保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤及び中性脂肪蓄積抑制剤
【課題】 本発明は、優れた保湿作用、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、抗酸化作用、及び中性脂肪蓄積抑制作用などを有する有効成分を見出し、皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤及び中性脂肪蓄積抑制剤を提供することを目的とする。
【解決手段】 ブラシノステロイドを保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤及び中性脂肪蓄積抑制剤として用いる。また、ブラシノステロイドを皮膚外用剤や食品等の組成物に配合することにより、優れた保湿作用、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、抗酸化作用、及び中性脂肪蓄積抑制作用を発揮する様々な組成物を提供することができる。
【解決手段】 ブラシノステロイドを保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤及び中性脂肪蓄積抑制剤として用いる。また、ブラシノステロイドを皮膚外用剤や食品等の組成物に配合することにより、優れた保湿作用、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、抗酸化作用、及び中性脂肪蓄積抑制作用を発揮する様々な組成物を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤及び中性脂肪蓄積抑制剤に関する。さらに詳しくは、ブラシノライドを含有する保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤及び中性脂肪蓄積抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢、紫外線、ストレスなどによるシワ、シミ、皮膚の弾性低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化傷害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な天然由来成分の検索及び配合検討が従来なされてきた。細胞賦活剤としては、ポンカンのエッセンス（特許文献１参照）、コラーゲン産生促進剤としては、レチノイドとブナ科ブナ属植物の木の芽からの抽出物（特許文献２参照）、ヒアルロン酸産生促進剤としては、アナアオサの抽出物（特許文献３参照）、抗酸化剤としては、サルオガセ科サルオガセ属植物の抽出物（特許文献４参照）、中性脂肪蓄積抑制剤としては、褐藻の酵素分解物（特許文献５参照）が知られている。
【０００３】
しかし、天然由来成分の中には未だその効果が知られていないものも数多く存在すると考えられ、より優れた作用を有する保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤などの開発が期待されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献２】特開２００１−２７８７８３号公報
【特許文献３】特開平６−９４２２号公報
【特許文献４】特開平１０−１８２４１３号公報
【特許文献５】特開平０７−２７８００５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤を見出すために、天然由来の種々の物質について検討を行った。その結果、ブラシノステロイドに優れた保湿作用、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、抗酸化作用、及び中性脂肪蓄積抑制作用を見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、皮膚外用剤や食品などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤は、ブラシノステロイドを有効成分とする。これらの保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤は、皮膚外用剤や食品（飲料を含む）など種々の組成物に配合することが可能であり、これにより美容や脂質代謝改善に優れた組成物を提供することができる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、優れた効果を有する保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤を得ることができる。また、これらを皮膚外用剤や食品等に配合することにより、シワ、タルミ、肌のハリ、シミ、クスミといった種々の皮膚症状や脂質代謝改善に優れた効果を発揮する組成物を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ブラシノステロイドは、植物に存在するステロイドホルモンの一種であり、ブラシノライドやエピブラシノライドが知られている。ブラシノステロイドは、単子葉類、双子葉類、裸子植物、シダ類、コケ類、藻類から発見されており、植物の茎、葉、根などの成長に関与することが知られている。例えば、根の成長において、ブラシノステロイドが低い濃度の場合は根の成長を促進し、高い濃度の場合には根の成長を阻害することが知られている。
本発明においては、植物から抽出したブラシノステロイドを用いても一般に市販されているものを用いてもよく、その中でもブラシノライドを用いるのが好ましい。
【００１０】
ブラシノステロイドは、優れた保湿作用、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、抗酸化作用、及び中性脂肪蓄積抑制作用を有し、保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤として利用することができる。また、ブラシノステロイドを有効成分とする保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤は、皮膚に外用するだけではなく、毛髪に利用することや経口摂取も可能であり、食品（飲料を含む）、あるいは医薬品などにも応用することが可能である。
【００１１】
ブラシノステロイドを有効成分とする保湿剤は、皮膚や毛髪に対して優れた保湿作用を発揮し、特に皮膚に対する保湿効果が高い。
【００１２】
ブラシノステロイドを有効成分とする細胞賦活剤は、種々の細胞に対して優れた細胞賦活作用を発揮するが、特に真皮線維芽細胞や表皮細胞に対して優れた効果を発揮する。
【００１３】
ブラシノステロイドを有効成分とするコラーゲン産生促進剤は、真皮線維芽細胞や表皮細胞に対してコラーゲン産生促進作用を発揮するが、特にＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンの産生促進に優れた効果を発揮する。
【００１４】
ブラシノステロイドを有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤は、優れたヒアルロン酸産生促進作用を発揮するが、特に真皮線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進に優れた効果を発揮する。
【００１５】
ブラシノステロイドを有効成分とする抗酸化剤は、優れた抗酸化作用を発揮するが、特に表皮細胞における過酸化脂質の酸化に対して優れた抗酸化効果を発揮する。
【００１６】
また、ブラシノステロイドを皮膚外用剤に配合することにより、シワ、タルミ、肌のハリ、シミ、クスミ、乾燥、小じわ等の皮膚症状の防止・改善に優れた効果を発揮する美肌用の皮膚外用剤を得ることができ、保湿用皮膚外用剤、老化防止改善用皮膚外用剤、肌引き締め用皮膚外用剤としても用いることができる。さらに、ブラシノステロイドは、美容や健康維持を目的とするような食品にも用いることもでき、美容用食品や脂質代謝改善用食品を得ることができる。
【００１７】
ブラシノステロイドを皮膚外用剤や食品等の組成物に配合する際の配合量は、組成物の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して０．０００００１〜５０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００００１〜２５．０質量％である。
