本発明は、ＤＮＡポリメラーゼαを特異的に阻害する第１の薬剤およびプロテインキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）を阻害する第２の薬剤を用いる併用療法を使用して、増殖性障害を処置するための組成物および方法を提供する。第１の薬剤は、ＤＮＡポリメラーゼαに指向される結合化合物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を含む。第１の薬剤はまた、ＰｏｌＡに指向されるアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを含み得る。第２の薬剤は、チェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）に指向される結合化合物（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を含む。第２の薬剤はまた、チェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）をコードする遺伝子に指向されるアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを含み得る。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖性障害（例えば、癌）の処置のための方法および組成物に関する。具体的には、本発明は、ＤＮＡ複製を妨げる第１の薬剤および複製チェックポイントを妨げる第２の薬剤を用いる併用療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サーベイランス機構の複雑なネットワークは、「チェックポイント」といわれ、種々のゲノム傷害に直面しても、ゲノム完全性を維持する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。チェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２など）は、不適切なとき（例えば、ＤＮＡ損傷に応答している場合）の細胞周期進行を妨げ、細胞が停止している間に細胞の代謝的バランスを維持し、チェックポイントの要求が満たされなかった場合、いくらかの場合には、アポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導し得る。チェックポイント制御は、ＤＮＡ合成（「Ｇ１／Ｓチェックポイント」）の前のＧ１期において、Ｓ期（「Ｓ内（ｉｎｔｒａ−Ｓ）チェックポイント」）において、および有糸分裂に入る前のＧ２期（「Ｇ２／Ｍチェックポイント」）において、起こり得る。この活動は、ＤＮＡ修復プロセスが、ゲノムの複製およびその後の新たな娘細胞への遺伝物質の分離が起こる前に、それらの作業を完了することを可能にする。ＣＨＫ１の不活性化は、ＤＮＡ損傷（内因性ＤＮＡ損傷または抗癌剤によって引き起こされる損傷）によって通常誘導されるＧ２停止を排除し、不適切な有糸分裂への進入および得られたチェックポイント欠損細胞の優先的な死滅を生じることが示された。例えば、非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；および非特許文献９を参照のこと。これらの効果は、Ｃｄｃ２５Ｃの活性の調節におけるＣｈｋ１の役割によって媒介され、続いて、有糸分裂への進入を制御するＣｄｃ−２／サイクリンＢ複合体の活性を制御すると考えられている。
【０００３】
Ｃｈｋ１（セリン／スレオニンチェックポイントキナーゼ）は、Ｓ内チェックポイントおよびＧ２／Ｍチェックポイント応答の両方に寄与する（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。複製ストレスおよびＳ内チェックポイントの関与後、Ｃｈｋ１は、ＡＴＭ（毛細管拡張性失調症変異（ａｔａｘｉａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ， ｍｕｔａｔｅｄ））およびＡＴＲ（ＡＴＭおよびＲａｄ３関連）プロテインキナーゼによって活性化される。ＤＮＡ代謝拮抗性薬物に対する曝露が、Ｓ内チェックポイントを活性化することを示した（例えば、非特許文献１５を参照のこと）が、Ｃｈｋ１がこの応答に寄与する機構は不明なままである。
【０００４】
Ｃｈｋ１インヒビターは、化学療法剤を使用する癌治療に潜在的に有用な補助物質として提唱されてきた。例えば、非特許文献１６を参照のこと。Ｃｈｋ１の活性の阻害は、化学療法誘導性ＤＮＡ損傷を有する癌細胞におけるチェックポイント制御の障害をもたらすと推定される。チェックポイントの障害は、ＤＮＡ損傷にも拘わらず、有糸分裂への細胞の進行をもたらし、有糸分裂の分かれ目（ｍｉｔｏｔｉｃ ｃｒｉｓｉｓ）および最終的にアポトーシスをもたらす。非癌性細胞は、Ｃｈｋ１媒介性チェックポイント機能の喪失にあたり感受性でないと推定される。なぜなら、非癌性細胞は、一般に、それほど急激に分裂せず、これらはまた、細胞周期を介した有糸分裂への進行を妨げるために、機能的Ｇ１チェックポイント（大部分の腫瘍細胞において欠落している）を有し得るからである。癌性細胞 対 正常細胞に対するＣｈｋ１インヒビターのこの差示的効果は、化学療法の効果を増強し、望ましくない副作用の所定のレベルに対してより多くの腫瘍死滅を提供すると推定される。
【０００５】
チェックポイントインヒビター（例えば、カフェイン、ＵＣＮ−０１、Ｇｏ６９７９、ＩＣＰ−１、ＳＢ２１８０７８、ＰＤ１６６２８５およびイソグラヌラチミド）を、非特許文献１７において検討されるように、ＤＮＡ損傷剤または照射と組み合わせた。Ｃｈｋ１の阻害を、ヌクレオシドアナログ（非特許文献１８）および他の化学療法剤および代謝拮抗物質（例えば、エトポシド、ドキソルビシン、シスプラチン、クロラムブシル、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、２−クロロアデノシン、フルダラビン、アザシチジン、ゲムシタビン（特許文献１；特許文献２；および特許文献３）、シトシンアラビノシド（ａｒａ−Ｃ）およびチミジン（非特許文献１９）、アフィジコリン（非特許文献２０）ならびに７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１）（非特許文献２１；非特許文献２２）と組み合わせた。
【０００６】
異常な細胞増殖と関連する疾患状態の処置もしくは予防を促進するために、正常組織とは対照的に、化学療法剤およびＤＮＡ代謝拮抗物質の毒性作用に対して腫瘍組織を優先的に感受性にするための改善された方法が必要である。好ましくは、このような方法および組成物は、腫瘍組織における有糸分裂の分かれ目もしくはアポトーシスを誘導するはずである。好ましくは、このような方法および組成物はまた、腫瘍組織に対して非常に選択的であるので、望ましくない副作用を最小にする。好ましくは、このような方法および組成物は、治療的利益を達成するために絶対に必要な分子（例えば、特異的ＤＮＡポリメラーゼ）のみを阻害すると同時に他の分子に対してあまり破壊的でないように、精密に標的化されるので、望ましくない副作用を最小にする。好ましくは、このような方法および組成物は、ＤＮＡへ組み込まれない化合物を必要とし、ＤＮＡ合成の長期の停止、ＤＮＡチェックポイントの増強された活性化、および治療剤としてのチェックポイントインヒビターの増大した効果を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，０６７，５０６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／００６９２８４号明細書
【特許文献３】国際公開第２００５／０２７９０７号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｒｔｗｅｌｌ ＆ Ｗｅｉｎｅｒｔ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：６２９
【非特許文献２】Ｗｅｉｎｅｒｔ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４５０
【非特許文献３】Ｋａｓｔａｎ ＆ Ｂａｒｔｅｋ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：３１６
【非特許文献４】Ｐｅｎｇら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１５０１
【非特許文献５】Ｓａｎｃｈｅｚら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：１４９７
【非特許文献６】Ｎｕｒｓｅ（１９９７）Ｃｅｌｌ ９１：８６５
【非特許文献７】Ｗｅｉｎｅｒｔ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：４５０
【非特許文献８】Ｗａｌｗｏｒｔｈら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６３：３６８
【非特許文献９】Ａｌ−Ｋｈｏｄａｉｒｙら（１９９４）Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ５：１４７
【非特許文献１０】Ｌｉｕら（２０００）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：１４４８
【非特許文献１１】Ｓｏｒｅｎｓｅｎら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２４７
【非特許文献１２】Ｃｈｏら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４：１３１
【非特許文献１３】Ｚａｃｈｏｓら（２００５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：５６３
【非特許文献１４】Ｐｅｔｅｒｍａｎｎら（２００６）ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３３１９
【非特許文献１５】Ｃｈｏら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４：１３１
【非特許文献１６】Ｔａｏ ＆ Ｌｉｎ（２００６）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：３７７
【非特許文献１７】Ｐｒｕｄｈｏｍｍｅ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．−Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ ４：４３５
【非特許文献１８】Ｓａｍｐａｔｈら（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：９０６３
【非特許文献１９】Ｃｈｏら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４：１３１
【非特許文献２０】Ｚａｃｈｏｓら（２００３）ＥＭＢＯ Ｊ：２２：７１３
【非特許文献２１】Ｆｅｉｊｏｏら（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５４：９１３
【非特許文献２２】Ｍｉａｏら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４２９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
その多くの実施形態において、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼαの活性を阻害する工程および少なくとも１種のチェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）の活性を阻害する工程を包含する、増殖性障害の処置のための方法を提供する。別の局面において、本発明は、被験体に、ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビターである第１の薬剤および少なくとも１種のチェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１もしくはＣｈｋ２）のインヒビターである第２の薬剤を投与することによって、被験体（例えば、処置の必要な被験体）における増殖性障害の処置のための方法を提供する。なお別の局面において、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビターおよびチェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１もしくはＣｈｋ２）のインヒビターを含む、その必要性がある被験体に投与される組成物に関する。
【００１０】
本発明のすべての局面のうちのいくつかの実施形態において、上記チェックポイントキナーゼはＣｈｋ１である。
【００１１】
種々の実施形態において、上記第１の薬剤は、第２の薬剤より前に、それと同時に、またはその後に投与される。他の実施形態において、上記第１の薬剤および／または上記第２の薬剤での処置は、いずれの順番でも、１回より多く反復される。好ましい実施形態において、上記第１の薬剤は、最初に投与され、そして上記第２の薬剤は、後のときに投与され、そのときに、上記第１の化合物の後のときの投与は、継続されてもよいし、中断されてもよい。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼαの阻害は、別のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼε）の阻害の少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、７００倍、１０００倍、またはそれ以上である。
【００１３】
例示的な第１の薬剤としては、４−ヒドロキシ−１７−メチリンシステロール（ｍｅｔｈｙｌｉｎｃｉｓｔｅｒｏｌ）、糖脂質であるガラクトシルジアシルグリセロール（ＧＤＧ）、パクリタキセル誘導体であるセファロマンニン、デヒドロアルテヌシン、スルホ脂質化合物（例えば、スルホキノボシルジアシルグリセロール）、非環式ホスホメトキシアルキルヌクレオチドアナログ（ｐｈｏｓｐｈｏｎｍｅｔｈｏｘｙａｌｋｙｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇ）、レスベラトール（３，４，５−トリヒドロキシスチルベン）、トリテルペンジカルボン酸、ｍｉｓｐｙｒｉｃ ａｃｉｄ、６−（ｐ−ｎ−ブチルアニリノ）ウラシルおよびＮ２−（ｐ−ブチルフェニル）グアニンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
一実施形態において、上記第１の薬剤は、４−ヒドロキシ−１７−メチリンシステロール、ガラクトシルジアシルグリセロール、セファロマンニン、デヒドロアルテヌシン、６−（ｐ−ｎ−ブチルアニリノ）ウラシルおよびＮ２−（ｐ−ブチルフェニル）グアニンからなる群より選択される。別の実施形態において、上記第１の薬剤はセファロマンニンである。なお別の実施形態において、上記第１の薬剤はデヒドロアルテヌシンである。
【００１５】
例示的な第２の薬剤としては、ピラゾロピリミジン、イミダゾピラジン、ＵＣＮ−０１、インドールカルバゾール化合物、Ｇｏ６９７６、ＳＢ−２１８０７８、スタウロスポリン、ＩＣＰ−１、ＣＥＰ−３８９１、イソグラヌラチミド、デブロモヒメニアルジシン（ＤＢＨ）、ピリドピリミジン誘導体、ＰＤ０１６６２８５、シトネミン、ジアリール尿素、ベンゾイミダゾールキノロン、ＣＨＲ １２４、ＣＨＲ ６００、三環式ジアゾピノインドロン、ＰＦ−００３９４６９１、フラノピリミジン、ピロロピリミジン、インドリノン、置換されたピラジン、化合物ＸＬ８４４、ピリミジニルインダゾリルアミン、アミノピラゾール、２−ウレイドチオフェン、ピリミジン、ピロロピリミジン、３−ウレイドチオフェン、インデノピラゾール、トリアゾロン、ジベンゾジアゼピノン、大環状尿素、ピラゾロキノリン、およびペプチド模倣物ＣＢＰ５０１が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、上記第２の薬剤は、ピラゾロピリミジンまたはイミダゾピラジンからなる群より選択される。別の実施形態において、上記ピラゾロピリミジンは、ピラゾロ［ｌ，５−ａ］ピリミジンである。別の実施形態において、上記イミダゾピラジンは、イミダゾ［１，２−ａ］ピラジンである。
【００１６】
いくつかの実施形態において、１種以上のさらなる薬剤は、上記第１の薬剤および上記第２の薬剤（例えば、細胞増殖抑制性薬剤、シスプラチン、ドキソルビシン、タキソテール、タキソール、エトポシド、イリノテカン、カンプトスター、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセル、エポチロン、タモキシフェン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、テモゾロミド、シクロホスファミド、ＳＣＨ ６６３３６、Ｒｌ１５７７７、Ｌ７７８，１２３、ＢＭＳ ２１４６６２、Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）、ＥＧＦＲに対する抗体、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、イントロン、ａｒａ−Ｃ、アドリアマイシン、シトキサン、ゲムシタビン、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））、ロイコビリン、ペントスタチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、テニポシド、１７α−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン、ゴセレリン、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミソール、ナベルベン、アナストラゾール、レトロゾール、カペシタビン、レロキサフィン、ドロロキサフェン、ヘキサメチルメラミン、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（登録商標）、Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）、ビノレルビン、ポルフィマー、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、リポソーム、チオテパ、アルトレタミン、メルファラン、レトロゾール、フルベストラント、エキセメスタン、フルベストラント、イホスファミド、Ｃ２２５、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、クロファラビン、クラドリビン、アフィジコリン（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｏｎ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）、スニチニブ、ダサチニブ、テザシタビン、Ｓｍｌｌ、フルダラビン、ペントスタチン、Ｔｒｉａｐｉｎｅ（登録商標）、ジドックス（ｄｉｄｏｘ）、トリミドックス（ｔｒｉｍｉｄｏｘ）、アミドックス（ａｍｉｄｏｘ）、３−ＡＰ、およびＭＤＬ−１０１，７３１からなる群より選択される１種以上の抗癌剤）との組み合わせにおいて含められる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記増殖性障害は、癌、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、真菌性疾患、神経学的／神経変性障害、関節炎、炎症、抗増殖性疾患、ニューロン疾患、脱毛症、心血管疾患または敗血症である。
【００１８】
一実施形態において、上記増殖性障害は癌である。いくつかの実施形態において、上記癌は、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部、食道、胆嚢、卵巣、膵臓、胃、子宮頚、甲状腺、前立腺、および皮膚の癌、扁平上皮癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞白血病、外套細胞リンパ腫、骨髄腫、バーキットリンパ腫；急性および慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、前骨髄芽球性白血病；線維肉腫、横紋筋肉腫;星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および神経鞘腫；黒色腫、精上皮腫、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、濾胞性甲状腺癌およびカポジ肉腫からなる群より選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明の併用療法は、放射線療法と組み合わせられる。
【００２０】
一実施形態において、本発明の併用療法は、必要に応じて、癌抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３遺伝子産物もしくはＲｂ遺伝子産物）の機能の低下もしくは喪失を伴う増殖性障害を示す被験体に選択的に投与される。このような実施形態において、被験体は、被験体の罹患していない組織と比較して、癌抑制遺伝子産物の機能の低下もしくは喪失についてスクリーニングされ、そしてこのような機能の低下もしくは喪失を示す被験体のみが、本発明の併用療法を使用して処置される。一実施形態において、上記被験体の異常に増殖している組織は、上記被験体が本発明の併用療法を使用した処置に適しているか否かを決定するために、ｐ５３遺伝子産物もしくはＲｂ遺伝子産物の存在および／または活性についてスクリーニングされる。このような実施形態において、受容可能な被験体は、ｐ５３、Ｒｂもしくは両方の機能の低下もしくは喪失を有し得る。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記第１の薬剤は、ＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα遺伝子によってコードされる）のＩＣ５０に対するＤＮＡポリメラーゼε（Ｐｏｌε遺伝子によってコードされる）の薬剤のＩＣ５０の比（式ＩＣ５０_ｐｏｌε／ＩＣ５０_ｐｏｌαによって表される）によって測定される場合、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、７００倍、１０００倍以上、別のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼε）と比較してＤＮＡポリメラーゼαに対して特異的である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、上記第２の薬剤は、Ｃｈｋ１のＩＣ５０に対するＣＤＫ２の薬剤のＩＣ５０の比（式ＩＣ５０_Ｃｈｋ２／ＩＣ５０_Ｃｈｋ１によって表される）によって測定される場合、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、７００倍、１０００倍以上、別のプロテインキナーゼ（例えば、ＣＤＫ２）と比較してＣｈｋ１に対して特異的である。いくつかの実施形態において、上記ＩＣ５０比は、５倍、１０倍、または５０倍である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、第１の薬剤は、ＤＮＡポリメラーゼαに指向される結合化合物（例えば、抗体（例えば、イントラボディー（ｉｎｔｒａｂｏｄｉｅｓ）またはその抗原結合フラグメント）を含む。第１の薬剤はまた、ＰｏｌＡに指向されるアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを含み得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、チェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）に指向される結合化合物（例えば、抗体（例えば、イントラボディー）またはその抗原結合フラグメント）を含む。第２の薬剤はまた、チェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）をコードする遺伝子に指向されるアンチセンス核酸またはｓｉＲＮＡを含み得る。
【００２５】
一実施形態において、併用療法は、ＤＮＡポリメラーゼαを阻害する一定量の第１の薬剤およびＣｈｋ１を阻害する一定量の第２の薬剤を含む薬学的組成物を用いてもたらされ、ここで被験体への上記組成物の投与は、治療的効果を生じる。種々の実施形態において、上記治療的効果は、異常な増殖の予防、低下または除去（例えば、腫瘍の予防、または被験体における腫瘍もしくは他の癌性組織の増殖もしくは除去の遅延）である。
【００２６】
別の局面において、本発明は、増殖性障害の処置のための医薬の製造における、ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビターおよびチェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）のインヒビターの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ヒドロキシ尿素（ＨＵ）、ゲムシタビン（ＧＥＭ）、Ａｒａ−Ｃ（Ａｒａ）または処置無し（「−」）での処置の後のＣｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化を示すゲルのウェスタンブロットである。Ｃｈｋ１を、添加コントロールとして測定した。
