪酸）；ｐ−ＮＰ（ｐ−ニトロフェニル）；ＳＲＩ（染み除去指数）。
【０１７３】
（実施例１）
サーモビフィダ・フスカリパーゼ２（ＴｆｕＬｉｐ２）のクローニング及び発現
サーモビフィダ・フスカリパーゼ２（又はＢＴＡ加水分解酵素２）の遺伝子はこれまでに同定されており（Ｌｙｋｉｄｉｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８９：２４７７〜２４８６，２００７）、その配列は、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＹＰ＿２８８９４４として公開されている。Ｂ．サブチリス発現ベクターｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩ（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）を制限酵素ＢｓｓＨＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した。ＢＣＥ１０３−ＢＢＩ融合遺伝子配列を含まないＤＮＡフラグメントを単離して、発現用のバックボーンとして使用した。このフラグメントを、ＴｆｕＬｉｐ２酵素をコードした合成遺伝子にライゲートすることにより、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドのＮ末端を、ｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩによってコードされるバチルス・サブチリスのＡｐｒＥプロペプチドの３番目のアミノ酸に融合させた。ホスト内での天然のシグナルペプチダーゼによる切断後、このようにして生成された組換えＴｆｕＬｉｐ２タンパク質は、アミノ末端に３個の更なるアミノ酸（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ）を有していた。
【０１７４】
サーモビフィダ・フスカリパーゼ２（ＴｆｕＬｉｐ２）の合成遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号１に示す。
【０１７５】
ＧＣＧＣＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＣＴＡＡＴＣＣＴＴＡＣＧＡＡＡＧＡＧＧＡＣＣＧＡＡＴＣＣＴＡＣＡＧＡＣＧＣＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＴＴＴＣＴＡＧＡＣＴＴＡＧＣＧＣＧＴＣＴＧＧＣＴＴＴＧＧＴＧＧＣＧＧＧＡＣＡＡＴＴＴＡＴＴＡＣＣＣＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＡＡＣＡＣＡＴＡＣＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＴＣＴＣＴＣＣＧＧＧＧＴＡＣＡＣＧＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣＡＴＣＴＡＴＴＧＣＴＴＧＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＧＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＣＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＴＣＡＣＡＡＴＴＧＡＣＡＣＡＡＴＴＡＣＧＡＣＡＣＴＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＴＴＧＡＡＴＧＣＡＧＣＣＣＴＧＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＧＣＡＣＧＧＴＡＡＧＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＧＡＴＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＣＡＴＡＧＣＡＴＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＡＣＴＴＡＧＡＴＴＡＧＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＣＣＴＧＡＴＴＴＡＡＡＧＧＣＡＧＣＧＡＴＴＣＣＧＴＴＧＡＣＧＣＣＴＴＧＧＣＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＴＣＣＣＧＡＣＧＣＴＣＡＴＴＡＴＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＴＡＣＧＡＴＴＧＣＡＣＣＧＧＴＣＧＣＧＡＣＡＣＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＧＴＴＣＴＡＴＡＡＣＴＣＡＴＴＧＣＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣＣＴＡＴＴＴＡＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＴＧＣＧＣＣＧＡＡＴＡＴＴＣＣＧＡＡＣＡＡＧＡＴＴＡＴＣＧＧＴＡＡＡＴＡＴＴＣＡＧＴＣＧＣＡＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＧＡＴＴＴＧＴＡＧＡＴＡＡＴＧＡＣＡＣＧＡＧＡＴＡＴＡＣＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＧＧＣＣＴＡＧＡＧＡＣＧＧＴＴＴＧＴＴＣＧＧＡＧＡＧＧＴＴＧＡＡＧＡＧＴＡＴＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＧＣＣＣＧＴＴＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴ
成熟したＴｆｕＬｉｐ２酵素のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１７６】