【００１８】
ブラシノステロイドを配合する組成物の剤型は任意であるが、皮膚外用剤の場合には、ローションなどの可溶化系、クリームや乳液などの乳化系、カラミンローション等の分散系、エアゾール、軟膏剤、粉末、顆粒などの種々の剤型で提供することもできる。また、組成物が経口用医薬品や食品の場合には、ドリンク剤・点滴剤などの液剤、ガム・飴のような固形剤、カプセル、粉末、顆粒、錠剤などの一般的な剤型とすることができる。
【００１９】
なお、ブラシノステロイドを配合する皮膚外用剤には、ブラシノステロイドの他に、必要に応じて、通常医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪用化粧料、洗浄料、及び食品に配合される油性成分、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤、香料、樹脂、防菌防黴剤、アルコール類、調味料、賦形剤等を適宜配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、あるいは中性脂肪蓄積抑制剤等との併用も可能である。
【実施例】
【００２０】
以下に、ブラシノステロイドの各作用を評価するための試験、皮膚外用剤や食品としての処方例、使用試験についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
まず、ブラシノステロイドの各作用を評価するための試験について示す。各試験には、市販されているブラシノライド（Ｅｐｉｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ，９０％：Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ.製）を用いた。
【００２１】
＜真皮線維芽細胞における細胞賦活作用の評価＞
評価は以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表１に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに４８時間培養した。上清を除いた後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ試薬）を４００μｇ／ｍｌ含有する培地に交換し、約２時間培養した。その後、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにより抽出し、マイクロプレートリーダーで５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００としたときの相対値により表１に示す。なお、表中の*及び**は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を*で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を**で表したものである。
【００２２】
【表１】
【００２３】
表１より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意な真皮線維皮芽細胞賦活効果が認められた。このことから、ブラシノライドは、優れた表皮細胞の細胞賦活作用を有することが明らかとなった。
【００２４】
＜真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生作用の評価＞
評価は以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表３に示す試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに２４時間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプＩコラーゲン定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）および過酸化水素を添加して反応させた後、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍの吸光度を測定した。
ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を求めた。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量あたりのタイプＩコラーゲン産生量を１００としたときの相対値により表２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】
表２より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意な真皮線維芽細胞コラーゲン産生効果が認められた。
【００２７】
＜表皮細胞におけるコラーゲン産生作用の評価＞
評価は、以下の手順で行った。ヒト表皮未全角化細胞を、１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表３に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに５日間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプＩＶコラーゲン定量には、ＩＶ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体（認識部位：α２鎖）およびビオチン化ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用い、アビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼを添加し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンにより発色させ、マイクロプレートリーダーにより６５０ｎｍの吸光度を測定した。
ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩＶコラーゲン産生量を求めた。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量あたりのタイプＩＶコラーゲン産生量を１００としたときの相対値により表３に示す。
【００２８】
【表３】
【００２９】
表３より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意な表皮細胞コラーゲン産生効果が認められた。
【００３０】
＜真皮線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生作用の評価＞
評価は、以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当たり９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表４に示す試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに５日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）および過酸化水素を添加して反応させた後、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍの吸光度を測定した。
ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量あたりのヒアルロン酸産生量を１００としたときの相対値により表４に示す。
【００３１】
【表４】
【００３２】
表４より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意なヒアルロン酸産生効果が認められた。
【００３３】
＜表皮細胞における過酸化脂質耐性の評価＞
