トリシンアミノ酸誘導体並びにそれを含む抗ウイルス剤及び抗癌剤
【課題】トリシンよりも高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有することにより、高い組織移行性、生物学的利用能を示す新規誘導体、並びにトリシンまたは新規誘導体を含む抗ウイルス剤及び抗癌剤を提供する。
【解決手段】式１：
で表される化合物（式中、Ａは任意のアミノ酸残基であり、Ｂは任意のアミノ酸残基であり、ＡとＢは同じ又は異なっても良く、ｎ＝０〜４である。）。該トリシンアミノ酸誘導体は、トリシンと比較して、高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有し、体内でトリシンに加水分解され、トリシンの有する制癌作用、抗ウイルス作用を発揮する。
【解決手段】式１：
で表される化合物（式中、Ａは任意のアミノ酸残基であり、Ｂは任意のアミノ酸残基であり、ＡとＢは同じ又は異なっても良く、ｎ＝０〜４である。）。該トリシンアミノ酸誘導体は、トリシンと比較して、高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有し、体内でトリシンに加水分解され、トリシンの有する制癌作用、抗ウイルス作用を発揮する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトリシンより高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有するトリシンアミノ酸誘導体及びそれを含む抗ウイルス剤及び抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラボノイドの１種であるトリシン（４’，５，７−トリヒドロキシ−３’，５’−ジメトキシフラボン）（ｔｒｉｃｉｎ（４’，５，７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−３’，５’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ））は、イネ科の植物に含まれ、抗酸化作用、抗癌作用、抗ウイルス作用などさまざまな生理活性を有することが確認されており、近年非常に注目されている。
例えば、非特許文献１等には、コムギの葉や穀類のヒエの子実等から単離されたトリシンが抗酸化作用を有する物質であることが報告されている。
また、米ぬか由来のトリシンが、シクロオキシゲナーゼを阻害し、小腸の発ガンを抑制すること（非特許文献２）、ヒト由来の大腸癌及び乳癌細胞に対しインビトロにおいて抗癌作用を示すこと（非特許文献３）、マウスのＰ３８８白血病モデルにおいて抗癌作用を示すこと（非特許文献４）等が報告されている。
さらに、クマザサのエキスに含まれるトリシンが抗ウイルス作用を示すことが報告されている（特許文献１）。
【０００３】
インビトロの検討において多くの有用な生理活性が確認され、その臨床応用が期待される一方で、トリシンは非常に疎水性が高く、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する必要があることから、インビボにおける検討、ひいては臨床試験における患者への投与のための薬剤調製において、その使用に制限があることが予測される。
【０００４】
またインビトロの検討においてトリシンの細胞浸透性は低く、このためインビボにおける組織移行性、生物学的利用能が低いことが予測される。また抗ウイルス剤として有効に作用させるためには薬剤の宿主細胞内への浸透性が要求される。したがって、高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有するプロドラッグの開発が期待されている。
【０００５】
一般にフラボノイド類が経口投与された際の薬物動態については明らかでない点も多い。フラボノイドは植物中では、各種の糖が結合した配糖体として存在している。この配糖体は消化管内で腸内細菌により加水分解され、糖が取れたアグリコンが大腸で吸収されるという説が本来主流であった。しかしヒト小腸モデルであるＣａｃｏ−２細胞を用い、フラボノイドの一種であるクエルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）について検討を行った結果、アグリコンはグルコース配糖体に比べ１０倍以上吸収されやすいことが示され、細胞浸透性が高いフラボノイド誘導体が小腸においてより効率よく吸収される可能性が示唆されている（非特許文献５）。
また、クエルセチンのアミノ酸誘導体がインビトロにおいて高い水溶性、細胞浸透性を示すことが報告されている（非特許文献６）
【０００６】
本発明者は、アミノ酸が親水性基であるカルボキシル基を有すること、アミノ酸誘導体は小腸において能動的に吸収されること、また吸収された後、血中においてエステラーゼでアミノ酸が切断されても加水分解されたアミノ酸自身は無害であることに着目し、トリシンの高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有するプロドラッグとして、新規化合物であるトリシンのアミノ酸誘導体を開発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ／２００８／１２３１０２
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Agric. Food Chem. 47: 4500-4505 (1999)
【非特許文献２】Molecular Cancer Therapeutics, 4: 1287-1292 (2005)．
【非特許文献３】Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,9:1163-70 (2000)．
【非特許文献４】J Nat Prod. 44: 530-5(1981)．
【非特許文献５】化学と生物 39: 213(2001)．
【非特許文献６】Bioorg. Med. Lett. 17: 1164-1171(2009).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、トリシンアミノ酸誘導体を提供することである。
本発明の他の目的は、高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有するトリシンアミノ酸誘導体を提供することである。
本発明の他の目的は、トリシンアミノ酸誘導体を含む抗ウイルス剤及び抗癌剤を提供することである。
本発明の他の目的は、トリシン又はトリシンアミノ酸誘導体を含む子宮頚癌治療用の抗癌剤を提供することである。
本発明の他の目的は、トリシン又はトリシンアミノ酸誘導体と、ガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンから選択される少なくとも一種とを含む、抗ウイルス剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成すべく、本発明は以下の構成を採用した。
（１）
式１：
で表される化合物（式中、Ａは任意のアミノ酸残基であり、Ｂは任意のアミノ酸残基であり、ＡとＢは同じ又は異なっても良く、ｎ＝０〜４である。）。
（２）Ａが任意のアミノ酸残基であり、ｎ＝０又は１である上記（１）記載の化合物。
（３）Ａがグリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸の残基である上記（１）又は（２）記載の化合物。
（４）Ａがアラニン残基であり、Ｂが任意のアミノ酸残基である上記（１）記載の化合物。
（５）Ａがアラニン残基であり、Ｂがアスパラギン酸又はグルタミン酸残基である上記（１）記載の化合物。
（６）４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｎ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン及び４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシンからなる群から選択される上記（１）記載の化合物。
（７）上記（１）〜（６）のいずれか一に記載の化合物を含む抗ウイルス剤。
（８）対象のウイルスが、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスあるいはインフルエンザウイルスである、上記７記載の抗ウイルス剤。
（９）対象のウイルスが、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルス株、アマンタジン耐性インフルエンザウイルス株、ガンシクロビル耐性ヒトサイトメガロウイルスからなる群より選択されるウイルスである、上記（７）記載の抗ウイルス剤。
（１０）経口投与用である上記７〜９のいずれか一に記載の抗ウイルス剤。
（１１）上記（１）〜（６）のいずれか一に記載の化合物を含む抗癌剤。
（１２）対象の癌が大腸癌または子宮頸癌である、上記（１１）記載の抗癌剤。
（１３）経口投与用である、上記（１１）または（１２）記載の抗癌剤。
（１４）（Ａ）トリシン又はそのアミノ酸誘導体、及び（Ｂ）ガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンからなる群から選択される少なくとも一種の化合物、を有効成分として含むことを特徴とする、抗ウイルス剤。
（１５）前記（Ｂ）成分がガンシクロビルである、上記（１４）に記載の抗ウイルス剤。
（１６）前記ウイルスがヘルペスウイルスである、上記（１４）または（１５）に記載の抗ウイルス剤。
（１７）前記ウイルスがサイトメガロウイルスである、上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
（１８）前記ウイルスが、ヒトサイトメガロウイルスである上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
（１９）前記（Ａ）成分と（Ｂ）成分とのモル比が１００：１〜１０００：１（（Ａ）成分：（Ｂ）成分）の範囲内である、上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、トリシンよりも高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有するため、高い組織移行性、生物学的利用能を示す。また本発明のトリシンアミノ酸誘導体は経口投与によりトリシンの高い血中移行性を示すが、かなり高濃度で投与しても毒性が見られない。
以上のことより、トリシンの有する制癌作用、抗ウイルス作用に基づいて、関連する疾患の予防や治療に用いることができる。
また、本発明のトリシン又はトリシンアミノ酸誘導体並びにガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンからなる群から選択される少なくとも一種を含む抗ウイルス剤は、トリシンのみを有効成分とする抗ウイルス剤に比べて著しく高い抗ウイルス作用を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】トリシン及びトリシンアミノ酸誘導体の細胞浸透性試験の結果を示す。
【図２】雄性ラットにおけるトリシン誘導体の単回経口投与による血漿中トリシン濃度の推移を表す。
【図３】トリシン誘導体投与前の代表的なクロマトグラムを表す。Ａは動物番号１０１、Ｂ：動物番号３０１を表す。
【図４】トリシン誘導体投与後３０分の代表的なクロマトグラムを表す。Ａは動物番号１０１、Ｂ：動物番号３０１（５倍希釈サンプル使用）を表す。
【図５】トリシン誘導体投与後２時間の代表的なクロマトグラムを表す。Ａは動物番号１０１、Ｂ：動物番号３０１（２倍希釈サンプル使用）を表す。
【図６】トリシン誘導体投与後４時間の代表的なクロマトグラムを表す。Ａは動物番号１０１（３倍希釈サンプル使用）、Ｂ：動物番号３０１（３倍希釈サンプル使用）を表す。
【図７】トリシン誘導体投与後８時間の代表的なクロマトグラムを表す。Ａは動物番号１０１、Ｂ：動物番号３０１（３倍希釈サンプル使用）を表す。
【図８】ＴＩＧ−３細胞（胎児肺繊維芽細胞）（正常細胞、コントロール）の増殖に対する、トリシンの抑制効果を表す。
【図９】ＣＡ細胞の増殖に対する、トリシンの抑制効果を表す。
【図１０】ＣａＳｋｉ細胞の増殖に対する、トリシンの抑制効果を表す。
【図１１】ＨｅＬａ細胞の増殖に対する、トリシンの抑制効果を表す。
【図１２】ＳｉＨａ細胞の増殖に対する、トリシンの抑制効果を表す。
【図１３】ガンシクロビルの、コントロールに対するウイルス力価（％）を示す。
【図１４】トリシン及びガンシクロビルを用いた場合、並びにトリシンのみを用いた場合の、コントロールに対するウイルス力価（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜＜トリシンアミノ酸誘導体＞＞
本発明の第一の態様は、トリシンの４’位ＯＨにカルボキシル基を介して一または複数のアミノ酸が結合している点に特徴を有するトリシンアミノ酸誘導体である。
本発明の一般式中のＡまたはＢで表されるアミノ酸残基を与えるアミノ酸の例としては、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）などの天然アミノ酸が挙げられる。
より好ましくは、アミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、セリン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択される。
さらに好ましくは、アミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択される。
また、上記アミノ酸はＬ体、Ｄ体のどちらであっても良いが、Ｌ体であることが好ましい。
【００１４】
本発明において「アミノ酸残基」とは
のように表されるアミノ酸から誘導される２価の基を意味する。
ここでＲはアミノ酸の側鎖であり、例えばアラニンの場合ＲはＣＨ3であり、アスパラギン酸の場合ＲはＣＨ2ＣＯＯＨとなる。
【００１５】
式１の
部分において、Ａとｎ個のＢはペプチド結合しており、これはより具体的には
と表される。Ｒ1及びＲ2はアミノ酸側鎖を表す。
【００１６】
−Ａ（Ｂ）ｎＯＨは、例えば、ｎ＝１の場合、
ｎ＝２の場合
と表される。
【００１７】
（合成方法）
本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、トリシンを原料として、上述したアミノ酸を様々な公知の手法で結合することにより製造することができる。
例えば、原料のアミノ酸のカルボキシル基を予めエステル化等により保護し、塩基存在下、ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート等の試薬を用いて、トリシンの４’位の−ＯＨ基と反応させてもよい。アミノ酸の保護基はその後適切に脱保護を行えばよい。
なお、２以上のアミノ酸が接合した誘導体を作成する場合には、アミノ酸を１つずつ順にトリシンに結合して製造しても良く、あるいは、あらかじめ複数のアミノ酸が結合したものを作成してからトリシンに結合しても良い。
【００１８】
（細胞浸透性）
ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来の細胞株）は単層に培養するとタイトジャンクションを形成し、塩や水を能動的に輸送する。受動拡散で吸収される薬物のＭＤＣＫ細胞膜透過性は、ヒトでの消化管吸収率との相関性が認められている。そこでトリシン誘導体のＭＤＣＫ細胞における細胞浸透性を検討した。
様々なトリシンアミノ酸誘導体について試験した結果、いずれもトリシンより高い細胞浸透性を示した。
【００１９】
（血中移行性）
トリシンアミノ酸誘導体のインビボにおける動態、特に経口投与した場合の血中移行性を検討するため、トリシン誘導体を経口で投与し、所定時間経過後採血して得られた血漿中のトリシン濃度を測定した。
トリシンを経口投与した場合には、トリシンの血中への移行は殆ど見られなかったが、トリシンアミノ酸誘導体を経口投与した試験では、最高で４４４８ｎｇ／ｍＬのトリシンが検出され、血中への移行性がトリシンに比べてはるかに高いことが見出された。
トリシンアミノ酸誘導体は体内に取り込まれた後、体内でアミノ酸部分が加水分解を受けてトリシンに変化し、血中に移行していると考えられる。
細胞浸透性、血中移行性の結果から、本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、トリシンに比べてより高い組織移行性及びより高い生物学的利用能を示すことが明らかである。
【００２０】
（毒性試験）
トリシンアミノ酸誘導体を経口投与した場合の血中へのトリシンの移行性が、トリシンを投与した場合に比べてはるかに高いことから、その安全性を確認するため毒性試験を行った。その結果、雄性マウスにトリシン誘導体を単回経口投与した場合、２０００ｍｇ／ｋｇという高用量群においても、異常知見は見られなかった。また雄性マウスにトリシン誘導体を１４日連続経口投与した場合の無影響量は３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであり、トリシン誘導体はトリシンと同様安全な薬剤であることが示唆された。
【００２１】
（抗ウイルス剤）
トリシンは、ＷＯ／２００８／１２３１０２に記載されているとおり、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス及びインフルエンザウイルス等に対する抗ウイルス作用を示す。
一方、本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を示し、トリシンの高い血中濃度を示す。従って、本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、抗ウイルス剤として用いることができる。
本発明の抗ウイルス剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件により適宜選択できる。通常、トリシンアミノ酸誘導体を１〜２０００mg／kg／日程度、好ましくは５〜１０００mg／kg／日程度、さらに好ましくは１０〜６００mg／kg／日程度の範囲となる量を目安とするのがよい。これら本発明の抗ウイルス剤は１日に１回又は２〜４回程度に分けて投与することができる。
【００２２】
本発明において「ウイルス」とは、動物ウイルス、昆虫ウイルス、植物ウイルス、細菌ウイルス(バクテリオファージ)を含み、特にヒトを含む哺乳動物、鳥類等を含む動植物に対して好ましくない影響を及ぼすウイルスを意味する
本発明の抗ウイルス剤が特に有効なウイルスとしては、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルスが挙げられ、とりわけ、サイトメガロウイルス、特にヒトサイトメガロウイルス、サルサイトメガロウイルス、マウスサイトメガロウイルス等のサイトメガロウイルス；インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ等のヒトインフルエンザウイルスやトリインフルエンザウイルス等が挙げられる。
【００２３】
本発明の抗ウイルス剤は、ヒトはもとより、ヒト以外の哺乳類、鳥類、魚貝類、甲殻類、昆虫類、両棲類、爬虫類等用の抗ウイルス剤としても有効である。従って本発明の抗ウイルス剤は、これらの動物用の抗ウイルス剤（例えば、ペット用医薬、動物用飼料、ペットフード等）として使用することができる。さらに本発明の抗ウイルス剤は、動物以外に、各種植物に対する抗ウイルス剤としても有用であり、また、防腐剤としても有用である。
【００２４】
本発明の抗ウイルス剤は、各種のウイルス、特にヘルペスウイルス、とりわけ、サイトメガロウイルス、特にヒトサイトメガロウイルス；インフルエンザウイルス、特にヒトインフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣやトリインフルエンザウイルスに対して高い抗ウイルス活性を有する。
本発明の抗ウイルス剤は、細胞浸透性が高く、血中移行性も高く、更に細胞毒性が低いという優れた利点に加え、耐性ウイルスに対しても優れた抗ウイルス活性を有する。
【００２５】
（抗癌剤）
トリシンは、シクロオキシゲナーゼを阻害し、小腸の発ガンを抑制すること（Molecular Cancer Therapeutics, 4: 1287-1292 (2005)）、ヒト由来の大腸癌及び乳癌細胞に対しインビトロにおいて抗癌作用を示すこと（Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,9:1163-70 (2000)）、マウスのＰ３８８白血病モデルにおいて抗癌作用を示すこと（J Nat Prod. 44: 530-5(1981)）等が報告されている。また、トリシンは、アゾキシメタン及び硫酸デキストラン誘導性の結腸癌に有効であること報告されている（Cancer Prev Res., 2(12), 1031-1038(2009)）。
また、実施例において示したとおり、トリシンは子宮頚癌細胞株の増殖を抑制することから、子宮頚癌治療用抗癌剤である。
本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有し、体内でトリシンに変換されることから、抗癌剤として用いることができる。
【００２６】
本発明の抗癌剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件により適宜選択できる。通常、トリシンアミノ酸誘導体を１〜２０００mg／kg／日程度、好ましくは５〜１０００mg／kg／日程度、さらに好ましくは１０〜６００mg／kg／日程度の範囲となる量を目安とするのがよい。これら本発明の抗癌剤は１日に１回又は２〜４回程度に分けて投与することができる。
【００２７】
本発明の抗癌剤を投与することにより治療ないしその症状を軽減できる癌としては、特に制限はなく、例えば、大腸癌、小腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、頭頚部癌、肺癌、乳癌、子宮頚癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、皮膚癌、悪性リンパ腫、急性白血病、脳腫瘍、等が挙げられる。
【００２８】
本発明の抗ウイルス剤及び抗癌剤は、ヒトはもとより、ヒト以外の哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類等用の抗癌剤としても有効である。従って本発明の抗癌剤は、これらの動物用の抗癌剤（例えば、ペット用医薬、ペットフード等）として使用することができる。
【００２９】
本発明の抗ウイルス剤または抗癌剤の剤型は、治療目的に応じて適宜選択できる。具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、軟膏等が例示できる。ここで用いられる製剤担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等の希釈剤ないし賦形剤等を例示できる。
【００３０】
経口投与形態としては錠剤、丸剤、粉剤、液剤、チューインガム、飴、チョコレート、パン、クッキー、煎餅、ビスケット、そば、うどん、各種ドリンク剤、ゼリー、みそ汁、スープ、ポタージュ等の食品形態が、非経口投与形態としては、注射剤、局所投与剤（クリーム、軟膏等）、座薬等が挙げられる。局所投与剤の剤型の例としては、本発明の抗癌剤を、天然繊維又は合成繊維製のガーゼ等の担体に含浸させたもの、口紅等の化粧品に含有させたもの等が挙げられる。
【００３１】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体として例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、単シロツプ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラツク、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩等の滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。
【００３２】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として例えば、ブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
カプセル剤は本発明の有効成分であるトリシンアミノ酸誘導体を上記で例示した各種の担体と混合し、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
【００３３】
本発明の抗ウイルス剤、抗癌剤中に含まれるトリシンアミノ酸誘導体の量は特に限定されず、適宜選択すればよいが、例えば、０．５〜５０質量％、好ましくは１〜８質量％程度とするのがよい。
【００３４】
