分岐ヒアルロン酸及びその製造方法
分岐ヒアルロン酸であって、その直鎖骨格が、１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化されたヒアルロン酸を含んでなり、前記脱アセチル化グルコサミンの第１級アミンに分岐側鎖が共有結合して第２級アミンを形成する、分岐ヒアルロン酸、前記分岐ヒアルロン酸を作製するための前駆体、並びに、前記分岐ヒアルロン酸を作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元的アルキル化による脱アセチル化ヒアルロン酸（ｄｅＨＡ）の分岐化、かかる分岐ヒアルロン酸自体、並びに、特に化粧品業界及び生物医学産業における、それらの応用及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
身体に最も豊富に存在するヘテロ多糖はグリコサミノグリカンである。グリコサミノグリカンは、二糖単位の繰り返しからなる非分岐炭水化物ポリマーである（ケラタン硫酸のみ炭水化物のコア領域で分岐している）。二糖単位は通常、第一のサッカライド単位として、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）又はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）という、２種の変性糖の一方を含んでなる。第二の単位は通常、ウロン酸、例えばグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）又はイズロネートである。
【０００３】
グリコサミノグリカンは負荷電分子であって、拡張した立体構造を有し、溶液に高い粘度を付与する。グリコサミノグリカンは主に細胞表面又は細胞外マトリクスに存在する。また、グリコサミノグリカンは溶液中で低圧縮性を示すことから、理想的な生理学的潤滑液（例えば関節等）となる。グリコサミノグリカンの剛性は、細胞に構造的一体性を与え、また細胞間に通路を提供し、細胞遊動を可能にしている。生理学的に最も重要なグリコサミノグリカンは、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸及びケラタン硫酸である。多くのグリコサミノグリカンは、特定のオリゴ糖構造を介してプロテオグリカンコアタンパク質に共有結合する。例外的にヒアルロナンは、特定のプロテオグリカンと大きな凝集体を形成するが、これは遊離炭水化物鎖がプロテオグリカンと非共有結合複合体を形成するためである。
【０００４】
ヒアルロナンの体内での役割は多数同定されている（Laurent T. C. and Fraser J. R. E., 1992, FASEB J. 6: 2397-2404; 及び Toole B.P., 1991, "Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation." In: Cell Biology of the Extracellular Matrix, pp. 305-341, Hay E. D., ed., Plenum, New Yorkを参照）。ヒアルロナンは、硝子軟骨、滑膜関節液及び皮膚組織（真皮及び表皮の両方）に存在する。また、ヒアルロナンは多くの生理学的機能、例えば付着、成長、細胞運動性、癌、血管形成及び創傷治癒に関与していると推測される。ヒアルロナンは、その独自の物理学的及び生物学的特性から、眼及び関節の手術で利用されるほか、その他の医療方法でも評価されている。
【０００５】
「ヒアルロナン（hyaluronan）」又は「ヒアルロン酸（hyaluronic acid）」という語は、文献では、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸の残基により構成される、種々の分子量を有する酸性多糖類であって、天然には細胞表面、脊椎動物の結合組織の塩基性細胞外基質、関節の滑液、眼の眼内流体、ヒト臍帯組織、及び鶏冠に存在するものを指す言葉として用いられる。
【０００６】
実際には「ヒアルロン酸（hyaluronic acid）」という語は、通常は種々の分子量を有するＤ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ-グルコサミン酸の残基が交互する鎖状多糖類全体、又はその分解された分画を意味するものとして使用されるため、複数形（hyaluronic acids）を用いるのがより正確であろう。但し、本明細書ではやはり単数形を用いる。加えて、かかる総称に代えてしばしば、略語である「ＨＡ」を用いる。
【０００７】
ＨＡは生物において重要な役割を果たす。皮膚、腱、筋肉及び軟骨等、多くの組織の細胞を機械的に支持し、細胞内マトリクスの主成分である。また、組織の保湿や潤滑等の生物学的過程で、ＨＡは別の重要な役割を演じる。
【０００８】
ＨＡは上述の天然組織から抽出され得るが、今日では、病原体による感染の潜在的リスクを最小限に抑え、かつ製品の均一性・品質・可用性を高めるために、微生物学的方法による調製が好適である。
【０００９】
ＨＡ及びその種々の分子サイズ分画、並びにこれらの塩は、（特に関節症治療用の）薬剤として、（特に眼科及び美容外科における）天然器官及び組織用の助剤及び／又は置換剤として、また、化粧品の材料として用いられてきた。また、整形外科、リュウマチ、及び皮膚科用にも、ヒアルロナン製品が開発されてきた。
【００１０】
さらに、ＨＡは衛生及び手術用品に用いられるポリウレタンやポリエステル等の種々のポリマー材料の生体適合性を高める添加剤としても使用され得る。
【００１１】
ヒドラジンを用いたＨＡの脱Ｎ−アセチル化が文献に記載されている（Crescenzi et al. (2002) New cross-linked and sulfated derivatives of partially deacetylated hyaluronan: Synthesis and preliminary characterization, Biopolymers 64, 86-94）。
【００１２】
亜硝酸（ＨＯＮＯ）を用いた還元的分解によるキトサンの分岐化及び還元的Ｎ−アルキル化が報告されている（Tommeraas et al. (2002) Carbohydrate Research 337, 2455-2462）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
例えば、直鎖ＨＡとの比較における粘弾性の向上、例えば、剪断菲薄化（shear thinning）やイオン強度変化に対する感受性の低減、同分子量の直鎖ＨＡからの粘度低減等の性質等、所望の特性を有する生物適合性ポリマーの新規の誘導体の開発が求められている。これらの特性は、生物医学用インプラントや、化粧品、生物医学及び医薬製剤の応用分野で有用であると考えられる。その他の興味ある特性としては、泡を安定化させる性質の向上や、化粧品で通常用いられるような非親水性物質との混合容易性等が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の態様によれば、本発明は、分岐ヒアルロン酸であって、その直鎖骨格が、１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化されたヒアルロン酸を含んでなり、前記脱アセチル化グルコサミンの第１級アミンに分岐側鎖が共有結合して第２級アミンを形成する、分岐ヒアルロン酸を提供する。
【００１５】
本発明の第２の態様は、前駆体又は中間体分子に関し、これは第３の態様の方法の一部を構成する。即ち、１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された、部分又は完全脱アセチル化ヒアルロン酸（ｄＨＡ）に関する。
【００１６】
第３の態様によれば、本発明は、分岐ヒアルロン酸を製造する方法であって、（ａ）１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された直鎖ヒアルロン酸骨格を供給する工程；及び（ｂ）少なくとも１の遊離還元性アルデヒド基を含んでなる生物適合性ポリマーを、（ａ）の１又は２以上のグルコサミンの第１級アミンと、還元的Ｎ−アルキル化により反応させ、分岐ヒアルロン酸を形成する工程を含んでなる方法を提供する。
【００１７】
第４の態様によれば、本発明は、第１の態様に係る分岐ヒアルロン酸と活性成分、好ましくは薬理学的活性剤とを含んでなる組成物に関する。
【００１８】
第５の態様によれば、本発明は、第１の態様に係る分岐ヒアルロン酸の有効量と、医薬的に許容し得る担体、賦形剤、又は希釈剤とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１９】