評価は、以下の手順で行った。ヒト表皮細胞株ＨａＣａＴを１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、１０質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表５に示す各濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに２４時間培養した。次に、任意濃度のｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅを添加したＨａｎｋｓ溶液で２時間培養し、１５０μｇ／ｍＬのニュートラルレッドを含有するＰＢＳ溶液に交換して３７℃で２時間培養した。その後、１質量％酢酸を含有する５０質量％エタノール水溶液に交換し、細胞内に取り込まれたニュートラルレッドを抽出し、５４０ｎｍの吸光度を測定した。
得られた結果を、ｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅを添加していないコントロールの細胞生存率を１００としたときの相対値により表５に示す。
【００３４】
【表５】
【００３５】
表５より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意な過酸化脂質耐性効果が認められた。
【００３６】
＜前駆脂肪細胞における中性脂肪蓄積抑制作用の評価＞
評価は、以下の手順で行った。皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Ｃｒｙｏ ＨＰＲＡＤ−ＳＱ（三光純薬株式会社製）を１ウェルあたり１．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＰＧＭ培地（１０質量％ＦＢＳ，２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ，１００μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ含有）を用いた。細胞がコンフルエントになる直前に、０．１２５ｍｇ／ｍＬとなるように試料を添加したＰＧＭ−分化用培地（１０μｇ／ｍＬ インシュリン，１μＭ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ２００μＭ ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ，５００μＭ Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、試料無添加のコントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０質量％中性緩衝ホルムアルデヒド液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳにて洗浄の後、０．５Ｗ／ｖ％オイルレッドＯ溶液を添加し、３７℃で２時間培養した。ＰＢＳにて洗浄の後、メタノールを添加し、色素を抽出した。マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積量を評価した。評価ではコントロール群における蓄積脂肪量を１００とした時の相対値を求めて行った。評価結果を表６に示す。
【００３７】
【表６】
【００３８】
表６より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意な中性脂肪蓄積抑制効果が認められた。
【００３９】
続いて、本発明に係るブラシノライドを配合した組成物として、皮膚外用剤と食品の処方例を示す。
【００４０】
［処方例１］乳液
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン ４．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン １．０
（７）グリセリン ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー ０．１５
（10）精製水 ５３．８５
（11）アルギニン（１質量％水溶液） ２０．０
（12）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（11）と（12）を順次加え、均一に混合する。
【００４１】
［処方例２］化粧水
（１）エタノール １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．３
（３）香料 ０．１
（４）精製水 ７８．３８
（５）クエン酸 ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム ０．１
（７）グリセリン １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース ０．１
（９）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。溶解後、（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【００４２】
［処方例３］クリーム
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸 ２．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）セタノール ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（７）グリセリン １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液） １５．０
（10）精製水 ３６．７
（11）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １５．０
（12）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、（11）を加え、冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００４３】
［処方例４］美容液
（１）精製水 ２７．４５(質量％)
（２）グリセリン １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム(１質量％水溶液) １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル ３．０
（８）N-ラウロイル-L-グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル） ２．０
（９）硬化パーム油 ２．０
（10）スクワラン（オリーブ由来） １．０
（11）ベヘニルアルコール ０．７５
（12）ミツロウ １．０
（13）ホホバ油 １．０
（14）１、３−ブチレングリコール １０．０
（15）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液） ２．０
（16）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（14）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、５０℃にて（15）を加える。さらに４０℃まで冷却し、（16）を加え、均一に混合する。
【００４４】
［処方例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー ０．５（質量％）
（２）精製水 ７８．７
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液） ０．５
（４）エタノール １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（６）香料 ０．１
（７）ブラシノステロイド １０．０
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．１
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【００４５】
［処方例６］クレンジング料
（１）スクワラン ７７．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル １５．０
（３）精製水 ３．０
（４）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）と（４）を順次加え、均一に混合する。
