免疫抑制のためのＦＬＴ３阻害剤
免疫系を抑制するため及び免疫関連の疾患を治療するための新規な方法が提供される。本発明の治療法には、ＦＬＴ３阻害剤化合物を、それを必要とする対象、例えば、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、後天性免疫不全症候群、関節炎、再生不良性貧血、移植片対宿主病、グレーブス病、確立された実験的アレルギー性脳脊髄炎、多発性硬化症、狼瘡、又は神経系の疾患などを患う対象への投与が含まれる。また、ＦＬＴ３受容体の活性レベルの高いマウスの使用を含む、免疫障害疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年７月１９日に出願の米国特許仮出願第６０／５８９，５１１号の優先権を主張するものであり、その全てを参照して本明細書に取り込む。
【０００２】
（発明分野）
本発明は、細胞の免疫応答を抑制すること、免疫関連の疾患を予防又は治療すること、並びに免疫関連の疾患を予防又は治療するための治療剤をスクリーニングする方法に関する。本発明の治療法には、ＦＭＳ関連のチロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）阻害剤を、移植後の臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、移植片対宿主病、又は狼瘡を患っているような、それを必要とする対象に投与することを包含する。免疫の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法には、ＦＬＴ３受容体の活性レベルが高いマウスの使用が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
免疫関連の疾患、特に移植後の臓器拒絶反応、糖尿病、移植片対宿主病、グレーブス病、及び狼瘡は、依然として世界中の数百万の人々を冒す衰弱性疾病である。
【０００４】
免疫関連の疾患は、個体に潜在的な壊滅的かつ不可逆的副作用を引き起こし、例えば免疫システムが増大した結果として発症する。免疫関連の疾患、例えば、骨髄移植拒絶反応、移植後の固形臓器拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、グレーブス病、溶血性貧血、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ、ウェグナー肉芽腫症、糖尿病１型、重症筋無力症、及び乾癬は、免疫システムの様々な過剰な活動により引き起こされる。最近の治療法は、免疫応答のＴ細胞アームの殆どの部分に作用し、その結果重篤な免疫抑制を招くことがよくある。
【０００５】
従って、このような徴候に対する治療のための新規な治療法を得ることが望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（発明の要約）
本発明者らは、ここに細胞の免疫応答を抑制する方法、免疫関連の疾患を治療する方法、並びに免疫関連の疾患及び神経系の疾患を含むＦＬＴ３疾患及びＦＬＴ３関連の疾患を治療する治療剤のスクリーニングのための方法を提供する。特に、ＦＭＳ関連のチロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）によるシグナル伝達を阻害することにより、例えば、インビボで成長する樹状細胞（ＤＣ）の数を減少させることにより、またＴ細胞を活性化させるそれらの能力を低下させることにより、ＦＬＴ３及びＦＬＴ３関連の疾患を治療することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、ＦＬＴ３の活性を低下させる少なくとも１つのＦＬＴ３阻害剤を細胞に接触させることを含んでなる、その細胞の免疫応答を抑制する方法を提供する。
【０００８】
ある特定の態様では、前記細胞は、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又は神経系の細胞、例えば、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト（乏突起神経膠細胞）、シュワン細胞、星状細胞、ミクログリアである。前記ニューロンの例では、例えば、求心性ニューロン、遠心性ニューロン、介在ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、神経内分泌細胞、分裂終了神経、胚性ニューロン又は網膜の神経節細胞の１つ又はそれ以上を含んでいる。
【０００９】
ある特定の態様では、ＦＬＴ３のキナーゼ活性が低下している。関連する態様では、ＦＬＴ３の自己リン酸化活性が低下している。
【００１０】
一態様によれば、前記ＦＬＴ３阻害剤は、小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗ＦＬＴ３抗体、抗ＦＬＴ３抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプチドをコードする核酸、有機分子及びそれらの何れかの組合せの１つ又はそれ以上から選択される。関連する態様では、前記小分子は、ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５、ＣＥＰ−５２１４、ＣＥＰ−７０５５、ＰＫＣ４１２、ＳＵ１１２４８、ＳＵ５４１６、ＳＵ５６１４、ＭＬＮ５１８、ＢＡＹ４３−９００６、ＣＨＩＲ−２５８、アミノ−ベンゾイミダゾール−キノロン類、Ｋｉ２３８１９、スタウロスポリン誘導体の１つ又はそれ以上から選択される。
更なる関連する態様では、小分子は、式Ｉ：
【００１１】
【化００３】
【００１２】
（式中、
Ｗは、Ｃ、Ｎ又はＯであってもよく；
Ｘは、Ｃ、Ｎ又は存在しない、であってもよく；
Ｙは、Ｃであってもよく；
Ｚは、Ｃ又はＮであってもよく；そして
Ｒ基は、以下のＲ１〜Ｒ５の置換されている可変基であってもよく：
Ｒ１は、Ｈ、アルコキシ、ヒドロキシル又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、アルコキシ又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ３は、Ｈ、Ｏ、アリール、ヘテロアリール又はＣ（Ｏ）ヘテロアリールであってもよく；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＨ−ヘテロアリール又は存在しない、であってもよく；
Ｒ５は、Ｈ、アリール、ヘテロアルキル／アリール又は存在しない、であってもよく；そして、
ＷＸ、ＷＹ、ＹＺ、ＹＲ３及びＺＲ４に於ける破線は、二重結合であってもよいことを示し、ここに於けるアリール、ヘテロアリール及び複素環アルキル／アリールは、置換されていてもよい）。
更に別な関連する態様では、小分子は、以下に示される化合物から選択される。
【００１３】
【化００４】
【００１４】
関連する態様では、前記抗体が、ＩＭＣ−ＥＢ１０及びＩＭＣ−ＮＣ７の１つ又はそれ以上から選ばれる、請求項６に記載の方法である。関連する態様では、前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、霊長類化抗体及びそれらの何れかの組合せであってよい。一態様では、前記抗体はＦＬＴ３のリン酸化型を特異的に認識し、別の態様では、前記抗体はＦＬＴ３の非リン酸化型を特異的に認識する。
【００１５】
関連する態様では、前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、図９のヌクレオチド配列又はそれらの生物活性を有する断片の１つ又はそれ以上から選択される。
別の態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、ＦＬＴ３依存性シグナル伝達を低下させる。
一態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は細胞の免疫賦活能を下方制御する。
本発明のある特定の方法は、前記ＦＬＴ３阻害剤と共にＴ細胞阻害剤を投与することを更に含むことがある。
【００１６】
一態様では、対象に於けるＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療する方法が提供される。その方法は、ＦＬＴ３阻害剤の治療有効量を対象に投与してＦＬＴ３の活性を低下させることを含む。
本発明の治療法は、ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患の治療を必要とする対象を同定することを更に含み、及び／又はそれによりＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患について対象を治療する。
【００１７】
一態様では、前記ＦＬＴ３疾患又は関連の疾患は、免疫関連の疾患である。
関連する態様では、前記免疫関連の疾患とは、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡並びにその他の自己免疫疾患のうちの１つ又はそれ以上のものである。本発明の方法は、骨髄非破壊的な処置療法及びそれらを組み合わせて施術した後に骨髄生着を促進させるためにも用いられてもよい。
【００１８】
一態様では、前記ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患は、神経系の疾患である。
関連する態様では、前記神経系の疾患は、例えば軸索変性によって起こる疾患のような神経変性疾患の１つ又はそれ以上である。神経変性疾患としては、例えば、多発性硬化症；脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、急性横断性脊髄炎；及び筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症などの運動単位の障害疾患；クロイツフェルト・ヤコブ病；又は亜急性硬化性全脳炎が挙げられる。
【００１９】
一態様では、前記対象は哺乳動物である。
別の態様では、前記哺乳動物は、ヒト、霊長類、ネズミ、イヌ、ネコ又はマウスである。
一態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗ＦＬＴ３抗体、抗ＦＬＴ３抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプチドをコードする核酸、有機分子及びそれらの何れかの組合せの１つ又はそれ以上から選択される。
一態様では、前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、図９のヌクレオチド配列又はそれらの生物活性を有する断片の１つ又はそれ以上から選択される。
【００２０】
別の態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、対象に於けるＦＬＴ３のキナーゼ活性を低下させる。
一態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、対象に於けるＦＬＴ３の自己リン酸化活性を低下させる。
一態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、対象に於けるＦＬＴ３依存性シグナル伝達を低下させる。
別の態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、対象に於ける免疫賦活能を下方制御する。
一態様では、本方法は、ＦＬＴ３阻害剤と共にＴ細胞阻害剤を投与することを更に含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ＦＬＴ依存のシグナル伝達を低減するために、ＦＬＴ３阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含んでなる、対象のＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、恒常的に活性化されたＦＬＴ３受容体を有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。一態様では、前記トランスジェニック動物はマウスである。
別の態様では、前記トランスジェニック動物は、治療剤をテストするために、及び／又は免疫関連の疾患のモデルとして用いられる。
【００２２】
別の態様では、ＦＬＴ３受容体の活性レベルが高いマウスに薬剤を投与する、そして免疫応答の変化を測定して、免疫応答の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる免疫関連の疾患を治療するための、治療剤をスクリーニングする方法が提供される。
一態様では、免疫応答の変化はＤＣ細胞の数の減少で示される。関連する態様では、免疫応答の変化はＮＫ細胞の数の減少で示される。別の関連する態様では、免疫応答の変化は、ＤＣ共刺激タンパク質のレベル判定により測定して、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルの増加が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す。
【００２３】
一態様では、前記ＤＣ共刺激タンパク質はＢ７−ＤＣである。一態様では、免疫応答の変化をＴ細胞増殖アッセイにより測定して、Ｔ細胞増殖の減少が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す。
治療剤を真核細胞へ投与する、そして細胞に於ける免疫応答の変化を測定して、細胞の免疫応答の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる、免疫関連の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００２４】
一態様では、前記細胞は、樹状細胞、ＮＫ細胞、脾細胞、Ｔ細胞及びそれらの混合物の１つ又はそれ以上から選択される。別の態様では、細胞の免疫応答の低下は、ＤＣ共刺激タンパク質のレベル判定により測定して、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルの増加が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す。
別の態様では、前記ＤＣ共刺激タンパク質はＢ７−ＤＣである。
別の態様では、免疫応答の変化をＴ細胞増殖の判定により測定して、その場合、Ｔ細胞増殖の減少が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す。
【００２５】
一つの態様では、薬剤をＭＯＧペプチドで免疫化されたマウスに投与する、そしてニューロンを可視化して、軸索の調節が、神経系の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる神経系の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法が提供される。
一態様では、軸索の変化は、変性した軸索の数の減少で示される。
【００２６】
別の態様では、可視化は顕微鏡検査による。一つの態様では、治療剤をニューロン細胞へ投与する、そして細胞における変化を測定して、変性した神経の数の減少が、神経系の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる神経系の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングするための方法が本明細書に提供される。
【００２７】
一態様の治療法には、ＦＬＴ３活性を低下させるために、ＦＬＴ３阻害剤の治療有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む、免疫関連の疾患の治療が含まれる。別の態様の治療法には、ＦＬＴ３依存性シグナル伝達を低下させるために、ＦＬＴ３阻害剤の治療有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む。また、治療法には、腫瘍ワクチン接種時の耐性の破壊も含まれる。
【００２８】
一態様の治療法には、哺乳動物、特にヒトを含む、動物のＦＬＴ３シグナル伝達を阻害することのできる治療剤の１つ又はそれ以上の治療有効量を、このような治療を必要とする対象に投与することを包含する。具体的には、免疫関連の疾患を患っている又は患う恐れがある対象を、同定及び／又は選択し、その後ＦＬＴ３阻害化合物の１つ又はそれ以上を、同定及び／又は選択した対象へ投与することが好ましい。
【００２９】
一態様として、免疫関連の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法には、ＦＬＴ３活性レベルの高いマウスのような哺乳動物又はその他の対象へ投与すること、及び免疫応答を測定することが含まれる。別の態様の免疫関連の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法には、薬剤を細胞へ投与すること及び免疫応答を測定することが含まれる。
本発明のその他の態様を、以下に開示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
上記のように、また下記の実施例に示すように、ＦＬＴ３を阻害することが、免疫関連の疾患を治療するのに効果的であることが見出された。それらの疾患には、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、後天性免疫不全症候群、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、低ガンマグロブリン血症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、狼瘡及びそれらの何れかの組合せが含まれる。
【００３１】
ＦＬＴ３は、造血前駆細胞で優先的に発現する受容体のチロシンキナーゼである（Small et al., Blood 15(4):1110-9(1993)）。樹状細胞（ＤＣ）の数がＦＬＴ３リガンドの配位子（ＦＬ）で活性化されて増加することで示されるように、ＦＬＴ３受容体によるシグナル伝達はＤＣにおいて重要な役割を果たす。ＦＬＴ３によるシグナル伝達は、造血幹細胞及び前駆細胞に影響を与えることが知られている。Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞の成長に重要であると考えられる、ＦＬＴ３による下流側のシグナル伝達を、ＦＬＴ３阻害剤は、抑制することができる。ＦＬＴ３シグナル伝達の阻害が、ＤＣの数を減少させ、そしてＴ細胞を活性化させる抗原を提示するＤＣの能力を妨げることは、驚くべき発見であった。ＦＬＴ３は、シグナル伝達のためにそのチロシンキナーゼ領域を必要とし、従って、ＦＬＴ３シグナル伝達を阻害する１つの方法は、この酵素活性を阻害することである。また、ＦＬＴ３のＦＬ活性は、免疫システムで重要な役割をもつＮＫ細胞及びＢリンパ球の成長を大いに刺激するが、このためＦＬＴ３シグナル伝達の阻害は、これらの細胞も同じように抑制する効果を有している。
【００３２】
ＦＬＴ３は、ＤＣ前駆体で発現し、そしてＦＬ／ＦＬＴ３シグナル伝達が、骨髄（ＢＭ）、脾臓、リンパ節、胃腸管、肝臓、肺臓、腹膜腔及び皮膚においてＤＣの数を大きく増加させる、結果を導く。例えば、「S. D. Lyman, Curr Opin Hematol 5, 192-6, (1998)」、「H. J. McKenna, K. L., et al., Blood 95, 3489-97, (2000)」、「E. Maraskovsky, et al., J Exp Med 184, 1953-62, (1996)、マウス及びヒトに於けるＦＬに刺激されたＤＣの機能」、「M. R. Shurin, et al., Cell Immunol 179, 174-84,(1997)」及び「E. Maraskovsky, et al., Blood 96, 878-84,(2000)、ＧＭ−ＣＳＦのＤＣ産生の活性化」を参照されたい。ＧＭ−ＣＳＦ又はＦＬの何れかがインビボで劇的にＤＣを増加させるが、生じたＤＣの表現型は多少異なるようであり、これらのサイトカインがＤＣにおいて異なる経路を活性化させることができることが示唆される。例えば、「E. Daro, et al., J Immunol 165, 49-58, (2000)」、「K. Brasel, et al., Blood 96, 3029-39, (2000)」、「P. Bjorck, Blood 98, 3520-6, (2001)」及び「P. J. O′Connell, et al., J Immunol 165, 795-803, (2000)」を参照されたい。ＧＭ−ＣＳＦはＣＤ１１ｂ−／ＣＤ１１ｃ＋のＤＣを主に増殖させるが、ＦＬは、特に、（骨髄の）ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ＋及び（リンパの）ＣＤ１１ｂ−／Ｃｄ１１ｃ＋の両方のＤＣサブセットを増殖させると思われる。
【００３３】
正常ＨＳＣｓでのリガンド結合において、ＦＬＴ３はホモ二量体化し、そのキナーゼ領域が活性化される。ＦＬＴ３キナーゼの活性化は、幾つかの結果をもたらす。ＦＬＴ３はチロシン残基上の多数の基質タンパク質を直接リン酸化し、次にこれらのタンパク質を活性化する。更に、ＦＬＴ３は、幾つかのチロシン残基上でそれ自体をリン酸化し、その後これらの残基はＳＨ２領域を含むアダプタータンパク質の多くと結合する。ＦＬＴ３シグナル伝達に関与すると見られるタンパク質には、ＰＩ−３キナーゼのｐ８５サブユニット、ＰＬＣｙ、ＶＡＶ、ＣＢＬ、ＣＲＫＬ、Ｇａｂ１及び２、ＳＨＰ２、ＳＨＩＰ、ＳＨＣ、並びにＳＴＡＴ５が挙げられる。最終的には、核に作用して細胞の遺伝プログラムを変更するシグナルを形質導入する結果となる。これらのシグナルの幾つかが増殖を刺激し、他のシグナルは細胞をアポトーシスから保護するか又は分化を推進すると思われる。
【００３４】
本発明者らは、特にＦＬＴ３の小分子阻害剤、例えば、ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５及びＣＥＰ−５２１４が、ＦＬＴ３シグナル伝達によって免疫応答を抑制できることを見出した。また、本発明者らは、抗ＦＬＴ３抗体が、受容体の活性化を阻害してＦＬＴ３シグナル伝達を妨げること、そしてアンチセンスＦＬＴ３分子もＦＬＴ３発現を妨げて、この結果ＦＬＴ３による免疫応答を阻害することも見出した。
【００３５】
一態様の細胞の免疫応答を抑制する方法には、真核細胞の細胞群を準備すること、そしてＦＬＴ３の活性を低下させるＦＬＴ３阻害剤の少なくとも１つを、細胞に接触させることを含む。本明細書で用いるＦＬＴ３の活性は、キナーゼ活性、下流シグナルを伝達する能力、自己リン酸化活性等を示す。
【００３６】
「投与」又は「投与すること」という用語は、本発明の化合物を、それらの意図された機能を発揮するように、対象へ導入する経路を含む。用いられる投与経路の例として、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、くも膜下腔内）、経口、吸入、直腸及び経皮が挙げられる。医薬製剤は、それぞれの投与経路に適した形態で投与してよい。例えば、これらの製剤は、錠剤又はカプセル剤の形態で、注射、吸入、点眼薬、軟膏、坐剤などにより投与さる。投与は注射、注入又は吸入により；局所へはローション剤又は軟膏により；直腸へは坐剤により投与される。経口投与が好ましい。注射はボーラスであっても、連続的な注入であってもよい。投与経路に応じて、本発明の化合物は、その意図される機能を発揮させる効能に悪影響を及ぼす自然状態から化合物を保護するように、選択された材料でコーティングするか又は処理することができる。本発明の化合物は、単独で、又は上記のその他の薬剤若しくは薬学的に許容される担体のどちらかと一緒に又は両方共一緒に投与できる。本発明の化合物は、その他の薬剤の投与前に投与しても、その薬剤と同時に投与しても、又はその薬剤の投与後に投与してもよい。更に、本発明の化合物は、インビボでその活性代謝物に、又はより活性のある代謝物に変換されるプリフォームの形で投与することもできる。
【００３７】
「アルキル」という用語は、飽和脂肪族基を示し、直鎖のアルキル基、分岐鎖のアルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換のシクロアルキル基、及びシクロアルキル置換のアルキル基が含まれる。アルキルという用語は、炭化水素骨格の１個又はそれ以上の炭素と置き換わる酸素、窒素、硫黄又はリン原子を更に含むアルキル基、例えば、酸素、窒素、硫黄又はリン原子を更に含む。好ましい態様では、直鎖又は分岐鎖アルキルは、その骨格中に３０個又はそれより少ない炭素原子（例えば、直鎖ではＣ１−Ｃ３０、分岐鎖ではＣ３−Ｃ３０）、好ましくは２６個又はそれより少ない、より好ましくは２０個又はそれより少ない、また更により好ましくは４個又はそれより少ない炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキル基は、その環構造中に３〜１０個の炭素原子を有し、より好ましくはその環構造中に３個、４個、５個、６個又は７個の炭素を有する。
【００３８】
更に、本明細書及び本文中で用いられるアルキルという用語は、「非置換アルキル」及び「置換アルキル」の両方を含み、後者は炭化水素骨格の１個又はそれ以上の炭素上の水素と置き換わる置換基を有するアルキル部分を示すことを意図する。このような置換基としては、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェイト、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェイト、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族若しくは芳香族複素環部分が挙げられる。当業者であれば、炭化水素鎖に置換する部分は、適切な場合にはそれら自体が置換することができることを当然理解するであろう。シクロアルキルは、例えば、上記の置換基でさらに置換することができる。「アルキルアリール」部分とは、アリールで置換されたアルキルである（例えば、フェニルメチル（ベンジル））。また、「アルキル」という用語には、上記のアルキルに鎖長及び置換の可能性が似ているが、少なくとも１つの二重結合又は三重結合を含む不飽和脂肪族基が含まれる。
【００３９】
炭素の数が別に指定されていない限り、本明細書において用いる「低級アルキル」は、上記に定義される通りであるが、その骨格構造中に１〜１０個の炭素、より好ましくは１〜６個、さらにより好ましくは１〜４個の炭素原子を有し、直鎖であっても分枝鎖であってもよい。低級アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどが挙げられる。好ましい態様では、「低級アルキル」という用語には、その骨格中に４個又はそれより少ない炭素原子を有する直鎖アルキル、例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキルが含まれる。
【００４０】
「アルケニル」及び「アルキニル」という用語は、上記のアルキルに鎖長及び置換の可能性が似ているが、少なくとも１つの二重結合又は三重結合を含む不飽和脂肪族基を示す。例えば、本発明では、シアノ基及びプロパルギル基を意図する。
【００４１】
本明細書で用いられる「アリール」という用語は、０〜４個のヘテロ原子を含んでもよい５員及び６員の単環芳香族基を含む、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン等のアリール基を示す。また、アリール基は、ナフチル、キノリル、インドリル等の多環式の縮合芳香族基を示す。環構造にヘテロ原子を有するアリール基も、「アリール複素環」、「ヘテロアリール」又は「芳香族複素環」として示される。芳香族環は、環の１つ又はそれ以上の位置で上記のような置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェイト、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェイト、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族若しくは芳香族複素環部分で置換することができる。アリール基は、また多環（例えば、テトラリン）を形成するような芳香族でない脂肪族環又は複素環と縮合又は架橋することができる。
【００４２】
本発明の化合物の「生物活性」という語には、応答細胞において本発明の化合物により発現する全ての活性が含まれる。それにはこれらの化合物により発現するゲノム活性及び非ゲノム活性が含まれる。
「生物学的組成物」又は「生体サンプル」とは、細胞若しくは生体高分子を含有するか又はそれらに由来する組成物を示す。細胞を含有する組成物としては、例えば、哺乳動物血液、赤血球濃縮物、血小板濃縮物、白血球濃縮液、血液細胞タンパク質、血漿、多血小板血漿、濃縮血漿、血漿の何れかの分画からの沈殿物、血漿の何れかの分画からの上清、血漿タンパク質画分、精製又は部分精製の血液タンパク質若しくはその他の成分、血清、精液、哺乳動物の初乳、乳、唾液、胎盤抽出物、クリオ沈殿物、クリオ上清、細胞ライセート、哺乳動物の細胞培養又は培地、発酵生成物、腹水、血液細胞に誘導されたタンパク質、及び正常細胞又は形質転換細胞により細胞培養中に（例えば、組換え型ＤＮＡ又はモノクローナル抗体技術によって）生成された生成物が挙げられる。生物学的組成物は無細胞であってもよい。好ましい態様では、好適な生物学的組成物又は生体サンプルは、赤血球懸濁液である。幾つかの態様では、血液細胞懸濁液には、哺乳動物の血液細胞が含まれる。血液細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタから得ることが好ましい。好ましい態様では、血液細胞懸濁液には、赤血球及び／又は血小板及び／又は白血球及び／又は骨髄細胞が含まれる。
【００４３】
「キラル」という用語は、鏡像相手と重ね合わせることができない特性を有する分子を示し、一方、「アキラル」という用語は、鏡像相手と重ね合わせることのできる分子を示す。
「ジアステレオマー」という用語は、不斉中心を２つ又はそれ以上含み、それらの分子が互いの鏡像でない、立体異性体を示す。
【００４４】
「有効量」という用語は、所望の結果を得る、つまりＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療するのに、必要な用量及び投与期間での有効な量である。本発明の化合物の有効量は、対象の疾病の状態、年齢、及び体重、並びに対象において所望の応答を発現させる本発明の化合物の効能のような要因によって変化する。用量の投与計画は、最適な治療応答を提供するように修正される。有効量は、また本発明の化合物の如何なる有毒又は有害な効果（例えば、副作用）をも、治療上有益な効果が上回る量でもある。
【００４５】
本明細書で用いられるＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患は、ＦＬＴ３に関連して、直接的又は間接的にＦＬＴ３によって発症する、すべての疾患又は症状を示す。ＦＬＴ３疾患及び関連の疾患としては、例えば、免疫関連の疾患及び神経変性疾患が挙げられる。免疫関連の疾患としては、例えば、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡並びにその他の自己免疫疾患のうちの１つ又はそれ以上のものである。本発明の方法はまた、骨髄非破壊的な処置療法及びそれらを組み合わせて施術した後に骨髄生着を促進させるためにも用いられてもよい。神経変性疾患としては、例えば、軸索変性疾患（例えば、多発性硬化症；多発性硬化症、急性横断性脊髄炎などの脱髄性疾患；並びに筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症などの運動単位の障害疾患を含む）；クロイツフェルト・ヤコブ病；又は亜急性硬化性全脳炎が挙げられる。
【００４６】
本発明の化合物の治療有効量（すなわち有効用量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ・体重、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ・体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ・体重、更により好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ・体重、２〜９ｍｇ／ｋｇ・体重、３〜８ｍｇ／ｋｇ・体重、４〜７ｍｇ／ｋｇ・体重、又は５〜６ｍｇ／ｋｇ・体重でありうる。当業者であれば、これらに限定されるものではないが、対象の疾病又は疾患の重篤度、治療歴、一般的な健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患をはじめとする特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要とされる用量に影響を及ぼすことを理解するであろう。更に、治療有効量の本発明の化合物での対象の治療には、１回の治療を含んでもよいし、好ましくは、連続治療を含んでもよい。一つの実施例では、本発明の化合物の約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ・体重を１週間当たりの１回の用量として、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、よりさらに好ましくは約４、５、又は６週間、対象を治療する。本発明の化合物の治療に用いられる有効用量を、特定の治療のコースで増加又は減少させてもよいことも理解される。治療は、化合物の最適な用量より少ない量から開始してもよい。その後、その治療状況下で最適な効果が得られるまで用量を少しずつ増加させてよい。便宜上、必要に応じて１日投与量の合計量を分割し、１日の間に少量ずつ投与してよい。本発明の化合物の治療有効量及び予防上有効な抗ウイルス量は、体重１キログラム当たり１日量を約０．１ミリグラム〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で変化すると予測される。
