フェヌグリーク種子生物活性組成物およびその抽出法
筋肉細胞へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を促進かつ支援するための生物活性化合物の組成物および方法。生物活性化合物の組成物は、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含むのが好ましい。本発明の1つの好ましい実施形態において、生物活性化合物はフェヌグリーク種子から抽出される。フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出する方法も開示されており、この方法は、(1)複数個のフェヌグリーク種子を用意するステップと、(2)フェヌグリーク種子を調製するステップと、(3)フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出するステップとを含み、生物活性化合物は、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む。生物活性化合物の組成物と組成物の抽出法は、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと約20〜40%のアミノ酸とを含むのが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、代謝に影響を与える方法および組成物、より具体的に言えば、動物およびヒトのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援するフェヌグリーク種子由来の生物活性成分の新規な組成物およびその抽出法に関する。
【背景技術】
【0002】
フェヌグリークは、最古の薬草で、南西ヨーロッパ、北アフリカおよび西アジア原産であるが、世界の他の地域で広く栽培されている。フェヌグリークは、マメ(Fabaceae)科の学名トリゴネラ・フェヌム・グラエクム(Trigonella foenum−graecum)として知られており、一般にグリークヘイと称されている。当業者には分るように、フェヌグリークはマメ科野菜であり、通常、約0.6096〜0.9144m(2〜3フィート)の高さに生長し、薄緑色の葉と小さな白い花をつける。フェヌグリーク種子のさやには、10〜20個の小さく平たい黄褐色の種子が入っている。通常、植物種子は、種皮と呼ばれ、しばしば種子殻と称される軟または硬外殻を付けて形成される。種子殻の内部には、植物胚と、胚を取り囲む胚乳と称される栄養組織とがある。フェヌグリーク種子胚は成熟過程で胚乳を消費する。フェヌグリーク種子は、多くの場合、刺激香を有し、セロリに似ていると言われる苦味を有し得る。
【0003】
フェヌグリークは、長い間アジアや地中海地方で薬草や調味料として用いられてきた。フェヌグリーク植物の種子は、例えば、鉄、ビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、リン酸、フラボノイド、サポニン、トリゴネリンおよび他のアルカロイドなどの多くの薬用活性化合物を含むと考えられている。フェヌグリークは、胃強壮薬として、また腹部の病気の治療薬として用いられている。欧米の科学研究により、フェヌグリーク種子の化学分析と共に、フェヌグリーク種子からの4−ヒドロキシイソロイシンの抽出の見通しが得られ、フェヌグリークのいくらかの臨床的有用性が示唆された。
【0004】
エル フォウデン卿(Sir L.Fowden)は、フェヌグリーク分析の研究を行った。ファウデン卿は、フェヌグリークからの4−ヒドロキシイソロイシンの単離、精製を教示し、4−ヒドロキシイソロイシンがフェヌグリーク種子に含まれている主要な遊離アミノ酸であると主張した(例えば、非特許文献1参照)。従来技術をさらに調べると、フェヌグリーク種子のアミノ酸が栄養価を有し得ることが示唆されている(例えば、非特許文献2参照)。当業者により、フェヌグリーク種子のステロイドサポゲニン含有量の分析における分光測光法も教示されており、そのような従来技術法は、一般に、脱脂フェヌグリークのサブフラクションの組成を調べる研究に用い得る(例えば、非特許文献3参照)。さらに、当業者は、フェヌグリーク種子からアミノ酸4−ヒドロキシイソロイシンを抽出するのにクロロホルムを使用している(例えば、非特許文献4参照)。しかし、クロロホルムは有毒であり、一般に、食品医薬品業界で定められている基準下では抽出法として許容されないことが判明している。
【0005】
フェヌグリーク種子からは他の化合物も単離されている。主要異性体(2S,3R,4S)−4−ヒドロキシイソロイシンに加えて、微量異性体4−ヒドロキシイソロイシンおよびアミノ酸(リシン、ヒスチジンおよびアルギニン)が単離されている。その後の研究で、フェヌグリーク種子中の4−ヒドロキシイソロイシンが2種のジアステレオ異性体として存在することが確認されている:主要ジアステレオ異性体は(2S,3R,4S)形配置で、4−ヒドロキシイソロイシンの総含有量の約90%を占め、微量ジアステレオ異性体は(2R,3R,4S)形配置である(例えば、非特許文献5参照)。
【0006】
当業者には分るように、主要異性体(2S,3R,4S)は、グルコース依存的に膵ベータ細胞刺激に直接影響を与えることによりマイクロモル濃度でグルコース応答性インスリン分泌を促進する能力を示す実験的証拠に関して現在関心を集めている。さらに、4−ヒドロキシイソロイシンは、相互作用して、相加的インスリン分泌増強効果(すなわち、過剰なグルコース濃度の存在下においてのみ、インスリンの分泌および活性を刺激するか、影響を与えること)を誘発し得る(例えば、非特許文献6参照)。さらに、従来技術を調べると、ラット、イヌおよびヒトの膵組織で実施された高血糖、糖尿および高脂質血症状におけるフェヌグリークサブフラクションの使用を調べる臨床研究が開示されている(例えば、非特許文献7〜10参照)。当業者には分るように、フェヌグリークに関して実施された臨床研究は、フェヌグリーク種子の特定のサブフラクション(例えば、種皮および胚乳)の調査、または糖尿病またはコレステロール疾患を有する動物およびヒトにおける4−ヒドロキシイソロイシンの特異的効果に集中している。
【0007】
さらに、種々の研究により、4−ヒドロキシイソロイシンの天然類似体は抗糖尿病薬として合成物より効果が高いことが証明されている。したがって、4−ヒドロキシイソロイシンの治療効果はフェヌグリーク種子のエキス(抽出物)から最も良く得られることが示唆される。しかし、フェヌグリーク種子を栄養補給用の原料源として使用することにはいくつかの問題がある。例えば、そのような問題または不都合な点の1つは、治療効果および他の栄養効果を得るためには、通常、大量のフェヌグリーク種子が必要であるという事実に由来する。患者または消費者は、脱脂種子や苦味を消した(de−bitterized、以下「脱苦味」とする)種子でさえ食事に取り入れるのを好まないことが多い。非脱脂種子を大量に摂取すると、軽度の胃腸異常が生じ得る。フェヌグリーク種子は繊維を多く含んでいるために、長期にわたって大量に摂取すると、腸内ガスや下痢などの副作用が生じ得る。
【0008】
また、フェヌグリーク種子中の繊維の結合能力も、栄養素、特にミネラルの利用可能性に影響を与え得る。フェヌグリーク種子を外用すると、不快な皮膚反応が生じ得ることが理解されよう。したがって、フェヌグリーク種子またはその一部の摂取に由来する不快な副作用を回避し得るように、フェヌグリーク種子から生物活性治療化合物を得る方法を提供することは技術的な進歩であろう。
【0009】
上述の研究調査中に、当業者は、フェヌグリーク種子から4−ヒドロキシイソロイシンを抽出する粗抽出法を開発した。これらの従来技術法および抽出技術は、主として、4−ヒドロキシイソロイシンの「高純度」エキスを得ることに集中している。例えば、吸着クロマトグラフィーを用いた4−ヒドロキシイソロイシンの抽出は当業では公知である。しかし、そのような従来技術法は、極く少量の4−ヒドロキシイソロイシンしか生成しない傾向があり、通常、小規模実験室用にしか適していない。先に説明したように、当業者が用いている代替抽出法は、フェヌグリーク種子から4−ヒドロキシイソロイシンを抽出するのにクロロホルムなどの毒性有機溶媒を使用するので、消費者に対して固有の不利点を持つと考えられる。したがって、当業者には容易に分るように、フェヌグリーク種子から4−ヒドロキシイソロイシンおよび他の生物活性成分を抽出するためのより安全かつより工業的に実行可能な方法が求められている。
【非特許文献1】フォウデンら(Fowden et al),Phytochemistry,第12巻: p.1707(1973 年)
【非特許文献2】ソヴェールら(Sauvaire et al),Nutr Rep Int., 第14巻: p.527(1976年)
【非特許文献3】バクーら(Baccou et al),Analyst, 第102 巻:p.458(1977 年)
【非特許文献4】アルコックら(Alcock et al),Phytochemistry,第28巻(7): p.1835(1989年)
【非特許文献5】アルコック(Alcock),Phytochemistry,第28巻:p.1835(1989年)
【非特許文献6】ソヴェールら(Sauvaire et al),Daibetes,第47巻: p.206(1998年)
【非特許文献7】シャニら(Shani et al),Arch Intern Phamacodyn Ther,第210 巻:p.27(1974年)
【非特許文献8】リベスら(Ribes et al),Ann Nutr Metab, 第28巻:p.37(1984年)
【非特許文献9】ヴァレットら(Valette et al),Athersclerosis, 第50巻:p.105 (1984年)
【非特許文献10】マダール(Madar),Nutr Rep Int, 第29巻:p.1267(1984年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の主な目的は、グルコース応答性インスリンレベル上昇を促進し得るフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
本発明の他の目的は、インスリン感受性を高め得るフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
【0011】
本発明のさらに他の目的は、グルコース輸送因子4の機能を刺激し得るフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
また、本発明の目的は、効率的な数のステップを含み、経済的に生産されるフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
【0012】
さらに、本発明の目的は、高効力エキスの産生を提供するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、高量のエキス収量を提供するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
【0013】
本発明の別の目的は、約10〜70%のエキス正味収量を提供するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、アミノ酸、タンパク質および4−ヒドロキシイソロイシンを含むがそれらには限定されない生物活性化合物プロファイルを生成するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することである。
【0014】
本発明のさらに他の目的は、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレート、トリメチルヒスチジン、およびEtOH NH2を含むがそれらには限定されないフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物を提供することである。
【0015】
さらに、本発明の目的は、抗過血糖性であるフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することである。
また、本発明の目的は、単独で、グルコース輸送タンパク質を刺激し、グルコースの筋肉細胞への輸送を促進し得るフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することである。
【0016】
本発明の他の目的は、インスリンと相乗作用して、グルコース輸送タンパク質を刺激し、グルコースの筋肉への輸送を促進するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することである。
【0017】
本発明のさらに他の目的は、グルコースおよび炭水化物の代謝を支援するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0018】
上記目的に合致し、かつ本明細書で具現化かつ広義に記載されている本発明に従って、本発明の1つの好ましい実施形態は、グルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を促進、支援するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出法を含む。具体的に言えば、フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物の1つの好ましい実施形態は、インスリンと相乗作用するか、単独で作用して、骨格筋細胞上に位置するGT−4受容体を刺激し得る。そのようにして単離された組成物は、一般に、アミノ酸とタンパク質とからなる。本発明の1つの好ましい実施形態においては、例えば、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレート、トリメチルヒスチジン、およびEtOH NH2を含む生物活性化合物の組成物の単離に特に重点が置かれる。
【0019】
本発明の上記および他の目的は、添付図面と併せて、以下の説明および添付特許請求の範囲から、さらに十分に明らかにされるであろう。これらの図面が本発明の代表的な実施形態のみを示すものであり、したがって、本発明の範囲を限定するものでないとの了解のもとで、添付図面を用いて、本発明をさらに具体的かつ詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0020】
本明細書に一般的に記載され、図面に例示されている本発明の構成要素は、多岐にわたる異なる配置で配列、設計し得る。本明細書に記載されている本発明の本質的特性を逸脱することなく細部を種々に変更し得ることが当業者には勿論分るであろう。したがって、図1〜図19に示されている本発明の組成物および方法の実施形態についての以下のより詳細な説明は、権利請求されている本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の好ましい実施形態を代表するものにすぎない。
【0021】
本発明の好ましい実施形態は、全体を通して同じ部分が同じ番号で指定されている図面を参照すると最も良く理解されるであろう。
用語「糖尿病」とは、単独で用いられる場合、最も一般的には真性糖尿病(diabetes mellitus)を指す。真性糖尿病は、一般に、糖が適切に分解されず、身体が利用することができない炭水化物代謝障害と言われている。炭水化物代謝障害は、通例、適切なインスリン分泌の欠如に関連し得る。当業者には分るように、インスリンは、ランゲルハンス島のベータ細胞として知られている特定膵細胞によって分泌される。インスリンは、膵臓から分泌され、体中を移動して、糖代謝を調節する、より厳密に言えば、血流中のグルコースレベルを調節する。具体的に言えば、インスリンは数種の細胞表面受容体と相互作用する。そのような受容体ファミリーの1つはグルコース輸送(GT)受容体と呼ばれている。1〜7(GT−1〜7)と称される少なくとも7種のGT受容体ファミリーサブタイプが当業者により同定されている。
【0022】
多くの非糖尿病個体は、生存期間中にグルコースおよび炭水化物の正常代謝に有意に影響を与え得る栄養および代謝不全を経験し得る。例えば、個体のなかにはインスリン抵抗性を発現し得るものがある。これらの個体は、通例、糖代謝に困難を有するが、真性糖尿病個体のレベルには至っていない。一般に「X症候群」として知られている上記症状の一例は、高血中グルコースレベルと特に腹部での脂肪沈着とを特徴とし得る。高血中グルコースレベルの1つの症状は、高血糖性または高血糖症と称されることがある。栄養および代謝不全を経験している非糖尿病個体の場合、体内のグルコースおよび他の炭水化物の正常代謝を促進、支援することが有利であろう。グルコースおよび炭水化物代謝の促進および支援は、存在するインスリンと相乗作用してグルコースおよび他の炭水化物代謝を調節
する組成物を投与するか、あるいは、インスリンとは無関係にグルコースおよび他の炭水化物代謝を調節する組成物を投与することにより達成し得る。
【0023】
本発明者らによる臨床研究は、4−ヒドロキシイソロイシンと1種以上のアミノ酸とを特定濃度で含有する、フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の新規組成物が、骨格筋細胞上のグルコース輸送因子4(GT−4)の存在に応答してグルコースの骨格筋細胞への輸送を有効に促進することを示唆している。GT−4に関する細胞挙動がインスリンに関する細胞挙動と極めて強力に相関することは十分に立証されている。したがって、フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物がヒト骨格筋へのグルコース輸送の促進に用い得るという支持できる指摘は本発明の最も重要な点である。
【0024】
さらに、4−ヒドロキシイソロイシンと一連の他のアミノ酸とを含むフェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の新規組成物は、グルコースおよび他の炭水化物と結合して、グルコースもしくは他の炭水化物のボーラス投与に関連する生理応答を変えるか、特異的生理応答を生成させ得る。生理応答には、グルコース腸吸収の増強、膵ベータ細胞の刺激およびグルコースまたは他の炭水化物除去の促進が含まれる。
【0025】
このように、本発明の新規組成物および方法は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物エキスがインスリンに対する身体応答を促進する傾向を有し、その結果として、骨格筋へのグルコース輸送の増進が、肝臓や脂肪組織に沈着したグルコースを減少させ、それによって脂肪沈着を減少させるのに有効であるという前述の事項を支援する。
【0026】
全体として5で示されている本発明の体重管理診断および解決法の1つの好ましい実施形態は、図1に最も正確に図解されている。示されているように、フェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物の使用を意図する体重管理法は、(1)グルコースおよび炭水化物の正常代謝に影響を与える栄養および代謝不全を経験している個体の体重管理分析を実施するステップ6と、(2)フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出することによりフェヌグリーク種子抽出を実施するステップ10と、(3)フェヌグリーク種子エキス組成物の送達によって対象個体内の骨格筋グルコース輸送を促進するステップ8とを含み得る。
【0027】
体重管理実施ステップ6には、対象個体のインスリン分泌不良、インスリン非感受性またはインスリン抵抗性症状の診断が含まれる。診断ステップは肥満症などの症状を見分けるステップをさらに含み得る。さらに、本発明で意図されている体重管理実施ステップ6は、さらに、1種以上のフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物の定期的投与および対象個体の運動習慣および食事の変更指示を含み得る。
【0028】
フェヌグリーク種子抽出ステップ10は、設定比率に基いて4−ヒドロキシイソロイシンと一連の他のアミノ酸とを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物を抽出するステップを含む。さらに、フェヌグリーク種子抽出ステップ10は、対象消費者による消費用にフェヌグリーク種子エキスを包装または調整するステップを含み得る。例えば、フェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物エキスは、固体(すなわち、ピル、粉剤、錠剤もしくはカプセル)として包装、呈示するか、または液体、懸濁液などの形態で調剤し得る。フェヌグリーク種子エキスの新規組成物を得るステップは、さらに、このエキスが、消費者の体内に導入されたときに標的組織に効率的に到達するように、組成物エキスを修飾またはコンディショニングするステップを含み得る。本発明の1つの好ましい実施形態において、フェヌグリーク種子抽出法は、全体として10で示され、図2に最も正確に図解され、以下にさらに詳細に説明されている。
【0029】
引き続き図1を参照すると、1種以上の新規フェヌグリーク種子エキス組成物の送達に
よって対象個体体内の骨格筋グルコース輸送を促進するステップ8は、フェヌグリーク種子エキスがグルコースおよび炭水化物の輸送および代謝を促進、支援するように、ある形態のエキス組成物を摂取または投与(例えば、非経口投与)して、組成物を個体組織に到達させ得るステップを意図している。以下に説明するように、投与組成物中の生物活性化合物の濃度が高くなればなるほどインスリン分泌がより大きく促進されるが、これは、ヒトのインスリン分泌促進における本発明の新規組成物およびその製造法の有効性を示している。
【0030】
本明細書に記載され、本発明の精神および範囲に一致する発明原理に基いて、さまざまな他の体重管理実施法6、フェヌグリーク種子抽出実施法10、および対象個体内の骨格筋グルコース輸送促進法8を実施し得ることは明らかであろう。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための任意の特定の方法、技術、ステップまたはステップの順序を限定するものではないとみなされるべきである。
【0031】
フェヌグリーク種子から、4−ヒドロキシイソロイシンと一連の他のアミノ酸とを含む生物活性化合物の組成物を抽出するための本発明方法の1つの好ましい実施形態は、図2に最も正確に図解されている。フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出する方法10は、(1)フェヌグリーク種子を調製するステップ15と、(2)一次抽出プロセスを実施するステップ20と、(3)二次抽出プロセスを実施するステップ25とを含むのが好ましい。当業者には分るように、この抽出法が、フェヌグリーク種子からそれらの有用な生物活性化合物をもっと最適に抽出するために他のステップを含み得ることは勿論である。
【0032】
図2および図3を参照すると、フェヌグリーク種子調製ステップ15は、(1)フェヌグリーク種子を用意するステップ40と、(2)フェヌグリーク種子を浸漬させるステップ42と、(3)フェヌグリーク種子を粉砕するステップ44とを含み得る。浸漬ステップは、通常、種子を水中に指定時間にわたって浸すステップを含む。水の分離特性を提供し得る他の方法を用いてもよい。種子が浸漬されたら、種子粉砕ステップ44で種子の種々の部分を効率的に分離する。例えば、粉砕ステップ44は、種子の種皮48と称される厚または硬外殻を、胚乳46として知られている種子の内部から分離し得る。当然のことながら、胚乳46は植物胚を取り囲む栄養組織である。
【0033】
図2および図4を参照すると、調製ステップ15の結果として生じる胚乳46および種皮48から一次抽出プロセスを実施するステップ20は、溶媒(溶媒I)を用いた抽出ステップ50を含み得る。例えば、溶媒Iとしては、ヘキサン、シクロヘキサン、エーテルまたはそれらの任意の組み合わせなどの化合物があり得る。本発明で意図されている抽出ステップ50は、種子を効率的に脱脂する。したがって、一次抽出プロセス20を実施した後、その生成物は「脱脂された」とみなされる。抽出ステップ50は、さらに、調製した種子と溶媒Iとの組み合わせを繰返し加熱するステップを含み得る。本発明の1つの好ましい実施形態において、種子と溶媒Iとの組み合わせは、3回、約20〜90℃の範囲の温度に加熱し得る。より好ましくは、種子と溶媒Iとの組み合わせを、3回、約65〜70℃の範囲の温度に加熱し得る。調製した種子と溶媒Iとの組み合わせは、所望の結果を達成するのに十分な時間上記高温に維持し得る。本発明の1つの好ましい実施形態において、調製した種子と溶媒Iとの組み合わせは、約1〜3時間高温に維持される。その結果として、抽出ステップ50により、通常、種子エキス52と種子残滓53とが生じる。
【0034】
特に図4を参照すると、フェヌグリーク種子残滓53に対して蒸留濃縮ステップ54を実施し得る。当然のことながら、蒸留濃縮ステップ54は、フェヌグリーク種子からエキスを蒸留濃縮するさまざまな従来法を利用し得る。例えば、精留塔を用いて第1溶媒で連
続抽出して得た種子残滓を蒸留するステップは、種子残滓を沸騰するまで加熱し、加熱蒸気を捕捉、冷却することにより達成し得る。蒸留濃縮ステップ54は、回収された溶媒Iと共に、フェヌグリーク種子オイル、ジオスゲニン、フェヌグリークイソフラボン、フェヌグリークサポニン、および水溶性繊維、例えばガラクトマナンなどの量56をもたらし得る。
【0035】