【００４６】
［処方例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸 １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸 １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（４）グリセリン ２０．０
（５）水酸化ナトリウム ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン １．０
（７）精製水 ３１．５
（８）ブラシノステロイド ６．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【００４７】
［処方例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン １０．２(質量％)
（２）セタノール ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル １．０
（５）プロピレングリコール １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（７）精製水 ６５．４
（８）酸化チタン １．０
（９）ベンガラ ０．１
（10）黄酸化鉄 ０．４
（11）香料 ０．１
（12）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（10）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【００４８】
［処方例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン ２．０(質量％)
（２）スクワラン ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル ５．０
（４）セタノール １．０
（５）ポリオキシエチレン(２０Ｅ．Ｏ．)
ソルビタンモノステアリン酸エステル １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン ０．７
（７）１、３−ブチレングリコール ８．０
（８）キサンタンガム ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（10）精製水 ５３．４
（11）酸化チタン ９．０
（12）タルク ７．４
（13）ベンガラ ０．５
（14）黄酸化鉄 １．１
（15）黒酸化鉄 ０．１
（16）香料 ０．１
（17）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（10）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（11）〜（15）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（16）と（17）の成分を順次加え、均一に混合する。
【００４９】
［処方例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン ３０．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）ワセリン ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル ５．０
（５）塩化ナトリウム １．３
（６）塩化カリウム ０．１
（７）プロピレングリコール ３．０
（８）１、３−ブチレングリコール ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（10）ブラシノステロイド ５．０
（11）精製水 ４３．４
（12）香料 ０．１
製法：（５）と（６）を（11）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（10）を（11）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００５０】
［処方例１１］パック
（１）精製水 ５８．９(質量％)
（２）ポリビニルアルコール １２．０
（３）エタノール １７．０
（４）グリセリン ５．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００） ２．０
（６）ブラシノステロイド ５．０
（７）香料 ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却を開始する。４０℃まで冷却し、（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【００５１】
［処方例１２］入浴剤
（１）香料 ０．３(質量％)
（２）ブラシノステロイド ５．０
（３）炭酸水素ナトリウム ４６．０
（４）硫酸ナトリウム ４８．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【００５２】
［処方例１３］ヘアーワックス
（１）ステアリン酸 ３．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）セチルアルコール ３．０
（４）高重合メチルポリシロキサン ２．０
（５）メチルポリシロキサン ５．０
（６）ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）
メチルポリシロキサン共重合体 １．０
（７）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（８）１、３−ブチレングリコール ７．５
（９）アルギニン ０．７
（10）精製水 ７０．６
（11）ブラシノステロイド ５．０
（12）香料 ０．１
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解後する。一方、（７）〜（10）の水相成分を７５℃にて加熱溶解し、前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【００５３】
［処方例１４］ヘアートニック
（１）エタノール ４６．０(質量％)
（２）精製水 ４８．９
（３）ブラシノステロイド ５．０
（４）香料 ０．１
製法：（１）〜（４）の成分を混合、均一化する。
【００５４】
［処方例１５］飲料
（１）ブラシノステロイド ８．０(質量％)
（２）エリスリトール １．０
（３）クエン酸 ０．１
（４）ステビア ０．０１
（５）精製水 ９０．８９
製法：（１）〜（５）を均一に混合する。
【００５５】
［処方例１６］錠剤
（１）ブラシノステロイド ０．３０（質量部）
（２）還元麦芽糖水飴 ０．５３
（３）トウモロコシデンプン ０．１５
（４）グリセリン脂肪酸エステル ０．０２
製法：（１）〜（３）を篩過して混合し、さらに（４）を添加して混合した。打錠機にて打錠を行い、全量３００ｍｇの錠剤を得た。
【００５６】
次に、ブラシノライドを配合した処方を用いて使用試験を行い、乾燥による肌荒れについて改善効果を評価した。その際、処方例１を実施例１として使用試験を行った。また、ブラシノライドを精製水に代替し、比較例１として同時に使用試験を行った。
【００５７】
各試料について、肌荒れ症状が顕著に認められる３０〜５０才代の乾燥肌の女性パネラー２０名をそれぞれ一群とし、ブラインドにて１週間使用させ、使用前後の皮膚状態の変化を観察して評価した。皮膚症状の指標として、乾燥による肌荒れについて、「改善」、「やや改善」、「変化なし」の三段階で評価し、表７に各評価を得たパネラー数にて示した。
【００５８】
【表７】
【００５９】