本発明の抗ウイルス剤、抗癌剤は経口投与、非経口投与いずれでもよく、投与方法は、各製剤形態、患者の年齢、性別、患者の症状の程度、その他の条件に応じて決定される。例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、液剤は注射剤として非経口投与され、軟膏等は局所投与される。
【００３５】
本発明の種々の剤型の製造には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を配合してもよい。また、通常の医薬組成物、化粧品、皮膚用組成物等に使用される油性成分等の基材成分、保湿剤、防腐剤、安定化剤、創傷治癒剤、界面活性剤等を使用することができる。抗癌剤に水を使用する場合、水道水、天然水、精製水等、特に限定されないが、一般にイオン交換水等の高純度の水が好ましい。
【００３６】
油性成分としては、スクワラン、牛脂、豚脂、馬油、ラノリン、蜜蝋等の動物性油、ユーカリ油、オリーブ油、グレープシード油、パーム油、ホホバ油、胚芽油（例えば、米胚芽油）等の植物性油、流動パラフィン、高級脂肪酸エステル（例えば、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル）、シリコーン油等の合成油、半合成油が挙げられる。ユーカリ油は刺激緩和効果があり好ましい。
【００３７】
油性成分は、皮膚の保護、エモリエント性付与効果（皮膚表面を薄膜で覆い、乾燥を防ぐと共に、柔軟性、弾力性を与える効果）、さっぱり感等の要求性能に合わせて適宜組み合わせて用いられる。スクワラン、オリーブ油及びミリスチン酸オクチルドデシルの組合せは好ましい例の一つである。
【００３８】
各剤形の硬さ、流動性を調節するために、ステアリン酸、ステアリルアルコール、ベヘニン酸、セタノール、ワセリン等の固体油が用いられ、好ましくはステアリン酸とセタノールが組み合わせて用いられる。
【００３９】
＜＜抗ウイルス剤（併用剤）＞＞
本発明の第二の態様は、（Ａ）トリシン又はそのアミノ酸誘導体、並びに（Ｂ）ガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンから選択される少なくとも一種を併用して用いることを特徴とする抗ウイルス剤（以下、抗ウイルス剤（併用剤）ということがある。）である。
【００４０】
本発明において「ウイルス」とは、動物ウイルス、昆虫ウイルス、植物ウイルス、細菌ウイルス(バクテリオファージ)を含み、特にヒトを含む哺乳動物、鳥類等を含む動植物に対して好ましくない影響を及ぼすウイルスを意味する。
【００４１】
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）は、ヒトはもとより、ヒト以外の哺乳類、鳥類、魚貝類、甲殻類、昆虫類、両棲類、爬虫類等用の抗ウイルス剤としても有効である。従って本発明の抗ウイルス剤は、これらの動物用の抗ウイルス剤（例えば、ペット用医薬、動物用飼料、ペットフード等）として使用することができる。さらに本発明の抗ウイルス剤は、動物以外に、各種植物に対する抗ウイルス剤としても有用であり、また、防腐剤としても有用である。
【００４２】
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）が特に有効なウイルスとしては、ヘルペスウイルスが挙げられ、特にヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、サルサイトメガロウイルス、マウスサイトメガロウイルス等のサイトメガロウイルスが挙げられる。これらの中でも、特にヒトサイトメガロウイルスに対して本発明の抗ウイルス剤は有効に作用する。
【００４３】
＜（Ａ）成分＞
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）における有効成分は４’，５，７−トリヒドロキシ−３’，５’−ジメトキシフラボン（トリシン）又はそのアミノ酸誘導体である。トリシンは隈笹から抽出されるが、合成品や他の源から採取されたものでも良いことはいうまでもない。例えば、隈笹以外の植物、特に、イネ科に属する多くの植物、例えば、イネ（米）、コムギ（小麦）、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ、タケ、ススキ、パンパスグラス、アシ（葦、ヨシともいう）等のカヤ類の葉や茎類にも４’，５，７−トリヒドロキシ−３’，５’−ジメトキシフラボン（トリシン）が多量に含まれており抽出することができる。具体的な植物名は以下のとおりである。
イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ、タケ、マコモ、サトウキビ、ハトムギ、ヨシ、ススキ、ササ、ダンチク、シロガネヨシ、シバ。
【００４４】
上記植物の葉、茎等を適切な溶媒を使用して抽出し、ＨＰＬＣ等の分離精製手段を用いてトリシンを分離精製できる。例えば、水抽出物を濃縮し、固形物をアルコール、含水アルコール（例えば、メタノール、エタノール、含水メタノール、含水エタノール）抽出し、固形分を水に溶解し、酢酸エチルとの分配等により精製できる。
【００４５】
トリシンのアミノ酸誘導体としては、上記第一の態様で記載した一般式１で表されるトリシンアミノ酸誘導体である。
【００４６】
＜（Ｂ）成分＞
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）は、有効成分として、前記（Ａ）成分と共に、ガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンから選択される少なくとも一種を含む。これらの中でも、ガンシクロビルが特に好ましい。
【００４７】
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）は、（Ａ）成分と（Ｂ）成分とを組み合わせることにより、トリシンを有効成分として用いる従来の抗ウイルス剤よりも著しく優れた抗ウイルス作用を発揮することが出来る。
また、主にガンシクロビルのみを有効成分とする従来の抗ウイルス剤では、ガンシクロビルを多量に使用することになるが、これは耐性ウイルスの出現や副作用（強い細胞毒性）といった問題につながる。一方、本発明の抗ウイルス剤（併用剤）ではトリシンを併用するため細胞毒性が弱く、耐性株の問題も生じにくい。さらにはガンシクロビルと比較しても同等以上の優れた抗ウイルス活性を有する。
【００４８】
（Ａ）成分と（Ｂ）成分との含有比（モル比）は本発明の効果を奏する限り特に制限されるものではないが、１：１〜１０００：１（（Ａ）成分：（Ｂ）成分）、更に好ましくは１０：１〜１０００：１、より好ましくは１００：１〜１０００：１である。含有比が上記範囲内であると、（Ａ）成分と（Ｂ）成分とが相乗効果を発揮し、それぞれの成分が有する高ウイルス作用から予想されるよりもはるかに優れた抗ウイルス作用を発揮することが出来る。
本発明の抗ウイルス剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件により適宜選択できる。例えば、静脈注射の場合には１日当たり、（Ｂ）成分の投与量が約０．１〜１０ｍｇ程度となるように投与すればよく、経口投与の場合には１日当たり（Ｂ）成分が０．１〜５０ｍｇ程度となるように投与すればよい。また、必要に応じて１日に１回又は２〜６回程度に分けて投与することが出来る。また、（Ａ）成分と（Ｂ）成分は、それぞれを同時あるいは連続的に投与してもよい。
ガンシクロビルを含む従来の抗ウイルス剤では、例えば、成人に対し、静脈注射では１日当たり約１０〜１０００ｍｇ、経口投与では１日当たり約１０〜５０００ｍｇ程度の量のガンシクロビルを投与していた。本発明は、トリシンと併用することにより（Ｂ）成分の量を従来のガンシクロビル投与量の約１００〜１０００分の１に抑えることができ、細胞毒性の問題が生じにくく安全性に優れる。
【００４９】
（Ａ）成分及び（Ｂ）成分を有効成分とする本発明の抗ウイルス剤（併用剤）は、種々の形態で使用できる。例えば、粘膜保護組成物、ウイルス感染予防及び／又は治療用組成物、防腐剤、濾過装置等の抗ウイルス剤として好適である。
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）の剤型は、液体状、固体状、気体状、ジェル状、ゲル状、エアゾール、いずれでも良い。本発明の抗ウイルス剤は、経口、非経口投与いずれの投与形態で投与してもよい。
経口投与形態としてはカプセル剤、ドライシロップ、錠剤、丸剤、粉剤、液剤等が挙げられる。
また、チューインガム、飴、各種ドリンク剤等の食品や、飲料水、調味料等の形態であってもよい。
非経口投与形態としては、例えば、点鼻用の液剤及びゲル剤、口腔スプレーなどのエアロゾルなどの鼻腔や咽頭に直接適用する点鼻適用製剤、軟膏剤、乳剤及びクリーム剤などの経皮吸収用製剤、注射剤、座薬、膣内投与形態（タンポン等）等が挙げられる。本発明の抗ウイルス剤を、天然繊維又は合成繊維製のガーゼ等の担体に含浸させたもの、口紅等の化粧品や他の形態の化粧品（ローション、オイル、石けん、化粧水、化粧クリーム等）や浴用剤に含有させたもの、美容液、シャンプー、ボディーソープ、洗顔フォーム等の半固体又は液体の形態としたものとしてもよい。点眼剤、うがい剤等の形態としてもよい。創傷部位治療用噴霧剤、咽頭部炎症治療用噴霧剤等の形態も挙げられる。
【００５０】
本発明の種々の剤型の抗ウイルス剤（併用剤）の製造には、所定量の上記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分のほか、通常の医薬組成物、化粧品、皮膚用組成物等に使用される油性成分等の基材成分、保湿剤、防腐剤等を使用することができる。
【００５１】
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）は、（Ａ）成分、（Ｂ）成分以外の他の抗ウイルス剤と併用してもよい。
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）には、さらに必要に応じて安定化剤、保湿剤、創傷治癒剤、防腐剤、界面活性剤等を含有させることができる。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
＜＜トリシンアミノ酸誘導体＞＞
［実施例１］
（化合物２：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００５３】
窒素雰囲気下、グリシンｔ−ブチルエステル塩酸塩（５５．３ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１）（９２ｍｇ， ６３％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１）（４０．０ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯＨ）−トリシン（化合物２）（３３ｍｇ， ９４％）を黄色粉末として得た。
【００５４】
［実施例２］
（化合物４：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００５５】
窒素雰囲気下、アラニンｔ−ブチルエステル塩酸塩（５９．９ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物３）（８４ｍｇ， ５５％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物３）（４１．１ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン（化合物４）（３０ｍｇ， ８１％）を黄色粉末として得た。
【００５６】
［実施例３］
（化合物６：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００５７】
窒素雰囲気下、バリンｔ−ブチルエステル塩酸塩（６９．２ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物５）（９４ｍｇ， ５２％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物５）（４４．６ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯＨ）−トリシン（化合物６）（３５ｍｇ， ９０％）を黄色粉末として得た。
【００５８】
［実施例４］
（化合物８：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００５９】
窒素雰囲気下、フェニルアラニンｔ−ブチルエステル塩酸塩（８５．１ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物７）（１１６ｍｇ， ６１％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物７）（４７．４ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯＨ）−トリシン（化合物８）（４８ｍｇ， ８０％）を黄色粉末として得た。
【００６０】
［実施例５］
（化合物１０：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００６１】
窒素雰囲気下、アスパラギン酸ｔ−ブチルエステル塩酸塩（９３．０ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物９）（１０６ｍｇ， ５３％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物９）（４９．３ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン（化合物１０）（３６ｍｇ， ９０％）を黄色粉末として得た。
【００６２】
［実施例６］
（化合物１２：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００６３】
窒素雰囲気下、グルタミン酸ｔ−ブチルエステル塩酸塩（９７．６ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１１）（１２４ｍｇ， ６１％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１１）（５０．５ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン（化合物１２）（３４ｍｇ， ８３％）を黄色粉末として得た。
【００６４】
［実施例７］
（化合物１４：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００６５】
窒素雰囲気下、０℃に冷却しながらアスパラギン酸ｔ−ブチルエステル塩酸塩（８７．４ｍｇ， ０．３１ｍｍｏｌ）、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン（化合物４）（１４０ｍｇ， ０．３１ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶かし、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（９４．９ｍｇ， ０．６２ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（６５．４ｍｇ， ０．３４ｍｍｏｌ）を加え、３日間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝ １０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１３）（６８ｍｇ， ３２％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１３）（５５．０ｍｇ， ０．０９５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン（化合物１４）（４２ｍｇ， ９１％）を黄色粉末として得た。
【００６６】
［実施例８］
（化合物１６：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００６７】
窒素雰囲気下、０℃に冷却しながらグルタミン酸ｔ−ブチルエステル塩酸塩（９１．７ｍｇ， ０．３１ｍｍｏｌ）、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン（化合物４）（１４０ｍｇ， ０．３１ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶かし、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（９４．９ｍｇ， ０．６２ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（６５．４ｍｇ， ０．３４ｍｍｏｌ）を加え、３日間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１５）（７３ｍｇ， ３３％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１５）（５５．０ｍｇ， ０．０７８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン（化合物１６）（４４ｍｇ， ９６％）を黄色粉末として得た。
【００６８】
実施例１〜８における出発化合物、中間体及び生成物の物理化学的性質を以下に示す。
ＮＭＲ ｄａｔａ
（トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.39 (s, 2H), 6.74 (s, 1H), 6.56 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.26 (d, J=2.0 Hz, 1H), 3.97 (s, 6H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 183.1, 165.1, 164.9, 163.3, 158.8, 149.1 (2C), 140.9, 122.3, 105.4 (2C), 105.2, 104.7, 99.7, 94.9, 56.9 (2C).
MS (FAB) : m/z = 331 [M+H]+
【００６９】
（化合物１：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.37 (s, 2H), 7.00 (br t, J=6.0 Hz, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.54 (d, J=1.8 Hz, 1H), 6.24 (d, J=1.8 Hz, 1H), 3.97 (s, 6H), 3.84 (d, J=6.0 Hz, 2H), 1.46 (s, 9H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 168.8, 164.2, 163.4, 162.5, 158.0, 153.9, 153.7 (2C), 132.4, 129.0, 105.5, 104.7, 103.6 (2C), 99.0, 94.2, 80.9, 56.1 (2C), 43.5, 28.8 (3C).
MS (FAB) : m/z = 488 [M+H]+
【００７０】
（化合物２：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.86 (br s, 1H), 8.05 (t, J=6.0 Hz, 1H), 7.34 (s, 2H), 7.09 (s, 1H), 6.56 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.20 (d, J=1.9 Hz, 1H), 3.85 (s, 6H), 3.72 (d, J=6.0 Hz, 2H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.5, 171.7, 164.9, 163.3, 161.9, 158.0, 154.1, 153.5 (2C), 132.1, 128.9, 106.1, 104.5, 104.2 (2C), 99.5, 94.9, 56.9 (2C), 42.9.
MS (FAB) : m/z = 432 [M+H]+
【００７１】
（化合物３：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.36 (s, 2H), 7.00 (br d, J=9.2 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.53 (d, J=2.3 Hz, 1H), 6.23 (d, J=2.3 Hz, 1H), 4.14 (quin, J=7.3 Hz, 1H), 3.92 (s, 6H), 1.46 (s, 9H), 1.41 (d, J=7.3 Hz, 3H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 183.2, 172.5, 165.0, 164.3, 163.3, 158.8, 154.5 (2C), 153.9, 133.3, 129.8, 106.4, 105.5, 104.5 (2C), 99.8, 95.0, 81.6, 56.9 (2C), 51.6, 28.1 (3C), 18.0.
MS (FAB): m/z = 502 [M+H]+
【００７２】
（化合物４：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.86 (br s, 1H), 8.11 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.33 (s, 2H), 7.08 (s, 1H), 6.56 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.20 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.03 (quin, J=7.3 Hz, 1H), 3.84 (s, 6H), 1.29 (d, J=7.3 Hz, 3H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.5, 174.5, 164.9, 163.3, 161.9, 158.0, 153.5 (3C), 132.2, 128.8, 106.1, 104.5, 104.2 (2C), 99.5, 94.9, 57.0 (2C), 50.0, 17.8.
MS (FAB) : m/z = 446 [M+H]+
【００７３】
（化合物５： ４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.36 (s, 2H), 6.87-6.83 (m, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.53 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.23 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.10-4.04 (m, 1H), 3.92 (s, 6H), 2.26-2.14 (m, 1H), 1.48 (s, 9H), 1.04-1.00 (m, 6H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 170.6, 164.2, 163.4, 162.5, 158.0, 153.6 (3C), 132.5, 128.9, 105.5, 104.7, 103.7 (2C), 99.0, 94.2, 81.0, 60.5, 56.0 (2C), 31.1, 27.4 (3C), 18.6, 17.3.
【００７４】
（化合物６：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.91 (br s, 1H), 8.06 (d, J=9.2 Hz, 1H), 7.38 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 6.59 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.23 (d, J=1.9 Hz, 1H), 3.95-3.88 (m, 1H), 3.88 (s, 6H), 2.15-2.08 (m, 1H), 0.96 (d, J=3.8 Hz, 3H), 0.94 (d, J=3.8 Hz, 3H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.0, 172.9, 164.4, 162.9, 161.4, 157.5, 153.7, 153.0 (2C), 131.8, 128.3, 105.6, 104.0, 103.7 (2C), 99.0, 94.4, 59.8, 56.4 (2C), 30.0, 19.1, 18.0.