【図２Ａ】図２Ａは、ＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）、ＤＮＡポリメラーゼε（Ｐｏｌε）もしくはＤＮＡポリメラーゼδ（Ｐｏｌδ）に対する特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖と比較した、ヒドロキシ尿素ありまたはなし（＋／−ＨＵ）で、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）に対するコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後での、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化を示すゲルのウェスタンブロットである。Ｒａｄ１７は、添加コントロールとして含められる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって評価した場合、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（ＨＵ処置ありまたはなし）で、またはＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）、ＤＮＡポリメラーゼε（Ｐｏｌε）もしくはＤＮＡポリメラーゼδ（Ｐｏｌδ）に対する特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖でトランスフェクトした細胞についての、γ−Ｈ２Ａ．Ｘリン酸化およびＤＮＡ含有量のプロットを提供する。特定の閾値より大きなＤＮＡ損傷を有する、各実験における細胞の割合（０．３％〜３．２％の範囲）を提供する。各実験について、プロットは、計数した細胞すべてのＤＮＡ含有量を提供する。データは、３回の独立した実験の平均を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって評価した場合、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ（ＨＵ処置ありまたはなし）で、またはＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）、ＤＮＡポリメラーゼε（Ｐｏｌε）もしくはＤＮＡポリメラーゼδ（Ｐｏｌδ）に対する特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖でトランスフェクトした細胞についての、γ−Ｈ２Ａ．Ｘリン酸化およびＤＮＡ含有量のプロットを提供する。特定の閾値より大きなＤＮＡ損傷を有する、各実験における細胞の割合（０．３％〜３．２％の範囲）を提供する。各実験のために、プロットは、計数した細胞すべてのＤＮＡ含有量を提供する。データは、３回の独立した実験の平均を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）に対するコントロールｓｉＲＮＡ二重鎖、Ｃｈｋ１、ＤＮＡポリメラーゼα（ＰｏｌＡ）、ＤＮＡポリメラーゼε（ＰｏｌＥ）、もしくはＤＮＡポリメラーゼδ（ＰｏｌＤ）の種々の組み合わせに対するコントロールｓｉＲＮＡ二重鎖でトランスフェクトした後のＣｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化を示すゲルのウェスタンブロットである。
【図３】図３は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）に対する特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖、またはＣｈｋ１、ＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）、ＤＮＡポリメラーゼε（Ｐｏｌε）、もしくはＤＮＡポリメラーゼδ（Ｐｏｌδ）の種々の組み合わせに対する特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖のトランスフェクション後の、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５およびＲＰＡ３２ Ｓ３３リン酸化を示すゲルのウェスタンブロットである。Ｒａｄ１７は、添加コントロールとして含められる。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｃｈｋ１、ＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）、ＤＮＡポリメラーゼε（Ｐｏｌε）、およびＤＮＡポリメラーゼδ（Ｐｏｌδ）に対するｓｉＲＮＡの種々の組み合わせと比較した場合、ヒドロキシ尿素ありまたはなしで（＋／− ＨＵ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクション後の、γ−Ｈ２ＡＸリン酸化の％（二本鎖ＤＮＡ破壊の尺度）のプロットである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、以下により詳細に記載されるように、低分子Ｃｈｋ１インヒビター（２．５μＭ，２時間）ありまたはなしで、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）もしくはＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）に対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞のＤＮＡ含有量に対するγ−Ｈ２ＡＸリン酸化のプロットである。未処理細胞およびＤＭＳＯ処理細胞をコントロールとして供する。
【図５】図５は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）に対するｓｉＲＮＡまたはＣｈｋ１、ＡＴＲ、ＡＴＭおよびＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）に対するｓｉＲＮＡの種々の組み合わせでのトランスフェクション後の、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化を示すゲルのウェスタンブロットである。Ｒａｄ１７は、添加コントロールとして含められる。
【図６】図６は、Ｃｈｋ１、ＡＴＲ、ＡＴＭおよびＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）に対するｓｉＲＮＡの種々の組み合わせでの処理と比較した場合、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）に対するコントロールｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後の、Ｈ２ＡＸリン酸化の％（二本鎖ＤＮＡ破壊の尺度）のプロットである。
【図７】図７は、抗Ｐｏｌαモノクローナル抗体ＳＪＫ−１３２−２０（Ｔａｎａｋａら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：８３８６）または陰性コントロールとしてＳＶ４０ Ｔ抗原に対するモノクローナル抗体（Ｐａｂ ４１９，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を使用する免疫沈降（ＩＰ）において、ＤＮＡポリメラーゼαでのＣｈｋ１およびＣｈｋ１ Ｓ３４５Ｐの免疫共沈降を示すゲルのウェスタンブロットである。結果は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、Ｃｈｋ１もしくはＡＴＲ（すべてヒドロキシ尿素ありまたはなし（＋／−ＨＵ））に対するｓｉＲＮＡで処理した細胞について示される。
【図８】図８は、抗Ｃｈｋ１モノクローナル抗体５８Ｄ７を使用する免疫沈降（ＩＰ）において、Ｃｈｋ１でのＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）およびＣｈｋ１ Ｓ３４５Ｐの免疫共沈降を示すゲルのウェスタンブロットである。結果は、ヒドロキシ尿素（ＨＵ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍ）またはゲムシタビンと、抗体５８Ｄ７に対する結合についてＣｈｋ１と競合する過剰のペプチド（コグネイト免疫原ＣＮＲＥＲＬＬＮＫＭＣＧＴＬＰＹＶＡＰＥＬＬＫＲＲＥＦ）（配列番号８）との組み合わせで処理した細胞、ならびに未処理（Ｕｎｔ）細胞について示される。
【図９】図９は、ＨＵでの処置の長さ（時間単位）の関数として、抗Ｐｏｌαモノクローナル抗体ＳＪＫ−１３２−２０（Ｔａｎａｋａら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：８３８６）を使用する免疫沈降（ＩＰ）において、ＤＮＡポリメラーゼαでのＣｈｋ１およびＣｈｋ１ Ｓ３４５Ｐの免疫共沈降を示すゲルのウェスタンブロットである。
【図１０】図１０は、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、Ｃｈｋ１もしくはＡＴＲに対するｓｉＲＮＡ（すべてヒドロキシ尿素ありまたはなし（＋／− ＨＵ））でのトランスフェクション後、Ｃｈｋ Ｓ３４５およびＲＰＡ３２ Ｓ３３リン酸化を示すゲルのウェスタンブロットである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書で引用される各特許、特許出願公開または他の刊行物（データベースエントリー（例えば、タンパク質配列および核酸配列）を含む）は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【００２９】
（Ｉ．定義）
上記でおよび本開示全体を通じて使用される場合、以下の用語は、別段示されなければ、以下の意味を有することが理解されるものとする。
【００３０】
「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「この、上記（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに別のことを示すのでなければ、それらの対応する複数の言及を含む。
【００３１】
別段示されなければ、「または、もしくは、あるいは（ｏｒ）」は、「および、ならびに（ａｎｄ）」を排除しない。例えば、「要素Ａまたは要素Ｂ」を記載する請求項は、Ａのみによる実施形態、Ｂのみによる実施形態、およびＡおよびＢの両方による実施形態を包含する。
【００３２】
「被験体」または「患者」とは、ヒトおよび動物の両方を含む。
【００３３】
「哺乳動物」とは、ヒトおよび他の哺乳動物を意味する。
【００３４】
「組成物」とは、特定の量において特定の成分を含む生成物、および直接的にもしくは間接的に特定の量において特定の成分の組み合わせから生じる任意の生成物を包含することが意図される。
【００３５】
「阻害する」または「処置する、処理する」もしくは「処置、処理」とは、増殖性障害と関連した症状の発生の遅延および／または発生することが予期されるこのような症状の重篤度の低下を包含する。従って、用語は、有益な結果が増殖性障害を有する脊椎動物被験体またはこのような障害もしくは症状を発生させる可能性を有する被験体に付与されたことを示す。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「治療上有効な量」または「有効量」とは、単独で、またはさらなる治療剤との組み合わせ（含有量に依存して）において細胞、組織もしくは被験体に投与される場合、増殖性障害を予防もしくは改善するに有効である薬剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼαもしくはＣｈｋ１のインヒビター）の量をいう。有効量はまた、診断を可能にするかもしくは促進するに十分な量を意味する。「治療上有効な用量」とは、症状の改善（例えば、関連する医学的状態の処置、治癒、予防もしくは改善、またはこのような状態の処置、治癒、予防もしくは改善の速度の増大）を生じるに十分な、薬剤の量をいう。特定の患者もしくは脊椎動物被験体にとって有効な量は、処置される状態、患者の全般的な健康状態、投与の経路および用量ならびに副作用の重篤度のような要因に依存して変動し得る（例えば、米国特許第５，８８８，５３０号明細書（Ｎｅｔｔｉらに対して発行）を参照のこと）。有効量は、顕著な副作用もしくは毒性効果を避ける最大用量もしくは投与プロトコルであり得る。上記効果は、少なくとも５％、通常は少なくとも１０％、より通常には少なくとも２０％、最も通常には少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、最も好ましくは、少なくとも６０％、理想的には、少なくとも７０％、より理想的には、少なくとも８０％、および最も理想的には少なくとも９０％だけ、診断尺度またはパラメーターの改善を生じる。ここで１００％は、正常の被験体によって示される診断パラメーターとして同定される（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら（１９９６）Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＳＯＰｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照のこと）。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「治療剤」とは、単独で、もしくは別の薬剤との組み合わせのいずれかで、望ましい治療効果、改善効果、阻害効果もしくは予防効果に寄与し得る薬剤である。このような「治療剤」とは、必ずしも、単独で投与される場合、任意の治療効力を有さなくてもよい。例えば、本発明のＤＮＡポリメラーゼαインヒビターまたは本発明のＣｈｋ１インヒビターは、別個に使用される場合、必ずしも治療的有用性を有しなくてもよいが、にもかかわらず、本発明の方法において一緒に使用される場合に治療的に有効であり得る。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、治療上有効な用量とは、その成分単独に言及する。組み合わせに適用される場合、治療上有効な用量とは、組み合わせて投与されようとそうでなかろうと、連続してまたは同時に治療的効果を生じる活性成分の組み合わせ量をいう。
【００３８】
「低分子」とは、１０ｋＤ未満、代表的には、２ｋＤ未満、しばしば１ｋＤ未満、好ましくは、０．７ｋＤ未満、および最も好ましくは、約０．５ｋＤ未満である分子量を有する分子として定義される。低分子としては、無機分子、有機分子、無機成分を含む有機分子、放射活性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模倣物、および抗体模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。治療剤として、低分子は、細胞に対してより透過性であり、分解に対して感受性が低く、かつ大きな分子より免疫応答を誘導しにくい可能性がある。低分子（例えば、抗体およびサイトカインのペプチド模倣物、ならびに低分子毒素）が記載されている（例えば、Ｃａｓｓｅｔら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０７：１９８−２０５；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７−３０２；Ｌｉ（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２５１−１２５６；Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：４１１−４２０；Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．８：２１８５−２１９９；Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓら（１９９９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：６５２−６５６；Ｓａｔｏ ａｎｄ Ｓｏｎｅ（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７１：６０３−６０８；米国特許第６，３２６，４８２号明細書（Ｓｔｅｗａｒｔらに対して発行）を参照のこと）。
【００３９】
「投与」および「処置」とは、動物、ヒト、実験的被験体、細胞、組織、器官もしくは生物学的流体に対して適用される場合、外因性の薬学的薬剤、治療剤、診断剤もしくは組成物を、上記動物、ヒト、被験体、細胞、組織、器官、もしくは生物学的流体に接触させることをいう。「投与」および「処置」とは、例えば、治療法、薬物動態学的方法、診断法、研究法および実験法に言及し得る。細胞の処理は、上記細胞への試薬の接触、および流体（ここでこの流体は上記細胞と接触している）への試薬の接触を包含する。「投与」および「処置」とはまた、例えば、細胞のインビトロおよびエキソビボ処置、試薬、診断組成物、結合組成物によるインビトロ処置およびエキソビボ処置、または別の細胞によるインビトロ処置およびエキソビボ処置を意味する。「処置」とは、ヒト、脊椎動物、または研究被験体に適用される場合、治療的処置、予防的手段、研究適用および診断適用をいう。「処置」とは、ヒト、脊椎動物、もしく研究被験体、または細胞、組織もしくは器官に適用される場合、本発明の治療剤の組み合わせと、ヒトもしくは動物被験体、細胞、組織、生理学的区画、または生理学的流体との接触を包含する。
【００４０】
別段示されなければ、薬剤によって引き起こされる「阻害」または「活性化」の程度は、タンパク質、遺伝子、細胞、細胞培養物、もしくは生物が阻害剤もしくは活性化剤で処理され、かつその結果が上記薬剤なしのコントロールサンプルと比較されるアッセイを使用して決定される。コントロールサンプル（すなわち、薬剤で処理されていない）は、１００％に対する相対活性値として割り当てられる。「阻害」とは、上記コントロールに対する活性値が約９０％未満、代表的には、８５％未満、より代表的には、８０％未満、最も代表的には、７５％未満、一般には、７０％未満、より一般には６５％未満、最も一般には、６０％未満、代表的には、５５％未満、通常５０％未満、より通常には４５％未満、最も通常には４０％未満、好ましくは、３５％未満、より好ましくは、３０％未満、さらにより好ましくは、２５％未満、および最も好ましくは、２５％である場合に、達成される。「活性化」とは、上記コントロールに対する活性値が、約１１０％、一般には少なくとも１２０％、より一般には少なくとも１４０％、より一般には少なくとも１６０％、頻繁には少なくとも１８０％、より頻繁には少なくとも２倍、最も頻繁には少なくとも２．５倍、通常は少なくとも５倍、より通常には少なくとも１０倍、好ましくは、少なくとも２０倍、より好ましくは、少なくとも４０倍、および最も好ましくは、４０倍より高い場合に達成される。
【００４１】
活性化または阻害におけるエンドポイントは、以下のようにモニターされ得る。処置に対する活性化、阻害、および応答（例えば、細胞、生理学的流体、組織、器官および動物もしくはヒト被験体のもの）は、エンドポイントによってモニターされ得る。上記エンドポイントは、例えば、炎症、腫瘍原性、または細胞顆粒喪失もしくは分泌（例えば、サイトカイン、毒性酸素、もしくはプロテアーゼの放出）のうちの１つ以上の徴候の所定の量もしくは割合を含み得る。上記エンドポイントは、例えば、イオンフラックスもしくは輸送の所定の量；細胞移動；細胞接着；細胞増殖；転移の可能性；細胞分化；および表現型の変化（例えば、炎症、アポトーシス、形質転換、細胞周期、もしくは転移に関する遺伝子の発現の変化を含み得る（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ（２０００）Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ ３０：１４５−１５８；Ｈｏｏｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２：９１−１００；Ｔｉｍｍｅら（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ４：２５１−２６１；Ｒｏｂｂｉｎｓ ａｎｄ Ｉｔｚｋｏｗｉｔｚ（２００２）Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．８６：１４６７−１４９５；Ｇｒａｄｙ ａｎｄ Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１−１２８；Ｂａｕｅｒら（２００１）Ｇｌｉａ ３６：２３５−２４３；Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ ａｎｄ Ｓａｔｏｈ（２０００）Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ．１０：１１３−１２６を参照のこと）。
【００４２】
阻害のエンドポイントは、一般には、コントロールの７５％以下、好ましくは、コントロールの５０％以下、より好ましくは、コントロールの２５％以下、および最も好ましくは、コントロールの１０％以下である。一般には、活性化のエンドポイントは、コントロールの少なくとも１５０％、好ましくは、コントロールの少なくとも２倍、より好ましくは、コントロールの少なくとも４倍、および最も好ましくは、コントロールの少なくとも１０倍である。
【００４３】
用語「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）、または「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」もしくは「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のようなバリエーションは、本明細書中および特許請求の範囲全体を通して使用される場合、任意の記載される要素または要素の群の包含、および記載される要素と類似または異なる性質の他の要素の選択肢的包含を示し、これらは、特定の投与レジメン、方法、もしくは組成物の基本的もしくは新規な特性を著しく変化させない。非限定的例として、記載されるアミノ酸配列から本質的になる結合化合物はまた、上記結合化合物の特性に著しく影響を及ぼさない１個以上のアミノ酸（１個以上のアミノ酸残基の置換を含む）を含み得る。
【００４４】
（抗体関連の定義）
本明細書で使用される場合、用語「抗体」とは、望ましい生物学的活性を示す抗体またはそのフラグメントの任意の形態をいう。従って、それは、その最も広義の意味において使用され、具体的には、それらが望ましい生物学的活性を示す限りにおいて、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、複数特異的抗体（例えば、二特異的抗体）、および抗体フラグメントを包含する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「抗原結合フラグメント」または「その結合フラグメント」とは、全長抗体の望ましい生物学的活性（例えば、ＤＮＡポリメラーゼαの阻害）をなお実質的に保持する抗体のフラグメントもしくは誘導体を包含する。従って、用語「抗体フラグメント」とは、全長抗体の一部分、一般には、その抗原結合領域もしくは可変領域をいう。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディー；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃ−Ｆｖ）；ならびに抗体フラグメントから形成される複数特異的抗体が挙げられる。代表的には、結合フラグメントもしくは誘導体は、その阻害活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは、結合フラグメントもしくは誘導体は、その生物学的活性の少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％もしくは１００％（またはそれ以上）を保持するが、望ましい生物学的効果を発揮するに十分なアフィニティーを有する任意の結合フラグメントが有用である。抗体の抗原結合フラグメントは、その生物学的活性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換を含み得ることもまた意図される。
【００４６】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均一の抗体（すなわち、微量に存在し得る考えられる天然に存在する変異を除いて、同一である集団を含む個々の抗体）の集団から得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗体エピトープに対して指向される。対照的に、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は、代表的には、異なるエピトープに対して指向される（または特異的である）複数の抗体を含む。修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を要するとみなされるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照のこと）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１において記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００４７】