【００４７】
本明細書で用いる「対象から生体サンプルを得ること」は、本明細書に記載の方法での使用のためにサンプルを得ることを含む。生体サンプルは上記の通りである。
本明細書で用いる、それを必要とする対象を同定することは、自己確認によるか、又は医療専門家の診断により実施してよい。
本明細書で用いる、それを必要とする対象とは、ＦＬＴ３関連の疾患の予防的治療を必要とする対象、又はＦＬＴ３関連の疾患と診断された対象である。
【００４８】
「エナンチオマー」という用語は、１つの化合物の２つの立体異性体であって、互いに重ね合わせることのできない鏡像体を示す。２つのエナンチオマーの等モル混合物を、「ラセミ混合物」又は「ラセミ化合物」と呼ぶ。
【００４９】
「ハロアルキル」という用語は、ハロゲンでモノ−、ジ−又はポリ置換されている上記定義のアルキル基、例えば、フルオロメチル及びトリフルオロメチルを含むことを意図する。
「ハロゲン」という用語は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを表す。
「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨを意味する。
本明細書において用いる「ヘテロ原子」という用語は、炭素又は水素以外の全ての元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄及びリンである。
【００５０】
「ホメオスタシス」という用語は、内部環境において静的な、又は一定の状態を維持することを意味すると当該技術分野で認識されている。
「改良された生物学的特性」という語は、本発明の化合物がインビボでその有効性を向上させる、特有な活性の全てを示す。好ましい態様では、この用語は、毒性を軽減させる、例えば、高カルシウム血症活性を低下させるような、本発明の化合物が定性的又は定量的に改良する全ての治療特性を意味する。
【００５１】
「置換されていてもよい」という用語は、非置換の基、又は１つ又はそれ以上の置換可能な位置、具体的には１、２、３、４又は５位に、１個又はそれ以上の水素以外の好適な基（同一であっても異なっていてもよい）で置換されている基を包含することを意図する。このような任意の置換基としては、例えば、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、Ｃ２−Ｃ８アルキルエーテル、Ｃ３−Ｃ８アルカノン、Ｃ１−Ｃ８アルキルチオ、アミノ、モノ−又はジ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）アミノ、ハロＣ１−Ｃ８アルキル、ハロＣ１−Ｃ８アルコキシ、Ｃ１−Ｃ８アルカノイル、Ｃ２−Ｃ８アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ８アルコキシカルボニル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、モノ−又はジ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）アミノカルボニル、−ＳＯ２ＮＨ２、及び／又はモノ−又はジ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）スルホンアミド、更に炭素環基及び複素環基が挙げられる。また任意の置換基は、「０〜Ｘ個の置換基で置換されている」（ここに於けるＸは、可能な置換基数の最大数である）という語句でも示される。ある特定の置換されていてもよい基は、０個〜２個、３個又は４個のそれぞれ独立して選ばれる置換基で置換されている（すなわち非置換であるか又は挙げられる最大数までの置換基で置換されている）。
【００５２】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、非芳香族の、完全に飽和の３〜９員の単環式、８〜１２員の二環式、又は１１〜１４員の三環式であり、もし単環式であれば１〜３個のヘテロ原子、二環式であれば１〜６個のヘテロ原子、又は三環式であれば１〜９個のヘテロ原子を含む（前記ヘテロ原子がＯ、Ｎ、Ｓ、Ｂ、Ｐ又はＳｉから選択される）。ヘテロシクロアルキル基は、１個又はそれ以上の置換基で置換されていてもよい。一態様では、ヘテロシクロアルキル基の各環の０個、１個、２個、３個又は４個の原子は、置換基で置換されていてもよい。代表的なヘテロシクロアルキル基としては、ピペリジニル、ピペラジニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロリジニル、４−ピペリドニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニルスルホン（tetrahydrothiopyranyl sulfone）、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルスルホキシド、チオモルホリニルスルホン、１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、チイレンが挙げられる。
【００５３】
「異性体」又は「立体異性体」という用語は、同一の化学成分を有するが、原子又は基の空間での配置において異なる化合物を示す。本明細書において化合物は、全ての異性体及び立体異性体を含むことを意図する。
「調節する」という用語は、所望の最終結果、例えば治療成果が得られるように、本発明の化合物への曝露に応答して細胞の活性を増加又は低下させること、例えば、動物における細胞の少なくとも１亜集団の増殖の阻害及び／又は分化の誘導を示す。好ましい態様では、この語句には細胞のウイルス感染を含むものとする。
【００５４】
「ＦＬＴ３阻害剤を得ること」における「得ること」という用語は、阻害剤を購入すること、合成すること、又は別な方法で入手することを含むよう意図する。
本明細書で用いられる「非経口投与」及び「非経口投与した」という用語は、経腸投与及び局所投与以外の、通常は注射による投与方法を意味し、これらに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内及び胸骨内の注射及び注入が挙げられる。
【００５５】
「プロドラッグ」という用語は、インビボで代謝される部分を有する化合物が含まれる。一般に、プロドラッグは、インビボでエステラーゼによるか又はその他のメカニズムにより代謝されて、活性な薬物となる。プロドラッグ及びそれらの使用の例は、当該技術で公知である（例えば、「Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19」を参照願いたい）。プロドラッグは、化合物の最終的な単離及び精製時にそのまま調製するか、又は精製された化合物を個別にその遊離酸又はヒドロキシルの形態で、適したエステル化剤と反応させることにより調製することができる。ヒドロキシル基は、カルボン酸で処理することにより、エステルに変換することができる。プロドラッグ部分の例としては、置換及び非置換の、分枝若しくは非分枝の低級アルキルエステル部分（例えば、プロピオン酸（propionoic acid）エステル）、低級アルケニルエステル、ジ−低級アルキル−アミノ低級アルキルエステル（例えば、ジメチルアミノエチルエステル）、アシルアミノ低級アルキルエステル（例えば、アセチルオキシメチルエステル）、アシルオキシ低級アルキルエステル（例えば、ピバロイルオキシメチルエステル）、アリールエステル（フェニルエステル）、アリール−低級アルキルエステル（例えば、ベンジルエステル）、（例えば、メチル、ハロ、又はメトキシ置換基での）置換アリール及びアリール−低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、ジ−低級アルキルアミド、並びにドロキシアミドが挙げられる。好ましいプロドラッグ部分はプロピオン酸エステル及びアシルエステルである。インビボでその他のメカニズムによって活性な形態へ変換されるプロドラッグも含まれる。
【００５６】
化合物の「予防上有効な量」という語は、ＦＬＴ３関連の疾患の予防又は治療に患者に単一回又は複数回の投与で有効な、式（Ｉ）の化合物又は本明細書に記載の別な化合物を含む、本発明の化合物の量を示す。
「毒性を軽減させる」という語は、インビボで投与した場合に本発明の化合物により発現される何れかの望ましくない副作用の軽減、例えば高カルシウム血症活性を低下させることを含むよう意図される。
「スルフヒドリル」又は「チオール」という用語は、−ＳＨを意味する。
【００５７】
「対象」という用語には、ＦＬＴ３疾患若しくはＦＬＴ３関連の疾患を患う可能性のある、又は本発明の化合物の投与により別に利点を得ることのできる生物、例えばヒト及び非ヒト動物が含まれる。好ましいヒト動物には、本明細書に記載のように、ＦＬＴ３疾患、ＦＬＴ３関連の疾患又は関連する症状を患っているか又は患いやすいヒト患者が含まれる。本発明の「非ヒト動物」という用語は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばげっ歯類、例えばマウス及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、例えばヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが含まれる。ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患に感受性が高いとは、ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を発症するリスクのある対象、すなわち免疫抑制された対象を含むことを意味する。
【００５８】
本明細書で用いる「置換基」又は「置換された」という用語は、化合物又は基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、へテロアラルキル、シクロアルキル、シクリル、ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクリル基等）の水素基が、化合物の安定性に実質的な悪影響を与えない何れか所望の基で置換されることを意味する。一態様では、望ましい置換基は、化合物の活性に悪影響を与えない置換基である。化合物の活性に実質的に影響を与える置換基は、化合物のＩＣ５０値を１００□Ｍより大きくする置換基である。好ましい態様では、本発明の化合物は、アッセイ又は活性を示すテストにおいて、ＩＬ−１２に関連する（又はIＬ−２３若しくはＩＬ−２７に関連する）疾病又は症状の治療に有用なＩＣ５０値を有する。このようなアッセイは当業者に周知であり、例えば、本明細書に記載のアッセイ、例えば、実施例１２〜１４のアッセイが含まれる。好ましい態様では、アッセイは実施例１２のアッセイであり、化合物のＩＣ５０値は１．０ｍＭ未満、より好ましくは１００□Ｍ未満、より好ましくは１０□Ｍ未満、より好ましくは１□Ｍ未満、より好ましくは１００ｎＭ未満、及びより好ましくは１０ｎＭ未満である。「置換された」という用語は、水素原子を置き換えた１個又はそれ以上の各々の置換基（同一であっても、異なっていてもよい）を示す。置換基の例としては、これらに限定されるものではないが、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルアミノ、ジアリールアミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、オキソ（つまり、カルボニル）、チオ、イミノ、ホルミル、カルボアミド、カルバミル、カルボキシル、チオウレイド、チオシアナト（thiocyanato）、スルホアミド、スルホニルアルキル、スルホニルアリール、アルキル、アルケニル、アルコキシ、メルカプトアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、シクリル、ヘテロシクリルが挙げられ、ここにおけるアルキル、アルケニル、アルキルオキシ、アリール、ヘテロアリール、シクリル及びヘテロシクリルは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、メルカプト、シアノ、ニトロ、オキソ（＝Ｏ）、チオキソ（＝Ｓ）、又はイミノ（＝ＮＲｃ）で置換されていてもよい。
【００５９】
別の態様では、任意の基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、へテロアラルキル、シクロアルキル、シクリル、ヘテロシクロアルキル、及びヘテロシクリルのような）の置換基は、その任意の基の何れかの原子上にあり、この場合、置換基で置換されている任意の基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、へテロアラルキル、シクロアルキル、シクリル、ヘテロシクロアルキル、及びヘテロシクリルのような）は、１個又はそれ以上の置換基（同一であっても異なっていてもよい）で、水素原子を各々置き換えて置換されていてもよい。適した置換基の例としては、これらに限定されるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクリル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルキル、アラルキル、へテロアラルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ハロアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、オキソ（つまり、カルボニル）、カルボキシル、ホルミル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールオキシカルボニル、チオ、メルカプト、メルカプトアルキル、アリールスルホニル、アミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アルキルアミノカルボニル又はアルコキシカルボニルアミノ；アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アルキルカルボニル又はアリールアミノ置換アリール；アリールアルキルアミノ、アラルキルアミノカルボニル、アミド、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、イミノ、カルバミド、カルバミル、チオウレイド、チオシアナト、スルホアミド、スルホニルアルキル、スルホニルアリール又はメルカプトアルコキシが挙げられる。
【００６０】
本明細書で用いる「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」及び「末梢に投与される」という語句は、患者のシステムに入り、これにより代謝及びその他の類似のプロセスに従事するような、本発明の化合物、薬物又はその他の物質の投与、例えば皮下投与を意味する。
【００６１】
キラル中心の命名法に関して、「ｄ」及び「ｌ」の立体配置という用語は、ＩＵＰＡＣ勧告に定義される通りである。用語の使用に関して、ジアステレオマー、ラセミ化合物、エピマー及びエナンチオマーは、通常の文脈中で用いられて調製物の立体化学を説明する。天然に存在する異性体又は合成異性体は、当該技術で公知の幾つかの方法で分離することができる。２つのエナンチオマーからなるラセミ混合物の分離方法には、キラル固定相を用いるクロマトグラフィーが挙げられる（例えば、「"Chiral Liquid Chromatography," W. J. Lough, Ed. Chapman and Hall, New York (1989)」を参照願いたい）。エナンチオマーは、また古典的な分割技術により分離することもできる。例えば、ジアステレオマー塩の形成及び分別結晶法を用いて、エナンチオマーを分離することができる。カルボン酸のエナンチオマーの分離のために、ブルシン、キニーネ、エフェドリン、ストリキニーネ等のエナンチオマー的に純粋なキラル塩基の添加によりジアステレオマー塩を形成することができる。あるいは、メントールのようなエナンチオマー的に純粋なキラルアルコールを用いてジアステレオマーエステルを形成し、その後ジアステレオマーエステルの分離及び加水分解により、遊離したエナンチオマー濃縮のカルボン酸が得られる。アミノ化合物の光学異性体を分離するために、カンファースルホン酸、酒石酸、マンデル酸又は乳酸のようなキラルなカルボン酸又はスルホン酸を添加すると、ジアステレオマー塩が形成される。
【００６２】
本明細書で用いる「免疫応答の抑制すること」とは、細胞又は動物、特に哺乳動物の免疫応答を開始する又は持続する能力を低下させること、細胞の免疫賦活能を下方制御すること等を示す。例えば、ＦＬＴ３活性を低下させるとは、免疫応答を抑制すること、又はＦＴＬ３依存性シグナル伝達を低下させることの１つの例である。ＦＬＴ３によるシグナル伝達の「抑制」には、次の状態：減速、遅延及び停止と同等、のうちの何れか又は全てが含まれる。抑制することには、またアポトーシスまで到達するＤＣ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞が包含される。
【００６３】
「治療有効量」とは、臨床の成果を含む、有益な成果又は所望の成果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回又はそれ以上の投与回数で投与することができる。本発明の目的において、有効量の治療剤とは、疾病状態の進行を緩和する、症状を改善させる、症状を安定させる、症状の進行を逆戻りさせる、減速させる又は遅延させるために十分な量である。有効量とはまた、患者への単一回又は複数回の投与時に、又はＦＬＴ３疾患若しくはＦＬＴ３関連の疾患の患者の生存率を、このような治療を施さない時に予期される率より高めるのに有効な薬剤の量でもある。
【００６４】
本明細書で用いる「治療」又は対象を「治療すること」には、疾病又は疾患、疾病又は疾患の症状、又は疾病又は疾患のリスク（又は感染しやすいこと）を、治療、治癒、緩和、軽減、変更、是正、改善、好転させる又は影響を与える目的で、疾病又は疾患（例えば、免疫関連の疾患）を有するか、疾病又は障害疾患の症状を有するか、又は疾病又は障害疾患のリスクのある（又は感染しやすい）対象への治療剤（例えば、小分子、抗体又はアンチセンス核酸）の適用又は投与、又は対象に由来の細胞又は組織への治療剤の適用又は投与が含まれる。
【００６５】
前記の通り、ＦＬＴ３阻害剤には、小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗ＦＬＴ３抗体、抗ＦＬＴ３抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプチドをコードする核酸、有機分子及びそれらの何れかの組合せが含まれる。
【００６６】
ＦＬＴ３阻害に有用な小分子の例としては、ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５、ＣＥＰ−５２１４、ＣＥＰ−７０５５、ＰＫＣ４１２、ＳＵ１１２４８、ＳＵ５４１６、ＳＵ５６１４、ＭＬＮ５１８、ＢＡＹ４３−９００６、ＣＨＩＲ−２５８、アミノ−ベンゾイミダゾール−キノロン類、Ｋｉ２３８１９、スタウロスポリン誘導体及び発見されている又は発見されるであろうその他の分子が挙げられる。ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５、（「新規なＦＬＴ３拮抗薬・ＭＬＮ５１８のフェイズＩ臨床結果：許容性、薬物動態学及び薬力学（抄録）De Angelo, et al.,(2003) Blood 102, 219a」、「野生型（WT)又は突然変異のＦＬＴ３で特徴付けられる急性脊髄白血病（ＡＭＬ）／ハイリスク骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の患者（pts）でのチロシンキナーゼ阻害剤・ＰＫＣ４１２のランダムのフェイズＩＩ試行（抄録）Estey, et al.,(2003) Blood 102, 2270a」、「強力なＦＬＴ３阻害剤・ＭＬＮ５１８のＦＬＴ３ＩＴＤ白血病細胞系列でのシタラビン及びダウノルビシンとの相乗効果の提示（抄録）Heinrich, et al.,(2003) Blood 102, 330a」、「新規な選択的ＦＬＴ３拮抗薬・ＣＴ５３５１８の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）治療、Kelly, L. M., et al.(2002c), Cancer Cell 1, 421-432」、「ＦＬＴ３標的のチロシンキナーゼ阻害剤のインビトロ及びインビボでの白血病細胞への細胞毒性、Levis, M., et al.,(2002) Blood 99, 3885-3891」、「新規なＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤、Levis, M., and Small, D.(2003b) Expert Opin Investig Drugs 12, 1951-1962」、「インビトロ及びインビボで強力な活性を有する新規なＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤・ＳＵ１１２４８、O'Farrell, et al.,(2003a) Blood 101, 3597-3605」、「再発又は難治性の急性骨髄白血病の患者で生物活性及び臨床効果を示す新規なＦＬＴ３阻害剤・単一薬剤ＣＥＰ７０１、Smith, B. D., et al.,(2004) Blood, in press」、「ＡＭＬにおけるＦＬＴ３阻害剤・ＰＫＣ４１２療法：フェイズＩＩ試行の結果、Stone, R. M., et al.(2004) Ann Hematol 83 Suppl 1, S89-90」、「チロシンキナーゼ阻害剤によるＡＭＬ患者のＦＬＴ３内部の直列重複変異体の形質転換活性の阻害、Tse, K. F., et al.,(2002) Leukemia 16, 2027-2036」、「チロシンキナーゼ阻害剤の使用によるＦＬＴ３介在の形質転換の阻害、Tse, K. F., et al.,(2001) Leukemia 15, 1001-1010」、「小分子チロシンキナーゼ阻害剤・ＰＫＣ４１２による白血病細胞の変異体ＦＬＴ３受容体の阻害、Weisberg, E., et al.,(2002) Cancer Cell, 433-443」及び「ＳＵ５４１６及びＳＵ５６１４の野生型及び変異体ＦＬＴ３受容体チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性の阻害、Yee, K. W., et al.,(2002) Blood 100, 2941-2949」を参照願いたい。
【００６７】
「ｔ（４；１４）多発性骨髄腫の治療のためのＦＧＦＲ３を標的とする小分子阻害剤・ＣＨＩＲ２５８の臨床前研究、Suzanne Trudel et al.；presented at the 95th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, March 2004, in Orlando, FIa.」、「成長因子チロシンキナーゼ受容体の小分子阻害剤・ＣＨＩＲ２５８でのインビボの耐久性ある標的の調節と強力な抗腫瘍効果のある種々の服薬スケジュールとの関連、Sang Hoon Lee et al.;presented at the 95th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, March 2004, in Orlando, FIa.」、「インビボでの抗血管新生作用及び抗腫瘍作用と受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤・ＣＨＩＲ２５８による標的の調節との関連、Sang Hoon Lee et al.;presented as a Symposium Talk at the Keystone Symposium on Protein Kinases and Cancer」、「分子ベース療法の見込み、February 2004, in Silverthorne, Colo」及び「ヒトの急性骨髄性白血病の異種移植片治療におけるＦＬＴ３キナーゼ阻害剤・ＣＨＩＲ２５８の臨床前薬理、Daniel Menezes et al.;presented at the American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting December, 2003, in San Diego, Calif.」を参照願いたい。 Ｋｉ２３８１９は、「Leukemia (2005) 19, 930-935, 07 April 2005」に開示されている。各論文はあらゆる目的において参照してその全体を本明細書に取り込む。
【００６８】
本発明の方法で有用な化合物の更なる例として、以下の米国特許又は米国特許出願（公開番号で記載）、第２００５０１４３４４２号、第２００５０１４３３８２号、第２００５０１３７２０１号、第２００５００２０５７０号、第２００３０２１９８２７号、及び第２００４０１０６６１５号に記載される化合物が挙げられ、これらはあらゆる目的において参照してその全体を本明細書に取り込む。
【００６９】
本発明による使用に好ましいＦＬＴ３の阻害剤の例として、インドリノン化合物、ビス（１Ｈ−２−インドリル）−１−メタノン化合物、インドロカルバゾール化合物、及びキノキサリン化合物が挙げられ、好ましくはこのような化合物が本明細書に記載のようなＦＬＴ３阻害活性を示す。本発明による使用に特に好ましいＦＬＴ３阻害剤は、以下に表される化合物を含む。
【００７０】
【化００５】
【００７１】
本発明において有用なＦＬＴ３阻害化合物は、式Ｉ：
【００７２】
【化００６】
【００７３】
（式中、
Ｗは、Ｃ、Ｎ又はＯであってもよく；
Ｘは、Ｃ、Ｎ又は存在しない、であってもよく；
Ｙは、Ｃであってもよく；
Ｚは、Ｃ又はＮであってもよく；そして
Ｒ基は、以下のＲ１〜Ｒ５の置換されている可変基であってもよく：
Ｒ１は、Ｈ、アルコキシ、ヒドロキシル又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、アルコキシ又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ３は、Ｈ、Ｏ、アリール、ヘテロアリール又はＣ（Ｏ）ヘテロアリールであってもよく；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＨ−ヘテロアリール又は存在しない、であってもよく；
Ｒ５は、Ｈ、アリール、ヘテロアルキル／アリール又は存在しない、であってもよく；そして、
ＷＸ、ＷＹ、ＹＺ、ＹＲ３及びＺＲ４に於ける破線は、二重結合であってもよいことを示す）
で表される化合物を含む。
式Ｉの置換基は、本明細書に記載の置換基で置換されていてもよい。
【００７４】
本発明の治療法の特定の治療剤の有効性は、容易に判定することができる。例えば、好適な化合物をインビトロアッセイにより同定することができる。このアッセイはＦＬＴ３の自己リン酸化を阻害する効能についてのアッセイであり、次の工程、１）潜在的なＦＬＴ３阻害剤を細胞に接触させること、及び２）対照（つまり、１つ又は複数の潜在的な化合物で処理されていない同じ細胞）に対して、前記細胞のＦＬＴ３のリン酸化状態を測定すること、を含む。このような工程１）及び２）を含むような自己リン酸化アッセイは、本明細書において「標準ＦＬＴ３インビトロアッセイ」と定義され、「チロシンキナーゼ阻害剤を用いたＦＬＴ３介在の形質転換の阻害：Tse, K. F., Novelli, E., Civin, C. I., Bohmer, F. D., and Small, D.(2001) Leukemia, 15(7):1001-10」で考察されている。
【００７５】
有用である潜在的なＦＬＴ３阻害化合物を、後に続く実施例に開示されるように評価することもでき、それには、潜在的なＦＬＴ３阻害薬剤をＦＬＴ３受容体の活性レベルが高いマウスに投与すること、及び免疫応答の変化を測定することが含まれ、この場合、免疫応答の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であり得ることを示す。この場合、その潜在的に有用な化合物は、Ｉ型インターフェロンの活性を低下させるインターフェロン拮抗薬の添加又は同時投与をせずに有用である。しかし、ある特定の態様では、Ｉ型インターフェロンの活性を低下させるインターフェロン拮抗薬の添加が有用なこともある。本明細書で用いられる「インターフェロン拮抗薬」は、対象内の細胞又はインビトロ細胞においてＩ型インターフェロンの活性又は機能を低下させることのできる抗体、抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ポリペプチドをコードする核酸、有機分子又はそれらの何れかの組合せを包含する。
【００７６】
本発明の治療法での使用に好ましい治療剤は、標準インビトロＦＬＴ３阻害剤アッセイで測定して、少なくとも５０％、そして好ましくは９０％を上回ってＦＬＴ３活性を阻害する。より好ましくは、薬剤は、標準インビトロＦＬＴ３阻害剤アッセイにおいて、ＦＬＴ３活性を少なくとも約４５％又は６５％阻害し、さらにより好ましくは、ＦＬＴ３を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％阻害する。
【００７７】
本明細書で用いられる「抗体（antibody）」又は「抗体（antibodies）」という用語は、Ｆａｂ又はその抗原認識断片を含む、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを包含する全ての型の免疫グロブリンを示す。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってもよく、（例えば）マウス、ネズミ、ウサギ、ウマ又はヒトを含む種の何れかの種類であってもよく、又はキメラ抗体であってもよい。例えば、「M. Walker et al., Molec. Immunol. 26:403-11 (1989)」、「Morrision et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 81:6851 (1984)」及び「Neuberger et al., Nature 312:604 (1984)」を参照願いたい。抗体は、米国特許第４，４７４，８９３号（Reading）又は米国特許第４，８１６，５６７号（Cabilly et al.）に開示される方法に従って作製した組換えモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、また米国特許第４，６７６，９８０号（Segel et al.）に開示される方法に従って作製した特異的抗体により化学的に構築してもよい。抗体は、モノクローナル、キメラ、抗イディオタイプ、ヒト化、霊長類化及びそれらの何れかの組合せであってもよい。
【００７８】
ＦＬＴ３抗体には、その活性化を阻害するような方法でＦＬＴ３と結合する抗体が含まれる。これには、ＦＬＴ３と結合し、そしてＦＬＴ３に結合するＦＬをブロックするか又はＦＬＴ３の立体構造の変化を引き起こすかのどちらかで、そのシグナルを送る能力を遮断して、ＦＬＴ３を活性化するＦＬの能力を阻害する、ポリクローナル及びモノクローナルの両方の抗体を含む。このような抗体に関しての「結合しない」という用語は、ＦＬＴ３に結合することと比較して、実質的に反応しないことを意味する。ＦＬＴ３抗体の例としては、ＩＭＣ−ＮＣ７及びＩＭＣ−ＥＢ１０が挙げられる（完全なヒト抗ＦＬＴ３中和の抗体による野生型又はＩＴＤ変異体のＦＬＴ受容体を発現するモデルにおけるヒト白血病の抑制：Li, Y., Li, H., Wang, M., Lu, D., Wu, Y., Bassi, R., Zhang, H., Ludwig, D., Pytowski, B., Kussie, P., Piloto, O., Small, D., Bohlen, P., Witte, L., Zhu, Z., and Hicklin, DJ. Blood (Epub 2004, in press, 2004））。
【００７９】
抗体は、リン酸化ＦＴＬ３又は非リン酸化ＦＴＬ３と結合する抗体を含んでいてもよい。抗体は、リン酸化又は非リン酸化ＦＴＬ３の何れかに特異的であってもよい。抗体との関連で本明細書で用いられる特異的とは、ＦＴＬ３を識別し、ＦＴＬ３と独占的に結合する抗体の能力を示す。
リン酸化又は非リン酸化ＦＬＴ３を識別する抗体はまた、本発明のＦＬＴ３阻害剤の有効性又は細胞若しくは対象の免疫応答の抑制を測定するのに有用でありえる。例えば、リン酸化ＦＬＴ３のレベルは、このような抗体を用いて、例えばウエスタンブロットによって測定することができる。
【００８０】