【００７５】
（化合物７：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.36 (s, 2H), 7.36-7.30 (m, 4H), 7.28-7.23 (m, 1H), 6.92-6.88 (m, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.55 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.24 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.40-4.34 (m, 1H), 3.90 (s, 6H), 3.19 (dd, J=13.7, 6.0 Hz, 1H), 3.08 (dd, J=13.7, 6.0 Hz, 1H), 1.42 (s, 9H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 183.2, 171.2, 165.8, 164.4, 163.4, 158.9, 154.5 (2C), 153.8, 138.1, 133.2, 130.4 (2C), 129.2 (2C), 127.5, 126.9, 106.4, 104.5 (3C), 99.9, 95.0, 82.0, 57.2, 56.9 (2C), 38.3, 28.1 (3C).
MS (FAB) : m/z = 578 [M+H]+
【００７６】
（化合物８：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.86 (br s, 1H), 8.15 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.30 (s, 2H), 7.29-7.20 (m, 5H), 7.07 (s, 1H), 6.55 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.19 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.20-4.13 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.08 (dd, J=13.7, 4.6 Hz, 1H), 2.87 (dd, J=13.7, 4.6 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.5, 173.5, 164.9, 163.3, 161.9, 158.0, 153.7, 153.4 (2C), 138.2, 132.2, 129.7 (2C), 128.8 (3C), 127.0, 106.1, 104.5, 104.2 (2C), 99.5, 94.9, 56.9 (2C), 56.2, 37.0.
【００７７】
（化合物９：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.37 (s, 2H), 6.98-6.93 (m, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.54 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.24 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.49-4.44 (m, 1H), 3.93 (s, 6H), 2.83 (dd, J=16.0, 6.0 Hz, 1H), 2.75 (dd, J=16.0, 6.0 Hz, 1H), 1.47 (s, 9H), 1.46 (s, 9H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 169.6, 169.5, 164.2, 163.5, 163.4, 162.5, 158.0, 153.7 (2C), 132.4, 129.1, 105.6, 104.7, 103.7 (2C), 99.0, 94.2, 81.4, 80.7, 56.1 (2C), 51.9, 37.5, 27.4 (3C), 27.3 (3C).
【００７８】
（化合物１０：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.90 (br s, 1H), 8.15 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.37 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 6.59 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.23 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.35 (q, J=7.8 Hz, 1H), 3.88 (s, 6H), 2.77 (dd, J=16.5, 6.7 Hz, 1H), 2.63 (dd, J=16.5, 6.7 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.0, 172.3, 171.6, 164.4, 162.8, 161.4, 157.5, 153.0, 152.9 (2C), 131.7, 128.3, 105.6, 104.0, 103.8 (2C), 99.0, 94.4, 56.4 (2C), 55.8, 29.6.
【００７９】
（化合物１１：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.36 (s, 2H), 7.01-6.97 (m, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.53 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.23 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.24-4.18 (m, 1H), 3.93 (s, 6H), 2.45-2.41 (m, 2H), 2.20-2.11 (m, 1H), 1.98-1.89 (m, 1H), 1.47 (s, 1H), 1.44 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 171.6, 170.8, 164.2, 163.5, 163.4, 162.5, 158.0, 153.6 (2C), 153.4, 132.5, 129.0, 105.5, 104.7, 103.7 (2C), 99.0, 94.2, 81.1, 79.8, 56.１ (2C), 54.4, 31.1, 27.5 (3C), 27.3 (3C).
【００８０】
（化合物１２：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.93 (br s, 1H), 8.15 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.38 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 6.60 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.24 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.09-4.02 (m, 1H), 3.89 (s, 6H), 2.40-2.35 (m, 1H), 2.09-2.00 (m, 1H), 1.88-1.78 (m, 1H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.5, 174.3, 173.6, 164.9, 163.3, 161.9, 158.0, 153.9, 153.4 (2C), 132.3, 128.8, 106.1, 104.5, 104.2 (2C), 94.9 (2C), 56.9 (2C), 53.7, 30.4, 26.9.
【００８１】
（化合物１３：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.51 (br d, J=8.2 Hz, 1H), 7.34 (s, 2H), 7.00 (br d, J=7.3 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.53 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.23 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.68-4.63 (m, 1H), 4.30 (quin, J=6.8 Hz, 1H), 3.91 (s, 6H), 2.74 (d, J=5.5 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.43 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.40 (s, 9H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 171.9, 169.6 (3C), 164.3, 163.4, 162.5, 158.0, 153.6 (2C), 131.9, 129.0, 105.5, 104.7, 103.5 (2C), 99.0, 94.3, 81.3, 80.6, 56.0 (2C), 50.8, 49.5, 37.3, 27.4 (3C), 27.3 (3C), 18.1.
【００８２】
（化合物１４：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.91 (br s, 1H), 8.15 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.99 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.37 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 6.59 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.23 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.56 (q, J=7.8 Hz, 1H), 4.13 (quin, J=7.8 Hz, 1H), 3.88 (s, 6H), 2.69 (dd, J=16.5, 6.0 Hz, 1H), 2.62 (dd, J=16.5, 6.0 Hz, 1H), 1.29 (d, J=6.8Hz, 3H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.0, 172.3, 172.0, 171.6, 164.4, 162.8, 161.4, 157.5, 153.0 (2C), 152.7, 131.7, 128.3, 105.6, 104.0, 103.7 (2C), 99.0, 94.4, 56.4 (2C), 50.1, 48.5, 36.0, 18.4.
【００８３】
（化合物１５：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.46 (br d, J=7.8 Hz, 1H), 7.34 (s, 2H), 6.97 (br d, J=7.8 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.53 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.24 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.42-4.36 (m, 1H), 4.29 (quin, J=7.3 Hz, 1H), 3.90 (s, 6H), 2.34-2.30 (m, 2H), 2.14-2.05 (m, 1H), 1.92-1.82 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.43 (d, J=7.3 Hz, 3H), 1.38 (s, 9H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 172.1, 171.5, 170.7, 164.3, 163.4, 162.5, 158.0, 153.6 (2C), 153.1, 132.0, 128.9, 105.4, 104.7, 103.5 (2C), 99.0, 94.3, 81.2, 79.7, 56.0 (2C), 52.3, 50.7, 31.2, 27.4 (3C), 27.3 (3C), 27.2, 18.0.
【００８４】
（化合物１６：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.90 (br s, 1H), 8.09 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.98 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.37 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 6.59 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.28-4.22 (m, 1H), 4.12 (quin, J=7.3 Hz, 1H), 3.89 (s, 6H), 2.31-2.23 (m, 2H), 2.03-1.94 (m, 1H), 1.83-1.74 (m, 1H), 1.27 (d, J=7.3 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.0, 173.7, 173.1, 172.2, 164.4, 162.8, 161.4, 157.5, 153.0 (2C), 152.7, 131.7, 128.3, 105.5, 104.0, 103.7 (2C), 99.0, 94.4, 56.4 (3C), 51.1, 29.9, 26.4, 18.2.
【００８５】
［実施例９］
（細胞浸透性試験）
ＭＤＣＫ細胞の培養液にはＥ−ＭＥＭ ８９％、非働化子ウシ血清１０％、ペニスト（抗生物質）１％を混合して用いた。
１２穴細胞浸透用プレートチャンバーの上層に２．７×１０5／ｃｍ2（３００μｌ）でＭＤＣＫ細胞をまき、下層には培養液を５００μｌ加えた。１日３７℃、ＣＯ2５％で培養し、その後、上層の培養液を除去し、新しい培養液を加えた。再び、１日培養後、上下層の培養液を除去した。下層に培養液を５００μｌ加え、上層には試験物質３０μＭ（溶媒：ＰＢＳ）を３００μｌ加えた。１時間培養後、上下層を１５０ μｌ採取し、ＵＶ（３５５ｎｍ）吸収を測定した。検量線にて試験物質の細胞浸透率を算出した。細胞浸透性試験の結果として、トリシンの細胞浸透率を１とした場合の相対的細胞浸透率を図１に示す。
細胞の層の状態はルシファーイエローが透過しないことで確認した。
この結果、トリシンのアミノ酸誘導体はいずれもトリシンより高い細胞浸透性を示し、より高い組織移行性及びより高い生物学的利用能を示す可能性が示唆された。
【００８６】
［参考例１］
（ラットにおけるトリシンの１４日連続経口投与後の血漿中トリシン濃度）
方法
１群につき各３匹の雄性及び雌性Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系ラット（日本チャールズ・リバー株式会社）を準備し、各群にそれぞれトリシン１００、３００、１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを１４日間反復経口投与し、投与１４日目の投与前、投与後０．５、２及び４時間後に採血して得られた血漿中のトリシン濃度を測定した。
・分析法
ラット血漿中のトリシン濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−ＵＶ法により測定した。血漿からのトリシンの抽出及びＨＰＬＣの測定条件はHong Caiらの方法（Hong Cai et al. Biomed. Chromatogr. 17, 435-439 (2003)、 Hong Cai, et al. Biomed. Chromatogr. 19, 518-522 (2005)）に準じて設定し、抽出方法を一部改変して血漿中トリシン濃度を測定した。
【００８７】
・採血
投与１４日の投与前、投与後３０分、投与後２及び４時間にヘパリン加処理血液を勁静脈より採取し、４℃下６０００回転／分で１０分間遠心した。得られた血漿はラットＴＫ血漿として採血当日より使用日まで−２５℃設定の冷凍庫に保存した。
・抽出方法
ラットＴＫ血漿５０μＬに内部標準溶液（ケルセチン・２水和物ＤＭＳＯ溶液、血漿中濃度８００ｎｇ／ｍＬ）１０μＬを添加して攪拌後、抽出溶媒（０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸／アセトン溶液）４０μＬを添加し、攪拌した。微量高速冷却遠心機で１５０００回転／分で１０分間遠心分離した後、蒸留水２５μＬを添加して攪拌後、微量高速冷却遠心機で遠心分離し、得られた上清をＨＰＬＣに注入した。
また、ラットプール血漿（無処置の雌雄Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系由来）５０μＬに検量線用標準溶液（血漿中トリシン濃度：５０、１００、２００、５００、１０００、２０００ ｎｇ／ｍＬ）１０μＬを添加し、添加後はラットＴＫ血漿と同様の操作を行ったものを検量線として使用した。
・ＨＰＬＣ条件
ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ （６．０ｍｍ×１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）カラムに、抽出後の上清４０μＬを注入し、カラム温度４０℃、波長３５５ｎｍ、流速１．４ｍＬ／ｍｉｎ、移動相は酢酸アンモニウム・酢酸（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ＰＨ５．１）：メタノール＝２：３、分析時間１０分の条件で測定した。
【００８８】
結果
ラットＴＫ血漿中のトリシン濃度の測定結果を表１及び２に示す。
いずれも定量限界（５００ｎｇ／ｍＬ）以下の値であったが、雄では投与後０．５、２及び４時間の血漿中にトリシンが検出された。投与後２及び４時間ではごく軽度ながら投与量に相関した血漿中トリシン濃度が高値となる傾向がみられたが、３００あるいは１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の投与後２及び４時間の血漿中トリシン濃度は同程度であり、時間経過に伴って増加ないし低下する傾向は見られなかった。これに対して、雌の１００および３００ｍｇ／ｋｇ投与群では投与後４時間まで血漿中にトリシンは検出されなかった。雌の１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では投与後０．５、２及び４時間の血漿中にトリシンが検出されたが、投与後０．５時間をピークとして血漿中トリシン濃度は低下する傾向にあった。
【００８９】
表１：１４日間反復経口投与毒性試験における雄性ラットの血漿中トリシン濃度
*：定量限界（５００ｎｇ／ｍＬ）以下であることから参考値である。
【００９０】
表２：１４日間反復経口投与毒性試験における雌性ラットの血漿中トリシン濃度
*：定量限界（５００ｎｇ／ｍＬ）以下であることから参考値である。
【００９１】
［実施例１０］
（雄性ラットにおけるトリシン誘導体の単回経口投与による毒性試験及びトリシンの血漿中濃度推移）
方法
１群につき各３匹の雄性Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系ラット（日本チャールズ・リバー株式会社）を準備し、各群にそれぞれトリシン濃度として０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、１００、３００および１０００ｍｇ／ｋｇに相当するトリシン誘導体、化合物１６（４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン）を単回投与し、投与前、投与後３０分、２時間、４時間および８時間に採血して得られた血漿中のトリシン濃度の推移について検討した。
【００９２】
・観察、測定及び検査項目
ａ．一般状態観察
全例について動物の生死、外観、行動等を投与日（０日）の投与前、投与直後、投与後３０分、２時間、４時間及び８時間の各採血時点に観察した。
ｂ．体重測定
全例について動物の体重を、投与日の投与前に、電子式上皿天秤を用いて測定し、１ｇ単位で記録した。
【００９３】
・分析法
ラット血漿中のトリシン濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−ＵＶ法により測定した。血漿からのトリシンの抽出及びＨＰＬＣの測定条件はHong Caiらの方法（Hong Cai et al. Biomed. Chromatogr. 17, 435-439 (2003)、 Hong Cai, et al. Biomed. Chromatogr. 19, 518-522 (2005））に準じて設定し、抽出方法を一部改変して血漿中トリシン濃度を測定した。
【００９４】
・採血
投与日の投与前、投与後３０分、２時間、４時間および８時間に勁静脈からヘパリン加処理血液を採取し、４℃下６０００回転／分で１０分間遠心した。得られた血漿はラットＴＫ血漿として採血当日より使用日まで−２５℃設定の冷凍庫に保存した。
・抽出方法
ラットＴＫ血漿５０μｌに内標準溶液（１．２５μｇ／ｌケルセチン・２水和物ＤＭＳＯ溶液）１０μｌを添加し混合後、抽出溶媒（０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸／アセトン溶液）４０μｌを添加し攪拌した。１０℃下１５０００回転／分で１０分間遠心した。蒸留水５０μｌを添加後攪拌し、１０℃下１５０００回転／分で１０分間遠心した。遠心後の上清を採取し、得られた上清をＨＰＬＣに注入した。
・ＨＰＬＣ条件
ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）カラムに、抽出後の上清４００μＬを注入し、カラム温度４０℃、波長３５５ｎｍ、流速１．４ｍＬ／ｍｉｎ、移動相は酢酸アンモニウム溶液：メタノール＝２：３、分析時間１０分の条件で測定した。
【００９５】
結果
・一般状態
一般状態の成績を表３に示す。
各投与群とも、投与日の投与前ならびに投与後３０分、２時間、４時間および８時間の各採血時点で一般状態に異常は認められなかった。
・体重
投与前日及び投与日の体重を表４に示す。
投与前日に比べて投与日の体重はいずれの投与群とも増加しており、投与日までの体重増加は順調であった。
したがってトリシン同様、トリシン誘導体は安全性の高い薬物と推測される。
【００９６】
・血漿内トリシン濃度
血漿中トリシン濃度の推移を図２及び表５に示す。また代表的なクロマトグラムを図３〜７に示す。
１００ｍｇ／ｋｇ投与群の血漿中トリシン濃度推移では、投与後３０分で増加し、投与後２時間で低下した後、投与後４時間で再び増加を示す二峰性の推移が認められた。投与後３０分に比べ、投与後４時間のトリシン濃度は約３．６倍高値であった。投与後８時間で血漿中濃度は低下したが、投与後３０分と同程度のトリシンが検出された。
【００９７】
３００ｍｇ／ｋｇ投与群の血漿中濃度推移においても、投与後３０分と４時間をピークとする二峰性の推移が認められたが、１００ｍｇ／ｋｇ投与群とは異なり、投与後３０分と４時間の血漿中濃度はほぼ同程度であった。１００ｍｇ／ｋｇ投与群に比べて、投与後３０分の血漿中トリシン濃度は約４．２倍、投与後２時間で約２．５倍高値であり、ほぼ投与量に応じた増加を示した。しかしながら、投与後４時間の濃度は約１．１倍、投与後８時間は約１．４倍であり、投与後４時間以降の血漿中濃度には１００ｍｇ／ｋｇ投与群と大きな差は認められなかった。
【００９８】
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の血漿中濃度推移でも、投与後３０分で増加し、投与後２時間で低下した後、投与後４時間で再び増加を示す二峰性の推移が認められた。投与後３０分の値は、多糖四群と異なり投与後４時間よりも約１．６倍高値であり、１００ｍｇ／ｋｇ投与群の約６．４倍３００ｍｇ／ｋｇ投与群の約１．５倍高値であった。また、投与後８時間の濃度は、同群の投与後４時間あるいは３００ｍｇ／ｋｇ投与群の投与後４時間と同程度の値であった。