濃縮種子エキスに対して、溶媒(溶媒II)を用いた抽出ステップ60を実施し得る。溶媒IIは、エタノールまたはエタノールと類似の化学特性を有する溶媒を含有する溶液であるのが好ましい。抽出ステップ60に用いられるエタノールの濃度はさまざまな値を有し得る。例えば、エタノール濃度は、約10〜95%の範囲の値内でさまざまであってよい。本発明の1つの好ましい実施形態において、抽出ステップ60は、さらに、種子エキス52と溶媒IIとの組み合わせを繰返し加熱するステップを含み得る。この組み合わせは、3回、約20〜90℃の範囲の温度に加熱するのが好ましい。より好ましくは、種子エキス52と溶媒IIとの組み合わせは、3回、約65〜70℃の範囲の温度に加熱し得る。本発明の1つの好ましい実施形態において、種子エキス52と溶媒IIとの組み合わせは、所望の結果を達成するのに十分な広範囲の時間、上記高温に維持し得る。例えば、種子エキス52と溶媒IIとの組み合わせは、約1〜3時間高温に維持し得る。この関連で、抽出ステップ60は、通常、種子残滓62と濃縮種子エキス64とをもたらす。
【0036】
一次抽出プロセス20に関連する追加ステップは、濃縮種子エキス64に対して実施される濃縮ステップ66を含み得る。濃縮ステップ66は、真空を用いて、溶媒68と濃縮物70の量を分離するのが好ましい。次いで、分離された濃縮物70を冷却沈降ステップ72にかけて、粗タンパク質を含む沈殿物74と、上清76とを得る。次いで、上清76を希釈ステップ78にかけて、希釈上清80を得る。当然のことながら、希釈ステップ78は脱イオン水の添加を含み得る。添加される水の量はさまざまであってよい。例えば、本発明の希釈ステップ78の1つの好ましい実施形態において添加される水の量は、上清76の量の約2〜10倍であってよい。次いで、希釈後、希釈上清70を、図2、図5および図6に図解されている二次抽出プロセス25にかける。
【0037】
本明細書に記載され、本発明の精神および範囲に一致する発明原理に基づいて、一次抽出プロセス20のさまざまな他の方法およびステップを実施し得ることは明らかであろう。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための任意の特定の方法、技術、ステップまたはステップの順序を限定するものではないとみなされるべきである。
【0038】
図2および図5を参照すると、一次抽出プロセス20の結果として生成された、希釈された上清80は二次抽出プロセス25にかけるのが好ましい。本発明の1つの好ましい実施形態において、二次抽出プロセス25は、希釈上清80のpHを調節するステップ100を含み得る。希釈上清80のpH調節ステップ100にはさまざまな溶液を使用し得る。例えば、塩酸を用い得るが、それには限定されない。pH調節溶液の成分濃度はさまざまな値を有し得る。当然のことながら、希釈上清80のpHは所望の結果を達成するのに十分な任意の範囲の値に調節し得る。したがって、塩酸溶液は、希釈上清80のpHを約1〜6.5の範囲のpHに調節し得る。
【0039】
次いで、pHが調節された希釈上清80を、陽イオン交換樹脂濾過ステップ104にかけ得る。1つの好ましい実施形態において、濾過ステップ104は、pH調節済上清80を樹脂中に流すステップを含み得る。陽イオン交換樹脂は、通常、高多孔質であり、弱極性または非極性であり得る。次いで、処理された樹脂を、樹脂を水洗するステップを含み得る洗浄ステップ108にかけ得る。さらに、樹脂を連続アンモニア溶液処理ステップ112にかけ、その後に酸回収ステップ116が行なわれる。連続アンモニア処理ステップ
112では、さまざまなアンモニア溶液の使用が考えられる。1つの好ましい実施形態において、アンモニア溶液はアンモニウム水などを含む。当然のことながら、溶液の成分濃度はさまざまな値を有し得る。例えば、アンモニウム水の濃度は約0.1〜1Nの範囲、好ましくは約0.3Nであってよい。
【0040】
連続アンモニア溶液処理ステップ112の非酸性流出物117は、保存されてて、生物活性を有する栄養素、例えば、ジオスゲニン、サポニン、フラボノイド、および水溶性繊維、例えばガラクトマンナンなどの分離に用られ得る。酸回収ステップ116の後、酸性部分に対して濃縮ステップ118を実施するのが好ましい。当然のことながら、濃縮ステップ118は真空の使用を含み得る。
【0041】
本発明の二次抽出プロセス25の1つの好ましい実施形態において、フェヌグリーク種子調製プロセス10のこれまでのステップ中に形成されたアンモニアを実質的に除去するために脱アンモニア化成(de−ammonification)ステップ120を組み込み得る。当業者には分るように、脱アンモニア化成ステップ120は、さまざまな従来法を用いて実施し得る。そのような方法の一例は、HDP100カラムなどの高多孔質で非極性のカラムを利用し得る。脱アンモニア化成ステップ120の完了後、4−ヒドロキシイソロイシンと一連の他のアミノ酸とを含有するフェヌグリーク種子調製物から抽出された生物活性化合物の組成物は脱苦味エキスと称され得る。
【0042】
脱アンモニア化成後、乾燥ステップ124を用いて、有用な化合物を有する最終生成物126を得る。当業者には分るように、乾燥ステップ124は、さまざまな方法、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、または真空乾燥を利用し得る。通常、調製フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、生成物収量(product yield)126)は、タンパク質とアミノ酸を共に含んでいる。より具体的に言えば、生成物収量126は、約10〜70%の割合の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%の割合の一連の他のアミノ酸で構成された他のタンパク質とを含有するフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物を含んでいるのが好ましい。したがって、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物は、約10〜90%の割合のアミノ酸を含有し得る。
【0043】
本明細書に記載され、本発明の精神および範囲に一致する発明原理に基いて二次抽出プロセス25のさまざまな他の方法またはステップを実施し得ることは明らかであろう。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための任意の特定の方法、技術、ステップまたはステップの順序を限定するものではないとみなされるべきである。
【0044】
図6を参照すると、本発明の二次抽出プロセス125の別の好ましい実施形態が示されている。具体的に言えば、一次抽出プロセス20の結果として生成された希釈上清80を二次抽出プロセス125にかけるのが好ましい。本発明の1つの好ましい実施形態において、二次抽出ステップ25は、陽イオン交換樹脂濾過ステップ130を含み得る。濾過ステップ130は、希釈上清80を樹脂上または樹脂中に流すように意図されている。樹脂は、適当な形状に形成され、高多孔質、かつ弱極性または非極性であるのが好ましい。次いで、処理された樹脂を、樹脂を水洗するステップを含み得る洗浄ステップ108にかける。
【0045】
1つの好ましい実施形態において、陽イオン交換樹脂を連続エタノール処理ステップ134にかけ得る。樹脂をエタノールで処理するステップ134は、樹脂上に溶媒溶液を繰返し流すステップを含み得る。溶媒中のエタノールの濃度は、通常、溶媒溶液を1回流す毎に増大される。当業者には分るように、連続エタノール処理ステップ134では、さまざまな適当な物質の利用が考えられる。例えば、エタノールまたは生物活性成分の抽出に
エタノールと同じように用いられる溶媒を使用し得る。
【0046】
酸回収ステップ138は、サポニンやフラボノイドなどの生物活性を有する栄養素を回収するために連続エタノール処理ステップ134におけるどの回の処理直後にも実施し得る。通常、最終エタノール処理後に回収される流出物138は、最高濃度の溶媒を利用し、本発明のさらなる処理のために回収される。
【0047】
さらに、流出物138をpH調節ステップ100にかけ得る。流出物138のpHを調節するステップ100では、さまざまな溶液を利用し得る。例えば塩酸を使用し得るが、それには限定されない。pH調節溶液の成分濃度はさまざまな値を有し得る。当然のことながら、回収流出物138のpHは所望の結果を達成するのに十分な範囲内の任意の値に調節し得る。したがって、塩酸溶液は、流出物138のpHを約1〜6.5の範囲に調節し得る。
【0048】
次いで、pH調節溶液を陽イオン交換樹脂濾過ステップ104にかけ得る。1つの好ましい実施形態において、濾過ステップ104は、pH調節溶液を、イオン交換特性を有する陽イオン交換樹脂上または樹脂中に流すステップを含む。樹脂は高多孔質かつ弱極性または非極性であるのが好ましい。処理された樹脂は、後に酸回収ステップ116が続き得る連続アンモニア溶液処理ステップ112にかけ得る。連続アンモニア処理ステップ112では、さまざまなアンモニア溶液の使用が考えられる。1つの好ましい実施形態において、アンモニア溶液はアンモニウム水などを含む。当然のことながら、アンモニア溶液の成分の濃度はさまざまな値を有し得る。例えば、アンモニウム水の濃度は、約0.1〜1Nの範囲、好ましくは約0.3Nであってよい。
【0049】
連続アンモニア溶液処理ステップ112の非酸性流出物217は、保存して、生物活性を有する栄養素、例えば、ジオスゲニン、サポニン、フラボノイド、および水溶性繊維、例えばガラクトマンナンなどの単離に用い得る。酸回収ステップ116の後、酸性部分に対して濃縮ステップ118を実施するのが好ましい。当然のことながら、濃縮ステップ118は真空の利用を含み得る。
【0050】
本発明の二次抽出プロセス125の1つの好ましい実施形態において、フェヌグリーク種子調製プロセス10の前のステップ中に形成されたアンモニアを実質的に除去するために脱アンモニア化成ステップ120を組み込み得る。当然のことながら、脱アンモニア化成ステップ120はさまざまな従来法を用いて実施し得る。そのような方法の一例は、高多孔質で非極性びカラム、例えばHDP 100カラムを利用し得る。脱アンモニア化成ステップ120の完了後、4−ヒドロキシイソロイシンと一連の他のアミノ酸とを含有するフェヌグリーク種子調製物から抽出された生物活性化合物の組成物は脱苦味エキスと称され得る。
【0051】
脱アンモニア化成後、有用化合物を有する最終生成物126を得るために乾燥ステップ124を利用し得る。当業者には分るように、乾燥ステップ124は、さまざまな方法、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、または真空乾燥を利用し得る。通常、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、生成物収量126)は、タンパク質とアミノ酸とを共に含んでいる。4−ヒドロキシイソロイシンはそのようなアミノ酸の1種である。より具体的に言えば、生成物収量126は、約10〜70%の割合の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%の割合の一連の他のアミノ酸で構成された他のタンパク質とを含有するフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物を含んでいるのが好ましい。
【0052】
本明細書に記載され、本発明の精神および範囲に一致する発明原理に基いて二次抽出プ
ロセス125のさまざまな他の方法およびステップを実施し得ることは明らかであろう。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための任意の特定の方法、技術、ステップまたはステップの順序を限定するものではないとみなされるべきである。
【0053】
当業者には分るように、本発明の新規組成物のアミノ酸およびタンパク質含有量を定量化するためにメソッド・バリデーション・プログラムを利用し得る。フェヌグリーク中の4−ヒドロキシイソロイシンと他のアミノ酸の割合の測定は、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)装置を用いて実施し得る。本発明において意図されているように、メソッド・バリデーション・プログラムには、蛍光検出器およびプログラム可能オートサンプラーを備えたHPLC装置を利用し得る。クロマトグラフィーカラムは、Zorbax Stable Bond SB−C18(4.6*150mm、5μm)であってよい。さらに、HPLC装置は、0.1mgまで測定可能な化学天秤、超音波浴、容量フラスコ、0.2μm膜付き2リットル真空濾過ガラス器、可変容量ピペット、ならびに電磁攪拌器および攪拌子を有し得る。
【0054】
メソッド・バリデーション・プログラムの試薬は、例えば、(1)メタノール(HPLCグレード)、(2)アセトニトリル(HPLCグレード)、(3)酢酸ナトリウム三水和物(ARグレード)、(4)トリエチルアミン(ARグレード)、(5)氷酢酸(ARグレード)、(6)テトラフラン(ARグレード)、(7)OPA試薬〔ホウ酸緩衝液中にo−フタルジアルデヒドおよび3−メルカプトプロピオン酸を含有、アジレント社(Agilent Co.)Part No.5061−3335〕、(8)4−ヒドロキシイソロイシン標準品〔ブリティッシュ アグリカルチュラル ラブ社(British Agricultural Lab)から取得〕、および(9)脱イオン水を含み得る。
【0055】
メソッド・バリデーション・プログラムの1つの好ましい実施形態は、移動相ステップ、標準調製ステップ、およびサンプル調製ステップを含み得る。移動相ステップでは、緩衝液A、緩衝液B、および濾過/脱気ステップを用い得る。緩衝液Aは、1リットルビーカー中で調製し得、ビーカー中で、1.36gの酢酸ナトリウム三水和物を500mlの水に溶かし得る。この組み合わせを完全に溶けるまで攪拌し得る。90μlのトリエチルアミンを加えて、混合し得る。1〜2%の酢酸溶液を加えてpHを約7.2に調節し得る。次いで、1.5mlのテトラフランを加えて混合し得る。最終混合物を「緩衝液A」と標識し得る。
【0056】
緩衝液Bは、以下の手順に従って形成し得る。ビーカー中で、1.36gの酢酸ナトリウム三水和物を100mlの水に溶解し得る。この組み合わせを完全に溶けるまで攪拌し得る。1〜2%の酢酸溶液を加えてpHを7.2に調節し得る。次いで、ビーカーに200mlのメタノールと200mlのアセトニトリルを加えて十分に混合し得る。最終混合物を「緩衝液B」と標識し得る。緩衝液は、真空および0.2μmの膜を用いて濾過、脱気するのが好ましい。
【0057】
本発明の1つの好ましい実施形態において、メソッド・バリデーション・プログラムの標準調製ステップは、約10mlの参照化合物を正確に秤量するステップと、参照化合物を50ml容量フラスコに入れるステップとを含み得る。約30mlの脱イオン水を用いて参照化合物を溶解し、約10分間超音波分解し得る。好ましくはフラスコを室温に冷ましてから、水で特定濃度に希釈し、十分に混合する。次いで、標準調製物をパラフィルムで密閉し、必要なときまで冷蔵保存し得る。
【0058】
メソッド・バリデーション・プログラムのサンプル調製ステップは、フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物約25mgを正確に秤量するステップと、この
組成物を50ml溶量フラスコ中で約30mlの脱イオン水に溶かすステップと、約10分間超音波分解するステップとを含み得る。好ましくはフラスコを室温に冷ましてから、溶液を水で特定濃度に希釈し、十分に混合し得る。サンプル調製物はHPLC装置に注入する前に濾過し得る。
【0059】
メソッド・バリデーション・プログラムの1つの好ましい実施形態用のクロマトグラフィー条件は、例えば、Zorbax Stable Bond SB−C18カラム、30℃のカラム温度、およびEX 340nM、EM 450クロマトグラフィー検出器を含み得る。以下の勾配および注入プログラムを利用し得る。
【0060】
勾配:
【表1】
【0061】
注入プログラム:
【表2】
【0062】
メソッド・バリデーション・プログラムの特異性は、同定ピークのスペクトルを調べて実行し得る。このピークは、サンプルと参照標準のスペクトルを示し得る。メソッド・バリデーション・プログラムの直線性は、4−ヒドロキシイソロイシンの標準調製物を調製して解析し、メソッド・バリデーション・プログラムで指示されているようにアッセイし得る。そのような直線性の1つに着手し、以下の結果が観察された。
【0063】
【表3】
相関係数は満足(r>0.99950)であり、これらのデータは本発明のメソッド・バリデーション・プログラムが良好な直線性を有することを示している。
【0064】
メソッド・バリデーション・プログラムは、所望により、試験サンプルに関して実施される6種の別個の試験により解析され得る。そのような精度解析の1つに着手し、以下の結果が観察された。
【0065】
【表4】
【0066】
【表5】
【0067】
【表6】
これらの結果から、相対標準偏差(RSD)は<3%である。上記に基き、本発明のメソッド・バリデーション・プログラムは、サンプルに関して良好な精度を達成した。
【0068】
メソッド・バリデーション・プログラムを実施し、連続2日間、多重HPLCアッセイにより同一サンプルを試験して再現精度について分析した。以下の結果が観察された。
【0069】
【表7】
【0070】
【表8】
RSDは、本発明のメソッド・バリデーション・プログラムが良好な再現精度を有することを示す<3%である。
【0071】
メソッド・バリデーション・プログラムを実施し、スパイクして回収したサンプル分析物と、スパイクして回収した標準分析物とを用いて回収率と正確さについて分析した。以下の結果が観察された。
【0072】
【表9】
これらの上記データは、本発明のメソッド・バリデーション・プログラムが良好な正確さを有することを立証している。
【0073】
本発明のメソッド・バリデーション・プログラムの上記結果に基き、本発明のフェヌグリーク種子調製プロセス10に従って抽出したフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物を含む2つのロットを分析すると、以下の結果が観察され得る。
【0074】
【表10】
【0075】
シリアンゴールデンハムスターの膵組織に関して実施した試験の結果を表すグラフデータを示す図7〜図9と、ヒト被験者に関して実施した臨床試験の結果を表すグラフデータを示す図10〜図19とを参照すると、本明細書に開示されている好ましい方法に従って抽出したフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物は、単独でGT−4を刺激するだけでなく、インスリンと相乗作用してGT−4を刺激することにより、グルコースおよび炭水化物の代謝を効率的に促進かつ支援することを示すデータが存在する。
【0076】
以下の実施例は、本発明の実践をさらに詳細に示すであろう。本明細書の実施例に一般的に説明かつ例示されている本発明の以下の方法、製剤、および新規高力価生物活性フェヌグリーク種子エキス組成物は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造またはプロセスを限定するものとみなされるべきではない。したがって、実施例I〜VIに示されている本発明の方法、製剤および組成物の好ましい実施形態についての以下のより詳細な説明は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するようには意図されておらず、本発明の好ましい実施形態を代表するものに過ぎない。
【0077】
実施例I
[シリアンゴールデンハムスター − 15mg/ml]
本発明のフェヌグリーク種子調製プロセス10の好ましい実施形態に従って、フェヌグリーク種子から独特な高力価生物活性エキスを調製する。より具体的に言えば、プロセス10の生成物収量から、1ml当たり15mgの4−ヒドロキシイソロイシン濃縮液を調製する。この濃縮液を、シリアンゴールデンハムスターの膵臓ランゲルハンス島ベータ細胞であるイン・ビトロ細胞系:HIT−T15に投与し、インスリン活性の経時的濃度変化を評価する。
【0078】
図7を参照すると、シリアンゴールデンハムスター由来の細胞培養物を調製し、培養膵ベータ細胞におけるフェヌグリークエキスの生物活性を評価する手順140が図解されている。本発明の1つの好ましい実施形態において、HIT−T15由来の細胞培養物を得142、増殖培地を除去し、約0.05%のトリプシンと0.53mMのEDTAを含有する約4mlの溶液を加え、約5秒間ゆっくり洗浄して、細胞を継代培養144し得る。溶液を除去し、4mlの新鮮溶液を加え得る。細胞は約37℃で約7分間培養し得る。分離後、当業者には自明の方法で、採取した細胞を計数146する。そのような方法の一例は、血球計を用いたトリプタンブルー(Tryptan Blue)除去法を利用し得る。次いで、採取した細胞を培地に希釈148するのが好ましい。培地は、ナイト(Knight’s)改変またはF12Kと称されることもあるハム(Ham’s)F−12を含み得る。この細胞希釈液を24ウエルプレートに1ウエル当たり1,500細胞で再培養150し得る。次いで、未使用細胞を75cm2フラスコに入れ得る。24ウエルプレートは約2日間継続培養152し得る。継続培養152の完了後、シリアンゴールデンハムスター由来培養膵ベータ細胞を、それぞれ陽性および陰性コントロールとしてのトルブタミド154およびDMSO156に暴露し、さらに、フェヌグリーク種子エキスの濃縮液158にも暴露し得る。
【0079】
図8を参照すると、準備手順140に従って培養し、1ml当たり15mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子エキス由来生物活性化合物の組成物濃縮液に暴露した後で評価したシリアンゴールデンハムスター由来膵ベータ細胞を用いて実施した試験の結果を表すグラフが示されている。プロットから分るように、0時に成分を添加した後、インスリンレベルは徐々に上昇して40分時でピークに達し、次いで、成分添加前に測定したインスリンレベルまで低下する。図8に示され、かつ当業者には分るように、実験にわたるシリアンゴールデンハムスターの膵ベータ細胞におけるインスリン活性レベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物が動物被験体のインスリンレベルに影響を与えることを示唆している。
【0080】
実施例II
[シリアンゴールデンハムスターにおけるフェヌグリーク種子エキス − 60mg/ml]
先の実施例1に記載され、かつ図7に図解されているように、準備手順140を用いて
、シリアンゴールデンハムスター由来の膵ベータ細胞を培養、採取、評価した。図9を参照すると、略グラフがこの試験の結果を説明している。準備手順140に従って、シリアンゴールデンハムスター由来の膵ベータ細胞を培養し、1ml当たり60mgのフェヌグリーク種子エキスの生物活性成分(例えば、Promilin(商標))の濃縮液に暴露後評価した。図に示されているように、生物活性化合物の濃度が高くなればなるほど、インスリン分泌がより大きく促進された。図に示され、かつ当業者には分るように、実験にわたるシリアンゴールデンハムスターの膵ベータ細胞におけるインスリン活性についての測定結果は、この生物活性成分が動物被験体のインスリンレベルに影響を与えることを示唆している。
【0081】
本発明の準備手順140の好ましい実施形態に従って培養し、フェヌグリーク種子調製プロセス10に従って調製したフェヌグリーク種子エキス由来の生物活性化合物組成物(例えば、Promilin(商標))の濃縮液に暴露後評価したシリアンゴールデンハムスター由来の膵ベータ細胞を用いて実施した試験は、本発明の精神および範囲に一致する本発明を実践するためのさまざまな実施形態に適用するように設定し得ることは容易に理解される。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造または方法を限定するものとみなされるべきではない。
【0082】
実施例III
[ヒトにおける非脱苦味フェヌグリーク種子エキス − 1mg4−ヒドロキシイソロイシン/kg]
図10〜図19を全体的に参照すると、糖尿病または炭水化物代謝不全歴を有していない3人の健康なヒト男性被験者で試験が行われた。試験には2つの手順が含まれていた。第1手順では、被験者を一晩絶食させた。グルコースおよびインスリンレベルを測定するために、試験の30分前、0分、15分、30分、60分、120分および180分時点で被験者から血液サンプルを採取した。0時に、水300ml中グルコース75gの溶液を被験者に投与した。モンタナ大学薬学部(School of Pharmacy at University of Montana)でラジオイムノアッセイ〔Radioimmunassay(RIA)〕を用いて各血液サンプルのインスリン含有量を測定した。血液サンプル試験の結果は、図10〜図12のグラフに「プラセボ部分」データポイントとして要約されている。当業者には分るように、このタイプの試験は、糖尿病や妊娠性糖尿病の診断に用いられる経口グルコース負荷試験(OGTT)に類似している。本発明の好ましい実施形態において、第1手順は、血中グルコースのベースライン値およびインスリン活性の濃度を定量化する制御機構としての役割を果たす。
【0083】
第2手順は第1手順と同一条件下に実施した。唯一の違いは、3人のヒト被験者に、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))を投与したことである。再度、図10〜図19を参照すると、活性溶液は、水300ml中75gのグルコースと共に、被験者の体重1kg当たり1〜9mgの4−ヒドロキシイソロイシンのフェヌグリークエキス(例えば、Promilin(商標))用量を含んでいた。第2手順の結果は、図10〜図19に「活性部分」データポイントとして要約されている。