表７より、ブラシノライドは優れた保湿効果を有することが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤及び中性脂肪蓄積抑制剤に関する。さらに詳しくは、ブラシノライドを含有する保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤及び中性脂肪蓄積抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢、紫外線、ストレスなどによるシワ、シミ、皮膚の弾性低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化傷害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な天然由来成分の検索及び配合検討が従来なされてきた。細胞賦活剤としては、ポンカンのエッセンス（特許文献１参照）、コラーゲン産生促進剤としては、レチノイドとブナ科ブナ属植物の木の芽からの抽出物（特許文献２参照）、ヒアルロン酸産生促進剤としては、アナアオサの抽出物（特許文献３参照）、抗酸化剤としては、サルオガセ科サルオガセ属植物の抽出物（特許文献４参照）、中性脂肪蓄積抑制剤としては、褐藻の酵素分解物（特許文献５参照）が知られている。
【０００３】
しかし、天然由来成分の中には未だその効果が知られていないものも数多く存在すると考えられ、より優れた作用を有する保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、中性脂肪蓄積抑制剤などの開発が期待されている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献２】特開２００１−２７８７８３号公報
【特許文献３】特開平６−９４２２号公報
【特許文献４】特開平１０−１８２４１３号公報
【特許文献５】特開平０７−２７８００５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明者らは、皮膚外用剤や飲食品などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤を見出すために、天然由来の種々の物質について検討を行った。その結果、ブラシノステロイドに優れた保湿作用、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、抗酸化作用、及び中性脂肪蓄積抑制作用を見出し、さらに検討を重ね、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、皮膚外用剤や食品などの分野に幅広く応用が可能な保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤は、ブラシノステロイドを有効成分とする。これらの保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤は、皮膚外用剤や食品（飲料を含む）など種々の組成物に配合することが可能であり、これにより美容や脂質代謝改善に優れた組成物を提供することができる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、優れた効果を有する保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤を得ることができる。また、これらを皮膚外用剤や食品等に配合することにより、シワ、タルミ、肌のハリ、シミ、クスミといった種々の皮膚症状や脂質代謝改善に優れた効果を発揮する組成物を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
ブラシノステロイドは、植物に存在するステロイドホルモンの一種であり、ブラシノライドやエピブラシノライドが知られている。ブラシノステロイドは、単子葉類、双子葉類、裸子植物、シダ類、コケ類、藻類から発見されており、植物の茎、葉、根などの成長に関与することが知られている。例えば、根の成長において、ブラシノステロイドが低い濃度の場合は根の成長を促進し、高い濃度の場合には根の成長を阻害することが知られている。
本発明においては、植物から抽出したブラシノステロイドを用いても一般に市販されているものを用いてもよく、その中でもブラシノライドを用いるのが好ましい。
【００１０】
ブラシノステロイドは、優れた保湿作用、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、抗酸化作用、及び中性脂肪蓄積抑制作用を有し、保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、及び中性脂肪蓄積抑制剤として利用することができる。また、ブラシノステロイドを有効成分とする保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤は、皮膚に外用するだけではなく、毛髪に利用することや経口摂取も可能であり、食品（飲料を含む）、あるいは医薬品などにも応用することが可能である。
【００１１】
ブラシノステロイドを有効成分とする保湿剤は、皮膚や毛髪に対して優れた保湿作用を発揮し、特に皮膚に対する保湿効果が高い。
【００１２】
ブラシノステロイドを有効成分とする細胞賦活剤は、種々の細胞に対して優れた細胞賦活作用を発揮するが、特に真皮線維芽細胞や表皮細胞に対して優れた効果を発揮する。
【００１３】
ブラシノステロイドを有効成分とするコラーゲン産生促進剤は、真皮線維芽細胞や表皮細胞に対してコラーゲン産生促進作用を発揮するが、特にＩ型コラーゲンとＩＶ型コラーゲンの産生促進に優れた効果を発揮する。
【００１４】
ブラシノステロイドを有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤は、優れたヒアルロン酸産生促進作用を発揮するが、特に真皮線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生促進に優れた効果を発揮する。
【００１５】
ブラシノステロイドを有効成分とする抗酸化剤は、優れた抗酸化作用を発揮するが、特に表皮細胞における過酸化脂質の酸化に対して優れた抗酸化効果を発揮する。
【００１６】
また、ブラシノステロイドを皮膚外用剤に配合することにより、シワ、タルミ、肌のハリ、シミ、クスミ、乾燥、小じわ等の皮膚症状の防止・改善に優れた効果を発揮する美肌用の皮膚外用剤を得ることができ、保湿用皮膚外用剤、老化防止改善用皮膚外用剤、肌引き締め用皮膚外用剤としても用いることができる。さらに、ブラシノステロイドは、美容や健康維持を目的とするような食品にも用いることもでき、美容用食品や脂質代謝改善用食品を得ることができる。
【００１７】
ブラシノステロイドを皮膚外用剤や食品等の組成物に配合する際の配合量は、組成物の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して０．０００００１〜５０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００００１〜２５．０質量％である。
【００１８】
ブラシノステロイドを配合する組成物の剤型は任意であるが、皮膚外用剤の場合には、ローションなどの可溶化系、クリームや乳液などの乳化系、カラミンローション等の分散系、エアゾール、軟膏剤、粉末、顆粒などの種々の剤型で提供することもできる。また、組成物が経口用医薬品や食品の場合には、ドリンク剤・点滴剤などの液剤、ガム・飴のような固形剤、カプセル、粉末、顆粒、錠剤などの一般的な剤型とすることができる。
【００１９】
なお、ブラシノステロイドを配合する皮膚外用剤には、ブラシノステロイドの他に、必要に応じて、通常医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪用化粧料、洗浄料、及び食品に配合される油性成分、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤、香料、樹脂、防菌防黴剤、アルコール類、調味料、賦形剤等を適宜配合することができる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、細胞賦活剤、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、抗酸化剤、あるいは中性脂肪蓄積抑制剤等との併用も可能である。
【実施例】
【００２０】
以下に、ブラシノステロイドの各作用を評価するための試験、皮膚外用剤や食品としての処方例、使用試験についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
まず、ブラシノステロイドの各作用を評価するための試験について示す。各試験には、市販されているブラシノライド（Ｅｐｉｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ，９０％：Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ.製）を用いた。