当該技術で公知の種々の手順が、ＦＬＴ３に対する抗体又はそのタンパク質の断片、誘導体、同族体若しくは類似体の製造に用いられる。本発明の抗体は、これらに限定されるものではないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え作製された抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（二重特異性ｓｃＦｖを含む）、一本鎖抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合のＦｖｓ（ｓｄＦｖ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、並びに上記の何れかのエピトープ結合断片が挙げられる。特に、本発明の抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位（例えば、抗体の１つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ））を有する分子が挙げられる。
【００８１】
抗体の製造のため、例えば、天然のＦＬＴ３タンパク質若しくは合成体、又は前述の誘導体を用いて注射により種々の宿主動物を免疫化することができる。このような宿主動物には、これらに限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ネズミなどが挙げられる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて、免疫応答を増加させることができ、そのようなアジュバントとして、これらに限定されるものではないが、（完全及び不完全な）フロイント、（水酸化アルミニウムのような）無機物ゲル、（リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールのような）界面活性物質、及び（カルメット・ゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin：ＢＣＧ）及びコリネバクテリウム属パルバム（Corynebacterium parvum）のような）潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。ＦＬＴ３又はその誘導体、断片、同族体若しくは類似体に対するモノクローナル抗体の製造のためには、連続継代培養細胞系による抗体分子の製造に提供される何れの技術を用いてもよい。
【００８２】
このような技術としては、これらに限定されないが、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に開発されたハイブリドーマ法（1975, Nature 256:495-497）、トリオーマ法（Gustafsson et al., 1991, Hum. Antibodies Hybridomas 2:26-32）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72）、及びヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ法（Cole et al., 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられる。本発明の追加の態様では、モノクローナル抗体は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５号に記載される最近の技術を用いて無菌動物において産生することができる。ＦＬＴ３のイディオタイプを含む抗体断片は、当該技術で公知の技術により生成することができる。例えば、このような断片には、これらに限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により産生できるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を少なくすることにより産生できるＦａｂ’断片；抗体分子をパパイン及び還元剤で処理して産生できるＦａｂ断片；及びＦｖ断片、が挙げられる。合成抗体、例えば化学合成により産生される抗体は、本発明において有用である。
【００８３】
標的ＦＬＴ３ｍＲＮＡ配列と結合することのできる（二重鎖を形成する）、又は二本鎖ＤＮＡヘリックス中のＦＬＴ３配列と結合することのできる（三重ヘリックスを形成する）、一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡの何れか）を含むアンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドを、本発明に従って産生できる。本発明によれば、アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドは、ＦＬＴ３ｃＤＮＡのコーディング領域の断片を含む。このような断片は、一般に少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは、約１４〜約３０ヌクレオチドを含む。所与のタンパク質のｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドを産生できることは、例えば、「Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988」及び「van der Krol et al., Bio Techniques 6:958, 1988」に記載されている。アンチセンス・オリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｓｍａｌｌ、Ｄ．、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ、Ｍ．、Ｋｉｍ、Ｅ．Ｋ．、Ｃａｒｏｗ、Ｃ、Ａｍｉｎ、Ｓ．、Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、Ｐ．、Ｗｉｔｔｅ、Ｌ．、Ｂｕｒｒｏｗ、Ｃ、Ｒａｔａｊｃｚａｋ、Ｍ．、Ｇｅｗｉｒｔｚ、Ａ．Ｍ．及びＣｉｖｉｎ、Ｃ．Ｉ．が挙げられる。Ｆｌｋ−２／ＦＬＴ３のヒト同族体である、ＳＴＫ−１は、ＣＤ３４＋ヒト骨髄細胞で選択的に発現し、早期の前駆体／幹細胞の増殖に関与する。「Proc. Natl. Acad. Sci. 91:459-463, 1994」を参照願いたい。図９に配列を示す。有用な配列としては、図９に示した全配列又はその生物学的に活性な断片が挙げられる。当業者であれば、通常の方法でそれらの有用な断片を容易に同定することができるであろう。
【００８４】
アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドと標的核酸配列との結合の結果、二重鎖の分解促進、転写又は翻訳の早期終止、又はその他の方法を含む幾つかの方法のうちの一方法により、翻訳（ＲＮＡ）又は転写（ＤＮＡ）を阻害する複合体が形成される。従ってアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＦＬＴ３タンパク質の発現を阻害するのに用いることができる。アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドは、修飾された糖−ホスホジエステル骨格（又はＷＯ９１／０６６２９号に記載のようなその他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを更に含み、この場合、このような糖結合は内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性を示す。抵抗性のある糖結合を有するこのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定している（つまり、酵素分解に抵抗することができる）が、標的ヌクレオチド配列と結合できる配列特異性を保持する。センス又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドのその他の例としては、ＷＯ９０／１０４４８号に記載のような有機部分、及びポリ−（Ｌ−リシン）のようなオリゴヌクレオチドの標的核酸配列に対する親和性を高めたその他の部分と、共有結合しているオリゴヌクレオチドが挙げられる。なお更に、エリプチシンのようなインターカレート剤、及びアルキル化剤又は金属錯体を、センス又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドに付着させてアンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列に対する結合特異性を修飾してもよい。
【００８５】
アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４に媒介されるＤＮＡトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又はエプスタイン−バーウイルス（Epstein-Barr virus）のような遺伝子導入ベクターを用いることによる、を含む何れかの遺伝子導入法により標的核酸配列を含有する細胞へ導入してよい。アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドは、インビボ又はエキソビボの何れかで、アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドを好適なレトロウイルスベクターへ挿入し、次に挿入された配列を含有するレトロウイルスベクターを、標的核酸配列を含有する細胞に接触させることによって、導入することが好ましい。好適なレトロウイルスベクターとしては、これらに限定されるものではないが、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと名付けられたダブルコピーベクター（ＰＣＴ出願米国９０／０２６５６号を参照願いたい）が挙げられる。
【００８６】
センス又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドを、ＷＯ９１／０４７５３号に記載のように、リガンド結合分子との結合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含有する細胞へ導入してもよい。好適なリガンド結合分子として、これらに限定されるものではないが、細胞表面受容体、増殖因子、その他のサイトカイン、又は細胞表面受容体と結合するその他のリガンドが挙げられる。リガンド結合分子の結合が、リガンド結合分子のその対応する分子又は受容体と結合する能力を実質的に干渉しないか、又はセンス若しくはアンチセンス・オリゴヌクレオチド又はその結合体の細胞への進入を阻害しないことが好ましい。
【００８７】
あるいは、センス又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８号に記載のように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含有する細胞へ導入してもよい。センス又はアンチセンス・オリゴヌクレオチド−脂質複合体は、細胞内で内在性リパーゼにより分離されることが好ましい。
【００８８】
ポリヌクレオチドの例として、限定するものではないが以下の通りである：遺伝子又は遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え型ポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体のような修飾されたヌクレオチド、ウラシル（uracyl）、その他の糖類及びフルオロリボースとチオエートのような結合基、並びにヌクレオチドの分枝物、を包含していてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合の後更に、標識成分との結合による修飾をしてもよい。この定義に含まれるその他の型の修飾としては、キャップ、１個又はそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体での置換、及びタンパク質、金属イオン、標識成分、その他のポリヌクレオチド又は固相支持体にポリヌクレオチドを接着させる手段の導入、が挙げられる。ポリヌクレオチドはＤＮＡであることが好ましい。本明細書で用いられる「ＤＮＡ」には、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧを含むだけでなく、メチル化ヌクレオチドのようなそれらの類似体又はこれらの塩基の修飾された形態の何れか、非荷電結合及びチオエートのようなヌクレオチド間修飾、糖類似体の使用、並びにポリアミドのような修飾及び／又は代替骨格構造も含まれる。ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域は、別な配列に対して特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％、又は９５％）の「配列同一性」を有し、２つの配列を比較して整列させた場合、そのパーセンテージの塩基が同一であることを意味する。このアラインメント及びホモロジー又は配列同一性パーセントは、当該技術で公知のソフトウェアプログラム、例えば、「Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, section 7.7.18」に記載のものを用いて判定することができる。好ましいアラインメントプログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Scientific and Educational Software, Pennsylvania）であり、デフォルトパラメータを用いることが好ましく、デフォルトパラメータは次の通りである：ｍｉｓｍａｔｃｈ＝２；ｏｐｅｎ ｇａｐ＝０；ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ＝２。
【００８９】
本発明の一態様では、インターフェロン拮抗薬は、Ｉ型インターフェロンとその受容体との結合を減少させる。別の態様では、インターフェロン拮抗薬は、インターフェロンが対象の細胞上の受容体と結合した後にシグナル伝達を干渉する。別の態様では、インターフェロン拮抗薬は、対象の細胞によるインターフェロンの産生を低下させる。別の態様では、インターフェロン拮抗薬は、対象において細胞によるインターフェロン分泌を減少させる。さらに別の態様では、インターフェロン拮抗薬は、対象のインターフェロンのバイオアベイラビリティを低下させる。更なる態様では、インターフェロン拮抗薬はＴＮＦである。
【００９０】
本明細書で用いられる「Ｉ型インターフェロン」は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−varpi、及びＩＦＮ−τを含む。「Oritani et al. (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12(4): 337-48」には、Ｉ型インターフェロンのその他の例が記載されている。
インターフェロン拮抗薬は、（ＩＦＮ−αのような）Ｉ型インターフェロンとその受容体との間の相互作用を妨げ、その結果、抗原提示細胞となるＤＣへの単球の分化を減少させることにより、抗原提示細胞の産生の減少をもたらす。抗原提示細胞の産生の減少は、１つ又はそれ以上の異なる機構により達成されるが、それが起こる厳密な機構は本発明では重大ではない。例えば、ＴＮＦ及び／又はアゴニストの抗ＴＮＦ受容体抗体は、ｐＤＣのＩ型ＩＦＮ非産生細胞への分化を促進することによりＩ型インターフェロン分泌を低下させることができる。
【００９１】
ある化合物が本発明で有用なインターフェロン拮抗薬であるかどうかを、同定するために実行することのできるアッセイは多数存在する。これらのアッセイは、当業者には周知である。１つのアッセイは、単球のＤＣへの分化に適した条件下で、テストする化合物を単球培養物に添加する、樹状細胞分化アッセイである。単球のＤＣへの分化を誘導するために、この条件には、ＳＬＥ血清又はインターフェロンの何れかの添加されている。従って、化合物を添加していない培養中の単球の分化と比較して、化合物が、インターフェロン及び／又はＳＬＥ血清が導く単球のＤＣへの分化を阻害するならば、その化合物はインターフェロン拮抗薬である。
【００９２】
インターフェロン拮抗薬である化合物を同定する別のアッセイは、標識されたインターフェロンの細胞上の受容体への結合を阻害するのを測定する結合実験である。化合物が、インターフェロンとその受容体との結合、又はインターフェロンとインターフェロン受容体を有する細胞との結合を阻害することができるならば、その化合物はインターフェロン拮抗薬である。
【００９３】
更に、化合物がインターフェロン拮抗薬であるかどうかを判定するアッセイは、通常インターフェロン産生及び／又は分泌を誘導する誘因、例えばウイルスに応答した細胞によるインターフェロンの産生を阻害する程度を測定するアッセイである。従って、化合物及び誘因（例えばウイルス）の存在下で、通常はインターフェロンを産生する細胞がインターフェロンを産生しないか、又は低いレベルでしかインターフェロンを産生しないならば、その化合物はインターフェロン阻害剤である。
【００９４】
一態様では、治療有効量のインターフェロン拮抗薬を同定するアッセイは、治療中の対象から採取した血清へのインターフェロン受容体のインビトロでの結合を減少させるのに必要なインターフェロン拮抗薬の量を測定することである。本明細書の実施例では、インビトロで結合を５０％減らすのに必要な濃度が、インビボで治療上有効となる。
【００９５】
本発明の一態様では、インターフェロン拮抗薬は、抗ＩＦＮ−α抗体又はその抗原結合断片を含む。本発明の別の実施形態では、インターフェロン拮抗薬はＴＮＦである。本発明の一態様において、組成物の要素でありえる抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体及びそれらの何れかの組合せを含む。
特定の態様では、本発明の方法は、免疫応答の発生を抑制すること、遅らせること、高まった免疫応答を治療すること、又は細胞の免疫応答を低下させることを提供する。
【００９６】
本発明の治療法には、免疫関連の疾患（特に、臓器移植の結果として）又はその他の免疫関連の疾患を患う哺乳動物細胞若しくは哺乳動物対象を選択すること、又は同定することが含まれる。治療のための細胞の例としては、種々の真核細胞、例えばＤＣ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
また、本発明は、対象の免疫関連の疾患を治療する方法を提供する。この方法は、対象に治療有効量のＦＬＴ３阻害剤を投与してＦＬＴ３の活性を低下させることを含む。
【００９７】
治療方法は、対象のＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療する方法を提供する。対象は哺乳動物であってよく、この場合の哺乳動物は、ヒト、霊長類、ネズミ、イヌ、ネコ又はマウスである。方法には、特に、移植後の臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、低ガンマグロブリン症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡の結果としての、免疫関連の疾患を患っているか若しくは潜在的に患っている、又は患うリスクの高いグループにいる哺乳動物対象を同定する工程が含まれる。本発明の方法は、骨髄非破壊的な処置療法又はそれらを組み合わせて施術した後の骨髄生着を促進させるためにも用いてもよい。対象が同定されると直ちに、ＦＬＴ３の活性を低下させるために、治療有効量のＦＬＴ３阻害剤を投与する。ある特定の態様によれば、ＦＬＴ３阻害剤は対象のＦＬＴ３依存性シグナル伝達を低下させる。この方法は、Ｔ細胞阻害剤の同時投与を更に含んでいてもよい。好適なＴ細胞阻害剤の例は、後で考察される。
【００９８】
その他の態様によれば、投与したＦＬＴ３阻害剤は、対象の免疫賦活能を下方制御する。患者の自己免疫疾患を治療する方法は、患者の樹状細胞の数を減らすのに十分な量のＦＬＴ３阻害剤を投与する工程を含んでもよい。更に、それを必要とする患者に治療有効量のＦＬＴ３阻害剤を投与することにより、移植片並びに移植された組織及び臓器の生着を促進するための方法が含まれる。
【００９９】
本発明は、臓器移植、肺移植、肝臓移植等のための外科手術をうける患者に、１つ又はそれ以上の本発明の化合物を投与することを含む、特に、治療のための方法を提供する。従って、免疫応答及び潜在的な臓器拒絶反応を減少させるために、１つ又はそれ以上の本発明の化合物の有効量を、手術前に、及び／又は手術時前後に、及び／又は手術後に投与することができる。
【０１００】
ＦＴＬ３阻害剤は、例えば、１日に１回、１日に２回、１日に３回又は１日に４回投与してよい。ＦＴＬ３阻害剤は、例えば、錠剤形態、粉末形態、液体形態で又はカプセル剤で投与できる。毎日投与されるＦＴＬ３阻害剤の量は、対象の体重、年齢、健康状態、性別又は病状に基づいて増加させても減少させてもよい。
【０１０１】
本発明の方法は、免疫抑制療法及び／若しくは予防法を提供するため、又は神経系の疾患からの保護若しくは神経系の疾患の治療を提供するために、哺乳動物対象、例えばヒトの治療に特に有用である。具体的に、このような対象として、移植片対宿主病、糖尿病１型、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、及び狼瘡のような、免疫関連の疾患に苦しむ対象が挙げられる。
【０１０２】
これらの方法による治療に適した個体として、免疫関連の疾患の初期又は後期にある個体、更に治療、例えば臓器移植を受けたか又は受ける直前の個体を含む、免疫関連の疾患を有する又は免疫関連の疾患の疑いのある個体が挙げられる。本明細書に記載される方法に適したその他の個体は、関節炎、糖尿病１型、関節リウマチ、クローン病又は多発性硬化症の発症に対して遺伝的素因を有する個体、及び／又は免疫関連の疾患の発症と関連がある薬剤に曝された個体、のような免疫関連の疾患を発症するリスクが高いと考えられる個体である。
【０１０３】
免疫関連の疾患の存在及び本明細書に記載される方法を受ける個体の適合性は、イメージング技術、血清マーカーの分析及び生検のような診断方法を含む、当該技術で公知の何れかの技術により確定することができる。
【０１０４】
別の態様において、本発明の方法では、これらに限定されるものではないが、プロテアーゼ阻害剤、抗炎症薬剤、Ｔ細胞阻害剤、化学療法薬剤、抗炎症薬剤、解熱剤、増感剤、放射線防護剤、泌尿器薬剤、制吐薬剤、及び／又は下痢止め薬剤等を含む、免疫関連の疾患のその他の既知治療と併せて投与する、すなわち同時投与することができる。例としては、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、メトトレキサート、タクロリムス、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、パクリタキセル、フルオロウラシル、カペシタビン、ゲムシタビン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、マイトマイシン、ゲフィチニブ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、アセトアミノフェン、ミソニダゾール、アミフォスチン、タムスロシン、フェナゾピリジン、オンダンセトロン、グラニセトロン、アロセトロン、パロノセトロン、プロメタジン、プロクロルペラジン、トリメトベンザミド、アプレピタント、アトロピン含有ジフェノキシレートが挙げられる。本発明のＦＬＴ３阻害剤と同時投与されるのに適した化合物のその他の例は、「Progress in Drug Research, "Recent advances in immunosuppressants," Bijoy Kundu and Sanjay K. Khare, Vol. 52 (E. Jucker, Ed.), 1999, Birkhauser Verlag, Basel (Switzerland)」に見られる。このような付加的治療及び／又は薬剤の投与は、本発明の方法に含まれるものとする。
【０１０５】
本発明の方法で用いる化合物は、鼻腔内に、経口的に、又は注射、例えば筋肉内、腹腔内、皮下若しくは静脈注射により、又は経皮、眼内若しくは腸内への手段で投与することができる。最適な用量は、従来の手段により決定することができる。本発明の方法で用いる化合物は、プロトン化された形態及び水溶性の形態で、例えば、有機酸若しくは無機酸の医薬上許容され得る塩、例えば、塩酸塩、硫酸、ヘミ硫酸、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩などとして、対象へ投与されることが適している。
【０１０６】
本発明の方法で用いる化合物は、単独で用いるか、又は上記に考察される１つ又はそれ以上のその他の治療剤と組み合わせて、従来型の賦形剤と、すなわち活性化合物と有害な反応を起こさず、そのレシピエントに有害でない、非経口、腸内又は鼻腔内適用に適した薬学的に許容される有機担体物質又は無機担体物質と混合した医薬組成物として用いることができる。好適な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペトロエトラル（petroethral）脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。医薬製剤は、滅菌し、必要に応じて助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、バッファー、着色剤、香味料及び／又は芳香剤、並びに活性化合物と有害な反応を起こさない同様な物と混合することができる。
【０１０７】
非経口適用のためには、溶液が特に適しており、好ましくは、油性又は水溶液、更に懸濁液、エマルジョン又は坐剤を含むインプラントである。アンプルは、便宜な投与量単位である。腸内適用のためには、タルク及び／又は炭水化物担体結合剤等を有する錠剤、糖衣錠又はカプセル剤が特に適し、担体は好ましくは、ラクトース及び／又はトウモロコシデンプン及び／又はジャガイモデンプンである。シロップ剤、エリキシル剤等は、加糖媒体を使用することができる。徐放性組成物は、有効成分を、例えばマイクロカプセル化、多重コーティング等による、区別をつけた分解が可能なコーティングで保護するような方法で製剤化できる。局所適用のためには、本発明の化合物の１つ又はそれ以上を含有する局所用軟膏又はクリーム中に調製して製剤にしてよい。軟膏として処方する場合は、本発明の化合物の１つ又はそれ以上をパラフィン又は水混和性基剤の何れかと一緒に用いることが適している。１つ又はそれ以上の化合物をまた、水中油型クリーム基剤を用いて処方することもできる。その他の適した局所製剤としては、例えばトローチ剤及び皮膚パッチが挙げられる。静脈投与又は非経口投与、例えば、皮下、腹膜内又は筋肉内投与が一般に好ましい。
【０１０８】
当然のことであるが、所与の療法で用いられる活性化合物の実際に好ましい量は、用いる具体的な化合物、処方される特定の組成物、適用様式、特定の投与部位等に応じて変動する。所与の投与プロトコルに対する最適な投与割合は、当業者が、前述の指針に関して実施される従来の投与量決定テストを用いて容易に確認することができる。所望の用量は、１日に１回投与するか、又は数回に分割した用量、例えば２〜４回に分割した用量を、１日の適当な間隔で投与するか、又はその他の適当なスケジュールで投与するのが適している。
【０１０９】
恒常的に活性化されたＦＬＴ３受容体を有するトランスジェニック非ヒト動物も、また提供される。特に、恒常的に活性なＦＬＴ３遺伝子をそのゲノムに挿入した「Ｔｅｌ−ＦＬＴ３トランスジェニックマウス」として知られる、トランスジェニックマウスが提供される。Ｔｅｌ−ＦＬＴ３トランスジェニックマウスは、当該技術で公知の標準的なトランスジェニック技術に従って作製された。ＦＬＴ３トランスジェニックマウスは、その脾臓及びリンパ節中のＤＣの数が非常に増加している。
【０１１０】
トランスジェニック動物を用いて、治療剤をテストする方法が提供される。例えば、方法の工程には、トランスジェニック動物、好ましくは恒常的に又は制御できる活性なＦＬＴ３遺伝子を有するマウスを準備することが含まれる。方法には、また動物に治療剤を投与すること及び治療剤の効果を判定するために動物の免疫応答を測定することが含まれる。例えば、ＤＣの数を測定することができ、その場合、ＤＣ数の減少が動物の免疫応答の低下を示す。Ｔ細胞の数も投与後に測定することができ、その場合、Ｔ細胞の数の減少が動物の免疫応答の低下を示す。ＦＬＴ３のリン酸化状態も、細胞又は対象の免疫応答が本発明のＦＬＴ３阻害剤の投与後に抑制されていることを示す指標として用いてもよい。例えば、リン酸化されたＦＬＴ３の量は、本発明の方法のＦＬＴ３阻害剤を投与した細胞又は対象において減少してもよい。ある特定の態様によればトランスジェニック動物は、免疫関連の疾患の有用なモデルである。例えば、ある特定の免疫関連の疾患を患っているヒトは、ＤＣ、Ｔ細胞、及び／又はＮＫ細胞の数が増加している。
【０１１１】
本発明は、またインビトロ及びインビボでの活性から治療剤をスクリーニングする方法を提供する。例えば、治療剤を細胞へ投与し、次いでその細胞の免疫応答の低下を調べる。具体的には骨髄細胞、より具体的には動物の骨髄から産生されたＤＣが、特に有用である。その他の有用な細胞種及び／又は系統としては、混合リンパ球、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。治療剤のスクリーニングの方法のようなインビトロ適用のためには、マルチウェルプレート又はその他の反応基質を用いることが適している。
【０１１２】
免疫関連の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法には、ＦＬＴ３受容体の活性レベルの高いマウスに薬剤を投与すること、そして免疫応答の変化を測定することが含まれ、この方法では、免疫応答の低下が、免疫関連の疾患の治療にその薬剤が有用でありうることを示す。免疫応答の変化とは、特に、ＤＣ細胞、ＮＫ細胞及び／又はＢ細胞の数の減少である。免疫応答の変化は、またＤＣ共刺激タンパク質のレベル判定により測定することもでき、その場合、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルの低下が、免疫関連の疾患の治療にその薬剤が有用でありうることを示す。ある特定の態様によれば、測定されるＤＣ共刺激タンパク質は、Ｂ７−ＤＣである。特定の態様によれば、免疫応答の測定というのは、同じ治療剤のその他の異なった用量又は対照と比較して、当該細胞の数を測定することであってもよい。測定される細胞は、例えば、ＤＣ細胞、ＮＫ細胞、脾細胞、混合骨髄細胞、Ｔ細胞及びそれらの混合物であってもよい。
【０１１３】
ある特定の態様によれば、免疫応答の変化は、Ｔ細胞増殖アッセイで測定してもよく、その場合、Ｔ細胞増殖の低下が、免疫関連の疾患の治療にその薬剤が有用でありうることを示す。
また、本発明は、インビボでの活性から治療剤をスクリーニングする方法を提供する。例えば、治療剤を哺乳動物へ投与し、次いでその細胞の免疫応答の低下を調べる。具体的には、ＦＬＴ３受容体が恒常的に活性化されているトランスジェニックマウスが作製される。このマウスは、脾臓及びリンパ節中のＤＣの数が非常に増加している。ＦＬＴ３遺伝子が失活しているノックアウトマウスが作製された（K. Mackarehtschian, J.D. Hardin, K.A. Moore, et al., Immunity 3, 147-61(1995)）。Ｂリンパ球前駆体細胞についてはその数の低下が見られるが、末梢のＢリンパ球は影響を受けなかった。ＤＣについては、これらのマウスでは調べていない。
【０１１４】
免疫応答抑制の方法が、下記の考察で実証されているが、上記の別法も同様に適用可能であり、そして好適なものであり、これらの方法のエンドポイント（例えば、治療の有効性）は、周知の診断法及び評価法を含む当該技術の標準法を用いて測定されることが当然理解されるであろう。
本発明を以下の実施例により更に説明するが、これら実施例は何ら本発明を限定するものではないと解釈されたい。本明細書を通じて引用される参考文献、特許及び公開された特許出願、並びに図及び配列表は、内容を参照してその全てを本明細書に取り込む。
【実施例１】
【０１１５】
ＦＬＴ３阻害剤での成熟ＤＣの処置は、成熟ＤＣにおけるアポトーシスを誘導する。
ＦＬＴ３阻害剤に暴露した場合の、ＤＣの生存及び機能を調査した。成熟ＤＣを、ＣＥＰ７０１、５２１４及びＡＧ１２９６に対する用量反応分析で、ＧＭ−ＣＳＦ＋／−ＦＬの存在下でインキュベートした。ＤＣの生存及び活性の減少が観察された。
【０１１６】
マウスの四肢の骨髄（ＢＭ）を、ＰＢＳで洗い流し、赤血球（ＲＢＣ）を低張緩衝液に溶解し、細胞を洗浄した後、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）又はＧＭ＋ＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）含有培地に２×１０６細胞／ｍｌで蒔いた。２、４及び６日目に、非接着細胞を除去し、接着細胞を洗浄した後に、新鮮な培地を添加した。８日目に、非接着成熟ＤＣを収集し、ＣＥＰ−７０１の非存在下又は存在下で、５又は５０ｎＭで再び蒔いた。２４時間後、細胞を次にＦＡＣＳ分析のために染色した。ＣＤ１１ｃ＋細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ発現及びアネキシンＶ結合について評価した（図１Ａ）。ＣＥＰ−７０１は、ＧＭ−ＣＳＦ単独又はＧＭ−ＣＳＦとＦＬの組合せのどちらかで、産生したＤＣのアポトーシスを誘導した。これらの結果は、ＣＥＰ−５２１４（データは示されていない）及びＡＧ１２９６を含む、２種類の他のＦＬＴ３阻害剤を用いても確認された。
【０１１７】