【0084】
本発明の1つの好ましい実施形態において、ヒト個体に、体重1kg当たり1mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含む一連の20種のアミノ酸を含有する独特な生物活性非脱苦味フェヌグリーク種子エキス組成物(例えば、Promilin(商標))を投与した。得られた組成物を第1ヒト被験者に投与した。
【0085】
特に図10を参照すると、プロット図は第1ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結
果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり1mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価非脱苦味フェヌグリーク種子生物活性化合物エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含有していた。
【0086】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第1ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))がヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第1ヒト被験者のインスリン活性レベルは生物活性化合物を含有する活性溶液に対して高くなったが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0087】
図11を参照すると、プロット図は、第2ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり1mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度のフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物組成物(例えば、Promilin(商標))の独特な高力価非脱苦味エキスを含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0088】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第2ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))がヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第2ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性化合物を含有する活性溶液の投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0089】
フェヌグリーク種子調製プロセスに従って調製したフェヌグリーク種子エキス由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))に暴露した結果を評価するために第1および第2ヒト被験者で実施した試験は、本発明の精神および範囲に合致する本発明を実施するためのさまざまな実施形態に適用するように設定または改変し得ることが容易に分る。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造または方法を限定するものではないとみなされるべきである。
【0090】
実施例IV
[ヒトにおける脱苦味フェヌグリーク種子エキス − 4mgの4−ヒドロキシイソロイシン/kg]
図12で分るように、プロット図は、第1ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0091】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第1ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第1ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第1ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性化合物を含有する活性溶液投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0092】
図13を参照すると、プロット図は、第2ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果
を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0093】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第2ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第2ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第2ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性化合物を含有する活性溶液投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0094】
1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの脱苦味エキスを用いる本発明の別の好ましい実施形態が図14にグラフで示されている。図示されているように、プロット図は、第1ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の別の実施形態を含んでいた。
【0095】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第1ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第1ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第1ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性化合物を含有する活性溶液投与後の測定では高くなったが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0096】
図15を参照すると、プロット図は、1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの脱苦味エキスを用いた第2ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の別の実施形態を含んでいた。
【0097】
図に示されているように、実験にわたる第2ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第2ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第2ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性化合物を含有する活性溶液投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0098】
本発明の好ましい実施形態または別の好ましい実施形態のフェヌグリーク種子調製プロセスに従って調製したフェヌグリーク種子エキス由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))に暴露した結果を評価するために第1および第2ヒト被験者で実施した試験は、本発明の精神および範囲に合致する本発明を実施するためのさまざまな実施形態に適用するように設定または改変し得ることが容易に分る。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造または方法を限定するものではないとみなされるべきである。
【0099】
実施例V
[ヒトにおける非脱苦味フェヌグリーク種子エキス − 4mgの4−ヒドロキシイソロイシン/kg]
図16を参照すると、プロット図は、第1ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物非脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0100】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第1ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第1ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第1ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性成分を含有する活性溶液に対して上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0101】
図17に示されているプロット図は、第2ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物非脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0102】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第2ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第2ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第2ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性成分を含有する活性溶液投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0103】
本発明の好ましい実施形態または別の好ましい実施形態のフェヌグリーク種子調製プロセスに従って調製したフェヌグリーク種子エキス由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))に暴露した結果を評価するために第1および第2ヒト被験者で行った試験は、本発明の精神および範囲に一致する本発明を実施するためのさまざまな実施形態に適用するように設定または改変し得ることが容易に分る。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造または方法を限定するものではないとみなされるべきである。
【0104】
実施例VI
[ヒトにおける脱苦味フェヌグリーク種子エキス − 9mgの4−ヒドロキシイソロイシン/kg]
図18を参照すると、プロット図は、第1ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり9mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0105】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第1ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルについて行われた測定の結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第1ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第1ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性成分を含有する活性溶液に対して上昇したが、グル
コースレベルは低くなることが容易に分る。
【0106】
図19を参照すると、プロット図は、第3ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり9mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0107】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第3ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第3ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第3ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性成分を含有する活性溶液投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0108】
本発明の好ましい実施形態または別の好ましい実施形態のフェヌグリーク種子調製プロセスに従って調製したフェヌグリーク種子エキス由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))に暴露した結果を評価するために第1および第3ヒト被験者で実施した試験は、本発明の精神および範囲に合致する本発明を実施するためのさまざまな実施形態に適用するように設定または改変し得ることが容易に分る。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造または方法に限定されないものとみなされるべきである。
【0109】
さらに、本発明のフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の新規な組成物は、経口、非経口、舌下、局所、経皮、筋内、または吸入投与が可能であり、さらに、採択される投与形態に応じて選択される賦形剤を含み得ることが理解されよう。また、個体に投与されるエキス組成物の投与量は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、いくつかの考慮すべきことがらに基いて様々であってよく、したがって、治療すべき対象個体の特定のケースによって決められる。
【0110】
上記説明から、本発明は、グルコース応答性インスリンレベルの上昇を促進し、インスリン感受性を高め、グルコース輸送因子4の機能を促進し得るフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の独特な組成物および抽出分離法を提供することが理解されよう。好ましい設計において、フェヌグリーク種子由来生物活性化合物の独特な抽出分離法は、経済的かつ効率的に生産される高力価かつ高品質エキス収量をもたらす。
【0111】
従来技術とは異なり、本発明は、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレート、トリメチルヒスチジン、およびEtOH NH2を含むがそれらには限定されないフェヌグリーク由来生物活性化合物の独特な組成物および抽出分離法を提供する。フェヌグリーク種子から抽出されたこれらの新規な組成物は、単独で、グルコース輸送タンパク質を刺激し、筋肉へのグルコース輸送を促進することができるし、あるいは、インスリンと相乗作用して、グルコース輸送タンパク質を刺激し、筋肉へのグルコース輸送を促進することができる。
【0112】
本発明は、その精神または本質的特性を逸脱することなく、他の特定の形態で具現化し得る。記載されている実施形態は、すべての点で、説明に役立つものであって、制限的なものではないとみなされるべきである。したがって、本発明の範囲は、上述の説明によってではなく、添付特許請求の範囲によって示される。添付特許請求の範囲の均等物の意味
および範囲内に含まれる変更はすべて特許請求の範囲内に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【0113】
【図1】フェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物を得るステップと、骨格筋グルコース輸送を促進するステップと、体重管理を実施するステップとを含む、筋肉細胞へのグルコース輸送およびその後のグルコース代謝を促進して体重管理するための本発明の方法の1つの好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図2】フェヌグリーク種子調製ステップ、一次抽出ステップおよび二次抽出ステップを含む本発明のフェヌグリーク種子由来生物活性成分抽出法の1つの好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図3】水中でフェヌグリーク種子を浸漬するステップと浸漬フェヌグリーク種子を粉砕するステップとを含む、図2に示されている本発明のフェヌグリーク種子調製ステップの1つの好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図4】調製フェヌグリーク種子を溶媒Iに暴露して第1種子残滓および種子エキスを得るステップと、回収した種子残滓を溶媒IIに暴露して第2種子残滓および濃縮エキスを得るステップと、さらに真空下に濃縮、冷却、沈降させて、粗タンパク質沈殿物と上清を得るステップと、上清を脱イオン水で希釈するステップとを含む、図2に示されている本発明の一次注出ステップの1つの好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図5】約20〜40%の総タンパク質を含むさまざまなアミノ酸と、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンとを含有する生物活性化合物の組成物を得るための、高多孔質で非極性または弱極性の溶イオン交換樹脂による樹脂濾過ステップと、脱イオン水洗浄ステップと、10〜90%エタノールを用いた連続エタノール処理ステップと、流出物回収ステップと、6標準(N)塩酸(HCl)によりpHを1〜6.5に調節するステップと、0.1〜1Nアンモニア溶液処理ステップと、流出物回収ステップと、真空濃縮ステップと、脱イオン水希釈ステップと、脱アミノ化成ステップと、乾燥ステップとを含む、図2に示されている二次抽出ステップの別の好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図6】約20〜40%の総タンパク質を含むさまざまなアミノ酸と、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンとを含有する生物活性化合物の組成物を得るための、6N HClによるpH1〜6.5調節ステップと、高多孔質かつ非極性または弱極性陽イオン交換樹脂による樹脂濾過ステップと、脱イオン水による洗浄ステップと、0.5〜2Nアンモニア溶液による処理ステップと、流出物および酸性部分回収ステップと、真空下酸性部分濃縮ステップと、脱アミノ化成ステップと、乾燥ステップとを含む、図2に示されている二次抽出ステップの別の好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図7】シリアンゴールデンハムスター〔メソクリセタス・アウラタス(Mesocricetus auratus)〕由来膵ベータ(β)細胞を培養する本発明方法の1つの好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図8】1ミリリットル(ml)当たり15ミリグラム(mg)の濃度のフェヌグリーク種子由来生物活性成分の組成物に暴露したシリアンゴールデンハムスター由来培養膵ベータ細胞を用いて実施した試験の結果を示すグラフ。
【図9】図8の表に示されている試験結果と類似の結果をもたらす、1ml当たり60mgの濃度のフェヌグリーク種子由来生物活性成分の組成物を用いた試験の結果を示すグラフ。
【図10】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第1ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり1mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【図11】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第2ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり1mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【図12】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第1ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【図13】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第2ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【図14】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第1ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の脱苦味エキス組成物の効果を説明する別のプロット図を示すグラフ。
【図15】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第2ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の脱苦味エキス組成物の効果を説明する別のプロット図を示すグラフ。
【図16】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第1ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するさらに別のプロット図を示すグラフ。
【図17】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第2ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するさらに別のプロット図を示すグラフ。
【図18】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第1ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり9mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【図19】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第3ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり9mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【技術分野】
【0001】
本発明は、代謝に影響を与える方法および組成物、より具体的に言えば、動物およびヒトのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援するフェヌグリーク種子由来の生物活性成分の新規な組成物およびその抽出法に関する。
【背景技術】
【0002】
フェヌグリークは、最古の薬草で、南西ヨーロッパ、北アフリカおよび西アジア原産であるが、世界の他の地域で広く栽培されている。フェヌグリークは、マメ(Fabaceae)科の学名トリゴネラ・フェヌム・グラエクム(Trigonella foenum−graecum)として知られており、一般にグリークヘイと称されている。当業者には分るように、フェヌグリークはマメ科野菜であり、通常、約0.6096〜0.9144m(2〜3フィート)の高さに生長し、薄緑色の葉と小さな白い花をつける。フェヌグリーク種子のさやには、10〜20個の小さく平たい黄褐色の種子が入っている。通常、植物種子は、種皮と呼ばれ、しばしば種子殻と称される軟または硬外殻を付けて形成される。種子殻の内部には、植物胚と、胚を取り囲む胚乳と称される栄養組織とがある。フェヌグリーク種子胚は成熟過程で胚乳を消費する。フェヌグリーク種子は、多くの場合、刺激香を有し、セロリに似ていると言われる苦味を有し得る。
【0003】
フェヌグリークは、長い間アジアや地中海地方で薬草や調味料として用いられてきた。フェヌグリーク植物の種子は、例えば、鉄、ビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、リン酸、フラボノイド、サポニン、トリゴネリンおよび他のアルカロイドなどの多くの薬用活性化合物を含むと考えられている。フェヌグリークは、胃強壮薬として、また腹部の病気の治療薬として用いられている。欧米の科学研究により、フェヌグリーク種子の化学分析と共に、フェヌグリーク種子からの4−ヒドロキシイソロイシンの抽出の見通しが得られ、フェヌグリークのいくらかの臨床的有用性が示唆された。
【0004】