薬物動態学的パラメーターでは、１０００ｍｇ／ｋｇ投与群のＣｍａｘは高値であったが、１００及び３００ｍｇ／ｋｇ投与群は同程度の値であった、Ｔｍａｘは投与量の増加に応じて短くなる傾向が見られた。またＡＵＣ0-8は１００ｍｇ／ｋｇ投与群に比べて３００および１０００ｍｇ／ｋｇ投与群はそれぞれ約１．５及び２．１倍高値であった。
【００９９】
トリシン誘導体の１００、３００および１０００ｍｇ／ｋｇ投与群において、投与後３０分の血漿中濃度及びＡＵＣ0-8では用量相関性の増加が認められ、いずれの投与群とも投与後３０分及び投与後４時間をピークとする二峰性の推移を示したことから、腸管循環による再吸収の可能性が示唆された。
また、トリシン誘導体の１００、３００および１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の投与後４時間の血漿中濃度はいずれも同程度の値であり、１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では投与後４時間と投与後８時間の血漿中濃度に差はなく、いずれも高値であった。このことから大量投与に伴う腸管からの吸収遅延が生じている可能性が示唆された。
なお、比較としてラットにトリシンを１４日連続経口投与し、同様に血漿中濃度推移を測定したが、最高でも６１ｎｇ／ｍＬのトリシンしか検出されなかった。トリシン誘導体を経口投与した本試験では最高で４４４８ｎｇ／ｍＬのトリシンが検出されており、血中への移行性はトリシンに比べてはるかに高いことが検証された。
【０１００】
表３：雄性ラットへのトリシン誘導体の単回経口投与試験における一般状態
Ｎ：異常所見無し
【０１０１】
表４：雄性ラットへのトリシン誘導体の単回経口投与試験における体重の推移
【０１０２】
表５：雄性ラットへのトリシン誘導体の単回経口投与試験における血漿中トリシン濃度
【０１０３】
［実施例１１］
（マウスにおけるトリシン誘導体の単回経口投与による毒性試験）
方法
１群につき各５匹の雄性及び雌性Ｃｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）系マウス（日本チャールズ・リバー株式会社）を準備し、各群にそれぞれトリシン濃度として０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、５００ｍｇ／ｋｇ（低用量群）、１０００ｍｇ／ｋｇ（中用量群）および２０００ｍｇ／ｋｇ（高用量群）に相当するトリシン誘導体、化合物１６（４′−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン）を単回経口投与した。
【０１０４】
・観察、測定及び検査項目
ａ．一般状態観察
全例について動物の生死、外観、行動等を投与開始日を投与０日として起算し、投与１日から投与１３日までは午前及び午後の少なくとも１日２回、投与後１４日は午前中に１回観察した。
ｂ．体重測定
全例について動物の体重を、投与１、３、５、７、１０及び１４日に、電子式上皿天秤を用いて測定し、０．１ｇ単位で記録した。
ｃ．剖検所見
全例について投与１４日に安楽死させ、全身の器官・組織を肉眼的に観察し、必要な臓器・組織を固定・保存した。
【０１０５】
結果
・一般状態
対照群及びいずれの投与群においても、投与期間中に異常は認められなかった。
・体重推移
体重推移を表６に示す。各投与群共に投与期間中に対照群と比較して有意な差は認められなかった。
・剖検所見
対照群及びいずれの投与群においても、異常所見は認められなかった。
以上より、トリシン誘導体のマウスへの単回経口投与毒性試験において、一般状態、体重推移及び剖検所見では被験物質投与に関連した変化は認められなかった。
【０１０６】
表６−１：雄性マウスへのトリシン誘導体の単回経口投与毒性試験における体重の推移
【０１０７】
表６−２：雌性マウスへのトリシン誘導体の単回経口投与毒性試験における体重の推移
【０１０８】
［実施例１２］
（雄性マウスにおけるトリシン誘導体の１４日連続経口投与による毒性試験）
方法
１群につき各５匹の雄性Ｃｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）系マウス（日本チャールズ・リバー株式会社）を準備し、各群にそれぞれトリシン濃度として０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、３００および１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙに相当するトリシン誘導体、化合物１６（４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン）を１４日間反復経口投与した。
【０１０９】
・観察、測定及び検査項目
ａ．一般状態観察
全例について動物の生死、外観、行動等を、投与開始日を投与１日として起算し、投与１日から投与１４日の翌日の剖検日まで、午前及び午後の１日２回観察した。
ｂ．体重測定
全例について動物の体重を、投与１、２、７、１０及び１４日の投与前及び剖検日に、電子式上皿天秤を用いて測定し、０．１ｇ単位で記録した。
ｃ．摂餌量
全例について摂餌量を、投与１、２、７、１０及び１４日の投与前に、電子式上皿天秤を用いて測定し、０．１ｇ単位で記録した。投与開始前日に適当量を測定後ケージ毎に給与しその後は測定日に残量及び給与量を測定する。以下の式により摂餌量を算出する。
摂餌量（ｇ／マウス／日）＝（給与量（ｇ／マウス）−残量（ｇ／マウス））／測定日間の日数（日）
【０１１０】
ｄ．血液学的検査
全例について剖検時に採血し、赤血球数（ＲＢＣ）、ヘマトクリット値（ＨＣＴ）、ヘモグロビン濃度（ＨＧＢ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板数（Ｐｌａｔｅｌｅｔ）、白血球数（ＷＢＣ）について自動血球分析装置ＸＴ−２０００ ｉＶ（シスメックス社）を用いて測定した。
ｅ．血液化学的検査
全例について剖検時に採血し、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）、尿素窒素（ＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒｅａ）、総蛋白（ＴＰ）について自動分析装置７０８０形（日立ハイテクノロジーズ社）を用いて測定した。
ｆ．剖検所見
全例について投与１４日の翌日に安楽死させ、全身の器官・組織を肉眼的に観察し、必要な臓器・組織を固定・保存した。
ｇ．器官重量
全例について剖検時に電子式上皿天秤を用いて脳、心臓、配、肝臓、腎臓（左右）、脾臓、副腎（左右）、精巣（左右）について重量を測定して記録した。以下の式から相対重量を算出した。
相対重量（％）＝（絶対重量（ｇ）／剖検日体重（ｇ））×１００
【０１１１】
結果
・一般状態
一般状態の成績を表７に示す。対照群及び３００ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与期間中に異常は認められなかった。
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では、１例で投与８日にのみ軟便が１回認められたのみであり、被験物質投与との関連性はないと判断した。
・体重推移
体重推移を表８に示す。各投与群共に投与期間中に対照群と比較して有意な差は認められなかった。
【０１１２】
・摂餌量
摂餌量を表９に示す。３００ｍｇ／ｋｇ投与群では投与７日に対照群と比較して有意な高値が認められたが、用量依存性もないことから毒性学的な意義はないと考えられた。
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群と比較して有意な変化は認められなかった。
・血液学的検査
各投与群共に投与期間中に対照群と比較して有意な差は認められなかった。
・血液化学的検査
各投与群共に投与期間中に対照群と比較して有意な差は認められなかったが、１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の１例でＡＳＴ及びＡＬＴの高値が認められた。
【０１１３】
・剖検所見
剖検所見を表１０に示す。対照群では異常所見は認められなかった。
３００ｍｇ／ｋｇ投与群では雄１例に左右の精巣に小型化が認められたが、用量依存性のない変化であった。
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では異常所見は認められなかった。
・器官重量
器官重量の成績を表１１に示す。
３００ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群と比較して有意な変化は認められなかった。
【０１１４】
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では、肝臓の絶対及び相対重量に有意な高値が認められた。肝機能検査項目のＡＳＴ及びＡＬＴが高値を示したのは１例のみであり、統計学的な有意差を伴わないことから、代謝酵素等の誘導による重量増加の可能性が考えられた。
他に、心臓の絶対重量に有意な低値が認められたが、相対重量の有意差を伴うものではなく毒性学的な意義はないと推察された。
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群で肝臓重量の増加が認められているが、一般状態、体重推移、摂餌量、血液学的検査、血液化学的検査及び剖検所見では被験物質投与に関連した変化は認められなかった。
以上より、本試験条件下におけるトリシン誘導体の無影響量は、現在のところ３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙと推察された。
【０１１５】
表７：雄性マウスへの１４日連続経口投与毒性試験における一般状態
数値は動物数を示す。
【０１１６】
表８：雄性マウスへのトリシン誘導体の１４日連続経口投与毒性試験における体重の推移
【０１１７】
表９：雄性マウスへのトリシン誘導体の１４日連続経口投与毒性試験における摂餌量
【０１１８】
表１０：雄性マウスへのトリシン誘導体の１４日連続経口投与毒性試験における剖検知見
数値は動物数を示す。
【０１１９】
表１１：雄性マウスへのトリシン誘導体の１４日連続経口投与毒性試験における器官重量
※:対照群に対しp≦0.05 (Dunnett’s test)
※※:対照群に対しp≦0.01 (Dunnett’s test)
【０１２０】
［実施例１３］
（加水分解試験）
トリシンアミノ酸誘導体のエステル結合の加水分解性について、細胞内の加水分解酵素を用いて試験を行った。
ＭＤＣＫ細胞（１．３３×１０6細胞）の溶解物をマニュアル（Harlow, E.; Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, p 449.）に従い作成した。
細胞溶解物によりトリシンアミノ酸誘導体を処理して、トリシンを放出するのに必要な時間（ｔ1/2：半減期）を測定した(Cai, H.; Verschoyle, R. D.; Steward, W. P.; Gescher, A. J. Determination of the flavone tricin in human plasma by high-performance liquid chromatography. Biomed. Chromatogr. 2003, 17, 435-439.)。
トリシン-Ala-Glu誘導体の半減期は１６５分であった。細胞内でトリシンアミノ酸誘導体からトリシンに変換されることが明らかである。
なお、トリシン-Ala-Glu誘導体の半減期（１６５分）は、類似構造のケルセチン-Ala-Glu誘導体の半減期（１１０分）よりかなり長い値を示した。トリシンアミノ酸誘導体は、３’位及び５’位のメトキシ基により立体障害を受け、酵素活性部位に対する親和性が低くなり、加水分解半減期が長くなったものと考えられる。
【０１２１】
［実施例１４］
（子宮頚癌細胞株増殖試験）
トリシンの子宮頚癌細胞株の増殖に対するトリシンの影響を調べるため、以下の実験を行った。
細胞株は以下のものを使用した。
(i) TIG-3株 胎児肺繊維芽細胞（正常細胞、コントロールとして）
(ii)CA株 HPV- p53-（子宮頚癌細胞株）
（“Establishment of a HPV and p53-mutation-nagative human cell line (CA) derived from a squamous carcinoma of the uterine cervix”, Keiichi Isaka et al., Gynecologic Oncology 92, 15-21 (2004)参照)
(iii)CaSki株 HPV16型高コピー p53＋（子宮頚癌細胞株）
(iv)HeLa株 HPV18型 p53＋（子宮頚癌細胞株）
(v)SiHa株 HPV16型低コピー p53＋（子宮頚癌細胞株）
【０１２２】
上記各細胞株を、トリシン添加24時間前に96well プレートに4,000個/1well 播種し、通常培養条件（３７℃、５％ＣＯ2）下にて前培養を行った。
トリシンをDMSOで溶解し、最終濃度０、１、１０、５０μＭとなるよう培養液に添加した
【０１２３】
トリシンを添加した後、７日目まで、２４時間毎に、CellTiter96(登録商標)Non-Radioactive Cell Proliferation Assayに準じたプロトコルにてアッセイ、測定を行った。
より具体的には、１５μｌの染色液を各ウェルに添加し、３７℃で、加湿されたＣＯ2インキュベーター内でインキュベートを行った。その後１００μｌの溶解／停止液を各ウェルに添加した。なお、終了まで培養液の交換は行わずにアッセイを行った。
着色されたホルマザン産物の５７０ｎｍの吸光度を、マルチウェル分光光度計（SpectraMax 190分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製））で測定した。参照波長として６３０〜７５０ｎｍの波長を用いた。解析ソフトは、Ｓｏｆｔｍａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いた。
培養時間と吸光度の関係を図８〜１２に示す。
図８〜１２から明らかなとおり、子宮頚癌細胞株４種および胎児肺繊維芽細胞株全てにおいて、トリシン濃度（0μM〜50μM）依存で細胞増殖は抑えられた。
以上の結果より、トリシンが子宮頸癌に対して優れた抗癌作用を示すことがわかる。
高い細胞浸透性を示し、また体内でトリシンに変化してトリシンの高い血中濃度を与えるトリシンアミノ酸誘導体についても同様に、子宮頸癌に対して優れた抗癌作用を示すことが明らかである。
【０１２４】
＜＜抗ウイルス剤（併用剤）のヘルペスウイルスに対する抗ウイルス作用＞＞
［実施例１５］
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）のヘルペスウイルスに対する抗ウイルス作用を以下の方法により調べた。
＜方法＞
２４ウェルのプレートに単層培養されたヒト胎児線維芽細胞（ＨＥＬ細胞）にヒトサイトメガロウイルス（Ｔｏｗｎｅ株）（１Ｍｏｉ）を１時間吸着・感染させた後、ガンシクロビル０．０００１μＭとトリシン（０、０．０１、０．０３又は０．１μＭ）とを含む培養液を加え、５％炭酸ガス培養器にて培養をスタートさせた。
ウイルス感染後５日目の上清を取り出し、プラークアッセイ実験を行った。
顕微鏡にて細胞変性効果（ＣＰＥ）の有無・状況を観察し、コントロール（トリシン、ガンシクロビル共に０μＭ）のウイルス力価を１００とした場合の、各試料のコントロールに対する相対的なウイルス力価（％）を求めた。その結果を表１２及び図１３に示す。
【０１２５】
［比較例１］
トリシン（０、０．０１、０．０３、０．１μＭ）及びガンシクロビル（０．０００１μＭ）を含む培養液に代えて、トリシンのみ（０、０．０１、０．０３又は０．１μＭ）を含む培養液を用いた以外は実施例１５と同様の方法により実験を行った。その結果を表１２及び図１３に示す。
【０１２６】
表１２：トリシン及びＧＣＶを組み合わせて用いた場合及びトリシンのみを用いた場合の抗ウイルス作用
【０１２７】
［参考例２］
参考として、ガンシクロビル単独を有効成分として用いた場合のヘルペスウイルスに対する抗ウイルス作用を以下の方法により調べた。実験は、４’，５，７−トリヒドロキシ−３’，５’−ジメトキシフラボン（０、０．０１、０．０３、０．１μＭ）及びガンシクロビル（０．０００１μＭ）を含む培養液に代えて、ガンシクロビル（０、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１又は１μＭ）を含む培養液を用いた以外は実施例１５と同様の方法により行った。その結果を表１３及び図１４に示す。
【０１２８】
表１３：ガンシクロビル（ＧＣＶ）のみを用いた場合の抗ウイルス作用
【０１２９】
表１２の結果から、トリシンとガンシクロビルを組み合わせて用いた本発明の抗ウイルス剤では、トリシン単独を用いた場合に比べて抗ウイルス活性が顕著に向上することが分かる。
また、本発明の抗ウイルス剤（併用剤）の細胞変性効果は、ガンシクロビル０．０００１μMによる細胞変性効果とトリシンによる細胞変性効果とから予想し得る結果よりもはるかに優れたものであることが分かる。例えば、トリシン０．０１μMのみを用いた場合の相対的ウイルス力価は約７５％であり、ガンシクロビル０．０００１μMのみを用いた場合の相対的ウイルス力価は約６２％である。これらの値から予想し得るトリシンとガンシクロビル（０．０００１μM）との組み合わせ製剤の効果は４７％前後である（０．７５×０．６２により算出した）。しかしながら、本発明の抗ウイルス剤（１）による実際の相対的ウイルス力価は約３１％であり、予想し得る数値よりもはるかに低い相対的ウイルス力価が得られた。この結果から、トリシンとガンシクロビルは相乗効果を発揮し、組み合わせることにより通常考えられるよりも著しく優れた抗ウイルス作用が得られることが分かる。
さらに、本発明の抗ウイルス剤は、ガンシクロビル単独を同濃度で用いた場合と比べても同等以上の優れた抗ウイルス作用を有しており、ガンシクロビルの問題点（細胞毒性、耐性）をも改善しうる新たな抗ウイルス剤として使用することが出来る。
【技術分野】
【０００１】
本発明はトリシンより高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有するトリシンアミノ酸誘導体及びそれを含む抗ウイルス剤及び抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラボノイドの１種であるトリシン（４’，５，７−トリヒドロキシ−３’，５’−ジメトキシフラボン）（ｔｒｉｃｉｎ（４’，５，７−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−３’，５’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ））は、イネ科の植物に含まれ、抗酸化作用、抗癌作用、抗ウイルス作用などさまざまな生理活性を有することが確認されており、近年非常に注目されている。
例えば、非特許文献１等には、コムギの葉や穀類のヒエの子実等から単離されたトリシンが抗酸化作用を有する物質であることが報告されている。
また、米ぬか由来のトリシンが、シクロオキシゲナーゼを阻害し、小腸の発ガンを抑制すること（非特許文献２）、ヒト由来の大腸癌及び乳癌細胞に対しインビトロにおいて抗癌作用を示すこと（非特許文献３）、マウスのＰ３８８白血病モデルにおいて抗癌作用を示すこと（非特許文献４）等が報告されている。
さらに、クマザサのエキスに含まれるトリシンが抗ウイルス作用を示すことが報告されている（特許文献１）。
【０００３】
インビトロの検討において多くの有用な生理活性が確認され、その臨床応用が期待される一方で、トリシンは非常に疎水性が高く、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する必要があることから、インビボにおける検討、ひいては臨床試験における患者への投与のための薬剤調製において、その使用に制限があることが予測される。
【０００４】
またインビトロの検討においてトリシンの細胞浸透性は低く、このためインビボにおける組織移行性、生物学的利用能が低いことが予測される。また抗ウイルス剤として有効に作用させるためには薬剤の宿主細胞内への浸透性が要求される。したがって、高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有するプロドラッグの開発が期待されている。
【０００５】
一般にフラボノイド類が経口投与された際の薬物動態については明らかでない点も多い。フラボノイドは植物中では、各種の糖が結合した配糖体として存在している。この配糖体は消化管内で腸内細菌により加水分解され、糖が取れたアグリコンが大腸で吸収されるという説が本来主流であった。しかしヒト小腸モデルであるＣａｃｏ−２細胞を用い、フラボノイドの一種であるクエルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）について検討を行った結果、アグリコンはグルコース配糖体に比べ１０倍以上吸収されやすいことが示され、細胞浸透性が高いフラボノイド誘導体が小腸においてより効率よく吸収される可能性が示唆されている（非特許文献５）。
また、クエルセチンのアミノ酸誘導体がインビトロにおいて高い水溶性、細胞浸透性を示すことが報告されている（非特許文献６）
【０００６】
本発明者は、アミノ酸が親水性基であるカルボキシル基を有すること、アミノ酸誘導体は小腸において能動的に吸収されること、また吸収された後、血中においてエステラーゼでアミノ酸が切断されても加水分解されたアミノ酸自身は無害であることに着目し、トリシンの高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有するプロドラッグとして、新規化合物であるトリシンのアミノ酸誘導体を開発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ／２００８／１２３１０２
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】J. Agric. Food Chem. 47: 4500-4505 (1999)
【非特許文献２】Molecular Cancer Therapeutics, 4: 1287-1292 (2005)．
【非特許文献３】Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,9:1163-70 (2000)．
【非特許文献４】J Nat Prod. 44: 530-5(1981)．
【非特許文献５】化学と生物 39: 213(2001)．
【非特許文献６】Bioorg. Med. Lett. 17: 1164-1171(2009).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、トリシンアミノ酸誘導体を提供することである。
本発明の他の目的は、高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有するトリシンアミノ酸誘導体を提供することである。
本発明の他の目的は、トリシンアミノ酸誘導体を含む抗ウイルス剤及び抗癌剤を提供することである。
本発明の他の目的は、トリシン又はトリシンアミノ酸誘導体を含む子宮頚癌治療用の抗癌剤を提供することである。
本発明の他の目的は、トリシン又はトリシンアミノ酸誘導体と、ガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンから選択される少なくとも一種とを含む、抗ウイルス剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成すべく、本発明は以下の構成を採用した。
（１）
式１：
で表される化合物（式中、Ａは任意のアミノ酸残基であり、Ｂは任意のアミノ酸残基であり、ＡとＢは同じ又は異なっても良く、ｎ＝０〜４である。）。
（２）Ａが任意のアミノ酸残基であり、ｎ＝０又は１である上記（１）記載の化合物。
（３）Ａがグリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸の残基である上記（１）又は（２）記載の化合物。
（４）Ａがアラニン残基であり、Ｂが任意のアミノ酸残基である上記（１）記載の化合物。
（５）Ａがアラニン残基であり、Ｂがアスパラギン酸又はグルタミン酸残基である上記（１）記載の化合物。
（６）４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｎ−ＯＨ）−トリシン、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン及び４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシンからなる群から選択される上記（１）記載の化合物。