第６の態様は、第１の態様に係る分岐ヒアルロン酸の有効量をビヒクルとして含んでなると共に、薬理学的活性剤を含んでなる医薬組成物に関する。
【００２０】
第７の態様は、有効量の第１の態様に係る分岐ＨＡ、又は第２、第３、第４の態様のいずれかに係る組成物を活性成分として含んでなる化粧製品に関する。
【００２１】
第８の態様によれば、本発明は、第１の態様に係る分岐ＨＡ、又は第２、第３、第４の態様のいずれかに係る組成物を含んでなる、衛生製品、医療又は手術製品、好ましくはおむつ、生理用ナプキン、手術用スポンジ、創傷治癒スポンジ、又は絆創膏や他の創傷被覆材の部材に関する。
【００２２】
重要な一態様は、第１の態様に係る分岐ＨＡ、又は第４〜６の態様のいずれかに係る組成物を含んでなる、医薬カプセル又はマイクロカプセルに関する。
【００２３】
本発明の最後の態様は、眼科的治療、変形性関節炎又は癌の治療、創傷の治療、薬理学的活性剤の皮膚投与又は経皮投与、又は化粧品の皮膚投与における処置を実施する方法に関し、その改善は、第１の態様に係る分岐ＨＡ、又は第３〜６の態様のいずれかに係る組成物の使用を包含する。
【００２４】
数々の態様が、変形性関節炎又は癌治療に用いられる薬剤の製造、眼科的治療に用いられる薬剤の製造、創傷の治療に用いられる薬剤の製造、血管形成に用いられる薬剤の製造、又は保湿剤の製造における、第１の態様のいずれかに係る分岐ＨＡ、又は第４〜６の態様のいずれかに係る組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ヒアルロン酸の分子量の関数である縮約因子（contraction factor）「ｇ」のプロットを示す（ｇ＝（Ｒg,分岐）2／（Ｒg,直鎖）2）。ｇ値が１未満の場合、ポリマーが分岐していることを示す。図に示すように、分子量の増大に伴って縮約因子も増加することから、分岐ＨＡの調製が確認できる。試料２．ａ、２．ｂ、及び２．ｃは、分岐反応実施後の実施例２の試料Ａ、Ｂ及びＣに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ヒアルロン酸
本明細書において「ヒアルロン酸」は、交互に現れるβ−１，４及びα−１，３グリコシド結合によって連結される、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）及びグルクロン酸（GlcUA）の繰り返し二糖構造からなる、非硫酸化グルコサミノグリカンとして定義される。ヒアルロン酸はヒアルロナン、ヒアルロネート、又はＨＡとしても知られている。ヒアルロナン及びヒアルロン酸という用語は、本明細書では何れも、前述の分子自体、及びそのあらゆる種類の塩を表す言葉として、同義に用いられる。
【００２７】
ヒアルロナンの重要な商業供給源としては雄鶏の鶏冠がある。代替源としては微生物がある。米国特許第４，８０１，５３９号には、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）の或る株を用いた、ヒアルロン酸調製のための発酵方法が開示されており、そのヒアルロン酸収量は約３．６ｇ／Ｌであると報告されている。欧州特許第０６９４６１６号では、ストレプトコッカス・ズーエピデミカスの改良株を用いた発酵方法が開示されており、そのヒアルロン酸産生量は約３．５ｇ／Ｌであると報告されている。ＷＯ０３／０５４１６３（Novozymes）（本文献は本明細書に組み入れられる）に開示のように、ヒアルロン酸又はその塩は、例えばグラム陽性バチルス宿主を用い、組み換えによって生産することができる。
【００２８】
ヒアルロナンシンターゼとしては、脊椎動物、病原菌及び藻類ウイルス由来のものが報告されている（DeAngelis, P. L., 1999, Cell. Mol. Life Sci. 56: 670-682）。ＷＯ９９／２３２２７には、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）由来のグループＩヒアルロン酸シンターゼが開示され、ＷＯ９９／５１２６５及びＷＯ００／２７３４７にはパスチュレラ・ムルトシダ（Pasturella multocida）由来のグループIIヒアルロン酸シンターゼが記載されている。Ferrettiらは、ヒアルロン酸シンターゼ、ＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼ、及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼをそれぞれコードする３つの遺伝子ｈａｓＡ、ｈａｓＢ及びｈａｓＣから構成される、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のヒアルロナンシンターゼオペロンを開示している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 4658-4663, 2001）。ＷＯ９９／５１２６５では、ストレプトコッカス・エクイシミリス由来のヒアルロナンシンターゼのコード領域を有する核酸セグメントが記載されている。
【００２９】
組み換えバチルス細胞のヒアルロナンは培地に直接発現されるので、簡単な方法で培地からヒアルロナンを単離することができる。まず、バチルス細胞及び破砕細胞を培地から物理的に除去する。所望により、最初に培地を希釈して培地の粘度を低減してもよい。培地から細胞を除去する方法としては、遠心分離や精密濾過等、多数の方法が当業者に公知である。所望により、残存する上清を限外濾過等によって濾過することによって、ヒアルロナンを濃縮するとともに小分子汚染物質を除去してもよい。細胞及び破砕細胞の除去後、既知の機序によって培地からヒアルロナンの単純沈殿を行う。濾液からのヒアルロナンの沈殿には、塩、アルコール、又は塩とアルコールの組み合わせを用いることができる。沈殿となったヒアルロナンは、物理的手段で溶液から容易に単離することができる。ヒアルロナンは、当技術分野で公知の蒸発技術、例えば噴霧乾燥等を用いて、濾液から乾燥又は濃縮することができる。
【００３０】
本発明の第１の態様は、分岐ヒアルロン酸であって、その直鎖骨格が、１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化されたヒアルロン酸を含んでなり、前記脱アセチル化グルコサミンの第１級アミンに分岐側鎖が共有結合して第２級アミンを形成する、分岐ヒアルロン酸に関する。
【００３１】
好ましい実施形態によれば、分岐側鎖は生物適合性ポリマーを含んでなる。生物適合性ポリマーは、好ましくはヒアルロン酸を含んでなる。
【００３２】
本発明の第２の態様は、第３の態様の方法で第１の態様の分岐ＨＡを製造するために必要な中間体又は前駆体分子に関する。前記中間体又は前駆体分子は、１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された、部分又は完全脱アセチル化ヒアルロン酸（ｄＨＡ）である。
【００３３】
前記１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンの脱アセチル化は、化学処理又は酵素処理により、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムと硫酸ヒドラジンとの併用や、ＨＡデアセチラーゼ活性を有する酵素の使用等により行われる。
【００３４】
第２の態様のｄＨＡに関する好ましい実施形態によれば、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの５０％以下がグルコサミンに脱アセチル化され、好ましくは、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、１０％以下、最も好ましくは５％以下がグルコサミンに脱アセチル化される。
【００３５】
第２の態様のｄＨＡに関する別の好ましい実施形態によれば、前記ｄＨＡは１０〜３，０００ｋＤａ、好ましくは２０〜２，０００ｋＤａ、最も好ましくは２０〜１，０００ｋＤａ、又はさらに小さく、２０〜９００ｋＤａ、２０〜８００ｋＤａ、２０〜７００ｋＤａ、２０〜６００ｋＤａ、２０〜５００ｋＤａ、２０〜４００ｋＤａ、２０〜３００ｋＤａ、２０〜２００ｋＤａ、２０〜１００ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。
【００３６】
分子量
ヒアルロン酸のレベルは、改良カルバゾール法（Bitter and Muir, 1962, Anal Biochem. 4: 330-334）で決定することができる。さらに、ヒアルロン酸の平均分子量は、本技術分野の標準的な方法、例えば、Ueno at al., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272: 1-40; 及び Wyatt Technologies, 1999, "Light Scattering University DAWN Course Manual" and "DAWN EOS Manual" Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California. に記載の方法で決定することができる。