エル フォウデン卿(Sir L.Fowden)は、フェヌグリーク分析の研究を行った。ファウデン卿は、フェヌグリークからの4−ヒドロキシイソロイシンの単離、精製を教示し、4−ヒドロキシイソロイシンがフェヌグリーク種子に含まれている主要な遊離アミノ酸であると主張した(例えば、非特許文献1参照)。従来技術をさらに調べると、フェヌグリーク種子のアミノ酸が栄養価を有し得ることが示唆されている(例えば、非特許文献2参照)。当業者により、フェヌグリーク種子のステロイドサポゲニン含有量の分析における分光測光法も教示されており、そのような従来技術法は、一般に、脱脂フェヌグリークのサブフラクションの組成を調べる研究に用い得る(例えば、非特許文献3参照)。さらに、当業者は、フェヌグリーク種子からアミノ酸4−ヒドロキシイソロイシンを抽出するのにクロロホルムを使用している(例えば、非特許文献4参照)。しかし、クロロホルムは有毒であり、一般に、食品医薬品業界で定められている基準下では抽出法として許容されないことが判明している。
【0005】
フェヌグリーク種子からは他の化合物も単離されている。主要異性体(2S,3R,4S)−4−ヒドロキシイソロイシンに加えて、微量異性体4−ヒドロキシイソロイシンおよびアミノ酸(リシン、ヒスチジンおよびアルギニン)が単離されている。その後の研究で、フェヌグリーク種子中の4−ヒドロキシイソロイシンが2種のジアステレオ異性体として存在することが確認されている:主要ジアステレオ異性体は(2S,3R,4S)形配置で、4−ヒドロキシイソロイシンの総含有量の約90%を占め、微量ジアステレオ異性体は(2R,3R,4S)形配置である(例えば、非特許文献5参照)。
【0006】
当業者には分るように、主要異性体(2S,3R,4S)は、グルコース依存的に膵ベータ細胞刺激に直接影響を与えることによりマイクロモル濃度でグルコース応答性インスリン分泌を促進する能力を示す実験的証拠に関して現在関心を集めている。さらに、4−ヒドロキシイソロイシンは、相互作用して、相加的インスリン分泌増強効果(すなわち、過剰なグルコース濃度の存在下においてのみ、インスリンの分泌および活性を刺激するか、影響を与えること)を誘発し得る(例えば、非特許文献6参照)。さらに、従来技術を調べると、ラット、イヌおよびヒトの膵組織で実施された高血糖、糖尿および高脂質血症状におけるフェヌグリークサブフラクションの使用を調べる臨床研究が開示されている(例えば、非特許文献7〜10参照)。当業者には分るように、フェヌグリークに関して実施された臨床研究は、フェヌグリーク種子の特定のサブフラクション(例えば、種皮および胚乳)の調査、または糖尿病またはコレステロール疾患を有する動物およびヒトにおける4−ヒドロキシイソロイシンの特異的効果に集中している。
【0007】
さらに、種々の研究により、4−ヒドロキシイソロイシンの天然類似体は抗糖尿病薬として合成物より効果が高いことが証明されている。したがって、4−ヒドロキシイソロイシンの治療効果はフェヌグリーク種子のエキス(抽出物)から最も良く得られることが示唆される。しかし、フェヌグリーク種子を栄養補給用の原料源として使用することにはいくつかの問題がある。例えば、そのような問題または不都合な点の1つは、治療効果および他の栄養効果を得るためには、通常、大量のフェヌグリーク種子が必要であるという事実に由来する。患者または消費者は、脱脂種子や苦味を消した(de−bitterized、以下「脱苦味」とする)種子でさえ食事に取り入れるのを好まないことが多い。非脱脂種子を大量に摂取すると、軽度の胃腸異常が生じ得る。フェヌグリーク種子は繊維を多く含んでいるために、長期にわたって大量に摂取すると、腸内ガスや下痢などの副作用が生じ得る。
【0008】
また、フェヌグリーク種子中の繊維の結合能力も、栄養素、特にミネラルの利用可能性に影響を与え得る。フェヌグリーク種子を外用すると、不快な皮膚反応が生じ得ることが理解されよう。したがって、フェヌグリーク種子またはその一部の摂取に由来する不快な副作用を回避し得るように、フェヌグリーク種子から生物活性治療化合物を得る方法を提供することは技術的な進歩であろう。
【0009】
上述の研究調査中に、当業者は、フェヌグリーク種子から4−ヒドロキシイソロイシンを抽出する粗抽出法を開発した。これらの従来技術法および抽出技術は、主として、4−ヒドロキシイソロイシンの「高純度」エキスを得ることに集中している。例えば、吸着クロマトグラフィーを用いた4−ヒドロキシイソロイシンの抽出は当業では公知である。しかし、そのような従来技術法は、極く少量の4−ヒドロキシイソロイシンしか生成しない傾向があり、通常、小規模実験室用にしか適していない。先に説明したように、当業者が用いている代替抽出法は、フェヌグリーク種子から4−ヒドロキシイソロイシンを抽出するのにクロロホルムなどの毒性有機溶媒を使用するので、消費者に対して固有の不利点を持つと考えられる。したがって、当業者には容易に分るように、フェヌグリーク種子から4−ヒドロキシイソロイシンおよび他の生物活性成分を抽出するためのより安全かつより工業的に実行可能な方法が求められている。
【非特許文献1】フォウデンら(Fowden et al),Phytochemistry,第12巻: p.1707(1973 年)
【非特許文献2】ソヴェールら(Sauvaire et al),Nutr Rep Int., 第14巻: p.527(1976年)
【非特許文献3】バクーら(Baccou et al),Analyst, 第102 巻:p.458(1977 年)
【非特許文献4】アルコックら(Alcock et al),Phytochemistry,第28巻(7): p.1835(1989年)
【非特許文献5】アルコック(Alcock),Phytochemistry,第28巻:p.1835(1989年)
【非特許文献6】ソヴェールら(Sauvaire et al),Daibetes,第47巻: p.206(1998年)
【非特許文献7】シャニら(Shani et al),Arch Intern Phamacodyn Ther,第210 巻:p.27(1974年)
【非特許文献8】リベスら(Ribes et al),Ann Nutr Metab, 第28巻:p.37(1984年)
【非特許文献9】ヴァレットら(Valette et al),Athersclerosis, 第50巻:p.105 (1984年)
【非特許文献10】マダール(Madar),Nutr Rep Int, 第29巻:p.1267(1984年)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明の主な目的は、グルコース応答性インスリンレベル上昇を促進し得るフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
本発明の他の目的は、インスリン感受性を高め得るフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
【0011】
本発明のさらに他の目的は、グルコース輸送因子4の機能を刺激し得るフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
また、本発明の目的は、効率的な数のステップを含み、経済的に生産されるフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
【0012】
さらに、本発明の目的は、高効力エキスの産生を提供するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、高量のエキス収量を提供するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
【0013】
本発明の別の目的は、約10〜70%のエキス正味収量を提供するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、アミノ酸、タンパク質および4−ヒドロキシイソロイシンを含むがそれらには限定されない生物活性化合物プロファイルを生成するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することである。
【0014】
本発明のさらに他の目的は、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレート、トリメチルヒスチジン、およびEtOH NH2を含むがそれらには限定されないフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物を提供することである。
【0015】
さらに、本発明の目的は、抗過血糖性であるフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することである。
また、本発明の目的は、単独で、グルコース輸送タンパク質を刺激し、グルコースの筋肉細胞への輸送を促進し得るフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することである。
【0016】
本発明の他の目的は、インスリンと相乗作用して、グルコース輸送タンパク質を刺激し、グルコースの筋肉への輸送を促進するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することである。
【0017】
本発明のさらに他の目的は、グルコースおよび炭水化物の代謝を支援するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出分離法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0018】
上記目的に合致し、かつ本明細書で具現化かつ広義に記載されている本発明に従って、本発明の1つの好ましい実施形態は、グルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を促進、支援するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物および抽出法を含む。具体的に言えば、フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物の1つの好ましい実施形態は、インスリンと相乗作用するか、単独で作用して、骨格筋細胞上に位置するGT−4受容体を刺激し得る。そのようにして単離された組成物は、一般に、アミノ酸とタンパク質とからなる。本発明の1つの好ましい実施形態においては、例えば、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレート、トリメチルヒスチジン、およびEtOH NH2を含む生物活性化合物の組成物の単離に特に重点が置かれる。
【0019】
本発明の上記および他の目的は、添付図面と併せて、以下の説明および添付特許請求の範囲から、さらに十分に明らかにされるであろう。これらの図面が本発明の代表的な実施形態のみを示すものであり、したがって、本発明の範囲を限定するものでないとの了解のもとで、添付図面を用いて、本発明をさらに具体的かつ詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【0020】
本明細書に一般的に記載され、図面に例示されている本発明の構成要素は、多岐にわたる異なる配置で配列、設計し得る。本明細書に記載されている本発明の本質的特性を逸脱することなく細部を種々に変更し得ることが当業者には勿論分るであろう。したがって、図1〜図19に示されている本発明の組成物および方法の実施形態についての以下のより詳細な説明は、権利請求されている本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の好ましい実施形態を代表するものにすぎない。
【0021】
本発明の好ましい実施形態は、全体を通して同じ部分が同じ番号で指定されている図面を参照すると最も良く理解されるであろう。
用語「糖尿病」とは、単独で用いられる場合、最も一般的には真性糖尿病(diabetes mellitus)を指す。真性糖尿病は、一般に、糖が適切に分解されず、身体が利用することができない炭水化物代謝障害と言われている。炭水化物代謝障害は、通例、適切なインスリン分泌の欠如に関連し得る。当業者には分るように、インスリンは、ランゲルハンス島のベータ細胞として知られている特定膵細胞によって分泌される。インスリンは、膵臓から分泌され、体中を移動して、糖代謝を調節する、より厳密に言えば、血流中のグルコースレベルを調節する。具体的に言えば、インスリンは数種の細胞表面受容体と相互作用する。そのような受容体ファミリーの1つはグルコース輸送(GT)受容体と呼ばれている。1〜7(GT−1〜7)と称される少なくとも7種のGT受容体ファミリーサブタイプが当業者により同定されている。
【0022】
多くの非糖尿病個体は、生存期間中にグルコースおよび炭水化物の正常代謝に有意に影響を与え得る栄養および代謝不全を経験し得る。例えば、個体のなかにはインスリン抵抗性を発現し得るものがある。これらの個体は、通例、糖代謝に困難を有するが、真性糖尿病個体のレベルには至っていない。一般に「X症候群」として知られている上記症状の一例は、高血中グルコースレベルと特に腹部での脂肪沈着とを特徴とし得る。高血中グルコースレベルの1つの症状は、高血糖性または高血糖症と称されることがある。栄養および代謝不全を経験している非糖尿病個体の場合、体内のグルコースおよび他の炭水化物の正常代謝を促進、支援することが有利であろう。グルコースおよび炭水化物代謝の促進および支援は、存在するインスリンと相乗作用してグルコースおよび他の炭水化物代謝を調節
する組成物を投与するか、あるいは、インスリンとは無関係にグルコースおよび他の炭水化物代謝を調節する組成物を投与することにより達成し得る。
【0023】
本発明者らによる臨床研究は、4−ヒドロキシイソロイシンと1種以上のアミノ酸とを特定濃度で含有する、フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の新規組成物が、骨格筋細胞上のグルコース輸送因子4(GT−4)の存在に応答してグルコースの骨格筋細胞への輸送を有効に促進することを示唆している。GT−4に関する細胞挙動がインスリンに関する細胞挙動と極めて強力に相関することは十分に立証されている。したがって、フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物がヒト骨格筋へのグルコース輸送の促進に用い得るという支持できる指摘は本発明の最も重要な点である。
【0024】
さらに、4−ヒドロキシイソロイシンと一連の他のアミノ酸とを含むフェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の新規組成物は、グルコースおよび他の炭水化物と結合して、グルコースもしくは他の炭水化物のボーラス投与に関連する生理応答を変えるか、特異的生理応答を生成させ得る。生理応答には、グルコース腸吸収の増強、膵ベータ細胞の刺激およびグルコースまたは他の炭水化物除去の促進が含まれる。
【0025】
このように、本発明の新規組成物および方法は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物エキスがインスリンに対する身体応答を促進する傾向を有し、その結果として、骨格筋へのグルコース輸送の増進が、肝臓や脂肪組織に沈着したグルコースを減少させ、それによって脂肪沈着を減少させるのに有効であるという前述の事項を支援する。
【0026】
全体として5で示されている本発明の体重管理診断および解決法の1つの好ましい実施形態は、図1に最も正確に図解されている。示されているように、フェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物の使用を意図する体重管理法は、(1)グルコースおよび炭水化物の正常代謝に影響を与える栄養および代謝不全を経験している個体の体重管理分析を実施するステップ6と、(2)フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出することによりフェヌグリーク種子抽出を実施するステップ10と、(3)フェヌグリーク種子エキス組成物の送達によって対象個体内の骨格筋グルコース輸送を促進するステップ8とを含み得る。
【0027】
体重管理実施ステップ6には、対象個体のインスリン分泌不良、インスリン非感受性またはインスリン抵抗性症状の診断が含まれる。診断ステップは肥満症などの症状を見分けるステップをさらに含み得る。さらに、本発明で意図されている体重管理実施ステップ6は、さらに、1種以上のフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物の定期的投与および対象個体の運動習慣および食事の変更指示を含み得る。
【0028】
フェヌグリーク種子抽出ステップ10は、設定比率に基いて4−ヒドロキシイソロイシンと一連の他のアミノ酸とを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物を抽出するステップを含む。さらに、フェヌグリーク種子抽出ステップ10は、対象消費者による消費用にフェヌグリーク種子エキスを包装または調整するステップを含み得る。例えば、フェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物エキスは、固体(すなわち、ピル、粉剤、錠剤もしくはカプセル)として包装、呈示するか、または液体、懸濁液などの形態で調剤し得る。フェヌグリーク種子エキスの新規組成物を得るステップは、さらに、このエキスが、消費者の体内に導入されたときに標的組織に効率的に到達するように、組成物エキスを修飾またはコンディショニングするステップを含み得る。本発明の1つの好ましい実施形態において、フェヌグリーク種子抽出法は、全体として10で示され、図2に最も正確に図解され、以下にさらに詳細に説明されている。
【0029】
引き続き図1を参照すると、1種以上の新規フェヌグリーク種子エキス組成物の送達に
よって対象個体体内の骨格筋グルコース輸送を促進するステップ8は、フェヌグリーク種子エキスがグルコースおよび炭水化物の輸送および代謝を促進、支援するように、ある形態のエキス組成物を摂取または投与(例えば、非経口投与)して、組成物を個体組織に到達させ得るステップを意図している。以下に説明するように、投与組成物中の生物活性化合物の濃度が高くなればなるほどインスリン分泌がより大きく促進されるが、これは、ヒトのインスリン分泌促進における本発明の新規組成物およびその製造法の有効性を示している。
【0030】
本明細書に記載され、本発明の精神および範囲に一致する発明原理に基いて、さまざまな他の体重管理実施法6、フェヌグリーク種子抽出実施法10、および対象個体内の骨格筋グルコース輸送促進法8を実施し得ることは明らかであろう。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための任意の特定の方法、技術、ステップまたはステップの順序を限定するものではないとみなされるべきである。
【0031】
フェヌグリーク種子から、4−ヒドロキシイソロイシンと一連の他のアミノ酸とを含む生物活性化合物の組成物を抽出するための本発明方法の1つの好ましい実施形態は、図2に最も正確に図解されている。フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出する方法10は、(1)フェヌグリーク種子を調製するステップ15と、(2)一次抽出プロセスを実施するステップ20と、(3)二次抽出プロセスを実施するステップ25とを含むのが好ましい。当業者には分るように、この抽出法が、フェヌグリーク種子からそれらの有用な生物活性化合物をもっと最適に抽出するために他のステップを含み得ることは勿論である。
【0032】
図2および図3を参照すると、フェヌグリーク種子調製ステップ15は、(1)フェヌグリーク種子を用意するステップ40と、(2)フェヌグリーク種子を浸漬させるステップ42と、(3)フェヌグリーク種子を粉砕するステップ44とを含み得る。浸漬ステップは、通常、種子を水中に指定時間にわたって浸すステップを含む。水の分離特性を提供し得る他の方法を用いてもよい。種子が浸漬されたら、種子粉砕ステップ44で種子の種々の部分を効率的に分離する。例えば、粉砕ステップ44は、種子の種皮48と称される厚または硬外殻を、胚乳46として知られている種子の内部から分離し得る。当然のことながら、胚乳46は植物胚を取り囲む栄養組織である。
【0033】
図2および図4を参照すると、調製ステップ15の結果として生じる胚乳46および種皮48から一次抽出プロセスを実施するステップ20は、溶媒(溶媒I)を用いた抽出ステップ50を含み得る。例えば、溶媒Iとしては、ヘキサン、シクロヘキサン、エーテルまたはそれらの任意の組み合わせなどの化合物があり得る。本発明で意図されている抽出ステップ50は、種子を効率的に脱脂する。したがって、一次抽出プロセス20を実施した後、その生成物は「脱脂された」とみなされる。抽出ステップ50は、さらに、調製した種子と溶媒Iとの組み合わせを繰返し加熱するステップを含み得る。本発明の1つの好ましい実施形態において、種子と溶媒Iとの組み合わせは、3回、約20〜90℃の範囲の温度に加熱し得る。より好ましくは、種子と溶媒Iとの組み合わせを、3回、約65〜70℃の範囲の温度に加熱し得る。調製した種子と溶媒Iとの組み合わせは、所望の結果を達成するのに十分な時間上記高温に維持し得る。本発明の1つの好ましい実施形態において、調製した種子と溶媒Iとの組み合わせは、約1〜3時間高温に維持される。その結果として、抽出ステップ50により、通常、種子エキス52と種子残滓53とが生じる。
【0034】
特に図4を参照すると、フェヌグリーク種子残滓53に対して蒸留濃縮ステップ54を実施し得る。当然のことながら、蒸留濃縮ステップ54は、フェヌグリーク種子からエキスを蒸留濃縮するさまざまな従来法を利用し得る。例えば、精留塔を用いて第1溶媒で連
続抽出して得た種子残滓を蒸留するステップは、種子残滓を沸騰するまで加熱し、加熱蒸気を捕捉、冷却することにより達成し得る。蒸留濃縮ステップ54は、回収された溶媒Iと共に、フェヌグリーク種子オイル、ジオスゲニン、フェヌグリークイソフラボン、フェヌグリークサポニン、および水溶性繊維、例えばガラクトマナンなどの量56をもたらし得る。
【0035】
濃縮種子エキスに対して、溶媒(溶媒II)を用いた抽出ステップ60を実施し得る。溶媒IIは、エタノールまたはエタノールと類似の化学特性を有する溶媒を含有する溶液であるのが好ましい。抽出ステップ60に用いられるエタノールの濃度はさまざまな値を有し得る。例えば、エタノール濃度は、約10〜95%の範囲の値内でさまざまであってよい。本発明の1つの好ましい実施形態において、抽出ステップ60は、さらに、種子エキス52と溶媒IIとの組み合わせを繰返し加熱するステップを含み得る。この組み合わせは、3回、約20〜90℃の範囲の温度に加熱するのが好ましい。より好ましくは、種子エキス52と溶媒IIとの組み合わせは、3回、約65〜70℃の範囲の温度に加熱し得る。本発明の1つの好ましい実施形態において、種子エキス52と溶媒IIとの組み合わせは、所望の結果を達成するのに十分な広範囲の時間、上記高温に維持し得る。例えば、種子エキス52と溶媒IIとの組み合わせは、約1〜3時間高温に維持し得る。この関連で、抽出ステップ60は、通常、種子残滓62と濃縮種子エキス64とをもたらす。
【0036】
一次抽出プロセス20に関連する追加ステップは、濃縮種子エキス64に対して実施される濃縮ステップ66を含み得る。濃縮ステップ66は、真空を用いて、溶媒68と濃縮物70の量を分離するのが好ましい。次いで、分離された濃縮物70を冷却沈降ステップ72にかけて、粗タンパク質を含む沈殿物74と、上清76とを得る。次いで、上清76を希釈ステップ78にかけて、希釈上清80を得る。当然のことながら、希釈ステップ78は脱イオン水の添加を含み得る。添加される水の量はさまざまであってよい。例えば、本発明の希釈ステップ78の1つの好ましい実施形態において添加される水の量は、上清76の量の約2〜10倍であってよい。次いで、希釈後、希釈上清70を、図2、図5および図6に図解されている二次抽出プロセス25にかける。
【0037】
本明細書に記載され、本発明の精神および範囲に一致する発明原理に基づいて、一次抽出プロセス20のさまざまな他の方法およびステップを実施し得ることは明らかであろう。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための任意の特定の方法、技術、ステップまたはステップの順序を限定するものではないとみなされるべきである。
【0038】
図2および図5を参照すると、一次抽出プロセス20の結果として生成された、希釈された上清80は二次抽出プロセス25にかけるのが好ましい。本発明の1つの好ましい実施形態において、二次抽出プロセス25は、希釈上清80のpHを調節するステップ100を含み得る。希釈上清80のpH調節ステップ100にはさまざまな溶液を使用し得る。例えば、塩酸を用い得るが、それには限定されない。pH調節溶液の成分濃度はさまざまな値を有し得る。当然のことながら、希釈上清80のpHは所望の結果を達成するのに十分な任意の範囲の値に調節し得る。したがって、塩酸溶液は、希釈上清80のpHを約1〜6.5の範囲のpHに調節し得る。
【0039】
次いで、pHが調節された希釈上清80を、陽イオン交換樹脂濾過ステップ104にかけ得る。1つの好ましい実施形態において、濾過ステップ104は、pH調節済上清80を樹脂中に流すステップを含み得る。陽イオン交換樹脂は、通常、高多孔質であり、弱極性または非極性であり得る。次いで、処理された樹脂を、樹脂を水洗するステップを含み得る洗浄ステップ108にかけ得る。さらに、樹脂を連続アンモニア溶液処理ステップ112にかけ、その後に酸回収ステップ116が行なわれる。連続アンモニア処理ステップ
112では、さまざまなアンモニア溶液の使用が考えられる。1つの好ましい実施形態において、アンモニア溶液はアンモニウム水などを含む。当然のことながら、溶液の成分濃度はさまざまな値を有し得る。例えば、アンモニウム水の濃度は約0.1〜1Nの範囲、好ましくは約0.3Nであってよい。