（７）上記（１）〜（６）のいずれか一に記載の化合物を含む抗ウイルス剤。
（８）対象のウイルスが、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスあるいはインフルエンザウイルスである、上記７記載の抗ウイルス剤。
（９）対象のウイルスが、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルス株、アマンタジン耐性インフルエンザウイルス株、ガンシクロビル耐性ヒトサイトメガロウイルスからなる群より選択されるウイルスである、上記（７）記載の抗ウイルス剤。
（１０）経口投与用である上記７〜９のいずれか一に記載の抗ウイルス剤。
（１１）上記（１）〜（６）のいずれか一に記載の化合物を含む抗癌剤。
（１２）対象の癌が大腸癌または子宮頸癌である、上記（１１）記載の抗癌剤。
（１３）経口投与用である、上記（１１）または（１２）記載の抗癌剤。
（１４）（Ａ）トリシン又はそのアミノ酸誘導体、及び（Ｂ）ガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンからなる群から選択される少なくとも一種の化合物、を有効成分として含むことを特徴とする、抗ウイルス剤。
（１５）前記（Ｂ）成分がガンシクロビルである、上記（１４）に記載の抗ウイルス剤。
（１６）前記ウイルスがヘルペスウイルスである、上記（１４）または（１５）に記載の抗ウイルス剤。
（１７）前記ウイルスがサイトメガロウイルスである、上記（１４）〜（１６）のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
（１８）前記ウイルスが、ヒトサイトメガロウイルスである上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
（１９）前記（Ａ）成分と（Ｂ）成分とのモル比が１００：１〜１０００：１（（Ａ）成分：（Ｂ）成分）の範囲内である、上記（１４）〜（１８）のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、トリシンよりも高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有するため、高い組織移行性、生物学的利用能を示す。また本発明のトリシンアミノ酸誘導体は経口投与によりトリシンの高い血中移行性を示すが、かなり高濃度で投与しても毒性が見られない。
以上のことより、トリシンの有する制癌作用、抗ウイルス作用に基づいて、関連する疾患の予防や治療に用いることができる。
また、本発明のトリシン又はトリシンアミノ酸誘導体並びにガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンからなる群から選択される少なくとも一種を含む抗ウイルス剤は、トリシンのみを有効成分とする抗ウイルス剤に比べて著しく高い抗ウイルス作用を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】トリシン及びトリシンアミノ酸誘導体の細胞浸透性試験の結果を示す。
【図２】雄性ラットにおけるトリシン誘導体の単回経口投与による血漿中トリシン濃度の推移を表す。
【図３】トリシン誘導体投与前の代表的なクロマトグラムを表す。Ａは動物番号１０１、Ｂ：動物番号３０１を表す。
【図４】トリシン誘導体投与後３０分の代表的なクロマトグラムを表す。Ａは動物番号１０１、Ｂ：動物番号３０１（５倍希釈サンプル使用）を表す。
【図５】トリシン誘導体投与後２時間の代表的なクロマトグラムを表す。Ａは動物番号１０１、Ｂ：動物番号３０１（２倍希釈サンプル使用）を表す。
【図６】トリシン誘導体投与後４時間の代表的なクロマトグラムを表す。Ａは動物番号１０１（３倍希釈サンプル使用）、Ｂ：動物番号３０１（３倍希釈サンプル使用）を表す。
【図７】トリシン誘導体投与後８時間の代表的なクロマトグラムを表す。Ａは動物番号１０１、Ｂ：動物番号３０１（３倍希釈サンプル使用）を表す。
【図８】ＴＩＧ−３細胞（胎児肺繊維芽細胞）（正常細胞、コントロール）の増殖に対する、トリシンの抑制効果を表す。
【図９】ＣＡ細胞の増殖に対する、トリシンの抑制効果を表す。
【図１０】ＣａＳｋｉ細胞の増殖に対する、トリシンの抑制効果を表す。
【図１１】ＨｅＬａ細胞の増殖に対する、トリシンの抑制効果を表す。
【図１２】ＳｉＨａ細胞の増殖に対する、トリシンの抑制効果を表す。
【図１３】ガンシクロビルの、コントロールに対するウイルス力価（％）を示す。
【図１４】トリシン及びガンシクロビルを用いた場合、並びにトリシンのみを用いた場合の、コントロールに対するウイルス力価（％）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜＜トリシンアミノ酸誘導体＞＞
本発明の第一の態様は、トリシンの４’位ＯＨにカルボキシル基を介して一または複数のアミノ酸が結合している点に特徴を有するトリシンアミノ酸誘導体である。
本発明の一般式中のＡまたはＢで表されるアミノ酸残基を与えるアミノ酸の例としては、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、バリン（Ｖａｌ）などの天然アミノ酸が挙げられる。
より好ましくは、アミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、セリン、フェニルアラニン、チロシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択される。
さらに好ましくは、アミノ酸はグリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択される。
また、上記アミノ酸はＬ体、Ｄ体のどちらであっても良いが、Ｌ体であることが好ましい。
【００１４】
本発明において「アミノ酸残基」とは
のように表されるアミノ酸から誘導される２価の基を意味する。
ここでＲはアミノ酸の側鎖であり、例えばアラニンの場合ＲはＣＨ3であり、アスパラギン酸の場合ＲはＣＨ2ＣＯＯＨとなる。
【００１５】
式１の
部分において、Ａとｎ個のＢはペプチド結合しており、これはより具体的には
と表される。Ｒ1及びＲ2はアミノ酸側鎖を表す。
【００１６】
−Ａ（Ｂ）ｎＯＨは、例えば、ｎ＝１の場合、
ｎ＝２の場合
と表される。
【００１７】
（合成方法）
本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、トリシンを原料として、上述したアミノ酸を様々な公知の手法で結合することにより製造することができる。
例えば、原料のアミノ酸のカルボキシル基を予めエステル化等により保護し、塩基存在下、ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート等の試薬を用いて、トリシンの４’位の−ＯＨ基と反応させてもよい。アミノ酸の保護基はその後適切に脱保護を行えばよい。
なお、２以上のアミノ酸が接合した誘導体を作成する場合には、アミノ酸を１つずつ順にトリシンに結合して製造しても良く、あるいは、あらかじめ複数のアミノ酸が結合したものを作成してからトリシンに結合しても良い。
【００１８】
（細胞浸透性）
ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来の細胞株）は単層に培養するとタイトジャンクションを形成し、塩や水を能動的に輸送する。受動拡散で吸収される薬物のＭＤＣＫ細胞膜透過性は、ヒトでの消化管吸収率との相関性が認められている。そこでトリシン誘導体のＭＤＣＫ細胞における細胞浸透性を検討した。
様々なトリシンアミノ酸誘導体について試験した結果、いずれもトリシンより高い細胞浸透性を示した。
【００１９】
（血中移行性）
トリシンアミノ酸誘導体のインビボにおける動態、特に経口投与した場合の血中移行性を検討するため、トリシン誘導体を経口で投与し、所定時間経過後採血して得られた血漿中のトリシン濃度を測定した。
トリシンを経口投与した場合には、トリシンの血中への移行は殆ど見られなかったが、トリシンアミノ酸誘導体を経口投与した試験では、最高で４４４８ｎｇ／ｍＬのトリシンが検出され、血中への移行性がトリシンに比べてはるかに高いことが見出された。
トリシンアミノ酸誘導体は体内に取り込まれた後、体内でアミノ酸部分が加水分解を受けてトリシンに変化し、血中に移行していると考えられる。
細胞浸透性、血中移行性の結果から、本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、トリシンに比べてより高い組織移行性及びより高い生物学的利用能を示すことが明らかである。
【００２０】
（毒性試験）
トリシンアミノ酸誘導体を経口投与した場合の血中へのトリシンの移行性が、トリシンを投与した場合に比べてはるかに高いことから、その安全性を確認するため毒性試験を行った。その結果、雄性マウスにトリシン誘導体を単回経口投与した場合、２０００ｍｇ／ｋｇという高用量群においても、異常知見は見られなかった。また雄性マウスにトリシン誘導体を１４日連続経口投与した場合の無影響量は３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙであり、トリシン誘導体はトリシンと同様安全な薬剤であることが示唆された。
【００２１】
（抗ウイルス剤）
トリシンは、ＷＯ／２００８／１２３１０２に記載されているとおり、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス及びインフルエンザウイルス等に対する抗ウイルス作用を示す。
一方、本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を示し、トリシンの高い血中濃度を示す。従って、本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、抗ウイルス剤として用いることができる。
本発明の抗ウイルス剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件により適宜選択できる。通常、トリシンアミノ酸誘導体を１〜２０００mg／kg／日程度、好ましくは５〜１０００mg／kg／日程度、さらに好ましくは１０〜６００mg／kg／日程度の範囲となる量を目安とするのがよい。これら本発明の抗ウイルス剤は１日に１回又は２〜４回程度に分けて投与することができる。
【００２２】
本発明において「ウイルス」とは、動物ウイルス、昆虫ウイルス、植物ウイルス、細菌ウイルス(バクテリオファージ)を含み、特にヒトを含む哺乳動物、鳥類等を含む動植物に対して好ましくない影響を及ぼすウイルスを意味する
本発明の抗ウイルス剤が特に有効なウイルスとしては、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルスが挙げられ、とりわけ、サイトメガロウイルス、特にヒトサイトメガロウイルス、サルサイトメガロウイルス、マウスサイトメガロウイルス等のサイトメガロウイルス；インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ等のヒトインフルエンザウイルスやトリインフルエンザウイルス等が挙げられる。
【００２３】
本発明の抗ウイルス剤は、ヒトはもとより、ヒト以外の哺乳類、鳥類、魚貝類、甲殻類、昆虫類、両棲類、爬虫類等用の抗ウイルス剤としても有効である。従って本発明の抗ウイルス剤は、これらの動物用の抗ウイルス剤（例えば、ペット用医薬、動物用飼料、ペットフード等）として使用することができる。さらに本発明の抗ウイルス剤は、動物以外に、各種植物に対する抗ウイルス剤としても有用であり、また、防腐剤としても有用である。
【００２４】
本発明の抗ウイルス剤は、各種のウイルス、特にヘルペスウイルス、とりわけ、サイトメガロウイルス、特にヒトサイトメガロウイルス；インフルエンザウイルス、特にヒトインフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣやトリインフルエンザウイルスに対して高い抗ウイルス活性を有する。
本発明の抗ウイルス剤は、細胞浸透性が高く、血中移行性も高く、更に細胞毒性が低いという優れた利点に加え、耐性ウイルスに対しても優れた抗ウイルス活性を有する。
【００２５】
（抗癌剤）
トリシンは、シクロオキシゲナーゼを阻害し、小腸の発ガンを抑制すること（Molecular Cancer Therapeutics, 4: 1287-1292 (2005)）、ヒト由来の大腸癌及び乳癌細胞に対しインビトロにおいて抗癌作用を示すこと（Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,9:1163-70 (2000)）、マウスのＰ３８８白血病モデルにおいて抗癌作用を示すこと（J Nat Prod. 44: 530-5(1981)）等が報告されている。また、トリシンは、アゾキシメタン及び硫酸デキストラン誘導性の結腸癌に有効であること報告されている（Cancer Prev Res., 2(12), 1031-1038(2009)）。
また、実施例において示したとおり、トリシンは子宮頚癌細胞株の増殖を抑制することから、子宮頚癌治療用抗癌剤である。
本発明のトリシンアミノ酸誘導体は、高い細胞浸透性、水溶性及び血中移行性を有し、体内でトリシンに変換されることから、抗癌剤として用いることができる。
【００２６】
本発明の抗癌剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件により適宜選択できる。通常、トリシンアミノ酸誘導体を１〜２０００mg／kg／日程度、好ましくは５〜１０００mg／kg／日程度、さらに好ましくは１０〜６００mg／kg／日程度の範囲となる量を目安とするのがよい。これら本発明の抗癌剤は１日に１回又は２〜４回程度に分けて投与することができる。
【００２７】
本発明の抗癌剤を投与することにより治療ないしその症状を軽減できる癌としては、特に制限はなく、例えば、大腸癌、小腸癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、結腸癌、直腸癌、頭頚部癌、肺癌、乳癌、子宮頚癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸腫瘍、骨・軟部肉腫、皮膚癌、悪性リンパ腫、急性白血病、脳腫瘍、等が挙げられる。
【００２８】
本発明の抗ウイルス剤及び抗癌剤は、ヒトはもとより、ヒト以外の哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類等用の抗癌剤としても有効である。従って本発明の抗癌剤は、これらの動物用の抗癌剤（例えば、ペット用医薬、ペットフード等）として使用することができる。
【００２９】
本発明の抗ウイルス剤または抗癌剤の剤型は、治療目的に応じて適宜選択できる。具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、軟膏等が例示できる。ここで用いられる製剤担体としては、通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等の希釈剤ないし賦形剤等を例示できる。
【００３０】
経口投与形態としては錠剤、丸剤、粉剤、液剤、チューインガム、飴、チョコレート、パン、クッキー、煎餅、ビスケット、そば、うどん、各種ドリンク剤、ゼリー、みそ汁、スープ、ポタージュ等の食品形態が、非経口投与形態としては、注射剤、局所投与剤（クリーム、軟膏等）、座薬等が挙げられる。局所投与剤の剤型の例としては、本発明の抗癌剤を、天然繊維又は合成繊維製のガーゼ等の担体に含浸させたもの、口紅等の化粧品に含有させたもの等が挙げられる。
【００３１】
錠剤の形態に成形するに際しては、担体として例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸等の賦形剤、水、エタノール、単シロツプ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、セラツク、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドン等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤、白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤、第４級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤、グリセリン、デンプン等の保湿剤、デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤、精製タルク、ステアリン酸塩等の滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。
【００３２】
丸剤の形態に成形するに際しては、担体として例えば、ブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤、アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン等の結合剤、ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
カプセル剤は本発明の有効成分であるトリシンアミノ酸誘導体を上記で例示した各種の担体と混合し、硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセル等に充填して調製される。
【００３３】
本発明の抗ウイルス剤、抗癌剤中に含まれるトリシンアミノ酸誘導体の量は特に限定されず、適宜選択すればよいが、例えば、０．５〜５０質量％、好ましくは１〜８質量％程度とするのがよい。
【００３４】
本発明の抗ウイルス剤、抗癌剤は経口投与、非経口投与いずれでもよく、投与方法は、各製剤形態、患者の年齢、性別、患者の症状の程度、その他の条件に応じて決定される。例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、液剤は注射剤として非経口投与され、軟膏等は局所投与される。
【００３５】
本発明の種々の剤型の製造には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を配合してもよい。また、通常の医薬組成物、化粧品、皮膚用組成物等に使用される油性成分等の基材成分、保湿剤、防腐剤、安定化剤、創傷治癒剤、界面活性剤等を使用することができる。抗癌剤に水を使用する場合、水道水、天然水、精製水等、特に限定されないが、一般にイオン交換水等の高純度の水が好ましい。
【００３６】
油性成分としては、スクワラン、牛脂、豚脂、馬油、ラノリン、蜜蝋等の動物性油、ユーカリ油、オリーブ油、グレープシード油、パーム油、ホホバ油、胚芽油（例えば、米胚芽油）等の植物性油、流動パラフィン、高級脂肪酸エステル（例えば、パルミチン酸オクチル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル）、シリコーン油等の合成油、半合成油が挙げられる。ユーカリ油は刺激緩和効果があり好ましい。
【００３７】
油性成分は、皮膚の保護、エモリエント性付与効果（皮膚表面を薄膜で覆い、乾燥を防ぐと共に、柔軟性、弾力性を与える効果）、さっぱり感等の要求性能に合わせて適宜組み合わせて用いられる。スクワラン、オリーブ油及びミリスチン酸オクチルドデシルの組合せは好ましい例の一つである。
【００３８】
各剤形の硬さ、流動性を調節するために、ステアリン酸、ステアリルアルコール、ベヘニン酸、セタノール、ワセリン等の固体油が用いられ、好ましくはステアリン酸とセタノールが組み合わせて用いられる。
【００３９】
＜＜抗ウイルス剤（併用剤）＞＞
本発明の第二の態様は、（Ａ）トリシン又はそのアミノ酸誘導体、並びに（Ｂ）ガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンから選択される少なくとも一種を併用して用いることを特徴とする抗ウイルス剤（以下、抗ウイルス剤（併用剤）ということがある。）である。
【００４０】
本発明において「ウイルス」とは、動物ウイルス、昆虫ウイルス、植物ウイルス、細菌ウイルス(バクテリオファージ)を含み、特にヒトを含む哺乳動物、鳥類等を含む動植物に対して好ましくない影響を及ぼすウイルスを意味する。
【００４１】
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）は、ヒトはもとより、ヒト以外の哺乳類、鳥類、魚貝類、甲殻類、昆虫類、両棲類、爬虫類等用の抗ウイルス剤としても有効である。従って本発明の抗ウイルス剤は、これらの動物用の抗ウイルス剤（例えば、ペット用医薬、動物用飼料、ペットフード等）として使用することができる。さらに本発明の抗ウイルス剤は、動物以外に、各種植物に対する抗ウイルス剤としても有用であり、また、防腐剤としても有用である。
【００４２】
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）が特に有効なウイルスとしては、ヘルペスウイルスが挙げられ、特にヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、サルサイトメガロウイルス、マウスサイトメガロウイルス等のサイトメガロウイルスが挙げられる。これらの中でも、特にヒトサイトメガロウイルスに対して本発明の抗ウイルス剤は有効に作用する。
【００４３】
＜（Ａ）成分＞
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）における有効成分は４’，５，７−トリヒドロキシ−３’，５’−ジメトキシフラボン（トリシン）又はそのアミノ酸誘導体である。トリシンは隈笹から抽出されるが、合成品や他の源から採取されたものでも良いことはいうまでもない。例えば、隈笹以外の植物、特に、イネ科に属する多くの植物、例えば、イネ（米）、コムギ（小麦）、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ、タケ、ススキ、パンパスグラス、アシ（葦、ヨシともいう）等のカヤ類の葉や茎類にも４’，５，７−トリヒドロキシ−３’，５’−ジメトキシフラボン（トリシン）が多量に含まれており抽出することができる。具体的な植物名は以下のとおりである。
イネ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、アワ、ヒエ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ、タケ、マコモ、サトウキビ、ハトムギ、ヨシ、ススキ、ササ、ダンチク、シロガネヨシ、シバ。
【００４４】
上記植物の葉、茎等を適切な溶媒を使用して抽出し、ＨＰＬＣ等の分離精製手段を用いてトリシンを分離精製できる。例えば、水抽出物を濃縮し、固形物をアルコール、含水アルコール（例えば、メタノール、エタノール、含水メタノール、含水エタノール）抽出し、固形分を水に溶解し、酢酸エチルとの分配等により精製できる。
【００４５】
トリシンのアミノ酸誘導体としては、上記第一の態様で記載した一般式１で表されるトリシンアミノ酸誘導体である。
【００４６】
＜（Ｂ）成分＞
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）は、有効成分として、前記（Ａ）成分と共に、ガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンから選択される少なくとも一種を含む。これらの中でも、ガンシクロビルが特に好ましい。
【００４７】
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）は、（Ａ）成分と（Ｂ）成分とを組み合わせることにより、トリシンを有効成分として用いる従来の抗ウイルス剤よりも著しく優れた抗ウイルス作用を発揮することが出来る。
また、主にガンシクロビルのみを有効成分とする従来の抗ウイルス剤では、ガンシクロビルを多量に使用することになるが、これは耐性ウイルスの出現や副作用（強い細胞毒性）といった問題につながる。一方、本発明の抗ウイルス剤（併用剤）ではトリシンを併用するため細胞毒性が弱く、耐性株の問題も生じにくい。さらにはガンシクロビルと比較しても同等以上の優れた抗ウイルス活性を有する。
【００４８】
（Ａ）成分と（Ｂ）成分との含有比（モル比）は本発明の効果を奏する限り特に制限されるものではないが、１：１〜１０００：１（（Ａ）成分：（Ｂ）成分）、更に好ましくは１０：１〜１０００：１、より好ましくは１００：１〜１０００：１である。含有比が上記範囲内であると、（Ａ）成分と（Ｂ）成分とが相乗効果を発揮し、それぞれの成分が有する高ウイルス作用から予想されるよりもはるかに優れた抗ウイルス作用を発揮することが出来る。
本発明の抗ウイルス剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件により適宜選択できる。例えば、静脈注射の場合には１日当たり、（Ｂ）成分の投与量が約０．１〜１０ｍｇ程度となるように投与すればよく、経口投与の場合には１日当たり（Ｂ）成分が０．１〜５０ｍｇ程度となるように投与すればよい。また、必要に応じて１日に１回又は２〜６回程度に分けて投与することが出来る。また、（Ａ）成分と（Ｂ）成分は、それぞれを同時あるいは連続的に投与してもよい。