図１Ｂは、マウスの四肢のＢＭをＰＢＳで洗い流し、ＲＢＣを溶解し、細胞を洗浄することにより生じたＤＣの刺激の結果を示す。洗浄後、細胞をＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）＋ＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）含有培地に２×１０６細胞／ｍｌで蒔いた。２、４及び６日目に、非接着細胞を除去し、接着細胞を洗浄した後に、新鮮な培地を添加した。８日目に、非接着成熟ＤＣを収集し、ＡＧ１２９６の非存在下又は存在下で再び蒔いた。２４時間後、細胞をＦＡＣＳ分析のために染色した。樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋細胞）を、ＣＤ８６発現及びアネキシンＶ結合について評価した（図１Ｂ）。ＡＧ１２９６は、ＤＣにおいて用量依存的にアポトーシスを誘導した。このように、ＦＬＴ３阻害は、ＤＣにおいて用量依存的に細胞死を誘導することができる。ＤＣは抗原の提示及びＴ細胞の活性化を担うため、ＤＣを死滅させること、ＦＬＴ３によるＤＣシグナル伝達を抑制すること、又はＦＬＴ３を阻害することによるＤＣの細胞生成を妨げることは、免疫系のＴ細胞アームの抑制に効果があると思われる。ＤＣがＴ細胞を活性化させるために、ＤＣはＭＨＣ分子と結合している抗原を提示し、その表面に共刺激タンパク質を発現させる。
【０１１８】
ＤＣによる共刺激タンパク質発現の調節におけるＦＬ／ＦＬＴ３刺激の役割を調べるため、ヒト骨とＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦとＦＬを、共刺激分子のＢ７ファミリーメンバーであるＢ７−ＤＣの発現についてノーザンブロッティングにより解析した。図１Ｃは、ＦＬの添加がＢ７−ＤＣ発現を大きく上方制御することを示す（ＧＭ−ＣＳＦ単独は発現を示さなかった；データは示されていない）。マウスＢＭ培養は、ＦＡＣＳにより同じ結果を示した。ＦＬＴ３シグナル伝達の阻害は、Ｂ７−ＤＣとＢ７．２（ＣＤ８６）のＤＣにおいて、Ｂ７−ＤＣと同様にＢ７．２（ＣＤ８６）の下方制御をもたらした（図６）。このことは、免疫応答の低下が、ＤＣの細胞死を誘導することだけでなく、その免疫賦活能を下方制御することにより免疫抑制剤としての有用性を高めることで、達成されることを示す。
【実施例２】
【０１１９】
ＦＬＴ３阻害は、Ｔ細胞のＤＣに基づく増殖を抑制する。これらの実験のため、ＤＣをＢＡＬＢｃマウスから上記のように産生させた。細胞を未処理のまま置くか、又はＣＥＰ７０１で処理した後、示した割合でＣ５７ＢＬ／６脾細胞とともに培養皿に蒔いた。３日後、３Ｈを添加し、増殖を判定した。図２Ａで示すように、ＣＥＰ７０１は、増殖を抑えるのに大きな効果を示した。図２ｂでは、標準混合リンパ球反応（ＭＬＲ）でＣＥＰ７０１の阻害をテストするため、ＤＣの代わりにＢＡＬＢ／ｃ脾細胞を用いた。また、この図が示すように、この応答もＣＥＰ７０１の存在下で阻害された。
【０１２０】
Ｔ細胞刺激応答がＡＧ１２９６への暴露の結果として阻害されるかどうかを判定するため、２つの異なるＴ細胞増殖アッセイを実施した。図２ｃは、阻害剤の存在下（１０μｍ）又は非存在下で、同種マウスの脾細胞を同時にインキュベートした結果を示す。この標準混合リンパ球反応では、等しい数の刺激細胞及び応答細胞（各１０６）を９６ウェルプレート中で混合し、３Ｈ−チミジンを加えて４日間インキュベートし、トリチウムの取り込みを分析することにより増殖を判定した。ＢＭ由来ＤＣを、ＡＧ１２９６の存在下（１０μｍ）又は非存在下で、同種の反応脾細胞と１：１０の割合でインキュベートすることによって（８日、上記のように）ＤＣに刺激された増殖もまた判定した。図７に示すように、ＡＧ１２９６の存在下でＤＣによりＴ細胞増殖の抑制が誘導された。
【実施例３】
【０１２１】
Ｔ細胞の処理は、その増殖を直接阻害しない。
図２ａ及びｂで見出された阻害が、阻害剤のＤＣへの効果に起因するものであり、Ｔ細胞そのものによるものでないことを示すため、１×１０６Ｔ細胞を抗ＣＤ３被覆プレートに蒔いた。次いでＴ細胞を抗ＣＤ２８抗体で刺激した。２日後、３Ｈを添加し、増殖を判定した。図で示されるように、Ｔ細胞の直接刺激の効果は観察されなかった。
【実施例４】
【０１２２】
ＦＬＴ３阻害剤でのマウスの処置は、ＣＤ１１ｃ細胞群を減少させるが、ＣＤ３又はＢ２２０を減少させない。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２０ｍｇ／ｋｇのＣＥＰ７０１又は媒体で、１日に２回、５日間処理した後、その免疫細胞群を分析した。脾臓及びリンパ節を収集し、コラゲナーゼで消化させて間質からＤＣを放出させた。次いで、細胞を洗浄し、Ｔ（ＣＤ３＋／ＤＸ５−）、ＮＫ（ＣＤ３−、ＤＸ５＋）、Ｂ（Ｂ２２０＋、ＣＤ１１ｃ−）又はＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）の存在をＦＡＣＳで解析した。図４ａ及びｂで示すように、この処理がＮＫ及びＤＣ細胞群の減少を導くのに対し、Ｂ細胞又はＴ細胞群には有意な変化が認められなかった。
【実施例５】
【０１２３】
ＦＬＴ３阻害剤でのマウスの処置は、インビボで免疫応答を低下させ、そしてＤＣの阻害は免疫応答を下方制御するのに十分な効果を示した。
ＦＬＴ３阻害が、インビボで免疫応答の下方制御を導くかどうかを判定するため、インフルエンザ血球凝集素抗原（ＨＡ）のトランスジェニックであるマウス（このマウスは「１３７」と名付けられている）に、ＨＡに特異的なトランスジェニックＴ細胞（これらのＣＤ４＋Ｔ細胞は、「６．５」と名付けられ、類似遺伝子型Ｔ細胞マーカーｔｈｙ１．１を発現する）を注射した。このモデル系において、移植されたトランスジェニックＴ細胞は増殖し、自己免疫プロセスを誘導する（Huang CT JI 2003）。これらの実験のため、１３７匹のマウスを、移植前の３日間及び移植後の５日間、ＣＥＰ７０１で上記のように処置した。５日後、Ｔ細胞の増殖についてマウスを分析した。図５に示すように、ＣＥＰ７０１処置は、ｔｈｙ１．１の測定で示されるように、自己反応性Ｔ細胞の増殖の抑制を導いた。
【実施例６】
【０１２４】
ＦＬＴ３に対するモノクローナル抗体
本実施例は、ＦＬＴ３に対するモノクローナル抗体を調製する方法を説明する。ＦＬＴ３は、ＣＯＳ−７又はＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞のような哺乳動物の宿主細胞で発現し、それをＦＬＴ３：Ｆｃ親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。精製されたＦＬＴ３、又は細胞外ドメイン、合成ペプチド若しくはＦＬＴ３を発現する細胞のようなその断片は、従来の技術、例えば米国特許第４，４１１，９９３号に記載の技術を用いて、ＦＬＴ３に対するモノクローナル抗体を産生するのに使用することができる。簡潔に言えば、マウスを免疫原としてＦＬＴ３で免疫化するが、その場合、ＦＬＴ３をアジュバント、例えば完全フロイントアジュバント中で乳化し、１０〜１００μｇの量でマウスの皮下又は腹膜内に注射する。１０〜１２日後、免疫化した動物をアジュバント中で乳化した更なるＦＬＴ３で追加免疫する。その後、毎週又は隔週の免疫化スケジュールで、マウスを定期的に追加免疫する。眼窩採血又は尾の先端切除により血清サンプルを定期的に採取してドットブロット法又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）によりＦＬＴ３抗体をテストする。
【０１２５】
適切な抗体力価を検出した後、陽性動物にＦＬＴ３の生理食塩水を最後の静脈注射として施す。３〜４日後、動物を犠牲にし、脾細胞を収集し、脾細胞をネズミ骨髄腫細胞系統、例えばＮＳ１又は好ましくはＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）と融合する。融合によりハイブリドーマ細胞が産生され、これらの細胞は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択培地の、複数のマイクロタイタープレートに蒔かれて、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド及び脾細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
【０１２６】
ハイブリドーマ細胞を、「Engvall et al., Immunochem. 8:871, 1971」及び米国特許第４，７０３，００４号に開示される技法を適用して、精製ＦＬＴ３に対する反応についてＥＬＩＳＡ法でスクリーニングする。好ましいスクリーニング法は、「Beckmann et al.,(J. Immunol. 144:4212, 1990)」に記載される抗体捕捉法である。陽性ハイブリドーマ細胞は、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜内に注射して、高濃度の抗ＦＬＴ３モノクローナル抗体を含有する腹水を生成することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、インビトロでフラスコ又はローラーボトル中で種々の技術によって増殖させることができる。マウス腹水中に産生されたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿の後、ゲル排除クロマトグラフィーにより精製することができる。あるいは、抗体とＡタンパク質又はＧタンパク質との結合に基づく親和性クロマトグラフィー、またＦＬＴ３との結合に基づく親和性クロマトグラフィーを用いることもできる。
【実施例７】
【０１２７】
ＦＬＴ３阻害剤を用いる処置は、確立された実験的自己免疫性脳脊髄炎を回復する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＦＡ中の１００マイクログラムの確立された実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）誘導のペプチドＭＯＧ３５−５５を、４００マイクログラムのヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）と一緒に注射した。免疫化当日及び４８時間後に、標準プロトコールに従って、マウスに百日咳毒素を追加注入した。初期症状の１日以内に、マウスに媒体対照又はＣＥＰ−７０１（２０ｍｇ／ｋｇ）の何れかを注射し、処置の区別を知らされていない観察者が、毎日スコアをつけた。スコアは次の通りである。０（症状無し）、０．５（尾の緊張の一部喪失）、１（尾の緊張の完全喪失）、２（歩行に影響あり）、２．５（後肢の一部麻痺）、３（後肢の完全麻痺）、４（前後肢麻痺）、５（瀕死状態）。本研究では、各群毎に１０匹のマウスが処置された。図８は、ＣＥＰ−７０１（ＦＬＴ３阻害剤）で処置されたマウスのスコアが低いことを示すグラフであり、ＦＬＴ３阻害剤が、ＥＡＥを回復させたことを示している。
【実施例８】
【０１２８】
図１０に関して、ＭＯＧペプチドで免疫化され、そして症状が出た後に媒体対照又はＣＥＰ−７０１の何れかで処置されたマウスから、損傷していない脳及び脊髄を取り出した。処置及びスコア開始の後、マウスを更に２ヶ月保持した後、犠牲にして、そのＣＮＳを評価のためにホルマリン保存による処理を行った。第５頚椎から薄い柔軟な切片（１ｍｍ）を作製した後、トルイジンブルーで染色し、軸索を可視化した。脊柱内側の予め定義された領域における軸索数及び活発に変性した線維の合計を熟練した試験者が盲検法により数え挙げた。プロットは、疾病誘導後２１０日目に媒体対照マウスと比較したＣＥＰ−７０１処理マウスの切片の定義された領域における変性した軸索線維の数を示す。これらの結果は、ＦＬＴ３を阻害することが神経変性の低下を導くことを示す。
【０１２９】
本発明を、特にその態様に関して詳細に説明した。しかしながら、当業者であれば本開示を考慮して、本発明の精神及び教示を逸脱することなく修正及び改良を行うことができるのは、当然のことである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１−１】図１ａは、ＤＣのＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ−７０１での処置を示すグラフである。濃度０、５又は５０ｎＭのＣＥＰ７０１に対する用量反応分析においてインキュベートされたＤＣの結果を示す。上の３つのグラフはＧＭ−ＣＳＦで活性化された細胞を示し、下の３つのグラフはＧＭ−ＣＳＦ及びＦＬＴ３リガンド（ＦＬ）で活性化された細胞を示す。ＦＬＴ３阻害の結果、ＤＣのアポトーシスの誘導がかなりの割合で発生した。
【図１−２】図１ｂは、０、１及び１０μＭのＦＬＴ３阻害剤ＡＧ１２９６でＤＣを処理し、アポトーシスについて分析した結果を示す。ＦＬＴ３阻害の結果、ＤＣのアポトーシスの誘導がかなりの割合で発生した。
【図１−３】図１ｃは、ＦＬ及びＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦで処理したヒト骨髄細胞のノーザンブロット解析を示す。ノーザンブロッティングは、ｈＢ７−ＤＣ及びβアクチンについて実施した。これにより、ＦＬの添加がＢ７−ＤＣ発現を大きく上方制御することが実証された（ＧＭ−ＣＳＦ単独では発現しなかった；データは示さず）。
【図２】図２ａ及び２ｂは、Ｔ細胞の増殖に基づくＤＣ及びＢＡＬＢ／ｃ脾細胞でのＦＬＴ３阻害の結果を示す。ＤＣをＣＥＰ７０１で処理し（又は対照として処理せずに）、その後示した割合のＣ５７ＢＬ／６脾細胞と共に培養皿に蒔いた。３日後、３Ｈを添加し、増殖を測定した。ＣＥＰ７０１は、Ｔ細胞の増殖を抑えることに大きな効果を示す。図２ｂでは、ＤＣの代わりにＢＡＬＢ／ｃ脾細胞を用いて、標準の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）でＣＥＰ７０１の阻害をテストした。この図から、この反応もまたＣＥＰ７０１の存在下で阻害されることが実証された。図２ｃは、ＦＬＴ３阻害剤ＡＧ１２９６によるＢＡＬＢ／ｃ脾細胞の阻害の結果を示す。
【図３】図３は、Ｔ細胞を、抗ＣＤ２８抗体で刺激した後に、ＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ−７０１で直接処理した結果を示すグラフである。図に示されるように、この処理はＴ細胞の増殖を阻害しない。
【図４】図４ａ及び４ｂは、マウスをＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ７０１で処理した免疫細胞群の結果を示すグラフである。ＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ７０１は、ＣＤ１１ｃ及びＮＫ細胞群を減少させるが、ＣＤ３又はＢ２２０細胞群を減少させない。
【図５】図５は、ＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ７０１でのマウスの処置を示すグラフである。ＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ７０１は、インビボでの自己反応性免疫応答を低下させ、ＤＣの阻害が免疫応答を下方制御するのに十分であることを実証する。
【図６】図６は、０、１、及び１０μＭの何れかのＡＧ１２９６でＤＣを処理した後、共刺激分子Ｂ７．２（ＣＤ８６）及びＢ７−ＤＣの発現について分析した結果を示す。図に示されるように、両方の共刺激分子がＡＧ１２９６の存在下で下方制御された。
【図７】図７は、Ｔ細胞のＤＣ刺激がＡＧ１２９６により阻害されることを示すグラフである。
【図８】図８は、ＦＬＴ３阻害剤での処理が、確立された実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を回復させることを示すグラフである。
【図９】図９は、ＳＴＫ−１ ｃＤＮＡの予測完全アミノ酸配列である。アミノ酸は、各列の左側に番号が付けられ、ヌクレオチドは右側に番号が付けられている。下線は予測シグナルペプチド（ａａ １〜２３）を示し、それに続いて推定切断部位が矢印で示される。
【図１０】図１０は、疾病誘導後２１０日目に媒体対照マウスと比較した、ＣＥＰ−７０１処理マウスの切片の定義された領域における変性した軸索線維の数を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００４年７月１９日に出願の米国特許仮出願第６０／５８９，５１１号の優先権を主張するものであり、その全てを参照して本明細書に取り込む。
【０００２】
（発明分野）
本発明は、細胞の免疫応答を抑制すること、免疫関連の疾患を予防又は治療すること、並びに免疫関連の疾患を予防又は治療するための治療剤をスクリーニングする方法に関する。本発明の治療法には、ＦＭＳ関連のチロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）阻害剤を、移植後の臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、移植片対宿主病、又は狼瘡を患っているような、それを必要とする対象に投与することを包含する。免疫の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法には、ＦＬＴ３受容体の活性レベルが高いマウスの使用が含まれる。
【背景技術】
【０００３】
免疫関連の疾患、特に移植後の臓器拒絶反応、糖尿病、移植片対宿主病、グレーブス病、及び狼瘡は、依然として世界中の数百万の人々を冒す衰弱性疾病である。
【０００４】
免疫関連の疾患は、個体に潜在的な壊滅的かつ不可逆的副作用を引き起こし、例えば免疫システムが増大した結果として発症する。免疫関連の疾患、例えば、骨髄移植拒絶反応、移植後の固形臓器拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、グレーブス病、溶血性貧血、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ、ウェグナー肉芽腫症、糖尿病１型、重症筋無力症、及び乾癬は、免疫システムの様々な過剰な活動により引き起こされる。最近の治療法は、免疫応答のＴ細胞アームの殆どの部分に作用し、その結果重篤な免疫抑制を招くことがよくある。
【０００５】
従って、このような徴候に対する治療のための新規な治療法を得ることが望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
（発明の要約）
本発明者らは、ここに細胞の免疫応答を抑制する方法、免疫関連の疾患を治療する方法、並びに免疫関連の疾患及び神経系の疾患を含むＦＬＴ３疾患及びＦＬＴ３関連の疾患を治療する治療剤のスクリーニングのための方法を提供する。特に、ＦＭＳ関連のチロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）によるシグナル伝達を阻害することにより、例えば、インビボで成長する樹状細胞（ＤＣ）の数を減少させることにより、またＴ細胞を活性化させるそれらの能力を低下させることにより、ＦＬＴ３及びＦＬＴ３関連の疾患を治療することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本発明は、ＦＬＴ３の活性を低下させる少なくとも１つのＦＬＴ３阻害剤を細胞に接触させることを含んでなる、その細胞の免疫応答を抑制する方法を提供する。
【０００８】
ある特定の態様では、前記細胞は、樹状細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又は神経系の細胞、例えば、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト（乏突起神経膠細胞）、シュワン細胞、星状細胞、ミクログリアである。前記ニューロンの例では、例えば、求心性ニューロン、遠心性ニューロン、介在ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、神経内分泌細胞、分裂終了神経、胚性ニューロン又は網膜の神経節細胞の１つ又はそれ以上を含んでいる。
【０００９】
ある特定の態様では、ＦＬＴ３のキナーゼ活性が低下している。関連する態様では、ＦＬＴ３の自己リン酸化活性が低下している。
【００１０】
一態様によれば、前記ＦＬＴ３阻害剤は、小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗ＦＬＴ３抗体、抗ＦＬＴ３抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプチドをコードする核酸、有機分子及びそれらの何れかの組合せの１つ又はそれ以上から選択される。関連する態様では、前記小分子は、ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５、ＣＥＰ−５２１４、ＣＥＰ−７０５５、ＰＫＣ４１２、ＳＵ１１２４８、ＳＵ５４１６、ＳＵ５６１４、ＭＬＮ５１８、ＢＡＹ４３−９００６、ＣＨＩＲ−２５８、アミノ−ベンゾイミダゾール−キノロン類、Ｋｉ２３８１９、スタウロスポリン誘導体の１つ又はそれ以上から選択される。
更なる関連する態様では、小分子は、式Ｉ：
【００１１】
【化００３】
【００１２】
（式中、
Ｗは、Ｃ、Ｎ又はＯであってもよく；
Ｘは、Ｃ、Ｎ又は存在しない、であってもよく；
Ｙは、Ｃであってもよく；
Ｚは、Ｃ又はＮであってもよく；そして
Ｒ基は、以下のＲ１〜Ｒ５の置換されている可変基であってもよく：
Ｒ１は、Ｈ、アルコキシ、ヒドロキシル又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、アルコキシ又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ３は、Ｈ、Ｏ、アリール、ヘテロアリール又はＣ（Ｏ）ヘテロアリールであってもよく；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＨ−ヘテロアリール又は存在しない、であってもよく；
Ｒ５は、Ｈ、アリール、ヘテロアルキル／アリール又は存在しない、であってもよく；そして、
ＷＸ、ＷＹ、ＹＺ、ＹＲ３及びＺＲ４に於ける破線は、二重結合であってもよいことを示し、ここに於けるアリール、ヘテロアリール及び複素環アルキル／アリールは、置換されていてもよい）。
更に別な関連する態様では、小分子は、以下に示される化合物から選択される。
【００１３】
【化００４】
【００１４】
関連する態様では、前記抗体が、ＩＭＣ−ＥＢ１０及びＩＭＣ−ＮＣ７の１つ又はそれ以上から選ばれる、請求項６に記載の方法である。関連する態様では、前記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、霊長類化抗体及びそれらの何れかの組合せであってよい。一態様では、前記抗体はＦＬＴ３のリン酸化型を特異的に認識し、別の態様では、前記抗体はＦＬＴ３の非リン酸化型を特異的に認識する。
【００１５】
関連する態様では、前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、図９のヌクレオチド配列又はそれらの生物活性を有する断片の１つ又はそれ以上から選択される。
別の態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、ＦＬＴ３依存性シグナル伝達を低下させる。
一態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は細胞の免疫賦活能を下方制御する。
本発明のある特定の方法は、前記ＦＬＴ３阻害剤と共にＴ細胞阻害剤を投与することを更に含むことがある。
【００１６】
一態様では、対象に於けるＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療する方法が提供される。その方法は、ＦＬＴ３阻害剤の治療有効量を対象に投与してＦＬＴ３の活性を低下させることを含む。
本発明の治療法は、ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患の治療を必要とする対象を同定することを更に含み、及び／又はそれによりＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患について対象を治療する。
【００１７】
一態様では、前記ＦＬＴ３疾患又は関連の疾患は、免疫関連の疾患である。
関連する態様では、前記免疫関連の疾患とは、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡並びにその他の自己免疫疾患のうちの１つ又はそれ以上のものである。本発明の方法は、骨髄非破壊的な処置療法及びそれらを組み合わせて施術した後に骨髄生着を促進させるためにも用いられてもよい。
【００１８】
一態様では、前記ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患は、神経系の疾患である。
関連する態様では、前記神経系の疾患は、例えば軸索変性によって起こる疾患のような神経変性疾患の１つ又はそれ以上である。神経変性疾患としては、例えば、多発性硬化症；脱髄性疾患、例えば多発性硬化症、急性横断性脊髄炎；及び筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症などの運動単位の障害疾患；クロイツフェルト・ヤコブ病；又は亜急性硬化性全脳炎が挙げられる。
【００１９】
一態様では、前記対象は哺乳動物である。
別の態様では、前記哺乳動物は、ヒト、霊長類、ネズミ、イヌ、ネコ又はマウスである。
一態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗ＦＬＴ３抗体、抗ＦＬＴ３抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプチドをコードする核酸、有機分子及びそれらの何れかの組合せの１つ又はそれ以上から選択される。
一態様では、前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、図９のヌクレオチド配列又はそれらの生物活性を有する断片の１つ又はそれ以上から選択される。
【００２０】
別の態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、対象に於けるＦＬＴ３のキナーゼ活性を低下させる。
一態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、対象に於けるＦＬＴ３の自己リン酸化活性を低下させる。
一態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、対象に於けるＦＬＴ３依存性シグナル伝達を低下させる。
別の態様では、前記ＦＬＴ３阻害剤は、対象に於ける免疫賦活能を下方制御する。
一態様では、本方法は、ＦＬＴ３阻害剤と共にＴ細胞阻害剤を投与することを更に含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ＦＬＴ依存のシグナル伝達を低減するために、ＦＬＴ３阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含んでなる、対象のＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、恒常的に活性化されたＦＬＴ３受容体を有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。一態様では、前記トランスジェニック動物はマウスである。
別の態様では、前記トランスジェニック動物は、治療剤をテストするために、及び／又は免疫関連の疾患のモデルとして用いられる。
【００２２】
別の態様では、ＦＬＴ３受容体の活性レベルが高いマウスに薬剤を投与する、そして免疫応答の変化を測定して、免疫応答の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる免疫関連の疾患を治療するための、治療剤をスクリーニングする方法が提供される。
一態様では、免疫応答の変化はＤＣ細胞の数の減少で示される。関連する態様では、免疫応答の変化はＮＫ細胞の数の減少で示される。別の関連する態様では、免疫応答の変化は、ＤＣ共刺激タンパク質のレベル判定により測定して、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルの増加が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す。
【００２３】
一態様では、前記ＤＣ共刺激タンパク質はＢ７−ＤＣである。一態様では、免疫応答の変化をＴ細胞増殖アッセイにより測定して、Ｔ細胞増殖の減少が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す。
治療剤を真核細胞へ投与する、そして細胞に於ける免疫応答の変化を測定して、細胞の免疫応答の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる、免疫関連の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００２４】
一態様では、前記細胞は、樹状細胞、ＮＫ細胞、脾細胞、Ｔ細胞及びそれらの混合物の１つ又はそれ以上から選択される。別の態様では、細胞の免疫応答の低下は、ＤＣ共刺激タンパク質のレベル判定により測定して、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルの増加が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す。
別の態様では、前記ＤＣ共刺激タンパク質はＢ７−ＤＣである。
別の態様では、免疫応答の変化をＴ細胞増殖の判定により測定して、その場合、Ｔ細胞増殖の減少が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す。
【００２５】
一つの態様では、薬剤をＭＯＧペプチドで免疫化されたマウスに投与する、そしてニューロンを可視化して、軸索の調節が、神経系の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる神経系の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法が提供される。
一態様では、軸索の変化は、変性した軸索の数の減少で示される。
【００２６】
別の態様では、可視化は顕微鏡検査による。一つの態様では、治療剤をニューロン細胞へ投与する、そして細胞における変化を測定して、変性した神経の数の減少が、神経系の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる神経系の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングするための方法が本明細書に提供される。
【００２７】
一態様の治療法には、ＦＬＴ３活性を低下させるために、ＦＬＴ３阻害剤の治療有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む、免疫関連の疾患の治療が含まれる。別の態様の治療法には、ＦＬＴ３依存性シグナル伝達を低下させるために、ＦＬＴ３阻害剤の治療有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む。また、治療法には、腫瘍ワクチン接種時の耐性の破壊も含まれる。
【００２８】
一態様の治療法には、哺乳動物、特にヒトを含む、動物のＦＬＴ３シグナル伝達を阻害することのできる治療剤の１つ又はそれ以上の治療有効量を、このような治療を必要とする対象に投与することを包含する。具体的には、免疫関連の疾患を患っている又は患う恐れがある対象を、同定及び／又は選択し、その後ＦＬＴ３阻害化合物の１つ又はそれ以上を、同定及び／又は選択した対象へ投与することが好ましい。
【００２９】
一態様として、免疫関連の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法には、ＦＬＴ３活性レベルの高いマウスのような哺乳動物又はその他の対象へ投与すること、及び免疫応答を測定することが含まれる。別の態様の免疫関連の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法には、薬剤を細胞へ投与すること及び免疫応答を測定することが含まれる。
本発明のその他の態様を、以下に開示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
上記のように、また下記の実施例に示すように、ＦＬＴ３を阻害することが、免疫関連の疾患を治療するのに効果的であることが見出された。それらの疾患には、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、後天性免疫不全症候群、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、低ガンマグロブリン血症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、狼瘡及びそれらの何れかの組合せが含まれる。
【００３１】