【0040】
連続アンモニア溶液処理ステップ112の非酸性流出物117は、保存されてて、生物活性を有する栄養素、例えば、ジオスゲニン、サポニン、フラボノイド、および水溶性繊維、例えばガラクトマンナンなどの分離に用られ得る。酸回収ステップ116の後、酸性部分に対して濃縮ステップ118を実施するのが好ましい。当然のことながら、濃縮ステップ118は真空の使用を含み得る。
【0041】
本発明の二次抽出プロセス25の1つの好ましい実施形態において、フェヌグリーク種子調製プロセス10のこれまでのステップ中に形成されたアンモニアを実質的に除去するために脱アンモニア化成(de−ammonification)ステップ120を組み込み得る。当業者には分るように、脱アンモニア化成ステップ120は、さまざまな従来法を用いて実施し得る。そのような方法の一例は、HDP100カラムなどの高多孔質で非極性のカラムを利用し得る。脱アンモニア化成ステップ120の完了後、4−ヒドロキシイソロイシンと一連の他のアミノ酸とを含有するフェヌグリーク種子調製物から抽出された生物活性化合物の組成物は脱苦味エキスと称され得る。
【0042】
脱アンモニア化成後、乾燥ステップ124を用いて、有用な化合物を有する最終生成物126を得る。当業者には分るように、乾燥ステップ124は、さまざまな方法、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、または真空乾燥を利用し得る。通常、調製フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、生成物収量(product yield)126)は、タンパク質とアミノ酸を共に含んでいる。より具体的に言えば、生成物収量126は、約10〜70%の割合の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%の割合の一連の他のアミノ酸で構成された他のタンパク質とを含有するフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物を含んでいるのが好ましい。したがって、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物は、約10〜90%の割合のアミノ酸を含有し得る。
【0043】
本明細書に記載され、本発明の精神および範囲に一致する発明原理に基いて二次抽出プロセス25のさまざまな他の方法またはステップを実施し得ることは明らかであろう。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための任意の特定の方法、技術、ステップまたはステップの順序を限定するものではないとみなされるべきである。
【0044】
図6を参照すると、本発明の二次抽出プロセス125の別の好ましい実施形態が示されている。具体的に言えば、一次抽出プロセス20の結果として生成された希釈上清80を二次抽出プロセス125にかけるのが好ましい。本発明の1つの好ましい実施形態において、二次抽出ステップ25は、陽イオン交換樹脂濾過ステップ130を含み得る。濾過ステップ130は、希釈上清80を樹脂上または樹脂中に流すように意図されている。樹脂は、適当な形状に形成され、高多孔質、かつ弱極性または非極性であるのが好ましい。次いで、処理された樹脂を、樹脂を水洗するステップを含み得る洗浄ステップ108にかける。
【0045】
1つの好ましい実施形態において、陽イオン交換樹脂を連続エタノール処理ステップ134にかけ得る。樹脂をエタノールで処理するステップ134は、樹脂上に溶媒溶液を繰返し流すステップを含み得る。溶媒中のエタノールの濃度は、通常、溶媒溶液を1回流す毎に増大される。当業者には分るように、連続エタノール処理ステップ134では、さまざまな適当な物質の利用が考えられる。例えば、エタノールまたは生物活性成分の抽出に
エタノールと同じように用いられる溶媒を使用し得る。
【0046】
酸回収ステップ138は、サポニンやフラボノイドなどの生物活性を有する栄養素を回収するために連続エタノール処理ステップ134におけるどの回の処理直後にも実施し得る。通常、最終エタノール処理後に回収される流出物138は、最高濃度の溶媒を利用し、本発明のさらなる処理のために回収される。
【0047】
さらに、流出物138をpH調節ステップ100にかけ得る。流出物138のpHを調節するステップ100では、さまざまな溶液を利用し得る。例えば塩酸を使用し得るが、それには限定されない。pH調節溶液の成分濃度はさまざまな値を有し得る。当然のことながら、回収流出物138のpHは所望の結果を達成するのに十分な範囲内の任意の値に調節し得る。したがって、塩酸溶液は、流出物138のpHを約1〜6.5の範囲に調節し得る。
【0048】
次いで、pH調節溶液を陽イオン交換樹脂濾過ステップ104にかけ得る。1つの好ましい実施形態において、濾過ステップ104は、pH調節溶液を、イオン交換特性を有する陽イオン交換樹脂上または樹脂中に流すステップを含む。樹脂は高多孔質かつ弱極性または非極性であるのが好ましい。処理された樹脂は、後に酸回収ステップ116が続き得る連続アンモニア溶液処理ステップ112にかけ得る。連続アンモニア処理ステップ112では、さまざまなアンモニア溶液の使用が考えられる。1つの好ましい実施形態において、アンモニア溶液はアンモニウム水などを含む。当然のことながら、アンモニア溶液の成分の濃度はさまざまな値を有し得る。例えば、アンモニウム水の濃度は、約0.1〜1Nの範囲、好ましくは約0.3Nであってよい。
【0049】
連続アンモニア溶液処理ステップ112の非酸性流出物217は、保存して、生物活性を有する栄養素、例えば、ジオスゲニン、サポニン、フラボノイド、および水溶性繊維、例えばガラクトマンナンなどの単離に用い得る。酸回収ステップ116の後、酸性部分に対して濃縮ステップ118を実施するのが好ましい。当然のことながら、濃縮ステップ118は真空の利用を含み得る。
【0050】
本発明の二次抽出プロセス125の1つの好ましい実施形態において、フェヌグリーク種子調製プロセス10の前のステップ中に形成されたアンモニアを実質的に除去するために脱アンモニア化成ステップ120を組み込み得る。当然のことながら、脱アンモニア化成ステップ120はさまざまな従来法を用いて実施し得る。そのような方法の一例は、高多孔質で非極性びカラム、例えばHDP 100カラムを利用し得る。脱アンモニア化成ステップ120の完了後、4−ヒドロキシイソロイシンと一連の他のアミノ酸とを含有するフェヌグリーク種子調製物から抽出された生物活性化合物の組成物は脱苦味エキスと称され得る。
【0051】
脱アンモニア化成後、有用化合物を有する最終生成物126を得るために乾燥ステップ124を利用し得る。当業者には分るように、乾燥ステップ124は、さまざまな方法、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、または真空乾燥を利用し得る。通常、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、生成物収量126)は、タンパク質とアミノ酸とを共に含んでいる。4−ヒドロキシイソロイシンはそのようなアミノ酸の1種である。より具体的に言えば、生成物収量126は、約10〜70%の割合の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%の割合の一連の他のアミノ酸で構成された他のタンパク質とを含有するフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物を含んでいるのが好ましい。
【0052】
本明細書に記載され、本発明の精神および範囲に一致する発明原理に基いて二次抽出プ
ロセス125のさまざまな他の方法およびステップを実施し得ることは明らかであろう。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための任意の特定の方法、技術、ステップまたはステップの順序を限定するものではないとみなされるべきである。
【0053】
当業者には分るように、本発明の新規組成物のアミノ酸およびタンパク質含有量を定量化するためにメソッド・バリデーション・プログラムを利用し得る。フェヌグリーク中の4−ヒドロキシイソロイシンと他のアミノ酸の割合の測定は、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)装置を用いて実施し得る。本発明において意図されているように、メソッド・バリデーション・プログラムには、蛍光検出器およびプログラム可能オートサンプラーを備えたHPLC装置を利用し得る。クロマトグラフィーカラムは、Zorbax Stable Bond SB−C18(4.6*150mm、5μm)であってよい。さらに、HPLC装置は、0.1mgまで測定可能な化学天秤、超音波浴、容量フラスコ、0.2μm膜付き2リットル真空濾過ガラス器、可変容量ピペット、ならびに電磁攪拌器および攪拌子を有し得る。
【0054】
メソッド・バリデーション・プログラムの試薬は、例えば、(1)メタノール(HPLCグレード)、(2)アセトニトリル(HPLCグレード)、(3)酢酸ナトリウム三水和物(ARグレード)、(4)トリエチルアミン(ARグレード)、(5)氷酢酸(ARグレード)、(6)テトラフラン(ARグレード)、(7)OPA試薬〔ホウ酸緩衝液中にo−フタルジアルデヒドおよび3−メルカプトプロピオン酸を含有、アジレント社(Agilent Co.)Part No.5061−3335〕、(8)4−ヒドロキシイソロイシン標準品〔ブリティッシュ アグリカルチュラル ラブ社(British Agricultural Lab)から取得〕、および(9)脱イオン水を含み得る。
【0055】
メソッド・バリデーション・プログラムの1つの好ましい実施形態は、移動相ステップ、標準調製ステップ、およびサンプル調製ステップを含み得る。移動相ステップでは、緩衝液A、緩衝液B、および濾過/脱気ステップを用い得る。緩衝液Aは、1リットルビーカー中で調製し得、ビーカー中で、1.36gの酢酸ナトリウム三水和物を500mlの水に溶かし得る。この組み合わせを完全に溶けるまで攪拌し得る。90μlのトリエチルアミンを加えて、混合し得る。1〜2%の酢酸溶液を加えてpHを約7.2に調節し得る。次いで、1.5mlのテトラフランを加えて混合し得る。最終混合物を「緩衝液A」と標識し得る。
【0056】
緩衝液Bは、以下の手順に従って形成し得る。ビーカー中で、1.36gの酢酸ナトリウム三水和物を100mlの水に溶解し得る。この組み合わせを完全に溶けるまで攪拌し得る。1〜2%の酢酸溶液を加えてpHを7.2に調節し得る。次いで、ビーカーに200mlのメタノールと200mlのアセトニトリルを加えて十分に混合し得る。最終混合物を「緩衝液B」と標識し得る。緩衝液は、真空および0.2μmの膜を用いて濾過、脱気するのが好ましい。
【0057】
本発明の1つの好ましい実施形態において、メソッド・バリデーション・プログラムの標準調製ステップは、約10mlの参照化合物を正確に秤量するステップと、参照化合物を50ml容量フラスコに入れるステップとを含み得る。約30mlの脱イオン水を用いて参照化合物を溶解し、約10分間超音波分解し得る。好ましくはフラスコを室温に冷ましてから、水で特定濃度に希釈し、十分に混合する。次いで、標準調製物をパラフィルムで密閉し、必要なときまで冷蔵保存し得る。
【0058】
メソッド・バリデーション・プログラムのサンプル調製ステップは、フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物約25mgを正確に秤量するステップと、この
組成物を50ml溶量フラスコ中で約30mlの脱イオン水に溶かすステップと、約10分間超音波分解するステップとを含み得る。好ましくはフラスコを室温に冷ましてから、溶液を水で特定濃度に希釈し、十分に混合し得る。サンプル調製物はHPLC装置に注入する前に濾過し得る。
【0059】
メソッド・バリデーション・プログラムの1つの好ましい実施形態用のクロマトグラフィー条件は、例えば、Zorbax Stable Bond SB−C18カラム、30℃のカラム温度、およびEX 340nM、EM 450クロマトグラフィー検出器を含み得る。以下の勾配および注入プログラムを利用し得る。
【0060】
勾配:
【表1】
【0061】
注入プログラム:
【表2】
【0062】
メソッド・バリデーション・プログラムの特異性は、同定ピークのスペクトルを調べて実行し得る。このピークは、サンプルと参照標準のスペクトルを示し得る。メソッド・バリデーション・プログラムの直線性は、4−ヒドロキシイソロイシンの標準調製物を調製して解析し、メソッド・バリデーション・プログラムで指示されているようにアッセイし得る。そのような直線性の1つに着手し、以下の結果が観察された。
【0063】
【表3】
相関係数は満足(r>0.99950)であり、これらのデータは本発明のメソッド・バリデーション・プログラムが良好な直線性を有することを示している。
【0064】
メソッド・バリデーション・プログラムは、所望により、試験サンプルに関して実施される6種の別個の試験により解析され得る。そのような精度解析の1つに着手し、以下の結果が観察された。
【0065】
【表4】
【0066】
【表5】
【0067】
【表6】
これらの結果から、相対標準偏差(RSD)は<3%である。上記に基き、本発明のメソッド・バリデーション・プログラムは、サンプルに関して良好な精度を達成した。
【0068】
メソッド・バリデーション・プログラムを実施し、連続2日間、多重HPLCアッセイにより同一サンプルを試験して再現精度について分析した。以下の結果が観察された。
【0069】
【表7】
【0070】
【表8】
RSDは、本発明のメソッド・バリデーション・プログラムが良好な再現精度を有することを示す<3%である。
【0071】
メソッド・バリデーション・プログラムを実施し、スパイクして回収したサンプル分析物と、スパイクして回収した標準分析物とを用いて回収率と正確さについて分析した。以下の結果が観察された。
【0072】
【表9】
これらの上記データは、本発明のメソッド・バリデーション・プログラムが良好な正確さを有することを立証している。
【0073】
本発明のメソッド・バリデーション・プログラムの上記結果に基き、本発明のフェヌグリーク種子調製プロセス10に従って抽出したフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物を含む2つのロットを分析すると、以下の結果が観察され得る。
【0074】
【表10】
【0075】
シリアンゴールデンハムスターの膵組織に関して実施した試験の結果を表すグラフデータを示す図7〜図9と、ヒト被験者に関して実施した臨床試験の結果を表すグラフデータを示す図10〜図19とを参照すると、本明細書に開示されている好ましい方法に従って抽出したフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の新規組成物は、単独でGT−4を刺激するだけでなく、インスリンと相乗作用してGT−4を刺激することにより、グルコースおよび炭水化物の代謝を効率的に促進かつ支援することを示すデータが存在する。
【0076】
以下の実施例は、本発明の実践をさらに詳細に示すであろう。本明細書の実施例に一般的に説明かつ例示されている本発明の以下の方法、製剤、および新規高力価生物活性フェヌグリーク種子エキス組成物は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造またはプロセスを限定するものとみなされるべきではない。したがって、実施例I〜VIに示されている本発明の方法、製剤および組成物の好ましい実施形態についての以下のより詳細な説明は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲を限定するようには意図されておらず、本発明の好ましい実施形態を代表するものに過ぎない。
【0077】
実施例I
[シリアンゴールデンハムスター − 15mg/ml]
本発明のフェヌグリーク種子調製プロセス10の好ましい実施形態に従って、フェヌグリーク種子から独特な高力価生物活性エキスを調製する。より具体的に言えば、プロセス10の生成物収量から、1ml当たり15mgの4−ヒドロキシイソロイシン濃縮液を調製する。この濃縮液を、シリアンゴールデンハムスターの膵臓ランゲルハンス島ベータ細胞であるイン・ビトロ細胞系:HIT−T15に投与し、インスリン活性の経時的濃度変化を評価する。
【0078】
図7を参照すると、シリアンゴールデンハムスター由来の細胞培養物を調製し、培養膵ベータ細胞におけるフェヌグリークエキスの生物活性を評価する手順140が図解されている。本発明の1つの好ましい実施形態において、HIT−T15由来の細胞培養物を得142、増殖培地を除去し、約0.05%のトリプシンと0.53mMのEDTAを含有する約4mlの溶液を加え、約5秒間ゆっくり洗浄して、細胞を継代培養144し得る。溶液を除去し、4mlの新鮮溶液を加え得る。細胞は約37℃で約7分間培養し得る。分離後、当業者には自明の方法で、採取した細胞を計数146する。そのような方法の一例は、血球計を用いたトリプタンブルー(Tryptan Blue)除去法を利用し得る。次いで、採取した細胞を培地に希釈148するのが好ましい。培地は、ナイト(Knight’s)改変またはF12Kと称されることもあるハム(Ham’s)F−12を含み得る。この細胞希釈液を24ウエルプレートに1ウエル当たり1,500細胞で再培養150し得る。次いで、未使用細胞を75cm2フラスコに入れ得る。24ウエルプレートは約2日間継続培養152し得る。継続培養152の完了後、シリアンゴールデンハムスター由来培養膵ベータ細胞を、それぞれ陽性および陰性コントロールとしてのトルブタミド154およびDMSO156に暴露し、さらに、フェヌグリーク種子エキスの濃縮液158にも暴露し得る。
【0079】
図8を参照すると、準備手順140に従って培養し、1ml当たり15mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子エキス由来生物活性化合物の組成物濃縮液に暴露した後で評価したシリアンゴールデンハムスター由来膵ベータ細胞を用いて実施した試験の結果を表すグラフが示されている。プロットから分るように、0時に成分を添加した後、インスリンレベルは徐々に上昇して40分時でピークに達し、次いで、成分添加前に測定したインスリンレベルまで低下する。図8に示され、かつ当業者には分るように、実験にわたるシリアンゴールデンハムスターの膵ベータ細胞におけるインスリン活性レベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物が動物被験体のインスリンレベルに影響を与えることを示唆している。
【0080】
実施例II
[シリアンゴールデンハムスターにおけるフェヌグリーク種子エキス − 60mg/ml]
先の実施例1に記載され、かつ図7に図解されているように、準備手順140を用いて
、シリアンゴールデンハムスター由来の膵ベータ細胞を培養、採取、評価した。図9を参照すると、略グラフがこの試験の結果を説明している。準備手順140に従って、シリアンゴールデンハムスター由来の膵ベータ細胞を培養し、1ml当たり60mgのフェヌグリーク種子エキスの生物活性成分(例えば、Promilin(商標))の濃縮液に暴露後評価した。図に示されているように、生物活性化合物の濃度が高くなればなるほど、インスリン分泌がより大きく促進された。図に示され、かつ当業者には分るように、実験にわたるシリアンゴールデンハムスターの膵ベータ細胞におけるインスリン活性についての測定結果は、この生物活性成分が動物被験体のインスリンレベルに影響を与えることを示唆している。
【0081】
本発明の準備手順140の好ましい実施形態に従って培養し、フェヌグリーク種子調製プロセス10に従って調製したフェヌグリーク種子エキス由来の生物活性化合物組成物(例えば、Promilin(商標))の濃縮液に暴露後評価したシリアンゴールデンハムスター由来の膵ベータ細胞を用いて実施した試験は、本発明の精神および範囲に一致する本発明を実践するためのさまざまな実施形態に適用するように設定し得ることは容易に理解される。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造または方法を限定するものとみなされるべきではない。
【0082】
実施例III
[ヒトにおける非脱苦味フェヌグリーク種子エキス − 1mg4−ヒドロキシイソロイシン/kg]
図10〜図19を全体的に参照すると、糖尿病または炭水化物代謝不全歴を有していない3人の健康なヒト男性被験者で試験が行われた。試験には2つの手順が含まれていた。第1手順では、被験者を一晩絶食させた。グルコースおよびインスリンレベルを測定するために、試験の30分前、0分、15分、30分、60分、120分および180分時点で被験者から血液サンプルを採取した。0時に、水300ml中グルコース75gの溶液を被験者に投与した。モンタナ大学薬学部(School of Pharmacy at University of Montana)でラジオイムノアッセイ〔Radioimmunassay(RIA)〕を用いて各血液サンプルのインスリン含有量を測定した。血液サンプル試験の結果は、図10〜図12のグラフに「プラセボ部分」データポイントとして要約されている。当業者には分るように、このタイプの試験は、糖尿病や妊娠性糖尿病の診断に用いられる経口グルコース負荷試験(OGTT)に類似している。本発明の好ましい実施形態において、第1手順は、血中グルコースのベースライン値およびインスリン活性の濃度を定量化する制御機構としての役割を果たす。
【0083】
第2手順は第1手順と同一条件下に実施した。唯一の違いは、3人のヒト被験者に、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))を投与したことである。再度、図10〜図19を参照すると、活性溶液は、水300ml中75gのグルコースと共に、被験者の体重1kg当たり1〜9mgの4−ヒドロキシイソロイシンのフェヌグリークエキス(例えば、Promilin(商標))用量を含んでいた。第2手順の結果は、図10〜図19に「活性部分」データポイントとして要約されている。
【0084】
本発明の1つの好ましい実施形態において、ヒト個体に、体重1kg当たり1mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含む一連の20種のアミノ酸を含有する独特な生物活性非脱苦味フェヌグリーク種子エキス組成物(例えば、Promilin(商標))を投与した。得られた組成物を第1ヒト被験者に投与した。
【0085】
特に図10を参照すると、プロット図は第1ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結
果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり1mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価非脱苦味フェヌグリーク種子生物活性化合物エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含有していた。
【0086】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第1ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))がヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第1ヒト被験者のインスリン活性レベルは生物活性化合物を含有する活性溶液に対して高くなったが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0087】
図11を参照すると、プロット図は、第2ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり1mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度のフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物組成物(例えば、Promilin(商標))の独特な高力価非脱苦味エキスを含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0088】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第2ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))がヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第2ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性化合物を含有する活性溶液の投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0089】
フェヌグリーク種子調製プロセスに従って調製したフェヌグリーク種子エキス由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))に暴露した結果を評価するために第1および第2ヒト被験者で実施した試験は、本発明の精神および範囲に合致する本発明を実施するためのさまざまな実施形態に適用するように設定または改変し得ることが容易に分る。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造または方法を限定するものではないとみなされるべきである。