ガンシクロビルを含む従来の抗ウイルス剤では、例えば、成人に対し、静脈注射では１日当たり約１０〜１０００ｍｇ、経口投与では１日当たり約１０〜５０００ｍｇ程度の量のガンシクロビルを投与していた。本発明は、トリシンと併用することにより（Ｂ）成分の量を従来のガンシクロビル投与量の約１００〜１０００分の１に抑えることができ、細胞毒性の問題が生じにくく安全性に優れる。
【００４９】
（Ａ）成分及び（Ｂ）成分を有効成分とする本発明の抗ウイルス剤（併用剤）は、種々の形態で使用できる。例えば、粘膜保護組成物、ウイルス感染予防及び／又は治療用組成物、防腐剤、濾過装置等の抗ウイルス剤として好適である。
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）の剤型は、液体状、固体状、気体状、ジェル状、ゲル状、エアゾール、いずれでも良い。本発明の抗ウイルス剤は、経口、非経口投与いずれの投与形態で投与してもよい。
経口投与形態としてはカプセル剤、ドライシロップ、錠剤、丸剤、粉剤、液剤等が挙げられる。
また、チューインガム、飴、各種ドリンク剤等の食品や、飲料水、調味料等の形態であってもよい。
非経口投与形態としては、例えば、点鼻用の液剤及びゲル剤、口腔スプレーなどのエアロゾルなどの鼻腔や咽頭に直接適用する点鼻適用製剤、軟膏剤、乳剤及びクリーム剤などの経皮吸収用製剤、注射剤、座薬、膣内投与形態（タンポン等）等が挙げられる。本発明の抗ウイルス剤を、天然繊維又は合成繊維製のガーゼ等の担体に含浸させたもの、口紅等の化粧品や他の形態の化粧品（ローション、オイル、石けん、化粧水、化粧クリーム等）や浴用剤に含有させたもの、美容液、シャンプー、ボディーソープ、洗顔フォーム等の半固体又は液体の形態としたものとしてもよい。点眼剤、うがい剤等の形態としてもよい。創傷部位治療用噴霧剤、咽頭部炎症治療用噴霧剤等の形態も挙げられる。
【００５０】
本発明の種々の剤型の抗ウイルス剤（併用剤）の製造には、所定量の上記（Ａ）成分及び（Ｂ）成分のほか、通常の医薬組成物、化粧品、皮膚用組成物等に使用される油性成分等の基材成分、保湿剤、防腐剤等を使用することができる。
【００５１】
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）は、（Ａ）成分、（Ｂ）成分以外の他の抗ウイルス剤と併用してもよい。
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）には、さらに必要に応じて安定化剤、保湿剤、創傷治癒剤、防腐剤、界面活性剤等を含有させることができる。
【実施例】
【００５２】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
＜＜トリシンアミノ酸誘導体＞＞
［実施例１］
（化合物２：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００５３】
窒素雰囲気下、グリシンｔ−ブチルエステル塩酸塩（５５．３ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１）（９２ｍｇ， ６３％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１）（４０．０ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯＨ）−トリシン（化合物２）（３３ｍｇ， ９４％）を黄色粉末として得た。
【００５４】
［実施例２］
（化合物４：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００５５】
窒素雰囲気下、アラニンｔ−ブチルエステル塩酸塩（５９．９ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物３）（８４ｍｇ， ５５％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物３）（４１．１ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン（化合物４）（３０ｍｇ， ８１％）を黄色粉末として得た。
【００５６】
［実施例３］
（化合物６：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００５７】
窒素雰囲気下、バリンｔ−ブチルエステル塩酸塩（６９．２ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物５）（９４ｍｇ， ５２％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物５）（４４．６ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯＨ）−トリシン（化合物６）（３５ｍｇ， ９０％）を黄色粉末として得た。
【００５８】
［実施例４］
（化合物８：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００５９】
窒素雰囲気下、フェニルアラニンｔ−ブチルエステル塩酸塩（８５．１ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物７）（１１６ｍｇ， ６１％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物７）（４７．４ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯＨ）−トリシン（化合物８）（４８ｍｇ， ８０％）を黄色粉末として得た。
【００６０】
［実施例５］
（化合物１０：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００６１】
窒素雰囲気下、アスパラギン酸ｔ−ブチルエステル塩酸塩（９３．０ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物９）（１０６ｍｇ， ５３％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物９）（４９．３ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン（化合物１０）（３６ｍｇ， ９０％）を黄色粉末として得た。
【００６２】
［実施例６］
（化合物１２：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００６３】
窒素雰囲気下、グルタミン酸ｔ−ブチルエステル塩酸塩（９７．６ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１００．４ｍｇ， ０．３３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。その後、この反応溶液にトリシン（１００．０ｍｇ， ０．３０ｍｍｏｌ）、再びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１１５．０μｌ， ０．６６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム／メタノール＝５０／１）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１１）（１２４ｍｇ， ６１％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１１）（５０．５ｍｇ， ０．０８２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン（化合物１２）（３４ｍｇ， ８３％）を黄色粉末として得た。
【００６４】
［実施例７］
（化合物１４：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００６５】
窒素雰囲気下、０℃に冷却しながらアスパラギン酸ｔ−ブチルエステル塩酸塩（８７．４ｍｇ， ０．３１ｍｍｏｌ）、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン（化合物４）（１４０ｍｇ， ０．３１ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶かし、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（９４．９ｍｇ， ０．６２ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（６５．４ｍｇ， ０．３４ｍｍｏｌ）を加え、３日間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝ １０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１３）（６８ｍｇ， ３２％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１３）（５５．０ｍｇ， ０．０９５ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン（化合物１４）（４２ｍｇ， ９１％）を黄色粉末として得た。
【００６６】
［実施例８］
（化合物１６：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシンの合成）
【００６７】
窒素雰囲気下、０℃に冷却しながらグルタミン酸ｔ−ブチルエステル塩酸塩（９１．７ｍｇ， ０．３１ｍｍｏｌ）、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン（化合物４）（１４０ｍｇ， ０．３１ｍｍｏｌ）、をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶かし、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（９４．９ｍｇ， ０．６２ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（６５．４ｍｇ， ０．３４ｍｍｏｌ）を加え、３日間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝１０／１）で確認後、溶媒留去した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）にて単離精製し、４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１５）（７３ｍｇ， ３３％）を黄色粉末として得た。
窒素雰囲気下、この４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン（化合物１５）（５５．０ｍｇ， ０．０７８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５ｍｌ）に溶かし、氷浴で冷却しながらトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）を加え、室温で４時間攪拌した。反応終了をＴＬＣ（クロロホルム／メタノール＝５／１）で確認後、溶媒留去した。これにジクロロメタン（５ｍｌ）を加え、吸引濾過して４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン（化合物１６）（４４ｍｇ， ９６％）を黄色粉末として得た。
【００６８】
実施例１〜８における出発化合物、中間体及び生成物の物理化学的性質を以下に示す。
ＮＭＲ ｄａｔａ
（トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.39 (s, 2H), 6.74 (s, 1H), 6.56 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.26 (d, J=2.0 Hz, 1H), 3.97 (s, 6H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 183.1, 165.1, 164.9, 163.3, 158.8, 149.1 (2C), 140.9, 122.3, 105.4 (2C), 105.2, 104.7, 99.7, 94.9, 56.9 (2C).
MS (FAB) : m/z = 331 [M+H]+
【００６９】
（化合物１：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.37 (s, 2H), 7.00 (br t, J=6.0 Hz, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.54 (d, J=1.8 Hz, 1H), 6.24 (d, J=1.8 Hz, 1H), 3.97 (s, 6H), 3.84 (d, J=6.0 Hz, 2H), 1.46 (s, 9H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 168.8, 164.2, 163.4, 162.5, 158.0, 153.9, 153.7 (2C), 132.4, 129.0, 105.5, 104.7, 103.6 (2C), 99.0, 94.2, 80.9, 56.1 (2C), 43.5, 28.8 (3C).
MS (FAB) : m/z = 488 [M+H]+
【００７０】
（化合物２：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.86 (br s, 1H), 8.05 (t, J=6.0 Hz, 1H), 7.34 (s, 2H), 7.09 (s, 1H), 6.56 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.20 (d, J=1.9 Hz, 1H), 3.85 (s, 6H), 3.72 (d, J=6.0 Hz, 2H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.5, 171.7, 164.9, 163.3, 161.9, 158.0, 154.1, 153.5 (2C), 132.1, 128.9, 106.1, 104.5, 104.2 (2C), 99.5, 94.9, 56.9 (2C), 42.9.
MS (FAB) : m/z = 432 [M+H]+
【００７１】
（化合物３：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.36 (s, 2H), 7.00 (br d, J=9.2 Hz, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.53 (d, J=2.3 Hz, 1H), 6.23 (d, J=2.3 Hz, 1H), 4.14 (quin, J=7.3 Hz, 1H), 3.92 (s, 6H), 1.46 (s, 9H), 1.41 (d, J=7.3 Hz, 3H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 183.2, 172.5, 165.0, 164.3, 163.3, 158.8, 154.5 (2C), 153.9, 133.3, 129.8, 106.4, 105.5, 104.5 (2C), 99.8, 95.0, 81.6, 56.9 (2C), 51.6, 28.1 (3C), 18.0.
MS (FAB): m/z = 502 [M+H]+
【００７２】
（化合物４：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.86 (br s, 1H), 8.11 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.33 (s, 2H), 7.08 (s, 1H), 6.56 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.20 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.03 (quin, J=7.3 Hz, 1H), 3.84 (s, 6H), 1.29 (d, J=7.3 Hz, 3H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.5, 174.5, 164.9, 163.3, 161.9, 158.0, 153.5 (3C), 132.2, 128.8, 106.1, 104.5, 104.2 (2C), 99.5, 94.9, 57.0 (2C), 50.0, 17.8.
MS (FAB) : m/z = 446 [M+H]+
【００７３】
（化合物５： ４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.36 (s, 2H), 6.87-6.83 (m, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.53 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.23 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.10-4.04 (m, 1H), 3.92 (s, 6H), 2.26-2.14 (m, 1H), 1.48 (s, 9H), 1.04-1.00 (m, 6H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 170.6, 164.2, 163.4, 162.5, 158.0, 153.6 (3C), 132.5, 128.9, 105.5, 104.7, 103.7 (2C), 99.0, 94.2, 81.0, 60.5, 56.0 (2C), 31.1, 27.4 (3C), 18.6, 17.3.
【００７４】
（化合物６：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.91 (br s, 1H), 8.06 (d, J=9.2 Hz, 1H), 7.38 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 6.59 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.23 (d, J=1.9 Hz, 1H), 3.95-3.88 (m, 1H), 3.88 (s, 6H), 2.15-2.08 (m, 1H), 0.96 (d, J=3.8 Hz, 3H), 0.94 (d, J=3.8 Hz, 3H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.0, 172.9, 164.4, 162.9, 161.4, 157.5, 153.7, 153.0 (2C), 131.8, 128.3, 105.6, 104.0, 103.7 (2C), 99.0, 94.4, 59.8, 56.4 (2C), 30.0, 19.1, 18.0.
【００７５】
（化合物７：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.36 (s, 2H), 7.36-7.30 (m, 4H), 7.28-7.23 (m, 1H), 6.92-6.88 (m, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.55 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.24 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.40-4.34 (m, 1H), 3.90 (s, 6H), 3.19 (dd, J=13.7, 6.0 Hz, 1H), 3.08 (dd, J=13.7, 6.0 Hz, 1H), 1.42 (s, 9H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 183.2, 171.2, 165.8, 164.4, 163.4, 158.9, 154.5 (2C), 153.8, 138.1, 133.2, 130.4 (2C), 129.2 (2C), 127.5, 126.9, 106.4, 104.5 (3C), 99.9, 95.0, 82.0, 57.2, 56.9 (2C), 38.3, 28.1 (3C).
MS (FAB) : m/z = 578 [M+H]+
【００７６】
（化合物８：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.86 (br s, 1H), 8.15 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.30 (s, 2H), 7.29-7.20 (m, 5H), 7.07 (s, 1H), 6.55 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.19 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.20-4.13 (m, 1H), 3.78 (s, 6H), 3.08 (dd, J=13.7, 4.6 Hz, 1H), 2.87 (dd, J=13.7, 4.6 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.5, 173.5, 164.9, 163.3, 161.9, 158.0, 153.7, 153.4 (2C), 138.2, 132.2, 129.7 (2C), 128.8 (3C), 127.0, 106.1, 104.5, 104.2 (2C), 99.5, 94.9, 56.9 (2C), 56.2, 37.0.
【００７７】
（化合物９：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.37 (s, 2H), 6.98-6.93 (m, 1H), 6.81 (s, 1H), 6.54 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.24 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.49-4.44 (m, 1H), 3.93 (s, 6H), 2.83 (dd, J=16.0, 6.0 Hz, 1H), 2.75 (dd, J=16.0, 6.0 Hz, 1H), 1.47 (s, 9H), 1.46 (s, 9H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 169.6, 169.5, 164.2, 163.5, 163.4, 162.5, 158.0, 153.7 (2C), 132.4, 129.1, 105.6, 104.7, 103.7 (2C), 99.0, 94.2, 81.4, 80.7, 56.1 (2C), 51.9, 37.5, 27.4 (3C), 27.3 (3C).
【００７８】
（化合物１０：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.90 (br s, 1H), 8.15 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.37 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 6.59 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.23 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.35 (q, J=7.8 Hz, 1H), 3.88 (s, 6H), 2.77 (dd, J=16.5, 6.7 Hz, 1H), 2.63 (dd, J=16.5, 6.7 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.0, 172.3, 171.6, 164.4, 162.8, 161.4, 157.5, 153.0, 152.9 (2C), 131.7, 128.3, 105.6, 104.0, 103.8 (2C), 99.0, 94.4, 56.4 (2C), 55.8, 29.6.