ＡＮＰＹＥＲＧＰＮＰＴＤＡＬＬＥＡＳＳＧＰＦＳＶＳＥＥＮＶＳＲＬＳＡＳＧＦＧＧＧＴＩＹＹＰＲＥＮＮＴＹＧＡＶＡＩＳＰＧＹＴＧＴＥＡＳＩＡＷＬＧＥＲＩＡＳＨＧＦＶＶＩＴＩＤＴＩＴＴＬＤＱＰＤＳＲＡＥＱＬＮＡＡＬＮＨＭＩＮＲＡＳＳＴＶＲＳＲＩＤＳＳＲＬＡＶＭＧＨＳＭＧＧＧＧＴＬＲＬＡＳＱＲＰＤＬＫＡＡＩＰＬＴＰＷＨＬＮＫＮＷＳＳＶＴＶＰＴＬＩＩＧＡＤＬＤＴＩＡＰＶＡＴＨＡＫＰＦＹＮＳＬＰＳＳＩＳＫＡＹＬＥＬＤＧＡＴＨＦＡＰＮＩＰＮＫＩＩＧＫＹＳＶＡＷＬＫＲＦＶＤＮＤＴＲＹＴＱＦＬＣＰＧＰＲＤＧＬＦＧＥＶＥＥＹＲＳＴＣＰＦ
３個のアミノ酸からなるアミノ末端の延長部分を有するＴｆｕＬｉｐ２酵素のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。
【０１７７】
ＡＧＫＡＮＰＹＥＲＧＰＮＰＴＤＡＬＬＥＡＳＳＧＰＦＳＶＳＥＥＮＶＳＲＬＳＡＳＧＦＧＧＧＴＩＹＹＰＲＥＮＮＴＹＧＡＶＡＩＳＰＧＹＴＧＴＥＡＳＩＡＷＬＧＥＲＩＡＳＨＧＦＶＶＩＴＩＤＴＩＴＴＬＤＱＰＤＳＲＡＥＱＬＮＡＡＬＮＨＭＩＮＲＡＳＳＴＶＲＳＲＩＤＳＳＲＬＡＶＭＧＨＳＭＧＧＧＧＴＬＲＬＡＳＱＲＰＤＬＫＡＡＩＰＬＴＰＷＨＬＮＫＮＷＳＳＶＴＶＰＴＬＩＩＧＡＤＬＤＴＩＡＰＶＡＴＨＡＫＰＦＹＮＳＬＰＳＳＩＳＫＡＹＬＥＬＤＧＡＴＨＦＡＰＮＩＰＮＫＩＩＧＫＹＳＶＡＷＬＫＲＦＶＤＮＤＴＲＹＴＱＦＬＣＰＧＰＲＤＧＬＦＧＥＶＥＥＹＲＳＴＣＰＦ
ＴｆｕＬｉｐ２タンパク質を、これまでに述べられている方法（Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，５５：４０〜５２，２００７）を用いて、バチルス・サブチリス細胞（ｄｅｇＵＨｙ３２，ｏｐｐＡ，ΔｓｐｏＩＩＥ，ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，Δｅｐｒ，ΔｉｓｐＡ，Δｂｐｒ，Δｖｐｒ，ΔｗｐｒＡ，Δｍｐｒ−ｙｂｆＪ，ΔｎｐｒＢ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｅｒｍＣ）内で産生させた。
【０１７８】
（実施例２）
ＴｆｕＬｉｐ２の単離及び特性決定
限外濾過濃縮物を、発現用のバチルス・サブチリス株の１４Ｌスケールの回分発酵より得た。清澄化したブロスを、組換えＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドの特性決定に用いた。
【０１７９】
ＴｆｕＬｉｐ２を精製するには、限外濾過濃縮物を１４Ｌスケールの回分発酵より得て、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０バッファーで５倍に希釈し、硫酸アンモニウムを最終濃度が１Ｍとなるように加える。硫酸アンモニウム沈殿により得られたペレットを回収し、更なる精製に供する。５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０バッファー中の１Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化したＦａｓｔＦｌｏｗフェニルセファロースカラムを使用する。試料を平衡化流速（１２ｍＬ／分）の半分の速度でロードし、ローディング後に平衡化バッファーで洗う。勾配を用いて、バッファー中の濃度を１Ｍの硫酸アンモニウムから０Ｍにまで低下させる。５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ ８．０バッファーで、カラムから夾雑タンパク質を洗い流す。５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ ８．０、及び４０％プロピレングリコールを含むバッファーで、ＴｆｕＬｉｐ２タンパク質を溶出させる。各分画を、下記に述べる酪酸ｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）アッセイを用いてアッセイする。リパーゼ活性を有する分画をプールし、５Ｋのメンブレンを備える攪拌式セルを用いて濃縮し、後の使用に備える。
【０１８０】
（実施例３）
ＴｆｕＬｉｐ２によるｐ−ニトロフェニルエステルの加水分解
エステル鎖の長さが異なる３種類の異なるｐ−ニトロフェニル（ｐＮＰ）エステル基質に対してリパーゼ活性についてＴｆｕＬｉｐ２タンパク質をアッセイし、ＬｉｐＡの鎖長選択性を調べた。表３−１に、ｐＮＰエステル基質の詳細を示す。
【表３】
【０１８１】
予めエタノール（５％）に懸濁した０．８ｍＭのｐＮＰエステルを以下の２種類のバッファーの一方に加えて、ｐＮＰエステル基質を含む反応エマルションを調製した。すなわち、０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、６ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ ８．２に調整）、又は０．０５Ｍ ＣＡＰＳ、６ｍＭ ＣａＣｌ２（ｐＨ １０に調整）。ｐＮＰエステルの乳化を促進するため、０．５％アラビアゴムを両方のバッファーに加えた。
【０１８２】
このｐＮＰエステル／バッファー懸濁液を混合し、２分間超音波処理してから、それぞれ１００μＬを、２０μＬの酵素試料が入った９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに移した。遊離したｐＮＰの生成を、ブランク値（酵素なしの値）を用いてＯＤ４０５ｎｍで１５分間にわたって測定及び修正した。１分当たりに生成されるｐＮＰ生成物を記録し、ウェル中の加えた酵素試料に対して正規化した（加えた酵素１ｍｇ当たりのΔ ＯＤ／分）。異なる基質に対する相対的な酵素活性を計算し、各基質を用いて得られた生成物の放出速度を最も高い活性に対して正規化した（例えば、カプリル酸ｐＮＰ基質に対する活性を１００とした）。
【表４】
【０１８３】
表３−２に示されるように、ＴｆｕＬｉｐ２はｐＨ ８．２及びｐＨ １０の両方において、炭素４〜１６個の長さのｐＮＰエステル基質に対して活性を示した。
【０１８４】
（実施例４）
洗剤の存在下及び非存在下でのＴｆｕＬｉｐ２によるトリグリセリドの加水分解
ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドを、洗剤の存在下及び非存在下でトリオクタン酸エステル及びトリオレイン酸エステル基質の加水分解についてアッセイした。トリオクタン酸グリセロール（ＣＡＳ ５３８−２３−８）及びトリオレイン酸グリセロール（ＣＡＳ １２２−３２−７）基質をシグマ社（Sigma）より購入した。この実験では以下の市販の洗剤を使用した。（１）ユニリーバ社（Unilever）より販売されるＯＭＯ色物用液体洗剤、（２）プロクター・アンド・ギャンブル社（Procter & Gamble）より販売されるＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤、（３）ブルモラー社（Blumoller）より販売されるＢｉｏｔｅｘ色物用粉末洗剤、及び（４）プロクター・アンド・ギャンブル社より販売されるＡｒｉｅｌ色物用粉末洗剤。
【０１８５】
ＯＭＯ色物用液体洗剤
ＯＭＯ色物用液体洗剤組成物は、５〜１５％のアニオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤、＜５％石鹸、カチオン性界面活性剤、ホスホン酸塩、香料、ブチルフェニルメチルプロピオネート、シトロネロール、酵素、及びベンゾイソチアゾリノンを含む。ＯＭＯ色物用液体洗剤は、以下の界面活性剤を含んでいる。すなわち、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス−７、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、及び水添ヤシ脂肪酸ナトリウム。
【０１８６】
ＯＭＯ色物用液体洗剤の成分は以下の通りである。水、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス−７、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、プロピレングリコール、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸ナトリウム、香料、硫酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ブチルフェニルメチルプロピオナール、ソルビトール、シトロネロール、プロテアーゼ、ベンゾイソチアゾリノン、ボロン酸、（４−ホルミルフェニル）、アミラーゼ、ＣＩ−４５１００、及びＣＩ−４２０５１。
【０１８７】
Ａｒｉｅｌ色物用液体洗剤
Ａｒｉｅｌ色物用液体洗剤組成物は、５〜１５％のアニオン性界面活性剤、＜５％非イオン性界面活性剤、ホスホン酸塩、石鹸、酵素、香料、ブチルフェニルメチルプロピオネート、及びゲラニオールを含む。Ａｒｉｅｌ色物用液体洗剤は、以下の界面活性剤を含んでいる。すなわち、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１４パレス−７、ラウレス硫酸ナトリウム、及びＣ１２〜Ｃ１４パレス−４。
【０１８８】
Ａｒｉｅｌ色物用液体洗剤の成分は以下の通りである。ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、パーム核脂肪酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１４パレス−７、ラウレス硫酸ナトリウム、変性アルコール、Ｃ１４〜Ｃ１５パレス−４、ｍｅａホウ酸エステル、硫酸化エトキシル化ヘキサメチレンジアミン四級化プロピレングリコール、水、水添ヒマシ油、香料、プロテアーゼ、ジエチレントリアミンペンタメチレンホスホン酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１５アルコール、グリコシダーゼ、ポリビニルピリジン−ｎ−オキシド、ポリエチレングリコール、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ジメチコン、着色剤、シリカ、ブチルフェニルメチルプロピオナール、及びゲラニオール。
【０１８９】
Ｂｉｏｔｅｘ色物用粉末洗剤
Ｂｉｏｔｅｘ色物用粉末洗剤組成物は、１５〜３０％のゼオライト、５〜１５％のアニオン性界面活性剤、＜５％石鹸、ポリカルボキシレート、ホスホン酸塩、酵素、及び香料を含む。Ｂｉｏｔｅｘ色物用粉末洗剤は、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス−７界面活性剤を含んでいる。
【０１９０】
Ｂｉｏｔｅｘ色物用液体洗剤の成分は以下の通りである。ゼオライト、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、水、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス−７、牛脂脂肪酸ナトリウム、マレイン酸−アクリル酸コポリマーナトリウム塩、クエン酸ナトリウム、ラウレス−７、セルロースガム、ラウレス−５、ナトリウムＥＤＴＭＰ、香料、エチドロン酸４ナトリウム、サブチリシン、アミラーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、及びセルロース。
【０１９１】
Ａｒｉｅｌ色物用粉末洗剤
Ａｒｉｅｌ色物用粉末洗剤組成物は、５〜１５％のアニオン性界面活性剤、ゼオライト、＜５％非イオン性界面活性剤、ポリカルボキシレート、ホスホン酸塩、酵素、香料、ヘキシルシンナマル、リモネン、及びブチルフェニルメチルプロピオネートを含む。Ａｒｉｅｌ色物用粉末洗剤は、以下の界面活性剤を含んでいる。すなわち、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス硫酸ナトリウム、及びＣ１２〜Ｃ１５パレス−７。
【０１９２】