【００３７】
場合によっては、最初に直鎖ヒアルロン酸骨格又はその塩の平均分子量を小さくすることが有利である。例えば、ヒアルロン酸のいわゆる低分子量分画の製造業者の一部は、それが皮膚バリアを透過して皮膚中の本来のヒアルロン酸量を回復し得ることから、かかる分画は、抗肌加齢剤及び抗しわ剤として販売される化粧用組成物に特に適していると主張している。食品への利用については、低分子量のヒアルロン酸が胃腸隔壁を透過し、生体利用率が向上させることが示されている。最後に、低分子量のヒアルロン酸は抗炎症作用を示し、炎症疾患の治療用途に有望である。ヒアルロン酸、その誘導体又は塩の平均分子量を減らすことは、当技術分野において一般的な方法、例えば単純加熱処理、酵素分解、超音波処理、又は酸による加水分解等により達成することができる（例えば、米国特許第６，０２０，４８４号では添加剤としてＮａＯＣｌを含むＨＡの超音波処理法が記載されている。又、T. Miyazaki et al. (2001) Polymer Degradation and Stability, 74: 77-85を参照）。
【００３８】
本発明の第３の態様は、分岐ヒアルロン酸を製造する方法であって、
（ａ）１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された直鎖ヒアルロン酸骨格を供給する工程；及び
（ｂ）少なくとも１の遊離還元性アルデヒド基を含んでなる生物適合性ポリマーを、（ａ）の１又は２以上のグルコサミンの第１級アミンと、還元的Ｎ−アルキル化により反応させ、分岐ヒアルロン酸を形成する工程を含んでなる方法に関する。
【００３９】
第３の態様の方法において、好ましくは、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの５０％以下がグルコサミンに脱アセチル化され、好ましくは、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、１０％以下、最も好ましくは５％以下がグルコサミンに脱アセチル化される。
【００４０】
第３の態様の好ましい実施形態によれば、直鎖ヒアルロン酸骨格の平均分子量は、１０〜３，０００キロダルトン（ｋＤａ）、好ましくは２０〜２，０００ｋＤａ、最も好ましくは２０〜１，０００ｋＤａ、又はさらに小さく、２０〜９００ｋＤａ，２０〜８００ｋＤａ、２０〜７００ｋＤａ、２０〜６００ｋＤａ、２０〜５００ｋＤａ，２０〜４００ｋＤａ、２０〜３００ｋＤａ、２０〜２００ｋＤａ、２０〜１００ｋＤａである。
【００４１】
生物適合性ポリマーは当技術分野で周知であり、天然品から合成生産品まで多様なポリマーを包含する。これらはヒト等の生物において、毒性や健康への悪影響を与えることなく代謝及び分解され得る。
【００４２】
第３の態様の方法に関する別の好ましい実施形態によれば、還元的Ｎ−アルキル化反応はシアノ水素化ホウ素ナトリウム、ＮａＣＮＢＨ3の存在下、好ましくはｐＨ値４〜１０の範囲、好ましくは５〜９、さらに好ましくは６〜８、最も好ましくは約７で行われる。
【００４３】
その他の成分
好ましい実施形態によれば、本発明の分岐ＨＡを含んでなる組成物は、更に他の成分、好ましくは１又は２以上の活性成分、好ましくは１又は２以上の薬理学的活性物質、及び同様に好ましくは水溶性賦形剤、例えばラクトース等を含んでいてもよい。
【００４４】
本発明で使用可能な活性成分又は薬理学的活性成分としては、これらに限定されるものではないが、タンパク質及び／又はペプチド薬剤、例えばヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン／ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、骨形態形成タンパク質、インターフェロン又はその誘導体、インスリン又はその誘導体、アトリオペプチンIII、モノクローナル抗体、腫瘍壊死因子、マクロファージ活性化因子、インターロイキン、腫瘍変性因子、インスリン様成長因子、表皮成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、第IIV因子、第IIIV因子、及びウロキナーゼが挙げられる。
【００４５】
活性成分を安定化する目的で、水溶性賦形剤を包含させてもよい。かかる賦形剤としては、タンパク質、例えばアルブミン又はゼラチン；アミノ酸、例えばグリシン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、リシン及びその塩；炭水化物、例えばグルコース、ラクトース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、サッカロース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、トレハロース及びコンドロイチンスルフェート；無機塩、例えばホスフェート；界面活性剤、例えばTWEEN（登録商標）（ICI）、ポリエチレングリコール及びその混合物が挙げられる。賦形剤又は安定剤は、生成物の０．００１〜９９重量％の範囲の量で使用することができる。
【００４６】
本発明の一部の態様は、種々の組成物及び医薬品であって、構成成分として特に、第１の態様に係る物質の有効量と、活性成分、好ましくは薬理学的活性剤；並びに、医薬的に許容し得る担体、賦形剤又は希釈剤、好ましくは水溶性賦形剤、最も好ましくはラクトースを含んでなるものに関する。
【００４７】
さらに、本発明の態様は、第１の態様に係る分岐ＨＡ、又は本発明の他の態様及び実施形態に係る組成物を含んでなる製品、例えば化粧品、衛生製品、医療又は手術製品に関する。最終態様によれば、本発明は、第１の態様に係る生成物、又は本発明の他の態様及び実施形態に係る組成物を含んでなる、薬剤カプセル又はマイクロカプセルに関する。
【実施例】
【００４８】
実施例１−脱アセチル化ＨＡの調製
ＨＡ（６．０ｇ）を硫酸ヒドラジン（３．０ｇ）とともにヒドラジン一水和物（３００ｍＬ）に溶解し、５５℃で９２時間撹拌した。得られた生成物に冷エタノール（３５０ｍＬ）を加えて沈殿させ、回収した。飽和ＮａＣｌ溶液（５ｍＬ）を加えて沈殿を促進した。得られた沈殿を新たなエタノール（２５０ｍＬ）で洗浄し、遠心分離（３０００ｇ、１０分）により回収した。回収物（７８０ｇ）は脱アセチル化ＨＡ（脱アセチル化度１３％）であることが分かった。
【００４９】
実施例２−脱アセチル化ＨＡ分解物の調製
実施例１の記載に従って調製した脱アセチル化ＨＡ（ｄｅＨＡ）を、亜硝酸を用いて以下の手順により分解した。
【００５０】
ｄｅＨＡ（１００ｍｇ）の３つの試料Ａ、Ｂ及びＣを、１％酢酸水溶液（６ｍＬ）に溶解させた。表１に従い、亜硝酸（ＮａＮＯ2）を加えた。これらの溶液を暗所で４時間放置した後、ｐＨを７前後に調整した。
【００５１】
表１ 試料Ａ、Ｂ及びＣに加えた亜硝酸量と、それに伴う破壊共有結合価
【表１】
【００５２】
実施例３−分岐ＨＡの調製
実施例２で調製した分解ｄｅＨＡの試料Ａ、Ｂ及びＣを、以下の手順で還元的アルキル化し、分岐化した。
【００５３】
ｐＨを調整した実施例２の水溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ＮａＣＮＢＨ3（２０．４１ｍｇ）を加えた。４８時間（撹拌下）放置して反応を進行させ、終了した。脱イオン水で透析後（ＭＷＣＯ１２〜１４ｋＤａ）、凍結乾燥法で生成物を回収した。
【００５４】
実施例４−ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ−ｖｉｓｃ分析
実施例３で調製した分岐生成物である試料２．ａ、２．ｂ及び２．ｃ（実施例２の試料Ａ、Ｂ及びＣに対応）を、オンライン検知器ＭＡＬＬＳ（多角度光散乱検知器）、ＲＩ（示差屈折計）及びｖｉｓｃ（固有粘度検知器）を用い、サイズ排除クロマトグラフィーで解析した。この方法で生成物質の立体構造及び分子量を評価し、生成物質が分岐しているか否かを調べた。図１に、分子量関数である縮約因子ｇのプロットを示す。ｇ値が１未満であれば、高分子が分岐していることを示す（ｇ＝（Ｒg,分岐）2／（Ｒg,直鎖）2）。図に示すとおり、分子量の増大に伴い縮約因子が増加することから、分岐ＨＡが調製されていることが分かる。
【００５５】
表２に分岐ＨＡ試料２．ａ、２．ｂ及び２．ｃの特性をまとめる。表２中、パラメータ「ａ」はｌｏｇＲg対ｌｏｇＭwのプロットから得られる。このパラメータから、用いた溶液中でのポリマーの立体構造に関する情報を知ることができる（通常、ランダムコイル：０．５〜０．６、剛直ロッド状：１．０、及び球形：０．３３）。出発物質（通常のＨＡ）では、値は０．５〜０．６であり、想定通りランダムコイル構造である。約０．２５という数値からは、高度且つ不規則に分岐した高分子が推定されるから、このことからも試料２．ａ、２．ｂ及び２．ｃが分岐生成物であることが示唆される。