【００７９】
（化合物１１：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.36 (s, 2H), 7.01-6.97 (m, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.53 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.23 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.24-4.18 (m, 1H), 3.93 (s, 6H), 2.45-2.41 (m, 2H), 2.20-2.11 (m, 1H), 1.98-1.89 (m, 1H), 1.47 (s, 1H), 1.44 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 171.6, 170.8, 164.2, 163.5, 163.4, 162.5, 158.0, 153.6 (2C), 153.4, 132.5, 129.0, 105.5, 104.7, 103.7 (2C), 99.0, 94.2, 81.1, 79.8, 56.１ (2C), 54.4, 31.1, 27.5 (3C), 27.3 (3C).
【００８０】
（化合物１２：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.93 (br s, 1H), 8.15 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.38 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 6.60 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.24 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.09-4.02 (m, 1H), 3.89 (s, 6H), 2.40-2.35 (m, 1H), 2.09-2.00 (m, 1H), 1.88-1.78 (m, 1H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.5, 174.3, 173.6, 164.9, 163.3, 161.9, 158.0, 153.9, 153.4 (2C), 132.3, 128.8, 106.1, 104.5, 104.2 (2C), 94.9 (2C), 56.9 (2C), 53.7, 30.4, 26.9.
【００８１】
（化合物１３：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.51 (br d, J=8.2 Hz, 1H), 7.34 (s, 2H), 7.00 (br d, J=7.3 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.53 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.23 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.68-4.63 (m, 1H), 4.30 (quin, J=6.8 Hz, 1H), 3.91 (s, 6H), 2.74 (d, J=5.5 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.43 (d, J=6.8 Hz, 3H), 1.40 (s, 9H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 171.9, 169.6 (3C), 164.3, 163.4, 162.5, 158.0, 153.6 (2C), 131.9, 129.0, 105.5, 104.7, 103.5 (2C), 99.0, 94.3, 81.3, 80.6, 56.0 (2C), 50.8, 49.5, 37.3, 27.4 (3C), 27.3 (3C), 18.1.
【００８２】
（化合物１４：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.91 (br s, 1H), 8.15 (d, J=8.2 Hz, 1H), 7.99 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.37 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 6.59 (d, J=2.0 Hz, 1H), 6.23 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.56 (q, J=7.8 Hz, 1H), 4.13 (quin, J=7.8 Hz, 1H), 3.88 (s, 6H), 2.69 (dd, J=16.5, 6.0 Hz, 1H), 2.62 (dd, J=16.5, 6.0 Hz, 1H), 1.29 (d, J=6.8Hz, 3H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.0, 172.3, 172.0, 171.6, 164.4, 162.8, 161.4, 157.5, 153.0 (2C), 152.7, 131.7, 128.3, 105.6, 104.0, 103.7 (2C), 99.0, 94.4, 56.4 (2C), 50.1, 48.5, 36.0, 18.4.
【００８３】
（化合物１５：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; アセトン-d6) : δ 7.46 (br d, J=7.8 Hz, 1H), 7.34 (s, 2H), 6.97 (br d, J=7.8 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.53 (d, J=1.9 Hz, 1H), 6.24 (d, J=1.9 Hz, 1H), 4.42-4.36 (m, 1H), 4.29 (quin, J=7.3 Hz, 1H), 3.90 (s, 6H), 2.34-2.30 (m, 2H), 2.14-2.05 (m, 1H), 1.92-1.82 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.43 (d, J=7.3 Hz, 3H), 1.38 (s, 9H).
13C NMR (100 MHz ; アセトン-d6) : δ 182.3, 172.1, 171.5, 170.7, 164.3, 163.4, 162.5, 158.0, 153.6 (2C), 153.1, 132.0, 128.9, 105.4, 104.7, 103.5 (2C), 99.0, 94.3, 81.2, 79.7, 56.0 (2C), 52.3, 50.7, 31.2, 27.4 (3C), 27.3 (3C), 27.2, 18.0.
【００８４】
（化合物１６：４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン）
1H NMR (400 MHz ; DMSO-d6) : δ 10.90 (br s, 1H), 8.09 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.98 (d, J=7.8 Hz, 1H), 7.37 (s, 2H), 7.12 (s, 1H), 6.59 (d, J=2.0 Hz, 1H), 4.28-4.22 (m, 1H), 4.12 (quin, J=7.3 Hz, 1H), 3.89 (s, 6H), 2.31-2.23 (m, 2H), 2.03-1.94 (m, 1H), 1.83-1.74 (m, 1H), 1.27 (d, J=7.3 Hz, 1H).
13C NMR (100 MHz ; DMSO-d6) : δ 182.0, 173.7, 173.1, 172.2, 164.4, 162.8, 161.4, 157.5, 153.0 (2C), 152.7, 131.7, 128.3, 105.5, 104.0, 103.7 (2C), 99.0, 94.4, 56.4 (3C), 51.1, 29.9, 26.4, 18.2.
【００８５】
［実施例９］
（細胞浸透性試験）
ＭＤＣＫ細胞の培養液にはＥ−ＭＥＭ ８９％、非働化子ウシ血清１０％、ペニスト（抗生物質）１％を混合して用いた。
１２穴細胞浸透用プレートチャンバーの上層に２．７×１０5／ｃｍ2（３００μｌ）でＭＤＣＫ細胞をまき、下層には培養液を５００μｌ加えた。１日３７℃、ＣＯ2５％で培養し、その後、上層の培養液を除去し、新しい培養液を加えた。再び、１日培養後、上下層の培養液を除去した。下層に培養液を５００μｌ加え、上層には試験物質３０μＭ（溶媒：ＰＢＳ）を３００μｌ加えた。１時間培養後、上下層を１５０ μｌ採取し、ＵＶ（３５５ｎｍ）吸収を測定した。検量線にて試験物質の細胞浸透率を算出した。細胞浸透性試験の結果として、トリシンの細胞浸透率を１とした場合の相対的細胞浸透率を図１に示す。
細胞の層の状態はルシファーイエローが透過しないことで確認した。
この結果、トリシンのアミノ酸誘導体はいずれもトリシンより高い細胞浸透性を示し、より高い組織移行性及びより高い生物学的利用能を示す可能性が示唆された。
【００８６】
［参考例１］
（ラットにおけるトリシンの１４日連続経口投与後の血漿中トリシン濃度）
方法
１群につき各３匹の雄性及び雌性Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系ラット（日本チャールズ・リバー株式会社）を準備し、各群にそれぞれトリシン１００、３００、１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを１４日間反復経口投与し、投与１４日目の投与前、投与後０．５、２及び４時間後に採血して得られた血漿中のトリシン濃度を測定した。
・分析法
ラット血漿中のトリシン濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−ＵＶ法により測定した。血漿からのトリシンの抽出及びＨＰＬＣの測定条件はHong Caiらの方法（Hong Cai et al. Biomed. Chromatogr. 17, 435-439 (2003)、 Hong Cai, et al. Biomed. Chromatogr. 19, 518-522 (2005)）に準じて設定し、抽出方法を一部改変して血漿中トリシン濃度を測定した。
【００８７】
・採血
投与１４日の投与前、投与後３０分、投与後２及び４時間にヘパリン加処理血液を勁静脈より採取し、４℃下６０００回転／分で１０分間遠心した。得られた血漿はラットＴＫ血漿として採血当日より使用日まで−２５℃設定の冷凍庫に保存した。
・抽出方法
ラットＴＫ血漿５０μＬに内部標準溶液（ケルセチン・２水和物ＤＭＳＯ溶液、血漿中濃度８００ｎｇ／ｍＬ）１０μＬを添加して攪拌後、抽出溶媒（０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸／アセトン溶液）４０μＬを添加し、攪拌した。微量高速冷却遠心機で１５０００回転／分で１０分間遠心分離した後、蒸留水２５μＬを添加して攪拌後、微量高速冷却遠心機で遠心分離し、得られた上清をＨＰＬＣに注入した。
また、ラットプール血漿（無処置の雌雄Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系由来）５０μＬに検量線用標準溶液（血漿中トリシン濃度：５０、１００、２００、５００、１０００、２０００ ｎｇ／ｍＬ）１０μＬを添加し、添加後はラットＴＫ血漿と同様の操作を行ったものを検量線として使用した。
・ＨＰＬＣ条件
ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ （６．０ｍｍ×１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）カラムに、抽出後の上清４０μＬを注入し、カラム温度４０℃、波長３５５ｎｍ、流速１．４ｍＬ／ｍｉｎ、移動相は酢酸アンモニウム・酢酸（０．１ｍｏｌ／Ｌ、ＰＨ５．１）：メタノール＝２：３、分析時間１０分の条件で測定した。
【００８８】
結果
ラットＴＫ血漿中のトリシン濃度の測定結果を表１及び２に示す。
いずれも定量限界（５００ｎｇ／ｍＬ）以下の値であったが、雄では投与後０．５、２及び４時間の血漿中にトリシンが検出された。投与後２及び４時間ではごく軽度ながら投与量に相関した血漿中トリシン濃度が高値となる傾向がみられたが、３００あるいは１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の投与後２及び４時間の血漿中トリシン濃度は同程度であり、時間経過に伴って増加ないし低下する傾向は見られなかった。これに対して、雌の１００および３００ｍｇ／ｋｇ投与群では投与後４時間まで血漿中にトリシンは検出されなかった。雌の１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では投与後０．５、２及び４時間の血漿中にトリシンが検出されたが、投与後０．５時間をピークとして血漿中トリシン濃度は低下する傾向にあった。
【００８９】
表１：１４日間反復経口投与毒性試験における雄性ラットの血漿中トリシン濃度
*：定量限界（５００ｎｇ／ｍＬ）以下であることから参考値である。
【００９０】
表２：１４日間反復経口投与毒性試験における雌性ラットの血漿中トリシン濃度
*：定量限界（５００ｎｇ／ｍＬ）以下であることから参考値である。
【００９１】
［実施例１０］
（雄性ラットにおけるトリシン誘導体の単回経口投与による毒性試験及びトリシンの血漿中濃度推移）
方法
１群につき各３匹の雄性Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系ラット（日本チャールズ・リバー株式会社）を準備し、各群にそれぞれトリシン濃度として０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、１００、３００および１０００ｍｇ／ｋｇに相当するトリシン誘導体、化合物１６（４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン）を単回投与し、投与前、投与後３０分、２時間、４時間および８時間に採血して得られた血漿中のトリシン濃度の推移について検討した。
【００９２】
・観察、測定及び検査項目
ａ．一般状態観察
全例について動物の生死、外観、行動等を投与日（０日）の投与前、投与直後、投与後３０分、２時間、４時間及び８時間の各採血時点に観察した。
ｂ．体重測定
全例について動物の体重を、投与日の投与前に、電子式上皿天秤を用いて測定し、１ｇ単位で記録した。
【００９３】
・分析法
ラット血漿中のトリシン濃度を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−ＵＶ法により測定した。血漿からのトリシンの抽出及びＨＰＬＣの測定条件はHong Caiらの方法（Hong Cai et al. Biomed. Chromatogr. 17, 435-439 (2003)、 Hong Cai, et al. Biomed. Chromatogr. 19, 518-522 (2005））に準じて設定し、抽出方法を一部改変して血漿中トリシン濃度を測定した。
【００９４】
・採血
投与日の投与前、投与後３０分、２時間、４時間および８時間に勁静脈からヘパリン加処理血液を採取し、４℃下６０００回転／分で１０分間遠心した。得られた血漿はラットＴＫ血漿として採血当日より使用日まで−２５℃設定の冷凍庫に保存した。
・抽出方法
ラットＴＫ血漿５０μｌに内標準溶液（１．２５μｇ／ｌケルセチン・２水和物ＤＭＳＯ溶液）１０μｌを添加し混合後、抽出溶媒（０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸／アセトン溶液）４０μｌを添加し攪拌した。１０℃下１５０００回転／分で１０分間遠心した。蒸留水５０μｌを添加後攪拌し、１０℃下１５０００回転／分で１０分間遠心した。遠心後の上清を採取し、得られた上清をＨＰＬＣに注入した。
・ＨＰＬＣ条件
ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、株式会社ワイエムシー）カラムに、抽出後の上清４００μＬを注入し、カラム温度４０℃、波長３５５ｎｍ、流速１．４ｍＬ／ｍｉｎ、移動相は酢酸アンモニウム溶液：メタノール＝２：３、分析時間１０分の条件で測定した。
【００９５】
結果
・一般状態
一般状態の成績を表３に示す。
各投与群とも、投与日の投与前ならびに投与後３０分、２時間、４時間および８時間の各採血時点で一般状態に異常は認められなかった。
・体重
投与前日及び投与日の体重を表４に示す。
投与前日に比べて投与日の体重はいずれの投与群とも増加しており、投与日までの体重増加は順調であった。
したがってトリシン同様、トリシン誘導体は安全性の高い薬物と推測される。
【００９６】
・血漿内トリシン濃度
血漿中トリシン濃度の推移を図２及び表５に示す。また代表的なクロマトグラムを図３〜７に示す。
１００ｍｇ／ｋｇ投与群の血漿中トリシン濃度推移では、投与後３０分で増加し、投与後２時間で低下した後、投与後４時間で再び増加を示す二峰性の推移が認められた。投与後３０分に比べ、投与後４時間のトリシン濃度は約３．６倍高値であった。投与後８時間で血漿中濃度は低下したが、投与後３０分と同程度のトリシンが検出された。
【００９７】
３００ｍｇ／ｋｇ投与群の血漿中濃度推移においても、投与後３０分と４時間をピークとする二峰性の推移が認められたが、１００ｍｇ／ｋｇ投与群とは異なり、投与後３０分と４時間の血漿中濃度はほぼ同程度であった。１００ｍｇ／ｋｇ投与群に比べて、投与後３０分の血漿中トリシン濃度は約４．２倍、投与後２時間で約２．５倍高値であり、ほぼ投与量に応じた増加を示した。しかしながら、投与後４時間の濃度は約１．１倍、投与後８時間は約１．４倍であり、投与後４時間以降の血漿中濃度には１００ｍｇ／ｋｇ投与群と大きな差は認められなかった。
【００９８】
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の血漿中濃度推移でも、投与後３０分で増加し、投与後２時間で低下した後、投与後４時間で再び増加を示す二峰性の推移が認められた。投与後３０分の値は、多糖四群と異なり投与後４時間よりも約１．６倍高値であり、１００ｍｇ／ｋｇ投与群の約６．４倍３００ｍｇ／ｋｇ投与群の約１．５倍高値であった。また、投与後８時間の濃度は、同群の投与後４時間あるいは３００ｍｇ／ｋｇ投与群の投与後４時間と同程度の値であった。
薬物動態学的パラメーターでは、１０００ｍｇ／ｋｇ投与群のＣｍａｘは高値であったが、１００及び３００ｍｇ／ｋｇ投与群は同程度の値であった、Ｔｍａｘは投与量の増加に応じて短くなる傾向が見られた。またＡＵＣ0-8は１００ｍｇ／ｋｇ投与群に比べて３００および１０００ｍｇ／ｋｇ投与群はそれぞれ約１．５及び２．１倍高値であった。
【００９９】
トリシン誘導体の１００、３００および１０００ｍｇ／ｋｇ投与群において、投与後３０分の血漿中濃度及びＡＵＣ0-8では用量相関性の増加が認められ、いずれの投与群とも投与後３０分及び投与後４時間をピークとする二峰性の推移を示したことから、腸管循環による再吸収の可能性が示唆された。
また、トリシン誘導体の１００、３００および１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の投与後４時間の血漿中濃度はいずれも同程度の値であり、１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では投与後４時間と投与後８時間の血漿中濃度に差はなく、いずれも高値であった。このことから大量投与に伴う腸管からの吸収遅延が生じている可能性が示唆された。
なお、比較としてラットにトリシンを１４日連続経口投与し、同様に血漿中濃度推移を測定したが、最高でも６１ｎｇ／ｍＬのトリシンしか検出されなかった。トリシン誘導体を経口投与した本試験では最高で４４４８ｎｇ／ｍＬのトリシンが検出されており、血中への移行性はトリシンに比べてはるかに高いことが検証された。
【０１００】
表３：雄性ラットへのトリシン誘導体の単回経口投与試験における一般状態
Ｎ：異常所見無し
【０１０１】
表４：雄性ラットへのトリシン誘導体の単回経口投与試験における体重の推移
【０１０２】
表５：雄性ラットへのトリシン誘導体の単回経口投与試験における血漿中トリシン濃度
【０１０３】
［実施例１１］
（マウスにおけるトリシン誘導体の単回経口投与による毒性試験）
方法
１群につき各５匹の雄性及び雌性Ｃｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）系マウス（日本チャールズ・リバー株式会社）を準備し、各群にそれぞれトリシン濃度として０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、５００ｍｇ／ｋｇ（低用量群）、１０００ｍｇ／ｋｇ（中用量群）および２０００ｍｇ／ｋｇ（高用量群）に相当するトリシン誘導体、化合物１６（４′−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン）を単回経口投与した。
【０１０４】
・観察、測定及び検査項目
ａ．一般状態観察
全例について動物の生死、外観、行動等を投与開始日を投与０日として起算し、投与１日から投与１３日までは午前及び午後の少なくとも１日２回、投与後１４日は午前中に１回観察した。
ｂ．体重測定
全例について動物の体重を、投与１、３、５、７、１０及び１４日に、電子式上皿天秤を用いて測定し、０．１ｇ単位で記録した。
ｃ．剖検所見
全例について投与１４日に安楽死させ、全身の器官・組織を肉眼的に観察し、必要な臓器・組織を固定・保存した。
【０１０５】
結果
・一般状態
対照群及びいずれの投与群においても、投与期間中に異常は認められなかった。
・体重推移
体重推移を表６に示す。各投与群共に投与期間中に対照群と比較して有意な差は認められなかった。
・剖検所見
対照群及びいずれの投与群においても、異常所見は認められなかった。
以上より、トリシン誘導体のマウスへの単回経口投与毒性試験において、一般状態、体重推移及び剖検所見では被験物質投与に関連した変化は認められなかった。
【０１０６】
表６−１：雄性マウスへのトリシン誘導体の単回経口投与毒性試験における体重の推移
【０１０７】
表６−２：雌性マウスへのトリシン誘導体の単回経口投与毒性試験における体重の推移
【０１０８】
［実施例１２］
（雄性マウスにおけるトリシン誘導体の１４日連続経口投与による毒性試験）
方法