本明細書のモノクローナル抗体は、それらが望ましい生物学的活性を示す限りにおいて、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種から得られるかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかもしくは相同である一方で、この鎖の残りが別の種から得られるかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかもしくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）およびこのような抗体のフラグメントを具体的には含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５）。
【００４８】
「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域もしくは軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。いくらかの場合において、２種以上のＶ_Ｈ領域は、二価ドメイン抗体を作製するためにペプチドリンカーで共有結合される。上記二価ドメイン抗体の２つのＶ_Ｈ領域は、同じ抗原を標的としてもよいし、異なる抗原を標的としてもよい。
【００４９】
「二価抗体」とは、２つの抗原結合部位を含む。いくつかの場合において、上記２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。しかし、二価抗体は、二特異的であり得る（以下を参照のこと）。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体とは、抗体のＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを含む抗体フラグメントであって、これらドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在するものをいう。一般に、上記Ｆｖポリペプチドは、上記ｓＦｖが抗体結合のための望ましい構造を形成することを可能にする、上記Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＯＦ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５を参照のこと。
【００５１】
本明細書のモノクローナル抗体はまた、ラクダ化した（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）単一ドメイン抗体を含む。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓら（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：２３０；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：２５；国際公開第９４／０４６７８号パンフレット；国際公開第９４／２５５９１号パンフレット；米国特許第６，００５，０７９号明細書（これらは、それら全体が本明細書に参考として援用される）を参照のこと。一実施形態において、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるように、改変を有する２つのＶ_Ｈドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、用語「ダイアボディー」とは、２つの抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントであって、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）をさらに含むもの（Ｖ_Ｈ−Ｖ_ＬまたはＶ_Ｌ−Ｖ_Ｈ）をいう。非常に短いので同じ鎖上で２つのドメイン間の追形成を可能にするリンカーを使用することによって、上記ドメインを、別の鎖の相補性ドメインと対形成させ、かつ２つの抗原結合部位を作製する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第４０４０９７Ｂ１号明細書；国際公開第９３／１１１６１号パンフレット；およびＨｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８においてより詳細に記載される。操作された抗体改変体の総説については、一般に、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１２６−１１３６を参照のこと。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト（例えば、マウス）抗体由来の配列およびヒト抗体由来の配列を含む抗体の形態をいう。このような抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含む。一般に、上記ヒト化抗体は、少なくとも１つの、および代表的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで上記超可変ループのすべてもしくは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応しかつＦＲ領域のすべてもしくは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。上記ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的には、ヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分を含む。齧歯類抗体のヒト化形態は、一般に、親齧歯類抗体の同じＣＤＲ配列を含むが、特定のアミノ酸置換が、上記ヒト化抗体のアフィニティーを増大させるかまたは安定性を増大させるために含められ得る。
【００５４】
本発明の抗体はまた、変化したエフェクター機能を提供するために、改変された（またはブロックされた）Ｆｃ領域を有する抗体を含む。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号明細書；国際公開第２００３／０８６３１０号パンフレット；国際公開第２００５／１２０５７１号パンフレット；国際公開第２００６／００５７７０２号パンフレット；Ｐｒｅｓｔａ（２００６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５８：６４０−６５６を参照のこと。このような改変は、診断および治療において考えられる有益な効果とともに、免疫系の種々の反応を増強または抑制するために使用され得る。Ｆｃ領域の改変としては、アミノ酸変化（置換、欠失および付加）、グリコシル化もしくは脱グリコシル化、および複数Ｆｃの付加が挙げられる。上記Ｆｃに対する変化はまた、治療的抗体における抗体半減期を変化させ得、そしてより長い半減期は、付随する増大した簡便性および材料の使用の減少とともに、投与頻度の減少を生じる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３４−３５の７３１を参照のこと。
【００５５】
用語「完全にヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体をいう。このような完全にヒト化抗体とは、トランスジェニックマウス、またはさらに他の動物を使用して生成され得る。例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１１７を参照のこと。完全にヒト抗体は、マウス、マウス細胞、またはマウス細胞由来のハイブリドーマにおいて生成される場合、マウス炭水化物鎖を含み得る。同様に、「マウス抗体」とは、マウス免疫グロブリン配列のみを含む抗体をいう。
【００５６】
「結合化合物」とは、標的に結合し得る分子、低分子、大分子、ポリペプチド、抗体またはフラグメントもしくはそのアナログ、あるいは可溶性レセプターをいう。「結合化合物」とはまた、イオン化分子、および共有的に改変されたもしくは非共有的に改変された分子（例えば、リン酸化、アシル化、架橋、環化、もしくは制限された切断によって改変される）に対する分子の複合体（例えば、非共有結合複合体）であって、標的に結合し得るものをいう。抗体に言及して使用される場合、用語「結合化合物」とは、抗体およびその結合フラグメントの両方をいう。「結合」とは、上記結合化合物は溶液中で溶解もしくは懸濁され得る場合に、上記結合化合物と標的との会合（ここでこの会合が、上記結合化合物の通常のブラウン運動の減少を生じる）をいう。「結合組成物」とは、安定化剤、賦形剤、塩、緩衝剤、溶媒、もしくは付加物と組み合わせて、標的に結合し得る分子（例えば、結合化合物）をいう。
【００５７】
ＩＩ．ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビターおよびＣｈｋ１のインヒビターとの併用療法
本明細書で開示される発明は、ＤＮＡポリメラーゼαおよびＣｈｋ１の特異的阻害によって、例えば、ＤＮＡポリメラーゼαおよびＣｈｋ１の特異的阻害を使用した、増殖性障害の処置のための方法および組成物に関する。
【００５８】
Ｃｈｋ１は、ＤＮＡ損傷に応じて活性化されている細胞周期チェックポイント制御またはより高等な真核生物における複製の引き留めにおける重要なエフェクターキナーゼである。Ｌｉｕら（２０００）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：１４４８；Ｓｏｒｅｎｓｅｎら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２４７；Ｓｙｌｊｕａｓｅｎら（２００５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２５：３５５３；Ｃｈｏら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４：１３１。代表的には、ＤＮＡ代謝拮抗物質で処理した細胞は、Ｓ期内チェックポイントの一部としてＣｈｋ１を活性化して、後期起点刺激（ｌａｔｅ ｏｒｉｇｉｎ ｆｉｒｉｎｇ）を制御しそして複製分岐の引き留めを安定化する。Ｆｅｉｊｏｏら（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５４：９１３；Ｃｈｏら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４：１３１。ＨＵは、ｄＮＴＰプールを除去して、ＤＮＡ複製を阻害するリボヌクレオチドレダクターゼインヒビターである。ゲムシタビンは、リボヌクレオチドレダクターゼを阻害するが、ＤＮＡに組み込まれた場合に、ＤＮＡ複製をまた阻害する。Ｓａｍｐａｔｈら（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２：９０６３。Ａｒａ−Ｃは、ＤＮＡに組み込まれかつ複製に関わるＤＮＡポリメラーゼを妨げるヌクレオシドアナログである。Ｔｏｗｎｓｅｎｄ ＆ Ｃｈｅｎｇ（１９８７）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３２：３３０；Ｍｉｋｉｔａ ＆ Ｂｅａｒｄｓｌｅｙ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：４６９８。図１は、代謝拮抗物質であるゲムシタビン（Ｇｅｍ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ，シトシンアラビノシド）、およびヒドロキシ尿素（ＨＵ）が、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化（これは、Ｃｈｋ１経路の活性化のマーカーである）を誘導することを確認する（Ｌｉｕら（２０００）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：１４４８；Ｚｈａｏ ＆ Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４１２９；Ｃａｐａｓｓｏら（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１５：４５５５）。
【００５９】
ＤＮＡ代謝拮抗物質は、ＤＮＡ合成の全般的抑制を介してそれらの効果を発揮するという事実に鑑みると、複製に関わるポリメラーゼの阻害は、Ｃｈｋ１経路の活性化を誘発し得ることが考えられた。この仮定を試験するために、特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖を使用して、ＤＮＡ複製ポリメラーゼα、εまたはδをＵ２０Ｓ細胞において特異的に除去した。これをその後、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化について試験した。
【００６０】
ｓｉＲＮＡによるＰｏｌαの除去は、残基Ｓ３４５でのＣｈｋ１リン酸化を誘導して、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５Ｐを生成することによって、代謝拮抗物質曝露を表現型コピーする。Ｐｏｌαの特異的除去は、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化を、ＨＵ処理の後に検出可能なものに類似のレベルまで誘導する（図２Ａ）。ＰｏｌεおよびＰｏｌδの除去は、これら条件下でＣｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化を促進しなかった（図２Ａ）。
【００６１】
ＰｏｌαおよびＣｈｋ１の組み合わせ除去は、Ｓ期内遅延およびＤＮＡ損傷の蓄積を生じる。図３〜６を参照のこと。ＰｏｌαとＣｈｋ１との間のこと遺伝的相互作用と一致して、Ｃｈｋ１は、Ｐｏｌαと免疫共沈降し、このことは、物理的相互作用を示唆する。図７〜８を参照のこと。ＰｏｌαおよびＡＴＲ（より低い程度にはＡＴＭ）の同時除去は類似の表現型を生じ、このことは、ＡＴＲおよびＣｈｋ１が上位でありかつ複製ストレス後にゲノム完全性の維持のために必要とされることを示唆する。複製ストレス後、Ｐｏｌα会合Ｃｈｋ１は、ＡＴＲ依存性様式において、Ｓ３４５で迅速にリン酸化される。顕著なことには、この文脈において効率的にＣｈｋ１をリン酸化する能力は、ＤＮＡ損傷の抑制と相関する。
【００６２】
本発明者らは次に、γ−Ｈ２Ａ．Ｘリン酸化（二本鎖ＤＮＡ破壊のマーカー）を試験した（Ｒｏｇａｋｏｕら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：５８５８；Ｎａｚａｒｏｖら（２００３）Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．１６０：３０９）。γ−Ｈ２Ａ．Ｘリン酸化は、細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって評価される場合、Ｐｏｌα除去細胞において中程度に増強され、３Ｎ集団において優先的に発現された。このことは、Ｓ期を通り抜けている細胞内のＤＮＡ損傷を示唆する（図２Ｂおよび図２Ｃ）。対照的に、ＰｏｌεおよびＰｏｌδ除去細胞は、γ−Ｈ２Ａ．Ｘの蓄積を示さなかった（図２Ｃ）。従って、Ｐｏｌαの特異的除去は、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化および軽度のＳ期内欠陥を誘導した。
【００６３】
図２Ｄは、Ｐｏｌα単独の除去が、ＰｏｌαとＰｏｌεまたはＰｏｌαとＰｏｌδの同時除去より多くのＣｈｋ１のリン酸化を誘導することを実証する。この驚くべき結果は、本発明において使用するための最も望ましいＤＮＡポリメラーゼαインヒビターがＰｏｌαに非常に特異的であるはずであり、特に、上記インヒビターがＰｏｌεの阻害より優先的なＰｏｌαの阻害を示すはずであることを示唆する。広い範囲のＤＮＡポリメラーゼインヒビター（例えば、アフィジコリン）は、本発明の方法および組成物において、ＤＮＡポリメラーゼα特異的薬剤としての使用に適していない。本発明の方法および組成物における使用に適したＤＮＡポリメラーゼα特異的インヒビターは、Ｐｏｌεと比較してＰｏｌαの活性を、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、７００倍、１０００倍以上の比率で、優先的に阻害する。この比率は、ＰｏｌεのＩＣ５０に対するＰｏｌαについての、問題の化合物のＩＣ５０（すなわち、半数阻害（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を達成するために必要とされる濃度）の比率として決定される。上記ＩＣ５０は、Ｏｓｈｉｇｅら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：２５９７；Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０８：２５６；Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３３６：５０９に記載されるように、標準的なＤＮＡポリメラーゼアッセイによって決定される。実施例８を参照のこと。
【００６４】
分裂酵母における遺伝的研究は、ＰｏｌαとＳ内チェックポイントとの間の関連を示唆した（Ｂｈａｕｍｉｋ ＆ Ｗａｎｇ（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：２１０７）。Ｘｅｎｏｐｕｓ抽出物中でも、Ｐｏｌαによって駆動されるＤＮＡ合成は、ＤＮＡ損傷後にＣｈｋ１の完全活性化に必要とされる（Ｂｙｕｎら（２００５）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．１９：１０４０）。
【００６５】
実施例４〜７に記載される結果は、Ｐｏｌαが、哺乳動物細胞において遺伝的に、生化学的にかつ機能的にＣｈｋ１と相互作用することを初めて明らかにする。さらに、この複合体内のＣｈｋ１活性の適切な制御は、主にＡＴＲによって、複製ストレス後のＤＮＡ損傷を抑制するために必要とされる。
【００６６】
これらの観察は、選択的チェックポイントアクチベーター（すなわち、ＤＮＡ Ｐｏｌαインヒビター）と選択的Ｃｈｋ１インヒビターとの組み合わせが相乗効果を生じることをさらに実証する。この予測される表現型は、複製分岐崩壊（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒｋ ｃｏｌｌａｐｓｅ）、ＤＮＡ損傷の蓄積およびアポトーシスの開始を含む。本発明は、ＰｏｌαおよびＣｈｋ１両方のインヒビター（例えば、治療剤）の使用を包含する、この二重の不活性化をもたらすための組成物および方法に関する。治療剤（例えば、薬剤）は、種々の疾患の処置において伝統的に使用されるが、Ｐｏｌαおよび／またはＣｈｋ１の活性を阻害する任意の方法は、このような阻害が治療剤、薬物、物質いずれの物質の投与もなく、もたらされるとしても、本発明の方法において使用され得る。
【００６７】
（Ｃｈｋ１依存性チェックポイント活性化におけるＰｏｌα、Ｐｏｌε、およびＰｏｌδの役割）
以前の研究は、Ｃｈｋ１が複製ストレスの間にＤＮＡ損傷を抑制し得ることを示した（Ｃｈｏら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４：１３１）。Ｃｈｋ１が同様に、Ｐｏｌα除去後にＤＮＡ損傷を抑制するために必要とされ得るという仮定を試験するために、本発明者らは、Ｐｏｌα、Ｐｏｌε、もしくはＰｏｌδとＣｈｋ１との同時除去後に、細胞におけるＤＮＡ損傷表現型を試験した。同様に、ＰｏｌαおよびＣｈｋ１の同時除去のみが、Ｐｏｌε／Ｃｈｋ１組み合わせおよびＰｏｌδ／Ｃｈｋ１組み合わせ、ならびにルシフェラーゼコントロールとは対照的に、ＲＰＡ３２リン酸化を引き起こした（図３）。同様に、ＦＡＣＳを使用したγ−Ｈ２Ａ．Ｘリン酸化の定量的試験によって、Ｐｏｌα／Ｃｈｋ１同時除去後の細胞の強染色集団が明らかになった（図４Ａ）。これら細胞は、約３Ｎ倍数性とともに蓄積し（ＰＩ染色によって評価される場合）、このことは、特異的Ｓ期内欠陥が、Ｐｏｌε／Ｃｈｋ１除去の後にも、Ｐｏｌδ／Ｃｈｋ１除去の後にも、コントロールｓｉＲＮＡ除去の後にも認められないことが示唆された（図４Ａ）。注意すべきは、そして代謝拮抗物質を使用する以前の観察と一致して（Ｃｈｏら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４：１３１）、Ｐｏｌα／Ｃｈｋ１の同時除去は、ＰｏｌαもしくはＣｈｋ１が単一で除去された細胞と比較して、有意に増強されたγ−Ｈ２Ａ．Ｘリン酸化を生じ（図４Ａ）、本発明の併用療法の相乗効果を示した。
【００６８】
図４Ｂは、Ｃｈｋ１の低分子インヒビター（３−アミノ−６−｛３−［（｛［４−（メチルオキシ）フェニル］メチル｝アミノ）カルボニル］フェニル｝−Ｎ−［（３Ｓ）−ピペリジン−３−イル］ピラジン−２−カルボキサミド）が、上記低分子Ｃｈｋ１インヒビターによる併用処置およびＰｏｌＡのｓｉＲＮＡ除去が、実質的二本鎖ＤＮＡ破壊を示す細胞の割合を、コントロールの１％未満から５０％超まで増大させる点で、特異的ｓｉＲＮＡ二重鎖でのＣｈｋ１の除去と同じ結果を生じることができることを実証する。
【００６９】
従って、Ｐｏｌαの特異的除去（しかしＰｏｌεでもＰｏｌδでもない）はＣｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化を誘導し、このことは、Ｃｈｋ１依存性チェックポイント活性化を示唆する。同様に、ＰｏｌαとＣｈｋ１との同時除去は、ＤＮＡ損傷マーカー（Ｈ２Ａ．Ｘ Ｓ１３９およびＲＰＡ３２ Ｓ３３）の蓄積を増強した。これら効果は、ＰｏｌεもしくはＰｏｌδが、Ｃｈｋ１により同時除去される場合に観察されなかった。このことは、応答プロフィールの特異性を示唆する。これらデータは、複製分岐点におけるＰｏｌα、Ｐｏｌε、およびＰｏｌδの異なる役割を示唆する。
【００７０】
ＡＴＲは、ＤＮＡ損傷もしくは複製ストレスに応じる、Ｃｈｋ１リン酸化の上流アクチベーターである（Ｌｉｕら（２０００）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：１４４８；Ｚｈａｏ ＆ Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４１２９）。Ｃｈｋ１は、Ｓｅｒ ３１７および３４５でリン酸化され、そして複製分岐の引き留めに応じて、ＡＴＲによって活性化される（Ｌｉｕら（２０００）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：１４４８；Ｈｅｋｍａｔ−Ｎｅｊａｄら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：１５６５．；Ｚｈａｏ ＆ Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４１２９）。従って、本発明者らは、Ｐｏｌα除去後のＣｈｋ１、ＡＴＲとＡＴＭとの間の上位関係を試験した。
【００７１】
ＡＴＲもしくはＡＴＭとＰｏｌαとの同時除去は、検出可能なＣｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化の蓄積を変化させなかった（すなわち、ホスホ−Ｓ３４５誘導は、Ｐｏｌαを単一で除去した細胞から調製された溶解物中で検出されたものに類似していた（図５）。このことは、ＡＴＲもしくはＡＴＭいずれかの非存在下で、Ｃｈｋ１の細胞性プールが活性化されることを示唆する。Ｐｏｌαの単一の除去は、ルシフェラーゼコントロールｓｉＲＮＡ、ＡＴＲ ｓｉＲＮＡもしくはＡＴＭ ｓｉＲＮＡについての０．２％、およびＣｈｋ１ ｓｉＲＮＡについての０．５％（図６）と比較して、トランスフェクトされた細胞のうちの４．８％においてγ−Ｈ２Ａ．Ｘの蓄積をもたらした。しかし、Ｐｏｌα／Ｃｈｋ１、Ｐｏｌα／ＡＴＲ、およびＰｏｌα／ＡＴＭの組み合わせｓｉＲＮＡノックダウンは、それぞれ、２１％、１４．６％および７．３％のγ−Ｈ２Ａ．Ｘ陽性画分を生じた（図６）。従って、Ｐｏｌα／ＡＴＲの組み合わせ除去は、いくらか低下した表現度を有するにも拘わらず、ＰｏｌαとＣｈｋ１との同時除去後に観察されたものと同様の表現型を生じた。Ｐｏｌα／ＡＴＭの組み合わせ除去は、Ｐｏｌα／ＡＴＲ組み合わせに対して減少したγ−Ｈ２Ａ．Ｘ表現型を生じた。γ−Ｈ２Ａ．Ｘシグナルは、Ｐｏｌαの単一の除去後に認められたものと比較してわずかに上昇していた。
【００７２】
全体的に、これら観察は、Ｃｈｋ１活性化（ＡＴＲによって主に駆動される）がＰｏｌαの除去後のＤＮＡ損傷の抑制に必須であることを示唆する。ＡＴＲもしくはＡＴＭいずれかの特異的除去は、Ｐｏｌαノックダウン後のＣｈｋ１ Ｓ３４５の総細胞性蓄積に対してほとんど認識できない影響を有した（図５）のに対して、複製ストレスの間のＤＮＡ損傷の機能的抑制は、ＡＴＲおよびＣｈｋ１を主に介して媒介されるようであるが、ＡＴＭからの寄与は、除外できない。
【００７３】
（Ｃｈｋ１ Ｓ３４５ＰとＰｏｌαとの物理的相互作用）
Ｐｏｌαと、Ｃｈｋ１、ＡＴＲとの間の強い遺伝的相互作用および機能的相互作用は、ＰｏｌαとＳ期内チェックポイント装置と、特異的にＣｈｋ１との間の直接的な生化学的相互作用の可能性を高めた。Ｐｏｌαは、ヒドロキシ尿素で前もって処理して、複製ストレスを誘導したＵ２０Ｓ細胞から免疫沈降した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット後に、Ｐｏｌα免疫複合体は、Ｃｈｋ１の容易に検出可能なレベルを含むことが分かった（図７）。ＰｏｌαとＣｈｋ１との間の会合は、ヒドロキシ尿素も、ＡＴＲも要しなかった。予測されるように、Ｃｈｋ１は、Ｃｈｋ１を除去した細胞から調製したＰｏｌα免疫沈降において検出できなかった。注意すべきは、ヒドロキシ尿素への曝露が、Ｐｏｌα免疫沈降物内で容易に検出可能なＣｈｋ１ Ｓ３４５の蓄積をもたらしたが、ＡＴＲを除去した細胞においてはそうでなかった（図７）。
【００７４】