【００５６】
表２ 試料２．ａ、２．ｂ及び２．ｃの主な特徴（Ｍwは重量平均分子量、ＰＤＩは多分散指数、Ｒgはｚ−平均回転半径、［η］は重量平均固有粘度、ａは方程式Ｒg〜Ｍaの指数を表す）。
【００５７】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元的アルキル化による脱アセチル化ヒアルロン酸（ｄｅＨＡ）の分岐化、かかる分岐ヒアルロン酸自体、並びに、特に化粧品業界及び生物医学産業における、それらの応用及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
身体に最も豊富に存在するヘテロ多糖はグリコサミノグリカンである。グリコサミノグリカンは、二糖単位の繰り返しからなる非分岐炭水化物ポリマーである（ケラタン硫酸のみ炭水化物のコア領域で分岐している）。二糖単位は通常、第一のサッカライド単位として、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）又はＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）という、２種の変性糖の一方を含んでなる。第二の単位は通常、ウロン酸、例えばグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）又はイズロネートである。
【０００３】
グリコサミノグリカンは負荷電分子であって、拡張した立体構造を有し、溶液に高い粘度を付与する。グリコサミノグリカンは主に細胞表面又は細胞外マトリクスに存在する。また、グリコサミノグリカンは溶液中で低圧縮性を示すことから、理想的な生理学的潤滑液（例えば関節等）となる。グリコサミノグリカンの剛性は、細胞に構造的一体性を与え、また細胞間に通路を提供し、細胞遊動を可能にしている。生理学的に最も重要なグリコサミノグリカンは、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸及びケラタン硫酸である。多くのグリコサミノグリカンは、特定のオリゴ糖構造を介してプロテオグリカンコアタンパク質に共有結合する。例外的にヒアルロナンは、特定のプロテオグリカンと大きな凝集体を形成するが、これは遊離炭水化物鎖がプロテオグリカンと非共有結合複合体を形成するためである。
【０００４】
ヒアルロナンの体内での役割は多数同定されている（Laurent T. C. and Fraser J. R. E., 1992, FASEB J. 6: 2397-2404; 及び Toole B.P., 1991, "Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation." In: Cell Biology of the Extracellular Matrix, pp. 305-341, Hay E. D., ed., Plenum, New Yorkを参照）。ヒアルロナンは、硝子軟骨、滑膜関節液及び皮膚組織（真皮及び表皮の両方）に存在する。また、ヒアルロナンは多くの生理学的機能、例えば付着、成長、細胞運動性、癌、血管形成及び創傷治癒に関与していると推測される。ヒアルロナンは、その独自の物理学的及び生物学的特性から、眼及び関節の手術で利用されるほか、その他の医療方法でも評価されている。
【０００５】
「ヒアルロナン（hyaluronan）」又は「ヒアルロン酸（hyaluronic acid）」という語は、文献では、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン酸の残基により構成される、種々の分子量を有する酸性多糖類であって、天然には細胞表面、脊椎動物の結合組織の塩基性細胞外基質、関節の滑液、眼の眼内流体、ヒト臍帯組織、及び鶏冠に存在するものを指す言葉として用いられる。
【０００６】
実際には「ヒアルロン酸（hyaluronic acid）」という語は、通常は種々の分子量を有するＤ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ-グルコサミン酸の残基が交互する鎖状多糖類全体、又はその分解された分画を意味するものとして使用されるため、複数形（hyaluronic acids）を用いるのがより正確であろう。但し、本明細書ではやはり単数形を用いる。加えて、かかる総称に代えてしばしば、略語である「ＨＡ」を用いる。
【０００７】
ＨＡは生物において重要な役割を果たす。皮膚、腱、筋肉及び軟骨等、多くの組織の細胞を機械的に支持し、細胞内マトリクスの主成分である。また、組織の保湿や潤滑等の生物学的過程で、ＨＡは別の重要な役割を演じる。
【０００８】
ＨＡは上述の天然組織から抽出され得るが、今日では、病原体による感染の潜在的リスクを最小限に抑え、かつ製品の均一性・品質・可用性を高めるために、微生物学的方法による調製が好適である。
【０００９】
ＨＡ及びその種々の分子サイズ分画、並びにこれらの塩は、（特に関節症治療用の）薬剤として、（特に眼科及び美容外科における）天然器官及び組織用の助剤及び／又は置換剤として、また、化粧品の材料として用いられてきた。また、整形外科、リュウマチ、及び皮膚科用にも、ヒアルロナン製品が開発されてきた。
【００１０】
さらに、ＨＡは衛生及び手術用品に用いられるポリウレタンやポリエステル等の種々のポリマー材料の生体適合性を高める添加剤としても使用され得る。
【００１１】
ヒドラジンを用いたＨＡの脱Ｎ−アセチル化が文献に記載されている（Crescenzi et al. (2002) New cross-linked and sulfated derivatives of partially deacetylated hyaluronan: Synthesis and preliminary characterization, Biopolymers 64, 86-94）。
【００１２】
亜硝酸（ＨＯＮＯ）を用いた還元的分解によるキトサンの分岐化及び還元的Ｎ−アルキル化が報告されている（Tommeraas et al. (2002) Carbohydrate Research 337, 2455-2462）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
例えば、直鎖ＨＡとの比較における粘弾性の向上、例えば、剪断菲薄化（shear thinning）やイオン強度変化に対する感受性の低減、同分子量の直鎖ＨＡからの粘度低減等の性質等、所望の特性を有する生物適合性ポリマーの新規の誘導体の開発が求められている。これらの特性は、生物医学用インプラントや、化粧品、生物医学及び医薬製剤の応用分野で有用であると考えられる。その他の興味ある特性としては、泡を安定化させる性質の向上や、化粧品で通常用いられるような非親水性物質との混合容易性等が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の態様によれば、本発明は、分岐ヒアルロン酸であって、その直鎖骨格が、１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化されたヒアルロン酸を含んでなり、前記脱アセチル化グルコサミンの第１級アミンに分岐側鎖が共有結合して第２級アミンを形成する、分岐ヒアルロン酸を提供する。
【００１５】
本発明の第２の態様は、前駆体又は中間体分子に関し、これは第３の態様の方法の一部を構成する。即ち、１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された、部分又は完全脱アセチル化ヒアルロン酸（ｄＨＡ）に関する。
【００１６】
第３の態様によれば、本発明は、分岐ヒアルロン酸を製造する方法であって、（ａ）１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された直鎖ヒアルロン酸骨格を供給する工程；及び（ｂ）少なくとも１の遊離還元性アルデヒド基を含んでなる生物適合性ポリマーを、（ａ）の１又は２以上のグルコサミンの第１級アミンと、還元的Ｎ−アルキル化により反応させ、分岐ヒアルロン酸を形成する工程を含んでなる方法を提供する。
【００１７】
第４の態様によれば、本発明は、第１の態様に係る分岐ヒアルロン酸と活性成分、好ましくは薬理学的活性剤とを含んでなる組成物に関する。
【００１８】
第５の態様によれば、本発明は、第１の態様に係る分岐ヒアルロン酸の有効量と、医薬的に許容し得る担体、賦形剤、又は希釈剤とを含んでなる医薬組成物に関する。
【００１９】