ＦＬＴ３は、造血前駆細胞で優先的に発現する受容体のチロシンキナーゼである（Small et al., Blood 15(4):1110-9(1993)）。樹状細胞（ＤＣ）の数がＦＬＴ３リガンドの配位子（ＦＬ）で活性化されて増加することで示されるように、ＦＬＴ３受容体によるシグナル伝達はＤＣにおいて重要な役割を果たす。ＦＬＴ３によるシグナル伝達は、造血幹細胞及び前駆細胞に影響を与えることが知られている。Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞の成長に重要であると考えられる、ＦＬＴ３による下流側のシグナル伝達を、ＦＬＴ３阻害剤は、抑制することができる。ＦＬＴ３シグナル伝達の阻害が、ＤＣの数を減少させ、そしてＴ細胞を活性化させる抗原を提示するＤＣの能力を妨げることは、驚くべき発見であった。ＦＬＴ３は、シグナル伝達のためにそのチロシンキナーゼ領域を必要とし、従って、ＦＬＴ３シグナル伝達を阻害する１つの方法は、この酵素活性を阻害することである。また、ＦＬＴ３のＦＬ活性は、免疫システムで重要な役割をもつＮＫ細胞及びＢリンパ球の成長を大いに刺激するが、このためＦＬＴ３シグナル伝達の阻害は、これらの細胞も同じように抑制する効果を有している。
【００３２】
ＦＬＴ３は、ＤＣ前駆体で発現し、そしてＦＬ／ＦＬＴ３シグナル伝達が、骨髄（ＢＭ）、脾臓、リンパ節、胃腸管、肝臓、肺臓、腹膜腔及び皮膚においてＤＣの数を大きく増加させる、結果を導く。例えば、「S. D. Lyman, Curr Opin Hematol 5, 192-6, (1998)」、「H. J. McKenna, K. L., et al., Blood 95, 3489-97, (2000)」、「E. Maraskovsky, et al., J Exp Med 184, 1953-62, (1996)、マウス及びヒトに於けるＦＬに刺激されたＤＣの機能」、「M. R. Shurin, et al., Cell Immunol 179, 174-84,(1997)」及び「E. Maraskovsky, et al., Blood 96, 878-84,(2000)、ＧＭ−ＣＳＦのＤＣ産生の活性化」を参照されたい。ＧＭ−ＣＳＦ又はＦＬの何れかがインビボで劇的にＤＣを増加させるが、生じたＤＣの表現型は多少異なるようであり、これらのサイトカインがＤＣにおいて異なる経路を活性化させることができることが示唆される。例えば、「E. Daro, et al., J Immunol 165, 49-58, (2000)」、「K. Brasel, et al., Blood 96, 3029-39, (2000)」、「P. Bjorck, Blood 98, 3520-6, (2001)」及び「P. J. O′Connell, et al., J Immunol 165, 795-803, (2000)」を参照されたい。ＧＭ−ＣＳＦはＣＤ１１ｂ−／ＣＤ１１ｃ＋のＤＣを主に増殖させるが、ＦＬは、特に、（骨髄の）ＣＤ１１ｂ＋／ＣＤ１１ｃ＋及び（リンパの）ＣＤ１１ｂ−／Ｃｄ１１ｃ＋の両方のＤＣサブセットを増殖させると思われる。
【００３３】
正常ＨＳＣｓでのリガンド結合において、ＦＬＴ３はホモ二量体化し、そのキナーゼ領域が活性化される。ＦＬＴ３キナーゼの活性化は、幾つかの結果をもたらす。ＦＬＴ３はチロシン残基上の多数の基質タンパク質を直接リン酸化し、次にこれらのタンパク質を活性化する。更に、ＦＬＴ３は、幾つかのチロシン残基上でそれ自体をリン酸化し、その後これらの残基はＳＨ２領域を含むアダプタータンパク質の多くと結合する。ＦＬＴ３シグナル伝達に関与すると見られるタンパク質には、ＰＩ−３キナーゼのｐ８５サブユニット、ＰＬＣｙ、ＶＡＶ、ＣＢＬ、ＣＲＫＬ、Ｇａｂ１及び２、ＳＨＰ２、ＳＨＩＰ、ＳＨＣ、並びにＳＴＡＴ５が挙げられる。最終的には、核に作用して細胞の遺伝プログラムを変更するシグナルを形質導入する結果となる。これらのシグナルの幾つかが増殖を刺激し、他のシグナルは細胞をアポトーシスから保護するか又は分化を推進すると思われる。
【００３４】
本発明者らは、特にＦＬＴ３の小分子阻害剤、例えば、ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５及びＣＥＰ−５２１４が、ＦＬＴ３シグナル伝達によって免疫応答を抑制できることを見出した。また、本発明者らは、抗ＦＬＴ３抗体が、受容体の活性化を阻害してＦＬＴ３シグナル伝達を妨げること、そしてアンチセンスＦＬＴ３分子もＦＬＴ３発現を妨げて、この結果ＦＬＴ３による免疫応答を阻害することも見出した。
【００３５】
一態様の細胞の免疫応答を抑制する方法には、真核細胞の細胞群を準備すること、そしてＦＬＴ３の活性を低下させるＦＬＴ３阻害剤の少なくとも１つを、細胞に接触させることを含む。本明細書で用いるＦＬＴ３の活性は、キナーゼ活性、下流シグナルを伝達する能力、自己リン酸化活性等を示す。
【００３６】
「投与」又は「投与すること」という用語は、本発明の化合物を、それらの意図された機能を発揮するように、対象へ導入する経路を含む。用いられる投与経路の例として、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、くも膜下腔内）、経口、吸入、直腸及び経皮が挙げられる。医薬製剤は、それぞれの投与経路に適した形態で投与してよい。例えば、これらの製剤は、錠剤又はカプセル剤の形態で、注射、吸入、点眼薬、軟膏、坐剤などにより投与さる。投与は注射、注入又は吸入により；局所へはローション剤又は軟膏により；直腸へは坐剤により投与される。経口投与が好ましい。注射はボーラスであっても、連続的な注入であってもよい。投与経路に応じて、本発明の化合物は、その意図される機能を発揮させる効能に悪影響を及ぼす自然状態から化合物を保護するように、選択された材料でコーティングするか又は処理することができる。本発明の化合物は、単独で、又は上記のその他の薬剤若しくは薬学的に許容される担体のどちらかと一緒に又は両方共一緒に投与できる。本発明の化合物は、その他の薬剤の投与前に投与しても、その薬剤と同時に投与しても、又はその薬剤の投与後に投与してもよい。更に、本発明の化合物は、インビボでその活性代謝物に、又はより活性のある代謝物に変換されるプリフォームの形で投与することもできる。
【００３７】
「アルキル」という用語は、飽和脂肪族基を示し、直鎖のアルキル基、分岐鎖のアルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換のシクロアルキル基、及びシクロアルキル置換のアルキル基が含まれる。アルキルという用語は、炭化水素骨格の１個又はそれ以上の炭素と置き換わる酸素、窒素、硫黄又はリン原子を更に含むアルキル基、例えば、酸素、窒素、硫黄又はリン原子を更に含む。好ましい態様では、直鎖又は分岐鎖アルキルは、その骨格中に３０個又はそれより少ない炭素原子（例えば、直鎖ではＣ１−Ｃ３０、分岐鎖ではＣ３−Ｃ３０）、好ましくは２６個又はそれより少ない、より好ましくは２０個又はそれより少ない、また更により好ましくは４個又はそれより少ない炭素原子を有する。同様に、好ましいシクロアルキル基は、その環構造中に３〜１０個の炭素原子を有し、より好ましくはその環構造中に３個、４個、５個、６個又は７個の炭素を有する。
【００３８】
更に、本明細書及び本文中で用いられるアルキルという用語は、「非置換アルキル」及び「置換アルキル」の両方を含み、後者は炭化水素骨格の１個又はそれ以上の炭素上の水素と置き換わる置換基を有するアルキル部分を示すことを意図する。このような置換基としては、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスフェイト、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェイト、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族若しくは芳香族複素環部分が挙げられる。当業者であれば、炭化水素鎖に置換する部分は、適切な場合にはそれら自体が置換することができることを当然理解するであろう。シクロアルキルは、例えば、上記の置換基でさらに置換することができる。「アルキルアリール」部分とは、アリールで置換されたアルキルである（例えば、フェニルメチル（ベンジル））。また、「アルキル」という用語には、上記のアルキルに鎖長及び置換の可能性が似ているが、少なくとも１つの二重結合又は三重結合を含む不飽和脂肪族基が含まれる。
【００３９】
炭素の数が別に指定されていない限り、本明細書において用いる「低級アルキル」は、上記に定義される通りであるが、その骨格構造中に１〜１０個の炭素、より好ましくは１〜６個、さらにより好ましくは１〜４個の炭素原子を有し、直鎖であっても分枝鎖であってもよい。低級アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチルなどが挙げられる。好ましい態様では、「低級アルキル」という用語には、その骨格中に４個又はそれより少ない炭素原子を有する直鎖アルキル、例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキルが含まれる。
【００４０】
「アルケニル」及び「アルキニル」という用語は、上記のアルキルに鎖長及び置換の可能性が似ているが、少なくとも１つの二重結合又は三重結合を含む不飽和脂肪族基を示す。例えば、本発明では、シアノ基及びプロパルギル基を意図する。
【００４１】
本明細書で用いられる「アリール」という用語は、０〜４個のヘテロ原子を含んでもよい５員及び６員の単環芳香族基を含む、例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン等のアリール基を示す。また、アリール基は、ナフチル、キノリル、インドリル等の多環式の縮合芳香族基を示す。環構造にヘテロ原子を有するアリール基も、「アリール複素環」、「ヘテロアリール」又は「芳香族複素環」として示される。芳香族環は、環の１つ又はそれ以上の位置で上記のような置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシレート、アルキルカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、ホスフェイト、ホスホナト、ホスフィナト、シアノ、アミノ（アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、及びアルキルアリールアミノを含む）、アシルアミノ（アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイル及びウレイドを含む）、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシレート、スルフェイト、スルホナト、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリール、又は芳香族若しくは芳香族複素環部分で置換することができる。アリール基は、また多環（例えば、テトラリン）を形成するような芳香族でない脂肪族環又は複素環と縮合又は架橋することができる。
【００４２】
本発明の化合物の「生物活性」という語には、応答細胞において本発明の化合物により発現する全ての活性が含まれる。それにはこれらの化合物により発現するゲノム活性及び非ゲノム活性が含まれる。
「生物学的組成物」又は「生体サンプル」とは、細胞若しくは生体高分子を含有するか又はそれらに由来する組成物を示す。細胞を含有する組成物としては、例えば、哺乳動物血液、赤血球濃縮物、血小板濃縮物、白血球濃縮液、血液細胞タンパク質、血漿、多血小板血漿、濃縮血漿、血漿の何れかの分画からの沈殿物、血漿の何れかの分画からの上清、血漿タンパク質画分、精製又は部分精製の血液タンパク質若しくはその他の成分、血清、精液、哺乳動物の初乳、乳、唾液、胎盤抽出物、クリオ沈殿物、クリオ上清、細胞ライセート、哺乳動物の細胞培養又は培地、発酵生成物、腹水、血液細胞に誘導されたタンパク質、及び正常細胞又は形質転換細胞により細胞培養中に（例えば、組換え型ＤＮＡ又はモノクローナル抗体技術によって）生成された生成物が挙げられる。生物学的組成物は無細胞であってもよい。好ましい態様では、好適な生物学的組成物又は生体サンプルは、赤血球懸濁液である。幾つかの態様では、血液細胞懸濁液には、哺乳動物の血液細胞が含まれる。血液細胞は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタから得ることが好ましい。好ましい態様では、血液細胞懸濁液には、赤血球及び／又は血小板及び／又は白血球及び／又は骨髄細胞が含まれる。
【００４３】
「キラル」という用語は、鏡像相手と重ね合わせることができない特性を有する分子を示し、一方、「アキラル」という用語は、鏡像相手と重ね合わせることのできる分子を示す。
「ジアステレオマー」という用語は、不斉中心を２つ又はそれ以上含み、それらの分子が互いの鏡像でない、立体異性体を示す。
【００４４】
「有効量」という用語は、所望の結果を得る、つまりＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療するのに、必要な用量及び投与期間での有効な量である。本発明の化合物の有効量は、対象の疾病の状態、年齢、及び体重、並びに対象において所望の応答を発現させる本発明の化合物の効能のような要因によって変化する。用量の投与計画は、最適な治療応答を提供するように修正される。有効量は、また本発明の化合物の如何なる有毒又は有害な効果（例えば、副作用）をも、治療上有益な効果が上回る量でもある。
【００４５】
本明細書で用いられるＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患は、ＦＬＴ３に関連して、直接的又は間接的にＦＬＴ３によって発症する、すべての疾患又は症状を示す。ＦＬＴ３疾患及び関連の疾患としては、例えば、免疫関連の疾患及び神経変性疾患が挙げられる。免疫関連の疾患としては、例えば、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡並びにその他の自己免疫疾患のうちの１つ又はそれ以上のものである。本発明の方法はまた、骨髄非破壊的な処置療法及びそれらを組み合わせて施術した後に骨髄生着を促進させるためにも用いられてもよい。神経変性疾患としては、例えば、軸索変性疾患（例えば、多発性硬化症；多発性硬化症、急性横断性脊髄炎などの脱髄性疾患；並びに筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症などの運動単位の障害疾患を含む）；クロイツフェルト・ヤコブ病；又は亜急性硬化性全脳炎が挙げられる。
【００４６】
本発明の化合物の治療有効量（すなわち有効用量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ・体重、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ・体重、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ・体重、更により好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ・体重、２〜９ｍｇ／ｋｇ・体重、３〜８ｍｇ／ｋｇ・体重、４〜７ｍｇ／ｋｇ・体重、又は５〜６ｍｇ／ｋｇ・体重でありうる。当業者であれば、これらに限定されるものではないが、対象の疾病又は疾患の重篤度、治療歴、一般的な健康状態及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患をはじめとする特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要とされる用量に影響を及ぼすことを理解するであろう。更に、治療有効量の本発明の化合物での対象の治療には、１回の治療を含んでもよいし、好ましくは、連続治療を含んでもよい。一つの実施例では、本発明の化合物の約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ・体重を１週間当たりの１回の用量として、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、よりさらに好ましくは約４、５、又は６週間、対象を治療する。本発明の化合物の治療に用いられる有効用量を、特定の治療のコースで増加又は減少させてもよいことも理解される。治療は、化合物の最適な用量より少ない量から開始してもよい。その後、その治療状況下で最適な効果が得られるまで用量を少しずつ増加させてよい。便宜上、必要に応じて１日投与量の合計量を分割し、１日の間に少量ずつ投与してよい。本発明の化合物の治療有効量及び予防上有効な抗ウイルス量は、体重１キログラム当たり１日量を約０．１ミリグラム〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲で変化すると予測される。
【００４７】
本明細書で用いる「対象から生体サンプルを得ること」は、本明細書に記載の方法での使用のためにサンプルを得ることを含む。生体サンプルは上記の通りである。
本明細書で用いる、それを必要とする対象を同定することは、自己確認によるか、又は医療専門家の診断により実施してよい。
本明細書で用いる、それを必要とする対象とは、ＦＬＴ３関連の疾患の予防的治療を必要とする対象、又はＦＬＴ３関連の疾患と診断された対象である。
【００４８】
「エナンチオマー」という用語は、１つの化合物の２つの立体異性体であって、互いに重ね合わせることのできない鏡像体を示す。２つのエナンチオマーの等モル混合物を、「ラセミ混合物」又は「ラセミ化合物」と呼ぶ。
【００４９】
「ハロアルキル」という用語は、ハロゲンでモノ−、ジ−又はポリ置換されている上記定義のアルキル基、例えば、フルオロメチル及びトリフルオロメチルを含むことを意図する。
「ハロゲン」という用語は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを表す。
「ヒドロキシル」という用語は、−ＯＨを意味する。
本明細書において用いる「ヘテロ原子」という用語は、炭素又は水素以外の全ての元素の原子を意味する。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、硫黄及びリンである。
【００５０】
「ホメオスタシス」という用語は、内部環境において静的な、又は一定の状態を維持することを意味すると当該技術分野で認識されている。
「改良された生物学的特性」という語は、本発明の化合物がインビボでその有効性を向上させる、特有な活性の全てを示す。好ましい態様では、この用語は、毒性を軽減させる、例えば、高カルシウム血症活性を低下させるような、本発明の化合物が定性的又は定量的に改良する全ての治療特性を意味する。
【００５１】
「置換されていてもよい」という用語は、非置換の基、又は１つ又はそれ以上の置換可能な位置、具体的には１、２、３、４又は５位に、１個又はそれ以上の水素以外の好適な基（同一であっても異なっていてもよい）で置換されている基を包含することを意図する。このような任意の置換基としては、例えば、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、ニトロ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ１−Ｃ８アルコキシ、Ｃ２−Ｃ８アルキルエーテル、Ｃ３−Ｃ８アルカノン、Ｃ１−Ｃ８アルキルチオ、アミノ、モノ−又はジ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）アミノ、ハロＣ１−Ｃ８アルキル、ハロＣ１−Ｃ８アルコキシ、Ｃ１−Ｃ８アルカノイル、Ｃ２−Ｃ８アルカノイルオキシ、Ｃ１−Ｃ８アルコキシカルボニル、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、モノ−又はジ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）アミノカルボニル、−ＳＯ２ＮＨ２、及び／又はモノ−又はジ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）スルホンアミド、更に炭素環基及び複素環基が挙げられる。また任意の置換基は、「０〜Ｘ個の置換基で置換されている」（ここに於けるＸは、可能な置換基数の最大数である）という語句でも示される。ある特定の置換されていてもよい基は、０個〜２個、３個又は４個のそれぞれ独立して選ばれる置換基で置換されている（すなわち非置換であるか又は挙げられる最大数までの置換基で置換されている）。
【００５２】
「ヘテロシクロアルキル」という用語は、非芳香族の、完全に飽和の３〜９員の単環式、８〜１２員の二環式、又は１１〜１４員の三環式であり、もし単環式であれば１〜３個のヘテロ原子、二環式であれば１〜６個のヘテロ原子、又は三環式であれば１〜９個のヘテロ原子を含む（前記ヘテロ原子がＯ、Ｎ、Ｓ、Ｂ、Ｐ又はＳｉから選択される）。ヘテロシクロアルキル基は、１個又はそれ以上の置換基で置換されていてもよい。一態様では、ヘテロシクロアルキル基の各環の０個、１個、２個、３個又は４個の原子は、置換基で置換されていてもよい。代表的なヘテロシクロアルキル基としては、ピペリジニル、ピペラジニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロリジニル、４−ピペリドニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニルスルホン（tetrahydrothiopyranyl sulfone）、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルスルホキシド、チオモルホリニルスルホン、１，３−ジオキソラン、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、チイレンが挙げられる。
【００５３】
「異性体」又は「立体異性体」という用語は、同一の化学成分を有するが、原子又は基の空間での配置において異なる化合物を示す。本明細書において化合物は、全ての異性体及び立体異性体を含むことを意図する。
「調節する」という用語は、所望の最終結果、例えば治療成果が得られるように、本発明の化合物への曝露に応答して細胞の活性を増加又は低下させること、例えば、動物における細胞の少なくとも１亜集団の増殖の阻害及び／又は分化の誘導を示す。好ましい態様では、この語句には細胞のウイルス感染を含むものとする。
【００５４】
「ＦＬＴ３阻害剤を得ること」における「得ること」という用語は、阻害剤を購入すること、合成すること、又は別な方法で入手することを含むよう意図する。
本明細書で用いられる「非経口投与」及び「非経口投与した」という用語は、経腸投与及び局所投与以外の、通常は注射による投与方法を意味し、これらに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内及び胸骨内の注射及び注入が挙げられる。
【００５５】
「プロドラッグ」という用語は、インビボで代謝される部分を有する化合物が含まれる。一般に、プロドラッグは、インビボでエステラーゼによるか又はその他のメカニズムにより代謝されて、活性な薬物となる。プロドラッグ及びそれらの使用の例は、当該技術で公知である（例えば、「Berge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19」を参照願いたい）。プロドラッグは、化合物の最終的な単離及び精製時にそのまま調製するか、又は精製された化合物を個別にその遊離酸又はヒドロキシルの形態で、適したエステル化剤と反応させることにより調製することができる。ヒドロキシル基は、カルボン酸で処理することにより、エステルに変換することができる。プロドラッグ部分の例としては、置換及び非置換の、分枝若しくは非分枝の低級アルキルエステル部分（例えば、プロピオン酸（propionoic acid）エステル）、低級アルケニルエステル、ジ−低級アルキル−アミノ低級アルキルエステル（例えば、ジメチルアミノエチルエステル）、アシルアミノ低級アルキルエステル（例えば、アセチルオキシメチルエステル）、アシルオキシ低級アルキルエステル（例えば、ピバロイルオキシメチルエステル）、アリールエステル（フェニルエステル）、アリール−低級アルキルエステル（例えば、ベンジルエステル）、（例えば、メチル、ハロ、又はメトキシ置換基での）置換アリール及びアリール−低級アルキルエステル、アミド、低級アルキルアミド、ジ−低級アルキルアミド、並びにドロキシアミドが挙げられる。好ましいプロドラッグ部分はプロピオン酸エステル及びアシルエステルである。インビボでその他のメカニズムによって活性な形態へ変換されるプロドラッグも含まれる。
【００５６】
化合物の「予防上有効な量」という語は、ＦＬＴ３関連の疾患の予防又は治療に患者に単一回又は複数回の投与で有効な、式（Ｉ）の化合物又は本明細書に記載の別な化合物を含む、本発明の化合物の量を示す。
「毒性を軽減させる」という語は、インビボで投与した場合に本発明の化合物により発現される何れかの望ましくない副作用の軽減、例えば高カルシウム血症活性を低下させることを含むよう意図される。
「スルフヒドリル」又は「チオール」という用語は、−ＳＨを意味する。
【００５７】
「対象」という用語には、ＦＬＴ３疾患若しくはＦＬＴ３関連の疾患を患う可能性のある、又は本発明の化合物の投与により別に利点を得ることのできる生物、例えばヒト及び非ヒト動物が含まれる。好ましいヒト動物には、本明細書に記載のように、ＦＬＴ３疾患、ＦＬＴ３関連の疾患又は関連する症状を患っているか又は患いやすいヒト患者が含まれる。本発明の「非ヒト動物」という用語は、あらゆる脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばげっ歯類、例えばマウス及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、例えばヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などが含まれる。ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患に感受性が高いとは、ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を発症するリスクのある対象、すなわち免疫抑制された対象を含むことを意味する。
【００５８】
本明細書で用いる「置換基」又は「置換された」という用語は、化合物又は基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルキレン、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、へテロアラルキル、シクロアルキル、シクリル、ヘテロシクロアルキル、又はヘテロシクリル基等）の水素基が、化合物の安定性に実質的な悪影響を与えない何れか所望の基で置換されることを意味する。一態様では、望ましい置換基は、化合物の活性に悪影響を与えない置換基である。化合物の活性に実質的に影響を与える置換基は、化合物のＩＣ５０値を１００□Ｍより大きくする置換基である。好ましい態様では、本発明の化合物は、アッセイ又は活性を示すテストにおいて、ＩＬ−１２に関連する（又はIＬ−２３若しくはＩＬ−２７に関連する）疾病又は症状の治療に有用なＩＣ５０値を有する。このようなアッセイは当業者に周知であり、例えば、本明細書に記載のアッセイ、例えば、実施例１２〜１４のアッセイが含まれる。好ましい態様では、アッセイは実施例１２のアッセイであり、化合物のＩＣ５０値は１．０ｍＭ未満、より好ましくは１００□Ｍ未満、より好ましくは１０□Ｍ未満、より好ましくは１□Ｍ未満、より好ましくは１００ｎＭ未満、及びより好ましくは１０ｎＭ未満である。「置換された」という用語は、水素原子を置き換えた１個又はそれ以上の各々の置換基（同一であっても、異なっていてもよい）を示す。置換基の例としては、これらに限定されるものではないが、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）、ヒドロキシル、アミノ、アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルアミノ、ジアリールアミノ、シアノ、ニトロ、メルカプト、オキソ（つまり、カルボニル）、チオ、イミノ、ホルミル、カルボアミド、カルバミル、カルボキシル、チオウレイド、チオシアナト（thiocyanato）、スルホアミド、スルホニルアルキル、スルホニルアリール、アルキル、アルケニル、アルコキシ、メルカプトアルコキシ、アリール、ヘテロアリール、シクリル、ヘテロシクリルが挙げられ、ここにおけるアルキル、アルケニル、アルキルオキシ、アリール、ヘテロアリール、シクリル及びヘテロシクリルは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、メルカプト、シアノ、ニトロ、オキソ（＝Ｏ）、チオキソ（＝Ｓ）、又はイミノ（＝ＮＲｃ）で置換されていてもよい。
【００５９】
別の態様では、任意の基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、へテロアラルキル、シクロアルキル、シクリル、ヘテロシクロアルキル、及びヘテロシクリルのような）の置換基は、その任意の基の何れかの原子上にあり、この場合、置換基で置換されている任意の基（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、へテロアラルキル、シクロアルキル、シクリル、ヘテロシクロアルキル、及びヘテロシクリルのような）は、１個又はそれ以上の置換基（同一であっても異なっていてもよい）で、水素原子を各々置き換えて置換されていてもよい。適した置換基の例としては、これらに限定されるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクリル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルキル、アラルキル、へテロアラルキル、アリール、ヘテロアリール、ハロゲン、ハロアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、ヒドロキシルアルキル、オキソ（つまり、カルボニル）、カルボキシル、ホルミル、アルキルカルボニル、アルキルカルボニルアルキル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールオキシカルボニル、チオ、メルカプト、メルカプトアルキル、アリールスルホニル、アミノ、アミノアルキル、ジアルキルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アルキルアミノカルボニル又はアルコキシカルボニルアミノ；アルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、アルキルカルボニル又はアリールアミノ置換アリール；アリールアルキルアミノ、アラルキルアミノカルボニル、アミド、アルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、イミノ、カルバミド、カルバミル、チオウレイド、チオシアナト、スルホアミド、スルホニルアルキル、スルホニルアリール又はメルカプトアルコキシが挙げられる。
【００６０】
本明細書で用いる「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」及び「末梢に投与される」という語句は、患者のシステムに入り、これにより代謝及びその他の類似のプロセスに従事するような、本発明の化合物、薬物又はその他の物質の投与、例えば皮下投与を意味する。
【００６１】
キラル中心の命名法に関して、「ｄ」及び「ｌ」の立体配置という用語は、ＩＵＰＡＣ勧告に定義される通りである。用語の使用に関して、ジアステレオマー、ラセミ化合物、エピマー及びエナンチオマーは、通常の文脈中で用いられて調製物の立体化学を説明する。天然に存在する異性体又は合成異性体は、当該技術で公知の幾つかの方法で分離することができる。２つのエナンチオマーからなるラセミ混合物の分離方法には、キラル固定相を用いるクロマトグラフィーが挙げられる（例えば、「"Chiral Liquid Chromatography," W. J. Lough, Ed. Chapman and Hall, New York (1989)」を参照願いたい）。エナンチオマーは、また古典的な分割技術により分離することもできる。例えば、ジアステレオマー塩の形成及び分別結晶法を用いて、エナンチオマーを分離することができる。カルボン酸のエナンチオマーの分離のために、ブルシン、キニーネ、エフェドリン、ストリキニーネ等のエナンチオマー的に純粋なキラル塩基の添加によりジアステレオマー塩を形成することができる。あるいは、メントールのようなエナンチオマー的に純粋なキラルアルコールを用いてジアステレオマーエステルを形成し、その後ジアステレオマーエステルの分離及び加水分解により、遊離したエナンチオマー濃縮のカルボン酸が得られる。アミノ化合物の光学異性体を分離するために、カンファースルホン酸、酒石酸、マンデル酸又は乳酸のようなキラルなカルボン酸又はスルホン酸を添加すると、ジアステレオマー塩が形成される。
【００６２】
本明細書で用いる「免疫応答の抑制すること」とは、細胞又は動物、特に哺乳動物の免疫応答を開始する又は持続する能力を低下させること、細胞の免疫賦活能を下方制御すること等を示す。例えば、ＦＬＴ３活性を低下させるとは、免疫応答を抑制すること、又はＦＴＬ３依存性シグナル伝達を低下させることの１つの例である。ＦＬＴ３によるシグナル伝達の「抑制」には、次の状態：減速、遅延及び停止と同等、のうちの何れか又は全てが含まれる。抑制することには、またアポトーシスまで到達するＤＣ細胞、ＮＫ細胞及びＢ細胞が包含される。
【００６３】
「治療有効量」とは、臨床の成果を含む、有益な成果又は所望の成果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回又はそれ以上の投与回数で投与することができる。本発明の目的において、有効量の治療剤とは、疾病状態の進行を緩和する、症状を改善させる、症状を安定させる、症状の進行を逆戻りさせる、減速させる又は遅延させるために十分な量である。有効量とはまた、患者への単一回又は複数回の投与時に、又はＦＬＴ３疾患若しくはＦＬＴ３関連の疾患の患者の生存率を、このような治療を施さない時に予期される率より高めるのに有効な薬剤の量でもある。