補完的免疫沈降実験もまた行った。Ｃｈｋ１の免疫沈降、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットは、Ｃｈｋ１免疫複合体内の内因性Ｐｏｌαの存在を実証した（図８）。繰り返すと、Ｃｈｋ１との相互作用は本質的であるようであったのに対して、上記Ｃｈｋ１免疫複合体内のホスホ−Ｓ３４５の蓄積は、ＨＵもしくはＧＥＭへの曝露によって誘導された。コントロール実験を、抗Ｃｈｋ１抗体に対してコグネイト免疫原ペプチド（配列番号８）を競合させて行って、上記免疫沈降の特異性を確認した（図８）。
【００７５】
まとめると、これら免疫沈降の結果は、Ｃｈｋ１が増殖しつつある細胞においてＰｏｌαと会合し、そして上記チェックポイントエフェクターがそれらの潜在的標的のすぐ近くに存在することを示唆する、そうであるならば、この明らかに予め組み立てられた複合体は、上記複製チェックポイントの関与に対して迅速に応答するはずであることを予期し得る。Ｐｏｌα複合体におけるＣｈｋ１ Ｓ３４５蓄積の過程によって、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５応答が、試験される第１の時点（すなわち、０．５時間）で完了していることが明らかにされた（図９）。全体的に、これらデータは、Ｃｈｋ１がＰｏｌαと会合し、そしてＡＴＲ依存性様式で、複製ストレス（ヒドロキシ尿素）後のこの状況において迅速にリン酸化され得ることを示唆する。これら観察は、Ｐｏｌαと、Ｃｈｋ１、ＡＴＲとの間の遺伝的相互作用を示唆する上記機能的データと一致している。
【００７６】
全細胞抽出物の直接免疫ブロッティングは、Ｃｈｋ１およびＡＴＲがそれらそれぞれのｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後に除去されるのに対して、ＰｏｌαレベルはＣｈｋ１除去によっても、ＡＴＲ除去によっても本質的に影響を受けないことを確認した（図１０）。ルシフェラーゼ（コントロール）ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞において、ＨＵへの曝露は、これらの条件下での機能的Ｓ期内チェックポイントの存在と一致して、強いＣｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化および低レベルのＲＰＡ３２リン酸化を誘発した。Ｃｈｋ１ Ｓ３４５のレベルはまた、上記ＡＴＲ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞のＨＵ処理によって上昇したが、ＲＰＡ３２は、Ｃｈｋ１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＵ処理細胞に認められたものと同様に、高レベルでリン酸化された（図１０）。従って、ＨＵは、ＡＴＲの存在下でも非存在下でも、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５リン酸化の類似のレベルを誘導するが、ＤＮＡ損傷は、ＡＴＲが存在しない場合には増強される。全体的に、これら結果によって、ＨＵがＡＴＲの存在下または非存在下でＣｈｋ１ Ｓ３４５Ｐを誘導する（図１０）が、Ｐｏｌαに結合したＣｈｋ１がＳ３４５に対してリン酸化しない（図７）ことが明らかになる。ＨＵ誘導性ＤＮＡ損傷は、ＡＴＲが存在する場合にのみ抑制され（図１０）かつＣｈｋ Ｓ３４５ＰはＡＴＲが存在する場合にのみＰｏｌαと免疫沈降可能な複合体を形成する（図７）ので、複製ストレス後のＤＮＡ損傷の適切な抑制が、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５Ｐ−Ｐｏｌα複合体の形成に依存し、そしてこれら複合体がＤＮＡ損傷の抑制を担うことが考えられる。
【００７７】
ＩＩＩ．ＤＮＡポリメラーゼαインヒビター
ＤＮＡポリメラーゼαを阻害する任意の方法が、本発明の方法において使用され得、そしてＤＮＡポリメラーゼαを阻害し得る任意の薬剤が、本発明の組成物において使用され得る。本発明のＤＮＡポリメラーゼα特異的インヒビターは、例えば、ＰｏｌＡによってコードされる場合、他のＤＮＡポリメラーゼとは対照的に、上記真核生物性ＤＮＡポリメラーゼαのアルファ（α）鎖の特異的インヒビターである。ヒトＤＮＡポリメラーゼαに関する配列情報および他の関連データは、公のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０５８６３３およびＮＭ＿０１６９３７、ならびにＭｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃ ｉｎ Ｍａｎのアクセッション番号３１２０４０、ならびにＧｅｎｅＩＤ番号５４２２）において見いだされ得る。データベースエントリーは、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚウェブサイトで利用可能である。この情報は、大分子インヒビター（例えば、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡおよび抗体）の設計および生成において特に有用であり得る。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「特異的」とは、ＤＮＡポリメラーゼのサブタイプ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼアルファ（α）、ＤＮＡポリメラーゼベータ（β）、ＤＮＡポリメラーゼイプシロン（ε）およびＤＮＡポリメラーゼガンマ（γ））に関して選択的に結合することをいう。種々の実施形態において、上記ＤＮＡポリメラーゼα阻害は、ＤＮＡポリメラーゼεもしくはＤＮＡポリメラーゼδのＩＣ５０の１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１２分の１、１５分の１、２０分の１、２５分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１、１５０分の１、２００分の１、３００分の１、４００分の１、５００分の１、７００分の１、１０００分の１以下（すなわち、より有効）であるＩＣ５０で、ＤＮＡポリメラーゼαを阻害する特異的方法（または薬剤）を使用してもたらされる。他の実施形態において、上記ＤＮＡポリメラーゼα阻害は、ＤＮＡポリメラーゼεもしくはＤＮＡポリメラーゼδのＩＣ５０の１．５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、１２分の１、１５分の１、２０分の１、２５分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、１００分の１、１５０分の１、２００分の１、３００分の１、４００分の１、５００分の１、７００分の１、１０００分の１、またはそれ以下である（すなわち、より有効である）ＩＣ５０で、ＤＮＡポリメラーゼαおよびわずか１種の他のＤＮＡポリメラーゼを阻害する選択的方法（または薬剤）を使用してもたらされる。いくつかの、しかしすべてではないが実施形態において、上記ＤＮＡポリメラーゼインヒビターは、ＤＮＡポリメラーゼε以外のＤＮＡポリメラーゼαを優先的に阻害する。
【００７９】
なお別の実施形態において、他のＤＮＡポリメラーゼと比較した場合のＤＮＡポリメラーゼαの特異性は、ＩＣ５０以外のアフィニティー測定値（例えば、ミカエリス定数（Ｋｍ）、または会合（Ｋ_ａ）もしくは解離（Ｋ_ｄ）平衡結合定数）の比率によって測定される。各場合において、アフィニティーの比率は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、７００倍、１０００倍、またはそれ以上の範囲に及び得る。なおさらなる実施形態において、会合（ｋ_ａ）速度定数および解離（ｋ_ｄ）速度定数の比率が使用され得る。一実施形態において、上記速度定数または平衡結合定数は、表面プラズモン共鳴分光法を使用して（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）機器（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標） Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を使用して）決定される。ここでＤＮＡポリメラーゼα、または目的のインヒビターは、センサーチップ（例えば、センサーチップＣＭ−５（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標） Ｉｎｃ．））の表面に結合される。次いで、このセンサーチップは、標準的手順を用いて速度定数もしくは結合定数を決定するために、他の結合パートナーに曝される。例えば、Ｔｈｕｒｍｏｎｄら（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：５７４７を参照のこと。
【００８０】
ＤＮＡポリメラーゼα阻害活性および特異性を決定するための例示的方法が、本明細書に提供されており、そして他のものは、例えば、Ｔｏｇａｓｈｉら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：５８３；Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（２００１）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４：９８２；Ｏｓｈｉｇｅら（２００４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：２５９７；Ｋａｍｉｓｕｋｉら（２００４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：５３５５；Ｍｕｒａｋａｍｉ−Ｎａｋａｉ（２００４）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６７４：１９３；Ｋａｍｉｓｕｋｉら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３：４２１；Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３３９５７；Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０８：２５６；Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３３６：５０９において見いだされ得る。ＤＮＡポリメラーゼαに対する薬剤の特異性を決定するための例示的方法は、実施例８において提供されるが、当業者に公知の他の方法が使用され得る。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼαの特異的阻害は、低分子を使用してもたらされる。ＤＮＡポリメラーゼαの活性を優先的に阻害する例示的化合物としては、４−ヒドロキシ−１７−メチリンシステロール（Ｔｏｇａｓｈｉら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６：５８３）、糖脂質であるガラクトシルジアシルグリセロール（ＧＤＧ）（Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（２００１）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４：９８２）、パクリタキセル誘導体であるセファロマンニン（Ｏｓｈｉｇｅら（２００４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：２５９７）、デヒドロアルテヌシン（Ｋａｍｉｓｕｋｉら（２００４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：５３５５；Ｍｕｒａｋａｍｉ−Ｎａｋａｉ（２００４）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６７４：１９３；Ｋａｍｉｓｕｋｉら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６３：４２１；Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３３９５７）、６−（ｐ−ｎ−ブチルアニリノ）ウラシル（ＣＡＳ ２１３３２−９６−７）およびＮ２−（ｐ−ブチルフェニル）グアニン（ＣＡＳ ８３１７３−１４−２）（Ｒｏｃｈｏｗｓｋａら（１９８２）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，Ｇｅｎｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ６９９：６７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
ＤＮＡポリメラーゼαおよびＤＮＡポリメラーゼβの活性を優先的に阻害する例示的化合物としては、スルホ脂質化合物（例えば、スルホキノボシルジアシルグリセロール）（Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：５３７；Ｏｈｔａら（１９９９）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２２：１１１）およびパクリタキセル代謝拮抗物質タキシニン（ｔａｘｉｎｉｎｅ）（Ｏｓｈｉｇｅら（２００４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：２５９７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
ＤＮＡポリメラーゼαおよびＤＮＡポリメラーゼεの活性を優先的に阻害する例示的化合物としては、非環式ホスホノメトキシアルキルヌクレオチドアナログ（例えば、９−（２−ホスホノメトキシエチル）グアニンジホスフェートが挙げられるが、これに限定されない。Ｋｒａｍａｔａら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４９：１００５。
【００８４】
ＤＮＡポリメラーゼα、ＤＮＡポリメラーゼβおよびＤＮＡポリメラーゼλの活性を優先的に阻害する例示的化合物としては、レスベラトール（３，４，５−トリヒドロキシスチルベン）が挙げられるが、これに限定されない。Ｌｏｃａｔｅｌｌｉら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８９：２５９。レスベラトールは、Ｃｈｋ１を活性化することが示された。Ｔｙａｇｉら（２００５）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２６：１９７８。
【００８５】
他の、あまり特異的ではないＤＮＡポリメラーゼのインヒビターとしては、トリテルペンジカルボン酸であるｍｉｓｐｙｒｉｃ ａｃｉｄが挙げられる。Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（２００５）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：１５３４。
【００８６】
ＤＮＡポリメラーゼαを特異的に阻害すると以前は考えられていた特定の化合物（例えば、アフィジコリン）（例えば、Ｈａｒａｇｕｃｈｉら（１９８３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：１１９７を参照のこと）は、もともと考えられていたよりも特異的ではないことがその後示された。例えば、Ｋａｍｉｓｕｋｉら（２００４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：５３５５；Ｏｓｈｉｇｅら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２：２５９７；Ｐｏｐａｎｄａら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７３：２５９を参照のこと。このような化合物は、本発明の方法および組成物においてＤＮＡポリメラーゼα特異的インヒビターとして使用され得ないが、それら化合物は、本発明のＤＮＡポリメラーゼα特異的インヒビターおよびＣｈｋ１インヒビターと組み合わせて、さらなる薬剤（例えば、第３の薬剤）として使用され得る。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼαインヒビターは、約５０００ｎＭ、２０００ｎＭ、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭまたは０．１ｎＭ未満のＩＣ５０値を示す。
【００８８】
ＤＮＡポリメラーゼαを選択的に阻害するために使用され得るさらなる化合物としては、ｓｉＲＮＡ（例えば、配列番号３）（例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ（２００４）Ｎｅｗ．Ｅｎｇｌａｎｄ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５１：１７７２を参照のこと）、アンチセンスＲＮＡ、および抗体（イントラボディー（例えば、Ａｌｖａｒｅｚら（２０００）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０８１）を含む）が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼαに対する抗体は、Ｔａｎａｋａら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：８３８６およびＭｉｌｌｅｒら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１３４において開示される。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡに組み込まれ得ない選択的ＤＮＡポリメラーゼαインヒビターが使用される。このような組み込み不能なインヒビターは、ＤＮＡ合成の長期の停止を引き起こし得、チェックポイントの活性化を増強し、そしてＤＮＡポリメラーゼインヒビターと上記チェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）インヒビターとの間のより大きな相乗効果を作り出し得る。この増大した相乗効果は、異常に増殖しつつある細胞において優先的に、有糸分裂の分かれ目の誘導に対して増強した特異性を生じ得、従って、他の治療的アプローチと比較した場合に毒性を減少させ得る。
【００９０】
ＩＶ．Ｃｈｋ１インヒビター
Ｃｈｋ１を阻害する任意の手段は、本発明の方法において使用され得、そしてＣｈｋ１を阻害し得る任意の薬剤が、本発明の組成物において使用され得る。ヒトＣｈｋ１に関する配列情報および他の関連データは、公のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＭ＿００１２７４、ＡＡＨ０４２０２およびＮＰ＿００１２６５、ならびにＭｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎのアクセッション番号６０３０７８、ならびにＧｅｎｅＩＤ番号１１１１）において見いだされ得る。すべてのこれらデータベースエントリーは、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚウェブサイトで利用可能である。この情報は、大分子インヒビター（例えば、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡおよび抗体）の設計および生成において特に有用であり得る。
【００９１】
いくつかの実施形態において、Ｃｈｋ１を阻害するための方法（またはＣｈｋ１を阻害するための薬剤）は、他のプロテインキナーゼと比較してＣｈｋ１を特異的に阻害する。種々の実施形態において、上記Ｃｈｋ１は、ＩＣ５０で測定した場合に、他のプロテインキナーゼより１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、７００倍、１０００倍以上で阻害される。いくつかの（しかしすべてではない）実施形態において、上記他のプロテインキナーゼはＣＤＫ２である。いくつかの実施形態において、ＣＤＫ２のＩＣ５０に対するＣｈｋ１についての薬剤のＩＣ５０の比率は、式ＩＣ５０_ＣＤＫ２／ＩＣ５０_Cｈｋ１によって表される。いくつかの実施形態において、上記ＩＣ５０比率は、５倍、１０倍または５０倍である。例えば、米国特許出願公開第２００７／００８２９００号明細書を参照のこと。
【００９２】
なおさらなる実施形態において、他のプロテインキナーゼと比較した場合に、Ｃｈｋ１に対する特異性は、ＩＣ５０以外のアフィニティー測定値（例えば、ミカエリス定数（Ｋｍ）、または会合（Ｋ_ａ）もしくは解離（Ｋ_ｄ）平衡結合定数）の比率によって測定される。各場合において、アフィニティーの比率は、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、７００倍、１０００倍、またはそれ以上の範囲に及び得る。なおさらなる実施形態において、会合（ｋ_ａ）速度定数および解離（ｋ_ｄ）速度定数の比率が使用され得る。Ｃｈｋ１キナーゼ阻害活性および特異性を決定するための例示的方法は、本明細書に記載されており（実施例２および３）、そして他のものは、例えば、Ｌｙｎｅら（２００４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７：１９６２において見いだされ得る。Ｃｈｋ１インヒビターの速度定数および平衡結合定数を決定するための例示的方法は、ＤＮＡポリメラーゼαインヒビターに関して上記で議論されるように、表面プラズモン共鳴分光法を含む。
【００９３】
本発明の方法および組成物においてＣｈｋ１インヒビターとして有用であり得る化合物としては、例えば、米国特許第６，９１９，３４１号明細書および米国特許出願公開第２００５／０００９８３２号明細書に開示されるようなイミダゾピラジンが挙げられる。他の化合物としては、国際公開第２００５／０４７２９０号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／０９５６１６号明細書；国際公開第２００５／０３９３９３号パンフレット；国際公開第２００５／０１９２２０号パンフレット；国際公開第２００４／０７２０８１号パンフレット；国際公開第２００５／０１４５９９号パンフレット；国際公開第２００５／００９３５４号パンフレット；国際公開第２００５／００５４２９号パンフレット；国際公開第２００５／０８５２５２号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／００９８３２号明細書；米国特許出願公開第２００４／２２０１８９号明細書；国際公開第２００４／０７４２８９号パンフレット；国際公開第２００４／０２６８７７号パンフレット；国際公開第２００４／０２６３１０号パンフレット；国際公開第２００４／０２２５６２号パンフレット；国際公開第２００３／０８９４３４号パンフレット；国際公開第２００３／０８４９５９号パンフレット；国際公開第２００３／０５１３４６号パンフレット；米国特許出願公開第２００３／０２２８９８号明細書；国際公開第２００２／０６０４９２号パンフレット；国際公開第２００２／０６０３８６号パンフレット；国際公開第２００２／０２８８６０号パンフレット；ＪＰ（１９８６）６１−０５７５８７明細書；米国特許出願公開第２００６／０１０６０２３号明細書；Ｂｕｒｋｅら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．２７８：１４５０；およびＢｏｎｄａｖａｌｌｉら（２００２）Ｊ．Ｍｅｄ．Cｈｅｍ．４５：４８７５において開示されるものが挙げられる。
【００９４】
本発明の方法および組成物においてＣｈｋ１インヒビターとして有用であり得る化合物としてはまた、米国特許出願公開第２００７／００８２９００号明細書；同第２００７／００８３０４４号明細書；同第２００７／００８２９０１号明細書；同第２００７／００８２９０２号明細書；同第２００６／０１２８７２５号明細書；同第２００６／００４１１３１号明細書および同第２００６／００９４７０６号明細書として公開された共有に係る米国特許出願；ならびに米国特許第７，１９６，０９２号明細書において開示されるピラゾロピリミジンが挙げられる。
【００９５】
本発明の方法および組成物においてＣｈｋ１インヒビターとして有用であり得る化合物としてはまた、米国特許出願公開第２００７／０１０５８６４号明細書；および同第２００７／０１１７８０４号明細書として公開された共有に係る米国特許出願；ならびに米国特許出願第１１／７５８，２４３号明細書において開示されるイミダゾピラジンが挙げられる。
【００９６】
本発明の方法および組成物においてＣｈｋ１インヒビターとして有用であり得る化合物としてはまた、ＵＣＮ−０１（Ｍｉｚｕｎｏら（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５９：２５９）および構造的に関連した修飾インドールカルバゾール化合物Ｇｏ６９７６（Ｋｏｈｎら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：３１）、ＳＢ−２１８０７８およびスタウロスポリン（Ｊａｃｋｓｏｎら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：５６６；Ｚｈａｏら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４６６０９）、ＩＣＰ−１（Ｅａｓｔｍａｎら（２００２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１：１０６７）およびＣＥＰ−３８９１（Ｓｙｌｊｕａｓｅｎら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６４：９０３５；Ｓｏｒｅｎｓｅｎら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３：２４７）が挙げられる。Ｔａｏ ＆ Ｌｉｎ（２００６）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００６）６：３７７を参照のこと。