第６の態様は、第１の態様に係る分岐ヒアルロン酸の有効量をビヒクルとして含んでなると共に、薬理学的活性剤を含んでなる医薬組成物に関する。
【００２０】
第７の態様は、有効量の第１の態様に係る分岐ＨＡ、又は第２、第３、第４の態様のいずれかに係る組成物を活性成分として含んでなる化粧製品に関する。
【００２１】
第８の態様によれば、本発明は、第１の態様に係る分岐ＨＡ、又は第２、第３、第４の態様のいずれかに係る組成物を含んでなる、衛生製品、医療又は手術製品、好ましくはおむつ、生理用ナプキン、手術用スポンジ、創傷治癒スポンジ、又は絆創膏や他の創傷被覆材の部材に関する。
【００２２】
重要な一態様は、第１の態様に係る分岐ＨＡ、又は第４〜６の態様のいずれかに係る組成物を含んでなる、医薬カプセル又はマイクロカプセルに関する。
【００２３】
本発明の最後の態様は、眼科的治療、変形性関節炎又は癌の治療、創傷の治療、薬理学的活性剤の皮膚投与又は経皮投与、又は化粧品の皮膚投与における処置を実施する方法に関し、その改善は、第１の態様に係る分岐ＨＡ、又は第３〜６の態様のいずれかに係る組成物の使用を包含する。
【００２４】
数々の態様が、変形性関節炎又は癌治療に用いられる薬剤の製造、眼科的治療に用いられる薬剤の製造、創傷の治療に用いられる薬剤の製造、血管形成に用いられる薬剤の製造、又は保湿剤の製造における、第１の態様のいずれかに係る分岐ＨＡ、又は第４〜６の態様のいずれかに係る組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ヒアルロン酸の分子量の関数である縮約因子（contraction factor）「ｇ」のプロットを示す（ｇ＝（Ｒg,分岐）2／（Ｒg,直鎖）2）。ｇ値が１未満の場合、ポリマーが分岐していることを示す。図に示すように、分子量の増大に伴って縮約因子も増加することから、分岐ＨＡの調製が確認できる。試料２．ａ、２．ｂ、及び２．ｃは、分岐反応実施後の実施例２の試料Ａ、Ｂ及びＣに相当する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
ヒアルロン酸
本明細書において「ヒアルロン酸」は、交互に現れるβ−１，４及びα−１，３グリコシド結合によって連結される、Ｎ−アセチルグルコサミン（GlcNAc）及びグルクロン酸（GlcUA）の繰り返し二糖構造からなる、非硫酸化グルコサミノグリカンとして定義される。ヒアルロン酸はヒアルロナン、ヒアルロネート、又はＨＡとしても知られている。ヒアルロナン及びヒアルロン酸という用語は、本明細書では何れも、前述の分子自体、及びそのあらゆる種類の塩を表す言葉として、同義に用いられる。
【００２７】
ヒアルロナンの重要な商業供給源としては雄鶏の鶏冠がある。代替源としては微生物がある。米国特許第４，８０１，５３９号には、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）の或る株を用いた、ヒアルロン酸調製のための発酵方法が開示されており、そのヒアルロン酸収量は約３．６ｇ／Ｌであると報告されている。欧州特許第０６９４６１６号では、ストレプトコッカス・ズーエピデミカスの改良株を用いた発酵方法が開示されており、そのヒアルロン酸産生量は約３．５ｇ／Ｌであると報告されている。ＷＯ０３／０５４１６３（Novozymes）（本文献は本明細書に組み入れられる）に開示のように、ヒアルロン酸又はその塩は、例えばグラム陽性バチルス宿主を用い、組み換えによって生産することができる。
【００２８】
ヒアルロナンシンターゼとしては、脊椎動物、病原菌及び藻類ウイルス由来のものが報告されている（DeAngelis, P. L., 1999, Cell. Mol. Life Sci. 56: 670-682）。ＷＯ９９／２３２２７には、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Streptococcus equisimilis）由来のグループＩヒアルロン酸シンターゼが開示され、ＷＯ９９／５１２６５及びＷＯ００／２７３４７にはパスチュレラ・ムルトシダ（Pasturella multocida）由来のグループIIヒアルロン酸シンターゼが記載されている。Ferrettiらは、ヒアルロン酸シンターゼ、ＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼ、及びＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼをそれぞれコードする３つの遺伝子ｈａｓＡ、ｈａｓＢ及びｈａｓＣから構成される、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のヒアルロナンシンターゼオペロンを開示している（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 4658-4663, 2001）。ＷＯ９９／５１２６５では、ストレプトコッカス・エクイシミリス由来のヒアルロナンシンターゼのコード領域を有する核酸セグメントが記載されている。
【００２９】
組み換えバチルス細胞のヒアルロナンは培地に直接発現されるので、簡単な方法で培地からヒアルロナンを単離することができる。まず、バチルス細胞及び破砕細胞を培地から物理的に除去する。所望により、最初に培地を希釈して培地の粘度を低減してもよい。培地から細胞を除去する方法としては、遠心分離や精密濾過等、多数の方法が当業者に公知である。所望により、残存する上清を限外濾過等によって濾過することによって、ヒアルロナンを濃縮するとともに小分子汚染物質を除去してもよい。細胞及び破砕細胞の除去後、既知の機序によって培地からヒアルロナンの単純沈殿を行う。濾液からのヒアルロナンの沈殿には、塩、アルコール、又は塩とアルコールの組み合わせを用いることができる。沈殿となったヒアルロナンは、物理的手段で溶液から容易に単離することができる。ヒアルロナンは、当技術分野で公知の蒸発技術、例えば噴霧乾燥等を用いて、濾液から乾燥又は濃縮することができる。
【００３０】
本発明の第１の態様は、分岐ヒアルロン酸であって、その直鎖骨格が、１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化されたヒアルロン酸を含んでなり、前記脱アセチル化グルコサミンの第１級アミンに分岐側鎖が共有結合して第２級アミンを形成する、分岐ヒアルロン酸に関する。
【００３１】
好ましい実施形態によれば、分岐側鎖は生物適合性ポリマーを含んでなる。生物適合性ポリマーは、好ましくはヒアルロン酸を含んでなる。
【００３２】
本発明の第２の態様は、第３の態様の方法で第１の態様の分岐ＨＡを製造するために必要な中間体又は前駆体分子に関する。前記中間体又は前駆体分子は、１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された、部分又は完全脱アセチル化ヒアルロン酸（ｄＨＡ）である。
【００３３】
前記１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンの脱アセチル化は、化学処理又は酵素処理により、例えば、シアノ水素化ホウ素ナトリウムと硫酸ヒドラジンとの併用や、ＨＡデアセチラーゼ活性を有する酵素の使用等により行われる。
【００３４】
第２の態様のｄＨＡに関する好ましい実施形態によれば、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの５０％以下がグルコサミンに脱アセチル化され、好ましくは、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、１０％以下、最も好ましくは５％以下がグルコサミンに脱アセチル化される。
【００３５】
第２の態様のｄＨＡに関する別の好ましい実施形態によれば、前記ｄＨＡは１０〜３，０００ｋＤａ、好ましくは２０〜２，０００ｋＤａ、最も好ましくは２０〜１，０００ｋＤａ、又はさらに小さく、２０〜９００ｋＤａ、２０〜８００ｋＤａ、２０〜７００ｋＤａ、２０〜６００ｋＤａ、２０〜５００ｋＤａ、２０〜４００ｋＤａ、２０〜３００ｋＤａ、２０〜２００ｋＤａ、２０〜１００ｋＤａの範囲の平均分子量を有する。
【００３６】
分子量
ヒアルロン酸のレベルは、改良カルバゾール法（Bitter and Muir, 1962, Anal Biochem. 4: 330-334）で決定することができる。さらに、ヒアルロン酸の平均分子量は、本技術分野の標準的な方法、例えば、Ueno at al., 1988, Chem. Pharm. Bull. 36, 4971-4975; Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272: 1-40; 及び Wyatt Technologies, 1999, "Light Scattering University DAWN Course Manual" and "DAWN EOS Manual" Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, California. に記載の方法で決定することができる。