【００６４】
本明細書で用いる「治療」又は対象を「治療すること」には、疾病又は疾患、疾病又は疾患の症状、又は疾病又は疾患のリスク（又は感染しやすいこと）を、治療、治癒、緩和、軽減、変更、是正、改善、好転させる又は影響を与える目的で、疾病又は疾患（例えば、免疫関連の疾患）を有するか、疾病又は障害疾患の症状を有するか、又は疾病又は障害疾患のリスクのある（又は感染しやすい）対象への治療剤（例えば、小分子、抗体又はアンチセンス核酸）の適用又は投与、又は対象に由来の細胞又は組織への治療剤の適用又は投与が含まれる。
【００６５】
前記の通り、ＦＬＴ３阻害剤には、小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗ＦＬＴ３抗体、抗ＦＬＴ３抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプチドをコードする核酸、有機分子及びそれらの何れかの組合せが含まれる。
【００６６】
ＦＬＴ３阻害に有用な小分子の例としては、ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５、ＣＥＰ−５２１４、ＣＥＰ−７０５５、ＰＫＣ４１２、ＳＵ１１２４８、ＳＵ５４１６、ＳＵ５６１４、ＭＬＮ５１８、ＢＡＹ４３−９００６、ＣＨＩＲ−２５８、アミノ−ベンゾイミダゾール−キノロン類、Ｋｉ２３８１９、スタウロスポリン誘導体及び発見されている又は発見されるであろうその他の分子が挙げられる。ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５、（「新規なＦＬＴ３拮抗薬・ＭＬＮ５１８のフェイズＩ臨床結果：許容性、薬物動態学及び薬力学（抄録）De Angelo, et al.,(2003) Blood 102, 219a」、「野生型（WT)又は突然変異のＦＬＴ３で特徴付けられる急性脊髄白血病（ＡＭＬ）／ハイリスク骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の患者（pts）でのチロシンキナーゼ阻害剤・ＰＫＣ４１２のランダムのフェイズＩＩ試行（抄録）Estey, et al.,(2003) Blood 102, 2270a」、「強力なＦＬＴ３阻害剤・ＭＬＮ５１８のＦＬＴ３ＩＴＤ白血病細胞系列でのシタラビン及びダウノルビシンとの相乗効果の提示（抄録）Heinrich, et al.,(2003) Blood 102, 330a」、「新規な選択的ＦＬＴ３拮抗薬・ＣＴ５３５１８の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）治療、Kelly, L. M., et al.(2002c), Cancer Cell 1, 421-432」、「ＦＬＴ３標的のチロシンキナーゼ阻害剤のインビトロ及びインビボでの白血病細胞への細胞毒性、Levis, M., et al.,(2002) Blood 99, 3885-3891」、「新規なＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤、Levis, M., and Small, D.(2003b) Expert Opin Investig Drugs 12, 1951-1962」、「インビトロ及びインビボで強力な活性を有する新規なＦＬＴ３チロシンキナーゼ阻害剤・ＳＵ１１２４８、O'Farrell, et al.,(2003a) Blood 101, 3597-3605」、「再発又は難治性の急性骨髄白血病の患者で生物活性及び臨床効果を示す新規なＦＬＴ３阻害剤・単一薬剤ＣＥＰ７０１、Smith, B. D., et al.,(2004) Blood, in press」、「ＡＭＬにおけるＦＬＴ３阻害剤・ＰＫＣ４１２療法：フェイズＩＩ試行の結果、Stone, R. M., et al.(2004) Ann Hematol 83 Suppl 1, S89-90」、「チロシンキナーゼ阻害剤によるＡＭＬ患者のＦＬＴ３内部の直列重複変異体の形質転換活性の阻害、Tse, K. F., et al.,(2002) Leukemia 16, 2027-2036」、「チロシンキナーゼ阻害剤の使用によるＦＬＴ３介在の形質転換の阻害、Tse, K. F., et al.,(2001) Leukemia 15, 1001-1010」、「小分子チロシンキナーゼ阻害剤・ＰＫＣ４１２による白血病細胞の変異体ＦＬＴ３受容体の阻害、Weisberg, E., et al.,(2002) Cancer Cell, 433-443」及び「ＳＵ５４１６及びＳＵ５６１４の野生型及び変異体ＦＬＴ３受容体チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性の阻害、Yee, K. W., et al.,(2002) Blood 100, 2941-2949」を参照願いたい。
【００６７】
「ｔ（４；１４）多発性骨髄腫の治療のためのＦＧＦＲ３を標的とする小分子阻害剤・ＣＨＩＲ２５８の臨床前研究、Suzanne Trudel et al.；presented at the 95th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, March 2004, in Orlando, FIa.」、「成長因子チロシンキナーゼ受容体の小分子阻害剤・ＣＨＩＲ２５８でのインビボの耐久性ある標的の調節と強力な抗腫瘍効果のある種々の服薬スケジュールとの関連、Sang Hoon Lee et al.;presented at the 95th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research, March 2004, in Orlando, FIa.」、「インビボでの抗血管新生作用及び抗腫瘍作用と受容体チロシンキナーゼの小分子阻害剤・ＣＨＩＲ２５８による標的の調節との関連、Sang Hoon Lee et al.;presented as a Symposium Talk at the Keystone Symposium on Protein Kinases and Cancer」、「分子ベース療法の見込み、February 2004, in Silverthorne, Colo」及び「ヒトの急性骨髄性白血病の異種移植片治療におけるＦＬＴ３キナーゼ阻害剤・ＣＨＩＲ２５８の臨床前薬理、Daniel Menezes et al.;presented at the American Society of Hematology (ASH) Annual Meeting December, 2003, in San Diego, Calif.」を参照願いたい。 Ｋｉ２３８１９は、「Leukemia (2005) 19, 930-935, 07 April 2005」に開示されている。各論文はあらゆる目的において参照してその全体を本明細書に取り込む。
【００６８】
本発明の方法で有用な化合物の更なる例として、以下の米国特許又は米国特許出願（公開番号で記載）、第２００５０１４３４４２号、第２００５０１４３３８２号、第２００５０１３７２０１号、第２００５００２０５７０号、第２００３０２１９８２７号、及び第２００４０１０６６１５号に記載される化合物が挙げられ、これらはあらゆる目的において参照してその全体を本明細書に取り込む。
【００６９】
本発明による使用に好ましいＦＬＴ３の阻害剤の例として、インドリノン化合物、ビス（１Ｈ−２−インドリル）−１−メタノン化合物、インドロカルバゾール化合物、及びキノキサリン化合物が挙げられ、好ましくはこのような化合物が本明細書に記載のようなＦＬＴ３阻害活性を示す。本発明による使用に特に好ましいＦＬＴ３阻害剤は、以下に表される化合物を含む。
【００７０】
【化００５】
【００７１】
本発明において有用なＦＬＴ３阻害化合物は、式Ｉ：
【００７２】
【化００６】
【００７３】
（式中、
Ｗは、Ｃ、Ｎ又はＯであってもよく；
Ｘは、Ｃ、Ｎ又は存在しない、であってもよく；
Ｙは、Ｃであってもよく；
Ｚは、Ｃ又はＮであってもよく；そして
Ｒ基は、以下のＲ１〜Ｒ５の置換されている可変基であってもよく：
Ｒ１は、Ｈ、アルコキシ、ヒドロキシル又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、アルコキシ又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ３は、Ｈ、Ｏ、アリール、ヘテロアリール又はＣ（Ｏ）ヘテロアリールであってもよく；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＨ−ヘテロアリール又は存在しない、であってもよく；
Ｒ５は、Ｈ、アリール、ヘテロアルキル／アリール又は存在しない、であってもよく；そして、
ＷＸ、ＷＹ、ＹＺ、ＹＲ３及びＺＲ４に於ける破線は、二重結合であってもよいことを示す）
で表される化合物を含む。
式Ｉの置換基は、本明細書に記載の置換基で置換されていてもよい。
【００７４】
本発明の治療法の特定の治療剤の有効性は、容易に判定することができる。例えば、好適な化合物をインビトロアッセイにより同定することができる。このアッセイはＦＬＴ３の自己リン酸化を阻害する効能についてのアッセイであり、次の工程、１）潜在的なＦＬＴ３阻害剤を細胞に接触させること、及び２）対照（つまり、１つ又は複数の潜在的な化合物で処理されていない同じ細胞）に対して、前記細胞のＦＬＴ３のリン酸化状態を測定すること、を含む。このような工程１）及び２）を含むような自己リン酸化アッセイは、本明細書において「標準ＦＬＴ３インビトロアッセイ」と定義され、「チロシンキナーゼ阻害剤を用いたＦＬＴ３介在の形質転換の阻害：Tse, K. F., Novelli, E., Civin, C. I., Bohmer, F. D., and Small, D.(2001) Leukemia, 15(7):1001-10」で考察されている。
【００７５】
有用である潜在的なＦＬＴ３阻害化合物を、後に続く実施例に開示されるように評価することもでき、それには、潜在的なＦＬＴ３阻害薬剤をＦＬＴ３受容体の活性レベルが高いマウスに投与すること、及び免疫応答の変化を測定することが含まれ、この場合、免疫応答の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であり得ることを示す。この場合、その潜在的に有用な化合物は、Ｉ型インターフェロンの活性を低下させるインターフェロン拮抗薬の添加又は同時投与をせずに有用である。しかし、ある特定の態様では、Ｉ型インターフェロンの活性を低下させるインターフェロン拮抗薬の添加が有用なこともある。本明細書で用いられる「インターフェロン拮抗薬」は、対象内の細胞又はインビトロ細胞においてＩ型インターフェロンの活性又は機能を低下させることのできる抗体、抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ポリペプチドをコードする核酸、有機分子又はそれらの何れかの組合せを包含する。
【００７６】
本発明の治療法での使用に好ましい治療剤は、標準インビトロＦＬＴ３阻害剤アッセイで測定して、少なくとも５０％、そして好ましくは９０％を上回ってＦＬＴ３活性を阻害する。より好ましくは、薬剤は、標準インビトロＦＬＴ３阻害剤アッセイにおいて、ＦＬＴ３活性を少なくとも約４５％又は６５％阻害し、さらにより好ましくは、ＦＬＴ３を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％阻害する。
【００７７】
本明細書で用いられる「抗体（antibody）」又は「抗体（antibodies）」という用語は、Ｆａｂ又はその抗原認識断片を含む、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥを包含する全ての型の免疫グロブリンを示す。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってもよく、（例えば）マウス、ネズミ、ウサギ、ウマ又はヒトを含む種の何れかの種類であってもよく、又はキメラ抗体であってもよい。例えば、「M. Walker et al., Molec. Immunol. 26:403-11 (1989)」、「Morrision et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 81:6851 (1984)」及び「Neuberger et al., Nature 312:604 (1984)」を参照願いたい。抗体は、米国特許第４，４７４，８９３号（Reading）又は米国特許第４，８１６，５６７号（Cabilly et al.）に開示される方法に従って作製した組換えモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、また米国特許第４，６７６，９８０号（Segel et al.）に開示される方法に従って作製した特異的抗体により化学的に構築してもよい。抗体は、モノクローナル、キメラ、抗イディオタイプ、ヒト化、霊長類化及びそれらの何れかの組合せであってもよい。
【００７８】
ＦＬＴ３抗体には、その活性化を阻害するような方法でＦＬＴ３と結合する抗体が含まれる。これには、ＦＬＴ３と結合し、そしてＦＬＴ３に結合するＦＬをブロックするか又はＦＬＴ３の立体構造の変化を引き起こすかのどちらかで、そのシグナルを送る能力を遮断して、ＦＬＴ３を活性化するＦＬの能力を阻害する、ポリクローナル及びモノクローナルの両方の抗体を含む。このような抗体に関しての「結合しない」という用語は、ＦＬＴ３に結合することと比較して、実質的に反応しないことを意味する。ＦＬＴ３抗体の例としては、ＩＭＣ−ＮＣ７及びＩＭＣ−ＥＢ１０が挙げられる（完全なヒト抗ＦＬＴ３中和の抗体による野生型又はＩＴＤ変異体のＦＬＴ受容体を発現するモデルにおけるヒト白血病の抑制：Li, Y., Li, H., Wang, M., Lu, D., Wu, Y., Bassi, R., Zhang, H., Ludwig, D., Pytowski, B., Kussie, P., Piloto, O., Small, D., Bohlen, P., Witte, L., Zhu, Z., and Hicklin, DJ. Blood (Epub 2004, in press, 2004））。
【００７９】
抗体は、リン酸化ＦＴＬ３又は非リン酸化ＦＴＬ３と結合する抗体を含んでいてもよい。抗体は、リン酸化又は非リン酸化ＦＴＬ３の何れかに特異的であってもよい。抗体との関連で本明細書で用いられる特異的とは、ＦＴＬ３を識別し、ＦＴＬ３と独占的に結合する抗体の能力を示す。
リン酸化又は非リン酸化ＦＬＴ３を識別する抗体はまた、本発明のＦＬＴ３阻害剤の有効性又は細胞若しくは対象の免疫応答の抑制を測定するのに有用でありえる。例えば、リン酸化ＦＬＴ３のレベルは、このような抗体を用いて、例えばウエスタンブロットによって測定することができる。
【００８０】
当該技術で公知の種々の手順が、ＦＬＴ３に対する抗体又はそのタンパク質の断片、誘導体、同族体若しくは類似体の製造に用いられる。本発明の抗体は、これらに限定されるものではないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え作製された抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（二重特異性ｓｃＦｖを含む）、一本鎖抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合のＦｖｓ（ｓｄＦｖ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、並びに上記の何れかのエピトープ結合断片が挙げられる。特に、本発明の抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位（例えば、抗体の１つ又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ））を有する分子が挙げられる。
【００８１】
抗体の製造のため、例えば、天然のＦＬＴ３タンパク質若しくは合成体、又は前述の誘導体を用いて注射により種々の宿主動物を免疫化することができる。このような宿主動物には、これらに限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ネズミなどが挙げられる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて、免疫応答を増加させることができ、そのようなアジュバントとして、これらに限定されるものではないが、（完全及び不完全な）フロイント、（水酸化アルミニウムのような）無機物ゲル、（リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールのような）界面活性物質、及び（カルメット・ゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin：ＢＣＧ）及びコリネバクテリウム属パルバム（Corynebacterium parvum）のような）潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。ＦＬＴ３又はその誘導体、断片、同族体若しくは類似体に対するモノクローナル抗体の製造のためには、連続継代培養細胞系による抗体分子の製造に提供される何れの技術を用いてもよい。
【００８２】
このような技術としては、これらに限定されないが、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に開発されたハイブリドーマ法（1975, Nature 256:495-497）、トリオーマ法（Gustafsson et al., 1991, Hum. Antibodies Hybridomas 2:26-32）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72）、及びヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ法（Cole et al., 1985, In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられる。本発明の追加の態様では、モノクローナル抗体は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５号に記載される最近の技術を用いて無菌動物において産生することができる。ＦＬＴ３のイディオタイプを含む抗体断片は、当該技術で公知の技術により生成することができる。例えば、このような断片には、これらに限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により産生できるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を少なくすることにより産生できるＦａｂ’断片；抗体分子をパパイン及び還元剤で処理して産生できるＦａｂ断片；及びＦｖ断片、が挙げられる。合成抗体、例えば化学合成により産生される抗体は、本発明において有用である。
【００８３】
標的ＦＬＴ３ｍＲＮＡ配列と結合することのできる（二重鎖を形成する）、又は二本鎖ＤＮＡヘリックス中のＦＬＴ３配列と結合することのできる（三重ヘリックスを形成する）、一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡの何れか）を含むアンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドを、本発明に従って産生できる。本発明によれば、アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドは、ＦＬＴ３ｃＤＮＡのコーディング領域の断片を含む。このような断片は、一般に少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは、約１４〜約３０ヌクレオチドを含む。所与のタンパク質のｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドを産生できることは、例えば、「Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988」及び「van der Krol et al., Bio Techniques 6:958, 1988」に記載されている。アンチセンス・オリゴヌクレオチドとしては、例えば、Ｓｍａｌｌ、Ｄ．、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎ、Ｍ．、Ｋｉｍ、Ｅ．Ｋ．、Ｃａｒｏｗ、Ｃ、Ａｍｉｎ、Ｓ．、Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、Ｐ．、Ｗｉｔｔｅ、Ｌ．、Ｂｕｒｒｏｗ、Ｃ、Ｒａｔａｊｃｚａｋ、Ｍ．、Ｇｅｗｉｒｔｚ、Ａ．Ｍ．及びＣｉｖｉｎ、Ｃ．Ｉ．が挙げられる。Ｆｌｋ−２／ＦＬＴ３のヒト同族体である、ＳＴＫ−１は、ＣＤ３４＋ヒト骨髄細胞で選択的に発現し、早期の前駆体／幹細胞の増殖に関与する。「Proc. Natl. Acad. Sci. 91:459-463, 1994」を参照願いたい。図９に配列を示す。有用な配列としては、図９に示した全配列又はその生物学的に活性な断片が挙げられる。当業者であれば、通常の方法でそれらの有用な断片を容易に同定することができるであろう。
【００８４】
アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドと標的核酸配列との結合の結果、二重鎖の分解促進、転写又は翻訳の早期終止、又はその他の方法を含む幾つかの方法のうちの一方法により、翻訳（ＲＮＡ）又は転写（ＤＮＡ）を阻害する複合体が形成される。従ってアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＦＬＴ３タンパク質の発現を阻害するのに用いることができる。アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドは、修飾された糖−ホスホジエステル骨格（又はＷＯ９１／０６６２９号に記載のようなその他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを更に含み、この場合、このような糖結合は内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性を示す。抵抗性のある糖結合を有するこのようなオリゴヌクレオチドは、インビボで安定している（つまり、酵素分解に抵抗することができる）が、標的ヌクレオチド配列と結合できる配列特異性を保持する。センス又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドのその他の例としては、ＷＯ９０／１０４４８号に記載のような有機部分、及びポリ−（Ｌ−リシン）のようなオリゴヌクレオチドの標的核酸配列に対する親和性を高めたその他の部分と、共有結合しているオリゴヌクレオチドが挙げられる。なお更に、エリプチシンのようなインターカレート剤、及びアルキル化剤又は金属錯体を、センス又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドに付着させてアンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列に対する結合特異性を修飾してもよい。
【００８５】
アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４に媒介されるＤＮＡトランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又はエプスタイン−バーウイルス（Epstein-Barr virus）のような遺伝子導入ベクターを用いることによる、を含む何れかの遺伝子導入法により標的核酸配列を含有する細胞へ導入してよい。アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドは、インビボ又はエキソビボの何れかで、アンチセンス又はセンス・オリゴヌクレオチドを好適なレトロウイルスベクターへ挿入し、次に挿入された配列を含有するレトロウイルスベクターを、標的核酸配列を含有する細胞に接触させることによって、導入することが好ましい。好適なレトロウイルスベクターとしては、これらに限定されるものではないが、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと名付けられたダブルコピーベクター（ＰＣＴ出願米国９０／０２６５６号を参照願いたい）が挙げられる。
【００８６】
センス又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドを、ＷＯ９１／０４７５３号に記載のように、リガンド結合分子との結合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含有する細胞へ導入してもよい。好適なリガンド結合分子として、これらに限定されるものではないが、細胞表面受容体、増殖因子、その他のサイトカイン、又は細胞表面受容体と結合するその他のリガンドが挙げられる。リガンド結合分子の結合が、リガンド結合分子のその対応する分子又は受容体と結合する能力を実質的に干渉しないか、又はセンス若しくはアンチセンス・オリゴヌクレオチド又はその結合体の細胞への進入を阻害しないことが好ましい。
【００８７】
あるいは、センス又はアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８号に記載のように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により、標的核酸配列を含有する細胞へ導入してもよい。センス又はアンチセンス・オリゴヌクレオチド−脂質複合体は、細胞内で内在性リパーゼにより分離されることが好ましい。
【００８８】
ポリヌクレオチドの例として、限定するものではないが以下の通りである：遺伝子又は遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え型ポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体のような修飾されたヌクレオチド、ウラシル（uracyl）、その他の糖類及びフルオロリボースとチオエートのような結合基、並びにヌクレオチドの分枝物、を包含していてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合の後更に、標識成分との結合による修飾をしてもよい。この定義に含まれるその他の型の修飾としては、キャップ、１個又はそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体での置換、及びタンパク質、金属イオン、標識成分、その他のポリヌクレオチド又は固相支持体にポリヌクレオチドを接着させる手段の導入、が挙げられる。ポリヌクレオチドはＤＮＡであることが好ましい。本明細書で用いられる「ＤＮＡ」には、塩基Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧを含むだけでなく、メチル化ヌクレオチドのようなそれらの類似体又はこれらの塩基の修飾された形態の何れか、非荷電結合及びチオエートのようなヌクレオチド間修飾、糖類似体の使用、並びにポリアミドのような修飾及び／又は代替骨格構造も含まれる。ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド領域は、別な配列に対して特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％、又は９５％）の「配列同一性」を有し、２つの配列を比較して整列させた場合、そのパーセンテージの塩基が同一であることを意味する。このアラインメント及びホモロジー又は配列同一性パーセントは、当該技術で公知のソフトウェアプログラム、例えば、「Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, section 7.7.18」に記載のものを用いて判定することができる。好ましいアラインメントプログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Scientific and Educational Software, Pennsylvania）であり、デフォルトパラメータを用いることが好ましく、デフォルトパラメータは次の通りである：ｍｉｓｍａｔｃｈ＝２；ｏｐｅｎ ｇａｐ＝０；ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ＝２。
【００８９】
本発明の一態様では、インターフェロン拮抗薬は、Ｉ型インターフェロンとその受容体との結合を減少させる。別の態様では、インターフェロン拮抗薬は、インターフェロンが対象の細胞上の受容体と結合した後にシグナル伝達を干渉する。別の態様では、インターフェロン拮抗薬は、対象の細胞によるインターフェロンの産生を低下させる。別の態様では、インターフェロン拮抗薬は、対象において細胞によるインターフェロン分泌を減少させる。さらに別の態様では、インターフェロン拮抗薬は、対象のインターフェロンのバイオアベイラビリティを低下させる。更なる態様では、インターフェロン拮抗薬はＴＮＦである。
【００９０】
本明細書で用いられる「Ｉ型インターフェロン」は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−varpi、及びＩＦＮ−τを含む。「Oritani et al. (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12(4): 337-48」には、Ｉ型インターフェロンのその他の例が記載されている。
インターフェロン拮抗薬は、（ＩＦＮ−αのような）Ｉ型インターフェロンとその受容体との間の相互作用を妨げ、その結果、抗原提示細胞となるＤＣへの単球の分化を減少させることにより、抗原提示細胞の産生の減少をもたらす。抗原提示細胞の産生の減少は、１つ又はそれ以上の異なる機構により達成されるが、それが起こる厳密な機構は本発明では重大ではない。例えば、ＴＮＦ及び／又はアゴニストの抗ＴＮＦ受容体抗体は、ｐＤＣのＩ型ＩＦＮ非産生細胞への分化を促進することによりＩ型インターフェロン分泌を低下させることができる。
【００９１】
ある化合物が本発明で有用なインターフェロン拮抗薬であるかどうかを、同定するために実行することのできるアッセイは多数存在する。これらのアッセイは、当業者には周知である。１つのアッセイは、単球のＤＣへの分化に適した条件下で、テストする化合物を単球培養物に添加する、樹状細胞分化アッセイである。単球のＤＣへの分化を誘導するために、この条件には、ＳＬＥ血清又はインターフェロンの何れかの添加されている。従って、化合物を添加していない培養中の単球の分化と比較して、化合物が、インターフェロン及び／又はＳＬＥ血清が導く単球のＤＣへの分化を阻害するならば、その化合物はインターフェロン拮抗薬である。
【００９２】
インターフェロン拮抗薬である化合物を同定する別のアッセイは、標識されたインターフェロンの細胞上の受容体への結合を阻害するのを測定する結合実験である。化合物が、インターフェロンとその受容体との結合、又はインターフェロンとインターフェロン受容体を有する細胞との結合を阻害することができるならば、その化合物はインターフェロン拮抗薬である。
【００９３】
更に、化合物がインターフェロン拮抗薬であるかどうかを判定するアッセイは、通常インターフェロン産生及び／又は分泌を誘導する誘因、例えばウイルスに応答した細胞によるインターフェロンの産生を阻害する程度を測定するアッセイである。従って、化合物及び誘因（例えばウイルス）の存在下で、通常はインターフェロンを産生する細胞がインターフェロンを産生しないか、又は低いレベルでしかインターフェロンを産生しないならば、その化合物はインターフェロン阻害剤である。
【００９４】
一態様では、治療有効量のインターフェロン拮抗薬を同定するアッセイは、治療中の対象から採取した血清へのインターフェロン受容体のインビトロでの結合を減少させるのに必要なインターフェロン拮抗薬の量を測定することである。本明細書の実施例では、インビトロで結合を５０％減らすのに必要な濃度が、インビボで治療上有効となる。
【００９５】
本発明の一態様では、インターフェロン拮抗薬は、抗ＩＦＮ−α抗体又はその抗原結合断片を含む。本発明の別の実施形態では、インターフェロン拮抗薬はＴＮＦである。本発明の一態様において、組成物の要素でありえる抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体及びそれらの何れかの組合せを含む。
特定の態様では、本発明の方法は、免疫応答の発生を抑制すること、遅らせること、高まった免疫応答を治療すること、又は細胞の免疫応答を低下させることを提供する。
【００９６】
本発明の治療法には、免疫関連の疾患（特に、臓器移植の結果として）又はその他の免疫関連の疾患を患う哺乳動物細胞若しくは哺乳動物対象を選択すること、又は同定することが含まれる。治療のための細胞の例としては、種々の真核細胞、例えばＤＣ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。
また、本発明は、対象の免疫関連の疾患を治療する方法を提供する。この方法は、対象に治療有効量のＦＬＴ３阻害剤を投与してＦＬＴ３の活性を低下させることを含む。