【００２１】
＜真皮線維芽細胞における細胞賦活作用の評価＞
評価は以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表１に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに４８時間培養した。上清を除いた後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ試薬）を４００μｇ／ｍｌ含有する培地に交換し、約２時間培養した。その後、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにより抽出し、マイクロプレートリーダーで５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００としたときの相対値により表１に示す。なお、表中の*及び**は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を*で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を**で表したものである。
【００２２】
【表１】
【００２３】
表１より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意な真皮線維皮芽細胞賦活効果が認められた。このことから、ブラシノライドは、優れた表皮細胞の細胞賦活作用を有することが明らかとなった。
【００２４】
＜真皮線維芽細胞におけるコラーゲン産生作用の評価＞
評価は以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表３に示す試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに２４時間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプＩコラーゲン定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）および過酸化水素を添加して反応させた後、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍの吸光度を測定した。
ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を求めた。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量あたりのタイプＩコラーゲン産生量を１００としたときの相対値により表２に示す。
【００２５】
【表２】
【００２６】
表２より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意な真皮線維芽細胞コラーゲン産生効果が認められた。
【００２７】
＜表皮細胞におけるコラーゲン産生作用の評価＞
評価は、以下の手順で行った。ヒト表皮未全角化細胞を、１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表３に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに５日間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプＩＶコラーゲン定量には、ＩＶ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体（認識部位：α２鎖）およびビオチン化ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用い、アビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼを添加し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンにより発色させ、マイクロプレートリーダーにより６５０ｎｍの吸光度を測定した。
ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩＶコラーゲン産生量を求めた。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量あたりのタイプＩＶコラーゲン産生量を１００としたときの相対値により表３に示す。
【００２８】
【表３】
【００２９】
表３より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意な表皮細胞コラーゲン産生効果が認められた。
【００３０】
＜真皮線維芽細胞におけるヒアルロン酸産生作用の評価＞
評価は、以下の手順で行った。正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当たり９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表４に示す試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに５日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）および過酸化水素を添加して反応させた後、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍの吸光度を測定した。
ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量あたりのヒアルロン酸産生量を１００としたときの相対値により表４に示す。
【００３１】
【表４】
【００３２】
表４より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意なヒアルロン酸産生効果が認められた。
【００３３】
＜表皮細胞における過酸化脂質耐性の評価＞
評価は、以下の手順で行った。ヒト表皮細胞株ＨａＣａＴを１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、１０質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表５に示す各濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに２４時間培養した。次に、任意濃度のｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅを添加したＨａｎｋｓ溶液で２時間培養し、１５０μｇ／ｍＬのニュートラルレッドを含有するＰＢＳ溶液に交換して３７℃で２時間培養した。その後、１質量％酢酸を含有する５０質量％エタノール水溶液に交換し、細胞内に取り込まれたニュートラルレッドを抽出し、５４０ｎｍの吸光度を測定した。
得られた結果を、ｔ−ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅを添加していないコントロールの細胞生存率を１００としたときの相対値により表５に示す。
【００３４】
【表５】
【００３５】
表５より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意な過酸化脂質耐性効果が認められた。
【００３６】
＜前駆脂肪細胞における中性脂肪蓄積抑制作用の評価＞