【0090】
実施例IV
[ヒトにおける脱苦味フェヌグリーク種子エキス − 4mgの4−ヒドロキシイソロイシン/kg]
図12で分るように、プロット図は、第1ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0091】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第1ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第1ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第1ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性化合物を含有する活性溶液投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0092】
図13を参照すると、プロット図は、第2ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果
を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0093】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第2ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第2ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第2ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性化合物を含有する活性溶液投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0094】
1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの脱苦味エキスを用いる本発明の別の好ましい実施形態が図14にグラフで示されている。図示されているように、プロット図は、第1ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の別の実施形態を含んでいた。
【0095】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第1ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第1ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第1ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性化合物を含有する活性溶液投与後の測定では高くなったが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0096】
図15を参照すると、プロット図は、1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの脱苦味エキスを用いた第2ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の別の実施形態を含んでいた。
【0097】
図に示されているように、実験にわたる第2ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第2ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第2ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性化合物を含有する活性溶液投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0098】
本発明の好ましい実施形態または別の好ましい実施形態のフェヌグリーク種子調製プロセスに従って調製したフェヌグリーク種子エキス由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))に暴露した結果を評価するために第1および第2ヒト被験者で実施した試験は、本発明の精神および範囲に合致する本発明を実施するためのさまざまな実施形態に適用するように設定または改変し得ることが容易に分る。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造または方法を限定するものではないとみなされるべきである。
【0099】
実施例V
[ヒトにおける非脱苦味フェヌグリーク種子エキス − 4mgの4−ヒドロキシイソロイシン/kg]
図16を参照すると、プロット図は、第1ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物非脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0100】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第1ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第1ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第1ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性成分を含有する活性溶液に対して上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0101】
図17に示されているプロット図は、第2ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物非脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0102】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第2ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第2ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第2ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性成分を含有する活性溶液投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0103】
本発明の好ましい実施形態または別の好ましい実施形態のフェヌグリーク種子調製プロセスに従って調製したフェヌグリーク種子エキス由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))に暴露した結果を評価するために第1および第2ヒト被験者で行った試験は、本発明の精神および範囲に一致する本発明を実施するためのさまざまな実施形態に適用するように設定または改変し得ることが容易に分る。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造または方法を限定するものではないとみなされるべきである。
【0104】
実施例VI
[ヒトにおける脱苦味フェヌグリーク種子エキス − 9mgの4−ヒドロキシイソロイシン/kg]
図18を参照すると、プロット図は、第1ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり9mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0105】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第1ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルについて行われた測定の結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第1ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第1ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性成分を含有する活性溶液に対して上昇したが、グル
コースレベルは低くなることが容易に分る。
【0106】
図19を参照すると、プロット図は、第3ヒト被験者のプラセボ部分と活性部分の結果を示している。活性部分は、水300ml中75gのグルコースと共に、体重1kg当たり9mgの4−ヒドロキシイソロイシンの濃度の独特な高力価フェヌグリーク種子生物活性化合物脱苦味エキス(例えば、Promilin(商標))を含む本発明の1つの好ましい実施形態を含んでいた。
【0107】
グラフ図に示されているように、実験にわたる第3ヒト被験者におけるインスリン活性およびグルコースレベルの測定結果は、フェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))が第3ヒト被験者のインスリンおよびグルコースレベルに影響を与えることを示唆している。0時後、第3ヒト被験者のインスリン活性レベルは、生物活性成分を含有する活性溶液投与後の測定では投与前レベルより著しく上昇したが、グルコースレベルは低くなることが容易に分る。
【0108】
本発明の好ましい実施形態または別の好ましい実施形態のフェヌグリーク種子調製プロセスに従って調製したフェヌグリーク種子エキス由来の生物活性化合物の組成物(例えば、Promilin(商標))に暴露した結果を評価するために第1および第3ヒト被験者で実施した試験は、本発明の精神および範囲に合致する本発明を実施するためのさまざまな実施形態に適用するように設定または改変し得ることが容易に分る。したがって、本明細書に提供されている実施例は、本発明の原理を代表するものであって、それらの原理を実践するための特定の構造または方法に限定されないものとみなされるべきである。
【0109】
さらに、本発明のフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の新規な組成物は、経口、非経口、舌下、局所、経皮、筋内、または吸入投与が可能であり、さらに、採択される投与形態に応じて選択される賦形剤を含み得ることが理解されよう。また、個体に投与されるエキス組成物の投与量は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、いくつかの考慮すべきことがらに基いて様々であってよく、したがって、治療すべき対象個体の特定のケースによって決められる。
【0110】
上記説明から、本発明は、グルコース応答性インスリンレベルの上昇を促進し、インスリン感受性を高め、グルコース輸送因子4の機能を促進し得るフェヌグリーク種子由来の生物活性化合物の独特な組成物および抽出分離法を提供することが理解されよう。好ましい設計において、フェヌグリーク種子由来生物活性化合物の独特な抽出分離法は、経済的かつ効率的に生産される高力価かつ高品質エキス収量をもたらす。
【0111】
従来技術とは異なり、本発明は、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレート、トリメチルヒスチジン、およびEtOH NH2を含むがそれらには限定されないフェヌグリーク由来生物活性化合物の独特な組成物および抽出分離法を提供する。フェヌグリーク種子から抽出されたこれらの新規な組成物は、単独で、グルコース輸送タンパク質を刺激し、筋肉へのグルコース輸送を促進することができるし、あるいは、インスリンと相乗作用して、グルコース輸送タンパク質を刺激し、筋肉へのグルコース輸送を促進することができる。
【0112】
本発明は、その精神または本質的特性を逸脱することなく、他の特定の形態で具現化し得る。記載されている実施形態は、すべての点で、説明に役立つものであって、制限的なものではないとみなされるべきである。したがって、本発明の範囲は、上述の説明によってではなく、添付特許請求の範囲によって示される。添付特許請求の範囲の均等物の意味
および範囲内に含まれる変更はすべて特許請求の範囲内に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【0113】
【図1】フェヌグリーク種子由来生物活性化合物の組成物を得るステップと、骨格筋グルコース輸送を促進するステップと、体重管理を実施するステップとを含む、筋肉細胞へのグルコース輸送およびその後のグルコース代謝を促進して体重管理するための本発明の方法の1つの好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図2】フェヌグリーク種子調製ステップ、一次抽出ステップおよび二次抽出ステップを含む本発明のフェヌグリーク種子由来生物活性成分抽出法の1つの好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図3】水中でフェヌグリーク種子を浸漬するステップと浸漬フェヌグリーク種子を粉砕するステップとを含む、図2に示されている本発明のフェヌグリーク種子調製ステップの1つの好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図4】調製フェヌグリーク種子を溶媒Iに暴露して第1種子残滓および種子エキスを得るステップと、回収した種子残滓を溶媒IIに暴露して第2種子残滓および濃縮エキスを得るステップと、さらに真空下に濃縮、冷却、沈降させて、粗タンパク質沈殿物と上清を得るステップと、上清を脱イオン水で希釈するステップとを含む、図2に示されている本発明の一次注出ステップの1つの好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図5】約20〜40%の総タンパク質を含むさまざまなアミノ酸と、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンとを含有する生物活性化合物の組成物を得るための、高多孔質で非極性または弱極性の溶イオン交換樹脂による樹脂濾過ステップと、脱イオン水洗浄ステップと、10〜90%エタノールを用いた連続エタノール処理ステップと、流出物回収ステップと、6標準(N)塩酸(HCl)によりpHを1〜6.5に調節するステップと、0.1〜1Nアンモニア溶液処理ステップと、流出物回収ステップと、真空濃縮ステップと、脱イオン水希釈ステップと、脱アミノ化成ステップと、乾燥ステップとを含む、図2に示されている二次抽出ステップの別の好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図6】約20〜40%の総タンパク質を含むさまざまなアミノ酸と、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンとを含有する生物活性化合物の組成物を得るための、6N HClによるpH1〜6.5調節ステップと、高多孔質かつ非極性または弱極性陽イオン交換樹脂による樹脂濾過ステップと、脱イオン水による洗浄ステップと、0.5〜2Nアンモニア溶液による処理ステップと、流出物および酸性部分回収ステップと、真空下酸性部分濃縮ステップと、脱アミノ化成ステップと、乾燥ステップとを含む、図2に示されている二次抽出ステップの別の好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図7】シリアンゴールデンハムスター〔メソクリセタス・アウラタス(Mesocricetus auratus)〕由来膵ベータ(β)細胞を培養する本発明方法の1つの好ましい実施形態を説明するプロセスフロー図。
【図8】1ミリリットル(ml)当たり15ミリグラム(mg)の濃度のフェヌグリーク種子由来生物活性成分の組成物に暴露したシリアンゴールデンハムスター由来培養膵ベータ細胞を用いて実施した試験の結果を示すグラフ。
【図9】図8の表に示されている試験結果と類似の結果をもたらす、1ml当たり60mgの濃度のフェヌグリーク種子由来生物活性成分の組成物を用いた試験の結果を示すグラフ。
【図10】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第1ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり1mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【図11】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第2ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり1mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【図12】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第1ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【図13】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第2ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【図14】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第1ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の脱苦味エキス組成物の効果を説明する別のプロット図を示すグラフ。
【図15】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第2ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の脱苦味エキス組成物の効果を説明する別のプロット図を示すグラフ。
【図16】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第1ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するさらに別のプロット図を示すグラフ。
【図17】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第2ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり4mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するさらに別のプロット図を示すグラフ。
【図18】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第1ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり9mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【図19】本発明の方法の1つの好ましい実施形態に従って実施した第3ヒト被験者のグルコース濃度およびインスリン濃度に及ぼす体重1kg当たり9mgの4−ヒドロキシイソロイシンを含有するフェヌグリーク種子由来生物活性化合物の非脱苦味エキス組成物の効果を説明するプロット図を示すグラフ。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
骨格筋細胞へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援するための生物活性化合物の組成物であって、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む組成物。
【請求項2】
生物活性化合物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項1に記載の組成物。
【請求項3】
生物活性化合物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項4】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項5】
骨格筋へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援するための生物活性化合物の組成物であって、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンを含む組成物。
【請求項6】
生物活性化合物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項5に記載の組成物。
【請求項7】
生物活性化合物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項8】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項9】
フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物を治療上有効量投与して、骨格筋細胞へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援する方法。
【請求項10】
グルコース応答性インスリンレベルを上昇させるステップをさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
インスリン感受性を高めるステップをさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項12】
グルコース輸送因子4の活性を刺激するステップをさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項13】
生物活性化合物の組成物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項9に記載の方法。
【請求項14】
経口、非経口、舌下、局所、経皮、筋内および吸入のうちから選択される方法で生物活性化合物の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項15】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜9mgである、請求項9に記載の方法。
【請求項16】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜4mgである、請求項9に記載の方法。
【請求項17】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約4mgである、請求項9に記載の方法。
【請求項18】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項19】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項20】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項21】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項22】
フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物を治療上有効量投与して体重管理を実施する方法。
【請求項23】
グルコース応答性インスリンレベルを上昇させるステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項24】
インスリン感受性を高めるステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項25】
グルコース輸送因子4の活性を刺激するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項26】
生物活性化合物の組成物がトリゴネラ・フェヌム・グラエクムから抽出される、請求項22に記載の方法。
【請求項27】
経口、非経口、舌下、局所、経皮、筋内および吸入のうちから選択される方法で生物活性化合物の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項28】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜9mgである、請求項22に記載の方法。
【請求項29】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜4mgである、請求項22に記載の方法。
【請求項30】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約4mgである、請求項22に記載の方法。
【請求項31】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項32】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項33】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項34】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項35】
フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出する方法であって、
複数個のフェヌグリーク種子を用意するステップと、
フェヌグリーク種子を調製するステップと、
フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出するステップとを含み、
前記生物活性化合物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む方法。
【請求項36】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項35に記載の方法。
【請求項37】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸とを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項38】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項39】
フェヌグリーク種子を調製するステップが、
フェヌグリーク種子を水中に浸漬するステップと、
フェヌグリーク種子を粉砕するステップと
をさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項40】
抽出ステップが、一次抽出プロセスを実施するステップと、二次抽出プロセスを実施す
るステップとをさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項41】
一次抽出プロセスが、
種子残滓と種子エキスとを得るために、調製したフェヌグリーク種子に対して、第1溶媒を用い、約1〜3時間にわたって約20〜90℃の温度での抽出を1回以上行なうステップと、
分別カラムを用い、種子残滓を沸騰するまで加熱し、種子残滓由来の加熱蒸気を捕捉、冷却して種子残滓を蒸留するステップと、
フェヌグリーク種子オイルと第1溶媒とを分離するために蒸留種子残滓を減圧下で濃縮するステップと、
第2種子残滓と濃縮種子エキスとを得るために、第2溶媒を用い、約1〜3時間にわたって約20〜90℃の温度で、種子エキスの抽出を1回以上行なうステップと、
第2溶媒から第2濃縮種子エキスを分離するために、濃縮種子エキスをさらに減圧下で濃縮するステップと、
第2濃縮種子エキスを室温に冷ますステップと、
第2濃縮種子エキスを沈殿させて粗タンパク質と上清とに分離するステップと、
上清を脱イオン水で上清容量の約2〜10倍に希釈するステップとを含む、請求項40に記載の方法。
【請求項42】
第2溶媒を用いて3回抽出を実施する、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
第1溶媒が有機溶媒を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項44】
有機溶媒は、ヘキサン、シクロヘキサンおよびエーテルのうちから選択し得る、請求項43に記載の方法。
【請求項45】
第2溶媒が水・アルコール混合物を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項46】
水・アルコール混合物が約10〜95%のエタノールである、請求項45に記載の方法。
【請求項47】
二次抽出プロセスが、
pH調節済上清を得るために、上清を酸で希釈して約1〜6.5のpH濃度に調節するステップと、
過剰な陽イオンを除去するために、pH調節済上清を陽イオン交換樹脂で濾過するステップと、
樹脂に結合したpH調節済上清から汚染物質を除去するために、陽イオン交換樹脂を洗浄するステップと、
樹脂結合pH調節済上清をアンモニア溶液で処理するステップと、
陽イオン交換樹脂から二次抽出生成物の酸性流出物と非酸性流出物とを回収するステップと、
汚染物質を分離するために酸性流出物を減圧下で濃縮するステップと、
二次抽出生成物から残留アンモニア溶液を除去するステップと、
4−ヒドロキシイソロイシンと1種以上のアミノ酸とを得るために二次抽出生成物を乾燥するステップとを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項48】
pH調節ステップが1Nの塩酸を含む、請求項47に記載の方法。
【請求項49】
陽イオン交換樹脂濾過ステップが、イオン交換特性を有する陽イオン交換樹脂にpH調節溶液を導入するステップをさらに含む、請求項47に記載の方法。
【請求項50】
洗浄ステップが、イオン交換特性を有する陽イオン交換樹脂に水を導入するステップをさらに含む、請求項47に記載の方法。
【請求項51】
アンモニア溶液処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮アンモニア溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項47に記載の方法。
【請求項52】
二次抽出プロセスが、
過剰な陽イオンを除去するために上清を陽イオン交換樹脂で濾過するステップと、
樹脂結合上清から汚染物質を除去するために、陽イオン交換樹脂を洗浄するステップと、
樹脂結合上清をエタノール処理により処理するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物を回収するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物を酸で希釈してpHを約1〜6.5に調節するステップと、
pH調節済二次抽出生成物を陽イオン交換樹脂で2回目の濾過にかけるステップと、
樹脂結合pH調節済二次抽出生成物をアンモニア溶液で処理するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物と非酸性流出物とを回収するステップと、
汚染物質を分離するために酸性流出物を減圧下で濃縮するステップと、
二次抽出生成物から残留アンモニア溶液を除去するステップと、
4−ヒドロキシイソロイシンと1種以上のアミノ酸とを得るために二次抽出生成物を乾燥するステップとを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項53】
陽イオン交換樹脂濾過ステップが、pH調節済上清を陽イオン交換樹脂に導入するステップをさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項54】
洗浄ステップが、陽イオン交換樹脂に水を導入するステップをさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項55】
エタノール処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮エタノール溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項56】
エタノール処理ステップが、エタノールに類似した化学特性を有する溶媒を含む、請求項52に記載の方法。
【請求項57】
pH調節ステップが6Nの塩酸を含む、請求項52に記載の方法。
【請求項58】
アンモニア溶液処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮アンモニア溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項59】
アンモニア溶液がアンモニウム水を含む、請求項52に記載の方法。
【請求項60】
アンモニウム水の濃度が約0.1〜約1Nである、請求項59に記載の方法。
【請求項61】
アンモニウム水の濃度が0.3Nである、請求項59に記載の方法。
【請求項62】
乾燥ステップが、噴霧乾燥、凍結乾燥、および真空乾燥のうちから選択される、請求項52に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
骨格筋細胞へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援するための生物活性化合物の組成物であって、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含み、前記生物活性化合物は、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む組成物。
【請求項2】
生物活性化合物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項1に記載の組成物。
【請求項3】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項4】
筋肉へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援するための生物活性化合物の組成物であって、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートを含む組成物。
【請求項5】
生物活性化合物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項4に記載の組成物。
【請求項6】
生物活性化合物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項4に記載の組成物。
【請求項7】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%
のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項4に記載の組成物。
【請求項8】
フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物を治療上有効量投与して、骨格筋細胞へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援する方法。
【請求項9】
グルコース応答性インスリンレベルを上昇させるステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
インスリン感受性を高めるステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項11】
グルコース輸送因子4の活性を刺激するステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項12】
生物活性化合物の組成物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項8に記載の方法。
【請求項13】
経口、非経口、舌下、局所、経皮、筋内および吸入のうちから選択される方法で生物活性化合物の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項14】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜9mgである、請求項8に記載の方法。
【請求項15】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜4mgである、請求項8に記載の方法。
【請求項16】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約4mgである、請求項8に記載の方法。
【請求項17】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項18】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項19】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項8に記載の方法。
【請求項20】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項21】
フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物を治療上有効量投与して体重管理を実施する方法であって、前記組成物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フ
ェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートからなる群から選択される1種以上のアミノ酸とを含む方法。
【請求項22】
グルコース応答性インスリンレベルを上昇させるステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
インスリン感受性を高めるステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項24】
グルコース輸送因子4の活性を刺激するステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項25】
生物活性化合物の組成物がトリゴネラ・フェヌム・グラエクムから抽出される、請求項21に記載の方法。
【請求項26】
経口、非経口、舌下、局所、経皮、筋内および吸入のうちから選択される方法で生物活性化合物の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項27】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜9mgである、請求項21に記載の方法。
【請求項28】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜4mgである、請求項21に記載の方法。
【請求項29】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約4mgである、請求項21に記載の方法。
【請求項30】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項31】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項32】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項33】
フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出する方法であって、
複数個のフェヌグリーク種子を用意するステップと、
フェヌグリーク種子を調製するステップと、
フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出するステップとを含み、
前記生物活性化合物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む方法。
【請求項34】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項35】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸とを含む、請求項33に記載の方法。
【請求項36】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートを含む、請求項33に記載の方法。
【請求項37】
フェヌグリーク種子を調製するステップが、
フェヌグリーク種子を水中に浸漬するステップと、
フェヌグリーク種子を粉砕するステップと
をさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項38】
抽出ステップが、一次抽出プロセスを実施するステップと、二次抽出プロセスを実施するステップとをさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項39】
一次抽出プロセスが、
種子残滓と種子エキスとを得るために、調製したフェヌグリーク種子に対して、第1溶媒を用い、約1〜3時間にわたって約20〜90℃の温度での抽出を1回以上行なうステップと、
分別カラムを用い、種子残滓を沸騰するまで加熱し、種子残滓由来の加熱蒸気を捕捉、冷却して種子残滓を蒸留するステップと、
フェヌグリーク種子オイルと第1溶媒とを分離するために蒸留種子残滓を減圧下で濃縮するステップと、
第2種子残滓と濃縮種子エキスとを得るために、第2溶媒を用い、約1〜3時間にわたって約20〜90℃の温度で、種子エキスの抽出を1回以上行なうステップと、
第2溶媒から第2濃縮種子エキスを分離するために、濃縮種子エキスをさらに減圧下で濃縮するステップと、
第2濃縮種子エキスを室温に冷ますステップと、
第2濃縮種子エキスを沈殿させて粗タンパク質と上清とに分離するステップと、
上清を脱イオン水で上清容量の約2〜10倍に希釈するステップとを含む、請求項38に記載の方法。
【請求項40】
第2溶媒を用いて3回抽出を実施する、請求項39に記載の方法。
【請求項41】
第1溶媒が有機溶媒を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項42】
有機溶媒は、ヘキサン、シクロヘキサンおよびエーテルのうちから選択し得る、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
第2溶媒が水・アルコール混合物を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項44】
水・アルコール混合物が約10〜95%のエタノールである、請求項43に記載の方法。
【請求項45】
二次抽出プロセスが、
pH調節済上清を得るために、上清を酸で希釈して約1〜6.5のpH濃度に調節するステップと、
過剰な陽イオンを除去するために、pH調節済上清を陽イオン交換樹脂で濾過するステップと、
樹脂に結合したpH調節済上清から汚染物質を除去するために、陽イオン交換樹脂を洗浄するステップと、
樹脂結合pH調節済上清をアンモニア溶液で処理するステップと、
陽イオン交換樹脂から二次抽出生成物の酸性流出物と非酸性流出物とを回収するステップと、
汚染物質を分離するために酸性流出物を減圧下で濃縮するステップと、
二次抽出生成物から残留アンモニア溶液を除去するステップと、
4−ヒドロキシイソロイシンと1種以上のアミノ酸とを得るために二次抽出生成物を乾燥するステップとを含む、請求項39に記載の方法。
【請求項46】
pH調節ステップが1Nの塩酸を含む、請求項45に記載の方法。
【請求項47】
陽イオン交換樹脂濾過ステップが、イオン交換特性を有する陽イオン交換樹脂にpH調節溶液を導入するステップをさらに含む、請求項45に記載の方法。
【請求項48】
洗浄ステップが、イオン交換特性を有する陽イオン交換樹脂に水を導入するステップをさらに含む、請求項45に記載の方法。
【請求項49】
アンモニア溶液処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮アンモニア溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項45に記載の方法。
【請求項50】
二次抽出プロセスが、
過剰な陽イオンを除去するために上清を陽イオン交換樹脂で濾過するステップと、
樹脂結合上清から汚染物質を除去するために、陽イオン交換樹脂を洗浄するステップと、
樹脂結合上清をエタノール処理により処理するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物を回収するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物を酸で希釈してpHを約1〜6.5に調節するステップと、
pH調節済二次抽出生成物を陽イオン交換樹脂で2回目の濾過にかけるステップと、
樹脂結合pH調節済二次抽出生成物をアンモニア溶液で処理するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物と非酸性流出物とを回収するステップと、
汚染物質を分離するために酸性流出物を減圧下で濃縮するステップと、
二次抽出生成物から残留アンモニア溶液を除去するステップと、
4−ヒドロキシイソロイシンと1種以上のアミノ酸とを得るために二次抽出生成物を乾燥するステップとを含む、請求項39に記載の方法。
【請求項51】
陽イオン交換樹脂濾過ステップが、pH調節済上清を陽イオン交換樹脂に導入するステップをさらに含む、請求項50に記載の方法。
【請求項52】
洗浄ステップが、陽イオン交換樹脂に水を導入するステップをさらに含む、請求項50に記載の方法。
【請求項53】
エタノール処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮エタノール溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項50に記載の方法。
【請求項54】
エタノール処理ステップが、エタノールに類似した化学特性を有する溶媒を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項55】
pH調節ステップが6Nの塩酸を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項56】
アンモニア溶液処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮アンモニア溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項50に記載の方法。
【請求項57】
アンモニア溶液がアンモニウム水を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項58】
アンモニウム水の濃度が約0.1〜約1Nである、請求項57に記載の方法。
【請求項59】
アンモニウム水の濃度が0.3Nである、請求項57に記載の方法。
【請求項60】
乾燥ステップが、噴霧乾燥、凍結乾燥、および真空乾燥のうちから選択される、請求項50に記載の方法。
【請求項1】
骨格筋細胞へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援するための生物活性化合物の組成物であって、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む組成物。
【請求項2】
生物活性化合物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項1に記載の組成物。
【請求項3】
生物活性化合物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項4】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項5】
骨格筋へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援するための生物活性化合物の組成物であって、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンを含む組成物。
【請求項6】
生物活性化合物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項5に記載の組成物。
【請求項7】
生物活性化合物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項8】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項5に記載の組成物。
【請求項9】
フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物を治療上有効量投与して、骨格筋細胞へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援する方法。
【請求項10】
グルコース応答性インスリンレベルを上昇させるステップをさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
インスリン感受性を高めるステップをさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項12】
グルコース輸送因子4の活性を刺激するステップをさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項13】
生物活性化合物の組成物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項9に記載の方法。
【請求項14】
経口、非経口、舌下、局所、経皮、筋内および吸入のうちから選択される方法で生物活性化合物の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項15】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜9mgである、請求項9に記載の方法。
【請求項16】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜4mgである、請求項9に記載の方法。
【請求項17】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約4mgである、請求項9に記載の方法。
【請求項18】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項19】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項20】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項21】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項9に記載の方法。