Ａｒｉｅｌ色物用粉末洗剤の成分は以下の通りである。硫酸ナトリウム，炭酸ナトリウム、ベントナイト、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、シリコアルミン酸ナトリウム、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス硫酸ナトリウム、ナトリウムアクリル酸／ＭＡコポリマー、水、クエン酸、ジメチコン、Ｃ１２〜Ｃ１５パレス−７、硫酸マグネシウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、香料、セルロースガム、塩化ナトリウム、エチドロン酸４ナトリウム、トルエンスルホン酸ナトリウム、デンプン、オクテニルコハク酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、グリコシダーゼ、エチレンジアミンジコハク酸３ナトリウム、硫酸、グリコール酸ナトリウム、フェニルプロピルエーテルメチコン、ポリアクリル酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸、シリカを含むジクロロジメチルシランＲＸ、着色剤、グリセリン、ラウレス硫酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、Ｃ１０〜１６アルキルベンゼンスルホン酸、ブチルフェニルメチルプロピオナール、ヘキシルシンナマル、及びリナロール。
【０１９３】
各洗剤を以下のようにして加熱により不活性化した。すなわち、各液体洗剤は９５℃の水浴中に２時間置き、各粉末洗剤はこれを水に加えた０．１ｇ／ｍＬ調合液をホットプレート上で１時間沸騰させた。熱処理により、市販の洗剤配合物中のすべてのタンパク質成分の酵素活性は失活するが、酵素以外の洗剤成分の性質は維持される。加熱処理の後、各洗剤を希釈し、リパーゼ酵素活性についてアッセイした。
【０１９４】
トリオクタン酸エステル及びトリオレイン酸エステルの反応エマルションを、エタノール（５％）に予め懸濁した０．４％トリオクタン酸エステル又はトリオレイン酸エステルを以下の２種類のバッファーの一方に加えることにより調製した。すなわち、ｐＨ ８．２に調整した０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、又はｐＨ １０に調整した０．０５Ｍ ＣＡＰＳである。バッファーは液体洗剤と使用するものはｐＨ ８．２に、粉末洗剤と使用するものはｐＨ １０に調整した。いずれのバッファーも、水の硬度を６ｍＭ ＣａＣｌ２に調整した。トリグリセリドの乳化を促進するため、２％アラビアゴムを両方のバッファーに加えた。
【０１９５】
各洗剤にトリオクタン酸エステルを加えた反応エマルションを、エタノール（５％）に予め懸濁した０．４％トリオクタン酸エステルを以下の２種類のバッファーの一方に加えることにより調製した。すなわち、ｐＨ ８．２に調整した０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ、又はｐＨ １０に調整した０．０５Ｍ ＣＡＰＳである。いずれのバッファーも、水の硬度を２４０ｐｐｍに調整した。最終的なアッセイ混合物は、トリグリセリドの乳化を促進するために異なる量の洗剤を含んでいた。
【０１９６】
各反応エマルションは、高剪断混合を２分間行い（２４，０００ｍ−１，Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５、ジャンケ・クンケル社（Janke Kunkel））、次いで１５０μＬを、３０μＬの酵素試料が予め入れられた９６穴マイクロタイタープレートのウェルに移すことによって調製した。遊離脂肪酸の生成を、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）の定量的測定のためのインビトロ酵素比色分析アッセイを用いて測定した。この方法は遊離脂肪酸に対する特異性を有するものであり、添加されたアシルＣｏＡシンテターゼの存在下で、脂肪酸によって補酵素Ａ（ＣｏＡ）がアシル化されることに基づいたものである。このようにして生成したアシルＣｏＡは、添加されたアシルＣｏＡオキシダーゼによって酸化され、ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素が生成する。これにより、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ（β−ヒドロキシエチル）−アニリンが４−アミノアンチピリンと酸化的に縮合して紫色の付加物を生成し、これを比色分析によって測定することができる。３０℃で６分間のインキュベーション後に生成した遊離アミノ酸の量を、ＮＥＦＡ ＨＲ（２）キット（和光純薬工業株式会社（Wako Chemicals GmbH）、ドイツ）の材料を使用し、３０μＬの加水分解溶液を、１２０μＬのＮＥＦＡ Ａ溶液が予め入れられた９６穴マイクロタイタープレートのウェルに移すことによって測定した。３０℃で３分間インキュベートした後、６０μＬのＮＥＦＡ Ｂ溶液を加えた。３０℃で４．５分間インキュベートした後、５２０ｎｍにおけるＯＤを測定した。
【０１９７】
表４−１は、ＴｆｕＬｉｐ２によるトリオレイン酸エステル及びトリオクタン酸エステルの加水分解を示す。トリグリセリドの加水分解のデータは、遊離脂肪酸のμｍｏｌとして求めた。結果は、バッファー中でのトリオクタン酸エステル（Ｃ８）に対する活性を１００としてこの活性に対して示す。
【表５】
【０１９８】
表４−２は、ｐＨ ８．２及びｐＨ １０．０における異なる洗剤の存在下又は非存在下でのＴｆｕＬｉｐ２によるトリオクタン酸エステルの加水分解を示す。洗剤の存在下でのトリオクタン酸エステルの加水分解のデータは、試験を行った両方のｐＨ値における洗剤の非存在下でのトリオクタン酸エステルの加水分解に対する、洗剤の存在下でのトリオクタン酸エステルの加水分解の比率（％）として示す。
【表６】
【０１９９】
ＴｆｕＬｉｐ２は、異なる液体及び粉末洗剤中で洗剤濃度の関数としてリパーゼ活性を示した。
【０２００】
（実施例５）
ＴｆｕＬｉｐ２の洗浄性能
染みが付いた衣類に対するＴｆｕＬｉｐ２の洗浄性能について、微小布片アッセイ方式で試験を行った。２４穴プレート方式（ヌンク社（Nunc）、デンマーク）で設定された脂質含有実験用染み（オランダの試験材料センター（Center for Testmaterials）より購入したＣＳ−６１布片）を使用して、染みの除去実験を行った。各アッセイウェルに、予め切断したＣＳ−６１布片の１３ｍｍの小片が入るように設定した。各布片は、リフレクトメータ（ＣＲ−４００、コニカ・ミノルタ社）を使用して予め読み取ってから、２４穴プレートに置いた。