評価は、以下の手順で行った。皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Ｃｒｙｏ ＨＰＲＡＤ−ＳＱ（三光純薬株式会社製）を１ウェルあたり１．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＰＧＭ培地（１０質量％ＦＢＳ，２ｍＭ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ，１００μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ含有）を用いた。細胞がコンフルエントになる直前に、０．１２５ｍｇ／ｍＬとなるように試料を添加したＰＧＭ−分化用培地（１０μｇ／ｍＬ インシュリン，１μＭ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ２００μＭ ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ，５００μＭ Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、試料無添加のコントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０質量％中性緩衝ホルムアルデヒド液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳにて洗浄の後、０．５Ｗ／ｖ％オイルレッドＯ溶液を添加し、３７℃で２時間培養した。ＰＢＳにて洗浄の後、メタノールを添加し、色素を抽出した。マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積量を評価した。評価ではコントロール群における蓄積脂肪量を１００とした時の相対値を求めて行った。評価結果を表６に示す。
【００３７】
【表６】
【００３８】
表６より明らかなように、ブラシノライドを添加した培地では、有意な中性脂肪蓄積抑制効果が認められた。
【００３９】
続いて、本発明に係るブラシノライドを配合した組成物として、皮膚外用剤と食品の処方例を示す。
【００４０】
［処方例１］乳液
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン ４．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．） １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン １．０
（７）グリセリン ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー ０．１５
（10）精製水 ５３．８５
（11）アルギニン（１質量％水溶液） ２０．０
（12）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（11）と（12）を順次加え、均一に混合する。
【００４１】
［処方例２］化粧水
（１）エタノール １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．３
（３）香料 ０．１
（４）精製水 ７８．３８
（５）クエン酸 ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム ０．１
（７）グリセリン １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース ０．１
（９）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。溶解後、（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【００４２】
［処方例３］クリーム
（１）スクワラン １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸 ２．０
（３）水素添加パーム核油 ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質 ０．１
（５）セタノール ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（７）グリセリン １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液） １５．０
（10）精製水 ３６．７
（11）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １５．０
（12）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、（11）を加え、冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００４３】
［処方例４］美容液
（１）精製水 ２７．４５(質量％)
（２）グリセリン １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液） １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム(１質量％水溶液) １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル ３．０
（８）N-ラウロイル-L-グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル） ２．０
（９）硬化パーム油 ２．０
（10）スクワラン（オリーブ由来） １．０
（11）ベヘニルアルコール ０．７５
（12）ミツロウ １．０
（13）ホホバ油 １．０
（14）１、３−ブチレングリコール １０．０
（15）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液） ２．０
（16）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（14）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、５０℃にて（15）を加える。さらに４０℃まで冷却し、（16）を加え、均一に混合する。
【００４４】
［処方例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー ０．５（質量％）
（２）精製水 ７８．７
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液） ０．５
（４）エタノール １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（６）香料 ０．１
（７）ブラシノステロイド １０．０
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 ０．１
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【００４５】
［処方例６］クレンジング料
（１）スクワラン ７７．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル １５．０
（３）精製水 ３．０
（４）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）と（４）を順次加え、均一に混合する。
【００４６】
［処方例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸 １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸 １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（４）グリセリン ２０．０
（５）水酸化ナトリウム ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン １．０
（７）精製水 ３１．５
（８）ブラシノステロイド ６．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【００４７】
［処方例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン １０．２(質量％)
（２）セタノール ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル １．０
（５）プロピレングリコール １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル １．３
（７）精製水 ６５．４
（８）酸化チタン １．０
（９）ベンガラ ０．１
（10）黄酸化鉄 ０．４
（11）香料 ０．１
（12）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（10）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【００４８】