【請求項22】
フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物を治療上有効量投与して体重管理を実施する方法。
【請求項23】
グルコース応答性インスリンレベルを上昇させるステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項24】
インスリン感受性を高めるステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項25】
グルコース輸送因子4の活性を刺激するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項26】
生物活性化合物の組成物がトリゴネラ・フェヌム・グラエクムから抽出される、請求項22に記載の方法。
【請求項27】
経口、非経口、舌下、局所、経皮、筋内および吸入のうちから選択される方法で生物活性化合物の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項22に記載の方法。
【請求項28】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜9mgである、請求項22に記載の方法。
【請求項29】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜4mgである、請求項22に記載の方法。
【請求項30】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約4mgである、請求項22に記載の方法。
【請求項31】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項32】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項33】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項34】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項35】
フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出する方法であって、
複数個のフェヌグリーク種子を用意するステップと、
フェヌグリーク種子を調製するステップと、
フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出するステップとを含み、
前記生物活性化合物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む方法。
【請求項36】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項35に記載の方法。
【請求項37】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸とを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項38】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、γ−アミノブチレートおよびトリメチルヒスチジンを含む、請求項35に記載の方法。
【請求項39】
フェヌグリーク種子を調製するステップが、
フェヌグリーク種子を水中に浸漬するステップと、
フェヌグリーク種子を粉砕するステップと
をさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項40】
抽出ステップが、一次抽出プロセスを実施するステップと、二次抽出プロセスを実施す
るステップとをさらに含む、請求項35に記載の方法。
【請求項41】
一次抽出プロセスが、
種子残滓と種子エキスとを得るために、調製したフェヌグリーク種子に対して、第1溶媒を用い、約1〜3時間にわたって約20〜90℃の温度での抽出を1回以上行なうステップと、
分別カラムを用い、種子残滓を沸騰するまで加熱し、種子残滓由来の加熱蒸気を捕捉、冷却して種子残滓を蒸留するステップと、
フェヌグリーク種子オイルと第1溶媒とを分離するために蒸留種子残滓を減圧下で濃縮するステップと、
第2種子残滓と濃縮種子エキスとを得るために、第2溶媒を用い、約1〜3時間にわたって約20〜90℃の温度で、種子エキスの抽出を1回以上行なうステップと、
第2溶媒から第2濃縮種子エキスを分離するために、濃縮種子エキスをさらに減圧下で濃縮するステップと、
第2濃縮種子エキスを室温に冷ますステップと、
第2濃縮種子エキスを沈殿させて粗タンパク質と上清とに分離するステップと、
上清を脱イオン水で上清容量の約2〜10倍に希釈するステップとを含む、請求項40に記載の方法。
【請求項42】
第2溶媒を用いて3回抽出を実施する、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
第1溶媒が有機溶媒を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項44】
有機溶媒は、ヘキサン、シクロヘキサンおよびエーテルのうちから選択し得る、請求項43に記載の方法。
【請求項45】
第2溶媒が水・アルコール混合物を含む、請求項41に記載の方法。
【請求項46】
水・アルコール混合物が約10〜95%のエタノールである、請求項45に記載の方法。
【請求項47】
二次抽出プロセスが、
pH調節済上清を得るために、上清を酸で希釈して約1〜6.5のpH濃度に調節するステップと、
過剰な陽イオンを除去するために、pH調節済上清を陽イオン交換樹脂で濾過するステップと、
樹脂に結合したpH調節済上清から汚染物質を除去するために、陽イオン交換樹脂を洗浄するステップと、
樹脂結合pH調節済上清をアンモニア溶液で処理するステップと、
陽イオン交換樹脂から二次抽出生成物の酸性流出物と非酸性流出物とを回収するステップと、
汚染物質を分離するために酸性流出物を減圧下で濃縮するステップと、
二次抽出生成物から残留アンモニア溶液を除去するステップと、
4−ヒドロキシイソロイシンと1種以上のアミノ酸とを得るために二次抽出生成物を乾燥するステップとを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項48】
pH調節ステップが1Nの塩酸を含む、請求項47に記載の方法。
【請求項49】
陽イオン交換樹脂濾過ステップが、イオン交換特性を有する陽イオン交換樹脂にpH調節溶液を導入するステップをさらに含む、請求項47に記載の方法。
【請求項50】
洗浄ステップが、イオン交換特性を有する陽イオン交換樹脂に水を導入するステップをさらに含む、請求項47に記載の方法。
【請求項51】
アンモニア溶液処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮アンモニア溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項47に記載の方法。
【請求項52】
二次抽出プロセスが、
過剰な陽イオンを除去するために上清を陽イオン交換樹脂で濾過するステップと、
樹脂結合上清から汚染物質を除去するために、陽イオン交換樹脂を洗浄するステップと、
樹脂結合上清をエタノール処理により処理するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物を回収するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物を酸で希釈してpHを約1〜6.5に調節するステップと、
pH調節済二次抽出生成物を陽イオン交換樹脂で2回目の濾過にかけるステップと、
樹脂結合pH調節済二次抽出生成物をアンモニア溶液で処理するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物と非酸性流出物とを回収するステップと、
汚染物質を分離するために酸性流出物を減圧下で濃縮するステップと、
二次抽出生成物から残留アンモニア溶液を除去するステップと、
4−ヒドロキシイソロイシンと1種以上のアミノ酸とを得るために二次抽出生成物を乾燥するステップとを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項53】
陽イオン交換樹脂濾過ステップが、pH調節済上清を陽イオン交換樹脂に導入するステップをさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項54】
洗浄ステップが、陽イオン交換樹脂に水を導入するステップをさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項55】
エタノール処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮エタノール溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項56】
エタノール処理ステップが、エタノールに類似した化学特性を有する溶媒を含む、請求項52に記載の方法。
【請求項57】
pH調節ステップが6Nの塩酸を含む、請求項52に記載の方法。
【請求項58】
アンモニア溶液処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮アンモニア溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項52に記載の方法。
【請求項59】
アンモニア溶液がアンモニウム水を含む、請求項52に記載の方法。
【請求項60】
アンモニウム水の濃度が約0.1〜約1Nである、請求項59に記載の方法。
【請求項61】
アンモニウム水の濃度が0.3Nである、請求項59に記載の方法。
【請求項62】
乾燥ステップが、噴霧乾燥、凍結乾燥、および真空乾燥のうちから選択される、請求項52に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
骨格筋細胞へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援するための生物活性化合物の組成物であって、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含み、前記生物活性化合物は、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む組成物。
【請求項2】
生物活性化合物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項1に記載の組成物。
【請求項3】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項1に記載の組成物。
【請求項4】
筋肉へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援するための生物活性化合物の組成物であって、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートを含む組成物。
【請求項5】
生物活性化合物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項4に記載の組成物。
【請求項6】
生物活性化合物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項4に記載の組成物。
【請求項7】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%
のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項4に記載の組成物。
【請求項8】
フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物を治療上有効量投与して、骨格筋細胞へのグルコースおよび炭水化物の代謝および輸送を支援する方法。
【請求項9】
グルコース応答性インスリンレベルを上昇させるステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項10】
インスリン感受性を高めるステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項11】
グルコース輸送因子4の活性を刺激するステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項12】
生物活性化合物の組成物がフェヌグリーク種子(トリゴネラ・フェヌム・グラエクム)から抽出される、請求項8に記載の方法。
【請求項13】
経口、非経口、舌下、局所、経皮、筋内および吸入のうちから選択される方法で生物活性化合物の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項8に記載の方法。
【請求項14】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜9mgである、請求項8に記載の方法。
【請求項15】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜4mgである、請求項8に記載の方法。
【請求項16】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約4mgである、請求項8に記載の方法。
【請求項17】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項18】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項19】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項8に記載の方法。
【請求項20】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項21】
フェヌグリーク種子から抽出された生物活性化合物の組成物を治療上有効量投与して体重管理を実施する方法であって、前記組成物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フ
ェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートからなる群から選択される1種以上のアミノ酸とを含む方法。
【請求項22】
グルコース応答性インスリンレベルを上昇させるステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項23】
インスリン感受性を高めるステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項24】
グルコース輸送因子4の活性を刺激するステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項25】
生物活性化合物の組成物がトリゴネラ・フェヌム・グラエクムから抽出される、請求項21に記載の方法。
【請求項26】
経口、非経口、舌下、局所、経皮、筋内および吸入のうちから選択される方法で生物活性化合物の組成物を投与するステップをさらに含む、請求項21に記載の方法。
【請求項27】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜9mgである、請求項21に記載の方法。
【請求項28】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約1〜4mgである、請求項21に記載の方法。
【請求項29】
投与される生物活性化合物の組成物の治療上有効量が体重1kg当たり約4mgである、請求項21に記載の方法。
【請求項30】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項31】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項32】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体とを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項33】
フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出する方法であって、
複数個のフェヌグリーク種子を用意するステップと、
フェヌグリーク種子を調製するステップと、
フェヌグリーク種子から生物活性化合物の組成物を抽出するステップとを含み、
前記生物活性化合物が、4−ヒドロキシイソロイシンと、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートのうちから選択される1種以上のアミノ酸とを含む方法。
【請求項34】
生物活性化合物の組成物が、約10〜90%のアミノ酸およびその化学塩、無水物または異性体を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項35】
生物活性化合物が、約10〜70%の4−ヒドロキシイソロイシンと、約20〜40%のアミノ酸とを含む、請求項33に記載の方法。
【請求項36】
生物活性化合物の組成物が、4−ヒドロキシイソロイシン、アルギニン、アスパルテート、トレオニン、セリン、グルタメート、プロリン、グリシン、アラニン、システイン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン、オルニチン、リシン、ヒスチジン、およびγ−アミノブチレートを含む、請求項33に記載の方法。
【請求項37】
フェヌグリーク種子を調製するステップが、
フェヌグリーク種子を水中に浸漬するステップと、
フェヌグリーク種子を粉砕するステップと
をさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項38】
抽出ステップが、一次抽出プロセスを実施するステップと、二次抽出プロセスを実施するステップとをさらに含む、請求項33に記載の方法。
【請求項39】
一次抽出プロセスが、
種子残滓と種子エキスとを得るために、調製したフェヌグリーク種子に対して、第1溶媒を用い、約1〜3時間にわたって約20〜90℃の温度での抽出を1回以上行なうステップと、
分別カラムを用い、種子残滓を沸騰するまで加熱し、種子残滓由来の加熱蒸気を捕捉、冷却して種子残滓を蒸留するステップと、
フェヌグリーク種子オイルと第1溶媒とを分離するために蒸留種子残滓を減圧下で濃縮するステップと、
第2種子残滓と濃縮種子エキスとを得るために、第2溶媒を用い、約1〜3時間にわたって約20〜90℃の温度で、種子エキスの抽出を1回以上行なうステップと、
第2溶媒から第2濃縮種子エキスを分離するために、濃縮種子エキスをさらに減圧下で濃縮するステップと、
第2濃縮種子エキスを室温に冷ますステップと、
第2濃縮種子エキスを沈殿させて粗タンパク質と上清とに分離するステップと、
上清を脱イオン水で上清容量の約2〜10倍に希釈するステップとを含む、請求項38に記載の方法。
【請求項40】
第2溶媒を用いて3回抽出を実施する、請求項39に記載の方法。
【請求項41】
第1溶媒が有機溶媒を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項42】
有機溶媒は、ヘキサン、シクロヘキサンおよびエーテルのうちから選択し得る、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
第2溶媒が水・アルコール混合物を含む、請求項39に記載の方法。
【請求項44】
水・アルコール混合物が約10〜95%のエタノールである、請求項43に記載の方法。
【請求項45】
二次抽出プロセスが、
pH調節済上清を得るために、上清を酸で希釈して約1〜6.5のpH濃度に調節するステップと、
過剰な陽イオンを除去するために、pH調節済上清を陽イオン交換樹脂で濾過するステップと、
樹脂に結合したpH調節済上清から汚染物質を除去するために、陽イオン交換樹脂を洗浄するステップと、
樹脂結合pH調節済上清をアンモニア溶液で処理するステップと、
陽イオン交換樹脂から二次抽出生成物の酸性流出物と非酸性流出物とを回収するステップと、
汚染物質を分離するために酸性流出物を減圧下で濃縮するステップと、
二次抽出生成物から残留アンモニア溶液を除去するステップと、
4−ヒドロキシイソロイシンと1種以上のアミノ酸とを得るために二次抽出生成物を乾燥するステップとを含む、請求項39に記載の方法。
【請求項46】
pH調節ステップが1Nの塩酸を含む、請求項45に記載の方法。
【請求項47】
陽イオン交換樹脂濾過ステップが、イオン交換特性を有する陽イオン交換樹脂にpH調節溶液を導入するステップをさらに含む、請求項45に記載の方法。
【請求項48】
洗浄ステップが、イオン交換特性を有する陽イオン交換樹脂に水を導入するステップをさらに含む、請求項45に記載の方法。
【請求項49】
アンモニア溶液処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮アンモニア溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項45に記載の方法。
【請求項50】
二次抽出プロセスが、
過剰な陽イオンを除去するために上清を陽イオン交換樹脂で濾過するステップと、
樹脂結合上清から汚染物質を除去するために、陽イオン交換樹脂を洗浄するステップと、
樹脂結合上清をエタノール処理により処理するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物を回収するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物を酸で希釈してpHを約1〜6.5に調節するステップと、
pH調節済二次抽出生成物を陽イオン交換樹脂で2回目の濾過にかけるステップと、
樹脂結合pH調節済二次抽出生成物をアンモニア溶液で処理するステップと、
二次抽出生成物の酸性流出物と非酸性流出物とを回収するステップと、
汚染物質を分離するために酸性流出物を減圧下で濃縮するステップと、
二次抽出生成物から残留アンモニア溶液を除去するステップと、
4−ヒドロキシイソロイシンと1種以上のアミノ酸とを得るために二次抽出生成物を乾燥するステップとを含む、請求項39に記載の方法。
【請求項51】
陽イオン交換樹脂濾過ステップが、pH調節済上清を陽イオン交換樹脂に導入するステップをさらに含む、請求項50に記載の方法。
【請求項52】
洗浄ステップが、陽イオン交換樹脂に水を導入するステップをさらに含む、請求項50に記載の方法。
【請求項53】
エタノール処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮エタノール溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項50に記載の方法。
【請求項54】
エタノール処理ステップが、エタノールに類似した化学特性を有する溶媒を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項55】
pH調節ステップが6Nの塩酸を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項56】
アンモニア溶液処理ステップが、陽イオン交換樹脂に濃縮アンモニア溶液を連続的に流すステップをさらに含む、請求項50に記載の方法。
【請求項57】
アンモニア溶液がアンモニウム水を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項58】
アンモニウム水の濃度が約0.1〜約1Nである、請求項57に記載の方法。
【請求項59】
アンモニウム水の濃度が0.3Nである、請求項57に記載の方法。
【請求項60】
乾燥ステップが、噴霧乾燥、凍結乾燥、および真空乾燥のうちから選択される、請求項50に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【公表番号】特表2006−513977(P2006−513977A)
【公表日】平成18年4月27日(2006.4.27)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2004−503031(P2004−503031)
【出願日】平成15年5月8日(2003.5.8)
【国際出願番号】PCT/US2003/014408
【国際公開番号】WO2003/094948
【国際公開日】平成15年11月20日(2003.11.20)
【出願人】(502223699)テクニカル ソーシング インターナショナル インコーポレイテッド (1)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成18年4月27日(2006.4.27)
【国際特許分類】
【出願日】平成15年5月8日(2003.5.8)
【国際出願番号】PCT/US2003/014408
【国際公開番号】WO2003/094948
【国際公開日】平成15年11月20日(2003.11.20)
【出願人】(502223699)テクニカル ソーシング インターナショナル インコーポレイテッド (1)
【Fターム(参考)】
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