【０２０１】
使用したバッファーは、液体洗剤の試験用には２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（最終濃度）、ｐＨ ８．２、粉末洗剤の試験用には２０ｍＭ ＣＡＰＳ（最終濃度）、ｐＨ １０．０とした。水の硬度を、両方のバッファーについて２４０ｐｐｍに調整した。使用した加熱不活性化した市販の洗剤は、実施例４のトリグリセリド加水分解アッセイにおいて述べたものと同じものを使用した。
【０２０２】
簡単に述べると、９００μＬの適当なバッファーを、布片が入った２４穴プレートの各ウェルに加えた。反応を開始するため、各ウェルに１００μＬの体積の酵素試料を加えた。各プレートを、３７℃で２００ｒｐｍで３０分間振盪した。インキュベーション後、反応バッファーを除去し、各ウェル内の布地を１ｍＬの蒸溜水で３回洗い流した。洗い流した布片を取り出した後、各布片を５０℃で４時間乾燥してから反射率を測定した。洗浄性能を、各布片の洗浄の前後の反射率測定値の差として計算した。反射率の測定は、分光光度計（ＣＲ−４００、コニカ・ミノルタ社）によりＣＩＥ Ｌ＊ａ＊ｂ＊測定値を取ることによって行った。洗浄された布地の染み除去指数（ΔＳＲＩ）の値の差は、下式を用いて洗浄しない布地に対して計算した。
【数１】
【０２０３】
この式では、ΔＬ、Δａ、Δｂはそれぞれ、洗浄の前後におけるＣＩＥ Ｌ＊、ＣＩＥ ａ＊、及びＣＩＥ ｂ＊値の差であり、ただし、Ｌ＊は明度を規定し、ａ＊及びｂ＊は、色度を規定する（例えば、Ｐｒｅｃｉｓｅ Ｃｏｌｏｒ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ：Ｃｏｌｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｆｒｏｍ Ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ ｔｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ Ｓｅｎｓｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ，ｐｐ．３２〜５９，１９９８）を参照。
【表７】
【０２０４】
ＴｆｕＬｉｐ２は、ユニリーバ社（Unilever）より販売されるＯＭＯ色物用液体洗剤中では洗浄性能をまったく示していない。しかしながら、ＴｆｕＬｉｐ２は、プロクター・アンド・ギャンブル社（Procter & Gamble）より販売されるＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤及びブルモラー社（Blumoller）より販売されるＢｉｏｔｅｘ色物用粉末洗剤中では顕著な洗浄性能を示し、プロクター・アンド・ギャンブル社より販売されるＡｒｉｅｌ色物用粉末洗剤では更に高い性能を示した。
【０２０５】
（実施例６）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む液体洗濯洗剤組成物
この実施例では、液体洗濯洗剤組成物の異なる配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表８】
【０２０６】
＃１：１Ｎ ＨＣｌ水溶液を加えることにより、配合の無希釈ｐＨを約３〜約５の範囲に調整する。上記の実施例６（Ｉ）〜（ＩＩ）のｐＨは約５〜約７であり、実施例６（ＩＩＩ）〜（Ｖ）のｐＨは約７．５〜約８．５である。
【０２０７】
（実施例７）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む液体食器手洗い用洗剤組成物
この実施例では、異なる食器手洗い用液体洗剤の配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表９】
【０２０８】
実施例７（Ｉ）〜（ＶＩ）のｐＨは約８〜約１１である。
【０２０９】
（実施例８）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む液体自動食器洗い用洗剤組成物
この実施例では、異なる液体自動食器洗い用洗剤の配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２ポリペプチドは約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１０】
【０２１０】
（実施例９）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む粒状及び／又は錠剤洗濯組成物
この実施例では、粒状及び／又は錠剤洗濯洗剤の異なる配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１１】
【０２１１】
＊ 香料、染料、増白剤／ＳＲＰ１／カルボキシメチルセルロースナトリウム／光漂白剤／ＭｇＳＯ４／ＰＶＰＶＩ／泡抑制剤／高分子量ＰＥＧ／粘土。
【０２１２】
（実施例１０）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む更なる液体洗濯洗剤
この実施例では、液体洗濯洗剤の更なる配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１２】
【０２１３】
（実施例１１）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む高密度食器洗い用洗剤
この実施例では、高密度食器洗い用洗剤の異なる配合を提供する。これらの圧縮型配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１３】
【０２１４】
＊ 増白剤／染料／ＳＲＰ１／カルボキシメチルセルロースナトリウム／光漂白剤／ＭｇＳＯ４／ＰＶＰＶＩ／泡抑制剤／高分子量ＰＥＧ／粘土。実施例１１（Ｉ）〜（ＶＩ）のｐＨは、約９．６〜約１１．３である。