【００９７】
本発明の方法および組成物においてＣｈｋ１インヒビターとして有用であり得る化合物としてはまた、イソグラヌラチミド（Ｒｏｂｅｒｇｅら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：５７０１）；デブロモヒメニアルジシン（ＤＢＨ）（Ｃｕｒｍａｎら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１７９１４）；ピリドピリミジン誘導体ＰＤ０１６６２８５（Ｗａｎｇら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：８２１１；Ｌｉら（２００２）Ｒａｄｉａｌ Ｒｅｓ．１５７：３２２）；シトネミン（米国特許出願公開第２００２／００２２５８９号明細書；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（２００２）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．３０３：８５８）；米国特許出願公開第２００４／０３４０３８号明細書ならびに国際公開２００２／０７０４９４号パンフレット、国際公開第２００３／１０１４４４号パンフレットおよび国際公開第２００５／０７２７３３号パンフレットにおいて開示されるような種々のジアリール尿素；Ａ−６９０００２およびＡ−６４１３９７（Ｃｈｅｎら（Ｄｅｃ．１５，２００６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１９：２７８４−２７９４（２００６年１０月３日の印刷の前にインターネット上で公開）；ベンゾイミダゾールキノロン（例えば、ＣＨＲ １２４およびＣＨＲ ６００（Ｋｅｓｉｃｋｉら（２００４）２２８^ｔｈ ＡＣＳ Ｎａｔ’ｌ Ｍｔｇ．：ＭＥＤＩ−２２５；国際公開第２００４／０１８４１９号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／０２５６１５７号明細書））；三環式ジアゾピノインドロン（例えば、ＰＦ−００３９４６９１（国際公開第２００４／０６３１９８号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／００７５４９９号明細書））；Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ化合物ライブラリーからの３２個の種々の化合物（例えば、Ｌｙｎｅら（２００４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４７：１９６２）の図５において示されるもの）；フラノピリミジンおよびピロロピリミジン（Ｆｏｌｏｐｐｅら（２００５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４８：４３３２）；インドリノン（Ｌｉｎら（２００６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１６：４２１）；置換されたピラジン（国際公開第２００３／０９３２９７号パンフレット）；化合物ＸＬ８４４（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００２３４４８１）；ピリミジニルインダゾリルアミン（国際公開第２００５／１０３０３６号パンフレット）；ピラゾロピリミジン（国際公開第２００４／０８７７０７号パンフレット）；アミノピラゾール（国際公開第２００５／００９４３５号パンフレットおよび国際公開第２００２／０００６９５２号パンフレット）；２−ウレイドチオフェン（国際公開第２００３／０２９２４１号パンフレット；国際公開第２００５／０１６９０９号パンフレット）；ピリミジン（米国特許出願公開第２００４／０１８６１１８号明細書）；ピロロピリミジン（国際公開第２００３／０２８７２４３号パンフレット）；３−ウレイドチオフェン（国際公開第２００３／０２８７３１号パンフレット）；インデノピラゾール（国際公開第２００４／０８０９７３号パンフレット）；トリアゾロン（国際公開第２００４／０８１００８号パンフレット）；ジベンゾジアゼピノン（米国特許出願公開第２００４／２５４１５９号明細書）；大環式尿素（国際公開第２００５／０４７２９４号パンフレット）；ピラゾロキノリン（国際公開第２００５／０２８４７４号パンフレット）；ペプチドおよびペプチド模倣物（例えば、ＣＢＰ５０１（国際公開第２００１／０２１７７１号パンフレット；国際公開第２００３／０５９９４２号パンフレット）が挙げられる。Ｔａｏ ＆ Ｌｉｎ（２００６）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００６）６：３７７を参照のこと。
【００９８】
本発明の方法および組成物においてＣｈｋ１インヒビターとして有用であり得る化合物としてはまた、国際公開第２００５／０４７２９４号パンフレット；米国特許第６，７９７，８２５号明細書、同第６，８３１，１７５号明細書、および同第７，０５６，９２５号明細書；国際公開第２００４／０７６４２４号パンフレット；国際公開第２００４／０８０９７３号パンフレット；国際公開第２００４／０１４８７６号パンフレット；ならびに国際公開第２００３／０５１８３８号パンフレットにおいて開示されるものが挙げられる。
【００９９】
本発明の方法および組成物においてＣｈｋ１インヒビターとして有用であり得る化合物としてはまた、国際公開第２００４／１０８１３６号パンフレットおよび国際公開第２００４／０８７７０７号パンフレットにおいて開示されるものが挙げられる。
【０１００】
本発明の方法および組成物においてＣｈｋ１インヒビターとして有用であり得る化合物としてはまた、国際公開第２００６／０４８７４５号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／２５０８３６号明細書；国際公開第２００５／００９９９７号パンフレット；国際公開第２００５／００９４３５号パンフレット；国際公開第２００４／０６３１９８号パンフレット；国際公開第２００３／０９１２５５号パンフレット；および国際公開第２００３／０３７８８６号パンフレットにおいて開示されるものが挙げられる。
【０１０１】
本発明の方法および組成物においてＣｈｋ１インヒビターとして有用であり得る化合物としてはまた、米国特許第７，０６４，２１５号明細書；米国特許出願公開第２００５／２６１３０７号明細書、同第２００５／２５６１５７号明細書；国際公開第２００５／０４７２４４号パンフレット；国際公開第２００４／０１８４１９号パンフレット；および国際公開第２００３／００４４８８号パンフレットに開示されるものが挙げられる。
【０１０２】
本発明の方法および組成物においてＣｈｋ１インヒビターとして有用であり得る化合物としてはまた、米国特許第７，０６７，５０６号明細書；米国特許出願公開第２００３／００６９２８４号明細書；および国際公開第２００５／０２７９０７号パンフレットにおいて開示されるものが挙げられる。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、本発明のＣｈｋ１インヒビターは、約５０００ｎＭ、２０００ｎＭ、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭもしくは０．１ｎＭ未満のＩＣ５０値を示す。
【０１０４】
Ｃｈｋ１を選択的に阻害するために使用され得る核酸ベースの化合物としては、米国特許第６，２１１，１６４号明細書、同第６，６７７，４４５号明細書および同第６，８４６，９２１号；米国特許出願公開第２００４／００９７４４６号明細書および同第２００５／０１５３３９２５号明細書；ならびに国際公開２００３／０７０８８８号パンフレットおよび国際公開第２００１／０５７２０６号パンフレットにおいて開示されるような、ｓｉＲＮＡ（例えば、配列番号２）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
抗体（例えば、イントラボディー（例えば、Ａｌｖａｒｅｚら（２０００）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０８１））はまた、Ｃｈｋ１を選択的に阻害するために使用され得る。
【０１０６】
Ｖ．ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡを生成および使用するための方法は、例えば、米国特許第６，５０６，５５９号明細書（国際公開第９９／３２６１９号パンフレット）；同第６，６７３，６１１号明細書（国際公開第９９／０５４４５９号パンフレット）；同第７，０７８，１９６号明細書（国際公開第０１／７５１６４号パンフレット）；同第７，０７１，３１１号明細書および国際公開０３／７０９１４号パンフレット；国際公開第０３／７０９１８号パンフレット；国際公開第０３／７０９６６号パンフレット；国際公開第０３／７４６５４号パンフレット；国際公開第０４／１４３１２号パンフレット；国際公開第０４／１３２８０号パンフレット；国際公開第０４／１３３５５号パンフレット；国際公開第０４／５８９４０号パンフレット；国際公開第０４／９３７８８号パンフレット；国際公開第０５／１９４５３号パンフレット；国際公開第０５／４４９８１号パンフレット；国際公開第０３／７８０９７号パンフレット（米国特許は、関連するＰＣＴ公開とともに挙げられている）において開示される。遺伝子サイレンシングおよび治療的処置においてｓｉＲＮＡを使用するための例示的方法は、国際公開国際公開第０２／０９６９２７号パンフレット（ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦレセプター）；国際公開第０３／７０７４２号パンフレット（テロメラーゼ）；国際公開第０３／７０８８６号パンフレット（プロテインチロシンホスファターゼタイプＩＶＡ（Ｐｒｌ３））；国際公開第０３／７０８８８号パンフレット（Ｃｈｋ１）；国際公開第０３／７０８９５号パンフレットおよび国際公開第０５／０３３５０号パンフレット（アルツハイマー病）；国際公開第０３／７０９８３号パンフレット（プロテインキナーゼＣα）；国際公開第０３／７２５９０号パンフレット（Ｍａｐキナーゼ）；国際公開第０３／７２７０５号パンフレット（サイクリンＤ）；国際公開第０５／４５０３４号パンフレット（パーキンソン病）において開示される。ｓｉＲＮＡの治療的使用に関する例示的実験は、Ｚｅｎｄｅｒら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：７７９７；Ｐａｄｄｉｓｏｎら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９９：１４４３；およびＳａｈ（２００６）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．７９：１７７３において開示された。ｓｉＲＮＡ分子はまた、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００２５７６４７）および加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００３６３７１４）の臨床試験において使用される。
【０１０７】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉経路（Ｆｉｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６）を介して遺伝子サイレンシングを誘導するために使用される分子をいうために使用されるが、このようなｓｉＲＮＡ分子は、厳密にポリリボヌクレオチドである必要はなく、代わりに、治療剤としてその特性を改善するために、核酸に対して１種以上の改変を含み得る。このような薬剤は、ときおり、短い干渉核酸の代わりに「ｓｉＮＡ」といわれる。このような変化は、上記分子を「リボ」ヌクレオチドの定義の外に、形式的に変え得るが、にもかかわらず、このような分子は、本明細書で「ｓｉＲＮＡ」分子としていわれる。例えば、いくつかのｓｉＲＮＡ二重鎖は、各鎖上の３’側で突出するＴＴ（デオキシリボヌクレオチド）を有する１７〜２３塩基対（例えば、１９塩基対）ポリヌクレオチド二重鎖を形成するために対になる２つの１９〜２５ｎｔ（例えば、２１ｎｔ）の鎖を含む。ＲＮＡ干渉経路を介して遺伝子サイレンシングを誘導するために使用される核酸の他の改変体としては、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１１５４５３号明細書に開示されるように、ショートヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）が挙げられる。
【０１０８】
いくつかの遺伝子に対する例示的ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、配列番号１〜７において提供される（例えば、ＤＮＡ Ｐｏｌαに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３において提供される）が、他の配列は、これら遺伝子をサイレントにすることにおいて使用するためのｓｉＲＮＡ分子を生成するために使用され得る。上記ｓｉＲＮＡ二重鎖の反対の鎖の配列は、両方の鎖が２ヌクレオチドの３’突出を有するという但し書きつきで、単に上記センス鎖の逆相補鎖である。すなわち、「ｎ」個のヌクレオチド長のセンス鎖については、その反対の鎖は、上記３’末端において２個のさらなるヌクレオチドが付加されて突出を提供する、残基１〜（ｎ−２）個の逆相補鎖である。ｓｉＲＮＡセンス鎖は２個のＵ残基を上記３’末端に含む場合、その反対の鎖はまた、その３’末端において２個のＵ残基を含む。ｓｉＲＮＡセンス鎖が２個のｄＴ残基をその３’末端に含む場合、その反対の鎖はまた、その３’末端において２個のｄＴ残基を含む。
【０１０９】
ＶＩ．抗体の生成
モノクローナル抗体を生成するための任意の適切な方法が使用され得る。例えば、レシピエトは、上記ＤＮＡポリメラーゼαもしくはＣｈｋ１ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントで免疫され得る。任意の適切な免疫方法が、使用され得る。このような方法は、アジュバント、他の免疫刺激物質、反復される追加免疫、および１種以上の免疫経路の使用を包含し得る。誘発する抗原は、単一エピトープ、複数エピトープ、またはタンパク質全体単独で、あるいは当該分野で公知の１種以上の免疫原性増強薬剤との組み合わせであり得る。
【０１１０】
任意の適切な方法が、ＤＮＡポリメラーゼαまたはＣｈｋ１を阻害するために、望ましい生物学的特性を有する抗体を誘発するために使用され得る。種々の哺乳動物宿主（例えば、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなど）からモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製することが望ましい。このようなモノクローナル抗体を調製するための技術は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓら（編）ＢＡＳＩＣ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（第４版）Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ，ＣＡ、およびそこに引用される参考文献；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹにおいて見いだされ得る。従って、モノクローナル抗体は、当業者が精通している種々の技術によって得られ得る。代表的には、所望の抗原で免疫した動物由来の脾細胞は、通常は、骨髄腫細胞との融合によって不死化される。Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９を参照のこと。不死化のための代替法としては、エプスタインバーウイルス、癌遺伝子、またはレトロウイルスでの形質転換、あるいは当該分野で公知の他の方法が挙げられる。例えば、Ｄｏｙｌｅら（編．１９９４および定期的補遺）ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ：ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥＳ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと。単一の不死化細胞から生じるコロニーは、所望の特異性および上記抗原に対するアフィニティーの抗体の生成についてスクリーニングされ、そしてこのような細胞によって生成されるモノクローナル抗体の収量は、種々の技術（脊椎動物宿主の腹腔への注射を含む）によって増強され得る。あるいは、例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１によって概説される一般的プロトコルに従って、ヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離し得る。
【０１１１】
他の適切な技術は、ファージまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリーの選択を包含する。例えば、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５；およびＷａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４を参照のこと。本発明のポリペプチドおよび抗体は、改変ありまたはなしで使用され得る（キメラ抗体またはヒト化抗体を含む）。また、組換え免疫グロブリンが生成され得るか（Ｃａｂｉｌｌｙ 米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＱｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３を参照のこと）；またはトランスジェニックマウスにおいて作製され得る（Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６を参照のこと；Ａｂｇｅｎｉｘ技術およびＭｅｄａｒｅｘ（登録商標）技術もまた参照のこと）。
【０１１２】
キメラ抗体もまた企図される。本明細書において示されるように、代表的なキメラ抗体は、特定の種から得られるかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において対応する配列と同一であるかまたは相同である重鎖および／または軽鎖の一部分を含む一方で、上記鎖の残りは、それらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて、別の種から得られるかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにこのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一もしくは相同である（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５）。
【０１１３】
二重特異的抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）はまた、本発明の方法および組成物において有用である。本明細書で使用される場合、用語「二重特異的抗体」とは、少なくとも２つの異なる抗原性エピトープ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼαおよびＣｈｋ１）に対する結合特異性を有する抗体（代表的には、モノクローナル抗体）をいう。一実施形態において、上記エピトープは、同じ抗原に由来する。別の実施形態において、上記エピトープは、２つの異なる抗原に由来する。二重特異的抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、二重特異的抗体は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現を使用して、組換え生成され得る。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７を参照のこと。あるいは、二重特異的抗体は、化学的連結を使用して調製され得る。例えば、Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１を参照のこと。二重特異的抗体は、二重特異的抗体フラグメントを含む。例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４；Ｇｒｕｂｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８を参照のこと。
【０１１４】
ＶＩＩ．薬学的組成物および医薬
本発明の方法において使用するための薬学的組成物または滅菌組成物（または医薬）を調製するために、上記薬剤は、薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤と混合される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照のこと。ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビターおよびプロテインキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１キナーゼ）のインヒビターは、別個の薬学的組成物において別個の薬剤として投与され得るか、またはそれらは、単一の薬学的組成物において混合物として投与され得る。別個の薬剤として投与される場合、上記薬剤は、いずれの順でもまたは順番に投与され得る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼαインヒビターは、Ｃｈｋ１のインヒビターの投与の前、投与と同時または投与の後に投与され得る。２つの薬剤の投与は、上記処置レジメンのある部分については重複するかもしれないが、上記処置レジメンの他の部分については重複しないかもしれない。一実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼα特異的インヒビターは、Ｃｈｋ１インヒビターの投与の前に投与され、次いで、その投与と同時に投与される。
【０１１５】
治療剤またはその組み合わせの処方は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液もしくは懸濁液の形態において、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、もしくは安定剤と混合することによって調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を参照のこと）。
【０１１６】
本発明によって記載される化合物から薬学的組成物を調製するために、不活性の薬学的に受容可能なキャリアは、固体または液体のいずれかであり得る。固体形態の調製物としては、散剤、錠剤、分散性顆粒、カプセル剤、カシェ剤および坐剤が挙げられる。上記散剤および錠剤は、約５〜約９５％の活性成分から構成され得る。適切な固体キャリアは、当該分野で公知である（例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖もしくはラクトース）。錠剤、散剤、カシェ剤およびカプセル剤は、経口投与に適した固体投与形態として使用され得る。薬学的に受容可能なキャリアおよび種々の組成物の製造方法の例は、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（編），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（１９９０） Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａにおいて見いだされ得る。
【０１１７】
液体形態調製物としては、液剤、懸濁液およびエマルジョンが挙げられる。例としては、非経口注射のための水もしくは水−プロピレングリコール溶液、または経口液剤のための甘味剤および乳白剤の追加、懸濁剤および乳化剤が挙げられる。液体形態調製物はまた、鼻内投与のための液剤を含み得る。
【０１１８】
吸入に適したエアロゾル調製物は、薬学的に受容可能なキャリア（例えば、不活性の圧縮ガス（例えば窒素））との組み合わせで存在し得る、液剤および粉末形態の固体を含み得る。
【０１１９】
経口投与もしくは非経口投与のいずれかのための液体形態調製物に使用直前に変換することが意図される固体形態調製物もまた含まれる。このような液体形態は、液剤、懸濁液およびエマルジョンを含む。
【０１２０】
本発明の化合物はまた、経皮的に送達可能であり得る。経皮的組成物は、クリーム剤、ローション剤、エアロゾルおよび／またはエマルジョンの形態をとり得、そしてこの目的で、当該分野で従来からあるように、マトリックスの経皮的パッチもしくはレザバタイプに含められ得る。
【０１２１】
好ましくは、上記薬学的調製物は、単位投与形態であり得る。このような形態において、上記調製物は、上記活性成分の適切な量（例えば、所望の目的を達成するに有効な量）を含む適切な大きさの単位用量に細分される。
【０１２２】
調製物の単位用量中の活性化合物の量は、特定の適用および問題の特定の活性化合物の特性（例えば、アフィニティー、毒性もしくは薬物動態プロフィール）に従って、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ、好ましくは、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、より好ましくは、約１ｍｇ〜約２５ｍｇにまで変動または調節され得る。