［処方例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン ２．０(質量％)
（２）スクワラン ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル ５．０
（４）セタノール １．０
（５）ポリオキシエチレン(２０Ｅ．Ｏ．)
ソルビタンモノステアリン酸エステル １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン ０．７
（７）１、３−ブチレングリコール ８．０
（８）キサンタンガム ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（10）精製水 ５３．４
（11）酸化チタン ９．０
（12）タルク ７．４
（13）ベンガラ ０．５
（14）黄酸化鉄 １．１
（15）黒酸化鉄 ０．１
（16）香料 ０．１
（17）ブラシノステロイド ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（10）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（11）〜（15）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（16）と（17）の成分を順次加え、均一に混合する。
【００４９】
［処方例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン ３０．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）ワセリン ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル ５．０
（５）塩化ナトリウム １．３
（６）塩化カリウム ０．１
（７）プロピレングリコール ３．０
（８）１、３−ブチレングリコール ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（10）ブラシノステロイド ５．０
（11）精製水 ４３．４
（12）香料 ０．１
製法：（５）と（６）を（11）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（10）を（11）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００５０】
［処方例１１］パック
（１）精製水 ５８．９(質量％)
（２）ポリビニルアルコール １２．０
（３）エタノール １７．０
（４）グリセリン ５．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００） ２．０
（６）ブラシノステロイド ５．０
（７）香料 ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却を開始する。４０℃まで冷却し、（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【００５１】
［処方例１２］入浴剤
（１）香料 ０．３(質量％)
（２）ブラシノステロイド ５．０
（３）炭酸水素ナトリウム ４６．０
（４）硫酸ナトリウム ４８．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【００５２】
［処方例１３］ヘアーワックス
（１）ステアリン酸 ３．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス ２．０
（３）セチルアルコール ３．０
（４）高重合メチルポリシロキサン ２．０
（５）メチルポリシロキサン ５．０
（６）ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）
メチルポリシロキサン共重合体 １．０
（７）パラオキシ安息香酸メチル ０．１
（８）１、３−ブチレングリコール ７．５
（９）アルギニン ０．７
（10）精製水 ７０．６
（11）ブラシノステロイド ５．０
（12）香料 ０．１
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解後する。一方、（７）〜（10）の水相成分を７５℃にて加熱溶解し、前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【００５３】
［処方例１４］ヘアートニック
（１）エタノール ４６．０(質量％)
（２）精製水 ４８．９
（３）ブラシノステロイド ５．０
（４）香料 ０．１
製法：（１）〜（４）の成分を混合、均一化する。
【００５４】
［処方例１５］飲料
（１）ブラシノステロイド ８．０(質量％)
（２）エリスリトール １．０
（３）クエン酸 ０．１
（４）ステビア ０．０１
（５）精製水 ９０．８９
製法：（１）〜（５）を均一に混合する。
【００５５】
［処方例１６］錠剤
（１）ブラシノステロイド ０．３０（質量部）
（２）還元麦芽糖水飴 ０．５３
（３）トウモロコシデンプン ０．１５
（４）グリセリン脂肪酸エステル ０．０２
製法：（１）〜（３）を篩過して混合し、さらに（４）を添加して混合した。打錠機にて打錠を行い、全量３００ｍｇの錠剤を得た。
【００５６】
次に、ブラシノライドを配合した処方を用いて使用試験を行い、乾燥による肌荒れについて改善効果を評価した。その際、処方例１を実施例１として使用試験を行った。また、ブラシノライドを精製水に代替し、比較例１として同時に使用試験を行った。
【００５７】
各試料について、肌荒れ症状が顕著に認められる３０〜５０才代の乾燥肌の女性パネラー２０名をそれぞれ一群とし、ブラインドにて１週間使用させ、使用前後の皮膚状態の変化を観察して評価した。皮膚症状の指標として、乾燥による肌荒れについて、「改善」、「やや改善」、「変化なし」の三段階で評価し、表７に各評価を得たパネラー数にて示した。
【００５８】
【表７】
【００５９】
表７より、ブラシノライドは優れた保湿効果を有することが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラシノステロイドを有効成分とする保湿剤。
【請求項２】
ブラシノステロイドを有効成分とする細胞賦活剤。
【請求項３】
ブラシノステロイドを有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
ブラシノステロイドを有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項５】
ブラシノステロイドを有効成分とする抗酸化剤。
【請求項６】
ブラシノステロイドを有効成分とする中性脂肪蓄積抑制剤。
【請求項７】
ブラシノステロイドを有効成分とする皮膚外用剤。
【請求項８】
ブラシノステロイドを有効成分とする食品。
【請求項１】
ブラシノステロイドを有効成分とする保湿剤。
【請求項２】
ブラシノステロイドを有効成分とする細胞賦活剤。
【請求項３】
ブラシノステロイドを有効成分とするコラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
ブラシノステロイドを有効成分とするヒアルロン酸産生促進剤。
【請求項５】
ブラシノステロイドを有効成分とする抗酸化剤。
【請求項６】
ブラシノステロイドを有効成分とする中性脂肪蓄積抑制剤。
【請求項７】
ブラシノステロイドを有効成分とする皮膚外用剤。
【請求項８】
ブラシノステロイドを有効成分とする食品。
【公開番号】特開２００８−７４７２４（Ｐ２００８−７４７２４Ａ）
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２５３０７８（Ｐ２００６−２５３０７８）
【出願日】平成１８年９月１９日（２００６．９．１９）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月３日（２００８．４．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１９日（２００６．９．１９）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
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