【００９７】
治療方法は、対象のＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療する方法を提供する。対象は哺乳動物であってよく、この場合の哺乳動物は、ヒト、霊長類、ネズミ、イヌ、ネコ又はマウスである。方法には、特に、移植後の臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、低ガンマグロブリン症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡の結果としての、免疫関連の疾患を患っているか若しくは潜在的に患っている、又は患うリスクの高いグループにいる哺乳動物対象を同定する工程が含まれる。本発明の方法は、骨髄非破壊的な処置療法又はそれらを組み合わせて施術した後の骨髄生着を促進させるためにも用いてもよい。対象が同定されると直ちに、ＦＬＴ３の活性を低下させるために、治療有効量のＦＬＴ３阻害剤を投与する。ある特定の態様によれば、ＦＬＴ３阻害剤は対象のＦＬＴ３依存性シグナル伝達を低下させる。この方法は、Ｔ細胞阻害剤の同時投与を更に含んでいてもよい。好適なＴ細胞阻害剤の例は、後で考察される。
【００９８】
その他の態様によれば、投与したＦＬＴ３阻害剤は、対象の免疫賦活能を下方制御する。患者の自己免疫疾患を治療する方法は、患者の樹状細胞の数を減らすのに十分な量のＦＬＴ３阻害剤を投与する工程を含んでもよい。更に、それを必要とする患者に治療有効量のＦＬＴ３阻害剤を投与することにより、移植片並びに移植された組織及び臓器の生着を促進するための方法が含まれる。
【００９９】
本発明は、臓器移植、肺移植、肝臓移植等のための外科手術をうける患者に、１つ又はそれ以上の本発明の化合物を投与することを含む、特に、治療のための方法を提供する。従って、免疫応答及び潜在的な臓器拒絶反応を減少させるために、１つ又はそれ以上の本発明の化合物の有効量を、手術前に、及び／又は手術時前後に、及び／又は手術後に投与することができる。
【０１００】
ＦＴＬ３阻害剤は、例えば、１日に１回、１日に２回、１日に３回又は１日に４回投与してよい。ＦＴＬ３阻害剤は、例えば、錠剤形態、粉末形態、液体形態で又はカプセル剤で投与できる。毎日投与されるＦＴＬ３阻害剤の量は、対象の体重、年齢、健康状態、性別又は病状に基づいて増加させても減少させてもよい。
【０１０１】
本発明の方法は、免疫抑制療法及び／若しくは予防法を提供するため、又は神経系の疾患からの保護若しくは神経系の疾患の治療を提供するために、哺乳動物対象、例えばヒトの治療に特に有用である。具体的に、このような対象として、移植片対宿主病、糖尿病１型、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、及び狼瘡のような、免疫関連の疾患に苦しむ対象が挙げられる。
【０１０２】
これらの方法による治療に適した個体として、免疫関連の疾患の初期又は後期にある個体、更に治療、例えば臓器移植を受けたか又は受ける直前の個体を含む、免疫関連の疾患を有する又は免疫関連の疾患の疑いのある個体が挙げられる。本明細書に記載される方法に適したその他の個体は、関節炎、糖尿病１型、関節リウマチ、クローン病又は多発性硬化症の発症に対して遺伝的素因を有する個体、及び／又は免疫関連の疾患の発症と関連がある薬剤に曝された個体、のような免疫関連の疾患を発症するリスクが高いと考えられる個体である。
【０１０３】
免疫関連の疾患の存在及び本明細書に記載される方法を受ける個体の適合性は、イメージング技術、血清マーカーの分析及び生検のような診断方法を含む、当該技術で公知の何れかの技術により確定することができる。
【０１０４】
別の態様において、本発明の方法では、これらに限定されるものではないが、プロテアーゼ阻害剤、抗炎症薬剤、Ｔ細胞阻害剤、化学療法薬剤、抗炎症薬剤、解熱剤、増感剤、放射線防護剤、泌尿器薬剤、制吐薬剤、及び／又は下痢止め薬剤等を含む、免疫関連の疾患のその他の既知治療と併せて投与する、すなわち同時投与することができる。例としては、シクロスポリン、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、メトトレキサート、タクロリムス、シスプラチン、カルボプラチン、ドセタキセル、パクリタキセル、フルオロウラシル、カペシタビン、ゲムシタビン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、マイトマイシン、ゲフィチニブ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン、アセトアミノフェン、ミソニダゾール、アミフォスチン、タムスロシン、フェナゾピリジン、オンダンセトロン、グラニセトロン、アロセトロン、パロノセトロン、プロメタジン、プロクロルペラジン、トリメトベンザミド、アプレピタント、アトロピン含有ジフェノキシレートが挙げられる。本発明のＦＬＴ３阻害剤と同時投与されるのに適した化合物のその他の例は、「Progress in Drug Research, "Recent advances in immunosuppressants," Bijoy Kundu and Sanjay K. Khare, Vol. 52 (E. Jucker, Ed.), 1999, Birkhauser Verlag, Basel (Switzerland)」に見られる。このような付加的治療及び／又は薬剤の投与は、本発明の方法に含まれるものとする。
【０１０５】
本発明の方法で用いる化合物は、鼻腔内に、経口的に、又は注射、例えば筋肉内、腹腔内、皮下若しくは静脈注射により、又は経皮、眼内若しくは腸内への手段で投与することができる。最適な用量は、従来の手段により決定することができる。本発明の方法で用いる化合物は、プロトン化された形態及び水溶性の形態で、例えば、有機酸若しくは無機酸の医薬上許容され得る塩、例えば、塩酸塩、硫酸、ヘミ硫酸、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩などとして、対象へ投与されることが適している。
【０１０６】
本発明の方法で用いる化合物は、単独で用いるか、又は上記に考察される１つ又はそれ以上のその他の治療剤と組み合わせて、従来型の賦形剤と、すなわち活性化合物と有害な反応を起こさず、そのレシピエントに有害でない、非経口、腸内又は鼻腔内適用に適した薬学的に許容される有機担体物質又は無機担体物質と混合した医薬組成物として用いることができる。好適な薬学的に許容される担体としては、これらに限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペトロエトラル（petroethral）脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。医薬製剤は、滅菌し、必要に応じて助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、バッファー、着色剤、香味料及び／又は芳香剤、並びに活性化合物と有害な反応を起こさない同様な物と混合することができる。
【０１０７】
非経口適用のためには、溶液が特に適しており、好ましくは、油性又は水溶液、更に懸濁液、エマルジョン又は坐剤を含むインプラントである。アンプルは、便宜な投与量単位である。腸内適用のためには、タルク及び／又は炭水化物担体結合剤等を有する錠剤、糖衣錠又はカプセル剤が特に適し、担体は好ましくは、ラクトース及び／又はトウモロコシデンプン及び／又はジャガイモデンプンである。シロップ剤、エリキシル剤等は、加糖媒体を使用することができる。徐放性組成物は、有効成分を、例えばマイクロカプセル化、多重コーティング等による、区別をつけた分解が可能なコーティングで保護するような方法で製剤化できる。局所適用のためには、本発明の化合物の１つ又はそれ以上を含有する局所用軟膏又はクリーム中に調製して製剤にしてよい。軟膏として処方する場合は、本発明の化合物の１つ又はそれ以上をパラフィン又は水混和性基剤の何れかと一緒に用いることが適している。１つ又はそれ以上の化合物をまた、水中油型クリーム基剤を用いて処方することもできる。その他の適した局所製剤としては、例えばトローチ剤及び皮膚パッチが挙げられる。静脈投与又は非経口投与、例えば、皮下、腹膜内又は筋肉内投与が一般に好ましい。
【０１０８】
当然のことであるが、所与の療法で用いられる活性化合物の実際に好ましい量は、用いる具体的な化合物、処方される特定の組成物、適用様式、特定の投与部位等に応じて変動する。所与の投与プロトコルに対する最適な投与割合は、当業者が、前述の指針に関して実施される従来の投与量決定テストを用いて容易に確認することができる。所望の用量は、１日に１回投与するか、又は数回に分割した用量、例えば２〜４回に分割した用量を、１日の適当な間隔で投与するか、又はその他の適当なスケジュールで投与するのが適している。
【０１０９】
恒常的に活性化されたＦＬＴ３受容体を有するトランスジェニック非ヒト動物も、また提供される。特に、恒常的に活性なＦＬＴ３遺伝子をそのゲノムに挿入した「Ｔｅｌ−ＦＬＴ３トランスジェニックマウス」として知られる、トランスジェニックマウスが提供される。Ｔｅｌ−ＦＬＴ３トランスジェニックマウスは、当該技術で公知の標準的なトランスジェニック技術に従って作製された。ＦＬＴ３トランスジェニックマウスは、その脾臓及びリンパ節中のＤＣの数が非常に増加している。
【０１１０】
トランスジェニック動物を用いて、治療剤をテストする方法が提供される。例えば、方法の工程には、トランスジェニック動物、好ましくは恒常的に又は制御できる活性なＦＬＴ３遺伝子を有するマウスを準備することが含まれる。方法には、また動物に治療剤を投与すること及び治療剤の効果を判定するために動物の免疫応答を測定することが含まれる。例えば、ＤＣの数を測定することができ、その場合、ＤＣ数の減少が動物の免疫応答の低下を示す。Ｔ細胞の数も投与後に測定することができ、その場合、Ｔ細胞の数の減少が動物の免疫応答の低下を示す。ＦＬＴ３のリン酸化状態も、細胞又は対象の免疫応答が本発明のＦＬＴ３阻害剤の投与後に抑制されていることを示す指標として用いてもよい。例えば、リン酸化されたＦＬＴ３の量は、本発明の方法のＦＬＴ３阻害剤を投与した細胞又は対象において減少してもよい。ある特定の態様によればトランスジェニック動物は、免疫関連の疾患の有用なモデルである。例えば、ある特定の免疫関連の疾患を患っているヒトは、ＤＣ、Ｔ細胞、及び／又はＮＫ細胞の数が増加している。
【０１１１】
本発明は、またインビトロ及びインビボでの活性から治療剤をスクリーニングする方法を提供する。例えば、治療剤を細胞へ投与し、次いでその細胞の免疫応答の低下を調べる。具体的には骨髄細胞、より具体的には動物の骨髄から産生されたＤＣが、特に有用である。その他の有用な細胞種及び／又は系統としては、混合リンパ球、Ｔ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。治療剤のスクリーニングの方法のようなインビトロ適用のためには、マルチウェルプレート又はその他の反応基質を用いることが適している。
【０１１２】
免疫関連の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法には、ＦＬＴ３受容体の活性レベルの高いマウスに薬剤を投与すること、そして免疫応答の変化を測定することが含まれ、この方法では、免疫応答の低下が、免疫関連の疾患の治療にその薬剤が有用でありうることを示す。免疫応答の変化とは、特に、ＤＣ細胞、ＮＫ細胞及び／又はＢ細胞の数の減少である。免疫応答の変化は、またＤＣ共刺激タンパク質のレベル判定により測定することもでき、その場合、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルの低下が、免疫関連の疾患の治療にその薬剤が有用でありうることを示す。ある特定の態様によれば、測定されるＤＣ共刺激タンパク質は、Ｂ７−ＤＣである。特定の態様によれば、免疫応答の測定というのは、同じ治療剤のその他の異なった用量又は対照と比較して、当該細胞の数を測定することであってもよい。測定される細胞は、例えば、ＤＣ細胞、ＮＫ細胞、脾細胞、混合骨髄細胞、Ｔ細胞及びそれらの混合物であってもよい。
【０１１３】
ある特定の態様によれば、免疫応答の変化は、Ｔ細胞増殖アッセイで測定してもよく、その場合、Ｔ細胞増殖の低下が、免疫関連の疾患の治療にその薬剤が有用でありうることを示す。
また、本発明は、インビボでの活性から治療剤をスクリーニングする方法を提供する。例えば、治療剤を哺乳動物へ投与し、次いでその細胞の免疫応答の低下を調べる。具体的には、ＦＬＴ３受容体が恒常的に活性化されているトランスジェニックマウスが作製される。このマウスは、脾臓及びリンパ節中のＤＣの数が非常に増加している。ＦＬＴ３遺伝子が失活しているノックアウトマウスが作製された（K. Mackarehtschian, J.D. Hardin, K.A. Moore, et al., Immunity 3, 147-61(1995)）。Ｂリンパ球前駆体細胞についてはその数の低下が見られるが、末梢のＢリンパ球は影響を受けなかった。ＤＣについては、これらのマウスでは調べていない。
【０１１４】
免疫応答抑制の方法が、下記の考察で実証されているが、上記の別法も同様に適用可能であり、そして好適なものであり、これらの方法のエンドポイント（例えば、治療の有効性）は、周知の診断法及び評価法を含む当該技術の標準法を用いて測定されることが当然理解されるであろう。
本発明を以下の実施例により更に説明するが、これら実施例は何ら本発明を限定するものではないと解釈されたい。本明細書を通じて引用される参考文献、特許及び公開された特許出願、並びに図及び配列表は、内容を参照してその全てを本明細書に取り込む。
【実施例１】
【０１１５】
ＦＬＴ３阻害剤での成熟ＤＣの処置は、成熟ＤＣにおけるアポトーシスを誘導する。
ＦＬＴ３阻害剤に暴露した場合の、ＤＣの生存及び機能を調査した。成熟ＤＣを、ＣＥＰ７０１、５２１４及びＡＧ１２９６に対する用量反応分析で、ＧＭ−ＣＳＦ＋／−ＦＬの存在下でインキュベートした。ＤＣの生存及び活性の減少が観察された。
【０１１６】
マウスの四肢の骨髄（ＢＭ）を、ＰＢＳで洗い流し、赤血球（ＲＢＣ）を低張緩衝液に溶解し、細胞を洗浄した後、ＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）又はＧＭ＋ＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）含有培地に２×１０６細胞／ｍｌで蒔いた。２、４及び６日目に、非接着細胞を除去し、接着細胞を洗浄した後に、新鮮な培地を添加した。８日目に、非接着成熟ＤＣを収集し、ＣＥＰ−７０１の非存在下又は存在下で、５又は５０ｎＭで再び蒔いた。２４時間後、細胞を次にＦＡＣＳ分析のために染色した。ＣＤ１１ｃ＋細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ発現及びアネキシンＶ結合について評価した（図１Ａ）。ＣＥＰ−７０１は、ＧＭ−ＣＳＦ単独又はＧＭ−ＣＳＦとＦＬの組合せのどちらかで、産生したＤＣのアポトーシスを誘導した。これらの結果は、ＣＥＰ−５２１４（データは示されていない）及びＡＧ１２９６を含む、２種類の他のＦＬＴ３阻害剤を用いても確認された。
【０１１７】
図１Ｂは、マウスの四肢のＢＭをＰＢＳで洗い流し、ＲＢＣを溶解し、細胞を洗浄することにより生じたＤＣの刺激の結果を示す。洗浄後、細胞をＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）＋ＦＬ（１００ｎｇ／ｍｌ）含有培地に２×１０６細胞／ｍｌで蒔いた。２、４及び６日目に、非接着細胞を除去し、接着細胞を洗浄した後に、新鮮な培地を添加した。８日目に、非接着成熟ＤＣを収集し、ＡＧ１２９６の非存在下又は存在下で再び蒔いた。２４時間後、細胞をＦＡＣＳ分析のために染色した。樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋細胞）を、ＣＤ８６発現及びアネキシンＶ結合について評価した（図１Ｂ）。ＡＧ１２９６は、ＤＣにおいて用量依存的にアポトーシスを誘導した。このように、ＦＬＴ３阻害は、ＤＣにおいて用量依存的に細胞死を誘導することができる。ＤＣは抗原の提示及びＴ細胞の活性化を担うため、ＤＣを死滅させること、ＦＬＴ３によるＤＣシグナル伝達を抑制すること、又はＦＬＴ３を阻害することによるＤＣの細胞生成を妨げることは、免疫系のＴ細胞アームの抑制に効果があると思われる。ＤＣがＴ細胞を活性化させるために、ＤＣはＭＨＣ分子と結合している抗原を提示し、その表面に共刺激タンパク質を発現させる。
【０１１８】
ＤＣによる共刺激タンパク質発現の調節におけるＦＬ／ＦＬＴ３刺激の役割を調べるため、ヒト骨とＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦとＦＬを、共刺激分子のＢ７ファミリーメンバーであるＢ７−ＤＣの発現についてノーザンブロッティングにより解析した。図１Ｃは、ＦＬの添加がＢ７−ＤＣ発現を大きく上方制御することを示す（ＧＭ−ＣＳＦ単独は発現を示さなかった；データは示されていない）。マウスＢＭ培養は、ＦＡＣＳにより同じ結果を示した。ＦＬＴ３シグナル伝達の阻害は、Ｂ７−ＤＣとＢ７．２（ＣＤ８６）のＤＣにおいて、Ｂ７−ＤＣと同様にＢ７．２（ＣＤ８６）の下方制御をもたらした（図６）。このことは、免疫応答の低下が、ＤＣの細胞死を誘導することだけでなく、その免疫賦活能を下方制御することにより免疫抑制剤としての有用性を高めることで、達成されることを示す。
【実施例２】
【０１１９】
ＦＬＴ３阻害は、Ｔ細胞のＤＣに基づく増殖を抑制する。これらの実験のため、ＤＣをＢＡＬＢｃマウスから上記のように産生させた。細胞を未処理のまま置くか、又はＣＥＰ７０１で処理した後、示した割合でＣ５７ＢＬ／６脾細胞とともに培養皿に蒔いた。３日後、３Ｈを添加し、増殖を判定した。図２Ａで示すように、ＣＥＰ７０１は、増殖を抑えるのに大きな効果を示した。図２ｂでは、標準混合リンパ球反応（ＭＬＲ）でＣＥＰ７０１の阻害をテストするため、ＤＣの代わりにＢＡＬＢ／ｃ脾細胞を用いた。また、この図が示すように、この応答もＣＥＰ７０１の存在下で阻害された。
【０１２０】
Ｔ細胞刺激応答がＡＧ１２９６への暴露の結果として阻害されるかどうかを判定するため、２つの異なるＴ細胞増殖アッセイを実施した。図２ｃは、阻害剤の存在下（１０μｍ）又は非存在下で、同種マウスの脾細胞を同時にインキュベートした結果を示す。この標準混合リンパ球反応では、等しい数の刺激細胞及び応答細胞（各１０６）を９６ウェルプレート中で混合し、３Ｈ−チミジンを加えて４日間インキュベートし、トリチウムの取り込みを分析することにより増殖を判定した。ＢＭ由来ＤＣを、ＡＧ１２９６の存在下（１０μｍ）又は非存在下で、同種の反応脾細胞と１：１０の割合でインキュベートすることによって（８日、上記のように）ＤＣに刺激された増殖もまた判定した。図７に示すように、ＡＧ１２９６の存在下でＤＣによりＴ細胞増殖の抑制が誘導された。
【実施例３】
【０１２１】
Ｔ細胞の処理は、その増殖を直接阻害しない。
図２ａ及びｂで見出された阻害が、阻害剤のＤＣへの効果に起因するものであり、Ｔ細胞そのものによるものでないことを示すため、１×１０６Ｔ細胞を抗ＣＤ３被覆プレートに蒔いた。次いでＴ細胞を抗ＣＤ２８抗体で刺激した。２日後、３Ｈを添加し、増殖を判定した。図で示されるように、Ｔ細胞の直接刺激の効果は観察されなかった。
【実施例４】
【０１２２】
ＦＬＴ３阻害剤でのマウスの処置は、ＣＤ１１ｃ細胞群を減少させるが、ＣＤ３又はＢ２２０を減少させない。
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２０ｍｇ／ｋｇのＣＥＰ７０１又は媒体で、１日に２回、５日間処理した後、その免疫細胞群を分析した。脾臓及びリンパ節を収集し、コラゲナーゼで消化させて間質からＤＣを放出させた。次いで、細胞を洗浄し、Ｔ（ＣＤ３＋／ＤＸ５−）、ＮＫ（ＣＤ３−、ＤＸ５＋）、Ｂ（Ｂ２２０＋、ＣＤ１１ｃ−）又はＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）の存在をＦＡＣＳで解析した。図４ａ及びｂで示すように、この処理がＮＫ及びＤＣ細胞群の減少を導くのに対し、Ｂ細胞又はＴ細胞群には有意な変化が認められなかった。
【実施例５】
【０１２３】
ＦＬＴ３阻害剤でのマウスの処置は、インビボで免疫応答を低下させ、そしてＤＣの阻害は免疫応答を下方制御するのに十分な効果を示した。
ＦＬＴ３阻害が、インビボで免疫応答の下方制御を導くかどうかを判定するため、インフルエンザ血球凝集素抗原（ＨＡ）のトランスジェニックであるマウス（このマウスは「１３７」と名付けられている）に、ＨＡに特異的なトランスジェニックＴ細胞（これらのＣＤ４＋Ｔ細胞は、「６．５」と名付けられ、類似遺伝子型Ｔ細胞マーカーｔｈｙ１．１を発現する）を注射した。このモデル系において、移植されたトランスジェニックＴ細胞は増殖し、自己免疫プロセスを誘導する（Huang CT JI 2003）。これらの実験のため、１３７匹のマウスを、移植前の３日間及び移植後の５日間、ＣＥＰ７０１で上記のように処置した。５日後、Ｔ細胞の増殖についてマウスを分析した。図５に示すように、ＣＥＰ７０１処置は、ｔｈｙ１．１の測定で示されるように、自己反応性Ｔ細胞の増殖の抑制を導いた。
【実施例６】
【０１２４】
ＦＬＴ３に対するモノクローナル抗体
本実施例は、ＦＬＴ３に対するモノクローナル抗体を調製する方法を説明する。ＦＬＴ３は、ＣＯＳ−７又はＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞のような哺乳動物の宿主細胞で発現し、それをＦＬＴ３：Ｆｃ親和性クロマトグラフィーを用いて精製した。精製されたＦＬＴ３、又は細胞外ドメイン、合成ペプチド若しくはＦＬＴ３を発現する細胞のようなその断片は、従来の技術、例えば米国特許第４，４１１，９９３号に記載の技術を用いて、ＦＬＴ３に対するモノクローナル抗体を産生するのに使用することができる。簡潔に言えば、マウスを免疫原としてＦＬＴ３で免疫化するが、その場合、ＦＬＴ３をアジュバント、例えば完全フロイントアジュバント中で乳化し、１０〜１００μｇの量でマウスの皮下又は腹膜内に注射する。１０〜１２日後、免疫化した動物をアジュバント中で乳化した更なるＦＬＴ３で追加免疫する。その後、毎週又は隔週の免疫化スケジュールで、マウスを定期的に追加免疫する。眼窩採血又は尾の先端切除により血清サンプルを定期的に採取してドットブロット法又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）によりＦＬＴ３抗体をテストする。
【０１２５】
適切な抗体力価を検出した後、陽性動物にＦＬＴ３の生理食塩水を最後の静脈注射として施す。３〜４日後、動物を犠牲にし、脾細胞を収集し、脾細胞をネズミ骨髄腫細胞系統、例えばＮＳ１又は好ましくはＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）と融合する。融合によりハイブリドーマ細胞が産生され、これらの細胞は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択培地の、複数のマイクロタイタープレートに蒔かれて、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド及び脾細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
【０１２６】
ハイブリドーマ細胞を、「Engvall et al., Immunochem. 8:871, 1971」及び米国特許第４，７０３，００４号に開示される技法を適用して、精製ＦＬＴ３に対する反応についてＥＬＩＳＡ法でスクリーニングする。好ましいスクリーニング法は、「Beckmann et al.,(J. Immunol. 144:4212, 1990)」に記載される抗体捕捉法である。陽性ハイブリドーマ細胞は、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹膜内に注射して、高濃度の抗ＦＬＴ３モノクローナル抗体を含有する腹水を生成することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、インビトロでフラスコ又はローラーボトル中で種々の技術によって増殖させることができる。マウス腹水中に産生されたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿の後、ゲル排除クロマトグラフィーにより精製することができる。あるいは、抗体とＡタンパク質又はＧタンパク質との結合に基づく親和性クロマトグラフィー、またＦＬＴ３との結合に基づく親和性クロマトグラフィーを用いることもできる。
【実施例７】
【０１２７】
ＦＬＴ３阻害剤を用いる処置は、確立された実験的自己免疫性脳脊髄炎を回復する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＦＡ中の１００マイクログラムの確立された実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）誘導のペプチドＭＯＧ３５−５５を、４００マイクログラムのヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）と一緒に注射した。免疫化当日及び４８時間後に、標準プロトコールに従って、マウスに百日咳毒素を追加注入した。初期症状の１日以内に、マウスに媒体対照又はＣＥＰ−７０１（２０ｍｇ／ｋｇ）の何れかを注射し、処置の区別を知らされていない観察者が、毎日スコアをつけた。スコアは次の通りである。０（症状無し）、０．５（尾の緊張の一部喪失）、１（尾の緊張の完全喪失）、２（歩行に影響あり）、２．５（後肢の一部麻痺）、３（後肢の完全麻痺）、４（前後肢麻痺）、５（瀕死状態）。本研究では、各群毎に１０匹のマウスが処置された。図８は、ＣＥＰ−７０１（ＦＬＴ３阻害剤）で処置されたマウスのスコアが低いことを示すグラフであり、ＦＬＴ３阻害剤が、ＥＡＥを回復させたことを示している。
【実施例８】
【０１２８】
図１０に関して、ＭＯＧペプチドで免疫化され、そして症状が出た後に媒体対照又はＣＥＰ−７０１の何れかで処置されたマウスから、損傷していない脳及び脊髄を取り出した。処置及びスコア開始の後、マウスを更に２ヶ月保持した後、犠牲にして、そのＣＮＳを評価のためにホルマリン保存による処理を行った。第５頚椎から薄い柔軟な切片（１ｍｍ）を作製した後、トルイジンブルーで染色し、軸索を可視化した。脊柱内側の予め定義された領域における軸索数及び活発に変性した線維の合計を熟練した試験者が盲検法により数え挙げた。プロットは、疾病誘導後２１０日目に媒体対照マウスと比較したＣＥＰ−７０１処理マウスの切片の定義された領域における変性した軸索線維の数を示す。これらの結果は、ＦＬＴ３を阻害することが神経変性の低下を導くことを示す。
【０１２９】
本発明を、特にその態様に関して詳細に説明した。しかしながら、当業者であれば本開示を考慮して、本発明の精神及び教示を逸脱することなく修正及び改良を行うことができるのは、当然のことである。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１−１】図１ａは、ＤＣのＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ−７０１での処置を示すグラフである。濃度０、５又は５０ｎＭのＣＥＰ７０１に対する用量反応分析においてインキュベートされたＤＣの結果を示す。上の３つのグラフはＧＭ−ＣＳＦで活性化された細胞を示し、下の３つのグラフはＧＭ−ＣＳＦ及びＦＬＴ３リガンド（ＦＬ）で活性化された細胞を示す。ＦＬＴ３阻害の結果、ＤＣのアポトーシスの誘導がかなりの割合で発生した。
【図１−２】図１ｂは、０、１及び１０μＭのＦＬＴ３阻害剤ＡＧ１２９６でＤＣを処理し、アポトーシスについて分析した結果を示す。ＦＬＴ３阻害の結果、ＤＣのアポトーシスの誘導がかなりの割合で発生した。
【図１−３】図１ｃは、ＦＬ及びＩＬ−４又はＧＭ−ＣＳＦで処理したヒト骨髄細胞のノーザンブロット解析を示す。ノーザンブロッティングは、ｈＢ７−ＤＣ及びβアクチンについて実施した。これにより、ＦＬの添加がＢ７−ＤＣ発現を大きく上方制御することが実証された（ＧＭ−ＣＳＦ単独では発現しなかった；データは示さず）。
【図２】図２ａ及び２ｂは、Ｔ細胞の増殖に基づくＤＣ及びＢＡＬＢ／ｃ脾細胞でのＦＬＴ３阻害の結果を示す。ＤＣをＣＥＰ７０１で処理し（又は対照として処理せずに）、その後示した割合のＣ５７ＢＬ／６脾細胞と共に培養皿に蒔いた。３日後、３Ｈを添加し、増殖を測定した。ＣＥＰ７０１は、Ｔ細胞の増殖を抑えることに大きな効果を示す。図２ｂでは、ＤＣの代わりにＢＡＬＢ／ｃ脾細胞を用いて、標準の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）でＣＥＰ７０１の阻害をテストした。この図から、この反応もまたＣＥＰ７０１の存在下で阻害されることが実証された。図２ｃは、ＦＬＴ３阻害剤ＡＧ１２９６によるＢＡＬＢ／ｃ脾細胞の阻害の結果を示す。
【図３】図３は、Ｔ細胞を、抗ＣＤ２８抗体で刺激した後に、ＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ−７０１で直接処理した結果を示すグラフである。図に示されるように、この処理はＴ細胞の増殖を阻害しない。
【図４】図４ａ及び４ｂは、マウスをＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ７０１で処理した免疫細胞群の結果を示すグラフである。ＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ７０１は、ＣＤ１１ｃ及びＮＫ細胞群を減少させるが、ＣＤ３又はＢ２２０細胞群を減少させない。
【図５】図５は、ＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ７０１でのマウスの処置を示すグラフである。ＦＬＴ３阻害剤ＣＥＰ７０１は、インビボでの自己反応性免疫応答を低下させ、ＤＣの阻害が免疫応答を下方制御するのに十分であることを実証する。
【図６】図６は、０、１、及び１０μＭの何れかのＡＧ１２９６でＤＣを処理した後、共刺激分子Ｂ７．２（ＣＤ８６）及びＢ７−ＤＣの発現について分析した結果を示す。図に示されるように、両方の共刺激分子がＡＧ１２９６の存在下で下方制御された。
【図７】図７は、Ｔ細胞のＤＣ刺激がＡＧ１２９６により阻害されることを示すグラフである。
【図８】図８は、ＦＬＴ３阻害剤での処理が、確立された実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を回復させることを示すグラフである。
【図９】図９は、ＳＴＫ−１ ｃＤＮＡの予測完全アミノ酸配列である。アミノ酸は、各列の左側に番号が付けられ、ヌクレオチドは右側に番号が付けられている。下線は予測シグナルペプチド（ａａ １〜２３）を示し、それに続いて推定切断部位が矢印で示される。
【図１０】図１０は、疾病誘導後２１０日目に媒体対照マウスと比較した、ＣＥＰ−７０１処理マウスの切片の定義された領域における変性した軸索線維の数を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＬＴ３の活性を低下させる少なくとも１つのＦＬＴ３阻害剤を細胞に接触させることを含んでなる、細胞の免疫応答を抑制する方法。
【請求項２】
前記細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が神経系の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記神経系の細胞が、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、星状細胞、ミクログリアである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ニューロンが、求心性ニューロン、遠心性ニューロン、介在ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、神経内分泌細胞、分裂終了ニューロン、胚性ニューロン、又は網膜の神経節細胞の１つ又はそれ以上である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＦＬＴ３のキナーゼ活性が低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＦＬＴ３の自己リン酸化活性が低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗ＦＬＴ３抗体、抗ＦＬＴ３抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプチドをコードする核酸、有機分子及びそれらの何れかの組合せの１つ又はそれ以上から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記小分子が、ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５、ＣＥＰ−５２１４、ＣＥＰ−７０５５、ＰＫＣ４１２、ＳＵ１１２４８、ＳＵ５４１６、ＳＵ５６１４、ＭＬＮ５１８、ＢＡＹ４３−９００６、ＣＨＩＲ−２５８、アミノ−ベンゾイミダゾール−キノロン類、Ｋｉ２３８１９、スタウロスポリン誘導体の１つ又はそれ以上から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記小分子が、式１：
【化００１】
（式中、
Ｗは、Ｃ、Ｎ又はＯであってもよく；
Ｘは、Ｃ若しくはＮ、又は存在していなくてもよく；
Ｙは、Ｃであってもよく；