【０２１５】
（実施例１２）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む錠剤食器洗い用洗剤組成物
この実施例は、異なる錠剤食器洗い用洗剤の配合を提供する。以下の本開示の錠剤洗剤組成物は、１２個のヘッドを有する標準的なロータリープレスを使用して、１３ＫＮ／ｃｍ２（１３０ＭＰａ）の圧力で粒状食器洗い用洗剤組成物を圧縮することによって調製される。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１４】
【０２１６】
＊ 増白剤／ＳＲＰ１／カルボキシメチルセルロースナトリウム／光漂白剤／ＭｇＳＯ４／ＰＶＰＶＩ／泡抑制剤／高分子量ＰＥＧ／粘土。実施例１２（Ｉ）〜１２（ＶＩＩ）のｐＨは約１０〜約１１．５であり、実施例１２（ＶＩＩＩ）のｐＨは８〜１０である。実施例１２（Ｉ）〜１２（ＶＩＩＩ）の錠剤重量は約２０ｇ〜約３０ｇである。
【０２１７】
（実施例１３）
ＴｆｕＬｉｐ２を含む液体硬質表面洗浄用洗剤
この実施例では、液体硬質表面洗浄用洗剤の異なる配合を提供する。これらの配合のそれぞれにおいて、ＴｆｕＬｉｐ２は約０．０００１〜約１０重量％の濃度で含まれる。いくつかの代替的な実施形態では、配合者によってニーズに応じて決定される他の濃度も有用であろう。
【表１５】
【０２１８】
実施例１３（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のｐＨは、約７．４〜約９．５である。
【０２１９】
（実施例１４）
プロテアーゼの存在下及び非存在下での洗剤中のＴｆｕＬｉｐ２の安定性
洗剤中のＴｆｕＬｉｐ２の安定性を、市販の洗剤においてプロテアーゼの存在下又は非存在下で調べ、同様の条件下における市販の基準酵素Ｌｉｐｅｘ（登録商標）（サーモマイセス・ラヌギノーサスＬｉｐ３リパーゼ（ノボザイムズ社（Novozymes）、コペンハーゲン、デンマーク））の安定性と比較した。
【０２２０】
ＯＭＯ（商標）Ｓｍａｌｌ ａｎｄ Ｍｉｇｈｔｙ液体洗剤（ユニリーバ社（Unilever））及びＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤（プロクター・アンド・ギャンブル社（（Procter & Gamble））を、使用に先立って９５℃の水浴中に２時間入れることにより加熱不活性化した。加熱による不活性化の後、各洗剤をプロテアーゼ及びリパーゼ活性について試験したところ、すべてについて陰性であった。
【０２２１】
ＴｆｕＬｉｐ２及びＬＩＰＥＸ（登録商標）リパーゼを、各洗剤に０．２ｐｐｍの最終濃度で加えた。サブチリシンプロテアーゼ（Ｐｕｒａｆｅｃｔ ４０００Ｌ；ダニスコ・ユー・エス社ジェネンコア部門（Danisco US Inc.,Genencor Division））を、１．０ｐｐｍの最終濃度で添加した。リパーゼ及びプロテアーゼのこれらの濃度は、洗剤の洗浄媒質において典型的なものであり、洗浄条件における酵素の実際の使用条件を反映している。リパーゼ又はリパーゼ／プロテアーゼを加えた洗剤混合物を３７℃に２８日間置いた。０、２、７、及び１５日目に試料を抜き取り、トリブチリン（ＣＡＳ ６０−０１−５）を基質として使用して、リパーゼ活性についてアッセイした。この方法は、酵素がトリブチリンを加水分解する速度に基づいたものである。リパーゼの作用によって生成した酪酸を水酸化ナトリウムで滴定し、ＮａＯＨの消費量を時間の関数として記録した。
【０２２２】
０．０５Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％アラビアゴム、及び９％グリセロール中に５％トリブチリン（ｖ／ｖ）を含むエマルションを、Ｔ２５ Ｕｌｔｒａ ＴＵＲＲＡＸ（登録商標）分散装置（ＩＫＡ（登録商標）、ドイツ）を使用して、試料を２０秒間高剪断混合することによって調製した。洗剤試料に加えた２ＭＬの酵素を、２５ＭＬのホモジナイズした基質に加え、試料を３０℃で６分間インキュベートした。反応混合物のＰＨを８．０に維持するのに必要とされる０．０５ＭのＮＡＯＨの量を求め、ＮＡＯＨ塩基の消費量に基づいて酵素活性を計算した。表１４−１に示されるデータは、プロテアーゼを加えていない０日目の活性と比較した残留リパーゼ活性の比率（％）を表している（それぞれの洗剤について）。ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼは、特にプロテアーゼの存在下で、ＬＩＰＥＸ（登録商標）リパーゼよりも優れた安定性を明らかに示した。
【表１６】
【０２２３】
（実施例１５）
異なる温度におけるＴｆｕＬｉｐ２の洗浄性能
染み付きの布地に対するＴｆｕＬｉｐ２の洗浄性能を、市販の加熱不活性化したＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤及びＡｒｉｅｌ色物用粉末洗剤中で、微小布片アッセイ方式で１５℃、２０℃、３０℃、及び４０℃で試験した。アッセイは、プレートを３７℃ではなく、それぞれ１５、２０、３０、及び４０℃で振盪する変更を行った以外は実施例５で述べたのと同様にして行った。０．２又は０．７Ｕ／ｍＬのＴｆｕＬｉｐ２を添加し、トリオレイン酸エステル（ｐＨ ８．２）から放出される遊離脂肪酸（μｍｏｌ／分）を実施例４で述べたのと同様にして測定した。結果を表１５−１、１５−２、及び１５−３に示す。
【表１７】
【０２２４】
表１５−１の結果は、ＴｆｕＬｉｐ２が、洗剤の非存在下で１５℃〜４０℃の範囲のすべての温度において用量反応的な洗浄性能を示すことを示している。最も高い性能は、４０℃で高用量の酵素を用いた場合に得られている。
【表１８】
【０２２５】
表１５−２の結果は、ＴｆｕＬｉｐ２が、０．６ｇ／ＬのＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤中で１５℃〜４０℃の範囲のすべての温度において用量反応的な洗浄性能を示すことを示している。最も高い性能は、４０℃で高用量の酵素を用いた場合に得られている。３０℃及び４０℃では、０．６ｇ／ＬのＡｒｉｅｌ色物用液体洗剤の存在下でＴｆｕＬｉｐ２によって得られる洗浄性能は、洗剤の非存在下でＴｆｕＬｉｐ２によって得られる洗浄性能よりも大幅に優れている。