【０１２３】
使用される実際の用量は、患者の要件および処置される状態の重篤度に依存して変動し得る。特定の状況のための適切な投与レジメンの決定は、当該分野の技術範囲内である。便宜上、合計一日用量は、必要に応じて、分割され得かつその日の間に少しずつ投与され得る。
【０１２４】
本発明の化合物および／またはその薬学的に受容可能な塩の投与の量および頻度は、患者の年齢、状態および大きさ、ならびに処置される症状の重篤度のような要因を考慮する主治医の判断に従って調節される。代表的な推奨される経口投与のための一日投与レジメンは、２〜４つの分割用量において、約１ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、好ましくは、１ｍｇ／日〜２００ｍｇ／日の範囲に及び得る。
【０１２５】
本発明に従うキットは、ＤＮＡポリメラーゼαまたはチェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）いずれか一方の少なくとも１つのインヒビター、または両方のインヒビターの組み合わせ、または上記薬剤の薬学的に受容可能な塩、溶媒和物、エステルもしくはプロドラッグの治療上有効な量、および薬学的に受容可能なキャリア、ビヒクルもしくは希釈剤を含み得るキットを使用し得る。上記キットは、必要に応じて、少なくとも１種のさらなる抗癌剤を含み得、ここで上記薬剤の量は、所望の治療的効果を生じる。
【０１２６】
本発明の治療的組成物の毒性および治療的有効性は、細胞培養物もしくは実験動物において標準的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために決定され得る。毒性効果と治療的効果との間の用量比は、治療指数であり、それは、ＬＤ_５０とＥＤ_５０との間の比率として表され得る。高い治療指数を示す治療的組み合わせが好ましい。これら細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方するにあたって使用され得る。このような化合物の投与量は、好ましくは、ほとんど毒性がないかまたは全く毒性がないＥＤ_５０を含む循環濃度範囲内にある。上記投与量は、使用される投与形態および投与経路に依存してこの範囲内で変動し得る。
【０１２７】
本発明の治療剤の投与様式は、特に重要ではない。適切な投与経路としては、例えば、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、または腸管投与；非経口送達（筋肉内注射、皮下注射、髄内注射、ならびに鞘内注射、直接的心室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射、または眼内注射が挙げられる）が挙げられ得る。
【０１２８】
治療剤のための投与レジメンの選択は、いくつかの要因に依存し、これら要因としては、上記薬剤の血清ターンオーバー速度もしくは組織ターンオーバー速度、症状のレベル、その実体の免疫原性、および生物学的マトリックス中の標的細胞の接近しやすさが挙げられる。好ましくは、投与レジメンは、副作用の許容可能なレベルと一致して、上記患者に送達される治療剤の量を最大化する。従って、送達される上記薬剤の量は、特定の薬剤および処置される状態の重篤度に一部依存する。抗体、サイトカインおよび低分子の適切な用量を選択するにあたってのガイダンスは、入手可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（編）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍら（１９９９）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３；Ｓｌａｍｏｎら（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９；Ｇｈｏｓｈら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２を参照のこと）。
【０１２９】
適切な用量の決定は、例えば、処置に影響を及ぼすために、または処置に影響を及ぼすと推定される当該分野で公知または推測されるパラメーターまたは因子を使用して、医師によってなされる。一般に、上記用量は、至適用量よりいくらか少ない量で始められ、そしてそれは、所望のもしくは最適な効果が任意のネガティブな副作用に対して成し遂げられるまで、その後少量ずつ増大される。重要な診断尺度としては、例えば、腫瘍組織の増殖速度の低下、または治療的有効性と関連する生体マーカーの変化の徴候が挙げられる。
【０１３０】
さらなる治療剤（例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射線）による同時投与もしくは処置のための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（編）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１０版，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｐｏｏｌｅ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（編）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ；Ｃｈａｂｎｅｒ ａｎｄ Ｌｏｎｇｏ（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡを参照のこと）。本発明の薬学的組成物はまた、他の免疫抑制剤または免疫調節剤を含み得る。任意の適した免疫抑制剤が使用され得る。これら免疫抑制剤としては、抗炎症剤、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス（すなわち、ＦＫ−５０６）、シロリムス、インターフェロン、可溶性サイトカインレセプター（例えば、ｓＴＮＲＦおよびｓＩＬ−１Ｒ）、サイトカイン活性を中和する薬剤（例えば、インフリキシマブ、エタナーセプト）、ミコフェノレートモフェチル、１５−デオキシスペルグアリン、サリドマイド、グラチラマー、アザチオプリン、レフルノミド、シクロホスファミド、メトトレキセートなどが挙げられるが、これらに限定されない。上記薬学的組成物はまた、光線療法および放射線療法のような他の治療的物理療法手段とともに使用され得る。
【０１３１】
ＶＩＩＩ．治療的用途
本明細書において開示される方法および組成物は、増殖性疾患（例えば、癌）、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、真菌性疾患、神経学的／神経変性障害、関節炎、炎症、抗増殖性疾患（例えば、眼の網膜症）、ニューロン疾患、脱毛症、心血管疾患および敗血症の治療において有用であり得る。これら疾患および障害の多くは、米国特許第６，４１３，９７４号明細書に列挙されている。
【０１３２】
より具体的には、本発明の方法および組成物は、種々の癌（以下が挙げられる（が、これらに限定されない）：癌腫（膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺（小細胞肺癌、非小細胞肺癌を含む）、頭頸部、食道、胆嚢、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺、前立腺、および皮膚（扁平上皮癌を含む）の癌腫が挙げられる）；リンパ系列の造血性腫瘍（白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞白血病、外套細胞リンパ腫、骨髄腫、およびバーキットリンパ腫を含む）；骨髄系列の造血性腫瘍（急性および慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群および前骨髄球性白血病を含む）；間葉起源の腫瘍（線維肉腫および横紋筋肉腫を含む）；中枢神経系および末梢神経系の腫瘍（星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および神経鞘腫を含む）；ならびに他の腫瘍（黒色腫、精上皮腫、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、濾胞性甲状腺癌およびカポジ肉腫を含む）の処置において有用であり得る。
【０１３３】
本発明の方法はまた、異常な細胞増殖を特徴とする任意の疾患プロセス（例えば、良性前立腺肥大、家族性大腸腺腫症、神経線維腫症、アテローム性動脈硬化症、肺線維症、関節炎、乾癬、糸球体腎炎、血管形成術もしくは脈管手術後の再狭窄、肥厚性瘢痕形成、炎症性腸疾患、移植拒絶反応（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、エンドトキシンショック、ウイルス性疾患および真菌感染）の処置において有用であり得る。
【０１３４】
本発明の方法は、アポトーシスを誘導または阻害し得る。上記アポトーシス応答は、種々のヒト疾患において異所性である。本発明の方法および組成物は、癌（本明細書中上記で言及されたタイプが挙げられるが、それらに限定されない）、ウイルス感染（ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、エプスタインバーウイルス、シンドビス・ウイルス、およびアデノウイルスが挙げられるが、これらに限定されない）、ＨＩＶ感染個体におけるＡIＤＳ発症の予防、自己免疫疾患（全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ）、紅斑性狼瘡、自己免疫媒介性糸球体腎炎、関節リウマチ、乾癬、炎症性腸疾患、および自己免疫糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない）、神経変性障害（アルツハイマー病、ＡＩＤＳ関連痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、脊髄性筋萎縮症および小脳変性症が挙げられるが、これらに限定されない）、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、心筋梗塞と関連する虚血性傷害、脳卒中および再灌流傷害、不整脈、アテローム性硬化症、毒素誘導性もしくはアルコール関連肝疾患、血液疾患（慢性貧血および再生不良性貧血が挙げられるが、これらに限定されない）、筋骨格系の変性疾患（骨粗鬆症および関節炎が挙げられるが、これらに限定されない）、アスピリン感受性副鼻腔炎、嚢胞性線維症、多発性硬化症、腎疾患および癌疼痛の処置において有用であり得る。
【０１３５】
本発明の方法および組成物はまた、癌の化学的予防において有用であり得る。化学的予防は、変異誘発性事象の開始をブロックすること、もしくは障害を既に受けた前癌細胞の進行をブロックすること、または腫瘍再発を阻害することのいずれかによって、侵襲性癌の発症を阻害することとして定義される。
【０１３６】
本発明の方法および組成物はまた、腫瘍脈管形成および転移を阻害することにおいて有用であり得る。
【０１３７】
本発明はまた、増殖性障害の処置のための医薬の製造における、ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビターおよびチェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）のインヒビターの使用に関する。
【０１３８】
（投与）
好ましい投与量は、約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日のＤＮＡポリメラーゼαのインヒビターもしくはチェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）のインヒビター、または上記インヒビターの各々の０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重／日である。特に好ましい投与量は、これらインヒビターのうちの一方または両方が約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ体重／日である。上記ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビターおよび上記チェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）のインヒビターは、同じ投与単位において、または別個の投与単位において存在し得る。
【０１３９】
（さらなる治療剤での併用療法）
本発明の治療剤はまた、１種以上の抗癌処置（例えば、放射線療法）、および／または１種以上のさらなる抗癌剤との組み合わせにおいて（一緒に投与されるか、またはいずれの順でも逐次的に）使用され得る。好ましい実施形態において、上記１種以上のさらなる抗癌剤は、上記αサブユニット以外のＤＮＡポリメラーゼのサブユニットを阻害しない。上記ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビター、上記チェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）のインヒビターおよび上記さらなる抗癌剤は、同じ投与単位において、または別個の投与単位において存在し得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物（例えば、ＤＮＡポリメラーゼαインヒビターおよびＣｈｋ１インヒビターを含む）は、同時にまたはいずれの順でも逐次的に、１種以上の薬剤（例えば、抗癌剤）と同時投与される。適切な抗癌剤の非限定的な例としては、細胞増殖抑制性薬剤、細胞傷害性薬剤（例えば、ＤＮＡ相互作用性薬剤（例えば、シスプラチンもしくはドキソルビシン）が挙げられるが、これらに限定されない）；タキサン（例えば、タキソテール、タキソール）；トポイソメラーゼＩＩインヒビター（例えば、エトポシド）；トポイソメラーゼＩインヒビター（例えば、イリノテカン（もしくはＣＰＴ−１１）、カンプトスター、またはトポテカン）；チューブリン相互作用性薬剤（例えば、パクリタキセル、ドセタキセルもしくはエポチロン）；ホルモン性薬剤（例えば、タモキシフェン）；チミジレートシンターゼインヒビター（例えば、５−フルオロウラシル）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート）；アルキル化剤（例えば、テモゾロミド（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，Ｎｅｗ ＪｅｒｓｅｙのＴｅｍｏｄａｒ（登録商標））、シクロホスファミド；ファルネシルプロテイントランスフェラーゼインヒビター（例えば、Ｓａｒａｒｓａｒ（登録商標）（４−［２−［４−［（１１Ｒ）−３，１０−ジブロモ−８−クロロ−６，１１−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［５，６］シクロヘプタ［１，２−ｂ］ピリジン−１１−イル−］−１−ピペリジニル］−２−オキソエチル］−１−ピペリジンカルボキサミド、またはＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，Ｎｅｗ ＪｅｒｓｅｙのＳＣＨ ６６３３６）、チピファルニブ（Ｊａｎｓｓｅｎ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＺａｒｎｅｓｔｒａ（登録商標）もしくはＲ１１５７７７）、Ｌ７７８，１２３（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙのファルネシルプロテイントランスフェラーゼインヒビター）、ＢＭＳ ２１４６６２（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙのファルネシルプロテイントランスフェラーゼインヒビター）；シグナル伝達インヒビター（例えば、Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）（Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｎｇｌａｎｄ製）、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）（ＥＧＦＲキナーゼインヒビター）、ＥＧＦＲに対する抗体（例えば、Ｃ２２５）、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ，Ｎｅｗ ＪｅｒｓｅｙのＣ−ａｂｌキナーゼインヒビター）；インターフェロン（例えば、イントロン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）、Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）；ホルモン治療併用；アロマターゼ併用；ａｒａ−Ｃ，アドリアマイシン、シトキサン、クロファラビン（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓのＣｌｏｌａｒ（登録商標））、ラドリビン（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ Ｌｔｄ．のＬｅｕｓｔａｔ（登録商標））、アフィジコリン、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ製）、スニチニブ（ＰｆｉｚｅｒのＳｕｔｅｎｔ（登録商標））、ダサチニブ（またはＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂのＢＭＳ−３５４８２５）、テザシタビン（Ａｖｅｎｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ製）、Ｓｍｌ１、フルダラビン（Ｔｒｉｇａｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ製）、ペントスタチン（ＢＣ Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｃｙ製）、トリアピン（Ｖｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ製）、ジドックス（Ｂｉｏｓｅｅｋｅｒ Ｇｒｏｕｐ製）、トリミドックス（ＡＬＳ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ製）、アミドックス、３−ＡＰ（３−アミノピリジン−２−カルボキシアルデヒドチオセミカルバゾン）、ＭＤＬ−１０１，７３１、（（Ｅ）−２’−デオキシ−２’−（フロロメチレン）シチジン）およびゲムシタビンが挙げられる。
【０１４１】
本発明の方法および組成物における併用療法において使用され得る他の抗癌剤（抗新生物薬としても公知）としては、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））、ロイコビリン、ペントスタチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、テニポシド、１７α−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン、ゴセレリン、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミソール、ナベルベン、アナストラゾール、レトロゾール、カペシタビン、レロキサフィン、ドロロキサフィン、ヘキサメチルメラミン、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（登録商標）、Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）、ビノレルビン、ポルフィマー、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、リポソーム、チオテパ、アルトレタミン、メルファラン、レトロゾール、フルベストラント、エキセメスタン、フルベストラント、イホスファミド、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）、Ｃ２２５、Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
固定用量として処方される場合、このような組み合わせ生成物は、本明細書に記載される投与量範囲内の本発明の化合物、および他の薬学的に活性な薬剤もしくはその投与量範囲内の処置を使用する。例えば、上記ＣＤＣ２インヒビターオロムシン（ｏｌｏｍｕｃｉｎｅ）を、アポトーシスを誘導するにあたって公知の細胞傷害性薬剤と相乗効果的に作用することが分かった（Ｏｎｇｋｅｋｏら（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０８：２８９７）。ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビターおよびチェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）のインヒビターはまた、例えば、組み合わせ処方が不適切である場合、公知の抗癌剤または細胞傷害性薬剤と連続して投与され得る。本発明は、投与の順に限定されない；ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビター、チェックポイントキナーゼ（例えば、Ｃｈｋ１）のインヒビター、および必要に応じて、さらなる抗癌剤もしくは細胞傷害性薬剤は、任意の順で投与され得る。例えば、サイクリン依存性キナーゼインヒビターフラボピリドールという上記細胞傷害性薬剤は、抗癌剤との投与の順によって影響を受ける。Ｂｉｂｌｅ ＆ Ｋａｕｆｍａｎｎ（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：３３７５。このような技術は、当業者および主治医の技術範囲内である。
【０１４３】
（患者の選択）
増殖性障害を有する任意の被験体が、本発明の方法および組成物を用いる処置について考慮に入れられ得るが、本発明の方法および組成物の使用に特に適した被験体は、Ｇ１／Ｓ複製チェックポイントの活性を阻害する変異もしくは他の機能的欠陥の存在または非存在に基づいて選択され得る。このような機能的欠陥の例としては、癌抑制遺伝子ｐ５３および網膜芽腫（Ｒｂ）癌抑制遺伝子の生成物の機能の非存在、低下または喪失を含む。ヒトｐ５３に関する配列情報および他の関連データは、公のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０００５３７、およびＭｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎのアクセッション番号１９１１７０、およびＧｅｎｅＩＤ Ｎｏ．７１５７において見いだされ得る。ヒトＲｂに関する配列情報および他の関連データは、公のデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿０００３１２、およびＭｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎのアクセッション番号１８０２００、およびＧｅｎｅＩＤ Ｎｏ．５９２５において見いだされ得る。データベースエントリーは、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚウェブサイトで利用可能である。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「非存在」および「低下」とは、癌抑制遺伝子産物またはその活性いずれかの物理的存在をいうが、活性は、上記遺伝子産物が物理的に存在しない場合において、必ず欠いている。細胞におけるこれら遺伝子のいずれか（または両方）の機能の喪失は、異常な増殖をもたらし得るが、本発明の方法および組成物に対する増強された感受性をももたらし得る。癌抑制遺伝子の機能の喪失は、転写（ＲＮＡ）レベルもしくは翻訳（タンパク質）レベルでの遺伝子発現の分析によって、または結合アッセイもしくは機能アッセイによって、測定され得る。転写のレベルは、例えば、関連転写物の定量的増幅（例えば、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析）、サザンブロットもしくはノーザンブロット、マイクロアッセイ、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）または当該分野で公知の任意の他の方法によって測定され得る。タンパク質発現のレベルは、例えば、イムノブロッティング（ウェスタンブロッティングを含む）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、二次元ゲル電気泳動または当該分野で公知の任意の他の方法によって測定され得る。癌抑制遺伝子における変異は、ＤＮＡ配列決定、ｃＤＮＡ配列決定、マイクロアレイ検出、適切な特異的試薬を用いるイムノブロッティング、結合アッセイもしくは機能アッセイまたは当該分野で公知の任意の他の方法によって決定され得る。ｐ５３の発現もしくは活性のレベルを決定するための例示的方法は、米国特許第５，５５２，２８３号明細書；同第６，０７１，７２６号明細書および同第６，１１０，６７１号明細書において見いだされる。Ｒｂの発現もしくは活性のレベルを決定するための例示的方法は、米国特許第５，５７８，７０１号明細書；同第５，６５０，２８７号明細書；同第５，８５１，９９１号明細書；同第５，９９８，１３４号明細書および同第６，８２１，７４０号明細書に見いだされる。
【０１４５】