Ｚは、Ｃ又はＮであってもよく；そして
Ｒ基は、以下のＲ１〜Ｒ５の置換されている可変基であってもよく：
Ｒ１は、Ｈ、アルコキシ、ヒドロキシル又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、アルコキシ又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ３は、Ｈ、Ｏ、アリール、ヘテロアリール又はＣ（Ｏ）ヘテロアリールであってもよく；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＨ−ヘテロアリール又は存在していなくてもよく；
Ｒ５は、Ｈ、アリール、ヘテロアルキル／アリール又は存在していなくてもよく；そして、
ＷＸ、ＷＹ、ＹＺ、ＹＲ３及びＺＲ４に於ける破線は、二重結合であってもよいことを示し、ここに於けるアリール、ヘテロアリール及び複素環アルキル／アリールは、置換されていてもよい）
で表される化合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記小分子が、
【化００２】
で表される化合物から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、ＩＭＣ−ＥＢ１０及びＩＭＣ−ＮＣ７の１つ又はそれ以上から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、霊長類化抗体及びそれらの何れかの組合せを包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、ＦＬＴ３のリン酸化型を特異的に認識する、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、ＦＬＴ３の非リン酸化型を特異的に認識する、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、図９のヌクレオチド配列又はそれらの生物活性を有する断片の１つ又はそれ以上から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、ＦＬＴ３依存性のシグナル伝達を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、細胞の免疫賦活能を下方制御する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＦＬＴ３阻害剤と共にＴ細胞阻害剤を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＦＬＴ３活性を低下させるＦＬＴ３阻害剤の治療有効量を、対象に投与することを含んでなる、対象のＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療する方法。
【請求項２２】
前記対象が、それによりＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が、ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患の治療を要すると同定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患が、免疫関連の疾患である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫関連の疾患が、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡並びにその他の自己免疫疾患のうちの１つ又はそれ以上のものであり、
当該方法はまた、骨髄非破壊的な処置療法及びそれらを組み合わせて施術した後に骨髄生着を促進させるためにも用いられてもよいものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患が、神経系の疾患である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記神経系の疾患が、神経変性疾患又は軸索変性疾患のうちの１つ又はそれ以上のものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が哺乳動物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物が、ヒト、霊長類、ネズミ、イヌ、ネコ又はマウスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗ＦＬＴ３抗体、抗ＦＬＴ３抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプチドをコードする核酸、有機分子及びそれらの何れかの組合せの１つ又はそれ以上から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記小分子が、ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５、ＣＥＰ−５２１４、ＣＥＰ−７０５５、ＰＫＣ４１２、ＳＵ１１２４８、ＳＵ５４１６、ＳＵ５６１４、ＭＬＮ５１８、ＢＡＹ４３−９００６、ＣＨＩＲ−２５８、アミノ−ベンゾイミダゾール−キノロン類、Ｋｉ２３８１９、スタウロスポリン誘導体の１つ又はそれ以上から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が、ＩＭＣ−ＥＢ１０及びＩＭＣ−ＮＣ７の１つ又はそれ以上から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、霊長類化抗体及びそれらの何れかの組合せを包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、ＦＬＴ３のリン酸化型を特異的に認識する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が、ＦＬＴ３の非リン酸化型を特異的に認識する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、図９のヌクレオチド配列又はそれらの生物活性を有する断片のうち１つ又はそれ以上のものから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、対象におけるＦＬＴ３のキナーゼ活性を低下させるものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、対象におけるＦＬＴ３の自己リン酸化活性を低下させるものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、対象におけるＦＬＴ３依存性のシグナル伝達を低下させるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、対象の免疫賦活能を下方制御するものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＦＬＴ３阻害剤と共にＴ細胞阻害剤を投与することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項４２】
ＦＬＴ３依存性のシグナル伝達を低下させるために、ＦＬＴ３阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含んでなる、対象のＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療する方法。
【請求項４３】
恒常的に活性化されたＦＬＴ３受容体を有するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４４】
前記動物がマウスである、請求項４３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４５】
治療剤をテストするための、請求項４３又は４４に記載のトランスジェニック動物の使用。
【請求項４６】
免疫関連の疾患のモデルとしての、請求項４３又は４４に記載のトランスジェニック動物の使用。
【請求項４７】
前記免疫関連の疾患が、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、狼瘡、及びそれらの組合せの１つ又はそれ以上から選択される、請求項４６に記載のトランスジェニック動物の使用。
【請求項４８】
ＦＬＴ３受容体の活性レベルが高いマウスに薬剤を投与する、そして
免疫応答の変化を測定して、免疫応答の低下が免疫関連疾患の治療に前記薬剤が有用でありうることを示す、ことを含んでなる免疫関連の疾患を治療するための、治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項４９】
前記免疫応答の変化が、ＤＣ細胞の数の減少で示される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫応答の変化が、ＮＫ細胞の数の減少で示される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記免疫応答の変化を、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルを判定することにより測定し、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルの増加が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用でありうることを示す、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＤＣ共刺激タンパク質がＢ７−ＤＣである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記免疫応答の変化をＴ細胞の増殖アッセイにより測定し、Ｔ細胞増殖の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用でありうることを示す、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫関連の疾患が、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡のうち一つ又はそれ以上から選択され、骨髄非破壊的な処置療法及びそれらを組み合わせて施術した後に骨髄生着を促進させるものである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
治療剤を真核細胞に投与する、そして
前記細胞の免疫応答の変化を測定して、細胞の免疫応答の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる免疫関連の疾患を治療するための、治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項５６】
前記細胞が、樹状細胞、ＮＫ細胞、脾細胞、Ｔ細胞及びそれらの混合物の１つ又はそれ以上から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞の免疫応答の低下を、ＤＣ共刺激タンパク質のレベル判定により測定して、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルの増加が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用でありうることを示す、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＤＣ共刺激タンパク質がＢ７−ＤＣである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
免疫応答の変化をＴ細胞増殖の判定により測定して、Ｔ細胞増殖の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用でありうることを示す、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫関連の疾患が、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡のうち一つ又はそれ以上から選択され、骨髄非破壊的な処置療法及びそれらを組み合わせて施術した後に骨髄生着を促進させるものである、、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
ＭＯＧペプチドで免疫化したマウスに薬剤を投与する、そして
ニューロンを可視化して、軸索の調節が、神経系の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる神経系の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項６２】
軸索の変化が、変性した軸索の数の減少で示される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記可視化が顕微鏡検査による、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記神経系の疾患が、多発性硬化症、脱髄性疾患、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎、運動単位の障害、筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症、若年性脊髄性筋萎縮症；クロイツフェルト・ヤコブ病、又は亜急性硬化性全脳炎の１つ又はそれ以上から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
治療剤をニューロン細胞に投与する、そして
細胞における変化を測定して、変性したニューロンの数の減少が、神経系の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる神経系の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項６６】
前記神経系の疾患が、神経変性疾患、軸索変性症、多発性硬化症、脱髄性疾患、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎、運動単位の障害、筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症、若年性脊髄性筋萎縮症；クロイツフェルト・ヤコブ病、又は亜急性硬化性全脳炎の１つ又はそれ以上から選択されるものである、請求項６５に記載の方法。
【請求項１】
ＦＬＴ３の活性を低下させる少なくとも１つのＦＬＴ３阻害剤を細胞に接触させることを含んでなる、細胞の免疫応答を抑制する方法。
【請求項２】
前記細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が神経系の細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記神経系の細胞が、ニューロン、グリア細胞、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞、星状細胞、ミクログリアである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ニューロンが、求心性ニューロン、遠心性ニューロン、介在ニューロン、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、神経内分泌細胞、分裂終了ニューロン、胚性ニューロン、又は網膜の神経節細胞の１つ又はそれ以上である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＦＬＴ３のキナーゼ活性が低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＦＬＴ３の自己リン酸化活性が低下している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗ＦＬＴ３抗体、抗ＦＬＴ３抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプチドをコードする核酸、有機分子及びそれらの何れかの組合せの１つ又はそれ以上から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記小分子が、ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５、ＣＥＰ−５２１４、ＣＥＰ−７０５５、ＰＫＣ４１２、ＳＵ１１２４８、ＳＵ５４１６、ＳＵ５６１４、ＭＬＮ５１８、ＢＡＹ４３−９００６、ＣＨＩＲ−２５８、アミノ−ベンゾイミダゾール−キノロン類、Ｋｉ２３８１９、スタウロスポリン誘導体の１つ又はそれ以上から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記小分子が、式１：
【化００１】
（式中、
Ｗは、Ｃ、Ｎ又はＯであってもよく；
Ｘは、Ｃ若しくはＮ、又は存在していなくてもよく；
Ｙは、Ｃであってもよく；
Ｚは、Ｃ又はＮであってもよく；そして
Ｒ基は、以下のＲ１〜Ｒ５の置換されている可変基であってもよく：
Ｒ１は、Ｈ、アルコキシ、ヒドロキシル又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ２は、Ｈ、Ｆ、アルコキシ又は複素環アルキル／アリールであってもよく；
Ｒ３は、Ｈ、Ｏ、アリール、ヘテロアリール又はＣ（Ｏ）ヘテロアリールであってもよく；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ＣＨ−ヘテロアリール又は存在していなくてもよく；
Ｒ５は、Ｈ、アリール、ヘテロアルキル／アリール又は存在していなくてもよく；そして、
ＷＸ、ＷＹ、ＹＺ、ＹＲ３及びＺＲ４に於ける破線は、二重結合であってもよいことを示し、ここに於けるアリール、ヘテロアリール及び複素環アルキル／アリールは、置換されていてもよい）
で表される化合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記小分子が、
【化００２】
で表される化合物から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が、ＩＭＣ−ＥＢ１０及びＩＭＣ−ＮＣ７の１つ又はそれ以上から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、霊長類化抗体及びそれらの何れかの組合せを包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が、ＦＬＴ３のリン酸化型を特異的に認識する、請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体が、ＦＬＴ３の非リン酸化型を特異的に認識する、請求項６に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、図９のヌクレオチド配列又はそれらの生物活性を有する断片の１つ又はそれ以上から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、ＦＬＴ３依存性のシグナル伝達を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、細胞の免疫賦活能を下方制御する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＦＬＴ３阻害剤と共にＴ細胞阻害剤を投与することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＦＬＴ３活性を低下させるＦＬＴ３阻害剤の治療有効量を、対象に投与することを含んでなる、対象のＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療する方法。
【請求項２２】
前記対象が、それによりＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記対象が、ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患の治療を要すると同定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患が、免疫関連の疾患である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫関連の疾患が、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡並びにその他の自己免疫疾患のうちの１つ又はそれ以上のものであり、
当該方法はまた、骨髄非破壊的な処置療法及びそれらを組み合わせて施術した後に骨髄生着を促進させるためにも用いられてもよいものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患が、神経系の疾患である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記神経系の疾患が、神経変性疾患又は軸索変性疾患のうちの１つ又はそれ以上のものである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が哺乳動物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳動物が、ヒト、霊長類、ネズミ、イヌ、ネコ又はマウスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、小分子、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、抗ＦＬＴ３抗体、抗ＦＬＴ３抗体の抗原結合断片、ポリペプチド、ペプチド模倣物、ペプチドをコードする核酸、有機分子及びそれらの何れかの組合せの１つ又はそれ以上から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記小分子が、ＣＥＰ７０１、ＡＧ１２９６、ＡＧ１２９５、ＣＥＰ−５２１４、ＣＥＰ−７０５５、ＰＫＣ４１２、ＳＵ１１２４８、ＳＵ５４１６、ＳＵ５６１４、ＭＬＮ５１８、ＢＡＹ４３−９００６、ＣＨＩＲ−２５８、アミノ−ベンゾイミダゾール−キノロン類、Ｋｉ２３８１９、スタウロスポリン誘導体の１つ又はそれ以上から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体が、ＩＭＣ−ＥＢ１０及びＩＭＣ−ＮＣ７の１つ又はそれ以上から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、霊長類化抗体及びそれらの何れかの組合せを包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体が、ＦＬＴ３のリン酸化型を特異的に認識する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体が、ＦＬＴ３の非リン酸化型を特異的に認識する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記アンチセンス・オリゴヌクレオチドが、図９のヌクレオチド配列又はそれらの生物活性を有する断片のうち１つ又はそれ以上のものから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、対象におけるＦＬＴ３のキナーゼ活性を低下させるものである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、対象におけるＦＬＴ３の自己リン酸化活性を低下させるものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、対象におけるＦＬＴ３依存性のシグナル伝達を低下させるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＦＬＴ３阻害剤が、対象の免疫賦活能を下方制御するものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＦＬＴ３阻害剤と共にＴ細胞阻害剤を投与することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項４２】
ＦＬＴ３依存性のシグナル伝達を低下させるために、ＦＬＴ３阻害剤の治療有効量を対象に投与することを含んでなる、対象のＦＬＴ３疾患又はＦＬＴ３関連の疾患を治療する方法。
【請求項４３】
恒常的に活性化されたＦＬＴ３受容体を有するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４４】
前記動物がマウスである、請求項４３に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４５】
治療剤をテストするための、請求項４３又は４４に記載のトランスジェニック動物の使用。
【請求項４６】
免疫関連の疾患のモデルとしての、請求項４３又は４４に記載のトランスジェニック動物の使用。
【請求項４７】
前記免疫関連の疾患が、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、狼瘡、及びそれらの組合せの１つ又はそれ以上から選択される、請求項４６に記載のトランスジェニック動物の使用。
【請求項４８】
ＦＬＴ３受容体の活性レベルが高いマウスに薬剤を投与する、そして
免疫応答の変化を測定して、免疫応答の低下が免疫関連疾患の治療に前記薬剤が有用でありうることを示す、ことを含んでなる免疫関連の疾患を治療するための、治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項４９】
前記免疫応答の変化が、ＤＣ細胞の数の減少で示される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫応答の変化が、ＮＫ細胞の数の減少で示される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記免疫応答の変化を、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルを判定することにより測定し、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルの増加が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用でありうることを示す、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＤＣ共刺激タンパク質がＢ７−ＤＣである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記免疫応答の変化をＴ細胞の増殖アッセイにより測定し、Ｔ細胞増殖の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用でありうることを示す、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫関連の疾患が、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡のうち一つ又はそれ以上から選択され、骨髄非破壊的な処置療法及びそれらを組み合わせて施術した後に骨髄生着を促進させるものである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
治療剤を真核細胞に投与する、そして
前記細胞の免疫応答の変化を測定して、細胞の免疫応答の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる免疫関連の疾患を治療するための、治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項５６】
前記細胞が、樹状細胞、ＮＫ細胞、脾細胞、Ｔ細胞及びそれらの混合物の１つ又はそれ以上から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞の免疫応答の低下を、ＤＣ共刺激タンパク質のレベル判定により測定して、ＤＣ共刺激タンパク質のレベルの増加が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用でありうることを示す、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＤＣ共刺激タンパク質がＢ７−ＤＣである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
免疫応答の変化をＴ細胞増殖の判定により測定して、Ｔ細胞増殖の低下が、免疫関連の疾患の治療に前記薬剤が有用でありうることを示す、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫関連の疾患が、臓器拒絶反応、骨髄移植拒絶反応、骨髄非破壊的な骨髄移植拒絶反応、強直性脊椎炎、関節炎、再生不良性貧血、ベーチェット病、糖尿病１型、移植片対宿主病、グレーブス病、溶血性貧血、ウェグナー肉芽腫症、高ＩｇＥ症候群、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬及び狼瘡のうち一つ又はそれ以上から選択され、骨髄非破壊的な処置療法及びそれらを組み合わせて施術した後に骨髄生着を促進させるものである、、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
ＭＯＧペプチドで免疫化したマウスに薬剤を投与する、そして
ニューロンを可視化して、軸索の調節が、神経系の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる神経系の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項６２】
軸索の変化が、変性した軸索の数の減少で示される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記可視化が顕微鏡検査による、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記神経系の疾患が、多発性硬化症、脱髄性疾患、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎、運動単位の障害、筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症、若年性脊髄性筋萎縮症；クロイツフェルト・ヤコブ病、又は亜急性硬化性全脳炎の１つ又はそれ以上から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
治療剤をニューロン細胞に投与する、そして
細胞における変化を測定して、変性したニューロンの数の減少が、神経系の疾患の治療に前記薬剤が有用であることを示す、ことを含んでなる神経系の疾患を治療するための治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項６６】
前記神経系の疾患が、神経変性疾患、軸索変性症、多発性硬化症、脱髄性疾患、多発性硬化症、急性横断性脊髄炎、運動単位の障害、筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症、若年性脊髄性筋萎縮症；クロイツフェルト・ヤコブ病、又は亜急性硬化性全脳炎の１つ又はそれ以上から選択されるものである、請求項６５に記載の方法。
【図１−１】
【図１−２】
【図１−３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１−２】
【図１−３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５０６７７８（Ｐ２００８−５０６７７８Ａ）
【公表日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２２６０５（Ｐ２００７−５２２６０５）
【出願日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５３１８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２０１４５
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０５０４５９０８）ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ (21)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月６日（２００８．３．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５３１８
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０２０１４５
【国際公開日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【出願人】（５０５０４５９０８）ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ (21)
【Ｆターム（参考）】
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