【表１９】
【０２２６】
表１５−３の結果は、ＴｆｕＬｉｐ２が、０．６ｇ／ＬのＡｒｉｅｌ色物用粉末洗剤中において２０℃〜４０℃で用量反応的な洗浄性能を示すことを示している。最も高い性能は、４０℃で高用量の酵素を用いた場合に得られている。３０℃及び４０℃では、０．６ｇ／ＬのＡｒｉｅｌ色物用粉末洗剤の存在下でＴｆｕＬｉｐ２によって得られる洗浄性能は、洗剤の非存在下でＴｆｕＬｉｐ２によって得られる洗浄性能よりも大幅に優れている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーモビフィダ・フスカから得られるリパーゼと、
界面活性剤と、を含む洗剤組成物であって、
洗浄しようとする表面から油性の染みを除去するうえで、前記リパーゼを含まない同等の洗剤組成物よりも効果的である、洗剤組成物。
【請求項２】
前記リパーゼが、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼである、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項３】
前記リパーゼが、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の洗剤組成物。
【請求項４】
前記リパーゼが、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の洗剤組成物。
【請求項５】
前記リパーゼが、組換えリパーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項６】
前記リパーゼが、バチルス内で発現される組換えリパーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項７】
前記界面活性剤が、イオン性又は非イオン性界面活性剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項８】
前記界面活性剤が、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１以上の界面活性剤である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項９】
前記界面活性剤が、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、Ｃ１２〜１４パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス硫酸ナトリウム、及びＣ１４〜１５パレス−４からなる群から選択される１以上の界面活性剤を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１０】
約８．０〜約１０．０のｐＨで配合される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１１】
約８．２〜約１０．０のｐＨで配合される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１２】
前記洗剤組成物が、洗濯洗剤、食器洗い用洗剤、及び硬質表面洗浄用洗剤からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１３】
前記組成物の形態が、液体、粉末、粒状固形物、及び錠剤からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１４】
前記洗剤組成物が、約３０℃〜約４０℃の温度で効果的に脂質を加水分解する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１５】
前記洗剤組成物が、サーモビフィダ・フスカのリパーゼの代わりにシュードモナス・シュードアルカリゲネスのリパーゼ変異体Ｍ２１Ｌ（ＬＩＰＯＭＡＸ（商標））を含む同等の洗剤組成物と比較して、Ｃ４〜Ｃ１６の基質をより効果的に加水分解する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１６】
プロテアーゼを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１７】
サブチリシンプロテアーゼを更に含む、請求項１６に記載の洗剤組成物。
【請求項１８】
サーモビフィダ・フスカリパーゼの安定性が、サーモビフィダ・フスカリパーゼの代わりにサーモマイセス・ラヌギノーサのＬｉｐ３リパーゼ（ＬＩＰＥＸ（登録商標））を含む同等の洗剤組成物中におけるサーモマイセス・ラヌギノーサＬｉｐ３リパーゼの安定性よりも高い、請求項１６又は１７に記載の洗剤組成物。
【請求項１９】
安定性が、最終的な洗浄媒質中で測定される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
表面の汚れ又は染みに存在する脂質を加水分解するための方法であって、前記表面を、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２１】
エステル交換反応を行うための方法であって、ドナー分子を、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２２】
前記ドナー分子が、Ｃ４〜Ｃ１６の炭素鎖を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ドナー分子が、Ｃ８の炭素鎖を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
サーモビフィダ・フスカから得られるリパーゼと、
界面活性剤と、を含む洗剤組成物であって、
洗浄しようとする表面から油性の染みを除去するうえで、前記リパーゼを含まない同等の洗剤組成物よりも効果的である、洗剤組成物。
【請求項２】
前記リパーゼが、ＴｆｕＬｉｐ２リパーゼである、請求項１に記載の洗剤組成物。
【請求項３】
前記リパーゼが、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の洗剤組成物。