被験体における癌抑制遺伝子産物の発現もしくは活性のレベルは、完全に機能的な癌抑制遺伝子を有する細胞もしくは組織（例えば、非腫瘍組織もしくは増殖性障害なしの被験体の組織）における発現の「正常」レベルと比較される。種々の好ましい実施形態において、問題の被験体におけるレベルに対する上記発現もしくは活性の正常レベルの比は、１．２、１．５、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００、５００もしくは１０００以上である。いくつかの実施形態において、被験体は、問題の被験体における（例えば、異常な増殖を示す組織（例えば、腫瘍もしくは他の癌性組織））発現もしくは活性のレベルに対する発現もしくは活性の正常レベルの比に基づいて、本発明の方法または組成物による処置に関して選択される。カットオフポイントとして選択される特定の比は、問題の組織が、実際に、望ましくない副作用の危険性を低下させるために、組織を、同じ被験体における他の組織より、本発明の方法もしくは組成物での処置に対して感受性にするに十分な癌抑制遺伝子産物発現もしくは活性の低下もしくは喪失を有することを確実にするように選択される。
【０１４６】
以下の例は、本発明の実施形態を示すために提供されるのであって、本発明を限定することを意図しない。本発明の多くの改変およびバリエーションは、当業者に明らかであるように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなくなされ得る。
【実施例】
【０１４７】
（実施例１：一般的方法）
分子生物学における標準的方法が記載される（Ｍａｎｉａｔｉｓら（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。標準的な方法はまた、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（これは、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、糖結合体（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、およびバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）を記載する）に見られる。
【０１４８】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製法が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。化学的分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、タンパク質のグリコシル化が記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１を参照のこと）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生成、精製、およびフラグメント化が記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，前出）。リガンド／レセプター相互作用を特徴づけるための標準的技術が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【０１４９】
フローサイトメトリーのための方法（蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を含む）が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第２版；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪを参照のこと）。例えば、診断用試薬として使用するために核酸（核酸プライマーおよびプローブを含む）、ポリペプチド、および抗体を改変するのに適した蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３）Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０１５０】
免疫系の組織学の標準的方法が記載されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編）（１９８６）Ｈｕｍａｎ Ｔｈｙｍｕｓ：Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｈｉａｔｔら（２０００）Ｃｏｌｏｒ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ；Ｌｏｕｉｓら（２００２）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：Ｔｅｘｔ ａｎｄ Ａｔｌａｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと）。
【０１５１】
例えば、抗原性フラグメント、リーダー配列、タンパク質折りたたみ、機能的ドメイン、グリコシル化部位、および配列アラインメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが入手可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ，Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ Ｃｏｒｐ．，Ｃｒｙｓｔａｌ Ｂａｙ，Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６：７４１−７４２；Ｍｅｎｎｅら（２０００）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｎｏｔｅ １６：７４１−７４２；Ｗｒｅｎら（２００２）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｂｉｏｍｅｄ．６８：１７７−１８１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３３：１７−２１；ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０を参照のこと）。
【０１５２】
細胞株、薬物、およびｓｉＲＮＡ処置物質および方法は、以下のとおりである。ヒトＵ２０Ｓ骨肉腫細胞を、１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、２００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、２００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、および３００μｇ／ｍｌ Ｌ−グルタミン（Ｃａｍｂｒｅｘ）を補充したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で増殖させる。ＨＵ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、１５時間にわたって、１ｍＭにて使用する。
【０１５３】
本明細書で使用されるｓｉＲＮＡ分子の配列は、表１に提供される。センス配列が提供される。ｓｉＲＮＡとして使用されるオリゴヌクレオチドを、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から得る。
【０１５４】
細胞を、Ｃｈｋ１に対する５０ｎＭ ｓｉＲＮＡ、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ＰｏｌＡ、ＰｏｌＥ、ＰｏｌＤ１に対する１００ｎＭ ｓｉＲＮＡ、および製造評者のプロトコルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用するＡＴＲ二重鎖でトランスフェクトする。
【０１５５】
フローサイトメトリー分析（例えば、ＤＮＡ損傷に関するγ−Ｈ２ＡＸ検出および細胞周期分析に関するＢｒｄＵ組み込み）を、以前に記載されるように行い（Ｃｈｏら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４：１３１）、ＦａｃｓＤＩＶＡソフトウェアを使用して、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析する。
【０１５６】
ｓｉＲＮＡノックダウンのウェスタンブロット分析を、以下のとおりに行う。細胞ペレットをトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、２×ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で溶解させる。タンパク質抽出物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（登録商標）−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌａｒｉｃａ，ＭＡ）への転写によって分離する。この研究において使用される抗体を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）（Ｐｏｌα、Ｐｏｌε、Ｐｏｌδ、Ｒａｄ１７）、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）（ｐＳ３４５−Ｃｈｋ１、ｐＴ６８−Ｃｈｋ２）、Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（Ｃｈｋ１）、およびＢｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）（ｐＳ３３−ＲＰＡ ３２）から得る。
【０１５７】
本明細書に記載される研究において使用されるさらなる抗体を、以下のように調製した。モノクローナル抗体（５８Ｄ７、１６Ｈ７）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスをヒトＣＨＫ１の活性化ループにまたがるペプチド（ＣＮＲＥＲＬＬＮＫＭＣＧＴＬＰＹＶＡＰＥＬＬＫＲＲＥＦ）（配列番号８）で免疫することによって惹起した。脾細胞を、ＳＰ２骨髄腫細胞株と融合した。反応性ハイブリドーマをＥＬＩＳＡによって同定し、ＣＨＫ１を免疫沈降する能力についてスクリーニングした。
【０１５８】
免疫沈降を以下のように行う。細胞ペレットを、ＬＴ２５０緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ−４０、１０％ グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、ホスファターゼインヒビターセットＩおよびＩＩの１：１００希釈液、ならびにプロテアーゼインヒビターカクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中で溶解する。タンパク質濃度を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて決定する。免疫沈降については、タンパク質溶解物（２ｍｇ）を、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇビーズに架橋した抗Ｐｏｌα（ＳＪＫ １３２−２０）抗体と４時間にわたって４℃でインキュベートした。ＳＶ４０ Ｔ抗原に対するＰａｂ４１９モノクローナルＡｂは、代表的には、陰性コントロールとして使用される。
【０１５９】
さらなる方法は、Ｃｈｏら（２００５）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ４：１３１において見いだされ得る。
【０１６０】
（実施例２：Ｃｈｋ１キナーゼアッセイ）
酵素供給源としてのバキュロウイルス発現系において発現される組換えＨｉｓ−ＣＨＫ１および基質としてＣＤＣ２５Ｃに基づいたビオチン化ペプチドを使用するインビトロシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）が記載されている。
【０１６１】
材料および試薬：
１）ＣＤＣ２５Ｃ Ｓｅｒ ２１６（下線を付した）Ｃ末端ビオチン化ペプチド基質（２５ｍｇ）を−２０℃で貯蔵し、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによってカスタム合成した：
ＲＳＧＬＹＲＳＰＳＭＰＥＮＬＮＲＰＲ−ビオチン（配列番号９）、２５９５．４ ＭＷ。ＣＤＣ２５Ｃに関する全配列情報は、ＮＰ＿００１７８１、およびＭｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎのアクセッション番号１５７６８０、およびＧｅｎｅＩＤ Ｎｏ．９９５において見いだされ得る。これらデータベースエントリーは、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚウェブサイト上で利用可能である。
【０１６２】
２）Ｈｉｓ−ＣＨＫ１、２３５μｇ／ｍＬ、−８０℃で貯蔵。
【０１６３】
３）Ｄ−ＰＢＳ（ＣａＣｌ_２およびＭｇＣｌ_２なし）：ＧＩＢＣＯ Ｃａｔ．＃ １４１９０−１４４。
【０１６４】
４）ＳＰＡビーズ：Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ） Ｃａｔ．＃ ＳＰＱ００３２：５００ｍｇ／バイアル
１０ｍｌのＤ−ＰＢＳを５００ｍｇのＳＰＡビーズに添加して、作業濃度５０ｍｇ／ｍｌを作製する。４０℃で貯蔵する。水和後２週間以内に利用する。
【０１６５】
５）ＧＦ／Ｂフィルターを接着した９６ウェル白色マイクロプレート：Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）Ｃａｔ．＃ ６００５１７７。
【０１６６】
６）Ｔｏｐ ｓｅａｌ−Ａ ９６ウェル接着フィルム：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）Ｃａｔ．＃ ６００５１８５。
【０１６７】
７）９６ウェル非結合白色ポリスチレンプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）Ｃａｔ．＃ ６００５１７７。
【０１６８】
８）ＭｇＣｌ_２：Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）Ｃａｔ．＃Ｍ−８２６６。
【０１６９】
９）ＤＴＴ：Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）Ｃａｔ．＃ Ｖ３１５５。
【０１７０】
１０）ＡＴＰ（４℃で貯蔵）：Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．＃Ａ−５３９４。
【０１７１】
１１）γ^３３Ｐ−ＡＴＰ、１０００〜３０００Ｃｉ／ｍＭｏｌ： Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃａｔ．＃ＡＨ９９６８。
【０１７２】
１２）ＮａＣｌ：Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．＃ＢＰ３５８−２１２。
【０１７３】
１３）Ｈ_３ＰＯ_４ ８５％ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔ．＃Ａ２４２−５００。
【０１７４】
１４）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０：Ｂｉｏ−Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ／Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）Ｃａｔ．＃１６−０１５Ｖ。
【０１７５】
１５）スタウロスポリン、１００μｇ：ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）Ｃａｔ．＃５６９３９７。
【０１７６】
１６）Ｈｙｐｕｒｅ細胞培養等級水、５００ｍＬ：ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）Ｃａｔ．＃ＳＨ３０５２９．０２。
【０１７７】
反応混合物：
１）キナーゼ緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０；１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２；１ｍＭ ＤＴＴ
２）Ｈｉｓ−ＣＨＫ１、ＭＷ約３０ｋＤａ、−８０℃で貯蔵。６ｎＭは、約５，０００ＣＰＭの陽性コントロールを得るために必要とされる。１プレート（１００ｒｘｎ）につき：８μＬの２３５μｇ／ｍＬ（７．８３μＭ）ストックを２ｍＬ キナーゼ緩衝液中で希釈する。これによって、３１ｎＭ混合物が作製される。２０μＬ／ウェルで添加する。これによって、６ｎＭの最終反応濃度が作製される。
【０１７８】
３）ＣＤＣ２５Ｃビオチン化ペプチド。ＣＤＣ２５Ｃを１ｍｇ／ｍＬ（３８５μＭ）ストックに希釈し、−２０℃で貯蔵する。１プレート（１００ｒｘｎ）につき：１０μＬの１ｍｇ／ｍＬペプチドストックを、２ｍｌ キナーゼ緩衝液中に希釈する。このことによって、１．９２５μＭ 混合物を得る。２０μＬ／ｒｘｎでを添加する。このことによって、３８５ｎＭの最終反応濃度が作製される。
【０１７９】
４）ＡＴＰミックス。１プレート（１００ｒｘｎ）につき：１０μＬの１ｍＭ ＡＴＰ（冷）ストックおよび２μＬ 新たな^３３Ｐ−ＡＴＰ（２０μＣｉ）を、５ｍｌ キナーゼ緩衝液中に希釈する。このことによって、２μＭ ＡＴＰ（冷）溶液が得られる；５０μｌ／ウェルで添加して、反応を開始する。最終反応濃度が１μＭ ＡＴＰ（冷）および０．２μＣｉ／ｒｘｎであるように、最終容積は、１００μｌ／ｒｘｎである。
【０１８０】
５）停止溶液：１プレート（１００ｒｘｎ）あたり、１０ｍＬ 洗浄緩衝液２（２Ｍ ＮａＣｌ １％ Ｈ_３ＰＯ_４）と１ｍＬ ＳＰＡビーズスラリー（５０ｍｇ）との混合物を調製する。１００μＬ／ウェルで添加する。
【０１８１】
６）洗浄緩衝液１：２Ｍ ＮａＣｌ。
【０１８２】
７）洗浄緩衝液２：２Ｍ ＮａＣｌ、１％ Ｈ_３ＰＯ_４。
【０１８３】
アッセイ手順：
【０１８４】
【化１】

１）化合物を、水／１０％ ＤＭＳＯ中で望ましい濃度に希釈する。これによって、ｒｘｎ中１％の最終ＤＭＳＯ濃度が得られる。１０μｌ／ｒｘｎで適切なウェルに分与する。１０μＬ １０％ ＤＭＳＯを陽性コントロールウェル（ＣＨＫ１＋ＣＤＣ２５Ｃ＋ＡＴＰ）および陰性コントロールウェル（ＣＨＫ１＋ＡＴＰのみ）に添加する。
【０１８５】
２）酵素を氷上で融解する−酵素をキナーゼ緩衝液中で適切な濃度に希釈し（反応混合物を参照のこと）、各ウェルに２０μｌを分与する。
【０１８６】
３）上記ビオチン化基質を氷上で融解し、キナーゼ緩衝液中で希釈する（反応混合物を参照のこと）。陰性コントロールウェルを除いて、２０μＬ／ウェルで添加する。代わりに、２０μＬ キナーゼ緩衝液をこれらウェルに添加する。
【０１８７】
４）ＡＴＰ（冷）および^３３Ｐ−ＡＴＰを、キナーゼ緩衝液中で希釈する（反応混合物を参照のこと）。５０μＬ／ウェルで添加して、上記反応を開始する。
【０１８８】
５）上記反応を室温で２時間継続させる。
【０１８９】
６）１００μＬの上記ＳＰＡビーズ／停止溶液を添加することによって反応を停止させ（反応混合物を参照のこと）、改修前に１５分間インキュベートする。
【０１９０】
７）ブランクのＰａｃｋａｒｄ ＧＦ／Ｂフィルタープレートを、真空フィルターデバイスに配置し（Ｐａｃｋａｒｄプレート採取器）、２００ｍＬ 水を吸引して、上記系をぬらす。
【０１９１】
８）ブランクを除外し、上記Ｐａｃｋａｒｄ ＧＦ／Ｂフィルタープレート中に入れる。
【０１９２】
９）上記反応物を、上記フィルタープレートを介して吸引する。
【０１９３】
１０）洗浄：各々２００ｍｌ洗浄；２Ｍ ＮａＣｌで１回；２Ｍ ＮａＣｌ／１％ Ｈ_３ＰＯ_４で１回。
【０１９４】
１１）フィルタープレートを１５分間乾燥させる。
【０１９５】
１２）ＴｏｐＳｅａｌ−Ａ接着剤をフィルタープレートの頂部に置く。
【０１９６】
１３）フィルタープレートを、Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンターで作動させる。
【０１９７】
設定：データモード：ＣＰＭ
放射性核種：マニュアルＳＰＡ：^３３Ｐ
シンチレーター：Ｌｉｑ／ｐｌａｓｔ
エネルギー範囲：低。
【０１９８】
ＩＣ５０決定：
用量応答曲線を、阻害性化合物の８点の連続希釈から、各々二連で生成される阻害データからプロットする。化合物濃度を、キナーゼ活性％に対してプロットし、処置サンプルのＣＰＭ÷未処理サンプルのＣＰＭによって計算する。ＩＣ５０値を生成するために、次いで、上記用量応答曲線を、標準的なシグモイド曲線に適合させ、ＩＣ５０値を、非線形回帰分析によって導出する。
【０１９９】
（実施例３：ＣＤＫ２アッセイ）
組換えサイクリンＥおよびＣＤＫ２を使用するインビトロシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）が記載されている。米国特許第７，０３８，０４５号明細書；米国特許出願公開第２００６／００３０５５５号明細書を参照のこと。サイクリンＥ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２２９）を、ｐＶＬ１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）へとＰＣＲによってクローニングし、５つのヒスチジン残基をアミノ末端に付加して、ニッケル樹脂での生成を可能にする。発現されるタンパク質は、約４５ｋＤａである。ＣＤＫ２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＣＡ４３８０７）を、ｐＶＬ１３９３へとＰＣＲによってクローニングし、ヘマグルチニンエピトープタグをカルボキシ末端に付加する（ＹＤＶＰＤＹＡＳ）（配列番号１０）。発現されるタンパク質は、約３４ｋＤａの大きさである。
【０２００】
サイクリンＥおよびＣＤＫ２を発現する組換えバキュロウイルスを、ＳＦ９細胞に、等しい感染多重度（ＭＯＩ＝５）で４８時間同時感染させる。細胞を、１０００ＲＰＭで１０分間の遠心分離によって回収し、次いで、ペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ４０、１ｍＭ ＤＴＴおよびプロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む、上記ペレット容積の５倍の溶解緩衝液中で、３０分間氷上で溶解する。溶解物を、１５０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、その上清を保持する。５ｍｌのニッケルビーズ（ＳＦ９細胞１Ｌにつき）を、溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で３回洗浄する。イミダゾールを上記バキュロウイルス上清に、最終濃度２０ｍＭにまで添加し、次いで、上記ニッケルビーズとともに４℃で４５分間インキュベートする。タンパク質を、２５０ｍＭ イミダゾールを含む溶解緩衝液で溶出する。溶出物を、２リットルのキナーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００μＭ オルトバナジン酸ナトリウムおよび２０％ グリセロールを含む）中で一晩透析する。酵素を、−７０℃でアリコートに分けて貯蔵する。
【０２０１】
サイクリンＥ／ＣＤＫ２キナーゼアッセイを、低タンパク質結合９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）において行う。酵素を、キナーゼ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、および０．１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウムを含む）中、最終濃度５０μｇ／ｍｌに希釈する。これらの反応において使用される基質は、Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ製）から得られるビオチン化ペプチドである。上記基質を氷上で融解し、キナーゼ緩衝液中、２μＭに希釈する。化合物を、１０％ ＤＭＳＯ中で望ましい濃度に希釈する。各キナーゼ反応について、２０μｌの５０μｇ／ｍｌ 酵素溶液（１μｇの酵素）および２０μｌの２μＭ 基質溶液を混合し、次いで、試験のために各ウェル中で１０μｌの希釈した混合物と合わせる。上記キナーゼ反応を、５０μｌの２μＭ ＡＴＰおよび０．１μＣｉの^３３Ｐ−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ製）を添加することによって開始する。上記反応を、室温で１時間行わせる。上記反応を、２００μｌの停止緩衝液（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および５ｍｇ／ｍｌ ストレプトアビジンおよびコーティングされたＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ製）を含む）を１５分間添加することによって停止させる。次いで、上記ＳＰＡビーズを、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．）を用いて、９６ウェルＧＦ／Ｂフィルタープレート（Ｐａｃｋａｒｄ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に捕捉する。非特異的シグナルを、上記ビーズを２Ｍ ＮａＣｌで２回、次いで、１％ リン酸含有２Ｍ ＮａＣｌで２回洗浄することによって除去する。次いで、上記放射活性シグナルを、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）９６ウェル液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を使用して測定する。
【０２０２】