【００３７】
場合によっては、最初に直鎖ヒアルロン酸骨格又はその塩の平均分子量を小さくすることが有利である。例えば、ヒアルロン酸のいわゆる低分子量分画の製造業者の一部は、それが皮膚バリアを透過して皮膚中の本来のヒアルロン酸量を回復し得ることから、かかる分画は、抗肌加齢剤及び抗しわ剤として販売される化粧用組成物に特に適していると主張している。食品への利用については、低分子量のヒアルロン酸が胃腸隔壁を透過し、生体利用率が向上させることが示されている。最後に、低分子量のヒアルロン酸は抗炎症作用を示し、炎症疾患の治療用途に有望である。ヒアルロン酸、その誘導体又は塩の平均分子量を減らすことは、当技術分野において一般的な方法、例えば単純加熱処理、酵素分解、超音波処理、又は酸による加水分解等により達成することができる（例えば、米国特許第６，０２０，４８４号では添加剤としてＮａＯＣｌを含むＨＡの超音波処理法が記載されている。又、T. Miyazaki et al. (2001) Polymer Degradation and Stability, 74: 77-85を参照）。
【００３８】
本発明の第３の態様は、分岐ヒアルロン酸を製造する方法であって、
（ａ）１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された直鎖ヒアルロン酸骨格を供給する工程；及び
（ｂ）少なくとも１の遊離還元性アルデヒド基を含んでなる生物適合性ポリマーを、（ａ）の１又は２以上のグルコサミンの第１級アミンと、還元的Ｎ−アルキル化により反応させ、分岐ヒアルロン酸を形成する工程を含んでなる方法に関する。
【００３９】
第３の態様の方法において、好ましくは、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの５０％以下がグルコサミンに脱アセチル化され、好ましくは、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、１０％以下、最も好ましくは５％以下がグルコサミンに脱アセチル化される。
【００４０】
第３の態様の好ましい実施形態によれば、直鎖ヒアルロン酸骨格の平均分子量は、１０〜３，０００キロダルトン（ｋＤａ）、好ましくは２０〜２，０００ｋＤａ、最も好ましくは２０〜１，０００ｋＤａ、又はさらに小さく、２０〜９００ｋＤａ，２０〜８００ｋＤａ、２０〜７００ｋＤａ、２０〜６００ｋＤａ、２０〜５００ｋＤａ，２０〜４００ｋＤａ、２０〜３００ｋＤａ、２０〜２００ｋＤａ、２０〜１００ｋＤａである。
【００４１】
生物適合性ポリマーは当技術分野で周知であり、天然品から合成生産品まで多様なポリマーを包含する。これらはヒト等の生物において、毒性や健康への悪影響を与えることなく代謝及び分解され得る。
【００４２】
第３の態様の方法に関する別の好ましい実施形態によれば、還元的Ｎ−アルキル化反応はシアノ水素化ホウ素ナトリウム、ＮａＣＮＢＨ3の存在下、好ましくはｐＨ値４〜１０の範囲、好ましくは５〜９、さらに好ましくは６〜８、最も好ましくは約７で行われる。
【００４３】
その他の成分
好ましい実施形態によれば、本発明の分岐ＨＡを含んでなる組成物は、更に他の成分、好ましくは１又は２以上の活性成分、好ましくは１又は２以上の薬理学的活性物質、及び同様に好ましくは水溶性賦形剤、例えばラクトース等を含んでいてもよい。
【００４４】
本発明で使用可能な活性成分又は薬理学的活性成分としては、これらに限定されるものではないが、タンパク質及び／又はペプチド薬剤、例えばヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン／ペプチド、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、マクロファージ−コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、骨形態形成タンパク質、インターフェロン又はその誘導体、インスリン又はその誘導体、アトリオペプチンIII、モノクローナル抗体、腫瘍壊死因子、マクロファージ活性化因子、インターロイキン、腫瘍変性因子、インスリン様成長因子、表皮成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、第IIV因子、第IIIV因子、及びウロキナーゼが挙げられる。
【００４５】
活性成分を安定化する目的で、水溶性賦形剤を包含させてもよい。かかる賦形剤としては、タンパク質、例えばアルブミン又はゼラチン；アミノ酸、例えばグリシン、アラニン、グルタミン酸、アルギニン、リシン及びその塩；炭水化物、例えばグルコース、ラクトース、キシロース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、サッカロース、デキストラン、マンニトール、ソルビトール、トレハロース及びコンドロイチンスルフェート；無機塩、例えばホスフェート；界面活性剤、例えばTWEEN（登録商標）（ICI）、ポリエチレングリコール及びその混合物が挙げられる。賦形剤又は安定剤は、生成物の０．００１〜９９重量％の範囲の量で使用することができる。
【００４６】
本発明の一部の態様は、種々の組成物及び医薬品であって、構成成分として特に、第１の態様に係る物質の有効量と、活性成分、好ましくは薬理学的活性剤；並びに、医薬的に許容し得る担体、賦形剤又は希釈剤、好ましくは水溶性賦形剤、最も好ましくはラクトースを含んでなるものに関する。
【００４７】
さらに、本発明の態様は、第１の態様に係る分岐ＨＡ、又は本発明の他の態様及び実施形態に係る組成物を含んでなる製品、例えば化粧品、衛生製品、医療又は手術製品に関する。最終態様によれば、本発明は、第１の態様に係る生成物、又は本発明の他の態様及び実施形態に係る組成物を含んでなる、薬剤カプセル又はマイクロカプセルに関する。
【実施例】
【００４８】
実施例１−脱アセチル化ＨＡの調製
ＨＡ（６．０ｇ）を硫酸ヒドラジン（３．０ｇ）とともにヒドラジン一水和物（３００ｍＬ）に溶解し、５５℃で９２時間撹拌した。得られた生成物に冷エタノール（３５０ｍＬ）を加えて沈殿させ、回収した。飽和ＮａＣｌ溶液（５ｍＬ）を加えて沈殿を促進した。得られた沈殿を新たなエタノール（２５０ｍＬ）で洗浄し、遠心分離（３０００ｇ、１０分）により回収した。回収物（７８０ｇ）は脱アセチル化ＨＡ（脱アセチル化度１３％）であることが分かった。
【００４９】
実施例２−脱アセチル化ＨＡ分解物の調製
実施例１の記載に従って調製した脱アセチル化ＨＡ（ｄｅＨＡ）を、亜硝酸を用いて以下の手順により分解した。
【００５０】
ｄｅＨＡ（１００ｍｇ）の３つの試料Ａ、Ｂ及びＣを、１％酢酸水溶液（６ｍＬ）に溶解させた。表１に従い、亜硝酸（ＮａＮＯ2）を加えた。これらの溶液を暗所で４時間放置した後、ｐＨを７前後に調整した。
【００５１】
表１ 試料Ａ、Ｂ及びＣに加えた亜硝酸量と、それに伴う破壊共有結合価
【表１】
【００５２】
実施例３−分岐ＨＡの調製
実施例２で調製した分解ｄｅＨＡの試料Ａ、Ｂ及びＣを、以下の手順で還元的アルキル化し、分岐化した。
【００５３】
ｐＨを調整した実施例２の水溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、ＮａＣＮＢＨ3（２０．４１ｍｇ）を加えた。４８時間（撹拌下）放置して反応を進行させ、終了した。脱イオン水で透析後（ＭＷＣＯ１２〜１４ｋＤａ）、凍結乾燥法で生成物を回収した。
【００５４】
実施例４−ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ−ｖｉｓｃ分析
実施例３で調製した分岐生成物である試料２．ａ、２．ｂ及び２．ｃ（実施例２の試料Ａ、Ｂ及びＣに対応）を、オンライン検知器ＭＡＬＬＳ（多角度光散乱検知器）、ＲＩ（示差屈折計）及びｖｉｓｃ（固有粘度検知器）を用い、サイズ排除クロマトグラフィーで解析した。この方法で生成物質の立体構造及び分子量を評価し、生成物質が分岐しているか否かを調べた。図１に、分子量関数である縮約因子ｇのプロットを示す。ｇ値が１未満であれば、高分子が分岐していることを示す（ｇ＝（Ｒg,分岐）2／（Ｒg,直鎖）2）。図に示すとおり、分子量の増大に伴い縮約因子が増加することから、分岐ＨＡが調製されていることが分かる。
【００５５】
表２に分岐ＨＡ試料２．ａ、２．ｂ及び２．ｃの特性をまとめる。表２中、パラメータ「ａ」はｌｏｇＲg対ｌｏｇＭwのプロットから得られる。このパラメータから、用いた溶液中でのポリマーの立体構造に関する情報を知ることができる（通常、ランダムコイル：０．５〜０．６、剛直ロッド状：１．０、及び球形：０．３３）。出発物質（通常のＨＡ）では、値は０．５〜０．６であり、想定通りランダムコイル構造である。約０．２５という数値からは、高度且つ不規則に分岐した高分子が推定されるから、このことからも試料２．ａ、２．ｂ及び２．ｃが分岐生成物であることが示唆される。