【請求項４】
前記リパーゼが、配列番号２又は配列番号３と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の洗剤組成物。
【請求項５】
前記リパーゼが、組換えリパーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項６】
前記リパーゼが、バチルス内で発現される組換えリパーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項７】
前記界面活性剤が、イオン性又は非イオン性界面活性剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項８】
前記界面活性剤が、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、双性イオン性界面活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１以上の界面活性剤である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項９】
前記界面活性剤が、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、水添ヤシ脂肪酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、Ｃ１２〜１４パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス−７、Ｃ１２〜１５パレス硫酸ナトリウム、及びＣ１４〜１５パレス−４からなる群から選択される１以上の界面活性剤を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１０】
約８．０〜約１０．０のｐＨで配合される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１１】
約８．２〜約１０．０のｐＨで配合される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１２】
前記洗剤組成物が、洗濯洗剤、食器洗い用洗剤、及び硬質表面洗浄用洗剤からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１３】
前記組成物の形態が、液体、粉末、粒状固形物、及び錠剤からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１４】
前記洗剤組成物が、約３０℃〜約４０℃の温度で効果的に脂質を加水分解する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１５】
前記洗剤組成物が、サーモビフィダ・フスカのリパーゼの代わりにシュードモナス・シュードアルカリゲネスのリパーゼ変異体Ｍ２１Ｌ（ＬＩＰＯＭＡＸ（商標））を含む同等の洗剤組成物と比較して、Ｃ４〜Ｃ１６の基質をより効果的に加水分解する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１６】
プロテアーゼを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の洗剤組成物。
【請求項１７】
サブチリシンプロテアーゼを更に含む、請求項１６に記載の洗剤組成物。
【請求項１８】
サーモビフィダ・フスカリパーゼの安定性が、サーモビフィダ・フスカリパーゼの代わりにサーモマイセス・ラヌギノーサのＬｉｐ３リパーゼ（ＬＩＰＥＸ（登録商標））を含む同等の洗剤組成物中におけるサーモマイセス・ラヌギノーサＬｉｐ３リパーゼの安定性よりも高い、請求項１６又は１７に記載の洗剤組成物。
【請求項１９】
安定性が、最終的な洗浄媒質中で測定される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
表面の汚れ又は染みに存在する脂質を加水分解するための方法であって、前記表面を、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２１】
エステル交換反応を行うための方法であって、ドナー分子を、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の洗剤組成物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２２】
前記ドナー分子が、Ｃ４〜Ｃ１６の炭素鎖を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ドナー分子が、Ｃ８の炭素鎖を含む、請求項２２に記載の方法。
【公表番号】特表２０１３−５１５１３９（Ｐ２０１３−５１５１３９Ａ）
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４６０２９（Ｐ２０１２−５４６０２９）
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０２５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８４４１２
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５０９２４０４７９）ダニスコ・ユーエス・インク (81)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１４日（２０１０．１２．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０２５３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０８４４１２
【国際公開日】平成２３年７月１４日（２０１１．７．１４）
【出願人】（５０９２４０４７９）ダニスコ・ユーエス・インク (81)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]