ＩＣ５０値を以下のように決定する。用量応答曲線を、阻害性化合物の８点の連続希釈から、各々二連で生成される阻害データからプロットする。化合物濃度を、キナーゼ活性％に対してプロットし、処置サンプルのＣＰＭ÷未処理サンプルのＣＰＭによって計算する。ＩＣ５０値を生成するために、次いで、上記用量応答曲線を、標準的なシグモイド曲線に適合させ、ＩＣ５０値を、非線形回帰分析によって導出する。
【０２０３】
（実施例４：Ｐｏｌαの除去は、ＤＮＡ損傷の非存在下でＣｈｋ１ Ｓ３４５ リン酸化を誘導する）
図１は、代謝拮抗物質がＣｈｋ１リン酸化を誘導することを実証する。Ｕ２０Ｓ細胞を、処理しなかった（「−」）か、または１ｍＭ ＨＵ、５μＭ Ｇｅｍ、もしくは５μＭ Ａｒａ−Ｃで２時間処理した。細胞抽出物を調製し、ホスホ−Ｃｈｋ１ Ｓ３４５抗体でイムノブロットして、リン酸化Ｃｈｋ１（Ｃｈｋ１ Ｓ３４５）およびＣｈｋ１（添加コントロール）を示した。３種の代謝拮抗物質はすべて、Ｃｈｋ１活性化の指標であるＣｈｋ１の実質的リン酸化を誘導した。Ｌｉｕら（２０００）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１４：１４４８；Ｚｈａｏ ＆ Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１：４１２９；Ｃａｐａｓｓｏら（２００２）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１５：４５５５。
【０２０４】
図２Ａは、ｓｉＲＮＡによるＰｏｌαの除去が、ＨＵ処置によって誘導されるのと同様に、Ｃｈｋ１リン酸化を誘導するが、ＰｏｌεおよびＰｏｌδの除去が、Ｃｈｋ１リン酸化を実質的に誘導しないことを実証する。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４８時間後、抽出物を調製し、示された抗体でイムノブロットした。ＨＵ処理細胞を、回収前に１ｍＭ ＨＵで７時間処理した。
【０２０５】
図２Ｂおよび図２Ｃは、図２Ａに示されるもののようなサンプルについてのフローサイトメトリーの結果を提供する。γ−Ｈ２Ａ．Ｘリン酸化レベルおよびＤＮＡ含有量を、ＨＵありまたはなしで、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）に対するｓｉＲＮＡにより、またはＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）、ＤＮＡポリメラーゼε（Ｐｏｌε）、およびＤＮＡポリメラーゼδ（Ｐｏｌδ）に対するｓｉＲＮＡにより処理した細胞に対して測定した。ＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）に対するｓｉＲＮＡで処理した培養物およびＨＵ（およびコントロールｓｉＲＮＡ）で処理した培養物は、コントロール培養物および他のＤＮＡポリメラーゼに対するｓｉＲＮＡで処理した培養物と比較して、約１０倍多いＤＮＡ損傷を示す細胞を含んでいた。ＤＮＡ含有量の関数として細胞数を示すプロットも提供し、このプロットは、ＤＮＡポリメラーゼα（Ｐｏｌα）に対するｓｉＲＮＡで処理した培養物が、Ｓ期中期において増大した細胞割合を有し（図２Ｂおよび図２ＣにおけるＤＮＡ含有量軸で約３Ｎ、すなわち、約７５）、そしてＨＵ処理培養物が減少した割合の４Ｎ細胞を有することを実証する。これら結果は、試験される他のＤＮＡポリメラーゼに対するｓｉＲＮＡではなく、ＤＮＡポリメラーゼαに対するｓｉＲＮＡのみが、ＨＵ処理によって誘導されるのと同様に、ＤＮＡ損傷を誘導することを実証する。
【０２０６】
図２Ｄは、図２ＤがＰｏｌα、ＰｏｌεおよびＰｏｌδの組み合わせの同時除去についての結果を含むことを除いて、図２Ａのものと同様の実験結果を示す。図２Ａの場合と同様に、Ｐｏｌαの除去は、Ｃｈｋ１リン酸化を誘導する一方で、ＰｏｌεおよびＰｏｌδの除去は、Ｃｈｋ１リン酸化を誘導しないが、驚くべきことに、Ｐｏｌα／Ｐｏｌε（およびおそらくＰｏｌα／Ｐｏｌδ）の同時除去は、Ｐｏｌα単独の除去と同程度にまで、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５Ｐ形成を誘導しない。具体的には、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５Ｐのレベルは、Ｐｏｌαレーンの除去よりもＰｏｌα／Ｐｏｌεレーンの同時除去において遙かに低い一方で、Ｃｈｋ１（リン酸化されていない）のレベルは変化しない。
【０２０７】
（実施例５：ＰｏｌαおよびＣｈｋ１の同時除去は、Ｓ期内停止を誘導する）
細胞を、ＤＮＡポリメラーゼ単独、Ｃｈｋ１の除去との組み合わせにおける除去の関数として、Ｃｈｋ１およびＲＰＡ３２リン酸化について試験した。時間０において、細胞をＰｏｌＡ、ＰｏｌＥ、またはＰｏｌＤ特異的二重鎖で２４時間トランスフェクトし、続いて、Ｃｈｋ１特異的二重鎖を２４時間トランスフェクトした。４８時間目に、抽出物を調製し、示された抗体でイムノブロットした。図３は、Ｃｈｋ１およびＲＰＡ３２が、ＤＮＡポリメラーゼαに対するｓｉＲＮＡで処理した細胞においてリン酸化されていること、およびＲＰＡ３２リン酸化が細胞をＣｈｋ１およびＤＮＡポリメラーゼαの両方に対するｓｉＲＮＡ処理される場合に、顕著に増大されることを示す。示されるデータは、３回の独立した実験の平均を表す。
【０２０８】
図４Ａは、図３におけるデータを得るために使用されるものと同様のサンプルに関するＨ２ＡＸのリン酸化レベル（二本鎖ＤＮＡ破壊の尺度）を測定するフローサイトメトリーの結果を示す。結果は３回の独立した実験の平均であり、エラーバーは標準偏差を示す。ＨＵおよびＰｏｌα ｓｉＲＮＡは、コントロールサンプルと比較してＨ２Ａ．Ｘリン酸化を中程度に増大するが、Ｐｏｌαに対するｓｉＲＮＡおよびＣｈｋ１に対するｓｉＲＮＡの組み合わせは、Ｈ２Ａ．Ｘリン酸化を有意に増大させ、このことは、二本鎖ＤＮＡ破壊の誘導における２つの薬剤の相乗効果を実証する。
【０２０９】
図４Ｂは、Ｃｈｋ１の低分子インヒビター（３−アミノ−６−｛３−［（｛［４−（メチルオキシ）フェニル］メチル｝アミノ）カルボニル］フェニル｝−Ｎ−［（３Ｓ）−ピペリジン−３−イル］ピラジン−２−カルボキサミド）が、ＤＮＡポリメラーゼαに指向されるｓｉＲＮＡと組み合わせて使用される場合に、ｓｉＲＮＡ Ｃｈｋ１ノックダウンと同じ効果を有することを実証する。図４Ａと同様に、Ｃｈｋ１およびＤＮＡポリメラーゼα両方の阻害の組み合わせは、顕著なＤＮＡ損傷を有する細胞の割合の実質的増加をもたらす。まとめると、図４Ａおよび図４Ｂの結果は、本発明の併用療法のより付加的な効果を実証する。
【０２１０】
（実施例６：ＡＴＲおよびより低い程度には、ＡＴＭは、Ｐｏｌα媒介性Ｓ期内停止に必要とされる）
ＡＴＭおよびＡＴＲを、単独で、またはＰｏｌαの除去との組み合わせのいずれかで除去して、Ｐｏｌα媒介性細胞周期停止におけるそれらの役割を決定した。図５はその結果を示す。時間０では、２種のｓｉＲＮＡ（Ｐｏｌα／Ｃｈｋ１、Ｐｏｌα／ＡＴＲおよびＰｏｌα／ＡＴＭ）でトランスフェクトした細胞に、ＰｏｌＡに対する特異的二重鎖を２４時間トランスフェクトし、続いて、Ｃｈｋ１、ＡＴＲ、またはＡＴＭの特異的二重鎖を２４時間トランスフェクトした。他のサンプルに、示されたｓｉＲＮＡを２４時間トランスフェクトした。４８時間で、抽出物を調製し、示された抗体でイムノブロットした。ＡＴＲもしくはＡＴＭ単独の除去は、Ｃｈｋ１ リン酸化を誘導しなかったが、ＡＴＭとＰｏｌαおよびＡＴＲとＰｏｌαの同時除去は、Ｐｏｌα単独の除去と比較して、Ｃｈｋ１リン酸化を増大させなかった。
【０２１１】
図６は、図５を参照して記載されるのと同様のサンプルに対するＤＮＡ損傷（Ｈ２ＡＸリン酸化によって測定される場合）のプロットである。図４に示されるように、ＰｏｌαおよびＣｈｋ１の同時除去は、Ｈ２ＡＸリン酸化における実質的増大を生じる。ＰｏｌαとＡＴＲおよびＰｏｌαとＡＴＭの同時除去はまた、Ｈ２ＡＸリン酸化を増大させたが、Ｃｈｋ１との同時除去より少ない程度であった。その結果は３回〜６回の独立した実験の平均であり、エラーバーは、標準偏差を表す。
【０２１２】
（実施例７：ＰｏｌαおよびＣｈｋ１の物理的会合）
免疫沈降実験を、ＰｏｌαポリペプチドおよびＣｈｋ１ポリペプチドが複合体を形成するか否か、およびどのような環境下で形成するかを決定するために行った。細胞を、ルシフェラーゼ（コントロール）、Ｃｈｋ１もしくはＡＴＲに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。２４時間後、細胞を１ｍＭ ＨＵで１５時間処理したか、または処理しなかった。Ｐｏｌαを、ルシフェラーゼ（陽性コントロール）、Ｃｈｋ１（陰性コントロール）、およびプロテインＧに架橋したＰｏｌα抗体（ＳＪＫｌ ３２−２０）によるＡＴＲ除去細胞、およびコントロール非関連抗体（４１９）による細胞から免疫沈降させた。ウェスタンブロットを、抗Ｐｏｌα、抗Ｃｈｋ１、および抗Ｃｈｋ１ Ｓ３４５抗体を用いて行った（図７）。Ｃｈｋ１は、Ｐｏｌαと同時に免疫沈降し、このことは、それらが溶液中に複合体で存在することを示唆した。
【０２１３】
相互的な実験を行って、上記会合を確認した。ここでＣｈｋ１は、未処理Ｕ２０Ｓ細胞、またはＨＵ、ゲムシタビン、もしくはゲムシタビンと抗Ｃｈｋ１抗体のＣｈｋ１への結合をブロックするペプチドとで処理した細胞から調製した溶解物から免疫沈降した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ウェスタンブロットを、Ｐｏｌα、Ｃｈｋ１ Ｓ３４５ＰおよびCｈｋ１全体に対して特異的な抗血清で、連続的にプローブした（図８）。Ｐｏｌαは、未処理細胞および処理細胞からの溶解物中、Ｃｈｋ１と同時に免疫沈降した。
【０２１４】
Ｃｈｋ１リン酸化のＨＵ誘導の過程を、行った。Ｕ２０Ｓ細胞を、０．５時間、１時間、２時間および１５時間にわたってＨＵで処理し、タンパク質抽出物を、免疫沈降のために調製した。Ｐｏｌαを、プロテインＧに架橋したＰｏｌα抗体（ＳＪＫ １３２−２０）と免疫沈降した。ウェスタンブロットを、抗Ｐｏｌα抗体、抗Ｃｈｋ１抗体および抗Ｃｈｋ１ Ｓ３４５抗体を用いて行った（図９）。Ｃｈｋ１リン酸化は、最も速い時点ですら完了しており、Ｃｈｋ１およびＣｈｋ１ Ｓ３４５Ｐの両方が、Ｐｏｌαと同時に免疫沈降した。
【０２１５】
図１０は、抗Ｐｏｌα抗体、抗ＡＴＲ抗体、抗Ｃｈｋ１抗体、抗Ｃｈｋ１ Ｓ３４５Ｐ抗体、および抗ＲＰＡ３２ Ｓ３３抗体を用いたウェスタンブロットに供した、全細胞抽出物を示す。
【０２１６】
（実施例８：ＤＮＡポリメラーゼα特異性）
他のＤＮＡポリメラーゼと比較した場合、ＤＮＡポリメラーゼαの阻害の特異性は、ＤＮＡポリメラーゼαの阻害と、他のＤＮＡポリメラーゼの阻害とを類似の条件下で比較することによって決定され得る。阻害剤の場合、上記薬剤は、ＤＮＡポリメラーゼアッセイにおいて力価測定されて、特定のレベルの阻害を達成するために必要な濃度（例えば、５０％（ＩＣ５０））が決定され得る。
【０２１７】
ＤＮＡポリメラーゼの阻害を決定するための例示的アッセイは、放射活性ヌクレオチドの組み込みの測定による。例えば、Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０８：２５６；Ｍｉｚｕｓｈｉｎａら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３３６：５０９を参照のこと。ＤＮＡポリメラーαの阻害は、以下のように、ＤＮＡポリメラーゼεの阻害と比較され得る。
【０２１８】
哺乳動物ＤＮＡポリメラーゼαおよびεを、従来の方法によって仔牛胸腺から調製する。例えば、Ｐｏｄｕｓｔら（１９９２）Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ １０２：Ｓ１３３；Ｆｏｃｈｅｒら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１８０５を参照のこと。
【０２１９】
標準的な混合物（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ ジチオスレイトール、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５μＭ ポリ（ｄＡ）／オリゴ（ｄＴ）_{１２〜１８}（＝２／１）、１０μＭ ［^３Ｈ］ｄＴＴＰ（１００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、１５％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび０．０５単位のＤＮＡポリメラーゼを含む）を、各ポリメラーゼについて調製する。ポリメラーゼ活性１単位は、１ｎｍｏｌのデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、合成テンプレートプライマー（すなわち、ポリ（ｄＡ）／オリゴ（ｄＴ）_{１２〜１８}、Ａ／Ｔ（＝２／１））へ、６０分間、３７℃で通常の反応条件下で組み込むのを触媒する量として定義される。このポリメラーゼ混合物の２４μｌを、８μｌの（推定）ポリメラーゼインヒビター溶液（上記インヒビターを可溶化するに適した緩衝液もしくは溶媒を含む）と混合する。各インヒビターについて経験的に決定した異なる濃度のインヒビターを含む一連のサンプルを使用して、阻害されていないレベルの５０％にまでポリメラーゼ活性を阻害するのに必要とされる濃度（ＩＣ５０）を決定する。コントロールサンプル（上記インヒビターの代わりに、８μｌの上記緩衝液もしくは溶媒を含む）を使用して、上記インヒビターおよび／もしくは溶媒が、上記反応混合物中で上記ＤＮＡポリメラーゼの活性をブロックしないことを確実にする。
【０２２０】
３７℃で６０分間のインキュベーション後、上記放射活性ＤＮＡ産物を、Ｌｉｎｄａｈｌら（１９７０）Ｓｃｉｅｎｃｅ １７０：４４７によって記載されるように、ＤＥＡＥ−セルロースペーパーディスク（ＤＥ８１）上に集める。上記ディスクに結合した放射活性をシンチレーションカウンターで、シンチレーション液中で測定する。そのＩＣ５０を、両方のＤＮＡポリメラーゼに対する各推定インヒビターについて決定する。これらＩＣ５０の比は、どのインヒビターがＤＮＡポリメラーゼαに対して特異的であるとみなされるかを決定する。
【０２２１】
本明細書で言及される配列番号は、表１に列挙される。
【０２２２】
【表１−１】

【０２２３】
【表１−２】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性障害を処置するための方法であって、該方法は、
ＤＮＡポリメラーゼαの活性を阻害する工程；および
少なくとも１種のチェックポイントキナーゼの活性を阻害する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記チェックポイントキナーゼはＣｈｋ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体における増殖性障害を処置するための方法であって、該方法は、
該被験体に、ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビターを投与する工程;および
該被験体に、少なくとも１種のチェックポイントキナーゼのインヒビターを投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
前記チェックポイントキナーゼはＣｈｋ１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡポリメラーゼαの阻害は、ＤＮＡポリメラーゼεの阻害より少なくとも１０倍高い、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡポリメラーゼαインヒビターは、４−ヒドロキシ−１７−メチリンシステロール（ｍｅｔｈｙｌｉｎｃｉｓｔｅｒｏｌ）、ガラクトシルジアシルグリセロール、セファロマンニン（ｃｅｐｈａｌｏｍａｎｎｉｎｅ）、デヒドロアルテヌシン（ｄｅｈｙｄｒｏａｌｔｅｎｕｓｉｎ）、６−（ｐ−ｎ−ブチルアニリノ）ウラシルおよびＮ２−（ｐ−ブチルフェニル）グアニンからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡポリメラーゼαインヒビターは、セファロマンニンおよびデヒドロアルテヌシンからなる群より選択される．請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｃｈｋ１インヒビターは、ピラゾロピリミジン、イミダゾピラジン、ＵＣＮ−０１、インドールカルバゾール化合物、Ｇｏ６９７６、ＳＢ−２１８０７８、スタウロスポリン、ＩＣＰ−１、ＣＥＰ−３８９１、イソグラヌラチミド（ｉｓｏｇｒａｎｕｌａｔｉｍｉｄｅ）、デブロモヒメニアルジシン（ｄｅｂｒｏｍｏｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ）（ＤＢＨ）、ピリドピリミジン誘導体、ＰＤ０１６６２８５、シトネミン（ｓｃｙｔｏｎｅｍｉｎ）、ジアリール尿素、ベンゾイミダゾールキノロン、ＣＨＲ １２４、ＣＨＲ ６００、三環式ジアゾピノインドロン、ＰＦ−００３９４６９１、フラノピリミジン、ピロロピリミジン、インドリノン、置換されたピラジン、化合物ＸＬ８４４、ピリミジニルインダゾリルアミン（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌｉｎｄａｚｏｌｙａｍｉｎｅ）、アミノピラゾール、２−ウレイドチオフェン、ピリミジン、ピロロピリミジン、３−ウレイドチオフェン、インデノピラゾール、トリアゾロン（ｔｒｉａｚｌｏｎｅ）、ジベンゾジアゼピノン、大環状尿素、ピラゾロキノリン（ｐｙｒａｚｏｌｏｑｕｉｎｏｌｏｉｎｅ）、およびペプチド模倣物ＣＢＰ５０１からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃｈｋ１インヒビターは、ピラゾロピリミジンまたはイミダゾピラジンからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホルアミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ロイコビリン（ｌｅｕｃｏｖｉｒｉｎ）、オキサリプラチン（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＦｒａｎｃｅのＥｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））、ペントスタチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、テニポシド、１７α−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン、ゴセレリン、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミソール、ナベルベン、アナストラゾール、レトロゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、カペシタビン、レロキサフィン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、ドロロキサフィン（ｄｒｏｌｏｘａｆｉｎｅ）、ヘキサメチルメラミン、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）、Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、Ｔｒｉｓｅｎｏｘ（登録商標）、Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）、ビノレルビン、プロフィマー（ｐｒｏｆｉｍｅｒ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ）、チオテパ、アルトレタミン、メルファラン、レトロゾール（ｌｅｒｏｚｏｌｅ）、フルベストラント、エキセメスタン、フルベストラント、イホスファミド、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）、Ｃ２２５およびＣａｍｐａｔｈ（登録商標）からなる群より選択される抗癌剤を前記被験体に投与する工程をさらに包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記増殖性障害は、癌、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、真菌性疾患、神経学的／神経変性障害、関節炎、炎症、抗増殖性疾患、ニューロン疾患、脱毛症、心血管疾患または敗血症である、請求項１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記疾患は癌である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌は、膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、頭頸部、食道、胆嚢、卵巣、膵臓、胃、子宮頚、甲状腺、前立腺、および皮膚の癌、扁平上皮癌；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞白血病、外套細胞リンパ腫、骨髄腫、バーキットリンパ腫；急性および慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、前骨髄球性白血病；線維肉腫、横紋筋肉腫； 星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および神経鞘腫；黒色腫、精上皮腫、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、濾胞性甲状腺癌およびカポジ肉腫からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
放射線療法をさらに含む、請求項１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡポリメラーゼαインヒビター；および
Ｃｈｋ１インヒビター
を含む、増殖性障害の処置のための組成物。
【請求項１６】
前記被験体における前記増殖性障害が、ｐ５３遺伝子産物もしくはＲｂ遺伝子産物の機能の低下または喪失を伴うか否かを決定する工程；および
前記インヒビターを、処置されるべき前記増殖性障害が前記ｐ５３遺伝子産物もしくはＲｂ遺伝子産物のうちの少なくとも一方の機能の低下または喪失を伴う被験体にのみ投与する工程
を包含する、請求項１、２、３または４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記機能の低下または喪失は、前記ｐ５３遺伝子産物に関する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記機能の低下または喪失は、Ｒｂ遺伝子産物に関する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡポリメラーゼαの活性のインヒビターは、ＤＮＡポリメラーゼεのＩＣ５０の少なくとも５分の１より低い、ＤＮＡポリメラーゼαのＩＣ５０を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃｈｋ１の活性のインヒビターは、前記ＣＤＫ２のＩＣ５０の少なくとも５分の１より低いＣｈｋ１のＩＣ５０を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡポリメラーゼαの活性のインヒビターは、ｓｉＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡポリメラーゼαの活性のインヒビターは、アンチセンス核酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡポリメラーゼαの活性のインヒビターは、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項４に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｃｈｋ１の活性のインヒビターは、ｓｉＲＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｃｈｋ１の活性のインヒビターは、アンチセンス核酸である、請求項４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｃｈｋ１の活性のインヒビターは、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項４に記載の方法。
【請求項２７】
増殖性障害の処置のための医薬の製造における、ＤＮＡポリメラーゼαのインヒビターおよびＣｈｋ１のインヒビターの使用。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図２Ｃ】

【図２Ｄ】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【公表番号】特表２０１０−５１０２２２（Ｐ２０１０−５１０２２２Ａ）
【公表日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３７２２２（Ｐ２００９−５３７２２２）
【出願日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２４０６４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０６３５５８
【国際公開日】平成２０年５月２９日（２００８．５．２９）
【出願人】（５９６１２９２１５）シェーリング　コーポレイション (785)
【氏名又は名称原語表記】Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【Ｆターム（参考）】