【００５６】
表２ 試料２．ａ、２．ｂ及び２．ｃの主な特徴（Ｍwは重量平均分子量、ＰＤＩは多分散指数、Ｒgはｚ−平均回転半径、［η］は重量平均固有粘度、ａは方程式Ｒg〜Ｍaの指数を表す）。
【００５７】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分岐ヒアルロン酸であって、その直鎖骨格が、１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化されたヒアルロン酸を含んでなり、前記脱アセチル化グルコサミンの第１級アミンに分岐側鎖が共有結合して第２級アミンを形成する、分岐ヒアルロン酸。
【請求項２】
分岐側鎖が生物適合性ポリマーを含んでなる、請求項１記載の分岐ヒアルロン酸。
【請求項３】
生物適合性ポリマーがヒアルロン酸を含んでなる、請求項２記載の分岐ヒアルロン酸。
【請求項４】
１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された、部分又は完全脱アセチル化ヒアルロン酸（ｄＨＡ）。
【請求項５】
１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンが化学及び／又は酵素処理により脱アセチル化された、請求項４記載のｄＨＡ。
【請求項６】
直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの５０％以下がグルコサミンに脱アセチル化され、好ましくは、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、１０％以下、最も好ましくは５％以下がグルコサミンに脱アセチル化された、請求項４又は５に記載のｄＨＡ。
【請求項７】
平均分子量が１０〜３，０００キロダルトン（ｋＤａ）、好ましくは２０〜２，０００ｋＤａ、最も好ましくは２０〜１，０００ｋＤａである、請求項４〜６のいずれかに記載のｄＨＡ。
【請求項８】
分岐ヒアルロン酸を製造する方法であって、
（ａ）１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された直鎖ヒアルロン酸骨格を供給する工程；及び
（ｂ）少なくとも１の遊離還元性アルデヒド基を含んでなる生物適合性ポリマーを、（ａ）の１又は２以上のグルコサミンの第１級アミンと、還元的Ｎ−アルキル化により反応させ、分岐ヒアルロン酸を形成する工程を含んでなる方法。
【請求項９】
直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの５０％以下がグルコサミンに脱アセチル化され、好ましくは、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、１０％以下、最も好ましくは５％以下がグルコサミンに脱アセチル化された、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
直鎖ヒアルロン酸骨格の平均分子量が１０〜３，０００キロダルトン（ｋＤａ）、好ましくは２０〜２，０００ｋＤａ、最も好ましくは２０〜１，０００ｋＤａである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
生物適合性ポリマーがヒアルロン酸を含んでなる、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
還元的Ｎ−アルキル化反応がシアノ水素化ホウ素ナトリウム、ＮａＣＮＢＨ3の存在下で行われる、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
還元的Ｎ−アルキル化反応がｐＨ値４〜１０の範囲、好ましくは５〜９、より好ましくは６〜８、最も好ましくは約７で行われる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸と、活性物質、好ましくは薬理学的活性物質とを含んでなる組成物。
【請求項１５】
水溶性賦形剤をさらに含んでなる、請求項１４に記載組成物。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸の有効量と、医薬的に許容し得る担体、賦形剤又は希釈剤とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸の有効量をビヒクルとして含んでなるとともに、薬理学的活性物質を含んでなる医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物を含んでなる化粧製品。
【請求項１９】
有効量の請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物を活性成分として含んでなる化粧製品。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物を含んでなる衛生製品、医療又は手術製品であって、好ましくは、おむつ、生理用ナプキン、手術用スポンジ、創傷治癒スポンジ、又は、絆創膏若しくは他の創傷被覆材の部材である前記製品。
【請求項２１】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物を含んでなる医薬カプセル又はマイクロカプセル。
【請求項２２】
眼科的処置を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２３】
変形性関節炎の治療における処置を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２４】
癌治療の治療における処置を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２５】
薬理学的活性剤の経皮投与を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２６】
薬理学的活性剤の皮膚投与を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２７】
化粧品の皮膚投与を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２８】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物を使用する眼科的方法。
【請求項２９】
変形性関節炎を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の有効量を、好ましくは皮膚、経皮、経口又は注射により、哺乳類に投与する工程を含んでなる方法。
【請求項３０】
創傷を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の有効量を、哺乳類に投与する工程を含んでなる方法。
【請求項３１】
脱毛又は禿頭症を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の有効量を、好ましくは皮膚、経皮、経口又は注射により、哺乳類に投与する工程を含んでなる方法。
【請求項３２】
変形性関節炎の治療に用いられる薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３３】
眼科的治療に用いられる薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３４】
癌の治療に用いられる薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３５】
創傷の治療に用いられる薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３６】
血管形成に用いられる薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３７】
保湿剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項１】
分岐ヒアルロン酸であって、その直鎖骨格が、１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化されたヒアルロン酸を含んでなり、前記脱アセチル化グルコサミンの第１級アミンに分岐側鎖が共有結合して第２級アミンを形成する、分岐ヒアルロン酸。
【請求項２】
分岐側鎖が生物適合性ポリマーを含んでなる、請求項１記載の分岐ヒアルロン酸。
【請求項３】
生物適合性ポリマーがヒアルロン酸を含んでなる、請求項２記載の分岐ヒアルロン酸。
【請求項４】