１群につき各５匹の雄性Ｃｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）系マウス（日本チャールズ・リバー株式会社）を準備し、各群にそれぞれトリシン濃度として０ｍｇ／ｋｇ（対照群）、３００および１０００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙに相当するトリシン誘導体、化合物１６（４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン）を１４日間反復経口投与した。
【０１０９】
・観察、測定及び検査項目
ａ．一般状態観察
全例について動物の生死、外観、行動等を、投与開始日を投与１日として起算し、投与１日から投与１４日の翌日の剖検日まで、午前及び午後の１日２回観察した。
ｂ．体重測定
全例について動物の体重を、投与１、２、７、１０及び１４日の投与前及び剖検日に、電子式上皿天秤を用いて測定し、０．１ｇ単位で記録した。
ｃ．摂餌量
全例について摂餌量を、投与１、２、７、１０及び１４日の投与前に、電子式上皿天秤を用いて測定し、０．１ｇ単位で記録した。投与開始前日に適当量を測定後ケージ毎に給与しその後は測定日に残量及び給与量を測定する。以下の式により摂餌量を算出する。
摂餌量（ｇ／マウス／日）＝（給与量（ｇ／マウス）−残量（ｇ／マウス））／測定日間の日数（日）
【０１１０】
ｄ．血液学的検査
全例について剖検時に採血し、赤血球数（ＲＢＣ）、ヘマトクリット値（ＨＣＴ）、ヘモグロビン濃度（ＨＧＢ）、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板数（Ｐｌａｔｅｌｅｔ）、白血球数（ＷＢＣ）について自動血球分析装置ＸＴ−２０００ ｉＶ（シスメックス社）を用いて測定した。
ｅ．血液化学的検査
全例について剖検時に採血し、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）、尿素窒素（ＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒｅａ）、総蛋白（ＴＰ）について自動分析装置７０８０形（日立ハイテクノロジーズ社）を用いて測定した。
ｆ．剖検所見
全例について投与１４日の翌日に安楽死させ、全身の器官・組織を肉眼的に観察し、必要な臓器・組織を固定・保存した。
ｇ．器官重量
全例について剖検時に電子式上皿天秤を用いて脳、心臓、配、肝臓、腎臓（左右）、脾臓、副腎（左右）、精巣（左右）について重量を測定して記録した。以下の式から相対重量を算出した。
相対重量（％）＝（絶対重量（ｇ）／剖検日体重（ｇ））×１００
【０１１１】
結果
・一般状態
一般状態の成績を表７に示す。対照群及び３００ｍｇ／ｋｇ投与群では、投与期間中に異常は認められなかった。
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では、１例で投与８日にのみ軟便が１回認められたのみであり、被験物質投与との関連性はないと判断した。
・体重推移
体重推移を表８に示す。各投与群共に投与期間中に対照群と比較して有意な差は認められなかった。
【０１１２】
・摂餌量
摂餌量を表９に示す。３００ｍｇ／ｋｇ投与群では投与７日に対照群と比較して有意な高値が認められたが、用量依存性もないことから毒性学的な意義はないと考えられた。
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群と比較して有意な変化は認められなかった。
・血液学的検査
各投与群共に投与期間中に対照群と比較して有意な差は認められなかった。
・血液化学的検査
各投与群共に投与期間中に対照群と比較して有意な差は認められなかったが、１０００ｍｇ／ｋｇ投与群の１例でＡＳＴ及びＡＬＴの高値が認められた。
【０１１３】
・剖検所見
剖検所見を表１０に示す。対照群では異常所見は認められなかった。
３００ｍｇ／ｋｇ投与群では雄１例に左右の精巣に小型化が認められたが、用量依存性のない変化であった。
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では異常所見は認められなかった。
・器官重量
器官重量の成績を表１１に示す。
３００ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群と比較して有意な変化は認められなかった。
【０１１４】
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群では、肝臓の絶対及び相対重量に有意な高値が認められた。肝機能検査項目のＡＳＴ及びＡＬＴが高値を示したのは１例のみであり、統計学的な有意差を伴わないことから、代謝酵素等の誘導による重量増加の可能性が考えられた。
他に、心臓の絶対重量に有意な低値が認められたが、相対重量の有意差を伴うものではなく毒性学的な意義はないと推察された。
１０００ｍｇ／ｋｇ投与群で肝臓重量の増加が認められているが、一般状態、体重推移、摂餌量、血液学的検査、血液化学的検査及び剖検所見では被験物質投与に関連した変化は認められなかった。
以上より、本試験条件下におけるトリシン誘導体の無影響量は、現在のところ３００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙと推察された。
【０１１５】
表７：雄性マウスへの１４日連続経口投与毒性試験における一般状態
数値は動物数を示す。
【０１１６】
表８：雄性マウスへのトリシン誘導体の１４日連続経口投与毒性試験における体重の推移
【０１１７】
表９：雄性マウスへのトリシン誘導体の１４日連続経口投与毒性試験における摂餌量
【０１１８】
表１０：雄性マウスへのトリシン誘導体の１４日連続経口投与毒性試験における剖検知見
数値は動物数を示す。
【０１１９】
表１１：雄性マウスへのトリシン誘導体の１４日連続経口投与毒性試験における器官重量
※:対照群に対しp≦0.05 (Dunnett’s test)
※※:対照群に対しp≦0.01 (Dunnett’s test)
【０１２０】
［実施例１３］
（加水分解試験）
トリシンアミノ酸誘導体のエステル結合の加水分解性について、細胞内の加水分解酵素を用いて試験を行った。
ＭＤＣＫ細胞（１．３３×１０6細胞）の溶解物をマニュアル（Harlow, E.; Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, p 449.）に従い作成した。
細胞溶解物によりトリシンアミノ酸誘導体を処理して、トリシンを放出するのに必要な時間（ｔ1/2：半減期）を測定した(Cai, H.; Verschoyle, R. D.; Steward, W. P.; Gescher, A. J. Determination of the flavone tricin in human plasma by high-performance liquid chromatography. Biomed. Chromatogr. 2003, 17, 435-439.)。
トリシン-Ala-Glu誘導体の半減期は１６５分であった。細胞内でトリシンアミノ酸誘導体からトリシンに変換されることが明らかである。
なお、トリシン-Ala-Glu誘導体の半減期（１６５分）は、類似構造のケルセチン-Ala-Glu誘導体の半減期（１１０分）よりかなり長い値を示した。トリシンアミノ酸誘導体は、３’位及び５’位のメトキシ基により立体障害を受け、酵素活性部位に対する親和性が低くなり、加水分解半減期が長くなったものと考えられる。
【０１２１】
［実施例１４］
（子宮頚癌細胞株増殖試験）
トリシンの子宮頚癌細胞株の増殖に対するトリシンの影響を調べるため、以下の実験を行った。
細胞株は以下のものを使用した。
(i) TIG-3株 胎児肺繊維芽細胞（正常細胞、コントロールとして）
(ii)CA株 HPV- p53-（子宮頚癌細胞株）
（“Establishment of a HPV and p53-mutation-nagative human cell line (CA) derived from a squamous carcinoma of the uterine cervix”, Keiichi Isaka et al., Gynecologic Oncology 92, 15-21 (2004)参照)
(iii)CaSki株 HPV16型高コピー p53＋（子宮頚癌細胞株）
(iv)HeLa株 HPV18型 p53＋（子宮頚癌細胞株）
(v)SiHa株 HPV16型低コピー p53＋（子宮頚癌細胞株）
【０１２２】
上記各細胞株を、トリシン添加24時間前に96well プレートに4,000個/1well 播種し、通常培養条件（３７℃、５％ＣＯ2）下にて前培養を行った。
トリシンをDMSOで溶解し、最終濃度０、１、１０、５０μＭとなるよう培養液に添加した
【０１２３】
トリシンを添加した後、７日目まで、２４時間毎に、CellTiter96(登録商標)Non-Radioactive Cell Proliferation Assayに準じたプロトコルにてアッセイ、測定を行った。
より具体的には、１５μｌの染色液を各ウェルに添加し、３７℃で、加湿されたＣＯ2インキュベーター内でインキュベートを行った。その後１００μｌの溶解／停止液を各ウェルに添加した。なお、終了まで培養液の交換は行わずにアッセイを行った。
着色されたホルマザン産物の５７０ｎｍの吸光度を、マルチウェル分光光度計（SpectraMax 190分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製））で測定した。参照波長として６３０〜７５０ｎｍの波長を用いた。解析ソフトは、Ｓｏｆｔｍａｘ（登録商標）Ｐｒｏ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用いた。
培養時間と吸光度の関係を図８〜１２に示す。
図８〜１２から明らかなとおり、子宮頚癌細胞株４種および胎児肺繊維芽細胞株全てにおいて、トリシン濃度（0μM〜50μM）依存で細胞増殖は抑えられた。
以上の結果より、トリシンが子宮頸癌に対して優れた抗癌作用を示すことがわかる。
高い細胞浸透性を示し、また体内でトリシンに変化してトリシンの高い血中濃度を与えるトリシンアミノ酸誘導体についても同様に、子宮頸癌に対して優れた抗癌作用を示すことが明らかである。
【０１２４】
＜＜抗ウイルス剤（併用剤）のヘルペスウイルスに対する抗ウイルス作用＞＞
［実施例１５］
本発明の抗ウイルス剤（併用剤）のヘルペスウイルスに対する抗ウイルス作用を以下の方法により調べた。
＜方法＞
２４ウェルのプレートに単層培養されたヒト胎児線維芽細胞（ＨＥＬ細胞）にヒトサイトメガロウイルス（Ｔｏｗｎｅ株）（１Ｍｏｉ）を１時間吸着・感染させた後、ガンシクロビル０．０００１μＭとトリシン（０、０．０１、０．０３又は０．１μＭ）とを含む培養液を加え、５％炭酸ガス培養器にて培養をスタートさせた。
ウイルス感染後５日目の上清を取り出し、プラークアッセイ実験を行った。
顕微鏡にて細胞変性効果（ＣＰＥ）の有無・状況を観察し、コントロール（トリシン、ガンシクロビル共に０μＭ）のウイルス力価を１００とした場合の、各試料のコントロールに対する相対的なウイルス力価（％）を求めた。その結果を表１２及び図１３に示す。
【０１２５】
［比較例１］
トリシン（０、０．０１、０．０３、０．１μＭ）及びガンシクロビル（０．０００１μＭ）を含む培養液に代えて、トリシンのみ（０、０．０１、０．０３又は０．１μＭ）を含む培養液を用いた以外は実施例１５と同様の方法により実験を行った。その結果を表１２及び図１３に示す。
【０１２６】
表１２：トリシン及びＧＣＶを組み合わせて用いた場合及びトリシンのみを用いた場合の抗ウイルス作用
【０１２７】
［参考例２］
参考として、ガンシクロビル単独を有効成分として用いた場合のヘルペスウイルスに対する抗ウイルス作用を以下の方法により調べた。実験は、４’，５，７−トリヒドロキシ−３’，５’−ジメトキシフラボン（０、０．０１、０．０３、０．１μＭ）及びガンシクロビル（０．０００１μＭ）を含む培養液に代えて、ガンシクロビル（０、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１又は１μＭ）を含む培養液を用いた以外は実施例１５と同様の方法により行った。その結果を表１３及び図１４に示す。
【０１２８】
表１３：ガンシクロビル（ＧＣＶ）のみを用いた場合の抗ウイルス作用
【０１２９】
表１２の結果から、トリシンとガンシクロビルを組み合わせて用いた本発明の抗ウイルス剤では、トリシン単独を用いた場合に比べて抗ウイルス活性が顕著に向上することが分かる。
また、本発明の抗ウイルス剤（併用剤）の細胞変性効果は、ガンシクロビル０．０００１μMによる細胞変性効果とトリシンによる細胞変性効果とから予想し得る結果よりもはるかに優れたものであることが分かる。例えば、トリシン０．０１μMのみを用いた場合の相対的ウイルス力価は約７５％であり、ガンシクロビル０．０００１μMのみを用いた場合の相対的ウイルス力価は約６２％である。これらの値から予想し得るトリシンとガンシクロビル（０．０００１μM）との組み合わせ製剤の効果は４７％前後である（０．７５×０．６２により算出した）。しかしながら、本発明の抗ウイルス剤（１）による実際の相対的ウイルス力価は約３１％であり、予想し得る数値よりもはるかに低い相対的ウイルス力価が得られた。この結果から、トリシンとガンシクロビルは相乗効果を発揮し、組み合わせることにより通常考えられるよりも著しく優れた抗ウイルス作用が得られることが分かる。
さらに、本発明の抗ウイルス剤は、ガンシクロビル単独を同濃度で用いた場合と比べても同等以上の優れた抗ウイルス作用を有しており、ガンシクロビルの問題点（細胞毒性、耐性）をも改善しうる新たな抗ウイルス剤として使用することが出来る。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１：
で表される化合物
（式中、Ａは任意のアミノ酸残基であり、Ｂは任意のアミノ酸残基であり、ＡとＢは同じ又は異なっても良く、ｎ＝０〜４である。）。
【請求項２】
Ａが任意のアミノ酸残基であり、ｎ＝０又は１である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ａがグリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸の残基である、請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
Ａがアラニン残基であり、Ｂが任意のアミノ酸残基である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ａがアラニン残基であり、Ｂがアスパラギン酸又はグルタミン酸残基である請求項１記載の化合物。
【請求項６】
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｎ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン又は
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン
からなる群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物を含む抗ウイルス剤。
【請求項８】
対象のウイルスが、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスあるいはインフルエンザウイルスである、請求項７記載の抗ウイルス剤。
【請求項９】
対象のウイルスが、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルス株、アマンタジン耐性インフルエンザウイルス株、ガンシクロビル耐性ヒトサイトメガロウイルスからなる群より選択されるウイルスである、請求項７記載の抗ウイルス剤。
【請求項１０】
経口投与用である請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１１】
トリシン又は請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物を含む抗癌剤。
【請求項１２】
対象の癌が大腸癌または子宮頸癌である、請求項１１記載の抗癌剤。
【請求項１３】
経口投与用である、請求項１１または１２記載の抗癌剤。
【請求項１４】
（Ａ）トリシン又は請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物、及び
（Ｂ）ガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンからなる群から選択される少なくとも一種の化合物、
を有効成分として含むことを特徴とする、抗ウイルス剤。
【請求項１５】
前記（Ｂ）成分がガンシクロビルである、請求項１４に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１６】
前記ウイルスがヘルペスウイルスである、請求項１４又は１５に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１７】
前記ウイルスがサイトメガロウイルスである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１８】
前記ウイルスが、ヒトサイトメガロウイルスである請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１９】
前記（Ａ）成分と（Ｂ）成分とのモル比が１００：１〜１０００：１（（Ａ）成分：（Ｂ）成分）の範囲内である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１】
式１：
で表される化合物
（式中、Ａは任意のアミノ酸残基であり、Ｂは任意のアミノ酸残基であり、ＡとＢは同じ又は異なっても良く、ｎ＝０〜４である。）。
【請求項２】
Ａが任意のアミノ酸残基であり、ｎ＝０又は１である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ａがグリシン、アラニン、バリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸の残基である、請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
Ａがアラニン残基であり、Ｂが任意のアミノ酸残基である請求項１記載の化合物。
【請求項５】
Ａがアラニン残基であり、Ｂがアスパラギン酸又はグルタミン酸残基である請求項１記載の化合物。
【請求項６】
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｙ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｖａｌ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｐｈｅ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ｇｌｎ−ＯＨ）−トリシン、
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ａｓｐ−ＯＨ）−トリシン又は
４’−Ｏ−ＣＯ−（Ａｌａ−Ｇｌｕ−ＯＨ）−トリシン
からなる群から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物を含む抗ウイルス剤。
【請求項８】
対象のウイルスが、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスあるいはインフルエンザウイルスである、請求項７記載の抗ウイルス剤。
【請求項９】
対象のウイルスが、オセルタミビル耐性インフルエンザウイルス株、アマンタジン耐性インフルエンザウイルス株、ガンシクロビル耐性ヒトサイトメガロウイルスからなる群より選択されるウイルスである、請求項７記載の抗ウイルス剤。
【請求項１０】
経口投与用である請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１１】
トリシン又は請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物を含む抗癌剤。
【請求項１２】
対象の癌が大腸癌または子宮頸癌である、請求項１１記載の抗癌剤。
【請求項１３】
経口投与用である、請求項１１または１２記載の抗癌剤。
【請求項１４】
（Ａ）トリシン又は請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物、及び
（Ｂ）ガンシクロビル、アシクロビル、シドフォビル、ファムシクロビル、フォミビルセン、ホスカルネット、イドクスウリジン、ペンシクロビル、トリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル及びビダラビンからなる群から選択される少なくとも一種の化合物、
を有効成分として含むことを特徴とする、抗ウイルス剤。
【請求項１５】
前記（Ｂ）成分がガンシクロビルである、請求項１４に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１６】
前記ウイルスがヘルペスウイルスである、請求項１４又は１５に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１７】
前記ウイルスがサイトメガロウイルスである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１８】
前記ウイルスが、ヒトサイトメガロウイルスである請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤。
【請求項１９】
前記（Ａ）成分と（Ｂ）成分とのモル比が１００：１〜１０００：１（（Ａ）成分：（Ｂ）成分）の範囲内である、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の抗ウイルス剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１１−１７３８７７（Ｐ２０１１−１７３８７７Ａ）
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８４７５（Ｐ２０１１−１８４７５）
【出願日】平成２３年１月３１日（２０１１．１．３１）
【出願人】（５９４１５５５５１）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年９月８日（２０１１．９．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１月３１日（２０１１．１．３１）
【出願人】（５９４１５５５５１）
【Ｆターム（参考）】
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