１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された、部分又は完全脱アセチル化ヒアルロン酸（ｄＨＡ）。
【請求項５】
１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンが化学及び／又は酵素処理により脱アセチル化された、請求項４記載のｄＨＡ。
【請求項６】
直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの５０％以下がグルコサミンに脱アセチル化され、好ましくは、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、１０％以下、最も好ましくは５％以下がグルコサミンに脱アセチル化された、請求項４又は５に記載のｄＨＡ。
【請求項７】
平均分子量が１０〜３，０００キロダルトン（ｋＤａ）、好ましくは２０〜２，０００ｋＤａ、最も好ましくは２０〜１，０００ｋＤａである、請求項４〜６のいずれかに記載のｄＨＡ。
【請求項８】
分岐ヒアルロン酸を製造する方法であって、
（ａ）１又は２以上のＮ−アセチル−グルコサミンがグルコサミンに脱アセチル化された直鎖ヒアルロン酸骨格を供給する工程；及び
（ｂ）少なくとも１の遊離還元性アルデヒド基を含んでなる生物適合性ポリマーを、（ａ）の１又は２以上のグルコサミンの第１級アミンと、還元的Ｎ−アルキル化により反応させ、分岐ヒアルロン酸を形成する工程を含んでなる方法。
【請求項９】
直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの５０％以下がグルコサミンに脱アセチル化され、好ましくは、直鎖ヒアルロン酸骨格中のＮ−アセチル−グルコサミンの４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、１０％以下、最も好ましくは５％以下がグルコサミンに脱アセチル化された、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
直鎖ヒアルロン酸骨格の平均分子量が１０〜３，０００キロダルトン（ｋＤａ）、好ましくは２０〜２，０００ｋＤａ、最も好ましくは２０〜１，０００ｋＤａである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
生物適合性ポリマーがヒアルロン酸を含んでなる、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
還元的Ｎ−アルキル化反応がシアノ水素化ホウ素ナトリウム、ＮａＣＮＢＨ3の存在下で行われる、請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
還元的Ｎ−アルキル化反応がｐＨ値４〜１０の範囲、好ましくは５〜９、より好ましくは６〜８、最も好ましくは約７で行われる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸と、活性物質、好ましくは薬理学的活性物質とを含んでなる組成物。
【請求項１５】
水溶性賦形剤をさらに含んでなる、請求項１４に記載組成物。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸の有効量と、医薬的に許容し得る担体、賦形剤又は希釈剤とを含んでなる医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸の有効量をビヒクルとして含んでなるとともに、薬理学的活性物質を含んでなる医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物を含んでなる化粧製品。
【請求項１９】
有効量の請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物を活性成分として含んでなる化粧製品。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物を含んでなる衛生製品、医療又は手術製品であって、好ましくは、おむつ、生理用ナプキン、手術用スポンジ、創傷治癒スポンジ、又は、絆創膏若しくは他の創傷被覆材の部材である前記製品。
【請求項２１】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物を含んでなる医薬カプセル又はマイクロカプセル。
【請求項２２】
眼科的処置を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２３】
変形性関節炎の治療における処置を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２４】
癌治療の治療における処置を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２５】
薬理学的活性剤の経皮投与を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２６】
薬理学的活性剤の皮膚投与を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２７】
化粧品の皮膚投与を実施する方法における、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用を含んでなる改良。
【請求項２８】
請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物を使用する眼科的方法。
【請求項２９】
変形性関節炎を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の有効量を、好ましくは皮膚、経皮、経口又は注射により、哺乳類に投与する工程を含んでなる方法。
【請求項３０】
創傷を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の有効量を、哺乳類に投与する工程を含んでなる方法。
【請求項３１】
脱毛又は禿頭症を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の有効量を、好ましくは皮膚、経皮、経口又は注射により、哺乳類に投与する工程を含んでなる方法。
【請求項３２】
変形性関節炎の治療に用いられる薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３３】
眼科的治療に用いられる薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３４】
癌の治療に用いられる薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３５】
創傷の治療に用いられる薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３６】
血管形成に用いられる薬剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項３７】
保湿剤の製造のための、請求項１〜３のいずれかに記載の分岐ヒアルロン酸、又は請求項１４〜１７のいずれかに記載の組成物の使用。
【図１】
【公表番号】特表２００９−５４５６３７（Ｐ２００９−５４５６３７Ａ）
【公表日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２２０８８（Ｐ２００９−５２２０８８）
【出願日】平成１９年７月１３日（２００７．７．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００７／０００３５８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１４７８７
【国際公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【出願人】（５０９１９８３４３）ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年７月１３日（２００７．７．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００７／０００３５８
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１４７８７
【国際公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【出願人】（５０９１９８３４３）ノボザイムス バイオファーマ デーコー アクティーゼルスカブ (11)
【Ｆターム（参考）】
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